KR20140038530A

KR20140038530A - 바이러스 항원 및 백신의 제조 방법

Info

Publication number: KR20140038530A
Application number: KR1020147001348A
Authority: KR
Inventors: 이-칭 추이; 이딩 왕; 조 더스; 호프 론 판트; 사바 스하케르; 로에이 게이르티에 야코바 판
Original assignee: 애보트 바이올로지컬스 비.브이.
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2012-07-04
Publication date: 2014-03-28
Also published as: AU2012286098C1; CN103827296B; EP2734619A1; ES2653197T3; JP6275641B2; MX2014000753A; AU2012286098A1; TW201311896A; BR112014001049A2; CN103827296A; EP2734619B1; CA2841604A1; RU2014101484A; WO2013010797A1; KR20160096215A; CA2841604C; JP2014524747A; RU2565827C2

Abstract

본 발명은 약제 산업의 분야에 속하고, 외피 바이러스로부터 유도된 바이러스 항원의 생산 방법으로서, 외피 바이러스를 포함하는 유체를 제공하는 단계, 상기 외피 바이러스를 포함하는 유체를 청징화하는 단계, 얻어진 액체 수확물의 용적을 감소시키는 단계, 외피 바이러스를 가용화시키는 단계, 및 바이러스 항원을 정제하는 단계를 포함하는, 외피 바이러스로부터 유도된 바이러스 항원의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 백신 제제의 생산을 위한 상기 방법의 용도에 관한 것이다.

Description

바이러스 항원 및 백신의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING VIRAL ANTIGEN AND VACCINES}

본 발명은 약제 산업 분야에 속하며, 외피 바이러스로부터 유도된 바이러스 항원을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

현재, 백신 제제 또는 이의 중간물과 같은 약제학적 조성물을 제조하기 위해 사용되는 바이러스는 유정란-기반 또는 세포-기반 배양 시스템에서 증식된다. 사용되는 각각의 시스템과는 독립적으로, 각각의 배양 시스템으로부터의 바이러스 항원의 프로세싱은 백신 제제와 같은 약제학적 조성물의 제조에서 매우 중요하고 결정적인 단계이다. 유정란-기반 시스템에 관해서, 프로세싱의 주요 요건은 오브알부민과 같은 발육란(embryonated-egg) 단백질의 충분한 제거이고, 세포-기반 시스템에 관해서, 프로세싱은 숙주-세포 DNA 및 숙주-세포 단백질의 유의한 감소와 같은 요건을 만족시켜야만 한다. 또한, 비-생산성 바이러스(non-productive virus)는 유의하게 제거되어야만 한다.

바이러스 단백질의 정제에 관해서, EP 1 982 727 A1에는, 배양 배지로부터 세포, 미세담체 및 세포 응집체를 침강에 의해 분리하는 단계, 상기 침강물을 화학적 불활성화시키고 상기 침강물을 가용화시키는 단계, 나트륨 콜레이트를 첨가하는 단계, 혼합물을 원심분리하는 단계, 앰버라이트(Amberlite) 처리에 의해 세제의 양을 감소시키는 단계, 및 친화성 크로마토그래피를 수행하고, 이어서 표적 단백질을 용출시키는 단계를 포함하는, 바이러스 막 단백질의 정제 방법이 개시되어 있다.

US 2011/0014230 A1에는, 정제된 비리온을 불활성화시키고, 이어서 상기 비리온을 세제와 스플리팅(splittingg)시키는 단계를 필수적으로 포함하는, 백신 항원을 제조하기 위한 방법이 기재되어 있다.

US 2009/0060950 A1에는 세포에서 바이러스를 증식시키는 단계, 세포 상청에서 상기 바이러스를 수집하는 단계, 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계, 상기 바이러스를 밀도 구배 초원심분리에 의해 정제하는 단계, 및 상기 바이러스를 세제로 처리하는 단계를 포함하는, 바이러스 백신을 제조하기 위한 방법이 개시되어 있다.

US 4,327,182에는 막 여과 기술을 이용하여 정제된 인플루엔자 서브유닛 백신을 제조하기 위한 방법이 개시되어 있다.

US 6,048,537은 농축 단계, 정제 단계, 및 단편화 단계를 포함하는, 정제된 인플루엔자 항원을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

정제 방법에 관한 추가의 문헌으로는 US 2010/0119552 A1; US 2010/0158944 A1; Kalbfuss et al., 2007, Biotech&Bioeng. Vol. 96, No. 5, pp 932-944; Onions et al., 2010, Biologicals, Vol.38, pp 544-551; US 2008/0118970; WO 03/097797; Goerke et al., 2005, Biotechnology and Bioengeneering, Vol. 91, No. 1, pp 12-21; Krober et al., Chem. Eng. Technology 2010, Vol. 33, pp 941-959; 및 WO 2010/052214 A2가 있다.

상기에 기재된 방법들에도 불구하고, 여전히, 바이러스 항원, 특히 바이러스 항원 제제, 그리고 특히 백신과 같은 약제학적 조성물을 생산하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 존재하며, 따라서, 이를 위한 목적이 존재한다. 특히, 상대적으로 낮은 생산 비용으로 높은 생성물 회수를 제공하고, 바이러스 스트레인 독립적이고, 최소 수의 단계만을 필요로 하며, 한편 숙주-세포 DNA 및 단백질 및 외인성 제제의 낮은 수준에 대한 엄격한 요건을 만족시키는 생산 방법에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명의 요약

본 발명은 하기 양상, 주제 및 바람직한 실시형태를 제공하고, 이들은 각각 단독으로 또는 조합하여 본 발명의 목적을 해결하는데 기여한다:

(1) 외피 바이러스로부터 유도되는 바이러스 항원을 생산하는 방법으로서,

나타내어진 순서대로 하기 단계들:

a) 외피 바이러스를 포함하는 유체를 제공하는 단계,

b) 상기 외피 바이러스를 포함하는 유체를 청징화시켜 상기 외피 바이러스를 포함하는 액체 수확물을 얻는 단계,

c) 상기 단계 b) 후에 얻어진 액체 수확물의 용적을 감소시켜 농축된 액체 수확물을 얻는 단계,

d) 상기 단계 c)에서 얻어진 농축된 액체 수확물에 양이온성 세제를 포함하는 세제 또는 세제 혼합물을 첨가함으로써 액체 수확물에 존재하는 외피 바이러스를 가용화시키는 단계,

e) 상기 단계 d) 후에 얻어진 조성물로부터 바이러스 코어를 분리하는 단계, 및

f) 임의로 상기 단계 e) 후에 얻어진 조성물로부터 양이온성 세제를 제거하는 단계,

및

g) 바이러스 항원을 정제하는 단계를 포함하고,

여기서, 상기 단계 c) 직후에 상기 단계 d)가 이어지는,

외피 바이러스로부터 유도되는 바이러스 항원을 생산하는 방법.

바람직한 실시형태에서, 상기 단계 e) 이전에, 주요 정제 단계, 특히, 외피 바이러스를 정제하는 것을 유도하는 정제 단계, 바람직하게는 크로마토그래피를 수행하지 않는다. 상기 단계 e) 후에, 주요 정제 단계를 수행한다. 상기 단계 e) 후에 수행하는 이러한 주요 정제 단계는 바이러스 항원을 정제하는 것을 유도한다. 전체 바이러스 또는 전체 비리온을 각각 정제하는 것을 유도하는 것은 아니다. 용어 "주요 정제 단계"(또는 각각 "주요 정제 방법")의 정의에 관해서는 본원에서 다른 곳의 정의를 참조한다.

추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 단계 g)에서 수행되는 크로마토그래피 단계만을 수행한다.

추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 단계 e) 이전에, 밀도 구배 원심분리(예를 들면, 밀도 구배 초원심분리, 예를 들면, 슈크로스 구배 초원심분리)를 수행하지 않는다.

추가의 실시형태에서, 추가의 바이러스 불활성화 단계, 예를 들면, 화학적 불활성화 단계, 및/또는 추가의 바이러스 제거 단계를 적용할 수 있다. 그러나, 본 발명을 적용함으로써, 임의의 병원체의 충분한 불활성화 및 충분한 제거에 도달하기 위한, 즉, 각각의 규제를 이행하는 불활성화 및 제거에 도달하기 위한 이러한 추가의 바이러스 불활성화 단계 및/또는 추가의 바이러스 제거 단계가 필요하지 않음이 당연할 것이다. 이는, 이러한 추가의 바이러스 불활성화 및/또는 추가의 바이러스 제거 단계를 생략하는 것이 프로세스 개선에, 예를 들면, 원하는 바이러스 항원에 노출되는 스트레스의 최소화 및/또는 프로세스 단축에 대하여 더욱 기여하므로, 이점이다. 그러나, 추가의 바이러스 불활성화 단계, 예를 들면, 화학적 불활성화, 및/또는 추가의 바이러스 제거 단계를 수행하는 경우, 이러한 단계(들)는 단계 c)와 단계 d) 사이에 수행하지 않는다. 다른 곳에 개시되어 있는 바와 같이, 그 중에서도 단계 c) 직후에 단계 d)가 이어지는 것이 바이러스 항원의 회수를 향상시키는 것에 기여한다. 다른 양상에서, 단계 e) 이전에, 상기 추가의 불활성화 및/또는 추가의 제거 단계를 수행하지 않는다. 추가의 실시형태에서, 상기 추가의 불활성화 및/또는 추가의 제거 단계는 예를 들면, 단계 g) 후에 수행한다. 또한, 이러한 추가의 바이러스 불활성화 단계 및/또는 추가의 바이러스 제거 단계를 수행하는 경우, 규제를 이행하는 최종 생성물에 도달하기 위해 필요한 사용되는 화학물질의 농도는 규제를 이행하는 최종 생성물에 도달하기 위해 종래 필요한 사용되는 화학물질의 농도에 비하여 더 낮다. 이는, 예를 들면, 바이러스 항원에 대해 노출된 스트레스 및 화학적 변형을 감소시키는 것에 관해서는 유리할 수 있다. 생성물 효능 및 가능하게는 안정성에 대해서도 추가로 이로울 수 있다.

본 발명의 의미 내에서, 용어 "바이러스 항원의 정제"는 주요 정제 방법 또는 주요 정제 단계, 예를 들면, 크로마토그래피, 또는 밀도 구배 초원심분리 정제 방법을 나타낸다. 한 실시형태에서, 주요 정제 방법은 선택적 막 여과를 포함하지 않는다. 사용되는 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피, 의사(pseudo) 친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 액체-액체 크로마토그래피 등일 수 있다. 본 발명의 의미 내에서, 용어 "주요 정제 방법" 또는 "주요 정제 단계"는, (최종으로) 원하는 생성물을 정제하기 위해서 사용되는 주요 정제 방법인 방법을 말한다. 즉, 주요 정제 방법/단계는 (최종으로) 원하는 생성물을 특이적으로 정제하는 것을 유도한다. 본 발명에서, 예를 들면, 상기 (최종으로) 원하는 생성물은, 정제되는 바이러스 항원이지만, 가용화 이전의 전체 외피 바이러스는 아니다. "주요 정제 방법"이 아닌 다른 방법은 상이한 목적, 예를 들면, 청징화 목적, 농축 목적 또는 펠렛화 목적을 이행할 수 있고, 원하는 (최종) 생성물을 추가로 정제하는 효과를 수반하는 경우도 있다. "주요 정제 단계" 또는 "주요 정제 방법"이 아닌 방법 단계의 결과는, 이러한 방법/단계를 수행한 후의 원하는 (최종) 생성물의 정제 효과가, "주요 정제 단계/방법"을 수행하는 경우에 도달되는 정제 효과에 비하여 더 낮다는 것이다. 주요 정제 단계를 수행한 후, 바람직하게 추가의 정제 단계를 수행하지 않는다(예를 들면, 조성물 내에 여전히 존재하는 불순물에 관한 규제를 이행하기 위함). 제거 및 불활성화 단계, 예를 들면, 화학적 불활성화 단계는 이러한 관점에서 주요 정제 단계로서 여겨지지 않는다. 본 발명에 따르면, 이러한 "주요 정제 단계/방법"은 단계 e) 이전에 수행하지 않는다.

(2) 항목 (1)에 있어서, 상기 단계 d) 후에 그리고 상기 단계 g) 이전에, 상기 단계 d)에서 첨가되었던 세제가 제거되는, 방법.

(3) 항목 (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 단계 c)에서의 용적이 4배 이상, 바람직하게는 5배 이상 감소하는, 방법.

바람직한 실시형태에서, 용적은 4배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 또는 9배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상, 더욱 더 바람직하게는 13배 이상, 또는 15배 이상, 가장 바람직하게는 20배 이상, 또는 25배 이상 감소한다. 전형적인 최대 용적 감소는 30, 35, 40 또는 45배이다.

한 실시형태에서, 단계 c)에서의 용적 감소는 하나의 단일 단계로 수행한다. 본 발명의 의미 내에서, 표현 "하나의 단일 단계"는, 수행되는 단 하나의 용적 감소 단계만이 존재하고 이러한 단일 용적 감소 단계가 반복되지 않음을 나타낸다.

(4) 항목 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 양이온성 세제의 최종 농도가, 약 2000㎍/ml 이상이고, 또한 바람직하게 약 2500㎍/ml 이상이고, 또한 바람직하게 약 3000㎍/ml 이상이고, 또한 바람직하게 약 3500㎍/ml 이상이고, 또한 바람직하게 약 4000㎍/ml 이상이고, 또한 바람직하게 약 4500㎍/ml 이상이고, 또한 바람직하게 약 5000㎍/ml 이상이고, 또한 바람직하게 약 5500㎍/ml 이상이고, 또한 바람직하게 약 6000㎍/ml 이상인, 방법.

(5) 항목 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 세제가, 4급 암모늄 양이온, 예를 들면, 세틸트리메틸암모늄 브롬화물 또는 다른 알킬 트리메틸암모늄염, 알킬 아민염, 예를 들면, 스테아릴 아민 아세테이트 또는 코코넛 알킬 아민 아세테이트, 벤즈알코늄 염화물 및 브롬화물, 예를 들면, 벤즈에토늄 염화물 또는 메틸벤즈에토늄 염화물, 스테아릴아민폴리글리콜에테르 또는 올레일아민폴리글리콜에테르에 기초하고, 바람직하게는 상기 양이온성 세제가 세틸 트리메틸암모늄 브롬화물(CTAB)인, 방법.

추가의 실시형태에서, 상기 세제가 세제들의 혼합물이고, 여기서, 상기 혼합물이 세제로서 본원에 기재된 바와 같은 양이온성 세제, 바람직하게는 CTAB, 및 본원에 기재된 바와 같은 비-이온성 세제, 바람직하게는 Tween-계열의 구성원, 바람직하게는 Tween-80을 포함한다.

(6) 항목 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 b) 직후에 상기 단계 c)가 이어지고, 그 직후에 상기 단계 d)가 이어지는, 방법.

추가의 실시형태에서, 상기 단계 d) 직후에 상기 단계 e)가 이어진다.

(7) 항목 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 세제 교환이 발생하지 않는, 방법.

(8) 항목 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 d) 이전에, 뉴클레아제 또는 다른 DNA 소화 효소, 바람직하게는 Benzonase®를 첨가하지 않고, 바람직하게는 프로세스의 어느 단계에서도 뉴클레아제를 첨가하지 않는, 방법.

(9) 항목 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 상기 외피 바이러스가, 외피 RNA 바이러스, 외피 DNA 바이러스 또는 외피 레트로바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서, 상기 외피 RNA 바이러스는 플라비바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, 간염 D 바이러스, 필로바이러스, 라브도바이러스, 분야바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스 및 아레나바이러스를 포함하고, 상기 외피 DNA 바이러스는 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스를 포함하고, 바람직하게는 상기 외피 바이러스가, 외피 RNA 바이러스로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 외피 바이러스가 오르토믹소바이러스이고, 가장 바람직하게는 인플루엔자 바이러스, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 A, B 또는 C인, 방법.

(10) 항목 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 a)의 유체가, 세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액 또는 유정란-기반 외피 바이러스 증식 배양액으로부터 유도되는, 방법.

(11) 항목 (10)에 있어서, 상기 세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액이 포유동물 세포주의 세포, 바람직하게 동물 세포주의 세포를 포함하는, 방법.

(12) 항목 (10) 또는 (11)에 있어서, 상기 포유동물 세포주의 세포가 Vero, PerC6, BHK, 293, COS, PCK, MRC-5, MDCK, MDBK 및 WI-38로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 포유동물 세포주의 세포가 MDCK 세포인, 방법.

(13) 항목 (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 부착세포로서 배양되는, 방법.

(14) 항목 (10)에 있어서, 상기 유정란-기반 외피 바이러스 증식 배양액이 계란을 포함하는, 방법.

(15) 항목 (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 a)의 유체가, 일회용 생물반응기를 사용함으로써 생산되는, 방법.

일회용 생물반응기의 사용은, 종래 방법에 비하여, 예를 들면, 얻어진 생성물 자체에 관하여, 예를 들면, 품질 및/또는 순도의 관점에서, 본 발명에 따른 방법의 개선에 더 기여할 수 있다. 이것은 특히, 상기 방법이 대규모, 예를 들면 공업 규모로 수행되는 경우에 이롭다.

(16) 항목 (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 상기 청징화 단계 b)가, 원심분리, 접선 유동 여과 및 심층 여과로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법을 적용함으로써 수행되는, 방법.

한 실시형태에서, 원심분리 조건은, 예를 들면, 2분 미만 동안 RCF(상대적 원심력) 1000g 이하이고, 바람직하게는 2분 이하 동안 RCF 3000g 이하이고, 보다 바람직하게는 2분 이하 동안 RCF 500g 이하이고, 더욱 더 바람직하게는 2분 이하 동안 RCF 300g 이하이다. 본 발명의 의미 내에서, "g"는 지표에서의 중력으로 인한 표준 가속도를 말한다.

한 실시형태에서, 접선 유동 여과의 경우, 미세여과 막의 세공 크기는 예를 들면, 0.2㎛ 이상이고, 바람직하게는 0.45㎛ 이상이고, 더욱 더 바람직하게는 0.65㎛ 이상이다.

한 실시형태에서, 심층 여과의 경우, 예를 들면, 0.2㎛-7㎛ 필터가 사용된다. 추가로, 생성물 회수를 더 향상시키고/시키거나 필터 막힘을 예방하기 위해서, 프리-필터(pre-filter)를 사용할 수 있다.

(17) 항목 (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 상기 농축 단계 c)가, 접선 유동 여과(TFF), 초원심분리 및 침전으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법을 적용함으로써 수행되는, 방법. TFF는 TFF 한외여과 또는 단일 단계로의 TFF 한외여과 및 투석여과(TFF 한외여과/투석여과)이다.

한 실시형태에서, 상기 단계 c)에 대해 접선 유동 여과가 사용되는 경우, 한외여과 막의 분자량 컷-오프는 예를 들면, 1000kDa 이하, 바람직하게는 750kDa 이하, 보다 바람직하게는 500kDa 이하, 더욱 더 바람직하게는 300kDa 이하, 가장 바람직하게는 100 내지 300kDa일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 한외여과 막의 분자량 컷-오프는 50kDa 이상이다.

단계 c)에 접선 유동 여과를 적용하는 경우, 바람직한 실시형태에서, 용적 감소는 5 내지 40배의 범위 내이고, 바람직하게는 용적 감소가 10배 초과이며, 더욱 바람직하게는 용적 감소가 15배 초과이다. 용적 감소는 30배 이하인 것이 바람직하다. 이는 하기 처리 단계의 결과를 개선시킬 수 있다.

한 실시형태에서, 단계 c)에 초원심분리를 사용하는 경우, 초원심분리의 조건은 예를 들면, 10분 초과 동안 30.000g 내지 200.000g일 수 있다. 단계 c)에 초원심분리를 적용하는 경우, 바람직한 실시형태에서, 초원심분리의 용적 감소는 10배 초과, 바람직하게는 20배 초과, 보다 바람직하게는 30배 초과, 더욱 더 바람직하게는 40배 초과이다.

한 실시형태에서, 농축이 침전을 적용함으로써 수행되는 경우, 적합한 화학물질은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들면, 각각 적절한 농도의 염, 메틸 및 에틸 알콜 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 절적한 농도로의 적합한 화학물질은 생성물, 예를 들면, 바이러스 항원 함유 입자를 침전시키지만, 상기 바이러스 항원에 대한 부정적인 효과는 없거나 최소이다. 화학물질은, 이들이 (최종으로) 원하는 생성물, 예를 들면, 바이러스 항원과 반응하지 않도록 선별된다. 단계 c)에 침전을 적용하는 경우, 바람직한 실시형태에서, 용적 감소는 10배 초과, 바람직하게는 20배 초과, 보다 바람직하게는 30배 초과, 더욱 더 바람직하게는 40배 초과이다.

(18) 항목 (1) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서, 액체 수확물에 존재하는 외피 바이러스의 전부를 본질적으로 가용화시키기에 충분한 시간 동안 및 충분한 온도에서 가용화를 수행하는, 방법.

일반적으로, 외피 바이러스의 전부를 본질적으로 가용화시키기에 충분한 시간 및 온도는 당해 분야 숙련가에 의해 측정될 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 시간은 0℃ 이상, 바람직하게는 2℃ 내지 30℃에서, 0.2h 내지 20h이고, 바람직하게 상기 시간은 2 내지 25℃, 보다 바람직하게는 2 내지 8℃에서 0.5h 내지 6.0h이다.

(19) 항목 (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 단계 e)가 수행되는 경우, 초원심분리 및 접선 유동 여과로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법을 적용함으로써 단계 e)가 수행되는, 방법.

한 실시형태에서, 단계 e)에서 초원심분리를 사용하는 경우, 바람직하게, 펠렛화를 위한 초원심분리의 조건은 10분 초과 동안 30.000g 내지 200.000g이고, 바람직하게는 30분 초과 동안 60.000g 초과이고, 보다 바람직하게는 30분 초과 동안 90.000g 초과이고, 더욱 더 바람직하게는 30분 초과 동안 120.000g 초과이다.

한 실시형태에서, 단계 e)에서 접선 유동 여과를 사용하는 경우, 한외여과 막의 분자량 컷-오프는 100kDa 초과인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 300kDa 초과이다. 추가로, 상기 막의 분자량 컷 오프는 500kDa 이하인 것이 바람직하다.

(20) 항목 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 f)가, 크로마토그래피를 적용함으로써 수행되고, 바람직하게는 상기 크로마토그래피가, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피, 의사 친화성 크로마토그래피, 액체-액체 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 크로마토그래피가, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 의사 친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.

(21) 항목 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 항원이 외피 바이러스의 일부이고, 바람직하게는 상기 바이러스 항원이 바이러스 단백질이고, 보다 바람직하게는 상기 바이러스 항원이 바이러스 단백질, 예를 들면, 바이러스 표면 단백질인, 방법.

(22) 항목 (1) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 단백질이, 인플루엔자 바이러스 유래의 바이러스 표면 단백질 HA 및/또는 NA인, 방법.

추가의 실시형태에서, 상기 바이러스 단백질은 인플루엔자 바이러스 유래의 M 단백질이다.

(23) 항목 (1) 내지 (22) 중 어느 하나에 있어서, 얻어진 바이러스 항원을 약제학적 조성물로 제형화하는 추가의 단계를 포함하는, 방법.

(24) 항목 (23)에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 백신 제제 또는 이의 중간물이고, 바람직하게는 상기 약제학적 조성물이 외피 바이러스 백신이고, 보다 바람직하게는 상기 약제학적 조성물이 인플루엔자 바이러스 백신인, 방법.

(25) 항목 (1) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 g)가, 25℃를 기준으로 하는 경우, 도전율(conductivity)이 3.0 이상 내지 5.0mS/cm 미만, 바람직하게는 3.5 이상 내지 4.7mS/cm 이하의 범위, 더욱 더 바람직하게는 3.6 이상 내지 4.65mS/cm 이하의 범위 내인 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 방법.

바람직한 실시형태에서, 상기 단계 g)는 크로마토그래피 단계, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피를 포함하고, 상기 정의된 도전율을 갖는 조성물은, 각각의 사용된 크로마토그래피 방법과 병용하기에 적합한 완충액, 예를 들면, 염을 포함하는 로드 완충액(load buffer) 및/또는 평형 완충액이다.

조성물의 도전율은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 따라, 예를 들면, 전자적 수단, 예를 들면, 도전율계를 사용함으로써 측정할 수 있다.

(26) 항목 (1) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 g)가, 25℃를 기준으로 하는 경우, 몰 농도가 1.0M 이상 내지 3.5M 이하의 범위, 바람직하게는 1.0M 이상 내지 3.0M 이하의 범위, 보다 바람직하게는 1.5M 이상 내지 3.0M 이하의 범위, 더욱 더 바람직하게는 1.5M 이상 내지 2.6M 이하의 범위 내인 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 방법.

바람직한 실시형태에서, 상기 단계 g)가 크로마토그래피 단계, 예를 들면, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하고, 상기 정의된 몰 농도를 갖는 조성물은, 각각의 사용된 크로마토그래피 방법과 병용하기에 적합한 완충액, 예를 들면, 염을 포함하는 로드 완충액 및/또는 평형 완충액이다.

몰 농도는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다.

항목 (25) 및/또는 (26)에 정의된 바와 같은 조성물을 이용하는 것은 특히 바이러스 항원 회수와 관련하여 바이러스 항원의 제조 방법의 개선에도 추가로 기여할 수 있다.

(27) 세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액으로부터 유도된 바이러스 항원을 함유하는 백신 제제를 제조하기 위한 방법의 용도로서,

나타내어진 순서대로 하기 단계들:

i) 세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액으로부터 얻어진 외피 바이러스를 함유하는 액체 수확물의 용적을 감소시켜 농축된 액체 수확물을 얻는 단계, 및

ii) 상기 단계 i)에서 얻어진 농축된 액체 수확물에 양이온성 세제를 포함하는 세제 또는 세제 혼합물을 첨가함으로써 액체 수확물에 존재하는 외피 바이러스를 가용화시키는 단계를 포함하고,

여기서, 상기 단계 i) 직후에 상기 단계 ii)가 이어지고,

이로써 백신 제제 내에 존재하는 숙주-세포 DNA의 감소가 2.5로그 이상이고, 바람직하게는 3.0로그 이상이고, 보다 바람직하게는 3.5로그 이상이고, 더욱 더 바람직하게는 4.0로그 이상인, 용도.

백신 제제 내의 숙주-세포 DNA의 2.5로그 이상의 감소는 단계 i) 및 ii)의 조합만으로, 최대 추가로 항목 (1)의 단계 b), e), f) 및/또는 g)로 달성된다. 임의의 경우에, 추가의 DNA-특이적 단계, 특히 DNA-소화 효소 처리 단계 및 DNA-제거 크로마토그래피(친화성 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피 등) 및/또는 불활성화 단계는, 상기 정의된 숙주-세포 DNA의 감소를 달성하기 위해 반드시 수행되는 것은 아니거나 심지어 모두 수행하지 않는다. 추가의 DNA-특이적 단계 및/또는 불활성화 단계가 수행되는 경우, 이들 단계(및 따라서 전체 방법)는 예를 들면, 상기 숙주-세포 감소를 달성하기 위해 유의하게 적은 양의 DNA 소화 효소 또는 불활성화 조성물이 필요하므로 프로세스 경제의 관점에서 현저하게 개선된 방법으로 수행될 수 있다.

용어 "백신 제제", "바이러스 항원", "세포-기반", "액체 수확물", "외피 바이러스" 및 "세제"와 관련하여, 본 명세서를 참조한다.

바람직한 실시형태에서, 상기 단계 i) 이전에, 외피 바이러스를 함유하는 액체 수확물로부터 세포 잔해물 및/또는 미세담체를 제거한다.

(28) 항목 (27)에 있어서, 상기 단계 i) 및 ii)가 상기 항목들에 정의된 상기 단계 c) 및 d)에 상응하는, 용도.

(29) 항목 (27) 또는 (28)에 있어서, 상기 단계 i) 이전에, 상기 항목들에 정의된 단계 a) 및 b)를, 그리고 상기 단계 ii) 후에, 상기 항목들에 정의된 단계 e), f) 및/또는 g)를 수행하는, 용도.

발명의 상세한 설명

본 발명은 하기에 바람직한 실시형태 및 실시예에 의해 보다 상세하게 기재되지만, 이러한 실시형태 및 실시예는 예시적 목적을 위해서만 나타내는 것이고, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

약제학적 조성물의 제조에 사용되는 바이러스, 예를 들면, 백신 제제 또는 이의 중간물은 세포-기반 또는 유정란-기반 시스템 중 어느 하나로 증식될 수 있다. 각각 사용된 시스템에 따라, 상기 약제학적 조성물은 흔히 유정란-기반 조성물 또는 세포-기반 조성물 중 어느 하나로서 분류된다. 백신 제제 또는 백신의 경우, 프로세싱의 주요 요건은 불순물의 제거, 예를 들면, 유정란-기반 바이러스 증식 시스템의 경우에 발육란 단백질, 예를 들면, 오브알부민의 제거, 및 비-생성물 바이러스의 제거이고, 세포-기반 바이러스 증식 시스템의 경우에, 프로세싱 동안 추가의 요건, 예를 들면, 숙주-세포 DNA의 유의한 감소 및 숙주-세포 단백질의 유의한 감소가 이행되어야만 한다.

본 발명과 관련하여, 정의된 순서로 수행되는 특정 프로세스 단계들의 조합은 종래 방법에 비하여, 예를 들면, 프로세스 자체에 관하여, 예를 들면, 전체 프로세스의 단순화의 관점에서, 그리고/또는 얻어진 생성물과 관련하여, 예를 들면, 품질, 수율 및/또는 순도의 관점에서, 개선된 방법을 제공함이 예상치 않게 발견되었다. 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써, 프로세스가, 상기 액체 수확물 내의 바이러스(바이러스 입자로서도 나타냄) 및 다른 구성성분의 농축을 초래하는, 증식된 바이러스를 함유하는 액체 수확물의 용적 감소 단계, 및 감소된 용적의 액체 수확물에 존재하는 바이러스를 가용화시키는 가용화 단계를 포함함이 제공되면, 상기 이롭고 놀라운 효과가 얻어질 수 있다. 특히, 종래 기술 프로세스와는 별개로, 본 발명에 따른 방법에 존재하는 정제 단계는 가용화 단계가 완료된 후에만 수행하고, 추가로, 전체 바이러스 입자에 유도되기보다는 바이러스 항원에 유도된다. 따라서, 본 발명에 따른 프로세스를 적용함으로써, 가용화 이전에, 전체 바이러스 입자 정제를 위해 의도되고 전체 바이러스 입자 정제를 목적으로 하는 생성물 손실이 높고, 힘들고, 시간 및 비용-집약적인 정제 단계(들)를 생략할 수 있지만, 여전히 만족할만한 순도 및 수율을 갖는 조성물이 얻어질 수 있다. 또한, 가용화 단계는 용적 감소 단계의 직전이다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 농축 단계 c)가 숙주 세포 DNA의 농도를 증가시킬 수 있고, 이는 결과적으로 침전 효율과 관련하여 이로울 수 있으므로, 이러한 단계들, 즉, 가용화 단계 직후에 용적 감소 단계가 이어지는 것은 이로운 효과에 기여하는 것으로 추정된다.

놀랍게도, 약제학적 조성물, 예를 들면, 바이러스 항원을 포함하는 백신의 종래 제조 방법과는 별개로, 본 발명에 따른 프로세스는, 향상된 생성물 회수를 얻는 한편 동시에 종래 프로세스에 비하여 감소된 수의 프로세스 단계를 요구하는 것만을 가능하게 하는, 개선된, 강건한 프로세스를 나타낸다. 이러한 감소된 수의 요구되는 프로세스 단계는 추가로 프로세스의 향상된 강건성에, 또한 백신 조성물을 제조하기 위해 종래 요구된 제조 비용 및 시간을 저하시키는 것에 기여한다. 이는, 신속한 생산 및 시장에의 범발성 또는 계절성 백신의 배포가 요구되므로, 특히, 바이러스 감염, 예를 들면, 인플루엔자의 범발적 또는 계절적 발생의 경우에 유용하고, 매우 시간 소모적인 것으로 알려져 있는 바이러스 증식을 위한 유정란-기반 배양 시스템을 이용하여 백신이 생산되는 경우에 더욱 더 유용하다.

또한, 약제학적 조성물에 적용되는 프로세스의 수를 감소시키면, 존재하는 바이러스 및 바이러스 항원을 위압하는 스트레스는 감소되고, 이는 최종 생성물(예를 들면, 백신) 및 이의 중간물의 효력 및 안정성을 개선시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방법을 적용함으로써, 종래 프로세스에 비하여 감소된 수의 프로세스 단계에도 불구하고, 단백질 및 DNA 오염물질의 최대 허용량(tolerated maximum amount)에 관한 특정 투여 요건을 이행하는 백신 제제가 제조될 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 백신 제제의 경우, 현재(2011) 허용되는 오염물질의 최대량은 120㎍의 비-헤마그글루티닌(HA) 단백질/용량 및 10ng의 DNA/용량이다(이러한 기준에서, 1용량은 500㎕ 백신 제제에 상당한다). 본 발명에 따른 프로세스의 추가의 이점은, 세포 기반 또는 유정란 기반 시스템에서 증식되는 바이러스와 독립적으로 적용될 수 있다는 점이다. 따라서, 예를 들면, 세포-기반 시스템이 바이러스 증식에 사용되는 경우, 본 발명에 따른 방법은 숙주 세포 DNA 오염물질의 유의한 감소를 제공하고, 유정란-기반 시스템이 바이러스 증식에 사용되는 경우, 본 발명에 따른 방법은 유정란 배양액으로부터 얻어지는 오염물질의 감소를 제공한다.

생산된 바이러스 항원의 향상된 회수로 인하여, 생산 배치당 증가된 수의 백신 용량이 제조될 수 있다. 이는 예를 들면, 계절성 인플루엔자 발생의 경우와 같이 백신 제제의 수요가 높은 경우에 특히 이로울 수 있다.

전형적이고 이로운 백신으로서, 상기 백신은 인플루엔자 백신, 특히 서브유닛 백신이다.

또한, 본 발명에 따른 프로세스는 바이러스 스트레인의 변이에 대처할 수 있고, 이는 상기 프로세스가 덜 스트레인-의존적임을 의미한다. 이는, 게놈의 일정한 부동(drift) 및 이동(shift)을 나타내는 바이러스, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스가 사용되는 경우에 특히 유용하다.

대체로, 본 발명에 따른 방법은 예를 들면, 강건성, 생성물 회수, 생산 시간 및 비용, 및 최종 생성물 또는 이의 중간물 내에 존재하는 오염물질과 관련하여 유의하게 개선된 방법을 제공할 수 있다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은 이러한 순서대로 하기 단계들:

a) 외피 바이러스를 포함하는 유체를 제공하는 단계,

및

g) 바이러스 항원을 정제하는 단계를 포함하고,

여기서, 상기 단계 c) 직후에 상기 단계 d)가 이어지는,

외피 바이러스로부터 유도되는 바이러스 항원의 생산 방법에 관한 것이다.

바이러스 항원은 외피 바이러스로부터 유도된다. 이들 외피 바이러스는, 단일 또는 이중 가닥 게놈을 갖는 임의의 외피 DNA 또는 RNA 바이러스일 수 있고, 센스 또는 안티센스일 수 있고, 연속 또는 분절일 수 있다. 예를 들면, 바이러스는, 외피 RNA 바이러스, 외피 DNA 바이러스 또는 레트로바이러스의 그룹으로부터 선택되고, 여기서, 외피 RNA 바이러스의 그룹은 플라비바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, 간염 D 바이러스, 필로바이러스, 라브도바이러스, 분야바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스 및 아레나바이러스를 포함하고, 여기서, 외피 DNA 바이러스의 그룹은 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스는, 간염 D 바이러스, 오르토믹소바이러스 및 파라믹소바이러스를 포함하는 외피 RNA 바이러스의 그룹으로부터 선택되고, 특히 바람직한 외피 RNA 바이러스는 오르토믹소바이러스, 예를 들면, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 또는 인플루엔자 C이다.

본 발명에 따른 방법의 단계 a)에서, 상기에 기재된 외피 바이러스를 포함하는 유체가 제공된다. 이러한 유체는 세포-기반 바이러스 증식 배양액 또는 유정란-기반 바이러스 증식 배양액으로부터 유도된다. 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 바와 같이, 바이러스, 예를 들면, 상기에 정의된 외피 바이러스는 세포-기반 배양 시스템에서 또는 유정란-기반 배양 시스템에서 증식될 수 있다. 바이러스, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스를 성장시키기 위해 사용되는 적합한 세포주는 전형적으로 포유동물 기원의 것이고, 따라서, 포유동물 세포주, 바람직하게는 동물 세포주를 나타낸다. 적합한 동물 세포주는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 햄스터, 소, 영장류(사람 및 원숭이 포함) 및 개 기원의 세포주를 포함할 수 있다. 소정 실시형태에서, 포유동물 세포주의 세포는 Vero, PerC6, BHK, 293, COS, PCK, MRC-5, MDCK, MDBK 및 WI-38로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게 상기 세포는 MDCK 세포이다. 바이러스는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 따라 세포 상에 성장될 수 있다. 예를 들면, 바이러스는 부착 세포 배양액 또는 현탁 세포 배양액에서 성장될 수 있다. 한 실시형태에서, 세포는 미세담체 상에서 성장된다. 추가의 실시형태에서, 세포는 또한 현탁액에서 성장시키기 위해 적응될 수 있다. 세포-기반 배양 시스템의 경우, 임의의 적합한 매질이 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 혈청-불포함 및/또는 단백질-불포함 매질에서 배양된다. 세포-기반 바이러스 증식의 경우, 일반적으로 바이러스 또는 생 바이러스 제제는 각각 이들이 증식하는 세포 배양액에 접종된다. 바이러스 증식은 뱃치 방식, 또는 공급-뱃치 방식, 또는 관류 방식으로 이루어질 수 있다. 25 내지 37℃에서 2 내지 5일 후, 일반적으로 바이러스 증식이 정지된다. 바이러스 증식 생물반응기에 함유된 바이러스 함유 유체는 이의 정제 프로세스에 직접 공급되거나 별도의 용기에 이동될 수 있다. 이어서, 별도의 용기 내의 바이러스 함유 유체를 백신 정제 프로세스에 공급된다.

대안으로, 바이러스는 유정란-기반 시스템에서 증식될 수 있다. 유정란-기반 제조에 있어서, 일반적으로 작업 종자 바이러스(working seed virus)를 산란계의 발육란에 주사한다. 바이러스는 상기 발육란의 요막액(난백)에서 증식하기 시작하여 바이러스의 양이 증가된다. 2 내지 3일의 항온배양 후, 상기 발육란은 2 내지 8℃로 냉각시키고, 각각의 발육란의 요막액을 수확하고, 수동 또는 자동화된 진공 수확 시스템을 이용하여 폴링한다(polled). 수집된 바이러스 함유 요막액은 바이러스를 포함하는 유정란-기반 유체이고, 후속적인 정제 프로세스에서 더 프로세싱된다.

바이러스 증식에 사용된 배양 시스템에 따라, 증식된 바이러스 입자를 포함하는 유체는 상이한 오염물질을 함유할 수 있다. 예를 들면, 유정란-기반 배양액에 존재하는 잠재적 오염물질은 유정란-기반 단백질, 예를 들면, 유정란 알부민, 또는 항생제이고, 반면에 세포-기반 배양액에 존재하는 전형적인 오염물질은 잔존하는 숙주-세포 DNA이다. 유리하게, 본 발명에 따른 방법은 바이러스 증식에 사용되는 시스템과 관련하여 제한되지 않고; 세포-기반 배양 시스템에서 및 마찬가지로 유정란-기반 배양 시스템에서 증식된 바이러스를 포함하는 유체를 사용하는 경우에 오히려 이로운 효과가 도달될 수 있다.

단계 a)의 유체는 일회용 생물반응기를 사용함으로써 제조될 수 있다. 이러한 일회용 생물반응기를 사용함으로써, 예를 들면, 얻어진 생성물 자체는 예를 들면, 품질 및/또는 순도의 관점에서 향상될 수 있다. 이는 특히 상기 방법이 대규모로, 예를 들면, 공업 규모로 수행되는 경우에 이롭다.

외피 바이러스를 포함하는 유체에는 청징화 단계를 수행한다. 청징화 단계는 바이러스 입자를 포함한 유체에 대해 수행되지만, 침강되거나 그 이외의 펠렛화된 물질에 대해서는 수행되지 않는다. 본 발명의 의미 내에서, 이러한 청징화 단계의 목적은 유체로부터 입자상 물질, 예를 들면, 세포 잔해, 단백질 불순물 및/또는 세포를 성장시키기 위해 사용된 지지 물질, 예를 들면, 미세담체를 제거하는 것이다. 본 발명의 의미 내에서, 청징화 단계는 예를 들면, 유체로부터 입자상 물질을 제거하지만, 외피 바이러스의 바이러스 항원의 80% 초과를 유지한다. 단백질 불순물은 예를 들면, 알란토인, 콜라겐 및/또는 알부민, 예를 들면, 오브알부민일 수 있다. 청징화를 위해, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 적합한 수단 또는 방법이 사용될 수 있다. 특히, 접선 유동 여과(TFF), 심층 여과, 또는 원심분리를 적용할 수 있다. 이로써, 각각 적용된 청징화 수단(TFF, 심층 여과, 원심분리)의 각각의 설정은, 상기 나타내어진 목적이 도달되도록 하는 방식으로 선택된다. 일반적으로, 이러한 목적이 주어지는 경우, 각각의 수단에 대한 각각의 상기 설정은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 바람직한 실시형태에서, 원심분리를 적용하는 경우, 10000g 이하의 원심력을 2분(min.) 이하의 시간 동안 적용할 수 있다. 이러한 청징화 단계에서 2분 이하의 시간 동안 보다 적은, 예를 들면, 1000g 이하, 바람직하게는 500g 이하, 보다 바람직하게는 300g의 원심력을 적용하는 것은, 본 발명의 이로운 효과에 더욱 더 기여하고, 예를 들면, 바이러스 항원의 더욱 향상된 회수에 기여할 수 있다. 원심분리를 적용하는 경우에 추가의 매개변수에 관하여, 또한 접선 유동 여과 또는 심층 여과에 대한 매개변수와 관련하여, 이 명세서의 다른 곳을 참조한다.

본 발명의 의미 내에서, 얻어진 청징화된 유체는 "액체 수확물"로서 나타낸다.

본 발명에 따른 방법의 주요 양상은 증식된 바이러스 입자를 함유하는 청징화된 유체 용적의 감소, 직후에 용적-감소된, 농축된 액체 수확물에 존재하는 바이러스 입자의 가용화/세제 처리 단계가 이어지는 것이다. 놀랍게도, 이러한 용적 감소, 직후에 상기 바이러스를 본원의 다른 곳에 기재되어 있는 세제로 처리하는 것은 회수를 향상시키고, 따라서 바이러스 항원의 수율을 개선시킨다는 것이 발견되었다. 또한, 놀랍게도, 세포-기반 시스템으로 바이러스 증식이 수행되는 경우, 예상치 못한 숙주-세포 DNA의 향상된 감소가 도달될 수 있음이 발견되었다.

본 발명의 의미 내에서, 용어 "직후"는, 단계 c)와 d) 사이에 예를 들면, 처리 단계 또는 특정 활성 정제 단계가 수행되지 않음을 나타낸다. 이는, 예를 들면, 단계 c)와 d) 사이의 액체 수확물에 처리 단계가 수행되지 않음, 예를 들면 불활성화 또는 정제 단계가 수행되지 않음을 의미한다. 또한, 이는, 추가의 시약을 단계 c)와 d) 사이의 액체 수확물로부터 취하거나 상기 액체 수확물에 첨가하지 않음을 의미할 수 있다. 다른 양상에서, 단계 b) 직후에 단계 c)가 이어지고, 그 직후에 단계 d)가 이어진다. 이는, 높은 생성물(바이러스 항원) 회수, 수율 및/또는 순도를 여전히 유지하면서, 예를 들면, 단순화의 관점에서, 또는 시간 효율성 및 비용 감소의 관점에서 본 발명의 방법의 향상에 추가로 기여할 수 있다.

불활성화는 바이러스의 감염성 제거를 초래하고, 전형적으로는 바이러스를 하기 화학적 수단 중 하나 이상의 유효량으로 처리함으로써 수행한다: 세제, 포름알데하이드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카복시풀러렌(C60), 2급 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민 또는 이들의 조합. 또한, 불활성화 방법은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들면, 바이러스를 물리적 수단, 예를 들면, 감마 조사 및/또는 UV 광으로 처리함을 포함한다.

본 발명의 소정 실시형태에서, 외피 바이러스를 가용화시키기 위해 사용된 것과 동일한 세제를 적용함에 의한 불활성화(단계 d))를 수행하지 않는다.

본 발명에 따른 추가의 실시형태에서, 단계 d) 이전에, 불활성화, 구체적으로 상기 바이러스를 포름알데하이드, β-프로피오락톤 및/또는 UV 광(예를 들면, UV-C)으로, 바람직하게는 포름알데하이드 및/또는 β-프로피오락톤으로 처리하는 것을 포함하는 불활성화를 수행하지 않는다. 다른 양상에서, 외피 바이러스의 가용화 단계 후에, 즉, 단계 d) 후에, 바이러스의 불활성화 단계를 적용할 수 있다. 추가의 양상에서도, 단계 a) 내지 f) 동안 불활성화 단계는 전혀 수행되지 않는다. 이는 예를 들면, 비용 및/또는 작업의 관점에서 본 발명에 따른 방법의 향상에 추가로 기여할 수 있다. 또한, 때때로, β-프로피오락톤은, 바이러스 증식이 세포-기반 시스템에서 수행되는 경우 존재할 수 있는 잔존 숙주-세포 DNA의 증식 불활성화에 사용된다. 그러나, β-프로피오락톤은, DNA뿐만 아니라 생성물 항원(바이러스 항원)도 알킬화시키는 알킬화제이므로, 예를 들면, 상기 항원의 안정성 및/또는 면역원성의 관점에서 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 이점은, 놀랍게도, 불활성화제, 예를 들면, β-프로피오락톤의 생략에도 불구하고, 최종 생성물(예를 들면, 백신 제제) 내의 최대 허용되는 숙주-세포 DNA 불순물의 제한이 준수될 수 있다는 것이다.

단계 c)의 액체 수확물의 농축은 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 방법은 액체 수확물의 용적을 감소시키는 것을 유도한다. 이러한 단계의 목적은 바이러스 입자를 특이적으로 정제하는 것이 아니다, 즉, 이러한 단계는 주요 정제 단계가 아니다. 오히려, 이러한 단계는 외피 바이러스 입자를 포함하는 액체 수확물의 용적을 감소시켜 농축된 액체 수확물을 얻는 것을 목표로 한다.

용적을 감소시키는 단계 동안, 소량의 불순물이 액체 바이러스 수확물로부터 분리되는 것이 일어날 수 있다.

소량의 불순물은 임의의 물질, 예를 들면, 외피 바이러스의 크기 미만, 바람직하게는 약 1000kDa 미만, 더욱 바람직하게는 약 500kDa 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 300kDa 미만의 크기를 갖는, 분자, 입자, 또는 매질 성분이다. 소량의 불순물의 이러한 분리가 발생하는 경우, 이러한 분리는 분리된 불순물의 크기에만 기초하고, 불순물의 밀도에 기초하는 것은 아니다. 상기 불순물의 크기뿐만 아니라 상기 불순물의 밀도에도 기초한 불순물의 분리는, 구배, 예를 들면, 구배 원심분리를 포함하는 정제 방법을 행하는 경우에 발생한다. 구배 원심분리의 예로는 슈크로스 구배 초원심분리가 있다. 용적의 감소 단계는 예를 들면, 바이러스 항원의 향상된 회수 및/또는 숙주-세포 DNA의 개선된 제거를 수득하는데 기여한다.

바람직한 실시형태에서, TFF 한외여과 또는 단일 단계로의 TFF 한외여과와 투석여과(TFF 한외여과/투석여과)를 적용함으로써 용적을 감소시킬 수 있고, 용적을 감소시키기 위해 초원심분리 또는 침전, 바람직하게는 TFF 한외여과를 사용한다. 이로써, 각각 적용된 농축 수단(TFF, TFF 한외여과/투석여과, 초원심분리 또는 침전)의 각각의 설정은 상기 나타낸 목적, 즉 용적 감소 및 바이러스 입자의 농축이 달성되는 방식으로 선택된다. 본 발명에 따른 바람직한 실시형태에서, 용적 감소는, 50kDa 내지 1000kDa 컷-오프 막, 바람직하게는 100kDa 내지 300kDa 컷-오프 막, 바람직하게는 50kDa 이상의 컷-오프 막을 이용하는 TFF 한외여과/투석여과를 적용함으로써 달성된다.

한 실시형태에서, 초원심분리를 사용하여 용적을 감소시키는 경우, 초원심분리의 조건은 예를 들면, 10분 초과 동안 30.000g 내지 200.000g일 수 있다.

한 실시형태에서, 침전을 적용함으로써 농축이 수행되는 경우, 적합한 화학물질은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들면, 각각 적절한 농도로의 염, 메틸 및 에틸 알콜 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 절적한 농도로의 적합한 화학물질은 생성물, 예를 들면, 바이러스 항원 함유 입자를 침전시키지만, 상기 바이러스 항원에 대한 부정적인 효과는 없거나 최소이다. 화학물질은, 이들이 원하는 항원, 예를 들면, 바이러스 항원과 반응하지 않고 원하는 항원의 면역원성을 변경하지 않도록 선별된다.

또한 바람직하게, 단계 c)에서의 용적 감소 단계는 밀도 구배 원심분리 방법, 예를 들면, 슈크로스 구배 초원심분리를 이용하여 수행되지 않는다. 구배 초원심분리는 높은 수준의 유지비용을 요구하는 고-비용 및 노동-집약적 프로세스 단계이고, 운영이 고가이다. 따라서, 구배 초원심분리 단계를 생략함으로써, 예를 들면, 감소된 생산 비용 및 노동의 관점에서 프로세스가 개선될 수 있다.

한 실시형태에서, 용적은 4배 이상, 바람직하게 5배 이상, 또는 9배 이상, 또한 바람직하게 12배 이상, 또한 바람직하게 13배 이상, 또는 15배 이상, 또한 바람직하게 20배 이상, 또는 25배 이상 감소한다. 전형적인 최대 용적 감소는 30, 35, 40 또는 45배이다. 본 발명에서, 본원에 나타낸 배수로, 특히 하기에 나타낸 농도로의 세제와 병용하여 용적을 감소시키는 것은 바이러스 항원의 회수 향상에 더욱 기여함을 발견하였다. 또한, 바이러스 증식을 위해 세포-기반 시스템이 사요되는 경우, 예상치 않게도 숙주-세포 DNA의 향상된 감소, 예를 들면, 2.5로그 이상의 감소가 달성될 수 있다.

외피 바이러스 입자를 포함하는 이러한 감소되고 농축된 용적에 직접 가용화 단계를 수행한다. 바이러스 항원은 상이한 형태, 예를 들면, 응집물 중의 거대 입자 및/또는 세포 및 세포 잔해에 부착된 거대 입자, 필라멘트 형태 바이러스, 온전한 구형 및 자유 구형 바이러스 입자, 바이러스 단편 및 바이러스와 관련되지 않은 루즈(loose) 바이러스 항원으로 존재할 수 있다. 가용화 단계는 상이한 구조로부터 바이러스 항원을 자유롭게 하기 위해서 수행한다.

액체 수확물에 존재하는 외피 바이러스를 가용화하는 것은, 단계 c) 후에 얻어진 액체 수확물에, 양이온성 세제를 포함하거나 양이온성 세제로 이루어진, 세제 또는 세제들의 혼합물을 첨가함으로써 수행한다. 양이온성 세제는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들면, 4급 암모늄 양이온, 예를 들면, 세틸트리메틸암모늄 브롬화물 또는 다른 알킬 트리메틸암모늄염, 알킬 아민염, 예를 들면, 스테아릴 아민 아세테이트 또는 코코넛 알킬 아민 아세테이트, 벤즈알코늄 염화물 및 브롬화물, 예를 들면, 벤즈에토늄 염화물 또는 메틸벤즈에토늄 염화물, 스테아릴아민폴리글리콜에테르 또는 올레일아민폴리글리콜에테르에 기초하고, 여기서, CTAB(세틸 트리메틸암모늄 브롬화물)이 바람직하다. 또한, 바람직하게 2개 이상의 세제들의 혼합물이 사용된다. 바람직하게, 세제들의 혼합물은 양이온성 및 비-이온성 세제를 포함하거나, 이들로 이루어진다. 바람직하게, 세제들의 혼합물은, 양이온성 세제, 바람직하게는 CTAB, 및 비-이온성 세제, 예를 들면, 알킬폴리에틸렌 옥사이드, 알킬 폴리글리코사이드(옥틸글리코사이드 및 데실 말토사이드 포함), 예를 들면, nonidet P10 또는 nonidet P40 계면활성제, MEGA-8, -9, 또는 -10, Triton X 100) 및 관련 세제 또는 폴리소르베이트, 예를 들면, Tween 계열의 세제, 예를 들면, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, APO-10, APO-12, C8E6, C10E6, C12E6, C12E8, C12E9, C12E10, C16E12, C16E21, 헵탄-1,2,3-트리올, 루브롤 PX, 게나폴 계열, n,-도데실-b-D-글루코피라노사이드, thesit, 플루로닉 계열, 등을 포함하거나 이들로 이루어지고; 바람직하게는 폴리소르베이트, 예를 들면, 폴리소르베이트 80이 사용된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 다중 세제들을 프리믹스(이들이 혼합물로 존재함을 의미함)로서 첨가하거나 별도로, 동시에 또는 연달아 첨가한다. 제2 세제의 첨가 이전에 제1 세제를 제거하는, 세제 교환은 수행하지 않는 것이 바람직하다.

양이온성 세제(들), 바람직하게는 CTAB의 총량, 즉, 최종 농도는 높고, 이것은 가용화 목적을 위해 전형적으로 사용되는 최종 양보다 높음을 의미한다. 따라서, 최종 농도는 약 2000㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 2500㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 3000㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 3500㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 4000㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 4500㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 5000㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 5500㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 6000㎍/ml 이상이다. 양이온성 세제(들)의 가능한 최대량은 약 8000㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 7000㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 6000㎍/ml 이상이다. 특히 바람직한 범위는 약 4000㎍/ml 내지 약 6000㎍/ml, 약 4500㎍/ml 내지 약 6000㎍/ml, 약 4000㎍/ml 내지 약 5000㎍/ml, 약 4500㎍/ml 내지 약 5000㎍/ml이다.

비-이온성 세제(들), 바람직하게는 폴리소르베이트의 총량, 즉, 최종 농도는 약 300㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 500㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 800㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 900㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 1000㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 1200㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 1400㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 1800㎍/ml 이상이다. 비-이온성 세제(들)의 바람직한 최대량은 약 4000㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 3000㎍/ml 이상, 또한 바람직하게 약 2000㎍/ml 이상이다. 특히 바람직한 범위는 약 300㎍/ml 내지 약 1500㎍/ml, 약 300㎍/ml 내지 약 1100㎍/ml, 약 900㎍/ml 내지 약 1500㎍/ml, 약 900㎍/ml 내지 약 1200㎍/ml이다.

추가의 실시형태에서, 액체 바이러스 수확물은 최종 농도 5000㎍/ml 이상의 양이온성 세제 존재시 20배 이상 감소하거나, 상기 수확물은 최종 농도 4000㎍/ml 이상의 양이온성 세제 존재시 15배 이상 감소하거나, 상기 수확물은 최종 농도 2500㎍/ml 이상의 양이온성 세제 존재시 10배 이상 감소한다.

이들 조건을 적용함으로써, 특히 생성물 회수와 관련하여 이로운 결과가 달성될 수 있다. 또한, 바이러스 증식을 위해 세포-기반 시스템이 사용되는 경우, 향상된 생성물 회수 이외에, 숙주-세포 DNA 불순물의 향상된 감소도 달성될 수 있다.

가용화는, 농축된 액체 수확물에 존재하는 본질적으로 모든, 바람직하게 모든 바이러스 입자의 가용화를 달성하기 위해 적합한 조건에서 수행될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 가용화는, 농축된 바이러스 수확물을 0℃ 이상, 바람직하게는 2 내지 25℃의 온도에서 0.2h 내지 20h, 바람직하게는 2 내지 25℃의 온도에서 0.5h 내지 6.0h, 보다 바람직하게는 2 내지 8℃의 온도에서 항온배양함으로써 수행된다.

바이러스 증식을 위해 세포-기반 시스템을 사용하는 경우, 단계 d) 이전에, 또는 모든 단계 a) 내지 f) 동안에, 뉴클레아제, 예를 들면, DNase, 예를 들면, Benzonase®를 첨가하지 않는 것이 바람직하다. 당해 분야에서, 바이러스를 포함하는 유체 또는 액체 수확물은 뉴클레아제로 및/또는 β-프로피오락톤(BPL)에 의해 및/또는 구역 초원심분리에 의해 및/또는 숙주 세포의 핵산을 분해하고/하거나 제거하기 위해 크로마토그래피 단계를 수행함으로써 처리하고, 따라서 숙주-세포 DNA 불순물이 최소화된다. 예를 들면, 인플루엔자-기초 정제 프로세스의 경우, 투여 규제를 이행하기 위해서 숙주-세포 DNA의 4로그 감소보다 자주 달성되어야만 한다. 놀랍게도, 본 발명의 방법을 적용함으로써, 뉴클레아제 처리, 예를 들면, Benzonase® 처리 없이도 투여 규제를 이행하기 위한 숙주-세포 DNA의 충분히 높은 감소가 달성될 수 있음이 발견되었다. 이것은 비용 효율성 및 시간의 관점에서 프로세스를 유의하게 향상시킨다. 또한, BPL 처리는 요구되지 않고, 필요에 따라 원하는 경우에 한정될 수 있다. 소정 실시형태에서, 단계 d) 이전에 BPL 처리는 수행되지 않고, 소정 실시형태에서, BPL 처리는 전혀 수행되지 않는다.

단계 d) 후에, 상기 조성물로부터 단계 d) 후에 얻어진 바이러스 코어를 분리하는 단계 e)가 수행될 수 있다. 바이러스 코어의 분리는, 상기 원하는 분리를 초래하는 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 한 실시형태에서, 이러한 분리 단계는 바이러스 코어를 펠렛화함으로써, 예를 들면, 초원심분리에 의해 수행된다(그러나, 바람직한 실시형태에서, 밀도 구배 초원심분리에 의한 것은 아니다). 바이러스 표면 단백질, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 (표면) 단백질, 예를 들면, HA, NA(뉴라미니다제) 또는 M 단백질은 상청에 존재하고, 최종으로 서브유닛 바이러스 백신에 도달하기위해 추가의 프로세스 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 바이러스를 펠렛화하기 위해 선택된 원심분리 조건은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들면, 초원심분리는 뱃치 방식, 또는 연속 방식 중 어느 하나일 수 있고, 사용된 초원심분리 조건은 각각 적합한 온도에서, 예를 들면, 2 내지 25℃, 보다 바람직하게는 2 내지 8℃에서 10분(min.) 초과 동안 30.000g 내지 10분 초과 동안 200.000g이다. 한 실시형태에서, 얻어진 바이러스 코어를 펠렛화하기 위한 초원심분리 조건은 2 내지 8℃의 온도 범위에서 30분 동안 100.000g이다.

추가의 실시형태에서, 단계 d) 후 및 단계 g) 이전에, 단계 d)로부터 유도된 세제를 제거할 수 있다. 이러한 세제 제거는 이러한 목적에 적합한 임의의 방법에 의해, 예를 들면, 앰버라이트 또는 TFF 처리에 의해 수행될 수 있다. 앰버라이트 처리를 이용하는 경우, 단계 e)가 수행된 후, 바람직한 실시형태에서, 바이러스 코어를 펠렛화한 후에 수집된 상청에 앰버라이트를 양이온성 세제의 질량에 대한 앰버라이트 질량비 약 100:1로 첨가하고, 적합한 온도, 예를 들면, 2 내지 8℃의 범위 내인 온도에서 적합한 시간 동안, 예를 들면, 8 내지 24시간, 적합하게는 16시간 동안 항온배양한다. 이어서, 앰버라이트는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들면, 종래 유동 여과/전량 여과(dead end filtration), 체, 또는 TFF를 사용함으로써 제거된다. 필터가 사용되는 경우, 5㎛ 보다 크거나 7㎛보다 큰 입자를 유지할 수 있는 방식으로 선택되어야만 한다. 또한, 앰버라이트는 체를 이용함으로써 제거될 수 있다. 적절한 체의 개구는 30 내지 200㎛의 범위 내이고, 바람직하게는 150㎛ 미만이고, 보다 바람직하게는 100㎛ 미만이고, 더욱 더 바람직하게는 대략 50㎛이다. 한 실시형태에서는 세제(들)을 제거하기 위해 크로마토그래피를 사용하지 않는다.

최종으로, 각각 주요 정제 단계 또는 주요 정제 방법을 나타내는 단계 g)에서, 바이러스 항원이 정제된다. 본 발명의 의미 내에서, 용어 "바이러스 항원"은 바이러스의 일부를 나타내고, 바람직하게는 외피 바이러스의 일부를 나타내고, 이는 상기 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 유도 할 수 있다. 바람직하게, 바이러스 항원은 바이러스 단백질이다. 바람직하게, 바이러스 막 단백질은 막 단백질, 예를 들면, HA, NA 또는 M 단백질이고, 바람직하게 바이러스 막 단백질은 HA 및/또는 NA이다.

바이러스 항원의 정제는, 단계 e) 후에 또는 단계 f)가 수행되는 경우에는 단계 f) 후에 얻어진 조성물로부터 바이러스 항원을 특이적으로 정제하기 위한 적합한 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 정제 방법은 정제 방법, 예를 들면, 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 의사-친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 액체-액체 크로마토그래피 등이다. 한 실시형태에서, 바람직한 정제 방법은 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피이다.

본 발명의 프로세스는 바이러스 백신 제제, 바람직하게 바이러스 백신, 보다 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 백신, 예를 들면, 서브유닛 백신을 제조하는 전체 생산 프로세스의 일부로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법을 나타내고, 여기서 상기 방법은 백신 생산, 바람직하게 인플루엔자 백신 생산에 사용된다. 생산된 백신은 서브유닛 백신일 수 있다.

본 발명은 추가로, 수득된 정제된 바이러스 항원을 약제학적 조성물로 제형화하는 추가의 단계를 추가로 포함하는, 본원에 기재된 방법을 나타내고, 여기서, 바람직하게, 상기 약제학적 조성물은 백신 제제 또는 이의 중간물이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 인플루엔자 백신이다. 이러한 추가의 단계(들)는 약제학적 조성물에 도달하기 위해 수행되어야만할 수도 있는 단계(들)이다. 이러한 단계는 예를 들면, 바이러스 불활성화 단계, 예를 들면, 조사 단계, 예를 들면, UVC 조사 단계일 수 있다. 일반적으로, 이러한 단계는, 바이러스 항원이 불활성이고 활성 오염물질 바이러스를 포함하지 않음을 확실히 한다. 미생물 오염을 최소화하기 위해, 예를 들면, 생물학적부담(bioburden) 감소 여과를 수행해야만 할 수도 있다. 또한, 예를 들면, 바이러스 항원이 바이러스 백신으로 제형화되어야만 하는 경우, 애쥬번트(들)이 소정 농도로 첨가되어야만 할 수 있다. 또한 추가의 단계는 추가의 바이러스 항원, 예를 들면, 다른 바이러스 스트레인으로부터 유도되는 바이러스 항원의 첨가일 수 있다. 또한 추가의 단계는 완충액의 첨가 및/또는 보존제의 포함일 수 있다. 또한 추가의 단계는 제거 단계 또는 멸균 여과 단계일 수 있다.

본 발명의 의미 내에서, 용어 "약제학적 조성물"은 사람 또는 동물에서 질환을 예방, 진단, 완화, 치료 또는 치유하기 위해 신체에 또는 신체 상에 사용될 수 있는 조성물을 나타낸다. 바람직하게, 이러한 약제학적 조성물은 백신 제제 또는 이의 중간 생성물, 보다 바람직하게 외피 바이러스 백신 제제, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 백신 제제(예를 들면, 계절성, 범발성 또는 유행성 인플루엔자 바이러스 백신 제제 포함)이다. 범발성 또는 유행성 인플루엔자 바이러스 백신 제제의 예로는 조류, 사람 또는 돼지 인플루엔자 바이러스 백신 제제가 있다.

본 발명은 또한 세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액으로부터 유도된 바이러스 항원을 함유하는 백신 제제를 제조하기 위한 방법의 용도로서,

나타내어진 순서대로 하기 단계들:

ii) 상기 단계 a)에서 얻어진 농축된 액체 수확물에 양이온성 세제를 포함하는 세제 또는 세제 혼합물을 첨가함으로써 액체 수확물에 존재하는 외피 바이러스를 가용화시키는 단계를 포함하고,

여기서, 상기 단계 i) 직후에 상기 단계 ii)가 이어지고,

여기서, 백신 제제 내에 존재하는 숙주-세포 DNA의 감소가 2.5로그 이상, 바람직하게 3.0로그 이상, 보다 바람직하게 3.5로그 이상인, 세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액으로부터 유도된 바이러스 항원을 함유하는 백신 제제를 제조하기 위한 방법의 용도를 나타낸다.

용어 "백신 제제", "바이러스 항원", "세포-기반", "액체 수확물", "외피 바이러스" 및 "세제"에 관하여, 본 명세서를 참조한다.

놀랍게도, 백신 제제의 제조에 상기 방법을 사용함으로써, 숙주-세포 DNA 오염이 유의하게 감소될 수 있음이 발견되었다.

바람직한 실시형태에서, 단계 i) 및 ii) 전체 명세서에 걸쳐 정의된 바와 같이 단계 c) 및 d)에 상응한다.

추가의 실시형태에서, 단계 i) 이전에 전체 명세서에 걸쳐 정의된 바와 같은 단계 a) 및 b), 및 단계 ii) 후에 전체 명세서에 걸쳐 정의된 바와 같은 단계 e) 및 f)가 수행된다.

도 1: 이 도면은 CTAB의 농축의 효과 및 전체 농축 배수, 즉, 세제 CTAB가 첨가된 후 주요 표면 항원 HA의 회수율에 대한 수확물의 최종 농도를 나타낸다. 도 1은 다수의 결과 및 그래프의 예를 나타낸다.
도 2: 이 도면은 CTAB의 농축의 효과 및 전체 농축 배수, 즉, 세제 CTAB가 첨가된 후 DNA 감소에 대한 수확물의 최종 농도를 나타낸다. 도 2는 다수의 결과 및 그래프의 예를 나타낸다.

실시예

실시예 1

이 실시예는 인플루엔자 바이러스 수확물을 최소 생성물 손실로 그리고 숙주-세포 DNA의 3로그 초과의 감소로 바이러스 표면 항원 헤마그글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)의 부분적으로 정제된 중간물로 프로세싱하는 방법을 입증한다. 얻어진 중간물은 크로마토그래피를 사용함으로써 추가로 정제될 것이다.

프로세스 단계의 일반적인 오버뷰는 하기 워크 플로우에 제공된다:

인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에서 증식시켰다. 수확물은 3220g에서 8분 동안 원심분리에 의해 청징화되었다. 100KD 내지 300kD 카세트를 이용한 TFF에 의해 청징화된 수확물을 약 4 내지 13.7배 농축시켰다. 청징화되고 농축된 수확물을, 2400 내지 3000㎍/ml의 CTAB 및 600 내지 90㎍/ml의 Tween-80을 이용하여 2 내지 8℃에서 가용화시켰다. 청징화되고 농축되고 가용화된 수확물을 2 내지 8℃에서 30분 동안 100.000g에서 원심분리하였다. 상청을 수집하였다. CTAB의 질량에 대한 앰버라이트의 질량비 100:1로, 수집된 상청에 앰버라이트를 첨가하였다. 2 내지 8℃에서 16h 동안 항온배양한 후, 5㎛ 필터를 통해 현탁액을 여과함으로써, 첨가된 앰버라이트를 제거하였다. 여과액은 바이러스 표면 항원 헤마그글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)의 부분적으로 정제된다. HA는 단일 방사상 면역 확산(SRD)에 의해 측정되었고, DNA는 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 의해 측정되었다.

그 결과는 하기에 나타낸다:

A/Urguay X-175C의 HA 회수, 8분 동안 3220g에서의 청징화, 300kDa 카세트를 이용한 10x 농축, 900㎍/ml Tween-80 및 3000㎍/ml CTAB로의 가용화, 30분 동안 100.000g에서 원심분리, 및 앰버라이트 처리된 수확물. 가용화 동안에 도입된 희석을 위해 수집된 후, 전체 농축 배수는 4x이다:

B/Malysia/2506/2004WT의 HA 회수, 청징화 조건: 2분 동안 300g, 100kDa 카세트를 이용한 4x 농축, 600㎍/ml Tween-80 및 2400㎍/ml CTAB로의 가용화, 30분 동안 100.000g에서 원심분리, 및 앰버라이트 처리된 수확물. 가용화 동안에 도입된 희석을 위해 수집된 후, 전체 농축 배수는 1.8x이다:

A/California X-179A의 HA 회수, 청징화 조건: 2분 동안 300g, 100kDa 카세트를 이용한 13.7x 농축, 가용화: 900㎍/ml Tween-80 및 3000㎍/ml CTAB, 30분 동안 100.000g에서 원심분리, 및 앰버라이트 처리된 수확물. 가용화 동안에 도입된 희석을 위해 수집된 후, 전체 농축 배수는 4.8x이다:

실시예 2

실시예 2는, 여과액의 청징화, 농축, 가용화, 앰버라이트 수확물의 HA 및 NA 항원이 이온 교환 크로마토그래피에 의해 충분히 정제될 수 있어 이의 총 단백질(TP)/100㎍ HA는 240㎍/100㎍ HA 미만이고 이의 숙주-세포 DNA는 20ng/100㎍ HA 미만임을 입증한다. NA 항원은 HA 항원과 함께 공동-정제된다.

인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에서 증식시켰다. 수확물은 300g에서 2분 동안 또는 3220g에서 8분 동안 원심분리에 의해 청징화되었다. 300kD 카세트를 이용한 TFF에 의해 청징화된 수확물을 약 10배 농축시켰다. 청징화되고 농축된 수확물을, 3000㎍/ml의 CTAB 및 900㎍/ml의 Tween-80을 이용하여 2 내지 8℃에서 가용화시켰다. 청징화되고 농축되고 가용화된 수확물을 2 내지 8℃에서 30분 동안 100.000g에서 원심분리하였다. 상청을 수집하였다. CTAB의 질량에 대한 앰버라이트의 질량비 100:1로, 수집된 상청에 앰버라이트를 첨가하였다. 2 내지 8℃에서 16h 동안 항온배양한 후, 5㎛ 심층 필터를 통해 현탁액을 여과함으로써, 첨가된 앰버라이트를 제거하였다. 여과액은 Capto® Q 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩하기 전에 조건조절되었다. 로딩 완충액으로 세척한 후, HA 및 NA 항원을 용출하였다. 통과액, 세척액 및 용출액을 분획화하였다. UV 신호에 기초하여, HA-SRD, NA, DNA, 총 단백질 분석을 위해 몇몇의 분획을 선택하였다. 그 결과를 하기에 나타낸다:

Capto Q

나타내어진 바와 같이, A/California의 HA 회수는 도전율에 의해 영향을 받았다. 도전율이 3.6 내지 4.65mS/cm의 범위 내인 경우, HA 회수는 85% 내지 92%였다. 크로마토그래피 단계의 로딩, 청징화, 농축, 가용화, 및 앰버라이트 단계의 제제의 HA 회수율을 고려하여, HA의 총 회수율은 A/California의 경우 약 80%일 수 있다. NA는 HA 항원과 함께 공동-정제되었다. 숙주-세포 DNA 및 TP의 함량은 이들의 사양을 충족시켰다.

A/Uruguay의 경우, 도전율이 pH 7.3에서 5mS/cm인 경우에 HA 회수율은 55%였다. 크로마토그래피 단계의 로딩, 청징화, 농축, 가용화, 및 앰버라이트 단계의 제제의 HA 회수율을 고려하여, HA의 총 회수율은 A/Uruguay의 경우 약 50%일 수 있다. NA 항원은 측정되지 않았다. TP의 함량은 이의 사양을 만족시켰다. 숙주-세포 DNA는 측정되지 않았다. A/California와 같이 도전율을 저하시킴으로써, A/Uruguay의 HA 회수율도 증가되는 것이 기대되었다.

실시예 3

실시예 3은, 여과액의 청징화, 농축, 가용화, 앰버라이트 수확물의 HA 및 NA 항원이 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 충분히 정제될 수 있어 이의 총 단백질/100㎍ HA는 240㎍/ml 미만이고 이의 숙주-세포 DNA 함량은 20ng/100㎍ HA 미만임을 입증한다. NA 항원은 HA 항원과 함께 공동-정제된다.

청징화되고 농축되고 가용화되고 앰버라이트 처리된 수확물의 제제는 실시예 2의 제제와 동일한 것이다. 여과액은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 컬럼 상에 로딩하기 전에 조건조절되었다.

로딩 완충액으로 세척한 후, HA 및 NA 항원을 용출하였다. 통과액, 세척액 및 용출액을 분획화하였다. UV 신호에 기초하여, HA-SRD, NA, DNA, 총 단백질 분석을 위해 몇몇의 분획을 선택하였다. 그 결과를 하기에 나타낸다:

나타내어진 바와 같이, 소수성 상호작용 크로마토그래피의 A/California의 HA 회수는 시험된 조건 하에 68% 내지 91%였다. 염 농도는 HA 회수에 영향을 미쳤다. 크로마토그래피 단계의 로딩, 청징화, 농축, 가용화, 및 앰버라이트 단계의 제제의 HA 회수율을 고려하여, HA의 총 회수율은 A/California의 경우 60 내지 80%였다. NA는 HA 항원과 함께 공동-정제되었다. 숙주-세포 DNA 및 TP의 함량은 이들의 사양을 충족시켰다.

B/Malaysia의 경우, 염 농도가 pH 7.4에서 1.5 내지 2.0M인 경우에 HA 회수율은 대략 70%였다.

크로마토그래피 단계의 로딩, 청징화, 농축, 가용화, 및 앰버라이트 단계의 제제의 HA 회수율을 고려하여, HA의 총 회수율은 B/Malaysia의 경우 60%였다. NA는 HA 항원과 함께 공동-정제되었다. 숙주-세포 DNA 및 TP의 함량은 이들의 사양을 만족시켰다.

실시예 4

방법 및 재료

인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에서 증식시켰다. 수확물은 300g에서 2분 동안 또는 3220g에서 8분 동안 원심분리에 의해 청징화되었다. 100 내지 300kDa 카세트를 이용한 TFF에 의해 청징화된 수확물을 다양한 배수로 농축시켰다. 청징화되고 농축된 수확물을, 600 내지 3000㎍/ml의 CTAB 및 300 내지 900㎍/ml의 Tween-80을 이용하여 2 내지 8℃에서 가용화시켰다. 청징화되고 농축되고 가용화된 수확물을 2 내지 8℃에서 30분 동안 100.000g에서 원심분리하였다. 상청을 수집하였다. CTAB의 질량에 대한 앰버라이트의 질량비 100:1로, 수집된 상청에 앰버라이트를 첨가하였다. 2 내지 8℃에서 16h 동안 항온배양한 후, 5㎛ 심층 필터를 통해 현탁액을 여과함으로써, 첨가된 앰버라이트를 제거하였다. HA-SRD(단일 방사상 면역확산 검정)을 위해 여과액을 측정하였고, NA, DNA, 및 총 단백질 분석을 수행하였다.

실시예 4.1

이 실시예는, 고농축 배수 및 고농도의 양이온성 세제의 조합이 항원의 회수 및 숙주-세포 DNA의 제거 둘 다를 위해 바람직함을 입증한다. 사용된 스트레인은 B/Brisbane이었다. 청징화 및 농축 후, 수확물은 다양한 조건에서 세제의 존재하에 항온배양하였다. 세제의 농도, 항온배양 시간, 및 농축 배수는 변하였다. CTAB의 농축 효과 및 주요 표면 항원 HA의 회수 및 DNA 감소에 대한 농축 배수는 도 1 및 도 2에 나타내었다. 나타내어질 수 있는 바와 같이, 양이온성 세제의 농도 및 농축 배수의 증가는 생성물의 회수(도 1) 및 숙주-세포 DNA의 감소(도 2) 둘 다를 위해 이롭다.

실시예 4.2

이 실시예는, 3000㎍/ml의 CTAB 및 900㎍/ml의 Tween-80을 사용함으로써, 이어서 30분 동안 100.000g에서의 원심분리에 의해, B/Florida/4/2006의 높은 생성물 회수율 및 숙주 세포 DNA의 유의한 감소 둘 다가 실현될 수 있음을 입증한다.

실시예 4.3

이 실시예는, 3000㎍/ml의 CTAB 및 900㎍/ml의 Tween-80을 사용함으로써, 이어서 30분 동안 100.000g에서의 원심분리에 의해, A/Wisconsin의 높은 생성물 회수율 및 숙주 세포 DNA의 유의한 감소 둘 다가 실현될 수 있음을 입증한다.

실시예 4.4

이 실시예는, 3000㎍/ml의 CTAB 및 900㎍/ml의 Tween-80을 사용함으로써, 이어서 30분 동안 100.000g에서의 원심분리에 의해, A/Victoria의 높은 생성물 회수율 및 숙주 세포 DNA의 유의한 감소 둘 다가 실현될 수 있음을 입증한다.

실시예 4.5

이 실시예는, 3000㎍/ml의 CTAB 및 900㎍/ml의 Tween-80을 사용함으로써, 이어서 30분 동안 100.000g에서의 원심분리에 의해, A/California의 높은 생성물 회수율 및 숙주 세포 DNA의 유의한 감소 둘 다가 실현될 수 있음을 입증한다.

Claims

외피 바이러스로부터 유도되는 바이러스 항원을 생산하는 방법으로서,
나타내어진 순서대로 하기 단계들:
a) 외피 바이러스를 포함하는 유체를 제공하는 단계,
b) 상기 외피 바이러스를 포함하는 유체를 청징화시켜 상기 외피 바이러스를 포함하는 액체 수확물을 얻는 단계,
c) 상기 단계 b) 후에 얻어진 액체 수확물의 용적을 감소시켜 농축된 액체 수확물을 얻는 단계,
d) 상기 단계 c)에서 얻어진 농축된 액체 수확물에 양이온성 세제를 포함하는 세제 또는 세제 혼합물을 첨가함으로써 액체 수확물에 존재하는 외피 바이러스를 가용화시키는 단계,
e) 상기 단계 d) 후에 얻어진 조성물로부터 바이러스 코어를 분리하는 단계, 및
f) 임의로 상기 단계 e) 후에 얻어진 조성물로부터 양이온성 세제를 제거하는 단계,
및
g) 바이러스 항원을 정제하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 단계 c) 직후에 상기 단계 d)가 이어지는,
외피 바이러스로부터 유도되는 바이러스 항원을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 d) 이전에, 외피 바이러스를 특이적으로 정제하는 것을 유도하는 정제 단계를 수행하지 않는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 g)에서 수행되는 크로마토그래피 단계만을 수행하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d) 이전에, 밀도 구배 초원심분리 및/또는 크로마토그래피를 수행하지 않는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 단계 및/또는 바이러스 제거 단계를 수행하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 c)에서의 용적이 4배 이상, 바람직하게는 5배 이상 감소하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 세제의 최종 농도가 2000㎍/ml 이상인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 세제가 4급 암모늄 양이온에 기초한, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b) 직후에 상기 단계 c)가 이어지고, 그 직후에 상기 단계 d)가 이어지는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세제 교환이 발생하지 않는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d) 이전에, 뉴클레아제 또는 다른 DNA 소화 효소를 첨가하지 않고, 바람직하게는 프로세스의 어느 단계에서도 뉴클레아제를 첨가하지 않는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외피 바이러스가, 외피 RNA 바이러스, 외피 DNA 바이러스 또는 외피 레트로바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서, 상기 외피 RNA 바이러스는 플라비바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, 간염 D 바이러스, 필로바이러스, 라브도바이러스, 분야바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스 및 아레나바이러스를 포함하고, 상기 외피 DNA 바이러스는 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스를 포함하고, 바람직하게는 상기 외피 바이러스가, 외피 RNA 바이러스로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 외피 바이러스가 오르토믹소바이러스이고, 가장 바람직하게는 인플루엔자 바이러스, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 A, B 또는 C인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a)의 유체가, 세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액 또는 유정란-기반 외피 바이러스 증식 배양액으로부터 유도되는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액이 포유동물 세포주의 세포, 바람직하게 동물 세포주의 세포를 포함하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 세포가 부착 세포로서 배양되는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 유정란-기반 외피 바이러스 증식 배양액이 계란을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a)의 유체가, 일회용 생물반응기를 사용함으로써 생산되는, 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)가, 원심분리, 접선 유동 여과 및 심층 여과로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법을 적용함으로써 수행되는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 c)가, 접선 유동 여과, 초원심분리 및 침전으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법을 적용함으로써 수행되는, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 e)가, 초원심분리 및 접선 유동 여과로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법을 적용함으로써 수행되는, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 g)가, 크로마토그래피를 적용함으로써 수행되고, 바람직하게는 상기 크로마토그래피가, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 외피 바이러스의 일부이고, 바람직하게는 상기 바이러스 항원이 바이러스 단백질인, 방법.
제22항에 있어서, 상기 바이러스 단백질이 인플루엔자 바이러스 유래의 HA 및/또는 NA인, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 바이러스 항원을 약제학적 조성물로 제형화하는 추가의 단계를 포함하는, 방법.
제24항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 백신 제제 또는 이의 중간물이고, 바람직하게는 상기 약제학적 조성물이 인플루엔자 백신인, 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 g)가, 25℃를 기준으로 하는 경우, 도전율이 3.0 이상 내지 5.0mS/cm 미만, 바람직하게는 3.5 이상 내지 4.7mS/cm 이하의 범위, 더욱 더 바람직하게는 3.6 이상 내지 4.65mS/cm 이하의 범위 내인 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 g)가, 25℃를 기준으로 하는 경우, 몰 농도가 1.0M 이상 내지 3.5M 이하의 범위, 바람직하게는 1.0M 이상 내지 3.0M 이하의 범위, 보다 바람직하게는 1.5M 이상 내지 3.0M 이하의 범위, 더욱 더 바람직하게는 1.5M 이상 내지 2.6M 이하의 범위 내인 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액으로부터 유도된 바이러스 항원을 함유하는 백신 제제를 제조하기 위한 방법의 용도로서,
나타내어진 순서대로 하기 단계들:
i) 세포-기반 외피 바이러스 증식 배양액으로부터 얻어진 외피 바이러스를 함유하는 액체 수확물의 용적을 감소시키는 단계, 및
ii) 상기 단계 i)에서 얻어진 농축된 액체 수확물에 양이온성 세제를 포함하는 세제 또는 세제 혼합물을 첨가함으로써 액체 수확물에 존재하는 외피 바이러스를 가용화시키는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 단계 i) 직후에 상기 단계 ii)가 이어지고,
이로써 백신 제제 내에 존재하는 숙주-세포 DNA의 감소가 2.5로그 이상인, 용도.