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KR20140069172A - 항­ｃｄ １３４（ｏｘ４０） 및 이의 용도 - Google Patents

항­ｃｄ １３４（ｏｘ４０） 및 이의 용도 Download PDF

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KR20140069172A
KR20140069172A KR1020147010124A KR20147010124A KR20140069172A KR 20140069172 A KR20140069172 A KR 20140069172A KR 1020147010124 A KR1020147010124 A KR 1020147010124A KR 20147010124 A KR20147010124 A KR 20147010124A KR 20140069172 A KR20140069172 A KR 20140069172A
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KR
South Korea
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human
antibody
binding
amino acid
ser
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Abandoned
Application number
KR1020147010124A
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English (en)
Inventor
페트루스 요하네스 시몬스
루이스 분
Original Assignee
바이오서오엑스 프로덕스 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44937444&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20140069172(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 바이오서오엑스 프로덕스 비.브이. filed Critical 바이오서오엑스 프로덕스 비.브이.
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Abstract

본 발명은 인간 CD134에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항-인간 CD134 항체는, 인간 CD134의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 이에는 인간 CD134 상에서의 비-OX40 리간드 (OX40L) 결합 도메인이 포함되며, 이는 예로서 통상의 활성화된 인간 이펙터 CD4 및/또는 CD8 T 림프구 (Teff) 및 활성화된 인간 억제 조절성 CD4 T 림프구 (Tregs) 상에서 발현된다. 본 발명의 항-인간 CD134 항체는 (예로서, Teff 항암 이펙터 기능에 힘을 부여 및/또는 Treg 억제 기능을 저해하여) 암치료에 유용하다.

Description

항­ＣＤ １３４（ＯＸ４０） 및 이의 용도{ANTI-CD134(OX40) ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 항체(antibodies), 상기 항체의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 암(cancer)의 치료용으로서의 CD134에 결합하는 항체에 관한 것이다.
항-종양(anti-tumour) T-세포 기능의 향상은 암의 치료를 위한 독특한 접근법으로 대표된다. 종양 세포(tumour cells)가 조절성 T 림프구(regulatory T 림프구s)에 의해 주로 매개되는 활성 면역 관용(active immune tolerance)에 의하여 면역계를 '탈출(escape)'한다는 주요한 증거가 있다(Treg; Quezda 등. Immunol Rev 2011; 241:104-118). 그러므로, 이펙터(effector)(즉, 종양 세포의 직접 또는 간접적 소거) T 림프구(Teff) 및 관용원성(tolerogenic)(즉, Teff 이펙터 기능 및 생존의 억제) Treg 간의 균형이 효과적인 항-종양 면역 치료에서 중요할 것으로 여겨진다. 즉, 효과적인 항-종양 면역 응답은 종양-특이적 Teff의 이펙터 기능 향상 및/또는 종양-특이적 Treg의 억제 기능 약화에 의하여 얻어질 수 있다. 이러한 응답을 매개하는 것으로 알려진 주요한 수용체(receptor)는 CD134(OX40) 수용체이다(Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431).
CD134(또한, OX40, TNFRSF4, 및 ACT35로 알려짐)는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(tumour necrosis factor receptor superfamily)의 구성원이다. CD134 표면 동시-자극 수용체(surface co-stimulatory receptor)는 활성화된 T 림프구 상에서 발현되고, 이의 생존 및 기능에 중요한 역할을 담당한다. CD134를 발현하는 T 림프구의 존재는 여러 가지 인간 악성 종양 및 암 환자의 드레이닝 림프절(draining lymph nodes)에서 알려져 있다(Ramstad 등. Am J Surg 2000; 179: 400-406; Vetto 등 Am J Surg 1997; 174: 258-265).
종양을 가진 마우스에서 (항-마우스 CD134 특이적 항체와 같은 가용성 마우스 OX40 리간드(OX40L)-면역글로불린 융합 단백질 또는 마우스 OX40L 모방체(mimetics)에 의한) 마우스 CD134 수용체의 생체 내 라이게이션(in vivo ligation)은 항-종양 면역성을 향상시키고, 예를 들어, 림프종(lymphoma), 흑색종(melanoma), 육종(sarcoma), 직장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 및 교종(glioma)과 같은 다양한 뮤린 악성 종양 세포주의 마우스 모델에서 무-종양(tumour-free) 생존을 이끈다(Sugamura 등. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431).
OX40R 결합제(binding agent)의 사용을 통해 OX40R를 조절함으로써 항원에 대한 포유 동물의 면역 응답을 향상시키는 것이 제안되었다(WO 99/42585; Weinberg, 2000). 상기 문헌은 일반적으로 OX40 결합제에 관한 것이지만, OX40L 또는 이의 부분의 사용을 강조하고 있다; 항-OX40 항체의 개시는 맥락상 OX40L에 해당한다. 더구나, Weinberg 팀이 상기 연구를 비-인간 영장류를 이용한 연구로 전환했을 때, 그들은 OX40L-결합 위치에 결합하고, 일반적으로 OX40L을 모방하는 항체를 의도적으로 다시 선택하였다.
Al-Shamkhani 등(Eur J Chem 1996; 26: 1695-1699)은, 활성화된 마우스 T-세포에서 OX40의 발현 양상의 차이를 확인하기 위하여, OX40L-결합을 차단하지 않는, OX86으로 명명되는, 항-OX40 항체를 사용하였고, Hirschhorn-Cymerman 등(J Exp Med 2009; 206: 1103-1116)은 마우스 모델에서 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)와 함께 OX86을 강력한 면역화학치료제로서 사용하였다. 그러나, OX86은 인간 OX40와 결합할 것으로 기대되지 않고, 인간에 효과적인 항체를 선별한 때, 당업자는 Weinberg 연구의 견지에서, OX40L-결합 위치에 결합하는 항체를 선택할 것이다.
SCID(severe combined immunodeficient) 마우스에서 (인간 CD134 상의 OX40L 결합 영역과 상호작용하는 항-인간 CD134-특이적 항체; US 2009/0214560에 의한) 인간 CD134 수용체의 생체 내 라이게이션은 항-종양 면역성을 향상시키고, 예를 들어, 림프종, 전립선암(prostate cancer), 직장암, 및 유방암과 같은 여러 가지 인간 악성 종양 세포주의 종양 성장 억제를 이끈다.
인간에서 인간 CD134 라이게이션-매개 항-종양 면역 응답의 정확한 기전은 여전히 명확하지 않지만, OX40L과의 상호작용에 의하여 자극되는 CD134 트랜스멤브레인(transmembrane) 신호 전달 경로를 통하여 매개되는 것으로 생각된다. 이러한 상호작용은 삼량체(trimeric) OX40L의 CD134로의 결합에 의하여 매개된다. 현재의 항암 치료에 있어서, 삼량체 OX40 리간드의 사용이 항-OX40 항체보다 효과적인 제제로 제안된다(Morris 등. Mol Immunol 2007; 44: 3112-3121).
발명의 개요
본 발명의 발명자들은, T-세포 매개 항-종양 활성을 유도하기 위하여, 인간 CD134에 결합하며, 인간 CD134(CD134) 수용체가 OX40 리간드(OX40L)에 결합하는 것을 차단하지 않는, 분리된 결합 분자(binding molecules)의 사용이 T-이펙터 세포의 면역자극제(immunostimulator)/이펙터 기능의 향상 및/또는 이러한 세포의 증식 및/또는 T-조절 세포의 면역억제 기능의 하향-조절로 특징되는 향상된 면역 응답을 이끌 수 있다는 놀라운 점을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 인간 CD134에 결합하며, 인간 CD134(CD134) 수용체가 OX40 리간드(OX40L)에 결합하는 것을 차단하지 않는, 분리된 결합 분자를 제공한다.
상기 결합 분자는 적절한 항-CD134 항체, 상기 항-CD134 항체의 항원-결합 단편, 및 상기 항-CD134 항체의 유도체를 포함한다. 하나의 구체예로서, 상기 결합 분자는 1 × 10-7 M 또는 그 미만의 K d 를 갖는 인간 CD134에 결합한다. 상기 결합 분자는 T-이펙터 세포 상의 인간 CD134에 대한 효능제(agonist) 활성 및/또는 T-조절 세포 상의 인간 CD134에 대한 길항제(antagonist) 활성을 가진다. 다른 하나의 구체예로서, 상기 결합 분자는 100 nM 또는 그 미만, 바람직하게는 50 nM 미만, 보다 바람직하게는 20 nM 미만의 K d 를 갖는 인간 CD134에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체이다.
또한, 본 발명은 상기 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체의 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 구체예로서, 상기 결합 분자는 인간 모노클로날 항-CD134 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 상기 조성물에는 면역치료제(immunotherapeutic agents), 화학요법치료제(chemotherapeutic agents), 및 호르몬치료제(hormonal therapeutic agents)와 같은 추가적인 약학적 제제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 결합 분자를 사용하는 진단 방법 및 치료 방법을 제공한다. 하나의 구체예로서, 본 발명은 본 발명에서 설명되는 결합 분자 또는 상기 결합 분자를 포함하는 조성물을 치료적으로 효과적인 양으로 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는 포유 동물에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 결합 분자 또는 상기 결합 분자를 포함하는 조성물을 치료적으로 효과적인 양으로 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는 포유 동물에서 면역 응답을 향상시키는 방법을 제공한다. 특별한 구체예로서, 상기 방법에서 사용되는 결합 분자는 인간 CD134에 결합하는 인간 모노클로날 항-CD134 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 상기 항체는 인간 CD134(OX40) 수용체가 OX40 리간드(OX40L)에 결합하는 것을 차단하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 결합 분자의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 상기 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 특허청구범위를 포함하는 명세서 전체의 기재 사항으로부터 명백하게 되는 다른 측면들을 제공한다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고하여 설명된다.
도 1은 PHA-M의 노출이 인간 T 림프구의 표면 인간 CD134 발현 상의 시간 및 농도별 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 휴지 상태 및 PHA-M 활성화된 인간 CD4 T 세포의 인간 CD134 발현을 나타낸 것이다.
도 3은 PHA-M로 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에 대한 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 ACT35, 클론 12H3, 및 클론 20E5의 결합 특성을 나타낸 것이다.
도 4는 PHA-M로 자극된 인간 CD134 발현 CD4 T 림프구 및 CD8 T 림프구에 대한 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 클론 20E5의 결합을 나타낸 것이다.
도 5는 PHA-M로 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에 대한 비-표지된 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 또는 클론 20E5와 PE-컨쥬게이트된 상업적으로 입수가능한 마우스 항-CD134 항체 클론 ACT35 또는 클론 L106의 교차-경쟁을 나타낸 것이다.
도 6은 PHA-M로 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에 대한 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 또는 클론 20E5와 인간 OX40L의 동시 결합을 나타낸다.
도 7은 항-인간 CD3/항-인간 CD28 항체 자극 인자(stimulator) 비드의 노출에 대한 인간 이펙터 T 림프구(Teff) 및 조절 T 림프구(Treg)의 표면 인간 CD134 발현의 시간 경과별 효과를 나타낸다.
도 8은 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 또는 클론 20E5, 또는 인간 OX40L의 농도별 노출에 따른 PHA-M로 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구의 증식 효과를 나타낸다.
도 9는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3과 인간 OX40L, 또는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5와 인간 OX40L의 조합에 따른 PHA-M로 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구의 증식 효과를 나타낸다.
도 10은 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 또는 클론 20E5, 또는 인간 OX40L의 노출에 따른 항-인간 CD3/항-인간 CD28 항체 자극 인자 비드로 자극된 인간 CD134 발현 이펙터 T 림프구의 증식 효과를 나타낸다.
도 11은 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 또는 클론 20E5, 또는 인간 OX40L의 노출에 따른 항-인간 CD3/항-인간 CD28 항체 자극 인자 비드로 자극된 인간 CD134 발현 조절 T 림프구의 증식 효과를 나타낸다.
도 12는 항-인간 CD3/항-인간 CD28 항체 자극 인자 비드로 자극된 인간 CD134 발현 인간 이펙터(A) 및 조절(B) T 림프구의 인간 OX40L-매개 증식에 대한 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3의 효과를 나타낸다.
도 13은 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 또는 클론 20E5, 또는 인간 OX40L의 노출에 따른 인간 CD134 발현 인간 이펙터 T 림프구 증식의 인간 CD134 발현 인간 조절 T 림프구-매개 억제의 효과를 나타낸다.
도 14는 (IL-2 마이너스 및 플러스 별로) CD3/CD28 비드로 자극된 인간 CD134 발현 CD4 T 림프구 및 CD8 T 림프구 상의 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5의 결합을 나타낸다.
도 15는 PHA-M으로 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구 상의 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 또는 인간 OX40L의 결합을 나타낸다.
도 16은 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 또는 인간 OX40L의 농도별 노출에 따른 PHA-M으로 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구의 증식 효과를 나타낸다.
도 17은 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5와 인간 OX40L의 조합에 따른 PHA-M로 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구의 증식 효과를 나타낸다.
도 18은 (IL-2 마이너스 및 플러스 별로) CD3/CD28 비드로 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구의 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 또는 인간 OX40L에 의한 증식 효과를 나타낸다.
도 19는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5와 비환원 및 환원된 재조합 인간 CD134: 인간 Fcγ 융합 단백질의 결합을 나타낸다. (A) 실시된 비환원(a, b) 및 환원(c, d) 조건. (B) 쿠마씨 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) 염색을 사용한 비환원(a, b) 및 환원(c, d) 조건하에서 재조합 인간 CD134: 인간 Fcγ 융합 단백질(rhuCD134)의 전기영동 이동 패턴. (C) 마우스 IgG1κ 이소타입 대조군 항체(mIgG1) 또는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5(각각 m12H3 및 m20E5)에 노출된 비환원(a, b) 및 환원(c, d) 재조합 인간 CD134: 인간 Fcγ 융합 단백질의 웨스턴 블롯.
도 20은 전장 인간 CD134의 시스테인-리치 도메인(CDR)('CDR1'으로 표시) 및 다양하게 절단된(truncated) 인간 CD134 형태('CDR2', 'CDR3', 'CDR4', 및 'tcCDR4'로 표시)를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 21은 전장 인간 CD134 구축물('CDR1'으로 표시) 또는 다양하게 절단된 인간 CD134 구축물('CDR2', 'CDR3', 'CDR4', 및 'tcCDR4'로 표시)로 일시적으로 트랜스팩션된 293-F 세포주에 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5의 결합을 나타낸다.
도 22는 전장 인간 CD134 구축물('CDR1'으로 표시) 또는 다양하게 절단된 인간 CD134 구축물('CDR2', 'CDR3', 'CDR4', 및 'tcCDR4'로 표시)로 일시적으로 트랜스팩션된 293-F 세포주에 키메릭 인간 IgG4κ 및/또는 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 또는 20E5의 결합을 나타낸다.
도 23은 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 (A) 및 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 (B)와 (Latza 등. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683의 정의에 따른) 절단된 CDR3 A1-모듈-CDR4 서브도메인 A1-모듈의 아미노산 서열에 상응하는 인간 CD134-유래 펩타이드의 결합을 나타낸다.
T-세포 활성은 T-세포 수용체를 통한 항원 자극뿐만 아니라, 동시-자극 분자를 통한 동시-자극 신호에 의하여 매개된다. 몇몇 동시-자극 분자 중에서, 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리 멤머인 OX40(CD134)는 에펙터 및 메모리 T-세포의 생존 및 항상성에 중요한 역할을 한다. OX40 동시-자극의 종래 이해에 따르면, OX40과 OX40 리간드(OX40L) 간의 상호 작용은 활성화된 T-세포가 APCs(professional antigen-presenting cells)에 결합할 때 발생한다. 다음으로, 사이토카인 생산, 증식, 및 생존을 포함하는 T-세포 기능은 OX40 동시-자극 신호에 의하여 향상된다. OX40과 OX40L 간의 상호 작용은 항원 인식 후 2-3일 후인 T-세포-DC(dendritic cell) 상호작용 동안 발생한다. 또한, OX40-발현 T-세포는 DCs와는 다른 OX40L-발현 세포와 상호 작용할 수 있고, 그 세포로부터 OX40 신호를 받아서 메모리 T-세포의 생성, Th2 응답의 향상, 및 염증 반응의 지속을 위한 필수적인 신호를 제공할 수 있다. 따라서, OX40과 OX40L 간의 최적의 상호 작용은 다음의 두 단계로 형성될 수 있다: 활성화된 CD4 T-세포 상에서 발현된 OX40L가 다른 응답자 CD4 T-세포 상에서 발현된 OX40와 상호 작용하여, 메모리 CD4 T-세포의 최적 생산을 유도하거나(Soroosh et al., 2006) 또는 CD4+ 부세포(accessoty cells) 상에 발현된 OX40L가 Th2 세포 상에서 OX40와 상호 작용하여 Th2 세포 생존을 촉진시킬 수 있다(Kim 등 2003). 추가적으로, B 세포 상에서 OX40L의 발현은 Th1 분화가 아니라 생체 내에서 Th2 분화에 필요하고(Linton 등. 2003), OX40L-발현 비만 세포(mast cell)는 비만 세포 상에서 OX40L과 T-세포상에서 OX40 간의 상호 작용을 통하여 이펙터 T-세포 기능을 직접적으로 향상시킨다(Kashiwakura 등. J Immunol 2004; 173: 5247-5257; Nakae 등. J Immunol 2006; 176: 2238-2248). 추가적으로, 내피 세포(endothelial cells)가 OX40L을 발현할 때(Imura 등. 1996), 내피 세포에 결합하는 OX40은 혈관 염증과 관련될 수 있다. 응답자 T-세포 및 T-조절 세포 양자에 대한 과다한 OX40 신호는 Treg-매개 면역 억제를 억제한다. 응답자 T-세포로 통과된 OX40 신호는 세포가 Treg-매개 억제에 저항하는 것을 돕는다. 한편, Treg 세포로 통과된 OX40 신호는, OX40 신호가 Treg 세포에서 Foxp3 발현량을 조절할 수 있는지에 대한 논란이 존재하지만, Treg-억제 기능을 직접적으로 저해한다. 추가적으로, 의도된 OX40 자극은 iTreg 세포(유도 Treg 세포)의 TGF-β-의존적 분화를 저해한다. 상기 저해는 OX40로 자극된 이펙터 T-세포에 의하여 생산된 IL-4 및 IFN-γ와 같은 이펙터 사이토카인에 의하여 부분적으로 매개될 수 있다. 중요하게, OX40L의 차단은 Treg 세포에 의하여 매개될 수 있는 iTreg 분화를 촉진시키고, 이식 관용(graft tolerance)을 유도한다. 그러므로, OX40은 T-세포로 매개되는 자가면역을 조절하기 위한 가능한 분자 타겟이다. 나아가, 최근의 연구는, 비만 세포에 의하여 발현되는 OX40L 및 Treg 세포에 의하여 발현되는 OX40 간의 상호 작용은 비만 세포 기능과 Treg 세포 억제 기능을 상호적으로 억제할 수 있음을 보고한다(Gri 등. 2008; Piconese 등. 2009).
마우스는 면역학자들에 의해 선택되는 실험적 도구이고, 이들의 면역 응답에 대한 연구는 인간 면역 시스템의 동작에 대한 커다란 시야를 제공한다. 마우스 및 인간 시스템의 일반적 구조는 상당히 유사하지만, 또한 중요한 차이가 존재한다. 예를 들어, 마우스에서, CD134는 Teff가 활성화될 때 발현되나, Treg는 CD134를 연속적으로 발현한다(Piconese 등. J Exp Med 2008; 205: 825-839). 인간에서, CD134는, 활성화되는 경우에만, Teff 및 Treg 모두에서 발현된다(예를 들어, 실시예 2(g), '항-인간 CD3/항-인간 CD28 항체 자극 인자 비드에 의한 자극 후 인간 이펙터 및 조절 T 림프구 상의 CD134 발현' 참고). 나아가, 마우스 Treg는 억제에 도달하기 위하여 마우스 Teff의 세포사멸(apoptosis)을 유도하지만(Pandiyan 등. Nat Immunol 2007; 8: 1353; Scheffold 등. Nat Immunol 2007; 8: 1285-1287), 인간 Treg는 억제에 도달하기 위하여 인간 Teff의 세포사멸을 유도하지 않는다(Vercoulen 등. Plos ONE 2009; 4: e7183). 종합하면, 이러한 결과들은 인간과 마우스 면역 시스템 간의 Treg 억제 기능에서 CD134의 역할이 다름을 보여준다.
용어 "결합 분자"는, 본 발명에서 정의된 바와 같이, (1) 항체, (2) 항체의 항원-결합 단편, 및 (3) 항체의 유도체를 포함한다. 용어 "CD134에 결합한다" 또는 "CD134에 결합"은, 본 발명에서 정의된 바와 같이, BIAcore assay 또는 Octet (surface plasmon resonance)에 의한 시험관 내 에세이(in vitro assay)에서 CD134 수용체로의 결합 분자의 결합을 의미한다. 상기 결합 분자는 바람직하게는 1 × 10-6 M 또는 그 미만, 보다 바람직하게는 50 × 10-7 M 미만, 보다 더 바람직하게는 1 × 10-7 M 미만의 결합 친화도(K d )를 가진다.
용어 "분리된 항체" 또는 "분리된 결합 분자"는 (1) 그것의 원래의 상태(native state)에서 그것을 동반하는 자연적으로 연관된 성분들과 연관되지 않거나, (2) 동일 종으로부터의 다른 단백질이 존재하지 않거나, (3) 다른 종으로부터의 세포에 의하여 발현되거나, 또는 (4) 자연적으로 발생되지 않는 항체 또는 결합 분자를 나타낸다. 분리된 항체의 실시예는 CD134를 사용하여 정제된 항-CD134 항체, 하이브리도마 또는 다른 세포주로부터 생성된 항-CD134 항체, 및 형질전환 동물로부터 유래된 인간 항-CD134 항체를 포함한다.
용어 "효능제"는, 본 발명에서 정의된 바와 같이, CD134에 결합할 때, (1) CD134를 자극 또는 활성화하거나, (2) CD134의 활성, 존재 또는 기능을 향상, 촉진, 유도, 증가 또는 지속시키거나, 또는 (3) CD134의 발현을 향상, 촉진, 증가 EH는 유도하는 결합 분자를 나타낸다. 용어 "길항제"는, 본 발명에서 정의된 바와 같이, CD134에 결합할 때, (1) CD134를 저해 또는 억제하거나, (2) CD134의 활성, 존재 또는 기능을 저해 또는 억제하거나, 또는 (3) CD134의 발현을 저해 또는 억제하는 결합 분자를 나타낸다.
용어 "항체"는 각 쌍이 하나의 "중"(H)쇄 및 하나의 "경"(L)쇄를 갖는, 폴리펩타이드 쇄의 동일한 두 개의 쌍을 포함하는 면역글로블린 분자를 나타낸다. 인간 경쇄는 카파(κ) 및 람다(λ)로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE와 같은 이소타입으로 정의된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 발명에서 HCVR 또는 VH로 표시) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. IgD, IgG, 및 IgA의 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인인 CH1, CH2, 및 CH3를 포함하고, IgM 및 IgE의 중쇄 불변 영역은 네 개의 도메인인 CH1, CH2, CH3, 및 CH4를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 발명에서 LCVR 또는 VL로 표시) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 한 개의 도메인 CL을 포함한다. 상기 항체의 불변 영역은 면역글로블린을 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 명명되는 보다 보존된 영역들 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 배열된 세 개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 각각의 중/경쇄 쌍(VH 및 VL)의 가변 영역은 항체 결합 위치를 각각 형성한다. 각각의 영역 또는 도메인의 아미노산의 할당은 Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991))의 Kabat Sequences의 정의 또는 Conformations of immunoglobulin hypervariable regions(Nature 1989; 342(6252):877-83)의 Chothia 등의 정의에 따른다. 용어 "항체"는 단량체 항체의 이량체, 삼량체, 또는 고차 다량체와 같은 다량체 형태의 항체를 포함한다. 또한, 비-항체 부분에 연결 또는 부착된 항체를 포함한다. 나아가, 용어 "항체"는 항체를 생산하는 특정한 방법에 의하여 제한되지 않는다. 예를 들어, 모노클로날 항체, 재조합 항체 및 폴리클로날 항체를 포함한다.
용어 "항체 유도체" 또는 항체의 "유도체"는 항체가 결합하는 동일한 항원(즉, 인간 CD134)에 결합할 수 있고, 추가적인 분자 독립체에 연결된 항체의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체 유도체에 포함된 상기 항체의 아미노산 서열은 전장 항체일 수 있거나, 또는 전장 항체의 특정 부분 또는 부분들일 수 있다. 상기 추가적인 분자 독립체는 생물학적 또는 화학적 분자일 수 있다. 추가적인 분자 독립체의 예는 화학적 잔기, 펩타이드, (효소, 항체와 같은) 단백질, 아미노산, 및 화학적 화합물을 포함한다. 상기 추가적인 분자 독립체는 검출제(detection agent), 마커 라벨, 치료적 또는 약학적 제제로서 사용될 수 있다. 항체의 상기 아미노산 서열은 비-공유결합, 화학적 커플링, 유전공학적 융합, 또는 다른 방법들에 의하여 상기 추가적인 분자 독립체에 부착되거나 연결될 수 있다. 또한, 용어 "항체 유도체"는 키메릭 항체, 인간화 항체, 및 보존된 아미노산 치환, 삽입 및 첨가와 같은 CD134 항체의 아미노산 서열의 수식으로부터 유래된 분자를 포함한다.
용어 항체의 "항원-결합 단편"은 항체가 결합하는 동일한 항원(즉, 인간 CD134)에 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체의 하나 이상의 부분들을 나타낸다. 또한, 용어 "항원-결합 단편"은 비-공유 또는 공유적 연관에 의하여 형성된 거대 분자 또는 하나 이상의 추가적인 분자 독립체를 가진 항체 일부분의 부분인 항체의 일부분을 포함한다. 추가적인 분자 독립체의 예는 사량체 scFv 분자를 제조하는데 사용될 수 있는 스트렙트아비딘 코어 영역과 같은 아미노산, 펩타이드, 또는 단백질을 포함한다(Kipriyanov 등. Hum Antibodies Hybridomas 1995; 6(3): 93-101).
용어 "키메릭 항체"는 두 개 이상의 다른 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 의미한다. 상기 두 개 이상의 다른 항체는 동일 종 또는 두 개 이상의 다른 종으로부터 유래될 수 있다.
용어 "에피토프(epitope)"는 항체, 또는 T-세포 수용체 또는 어떤 분자와 상호작용하는 다른 것과 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부분을 의미한다. 또한, "에피토프"는 "항원결정기(antigenic determinant)"와 같이 종래 기술에서 언급된다. 일반적으로 에피토프는 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 곁사슬과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 잔기로 구성된다. 에피토프는 "선형" 또는 "비선형/입체배좌성(conformational)"일 수 있다. 일단, (예를 들어, 에피토프 맵핑에 의하여) 원하는 에피토프가 결정되면, 상기 에피토프에 대한 항체는 생성될 수 있다. 또한, 항체의 생성 및 특성은 원하는 에피토프에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 정보로부터, 예를 들어, 서로와 경쟁적으로 결합하는 항체(즉, 항체들은 항원에 결합하기 위하여 경쟁함)를 발견하기 위한 교차-경쟁 연구를 도입함으로써 동일한 에피토프에 결합하는 것들을 대한 항체를 스크리닝할 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입되는 세포를 의미한다. 상기 용어는 특정 대상의 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손도 포함한다. 어떠한 수식은 환경적인 영향 또는 돌연변이에 기인하여 연속적인 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 모세포와 동등하지는 않지만, 여전히 용어 "숙주 세포"의 범위에 포함된다.
용어, "인간 항체"는 인간 면역글로블린 서열만의 아미노산 서열로 구성되는 항체를 의미한다. 인간 항체는, 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 세포 기원의 하이브리도마에서 생산된다면, 뮤린 탄수화물 쇄를 포함할 수 있다. 인간 항체는 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 인간 항체 서열 유래의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 의미한다. 인간화 항체는 비-인간 동물 항체 기원의 CDR의 부분 또는 전체를 포함할 수 있으나, 상기 항체의 프레임워크 및 불변 영역은 인간 항체 서열 유래의 아미노산 잔기를 포함한다.
용어 "포유 동물"은 포유동물강(mammalian class)의 어떠한 동물 종을 의미한다. 포유 동물의 예는 인간; 렛(rats), 마우스, 원숭이(simians), 기니 피그(guinea pigs)와 같은 실험 동물; 토끼, 소, 양, 염소, 고양이, 개, 말, 및 돼지와 같은 가축 동물 등을 포함한다.
용어 "분리된 핵산"은 핵산의 자연적 기원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 게놈, cDNA, 또는 합성 기원, 또는 이들의 조합의 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, "분리된" 핵산은 핵산이 유래하는 생물의 게놈 DNA 내의 흥미로운 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열이 없는 것이다.
용어 "해리 상수(off-rate)" 또는 "K d "는 특정 항체-항원 상호 작용의 평형 해리 상수를 의미하고, (항체와 같은) 리간드 및 (CD134와 같은) 단백질 간의 결합 친화도를 설명하는데 사용된다. 더 작은 평형 해리 상수는 리간드가 더 밀접하게 결합되는 것이거나, 또는 리간드와 단백질 간의 더 높은 친화도를 가짐을 의미한다. K d 는, 예를 들어, BIACORE 1 또는 옥텟 시스템(Octet system)을 사용한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의하여 측정될 수 있다. 용어 "항-CD134 항체"는, 본 발명에서 정의되는 바와 같이, 인간 CD134에 결합할 수 있는 항체를 의미한다.
용어 "OX40 수용체" 및 "CD134 수용체"는 본 명세서에서 상호변환가능하게 사용되고, 인간 CD134뿐만 아니라, 이의 변이체(variants), 이소 형태(isoforms), 및 종 상동체(species homologues)를 포함한다. 따라서, 어떤 경우에 있어서, 본 발명에서 개시되는 인간 결합 분자는 인간과는 다른 종 기원의 CD134에 결합할 수 있다. 다른 경우에 있어서, 상기 결합 분자는 인간 CD134에 완전히 특이적일 수 있고, 종 또는 다른 타입의 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다. 특히, 마우스 또는 렛 CD134에 결합하지 않을 것이다.
용어 "인간 CD134에 특이적으로 결합한다"는, 인간 CD134에 결합하는 결합분자의 K d 가, 본 발명에서 설명되거나 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 에세이 (예를 들어, BIAcore assay)를 사용하여 결정되는 것과 같은, 예를 들어 인간 CD40에 결합하는 K d 의 바람직하게는 10배, 50배 이상, 또는 보다 바람직하게는 100배 이상인 것이다. 특정 제제가 OX40 수용체에 특이적으로 결합한다는 결정은 통상적인 과정을 사용하거나 적용하여 택일적으로 쉽게 얻어질 수 있다. 하나의 적합한 시험관 내(in vitro) 에세이는 (Harlow와 Lane에 의한 "Antibodies, A Laboratory Manual"을 포함하는 다양한 표준 텍스트에서 설명된) 웨스턴 블롯 과정을 사용하는 것이다. 주어진 OX40 수용체 결합제가 인간 OX40 단백질에 특이적으로 결합하는지를 결정하기 위하여, 총 세포 단백질이 OX40을 암호화하는 핵산 분자로 형질전환된 비-림프구 세포(예를 들어, COS 세포 또는 CHO 세포)와 같은 OX40 항원을 발현하지 않는 포유 동물 세포로부터 추출된다. 음성 대조군으로서, 대응하는 비-형질전환 세포로부터의 총 세포 단백질이 추출된다. 다음으로, 이러한 단백질들은 비-변성 또는 변성 폴리아크릴아마이드 겔(PAGE) 상에서 전기영동된다. 다음으로, 상기 단백질들은 웨스턴 블롯에 의하여 멤브레인(예를 들어, 니트로셀룰로오스)로 전달되고, 테스트되는 제제가 상기 멤브레인과 함께 인큐베이션된다. 비-특이적으로 결합된 제제를 제거하기 위하여 상기 멤브레인을 세척한 후, 결합된 제제의 존재는 효소 알칼라인 포스파타아제와 같은 검출제에 콘주게이션된 테스트 제제에 대한 항체의 사용에 의하여 검출된다; 기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸리움의 적용은 면역-위치된 알칼리성 포스파타아제에 의하여 강한 청색 화합물의 생산으로 나타난다. 이러한 방법에 의하여, 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 제제는 OX40 형질전환된 세포로부터의 추출물에서 (그것의 분자량에 의하여 결정되는 겔 상의 주어진 자리에 위치될) 인간 OX40 밴드에 결합하는 것으로 나타날 것이고, 비-형질전환된 세포로부터의 추출물에서는 결합이 거의 관찰되지 않을 것이다. 다른 단백질에 대한 상기 제제의 비-특이적 결합이 발생할 수 있고, 웨스턴 블롯 상에서 약한 신호로 검출될 수도 있다. 이러한 결합의 비특이적 특성은 특이적 제제/인간 OX40 단백질 결합으로부터 발생하는 강한 기본적인 신호와 비교하여 웨스턴 블롯 상에서 획득된 약한 신호로서 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 인식될 수 있을 것이다. 이상적으로, OX40 수용체 결합 제제는 비-형질전환된 세포로부터 추출된 단백질에 결합하지 않을 것이다. 추출된 단백질을 사용한 결합 에세이에 추가하여, 추정의 OX40 수용체 결합 제제가 생체 내에서 OX40 수용체에만 실질적으로 결합하는 능력을 확인하기 위하여, 상기 제제를 (FITC와 같은) 형광 태그에 콘주게이션시키고, 항원 활성화된 CD4+ T-세포 및 비-활성화된 T-세포 군집에 대한 그것의 결합을 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)에 의하여 분석함으로써 테스트할 수 있다. 실질적으로 OX40 수용체에만 결합하는 제제는 활성화된 CD4+ T-세포만을 염색할 것이다.
용어 "벡터"는 숙주 세포로 다른 핵산 분자를 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스성 벡터, 코스미드 또는 파아지 벡터, 및 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함한다. 어떠한 벡터는 이들이 도입될 숙주 세포에서 자가 복제가 가능하다. 어떠한 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의하여 숙주 게놈과 함께 복제된다. 어떠한 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 이끌 수 있고, 이는 "발현 벡터"와 같이 언급될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 것으로서, 20개의 공지된 아미노산 및 그들의 약어는 공지된 방법에 따른다.
본 발명은 항-CD134 항체, 상기 항-CD134 항체의 항원-결합 단편, 및 상기 항-CD134 항체의 유도체를 포함하는 인간 CD134에 결합하는 분리된 결합 분자를 제공한다. 상기 결합 분자는 다음의 기능적 특징의 적어도 하나에 의하여 특징지워진다: (a) 1 × 10-6 M 또는 그 미만의 K d 로 인간 CD134에 결합, (b) 인간 CD134(OX40) 수용체가 OX40 리간드(OX40L)에 결합하는 것을 차단하지 않음, (c) T-이펙터 세포의 인간 CD134에 대한 효능제 활성 및/또는 T-조절 세포의 인간 CD134에 대한 길항제 활성을 가짐, (d) 최대 500 nM의 농도에서 CD40 수용체에 결합하지 않음, (e) 최대 500 nM의 농도에서 CD137 수용체에 결합하지 않음, (f) 최대 500 nM의 농도에서 CD271 수용체에 결합하지 않음, (g) 분리된 인간 T-세포에 의하여 IL-2 생산을 향상시킬 수 있음, (h) 면역 응답을 향상시킬 수 있음, (i) 종양 세포 성장을 저해할 수 있음, 및 (j) 암에 대한 치료 효과를 가질 수 있음. 어떠한 구체예에 있어서, 상기 결합 분자는 1 × 10-7 M 또는 그 미만, 1 × 10-8 M 또는 그 미만, 또는 5 × 1 × 10-9 M 또는 그 미만의 K d 로 인간 CD134에 결합한다.
본 발명의 항체 및 다른 결합 분자는 종래 기술에 의하여 제조될 수 있고, 다음으로 OX40L이 CD134에 결합하는 것을 차단하지 않는 결합 분자를 동정 및 수득하기 위하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, CD134가 OX40L의 포화 농도에 노출될 때에도 CD134에 결합하는 결합 분자가 선택될 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 인간 CD134에 결합하는 인간 항체가 제공된다. 어떠한 구체예에 있어서, 상기 인간 항체는 100 nM 또는 그 미만, 바람직하게는 10 nM 또는 그 미만의 K d 로 인간 CD134에 특이적으로 결합 및/또는 T-이펙터 세포의 인간 CD134에 대한 효능제 활성 및/또는 T-조절 세포의 인간 CD134에 대한 길항제 활성을 갖는 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 항체의 하나의 예는 인간 모노클로날 항체 클론 12H3이다. 전체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 항체 클론 12H3의 중쇄(VH)의 가변 영역의 세 CDRs의 아미노산 서열은 서열번호 12 및 14-16에 각각 나타내었다. 전체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 항체 클론 12H3의 경쇄(VL)의 가변 영역의 세 CDRs의 아미노산 서열은 서열번호 13 및 17-19에 각각 나타내었다. 본 발명의 다른 실례가 되는 항체는 인간 모노클로날 항체 클론 20E5이다. 전체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 항체 클론 20E5의 중쇄(VH)의 가변 영역의 세 CDRs의 아미노산 서열은 서열번호 4 및 6-8에 각각 나타내었다. 전체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 항체 클론 20E5의 경쇄(VL)의 가변 영역의 세 CDRs의 아미노산 서열은 서열번호 5 및 9-11에 각각 나타내었다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 이러한 CDRs, 또는 CDR 당 1, 2 또는 3 개의 아미노산이 치환된 이러한 CDRs를 포함할 수 있다. 상기 치환은 '보전적"인 것이 바람직하다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환은 본 기술 분야에서 공지되어 있으며, 참고문헌으로서 본 명세서에 통합된 WO2010/019702의 표 1에 예시로서 설명되어 있다.
클론 12H3과 클론 20E5가 인간 CD134에 결합하는 것을 고려하면, 이들 각각의 VH 및 VL 서열은 추가적인 항체를 생산하기 위하여 다른 항-CD134 항체와 "혼합(mixed) 및 매치(matched)"될 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치"된 항체의 인간 CD134로의 결합은 실시예에서 설명된 에세이를 포함하는 본 기술 분야에 공지된 결합 에세이를 사용하여 테스트될 수 있다. 하나의 경우에 있어서, VH 및 VL 영역이 혼합 및 매치될 때, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 이러한 방식으로, 다른 경우에 있어서, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체된다.
단지 하나 또는 두 개의 CDR 영역(어떠한 경우에 있어서, 단지 하나의 CDR 또는 이의 부분, 특히 CDR3)을 포함하는 분자는 CDR(s)이 유래된 항체의 항원-결합 활성을 유지할 수 있다. 예를 들어, Laune 등. JBC 1997; 272: 30937-44; Monnet 등. JBC 1999; 274 :3789-96; Qiu 등. Nature Biotechnology 2007; 25: 921-9; Ladner 등. Nature Biotechnology 2007; 25: 875-7; Heap 등. J Gen Virol 2005; 86: 1791-1800; Nicaise 등. Protein Science 2004; 13: 1882-91; Vaughan and Sollazzo Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 2001; 4:417-430; Quiocho Nature 1993; 362: 293-4; Pessi 등. Nature 1993; 362: 367-9; Bianchi 등. J Mol Biol 1994; 236: 649-59; 및 Gao 등. J Biol Chem 1994; 269: 32389-93을 참고할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 구체예는, (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-인간 CD134 결합 분자이다.
본 발명에 따른 다른 구체예는, (a) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 및/또는 (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및/또는 (c) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 분리된 CDR134 결합 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 다른 구체예는, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 및/또는 (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및/또는 (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 분리된 CDR134 결합 분자를 제공한다.
따라서, 본 발명의 하나의 구체예는, (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-인간 CD134 결합 분자이다.
본 발명에 따른 다른 구체예는, (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 및/또는 (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 /또는 (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 분리된 CDR134 결합 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 다른 구체예는, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 및/또는 (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 /또는 (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 분리된 CDR134 결합 분자를 제공한다.
클론 12H3과 클론 20E5가 인간 CD134에 결합하고 항원-결합 특이성이 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역에 의하여 기본적으로 제공되는 것을 고려하면, VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 추가적인 항-CD134 항체를 생산하기 위하여 "혼합 및 매치"될 수 있다. 예를 들어, 다른 항-CD134 항체로부터의 CDRs은, 각 항체가 전형적으로 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함할지라도, 혼합 및 매치될 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치"된 항체의 CD134로의 결합은 상기 설명 및 실시예(예를 들어, ELISAs, Biacore analysis)에서 설명된 결합 에세이를 사용하여 테스트될 수 있다. 하나의 경우에 있어서, VH CDR 서열이 혼합 및 매치될 때, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 이러한 방식으로, 다른 경우에 있어서, VL CDR 서열이 혼합 및 매치될 때, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 신규한 VH 및 VL 서열은 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 명세서에 기재된 CDR 서열과 구조적으로 유사한 서열로 대체함으로써 생성될 수 있음은 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
항-CD134 항체의 클래스(예를 들어, IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD) 및 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)는 ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같은 적절한 방법뿐만 아니라 다른 기술들에 의하여 결정될 수 있다. 택일적으로, 상기 클래스와 서브클래스는 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역의 전부 또는 부분을 시퀀싱하고, 이러한 아미노산 서열을 공지된 다양한 클래스 및 서브클래스의 면역글로블린의 아미노산 서열과 비교하고, 상기 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정함으로써 결정될 수 있다. 상기 항-CD134 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있다. 예를 들어, 항-CD134 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브클래스인 IgG일 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 항-CD134 항체의 클래스 또는 서브클래스를 다른 클래스 또는 서브클래스로 전환시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에 따른 결합 분자는 모노클로날 항체, 이들의 단편, 펩타이드 및 다른 화학적 독립체를 포함한다. 모노클로날 항체는 포유 동물의 면역화, 흥미로운 모노클로날 항체를 생산하는 플라스마 B 세포(plasma B cell)의 분리 및 골수종 세포(myeloma cell)와의 융합의 종래 기술에 의하여 제조될 수 있다.
다양한 구체예로서, 실제 항체의 존재 대신에, 결합 부분(binding moiety)은 (예를 들어, 비-항체 스캐폴더에 기초한) 항체 모방체, RNA 앱타머(RNA aptamer), 작은 분자(small molecule) 또는 CovX-바디(CovX-body)일 수 있다.
항체 모방체(예를 들어, 특정 위치에 도입되기 위한 다양성을 허락하면서도 높은 정도의 안정성을 가지는 비-항체 스캐폴더 구조체)는 결합 부분이 유래될 수 있는 분자 라이브러리를 생산하기 위하여 사용될 수 있음을 이해하여야 할 것이다. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 다양한 이러한 분자에 익숙할 것이다. 이러한 분자는 본 발명의 제제에서 결합 부분으로 사용될 수 있다.
예시적인 항체 모방체는 Skerra 등. (2007, Curr. Opin. Biotech., 18: 295-304)에서 설명되고, 아피바디(affibodies) (또한, 트리넥틴(Trinectins)으로 명명됨; Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLDs (또한, 테트라넥틴(Tetranectins)으로 명명됨; Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27-30; 애드넥틴(adnectins) (또한, 모노바디(monobodies)로 명명됨; Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109); 안티칼린(anticalins) (Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33); DARPins (안키린(ankyrins); Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582); 아비머(avimers) (Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561); 마이크로바디(microbodies) (FEBS J, (2007), 274, 86-95); 펩타이드 앱타머(peptide aptamers) (Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797); 쿠니츠 도메인(Kunitz domains) (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809); 아필린(affilins) (Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522)을 포함한다.
따라서, 항체 모방체는 아피바디, 테트라넥틴(CTLDs), 애드넥틴(모노바디), 안티칼린, DARPins(안키린), 아비머, iMabs, 마이크로바디, 펩타이드 앱타머, 쿠니츠 도메인, 앱타머 및 아필린을 포함 또는 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "작은 분자"는 900 달톤 또는 그 미만의 저 분자량 유기 화합물을 의미한다. 핵산, 단백질, 및 (전분 또는 셀룰로오스와 같은) 다당류와 같은 큰 바이오폴리머는 "작은 분자"에 포함되지 않지만, 이들을 구성하는 모노머(각각, 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 아미노산, 및 단당류) 및 올리고머(즉, 디뉴클레오티드와 같은 짧은 폴리머, 항산화제 글루타치온과 같은 펩타이드, 및 수크로오스와 같은 이당류)는 포함된다. 작은 분자의 합성은 Mayes & Whitcombe, 2005, Adv. Drug Deliv. Rev. 57:1742-78 및 Root-Bernstein & Dillon, 2008, Curr. Pharm. Des. 14:55-62에서 설명된다.
CovX-바디는 파마코포어(pharmacophor)를 링커를 통하여 특이적으로 디자인된 항체의 결합 부위에 공유적으로 결합시키고, 상기 항체를 효과적으로 재프로그램시켜 제조된다(Tryder 등, 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17:501-6). 그 결과로서 형성된 신규 클래스의 화학적 독립체의 각 구성 성분은 온전한 CovX-바디에 바람직한 특성을 부여하고, 특히, 상기 독립체는 펩타이드의 생물학적 작용 및 증가된 항체의 반감기를 가진다.
인간 항체는, 키메릭 항체를 생산하는 것과 유사한 기술을 사용하여, 인간 항체의 단편(VH, VL, Fv, Fd, Fab, 또는 (Fab')2)을 생산하기 위한 인간 면역글로블린 발현 라이브러리(Stratagene Corp., La Jolla, California; Cambridge Antibody Technology Ltd., London, England)의 사용, 및 적절한 부분의 융합에 의한 전체 인간 항체의 구축을 위한 이러한 단편의 사용을 포함하는 몇 가지 다른 방법들에 의하여 제조될 수 있다. 또한, 인간 항체는 인간 면역글로블린 게놈을 갖는 형질전환 마우스에서 생산될 수도 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어, Abgenix, Inc., Fremont, California, 및 Medarex, Inc., Annandale, New Jersey로부터 이용할 수 있다. 단일쇄 펩타이드를 형성하기 위한 중쇄 및 경쇄 Fv의 연결에 추가하여, Fab가 구축될 수 있고, 유사한 수단들에 의하여 발현될 수 있다(M.J. Evans 등. J Immunol Meth 1995; 184: 123-138).
DeImmunizedTM 항체는, 국제특허출원 PCT/GB98/01473에 설명된 바와 같이, 잠재적인 면역원성 T-세포 에피토프가 제거된 항체이다. 그러므로, 인간에서의 면역원성은 그들이 생체 내에 적용될 때 제거되거나 실질적으로 감소될 것으로 기대된다. 본 발명의 면역글로블린 기반의 결합 분자는 이러한 방법에 의하여 (만약 존재한다면) 제거된 그들의 면역원성 T-세포 에피토프를 가질 수 있다.
상기 설명된 전체적 및 부분적 인간 항체 전부는 단편 및 단일쇄 항체이므로 전체 뮤린 또는 비-인간 유래 항체보다 면역원성이 덜하다. 그러므로, 이러한 모든 분자 (또는 이들의 유도체)는 면역 또는 알러지 반응을 덜 촉발시킬 것이다. 결과적으로, 이들은 인간에 생체 내 투여에, 특히 반복된 투여 또는 장기간의 투여가 필요한 경우, 전체 비-인간 항체보다 적합하다.
이중특이성 항체(bispecific antibodies)는 동일한 인간 표적 세포의 CD134 사이 또는 두 개의 다른 인간 표적 세포 상의 인간 CD134 사이에서 교차 결합제로서 사용될 수 있다. 이러한 이중특이성 항체는 인간 CD134의 두 개의 다른 에피토프의 각각에 대하여 하나의 특이성을 갖는다. 이러한 항체 및 상기 항체를 제조하는 방법은 U.S. Patent No. 5,534,254 (Creative Biomolecules, Inc.)에 설명되어 있다. 본 발명에서 설명되는 이중특이성 항체의 다른 구체예들은 단일쇄 Fv를 Ser-Cys, (Gly)4-Cys, (His)6-(Gly)4-Cys, 킬레이트제, 및 비스말레이미도헥센(bismaleimidohexane) 및 비스말레이미도카프로일(bismaleimidocaproyl)을 포함하는 케미컬 또는 디설파이드 커플링을 포함하는 펩타이드 커플러와 연결시키는 것을 포함한다.
비-항체 분자는 종래의 방법에 의하여 화합물 라이브러리로부터 분리 또는 스크리닝될 수 있다. 화합물 라이브러리를 생산 및 스크리닝하기 위한 자동화된 시스템은 U.S. Patents Nos. 5,901,069 및 5,463,564에 설명되어 있다. 보다 구체적인 접근법은 결합 부위의 3차원적 모델링과, 그 다음으로, 상기 모델을 확정하기 위한 분자 패밀리를 제조하는 것과 관련된다. 다음으로, 최적의 결합 특성을 갖는 것들을 스크리닝한다.
다른 접근법은 재조합 펩타이드 라이브러리를 생산하고, 다음으로, 이들로부터 흥미로운 인간 CD134의 에피토프에 결합할 수 있는 것들을 스크리닝하는 것이다. 예를 들어, U.S. Patent No. 5,723,322을 참고할 수 있다. 이러한 에피토프는 아래의 실시예에서 설명될 모노클로날 항체에 의하여 결합되는 것과 동일한 것이다. 실질적으로, 상기 분자는 상기 에피토프가 특정되면, 본 기술 분야에서 공지된 기술들에 의거하여 비교적 쉽게 생산 및 분리될 수 있다.
추가적인 구체예는 상기 설명된 바와 같은 어떠한 항-CD134 항체의 유도체를 제공한다. 구체적인 일 측면에 있어서, 항체 유도체는 클론 12H3 및/또는 클론 20E5의 아미노산 서열의 모식으로부터 유래된다. 항체 쇄의 프레임워크 영역, CDR 영역, 또는 불변 영역과 같은 어떤 영역의 아미노산 서열은 수식될 수 있다. 상기 수식은 위치선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 및 랜덤 PCR-매개 돌연변이와 같은 종래에 공지된 표준 기술들에 의하여 도입될 수 있고, 천연뿐만 아니라 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 수식의 형태는 항-CD134 항체의 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실, 치환, 또는 이들의 조합을 포함한다. 어떤 구체예에 있어서, 상기 항체 유도체는 중쇄 CDRs에서의 1, 2, 3, 또는 4 개의 아미노산 치환 및/또는 경쇄 CDRs에서의 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 어떤 구체예에 있어서, 항-CD134 항체의 유도체는 인간 유전자의 생식 세포 계열(germ line) 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구체예로서, 생식 세포 계열로부터의 이들의 하나 이상의 치환은 중쇄의 CDR2에서 일어난다. 다른 특정 구체예로서, 상기 생식 세포 계열과 대비된 아미노산 치환은 항체 클론 12H3 및 클론 20E5에서의 생식 세포 계열과 대비되는 치환과 동일한 하나 이상의 위치이다. 다른 구체예로서, 상기 아미노산 치환은 항체의 하나 이상의 시스테인을, 제한되지는 않지만, 알라닌 또는 세린과 같은 다른 잔기로 변화시킨다. 상기 시스테인은 케노니컬(canonical) 또는 비-케노니컬 시스테인일 수 있다. 상기 치환은 가변 영역의 CDR 또는 페레임워크 영역 또는 항체의 불변 영역에서 일어날 수 있다. 다른 형태의 아미노산 치환은 하나 이상의 잔기의 변화에 의한 잠재적 탈아미노화 위치(deamination sites)를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 또 다른 구체예로서, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 하나의 구체예로서, 항체 유도체는 클론 12H3 및/또는 클론 20E5의 아미노산 서열과 대비하여 중쇄 CDR 영역에서 1, 2, 3, 또는 4 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 다른 형태의 항-CD134 항체의 수식은 상기 항체의 원래의 당화(glycosylation) 패턴을 변경시키는 것이다. 용어 "변경(alteration)"은 상기 항체에서 발견되는 하나 이상의 당 부분의 결실 및/또는 상기 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 위치의 첨가를 의미한다.
항체의 당화는 전형적으로 N-연결(N-linked)이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 곁사슬에 탄수화물을 부착하는 것을 의미한다. 다른 수식의 예는 아실화(acylation), 아미드화(amidation), 아세틸화(acetylation), 가교-연결(cross-linking), 고리화(cyclization), 포르밀화(formylation), 히드록실화(hydroxylation), 요오드화(iodination), 메틸화(methylation), 미리스토일화( myristoylation), 이황화결합 형성(disulfide bond formation), 탈메틸화(demethylation), 공유 가교-연결의 형성(formation of covalent cross-links), 시스테인의 형성(formation of cysteine), 산화(oxidation), 인산화(phosphorylation), 프레닐화(prenylation), 페길레이션(pegylation), 단백분해 과정(proteolytic processing) 및 황산화(sulfation)을 포함한다.
또 다른 구체예는, 본 명세서에서 설명되는 바와 같이, 추가적인 분자 독립체에 연결된 항-CD134 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함하는 항체 유도체를 제공한다. 추가적인 분자 독립체의 예는 약학적 제제, 펩타이드 또는 단백질, 및 검출제 또는 표지(labels)를 포함한다. 항-CD134 항체에 연결될 수 있는 약학적 제제의 구체적인 예는 세포독성 제제 또는 다른 항암제, 및 방사선 동위원소를 포함한다. 항-CD134 항체에 연결될 수 있는 펩타이드 또는 단백질의 구체적인 예는 동일한 CD134 항체 또는 다른 항체일 수 있는 항체를 포함한다. 항-CD134 항체에 연결될 수 있는 검출제 및 라벨의 구체적인 예는 (1) 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 5-디메틸아민-l-나프탈렌설포닐 클로라이드(5-dimethylamine-l-naphthalenesulfonyl chloride) 및 란타나이드 포스포르스(lanthanide phosphors)와 같은 형광 화합물(fluorescent compounds); (2) 호스레디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 루시페라아제(luciferase), 및 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase)와 같은 효소; (3) 비오틴(biotin); (4) 류신 지퍼 쌍 서열(leucine zipper pair sequences), 금속 결합 도메인(metal binding domains), 에피토프 태그(epitope tags) 및 2차 항체를 위한 결합 위치와 같은 2차 리포터에 의하여 인식되는 기결정된 폴리펩타이드 에피토프(predetermined polypeptide epitope)를 포함한다. 또 다른 구체예는 항체 이량체, 삼량체, 또는 단량체 항체의 고차 다량체와 같은 항-CD134 항체의 다가 형태인 항체 유도체를 제공한다. 항체 다량체내의 개별적 단량체는 동일하거나 다를 수 있는데, 즉, 이들은 이형(heteromeric) 또는 동형(homomeric) 항체 다량체일 수 있다. 항체의 다량체화는 자연 응집(natural aggregation)을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 항체 정제물 (예를 들어, 정제된 IgG1 분자)의 일정 부분은 항체 동형이량체, 및 다른 고차 항체 다량체를 포함하는 단백질 응집체를 자발적으로 형성한다. 택일적으로, 항체 동형이량체는 공지된 기술인 화학적 연결 기술을 통하여 형성될 수 있다. 적절한 가교링커는 as m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), N-석신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(N-succinimidyl S-acethylthioacetate) 및 석신이미딜 4-(말레이미도메틸(시클로헥센)-1-카르복실레이트(succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)와 같은 이형이기능성(heterobifunctional) 또는 (디석신이미딜 수버레이트(disuccinimidyl suberate)와 같은) 동형이기능성(homobifunctional)인 것을 포함한다. 이러한 링커는 상업적으로 이용가능하다. 또한, 항체는 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 다량체화될 수 있다.
또 다른 구체예는 상기 본 명세서에 설명된 항-인간 CD134 항체의 아미노산 서열을 포함하는 키메릭 항체인 항체 유도체를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 키메틱 항체의 모든 CDR은 항-인간 CD134 항체 유래이다. 또 다른 구체예에서, 하나를 초과하는 항-인간 CD134 항체의 CDR은 키메릭 항체에서 조합된다. 나아가, 키메릭 항체는 하나의 항-인간 CD134 항체로부터 유래된 프레임워크 영역 및 하나 이상의 다른 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 키메릭 항체는 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 어떠한 특정 구체예로서, 키메릭 항체는 항체 클론 12H3 및/또는 클론 20E5로부터 선택된 항체의 중쇄 가변 영역으로부터 또는 경쇄 가변 영역으로부터의 하나, 둘, 세 개의 CDR을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 다른 항체 유도체의 예는 단일 쇄 항체, 디아바디(diabodies), 도메인 항체(domain antibodies), 나노바디(nanobodies), 및 유니바디(unibodies)를 포함한다. 바람직한 구체예로서, 모노클로날 항체는 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, DeImmunizedTM 항체, 단일 쇄 항체, Fab, F(ab')2, Fv를 포함하는 단편, 또는 모 항체(parent antibodies)의 항원 결합 기능을 보유하는 다른 단편일 수 있다. 단일 쇄 항체("ScFv") 및 이의 구축 방법은 U.S. Patent No. 4,946,778에 설명되어 있다.
"단일 쇄 항체"(scFv)는 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 포함하며, 상기 VL 도메인 및 VH 도메인은 1가(monovalent) 분자를 형성하기 위하여 쌍으로 되어 있는 단일 폴리펩타이드 쇄로 이루어진다. 단일 쇄 항체는 공지 기술 (예를 들어, Bird 등, (1988) Science 242:423-426 및 Huston 등, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참고)에 따라 제조될 수 있다. "디아바디"는 두 개의 쇄로 구성되고, 동일한 폴리펩타이드 상에서 경쇄 가변 영역으로 연결된 중쇄 가변 영역을 포함하는 각 쇄는 짧은 펩타이드 링커에 의하여 연결되고, 이중특이적 분자를 형성하기 위하여 동일 쇄 상의 상기 두 영역은 서로와는 쌍을 형성하지 않고, 다른 쇄 상의 상보적인 도메인과는 쌍을 형성한다. 디아바디의 제조 방법은 종래 기술로서 공지되어 있다(예를 들어, Holliger P. 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 및 Poljak R. J. 등, (1994) Structure 2:1121-1123 참고). 도메인 항체(dAbs)는 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나의 가변 영역에 상응하는 항체의 작은 기능적 분자 단위이다. 도메인 항체는 세균, 효모, 및 포유 동물 세포 시스템에서 우수하게 발현된다. 도메인 항체의 보다 구체적인 설명 및 이의 제조 방법은 종래 기술로서 공지되어 있다(예를 들어, U.S. Patent Nos. 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; WO04/003019 및 WO03/002609 참고). 나노바디는 항체의 중쇄로부터 유래된다. 나노바디는 전형적으로 단일 가변 영역 및 두 개의 불변 영역(CH2 및 CH3)를 포함하고, 원래의 항체의 항원-결합 능력을 보유한다. 나노바디는 종래 기술에서 공지된 방법으로 제조될 수 있다(예를 들어, U.S. Patent No. 6,765,087, U.S. Patent No. 6,838,254, WO 06/079372 참고). 유니바디는 IgG4 항체의 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄로 구성된다. 유니바디는 IgG4 항체의 힌지 영역(hinge region)의 제거에 의해 제조될 수 있다. 유니바디에 관한 보다 상세한 설명 및 이의 제조 방법은 WO2007/059782에 나타나 있다.
본 발명의 결합 분자에 추가하여, 본 발명의 상기 분자는, 제한되지는 않지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 당화 그룹(glycosylation group), 지방산(fatty acids) 및 덱스트란(dextran)과 같은 생체 내 분자의 반감기를 증가시키기 위한 부분을 더 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 부분은 종래 기술에서 공지된 방법을 사용하여 콘쥬게이션되거나 결합될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 제 1의 측면에 따른 CD134-결합 결합 분자의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자에 의하여 암호화되는 상기 아미노산 서열은 CDR, 하나, 둘, 또는 3개의 CDR을 포함하는 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역과 같은 온전한 항체의 어떠한 부분일 수 있고, 전장 중쇄 또는 경쇄일 수 있다. 어떠한 구체예로서, 상기 핵산 분자는 (1) 항체 클론 12H3 및/또는 클론 20E5의 CDR3, 특히 중쇄 CDR3 영역; (2) 항체 클론 12H3 및/또는 클론 20E5의 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역; 또는 (3) 항체 클론 12H3 및/또는 클론 20E5의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 아미노산 서열을 암호화한다. 다른 구체예로서, 상기 핵산 분자는 서열번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19로 이루어지는 군으로부터, 또는 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다.
본 명세서에 의하여 개시되는 상기 핵산 서열은 본 발명에 따른 CD134 항체를 생산하는 어떠한 기원으로부터도 획득될 수 있다. 항-CD134 항체-생산 세포로부터의 mRNA는 표준 기술로 분리될 수 있고, PCR 및 라이브러리 구축 기술을 사용하여 클론 및/또는 증폭될 수 있고, 항-CD134 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 얻기 위하여, 표준 프로토콜을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 상기 mRNA는, 항체 유전자의 중합 연쇄 반응(PCR) 또는 cDNA 클로닝에 사용될 cDNA를 생산하는데 사용될 수 있다. 하나의 구체예로서, 상기 핵산 분자는, 상기 설명된 바와 같이, 항-CD134 항체를 발현하는 하이브리도마, 바람직하게는, 그것의 융합 파트너로서, 인간 면역글로블린 유전자를 발현하는 비-인간 형질전환 동물 세포를 가지는 하이브리도마로부터 얻어질 수 있다. 다른 구체예로서, 상기 하이브리도마는 비-인간, 비-형질전환 동물 유래이다.
항-CD134 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 분자는 상기 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자를 중쇄의 불변 영역을 암호화하는 핵산 분자와 융합함으로써 구축될 수 있다. 유사하게, 항-CD134 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 상기 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자를 경쇄의 불변 영역을 암호화하는 핵산 분자와 융합함으로써 구축될 수 있다. VH 및 VL 쇄를 암호화하는 상기 핵산 분자는 이들을 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 각각 암호화하고 있는 발현 벡터 내로 삽입, 즉, VH 단편은 상기 벡터 내에서 중쇄 불변 영역(CH) 단편(들)에 작동가능하게 연결되고, VL 단편은 상기 벡터 내에서 경쇄 불변 영역(CL) 단편에 작동가능하게 연결되어 전장 항체 유전자로 전환될 수 있다. 택일적으로, VH 또는 VL 쇄를 암호화하는 상기 핵산 분자는 연결, 예를 들어, 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 VH 쇄를 암호화하는 상기 핵산 분자를 CH 쇄를 암호화하는 핵산 분자에 라이게이션함으로써 전장 항체 유전자로 전환될 수 있다. 다음으로, 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 이들이 도입되는 세포로부터 발현될 수 있고, 항-CD134 항체는 분리된다.
상기 핵산 분자는, 아래에서 설명되는 바와 같이, 다량의 항-CD134 항체를 재조합 방식으로 발현시키는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자는, 본 명세서에서 설명되는 바와 같이, 키메릭 항체, 단일 쇄 항체, 면역접합체(immunoadhesins), 다이바디, 돌연변이 항체, 및 항체 유도체와 같은 공지된 것으로서 제공되는 다른 결합 분자를 생산하는데 사용될 수 있다. 하나의 구체예로서, 핵산 분자는 특이적 항체 서열을 위한 프로브(probe) 또는 PCR 프라이머(PCR primer)로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자 프로브는 진단 방법에 사용될 수 있고, 핵산 분자 PCR 프라이머는 사용될 수 있는 DNA의 영역을 증폭, 그 중에서도 항-CD134 항체의 가변 영역을 생산하는데 사용되기 위한 핵산 서열을 분리하기 위하여 사용될 수 있다.
항-CD134 항체의 VH 및 VL 단편을 암호화하는 DNA 분자가 획득되면, 이러한 DNA 분자는, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자, 또는 scFv 유전자로 전환시키는 재조합 DNA 기술에 의하여 추가적으로 조작될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 명세서에서 설명된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 핵산 분자는 (CDR 또는 가변 영역과 같은) 중쇄 또는 경쇄의 부분, 전장 경쇄 또는 중쇄, 전장 중쇄 또는 경쇄의 부분을 포함하는 폴리펩티드, 또는 항체 유도체 또는 항체-결합 단편의 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
적절한 발현 벡터의 예는, VH 또는 VL 서열이 삽입 및 발현될 수 있게 하기 위하여, 조작된 적절한 제한 위치를 갖는, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로블린 서열을 암호화하는 것이다. 또한, 상기 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 아미노산 서열의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 쇄의 아미노산 서열을 암호화하는 상기 DNA는 상기 벡터로 클로닝되고, 상기 신호 펩티드는 상기 항체 쇄의 아미노산 서열의 아미노 말단에 정확히(in-frame) 연결된다. 상기 신호 펩티드는 면역글로블린 신호 펩티드 또는 이형 신호 펩티드(즉, 비-면역글로블린 단백질 기원의 신호 펩티드)일 수 있다. 항-CD134 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열(항체 쇄 유전자)에 추가하여, 상기 발현 벡터는 숙주 세포에서 상기 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 가진다. 조절 서열의 선택을 포함하는 상기 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 의존될 수 있다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 레트로바이러스 LTRs(retroviral LTRs), (CMV 프로모터/인핸서와 같은) 사이토메갈로바이러스(CMV), (SV40 프로모터/인핸서와 같은) 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 메이저 후기 프로모터(adenovirus major late promoter(AdMLP))), 네이티브 면역글로블린 및 액틴 프로모터와 같은 폴리오마(polyoma) 및 스트롱 포유동물 프로모터(strong mammalian promoters)에서 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같이 포유동물 세포에서 높은 양의 단백질 발현을 유래하는 바이러스 요소를 포함한다.
상기 숙주 세포는 포유동물, 곤충, 식물, 세균, 또는 효모 세포일 수 있다. 숙주 세포로서 적합한 포유동물 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary (CHO) cells), NSO 세포, PER-C6 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(baby hamster kidney(BHK)) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(African green monkey kidney cells (COS)), 인간 간세포 암종 세포(human hepatocellular carcinoma cells) (예를 들어, Hep G2), 인간 폐 세포(human lung cells), A549 세포, 및 다른 다양한 세포주를 포함한다. 곤충 세포주의 예는 Sf9 또는 Sf21 세포를 포함한다. 식물 숙주 세포의 예는 담배(Nicotiana), 애기장대(Arabidopsis), 존개구리밥(duckweed), 옥수수(corn), 밀(wheat), 감자(potato) 등을 포함한다. 세균 숙주 세포는 대장균(E. coli) 및 스트렙토마이세스 종(Streptomyces species)를 포함한다. 효모 숙주 세포의 예는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.
다른 세포주 또는 형질전환 동물에서 발현되는 결합 분자의 아미노산 서열은 상이한 당화를 가질 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 제공되는 핵산 분자에 의하여 암호화되거나, 본 명세서에서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 모든 결합 분자는, 상기 결합 분자의 당화와는 무관하게, 본 발명의 부분이다.
본 발명의 다른 측면은 파아지 디스플레이를 사용하는, 상기 설명된 바와 같은 CD134-결합 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 파이지 상에 인간 항체의 라이브러리를 합성하는 단계, (b) CD134 또는 이의 부분으로 상기 라이브러리를 스크리닝하는 단계, (c) CD134 또는 이의 부분과 결합하는 파아지의 분리하는 단계, 및 (d) 상기 파아지로부터 상기 항체의 획득하는 단계들을 포함한다. 항체의 라이브러리를 제조하기 위한 하나의 예시적인 방법은 (a) 면역 응답을 유도하기 위하여, 인간 면역글로블린 유전자좌(loci)를 포함하는 비-인간 동물을 CD134 또는 이의 항원 부분으로 면역화하는 단계, (b) 상기 면역화된 동물로부터 항체-생산 세포를 추출하는 단계, (c) 상기 추출된 세포로부터 항-CD134 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 RNA를 분리하는 단계; (d) cDNA를 얻기 위하여 RNA를 역전사키키는 단계, (e) 상기 cDNA를 증폭시키는 단계, (f) 파아지 상에 항체가 발현되도록하기 위하여, 상기 cDNA를 파아지 디스플레이 벡터로 삽입시키는 단계를 포함한다. 재조합 항-인간 CD134 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하여 분리될 수 있다. 상기 라이브러리는, B 세포로부터 분리된 mRNA로부터 제조되는 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조되는, scFv 파아지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 파아지 라이브러리를 제조하기 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다.
본 발명에 따른 바람직한 구체예는, 예를 들어, 본 명세서에서 설명된 것과 같은 결합 분자의 하나 또는 조합, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물과 같은 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본 기술 분야에서 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 어떤 구체예에 있어서, 상기 조성물은 항-CD134 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구체예로서, 상기 조성물은 항체 클론 12H3 및/또는 클론 20E5, 또는 이들 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 또 다른 구체예로서, 상기 조성물은 항체 크론 12H3 및/또는 클론 20E5의 유도체를 포함한다. 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 결합 분자의 전달을 위한 제형으로 사용되기에 적합한 어떤 불활성 물질을 의미한다. 담체는 항피착제(antiadherent), 바인더(binder), 코팅(coating), 붕괴제(disintegrant), 충전제(filler) 또는 희석제(diluent), (항산화제(antioxidant), 항세균제(antibacterial agent) 또는 항진균제(antifungal agent)와 같은) 방부제(perservative), 감미제(sweetener), 흡수지연제(absorption delaying agent), 습윤제(wetting agent), 에멀젼화제(emulsifying agent), 완충액(buffer) 등일 수 있다.
본 발명의 비-펩티드 분자는 현탁액(suspension), 정제(tablet) 등을 포함하는 경구로 투여될 수 있다. 액체 제형은 라이오필화(lyophilized) 또는 에어로졸화(aerosolized) 마이크로캡슐의 흡입에 의하여 투여될 수도 있다. 또한, 좌약이 사용될 수 있다. 추가적인 약학적 비히클은 본 발명의 분자의 작용의 기간을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 제형의 투여량 및 투여 계획은 본 기술분야에서 공지된 표준 과정으로 결정될 수 있다. 이러한 과정은 동물 모델로부터 추정된 투여 계획을 추론하고, 다음으로 인간 임상 투여 범위 연구에 의한 최적화된 투여량 결정과 관련된다.
상기 조성물은 액체, 반고체, 및 고체 투여 형태와 같은 어떤 적절한 형태일 수 있다. 상기 조성물의 다양한 투여 형태는 본 기술분야에서 공지된 종래 기술에 의하여 제조될 수 있다.
상기 조성물에 포함되는 결합 분자의 상대적인 양은 원하는 방출 및 약물동력학적인 특징, 사용되는 특이적 결합 분자 및 담체 및 투여 형태와 같은 다양한 인자에 다양하게 의존할 것이다. 단일 투여 형태에서 결합 분자의 양은 치료 효과를 나타내는 일반적인 양일 수 있지만, 또한 더 작은 양일 수도 있다. 일반적으로, 이러한 양은 투여 형태의 총 중량의 약 0.001% 내지 약 99%, 약 0.1% 내지 약 70%, 또는 약 1% 내지 약 30%의 범위일 것이다.
상기 결합 분자에 추가하여, 하나 이상의 추가적인 치료제가 상기 치료 요법의 일부분으로서 상기 조성물 내에 또는 분리되어 포함될 수 있다. 상기 추가적인 치료제의 예는 아래에 설명된다. 상기 조성물에 포함되는 상기 추가적인 치료제의 적절한 양은 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 쉽게 선택할 수 있고, 사용되는 특정 치료제 및 담체, 투여 형태, 및 원하는 방출 및 약물동력학적 특징과 같은 다양한 인자들의 다양하게 의존할 수 있을 것이다. 단일 투여 형태로 포함되는 상기 추가적인 치료제의 양은 치료 효과를 나타내는 일반적인 양일 수 있지만, 또한 더 작은 양일 수도 있다.
본 명세서에서 제공되는 결합 분자 및 상기 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물은 치료, 진단, 또는 면역 응답의 향상, 암의 치료, 다른 암 치료의 효능 향상, 또는 백신 효능 향상과 같은 다른 목적에 유용하고, 의약 또는 진단제로서의 용도와 같은 다양한 응용 분야를 가진다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 측면은 결합 분자 또는 약학적 조성물의 사용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (1) 자연적으로 발생하는 인간 OX40L과 인간 CD134 수용체의 상호 작용을 회피하고/하거나 (2) 자연적으로 발생하는 인간 OX40L에 의한 선점 후 인간 CD1340-매개 세포 신호를 차단하지 않는 항-인간 CD134 항체를 포함하는 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 사용하여, 인간 CD134 발현 인간 Teff 이팩터 기능의 향상 및/또는 인간 CD134 발현 인간 Treg 억제 기능의 약화를 포함하는 인간 CD134-매개 항-종양 면역 응답의 조절 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 인간 CD134 수용체 상의 인간 OX40L 결합 도메인과 상호 작용하고/하거나 인간 OX40L-인간 CD134 세포 신호를 차단하는 인간 OX40L 유사체와 같은 항-인간 CD134 항체를 포함하는 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 포함하지 않는, 인간 CD134-매개 항-종양 면역 응답의 조절 방법을 제공한다.
본 발명은 항-종양 치료 목적으로 항-인간 CD134 항체를 포함하는 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 개시한다. 상기 항-인간 CD134 항체는 인간 CD134의 세포외 도메인(extracellular domain)과 결합한다. 보다 구체적으로, 상기 항-인간 CD134 항체는 활성화된 인간 Teff 및 인간 Treg 상의 인간 CD134의 세포외 도메인 상의 비-OX40L-결합 영역에 결합한다 (즉, 상기 항-인간 CD134 항체는 인간 OX40L의 인간 CD134로의 결합을 완전히 차단하지는 않는다).
하나의 특별한 측면으로서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 포유 동물에 치료적으로 효과적인 양의 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 포유 동물의 면역 응답을 향상시키는 방법을 제공한다. 어떠한 구체예로서, 상기 결합 분자는 항-CD134 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 상기 포유 동물은 인간이다. 다른 구체예로서, 상기 결합 분자는 항체 클론 12H3 및/또는 클론 20E5이거나, 이들 항체의 항원-결합 단편이다. 용어 "면역 응답을 향상"은 포유 동물의 면역 시스템의 어떠한 응답을 자극(stimulating), 촉발(evoking), 증가(increasing), 개선(improving), 또는 증대(augmenting)를 의미한다. 상기 면역 응답은 세포성 응답 (즉, 세포 독성 T 림프구 매개와 같은 세포-매개) 또는 체액성 응답 (즉, 항체 매개 응답)일 수 있고, 1차 또는 2차 면역 응답일 수 있다. 면역 응답의 향상의 예는 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성 및 세포 독성 T 세포의 생성을 포함한다. 면역 응답의 향상은, 제한되지는 않지만, 세포 독성 T 림프구 에세이, 사이토카인 (예를 들어, IL-2 생산)의 방출, 종양의 감소, 종양을 갖는 동물의 생존, 항체 생산, 면역 세포 증식, 세포 표면 마커의 발현, 및 세포 독성을 포함하는 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 공지된 다수의 시험관 내 또는 생체 내 측정법을 사용하여 평가될 수 있다. 하나의 구체예로서, 상기 방법은 세포성 면역 응답, 특히 세포 독성 T 세포 응답을 향상시킨다.
본 발명의 하나의 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 상기 결합 분자의 포화 농도 또는 그 이상에서, CD134로의 OX40L의 결합 효과는, 실시예 2(f)에서 설명되는 바와 같은 형광 기반 유세포 분석 에세이(fluorescence-based flow cytometric assay)에 의하여 측정되는 바와 같이, 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 70%를 초과하지 않게 감소된다. 보다 바람직하게는, 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않게 감소되거나, 바람직하게는 전혀 감소되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 결합 분자를 제공하고, 상기 결합 분자의 70 nM 농도에서, CD134로의 OX40L의 결합 효과는, 실시예 2(f)에서 설명되는 바와 같은 형광 기반 유세포 분석 에세이에 의하여 측정되는 바와 같이, 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 70%를 초과하지 않게 감소된다. 보다 바람직하게는, 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않게 감소되거나, 바람직하게는 전혀 감소되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은, 유세포 분석기에 의하여 측정되는 바와 같은 PHA-자극 인간 CD134 발현 T-림프구 상에서 비표지된 상기 결합 분자 및 형광 표지된 상기 항체 간의 교차-경쟁에서 보여주는 바와 같이, (1) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (2) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 결합하는 인간 CD134와 경쟁하는 결합 분자를 제공한다 (실시예 2(e)에서 추가적으로 설명됨). 바람직하게는, 상기 항체의 결합은, 그것의 포화 농도에서 또는 그 이상의 농도에서, 상기 결합 분자에 대한 교차-경쟁에 의하여 평가되었을 때, 적어도 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90% 또는 그 이상으로 감소되고, 바람직하게는 폐지된다.
본 발명의 다른 측면은, 유세포 분석기에 의하여 측정되는 바와 같은 PHA-자극 인간 CD134 발현 T-림프구 상에서 비표지된 상기 결합 분자 및 형광 표지된 상기 항체 간의 교차-경쟁에서 보여주는 바와 같이, (1) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (2) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 결합하는 인간 CD134와 경쟁하는 결합 분자를 제공한다 (실시예 2(e)에서 추가적으로 설명됨). 바람직하게는, 상기 항체의 결합은, 그것의 포화 농도에서 또는 그 이상의 농도에서, 상기 결합 분자에 대한 교차-경쟁에 의하여 평가되었을 때, 적어도 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90% 또는 그 이상으로 감소되고, 바람직하게는 폐지된다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 CD134로의 OX40L의 결합 효과는 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않게 감소되고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-이펙터 세포 상에서 인간 OX40L의 면역자극 및/또는 증식 응답을 더 지연시키지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 상기 결합 분자는 OX40 리간드 (OX40L)와 결합하는 인간 CD134 (OX40) 수용체를 막지 않고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-이펙터 세포 상에서 인간 OX40L의 면역자극 및/또는 증식 응답을 더 지연시키지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 CD134로의 OX40L의 결합 효과는 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않게 감소되고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-이펙터 세포 상에서 인간 OX40L의 면역자극 및/또는 증식 응답을 향상시킨다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 상기 결합 분자는 OX40 리간드 (OX40L)와 결합하는 인간 CD134 (OX40) 수용체를 막지 않고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-이펙터 세포 상에서 인간 OX40L의 면역자극 및/또는 증식 응답을 향상시킨다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 CD134로의 OX40L의 결합 효과는 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않게 감소되고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-조절 세포 상에서 인간 OX40L의 억제 기능 응답을 지연시키지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 상기 결합 분자는 OX40 리간드 (OX40L)와 결합하는 인간 CD134 (OX40) 수용체를 막지 않고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-조절 세포 상에서 인간 OX40L의 억제 기능 응답을 지연시키지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 CD134로의 OX40L의 결합 효과는 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않게 감소되고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-조절 세포 상에서 인간 OX40L의 억제 기능 응답을 향상시킨다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 상기 결합 분자는 OX40 리간드 (OX40L)와 결합하는 인간 CD134 (OX40) 수용체를 막지 않고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-조절 세포 상에서 인간 OX40L의 억제 기능 응답을 향상시킨다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 CD134로의 OX40L의 결합 효과는 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않게 감소되고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-조절 세포 상에서 인간 OX40L의 증식 응답을 지연시키지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 상기 결합 분자는 OX40 리간드 (OX40L)와 결합하는 인간 CD134 (OX40) 수용체를 막지 않고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-조절 세포 상에서 인간 OX40L의 증식 응답을 지연시키지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 CD134로의 OX40L의 결합 효과는 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않게 감소되고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-조절 세포 상에서 인간 OX40L의 증식 응답을 저해한다.
본 발명의 다른 측면은 인간 CD134에 결합하는 결합 분자를 제공하고, 상기 결합 분자는 OX40 리간드 (OX40L)와 결합하는 인간 CD134 (OX40) 수용체를 막지 않고, 상기 결합 분자는 인간 CD134 발현 T-조절 세포 상에서 인간 OX40L의 증식 응답을 저해한다.
OX40L 및 항-CD134 항체의 동시 결합을 측정하는 적절한 방법은 아래에서 설명된다. 항-인간 CD134 항체의 부재하에서 PHA-자극 인간 CD134 발현 PBMC에 결합하는 인간 OX40L의 FITC 형광 신호 (기하평균 또는 평균 형광 강도(MFI))는 100%로 세팅된다. 인간 OX40L의 부재하에서 PHA-자극 인간 CD134 발현 PBMC에 결합하는 g항-인간 CD134 항체의 PE 형광 신호 (MFI)는 100%로 세팅된다. 인간 OX40L 및 항-인간 CD134 항체 모두가 PHA-자극 인간 CD134 발현 PBMC에 동시에 첨가될 때, 상기 FITC 형광 신호 및 PE 형광 신호의 감소는 바람직하게는 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않는다.
Teff의 OX40L-매개 증식 응답에 대한 지연의 결핍을 측정하는 적절한 방법은 아래와 같다. 인간 OX40L 처리 후, 인간 CD134 발현 Teff로의 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합은 100%로 세팅된다. 인간 OX40L 및 항-인간 CD134 항체 모두가 활성화 (예를 들어, PHA-자극 또는 항-CD3/항-CD28 비드-자극) 인간 CD134 발현 Teff에 동시에 첨가될 때, 상기 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합의 변화 (즉, 감소 또는 증가)는 바람직하게는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않는다.
Teff의 OX40L-매개 증식 응답에 대한 향상을 측정하는 적절한 방법은 아래와 같다. 인간 OX40L 처리 후, 인간 CD134 발현 Teff로의 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합은 100%로 세팅된다. 인간 OX40L 및 항-인간 CD134 항체 모두가 활성화 (예를 들어, PHA-자극 또는 항-CD3/항-CD28 비드-자극) 인간 CD134 발현 Teff에 동시에 첨가될 때, 상기 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합의 향상은 바람직하게는 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 그 이상보다 크다.
Treg의 OX40L-매개 억제 기능에 대한 지연의 결핍을 측정하는 적절한 방법은 아래와 같다. 인간 OX40L 처리 후, 인간 CD134 발현 Teff와 동시에 배양되는 (예를 들어, Teff/Treg 비 = 1 : 1) 인간 CD134 발현 Teff로의 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합은 100%로 세팅된다. 인간 OX40L 및 항-인간 CD134 항체 모두가 인간 CD134 발현 Teff와 동시에 배양되는 (예를 들어, Teff/Treg 비 = 1 : 1) 활성화 (예를 들어, PHA-자극 또는 항-CD3/항-CD28 비드-자극) 인간 CD134 발현 Teff에 동시에 첨가될 때, 상기 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합의 변화 (즉, 감소 또는 증가)는 바람직하게는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10%, 또는 그 이하를 초과하지 않는다.
Treg의 OX40L-매개 억제 기능에 대한 향상을 측정하는 적절한 방법은 아래와 같다. 인간 OX40L 처리 후, 인간 CD134 발현 Teff와 동시에 배양되는 (예를 들어, Teff/Treg 비 = 1 : 1) 인간 CD134 발현 Teff로의 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합은 100%로 세팅된다. 인간 OX40L 및 항-인간 CD134 항체 모두가 인간 CD134 발현 Teff와 동시에 배양되는 (예를 들어, Teff/Treg 비 = 1 : 1) 활성화 (예를 들어, PHA-자극 또는 항-CD3/항-CD28 비드-자극) 인간 CD134 발현 Teff에 동시에 첨가될 때, 상기 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합의 향상은 바람직하게는 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 그 이상보다 크다.
Treg의 OX40L-매개 증식 응답에 대한 지연의 결핍을 측정하는 적절한 방법은 아래와 같다. 인간 OX40L 처리 후, 인간 CD134 발현 Treg로의 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합은 100%로 세팅된다. 인간 OX40L 및 항-인간 CD134 항체 모두가 활성화 (예를 들어, PHA-자극 또는 항-CD3/항-CD28 비드-자극) 인간 CD134 발현 Treg에 동시에 첨가될 때, 상기 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합의 변화 (즉, 감소 또는 증가)는 바람직하게는 약 30%, 또는 약 20%, 또는 약 10% 또는 그 이하를 초과하지 않는다.
Treg의 OX40L-매개 증식 응답의 저해를 측정하는 적절한 방법은 아래와 같다. 인간 OX40L 처리 후, 인간 CD134 발현 Treg로의 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합은 100%로 세팅된다. 인간 OX40L 및 항-인간 CD134 항체 모두가 활성화 (예를 들어, PHA-자극 또는 항-CD3/항-CD28 비드-자극) 인간 CD134 발현 Treg에 동시에 첨가될 때, 상기 삼중수소 티미딘 또는 BrdU 통합의 감소는 바람직하게는 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 그 이상보다 크다.
본 발명의 다른 측면은 포유 동물에 본 명세서에서 설명된 바와 같은 치료적으로 효과적인 양의 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 포유 동물에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예로서, 상기 결합 분자는 항체 클론 12H3 및/또는 클론 20E5, 또는 이들 항체의 항원-결합 단편이다. 다른 구체예로서, 상기 포유 동물은 인간이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예는 포유 동물에 본 명세서에서 설명된 바와 같은 치료적으로 효과적인 양의 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 포유 동물에서 암을 예방하는 방법을 제공한다.
상기 용어 "암을 예방" 또는 "암의 예방"은 암형성(oncogenesis) 또는 종양형성(tumorigenesis)이 확인되지는 않았지만, 예를 들어, 유전자 스크리닝에 의해 결정되든 또는 다른 방법으로 결정되든 암의 소인(predisposition)이 확인된 포유 동물에서 암의 발생을 지연, 저해, 또는 차단하는 것을 의미한다. 또한 상기 용어는 악성으로 진행되는 전암 상태(premalignant condition)의 진행을 막거나, 감소를 유도하기 위하여 전암 상태를 갖는 포유 동물을 치료하는 것을 포함한다. 전암 상태의 예는 과형성(hyperplasia), 이형성(dysplasia), 및 변형(metaplasia)을 포함한다.
어떠한 구체예로서, 상기 결합 분자는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 항-CD134 항체 또는 이의 단편이다. 본 발명의 다른 구체예는 항체 클론 12H3 및/또는 클론 20E5, 또는 이들 항체의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 결합 분자를 제공한다. 또 다른 구체예로서, 상기 포유 동물은 인간이다.
악성 또는 양성 및/또는 1차 또는 2차를 포함하는 다양한 암이 본 발명에 따른 방법으로 치료 또는 예방될 수 있다. 이러한 암의 예는 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 공지되어 있고, Merck Manual of Diagnosis and Therapy (Merck 발행)과 같은 표준 교과서에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 결합 분자는 단독치료(monotherapy)로서 단독으로 투여되거나, 하나 이상의 추가적인 치료제 또는 치료법과의 조합으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 구체예는 조합 치료에 의하여 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 치료법 또는 치료제와의 조합으로 본 명세서에서 설명되는 결합 분자를 투여하는 것을 포함한다. 용어 "추가적인 치료법"은 치료제로서 본 명세서에 의하여 제공되는 결합 분자를 적용하지 않는 치료법을 의미한다. 용어 "추가적인 치료제"는 본 명세서에의 하여 제공되는 결합 분자와는 다른 임의의 치료제를 의미한다. 어떠한 구체예로서, 상기 결합 분자는 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및/또는 클론 20E5, 또는 이들 항체의 항원-결합 단편이다. 하나의 특정한 측면으로, 본 발명은 포유 동물에 하나 이상의 추가적인 치료제와의 조합으로 본 명세서에 의하여 제공되는 치료적으로 효과적인 양의 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 포유 동물에서 암을 치료하는 조합 치료법을 제공한다. 다른 구체예로서, 상기 포유 동물은 인간이다.
다양한 암 치료제가 결합 분자와의 조합으로 사용될 수 있다. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 명세서의 방법 및 결합 분자와의 조합으로 사용될 수 있는 다른 암 치료법의 존재 및 개발을 인식할 수 있을 것이고, 본 명세서에서 나타난 이러한 형태의 치료법에 한정되지 않음을 인식할 수 있을 것이다. 암을 치료하기 위한 조합 치료법으로 사용될 수 있는 추가적인 치료제 카테고리의 예는 (1) 화학치료제(chemotherapeutic agents), (2) 면역치료제(immunotherapeutic agents), 및 (3) 호르몬치료제(hormone therapeutic agents)를 포함한다.
용어 "화학치료제"는 암세포의 사멸을 야기하거나, 암세포의 분열(division), 회복(repair), 성장(growth), 및/또는 기능(function)을 방해할 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질을 의미한다. 화학치료제의 예는 본 명세서에 참고문헌으로서 통합되는 WO 2006/088639, WO 2006/129163, 및 US 20060153808에 공개된 문헌들을 포함한다.
용어 "면역치료제"는 포유 동물의 면역 응답을 향상시킬 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질을 의미한다. 면역치료제의 예는 칼메트-게랭균(bacillus Calmette-Guerin (BCG)); 인터페론(interferons)과 같은 사이토카인; MyVax personalized immunotherapy, Onyvax-P, Oncophage, GRNVACl, Favld, Provenge, GVAX, Lovaxin C, BiovaxID, GMXX, 및 NeuVax과 같은 백신; 및 alemtuzumab (CAMPATH), bevacizumab (AVASTIN), cetuximab (ERBITUX), gemtuzunab ozogamicin (MYLOTARG), ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN), panitumumab (VECTIBIX), rituximab (RITUXAN, MABTHERA), trastuzumab (HERCEPTIN), tositumomab (BEXXAR), tremelimumab, CAT-3888, 및 WO2003/040170에 개시된 CD40 수용체에 대한 길항적 항체와 같은 항체를 포함한다.
용어 "호르몬치료제"는 호르몬의 생산을 저해 또는 제거하거나, 암성 세포의 성장 및/또는 생존에 대한 호르몬의 효과를 저해 또는 대항하는 화학적 또는 생물학적 물질을 의미한다. 본 명세서에서 설명되는 방법에 적용하기에 적합한 이러한 치료제의 예는 US 20070117809에 개시되어 있는 것들을 포함한다. 호르몬치료제의 특정 예는 타목시펜(tamoxifen (NOLVADEX)), 토레미펜(toremifene (Fareston)), 플베스트란트(fulvestrant (FASLODEX)), 아나스트로졸(anastrozole (ARIMIDEX)), 엑셈에스탄(exemestane (AROMASIN)), 레트로졸(letrozole (FEMARA)), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate (MEGACE)), 고세렐린(goserelin (ZOLADEX)), 및 류프롤라이드(leuprolide (LUPRON))를 포함한다. 또한, 본 발명의 결합 분자는 (1) 난소(ovaries), 고환(testicles), 부신(adrenal gland), 및 뇌하수체(pituitary gland)와 같은 호르몬의 생산에 참여하는 조직 또는 선(gland)의 전부 또는 일부를 제거하는 외과적 방법, 및 (2) 환자의 조직 또는 선에 타겟 호르몬의 생산을 저해 또는 제거하기에 충분한 양의 방사선을 적용하는 방사선 치료법과 같은 비-드러그(non-drug) 호르몬 치료법과의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 조합 치료법에 의하여 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에서 설명되는 결합 분자의 투여, 및 종양을 제거하기 위한 외과적 수술을 포함한다. 상기 결합 분자는 상기 외과적 수술 전, 중, 또는 후에 상기 포유동물에 투여될 수 있다.
또한, 암을 치료하는 조합 치료법은 이온화 방사선치료법(ionizing (electromagnetic) radiotherapy) (예를 들어, X-선 또는 감마 선) 및 입자 빔 방사선 치료법(particle beam radiation therapy (예를 들어, high linear energy radiation)과 같은 방사선 치료법과 함께 본 발명의 결합 분자를 조합하는 것을 포함한다. 방사선 원은 포유 동물의 외부 또는 내부로 적용될 수 있다. 상기 결합 분자는 방사선 치료 전, 중, 또는 후에 상기 포유 동물에 투여될 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 결합 분자 및 조성물은 장 경로(enteral route) 또는 비경구 경로(parenteral route)를 통하여 투여될 수 있다. 상기 투여의 "장 경로"는 소화기관의 어떠한 부분을 통한 투여를 의미한다. 장 경로의 예는 경구(oral), 점막(mucosal), 구강(buccal) 및 직장(rectal) 경로, 또는 위내(intragastric) 경로를 포함한다. 상기 투여의 "비경구 경로"는 장 경로와는 다른 투여 경로를 의미한다. 투여의 적절한 경로 및 방법은 사용되는 특정 항체, 원하는 흡수율, 사용되는 특정 제형 또는 투여량, 치료되는 질병의 타입 또는 중증도, 특정된 작용 부위, 및 환자의 상태와 같은 다양한 인자들에 의하여 다양하게 의존할 수 있으며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
상기 용어로서, 결합 분자의 "치료적으로 효과적인 양"은 의도된 치료 목적에 효과적인 양을 의미한다. 예를 들어, 면역 응답을 향상시키는 범위에서의 "치료적으로 효과적인 양"은 포유 동물의 면역 시스템의 어떠한 응답을 자극(stimulating), 촉발(evoking), 증가(increasing), 개선(improving), 또는 증대(augmenting)시키는데 효과적인 어떠한 양이다. 암의 치료의 범위에서의 "치료적으로 효과적인 양"은 암의 추가적인 성장 또는 확산의 저해, 암 세포의 사멸, 암의 재발 저해, 암과 관련된 통증의 감소, 또는 포유 동물의 향상된 생존과 같은 치료되는 포유 동물에서 어떠한 원하거나 유익한 효과를 일으키기에 충분한 어떠한 양이다. 암의 예방의 범위에서의 "치료적으로 효과적인 양"은 결합 분자가 투여된 포유 동물에서 암의 발생을 지연, 저해, 또는 예방하는데 효과적인 어떠한 양이다.
결합 분자의 치료적으로 효과적인 양은 포유 동물의 체중을 기준으로 바람직하게는 약 0.001 내지 약 500mg/kg, 및 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 약 100mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 상기 양은 포유 동물의 체중을 기준으로 약 0.3mg/kg, 1mg/kg, 3mg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg, 50mg/kg, 또는 100mg/kg일 수 있다. 어떠한 구체예로서, 항-인간 CD134 항체의 치료적으로 효과적인 양은 포유 동물의 체중을 기준으로 약 0.1 - 30mg/kg의 범위이다. 투여되는 정확한 투여량은 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 쉽게 결정될 수 있고, 치료되는 질병의 종류, 및 중증도, 적용되는 특정 결합 분자, 투여 경로, 투여 횟수, 투여 기간, 적용되는 특정 추가적인 치료법, 치료되는 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 일반적 건강 상태 및 이전 병력, 및 본 기술 분야에서 공지된 유사한 인자들과 같은 다양한 인자에 의존할 것이다.
결합 분자 또는 조성물은 일반적으로 수회(multiple occasions) 투여된다. 예를 들어, 일회 투여의 기간은 주, 월, 매 3개월 또는 년일 수 있다. 예시적인 처방은 주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회, 4주당 1회, 1개월당 1회, 3개월당 1회 또는 3 내지 6개월당 1회로 투여된다. 항-인간 CD134 항체에 대한 전형적인 투여 처방은 (ⅰ) 매 4주 당 6회, 그 다음 매 3개월, (ⅱ) 매 3주, (ⅲ) 체중 기준으로 3mg/kg을 1회, 다음으로 매 3주 당 체중 기준으로 1mg/kg의 투여 계획 중 하나를 사용하여 정맥 주사 투여로 체중을 기준으로 1mg/kg 또는 3mg/kg을 포함한다.
본 발명은, 본 발명의 범위를 제한할 목적이 아닌, 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명된다. 또한, 본 명세서를 해독한 후 여러 가지 다른 구체예, 수식, 및 이의 균등물과 같은 수단은 본 발명 및/또는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상으로부터 벗어남이 없이 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 제안될 수 있음을 명확히 이해하여야 한다.
실시예
실시예 1. 마우스 항-인간 CD134 (=OX40) 모노클로날 항체의 생성
(a) 표면 CD134 를 발현하는 Sf9 곤충 세포의 생성
인간 CD134 단백질을 암호화하는 cDNA (GenBank ref CAB96543.1; 서열번호 1 참조)를 Sf9 곤충 세포 (스포돕테라 프루기페르다(Spodotera frugiperda)) 발현에 대하여 최적화하고 GENEART [Regensburg, Germany 소재]에 의하여 합성하였다(서열번호 2 참조). 이 cDNA를 배큘로바이러스 (baculovirus) 전달 플라스미드 pVL1393 (BD 형질감염 키트, 카트리지 번호 560129; BD Biosciences)에서 서브클로닝하였다. 이어서, Sf9 곤충 세포(ATCC)를, BaculoGold 배큘로바이러스 DNA와 함께 인간 CD134를 암호화하는 cDNA를 포함하는 전달 플라스미드 pVL1393로 공동-형질감염시킨 후 (BD 형질감염 키트), 27℃에서 4~5일 동안 인큐베이션하였다. 이러한 공동-형질감염 단계 후, 상등액을 수집하고 4℃에서 저장하여, 바이러스 증폭을 위해 추가의 Sf9 곤충 세포를 감염시키는데 사용하였다. 이 목적을 위하여, Sf9 곤충 세포를 증폭된 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 형질감염시키고, 그 후 27℃에서 3~5일 동안 인큐베이션하였다. 이들 Sf9 곤충 세포를 수확하고, 멸균 PBS로 세척하고, 5×106 세포/250㎕ PBS 로 분취하여 -80℃에서 저장하여 세포 용균물을 수득하였다. 저장 전에, 1:10 파이코에리트린(phycoerythrin) (PE)-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD134 (클론 ACT35; BD Biosciences) 및 유세포분석기를 이용하여, 형질감염된 Sf9 곤충 세포 상에서 인간 CD134 표면 발현을 확인하였다.
(b) 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체의 면역화 및 생성
0일에, BALB/c 마우스 (암컷, 6주령; Charles River Laboratories)에 ~400㎕ 인간 CD134-형질감염된 Sf9 곤충 세포 용균물 (250㎕ 세포 용균물 분취액 + 250㎕ 완전 프로인트 항원보강제 (Complete Freund's adjuvant); Sigma)를 피하주사하였다. 인간 CD134-형질감염된 Sf9 곤충 세포 용균물 및 불완전 프로인트 항원보강제 (Sigma)를 이용한 유사한 피하주사를 21일 및 42일에 제공하였다. 보조제 없이 인간 CD134-형질감염된 Sf9 곤충 세포 용균물 (250㎕/마우스)을 이용한 복강 내 부스터 주사를 61일 및 62일에 제공하였다. 65일에, 면역화된 마우스로부터의 지라세포를, Koehler and Milstein (Nature 1975; 256: p495~497)에 의해 최초로 기술된 표준 하이브리도마 기술을 이용하여 SP2/0 골수종 세포 (ATCC)와 융합하였다. 인간 CD134 (타겟으로서 각각 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질 (R&D Systems) 및 인간 CD134 발현 PHA (Roche)-자극된 CD4 T 세포 블라스트 (하기 실시예 2 참조)를 이용하여 유세포 분석 기술 및 통상의 ELISA를 이용하여 스크리닝됨)에 대한 항체 (마우스 IgG 클래스)를 생산한 하이브리도마를 제한 희석에 의하여 확장, 저온보존 및 클로닝하였다. 항-인간 CD134 특이적 모노클로날 항체를 단백질 G 컬럼 (GE Healthcare)을 이용하여 정제하여, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 (마우스 IgG1κ 이소타입; Roche로부터의 IsoStrip™ 마우스 모노클로날 항체 이소타입 키트로 결정됨) 및 클론 20E5 (마우스 IgG1κ 이소타입; 상동)을 결과로서 생성하였다.
실시예 2. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5의 유세포 분석 특징화
(a) PHA -자극된 인간 T 림프구상에서 CD134 발현
건강한 공여자 (사전 동의 (informed consent))로부터의 인간 말초혈액 단핵세포 (PBMC)를 Lymphoprep (1.077 g/mL; Nycomed) 상에서 밀도 원심분리에 의하여 분리하였다. 이어서, 10% 우태 혈청 (Bodinco) 및 50 ㎍/mL 젠타마이신 (Gibco)을 포함하는 RPMI-1640 배양 매질 (Gibco)중에서 1~2×106 PBMC/mL을, 0, 0.1, 1.0 또는 10.0 ㎍/mL 피토헤마글루티닌-M (PHA-M; Roche)으로 37℃/5% CO2에서 1~3일 동안 보충하였다. 배양 후, PBMC를 수확하고, 10% 인간 풀화된(pooled) 혈청 (HPS; Fcγ 수용체 차단; BioWhittaker)으로 보충된 0.1% 소혈청 알부민 (Sigma)/0.05% NaN3 (PBS/BSA/NaN3)을 포함하는 빙냉된 인산염-완충된 식염수 중에 1~2x106 세포/mL로 넣었다. 세포를 10 ㎍/mL 상업적으로 구매가능한 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 ACT35 (마우스 IgG1 이소타입; BD Biosciences [Alphen aan de Rijn, The Netherlands 소재])와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 이어서 세포들을 1:200 희석 PE-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, T 림프구를 검출하기 위하여, 세포들을 플루오로세인 이소티오시아네이트(FITC)-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD3 항체 (BD Biosciences)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)을 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
도 1에 나타낸 것과 같이 (각 공여자로부터 n=1), 말초혈액-유래의 비자극된/휴지 인간 T 림프구는 어떤 CD134도 발현하지 않았으나, 표면 CD134를 발현하기 위하여 PHA 투여량-의존적으로 인간 CD3양성 T 림프구를 자극하였다. 10 ㎍/mL PHA에 노출된 경우, 활성화된 인간 CD3양성 T 림프구 상에서 CD134 발현 수준은 '1일' 및 '2일' 사이에 안정기 (plateau)에 도달한 것으로 보였으나, 인간 CD134양성/CD3양성 T 림프구의 백분율은 시험 동안 시간-의존적으로 증가하였다.
(b) PHA -자극된 인간 CD4 T 림프구 부집단 ( subpopulation ) 상에서의 CD134 발현
PHA-자극된 (1일동안 0 및 10㎍/mL; 상기 참조) 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포를 수확하고, 10% HPS (Fcγ 수용체 차단; BioWhittaker)로 보충된 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에 1~2x106 세포/mL로 넣었다. 1:10 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD4 항체 (BD Biosciences)와 함께 또는 1:10 희석된 상업적으로 구매가능한 PE-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD134 클론 ACT35 (BD Biosciences)와 조합된 1:10 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD8 항체 (BD Biosciences)와 함께, 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)을 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, CD134 발현은 PHA-자극된 인간 CD4양성 T 림프구 상에 관찰되었으나, 휴지 인간 CD4양성 T 림프구에서는 관찰되지 않았다. 낮은 CD134 발현이 PHA-활성화된 인간 CD8양성 T 림프구 상에서 발견되었으나, 휴지 인간 CD8 양성 T 림프구에서는 발견되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
(c) PHA -자극된 인간 CD134 발현 T 림프구 상 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12 H3 및 20 E5 의 결합
PHA-자극된 (2일 동안 10㎍/mL; 상기 참조) 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포를 수확하고, 10% HPS (Fcγ 수용체 차단; BioWhittaker)로 보충된 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에 1~2x106 세포/mL로 넣었다. 0, 0.007, 0.02, 0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 ㎍/mL 의 상업적으로 구매가능한 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 ACT35 (마우스 IgG1 이소타입; BD Biosciences) 및 사내에서(in-house) 생성된 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 또는 클론 20E5와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 이어서 1:200 희석된 PE-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, T 림프구를 검출하기 위하여, 1:20 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD3 항체 (BD Biosciences)와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)를 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 (평균± SD; 두 공여자에서 관찰된 결과), 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 ACT35, 클론 12H3, 및 클론 20H5은 약 5.0~10.0 ㎍/mL에서, PHA-자극된 CD3양성 T 림프구 상에서 인간 CD134 표면 분자를 포화시켰다. 이들 두 공여자를 이용하여, 최대 결합의 절반이 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3의 경우 ~0.5 ㎍/mL, 및 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 ACT35 및 클론 20E5의 경우 ~2.5 ㎍/mL에서 관찰되었다.
(d) PHA -자극된 인간 CD134 발현 CD4 양성 및 CD8 양성 T 림프구 상에서 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12 H3 및 20 E5 의 결합
PHA-자극된 (1일 동안 20 ㎍/mL; 상기 참조) 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포를 수확하고, 10% HPS (Fcγ 수용체 차단; BioWhittaker)로 보충된 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에 1~2x106 세포/mL로 넣었다. 20.0 ㎍/mL 마우스 IgG1κ 이소타입 대조구 (BD Biosciences)와 함께, 또는 20.0 ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 또는 클론 20E5와 함께, 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 이어서 1:100 희석된 PE-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, T 림프구 부집단을 검출하기 위하여, 세포들을 1:20 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD4 항체 (BD Biosciences)와 함께 또는 1:20 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD8 항체 (BD Biosciences)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)를 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
도 4에 나타낸 것과 같이, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 클론 20E5은 활성화된 인간 CD4양성 T 림프구 부집단 상에서 양성 염색을 보였으며, 활성화된 인간 CD8양성 T 림프구 부집단 상에서 낮은 양성 염색을 보였다.
(e) PHA -자극된 인간 CD134 발현 T 림프구 상에서 비- 표지된 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12 H3 및 20 E5 의 PE - 컨쥬게이트된 상업적 마우스 항- CD134 항체와의 교차-경쟁
PHA (4일 동안 또는 1일 동안 각각 10 ㎍/mL 또는 20 ㎍/mL; 상기 참조) 자극된 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포를 수확하고, 10% HPS (Fcγ 수용체 차단; BioWhittaker)로 보충된 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에 1~2x106 세포/mL로 넣었다. 20 ㎍/mL 비-표지된 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3과 함께 또는 10 ㎍/mL 비-표지된 클론 20E5와 함께, 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포들을 1:20 희석된 PE-컨쥬게이트된 상업적으로 이용가능한 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 ACT35 (BD Biosciences) 또는 클론 L106 (BD Biosciences; Godfrey의 특허도 참조)과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. PE-컨쥬게이트된 상업적으로 이용가능한 항-CD134 항체의 결합을 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)를 이용하여 측정하였다.
도 5에 나타낸 것과 같이, 비-표지된 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3과의 예비-인큐베이션은 PHA-자극된 T 림프구 상에서 인간 CD134에 대한 상업적 PE-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 L106의 결합을 부분적으로 차단하였다. 비-표지된 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5와의 예비-인큐베이션은 PHA-자극된 T 림프구 상에서 인간 CD134에 대한 상업적 PE-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 L106의 결합은 약간 차단되었다. 비-표지된 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 클론 20E5와의 예비 인큐베이션은 PHA-자극된 T 림프구 상에서 인간 CD134에 대한 상업적 PE-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 ACT35의 결합에 어떤 영향도 보이지 않았다.
이들 결과는, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3가 PHA-자극된 T 림프구 상에서 인간 CD134 (클론 L106 결합의 부분 차단)를 특이적으로 인식하였고, (ii) 상업적 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 L106에 의하여 인식된, 인간 CD134 상에서 동일하지 않은 에피토프에 결합되었음을 증명하였다. 이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5이 (i) PHA-자극된 T 림프구 상에서 인간 CD134 (클론 L106 결합을 약간 차단)을 특이적으로 인식하였으며, (ii) 상업적 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 L106에 의하여 인식된, 동일하지 않은 에피토프에 결합되었음도 증명하였다. 또한, 이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 클론 20E5가, 상업적 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 ACT35에 의하여 인식된 에피토프와 상이한, PHA-자극된 T 림프구 상에서 인간 CD134 에피토프를 인식하는 것 같았음을 증명하였다. 추가적으로, 이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 클론 20E5이 PHA-자극된 T 림프구 상에서 다른 인간 CD134 에피토프 (L106 결합의 부분 차단 대 약간의 차단 각각에 의하여 증명됨)를 인식하는 것 같았음을 증명하였다.
(f) PHA -자극된 인간 CD134 발현 T　림프구 상에서 재조합 인간 OX40 리간드 및 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12 H3 및 20 E5 의 동시 결합
PHA-자극된 (1일 동안 10 ㎍/mL; 상기 참조) 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포를 수확하고, 10% HPS (Fcγ 수용체 차단; BioWhittaker)로 보충된 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에 1~2x106 세포/mL로 넣었다. 50.0㎍/mL 항-폴리히스티딘 항체 (마우스 IgG1, clone AD1.1.10; R&D Systems)와 조합된 10.0㎍/mL 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 OX40 리간드 (OX40L; R&D Systems)와 함께, 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 이어서 세포들을 1:100 희석된 FITC-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 10.0㎍/mL 비오티닐화 (Pierce로부터의 N-히드록시숙신이미도-비오틴 이용) 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 또는 클론 20E5와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 1:100 희석된 PE-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘 (Jackson ImmunoResearch)과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)를 이용하여 인간 OX40L 및 항-인간 CD134 항체의 결합을 측정하였다.
도 6에 나타낸 것과 같이, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5는 모두, PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구 상에서 인간 OX40L와 함께 동시에 결합되었다. 이는 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 클론 20E5이 인간 CD134 수용체 상의 OX40L 결합 영역 내에서 에피토프와 상호작용하지 않음을 나타내었다. 이러한 발견은, 인간 CD134 수용체의 인간 OX40L 결합 영역 내에서 에피토프를 인식하는 (Taylor and Schwarz. J Immunol Methods 2001; 255: 67~72; Kirin & La Jolla Institute/Croft 특허 WO 2007/062235 A2), 상업적으로 이용가능한 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 L106 (Stanford University/Godfrey 특허 EP 0 726 952 B1)과 대조적인 것이다.
(g) 항-인간 CD3 /항-인간 CD28 항체 자극제 비즈를 이용한 자극 후 인간 이펙터 및 조절성 T 림프구 상에서의 CD134 발현
인간 CD4 T 림프구를 마이크로비즈-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD4 항체 (Miltenyi Biotec) 및 VarioMACS™ Magnet/LS 컬럼 (Miltenyi Biotec)을 이용한 양성 선발에 의하여 PBMC로부터 정제하였다. 이어서, 이들 CD4 T 림프구를 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD4 항체 (Dako) 및 PE-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD25 항체 (BD Biosciences)로 염색하였다. CD4양성/CD25음성 의 통상의 이펙터 T 림프구 (Teff) 및 CD4양성/CD25고도 조절성 T　림프구 (Treg)를, Altra 유세포분석 세포 정렬기(sorter) (Beckman-Coulter)를 이용하여 정렬시켰다. 이로써 >95%의 Teff 및 >95%의 Treg의 풍부화 결과가 수득되었다. Teff 및 Treg를, 0.02 mM 피루베이트 (Gibco), 100 U/mL 페니실린 (Gibco), 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (Gibco), 및 10% 열 불활성화된 HPS (HPSi; LMI로부터)로 보충된 RPMI-1640/글루타맥스 배양 매질 (Gibco) 내에 2.5×105 세포/mL 로 넣었다. 그 후, 세포들을 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Greiner) 내에 2.5×104 세포/200㎕/웰로 접종하고, 마우스 항-인간 CD3/마우스 항-인간 CD28 항체 자극제 비즈 (CD3/CD28 비즈; Invitrogen)를 1 비드/2 세포로 이용하여, 25 U/mL 재조합 인간 인터류킨-2 (Novartis Pharmaceuticals UK Ltd로부터의 Proleukin®) 존재 하에, 37℃/5% CO2 에서 2~8 일 동안 자극하였다. 배양 후, 세포를 수확하고, 빙냉된 PBS/0.2% BSA 내에 1~2x106 세포/mL로 넣었으며, 동시에 1:50 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD4 항체 (Dako), 1:10 희석된 PE-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD25 항체 (BD Biosciences), 1:50 희석된 ECD™-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD3 항체 (Beckman-Coulter), 1:10 희석된 PE-Cy™5-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD134 항체 (클론 ATC35; BD Biosciences), 및 1:10 희석된 PE-Cy™7-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD127 항체 (eBiosciences)로 염색하였다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)을 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이 (각 공여자로부터 n=1), 말초 혈액-정제된 비-자극된/휴지 (0일) 인간 Teff 및 인간 Treg는 어떤 CD134도 발현하지 않았으나, CD3/CD28 비즈-자극된 인간 Teff 및 인간 Treg은 표면 CD134를 발현하였다. 활성화된 인간 Teff 및 인간 Treg 상에서 CD134 발현은 배양 중에서 2일 후 최고였으며, 배양 중에서 5일 및 8일 후 약화되었다.
실시예 3. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5의 생물학적 특징화
(a) 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12 H3 및 20 E5 처리 후 PHA -자극된 인간 CD134 발현 T 림프구의 증식
PHA-자극된 (1일동안 0 및 10 ㎍/mL; 상기 참조) 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포들을 수확하고, 10% 우태혈청 (Bodinco) 및 50 ㎍/mL 젠타마이신(Gibco)을 포함하는 RPMI 배양 매질 (Gibco) 내에 2×106 세포/mL로 현탁시켰다. 세포들을 96-웰 편평 바닥 플레이트 (Corning) 내에 0.1×106 세포/100㎕/웰 (즉, 1×106 세포/mL)로 접종시키고, 0, 0.025, 0.25, 2.5, 또는 25.0 ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 또는 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5에 또는/및 0, 0.01, 0.1, 또는 1.0 ㎍/mL 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 OX40L (1:5 몰 비의 마우스 항-폴리히스티딘 항체 존재 하에; R&D Systems)과 조합하여, 37℃/5% CO2에서 6 일 동안 노출시켰다. 6 일 후, 비색성 (BrdU 혼입) 세포 증식 ELISA™ (Roche) 및 A450 nm에서 ELISA 판독기 (BioRad)를 이용하여 세포 증식을 측정하였다.
도 8에 나타낸 것과 같이 (평균±SD, 하나의 공여자를 이용하여 n=4), 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5는 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에서 투여량-의존적으로 증식을 유도하였다. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3은 0.25, 2.5, 및 25 ㎍/mL에서 증식을 유도하였다. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3은 2.5 및 25 ㎍/mL에서 증식을 유도하였다. 추가적으로, 인간 OX40L도 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에서 투여량-의존적으로 증식을 유도하였다. 인간 OX40L은 0.1 및 1.0 ㎍/mL에서 증식을 유도하였다. 휴지 (PHA 자극 없이) 인간 CD134음성 T 림프구는 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5, 또는 인간 OX40L을 이용한 처리 후 어떤 증식 반응도 나타내지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
도 9에 나타낸 것과 같이 (평균±SD, 하나의 공여자 이용 n=2), 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 (2.5 및 25 ㎍/mL), 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5 (2.5 및 25 ㎍/mL), 및 인간 OX40L (1.0 ㎍/mL)은 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에서 증식을 유도하였다. 비처리된 (매질만 존재) 또는 마우스 IgG1κ 이소타입 대조구 (2.5 및 25 ㎍/mL; BD Biosciences)을 이용한 처리는 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구 증식에 어떤 효과도 나타내지 않았다. 2.5 및 25 ㎍/mL (또는 더욱 낮은 농도에서; 데이터는 나타내지 않음)의 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 또는 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5과 1.0 ㎍/mL의 (또는 더욱 낮은 농도; 데이터는 나타내지 않음) 인간 OX40L의 조합은 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에서의 증식에 대해 어떤 상호적인 (즉, 상승작용적 또는 부가 또는 심지어는 저해) 효과도 나타내지 않았다.
(b) 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12 H3 및 20 E5 처리 후 항-인간 CD3 /항-CD28 비즈 -자극된 인간 CD134 발현 T　 이펙터 및 T 조절제 림프구의 증식
인간 CD4 T 림프구를, 인간 CD8 (클론 RPA-T8), CD14 (클론 M5E2), CD16 (클론 3G8), CD19 (클론 4G7), CD33 (클론 P67.6), CD56 (클론 B159) 및 CD235a (HIR2)에 대한 마우스 항체의 칵테일 (BD BioSciences)을 이용하여 음성 선발에 의하여 PBMC로부터 정제하였다. Dynabeads®-컨쥬게이트된 양 항-마우스 IgG (Invitrogen)와 인큐베이션 후, 결합되지 않은 CD4 T 림프구를 Dynal Magnetic Particle Concentrator (다이널 자석 입자 농축기), MPC™-6 (Invitrogen)로부터 수집하였다. 이들 풍부화된 CD4 T 림프구로부터, CD25고도 Treg 및 CD25음성 Teff를 10㎕ 마이크로비즈-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD25 항체 (Miltenyi Biotec)/107 세포 및 MiniMACS™ Magnet/MS 컬럼 (Miltenyi Biotec VarioMACS™ Magnet/LS 컬럼 (Miltenyi Biotec)을 MACS-정렬에 의하여 분리하였다. 이는 >90% Teff 및 >90% Treg의 풍부화를 결과로서 생성하였다. Teff 및 Treg를 0.02 mM 피루베이트 (Gibco), 100 U/mL 페니실린 (Gibco), 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (Gibco), 및 10% HPSi 으로 보충된 RPMI-1640/글루타맥스 배양 매질 (Gibco) 내에 0.25×106 세포/mL로 넣었다. 그 후, Teff 및 Treg를 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Greiner)에 2.5×104　세포/200㎕/웰 (즉, 0.125×106 세포/mL)로 접종하고, 1 비드/5 세포의 CD3/CD28 비즈 (Invitrogen)를 이용하여, 5.0 ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3, 5.0 ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5, 1.0 ㎍/mL 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 OX40L (1:5 몰 비 마우스 항-폴리히스티딘 항체 존재 하에; R&D Systems), 5.0 ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3와 1.0 ㎍/mL 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 OX40L의 조합 (1:5 몰 비 마우스 항-폴리히스티딘 항체 존재 하에), 또는 5.0 ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5와 1.0 ㎍/mL 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 OX40L의 조합 (1:5 몰 비 마우스 항-폴리히스티딘 항체 존재하에)과 함께 또는 이의 부재 하에서, 37℃/5% CO2에서 4일 또는 5 일 동안 자극하였다. 4일 또는 5일 후, 0.5μCi 3중수소화 티미딘 (Perkin & Elmer) 혼입 및 β-카운터 (Canberra-Packard)를 이용하여 세포 증식을 측정하였다.
도 10에 나타낸 것과 같이 (평균±SD), CD3/CD28 자극제 비즈는 인간 CD134 발현 Teff (즉, 매질)에서 상당한 증식을 단독으로 유도하였으나, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 또는 인간 OX40L은 CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 Teff에서 추가적인 증식을 유도하였다. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5는 CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 Teff에서 추가적인 증식을 유도하지 않았다.
도 11에 나타낸 것과 같이 (5 공여자로부터의 평균±SEM), 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5는 CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 Treg에서 증식을 유도하지 않거나 또는 낮은 증식을 유도한 한편, 인간 OX40L은 CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 Treg에서 매우 강한 증식을 유도하였다.
도 12A에 나타낸 것과 같이 (평균±SD), 인간 OX40L과 조합된 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3은 CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 Teff에서 어떤 상호적인 (즉, 저해, 상승작용적 또는 부가적) 효과도 나타내지 않았다. 또한, 인간 OX40L과 조합된 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5은 CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 Teff에서 어떤 상호적인 (즉, 저해, 상승작용적 또는 부가적) 효과도 나타내지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
도 12B에 나타낸 것과 같이 (평균±SD), CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 Teff에서 인간 OX40L-매개된 증식 반응으로 관찰된 효과 (어떤 효과의 결여)에 대조적으로, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3은 CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 Treg에서 인간 OX40L-매개된 증식 반응을 강하게 억제하였다.
(c) 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12 H3 및 20 E5 처리 후 항-인간 CD3 /항-CD28 비즈 -자극된 인간 CD134 발현 T 조절제 림프구의 억제 기능
인간 CD4 T 림프구를 PBMC로부터 정제하고, Teff 및 Treg를 상기 실시예 3(b)에 기재된 것과 같이 풍부화하였다. Teff 및 Treg를, 0.02 mM 피루베이트 (Gibco), 100 U/mL 페니실린 (Gibco), 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (Gibco), 및 10% HPSi로 보충된 RPMI-1640/글루타맥스 배양 매질 (Gibco) 내에 0.25×106 세포/mL로 넣었다. 그 후, Teff를 2.5x104 세포/200㎕/웰 (즉, 0.125×106 Teff/mL)로 접종하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Greiner)에 2.5x104 억제성 Treg/200㎕/웰 (즉, 0.125×106 Treg/mL; Teff/Treg 비 = 1:1)로 공동배양하였다. 이들 Teff/Treg 공동배양은 1 비드/10 세포의 CD3/CD28 비즈 (Invitrogen)로, 5.0 ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3, 5.0 ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5, 및 1.0 ㎍/mL 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 OX40L (1:5 몰 비 마우스 항-폴리히스티딘 항체 존재 하에; R&D Systems)과 함께 또는 이의 부재 하에 37℃/5% CO2에서 5일 동안 자극되었다. 5일 후, 0.5 μCi 3중수소화 티미딘 (Perkin & Elmer) 혼입 및 β-카운터 (Canberra-Packard)를 이용하여 세포 증식을 측정하였다.
도 13에 나타낸 것과 같이 (평균±SD), 인간 Treg는 CD3/CD28 비즈-유도된 인간 Teff 증식 반응을 억제하였다 (즉, 매질). 인간 Treg의 이러한 억제성 기능은 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3의 존재 하에서 또는 인간 OX4OL의 존재 하에서 약화되었다. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5은 인간 Treg 억제 기능에 어떤 영향도 나타내지 않았다.
실시예 4. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5 및 12H3의 분자 유전학적 특징화
(a) 이소타입화 및 에드만 ( Edman ) 분해
단백질 G-정제된 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5 및 12H3의 마우스 면역글로불린 클래스, 이소타입, 및 경쇄 유형을, IsoStrip™ 마우스 모노클로날 항체 이소타입 키트 (Roche)를 이용하여 결정하였으며, 이는 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5 및 12H3 모두가 κ 경쇄를 갖는 마우스 IgG1 였음을 보여주었다.
표준 LDS-PAGE 전기영동 후, 감소된 (DTT 및 70℃ 가열) 조건 하에서 예비-캐스트 겔 NuPage® Novex® 시스템 (Invitrogen)을 이용하여, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5를 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PDVF/Immobilon-P) 전달막 (Millipore) 상에 일렉트로-블로팅(electro-blotted)하였으며, 쿠마씨 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) (BioRad)로 염색하였다. 그 후, 중쇄 및 경쇄 밴드 (각각 50 kDa 및 25 kDa)를 PVDF 막으로부터 절단하고, 에드만 분해 분석에 사용하여 (EuroSequence [Groningen, The Netherlands 소재]에 의해 수행) N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 결과를 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5에 대한 서열번호 3 및 서열번호 61에 나타내었다. 중쇄로부터의 N-말단의 11개 아미노산 및 경쇄로부터의 N-말단의 11개 아미노산을 결정하였다.
(b) RT PCR
클론 20E5 및 12H3의 하이브리도마 세포를 세포 배양물로부터 수확하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 5×106 세포를 담은 바이알 내로 분액하고, 펠렛으로서 -80℃에서 보관하였다. 세포 펠렛은, RNeasy Mini Isolation Kit (QIAGEN)를 이용하여 RNA를 분리하는데 사용되었다. RNA 농도를 결정하고 (A260 nm) RNA를 -80℃에서 보관하였다. 분리된 RNA의 총 수율: 클론 20E5 및 클론 12H3 각각에 대하여 27.3 ㎍ 및 58.4 ㎍ (두 경우 모두에서 A260/A280 비는 1.9). 역전사제에 의하여, cDNA를 RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)를 이용하여 RNA 1 ㎍을 합성하고, -20℃에서 보관하였다.
마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5의 이소타입 (마우스 카파/IgG1) 및 에드만 분해 분석에 근거하여, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5의 V-영역을 증폭하기 위하여 하기 프라이머들을 설계하였다:
Figure pct00001
* Bioceros 내부 코딩 시스템에 따른 번호;
** 변성 (degnerated) 프라이머: N = A, C, G, 또는 T, Y = C 또는 T, R = A 또는 G, W = A 또는 T, 및 S = G 또는 C.
마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3의 이소타입 (마우스 카파/IgG1) 및 마우스 신호 펩타이드를 암호화하는 cDNA에 어닐링하는 센스 프라이머에 근거하여 (Antibody Engineering Volume 1 Kontermann, Roland E.; Duebel, Stefan (Eds.), Springer Lab Manuals, 제 2판, 2010에 일부 근거), 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3의 V-영역을 증폭하기 위하여 하기 프라이머들을 설계하였다:
Figure pct00002
* Bioceros 내부 코딩 시스템에 따른 번호;
** 변성 프라이머: N = A, C, G, 또는 T, Y = C 또는 T, R = A 또는 G, W = A 또는 T, 및 S = G 또는 C, M = C 또는 A 및 K = G 또는 T.
프라이머 201 및 266은, 각각 214~232 및 236~255 위치에서 마우스 카파 유전자의 불변영역 내에서 어닐링을 위하여 설계된 안티센스이다 (접수번호 V00807에 근거 [버전 V00807.1]).
프라이머 203 및 204는, 각각 115~134 및 221~240 위치에서 마우스 IgG1의 불변영역 내에서 어닐링을 위하여 설계된 안티센스이다 (접수번호 J00453에 근거 [버전 J00453.1]).
프라이머 259 및 260은, 에드만 분해에 근거하여 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5의 중쇄의 N-말단 (각각 아미노산 1~8 및 2~9)에서 어닐링한 센스 변성 프라이머 (각각 512 및 256에서 변성)이다.
프라이머 265는, 에드만 분해에 근거하여 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5의 경쇄의 N-말단 (아미노산 1~7)에서 어닐링한 센스 변성 프라이머(16에서 변성)이다.
프라이머 416은, 111~131 위치에서 마우스 IgG1의 불변 영역 내에서 어닐링을 위해 설계된 안티센스이다 (접수번호 J00453에 근거 [버전 J00453.1]).
프라이머 394는 235~254 위치에서 마우스 카파 유전자의 불변 영역 내에서 어닐링을 위해 설계된 안티센스이다 (접수번호 V00807에 근거[버전 V00807.1]).
프라이머 389, 405 및 410은 쥐과 항체의 신호 펩타이드 서열을 이용하여 어닐링한 변성 프라이머이다 (각각 2, 8 및 8에서 변성). 프라이머 389는 경쇄에 대해 설계되었고, 프라이머 405 및 410은 중쇄에 대해 설계되었다.
프라이머 201, 266, 203, 204, 259, 260 및 265은 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5의 가변 영역 증폭을 위한 각종 조합에 사용되었으며, 프라이머 416, 394, 405, 410 및 389는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3의 가변 영역 증폭을 위한 각종 조합에 사용되었다. 두 클론들 모두의 생성된 cDNA를 주형으로 사용하여 각종 상이한 PCR을 수행하였다.
AccuprimeTM Pfx DNA 폴리머라아제 (Invitrogen)를, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 및 클론 12H3 모두의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 증폭하는데 사용하였다. PCR 생성물을 1% 아가로오스 겔 상에서 분석하였다. PCR 반응 생성물을, 서열 분석을 위하여 겔-정제하고, pCR-Blunt II-TOPO® 벡터에서 클로닝하였다. PCR 삽입물을 포함하는 플라스미드로부터, 클로닝된 삽입물을 T7을 이용하여 DNA 서열분석 (ServicXS B.V. [Leiden, The Netherlands 소재] 또는 Macrogen [Amsterdam, The Netherlands 소재]에 의하여 수행)에 의해 분석하여, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 및 12H3의 V-영역의 컨센서스 서열을 수득하였다. 11개의 정보 서열들 중쇄 반응 및 3개의 정보 경쇄 서열 반응이, 마우스 항-CD134 항체 클론 20E5에 대해 수득되었다. 5개의 정보 서열 중쇄 반응 및 3 개의 정보 경쇄 서열 반응이 마우스 항-CD134 항체 클론 12H3에 대해 수득되었다. 이 정보에 기초하여, 두 항체들 모두의 V-영역의 컨센서스 서열을 결정하였다 (서열번호 4, 5, 12 및 13 참조).
본 명세서에서 명백한 선행-간행 문헌들의 열거 또는 논의는, 그 문헌이 반드시 현 기술수준의 일부 또는 흔한 일반 지식이라는 인정으로서 받아들여져서는 안된다.
실시예 5. 키메릭 인간 IgG4/카파 및/또는 인간 IgG1/카파 (즉, 마우스 불변 도메인을 불변 인간 IgG/카파 도메인으로 교환) 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5 및 12H3의 생성
마우스 항-CD134 항체 클론 20E5 및 12H3의 결정된 쥐과의 V-영역 (상기 실시예 4 (b) 참조)에 기초하여, 키메릭 인간 항체 버전을 생성하기 위한 설계를 하였다. 이 목적을 위하여, CHO 세포-최적화된 cDNA 서열 (서열번호 20 (키메릭 인간 중쇄 IgG4 클론 20E5을 코딩), 서열번호 21 (키메릭 인간 경쇄 κ 클론 20E5를 코딩), 서열번호 22 (키메릭 인간 중쇄 IgG1 클론 20E5를 코딩), 서열번호 23 (키메릭 인간 중쇄 IgG4 클론 12H3을 코딩), 및 서열번호 24 (키메릭 인간 경쇄 κ 클론 12H3을 코딩))을 GENEART (Regensburg, Germany 소재)에서 정렬하였으며 (ordered), 이는 인간 카파 불변 영역에 연결된 가변 경쇄가 뒤따르거나 또는 인간 IgG 불변 영역에 연결된 가변 중쇄가 뒤따르는 쥐과의 신호 펩타이드를 암호화하였다. 이 설계는 두 항체 모두에 대하여 수행되었으며; 클론 20E5의 경우, 가변성 중쇄는 인간 IgG4 또는 인간 IgG1 불변 영역에 연결되었다; 클론 12H3의 경우, 가변성 중쇄 영역은 인간 IgG4 불변 영역에 연결되었다. 적합한 제한 효소를 이용하여, 생성된 cDNA를 pcDNA3.1-유도된 발현 플라스미드에서 서브클로닝하였다. FreeStyle™ MAX CHO (CHO-S 세포) 발현 시스템 (Invitrogen)을 이용하여 키메릭 항체를 발현시켰다. 발현된 항체를 친화성 크로마토그래피 단백질 A 컬럼 (GE Healthcare)을 이용하여 정제하였다. 키메릭 아미노산 서열에 대하여, 서열번호 25, 26, 27, 28, 및 29 참조.
실시예 6. 키메릭 인간 IgG4/카파 및/또는 IgG1/카파 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5의 결합 특징화
(a) PHA -자극된 인간 CD134 발현 CD4 양성 T 림프구 상에서 인간 IgG4 κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20 E5 의 결합 특징
PHA-자극된 (1일 동안 10㎍/mL; 상기 참조) 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포를 수확하고, 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에 1~2x106 세포/mL로 넣었다. 0, 0.007, 0.02, 0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 ㎍/mL 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 이어서 1:50 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 IgG4 항체 (Sigma)와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 1:10 희석된 PE-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD4 항체 (BD Biosciences)와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)를 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5은, 약 5.0~10.0 ㎍/mL에서 PHA-자극된 CD4양성 T 림프구 상에서 인간 CD134 표면 분자들을 포화시켰다 (데이터는 나타내지 않음). 최대 결합 절반은, 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5의 경우 ~1.0 ㎍/mL에서 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음).
(b) PHA -자극된 인간 CD134 발현 CD4 양성 및 CD8 양성 T 림프구 상에서 키메릭 인간 IgG4 κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20 E5 의 결합
PHA-자극된 (1일 동안 10㎍/mL; 상기 참조) 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포들을 수확하고, 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에 1~2x106 세포/mL로 넣었다. 20.0 ㎍/mL 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5와 함께 또는 부재하에 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 이어서 1:200 희석된 PE-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (Fcγ 특이적) 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, T 림프구 부집단을 검출하기 위하여, 1:10 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD4 항체 (BD Biosciences)와 함께 또는 1:10 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD8 항체 (BD Biosciences)와 함께 세포들을 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)을 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5는, PHA-활성화된 인간 CD4양성 T 림프구 부집단 상에서 양성 염색, 및 PHA-활성화된 인간 CD8양성 T 림프구 부집단에서 낮은 양성 염색을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
(c) 항-인간 CD3 /항-인간 CD28 항체 자극제 비즈 -자극된 인간 CD134 발현 CD4 양성 및 CD8 양성 T 림프구 상에서 키메릭 인간 IgG4 κ 항-인간 CD134 모노클 로날 항체 클론 20E5의 결합
건강한 공여자 (사전 동의)로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 Lymphoprep (1.077 g/mL; Nycomed) 상에서 밀도 원심분리에 의해 분리하였다. 이어서, 10% 우태혈청 (Bodinco) 및 50 ㎍/mL 젠타마이신 (Gibco)을 포함하는 RPMI-1640 배양 매질 (Gibco) 내의 1×106 PBMC/mL를, 마우스 항-인간 CD3/마우스 항-인간 CD28 항체 자극제 비즈 (CD3/CD28 비즈; Invitrogen)를 1 비드/4 세포로 이용하여, 25 U/mL 재조합 인간 인터류킨-2 (PeproTech) 존재 또는 부재 하에, 37℃/5% CO2 에서 1일 동안 자극시켰다. 배양 후, PBMC를 수확하고, 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에 1~2×106 세포/mL로 넣었다. 20.0 ㎍/mL 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5과 함께 또는 이의 부재 하에 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 이어서 1:200 희석된 PE-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (Fcγ 특이적) 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, T 림프구 부집단을 검출하기 위하여 1:10 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD4 항체 (BD Biosciences)와 함께 또는 1:10 희석된 FITC-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 CD8 항체 (BD Biosciences)와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)을 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5는 CD3/CD28 비즈-활성화된 인간 CD4양성 T　림프구 부집단 상에서 양성 염색, 그리고 CD3/CD28 비즈-활성화된 인간 CD8양성 T 림프구 부집단 상에서 낮은 양성 염색을 나타내었다. 재조합 인간 IL-2 보충물을 사용한 명백한 효과는 없는 것으로 관찰되었다.
실시예 7. 키메릭 인간 IgG4/카파 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5의 생물학적 특징화
(a) 키메릭 인간 IgG4 κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20 E5 처리 후 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구의 증식
PHA-자극된 (1일 동안 10 ㎍/mL; 상기 참조) 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포들을 수확하고, 10% 우태혈청 (Bodinco) 및 50 ㎍/mL 젠타마이신 (Gibco)을 포함하는 RPMI 배지 (Gibco) 내 2×106 세포/mL로 현탁시켰다. 세포를 96-웰의 편평 바닥 플레이트 (Corning)에 0.1×106 세포/100㎕/웰 (즉, 1×106 세포/mL)로 접종하고, 25.0 ㎍/mL 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 또는 25.0 ㎍/mL 대조구 인간 IgG4κ 항-인간 CD40 항체 (PG102; Pangenetics), 또는 1.0 ㎍/mL 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 OX40L (1:5 몰 비 마우스 항-폴리히스티딘 항체 존재 하에서; R&D Systems)에, 37℃/5% CO2에서 6일 동안 노출시켰다. 6일 후, 비색성 (BrdU 혼입) 세포 증식 ELISA™ (Roche) 및 A450nm에서 ELISA 판독기 (BioRad)를 이용하여 세포 증식을 측정하였다.
도 15에 나타낸 것과 같이 (평균±SD), 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 (hu20E5) 및 인간 OX40L은 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에서 증식을 유도하였다. 비처리된 (매질만 존재) 또는 대조군 인간 IgG4κ 항-인간 CD40 항체 (huIgG4)를 이용한 처리는 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구 증식에 대한 어떤 효과도 나타내지 않았다.
(b) 재조합 인간 OX40L 와 조합된 키메릭 인간 IgG4 κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20 E5 처리 후 PHA -자극된 인간 CD134 발현 T 림프구의 증식
PHA-자극된 (1일 동안 10 ㎍/mL; 상기 참조) 인간 CD134 발현 T 림프구를 생성하였다. 세포들을 수확하고, 10% 우태혈청 (Bodinco) 및 50 ㎍/mL 젠타마이신 (Gibco)을 포함하는 RPMI 배양 매질 (Gibco) 내에서 2×106 세포/mL로 현탁하였다. 세포를 96-웰의 편평 바닥 플레이트 (Corning)에 0.1×106 세포/100㎕/웰 (즉, 1×106 세포/mL)로 접종하고, 0, 0.025, 0.25, 2.5, 또는 25.0 ㎍/mL 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5, 또는/및 이와 0, 0.01, 0.1, 또는 1.0 ㎍/mL 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 OX40L (1:5 몰 비의 마우스 항-폴리히스티딘 항체 존재 하에; R&D Systems)과의 조합에 37℃/5% CO2 에서 6 일 동안 노출시켰다. 6일 후, 비색성 (BrdU 혼입) 세포 증식 ELISA™ (Roche) 및 A450nm에서 ELISA 판독기 (BioRad)를 이용하여 세포 증식을 측정하였다.
도 16에 나타낸 것과 같이 (평균±SD), 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 (hu20E5) 및 인간 OX40L은 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에서 투여량 의존적으로 증식을 유도하였다. 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5는 2.5 및 25 ㎍/mL (공여자 1) 또는 0.25, 2.5, 및 25 ㎍/mL (공여자 2)에서 공여자-의존적으로 증식을 유도하였다. 추가적으로, 인간 OX40L은, 0.1 및 1.0 ㎍/mL (공여자 1) 또는 0.01, 0.1, 및 1.0 ㎍/mL (공여자 2) 중 어느 하나에서 공여자-의존적으로 증식을 유도하였다.
도 17에 나타낸 것과 같이 (평균±SD), 2.5 및 25 ㎍/mL (또는 더욱 낮은 농도; 데이터는 나타내지 않음)의 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 (hu20E5)의 0.1 및 1.0 ㎍/mL (또는 더욱 낮은 농도; 데이터는 나타내지 않음)의 인간 OX40L와의 조합은, PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에서의 증식에 어떤 상호적인 (즉, 상승작용적 또는 부가적 또는 심지어는 저해) 효과도 나타내지 않았다.
(c) 키메릭 인간 IgG4 κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20 E5 로 처리 후, 항-인간 CD3 /항-인간 CD28 항체 자극제 비즈 -자극된 인간 CD134 발현 T 림프구의 증식
건강한 공여자로부터 (사전 동의) 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 Lymphoprep (1.077 g/mL; Nycomed) 상에서 밀도 원심분리에 의하여 분리하였다. 이어서, PBMC를 10%, 우태혈청 (Bodinco) 및 50 ㎍/mL 젠타마이신 (Gibco)을 포함하는 RPMI-1640 배양 매질 (Gibco) 내에, 96-웰 편평 바닥 플레이트 (Corning) 내에 0.1×106 세포/100㎕/웰 (즉, 1×106 세포/mL)로 접종하고, 마우스 항-인간 CD3/마우스 항-인간 CD28 항체 자극제 비즈 (CD3/CD28 비즈; Invitrogen)를 1 비드/2 세포로 이용하여, 25 U/mL 재조합 인간 인터류킨-2 (PeproTech) 부재 또는 존재 하에, 37℃/5% CO2에서 자극하였다. 1일 또는 2일 후, 이들 (마이너스 및 플러스 인터류킨-2) CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구를 25.0 ㎍/mL 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5에 또는 1.0 ㎍/mL 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 OX40L (1:5 몰비의 마우스 항-폴리히스티딘 항체 존재; R&D Systems)에, 37℃/5% CO2에서 각각 6일 또는 5일동안 노출시켰다. 처음에는 CD3/CD28 비즈와 재조합 인간 인터류킨-2의 조합물로 자극된 세포를, 1일 25 U/mL의 재조합 인간 인터류킨-2을 이용하여 세포 증식 측정 1일 전에 재-자극하였다. 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 또는 인간 OX40L에 노출한지 6일 또는 5일 후, 비색성 (BrdU 혼입) 세포 증식 ELISA™ (Roche) 및 A450nm에서 ELISA 판독기 (BioRad)를 이용하여 세포 증식을 측정하였다.
도 18에 나타낸 것과 같이 (평균±SD, 하나의 공여자 이용 n=3), CD3/CD28 자극제 비즈는 인간 CD134 발현 T 림프구 (즉, 매질)에서 상당한 증식을 단독으로 유도하였지만, 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 항체 클론 20E5 (hu20E5) 및 인간 OX40L는 CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구에서 추가적인 증식을 유도하였다. 인터류킨-2만의 첨가는, CD3/CD28 비즈-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구 내 기저 (즉, 매질) 증식을 증진시키기만 하는 것으로 보였다.
(d) 인간 ( 키메릭 ) 항-인간 CD134 항체 클론 12 H3 및 20 E5 로 처리 후, 붉은털 원숭이 ( rhesus macaque monkey )에서 면역자극 반응
비-인간 영장류인 붉은털 원숭이는 원숭이류 면역결핍 바이러스 단백질, gp130을 이용하여, Weinberg 등 (J Immunother 2006; 29: 575~585)에 기재된 바와 같이, 면역화될 수 있다.
인간 (예로서, 키메릭 또는 인간화된 또는 탈면역화된; 예로서, 서브클래스 인간 IgG1 또는 IgG4) 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5로 처리된 면역화된 원숭이로부터의 배출 (draining) 림프절은 대조구 면역화된 원숭이와 비교하여 확장된 림프절을 나타내는 것으로 예측된다. 인간 (예로서, 키메릭 또는 인간화된 또는 탈면역화된) 항-인간 CD134 항체 클론 12H3-처리된 및 20E5-처리된 원숭이는, 대조구에 비교하여, 증가된 gp130-특이적 항체 역가 및 증가된 오래지속된(long-lived) T-세포 반응을 나타내는 것으로 예측된다. (예로서, 키메릭 또는 인간화된 또는 탈면역화된) 항-인간 CD134 항체 클론 12H3-처리된 또는 클론 20E5-처리된 원숭이에서 명백한 독성의 표시는 없어야만 한다.
실시예 8. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5에 의하여 인식된 인간 CD134 도메인 및 에피토프의 특징화
(a) 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12 H3 및 20 E5 의, 비- 감소된 및 감소된 재조합 인간 CD134 :인간 Fc γ 융합 단백질 ( 웨스턴 블로팅 )과의 결합
1300 또는 650 ng/래인 (쿠마씨 브릴리언트 블루 염색의 경우) 또는 250 ng/래인 (웨스턴 블로팅의 경우)의 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ (IgG1) 융합 단백질 (R&D Systems)을 4~12% Tris-비스 겔 및 MOPS 흐름 (running) 버퍼 (Invitrogen)를 이용하여, 예비-캐스트 LDS-PAGE 변성화 전기영동 NuPage® Novex® 시스템에서 각종 비-환원 및 환원 조건 (도 19-A 참조) 하에 전기영동하였다. 그 후, 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PDVF) 수송막 (Millipore) 상에서 쿠마씨 브릴리언트 블루 (BioRad)로 염색하거나 또는 일렉트로-블로팅되었다. RT에서 20분 동안 PBS/0.05% Tween 20/1% BSA 분획 V (Roche)로 차단한 후, PDVF 막을 RT에서 1시간 동안 100 ng/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 또는 20E5과 인큐베이션하였다. 병행하여, 100 ng/mL 마우스 IgG1κ 이소타입 대조구 항체 (BD Biosciences)를 음성 대조구로서 사용하였다. PBS/0.05% Tween 20 내에서 철저히 세척 후, RT에서 1시간 동안 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 또는 20E5의 결합을 1:5000 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 Fcγ-특이적 항체 (Jackson ImmunoResearch)를 이용하고, 이어서 비색 검출을 위하여 TMB 기질 (Sigma)의 바로 사용가능한 용액을 이용하여 결정하였다.
도 19-B에 나타낸 것과 같이, 비환원 (및 각각 열 변성화와 함께 및 열변성화 없는 LDS 변성화인 조건 a 및 b) 조건 하에서 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질은 ~130~140 kDa의 분자 질량인 것으로 나타났다. 가열 없이 비-환원 (조건 a)은 가까이 근접한 두 밴드들을 보였으며, 이는 재조합 인간 CD134: 인간 Fcγ 융합 단백질 분획이 불완전하게 변성화/펼쳐졌음을 암시하였다. 가열과 함께 비환원 (조건 b)은 하나의 밴드를 보였으며, 이는 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질은 완전히 변성화/펼쳐졌음을 암시하였다. 환원 (및 각각 열 변성화와 함께 및 열변성화 없는 LDS 변성화인, 조건 c 및 d) 조건 하에서의 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질은 ~110 kDa (조건 c) 및 ~60~65 kDa (조건 d)에서의 밴드를 결과로서 생성하였다. 앞의 관찰은 재조합 인간 CD134:인간 FCγ 융합 단백질의 불완전한 환원을 암시하였으며, 후의 관찰은 각 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질 분자 내에서 두 개의 인간 IgG1-유도된 Fcγ-단편들을 연결하고 있는 이황화물 다리결합의 완전한 환원/파괴를 암시하였다.
도 19-C에 나타낸 것과 같이, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 클론 20E5는 모두 비환원 (및 각각 열 변성화와 함께 및 열변성화 없는 LDS 변성화인, 조건 a 및 b) 조건 하에서 주로 ~130 kDa의 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질을 인식하였다. 대조적으로, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3은 환원(및 각각 열 변성화와 함께 및 열변성화 없는 LDS 변성화인, 조건 c 및 d) 조건 하에서 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질과 단지 약한 결합만을 보이는 한편, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5는 환원 (및 각각 열 변성화와 함께 및 열변성화 없는 LDS 변성화인, 조건 c 및 d) 조건 하에서 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질에의 강한 결합을 보였다.
이들 결과는, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 클론 20E5은 인간 CD134를 특이적으로 인식함을 증명하였다. 나아가, 이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 클론 20E5가 유사하지 않은 인간 CD134 에피토프를 인식하는 것 같았음을 증명하였으며, 이는 환원 (및 열 변성화와 함께 및 열변성화 없는 LDS 변성화) 조건 하에서 재조합 인간 CD134:인간 Fcγ 융합 단백질과의 각각의 약한 결합 (클론 12H3) 대 강한 결합 (클론 20E5)에 의하여 증명된다. 이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3이 인간 CD134 상에서 에피토프를 인식하였음을 암시하였으며, 이는 변성화 (LDS 및 열 처리)에 민감성이지 않고, 환원 (즉, DTT에 의한 - 필경, 시스테인-풍부 도메인 (CRD)-관련된- 이황화물 다리결합(들)의 파괴)에 민감성이다. 이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5가 인간 CD134 상에서 에피토프를 인식하였음을 암시하였고, 이는 변성화 (LDS 및 열 처리)에 민감성이지 않고, 환원 (즉, DTT에 의한 -필경, CRD-관련된- 이황화물 다리결합(들)의 파괴)에 민감성이 아니다.
(b) 293-F 세포주 상에서 발현된 전장 인간 CD134 구축물 및 각종 절단된 인간 CD134 구축물과 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12 H3 및 20 E5 의 결합 (도메인 맵핑)
마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5의 양호한 특이성을 분석하기 위하여, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5에 의하여 인식된 에피토프(들)의 위치를 도메인 맵핑에 의하여 결정하였다. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5이, (HEK-유도된) 297-F 세포의 표면 상에서 발현된, 절단된 인간 CD134 구축물에 결합하는 능력을 FACS 분석에 의하여 결정하였다.
문헌 (Swiss-Prot: P43489.1; Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683; Bodmer 등 Trends Biochem Sci 2002; 27: 19~26; Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321~1330; US 특허 2011/0028688 A1)에 근거하여, 인간 CD134의 세포외 영역 내에서 시스테인-풍부 도메인 (CRD) 및 힌지-유사 (hinge-like) 구조를 확인하였다. CRD은 CRD1, CRD2, (절단된) CRD3, (절단된) CRD4로 코딩되어 있다 (도 20 참조). CRD는, A-모듈 및 B-모듈로 지칭되는, 분자배열학적으로 구분되는 유형의 분자들을 포함한다 (역시 도 20 참조). A-모듈은 C-형태의 구조이고, B-모듈은 S-형태의 구조이다. 전형적인 CRD는 6 개의 보존된 시스테인 잔기를 갖는 A1-B2-모듈 또는 A2-B1-모듈 (또는, 덜 빈번하게, A1-B1과 같은 상이한 모듈의 짝)로 일반적으로 구성되며, 여기에서 숫자는 각 모듈 내의 이황화물 다리결합의 수를 나타낸다 (역시 도 20 참조). 도 20에 나타낸 것과 같이, 5개의 상이한 인간 CD134 구축물을 생성 및 발현하였다: (1) N-말단 CRD1 (즉, CRD1 A1-B2-모듈은 아미노산 29~65를 커버)로 시작하고, 따라서 'CRD1'로서 표시되었으며, 아미노산 1~277을 포함한, 전장 인간 CD134 구축물 (서열번호 1 참조), (2) N-말단 CRD2 (즉, CRD2 A1-B2-모듈은 아미노산 66~107을 커버한다)로 시작하고, 신호 펩타이드 아미노산 1~28에 연결된 아미노산 66~277을 포함하는 'CRD2' 구축물 (서열번호 30 참조), (3) N-말단 CRD3 (즉, CRD3 A1-B1-모듈은 아미노산 108~146을 커버하거나 (Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321~1330에 따름) 또는 절단된 CRD3 A1-모듈은 아미노산 108~126을 커버한다 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683을 따름))로 시작하고, 신호 펩타이드 아미노산 1~28에 연결된 아미노산 108~277을 포함하는 'CRD3' 구축물 (서열번호 31 참조), (4) N-말단 CRD4 또는 CRD3 서브도메인 B1-모듈/절단된 CRD4 A1-모듈 (즉, CRD4 A1-B1-모듈은 아미노산 127~167을 커버하거나 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683) 또는 절단된 CRD4 A1-모듈과 CRD3 서브도메인 B1-모듈의 조합은 (도 20에 나타내지 않음) 아미노산 147~167을 갖는 아미노산 127~146을 각각 커버한다 (Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321~1330))로 이루어지고, 그리고 신호 펩타이드 아미노산 1~28에 연결된 아미노산 127~277을 포함하는, 'CRD4' 구축물 (서열번호 32 참조), 및 (5) N-말단 절단된 CRD4 또는 CRD4 서브도메인 B1-모듈 (즉, 절단된 CRD4 A1-모듈은 아미노산 147~167을 커버하거나 (Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321~1330) 또는 CRD4 서브도메인 B1-모듈 (도 20에 나타내지 않음; Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683)은 아미노산 147~167을 커버한다)로 이루어지고, 신호 펩타이드 아미노산 1~28에 연결된 아미노산 147~277을 포함하는, '절단된 (tc) CRD4' 구축물' (서열번호 33 참조). AccuprimeTM Pfx DNA 폴리머라아제 (Invitrogen)을 이용하는 조립 PCR에 의하여, 이들 5개의 인간 CD134 구축물을 하기 표에 나타낸 프라이머들을 이용하여 생성하였다:
Figure pct00003
* 프라이머 번호는 Bioceros 내부 코딩 시스템에 따름
간략히는, 신호 펩타이드의 cDNA 암호화 아미노산 1~28 및 인간 CD134의 cDNA 암호화 아미노산 66~277을, 전장의 인간 CD134를 주형으로서 이용하는 PCR 반응에서 개별적으로 프라이머쌍 362/365 및 364/363을 이용하여 증폭하였다. 이어서, 프라이머 쌍 362/363을 이용하는 조립 PCR에서 이들 두 개의 PCR 생성물들을 이용하여 'CRD2' 구축물을 생성하였다. cDNA 암호화 'CRD2' 구축물을, 적합한 제한 자리를 이용하여 pcDNA3.1-유도된 발현 플라스미드 내로 서브클로닝하였다. 유사하게, 'CRD3' 구축물 (인간 CD134의 아미노산 108~277에 연결된 신호 펩타이드의 아미노산 1~28), 'CRD4' 구축물 (아미노산 127~277에 연결된 신호 펩타이드의 아미노산 1~28), 및 '절단된 CRD4' 구축물 (아미노산 147~277에 연결된 신호 펩타이드의 아미노산 1~28)을, 상기 언급된 표에 나타낸 대응 프라이머를 이용하여, pcDNA3.1-유도된 발현 플라스미드 내에서 생성 및 서브클로닝하였다. 나아가, 전장 인간 CD134 (서열번호 1)도 pcDNA3.1-유도된 발현 플라스미드 내에서 재클로닝하였다.
FreeStyleTM 293 발현 시스템 (Invitrogen)을 이용하여, FreeStyleTM 293-F 세포 (Invitrogen)를 인간 CD134의 5개의 생성된 변이체들로 일시적으로 형질감염시켰다. 48~72시간 후, 형질감염된 세포 상에서의 표면 인간 CD134 발현을 FACS 분석에 의하여 분석하였다. 이 목적을 위하여, 형질감염된 세포들을 수확하고, 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에서 1~2×106 세포/mL로 넣었다. 20.0 ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 병행하여, 20.0 ㎍/mL 마우스 IgG1κ 이소타입 대조구 항체 (BD Biosciences)를 음성 대조구로서 사용하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 이어서 세포들을 1:200 희석된 PE-컨쥬게이트된 염소 항-마우스IgG (Fcg 특이적) 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)을 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
도 21에 나타낸 것과 같이, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5은 모두 형질감염된 293-F 세포 상에서 전장 인간 CD134를 인식한 한편 ('CRD1' 구축물로 표시됨), 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5는 모두 모의-형질감염된 (mock-transfected) 293-F 세포 상에서 결합을 나타내지 않았다. 또한, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5는, 형질감염된 293-F 세포 상에서 CRD1 및 CRD1-CRD2을 결여한 절단된 인간 CD134 변이체들 (각각, 'CRD2' 구축물 및 'CRD3' 구축물로 표시됨)을 인식하였다. 대조적으로, CRD1-CRD2-절단된 CRD3 A1-모듈을 결여한 절단된 인간 CD134 변이체 ('CRD4' 구축물로 표시됨)에 대한 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3의 결합은 매우 약하였고, (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따른) CRD1-CRD2-절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 또는 대안적으로 CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-모듈을 결여한 절단된 인간 CD134 변이체 (Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321~1330의 정의에 따름; 'tcCRD4' 구축물로 표시됨)에 대한 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3의 결합은 완전히 부재한 한편, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5는 CRD1-CRD2-절단된 CRD3 A1-모듈을 결여한 ('CRD4' 구축물로 표시됨) 절단된 인간 CD134 변이체에 대하여 그리고 CRD1-CRD2-절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름)을 결여 또는 대안적으로 CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-모듈을 결여한 절단된 인간 CD134 변이체 (Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321-1330의 정의에 따름; 'tcCRD4' 구축물로 표시됨)에 대하여 강한 결합을 나타내었다.
이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5이 인간 CD134을 특이적으로 인식하였음을 증명하였다 (전장 인간 CD134 형질감염 대 모의 형질감염의 비교). 나아가, 이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5가 유사하지 않은 인간 CD134 에피토프를 인식하는 것 같았음을 증명하였으며, 이는 CRD1-CRD2-절단된 CRD3 A1-모듈을 결여한 절단된 인간 CD134 변이체 ('CRD4' 구축물로 표시됨)와, 그리고 CRD1-CRD2-절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 (Latza 등, Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름)을 결여하거나 또는 대안적으로 CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-모듈을 결여한 (Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321~1330의 정의에 따름; 'tcCRD4' 구축물로 표시됨) 절단된 인간 CD134 변이체와의 결합의 결여 (클론 12H3 이용) 대 강한 결합 (클론 20E5 이용) 각각에 의하여 증명된다. 이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3이 CRD1 및 CRD2에서 인간 CD134 에피토프를 인식하는 것 같지 않았고, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5가 CRD1, CRD2, 및 절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름) 또는 대안적으로 CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-모듈 (Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321~1330의 정의에 따름)에서 인간 CD134 에피토프를 인식하는 것 같지 않음을 증명하였다. 이들 결과는, 마우스 항-인간 CD134항체 클론 12H3이 세포외 인간 CD134 상에서 아미노산 서열 108~126 (즉, 19-머 펩타이드 rcragtqpldsykpgvdca; 서열번호 　34 참조)을 이용하여, 절단된 CRD3 A1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름)에서 선형 또는 비-선형/입체배좌성 에피토프를 인식하는 것 같았음, 또는 아미노산 서열 108~126 (즉, 19-머 펩타이드 rcragtqpldsykpgvdca; 서열번호 34 참조)가 절단된 CRD3 A1-모듈/CRD4 A1-B1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름)에서, 그리고 가능하게는 힌지-유사구조에서, 세포외 인간 CD134 상의 아미노산 서열 108~214 (서열번호 35 참조)을 이용하여, 비-선형/입체배좌성 에피토프에의 결합에 중요한 부분을 형성하였음을 증명하였다. 이들 결과는, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5가 절단된 CRD4 A1-모듈 (Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321~1330의 정의에 따름)에서, 그리고 가능하게는 힌지-유사 구조에서, 세포외 인간 CD134 상 아미노산 서열 147~214 (서열번호 36)을 이용하여 선형 또는 비-선형/입체배좌성 에피토프를 인식하는 것과 같았음을 증명하였다.
결정학을 이용하여, Compaan 등 (Structure 2006; 14: 1321~1330)은, OX40리간드 (CD252)/CD134 (=OX40) 상호작용 동안 인간 CD134 상에서 CRD1, CRD2 (특히 A1 루프 및 직후의 잔기), 및 CRD3 (일차적으로 A1 루프)의 결정적인 관여를 최근 발견하였다. 이러한 발견은, (1, 상기 참조) 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5가 세포외 인간 CD134 상에서 CRD1, CRD2 및 절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름)에서 또는 대안적으로 CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-모듈 (Compaan 등 Structure 2006; 14: 1321~1330의 정의에 따름)에서 인간 CD134 에피토프를 인식하지 못하는 것 같다는 것 및 (2, 상기 참조) 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5이 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구 상에서 인간 OX40L과 동시에 결합되었다는 본 발명자들의 발견과 일치한다. 이는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 20E5가 인간 CD134 상에서 에피토프를 인식하였음을 암시하였으며, 인간 CD134의 인간 OX40L과의 상호작용에 중요하게 관여하지 않았다. 또한, (1, 상기 참조) 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3이 세포외 인간 CD134 상에서 아미노산 서열 108~126 (즉, 19-머 펩타이드 rcragtqpldsykpgvdca; 서열번호 34 참조)을 이용하여, 절단된 CRD3 A1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름)에서 선형 또는 비-선형/입체배좌성 에피토프를 인식하는 것으로 보임 또는 아미노산 서열 108~126 (즉, 19-머 펩타이드 rcragtqpldsykpgvdca; 서열번호 34 참조)이 세포외 인간 CD134 상의 아미노산 서열 108~214 (서열번호 35 참조)을 이용하여 절단된 CRD3 A1-모듈/CRD4 A1-B1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름)에서 및 가능하게는 힌지-유사 구조에서의 비-선형/입체배좌성 에피토프에의 결합에 중요한 부분을 형성하였으며, (2, 상기 참조) 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3이 PHA-자극된 인간 CD134 발현 T 림프구 상에서 인간 OX40L와 동시에 결합되었다는 본 발명자들의 발견은, 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3에 의하여 인식된 인간 CD134 상에서의 에피토프가 인간 CD134의 인간 OX40L와의 상호작용에 중요하게 관여되지 않았다는 아이디어를 입증하였다.
(c) 인간 CD134 -유도된 펩타이드 ELISA 를 이용한 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12 H3 의 에피토프 맵핑 (1)
마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3의 양호한 특이성을 더욱 분석하기 위하여, 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3에 의하여 인식된 에피토프의 위치를 에피토프 맵핑에 의하여 결정하였다. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3이, 절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름)의 아미노산 서열에 대응하는, 인간 CD134-유도된 펩타이드와 결합하는 능력을 ELISA에 의하여 결정하였다.
96-웰 편평바닥 ELISA 플레이트 (Corning)를, 절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈의 아미노산 서열에 대응하는 (서열번호 38 참조) 10 ng/웰 인간 CD134-유도된 펩타이드 (Pepscan Presto [Lelystad, The Netherlands 소재]에 의하여 합성됨)로, 또는 엑스트라 유형 III 구조 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 37)에 대응하는 10 ng/웰 인간 피브로넥틴-유도된 대조구 펩타이드 (Pepscan Presto [Lelystad, The Netherlands 소재]에 의하여 합성됨)로, PBS o/n 내 4℃에서 코팅하였다. PBS/0.05% Tween 20 내에서 철저히 세척 후, PBS/0.05% Tween 20/1% BSA 분획 V (Roche) 내, RT에서 1시간 동안 플레이트를 차단하였다. 이어서, 플레이트를 0, 0.00005~50.0 (차단 버퍼 내에서 10-배 희석 단계) ㎍/mL 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 또는 마우스 IgG1κ 이소타입 대조구 항체 (BD Biosciences)와 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS/0.05% Tween 20 내에서 철저히 세척 후, 항체의 결합을 1:5000 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG Fcγ-특이적 항체 (Jackson ImmunoResearch)를 이용하여 RT에서 1시간 동안 결정하고, 이어서 비색 검출을 위하여 TMB 기질의 즉시 이용가능한 용액 (Invitrogen)을 이용하였다. 1 M H2SO4 첨가 후, 마이크로플레이트 판독기 (BioRad)를 이용하여 450 nm 파장 (기준 파장 655 nm)에서 광학 밀도를 측정하였다.
도 23-A에 나타낸 것과 같이 (n=1), 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3은 인간 CD134-유도된 펩타이드에 투여량 의존적으로 및 특이적으로 결합한 한편, 마우스 IgG1κ 이소타입 대조구 항체는 인간 CD134-유도된 펩타이드에의 결합을 나타내지 않았다. 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 IgG1κ 이소타입 대조구 항체는 인간 피브로넥틴-유도된 대조구 펩타이드에의 결합을 나타내지 않았다.
이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3이 인간 CD134 상에서 에피토프를 특이적으로 인식하였음을 증명하였다 (인간 CD134-유도된 펩타이드 대 인간 피브로넥틴-유도된 대조구 펩타이드의 비교). 나아가, 이들 결과는 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3이, 세포외 인간 CD134 상의 아미노산 서열 108~146 (즉, 39-머 펩타이드 rcragtqpldsykpgvdcapcppghfspgdnqackpwtn; 서열번호 38 참조)을 이용하여, 절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름) 내 선형 또는 비-선형/입체배좌성 에피토프를 인식하는 것같았음을 증명하였다.
(d) Pepscan에 의한 CLIPS 에피토프 맵핑 기술을 이용한 마우스 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5의 에피토프 맵핑 (2)
Pepscan (Lelystad, The Netherlands)의 CLIPS 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5에 의해 인식된 에피토프를 결정하는데 사용할 수 있다. 이러한 CLIPS 기술은 선형, 입체배좌성, 불연속성, 및 2량체성 또는 다량체성 단백질 복합체를 포함하는 복합 에피토프의 결정을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위하여, 인간 CD134 = OX40 (서열번호 1)의 선형 아미노산 서열이 타겟 단백질로 사용된다.
실시예 9. 키메릭 인간 IgG4/카파 및/또는 IgG1/카파 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5에 의해 인식된 인간 CD134 도메인 및 에피토프의 특징화
(a) 293-F 세포주 (도메인 맵핑 ) 상에서 발현된 전장 인간 CD134 구축물 및 각종 절단된 인간 CD134 구축물과 키메릭 인간 IgG4 κ 및/또는 IgG1 κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5의 결합
키메릭 인간 IgG4κ 및/또는 IgG1κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5의 양호한 특이성을 분석하기 위하여, 키메릭 인간 IgG4κ 및/또는 IgG1κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5에 의하여 인식된 에피토프(들)의 위치를 도메인 맵핑에 의하여 결정하였다. 키메릭 인간 IgG4κ 및/또는 IgG1κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5이, (HEK-유도된) 297-F 세포의 표면 상에서 발현된, 절단된 인간 CD134 구축물 (상기 실시예 8 (b) 참조)에 결합하는 능력을 FACS 분석에 의하여 결정하였다.
FreeStyleTM 293 발현 시스템 (Invitrogen)을 이용하여, FreeStyleTM 293-F 세포 (Invitrogen)를 인간 CD134의 5 개의 생성된 변이체를 이용하여 일시적으로 형질감염시켰다 (상기 참조). 48~72시간 후에, 형질감염된 세포들 상에서의 표면 인간 CD134 발현을 FACS 분석에 의해 분석하였다. 이 목적을 위하여, 형질감염된 세포들을 수확하고, 빙냉된 PBS/BSA/NaN3 내에 1~2×106 세포/mL로 넣었다. 20.0 ㎍/mL 키메릭 인간 IgG4κ 및/또는 IgG1κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 20E5과 함께 또는 이의 부재하에 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 이어서 1:200 희석된 PE-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (Fcγ 특이적) 항체 (Jackson ImmunoResearch)와 함께 세포들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS/BSA/NaN3 내에서 철저히 세척 후, 세포들을 PBS/BSA/NaN3 내 2% 포름알데히드 중에서, 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 유세포분석기 (FACSCalibur; BD Biosciences)을 이용하여 항체 결합을 측정하였다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 키메릭 인간 IgG4κ 및 IgG1κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 모두, 및 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 20E5은 형질감염된 세포들 상에서의 각종 절단된 인간 CD134 구축물에 대하여 결합 특징을 나타내었으며, 이는 그의 대응하는 부모 마우스 항-인간 CD134 항체 클론 12H3 및 20E5 카운터파트의 결합 특징과 동일하였다 (상기 실시예 8 (b); 비교를 위하여, 도 22 대 도 21 참조).
(b) 인간 CD134 -유도된 펩타이드 ELISA 를 이용한 키메릭 인간 IgG4 κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12 H3 의 에피토프 맵핑
키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3의 양호한 특이성을 더욱 분석하기 위하여, 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3에 의해 인식된 에피토프의 위치를 에피토프 맵핑에 의하여 결정하였다. 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3이, 절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름)의 아미노산 서열에 대응하는, 인간 CD134-유도된 펩타이드와 결합하는 능력을 ELISA로 결정하였다.
96-웰 편평바닥 ELISA 플레이트 (Corning)를, 절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 (서열번호 38 참조)의 아미노산 서열에 대응되는, 10 ng/웰 인간 CD134-유도된 펩타이드 (Pepscan Presto [Lelystad, The Netherlands 소재]에 의하여 합성됨)로 또는 엑스트라 유형 III 구조 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 37 참조)에 대응되는 10 ng/웰 인간 피브로넥틴-유도된 대조구 펩타이드 (Pepscan Presto [Lelystad, The Netherlands 소재]에 의하여 합성됨)로, PBS o/n 내 4℃에서 코팅하였다. PBS/0.05% Tween 20 내에서 철저히 세척 후, 플레이트는 RT에서 1시간 동안 PBS/0.05% Tween 20/1% BSA 분획 V (Roche) 내에 차단되었다. 이어서, 플레이트를 0, 0.00005~50.0 (차단 버퍼 내 10-배 희석 단계) ㎍/mL 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 또는 대조구 인간 IgG4κ 항-인간 CD40 항체 (Biocult)와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS/0.05% Tween 20 내에서 철저히 세척 후, 항체 결합을 1:5000 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fcγ-특이적 항체 (Jackson ImmunoResearch)를 이용하여 RT에서 한시간 동안 결정하고, 이어서 비색 검출을 위해 TMB 기질 (Invitrogen)의 바로 사용가능한 용액을 이용하였다. 1 M H2SO4 첨가 후, 마이크로플레이트 판독기 (BrioRad)를 이용하여 450 nm 파장 (기준 파장 655 nm)에서 광학 밀도를 측정하였다.
도 23-B에 나타낸 것과 같이 (n=1), 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3은 인간 CD134-유도된 펩타이드에 투여량 의존적으로 및 특이적으로 결합한 한편, 대조구 인간 IgG4κ 항-인간 CD40 항체는 인간 CD134-유도된 펩타이드에 결합을 나타내지 않았다. 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3 및 대조구 인간 IgG4κ 항-인간 CD40 항체는 모두 인간 피브로넥틴-유도된 대조구 펩타이드에 결합을 나타내지 않았다.
이들 결과는 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3이 인간 CD134 상에서 에피토프를 특이적으로 인식하였음을 증명하였다 (인간 CD134-유도된 펩타이드 대 인간 피브로넥틴-유도된 대조구 펩타이드의 비교). 나아가, 이들 결과는 키메릭 인간 IgG4κ 항-인간 CD134 모노클로날 항체 클론 12H3은, 세포외 인간 CD134 상에서 아미노산 서열 108~146 (즉, 39-머 펩타이드 rcragtqpldsykpgvdcapcppghfspgdnqackpwtn; 서열번호 38 참조)를 이용하여, 절단된 CRD3 A1-모듈-CRD4 서브도메인 A1-모듈 (Latza 등 Eur J Immunol 1994; 24: 677~683의 정의에 따름) 내에서 선형 또는 비-선형/입체배좌 에피토프를 인식하는 것 같았음을 증명하였다.
첨부된 서열목록은 본 명세서의 일부를 형성한다.
아미노산 서열 인간 CD134 (GenBank ref CAB96543.1; aa 1~277)인 서열번호 1에서, 신호 펩타이드는 아미노산 (aa) 1-28)이고 막관통 영역은 aa 215~235에 존재한다.
서열번호 61은 서열번호 5의 11개 N-말단 아미노산을 형성하며, 이 역시 이익이 있다. 이는, 20E5 중쇄의 11개 N-말단 아미노산인, 서열번호 3의 20E5 경쇄 균등물이다.
서열번호 37 (TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGGC)은 인간 피브로넥틴-유도된 펩타이드으로부터의 아미노산 서열로, 엑스트라 유형 III 구조 도메인의 아미노산 서열에 대응된다 (ED1; Peters 등 Am Rev Resp Dis 1988; 138: 167~71).
SEQUENCE LISTING <110> Bioceros B.V. <120> ANTI-CD134 (OX40) ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> BIOBF/P51941PC <150> GB 1116092.6 <151> 2011-09-16 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(28) <220> <221> TRANSMEM <222> (215)...(235) <400> 1 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val 210 215 220 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 260 265 270 Thr Leu Ala Lys Ile 275 <210> 2 <211> 834 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sf9 insect cell-optimized cDNA sequence for human CD134 <400> 2 atgtgcgtgg gcgctcgtcg tctgggtcgt ggtccctgcg ctgctctgct gctgctgggt 60 ctgggcctgt ccactgtcac tggactccac tgcgtgggcg acacctaccc ctccaacgac 120 cgttgctgcc acgaatgcag gcctggcaac ggcatggtgt cccgttgctc ccgttcccag 180 aacaccgtgt gccgtccctg cggtcccggt ttctacaacg acgtggtgtc ctccaagccc 240 tgcaagcctt gcacttggtg taacctccgc tccggttccg agcgcaagca gctgtgcacc 300 gctacccagg acactgtctg taggtgcagg gctggcaccc agcccctgga ctcctacaag 360 cccggtgtcg actgcgctcc ctgcccccct ggtcacttct ctcccggcga caaccaggct 420 tgcaaaccat ggaccaactg caccctggct ggcaagcaca ccctgcagcc cgcttccaac 480 tcctccgacg ctatctgcga ggaccgtgac ccccctgcta ctcaacctca ggagactcag 540 ggtccccccg ctcgtcccat caccgtgcag cccaccgagg cttggccccg tacctcccaa 600 ggacctagca ctaggcctgt ggaggtgccc ggtggtcgtg ctgtggctgc tatcctgggc 660 ctgggtctgg tgctgggcct gctgggtccc ctggctatcc tgctggctct gtacctcctg 720 cgtcgtgacc agcgtctgcc ccccgacgct cacaagcccc ctggtggtgg ttccttccgt 780 acccccatcc aggaggagca ggctgacgct cactccaccc tggccaagat ctaa 834 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus amino acid sequence of clone 20E5 heavy chain <400> 3 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 20E5 heavy chain variable region <400> 4 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 20E5 light chain variable region <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 20E5 heavy chain CDR1 <400> 6 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 20E5 heavy chain CDR2 <400> 7 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 20E5 heavy chain CDR3 <400> 8 Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 20E5 light chain CDR1 <400> 9 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 20E5 light chain CDR2 <400> 10 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 20E5 light chain CDR3 <400> 11 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 12H3 heavy chain variable region <400> 12 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro 115 120 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 12H3 light chain variable region <400> 13 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 12H3 heavy chain CDR1 <400> 14 Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 12H3 heavy chain CDR2 <400> 15 Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 12H3 heavy chain CDR3 <400> 16 Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 12H3 light chain CDR1 <400> 17 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala Val Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 12H3 light chain CDR2 <400> 18 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of clone 12H3 light chain CDR3 <400> 19 Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 20 <211> 1398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHO-optimized cDNA sequence coding for chimeric clone 20E5 human IgG4 chain <400> 20 atggagtgga gcggagtgtt tatgttcctg ctgagcgtga ccgctggcgt gcactcagag 60 gtgcagctgc agcagtcagg ccccgagctg gtcaagcctg gcgctagcgt gaagatgagc 120 tgtaaagcta gcggctacac cttcactagc tacgtgatgc actgggtcaa gcagaagccc 180 ggccagggcc tggagtggat cggctatatt aacccctata acgacggcac taagtataac 240 gagaagttta agggcaaggc taccctgact agcgataagt ctagctctac cgcctatatg 300 gaactgtcta gtctgactag tgaagatagc gccgtctact actgcgctaa ctactacggc 360 tctagcctgt ctatggacta ctggggccag ggcactagcg tgaccgtgtc tagcgctagc 420 actaagggcc ctagcgtgtt ccccctggcc ccctgctcta gatctactag cgagtctacc 480 gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt cagctggaat 540 agcggcgctc tgactagcgg cgtgcacacc ttccctgccg tgctgcagtc tagcggcctg 600 tatagtctgt ctagcgtggt caccgtgcct agttctagcc tgggcactaa gacctacacc 660 tgtaacgtgg accacaagcc ctctaacact aaggtggaca agcgggtgga atctaagtac 720 ggccctccct gccccccctg ccctgcccct gaatttctgg gcggacctag tgtgttcctg 780 ttcccaccta agcctaagga caccctgatg atctctagaa cccccgaagt gacctgcgtg 840 gtggtggacg tgtcacagga agatcccgag gtccagttta attggtacgt ggacggcgtg 900 gaagtgcaca acgctaagac taagcctaga gaggaacagt ttaactctac ctatagggtc 960 gtcagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta taagtgtaaa 1020 gtgtctaaca agggcctgcc tagctctatc gaaaagacta tctctaaggc taagggccag 1080 cctagagaac ctcaggtcta caccctgccc cctagtcagg aagagatgac taagaatcag 1140 gtgtcactga cctgtctggt caagggcttc taccctagcg atatcgccgt cgagtgggag 1200 tctaacggcc agcccgagaa caactataag actacccccc ctgtgctgga tagcgacggt 1260 agcttcttcc tgtactcacg gctgaccgtg gataagtcta ggtggcagga aggcaacgtc 1320 tttagctgta gcgtgatgca cgaggccctg cacaatcact acactcagaa gtcactgagc 1380 ctgagcctgg gcaagtga 1398 <210> 21 <211> 702 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHO-optimized cDNA sequence coding for chimeric clone 20E5 human kappa chain <400> 21 atggagtgga gcggagtgtt tatgttcctg ctgagcgtga ccgctggcgt gcactcagat 60 attcagatga ctcagactac ctctagcctg agcgctagcc tgggcgatag agtgactatt 120 agctgtagag ctagtcagga tatctctaac tacctgaact ggtatcagca gaaacccgac 180 ggcaccgtga agctgctgat ctactacacc tctagactgc actcaggcgt gccctctagg 240 tttagcggta gcggtagtgg caccgactat agcctgacta tctctaacct ggaacaggaa 300 gatatcgcta cctacttctg tcagcagggc aacaccctgc cctggacctt cggcggaggc 360 actaagctgg aaatcaagcg gaccgtggcc gctccctcag tgtttatctt cccacctagc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgctagc gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480 agagaagcta aggtgcagtg gaaagtggat aacgccctgc agtcaggcaa ctctcaggaa 540 tcagtcaccg agcaggactc taaggatagc acctatagcc tgtctagcac cctgaccctg 600 tctaaggccg actacgagaa gcacaaggtc tacgcctgcg aagtgactca ccagggactg 660 tctagccccg tgactaagtc ctttaataga ggcgagtgct ga 702 <210> 22 <211> 1407 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHO-optimized cDNA sequence coding for chimeric clone 20E5 human IgG1 chain <400> 22 atggagtggt caggcgtgtt catgttcctg ctgagcgtga ccgctggcgt gcactcagag 60 gtgcagctgc agcagtcagg ccccgagctg gtcaagcctg gcgctagcgt gaagatgagc 120 tgtaaagcta gcggctacac cttcactagc tacgtgatgc actgggtcaa gcagaagccc 180 ggtcagggcc tggagtggat cggctatatt aacccctata acgacggcac taagtataac 240 gagaagttta agggtaaagc taccctgact agcgataagt ctagctctac cgcctatatg 300 gaactgtcta gtctgactag tgaagatagc gccgtctact actgcgctaa ctactacggc 360 tctagcctgt ctatggacta ctggggtcag ggcactagcg tgaccgtgtc tagcgctagc 420 actaagggcc ctagcgtgtt ccccctggcc cctagctcta agtctactag cggcggcacc 480 gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt cagctggaat 540 agcggcgctc tgactagcgg agtgcacacc ttccccgccg tgctgcagtc tagcggcctg 600 tatagtctgt ctagcgtggt caccgtgcct agttctagcc tgggcactca gacctatatc 660 tgtaacgtga accacaagcc ctctaacact aaggtggaca agaaggtgga acctaagtcc 720 tgcgataaga ctcacacctg tcccccctgc cctgcccctg agctgctggg aggacctagt 780 gtgttcctgt tcccacctaa gcctaaggac accctgatga tctctagaac ccccgaagtg 840 acctgcgtgg tggtggacgt cagtcacgag gaccctgaag tgaagtttaa ttggtacgtg 900 gacggcgtgg aagtgcacaa cgctaagact aagcctagag aggaacagta taactctacc 960 tatagggtcg tcagcgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg taaagagtat 1020 aagtgtaaag tgtctaacaa ggccctgcca gcccctatcg aaaagactat ctctaaggct 1080 aagggtcagc ctagggaacc tcaggtctac accctgcccc ctagtaggga cgagctgact 1140 aagaatcagg tcagcctgac ttgtctggtc aagggcttct accctagcga tatcgccgtc 1200 gagtgggagt ctaacggtca gcccgagaac aactataaga ctaccccccc tgtgctggat 1260 agcgacggta gcttcttcct gtactctaaa ctgaccgtgg ataagtctag gtggcagcag 1320 ggtaacgtgt tcagctgtag cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cactcagaag 1380 tcactgagcc tgagccccgg taagtga 1407 <210> 23 <211> 1404 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHO-optimized cDNA sequence coding for chimeric clone 12H3 human IgG4 chain <400> 23 atggagtggt ctggtgtctt tatgttcctg ctgtccgtga ccgcgggtgt ccacagcgag 60 gtgcagctgc agcagtccgg ccctgagctg gtgaaacctg gcgcctccgt gaagatctcc 120 tgcaagacct ccggctacac cttcaaggac tacacaatgc actgggtgaa acagtcccac 180 ggcaagtcct tggagtggat cggcggaatc taccccaaca acggcggctc cacctacaac 240 cagaacttca aggacaaggc caccctgacc gtggacaagt cctcctccac cgcctatatg 300 gaatttcggt ccctgacctc cgaggactcc gccgtgtact actgcgcccg gatgggctac 360 cacggccccc acctggattt cgacgtgtgg ggcgctggca ccaccgtgac cgtgtctcca 420 gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 480 tctaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtcc 540 tggaactctg gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 600 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgaca gtgccctcct ccagcctggg caccaagacc 660 tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 720 aagtacggcc ctccctgccc accttgccct gcccctgaat ttctgggcgg accttccgtg 780 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 840 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaagaagat cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac 900 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 960 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaggg cctgcccagc tctatcgaaa agacaatctc caaggccaag 1080 ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaagaaga gatgaccaag 1140 aaccaggtgt ccctgacttg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtcgag 1200 tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg acagtggata agtcccggtg gcaagaaggc 1320 aacgtcttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1380 ctgtccctga gcctgggcaa gtag 1404 <210> 24 <211> 702 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHO-optimized cDNA sequence coding for chimeric clone 12H3 human kappa chain <400> 24 atggagtggt ccggtgtctt tatgttcctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcactccgat 60 atcgtgatga cccagtccca caagtttatg tccacctccc tgggcgacag agtctctatt 120 acctgcaagg cctcccagga cgtgggcgct gccgtggcct ggtatcagca gaagcccggc 180 cagtccccca agctgctgat ctactgggcc tccaccagac acaccggcgt gcccgacaga 240 ttcaccggcg gaggctctgg caccgacttc accctgacaa tctccaacgt gcagtccgag 300 gacctgaccg actacttctg ccagcagtat atcaactacc ccctgacctt cggcggaggc 360 accaagctgg aaatcaagcg gaccgtggcc gctccctccg tgtttatctt cccaccctcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtctgcc tgctgaacaa cttctacccc 480 cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaagaa 540 tccgtgaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 tccagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct aa 702 <210> 25 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of chimeric clone 20E5 human IgG4 chain <400> 25 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 225 230 235 240 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 26 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of chimeric clone 20E5 human kappa chain <400> 26 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile 35 40 45 Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn 85 90 95 Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr 100 105 110 Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 27 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of chimeric clone 20E5 human IgG1 chain <400> 27 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 28 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of chimeric clone 12H3 human IgG4 chain <400> 28 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Lys Asp Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp 115 120 125 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 225 230 235 240 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Gly Lys 465 <210> 29 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of chimeric clone 12H3 human kappa chain <400> 29 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Met Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 40 45 Gly Ala Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn 85 90 95 Val Gln Ser Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn 100 105 110 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 30 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human CD134_CRD2 (aa 1-28 >< 66-277) <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(28) <220> <221> TRANSMEM <222> (178)...(198) <400> 30 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Pro Cys Gly Pro 20 25 30 Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr 35 40 45 Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala 50 55 60 Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp 65 70 75 80 Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe 85 90 95 Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu 100 105 110 Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile 115 120 125 Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly 130 135 140 Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg 145 150 155 160 Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg 165 170 175 Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly 180 185 190 Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg 195 200 205 Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr 210 215 220 Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 225 230 235 240 <210> 31 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human CD134_CRD3 (aa 1-28 >< 108-277) <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(28) <220> <221> TRANSMEM <222> (136)...(156) <400> 31 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Arg Cys Arg Ala 20 25 30 Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro 35 40 45 Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro 50 55 60 Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser 65 70 75 80 Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln 85 90 95 Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro 100 105 110 Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val 115 120 125 Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu 130 135 140 Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu 145 150 155 160 Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly 165 170 175 Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His 180 185 190 Ser Thr Leu Ala Lys Ile 195 <210> 32 <211> 179 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human CD134_CRD4 (aa 1-28 >< 127-277) <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(28) <220> <221> TRANSMEM <222> (117)...(137) <400> 32 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Pro Cys Pro Pro 20 25 30 Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn 35 40 45 Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser 50 55 60 Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu 65 70 75 80 Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala 85 90 95 Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro 100 105 110 Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly 115 120 125 Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg 130 135 140 Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu 165 170 175 Ala Lys Ile <210> 33 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human CD134_CRD4 truncated (aa 1-28 >< 147-277) <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(28) <220> <221> TRANSMEM <222> (97)...(117) <400> 33 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Cys Thr Leu Ala 20 25 30 Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys 35 40 45 Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro 50 55 60 Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr 65 70 75 80 Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala 85 90 95 Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro 100 105 110 Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu 115 120 125 Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro 130 135 140 Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 145 150 155 <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val 1 5 10 15 Asp Cys Ala <210> 35 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val 1 5 10 15 Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln 20 25 30 Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu 35 40 45 Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro 50 55 60 Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile 65 70 75 80 Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser 85 90 95 Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala 100 105 <210> 36 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser 1 5 10 15 Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu 20 25 30 Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala 35 40 45 Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro 50 55 60 Gly Gly Arg Ala 65 <210> 37 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro Ala Pro 1 5 10 15 Asp Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Gly Cys 20 25 <210> 38 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val 1 5 10 15 Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln 20 25 30 Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn 35 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mkappa antisense primer (primer no: 201) <400> 39 gacagttggt gcagcatcag 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mkappa antisense primer (primer no: 266) <400> 40 cactggatgg tgggaagatg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mlgG1 antisense primer (primer no: 203) <400> 41 ggccagtgga tagacagatg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mlgG1 antisense primer (primer no: 204) <400> 42 tggacaggga tccagagttc 20 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20E5HC sense primer (primer no: 259) <400> 43 gcgaagtaca aytncarcar wsngg 25 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20E5HC sense primer (primer no: 260) <400> 44 gcgtacaatt acarcarwsn ggncc 25 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20E5LC sense primer (primer no: 265) <400> 45 gcgatataca ratgacncar ac 22 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mlgG1 antisense primer (primer no: 416) <400> 46 cagtggatag acagatgggg g 21 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mkappa antisense primer (primer no: 394) <400> 47 actggatggt gggaagatgg 20 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide sense primer (primer no: 405) <400> 48 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide sense primer (primer no: 410) <400> 49 atggratgga gckgggtctt tmtctt 26 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide sense primer (primer no: 389) <400> 50 atgggcwtca aagatggagt caca 24 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD134 leader sense primer (primer no: 362) <400> 51 ctcggatccg ccaccatgtg cgtg 24 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRD2 sense primer (primer no: 364) <400> 52 actgtcactg gaccctgcgg tccc 24 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRD2 antisense primer (primer no: 365) <400> 53 gggaccgcag ggtccagtga cagt 24 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRD3 sense primer (primer no: 366) <400> 54 actgtcactg gaaggtgcag ggct 24 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD134 end primer (primer no: 363) <400> 55 agaattctta ttagatcttg gcca 24 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRD3 antisense primer (primer no: 367) <400> 56 agccctgcac cttccagtga cagt 24 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRD4 sense primer (primer no: 368) <400> 57 actgtcactg gaccctgccc ccct 24 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRD4 antisense primer (primer no: 369) <400> 58 aggggggcag ggtccagtga cagt 24 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRD4 truncated sense primer (primer no: 370) <400> 59 actgtcactg gatgcaccct ggct 24 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRD4 truncated antisense primer (primer no: 371) <400> 60 agccagggtg catccagtga cagt 24 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal amino acid sequence of clone 20E5 light chain <400> 61 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 1 5 10

Claims (48)

  1. 인간 CD134에 결합하는 결합 분자로서, 인간 CD134 (OX40) 수용체가 OX40 리간드 (OX40L)에 결합하는 것을 방지하지 않는 결합 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 분자의 포화 농도 이상에서, OX40L의 CD134로의 결합에 대한 효과가 인간 CD134 발현 T-세포에 대하여 50% 이하 감소되는 결합 분자.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 70nM의 결합 분자 농도에서, OX40L의 CD134로의 결합에 대한 효과가 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 70% 이하 감소되는 결합 분자.
  4. (a) 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는
    (b) 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 결합 분자.
  5. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및/또는
    (c) 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3
    을 포함하는 결합 분자.
  6. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1;
    (b) 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및/또는
    (c) 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 결합 분자.
  7. 인간 CD134 결합에 대하여,
    (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는 결합 분자.
  8. (a) 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는
    (b) 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 결합 분자.
  9. 제 1항, 제 2 항 또는 제 8항 중 어느 한 항에 있어서:
    (a) 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및/또는
    (c) 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3
    을 포함하는 결합 분자.
  10. 제 1항, 제 2항 또는 제 8항 중 어느 한 항에 있어서:
    (a) 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1;
    (b) 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및/또는
    (c) 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3
    를 포함하는 결합 분자.
  11. 인간 CD134 결합에 대하여,
    (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는 결합 분자.
  12. 제 7항 또는 제 11항에서 정의된 항체가 결합되는, 인간 CD134의 세포외 도메인의 아미노산 서열 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자.
  13. 제 12항에 있어서,
    (a) 서열번호 34;
    (b) 서열번호 35;
    (c) 서열번호 36; 및/또는
    (d) 서열번호 38
    의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD134의 세포외 도메인의 에피토프에 결합하는 결합분자.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 인간 종양 세포의 성장 저해에 관련된 인간 CD134 발현 인간 면역적격 세포 (예로서, 활성화된 Teff 및/또는 활성화된 Treg) 상에서 인간 CD134 수용체가 OX40 리간드 (OX40L)에 결합되는 것을 방지하지 않는 결합 분자.
  15. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 인간 종양 세포의 성장 저해에 관련된 인간 CD134 발현 인간 면역적격 세포 (예로서, 활성화된 Teff 및/또는 활성화된 Treg) 상에서 인간 OX40 리간드 (OX40L)의 결합 및/또는 면역자극 반응을 증진시키는 결합 분자.
  16. 인간 CD134에 결합하는 결합 분자로서, 인간 CD134가 OX40 리간드 (OX40L)에 결합하는 것을 방지하지 않고, 인간 CD134 발현 T-이펙터 세포 상에서 인간 OX40L의 면역자극 및/또는 증식 반응을 저지하지 않는 결합 분자.
  17. 인간 CD134에 결합하는 결합 분자로서, 인간 CD134가 OX40 리간드 (OX40L)에 결합하는 것을 방지하지 않고, 인간 CD134 발현 T-이펙터 세포 상에서 인간 OX40L의 면역자극 및/또는 증식 반응을 증진시키는 결합 분자.
  18. 인간 CD134에 결합하는 결합 분자로서, 인간 CD134가 OX40 리간드 (OX40L)에 결합하는 것을 방지하지 않고, 인간 CD134 발현 T-조절성 세포 상에서 인간 OX40L의 저해 기능 반응을 저지하지 않는 결합 분자.
  19. 인간 CD134에 결합하는 결합 분자로서, 인간 CD134가 OX40 리간드 (OX40L)에 결합하는 것을 방지하지 않고, 인간 CD134 발현 T-조절성 세포 상에서 인간 OX40L의 저해 기능 반응을 증진시키는 결합 분자.
  20. 인간 CD134에 결합하는 결합 분자로서, 인간 CD134가 OX40 리간드 (OX40L)에 결합하는 것을 방지하지 않지만, 인간 CD134 발현 T-조절성 세포 상에서 인간 OX40L의 증식 반응을 저지하지 않는 결합 분자.
  21. 인간 CD134에 결합하는 결합 분자로서, 인간 CD134가 OX40 리간드 (OX40L)에 결합하는 것을 방지하지 않지만, 인간 CD134 발현 T-조절성 세포 상에서 인간 OX40L의 증식 반응을 억제하지 않는 결합 분자.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자의 포화 농도 이상에서, OX40L의 CD134로의 결합에 대한 효과가 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 50% 이하 감소되는 결합 분자.
  23. 제 22항에 있어서, 70nM의 결합 분자 농도에서 OX40L의 CD134로의 결합에 대한 효과가 인간 CD134 발현 T-세포 상에서 70% 이하 감소되는 결합 분자.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 결합 분자.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 DeImmunized™ 항체 또는 그의 단편인 결합 분자.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, (예로서, 비-항체 스캐폴드에 기초한) 항체 모방체, RNA 앱타머, 작은 분자 또는 CovX-바디인 결합 분자.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 항체, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체인 결합 분자.
  28. 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 예로서 Fv　단편 (예로서, 단일쇄 Fv 및 이황화-결합된 Fv); Fab-유사 단편 (예로서, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편); 및 도메인 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체의 항원-결합 단편인 결합 부분.
  29. 제 28항에 있어서, 항원-결합 단편이 scFv인 결합 분자.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 부분이 재조합 항체인 결합 부분.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 부분이 모노클로날 항체인 결합 부분.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자로, 단 상기 결합 부분은 폴리펩타이드인 핵산 분자.
  33. 제 32항에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  34. 제 33항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  35. 제 34항에 있어서, 포유동물 또는 곤충으로부터 유래된 것인 숙주 세포.
  36. 하기 (i) 및 (ii)의 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자의 제조방법:
    (i) CD134-결합 분자를 제조하는 단계, 및
    (ii) OX40L가 CD134로 결합되는 것을 방지하지 않는 결합 분자를 동정 및 수득하기 위하여, 상기 분자를 스크리닝하는 단계.
  37. 제 36항에 있어서, 단계가 CD134를 포화 농도의 OX40L에 노출시킨 후 CD134에 결합하는 결합 분자를 동정하는 것을 포함하는 제조 방법.
  38. 제 36항 또는 제 37항에 있어서, 결합 분자가 모노클로날 항체이고, 동물을 인간 CD134로 면역화시키고, 항-CD134 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하고, 항-CD134 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하는 것을 포함하는 제조 방법.
  39. 암 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 예방 또는 치료용의, 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따른, 또는 제 36항 내지 38항 중 어느 한 항에 따라 제조된 결합분자.
  40. 제 39항에 따른 용도를 위한, 상기 암은 폐암, 전립선암, 유방암, 머리 및 목암, 식도암, 위암, 결장암, 결장직장암, 방광암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 간암, 혈액암, 또는 제어되지 않는 세포 성장이 특징인 임의의 기타 질병 또는 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 결합 분자.
  41. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 제 36항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따라 제조된 결합 분자의 치료 유효량, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 인간 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상에서 면역 반응의 증진방법.
  42. 제 41항에 있어서, 증진된 면역 반응이, 선택적으로 T-이펙터 세포들의 증식 결과로서, 이들 T-이펙터 세포의 면역자극/이펙터 기능에서의 증가, 및/또는 선택적으로 T-조절성 세포들의 수에서의 확장 없이, 이들 T-조절성 세포들의 면역저해 기능의 하향-조절을 포함하는 방법.
  43. 치료를 필요로 하는 인간 대상에서, 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 제 36항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따라 제조된 결합 분자의 치료 유효량을 인간 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 암은 폐암, 전립선암, 유방암, 머리 및 목암, 식도암, 위암, 결장암, 결장직장암, 방광암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 간암, 혈액암, 또는 제어되지 않는 세포 성장이 특징인 임의의 기타 질병 또는 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  45. 대상에서 종양 크기를 감소 또는 암세포의 성장을 억제, 또는 암을 앓고 있는 대상에서 전이성 암의 발달을 감소 또는 억제하는 방법으로서, 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 제 36항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따라 제조된 결합 분자를 인간 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 제 36항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따라 제조된 결합 분자의, 암 치료 또는 예방용 약제의 제조에서의 용도.
  47. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 제 36항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따라 제조된 결합 부분과 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  48. 제 47항에 있어서, 예로서, 정맥, 근육내, 피내, 복강내, 종양내, 방광내, 동맥내, 척수관내, 관절낭내(intra-capsular), 안와내(intra-orbital), 심강내, 경기관(transtracheal), 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 흉골내 또는 피하 투여에 의하여, 인간 내로의 비경구 투여에 적당한 조성물.
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