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KR20140091750A - 표적 단백질에 결합하는 핵산 단편 - Google Patents

표적 단백질에 결합하는 핵산 단편 Download PDF

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KR20140091750A
KR20140091750A KR1020147016080A KR20147016080A KR20140091750A KR 20140091750 A KR20140091750 A KR 20140091750A KR 1020147016080 A KR1020147016080 A KR 1020147016080A KR 20147016080 A KR20147016080 A KR 20147016080A KR 20140091750 A KR20140091750 A KR 20140091750A
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Abstract

종래법으로 얻어지는 핵산 앱타머보다 표적 물질과의 특이성 및 결합성이 높은 핵산 앱타머, 특히 DNA 앱타머를 효율적으로 제조하는 방법을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다. 천연형 뉴클레오티드와 인공 염기 대합 가능한 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 포함하고, 또한 전사 또는 복제 가능한 핵산 앱타머를 제공한다. 또한, 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법을 제공한다.

Description

표적 단백질에 결합하는 핵산 단편{Nucleic acid fragment binding to target protein}
본 발명은 인공 염기를 포함하는 핵산 라이브러리를 이용한 기능성 핵산, 특히 핵산 앱타머, 그 중에서도 DNA 앱타머의 효율적인 제작 방법에 관한 것이다.
최근 저분자 화합물에 대신하는 의약 또는 진단약의 새로운 유효 성분으로서 핵산 앱타머가 siRNA 등의 다른 기능성 핵산과 함께 주목받고 있고, 그 의료 응용을 위해 여러 가지 연구 및 개발이 세계 각국에서 진행되고 있다.
핵산 앱타머는 그 자신이 가지는 입체 구조에 따라 단백질 등의 표적 물질과 강고하고 특이적으로 결합하여 그 기능을 저해 또는 억제할 수 있는 기능성 핵산이다. 의약품으로서 이용되는 핵산 앱타머의 대표적인 예로서는 2004년에 FDA에 의해 승인된 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF)를 표적으로 하는 가령황반변성증 치료용 수식 RNA 앱타머(Macugen)가 알려져 있다.
한편, 핵산 앱타머는 20종류의 아미노산으로 이루어지는 단백질인 항체와 비교하여 구성하는 염기의 종류가 4종류밖에 없고, 게다가 이들 4종류의 염기의 화학적·물리적 성질이 매우 비슷한 점에서 그 변형(variation)이 한정되고, 핵산 앱타머의 성능에 한계가 있는 문제가 있었다.
이 문제를 해결하기 위해, 1종류 또는 2종류의 천연형 염기에 링커를 통해 치환기를 결합한 수식 천연형 염기를 핵산 앱타머 분리를 위한 핵산 라이브러리에 이용하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2, 비특허문헌 1~3). 이러한 수식 천연형 염기를 포함하는 수식 핵산 앱타머로서 단백질을 검출 가능한 핵산 칩으로의 응용을 목표로 한 진단 분야에 이용 가능한 DNA 앱타머도 알려져 있다(비특허문헌 3). 그러나, 수식 핵산 앱타머는 1종류 또는 2종류의 수식 천연형 염기를 도입하고 있으므로, 핵산 앱타머 전체의 약 25% 이상의 염기가 수식 천연형 염기로 치환되게 된다. 그 결과, 앱타머의 제조율은 올라가지만 앱타머의 선택성 저하나 세포 독성 문제가 새로 발생한다. 그 때문에, 지금까지 수식 천연형 염기를 가지는 수식 핵산 앱타머는 진단용으로 한정되어 있고, 치료약으로서 승인된 것은 없다(비특허문헌 3).
특허문헌 1: 일본특허공표 평09-502354 특허문헌 2: WO1992014842
비특허문헌 1: Shoji A., et al., J. Am. Chem. Soc., 129, 1456-1464(2007) 비특허문헌 2: Vaught J.D., et al., J. Am. Chem. Soc., 132, 4141-4151(2010) 비특허문헌 3: Gold L., et al., PLoS One, 5, e15004(2010)
본 발명은 종래법으로 얻어지는 핵산 앱타머보다 표적 물질과의 특이성 및 결합성이 높은 핵산 앱타머, 특히 DNA 앱타머를 효율적으로 제조하는 방법을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 유효 성분으로 하는 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 면밀히 연구를 거듭한 결과, 천연형 뉴클레오티드로 구성되는 1본쇄(단일 가닥) 핵산 분자에 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 도입함으로써, 천연형 뉴클레오티드만으로 구성되는 핵산 앱타머보다도 표적 물질에의 결합 능력이 높은 핵산 앱타머를 취득할 수 있는 것을 발견하였다. 이 인공 염기는 상보성에 의해 대합(pairing, 염기쌍을 이룸)할 수 있는 다른 인공 염기를 가지는 점에서 핵산 복제나 전사에서도 기능할 수 있다. 그 때문에, PCR 등의 종래의 핵산 증폭법에 의한 핵산 라이브러리의 증폭이 가능하게 된다. 이러한 핵산 복제나 전사에서 기능할 수 있는 인공 염기에 대해서는 이미 알려져 있었지만(I. Hirao I., et al., Nature Methods, 3, 729-735(2006); Hirao I., et al., J. Am. Chem. Soc., 129, 15549-15555(2007); Kimoto M., et al., Nucleic Acids Res., 37, e14(2009); Kimoto M.,et al., J. Am. Chem. Soc., 132, 15418-15426(2010); Kimoto M., et al., Expert Rev. Mol. Diagn., 11, 321-331(2011); Malyshev D.A., et al., J. Am. Chem. Soc., 131, 14620-14621(2009); Malyshev D.A., et al., Chemistry, 16, 12650-12659(2010); Yang Z., et al., Nucleic Acids Res., 35, 4238-4249(2007); Z. Yang, et al., J. Am. Chem. Soc., 133, 15105-15112(2011)), 그 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 앱타머에 대해서는 지금까지 전혀 알려지지 않았다. 그 이유 중 하나로서, 핵산 라이브러리 중의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 앱타머의 염기 서열을 결정하는 방법이 전혀 확립되지 않은 것을 들 수 있다. 그래서, 본 발명자들은 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 라이브러리에서의 개개의 염기 서열을 결정하는 방법도 새로 개발하였다.
본 발명은 상기 개발 결과에 기초한 것으로, 구체적으로 이하의 발명을 제공한다.
(1)천연형(natural) 뉴클레오티드와 인공 염기 대합 가능한 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 포함하고, 또한 전사 또는 복제 가능한 핵산 앱타머.
(2)(1)에 있어서, 상기 인공 염기가 Ds, Pn 및 Pa로 이루어지는 군에서 선택되는 핵산 앱타머.
(3)(2)에 있어서, 상기 인공 염기가 인공 염기 대합 가능한 상기 인공 염기의 유도체를 포함하는 핵산 앱타머.
(4)(1)~(3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 비천연형 뉴클레오티드의 함유율이 전체 뉴클레오티드 수의 20% 이하인 핵산 앱타머.
(5)(1)~(4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 DNA 또는 RNA인 핵산 앱타머.
(6)(1)에 있어서, 혈관 내피 세포 증식 인자를 표적 물질로 하는 핵산 앱타머.
(7)(6)에 있어서, 서열 번호 25~73, 80~104, 106~109, 111, 155~166(단, 서열 중의 n을 Ds로 함), 175, 177, 179, 181, 183, 198, 201, 202, 205~209, 211, 212 및 229~278로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 핵산 앱타머.
(8)(7)에 있어서, (7)에 기재된 어느 하나의 염기 서열, 그 5' 말단측에 인접하는 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열 및 그 3' 말단측에 인접하는 서열 번호 2로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 핵산 앱타머.
(9)(1)에 있어서, 인터페론γ을 표적 물질로 하는 핵산 앱타머.
(10)(9)에 있어서, 서열 번호 167~174(단, 서열 중의 n을 Ds로 함), 186, 188, 190, 192, 194, 214~222 및 279~328로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 핵산 앱타머.
(11)(10)에 있어서, (10)에 기재된 어느 하나의 염기 서열, 그 5' 말단측에 인접하는 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열 및 그 3' 말단측에 인접하는 서열 번호 2로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 핵산 앱타머.
(12)천연형 뉴클레오티드와 인공 염기 대합 가능한 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드로 구성되는 전사 또는 복제 가능한 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 포함하는 1본쇄 핵산 라이브러리.
(13)(12)에 있어서, 상기 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자에서의 비천연형 뉴클레오티드의 함유율이 전체 뉴클레오티드의 20% 이하인 1본쇄 핵산 라이브러리.
(14)(12) 또는 (13)에 있어서, 1본쇄 핵산 분자의 5' 말단 및 3' 말단에 위치하고, 각각이 공통되는 기지(旣知)의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 결합 영역 및 그 프라이머 결합 영역 사이에 위치하는 중앙 영역을 포함하는 1본쇄 핵산 라이브러리.
(15)(14)에 있어서, 상기 중앙 영역의 적어도 한쪽 말단에 상기 프라이머 결합 영역에 인접하도록 배치되고, 그 중앙 영역의 염기 서열 상의 특정 위치에 배치된 하나 이상의 인공 염기의 위치 정보와 관련된 천연형 뉴클레오티드로 구성되는 식별 부위를 더 포함하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자로 이루어지는 1본쇄 핵산 라이브러리.
(16)핵산 앱타머의 제조 방법으로서, (12)~(15) 중 어느 하나에 기재된 1본쇄 핵산 라이브러리와 표적 물질을 용액 중에서 혼합하여 1본쇄 핵산 분자와 표적 물질의 복합체를 형성시키는 복합체 형성 공정, 상기 복합체를 회수하는 복합체 회수 공정, 상기 회수된 복합체로부터 1본쇄 핵산 분자를 회수하는 1본쇄 핵산 분자 회수 공정, 상기 회수된 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 증폭 공정 및 상기 증폭 공정 후에 얻어진 핵산 분자를 핵산 앱타머에 조제하는 핵산 앱타머 조제 공정을 포함하는 상기 제조 방법.
(17)(16)에 있어서, 핵산 앱타머 조제 공정에서 조제된 핵산 앱타머를 새로운 1본쇄 핵산 라이브러리에 이용하여 상기 복합체 형성 공정부터 핵산 앱타머 조제 공정까지를 새로이 1회 이상 반복하는 반복 공정을 더 포함하는 제조 방법.
(18)(17)에 있어서, 반복 횟수가 15회 이하인 제조 방법.
(19)(16)~(18) 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 앱타머가 DNA 앱타머 또는 RNA 앱타머인 제조 방법.
(20)(19)에 있어서, 상기 핵산 앱타머가 RNA 앱타머일 때에, 상기 증폭 공정이 역전사 단계, DNA 증폭 단계 및 전사 단계를 포함하는 제조 방법.
(21)(16)~(20) 중 어느 하나에 있어서, 상기 인공 염기가 Ds, Pn 및 Pa로부터 선택되는 제조 방법.
(22)(21)에 있어서, 상기 인공 염기가 인공 염기 대합 가능한 상기 인공 염기의 유도체를 포함하는 제조 방법.
(23)(14)에 기재된 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법으로서, 천연형 뉴클레오티드를 기질로 하여 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 상기 선택된 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 제1 증폭 공정, 상기 제1 증폭 공정 후에 얻어지는 천연형 뉴클레오티드만으로 구성된 증폭 산물로부터 단일 클론을 얻는 클로닝 공정, 천연형 뉴클레오티드 및 상기 비천연형 뉴클레오티드를 기질로 하여 상기 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 상기 선택된 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 제2 증폭 공정, 상기 클로닝 공정에서 얻어진 단일 클론을 프로브로 하여 상기 제2 증폭 공정 후에 얻어지는 증폭 산물로부터 단일 클론 유래의 1본쇄 핵산 분자를 단리하는 1본쇄 핵산 분자 단리 공정 및 상기 1본쇄 핵산 분자 단리 공정에서 단리된 단일 클론 유래의 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 염기 서열 결정 공정을 포함하는 상기 방법.
(24)(23)에 있어서, 상기 1본쇄 핵산 분자 단리 공정에 있어서 고상 담체에 고정화한 프로브를 이용하는 방법.
(25)(23) 또는 (24)에 있어서, 상기 1본쇄 핵산 분자 단리 공정에서 단리된 단일 클론 유래의 1본쇄 핵산 분자가 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
(26)(15)에 기재된 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법으로서, 천연형 뉴클레오티드를 기질로 하여 상기 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 상기 선택된 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 제3 증폭 공정, 상기 증폭 공정 후에 얻어지는 천연형 뉴클레오티드만으로 구성된 증폭 산물로부터 단일 클론을 얻는 클로닝 공정, 상기 클로닝 공정 후에 얻어지는 단일 클론의 염기 서열을 결정하는 염기 서열 결정 공정 및 상기 단일 클론의 염기 서열에서의 식별 영역의 염기 서열에 기초하여 그 단일 클론의 주형이 된 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열 상의 인공 염기의 위치를 결정하는 인공 염기 위치 결정 공정을 포함하는 상기 방법.
(27)(23)~(26) 중 어느 하나에 있어서, 상기 인공 염기가 Ds, Pn 및 Pa로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
(28)(27)에 있어서, 상기 인공 염기가 인공 염기 대합 가능한 상기 인공 염기의 유도체를 포함하는 방법.
(29)(23)~(28) 중 어느 하나에 있어서, 상기 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자가 DNA 또는 RNA인 방법.
(30)(26)~(29) 중 어느 하나에 있어서, 1본쇄 핵산 분자가 RNA일 때에 상기 증폭 공정 또는 제1~제3 증폭 공정이 역전사 단계, DNA 증폭 단계 및 전사 단계를 포함하는 방법.
(31)(1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 핵산 앱타머 및/또는 (16)~(22)에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 핵산 앱타머를 유효 성분으로 하고, 그 핵산 앱타머의 표적 물질의 기능을 저해하는 의약 조성물.
(32)(6)~(8) 중 어느 하나에 기재된 핵산 앱타머를 유효 성분으로 하는 혈관 내피 세포 증식 인자의 기능 저해용 의약 조성물.
(33)(9)~(11) 중 어느 하나에 기재된 핵산 앱타머를 유효 성분으로 하는 인터페론γ의 기능 저해용 의약 조성물.
(34)(1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 핵산 앱타머 및/또는 (16)~(22)에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 핵산 앱타머를 이용하여 시료 중에 존재하는 그 핵산 앱타머가 결합하는 표적 물질을 검출하는 방법.
(35)비수식의 천연형 리보뉴클레오티드와 인공 염기 대합 가능한 인공 염기를 가지는 비천연형 리보뉴클레오티드를 포함하고, 또한 복제 가능한 데옥시리보자임 또는 전사 가능한 리보자임.
(36)(35)에 있어서, 상기 인공 염기가 Ds, Pn 및 Pa로 이루어지는 군에서 선택되는 리보자임.
(37)(35)에 있어서, 상기 인공 염기가 인공 염기 대합 가능한 상기 인공 염기의 유도체를 포함하는 리보자임.
(38)(12)~(15) 중 어느 하나에 기재된 1본쇄 핵산 라이브러리 및 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 포함하는 핵산 앱타머, 데옥시리보자임 또는 리보자임 제조용 키트.
본 명세서는 본원 우선권의 기초인 일본특허출원 2011-253357호, 2012-148962호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법에 의하면, 표적 물질과의 특이성 및 결합성이 높은 핵산 앱타머, 특히 DNA 앱타머를 효율적으로 제조할 수 있다.
본 발명의 염기 서열 결정 방법에 의하면, 지금까지 확립되지 않았던 비천연형 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정할 수 있다.
도 1은 인공 염기의 구체적인 예를 나타낸 도면이다.
도 2는 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자의 구조를 나타낸 개념도이다.
도 3은 핵산 앱타머의 제조 방법의 공정 흐름을 나타낸다.
도 4는 랜덤 라이브러리법의 공정 흐름을 나타낸다.
도 5는 프레데터민법의 공정 흐름을 나타낸다.
도 6a는 IonTorrent PGM에 의해 해석한 클론과 그 수의 내역을 나타낸다. 도면 중, 굵은 글씨 밑줄은 식별 부위를 나타낸다. 식별 부위로부터 예상되는 Ds의 위치를 소문자「n」로 나타낸다.
도 6b는 IonTorrent PGM에 의해 해석한 클론과 그 수의 내역을 나타낸다. 도면 중, 굵은 글씨 밑줄은 식별 부위를 나타낸다. 식별 부위로부터 예상되는 Ds의 위치를 소문자「n」로 나타낸다.
도 7은 IonTorrent PGM에 의해 얻어진 클론 간의 모티프 얼라인먼트를 나타낸다. 샘플명 란에서 괄호 안 숫자는 리드(read) 수(클론의 수)를 나타낸다. 식별 부위는 밑줄로, 식별 부위로부터 예상되는 Ds의 위치를 굵은 글씨 Ds로, 9종의 서열에서 GGGDsTTGGNGGGGDsGTCGG(N은 임의의 천연형 염기)에 상동성이 있는 서열을 이탤릭체로 나타내었다.
도 8은 실시예 2에서 SPR 해석에 이용한 DNA 앱타머의 전체 길이와 컨트롤 서열(VEGF binding DNA 64)을 나타낸다. 굵은 글씨·밑줄은 식별 서열을, 소문자는 프라이머 결합 영역을, 그리고 굵은 글씨는 Ds 또는 Ds를 천연형 염기로 치환한 부분을 각각 나타낸다. T*=Biotin-dT. VEGF binding DNA 64는 컨트롤 서열로, 굵은 글씨 이탤릭체 서열 영역은 셀렉션에서 Competitor에 사용한 서열에 상당한다.
도 9는 전체 길이 DNA 앱타머의 센서 그램을 나타낸다.
도 10은 대장균을 이용한 클로닝법에 의해 결정한 5라운드 후의 도프 셀렉션으로 얻어진 28 클론의 염기 서열을 나타낸다. 염기 서열 중, 「D」는 「Ds」를 나타낸다.
도 11은 5라운드 후의 도프 셀렉션으로 얻어진 DNA의 IonTorrent PGM에 의한 해석 결과를 나타낸다. 가로축에 나타내는 염기 서열에 있어서, 「D」는 「Ds」를 나타낸다.
도 12는 전체 길이 및 줄인 DNA 앱타머의 센서 그램을 나타낸다.
도 13은 VEGF165 및 그 이외의 단백질과의 상호 작용 해석을 나타낸다.
도 14는 대장균을 이용한 클로닝법에 의해 결정한 8라운드 후의 랜덤 셀렉션으로 얻어진 59 클론의 염기 서열을 나타낸다. 괄호 안 숫자는 동일 클론수를 나타낸다. 클론 서열의 랜덤 영역 중, 굵은 글씨로 나타낸 염기는 상동성이 있는 염기 간에 1염기의 변이가 보인 개소이다. 인공 염기 Ds의 위치 동정에 사용한 비오틴화 프로브(3'-프로브 서열-5') 5종류도 도면 중에 나타내었다.
도 15는 실시예 8에 기재된 VEGF-165에 대한 1회째 SELEX에 의해 얻어진 각 클론의 VEGF-165에 대한 결합을 나타내는 SPR 센서 그램을 나타낸다. (A~C)2.5nM, 5nM, 10nM의 VEGF-165를 인젝션한 경우의 SPR 센서 그램이다. (D)VG20Ds-57의 각종 단백질에의 결합 해석을 나타낸다. 센서 그램은 SPR에 결합시킨 DNA 단편의 분자량, 인젝션하는 단백질의 분자량, SPR에 결합시킨 DNA 단편의 고정화량(RU)으로 규격화하였다. 인젝션 시간은 480초이고, 해리 시간은 480초이다. 인젝션으로부터 930초 후(해리 시간이 450초 경과 후)의 값을 표 9에 나타내었다.
도 16a는 VEGF-165에 대한 2회째 Doped SELEX에 의해 얻어진 서열을 나타낸다. 4라운드의 Doped SELEX에 의해 얻어진 서열 중에서 상위 50위의 서열의 셀렉션에서 도프로 한 45 염기 부분을 나타내고 있다. 굵은 글씨는 VG20의 서열로부터 변이한 염기 부분이다.
도 16b는 VGd1-2Ds-47의 서열이라고 예측된 2차 구조를 나타낸다. 4라운드의 Doped 셀렉션에 의해 얻어진 서열에 있어서, 인공 염기 이외의 Doped 서열 부분에서 그 염기가 99% 이상, 96% 이상의 저장률을 나타내는 것은 각각 동그라미, 팔각형으로 나타내었다. 소문자는 셀렉션시의 Primer 영역 서열에 유래하는 염기이다.
도 17a는 VGd1-2Ds-47과 기존의 항VEGF-165 앱타머의 각 단백질에의 결합을 SPR에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
도 17b는 각종 VGd1-2Ds-47 변이체의 예측 2차 구조에서의 Ds의 위치와 VEGF-165에 대한 결합 능력(KD)을 나타낸다.
도 18은 각종 VGd1-2Ds-47 변이체의 VEGF-165에 대한 결합을 나타내는 SPR 센서 그램이다. 2.5nM(A), 5nM(B), 10nM(C), 20nM(D)의 VEGF-165를 인젝션한 경우의 SPR 센서 그램이다.
도 19는 실시예11에 기재된 ITF-γ에 대한 1회째 SELEX에 의해 얻어진 각 클론의 IFN-γ에 대한 결합을 나타내는 SPR 센서 그램을 나타낸다. (A~C)50nM, 100nM, 150nM의 IFN-γ를 인젝션한 경우의 SPR 센서 그램이다. (D)IF07bDs-57의 각종 단백질에의 결합 해석을 나타낸다. 센서 그램은 SPR에 결합시킨 DNA 단편의 분자량, 인젝션하는 단백질의 분자량, SPR에 결합시킨 DNA 단편의 고정화량(RU)으로 규격화하였다. 인젝션 시간은 480초이고, 해리 시간은 480초이다. 인젝션으로부터 930초 후(해리 시간이 450초 경과 후)의 값을 표 9에 나타내었다.
도 20a는 IFN-γ에 대한 2회째 Doped SELEX에 의해 얻어진 서열을 나타낸다. 4라운드의 Doped SELEX에 의해 얻어진 서열 중에서 상위 50위의 서열의 셀렉션에서 도프로 한 45 염기 부분을 나타내고 있다. 굵은 글씨는 IF07b의 서열로부터 변이한 염기 부분이다.
도 20b는 IFd1-3Ds-49의 서열이라고 예측된 2차 구조를 나타낸다. 4라운드의 Doped 셀렉션에 의해 얻어진 서열에 있어서, 인공 염기 이외의 Doped 서열 부분에서 그 염기가 99% 이상, 96% 이상의 저장률을 나타내는 것은 각각 동그라미, 팔각형으로 나타내었다. 소문자는 셀렉션시의 Primer 영역 서열에 유래하는 염기이다.
도 21a는 IFd1-3Ds-49와 기존의 항IFN-γ 앱타머의 각 단백질에의 결합을 SPR에 의해 해석한 결과를 나타낸다.
도 21b는 각종 IFd1-3Ds-49 변이체의 예측 2차 구조에서의 Ds의 위치와 IFN-γ에 대한 결합 능력(KD)을 나타낸다.
도 22는 각종 IFd1-3Ds-49 변이체의 IFN-γ에 대한 결합을 나타내는 SPR 센서 그램을 나타낸다. 50nM(A), 100nM(B), 150nM(C)의 IFN-γ를 인젝션한 경우의 SPR 센서 그램이다.
1. 핵산 앱타머
1-1. 개요
본 발명의 제1 실시형태는 핵산 앱타머이다. 본 발명의 핵산 앱타머는 천연형 뉴클레오티드와 비천연형 뉴클레오티드를 포함하고, 종래법으로 얻어지는 핵산 앱타머보다도 표적 물질과의 특이성 및 결합성이 높은 성질을 가질 수 있다.
1-2. 정의
본 명세서에서 사용하는 일반적인 용어의 정의에 대해 이하에서 설명한다.
본 명세서에서 「핵산」 또는 「핵산 분자」란 원칙적으로 뉴클레오티드를 구성 단위로 하고, 이들이 포스포디에스테르 결합에 의해 연결한 생체 고분자를 말한다.
본 명세서에서 「천연형 뉴클레오티드」란 자연계에 존재하는 뉴클레오티드로서, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 중 어느 하나의 천연형 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오티드로 구성되는 DNA 및 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실 중 어느 하나의 천연형 염기를 가지는 리보뉴클레오티드로 구성되는 RNA, 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 천연형 뉴클레오티드만으로 구성되는 핵산(분자)을 본 명세서에서는 천연형 핵산(분자)이라고 한다.
본 명세서에서 「비천연형 뉴클레오티드」란 그 염기가 인공 염기로 구성되어 있는 자연계에 존재하지 않는 뉴클레오티드를 말한다. 본 발명에서의 비천연형 뉴클레오티드를 구성하는 인산기 및 당은 천연형 뉴클레오티드의 인산기 및 당과 구조적으로 동일하다.
본 명세서에서 「인공 염기」란 천연형 뉴클레오티드를 구성하는 천연형 염기에 유사한 성질을 가지는 인공적으로 구축된 염기 유사체로서, 천연형 염기와 마찬가지로 인공 염기 대합을 형성할 수 있는 상대가 되는 염기 유사체(본 명세서에서는 이후 「상보적 인공 염기」라고 함)를 가진다. 본 명세서에서 「인공 염기 대합」이란 천연형 염기의 아데닌과 티민, 아데닌과 우라실 또는 구아닌과 시토신과 같이 한 쌍의 상보적 인공 염기가 서로 형성하는 염기 대합을 말한다. 인공 염기 대합은 천연형 염기 간의 염기 대합에 보이는 수소 결합을 통한 화학적 결합, 인공 염기 간의 분자 구조에 기초한 끼워맞춤을 통한 물리적 결합 및 소수성 상호 작용을 통한 스태킹 효과를 포함한다.
인공 염기가 가지는 「천연형 염기에 유사한 성질」에는 인공 염기 대합에 의한 상보성에 따라 핵산 복제 또는 전사(역전사를 포함함)가 가능한 성질을 포함한다. 인공 염기는 천연형 염기와 마찬가지로 인공 염기 대합에서 배타적 선택성을 가진다. 따라서, 기질 뉴클레오티드에 한 쌍의 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드가 존재하면, 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이어도 인공 염기 간의 상보성에 따라 천연형 뉴클레오티드와 마찬가지로 정확한 복제나 전사가 가능하다. 그 때문에 비천연형 뉴클레오티드를 포함하면서 PCR 등의 핵산 증폭법에 따른 DNA 분자 증폭이나 in vitro 전사법에서의 RNA 분자 증폭이 가능하게 된다.
상기 인공 염기의 구체적인 예를 도 1에 나타낸다. a는 Ds(7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl; 본 명세서에서는 「Ds」라고 함), b는 Pn(2-nitropyrrole-1-yl; 본 명세서에서는 「Pn」이라고 함), c는 Pa(2-formyl-1H-pyrrole-1-yl; 본 명세서에서는 「Pa」라고 함), d는 P(2-amino-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one; 본 명세서에서는 「P」라고 함), e는 Z(6-amino-5-nitro-2(1H)-pyridone; 본 명세서에서는 「Z」라고 함), f는 5SICS(6-methylisoquinoline-1(2H)-thione; 본 명세서에서는 「5SICS」라고 함), g는 NaM(3-methoxynaphthalen-2-yl; 본 명세서에서는 「NaM」이라고 함) 및 h는 MMO2(2-methoxy-4-methylphenyl; 본 명세서에서는 「MMO2」라고 함)를 들 수 있다. 이들 인공 염기에 있어서, Ds의 상보적 인공 염기에는 Pn 및 Pa를 들 수 있다. P의 상보적 인공 염기에는 Z를 들 수 있다. 5SICS의 상보적 인공 염기에는 NaM 및 MMO2를 들 수 있다.
또, 인공 염기는 복제나 전사시에 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드가 기질에 포함되지 않는 경우에는 상보적 인공 염기와 구조적으로 및/또는 성질적으로 가까운 천연형 염기와 대체적으로 염기 대합할 수 있다. 이 경우, 주형이 된 핵산 분자에서의 비천연형 뉴클레오티드는 복제 또는 전사 후에 천연형 뉴클레오티드로 치환되게 된다. 예를 들면 Ds의 경우, A 또는 T로 치환되는 것이 알려져 있다.
본 명세서에서 「핵산 앱타머」란 핵산으로 구성되는 앱타머로서, 수소 결합 등을 통한 1본쇄 핵산 분자의 2차 구조, 나아가 3차 구조에 기초하여 형성되는 입체 구조에 따라 표적 물질과 강고하고 특이적으로 결합하여, 표적 물질의 생리 활성 등의 기능을 특이적으로 저해 또는 억제하는 능력을 가진 리간드 분자를 말한다. 따라서, 핵산 앱타머는 표적 물질의 기능 저해제가 될 수 있다. 본 명세서에서 「표적 물질의 기능 저해」란 표적 물질이 가지는 촉매 기능 또는 유전자 발현 제어 기능(전사, 번역, 수송 등의 제어를 포함함), 아포토시스 제어 기능과 같은 생물학적 기능을 저해 또는 억제하는 것을 말한다.
핵산 앱타머는 일반적으로 RNA만으로 구성되는 RNA 앱타머와 DNA만으로 구성되는 DNA 앱타머가 알려져 있지만, 본 명세서에서의 핵산 앱타머를 구성하는 핵산은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, DNA 앱타머, RNA 앱타머, DNA와 RNA의 조합으로 구성되는 앱타머 등을 포함한다. 안정성, 화학 합성에서의 제조 비용 및 앱타머 제조에서의 공정수를 고려한 경우, DNA 앱타머는 보다 적합하다.
본 명세서에서 「표적 물질」이란 핵산 앱타머, 데옥시리보자임 또는 리보자임의 결합 대상이 될 수 있는 물질을 말한다. 표적 물질 종류는 핵산 분자가 결합할 수 있는 물질이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 펩티드(올리고펩티드 또는 폴리펩티드), 핵산, 지방질, 당(당쇄를 포함함) 또는 저분자 화합물을 들 수 있다. 바람직하게는 펩티드, 보다 바람직하게는 폴리펩티드, 즉 단백질이다. 또한, 천연 유래의 물질, 화학 합성 물질, 유전자 재조합 물질 등 어떤 것이어도 된다.
1-3. 구성
본 발명의 핵산 앱타머는 천연형 뉴클레오티드와 비천연형 뉴클레오티드를 포함하고, 또한 전사 또는 복제 가능한 폴리 뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명의 핵산 앱타머에 포함되는 비천연형 뉴클레오티드는 그 염기가 인공 염기로 구성된다. 인공 염기는 상기 성질을 가지는 것이면, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 인공 염기의 구체적인 예로서 열거한 인공 염기나 후술하는 인공 염기의 유도체를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 앱타머에서의 비천연형 뉴클레오티드의 함유율은 그 핵산 앱타머를 구성하는 전체 뉴클레오티드 수의 20% 이하, 바람직하게는 15% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하이면 된다. 전체길이 100 염기 이하의 핵산 앱타머의 경우, 통상은 하나의 핵산 앱타머당 비천연형 뉴클레오티드를 1~20개 가지고 있으면 본 발명의 효과를 나타낼 수 있다.
비천연형 뉴클레오티드가 하나의 핵산 앱타머당 복수 포함되는 경우, 각 비천연형 뉴클레오티드가 가지는 인공 염기는 동일해도 및/또는 달라도 된다. 단, 인공 염기가 다른 경우에는 동일한 상보적 인공 염기를 가지는 2 이상의 인공 염기를 혼재시키지 않도록 유의한다. 복제 또는 전사 과정에서 상보적 인공 염기를 통해 당초의 인공 염기가 다른 인공 염기로 치환될 가능성이 있기 때문이다. 예를 들면, 핵산 앱타머가 Pn 및 Pa를 가지는 비특이적 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 복제 과정에서 각각의 상보적 인공 염기인 Ds를 통해 Pn과 Pa의 위치가 치환될 수 있기 때문이다.
본 발명의 핵산 앱타머를 구성하는 비천연형 뉴클레오티드의 염기는 상기 예시한 인공 염기의 유도체이어도 된다. 「인공 염기의 유도체」란 인공 염기의 일부가 다른 원자단 또는 다른 관능기로 치환된 염기 유사체로서, 인공 염기의 상보적 인공 염기와의 상보성을 유지하고 있다.
예를 들면, 상기 Ds의 유도체로서는 이하의 식(1)으로 나타내는 Ds 유도체를 들 수 있다.
Figure pct00001
식 중, R 및 R'는 각각 독립적으로 이하의 식(2)으로 나타내는 어느 하나이다.
Figure pct00002
Figure pct00003
(2)
식 중, n1=2~10, n2=1 또는 3, n3=1, 6 또는 9, n4=1 또는 3, n5=3 또는 6, R1=Phe(페닐알라닌), Tyr(티로신), Trp(트립토판), His(히스티딘), Ser(세린) 또는 Lys(리신), R2, R3, R4=Leu(류신), Leu, Leu 또는 Trp, Phe, Pro(프롤린)이다.
또한, Pn의 유도체로서는 이하의 식(3)으로 나타내는 인공 염기 유도체를 들 수 있다.
Figure pct00004
식 중, R은 이하의 식(4)로 나타내는 어느 하나이다.
Figure pct00005
Figure pct00006
(4)
식 중, n1=1, 3, n2=2~10, n3=1, 6, 9, n4=1, 3, n5=3, 6, R1=Phe, Tyr, Trp, His, Ser, Lys, R2, R3, R4=Leu, Leu, Leu 또는 Trp, Phe, Pro이다.
또, Pa의 유도체로서는 이하의 식(5)으로 나타내는 인공 염기 유도체를 들 수 있다.
Figure pct00007
식 중, R은 이하의 식(6)으로 나타내는 어느 하나이다.
Figure pct00008
Figure pct00009
(6)
식 중, n1=1, 3, n2=2~10, n3=1, 6, 9, n4=1, 3, n5=3, 6, R1=Phe, Tyr, Trp, His, Ser, Lys, R2, R3, R4=Leu, Leu, Leu 또는 Trp, Phe, Pro이다.
상기 유도체는 상보적 인공 염기와의 사이에서 인공 염기 대합에 의해 핵산의 복제 또는 전사(역전사를 포함함)가 가능하다.
또한, 본 발명의 핵산 앱타머를 구성하는 천연형 뉴클레오티드의 일부는 수식되어 있어도 된다. 여기서 말하는 「수식」이란 핵산의 구성 단위인 뉴클레오티드 또는 그 구성 요소인 뉴클레오시드의 일부 또는 전부가 다른 원자단 또는 다른 관능기로 치환되는 것을 말한다. 구체적으로 예를 들면, 당 수식, 염기 수식 또는 인산 수식을 들 수 있다.
당 수식이란 뉴클레오시드를 구성하는 리보스부의 수식이다. 예를 들면, 리보뉴클레오시드를 구성하는 리보스부의 수식으로서, 2'위의 히드록시기에서의 치환을 들 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 히드록시기를 메톡시기로 치환한 2'-O-메틸 리보스, 에톡시기로 치환한 2'-O-에틸 리보스, 프로폭시기로 치환한 2'-O-프로필 리보스, 혹은 부톡시기로 치환한 2'-O-부틸 리보스, 히드록시기를 플루오로기로 치환한 2'-디옥시-2'-플루오로 리보스 또는 히드록시기를 2'-O-메톡시-에틸기로 치환한 2'-O-메톡시에틸 리보스가 해당한다. 또는, 뉴클레오시드의 (디옥시)리보스부의 다른 당으로의 치환 등을 들 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 리보스부의 아라비노스, 2'-플루오로-β-D-아라비노스, 리보스의 2' 히드록시기와 4'위의 탄소 원자를 메틸렌으로 가교한 리보스 유도체, 리보스 고리의 4위치의 산소를 유황으로 치환한 리보스 유도체로의 치환이 해당한다. 또는, 리보프라노스 고리 상의 산소 원자(리보스의 4위치의 산소 원자)가 유황으로 치환된 것도 포함된다.
염기 수식이란 뉴클레오시드를 구성하는 염기부의 수식이다. 예를 들면, 염기부로의 관능기의 치환 혹은 부가 또는 염기부의 염기 유사체로의 치환을 들 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 시토신의 5위치로 메틸기가 치환된 5-메틸 시토신, 시토신의 5위로 히드록시기가 치환된 5-히드록시 시토신, 우라실의 5위치로 플루오로기가 치환된 5-플루오로 우라실, 우라실의 4위치의 산소 원자가 티오기로 치환된 4-티오 우라실 혹은 우라실의 5위치로 메틸기가 치환된 5-메틸 우라실이나 우라실의 2위치의 산소 원자가 티오기로 치환된 2-티오 우라실과 같은 수식 피리미딘, 아데닌의 6위치로 메틸기가 치환된 6-메틸 아데닌, 구아닌의 6위치로 티오기가 치환된 6-티오 구아닌과 같은 수식 퓨린 또는 다른 복소환 염기 등이 해당한다.
본 발명의 앱타머의 염기 길이는 한정되지는 않지만, 10~100 염기의 범위 내인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 15~80 염기의 범위 내이다.
본 발명의 핵산 앱타머는 천연형 및 비천연형 뉴클레오티드로 구성되지만, 천연형 뉴클레오티드만으로 구성되는 폴리 뉴클레오티드와 마찬가지로 복제 또는 전사(역전사를 포함함)가 가능하다. 이는 전술한 바와 같이 비천연형 뉴클레오티드가 가지는 인공 염기가 상보적 인공 염기와 인공 염기 대합하는 상보성에 따라 핵산 앱타머의 복제 또는 전사에서 천연형 염기와 마찬가지의 기능을 할 수 있기 때문이다. 따라서, 통상의 핵산 증폭 방법이나 in vitro 전사법에 의해 핵산 앱타머를 클로닝할 수 있다.
1-4. 제조 방법
본 발명의 핵산 앱타머는 비천연형 뉴클레오티드를 포함하지만, 그 비천연형 뉴클레오티드가 가지는 인공 염기는 전술한 성질을 가지는 점에서 핵산 증폭 공정에서 기질 뉴클레오티드에 한 쌍의 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 추가함으로써, 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 소정의 제조 공정을 거침으로써 제조할 수 있다. 이하, 본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법에 대해 설명한다.
1-4-1. 1본쇄 핵산 라이브러리
본 명세서에서 「1본쇄 핵산 라이브러리」란 핵산 앱타머의 후보 분자를 포함하는 동일한 및/또는 다른 복수의 1본쇄 핵산 분자로 구성되는 풀을 말한다. 단, 1본쇄 핵산 분자에서 그 전부 또는 일부의 염기가 서로 대합함으로써 2본쇄를 형성한 분자가 포함되어 있어도 된다.
본 발명의 1본쇄 핵산 라이브러리는 그 전부 또는 일부가 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자로 구성된다.
본 명세서에서 「비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자」란 천연형 뉴클레오티드와 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 핵산 분자를 말한다. 비천연형 뉴클레오티드는 인공 염기의 상보적 인공 염기와의 상보성을 유지하고 있는 전술한 인공 염기의 유도체이어도 된다.
비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자에서의 비천연형 뉴클레오티드의 함유율은 그 핵산 분자를 구성하는 전체 뉴클레오티드 수의 20% 이하, 바람직하게는 15% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하이다. 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자가 비천연형 뉴클레오티드를 복수 포함하는 경우, 각 비천연형 뉴클레오티드가 가지는 인공 염기는 동일해도 및/또는 달라도 된다. 예를 들면, Ds와 Pn, Ds 유도체와 Pn, Ds 유도체와 Pn 유도체, Ds와 Pa, Ds 유도체와 Pa 또는 Ds 유도체와 Pa 유도체와 같이 서로 상보적인 한 쌍의 다른 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 함유시킬 수 있다. 단, 인공 염기가 다른 경우에는 동일한 상보적 인공 염기를 가지는 2 이상의 인공 염기를 혼재시키지 않도록 유의한다. 복제 또는 전사 과정에서 상보적 인공 염기를 통해 당초의 인공 염기가 다른 인공 염기로 치환될 가능성이 있기 때문이다. 예를 들면, 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자가 Pa 및 Pn을 가지는 비특이적 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 복제 과정에서 각각의 상보적 인공 염기인 Ds를 통해 Pa와 Pn의 위치가 치환될 수 있기 때문이다.
1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자는 1본쇄 DNA 분자 또는 1본쇄 RNA 분자 중 어느 것이어도 된다. 본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법에서 DNA 앱타머를 제조하는 경우에는 1본쇄 DNA 분자로 구성되는 1본쇄 핵산 라이브러리를, RNA 앱타머를 제조하는 경우에는 1본쇄 RNA 분자로 구성되는 1본쇄 핵산 라이브러리를 사용한다.
1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자는 도 2에서 나타내는 1차 구조를 가질 수 있다. 도 2의 A 및 B에서 도시된 바와 같이, 1본쇄 핵산 분자는 어느 것이든 그 5' 단말측 및 3' 단말측에 프라이머가 결합하는 프라이머 결합 영역(201, 203)과 이들 2개의 프라이머 결합 영역 사이에 위치하는 중앙 영역(202)을 포함한다.
프라이머 결합 영역은 천연형 뉴클레오티드, 비천연형 뉴클레오티드 또는 그 조합으로 구성된다.
프라이머 결합 영역의 염기 길이는 15~40 염기, 중앙 영역의 염기 길이는 20~80 염기이다. 따라서, 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자의 염기 길이는 50~160 염기의 범위 내이다.
5' 단말측 및 3' 단말측의 프라이머 결합 영역은 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 각 1본쇄 핵산 분자 간에 각각 공통되는 이미 알려진 염기 서열로 이루어지고, 5' 단말측(201)은 포워드 프라이머(204)에 대응하는 염기 서열로, 3' 단말측(203)은 리버스 프라이머(205)에 상보적인 염기 서열로 구성된다. 각 프라이머의 염기 서열은 프라이머가 분자 내에서 2차 구조를 형성하기 어려운 서열인 것 및/또는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머끼리가 염기 대합에 의해 연속하는 2본쇄 영역을 형성하지 않은 서열인 것, 각각의 Tm값이 40~80℃, 45~75℃ 또는 50~65℃의 범위 내에 있는 것, 두 프라이머의 Tm값이 크게 다르지 않은 것 및 각 프라이머의 GC함량이 40~60% 또는 45~55%인 것이 바람직하다.
중앙 영역(202)은 전부 혹은 일부가 랜덤 염기 서열 또는 특정의 염기 서열로 이루어진다.
중앙 영역의 염기 서열은 원칙적으로 그 전부가 랜덤 염기 서열(202에서 사선으로 나타냄)이다. 특히, 본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법에서 1본쇄 핵산 라이브러리를 첫회 라운드에 사용하는 경우에는 핵산 앱타머의 선택폭을 확대하기 위해서도 랜덤 염기 서열인 것이 바람직하다. 이 경우, 중앙 영역에 비천연형 뉴클레오티드를 전혀 포함하지 않는 1본쇄 핵산 분자가 1본쇄 핵산 라이브러리 중에 포함되어 있어도 된다. 이러한 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자 중에 비천연형 뉴클레오티드를 포함하지 않는 1본쇄 핵산 분자를 포함하는 1본쇄 핵산 라이브러리를 본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법에 이용함으로써, 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 핵산 앱타머보다는 표적 물질에 강고하게 결합하는 천연형 뉴클레오티드만으로 구성된 핵산 앱타머가 제조될 수 있을 가능성이 있기 때문에 핵산 앱타머의 제조 방법으로서는 보다 그 목적에 이바지하기 때문이다.
중앙 영역이 「특정의 염기 서열」로 이루어지는 경우란, 예를 들면 소정의 선택압을 받은 1본쇄 핵산 분자에서의 염기 서열을 말한다. 여기서, 「소정의 선택압을 받은 1본쇄 핵산 분자」란, 예를 들면 본 발명의 제조 방법이 후술하는 반복 공정을 포함하는 경우에 반복 공정 후의 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자가 해당한다.
1본쇄 핵산 라이브러리의 일 형태로서 중앙 영역의 일부가 랜덤 염기 서열로 이루어지는 1본쇄 핵산 분자로 구성된 것이어도 된다. 「중앙 영역의 일부가 랜덤 염기 서열」이란, 예를 들면 중앙 영역의 염기 서열에 있어서 소정 위치의 염기 서열이 미리 특정되어 있고, 그 이외의 다른 염기가 랜덤인 1본쇄 핵산 분자 및/또는 소정 위치의 염기가 인공 핵산으로 구성되어 있고, 그 이외의 다른 염기가 랜덤인 1본쇄 핵산 분자를 들 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 도 2의 B에서 나타내는 중앙 영역의 적어도 한쪽 말단에 식별 부위(206)를 포함하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 들 수 있다. 「식별 부위」(206)란 중앙 영역에서 상기 프라이머 결합 영역에 인접하도록 배치되고, 그 염기 서열이 미리 결정된 부위를 말한다. 이 식별 부위는 천연형 염기를 가지는 1~10개, 바람직하게는 1~8개, 보다 바람직하게는 1~5개의 천연형 뉴클레오티드로 구성되고, 그 염기 서열은 해당 중앙 영역의 염기 서열 상의 특정 위치에 미리 배치된 하나 이상의 인공 염기(207)의 위치 정보와 관련된다. 「인공 염기의 위치 정보와 관련된다」란 중앙 영역의 소정 위치에 도입한 인공 염기의 위치를 나타내는 태그 서열로서 기능하는 것을 말한다. 예를 들면, 중앙 영역의 5' 말단에 배치되는 식별 부위의 염기 서열이 AG인 경우에는 중앙 영역의 5' 말단에서 10번째 염기가 Ds인 것을 나타낸다는 식이다. 이와 같이 식별 영역은 천연형 뉴클레오티드로 구성되고, 또한 프라이머 결합 영역에 인접하는 이미 알려진 염기 서열로 구성되어 있기 때문에, 증폭 공정 후이어도 그 염기 서열은 유지되고 태그 서열로서 기능할 수 있다. 인공 염기의 위치 정보는 식별 부위의 염기 수, 염기 서열, 5' 단말측 및/또는 3' 단말측 배치 위치 또는 이들의 조합에 의해 무수히 설정하는 것이 가능하다. 따라서, 중앙 영역에 하나 또는 2개 이상의 인공 염기를 배치시킬 수도 있다. 이러한 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자로 이루어지는 1본쇄 핵산 라이브러리는 후술하는 1본쇄의 염기 서열을 결정하는 방법의 일 형태에 있어서 유용하다.
1본쇄 핵산 라이브러리의 조제는 해당 분야에서 공지의 방법에 따라 적절히 조제하면 된다. 예를 들면, 핵산 합성기를 이용하여 1본쇄 핵산 라이브러리를 화학 합성에 의해 조제하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는 1본쇄 DNA 라이브러리를 조제한다면, DNA 신시사이저를 이용하여 염기 서열의 합성 프로그램을 입력해 둠으로써, 그 프로그램에 따라 목적하는 1본쇄 핵산 라이브러리를 얻을 수 있다. 예를 들면, 프라이머 결합 영역은 소정의 염기 서열이 되도록 입력하고, 중앙 영역은 랜덤 염기 서열이 되도록 프로그램해 두면 된다. 그 때, 핵산 합성의 기질로서 4종의 천연형 뉴클레오티드에 1종 이상의 비천연형 뉴클레오티드를 추가함으로써, 비천연형 뉴클레오티드가 도입된 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 포함하는 1본쇄 핵산 라이브러리를 얻을 수 있다.
또한, 전술한 중앙 영역의 일부가 랜덤 염기 서열로 이루어지는 1본쇄 핵산 라이브러리의 조제도 상기와 마찬가지로 프라이머 결합 영역 및 중앙 영역의 소정 위치(예를 들면, 식별 부위 및 그것에 관련된 인공 염기 도입 위치)가 소정의 염기가 되도록 프로그램을 입력하고, 그 밖의 중앙 영역은 랜덤 염기 서열이 되도록 합성 프로그램을 입력해 두면 된다.
1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 각 핵산 분자의 합성은 생명과학 제조사에 위탁해도 된다.
핵산 앱타머의 제조 방법이 후술하는 반복 공정을 포함하는 경우, 2라운드째 이후에 사용하는 1본쇄 핵산 라이브러리는 그 반복 공정 직전 라운드에서 얻어진 1본쇄 핵산 분자에 기초하여 조제하면 된다.
1본쇄 핵산 라이브러리는 핵산 앱타머 후보를 포함하는 라이브러리이기 때문에, 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 각 1본쇄 핵산 분자는 원칙적으로 셀프 폴딩에 의한 고차 구조를 형성하고 있다.
1-4-2. 제조 공정
본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법에서의 공정 흐름을 도 3에 나타낸다. 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법은 복합체 형성 공정(301), 복합체 회수 공정(302), 1본쇄 핵산 분자 회수 공정(303), 증폭 공정(304) 및 핵산 앱타머 조제 공정(305)을 필수 공정으로서 포함한다. 또한, 반복 공정(306)을 임의의 공정으로서 포함할 수 있다. 또한, 제조하는 핵산 앱타머가 DNA 앱타머인 경우에는 복합체 회수 공정(302)이 고정화 단계(307)를 포함하고, 또한 제조하는 핵산 앱타머가 RNA 앱타머인 경우에는 증폭 공정(304)이 역전사 단계(308), DNA 증폭 단계(309) 및 전사 단계(310)를 포함한다.
상기 핵산 앱타머의 제조 방법은 기본적으로 종래의 SELEX법(systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (WO1991019813; WO1994008050; Lauhon C.T. and Szostak J.W., 1995, J. Am. Chem. Soc., 117: 1246-1257; Zhao X., et al., 2006, Nucleic Acids Res., 34: 3755-3761; Fan X., et al., 2004, J. T. Lis, 101: 6934-6939; Jeong S., et al., 2010, Oligonucleotides, 20: 155-161)이라고 불리는 in vitro 셀렉션법(시험관 내 선별법)에 기초한다. 특히 RNA 앱타머를 제조하는 경우에는 종래의 SELEX법에 준하여 행할 수 있다. 그러나, 종래의 SELEX법에서는 복합체 회수 공정에서의 복합체를 회수하는 방법으로서 (1)소수성 상호 작용을 이용하여 표적 물질인 단백질을 니트로셀룰로오스 필터에 트랩함으로써 복합체를 회수하는 방법, (2)겔 전기 영동시의 겔 이동도의 시프트에 의해 복합체를 회수하는 방법, 또는 (3)표적 물질을 미리 담체 등에 고정화하고, 이를 DNA 라이브러리와 혼합하는 방법이 채용되어 있었다. 그 때문에 DNA 앱타머를 제조하는 경우, (1)의 방법에서는 RNA보다 소수성이 높은 DNA가 단체(單體)로 니트로셀룰로오스 필터 상에 비특이적으로 흡착되어 버리는 문제가 있고, (2)의 방법에서는 복수 종류의 다른 서열로 이루어지는 DNA 라이브러리는 그 밴드가 흐트러지기 쉬워진다는 문제가 있고, 나아가 (3)의 방법에서는 고상 담체에만 결합한 DNA까지도 얻어진다는 문제가 있었다.
그래서, 본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법에서는 본 발명자들이 개발한 개변형 SELEX법을 이용함으로써 비특이적 흡착에 기초한 백그라운드를 최대한 저감함과 동시에, 표적 물질에 매우 강고하고 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머, 특히 DNA 앱타머를 제조할 수 있다.
이하, 상기 각 공정 및 단계에 대해 구체적으로 설명한다.
(1)복합체 형성 공정
「복합체 형성 공정」(301)이란, 1본쇄 핵산 라이브러리와 표적 물질을 용액 중에서 혼합하여 1본쇄 핵산 분자와 표적 물질의 복합체를 형성시키는 공정이다.
본 공정에 있어서, 「복합체」란 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자, 구체적으로는 핵산 앱타머의 후보인 1본쇄 핵산 분자와 표적 물질이 결합되어 형성되는 핵산-표적 물질 복합체를 말한다.
본 공정에서 사용하는 용액은 핵산과 표적 물질이 복합체를 형성할 수 있는 용액이면, 그 종류, 성질은 특별히 제한하지 않는다. 바람직하게는 물 또는 수용액이다. 수용액의 경우, pH는 5.0~9.0, 바람직하게는 6.0~8.0, 보다 바람직하게는 6.5~7.6의 범위이면 된다. 또한, 염 농도는 최종 농도로 20~500mM, 바람직하게는 50~300mM, 보다 바람직하게는 90~180mM의 범위이면 된다. 바람직한 수용액은 버퍼이다. 예를 들면, 상기 pH 범위가 적응 범위인 pH 완충액(예를 들면, 인산 버퍼, 구연산-인산 버퍼, 트리스-염산 버퍼 또는 HEPES 버퍼)에 적당한 염(예를 들면, NaCl, CH3COOK)을 최종 염 농도가 상기 범위가 되도록 첨가한 것이다. 구체적으로 예를 들면, PBS 버퍼(1.1mM KH2PO4, 155mM NaCl, 3mM Na2HPO4, pH 7.4)를 들 수 있다. 상기 pH 버퍼의 조성은 예를 들면 Sambrook, J. et. al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York에 기재된 공지 조성에 기초하여 필요에 따라 미세 조정하면 된다.
상기 용액은 필요에 따라 추가로 환원제나 계면활성제를 포함하고 있어도 된다.
환원제로는 예를 들면 DTT(디티오트레이톨)나 2-메르캅토 에탄올을 들 수 있다. 용액 중의 환원제의 최종 농도는 0.5~10mM, 바람직하게는 1~5mM의 범위이면 된다.
또한, 계면활성제는 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 예를 들면, Nonidet P40(NO-40), Triton X-100, Triton X-114, Brij-35, Brij-58, Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80, n-옥틸-β-글루코시드, MEGA-8, MEGA-9, MEGA-10을 들 수 있다. 용액 중의 계면활성제의 최종 농도는 부피/부피(V/V)로 0.005%~0.1%, 바람직하게는 0.01%~0.08%의 범위이면 된다.
나아가 본 공정에서 사용하는 용액은 경합 물질을 포함하고 있어도 된다. 본 명세서에 있어서, 「경합 물질」이란 핵산 앱타머의 후보인 1본쇄 핵산 분자와의 사이에서 표적 물질과의 결합을 서로 경합하는 물질을 말한다. 경합 물질이 상기 용액에 포함됨으로써, 보다 강고하게 표적 물질에 결합하는 핵산 앱타머를 제조하는 것이 가능하게 된다. 경합 물질의 종류는 1본쇄 핵산 분자와 표적 물질에 대해 경합할 수 있는 물질이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 핵산, 펩티드, 지방질, 당 또는 저분자 화합물을 들 수 있다. 목적하는 핵산 앱타머인 1본쇄 핵산 분자와 동일한 성질을 가지는 물질, 예를 들면 표적 물질 상의 결합 부위가 같은 물질이 바람직하다. 이러한 물질로서는 목적의 1본쇄 핵산 분자에 유사한 염기 서열을 가지는 핵산 분자(1본쇄 핵산 분자 및/또는 2본쇄 핵산 분자)가 해당한다. 구체적으로 예를 들면 표적 물질이 전사 조절 인자인 경우, 그 전사 조절 인자가 본래 결합하는 게놈 서열 상의 염기 서열 등이 상당한다. 경합 물질이 핵산 분자인 경우에는 경합 물질이 표적 물질과 복합체를 형성한 경우이어도 그 핵산 분자가 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자와 공통되는 프라이머 결합 영역(201, 203)을 가지지 않도록 디자인해 둠으로써, 후술하는 증폭 공정(304)에서 증폭되지 않게 되기 때문에 시료 중에서 제거할 수 있다.
복합체를 형성시키기 위해서는 1본쇄 핵산 라이브러리와 표적 물질을 9:1~1:9, 바람직하게는 1:1(부피:부피)로 혼합하고, 4~40℃, 바람직하게는 15~37℃의 범위 내에서 5분~30분 이상, 예를 들면 10분~1시간 정도, 바람직하게는 20분~40분 정도 인큐베이트하면 된다.
형성된 복합체는 다음의 복합체 회수 공정(302) 전에 세정해도 된다. 용액 중에서 표적 물질과 복합체를 형성하지 않았던 유리 상태인 1본쇄 핵산 분자를 세정에 의해 제거 또는 저감함으로써, 유리 1본쇄 핵산 분자의 비특이적 결합에 의한 백그라운드를 보다 저감할 수 있기 때문이다. 복합체의 세정은 표적 물질의 종류, 복합체의 분자 크기나 특성에 기초하여 해당 분야에서 공지의 방법을 이용하여 행하면 된다. 예를 들면 표적 물질이 단백질인 경우, 분자 크기에 의해 핵산만이 통과하는 한외 여과막을 이용하여 복합체를 유리 1본쇄 핵산으로부터 분리할 수 있다. 세정용 버퍼의 조성은 상기 복합체 형성에 이용한 버퍼와 마찬가지의 조성으로 된다. 또한, 복합체 형성에 이용한 버퍼와 마찬가지로 세정용 버퍼에도 환원제나 계면활성제를 포함하고 있어도 된다. 환원제나 계면활성제의 농도나 조성은 복합체 형성에 이용한 버퍼와 동일해도 된다. 무엇보다도 이 단계에서 유리 1본쇄 핵산을 제거하지 않아도 또는 완전히 제거할 수 없어도, 이어지는 복합체 회수 공정(302)이나 1본쇄 핵산 분자 회수 공정(303)에서도 세정 조작에 의해 잔존하는 유리 1본쇄 핵산을 제거할 수 있다. 따라서, 세정은 필요에 따라 행하면 된다.
(2)복합체 회수 공정
「복합체 회수 공정」(302)이란, 전 공정 후의 용액으로부터 복합체를 회수하는 공정을 말한다.
RNA 앱타머를 제조하는 경우 본 공정은 종래의 SELEX법(WO1991019813; WO1994008050; Lauhon C.T. and Szostak J.W., 전술; Zhao X., et al., 전술; Fan X., et al., 전술; Jeong S., et al., 전술)에 준하여 회수하면 된다. 그러나, DNA 앱타머를 제조하는 경우에는 종래의 SELEX법에서는 본 공정에서 전술한 문제가 있었다. 그래서, 본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법에서는 본 발명자들이 개발한 개변형 SELEX법에 기초한 복합체 회수 공정에 의해 복합체를 회수하는 것이 바람직하다.
개변형 SELEX법에 기초한 복합체 회수 공정에서는 복합체 형성 공정 후의 용액에 고상 담체를 혼합하여 복합체를 그 고상 담체에 고정화하는 고정화 단계(307)를 포함한다.
(2-1)고정화 단계
「고상화 단계」(307)란 복합체 형성 공정 후의 용액에 고상 담체를 혼합하여 복합체를 그 고상 담체에 고정화하는 단계이다.
본 발명에 있어서 「고상 담체」란 고체 상태의 담체로서, 예를 들면 자기 비즈, 고분자 다당 지지체, 실리카, 유리, 금속, 플라스틱, 세라믹스, 천연 또는 합성 수지 또는 이들의 조합을 포함한다. 고상 담체 표면은 친수성인 것이 바람직하다. 이 경우 고상 담체 자체가 친수성이어도 되고, 고상 담체가 소수성이고 그 표면을 친수성 코팅 처리한 것이어도 된다. 담체의 형상은 특별히 한정하지 않는다. 비즈와 같은 구체 또는 대략 구체 형상의 입자는 결합 표면적이 크고 조작성도 높기 때문에 본 단계에서의 고상 담체의 형상으로서 특히 바람직하다.
본 단계에 있어서, 「고정화」란 복합체를 고상 담체와 연결시키는 것을 말한다. 복합체의 고상 담체에의 고정화는 표적 물질 및/또는 고상 담체에 흡착시킨 결합자를 통해 행해진다.
본 명세서에 있어서, 「결합자」란 표적 물질과 고상 담체의 연결을 개재하는 분자를 말한다. 결합자는 결과적으로 표적 물질 및 고상 담체 간의 연결을 개재할 수 있으면, 단일 분자뿐만 아니라 2개 이상의 연결하는 다른 분자도 포함할 수 있다. 결합자의 구체적인 예로서는, 예를 들면 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 이루어지는 결합자, 상기 비오틴에 추가로 렉틴이 결합된 렉틴-비오틴 및 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 뉴트라아비딘으로 이루어지는 결합자, 하나 이상의 항체만으로 이루어지는 결합자 또는 항체 및 프로테인 A, G 또는 L로 이루어지는 결합자를 들 수 있다.
결합자는 표적 물질, 고상 담체 또는 그 둘 다에 흡착되어 있다. 여기서 말하는 「흡착」이란, 결합자를 표적 물질 또는 고상 담체에 화학적 흡착, 물리적 흡착 및/또는 친화력에 의해 고정화하는 것을 말한다. 여기서 말하는 화학적 흡착은 공유 결합, 이온 결합, 수소 결합과 같은 화학 결합을 포함하고, 물리적 흡착은 쿨롱 힘, 반데르발스 힘, 소수성 상호 작용, CH-π 상호 작용을 포함한다.
결합자가 표적 물질 또는 고상 담체의 한쪽에만 흡착되어 있는 경우, 그 결합자는 결합자가 흡착되어 있지 않은 상대측 물질을 특이적으로 인식하여 결합할 수 있다. 예를 들면, 고상 담체에 결합자가 흡착되어 있는 경우, 그 결합자는 표적 물질을 특이적으로 인식하여 결합한다. 보다 구체적으로 예를 들면, 항체 또는 항체와 결합한 프로테인 A가 결합자로서 고상 담체에 흡착되어 있는 경우, 그 항체는 표적 물질을 특이적으로 인식하여 결합한다. 그 때문에, 표적 물질과 고상 담체를 용액 중에서 혼합함으로써 표적 물질과 고상 담체가 결합자를 통해 연결된다. 복합체 형성 공정 후의 표적 물질은 그 일부 또는 전부가 핵산 앱타머의 후보인 1본쇄 핵산 분자와 복합체를 형성하고 있다. 따라서, 이 공정에 의해 복합체를 고상 담체에 고정화할 수 있다.
결합자가 표적 물질 및 고상 담체 각각에 흡착되어 있는 경우, 이들 결합자(편의상 이후, 표적 물질에 흡착된 결합자를 「제1 결합자」, 고상 담체에 흡착된 결합자를 「제2 결합자」라고 함)는 서로 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 표적 물질에 제1 결합자인 비오틴이, 고상 담체에 제2 결합자인 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 뉴트라아비딘이 각각 흡착되어 있는 경우, 표적 물질과 고상 담체를 용액 중에서 혼합함으로써 비오틴과 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 뉴트라아비딘이 서로 특이적으로 결합한다. 그 결과, 표적 물질과 고상 담체가 비오틴 및 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 뉴트라아비딘의 결합을 통해 연결된다.
표적 물질이나 고상 담체에의 결합자의 흡착 방법은 표적 물질, 고상 담체 및/또는 결합자의 종류에 따라 다르다. 각각의 종류나 목적에 따라 해당 분야에서 공지의 방법에 따라 적절히 흡착시키면 된다. 표적 물질 및 고상 담체의 어느 것에 결합자를 흡착시키는 경우이어도, 본 단계 및 다음 회수 공정에서의 조작으로 쉽게 해리하지 않는 방법으로 흡착시키는 것이 바람직하다.
흡착 방법의 예로서 표적 물질이나 고상 담체가 관능기를 가지는 경우에는, 예를 들면 그 관능기와 공유 결합이 가능한 활성 관능기(예를 들면, 알데히드기, 카르복실기, 술포기, 아미노기, 티올기, 시아노기, 니트로기)를 가지는 결합자, 또는 이러한 활성 관능기를 도입한 결합자를 이용하여 두 관능기 간의 구핵적 부가 반응, 구핵 치환 반응 혹은 구전자 치환 반응과 같은 화학 반응에 의한 공유 결합을 통해 표적 물질이나 고상 담체에 결합자를 흡착시킬 수 있다. 관능기끼리를 화학 반응에 의해 공유 결합시키는 방법은 해당 분야에서는 주지 기술이다. 예를 들면, 표적이 단백질인 경우, 비오틴을 결합자로서 단백질을 흡착시키는 경우에는 비오틴에 N-히드록시숙신이미드 에스테르(NHS) 등을 이용하여 활성 에스테르기를 도입한 후, 단백질의 아미노기와 그 에스테르기의 사이에서 아미드 결합을 형성시킴으로써 단백질을 비오틴 흡착시킬 수 있다. 표적 물질에 비오틴을 흡착시키는 경우에는 각종 비오틴화 시약이 제조사로부터 시판되고 있고, 이들을 이용해도 된다.
또한, 표적 물질이 항원이고, 또한 제1 결합자가 그 항원의 에피토프를 특이적으로 인식하여 결합하는 항체인 경우, 적당한 용액 중에서 양자를 접촉시킴으로써 어피니티 결합에 의해 제1 결합자를 표적 물질에 흡착시킬 수 있다.
표적 물질에 결합자를 흡착시키는 경우는, 복합체 형성 공정 후 본 단계 전의 적당한 시기, 예를 들면 복합체 형성 공정 후에 얻어지는 복합체를 포함하는 용액에 대해 상기 어느 하나의 흡착 방법에 의해 표적 물질에 결합자를 흡착시키면 된다. 또한, 고상 담체에 결합자를 흡착시키는 경우는, 적어도 본 단계에서 복합체를 포함하는 용액과 고상 담체를 혼합하기 전에 상기 어느 하나의 흡착 방법에 의해 고상 담체에 결합자를 흡착시키면 된다. 구체적으로 예를 들면, 표적 물질인 단백질에 제1 결합자로서 비오틴을, 고상 담체인 자기 비즈에 제2 결합자로서 스트렙트아비딘을 각각 흡착시키는 경우, 단백질에의 비오틴 흡착은 복합체 형성 공정 후에 얻어지는 복합체를 포함하는 용액에 대해, 예를 들면 시판되는 비오틴화 시약을 이용하여 첨부에 프로토콜에 따라 흡착시키면 된다. 또한, 자기 비즈에의 스트렙트아비딘의 흡착은 복합체 형성 공정과는 독립적으로 미리 자기 비즈에 공지의 방법을 이용하여 스트렙트아비딘을 흡착시켜 두면 된다. 예를 들면, 자기 비즈가 Tosyl기나 에폭시기를 가지는 경우에는 스트렙트아비딘과 혼합하는 것만으로 그대로 스트렙트아비딘의 1급 아미노기와 공유 결합에 의해 흡착시킬 수 있다. 또한, 자기 비즈가 카르복실기를 가지는 경우에는 카르보디이미드에 의한 활성화에 따라 스트렙트아비딘의 1급 아미노기와 공유 결합에 의해 흡착시킬 수 있다. 이들은 해당 분야에서 주지의 방법이다.
고정화 단계 후에 형성된 복합체를 복합체-고상 담체 상태로 용액으로부터 회수하려면 고상 담체의 특성에 기초한 방법을 이용한다. 고상 담체의 특성이란 자력, 비중, 형광, 발광, 친화력 등의 고상 담체 특유의 성질을 말한다. 예를 들면, 고상 담체가 자기 비즈이면, 용액 중의 복합체-고상 담체를 자석을 이용하여 회수한 후, 복합체 형성 공정에서 사용한 버퍼와 동일한 조성의 버퍼를 이용하여 세정하고, 표적 물질이나 고상 담체에 비특이적으로 흡착한 1본쇄 핵산을 세정, 제거함으로써 회수하면 된다. 또한, 고상 담체가 고분자 다당 지지체, 실리카, 금속 또는 유리이면, 원심에 의해 복합체-고상 담체를 침전시키고 상청을 제거한 후, 버퍼를 이용하여 세정함으로써 마찬가지로 복합체-고상 담체를 회수하면 된다. 나아가 고상 담체가 형광 물질을 담지한 고분자 다당 지지체 등이면, FACS와 같은 형광 검출기에 의해 회수하면 된다.
또, 본 단계에서는 복합체를 형성하지 않은 유리 상태의 표적 물질도 고상 담체에 고정화된다. 그러나, 후술하는 증폭 공정에서 복합체로부터 표적 물질을 제거하여 1본쇄 핵산을 회수할 때에, 이러한 복합체를 형성하지 않은 표적 물질도 동시에 제거되기 때문에 특별히 문제는 되지 않는다.
(3)1본쇄 핵산 분자 회수 공정
「1본쇄 핵산 분자 회수 공정」(303)이란 회수된 복합체로부터 1본쇄 핵산 분자를 회수하는 공정이다.
1본쇄 핵산 분자를 회수하는 방법은 복합체로부터 핵산을 회수하는 해당 분야에서 공지의 방법에 기초하여 행하면 된다. 통상 이 방법은 복합체 중의 표적 물질의 종류에 따라 다르다. 예를 들면, 표적 물질이 단백질과 같은 펩티드인 경우, 알칼리법이나 페놀/클로로포름법과 같은 단백질 변성법에 따라 단백질을 응고, 제거함으로써 목적하는 1본쇄 핵산 분자를 회수할 수 있다. 또한, 표적 물질이 지질 또는 저분자 화합물인 경우, 예를 들면 용출 버퍼를 가한 후, 가열 처리를 하여 핵산 구조를 파괴하거나 용출 버퍼에 킬레이트제를 첨가한 상태 혹은 용출 버퍼의 pH를 결합 버퍼와 바꾼 상태로 가열 처리를 하여 핵산 구조를 파괴함으로써, 표적 물질과 핵산의 결합을 해리시킨 후, 알코올 침전법 등에 의해 해리한 1본쇄 핵산 분자를 회수할 수 있다.
상기 복합체 회수 공정(302)에서 고정화 단계를 경유한 경우에는, 복합체는 복합체-고상 담체 상태로 회수되기 때문에, 필요에 따라 복합체의 용출을 행한다. 용출 방법은 결합자의 종류에 따라 다르다. 예를 들면 결합자가 항체인 경우에는, 복합체-고상 담체를 산처리 등에 의해 해리시킨 후, 필요에 따라 알칼리를 가하고 중화 처리를 행함으로써 복합체-고상 담체로부터 복합체를 용출할 수 있다. 또한, 결합자가 비오틴 및 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 뉴트라아비딘인 경우, 7M 이상의 요소 및/또는 2M 이상의 β-메르캅토 에탄올을 포함하는 용액 중에서 가열 처리함으로써 비오틴과 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 뉴트라아비딘의 결합을 해리시키고 복합체를 용출할 수 있다. 또, 표적 물질이 당쇄 수식된 물질이고 결합자가 렉틴인 경우, 글루코오스 등의 당을 첨가함으로써 복합체를 용출할 수 있다. 이들 방법은 해당 분야에서 공지의 방법에 따라 적절히 행하면 된다. 그 후, 용출된 복합체로부터 1본쇄 핵산 분자를 회수하는 방법은 전술한 바와 같다.
본 공정에서 세정에 이용하는 버퍼로는 복합체 형성 공정에서 사용한 버퍼와 동일한 조성의 버퍼를 사용할 수 있다. 나아가 버퍼는 필요에 따라 DTT나 2-메르캅토 에탄올과 같은 환원제나 Nonidet P40(NO-40), Triton X-100 또는 Tween-20과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하고 있어도 된다. 용액 중의 계면활성제의 최종 농도는 부피/부피(V/V)로 0.005%~0.1%, 0.01%~0.08%의 범위이면 된다. 세정은 상기 버퍼를 이용하여 1~수회 행하면 된다. 2~3회 행하는 것이 바람직하다. 세정 온도나 세정 시간은 특별히 한정하지 않지만, 15~50℃ 또는 20~40℃에서 10분~1시간 행하면 된다.
(4)증폭 공정
「증폭 공정」(304)이란 상기 1본쇄 핵산 분자 회수 공정에서 회수된 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 따라 증폭하는 공정이다.
「핵산 증폭법」이란 프라이머와 폴리메라제 등의 효소를 이용하여 주형이 되는 핵산을 증폭하는 방법을 말한다.
본 공정에서는 제조하는 핵산 앱타머가 DNA 앱타머인 경우와 RNA 앱타머인 경우에 그 공정이 다소 다르다. 즉, DNA 앱타머인 경우에는 DNA 증폭 단계(309)만으로 충분하지만, RNA 앱타머인 경우에는 DNA 증폭 단계(309)에 덧붙여 역전사 단계(308) 및 전사 단계(310)를 필요로 한다.
(4-1)DNA 증폭 단계
「DNA 증폭 단계」(309)는 DNA 앱타머 및 RNA 앱타머에서의 제조 방법의 증폭 공정에서 공통되는 단계로서, DNA(cDNA를 포함함)를 주형으로 하여 프라이머와 DNA 폴리메라제 등의 효소를 이용하여 그 주형 DNA의 특정 영역을 복제하고 증폭하는 단계이다. 본 단계에서 이용하는 DNA 증폭법은 해당 분야에서 공지의 어느 하나의 방법을 사용하면 된다. 예를 들면, PCR(폴리메라제 연쇄 반응)법, ICAN(등온 유전자 증폭)법 등을 들 수 있다. 바람직하게는 PCR법이다.
상기 반응에서 이용되는 DNA 폴리메라제는 사용하는 핵산 증폭 방법에 따라 적절히 정해지지만, 통상은 내열성 DNA 폴리메라제를 사용한다. 이러한 내열성 핵산 폴리메라제는 TaKaRa사, New England Biolab사, Roche사, Life Technologies사, Roche사, Promega사 등의 각 제조사로부터 여러 가지 종류의 것이 시판되고 있고, 이들을 이용할 수도 있다.
DNA 증폭법의 반응 조건은 증폭시키는 폴리뉴클레오티드의 길이, 주형용 DNA의 양, 프라이머의 Tm값, 사용하는 DNA 폴리메라제의 최적 반응 온도 및 최적 pH 등을 감안하여 결정하면 된다. 예를 들어 PCR법이면, 1본쇄 핵산 분자를 구성하는 5' 말단측 프라이머 결합 영역(201)에 대응하는 서열을 포워드 프라이머(204)에, 3' 말단측 프라이머 결합 영역(203)에 상보적인 서열을 리버스 프라이머(205)에 이용하면 된다. 이 때, 리버스 프라이머를 표지자로 표지해 둠으로써, 그 표지자에 기초하여 증폭 반응 후의 반응 용액으로부터 증폭 산물인 2본쇄 핵산을 선택적으로 분리, 정제하거나, 그 후 그 2본쇄 핵산 중에서 목적하는 1본쇄 핵산에 상보하는 다른 쪽의 1본쇄 핵산을 그 표지자에 기초하여 분리, 제거할 수 있으므로 편리하다.
본 단계에서 유의해야 할 점으로서 DNA 증폭, 즉 DNA 복제에 이용하는 기질 조성을 들 수 있다. 통상의 DNA 증폭법에서는 4종의 천연형 디옥시리보뉴클레오티드(dATP, dGTP, dCTP, dTTP; 이하, 이들을 모아 「dNTP」라고 함)가 기질로서 사용된다. 그러나, 본 단계에서는 dNTP에 더하여 추가적으로 비천연형 디옥시리보뉴클레오티드 및 그 뉴클레오티드가 가지는 인공 염기의 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 디옥시리보뉴클레오티드를 기질로서 이용한다. 어떤 비천연형 디옥시리보뉴클레오티드를 이용할지는 본 제조 방법에서 사용한 1본쇄 핵산 라이브러리가 포함하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자에 포함되는 비천연형 뉴클레오티드에 따른다. 예를 들면, 1본쇄 핵산 라이브러리가 Ds를 가지는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 DNA 분자를 포함하는 경우, 본 단계에서 사용하는 기질로는 상기 dNTP에 더하여 Ds 및 그 상보적 인공 염기인 Pn 또는 Pa를 각각 가지는 비천연형 디옥시리보뉴클레오티드를 사용한다. 전술한 바와 같이, 본 명세서에서의 인공 염기는 천연형 염기에 유사한 성질로서 인공 염기 대합에 의한 상보성에 따라 핵산의 복제 또는 전사(역전사를 포함함)가 가능하다. 그 때문에, 한 쌍의 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 기질 뉴클레오티드에 첨가함으로써, 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자이어도 DNA 증폭법에 의한 DNA 분자의 증폭이 가능하게 된다.
PCR을 변성, 어닐링 및 신장의 3단계로 행하는 경우, 각 단계의 온도와 반응 시간은 예를 들면 열변성 단계를 90℃~98℃에서 30초~1분간, 어닐링 단계를 50℃~60℃에서 30초~1분간, 신장 단계를 70℃~75℃에서 40초~2분간 정도 행하면 된다. 또한, 사이클 수는 통상 10사이클~40사이클로 된다. 바람직하게는 15사이클에서 20사이클이다.
본 단계 후에 얻어진 증폭 DNA는 필요에 따라 정제해도 된다. 정제 방법은 해당 분야에서 공지의 어떤 방법이어도 된다. 예를 들면, 에탄올 침전법이나 스핀식 겔 여과 칼럼을 이용한 정제 방법을 들 수 있다.
(4-2)역전사 단계
「역전사 단계」(308)는 RNA 앱타머에서의 제조 방법의 증폭 공정 특유의 단계로서, RNA를 주형으로 하여 프라이머와 역전사 폴리메라제 등의 효소를 이용하여 cDNA를 생성하는 단계이다. RNA 앱타머의 제조 방법에 있어서, 본 단계는 상기 DNA 증폭 단계(309) 전에 실행된다.
본 단계에서 이용하는 역전사 방법은 해당 분야에서 공지의 어느 하나의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York에 기재된 역전사 방법에 준하여 행하면 된다.
본 단계에서 유의해야 할 점으로서 역전사 반응에 이용하는 기질 조성을 들 수 있다. 통상의 역전사 반응에서는 상기 DNA 증폭 단계와 마찬가지로 dNTP가 기질로서 사용된다. 그러나, 본 단계에서는 dNTP에 덧붙여 추가로 주형이 되는 RNA 분자에 포함되는 비천연형 리보뉴클레오티드가 가지는 인공 염기 및 그 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 디옥시리보뉴클레오티드를 기질로서 이용한다. 어떤 비천연형 디옥시리보뉴클레오티드를 이용할지는 본 제조 방법에서 사용한 1본쇄 핵산 라이브러리가 포함하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자에 포함되는 비천연형 뉴클레오티드에 따른다. 예를 들면, 1본쇄 핵산 라이브러리가 Ds를 가지는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 RNA 분자를 포함하는 경우, 본 단계에서 사용하는 기질로는 dNTP에 더하여 Ds 및 그 상보적 인공 염기인 Pn 또는 Pa를 각각 가지는 비천연형 디옥시리보뉴클레오티드를 사용한다. 전술한 바와 같이, 본 명세서에서의 인공 염기는 인공 염기 대합에 의한 상보성에 따라 핵산의 역전사가 가능하다. 그 때문에, 한 쌍의 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 기질 뉴클레오티드에 첨가함으로써, 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자로부터도 cDNA 분자의 생성이 가능하게 된다.
본 단계에서 얻어진 cDNA는 상기 DNA 증폭 단계(309)에 제공된다.
(4-3)전사 단계
「전사 단계」(310)는 RNA 앱타머에서의 제조 방법의 증폭 공정에 특유한 단계로서, 프라이머와 RNA 폴리메라제 등의 효소를 이용하여 DNA로부터 RNA를 전사하는 단계이다. RNA 앱타머의 제조 방법에 있어서, 본 단계는 상기 DNA 증폭 단계 후에 실행된다.
본 단계에서 이용하는 전사 방법은 해당 분야에서 공지의 어느 하나의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, in vitro RNA 전사법을 들 수 있다. 또한, 상기 DNA를 도입한 대장균 등의 형질 전환체를 이용하여 해당 분야에서 공지의 기술에 의해 발현 유도 처리를 행하고, 그 형질 전환체로부터 목적하는 RNA를 회수해도 된다. 이들 전사 방법의 구체적 방법은 예를 들면 Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York에 기재된 전사 방법에 준하여 행하면 된다.
본 단계에서 유의해야 할 점으로서 전사 반응에 이용하는 기질 조성을 들 수 있다. 통상의 전사 반응에서는 4종의 천연형 리보뉴클레오티드(ATP, GTP, CTP, UTP; 이하, 이들을 모아 「NTP」라고 함)가 기질로서 사용된다. 그러나, 본 단계에서는 NTP에 더하여 추가로 DNA 분자에 포함되는 비천연형 디옥시리보뉴클레오티드가 가지는 인공 염기 및 그 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 리보뉴클레오티드를 기질로서 이용한다. 어떤 비천연형 리보뉴클레오티드를 이용할지는 본 제조 방법에서 사용한 1본쇄 핵산 라이브러리가 포함하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자에 포함되는 비천연형 뉴클레오티드에 따른다. 예를 들면, 1본쇄 핵산 라이브러리가 Ds를 가지는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 DNA 분자를 포함하는 경우, 본 단계에서 사용하는 기질로는 NTP에 더하여 Ds의 상보적 인공 염기인 Pn 또는 Pa를 각각 가지는 비천연형 리보뉴클레오티드를 사용한다. 전술한 바와 같이, 본 명세서에서의 인공 염기는 인공 염기 대합에 의한 상보성에 따라 핵산 역전사가 가능하다. 그 때문에, 한 쌍의 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 기질 뉴클레오티드에 첨가함으로써, 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자로부터도 RNA 분자의 전사가 가능하게 된다.
(5)핵산 앱타머 조제 공정
「핵산 앱타머 조제 공정」(305)이란 상기 증폭 공정 후에 얻어진 핵산 분자를 핵산 앱타머에 조제하는 공정이다.
상기 증폭 공정 후의 핵산 분자는, 핵산 분자가 DNA인 경우에는 통상 표적 물질과 특이적으로 결합하는 1본쇄 핵산 분자(핵산 앱타머)와 이에 상보적인 염기 서열을 가지는 1본쇄 핵산 분자가 염기 대합한 2본쇄 핵산 상태로 존재하고 있다. 또한, 핵산 분자가 RNA인 경우에는 1본쇄 핵산 분자로서 얻을 수 있지만, 반드시 본 발명의 핵산 앱타머의 구조를 형성하지 않는다. 그래서, 본 공정에서는 핵산 분자가 DNA인 경우에는 2본쇄 핵산을 1본쇄로 조제한 후에, 핵산 분자가 RNA인 경우에는 얻어진 1본쇄 핵산 분자를 각각 셀프 폴딩시켜 표적 물질과의 결합 활성을 가지는 본 발명의 핵산 앱타머의 조제를 행한다.
핵산 분자가 DNA인 경우, 2본쇄 핵산의 1본쇄화는 일반적으로 열 변성에 의해 행해진다. 열 변성은 60~90℃의 범위에서 행하면 된다. 이 때, 변성시에 사용하는 용액 중에 1~7M의 요소가 포함되어 있어도 된다. 그 후, 변성 겔을 이용하여 전기 영동을 행하고, 목적하는 크기의 밴드를 겔로부터 용출하여 정제하는 등의 해당 분야에서 공지의 방법에 따라 2본쇄의 1본쇄화와 그 정제를 행할 수 있다.
또, 2본쇄 핵산의 1본쇄화 후에는 목적하는 핵산 앱타머를 형성할 수 있는 1본쇄 핵산 분자와 이에 상보적인 염기 서열을 가지는 쌍이 되는 1본쇄 핵산 분자가 혼재한다. 그래서, 본 공정에서는 목적하는 핵산 앱타머를 형성하는 1본쇄 핵산 분자를 셀프 폴딩시키기 전에 상보적인 염기 서열을 가지는 불필요한 1본쇄 핵산 분자를 분리·제거해도 된다. 목적하는 1본쇄 핵산 분자만을 선택적으로 분리하려면, 예를 들면 전술한 바와 같이 리버스 프라이머를 표지자로 표지해 둠으로써 달성할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 비오틴으로 표지한 리버스 프라이머를 이용하여 PCR을 행한 후, 에탄올 침전법 등에 의해 반응액 중의 증폭된 2본쇄 핵산을 회수한 후, 그 현탁액에 스트렙트아비딘을 첨가하여 비오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성시키고, 이에 따라 2본쇄 핵산을 분리, 정제한다. 그 후, 정제된 2본쇄 핵산을 변성시켜 1본쇄화하고, 변성 겔 전기 영동으로 그 양쇄의 이동도의 차이에 따라 분획화하여 목적하는 1본쇄 핵산 분자만을 겔로부터 분리, 정제할 수 있다.
1본쇄 핵산 분자를 셀프 폴딩시키기 위해서는, 예를 들면 1본쇄 핵산 분자에 가열·냉각 처리를 행하면 된다. 구체적으로 예를 들면, 1본쇄 핵산 분자를 복합체 형성 공정에서 사용한 버퍼(예를 들면, PBS 버퍼)에 용해하여 80~98℃, 바람직하게는 85~95℃에서 30초~5분, 바람직하게는 30초~3분 열 변성시킨 후, 실온 등에 방치하여 서냉하거나 단계 냉각함으로써 분자 내 고차 구조를 형성시키면 된다. 단계 냉각은 예를 들면 열 변성 후, 일단 50~70℃에서 1분~20분 정도 냉각시킨 후, 추가로 온도를 15~35℃로 내려 냉각하면 된다.
본 공정에 의해 표적 물질에 특이적으로 결합하는 본 발명의 핵산 앱타머를 제조할 수 있다.
(6)반복 공정
「반복 공정」(306)이란, 핵산 앱타머 공정에서 조제된 핵산 앱타머 또는 그 후보인 1본쇄 핵산 분자를 새로운 1본쇄 핵산 라이브러리에 이용하여 복합체 형성 공정부터 핵산 앱타머 조제 공정까지(본 명세서에서는, 이후 이들 일련의 공정을 「라운드」라고 함)를 새로 1회 이상 반복하는 공정이다.
본 공정은 임의 공정이다. 그러나, 핵산 앱타머 조제 공정 후에 표적 물질과의 특이성이 보다 높은 핵산 앱타머를 추려내기 위해서는 본 공정을 1라운드 이상 반복하는 것이 바람직하다. 구체적으로 예를 들면 1라운드(1회) 이상, 바람직하게는 1~15라운드, 1~8라운드 또는 1~5라운드이다.
본 공정의 각 라운드에서 복합체 형성 공정에서 사용하는 1본쇄 핵산 라이브러리는 원칙적으로 직전 라운드의 핵산 앱타머 조제 공정으로 얻어지는 1본쇄 핵산 분자의 풀을 새로운 1본쇄 핵산 라이브러리로서 이용한다. 각 라운드에서 사용하는 1본쇄 핵산 라이브러리에는 필요에 따라 각 라운드에서의 각각의 공정, 즉 복합체 형성 공정부터 핵산 앱타머 조제 공정의 여러 가지 조건은 첫회 조건과 동일해도 되고 달라도 된다. 라운드의 조건이 다른 경우로서, 예를 들면 각 라운드에서 사용하는 용액이나 버퍼의 조성을 변경하는 것을 들 수 있다. 구체적으로는 라운드 전반의 버퍼는 세정 조건을 마일드하게 하여 핵산 앱타머 후보를 보다 많이 획득하고, 라운드 후반의 버퍼에는 3M 정도의 요소를 혼화하여 세정 조건을 엄격하게 함으로써 표적 물질에 보다 강고하게 결합하는 1본쇄 핵산 분자만을 분리할 수 있다. 나아가 복합체 형성 공정에서의 표적 물질과 1본쇄 핵산 라이브러리의 농도를 각 라운드에서 변경할 수도 있다. 예를 들면, 라운드를 거듭할 때마다 표적 물질과 1본쇄 핵산 라이브러리의 농도를 낮추어 복합체 형성 조건을 보다 엄격하게 함으로써, 표적 물질에 의해 강고하게 결합하는 핵산 앱타머만을 분리할 수 있다.
2. 염기 서열 결정 방법
본 발명의 제2 실시형태는 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법이다.
상기 제1 실시형태에 기재된 핵산 앱타머의 제조 방법으로 얻어진 핵산 앱타머를 화학 합성에 의해 대량 제조하려면, 그 염기 서열을 결정할 필요가 있다. 염기 서열 결정에는 동일 염기 서열을 가지는 단일 클론이 필요하지만, 상기 제조 공정 후에 얻어지는 핵산 앱타머는 다른 복수의 핵산 앱타머의 클론을 포함할 수 있기 때문에, 제조된 핵산 앱타머의 단일 클론을 조제해야만 한다. 천연형 뉴클레오티드로 구성되는 종래의 핵산 앱타머이면, 얻어진 핵산 앱타머가 다른 복수의 클론이어도 해당 분야에서 공지의 통상의 핵산 클로닝 기술을 이용하여 단일 클론화한 후에 염기 서열을 결정할 수 있었다. 구체적으로 예를 들면, 얻어진 핵산 앱타머의 각 클론을 적당한 클로닝 벡터 내에 삽입 후, 그 벡터를 대장균 등에 도입하여 형질 전환체로서 단일 클론을 단리한 후, 그 단일 클론에 기초한 사이클 시퀀스 반응 등에 의해 염기 서열을 결정하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 핵산 앱타머는 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 포함한다. 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자의 염기 서열 결정 방법 자체는 공지의 기술이다(Hirao I., et al., Nature Methods, 3, 729-735(2006); Kimoto M., et al., Nucleic Acids Res., 37, e14(2009)). 그러나, 그 방법에 제공하기 위해서는 천연형 뉴클레오티드만으로 구성되는 종래의 핵산 분자와 마찬가지로 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자의 단일 클론을 조제할 필요가 있다. 그런데, 비천연형 뉴클레오티드는 대장균 등의 생체 내에는 존재하지 않기 때문에, 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 핵산 앱타머의 단일 클론화에는 종래의 클로닝 기술을 사용할 수 없다. 그 때문에, 비천연형 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 단일 클론 또는 복수의 다른 클론으로 이루어지는 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법은 지금까지 확립되지 않았다.
본 발명자들은 이번에 상기 비천연형 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법으로서 랜덤 라이브러리법과 프레데터민법의 2가지 방법을 새로 개발하였다. 이들 방법을 이용하면, 상기 핵산 앱타머의 제조 방법 후에 얻어지는 핵산 앱타머의 염기 서열을 결정할 수 있다. 이하, 각각의 방법에 대해 설명한다.
2-1. 랜덤 라이브러리법
「랜덤 라이브러리법」은 상기 본 발명의 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법이다. 이 방법에서 대상이 되는 1본쇄 핵산 분자는 도 2a에서 도시된 중앙 영역(202) 전부가 비천연형 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 랜덤 염기 서열로 이루어진다.
랜덤 라이브러리법의 공정 흐름을 도 4에 나타낸다. 도 4에 도시된 바와 같이 랜덤 라이브러리법은 제1 증폭 공정(401), 클로닝 공정(402), 제2 증폭 공정(403), 1본쇄 핵산 분자 단리 공정(404) 및 염기 서열 결정 공정(405)을 필수 공정으로서 포함한다. 이 중에서 제2 증폭 공정(403)은 제1 증폭 공정(401) 및 클로닝 공정(402)과는 독립적인 공정이다. 따라서, 제1 증폭 공정(401) 전, 클로닝 공정(402) 후 또는 제1 증폭 공정(401) 및 클로닝 공정(402)과 평행하게 실행할 수 있다. 이하, 각 공정에 대해 구체적으로 설명한다.
(1)제1 증폭 공정
「제1 증폭 공정」(401)이란 천연형 뉴클레오티드를 기질로 하여 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택된 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 공정이다.
본 공정의 기본적 순서는 상기 제1 실시형태의 「1-4. 제조 방법」에서의 「1-4-2. 제조 공정 (4)증폭 공정」에 기재된 순서에 준한다. 즉, 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택된 1본쇄 핵산 분자를 공지의 핵산 증폭법에 따라 증폭하는 공정으로서, 그 염기 서열 결정의 대상이 되는 1본쇄 핵산 분자가 DNA인 경우에는 DNA 증폭 단계만을 행하고, RNA인 경우에는 역전사 단계, DNA 증폭 단계 및 전사 단계를 행한다.
그래서, 여기서는 전술한 상기 제1 실시형태의 「1-4-2. 제조 공정 (4)증폭 공정」과 동일한 방법에 대해서는 생략하고, 다른 점에 대해서만 이하 구체적으로 설명한다.
상기 본 발명의 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택된 1본쇄 핵산 분자는 전술한 바와 같이 도 2에서 나타내는 구조를 가진다. 5' 말단측 및 3' 말단측의 프라이머 결합 영역(201, 203)은 이미 알려진 염기 서열로 이루어지기 때문에, 포워드 프라이머(204) 및 리버스 프라이머(205)로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭할 수 있다.
본 공정의 특징으로서 비록 염기 서열 결정의 대상이 되는 1본쇄 핵산 분자가 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 경우이어도 핵산 증폭법에 사용하는 기질로서 천연형 뉴클레오티드만을 사용하는 점을 들 수 있다. 즉, DNA 증폭 단계이면 DNA 복제에 이용하는 기질로 dNTP만을, 역전사 단계이면 RNA로부터의 역전사에 이용하는 기질로 dNTP만을, 및 전사 단계이면 DNA로부터 RNA의 전사에 이용하는 기질로 NTP만을 사용한다. 전술한 바와 같이, 인공 염기는 복제나 전사시에 기질에 상보적 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드가 포함되지 않는 경우에는 상보적 인공 염기와 구조적으로 및/또는 성질적으로 가까운 천연형 염기와 대체(代替)적으로 염기 대합하여 천연형 뉴클레오티드로 치환된다. 그 때문에, 염기 서열 결정의 대상이 되는 1본쇄 핵산 분자가 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자이어도 본 공정에서는 천연형 뉴클레오티드만으로 구성되는 1본쇄 핵산 분자가 증폭 산물로서 얻어진다.
(2)클로닝 공정
「클로닝 공정」(402)이란 상기 제1 증폭 공정 후에 얻어지는 증폭 산물로부터 단일 클론을 얻는 공정이다.
제1 증폭 공정 후에 얻어지는 증폭 산물은 전술한 바와 같이 천연형 뉴클레오티드만으로 구성된다. 따라서, 상기 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택된 1본쇄 핵산 분자가 복수의 다른 클론으로 이루어지는 경우이어도, 해당 분야에서 공지의 통상의 핵산 클로닝 기술을 이용하여 단일 클론화가 가능하다. 예를 들면, 얻어진 핵산 앱타머의 각 클론을 적당한 클로닝 벡터 내에 삽입 후, 그 벡터를 대장균 등에 도입하여 형질 전환체로서 단일 클론을 단리하는 방법을 들 수 있다. 이러한 클로닝 방법은 예를 들면 Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York에 기재된 방법에 준하여 행하면 되고, 각 제조사로부터 시판되고 있는 각종 클로닝 키트 등을 이용할 수도 있다.
(3)제2 증폭 공정
「제2 증폭 공정」(403)이란 천연형 뉴클레오티드 및 상기 비천연형 뉴클레오티드를 기질로 하여 상기 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 상기 선택된 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 공정이다.
본 공정의 기본적 수순도 제1 증폭 공정과 마찬가지로 상기 제1 실시형태의 「1-4. 제조 방법」에서의 「1-4-2. 제조 공정 (4)증폭 공정」에 기재된 순서에 준한다. 즉, 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택된 1본쇄 핵산 분자를 공지의 핵산 증폭법에 따라 증폭하는 공정으로서, 그 염기 서열 결정의 대상이 되는 1본쇄 핵산 분자가 DNA인 경우에는 DNA 증폭 단계만을 행하고, RNA인 경우에는 역전사 단계, DNA 증폭 단계 및 전사 단계를 행한다.
단, 제1 증폭 공정이 핵산 증폭법에 사용하는 기질로서 천연형 뉴클레오티드만을 사용한 것에 대조적으로 본 공정은 천연형 뉴클레오티드 및 상기 비천연형 뉴클레오티드를 기질로서 선택된 1본쇄 핵산 분자를 증폭하는 점에서 다르다. 즉, 본 공정은 상기 제1 실시형태의 「1-4-2. 제조 공정 (4)증폭 공정」에 기재된 수순에 보다 가까운 방법이라고 할 수 있다.
본 발명의 1본쇄 핵산 라이브러리가 포함하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자에 포함되는 비천연형 뉴클레오티드에 따라 그 비천연형 뉴클레오티드 및 이와 쌍이 되는 비천연형 뉴클레오티드를 천연형 뉴클레오티드와 함께 기질로 사용한다. 따라서, 1본쇄 핵산 분자가 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자이면, 본 공정 후에는 그 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자가 증폭 산물로서 얻어지게 된다.
(4)1본쇄 핵산 분자 단리 공정
「1본쇄 핵산 분자 단리 공정」(404)이란 클로닝 공정에서 얻어진 단일 클론을 프로브로서 상기 제2 증폭 공정 후에 얻어지는 증폭 산물로부터 단일의 1본쇄 핵산 분자를 단리하는 공정이다.
본 공정에서는 우선 클로닝 공정에서 얻어진 단일 클론을 프로브로 조제한다.
상기 단일 클론은 1본쇄 핵산 라이브러리가 DNA인 경우에는 통상 2본쇄 DNA로서 얻어진다. 그래서, 이 2본쇄 DNA를 1본쇄로 조제한다. 2본쇄 DNA의 1본쇄화는 일반적으로 열 변성에 의해 행해진다. 열 변성은 60~90℃의 범위에서 행하면 된다. 이 때 변성시에 사용하는 용액 중에 1~7M의 요소가 포함되어 있어도 된다. 그 후, 변성 겔을 이용하여 전기 영동을 행하고, 목적하는 크기의 밴드를 겔로부터 용출하여 정제하는 등의 해당 분야에서 공지의 방법에 따라 2본쇄 DNA의 1본쇄화와 그 정제를 행할 수 있다.
이어서, 2본쇄 중 한쪽의 DNA쇄를 프로브로서 분리한다. 핵산 앱타머를 코드하는 센스쇄, 이에 상보적인 염기 서열을 가지는 안티센스쇄의 어느 것을 이용해도 된다. 바람직하게는 안티센스쇄이다. 2본쇄 중 한쪽의 DNA쇄를 분리하는 방법은 전술한 방법을 이용하면 된다. 즉, 포워드 프라이머 또는 리버스 프라이머 중 어느 한쪽을 표지자로 표지해 두고, 그 표지에 기초하여 한쪽의 DNA쇄를 프로브로서 분리, 정제하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 안티센스쇄를 분리하려면, 비오틴으로 표지한 리버스 프라이머를 이용하여 PCR을 행한 후, 에탄올 침전법 등에 의해 반응액 중의 증폭된 2본쇄 DNA를 회수하고, 그 현탁액에 스트렙트아비딘을 첨가하여 비오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성시키고, 이에 따라 2본쇄 핵산을 분리, 정제한다. 그 후, 정제된 2본쇄 핵산을 변성시켜 1본쇄화하고, 변성 겔 전기 영동으로 그 양쇄의 이동도 차이에 따라 분획화하여 목적하는 안티센스쇄를 겔로부터 분리, 정제할 수 있다.
한편, 1본쇄 핵산 라이브러리가 RNA인 경우에는 1본쇄 RNA로서 얻어진다. 그런데, 제2 증폭 공정 후에 얻어지는 증폭 산물도 같은 1본쇄 RNA이며, 양자는 상보적 관계에 없기 때문에 프로브로서 이용할 수 없다. 또한, RNA 자체가 불안정하여 분해되기 쉬운 문제도 수반한다. 그래서, 클로닝 공정에서 얻어진 단일 클론이 RNA인 경우에는, 역전사에 의해 일단 2본쇄 DNA로 한 후에 상기와 같은 방법으로 2본쇄 DNA의 1본쇄화와 그 정제를 행해도 된다. 역전사 반응에 대해서는 상기 역전사 단계에 기재된 방법에 준하여 행하면 된다.
이어서, 상기 조제한 단일 클론 유래의 1본쇄 핵산을 프로브로서 제2 증폭 공정 후에 얻어지는 증폭 산물로부터 단일의 1본쇄 핵산 분자를 단리한다. 동일한 1본쇄 핵산 라이브러리를 주형으로 하는 제1 증폭 공정 후의 증폭 산물과 제2 증폭 공정 후의 증폭 산물 중에는 동일한 1본쇄 핵산 분자 유래의 증폭 산물을 포함할 수 있다. 이들은 원칙적으로 동일한 염기 서열을 가진다. 단, 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 경우, 제1 증폭 공정 후의 증폭 산물에서는 비천연형 뉴클레오티드가 천연형 뉴클레오티드로 치환되어 있기 때문에 동일한 1본쇄 핵산 분자 유래이어도 두 증폭 산물의 염기 서열은 다르다. 그러나, 증폭 산물 전체로서의 염기 서열의 상동성은 매우 높다. 그 때문에 클로닝 공정에 의해 단일 클론화된 제1 증폭 공정 후의 증폭 산물을 프로브라고 하면, 1본쇄 핵산 라이브러리가 다른 복수의 1본쇄 핵산 분자를 포함하는 경우이어도, 또한 그 1본쇄 핵산 분자가 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자이어도 염기 서열 결정의 시료로서 충분량의 단일 클론을 단리할 수 있다. 본 공정은 이러한 원리에 기초한다.
조제한 프로브를 이용하여 제2 증폭 공정 후에 얻어지는 증폭 산물로부터 단일의 1본쇄 핵산 분자를 단리하는 방법은 해당 분야에서 공지의 방법을 이용하면 된다. 예를 들면, Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다. 보다 효율적으로 단리하기 위해 프로브를 고상 담체에 고정화해 두고, 제2 증폭 공정 후의 증폭 산물 중의 목적하는 1본쇄 핵산 분자와 혼성화(hybridize)시켜 단리해도 된다. 프로브의 고상 담체에의 고정화나 목적하는 1본쇄 핵산 분자의 단리에는 제1 실시형태의 「1-4. 제조 방법」에서의 「1-4-2. 제조 공정 (2)복합체 회수 공정」에 기재된 방법을 이용해도 된다.
이 공정에서는 천연형 뉴클레오티드만으로 구성되는 1본쇄 핵산 분자, 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 뉴클레오티드에 관계없이 염기 서열 결정의 대상이 되는 1본쇄 핵산 분자를 단일 클론으로서 단리할 수 있다.
(5)염기 서열 결정 공정
「염기 서열 결정 공정」(405)이란 상기 1본쇄 핵산 분자 단리 공정으로 단리된 단일 클론의 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 공정이다.
본 공정은 해당 분야에서 공지의 염기 서열 결정 방법을 이용할 수 있다. 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 DNA의 염기 서열을 결정하는 방법은 공지 기술이다. 예를 들면, Hirao I., et al., Nature Methods, 3, 729-735(2006); Kimoto M., et al., Nucleic Acids Res., 37, e14(2009)에 기재된 방법에 준하여 행하면 된다. 이 염기 서열 결정 방법은 천연형 뉴클레오티드만으로 이루어지는 종래의 DNA 분자의 염기 서열도 결정할 수 있기 때문에, 상기 1본쇄 핵산 분자 단리 공정으로 단리된 단일 클론의 1본쇄 핵산 분자가 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자이어도, 또한 천연형 뉴클레오티드만으로 이루어지는 핵산 앱타머이어도 그 서열을 결정할 수 있다.
이상의 공정에 따라, 지금까지 수단이 없었던 비천연형 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정할 수 있다.
2-2. 프레데터민법
「프레데터민법」은 식별 부위를 가지고, 또한 미리 설정된 특정 위치에만 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자로 이루어지는 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법이다. 이 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 각 비뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자에서의 식별 부위는 천연형 뉴클레오티드로 구성되어 있고, 또한 그 염기 서열은 1본쇄 핵산 분자의 중앙 영역의 염기 서열 상에서 미리 설정된 인공 염기의 위치 정보와 관련되어 있다. 본 방법은 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 천연형 뉴클레오티드만으로 구성되는 1본쇄 핵산 분자로 치환하고, 종래 기술에서 단일 클론화하여 염기 서열을 결정한 후, 식별 부위의 염기 서열에 기초하여 천연형 뉴클레오티드로 치환된 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드의 위치를 결정함으로써, 목적하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정한다.
프레데터민법의 공정 흐름을 도 5에 나타낸다. 도 5에 도시된 바와 같이, 프레데터민법은 제3 증폭 공정(501), 클로닝 공정(502), 염기 서열 결정 공정(503) 및 인공 염기 위치 결정 공정(504)을 필수 공정으로서 포함한다. 이하, 각 공정에 대해 구체적으로 설명한다.
(1)제3 증폭 공정
「제3 증폭 공정」(501)이란 천연형 뉴클레오티드를 기질로 하여 상기 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 선택된 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 공정이다.
본 공정의 기본적 순서는 상기 제1 실시형태의 「1-4. 제조 방법」에서의 「1-4-2. 제조 공정 (4)증폭 공정」에 기재된 수순에 준한다. 즉, 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택된 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 공지의 핵산 증폭법에 따라 증폭하는 공정으로서, 그 염기 서열 결정의 대상이 되는 1본쇄 핵산 분자가 DNA인 경우에는 DNA 증폭 단계만을 행하고, RNA인 경우에는 역전사 단계, DNA 증폭 단계 및 전사 단계를 행하면 된다.
본 방법에서 염기 서열 결정의 대상이 되는 1본쇄 핵산 분자는 모두 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자이다. 그러나, 본 공정에서는 상기 랜덤 라이브러리법에서의 제1 증폭 공정과 마찬가지로 핵산 증폭법에 사용하는 기질로서 천연형 뉴클레오티드만을 사용한다. 즉, DNA 증폭 단계이면 DNA 복제에 이용하는 기질로 dNTP만을, 역전사 단계이면 RNA로부터의 역전사에 이용하는 기질로 dNTP만을, 및 전사 단계이면 DNA로부터 RNA의 전사에 이용하는 기질로 NTP만을 사용한다. 그 결과, 염기 서열 결정의 대상이 되는 1본쇄 핵산 분자가 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자이어도 증폭 반응 과정에서 비천연형 뉴클레오티드가 천연형 뉴클레오티드로 치환되고, 천연형 뉴클레오티드만으로 구성되는 1본쇄 핵산 분자가 증폭 산물로서 얻어지게 된다.
(2)클로닝 공정
「클로닝 공정」(502)이란 상기 증폭 공정 후에 얻어지는 천연형 뉴클레오티드만으로 구성된 증폭 산물로부터 단일 클론을 얻는 공정이다.
제3 증폭 공정 후에 얻어지는 증폭 산물은 전술한 바와 같이 천연형 뉴클레오티드만으로 구성된다. 따라서, 상기 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택된 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자가 복수의 다른 클론으로 이루어지는 경우이어도 천연형 뉴클레오티드로만 치환됨으로써, 해당 분야에서 공지의 통상의 핵산 클로닝 기술을 이용한 단일 클론화가 가능하게 된다. 예를 들면, 얻어진 핵산 앱타머의 각 클론을 적당한 클로닝 벡터 내에 삽입 후, 그 벡터를 대장균 등에 도입하여 형질 전환체로서 단일 클론을 단리하는 방법을 들 수 있다. 이러한 클로닝 방법은 예를 들면 Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York에 기재된 방법에 준하여 행하면 되고, 또한 각 제조사로부터 시판되고 있는 각종 클로닝 키트 등을 이용할 수도 있다.
(3)염기 서열 결정 공정
「염기 서열 결정 공정」(503)이란 상기 클로닝 공정 후에 얻어지는 단일 클론의 염기 서열을 결정하는 공정이다. 본 공정은 공지의 기술에 준하여 행하면 된다. 예를 들면, 단일 클론의 형질 전환체로부터 조제한 단일 클론을 사이클 시퀀스 반응 등을 통한 공지 기술에 의해 염기 서열을 결정할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 단일 클론의 형질 전환체로부터 미니ㆍ프레퍼레이션법 등의 공지 기술에 의해 DNA를 조제 후, ABI사의 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit 등의 시판되는 키트를 이용하여 시퀀서에 의해 염기 서열을 결정하면 된다.
(4)인공 염기 위치 결정 공정
「인공 염기 위치 결정 공정」(504)이란 상기 단일 클론의 염기 서열에서의 식별 부위의 염기 서열에 기초하여 해당 단일 클론의 주형이 된 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열 상의 인공 염기의 위치를 결정하는 공정이다.
염기 서열 결정 공정에 의해 결정된 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열은 4종(ATGC)의 천연형 염기만으로 구성된 염기 서열이다. 그러나, 본 방법의 제3 증폭 공정에서 염기 서열 결정에 제공한 1본쇄 핵산 분자는 모두 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자이기 때문에, 실제 염기 서열에는 중앙 영역의 특정 위치에 인공 염기가 배치되어 있다. 본 공정에서는 염기 서열 결정 공정 후의 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열에서의 식별 부위의 염기 서열에 기초하여 제3 증폭 공정에서 천연형 염기로 치환된 염기 서열 상의 염기를 원래의 인공 염기로 수정하여 염기 서열 결정에 제공한 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 실제 염기 서열을 결정한다.
식별 부위는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 5' 말단측 및/또는 3' 말단측의 프라이머 결합 영역에 인접하는 중앙 영역의 말단부에 배치되어 있고, 그 염기 서열도 미리 결정되어 있다. 또한, 천연형 뉴클레오티드로 구성되어 있기 때문에 제3 증폭 공정~염기 서열 결정 공정 간에 그 염기 서열은 바뀌지 않고 유지된다. 또, 식별 부위의 염기 서열은 중앙 영역의 염기 서열 상에서 미리 설정된 인공 염기의 위치 정보와 관련되어 있기 때문에, 식별 부위의 염기 서열이 판명되면, 그 1본쇄 핵산 분자의 중앙 영역에서의 어느 위치에 인공 염기가 배치되어 있는지 혹은 배치되어 있었는지가 필연적으로 결정될 수 있다.
3. 항혈관 내피 세포 증식 인자 핵산 앱타머
본 발명의 제3 실시형태는 항혈관 내피 세포 증식 인자(Vascular Endothelial Growth Factor: 이하 「VEGF」라고 함) 핵산 앱타머이다.
VEGF는 혈관 신생 촉진 인자로서 기능하는 증식 인자로서, 가령황반변성(age-related macular degeneration: AMD)의 원인 인자의 하나로 알려져 있다. 가령황반변성은 성인에 있어서 시기능의 저하나 중도 실명 등의 심각한 증상을 초래하는 진행성 망막 질환으로, 망막에서의 혈관 신생의 진행에 동반하여 병의 상태가 악화되어 중증화되는 것이 판명되어 있다(Martin A. et al., 2003, Medicinal Research Reviews, Vol. 23, No. 2: 117-145; Ferris III, F.L. et al., 1984, Archives of Ophthalmology, Vol. 102,Issue 11: 1640-1642).
본 발명의 항VEGF 핵산 앱타머는 VEGF를 표적 물질로 하여 강고하고 특이적으로 결합하고, VEGF가 가지는 혈관 신생 기능을 억제하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 DNA 분자로 구성되는 DNA 앱타머(이하, 「항VEGF-DNA 앱타머」라고 함)이다. 본 발명의 항VEGF-DNA 앱타머는 상기 제1 실시형태에 기재된 핵산 앱타머의 제조 방법에 따라 제조하고, 상기 제2 실시형태에 기재된 랜덤 라이브러리법 또는 프레데터민법에 따라 그 염기 서열을 결정한 것이다.
본 발명의 항VEGF-DNA 앱타머는 서열 번호 25~73, 80~104, 106~109, 111, 155~166(단, 서열 중의 n을 Ds로 함), 175, 177, 179, 181, 183, 198, 201, 202, 205~209, 211, 212 및 229~278로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 포함한다. 또한, 이 서열 번호 25~73, 80~104, 106~109, 111 및 155~166(단, 서열 중의 n을 Ds로 함), 198, 201, 202, 205~209, 211 및 212로 나타나는 영역은 도 2에서 나타내는 본 발명의 핵산 앱타머에서 주로 중앙 영역(202)에 상당한다. 그 때문에, 이들 염기 서열의 5' 말단측에 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열 및 그 3' 말단측에 서열 번호 2로 나타나는 염기 서열이 각각 인접하여 이루어지는 핵산 앱타머도 본 발명의 항VEGF-DNA 앱타머로서 바람직하다.
4. 항인터페론-γ 핵산 앱타머
본 발명의 제4 실시형태는 항인터페론-γ(이하, 「IFN-γ」라고 약칭함) 핵산 앱타머이다.
본 발명의 항IFN-γ 핵산 앱타머는 IFN-γ를 표적 물질로 하여 강고하고 특이적으로 결합하고, IFN-γ가 가지는 세포 장해성 T세포 유도 활성을 억제하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 DNA 분자로 구성되는 DNA 앱타머(이하, 「항IFN-γ-DNA 앱타머」라고 함)이다. 본 발명의 항IFN-γ-DNA 앱타머는 상기 제1 실시형태에 기재된 핵산 앱타머의 제조 방법에 따라 제조하고, 상기 제2 실시형태에 기재된 프레데터민법에 따라 그 염기 서열을 결정한 것이다.
본 발명의 항IFN-γ-DNA 앱타머는 서열 번호 167~174(단, 서열 중의 n을 Ds로 함), 186, 188, 190, 192, 194, 214~222 및 279~328로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 포함한다.
5. 의약 조성물
본 발명의 제5 실시형태는 의약 조성물이다.
5-1. 구성
본 발명의 의약 조성물은 상기 제3 실시형태에 기재된 표적 물질 기능 억제제를 적어도 하나 함유한다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 「제약상 허용 가능한 담체」란 제제(製劑) 기술 분야에서 통상 사용하는 의약 조성물의 제제화나 생체에의 적용을 용이하게 하고, 상기 표적 물질 기능 억제제의 효과를 유지하기 위해, 그 작용을 저해 또는 억제하지 않는 범위에서 첨가되는 물질을 말한다. 담체로는 예를 들면 부형제, 결합제, 붕괴제, 충전제, 유화제, 유동 첨가 조절제, 활택제 또는 계면활성제를 들 수 있다.
「부형제」로서는 예를 들면 단당, 이당류, 시클로덱스트린 및 다당류와 같은 당(구체적으로 한정하지 않지만, 글루코오스, 슈크로오스, 락토스, 라피노스, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 덱스트린, 말토덱스트린, 전분 및 셀룰로오스를 포함함), 금속염(예를 들면, 인산 나트륨 혹은 인산 칼슘, 황산 칼슘, 황산 마그네슘), 구연산, 주석산, 글리신, 저, 중, 고분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG), 풀로닉 혹은 이들의 조합을 들 수 있다.
「결합제」로서는 예를 들면 옥수수, 밀, 쌀 혹은 감자의 전분을 이용한 전분 풀, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 및/또는 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.
「붕괴제」로서는 예를 들면 상기 전분이나 카르복시메틸 전분, 가교 폴리비닐피롤리돈, 한천(agar), 알긴산 혹은 알긴산 나트륨 또는 이들의 염을 들 수 있다.
「충전제」로서는 예를 들면 상기 당 및/또는 인산 칼슘(예를 들면, 인산삼칼슘 혹은 인산 수소 칼슘)을 들 수 있다.
「유화제」로서는 예를 들면 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르를 들 수 있다.
「유동 첨가 조절제」 및 「활택제」로서는 예를 들면 규산염, 탈크, 스테아린산염 또는 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있다.
이러한 담체는 필요에 따라 적절히 사용하면 된다. 본 발명의 약물 조성물은 상기 첨가제 이외에 필요에 따라 교미교취제, 용해 보조제(가용화제), 현탁제, 희석제, 계면활성제, 안정제, 흡수 촉진제(예를 들면, 제4급 암모늄염류, 라우릴 황산 나트륨 등), 증량제, 부습제, 보습제(예를 들면, 글리세린, 전분 등), 흡착제(예를 들면, 전분, 젖당, 카올린, 벤토나이트, 콜로이드상 규산 등), 붕괴 억제제(예를 들면, 백설탕, 스테아린, 카카오 버터, 수소 첨가유 등), 코팅제, 착색제, 보존제, 항산화제, 향료, 풍미제, 감미제, 완충제 등을 포함할 수도 있다.
「계면활성제」로서는 예를 들면 리그노술폰산, 나프탈렌 술폰산, 페놀 술폰산, 디부틸나프탈렌 술폰산의 알칼리 금속염, 알칼리 토류 금속염 및 암모늄염, 알킬아릴 술포네이트, 알킬 설페이트, 알킬 술포네이트, 지방 알코올 설페이트, 지방산 및 황산화 지방 알코올글리콜에테르, 나아가 술폰화 나프탈렌 및 나프탈렌 유도체와 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌 술폰산과 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, 에톡실화 이소옥틸페놀, 옥틸페놀, 노닐페놀, 알킬페닐 폴리글리콜에테르, 트리부틸페닐 폴리글리콜에테르, 트리스테아릴페닐 폴리글리콜에테르, 알킬아릴 폴리에테르알코올, 알코올 및 지방 알코올/에틸렌 옥사이드의 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 에톡실화 폴리옥시프로필렌, 라우릴알코올 폴리글리콜에테르아세탈, 솔비톨 에스테르, 리그노 아황산 폐액 및 메틸셀룰로오스가 해당한다.
본 실시형태의 의약 조성물은 하나의 의약 조성물 중에 상기 담체를 하나 이상 포함하는 것이 가능하다.
또, 본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 핵산이 가지는 약리 효과를 잃지 않는 범위에서 다른 약제를 함유할 수도 있다. 예를 들면, 항생 물질을 소정량 함유하고 있어도 된다.
본 발명의 의약 조성물의 제형은 유효 성분을 불활화시키지 않는 형태로서, 투여 후 생체 내에서 그 약리 효과를 발휘할 수 있는 형태이면 특별히 한정하지 않는다. 통상은 투여 방법 및/또는 처방 조건에 따라 다르다.
예를 들면, 경구 투여에 적합한 제형으로서는 고형제(정제, 환제, 설하제(舌下劑), 캡슐제, 드롭제, 트로키제를 포함함), 과립제, 분제, 산제(散劑), 액제(液劑) 등을 들 수 있다. 나아가 고형제는 필요에 따라 해당 분야에서 공지의 제피(劑皮)를 실시한 제형, 예를 들면 당의정, 젤라틴 피포정, 장용정, 필름 코팅정, 이중정, 다층정으로 할 수 있다.
비경구 투여는 전신 투여 및 국소 투여로 세분되고, 국소 투여는 조직 내 투여, 경표피 투여, 경점막 투여 및 경직장적 투여로 더 세분되지만, 의약 조성물도 각각의 투여 방법에 적합한 제형으로 할 수 있다. 전신 또는 조직 내 투여에 적합한 제형으로서는 예를 들면 액제인 주사제를 들 수 있다. 경표피 투여 또는 경점막 투여에 적합한 제형으로서는 예를 들면 액제(도포제, 점안제, 점비제, 흡인제를 포함함), 현탁제(유제, 크림제를 포함함), 분제(점비제, 흡인제를 포함함), 페이스트제, 겔제, 연고제, 경고제 등을 들 수 있다. 경직장적 투여에 적합한 제형으로서는 예를 들면 좌제 등을 들 수 있다.
약물을 식물에 투여하는 경우에는 약제 조성물의 제형은 액체, 고체(반고체를 포함함) 또는 그 조합을 들 수 있다. 용액제, 유성 분산 액제, 에멀션제, 현탁제제, 분제, 산제, 페이스트제, 겔제, 펠렛제, 정제 및 과립제로 할 수 있다.
또, 상기 각 제형의 구체적인 형상, 크기에 대해서는 어느 것이든 각각의 제형에서 해당 분야에서 공지의 제형의 범위 내에 있으면 되고, 특별히 한정되지 않는다.
5-2. 제조 방법
본 발명의 의약 조성물을 제조하려면, 원칙적으로 해당 분야에서 공지의 제제화 방법을 응용하면 된다. 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences(Merck Publishing Co., Easton, Pa.)에 기재된 방법을 참조할 수 있다.
예를 들면 주사제인 경우에는, 제2 실시형태의 핵산 분자를 제약상 허용 가능한 용매에 용해하고, 필요에 따라 제약상 허용 가능한 담체를 가하여 해당 분야에서 관용되고 있는 방법에 의해 제조할 수 있다.
「약학적으로 허용 가능한 용매」로서는 예를 들면 물, 에탄올, 프로필렌글리콜, 에톡시화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 들 수 있다. 이들은 살균되어 있는 것이 바람직하고, 필요에 따라 혈액과 등장(等張)으로 조정되어 있는 것이 바람직하다.
5-3. 투여 방법
본 실시형태의 의약 조성물은 목적으로 하는 질환 등의 치료 또는 예방을 위해 제약상 유효한 양을 생체에 투여할 수 있다. 투여하는 대상이 되는 생체는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람이다.
본 발명의 의약 조성물은 전신 투여 또는 국소적 투여 중 어느 것이어도 된다. 질환의 종류, 발증 개소 또는 진행도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 발증 개소가 국부적인 질환이면, 주사 등에 의해 발증 개소 및 그 주변에 직접 투여하는 국소적 투여가 바람직하다. 치료해야 할 개소(조직 또는 기관)에 본 발명의 핵산 분자를 충분량 투여할 수 있고, 다른 조직에 영향을 미치기 어렵기 때문이다. 한편, 치료 개소를 특정할 수 없는 경우나 발증이 전신성 질환인 경우에는 한정하지 않지만, 정맥 주사 등에 의한 전신 투여가 바람직하다. 혈류를 통해 본 발명의 핵산 분자를 전신에 널리 퍼지게 함으로써, 진단으로 발견할 수 없는 병변부에도 투여가 가능하게 되기 때문이다.
본 발명의 의약 조성물은 유효 성분이 실활되지 않는 여하한 적당한 방법으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 비경구(예를 들면, 주사, 에어로졸, 도포, 점안, 점비) 또는 경구 중 어느 것이어도 된다. 바람직하게는 주사이다.
주사에 의한 투여의 경우, 주입 부위는 특별히 한정하지 않는다. 유효 성분인 핵산 분자가 표적 물질에 결합하여 그 기능을 억제할 수 있으면, 어떤 부위이어도 된다. 예를 들면, 정맥 내, 동맥 내, 간장 내, 근육 내, 관절 내, 골수 내, 골수강 내, 심실 내, 경폐, 경피, 피하, 피내, 복강 내, 비강 내, 장내 또는 설하 등을 들 수 있다. 바람직하게는 정맥 내 주사 또는 동맥 내 주사 등의 혈관 내에의 주사이다. 전술한 바와 같이 혈류를 통해 본 발명의 의약 조성물을 전신에 널리 퍼지게 하는 것이 가능하고, 또한 침습성도 비교적 낮기 때문이다.
6. 표적 물질 검출 방법
본 발명의 제6 실시형태는 상기 제1 실시형태에 기재된 핵산 앱타머를 이용한 표적 물질의 검출 방법이다.
6-1. 구성
제1 실시형태에 기재된 핵산 앱타머는 그 핵산 분자의 표적 물질과 매우 강고하면서 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 핵산 분자의 그 성질을 이용하여 시료 중에 존재하는 표적 물질을 검출할 수 있다.
제1 실시형태에 기재된 핵산 앱타머와 표적 물질 간의 결합을 이용한 방법이면, 검출 방법 자체는 공지의 검출 방법을 이용하면 된다. 예를 들면, SPR법, 수정 진동자 마이크로밸런스법, 비탁법, 비색법 또는 형광법을 이용할 수 있다.
SPR(표면 플라즈몬 공명)은 금속 박막에 레이저광을 조사하면 특정의 입사 각도(공명각)에서 반사광 강도가 현저히 감쇠하는 현상을 말한다. SPR법은 이 현상을 이용한 측정 방법으로, 센서부인 금속 박막 표면 상의 흡착물을 고감도로 측정할 수 있다. 본 발명에서는 예를 들면 미리 제1 실시형태의 핵산 앱타머를 금속 박막 표면 상에 고정화해 두고, 그 금속 박막 표면 상에 시료를 통과시켜 해당 핵산 분자와 표적 물질의 결합에 의해 생기는 시료 통과 전후의 금속 표면 상의 흡착물 차이를 검출함으로써 시료 중의 표적 물질을 검출할 수 있다. SPR법에는 치환법, 간접 경합법 등이 알려지지만 어느 것을 이용해도 된다.
QCM(수정 진동자 마이크로밸런스: Quartz Crystal Microbalance)법은 수정 진동자에 장착한 전극 표면에 물질이 흡착되면, 그 질량에 따라 수정 진동자의 공진 주파수가 감소하는 현상을 이용한 방법이다. 이 방법을 이용한 QCM 센서는 물 공진 주파수의 변화량에 따라 극미량의 흡착물을 정량적으로 잡을 수 있다. 본 발명에서는 전극 표면에 상기 SPR법과 마찬가지로 미리 핵산 분자를 고정화해 두고 시료를 전극 표면에 접촉시킴으로써, 핵산 분자와 표적 물질의 결합에 의해 생기는 물 공진 주파수의 변화량으로부터 시료 중의 표적 물질을 정량적으로 검출할 수 있다. 본 기술은 해당 분야에서 주지이다. 예를 들면, Christopher J., et al.(2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review, 105: 1103-1169를 참조하면 된다.
비탁법은 용액에 광을 조사하고, 용액 중에 부유하는 물질에 의해 산란하는 산란광의 감쇠 또는 그 용액을 통과한 투과광을 비색계 등을 이용하여 광학적으로 계측함으로써 용액 중의 물질량을 측정하는 방법이다. 본 발명에서는 시료 중에 제1 실시형태의 핵산 앱타머를 첨가하기 전후의 흡광도를 계측함으로써, 시료 중의 표적 물질을 정량적으로 검출할 수 있다.
또한, 표적 물질에 대한 항체와 병용함으로써 표적 물질을 검출할 수도 있다. 예를 들면, ELISA법의 샌드위치법을 응용한 방법을 이용해도 된다. 이 방법에서는 우선 고상 담체에 제1 실시형태의 핵산 앱타머를 고정해 두고, 다음에 시료를 가하여 시료 중에 존재하는 표적 물질과 상기 핵산 분자를 결합시킨다. 이어서, 시료를 씻어내린 후, 항표적 물질 항체를 가하여 표적 물질에 결합시킨다. 세정 후, 적당한 표지를 한 2차 항체를 이용하여 항표적 물질 항체를 검출함으로써 시료 중의 표적 물질을 검출할 수 있다. 고상 담체로서는 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐톨루엔, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 나일론, 폴리메타크릴레이트, 라텍스, 젤라틴, 아가로스, 셀룰로오스, 세파로스, 유리, 금속, 세라믹스 또는 자성체 등의 재질로 이루어지는 비즈, 마이크로 플레이트, 시험관, 스틱 또는 시험편 등의 형상의 불용성 담체를 이용할 수 있다.
7. 촉매 효소(데옥시리보자임, 리보자임)
본 발명의 제7 실시형태는 촉매 효소이다.
7-1. 구성
「데옥시리보자임」이란 DNA 촉매라고도 불리는 촉매 활성을 가지는 DNA 분자이다. 또한, 「리보자임」이란 리보 효소라고도 불리는 촉매 활성을 가지는 RNA 분자이다. 기질로서의 표적 물질인 RNA 분자나 저분자 화합물 등에 특이적으로 결합하고, 그 표적 RNA 분자를 절단 또는 연결하거나 산화나 환원 등의 화학 반응을 촉매하는 기능을 가진다.
본 발명의 데옥시리보자임은 천연형 디옥시리보뉴클레오티드와 비천연형 디옥시리보뉴클레오티드를 포함하고, 또한 복제 가능한 폴리뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명의 리보자임은 천연형 리보뉴클레오티드와 비천연형 리보뉴클레오티드를 포함하고, 또한 전사 또는 복제 가능한 폴리뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명의 데옥시리보자임 또는 리보자임(본 명세서에서는 이후 자주 「(데옥시)리보자임」이라고 함)에 포함되는 비천연형 뉴클레오티드는 그 염기가 인공 염기로 구성된다. 인공 염기는 제1 실시형태에 기재한 인공 염기의 성질을 가지는 것이면, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 인공 염기의 구체적인 예로서 열거한 인공 염기나 후술하는 인공 염기의 유도체를 들 수 있다.
본 발명의 (데옥시)리보자임에서의 비천연형 뉴클레오티드의 함유율은 그 (데옥시)리보자임을 구성하는 전체 뉴클레오티드 수의 20% 이하, 바람직하게는 15% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하이면 된다. 전체길이 100 염기 이하의 (데옥시)리보자임의 경우, 통상은 하나의 (데옥시)리보자임당 비천연형 뉴클레오티드를 1~4개 가지고 있으면 본 발명의 효과를 얻을 수 있다.
비천연형 뉴클레오티드가 하나의 (데옥시)리보자임당 복수 포함되는 경우, 각 비천연형 뉴클레오티드가 가지는 인공 염기는 동일해도 및/또는 달라도 된다. 단, 인공 염기가 다른 경우에는 동일한 상보적 인공 염기를 가지는 2개 이상의 인공 염기를 혼재시키지 않도록 유의한다. 복제 또는 전사 과정에서 상보적 인공 염기를 통해 당초의 인공 염기가 다른 인공 염기로 치환될 가능성이 있기 때문이다. 예를 들면, (데옥시)리보자임이 Pn 및 Pa를 가지는 비특이적 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 복제 과정에서 각각의 상보적 인공 염기인 Ds를 통해 Pn과 Pa의 위치가 치환될 수 있기 때문이다.
본 발명의 (데옥시)리보자임을 구성하는 비천연형 뉴클레오티드의 염기는 제1 실시형태에 예시한 인공 염기의 유도체이어도 된다.
7-2. (데옥시)리보자임의 제조 방법
본 발명의 데옥시리보자임의 제조 방법은 복합체 형성 공정, 복합체 회수 공정, 1본쇄 핵산 분자 회수 공정, DNA 증폭 공정, 데옥시리보자임 조제 공정 및 촉매 활성 확인 공정을 필수 공정으로서 포함한다. 또한, 반복 공정을 임의의 공정으로서 포함할 수 있다.
본 발명의 리보자임의 제조 방법은 복합체 형성 공정, 복합체 회수 공정, 1본쇄 핵산 분자 회수 공정, 역전사 공정, DNA 증폭 공정, 전사 공정, 리보자임 조제 공정 및 촉매 활성 확인 공정을 필수 공정으로서 포함한다. 또한, 반복 공정을 임의의 공정으로서 포함할 수 있다.
상기 공정 중에서 복합체 형성 공정, 복합체 회수 공정, 1본쇄 핵산 분자 회수 공정 및 반복 공정은 상기 핵산 앱타머의 제조 방법에서의 복합체 형성 공정, 복합체 회수 공정, 1본쇄 핵산 분자 회수 공정 및 반복 공정에 각각 준하여 행할 수 있다. 또한, 역전사 공정, DNA 증폭 공정 및 전사 공정은 상기 핵산 앱타머의 제조 방법에서의 증폭 공정 중의 역전사 단계, DNA 증폭 단계 및 전사 단계에 각각 준하여 행하면 된다. 나아가 (데옥시)리보자임 조제 공정은 상기 핵산 앱타머의 제조 방법에서의 핵산 앱타머 조제 공정과 마찬가지로, 얻어진 1본쇄 핵산 분자를 셀프 폴딩시켜 표적 물질과의 결합 활성 및 효소 활성을 가지는 본 발명의 (데옥시)리보자임을 조제하면 된다. 촉매 활성 확인 공정은 (데옥시)리보자임의 촉매 활성을 확인하는 공정으로서, (데옥시)리보자임의 표적 물질인 기질을 촉매하고 있는지 여부를 반응 산물로서의 기질 상태를 공지 기술로 확인하면 된다.
8. 핵산 앱타머, 데옥시리보자임 또는 리보자임 제조용 키트
본 발명의 제8 실시형태는 제1 실시형태에 기재된 핵산 앱타머 또는 제7 실시형태에 기재된 리보자임을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 제1 실시형태에 기재된 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 포함하는 1본쇄 핵산 라이브러리 및 그 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자의 프라이머 결합 영역에 상보적인 서열을 가지는 프라이머 세트를 포함한다. 나아가 그 키트의 사용 설명서를 포함할 수도 있다.
실시예
<실시예 1: VEGF-165에 결합하는 DNA 앱타머의 제작(1)>
(1)인공 염기 Ds를 중앙 영역의 특정 부위에 포함하는 1본쇄 DNA 라이브러리의 조제
인공 염기 Ds를 중앙 영역의 특정 부위에 포함하는 1본쇄 DNA 라이브러리(전체길이 97 염기 또는 98 염기)는, 우선 인공 염기 Ds를 중앙 영역 중의 1개소부터 3개소의 임의의 특정 위치에 설정한 22종류의 DNA 라이브러리 서열(하기 참조)을 각각 화학 합성하여 겔 정제한 후, 합성한 각종 DNA 라이브러리를 각각 등량씩 혼합하여 본 발명의 핵산 앱타머 제조 방법에서의 최초 라이브러리로서 이용하였다. 또한, 중앙 영역 중의 어느 위치에 Ds가 배치되어 있는지를 각종 1본쇄 DNA가 혼합된 상태에서도 식별할 수 있도록 하기 위해, 중앙 영역의 5' 말단측에서 PCR용 프라이머 결합 영역 직후에 식별 부위로서의 2염기 또는 3염기의 태그 서열을 도입하였다. 이에 의해, PCR에 의해 DNA 단편 중의 인공 염기를 천연형 염기로 치환한 후에도 시퀀스 해석을 행함으로써, 그 DNA 단편이 어느 라이브러리 유래의 것인지 그리고 어느 위치에 인공 염기가 도입되었는지를 판단할 수 있다.
하기에 화학 합성한 22종류의 DNA 라이브러리 서열을 나타낸다.
N43Ds-01:
5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(AA)NNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 3
N43Ds-02: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(AT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 4
N43Ds-03: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(AG)NNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 5
N43Ds-04: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TA)NNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 6
N43Ds-05: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TT)NNNNNNNNNNDsNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 7
N43Ds-06: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TG)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNDsNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 8
N43Ds-07: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TC)NNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 9
N43Ds-08: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GA)NNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 10
N43Ds-09: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GT)NNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 11
N43Ds-10: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CA)NNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 12
N43Ds-11: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CT)NNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 13
N43Ds-12: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CAG)NNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 14
N43Ds-13: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CAT)NNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 15
N43Ds-14: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TAT)NNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 16
N43Ds-15: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TTA)NNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 17
N43Ds-16: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GCT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 18
N43Ds-17: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CCA)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 19
N43Ds-18: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CCT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 20
N43Ds-19: 5'-TGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GGA)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 21
N43Ds-20: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GGT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 22
N43Ds-21: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CGA)NNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 23
N43Ds-22: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CGT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3'; 서열 번호 24
상기 서열에 있어서, N=A, G, C 또는 T이고, 5'측의 고정 서열(5'측의 PCR용 프라이머 서열에 상당)은 CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(서열 번호 1), 3'측의 고정 서열(3'측의 PCR용 프라이머 서열인 서열 번호 149의 상보적 서열에 상당)은 GCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC(서열 번호 2), 그리고 괄호 안의 서열은 식별 부위를 나타낸다.
(2)VEGF-165에 결합하는 Ds를 포함하는 1본쇄 DNA 앱타머의 제조
상술한 (1)에서 조제한 1본쇄 DNA 라이브러리와 표적 단백질 human VEGF-165(Peprotech)를 이용하여 자기 비즈를 이용한 핵산 단백질 복합체의 고정화법에 의해 이하의 순서로 VEGF-165에 결합하는 DNA 앱타머를 단리하였다.
A. 셀렉션 1라운드의 조작
(i)표적 단백질과 DNA 라이브러리의 결합
1본쇄 DNA 라이브러리를 PBS 용액(1.1mM KH2PO4, 155mM NaCl, 3mM Na2HPO4, pH 7.4)에 용해하여 DNA의 분자 내에서의 고차 구조를 형성시키기 위해 폴딩 처리(90℃, 3분간→60℃, 3분간→25℃)를 행하였다. 그 후, Nonidet P-40을 포함하는 PBS 용액과 혼합하여 Nonidet P-40의 최종 농도가 0.05%가 되도록 조제하고, 자기 비즈에 비특이적으로 흡착하는 핵산 단편을 라이브러리로부터 제거하기 위해, 그 핵산 용액을 0.2mg의 스트렙트아비딘 자기 비즈(Hydrophilic Streptavidin Magnetic Beads, NEB)와 혼합하여 실온 하에서 30분간 전도(顚倒) 혼화하였다. 자기 스탠드와 원심 조작에 의해 자기 비즈를 제거한 후의 상청액을 표적 단백질인 VEGF-165와 혼합하고 25℃에서 30분간 인큐베이션함으로써 DNA-단백질 복합체를 형성시켰다.
(ii)표적 단백질에 결합한 DNA 서열의 선별
상술한 혼합 용액 중에 9% 부피의 10mM EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Scientific) 수용액을 첨가하여(최종 농도 0.83mM) 25℃에서 15분간 인큐베이션함으로써 단백질의 비오틴화를 행하였다. 미반응의 비오틴화 시약을 마이크로콘 50(밀리포어)을 이용한 한외 여과에 의해 제거한 후, 그 용액을 스트렙트아비딘 자기 비즈와 혼합하여 실온에서 10분간 인큐베이션함으로써 DNA-단백질 복합체를 자기 비즈에 고정화하였다. 그 후, 단백질이나 자기 비즈에 비특이적으로 흡착한 핵산을 세정하기 위해, 자기 비즈를 40ml의 0.05% Nonidet P-40을 포함하는 PBS 용액(완충액 A)에 현탁하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하는 조작을 2~3회 반복하였다. 세정 후의 자기 비즈에 400μl의 용출액(100mM 구연산 나트륨 pH 5.0, 7M 요소, 3mM EDTA)을 가하여 90℃에서 5분간 가열함으로써 단백질-DNA 복합체를 해리시켰다. 그리고, 그 용출액으로부터 페놀·클로로포름 추출, 이소프로필알코올 침전 조작에 의해 단백질에 결합되어 있던 DNA를 회수하고, PCR에 의한 다음의 셀렉션 라운드의 라이브러리 조제시의 주형으로 하였다.
(iii)1본쇄 DNA 라이브러리의 조제(증폭)
다음의 라운드에 이용하는 1본쇄 DNA의 라이브러리는 각 셀렉션 라운드 후의 DNA를 주형으로 하여 비오틴 수식된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 행하고, 그 후 스트렙트아비딘과의 결합을 이용한 겔 시프트에 의해 1본쇄화된 Ds를 포함하는 DNA 단편을 분리하고, 겔로부터 그 DNA 단편을 용출하여 회수함으로써 조제하였다. PCR은 Invitrogen사의 AccuPrime Pfx DNA 폴리메라제를 이용하여 400μl부피로 행하고, 그 반응 조성은 1×AccuPrime Pfx reaction mix(각종 dNTP 0.3mM, MgSO44 1mM 함유), 1μM 5'-프라이머(서열 하기 참조), 1μM 3'-프라이머(서열 하기 참조), 0.1mM dNTPs(N=A, G, C, T)(최종 농도 0.4mM), 0.5mM MgSO4(최종 농도 1.5mM), 50μM dDsTP, 50μM Diol1-dPxTP, 0.05U/μl AccuPrime Pfx DNA 폴리메라제이며, PCR의 사이클 조건은 (94℃ 30초-50℃ 30초-65℃ 2분)×13-19사이클이다.
5'-프라이머: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC-3'(서열 번호 1)
3'-프라이머: 5'-BGTAGTCACTAATCCGTTCGAGTCATGC-3'(서열 번호 148; B=비오틴 수식한 T)
PCR 용액으로부터 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한 후, SA완충액(10mM Tris-HCl pH 7.6, 50mM NaCl, 1mM EDTA)을 PCR 용액 0.1ml당 5μl 가하여 용해하고 75℃에서 3분간 가열함으로써 1본쇄 상태로 변성하였다. 이 용액에 PCR 용액 0.1ml당 12.5μg의 스트렙트아비딘(5mg/ml SA완충액, 2.5μl)을 가하여 25℃에서 30분간 인큐베이션함으로써 비오틴-아비딘 복합체를 형성시켰다. 같은 부피의 10M 요소-1×TBE 용액을 가한 후, 7M 요소를 포함하는 6% 폴리아라미드 변성 겔에 의해 증폭된 1본쇄 DNA 라이브러리를 분리하고, 겔로부터 용출·회수된 라이브러리를 다음 라운드의 라이브러리로서 이용하였다.
B. 반복 공정에서의 선택 라운드의 조건
각 라운드의 셀렉션 조건을 표 1에 나타내었다.
Figure pct00010
최초 라운드에는 화학 합성에 의해 조제한 22종류의 DNA 라이브러리 서열을 등량씩 혼합한 것을 직접 이용하고 있고, 분자종 총수는 300pmol, 즉 약 2×1014 분자이다. 단백질-DNA 복합체 형성 조건을 엄격하게 하기 위해 서서히 단백질과 DNA의 농도를 낮춤과 동시에, 8라운드째에는 단백질-DNA 라이브러리를 혼합할 때에 경합하는 DNA 분자로서 지금까지 VEGF에 결합하는 DNA 앱타머로서 보고가 있는 DNA 단편(5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA-3')(서열 번호 147)을 Competitor로서 과잉량 가하였다. 또한, 7라운드째에는 40ml의 완충액 A에서의 세정을 2회 행한 후에, 3M 요소를 포함하는 완충액 A(1ml, 실온에서 15분간)로 전도 혼화하는 조작을 가하여 세정 조건을 더 엄격하게 하였다. 8라운드째에는 요소 존재 하에서의 세정 조작을 2회 반복하였다.
(3)셀렉션에 의해 얻어진 DNA 앱타머 서열의 결정
셀렉션에 의해 얻어진 DNA 앱타머 서열의 결정은 하기의 2가지 방법을 이용하여 행하였다.
(i)대장균을 이용한 클로닝법에 의한 DNA 앱타머 서열의 결정
최종 라운드(8라운드) 후의 셀렉션에서 회수한 1본쇄 DNA의 일부를 주형으로 하여 인공 염기 Ds를 천연 염기로 치환하는 PCR을 행하고, 그 PCR 산물을 종래법에 의해 클로닝하였다. 구체적으로는 1μM의 각 프라이머(5'-프라이머: 5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC-3'(서열 번호 1)와 3'-프라이머: 5'-GTAGTCACTAATCCGTTCGAGTCATGC-3'(서열 번호 149))와 20nM의 주형 1본쇄 DNA 존재 하에서 Clontech사의 1×Titanium Taq PCR buffer 중에서 0.3mM dNTPs(N=A, G, C, T), 50μM dPa' TP, 1×Titanium Taq의 반응 조성으로 5사이클의 PCR(20μl 부피)을 행하였다. 본 PCR에서는 dPa' TP를 의도적으로 첨가하고 있지만, 이는 인공 염기 Ds가 인접 서열에 따라서는 천연형 염기 기질만으로는 증폭되기 어려운 경우가 있고, 그 천연형 염기에의 치환 효율의 차이를 저감하기 위해 Ds 대신에 천연형 염기로 치환되기 쉬운 Pa'를 Ds에 상보한 위치에 1사이클째의 PCR로 도입시키기 위해서이다. PCR 사이클 조건은 94℃ 1분→(94℃ 30초-68℃ 2분)×5사이클→75℃ 10분이다. PCR 산물의 일부(4μl)를 TOPO TA 클로닝 키트(인비트로젠)에 의해 대장균(Top10)에 클로닝하고, 각 클론 유래의 플라스미드를 회수하여 각 클론의 시퀀싱을 결정하였다. 결정한 클론의 서열 중에서 프라이머 서열의 사이가 45~46 염기이고, 태그 서열을 가지는 35 클론의 염기 서열 14종을 표 2에 나타낸다.
Figure pct00011
인공 염기 Ds의 위치는 태그 서열에 따라 분류된 DNA 라이브러리의 서열에 기초하여 결정하였다. 가장 클론수가 많았던 것은 cN43Ds-21-04의 서열이었지만, 한편으로는 cN43Ds-08-07에 포함되는 GGGDsTTGGAGGGGDsGTCGG 서열과 유사한 모티프가 그 밖의 클론 사이에서 보존되어 포함되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 태그 서열로부터 예상된 인공 염기 Ds의 위치의 염기 서열은 대부분이 A 또는 T로 치환되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 인공 염기 Ds의 상당하는 위치의 서열은 A 또는 T의 변이로서 얻어진 것은 셀렉션을 통한 PCR 중에서도 인공 염기가 보유되어 있음을 강하게 시사하고 있다.
(ii)차세대 시퀀서(Life Technologies사; Ion Torrent The Personal Genome Machine™(PGM™))에 의한 DNA 앱타머 서열의 결정
상술한 (i)에서 나타낸 천연 염기를 인공 염기로 치환하는 PCR을 100μl 부피로 행하여 얻어진 PCR 산물을 Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)를 이용하여 정제하였다. 정제 후의 DNA를 Ion Fragment Library Kit(Life Technologies)에 의해 첨부한 설명서에 기재된 방법으로 라이브러리화하였다. 얻어진 DNA 라이브러리는 Ion Library Quantification Kit(Life Technologies)를 이용하여 정량하고 소정의 농도까지 희석한 후, Ion XpressTM Template Kit v2.0(Life Technologies)을 이용하여 처리함으로써, Life Technologies사의 The Personal Genome Machine™(PGM™) 해석용 주형 DNA를 조제하였다. 그리고, Ion Sequencing Kit(Life Technologies)를 이용하여 이온토렌트 PGM™에 의한 시퀀싱을 행하여 얻어진 총 리드수를 CLCBio사의 CLC Genomics Workbench(version 4.7.2)를 이용하여 해석하였다. 구체적으로는 Ds를 포함하는 라이브러리 서열에 대해서는 5'-프라이머 25염기·태그 서열(각종)·43염기로 이루어지는 서열·3'-프라이머의 부분 서열 6염기(GCATGA)를 연속하여 포함하면서 동일 서열의 리드수가 2 이상인 것을, 또한 Ds를 포함하는 라이브러리의 상보 서열에 대해서는 3'-프라이머 27염기·43염기로 이루어지는 서열·태그 서열(각종)·5'-프라이머의 부분 서열 6염기(GTGGAC)를 연속하여 포함하면서 동일 서열의 리드수가 2 이상인 것을 각각 해석 대상의 서열로서 선별하고, 합계수 14094의 리드 서열을 더 해석하였다. 도 6a 및 도 6b에 라이브러리마다 상기 조건을 만족시킨 리드 해석수 및 인공 염기 Ds가 해당하는 부분 이외가 동일 서열이었던 리드수가 3 이상이었던 것을 선택하여 나타낸다.
그 결과, 이온토렌트 PGM™에 의해 해석된 클론 서열도 클로닝으로 해석된 클론 서열도 마찬가지의 경향을 나타내는 것을 알 수 있었다. 클로닝법으로 확인된 서열의 대부분은 이온토렌트 PGM™에 의한 클론의 해석 결과로부터도 확인할 수 있었다. 이온토렌트 PGM™로 해석된 서열 중에서 가장 클론수가 많았던 것은 클로닝법으로 가장 많이 얻어진 클론 cN43Ds-21-04와 같은 서열인 N43Ds-21-1이었다. 또한, GGGDsTTGGNGGGGDsGTCGG(N=임의의 천연형 염기)의 모티프를 포함하는 서열에 대해서도 많이 확인되고, 이 중에서 50 이상의 리드수를 확인할 수 있었던 서열은 13종류이었다(도 7).
<실시예 2 VEGF-165에 결합하는 DNA 앱타머의 결합 해석(1)>
본 실시예에서는 GE 헬스케어사의 BIACORE3000를 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 측정에 의해 실시예 1에서 얻어진 클론으로부터 대표적인 클론으로서 N43Ds-08-1, N43Ds-09-1, N43Ds-20-1, N43Ds-21-1을 선택하고, 전체길이 DNA 단편(DNA 앱타머)의 VEGF-165에의 결합 능력을 해석하였다.
우선, 본 발명의 핵산 앱타머의 제조 방법으로 얻어진 각 클론 서열에 기초하여 5'-말단에 비오틴화된 T가 부가된 Ds를 포함하는 1본쇄 DNA 단편(전체길이 98 및 99-mer) 및 Ds를 천연형 염기 A, T 혹은 G로 치환한 DNA 단편을 화학 합성과 겔 정제에 의해 조제하였다. 도 8에 그 서열을 나타낸다. 그리고, SPR의 센서 칩에는 스트렙트아비딘이 코트된 SA칩(GE 헬스케어)을 이용하여 DNA 단편을 칩에 불가역적으로 고정화 후, VEGF에의 결합을 해석하였다. 컨트롤로서 VEGF에 결합하는 DNA 앱타머로서 보고가 있는 DNA 단편(VEGF binding DNA 64, 64mer)도 조제하여 마찬가지로 하여 결합을 해석하였다. 또, SPR의 측정 조건은 런닝 버퍼: 완충액 A, 설정 온도: 25℃로 행하였다.
각 DNA 단편의 센서 칩에의 고정화는 50nM이 되도록 PBS 용액으로 희석한 DNA 용액을 폴딩 처리(90℃, 3분간→60℃, 3분간→25℃)한 후, 최종 농도 0.05%가 되도록 Nonidet P40를 가하였다. 그 DNA 용액을 유속 5μl/min로 10μl(2분간 상당) 인젝션함으로써 SA칩에 고정화하였다. 또한, 고정화 후, 유속 20μl/min로 50mM NaOH 용액을 인젝션(5μl, 5회)함으로써, SA칩에 비특이적으로 흡착되어 있는 DNA 단편을 세정하였다. 고정화된 DNA 단편과 VEGF-165의 상호 작용 검출은 100nM, 150nM 및 200nM의 VEGF-165 용액(완충액 A에 의해 희석, dimer 환산)을 Kinetic Injection 모드에 의해 인젝션함으로써 모니터하였다. 측정 조건은 유속 20μl/min, 단백질 인젝션은 3분간이다. 칩의 재생(결합 단백질의 해리 및 DNA의 리폴딩)은 50mM NaOH의 용액을 5μl(15초 상당) 인젝션 후, 칩의 프라임 처리를 행하여 대량의 완충액 A를 흘려 보냄으로써 행하였다. 각 DNA 단편의 센서 그램은 센서 칩에 대한 벌크 효과나 비특이적 흡착에 의한 리스폰스값을 빼기 위해, DNA를 고정화하지 않은 셀을 레퍼런스의 셀로 하여 그 리스폰스값을 각 DNA 단편의 센서 그램으로부터 뺐다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.
본 측정 결과, 센서 그램의 파형으로부터 DNA 단편과 VEGF-165의 특이적인 결합 이외에도 약한 비특이적인 결합도 보이는 것을 알 수 있었다. 이 경우에는 커브 피팅에 의한 결합 속도(ka), 해리 속도(kd)에 기초한 해리 상수(Kd=kd/ka)의 산출은 어렵다고 판단하고, 각 DNA 단편의 결합 강도 평가는 단백질 인젝션 종료 후의 단백질 해리 단계에서 얼만큼 해리되기 어려운지를 지표로서 비교하기로 하였다. 구체적으로는 인젝션 종료 후, 23초 후의 리스폰스값(RU)을 100%로 하고 나아가 200초 경과 후의 리스폰스값(RU)으로부터 어느 정도 결합이 유지되고 있는 비율을 구하고, 100nM, 150nM, 200nM에서 얻어진 비율을 평균하여 결합 유지율 Retention(%)을 산출하였다. 그 산출 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00012
모든 클론에 있어서, 인공 염기 Ds를 포함하는 DNA 단편이 인공 염기 Ds를 천연형 염기로 치환한 DNA 단편보다 VEGF-165의 결합 유지율이 높은 것을 알 수 있었다. 특히 N43Ds-09-1은 다른 DNA 단편에 비해 강한 결합을 나타낼 뿐만 아니라, Ds를 G나 A/T로 치환한 경우의 결합 유지율의 저하가 다른 DNA 단편에 비해 컸다. 이 결과로부터, N43Ds-09-1의 VEGF-165에의 결합은 Ds의 유무에 의존하고, Ds를 천연형 염기로 치환한 경우에는 특히 그 해리 속도(kd)가 커지는 것이 명확해졌다.
<실시예 3: N43Ds-09-1의 서열을 기초로 한 도프 셀렉션(1)>
본 실시예에서는 실시예 1, 2에서 얻어진 VEGF-165에 인공 염기 Ds에 의존하여 강하게 결합하는 DNA 단편 N43Ds-09-1에 대해, 전체길이 98-mer 중의 어느 부분이 표적 단백질과의 결합에 관여하고 있는지를 조사하기 위해 도프 셀렉션을 행하였다.
(1)도프 셀렉션에 이용한 DNA 라이브러리의 조제
도프 셀렉션에 이용한 DNA 라이브러리는 N43Ds-09-1 서열의 3개의 Ds의 염기 및 프라이머 영역은 고정하고, 그 이외의 태그 서열을 포함한 천연 염기 서열 부분은 62.5%가 원래 염기, 37.5%가 원래 염기와 다른 염기(3종류의 염기가 12.5%씩)가 되도록 하여 화학 합성하고 겔 정제에 의해 조제하였다. 서열은 하기와 같다.
N43Ds-09-1-Dope
5'-ctgtcaatcgatcgtatcagtccacgtctaagta(Ds)ggtggg(Ds)ttggcgggg(Ds)tgtcggatatacttt gacgcatgactcgaacggattagtgactac-3'
(대문자 고정 서열:소문자 Doped 서열)
a= A: 62.5%; G: 12.5%; C: 12.5%, T: 12.5%
g= A: 12.5%; G: 62.5%; C: 12.5%, T: 12.5%
c= A: 12.5%; G: 12.5%; C: 62.5%, T: 12.5%
t= A: 12.5%; G: 12.5%; C: 12.5%, T: 62.5%
(2)VEGF-165에 결합하는 Ds를 포함하는 ssDNA 앱타머의 도프 셀렉션
(1)에서 조제한 DNA 라이브러리와 표적 단백질 human VEGF-165(Peprotech)를 이용하여 자기 비즈를 이용한 핵산 단백질 복합체의 고정화법에 의해, 실시예 1에 나타낸 「A. 셀렉션 1라운드의 조작」과 동일한 수순으로 VEGF-165에 결합하는 DNA 앱타머를 단리하였다.
A. 도프 셀렉션 라운드의 조건
각 라운드의 셀렉션 조건을 표 4에 나타내었다.
Figure pct00013
최초 라운드에는 화학 합성에 의해 조제한 DNA 라이브러리 N43Ds-09-1-Dope를 그대로 300pmol 이용하여 실시하였다. 실시예 1과 마찬가지로 셀렉션 라운드가 진행될 때마다 단백질-DNA 복합체 형성 조건을 엄격하게 하기 위해 서서히 단백질과 DNA의 농도를 낮춤과 동시에, 3, 4 및 5라운드째에는 단백질-DNA 라이브러리를 혼합할 때에 경합하는 DNA 분자(Competitor)로서 지금까지 VEGF에 결합하는 DNA 앱타머로서 보고가 있는 DNA 단편(5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA-3'; 서열 번호 147)을 과잉량 가하였다. 또한, 4라운드째에는 40ml의 완충액 A로의 세정을 2회 행한 후에 3M 요소를 포함하는 완충액 A(1ml, 실온에서 15분간)로 전도 혼화하는 조작을 가하여 세정 조건을 더 엄격하게 하였다. 5라운드째에는 이 조작을 2회 반복하였다.
(3)도프 셀렉션에 의해 얻어진 DNA 앱타머 서열의 해석
도프 셀렉션에 의해 얻어진 DNA 앱타머 서열의 해석은 실시예 1과 마찬가지로 하여 최종 라운드(5라운드) 후의 셀렉션에서 회수한 DNA를 이용하여 하기의 2가지 방법을 이용하여 행하였다.
(i)대장균을 이용한 클로닝법에 의한 DNA 앱타머 서열의 동정
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 결정한 클론의 서열 중에서 프라이머 서열의 사이가 45염기인 28클론의 염기 서열 25종을 도 10에 나타낸다.
(ii)차세대 시퀀서(Life Technologies사 Ion Torrent The Personal Genome Machine™(PGM™))에 의한 DNA 앱타머 서열의 동정
PGM에 의한 시퀀스는 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 행하였다. 얻어진 총 리드수를 CLC Genomics Workbench(version 4.7.2)를 이용하여 해석하고, Ds를 포함하는 라이브러리 서열에 대해서는 5'-프라이머의 25염기·45염기로 이루어지는 서열·3'-프라이머의 부분 서열 6염기(GCATGAC)를 연속하여 포함하는 리드(총수: 2474) 및 Ds를 포함하는 라이브러리의 상보 서열에 대해서는 3'-프라이머 27염기·45염기로 이루어지는 서열·5'-프라이머의 부분 서열 6염기(GTGGAC)를 연속하여 포함하는 리드(총수: 2365)를 선택하여 합계수 4839의 클론 서열에 대해 추가로 해석하였다. 45염기 중의 각 위치에서의 염기 조성을 산출한 결과를 도 11에 나타낸다.
(i) 및 (ii)의 두 수법으로 해석한 결과, 공통적으로 N43Ds-09-1의 원래 서열 중의 모티프 GGGDsTTGGNGGGGDsTGTCGG(N=A, G, C, T)로 이루어지는 서열(서열 번호 105)이 매우 잘 보존되어 있는 것을 알 수 있었다. 이 모티프와 유사 서열을 포함하는 클론이 실시예 1의 셀렉션에서도 많이 얻어져 있고(도 7), 이 모티프가 VEGF-165에의 결합에 중요한 것이 시사되었다.
<실시예 4: 도프 셀렉션에 의해 얻어진 모티프를 포함하는 DNA 단편의 결합 해석(1)>
본 실시예에서는 GE 헬스케어사의 BIACORE3000를 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 측정에 의해, 실시예 3에서 동정된 GGGDsTTGGNGGGGDsTGTCGG 모티프(서열 번호 105)를 포함하도록 N43Ds-09-1을 줄인 DNA 단편(35mer) Ds-09-1-DsDsDs 및 그 변이체의 DNA 단편에 대해 VEGF-165에의 결합 능력을 해석하였다.
A. SPR에 의한 각종 DNA 단편의 VEGF-165에의 결합 해석
SPR의 측정 조건은 실시예 2와 마찬가지로 런닝 버퍼: 완충액 A, 설정 온도: 25℃로 행하였다. 본 실시예에서 해석에 이용한 DNA 단편 6종을 표 5에 나타낸다.
Figure pct00014
Ds-09-1-ADsDs, Ds-09-1-DsADs, Ds-09-1-DsDsA, Ds-09-1-AAA는 Ds-09-1-DsDsDs의 인공 염기 Ds를 모두 혹은 1개소씩 천연형 염기 A로 치환한 것이다. Ds-09-1-mDsDsDs는 도프 셀렉션에서 보존되어 있는 비율이 낮았던 염기 부분에서 2개소를 빈출 빈도가 높은 염기로 치환한 Ds-09-1-DsDsDs 변이체의 DNA 단편이다. 또한, 비교를 위해 전체길이 98mer의 N43Ds-09-1 및 인공 염기 Ds를 천연형 염기로 치환한 전체길이의 DNA 단편, N43Ds-09-1(AT)과 N43Ds-09-1(G) 및 컨트롤로서 VEGF에 결합하는 DNA 앱타머로서 보고가 있는 DNA 단편 35mer(VEGF binging DNA 35)도 동일 조건 하에서 측정하였다. 실시예 2의 전체길이의 결합 해석과 마찬가지로 SA칩(GE 헬스케어)에 DNA 단편을 직접 고정화하기 위해, 각각의 DNA의 말단에는 비오틴화된 T를 부가하여 화학 합성하고 겔 정제에 의해 조제하였다. 각 DNA 단편의 센서 칩에의 고정화는 25nM이 되도록 PBS 용액으로 희석한 DNA 용액을 폴딩 처리(90℃, 3분간→60℃, 3분간→25℃)한 후, 최종 농도 0.05%가 되도록 Nonidet P40을 가하였다. 그 DNA 용액을 유속 5μl/min로 5μl(1분간 상당) 인젝션함으로써 SA칩에 고정화하였다. 또한, 고정화 후 유속 20μl/min로 50mM NaOH 용액을 인젝션(5μl, 5회)함으로써, SA칩에 비특이적으로 흡착되어 있는 DNA 단편을 세정하였다.
고정화된 DNA 단편과 VEGF-165의 상호 작용 검출은 12.5nM, 25nM, 37.5nM, 50nM, 62.5nM 및 75nM의 VEGF-165 용액(완충액 A에 의해 희석, dimer 환산)을 Kinetic Injection 모드에 따라 인젝션함으로써 모니터하였다. 측정 조건은 유속 20μl/min, 단백질 인젝션은 6분간이다. 칩의 재생(결합 단백질의 해리 및 DNA의 리폴딩)은 50mM NaOH의 용액을 5μl(15초 상당) 인젝션한 후, 칩의 프라임 처리를 행하여 대량의 완충액 A를 흘려 보냄으로써 달성하였다. DNA 단편의 센서 그램은 센서 칩에 대한 벌크 효과나 비특이적 흡착에 의한 리스폰스값을 빼기 위해, DNA를 고정화하지 않은 셀을 레퍼런스의 셀로 하여 그 리스폰스값을 각 DNA 단편의 센서 그램으로부터 뺐다. 그 결과를 도 12에 나타낸다. 전체길이를 35mer로 줄인 Ds-09-1-DsDsDs는 전체길이의 N43Ds-09-1(Ds)와 마찬가지로 VEGF-165에 강하게 결합하는 것을 알 수 있었다. 또한, Ds-09-1-DsDsDs에 포함되는 3개의 Ds 염기 중에서 5'-말단측에 위치하는 Ds를 천연 염기 A로 치환한 DNA 단편 Ds-09-11-ADsDs도 강하게 결합하는 것을 알 수 있었다. 한편, 5'-말단측으로부터 2번째, 3번째의 Ds를 A로 치환한 DNA 단편(Ds-09-1-DsADs 또는 Ds-09-1-DsDsA) 및 인공 염기 Ds를 모두 A로 치환한 DNA 단편(Ds-09-1-AAA)은 Ds-09-1-DsDsDs 및 Ds-09-1-ADsDs와 비교하여 VEGF 인젝션 후의 VEGF의 해리가 빨라지고 결합이 약해지는 것을 알 수 있었다. 또한, DNA 단편 Ds-09-1-mDsDsDs는 VEGF 인젝션 후의 리스폰스(RU)는 다른 DNA 단편에 비해 낮았지만, VEGF 인젝션 후의 VEGF의 해리는 Ds-09-1-DsDsDs나 Ds-09-1-ADsDs와 마찬가지로 느린 것을 알 수 있었다.
짧은 단편에서의 SPR 측정에서는 전체길이의 DNA 단편과 비교하여 약한 비특이적인 결합을 무시할 수 있는 레벨이며, Ds-09-1-DsDsDs, Ds-09-1-ADsDs, Ds-09-1-mDsDsDs에 대해서는 Biacore3000의 부속 BiaEvalutaion 소프트에 의해 1:1 binding의 반응 모델로 커브 피팅을 행하여 해리 상수(Kd)를 산출할 수 있었다. Ds-09-1-DsDsDs의 Kd값은 4nM, Ds-09-1-ADsDs의 Kd값은 1nM, Ds-09-1-mDsDsDs의 Kd값은 50nM이었다. 또한, 결합이 약한 Ds-09-1-DsAD, Ds-09-1-DsDsA, Ds-09-1-AAA에 대해서는 피팅이 어려워 정확한 Kd값은 산출할 수 없었지만, 100nM보다 큰 것을 알 수 있었다(표 5).
또한, 실시예 2와 마찬가지로 각 DNA 단편의 결합 강도를 단백질 인젝션 종료 후의 단백질 해리 단계에서 얼만큼 해리되기 어려운지를 지표로 한 비교도 행하였다. 구체적으로는 인젝션 종료 후, 16초 후의 리스폰스값(RU)을 100%로 하고, 나아가 300초 경과 후의 리스폰스값(RU)으로부터 얼만큼 결합이 유지되고 있는 비율을 구하고, 37.5nM, 50nM, 62.5nM, 75nM에서 얻어진 비율을 평균하여 결합 유지율 Retention(%)를 산출하였다(도 10, 표 5). 그 결과, 짧게 줄인 Ds-09-1-DsDsDs, Ds-09-1-ADsDs 및 Ds-09-1-mDsDsDs는 결합 유지율이 90% 이상으로 98mer 전체길이의 Ds-09-1의 결합 유지율과 거의 같았다.
이상의 결과로부터, GGGDsTTGGNGGGGDsTGTCGG(서열 번호 105)를 포함하고 짧게 줄인 DNA 단편 35mer는 모티프 중의 Ds 염기에 의존하여 VEGF로부터 해리하기 어려워짐과 동시에 강하게 VEGF에 결합하는 것을 알 수 있었다.
B. 줄인 DNA 단편의 VEGF-165에의 결합 선택성 해석
본 셀렉션에서 얻어진 앱타머 35mer의 VEGF-165에의 결합 선택성을 조사하기 위해, VEGF-165의 서브 타입인 VEGF-121(Peprotech) 및 human EGF(Peprotech), human α-thrombin(Enzyme Research Laboratories)에 대한 Ds-09-11-DsDsDs 및 Ds-09-11-ADsDs의 결합 능력을 조사하였다. VEGF-165에의 결합 해석과 마찬가지로 하여 Ds-09-11-DsDsDs 및 Ds-09-11-ADsDs를 고정화한 SA칩에 각종 단백질(75nM)을 인젝션한 경우의 센서 그램을 도 13에 나타내었다. Ds-09-11-DsDsDs 및 Ds-09-11-ADsDs 모두 VEGF-165 이외의 단백에는 거의 결합하지 않고, 본 실험의 셀렉션에서 얻어진 인공 염기를 포함하는 앱타머가 VEGF-165에 선택적으로 결합하는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5: 인공 염기 Ds를 중앙 영역에 랜덤으로 포함하는 1본쇄 DNA 라이브러리(랜덤 라이브러리법)에 의한 셀렉션>
본 실시예에서는 인공 염기 Ds를 포함하는 1본쇄 DNA 라이브러리로서 인공 염기 Ds를 무작위(random)로 도입한 랜덤 라이브러리를 이용하여 VEGF에 결합하는 DNA 앱타머의 셀렉션을 행하였다.
(1)인공 염기 Ds를 무작위로 도입한 1본쇄 DNA 라이브러리의 조제
인공 염기 Ds를 무작위로 도입한 1본쇄 DNA 라이브러리(N45.26mixDs-3)의 화학 합성은 중앙 영역 45염기로 이루어지는 서열에 대해 인공 염기 Ds의 아미다이트가 6%, 천연형 염기 4종 등량씩의 아미다이트가 94%의 비율이 되도록 혼합하여 조제한 아미다이트를 이용함으로써 행하였다. 이 조건으로 합성한 라이브러리의 이론상 조성은 Ds를 포함하지 않고 천연형 염기로 이루어지는 라이브러리가 전체의 6.2%, 임의의 위치에 Ds를 1염기 포함하는 라이브러리가 전체의 17.7%, Ds를 2염기 포함하는 라이브러리가 전체의 24.9%, Ds를 3염기 포함하는 라이브러리가 22.8%, Ds를 4염기 포함하는 라이브러리가 15.3%, Ds를 5염기 포함하는 라이브러리가 8.0%, 나머지 약 2%의 라이브러리가 Ds를 6염기 이상 포함한다고 생각된다. N45.26mixDs-3의 서열(전체길이 89-mer, 괄호 안의 영역은 PCR 프라이머를 위한 고정 서열)을 이하에 나타낸다.
5'-(ACGCATGAACAAACTTGCTTG)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(GGAGTACGCAGAAGTTTCATTGT)-3'(서열 번호 114)
(N=A, G, C, T(94%) 또는 Ds(6%))
(2)VEGF-165에 결합하는 Ds를 포함하는 ssDNA 앱타머의 셀렉션
상기 (1)의 DNA 라이브러리와 표적 단백질 human VEGF-165(Peprotech)를 이용하여 자기 비즈를 이용한 핵산 단백질 복합체의 고정화법에 의해, 실시예 1에 나타낸 <셀렉션 1라운드의 조작>과 마찬가지로 하여 VEGF-165에 결합하는 DNA 앱타머를 단리하였다. 또, (iii)의 라이브러리 조제에서는 PCR의 사이클 조건은 (94℃ 30초-50℃ 30초-65℃ 2분)×15-25사이클이며, 5'-프라이머와 3'-프라이머에는 하기의 서열을 사용하였다.
5'-프라이머: 5'-ACGCATGAACAAACTTGCTTG-3'(서열 번호 112)
3'-프라이머: 5'-BACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3'(B=비오틴 수식한 T)(서열 번호 150)
<셀렉션 라운드의 조건>
각 라운드의 셀렉션 조건을 표 6에 나타내었다.
Figure pct00015
최초 라운드에는 화학 합성에 의해 조제한 DNA 라이브러리를 직접 이용하고 있고, 분자종 총수는 300pmol, 즉 약 2×1014 분자이다. 단백질-DNA 복합체 형성 조건을 엄격하게 하기 위해 서서히 단백질과 DNA의 농도를 낮춤과 동시에 복합체를 세정하는 단계수를 늘렸다.
(3)셀렉션 라운드마다의 라이브러리의 시퀀스 해석
인공 염기 Ds를 포함하는 DNA의 시퀀스 해석에서는 통상의 다이 터미네이터(Dye Terminator)에 의한 시퀀스 반응 중에 인공 염기 Ds에 상보적인 기질로서 ddPa' TP 혹은 dPa' TP를 가하면 시퀀스 패턴이 달라지기 때문에, 시퀀스의 주형에 이용한 DNA 단편 중의 인공 염기 Ds의 유무를 추측할 수 있다. 그래서, 각 셀렉션 라운드 후에 조제한 1본쇄 DNA 라이브러리를 주형에 이용하여 ddPa' TP 혹은 dPa' TP 존재 하에서 시퀀스 해석을 행하고, 셀렉션 과정을 통해 인공 염기 Ds가 얼만큼 유지되고 있는지를 해석하였다.
구체적으로는 DNA의 시퀀싱 반응은 전량 10μl 스케일에서 시판되는 BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)의 Cycle Sequencing Mix 2μl에 키트 첨부한 v1.1용 Sequencing Buffer(×5) 1μl, 시퀀스 프라이머로서 (2pmol, 5'-ACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3'; 서열 번호 113)와 각 라운드 후 PCR 증폭하여 조제한 1본쇄 DNA 단편(0.15pmol 정도) ddPa' TP 혹은 dPa' TP(500pmol)를 가하고, 25사이클의 PCR(96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분)을 행하였다. 미반응의 다이 터미네이터를 CentriSep 스핀 칼럼(Applied Biosystems)으로 반응 용액으로부터 제거하고, 나머지 용액을 감압 하에서 건조하였다. 잔존물에 Blue-Dextran을 희석한 포름아미드 용액을 3μl 가하여 그 일부를 ABI377DNA 시퀀서에 의해 해석하였다. 해석에 이용한 겔 조성은 6% 폴리아크릴아미드-6M 요소 겔이다. 서열의 피크 패턴은 Applied Biosystems PRISM 시퀀싱 해석 v3.2 소프트웨어를 이용하여 해석하였다. 시퀀스 패턴을 해석한 결과로부터, 4라운드 이후 특정의 서열군이 농축되어 있는 것을 알 수 있었다. 천연형 염기 서열만으로 이루어지는 앱타머도 라이브러리에 포함되어 있기 때문에, ddPa' TP 존재 하에서 시퀀스가 인공 염기에 상보하는 위치에서 멈추는 패턴은 되지 않았지만, ddPa' TP 존재 하와 dPa' TP 존재 하의 시퀀스 패턴은 모든 라운드에서 차이가 확인되었다. 통상 천연형 염기만으로 이루어지는 서열의 경우에는, ddPa' TP 존재 하와 dPa' TP 존재 하에서도 시퀀스 패턴에 의미 있는 차이는 인정되지 않는다. 따라서, 본 셀렉션에서 얻어진 라이브러리 중에는 적어도 인공 염기 Ds는 유지된 서열이 존재하는 것으로 추측되었다.
(4)셀렉션에 의해 얻어진 DNA 앱타머 서열의 동정
(3)의 시퀀스 결과로부터 천연형 염기 서열만으로 이루어지는 앱타머도 8라운드 후의 라이브러리에 포함되어 있는 것이 시사되었기 때문에, 실시예 1의 (3)(i)의 수법 전에 인공 염기 Ds를 포함하는 DNA 단편을 농축하는 조작을 행하여 Ds를 포함하는 DNA 앱타머의 서열 결정을 행하였다.
인공 염기 Ds를 포함하는 DNA 단편을 농축하는 조작은 Nucleic Acid Research(2009) Kimoto et al.에 기재한 방법에 준하여 행하고, 논문 중의 FAM-hx-dPxTP 대신에 Biotin-dPxTP를 이용하여 마찬가지의 조작을 행하였다. 구체적으로는 8라운드 후에 증폭한 1본쇄 DNA 라이브러리 1pmol를 주형으로 하고 dDsTP, Biotin-dPxTP 50μM 존재 하에서 AccuPrime Pfx DNA 폴리메라제를 이용하여 PCR5 사이클로 증폭하고, Ds를 포함하는 1본쇄 DNA 단편을 Ds-(Biotin-dPx) 염기쌍을 포함하는 2본쇄 DNA로 하였다. PCR 조성과 조건은 Diol1-dPxTP를 Biotin-dPxTP로 치환한 점, PCR의 프라이머에 비오틴화되지 않은 프라이머(5'-ACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3'(서열 번호 113) 및 5'-ACGCATGAACAAACTTGCTTG-3'(서열 번호 112))를 사용한 점 이외에는 실시예 1의 (2)(iii)과 동일하다. 그리고, PCR 용액을 마이크로콘 10(밀리포어)을 이용한 한외 여과에 의해 1×Binding 용액(20mM TrisHCl, pH 7.6, 0.5M NaCl, 10mM MgCl2)으로 버퍼 교환하고, PCR 산물에 도입되지 않은 미반응의 Biotin-dPxTP를 PCR 용액으로부터 제거하였다. 그 용액(약 45μl)을 셀렉션에서 사용하였던 스트렙트아비딘 자기 비즈(40μl 분)와 25℃ 15분간 인큐베이션하고, Ds-(Biotin-dPx) 염기쌍을 포함하는 2본쇄 DNA를 자기 비즈에 고정화하였다. 1×Binding 용액으로 비즈를 세정하여 Ds-(Biotin-dPx) 염기쌍을 포함하지 않는 DNA 단편을 제거한 후, 회수한 자기 비즈에 20mM NaOH 용액을 12μl 가하고 실온에서 5분간 정도 방치함으로써, 2본쇄 DNA를 1본쇄 DNA로 하여 Ds를 포함하는 DNA 단편을 용액 중에 유리시켰다. 80mM HCl 용액을 3μl 가하고 중화한 후, 자기 스탠드를 이용하여 DNA 단편을 포함하는 용액을 회수하고 실시예 1의 (3)(i)의 수법의 주형 DNA로 하였다.
(5)클로닝법에 의한 DNA 앱타머 서열의 동정
상술한 DNA 용액의 일부를 주형으로 하여 인공 염기 Ds를 천연 염기로 치환하는 PCR을 행하고, 그 PCR 산물을 종래법에 의해 클로닝하였다. 구체적으로 DNA 용액 4μl를 주형으로 하여 1μM의 각 프라이머(5'-ACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3'(서열 번호 113) 및 5'-ACGCATGAACAAACTTGCTTG-3'(서열 번호 112))의 존재 하에서 다카라사의 1×ExTaq pre mix에 최종 농도가 50μM이 되도록 dPa' TP를 가하여 PCR(20μl부피)을 행하였다. PCR 사이클 조건은 (94℃ 30초-50℃ 30초-65℃ 2분)×10사이클→75℃ 5분이다. PCR 산물의 일부(4μl)를 TOPO TA 클로닝 키트(인비트로젠)에 의해 대장균(Top10)에 클로닝하고, 각 클론 유래의 플라스미드를 회수하여 각 클론의 염기 서열을 결정하였다. 결정한 클론의 서열 중에서 프라이머 서열의 사이가 45염기인 59클론의 염기 서열 27종을 얼라인먼트한 결과를 도 14에 나타낸다.
동정된 서열의 상동성을 해석한 결과, 중앙 영역 중에서 염기 변이를 2개소에서 3개소 포함하는 상동 서열 그룹이 5종류 있고, 그 중에는 인공 염기 Ds가 본 클로닝법에 따라 천연형 염기 T 또는 A로 치환되었다고 추측되는 염기 변이도 확인할 수 있었다.
<실시예 6: 제조 방법에 의해 얻어진 앱타머에서의 인공 염기 Ds의 위치의 동정>
본 실시예에서는, 실시예 5에서 얻어진 5종류의 그룹으로 이루어지는 앱타머의 서열 중에 인공 염기 Ds가 포함되어 있는지 또한 그 서열 중의 위치의 동정을 행하였다.
A. DNA 라이브러리로부터 프로브에 상보적인 DNA 단편의 단리
5종류의 그룹 서열에 각각 특이적이 되도록 디자인한 24염기로 이루어지는 DNA 단편의 프로브 서열을 도 14 중에 나타낸다. 이들 프로브는 5' 말단을 비오틴화 표지한 화학 합성·간이 정제가 완료된 것을 인비트로젠사로부터 구입하여 사용하였다. 8라운드 후에 얻어진 DNA 단편을 dDsTP와 Diol1-dPxTP로 PCR 증폭하여 조제한 1본쇄 DNA 라이브러리를 100nM/1×Binding 용액이 되도록 조제하고, 그 용액 130μl를 스트렙트아비딘 자기 비즈(50μl 분)와 실온에서 10분간 인큐베이트함으로써 스트렙트아비딘에 결합하는 DNA 단편을 제거하였다. 그 후, 회수한 DNA 용액 20μl를 각 비오틴화 프로브(5μM, 1μl)와 혼합한 후, 어닐링 조작(90℃ 3분-0.1℃/초로 서냉-55℃ 15분) 후, 1×Binding 용액으로 치환한 스트렙트아비딘 자기 비즈(5μl 분)와 혼합하여 55℃에서 5분간 인큐베이트함으로써 비오틴화 프로브 및 프로브에 상보적으로 혼성화한 DNA 단편을 자기 비즈에 고정화하였다. 자기 스탠드를 이용하여 용액을 제거하고, 프로브에 혼성화하지 않은 잉여의 DNA 단편을 제거한 후, 자기 비즈를 150μl의 1×Binding 용액으로 5회 세정하였다. 그리고, 세정 후의 자기 비즈에 멸균수 10μl 첨가하고 75℃에서 5분간 가열한 후에 용액을 회수함으로써, 각 프로브에 하이브리다이즈한 DNA 단편을 회수하였다.
B. 프로브에 의해 회수한 DNA 단편의 DNA 시퀀싱
회수한 DNA 단편을 이용하여 이하의 3종류 (i)~(iii)의 방법에 따라 DNA 시퀀싱을 행하였다. 또, 시퀀싱 방법은 변경점이 명기되어 있는 것 이외에는 실시예 5의 (3)에 나타낸 방법과 마찬가지로 하여 행하였다.
(i)회수한 DNA 용액 4μl를 이용하여 직접 0.05mM dPa' TP 존재 하에서 시퀀스
(ii)회수한 DNA 용액 2μl를 이용하여 dDsTP, Diol1-dPxTP의 존재 하에서 Accuprim Pfx DNA 폴리메라제를 이용하여 15사이클의 PCR로 증폭 후, 겔 정제에 의해 회수한 단편을 10μl의 물에 녹이고, 그 용액 1-2μl를 이용하여 0.05mM dPa' TP 존재 하에서 0.05mM ddPa' TP 존재 하에서 시퀀스(회수한 DNA가 인공 염기 Ds를 보유하고 있으면, Ds는 PCR 중에도 보유됨)
(iii)회수한 DNA 용액 2μl를 이용하여 0.05mM dPa' TP 존재 하에서 ExTaqDNA 폴리메라제를 이용하여 15사이클의 PCR로 증폭 후, 겔 정제에 의해 회수한 단편을 10μl의 물에 녹이고, 그 용액 1~2μl를 이용하여 0.05mM dPa' TP 존재 하, 0.05mM ddPa' TP 존재 하에서 시퀀스(회수한 DNA가 인공 염기 Ds를 보유하고 있으면, Ds는 PCR 후에 A 혹은 T로 치환됨)
또, (ii) 및 (iii)에 관해서는 인공 염기 Ds측의 시퀀스(시퀀스 프라이머로서 Sequencing Primer 2: 5'-ACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3'(서열 번호 113)를 사용) 뿐만 아니라, Pa' 기질의 비존재 하에서 인공 염기 Diol1-Px측의 시퀀스(시퀀스 프라이머로서 Sequencing Primer 1: 5'-ACGCATGAACAAACTTGCTTG-3'(서열 번호 112))도 행하였다. (i)~(iii)의 시퀀스 패턴으로부터 8라운드 후의 라이브러리로부터 회수한 DNA 중에서 클로닝법에 따라 앱타머의 서열 중에서 A/T의 염기 변이가 보인 개소는 (A)Ds가 완전히 저장되어 있거나, (B)일부 천연형 염기 A 혹은 T로 치환되어 있기는 하지만 Ds가 일정한 비율로 보유되어 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 실시예에서 나타낸 수법에 의해 랜덤으로 도입한 Ds의 위치를 동정하는 것이 가능하였다. 또한, 실시예 1, 실시예 3에서 나타낸 바와 같이 Ds의 도입 위치를 미리 특정한 셀렉션의 경우에서도 차세대 시퀀서의 서열 해석으로부터 Ds의 도입 위치는 대부분이 A/T로 치환되어 있었다. 따라서, 본 실시예의 결과로부터 차세대 시퀀서에 의한 대량의 서열군을 해석하면, 중앙 영역 중에 도입되어 있고 또한 선택 과정에서 보존된 Ds의 위치는 셀렉션 후에 동정 가능하고, Ds를 랜덤 위치에 도입한 DNA를 라이브러리에 사용한 경우에서도 선택이 충분히 가능한 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 7: 각종 dPnTP 유도체의 조제>
실시예 1, 3, 5에서는 Ds를 제5번째 염기로서 셀렉션 라이브러리에 사용하였지만, Pn염기는 PCR에서 기능하는 Ds의 상보 염기이기 때문에, Pn을 제5번째 염기로서 라이브러리를 조제하여 셀렉션하는 것도 가능하다. 그리고, 인공 염기 Pn의 프로피닐기 끝에 여러 가지 치환기를 도입하는 것도 가능하다. 본 실시예에서는 명세서 중에 나타낸 각종 dPnTP 유도체의 조제를 나타낸다.
(1)시약 및 용매
시약 및 용매는 표준적인 공급업자로부터 구입하여 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 1H-NMR(300MHz), 31P-NMR(121MHz) 및 13C-NMR(75MHz) 스펙트럼은 BRUKER AV300 핵자기 공명 스펙트로미터 상에 기록하였다. 합성한 뉴클레오시드 유도체와 뉴클레오시드 5'-삼인산은 Gilson HPLC 시스템에서 정제를 행하였다. 고분해능 매스 스펙트럼(HR-MS, FAB)은 JEOL JM 700 혹은 JEOL GC mate 스펙트로미터 상에 기록하였다. 일렉트로 스프레이-이온화 매스 스펙트럼(MS, ESI)은 Waters2690LC 시스템을 수반한 Waters ZMD 4000 매스 시스템 혹은 Waters UPLC-MS(H class) 시스템 상에 기록하였다.
(2)dPnTP의 합성
(2-1)1-(2-데옥시-3-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤(200mg, 0.75mmol)을 피리딘으로 공비(共沸)한 후, 피리딘(7.5ml)을 가하고 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(280mg, 0.83mmol)를 가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산 에틸과 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 분액하고, 유기층을 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조 후, 감압 하에서 농축하고, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(염화 메틸렌:메탄올 200:1 v/v)로 정제하여 1-(2-데옥시-5-O-디메톡시트리틸-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤을 365mg(86%) 얻었다. 1-(2-데옥시-5-O-디메톡시트리틸-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤(160mg, 0.28mmol)을 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(2.8ml)을 가하고 무수 아세트산(53μl, 0.56mmol)을 가하여 반응 용액을 실온에서 12시간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산 에틸과 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 분액하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조 후 농축하여 톨루엔으로 공비한 후, 염화 메틸렌 28ml에 용해시켰다. 이 반응 용액에 디클로로 아세트산(280μl)을 0℃에서 가하여 15분간 빙냉(氷冷) 하에서 교반하였다. 5% 탄산 수소 나트륨 수용액을 반응 용액에 가하여 분액하고, 유기층을 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 감압 하에서 농축 후, 실리카 겔 칼럼으로 정제하여 1-(2-데옥시-3-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤을 78mg(89%) 얻었다.
(2-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤 5'-삼인산의 합성
1-(2-데옥시-3-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤(31mg, 0.1mmol)을 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(100μl)과 디옥산(300μl)을 가한 후, 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온(110μl, 1M 디옥산 용액)을 가하여 10분간 실온에서 교반하였다. 트리-n-부틸아민(100μl)과 비스(트리부틸암모늄) 피로포스페이트(300μl, 0.5M DMF 용액)를 반응 용액에 가하여 10분간 교반하였다. 요오드/피리딘(2.0ml, 1% 요오드의 피리딘:물 98:2 v/v용액)을 가하여 15분간 교반 후, 5% NaHSO3(150μl)를 가하여 반응 용액을 농축하였다. 물(5.0ml)을 가하여 실온에서 30분 교반 후, 28% 암모니아수를 20ml 가하여 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 용액을 농축, 동결 건조한 후, DEAE Sephadex A-25 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(50mM로부터 1.0M TEAB의 직선 기울기로 용출)와 RP-HPLC로 정제하고, 목적으로 하는 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤 5'-삼인산을 (31μmol, 31%) 얻었다.
(2-3)화합물의 물성값
(2-3-1)1-(2-데옥시-3-O-아세틸-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 7.90(d, 1H, J=2.1Hz), 7.30(d, 1H, J=2.1Hz), 6.60(t, 1H, J=6.4Hz), 5.22(m, 2H), 4.13(m, 1H), 3.65(m, 2H), 2.62(ddd, 1H, J=3.1, 6.1, 14.3Hz), 2.43(m, 1H), 2.08(s, 3H), 2.00(s, 3H). HR-MS(FAB, 3-NBA matrix) for C14H17N2O6(M+H)+calcd. 309.1087, found 309.1066.
(2-3-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-프로피닐-2-니트로피롤 5'-삼인산
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.74(d, 1H, J=2.1Hz), 7.35(d, 1H, J=2.1Hz), 6.76(t, 1H, J=6.1Hz), 4.63(m, 1H), 4.24(m, 3H), 3.21(q, 20H, J=7.3Hz), 2.64(ddt, 1H, J=5.2, 13.9Hz), 2.49(ddt, 1H, J=6.2, 14.0Hz), 1.99(s, 3H), 1.28(t, 29H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.16(d, 1P, J=19.8Hz), -10.66(d, 1P, J=20.0Hz), -22.58(t, 1P, J=20.0Hz). MS(ESI) for C12H17O14N2P3(M-H)-calcd. 504.97, found 504.82 (M-H)-. UV(10mM sodium phophate buffer, pH 7.0) λmax=373nm(ε9500).
(3)NH2-C1-dPnTP의 합성
(3-1)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-(트리플루오로아세타미드)-1-프로피닐)-2-니트로피롤(TFA-NH-C1-dPn)의 합성
무수 아세트산(4.6ml, 33mmol)의 염화 메틸렌(30ml) 용액을 프로파길아민(1.0ml, 15mmol), 염화 메틸렌(30ml), 피리딘(3.7ml)의 용액에 0℃로 가하였다. 반응 용액을 실온에서 12시간 교반하였다. 생성물을 염화 메틸렌과 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 분액하고, 유기층을 5% 탄산 수소 나트륨으로 세정 후, 무수 황산 나트륨으로 건조하였다. 유기층을 감압 하에서 농축한 후, TFA-NH 링커를 얻었다(925mg). TFA-NH-linker(227mg, 1.5mmol)를 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤(354mg, 1.0mmol), CuI(30mg, 0.16mmol), Pd(PPh3)4(58mg, 0.05mmol), TEA(209μl, 1.5mmol)의 DMF(5.0ml) 용액에 가하였다. 반응 용액을 실온에서 12시간 교반한 후, 감압 하에서 농축하였다. TFA-NH-C1-dPn(330mg, 88%)은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(10%의 메탄올/염화 메틸렌 용액으로 용출) 및 RP-HPLC(35-50% CH3CN in H2O, 12min)로 정제하여 얻었다.
(3-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-아미노-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(NH2-C1-dPnTP)의 합성
TFA-NH-C1-dPn 뉴클레오시드(75mg, 0.2mmol)를 피리딘, 톨루엔으로 공비 건조한 후, proton sponge(66mg, 0.3mmol)를 가하여 (CH3O)3PO(1.0ml)에 용해하였다. POCl3(26μl, 0.26mmol)를 가하여 0℃에서 1시간 교반하였다. 반응 용액에 tri-n-butylamine(240μl)과 피로인산 비스(트리-n-부틸암모늄)(2.0ml, 0.5M DMF solution)을 가하여 30분 교반 후, 0.5M 탄산 트리에틸 암모늄 완충액(TEAB)(1ml)과 물(10ml)을 가하였다. 반응 용액을 실온에서 1시간 교반한 후, 반응 용액을 동결 건조하였다. 잔사에 H2O(10ml)를 가한 후, 28% NH4OH(40ml)를 가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 용액을 감압 하에서 농축한 후, NH2-C1-dPnTP(54μmol, 27%)은 DEAE sephadex A-25 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(eluted with 50mM to 1.0M TEAB linear gradient)와 RP-HPLC(28% CH3CN in 100mM TEAA, 15min)로 정제하여 얻었다.
(3-3)화합물의 물성값
(3-3-1)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[3-(트리플루오로아세타미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤(TFA-NH-C1-dPn)
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 10.04(s, 1H), 7.98(s, 1H), 7.34(s, 1H), 6.54(t, 1H, J=5.5Hz), 5.27(d, 1H, J=4.4Hz), 5.10(t, 1H, J=4.9Hz), 4.22(bs, 3H), 3.84(m, 1H), 3.67-3.54(m, 2H), 2.44(m, 1H), 2.26(m, 1H). HRMS(FAB, 3-NBA matrix) for C14H15F3N3O6(M+H)+calcd. 378.0913, found 378.0882.
(3-3-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-아미노-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(NH2-C1-dPnTP)
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.96(d, 1H, J=2.1Hz), 7.32(d, 1H, J=2.2Hz), 6.67(t, 1H, J=6.4Hz), 4.55(m, 1H), 4.24-4.12(m, 3H), 3.91(s, 2H), 3.11(q, 16H, J=7.3Hz), 2.58(dt, 1H, J=6.3 and 13.8Hz), 2.41(ddd, 1H, J=1.6, 4.8, and 14.0Hz), 1.19(t, 24H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -8.51(bs, 1P), -10.70(d, 1P, J=19.4Hz), -22.19(t, 1P, J=19.9Hz). MS(ESI) for C12H18O14N3P3(M-H) -calcd. 520.20, found, 520.24. UV(10mM sodium phophate buffer, pH 7.0) λmax=364nm(ε10, 600).
(4)NH2-C3-dPnTP의 합성
(4-1)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-트리플루오로아세타미드-1-펜티닐]-2-니트로피롤의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤(373mg, 1.05mmol)의 DMF 용액(5.3ml)에 요오드화 구리(I)(32mg, 168μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(0)(61mg, 53μmol)을 가하고, 트리에틸아민(220μl, 1.6mmol)을 더 가하여 아르곤 분위기 하에서 실온에서 교반하였다. 5-트리플루오로아세타미드-1-펜틴1)(283mg, 1.6mmol)의 DMF 용액(3.0ml)을 이 용액에 적하하고, 실온에서 19시간 교반하였다. 감압 하에서 농축한 후에, 조생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(전개 용매; 디클로로메탄:메탄올=100:0→90:10) 및 C18-HPLC에 의해 정제하여 목적물(355mg, 수율 83%)을 얻었다.
(4-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-아미노-1-펜티닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(NH2-C3-dPnTP)의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(5-트리플루오로아세타미드-1-펜티닐)-2-니트로피롤(101mg, 250μmol)을 무수 피리딘으로 2회, 무수 톨루엔으로 2회 공비시켰다. 잔사와 Proton sponge(80mg, 375μmol)를 인산 트리메틸(1.25ml)에 용해시키고, 옥시 염화 인(30μl, 325μmol)을 가하여 0℃에서 1시간 교반한 후에, 트리-n-부틸아민(300μl, 1.25mmol) 및 피로인산 비스(트리-n-부틸암모늄)의 0.5M DMF 용액(2.5ml)을 가하여 30분간 교반하였다. 이에 0.5M 탄산 트리에틸암모늄 완충액(TEAB)(1.25ml)을 가하여 반응을 정지시키고, 물(12.5ml)을 가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 이 용액에 진한 암모니아수(50ml)를 가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 용액을 감압 농축 후, 잔사를 폴리스티렌 칼럼 크로마토그래피(1.5×20cm, 0-15% 아세토니트릴의 50mM TEAB 용액) 및 DEAE Sephadex A-25 칼럼 크로마토그래피(1.5×30cm, 농도 직선 기울기; TEAB의 50mM-0.8M 용액)로 정제를 행하였다. DEAE 정제 후에 얻어진 NH2-C3-dPnTP의 일부(합성량의 3/5)를 C8-HPLC(SensyuPak, 농도 기울기; 2.5%-50% 아세토니트릴의 100mM 아세트산 트리에틸암모늄 완충액(pH 7.0))으로 정제(37.8μmol)하였다.
(4-3)화합물의 물성값
(4-3-1)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-트리플루오로아세타미드-1-펜티닐]-2-니트로피롤
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 9.47(brs, 1H), 7.91(d, 1H, J=2.2Hz), 7.27(d, 1H, J=2.2Hz), 6.55(t, 1H, J=5.7Hz), 5.29(d, 1H, J=4.5Hz), 5.10(t, 1H, J=5.2Hz), 4.24(m, 1H), 3.85(dt, 1H, J=4.1, 3.9Hz), 3.66(ddd, 1H, J=12.1, 5.2, 3.7Hz), 3.57(ddd, 1H, J=12.1, 4.9, 4.8Hz), 3.29(m, 2H), 2.48-2.39(m, 1H), 2.42(t, 2H, J=7.0Hz), 2.23(ddd, 1H, J=13.4, 5.8, 5.7Hz), 1.73(m, 2H). HRMS(FAB, 3-NBA matrix) for C16H19F3N3O6(M+H)+calcd. 406.1226, found　406.1225.
(4-3-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-아미노-1-펜티닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(NH2-C3-dPnTP).
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.87(d, 1H, J=1.6Hz), 7.25(d, 1H, J=2.0Hz), 6.68(t, 1H, J=5.8Hz), 4.56(m, 1H), 4.24-4.13(m, 3H), 3.11(q, J=7.3Hz, the signals of NH2CH2-　were superimposed), 2.65-2.36(m, 4H), 1.85(m, 2H), 1.19(t, 22H, J=7.4Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -9.15(1P), -11.13(d, 1P, J=19.4Hz), -22.61(t, 1P, J=20.0Hz). MS(ESI) for C14H21N3O14P3(M-H)-calcd. 548.02, found 548.09. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax=374nm(ε10,600).
(5)Diol3o3-dPnTP의 합성
(5-1)5-(4-펜티닐옥시)펜탄-1,2-디아세테이트(Di(OAc)3o3 linker)의 합성
4-pentyne-1-ol(4.65ml, 50mmol), 5-bromo-1-pentene(17.8ml, 150mmol), KOH(12.6g, 225mmol)의 벤젠(50ml) 용액을 12시간 가열 환류하였다. 여과 후, 반응 용액을 아세트산 에틸과 10% 염화 암모늄 수용액으로 분액하였다. 유기층을 10% 염화 암모늄 수용액, 포화 염화 나트륨 수용액으로 세정하고, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 감압 하에서 농축하였다. 5-(4-펜티닐옥시)-1-펜텐(6.5g)은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(10% EtOAc의 헥산 용액으로 용출)로 조정제(粗精製)하였다. OsO4(543mg, 2.0mmol)를 5-(4-펜티닐옥시)-1-펜텐(6.5g)과 N-메틸모르포린-N-옥사이드(10.0g, 85.4mmol)의 아세톤/H2O/tBuOH(4:1:1, 214ml) 용액에 가하여 실온에서 1시간 교반하였다. NaHSO3(1.5g)를 가한 후 생성된 침전을 여과하여 제거하고, 메탄올로 세정하여 여과액을 감압 하에서 농축하였다. 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(3% 메탄올의 염화 메틸렌 용액으로 용출)로 조정제하여 5-(4-펜티닐옥시)펜탄-1,2-디올(2.9g)을 얻었다. 5-(4-펜티닐옥시)펜탄-1,2-디올(2.9g)을 피리딘으로 공비 건조한 후, 피리딘(78ml)을 가하여 무수 아세트산(5.9ml, 62.4mmol)을 가하였다. 반응 용액을 실온에서 9시간 교반하고, 생성물을 아세트산 에틸과 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 감압 하에서 농축하였다. 5-(4-펜티닐옥시)펜탄-1,2-디아세테이트(Di(OAc) 3o3 linker)(3.27g, 24% 3steps)는 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(20% 헥산의 염화 메틸렌 용액으로 용출)로 정제하여 얻었다.
(5-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-(4-펜티닐옥시)펜탄-1,2-디아세테이트)-1-프로피닐]-2-니트로피롤(Di(OAc)3o3-dPn)의 합성
Di(OAc)3o3 linker(180mg, 0.7mmol)를 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤(177mg, 0.5mmol), CuI(19mg, 0.1mmol), Pd(PPh3)4(29mg, 0.025mmol), TEA(104μl, 0.75mmol)의 DMF(2.5ml) 용액에 가하였다. 반응 용액을 실온에서 13시간 교반하고 감압 하에서 농축하였다. 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(5% 메탄올의 염화 메틸렌 용액으로 용출)와 RP-HPLC(50-55% 아세토니트릴의 수용액을 직선 기울기 10분간으로 용출)로 정제하여 Di(OAc)3o3-dPn(60mg, 24%)를 얻었다.
(5-3)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-(4-펜티닐옥시)펜탄-1,2-디올)-1-프로피닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(Diol3o3-dPnTP)의 합성
Di(OAc)3o3-dPn 뉴클레오시드(50mg, 0.1mmol)를 피리딘 및 톨루엔에 의해 공비 건조하였다. proton sponge(33mg, 0.15mmol)를 가하여 (CH3O)3PO(500μl)에 용해하였다. POCl3(13μl, 0.13mmol)를 이 용액에 0℃에서 가하여 1.5시간 교반하였다. 트리-n-부틸아민(120μl)과 비스-트리-n-부틸암모늄 피로포스페이트(1.0ml, 0.5M DMF solution)를 반응 용액에 가하여 30분 교반하였다. 500μl의 0.5M 탄산 트리에틸암모늄 완충액(TEAB)과 물(5.0ml)을 반응 용액에 가하고 0℃에서 30분 교반하였다. 동결 건조 후, 잔사에 H2O(2.0ml)을 가하고 28% NH4OH(20ml)를 가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 용액을 감압 하에서 농축 후, 생성물은 DEAE sephadex A-25 이온 교환 크로마토그래피(50mM-1.0M TEAB 직선 기울기로 용출) 및 RP-HPLC(5-50% 아세토니트릴의 100mM TEAA 용액으로 12분에 용출)로 정제하여 Diol3o3-dPnTP(18μmol, 18%)를 얻었다.
(5-4)화합물의 물성값
(5-4-1)5-(4-펜티닐옥시)펜탄-1,2-디아세테이트(Di(OAc)3o3 linker)
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 4.96(m, 1H), 4.16(dd, 1H, J=3.3, 12.0Hz), 4.01(dd, 1H, J=6.4, 11.9Hz), 3.39(t, 2H, J=6.4Hz), 3.33(t, 2H, J=6.2Hz), 2.74(t, 1H, J=2.7Hz), 2.18(dt, 2H, J=2.6, 7.2Hz), 1.66-1.45(m, 6H). HR-MS(FAB, NBA matrix) for C14H23O5(M+H)+calcd. 271.1545, found 271.1592.
(5-4-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-(4-펜티닐옥시)펜탄-1,2-디아세테이트)-1-프로피닐]-2-니트로피롤(Di(OAc)3o3-dPn)
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 7.91(d, 1H, J=2.2Hz), 7.28(d, 1H, J=2.2Hz), 6.55(t, 1H, J=5.7Hz), 5.29(d, 1H, J=4.5Hz), 5.10(t, 1H, J=5.2Hz), 4.97(m, 1H), 4.24(m, 1H), 4.16(dd, 1H, J=3.3, 12.0Hz), 4.01(dd, 1H, J=6.5, 11.9Hz), 3.85(m, 1H), 3.70-3.53(m, 2H), 3.44(t, 2H, J=6.2Hz), 3.36(t, 2H, J=6.1Hz), 2.45-2.39(m, 3H), 2.28-2.19(m, 2H), 2.01, 2.00(s, s, 3H, 3H), 1.76-1.47(m, 6H). HR-MS(FAB, NBA matrix) for C23H33N2O10(M+H)+calcd. 497.2135, found 497.2110.
(5-4-3)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-(4-펜티닐옥시)펜탄-1,2-디올)-1-프로피닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(Diol3o3-dPnTP)
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.73(d, 1H, J=2.1Hz), 7.37(d, 1H, J=2.1Hz), 6.76(t, 1H, J=6.1Hz), 4.62(m, 1H), 4.26-4.20(m, 3H), 3.72-3.42(m, 7H), 3.20(q, 22H, J=7.3Hz), 2.64(m, 1H), 2.53-2.44(m, 3H), 1.89-1.41(m, 6H), 1.28(t, 32H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.07(d, 1P, J=19.7Hz), -10.63(d, 1P, J=20.1Hz), -22.55(t, 1P, J=20.0Hz). MS(ESI) for C19H30N2O17P3(M-H) -calcd. 651.37, found 651.39. UV(10mM sodium phosphate buffer pH 7.0) λmax=374nm(ε9,200).
(6)Diox6-dPnTP의 합성
(6-1)2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란(Diox6 링커)의 합성
8-브로모-1-옥텐(839μl, 5.0mmol)을 lithiumacetylide etylenediamine complex(563mg, 5.5mmol)의 DMSO(25ml) 용액에 가하였다. 반응 용액을 10℃에서 2시간 교반하였다. 생성물은 에테르와 물로 분액한 후, 유기층을 물로 세정하고, 무수 황산 나트륨으로 건조 후 감압 하에서 농축하였다. 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(25% 헥산의 염화 메틸렌 용액으로 용출)로 조정제하여 dec-1-en-9-yne(457mg, 67%)를 얻었다. OsO4(42mg, 0.17mmol)를 dec-1-en-9-yne(450mg) 및 N-메틸모르포린-N-옥사이드(775mg, 6.6mmol)의 아세톤/H2O/tBuOH(4:1:1, 16.5ml) 용액에 가하여 실온에서 30분 교반하였다. 반응 용액에 115mg의 NaHSO3를 가한 후, 생성된 침전을 여과로 제거하였다. 침전을 메탄올로 세정하고, 여과액을 모아 감압 하에서 농축하였다. 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(3% 메탄올의 염화 메틸렌 용액으로 용출)에 의해 조정제하여 dec-9-yne-1, 2-diol를 얻었다. dec-9-yne-1, 2-diol의 아세톤/H2O(7:3, 33ml) 용액에 NaIO4(10mg, 4.8mmol)를 가하여 실온에서 12시간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산 에틸과 물로 분액하고, 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 감압 하에서 농축하여 310mg의 non-8-ynal(68%, 2단계 수율)를 얻었다. non-8-ynal(310mg)와 p-톨루엔 술폰산-수화물(42mg, 0.22mmol), 에틸렌글리콜(279mg, 4.5mmol)의 벤젠(11ml) 용액을 2시간 가열 환류하였다. 반응 용액을 감압 하에서 농축하고, 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(염화 메틸렌으로 용출)로 정제하여 2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란(310mg, 76%)을 얻었다.
(6-2)4-(2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(Diox-C6CC-dPn)의 합성
2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란(137mg, 0.37mmol)을 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤(177mg, 0.5mmol), CuI(15mg, 0.08mmol), Pd(PPh3)4(29mg, 0.025mmol), TEA(105μl, 0.75mmol)의 DMF(2.5ml) 용액에 가하여 실온에서 12시간 교반하였다. 반응 용액을 감압 하에서 농축한 후, 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(2% 메탄올의 염화 메틸렌 용액으로 용출) 및 C18 RP-HPLC(54%-55% 아세토니트릴 수용액)로 정제하여 4-(2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(Dio-C6CC-dPn)을 180mg(88%의 수율) 얻었다.
(6-3)4-(2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Diox6-dPnTP)의 합성
4-(2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(82mg, 0.2mmol)을 피리딘 및 톨루엔으로 공비 건조한 후, proton sponge(66mg, 0.3mmol)와 (CH3O)3PO(1.0ml)를 가하였다. 이 용액에 POCl3(26μl, 0.26mmol)를 가하여 0℃에서 1.5시간 교반하였다. 이 반응 용액에 트리-n-부틸아민(240μl)과 비스-트리-n-부틸암모늄 피로포스페이트(2.0ml, 0.5M DMF 용액)를 가하여 30분 교반하였다. 1ml의 0.5M 탄산 트리에틸암모늄 완충액(TEAB)과 물(10ml)을 반응 용액에 가하여 0℃에서 30분 교반하였다. 생성물은 DEAE sephadex A-25 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(50mM-1.0M TEAB 직선 기울기로 용출) 및 RP-HPLC로 정제하여 4-(2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Diox6-dPnTP)(수량 29μmol)을 얻었다.
(6-4)화합물의 물성값
(6-4-1)2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란(Diox6-링커)
1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 4.86(t, 1H, J=4.8Hz), 3.99-3.86(m, 4H), 2.20(dt, 2H, J=2.6, 7.1Hz), 1.95(t, 1H, J=2.7Hz), 1.66(m, 2H), 1.58-1.39(m, 8H). HR-MS(FAB, NBA matrix) for C11H19O2(M+H)+calcd. 183.1385, found 183.1579.
(6-4-2)4-(2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(Diox6-dPn)
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 7.90(d, 1H, J=2.2Hz), 6.27(d, 1H, J=5.8Hz), 5.28(d, 1H, J=4.5Hz), 5.10(t, 1H, J=5.2Hz), 4.75(t, 1H, J=4.8Hz), 4.24(m, 1H), 3.88-3.53(m, 7H), 2.43(m, 1H), 2.36(t, 2H, J=7.1Hz), 2.23(m, 1H), 1.56-1.34(m, 10H). HR-MS(FAB, NBA matrix) for C20H29O7N2(M+H)+calcd. 409.1975, found 409.1979.
(6-4-3)4-(2-(7-옥티닐)-1,3-디옥소란)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Diox6-dPnTP)
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.72(d, 1H, J=2.1Hz), 7.37(d, 1H, J=2.1Hz), 6.77(t, 1H, J=6.1Hz), 4.93(t, 1H, J=5.0Hz), 4.63(m, 1H), 4.27-4.18(m, 3H), 4.08-3.87(m, 4H), 3.21(q, 19H, J=7.3Hz), 2.65(dt, 1H, J=6.1Hz), 2.48(dt, 1H, J=6.2Hz), 2.40(t, 2H, J=7.0Hz), 1.69(m, 2H), 1.59(m, 2H), 1.50-1.42(m, 6H), 1.29(t, 28H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.23(d, 1P, J=19.6Hz), -10.63(d, 1P, J=19.7Hz), -22.59(t, 1P, J=19.8Hz). MS(ESI) for C20H31N2O16P3(M-H)-calcd. 647.09, found 647.14. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax=373nm(ε9900).
(7)Diol6-dPnTP의 합성
(7-1)9-데신-1,2-디일 디아세테이트의 합성
8-브로모-1-옥텐(839μl, 5.0mmol)을 lithiumacetylide etylenediamine complex(563mg, 5.5mmol)의 DMSO(5ml) 용액에 가하여 10℃에서 2시간 교반하였다. 반응 용액을 에테르와 물로 분액하고, 유기층을 물로 세정하여 무수 황산 나트륨으로 건조 후, 감압 하에서 농축하였다. 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(헥산으로 용출)로 정제하여 dec-1-en-9-yne(633mg, 93%)을 얻었다. OsO4(58mg, 0.23mmol)를 dec-1-en-9-yne(630mg), N-메틸모르포린-N-옥사이드(1.08g, 9.2mmol)의 아세톤/H2O/tBuOH(4:1:1, 23ml) 용액에 가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 160mg의 NaHSO3를 가한 후, 생성된 침전을 여과로 제거하였다. 침전을 메탄올로 세정 후, 여과액을 모아 감압 하에서 농축하였다. 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(3% 메탄올의 염화 메틸렌 용액으로 용출)로 정제하여 dec-9-yne-1, 2-diol(494mg)를 얻었다. dec-9-yne-1, 2-diol(494mg)을 피리딘으로 공비한 후, 피리딘(10ml)을 가하였다. 무수 아세트산(2.17ml, 23mmol)을 가하여 실온에서 13시간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산 에틸과 5% 탄산 수소 나트륨으로 분액하고, 유기층을 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 세정하여 무수 황산 나트륨으로 건조 후, 감압 하에서 농축하였다. 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(1% 메탄올의 염화 메틸렌 용액으로 용출)로 정제하여 9-데신-1,2-디일 디아세테이트(414mg, 35%, 2단계 수율)를 얻었다.
(7-2)4-(9-데신-1,2-디일 디아세테이트)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(Di-OAc-6-dPn)의 합성
9-데신-1,2-디일 디아세테이트(381mg, 1.5mmol)를 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤(354mg, 1.0mmol), CuI(38mg, 0.2mmol), Pd(PPh3)4(58mg, 0.05mmol), TEA(208μl, 1.5mmol)의 DMF(5.0ml) 용액에 가하여 실온에서 20시간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산 에틸과 물로 분액하고, 유기층을 물로 세정하여 무수 황산 나트륨으로 건조 후, 감압 하에서 농축하였다. 생성물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(3% 메탄올의 염화 메틸렌 용액으로 용출) 및 RP-HPLC(55% 아세토니트릴 수용액)로 정제하여 4-(9-데신-1,2-디일 디아세테이트)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(Di-OAc-6-dPn)을 500mg(99%의 수율) 얻었다.
(7-3)4-(9-데신-1,2-디올)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Diol6-dPnTP)의 합성
4-(9-데신-1,2-디일 디아세테이트)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(48mg, 0.1mmol)을 피리딘과 톨루엔으로 공비 건조한 후, proton sponge(33mg, 0.15mmol)와 (CH3O)3PO(500μl)를 가하였다. 이 용액에 POCl3(13μl, 0.13mmol)를 0℃에서 가하여 1.5시간 교반하였다. 트리-n-부틸아민(120μl)과 비스-트리-n-부틸암모늄 피로포스페이트(1.0ml, 0.5M DMF solution)를 가하여 30분 교반한 후, 500μl의 0.5M 탄산 트리에틸암모늄 완충액(TEAB)과 물(5.0ml)을 가하여 0℃에서 30분 교반하였다. 동결 건조 후, H2O(2.0ml)와 28% NH4OH(20ml)를 가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 감압 하에서 농축 후, 생성물은 DEAE sephadex A-25 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(50mM-1.0M TEAB 직선 기울기로 용출) 및 RP-HPLC(5-50% 아세토니트릴의 100mM TEAA, 12분)로 정제하여 4-(9-데신-1,2-디올)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Diol6-dPnTP)을 18μmol(18%의 수율) 얻었다.
(7-4)화합물의 물성값
(7-4-1)9-데신-1,2-디일 디아세테이트 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 4.94(m, 1H), 4.07(ddd, 2H, J=3.2, 6.5, 48.3Hz), 2.72(t, 1H, J=2.7Hz), 2.13(dt, 2H, J=2.6, 6.8Hz), 2.00(s, 3H9, 1.99(s, 3H), 1.52-1.25(m, 10H). HR-MS(FAB, NBA matrix) for C14H23O4(M+H)+calcd. 255.1596, found 255.1605.
(7-4-2)4-(9-데신-1,2-디일 디아세테이트)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤(Di-OAc-6-dPn) 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 7.89(d, 1H, J=2.2Hz), 7.26(d, 1H, J=2.2Hz), 6.54(t, 1H, J=5.8Hz), 5.27(d, 1H, J=4.5Hz), 5.09(t, 1H, J=5.2Hz), 4.94(m, 1H), 4.23(m, 1H), 4.07(ddd, 2H, J=3.2, 6.5, 48.8Hz), 3.83(m, 1H), 3.68-3.52(m, 2H), 2.42(m, 1H), 2.35(t, 2H, J=7.1Hz), 2.22(m, 1H), 2.00(s, 3H), 1.99(s, 3H), 1.52-1.28(m, 10H). HR-MS(FAB, NBA matrix) for C23H33O9N2(M+H)+calcd. 481.2186, found 481.2206.
(7-4-3)4-(9-데신-1,2-디올)-1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Diol6-dPnTP) 1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.72(d, 1H, J=2.1Hz), 7.35(d, 1H, J=2.1Hz), 6.76(t, 1H, J=6.1Hz), 4.62(m, 1H), 4.26-4.20(m, 3H), 3.70(m, 1H), 3.59(dd, 1H, J=3.8, 11.6Hz), 3.46(dd, 1H, J=6.9, 11.6Hz), 3.20(q, 20H, J=7.3Hz), 2.64(dt, 1H, J=6.2, 13.0Hz), 2.47(dt, 1H, J=6.2, 14.0Hz), 2.40(t, 2H, J=7.0Hz), 1.60-1.25(m, 10H), 1.28(t, 30H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.20(d, 1P, J=19.9Hz), -10.64(d, 1P, J=20.1Hz), -22.59(t, 1P, J=20.0Hz). MS(ESI) for C19H31N2O16P3(M-H)-calcd. 635.08, found. 635.08. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax=374nm(ε9400).
(8)COOH-C1-dPnTP의 합성
(8-1)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-카르복시 프로파나미드-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(COOH-C1-dPnTP)의 합성
NH2-C1-dPnTP(10μmol)의 200mM TEAA(pH 7.0, 500μl) 용액에 무수 숙신산(4mg, 40μmol)의 DMSO(500μl) 용액을 가하여 실온에서 1시간 정치하였다. 동결 건조 후, HPLC(100mM 아세트산 트리에틸암모늄 중의 0% 내지 30% 아세토니트릴의 직선 기울기를 10분간 걸쳐 용출함)로 정제하여 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-카르복시 프로파나미드-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(COOH-C1-dPnTP)을 8.4μmol(84%의 수율) 얻었다.
(8-2)화합물의 물성값
(COOH-C1-dPnTP) 1H-NMR(300MHz, D2O) δ (ppm) 7.73(1H, d, J=2.0Hz), 7.36(d, 1H, J=2.0Hz), 6.70(t, 1H, J=5.9 and 6.3Hz), 4.59-4.54(m, 1H), 4.21-4.15(m, 3H), 4.10(s, 2H), 3.15(q, 24H, J=7.3Hz), 2.64-2.55(m, 1H), 2.48-2.39(m, 5H), 1.23(t, 36H, J=7.3Hz). 31P-NMR(121MHz, D2O) δ (ppm) -10.66(d, 1P, J=19.6Hz), -11.27(d, 1P, J=19.9Hz), -23.16(t, 1P, J=19.8 and 20.1Hz). MS(ESI) for C16H21O17N3P3(M-H)-calcd. 620.01, found 619.91. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax 365nm(ε9800).
(9)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-(2-피리딜 디티오)프로파나미드-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(PDP-C1-dPnTP)의 합성
(9-1)PDP-C1-dPnTP의 합성
NH2-C1-dPnTP(20μmol)의 0.1M NaHCO3-Na2CO3 버퍼 용액(pH 8.5, 600μl)에 숙신이미딜 3-(2-피리딜 디티오)-프로피오네이트(PDP-SE, Invitrogen)(12.5mg, 40μmol)의 DMF(300μl) 용액을 가하여 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 용액에 28% 암모니아수를 1ml 가하여 반응을 정지하고 동결 건조하였다. 생성물은 DEAE Sephadex A-25 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(1.5cm×30cm, 50mM-1.0M TEAB 직선 기울기로 용출) 및 C18 HPLC로 정제하여 3.8μmol의 PDP-dPnTP(19%)를 얻었다.
(9-2)화합물의 물성값
PDP-C1-dPnTP: 1H NMR(300MHz, D2O) δ 8.38(m, 1H), 7.89-7.83(m, 2H), 7.80(d, 1H, J=2.1Hz), 7.38(d, 1H, J=2.1Hz), 7.29(m, 1H), 6.75(t, 1H, J=6.0Hz), 4.62(m, 1H), 4.23(m, 3H), 4.08(s, 2H), 3.21(q, 19H, J=7.3Hz), 3.12(t, 2H, J=6.7Hz), 2.69(t, 2H, J=6.6Hz), 2.62(m, 1H), 2.49(m, 1H), 1.29(t, 30H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.02(d, 1P, J=19.9Hz), -10.68(d, 1P, J=20.0Hz), -22.48(t, 1P, J=19.9Hz). MS(ESI) for C20H24N4O15P3S2(M-H)-calcd. 717.00, found 717.08. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax 285nm(ε7600), 365nm(ε10700).
(10)아미노산 결합-C1-dPnTP(a.a.-C1-dPnTP)의 합성
(10-1)Fmoc-아미노산 숙신이미드에스테르(Fmoc-a.a.-SE)의 합성
Fmoc-L-아미노산(0.5mmol), 1-히드록시숙신이미드(0.6mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(0.6mmol)의 DMF(1ml) 용액을 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 용액을 물 30ml에 가하여 생긴 침전을 여과하고 물로 세정하여 감압 하에서 건조하였다. Fmoc-His(Fmoc)-SE, Fmoc-Ser(OTBDMS)-SE 및 Fmoc-Lys(Fmoc)-SE는 반응 후 아세트산 에틸과 물로 분액하고, 유기상을 물로 2회 세정 후 황산 나트륨으로 건조하였다. 유기상을 감압 하에서 농축하고, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(1% 메탄올의 염화 메틸렌 용액으로 용출)로 정제하여 얻었다. Fmoc-Phe-SE(195mg, 81%), Fmoc-Tyr-SE(216mg, 86%), Fmoc-Trp-SE(219mg, 84%), Fmoc-His(Fmoc)-SE(200mg, 57%), Fmoc-Ser(TBDMS)-SE(222mg, 82%), Fmoc-Lys(Fmoc)-SE(278mg, 81%).
(10-2)아미노산 결합-C1-dPnTP(a.a.-C1-dPnTP)의 합성
(10-2-1)Phe-, Tyr- 및 Trp-C1-dPnTP:
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-아미노-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(19μmol)의 DMF(1ml) 용액에 Fmoc-아미노산 숙신이미드에스테르(Fmoc-a.a.-SE)(29μmol)의 DMF(1ml) 용액을 가하여 실온에서 12시간 정치하였다. 반응 용액에 피페리딘(100μl)을 가하여 실온에서 3분간 교반하였다. 반응 용액에 물(2ml)을 가한 후, 아세트산 에틸(4ml)로 3회 세정하였다. 수상(水相)에 물(10ml)과 2M TEAB(100μl)를 가하여 동결 건조하였다. DEAE Sephadex A-25 column(50mM 내지 1M TEAB 직선 기울기로 용출)로 정제한 후, HPLC로 정제하여 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-(L-티로시나미드)-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Tyr-C1-dPnTP, 11.3μmol, 수율 59%, HPLC: 100mM 트리에틸아민 아세트산 버퍼 중에서 0 내지 40% 아세토니트릴의 직선 기울기를 15분간 걸쳐 용출), 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-(L-트립토파나미드)-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Trp-C1-dPnTP, 12.1μmol, 수율 64%, HPLC: 100mM 트리에틸아민 아세트산 버퍼 중에서 10 내지 50% 아세토니트릴의 직선 기울기를 10분간 걸쳐 용출), 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-(L-페닐아라니나미드)-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Phe-C1-dPnTP, 11.4μmol, 수율 60%, HPLC: 100mM 트리에틸아민 아세트산 버퍼 중에서 0 내지 50% 아세토니트릴의 직선 기울기를 10분간 걸쳐 용출)을 얻었다.
(10-2-2)His-, Ser-C1-dPnTP:
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-아미노-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(19μmol)의 DMF(1ml) 용액에 Fmoc 아미노산 숙신이미드에스테르(Fmoc-a.a.-SE)(29μmol)의 DMF(1ml) 용액을 가하여 실온에서 24시간 교반하였다. 물을 8ml 가하여 아세트산 에틸 4ml로 1회 세정하였다. 수상에 포함되는 Fmoc기를 포함하는 삼인산을 HPLC에 의해 정제 후(히스티딘: 100mM 트리에틸아민 아세트산 버퍼 중에서 20 내지 50% 아세토니트릴의 직선 기울기를 10분간 걸쳐 용출, 세린: 100mM 트리에틸아민 아세트산 버퍼 중에서 30% 아세토니트릴을 10분간 걸쳐 용출) 동결 건조하였다. 잔사를 DMF(2.0ml)에 용해하고, 피페리딘(100μl)으로 실온 하에서 5분간 처리하였다. H2O(4.0ml)를 가한 후, 아세트산 에틸(4ml)로 3회 세정하였다. 수상에 H2O(4ml)와 2M TEAB(100μl)를 가하여 동결 건조하였다. DEAE Sephadex A-25 column(50mM 내지 1M TEAB 직선 기울기로 용출)로 정제한 후, HPLC로 정제하여 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-(L-히스티디나미드)-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(His-C1-dPnTP, 8.8μmol, 수율 46%, HPLC: 100mM 트리에틸아민 아세트산 버퍼 중에서 0 내지 40% 아세토니트릴의 직선 기울기를 15분간 걸쳐 용출) 및 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(3-(L-세리나미드)-1-프로피닐)-2-니트로피롤 5'-삼인산(Ser-C1-dPnTP, 10.3μmol, 수율 54%, HPLC: 100mM 트리에틸아민 아세트산 버퍼 중에서 0 내지 30% 아세토니트릴의 직선 기울기를 13분간 걸쳐 용출)을 얻었다.
(10-3)화합물의 물성값
(10-3-1)Fmoc-아미노산 숙신이미드에스테르(Fmoc-a.a.-SE)
Fmoc-Phe-SE: 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.24(d, 1H, J=8.5Hz), 7.88(d, 2H, J=7.5Hz), 7.62(dd, 2H, J=2.9 and 7.4Hz), 7.43-7.21(m, 9H), 4.73-4.65(m, 1H), 7.29-4.14(m, 3H), 3.25(dd, 1H, J=4.3 and 13.8Hz), 3.05(dd, 1H, J=11.0 and 13.8Hz), 2.84(s, 4H). Fmoc-Tyr-SE: 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 9.23(s, 1H), 8.19(d, 1H, J=8.5Hz), 7.89(d, 2H, J=7.5Hz), 7.65-7.60(m, 2H), 7.44-7.39(m, 2H), 7.34-7.27(m, 2H), 7.14(d, 2H, J=8.4Hz), 7.68(d, 2H, J=8.5Hz), 4.61-4.53(m, 1H), 4.26-4.15(m, 3H), 3.12(dd, 1H, J=4.3 and 13.8Hz), 2.92(dd, 1H, J=10.7 and 13.8Hz), 2.83(s, 4H). Fmoc-Trp-SE: 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 0.95(s, 1H), 8.24(d, 1H, J=8.2Hz), 7.88(d, 2H, J=7.6Hz), 7.65-7.57(m, 3H), 7.44-7.24(m, 6H), 7.10(t, 1H, J=7.9Hz), 7.01(t, 1H, J=7.5Hz), 4.70-4.63(m, 1H), 4.29-4.18(m, 3H), 3.39(m, 1H), 3.21(m, 1H), 2.84(s, 4H). Fmoc-Ser(OTBDMS)-SE: 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.11(d, 1H, J=8.5Hz), 7.90(d, 2H, J=7.5Hz), 7.72(t, 2H, J=6.6Hz), 7.42(t, 2H, J=7.4Hz), 7.32(dt, 2H, J=1.0 and 7.4Hz), 4.63-4.56(m, 1H), 4.35-4.22(m, 3H), 4.00-3.88(m, 2H), 2.81(s, 4H), 0.86(s, 9H), 0.07(s, 3H), 0.06(s, 3H). Fmoc-His(Fmoc)-SE: 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.14(m, 2H), 7.95-7.86(m, 4H), 7.7(dd, 2H, J=3.0, 7.3Hz), 7.62(d, 2H, J=7.4Hz), 7.46-7.25(m, 9H), 4.84-4.76(m, 1H), 4.69(d, 2H, J=6.7Hz), 4.43(t, 1H, J=6.7Hz), 4.30(d, 2H, J=7.0Hz), 4.20(t, 1H, J=7.3Hz), 3.15-3.00(m, 2H), 2.81(s, 4H). Fmoc-Lys(Fmoc)-SE: 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.10(d, 1H, J=7.8Hz), 7.89(d, 4H, J=7.5Hz), 7.70(m, 4H), 7.41(t, 4H, J=7.4Hz), 7.35-7.26(m, 5H), 4.44-4.18(m, 7H), 2.98(m, 2H), 2.80(s, 4H), 1.81(m, 2H), 1.42(m, 4H).
(10-3-2)아미노산 결합-C1-dPnTP(a.a.-C1-dPnTP)
(10-3-2-1)Phe-C1-dPnTP: 1H-NMR(300MHz, D2O) δ 7.83(d, 1H, J=2.1Hz), 7.32-7.20(m, 6H), 7.66(dd, 1H, J=4.7, 6.3Hz), 4.54(m, 1H), 4.22-4.11(m, 4H), 4.07(d, 1H, J=17.7Hz), 3.78(d, 1H, J=17.7Hz), 3.11(q and m, 15H, 2H, J=7.3Hz), 2.56(m, 1H), 2.40(m, 1H), 1.19(t, 23H, J=7.3Hz). 31P-NMR(121MHz, D2O) δ -8.37(bs, 1P), -10.67(d, 1P, J=20.1Hz), -22.01(t, 1P, J=20.1Hz). MS(ESI) for C21H27O15N4P3(M-H)-calcd. 667.06, found 666.66. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax 368nm(ε9540).
(10-3-2-2)Tyr-C1-dPnTP: 1H-NMR(300MHz, D2O) δ 7.81(d, 1H, J=2.1Hz), 7.27(d, 1H, J=2.1Hz), 7.08(d, 2H, J=8.5Hz), 6.75(d, 2H, J=8.6Hz), 6.67(dd, 1H, J=4.8, 6.2Hz), 4.53(m, 1H), 4.21-4.09(m, 4H), 4.04(d, 1H, J=17.6Hz), 3.85(d, 1H, J=17.7Hz), 3.11(q and m, 13H, 1H, J=7.3Hz), 2.94(m, 1H), 2.56(m, 1H), 2.40(m, 1H), 1.19(t, 20H, J=7.3Hz). 31P-NMR(121MHz, D2O) δ -9.11(bs, 1P), -10.71(d, 1P, J=19.8Hz), -22.22(t, 1P, J=19.9Hz). MS(ESI) for C21H27O16N4P3(M-H)-calcd. 683.06, found, 682.80.　UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax 282nm(ε3400), 368nm(ε9760).
(10-3-2-3)Trp-C1-dPnTP: 1H-NMR(300MHz, D2O) δ 7.79(d, 1H, J=2.1Hz), 7.53(d, 1H, J=7.6Hz), 7.38(d, 1H, J=7.9Hz), 7.27(s, 1H), 7.21(d, 1H, J =2.1Hz), 7.16-7.04(m, 2H), 6.66(dd, 1H, J=4.5, 6.3Hz), 3.54(m, 1H), 4.23-4.10(m, 4H), 3.95(d, 1H, J=17.7Hz), 3.68(d, 1H, J=17.6Hz), 3.39-3.19(m, 2H), 3.11(q, 23H, J=7.3Hz), 2.55(m, 1H), 2.41(m, 1H), 1.19(t, 35H, J=7.3Hz). 31P-NMR(121MHz, D2O) δ -7.36(bs, 1P), -10.61(d, 1P, J=19.8Hz), -21.79(t, 1P, J=19.9Hz, 20.1Hz). MS(ESI) for C23H28O15N5P3(M-H)-calcd. 706.07, found, 705.84.　UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax 280nm(ε7270), 287nm(ε6950), 369nm(ε9650).
(10-3-2-4)His-C1-dPnTP: 1H-NMR(300MHz, D2O) δ 8.38(d, 1H, J=1.2Hz), 7.90(d, 1H, J=2.1Hz), 7.22(s, 1H), 6.67(dd, 1H, J=4.5, 6.4Hz), 4.54(m, 1H), 4.33-4.12(m, 4H), 4.08(d, 1H, J=17.7Hz), 3.94(d, 1H, J=17.8Hz), 3.23(m, 2H), 3.11(q, 10H, J=7.3Hz), 2.57(m, 1H), 2.41(m, 1H), 1.19(t, 16H, J=7.3Hz). 31P-NMR(121MHz, D2O) δ -8.29(d, 1P, J=19.2Hz), -10.69(d, 1P, J=19.2Hz), -21.86(t, 1P, J=19.4, 19.3Hz). MS(ESI) for C18H25O15N6P3(M-H)-calcd. 657.05, found 656.93. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax 367nm(ε9890).
(10-3-2-5)Ser-C1-dPnTP: 1H-NMR(300MHz, D2O) δ 7.87(d, 1H, J=2.0Hz), 7.27(d, 1H, J=2.1Hz), 6.66(dd, 1H, J=4.5, 6.3Hz), 4.54(m, 1H), 4.24-4.09(m, 5H), 4.0-3.81(m, 3H), 3.11(q, 18H, J=7.3Hz), 2.56(m, 1H), 2.40(m, 1H), 1.19(t, 27H, J=7.3Hz). 31P-NMR(121MHz, D2O) δ -7.57(bs, 1P), -10.62(d, 1P, J=19.6Hz), -21.88(t, 1P, J=20.2, 20.0Hz). MS(ESI) for C15H23O16N4P3(M-H)-calcd. 607.02, found 606.81. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax 367nm(ε9630).
(11)아미노산 결합-C3-dPnTP의 합성
(11-1)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-(L-페닐아라니나미드)-1-펜티닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(Phe-C3-dPnTP)의 합성
NH2-C3-dPnTP(18μmol)의 DMF 용액(4ml)에 Fmoc-Phe-SE(13.1mg, 27μmol)를 가하고 실온에서 20시간 반응시킨 후에, 트리에틸아민을 가하여 추가로 5시간 교반하였다. 이 반응 용액에 피페리딘(100μl)을 가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 반응 용액에 물(5ml)을 가하고 물층을 아세트산 에틸로 3회 세정한 후에 동결 건조시켰다. 잔사를 DEAE Sephadex A-25 칼럼 크로마토그래피(1.5×30cm, 농도 직선 기울기; TEAB의 50mM-1M 용액) 및 C8-HPLC(SensyuPak, 농도 기울기; 10%-50% 아세토니트릴의 100mM 아세트산 트리에틸암모늄 완충액(pH 7.0))로 정제하여 목적물(7.4μmol, 41%)을 얻었다.
(11-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-(L-트립토파나미드)-1-펜티닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(Trp-C3-dPnTP)의 합성
NH2-C3-dPnTP(18μmol)의 DMF 용액(4ml)에 Fmoc-Trp-SE(14.1mg, 27μmol)를 가하고 실온에서 20시간 반응시킨 후에, 트리에틸아민을 가하여 추가로 5시간 교반하였다. 이 반응 용액에 피페리딘(100μl)을 가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 반응 용액에 물(5ml)을 가하고, 물층을 아세트산 에틸로 3회 세정한 후에 동결 건조시켰다. 잔사를 DEAE Sephadex A-25 칼럼 크로마토그래피(1.5×30cm, 농도 직선 기울기; TEAB의 50mM-1M 용액) 및 C8-HPLC(SensyuPak, 농도 기울기; 15%-50% 아세토니트릴의 100mM 아세트산 트리에틸암모늄 완충액(pH 7.0))로 정제하여 목적물(6.6μmol, 36%)을 얻었다.
(11-3)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-(L-티로시나미드)-1-펜티닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(Tyr-C3-dPnTP)의 합성
NH2-C3-dPnTP(21μmol)의 DMF 용액(1ml)에 Fmoc-Tyr-SE(15.8mg, 31.5μmol)를 가하고 실온에서 60시간 반응시켰다. 이 반응 용액에 H2O(8ml)를 가하고, 물층을 아세트산 에틸로 3회 세정한 후에, C8 HPLC(SensyuPak, 농도 기울기; 35% 아세토니트릴의 100mM 아세트산 트리에틸암모늄 완충액(pH 7.0))로 정제하였다. Fmoc-Tyr-C3-dPnTP의 DMF 용액(2ml)에 피페리딘(100μl)을 가하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 이 반응 용액에 H2O(8ml)를 가하고, 물층을 아세트산 에틸로 3회 세정한 후에 동결 건조시켰다. 잔사를 DEAE Sephadex A-25 칼럼 크로마토그래피(1.5×30cm, 농도 직선 기울기; TEAB의 50mM-1M 용액) 및 C8-HPLC(Sensyupak, 농도 기울기; 10%-50% 아세토니트릴의 100mM 아세트산 트리에틸암모늄 완충액(pH 7.0))로 정제하여 목적물(9.7μmol, 46%)을 얻었다.
(11-4)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-(L-세리나미드)-1-펜티닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(Ser-C3-dPnTP)의 합성
NH2-C3-dPnTP(19μmol)의 DMF 용액(1ml)에 Fmoc-(O-TBDMS)-Ser-SE(13.0mg, 28μmol)를 가하고 실온에서 60시간 반응시켰다. 이 반응 용액에 H2O(8ml)를 가하고, 물층을 아세트산 에틸로 3회 세정한 후에, C8 HPLC(Sensyupak, 농도 기울기; 32% 아세토니트릴의 100mM 아세트산 트리에틸암모늄 완충액(pH 7.0))로 정제하였다. Fmoc-Ser-C3-dPnTP의 DMF 용액(2ml)에 피페리딘(100μl)을 가하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 이 반응 용액에 H2O(8ml)를 가하고, 물층을 아세트산 에틸로 3회 세정한 후에 동결 건조시켰다. 잔사를 DEAE Sephadex A-25 칼럼 크로마토그래피(1.5×30cm, 농도 직선 기울기; TEAB의 50mM-1M 용액) 및 C8-HPLC(SensyuPak, 농도 기울기; 10%-50% 아세토니트릴의 100mM 아세트산 트리에틸암모늄 완충액(pH 7.0))로 정제하여 목적물(5.4μmol, 29%)을 얻었다.
(11-5)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-[5-(L-리시나미드)-1-펜티닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(Lys-C3-dPnTP)의 합성
NH2-C3-dPnTP(20μmol)의 DMF 용액(1ml)에 Fmoc-Lys(Fmoc)-SE(27.5mg, 40μmol)를 가하고 실온에서 58시간 반응시켰다. 반응 용액에 피페리딘(100μl)을 가하고 3분간 반응시킨 후에 H2O(2ml)를 가하였다. 물층을 아세트산 에틸(4ml)로 3회 세정한 후에 동결 건조시켰다. 조생성물을 DEAE Sephadex A-25 칼럼 크로마토그래피(1.5×30cm, 농도 직선 기울기; TEAB의 50mM-0.8M 용액) 및 C18-HPLC(농도 기울기; 5%-50% 아세토니트릴의 100mM 아세트산 트리에틸암모늄 완충액(pH 7.0))로 정제하여 목적물(4.6μmol, 23%)을 얻었다.
(11-6)화합물의 물성값
(11-6-1)Phe-C3-dPnTP: 1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.71(d, 1H, J=1.9Hz), 7.32-7.14(m, 5H), 7.19(d, 1H, J=2.0Hz), 6.61(t, 1H, J=5.8Hz), 4.51(m, 1H), 4.16-4.10(m, 4H), 3.36(m, 1H), 3.11(q, J=7.4Hz, the signals of Phe-CH2- and one proton of -CONHCH2- were superimposed), 2.51(m, 1H), 2.31(m, 1H), 2.19(m, 1H), 2.05(m, 1H), 1.55(m, 2H), 1.19(t, 18H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.34(d, 1P, J=18.0Hz), -11.32(d, 1P, J=19.7Hz), -22.99(t, 1P, J=20.0Hz). MS(ESI) for C23H30N4O15P3(M-H)-calcd, 695.09, found 694.53. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax=374nm(ε10,000).
(11-6-2)Trp-C3-dPnTP: 1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.57(d, 1H, J=2.0Hz), 7.38(d, 2H, J=8.5Hz), 7.24(s, 1H), 7.15(d, 1H, J=2.0Hz), 7.11(t, 1H, J=7.8Hz), 6.99(t, 1H, J=7.9Hz), 6.40(t, 1H, J=5.8Hz), 4.29(m, 1H), 4.14-4.07(m, 4H), 3.39(m, 1H), 3.24(t, 2H, J=6.9Hz), 3.11(q, J=7.3Hz, the signal of one proton of -CONHCH2- was superimposed), 3.17-3.01(m, 1H), 2.32(m, 1H), 2.14(m, 1H), 2.01(m, 1H), 1.84(m, 1H), 1.49(m, 2H), 1.19(t, 18H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.45(d, 1P, J=19.6Hz), -11.29(d, 1P, J=19.4Hz), -23.01(t, 1P, J=20.0Hz). MS(ESI) for C25H31N5O15P3(M-H)-calcd, 734.10, found 733.64. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax=280nm(ε8,000), 287nm(ε7,600), 375nm(ε9,600).
(11-6-3)Tyr-C3-dPnTP: 1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.70(d, 1H, J=2.1Hz), 7.19(d, 1H, J=2.1Hz), 7.02(d, 2H, J=8.5Hz), 6.75(d, 2H, J=8.5Hz), 6.62(t, 1H, J=5.9Hz), 4.51(m, 1H), 4.16(m, 3H), 4.06(m, 1H), 3.39(m, 1H), 3.11(q, 13H, J=7.4Hz), 3.06-2.90(m, 3H), 2.52(m, 1H), 2.30(m, 1H), 2.17(m, 1H), 2.01(m, 1H), 1.53(m, 2H), 1.19(t, 20H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -9.86(1P), -11.30(d, 1P, J=19.8Hz), -22.89(t, 1P, J=19.9Hz). MS(ESI) for C23H30N4O16P3(M-H)-calcd, 711.09, found 711.07. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax=282nm(ε3,800), 373nm(ε10,400).
(11-6-4)Ser-C3-dPnTP: 1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.77(d, 1H, J=2.0Hz), 7.26(d, 1H, J=2.0Hz), 6.68(t, 1H, J=5.9Hz), 4.56(m, 1H), 4.16(m, 3H), 4.07(dd, 1H, J=5.4, 4.6Hz), 3.92(dd, 1H, J=12.3, 4.2Hz), 3.82(dd, 1H, J=12.4, 6.0Hz), 3.34(m, 2H), 3.11(q, 13H, J=7.3Hz), 2.57(m, 1H), 2.45-2.36(m, 3H), 1.72(m, 2H), 1.19(t, 20H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -9.83(1P), -11.29(d, 1P, J=19.6Hz), -22.85(t, 1P, J=19.9Hz).　MS(ESI) for C17H26N4O16P3(M-H)-calcd. 635.06, found 634.68. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax=373nm(ε9,900).
(11-6-5)Lys-C3-dPnTP: 1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.80(d, 1H, J=2.1Hz), 7.26(d, 1H, J=2.1Hz), 6.69(t, 1H, J=6.0Hz), 4.55(m, 1H), 4.23-4.14(m, 3H), 3.96(t, 1H, J=6.8Hz), 3.44(m, 1H), 3.25(m, 1H), 3.12(q, 7H, J=7.3Hz), 2.90(t, 2H, J=7.4Hz), 2.57(m, 1H), 2.45-2.36(m, 3H), 1.83(m, 2H), 1.73(m, 2H), 1.61(m, 2H), 1.40(m, 2H), 1.19(t, 11H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -9.92(d, 1P, J=19.3Hz), -11.34(d, 1P, J=19.9Hz), -22.79(t, 1P, J=19.8Hz). MS(ESI) for C20H33N5O15P3(M-H)-calcd. 676.12, found 675.67.
(12)Diol1-dPnTP의 합성
(12-1)4-펜틴-1,2-디아세테이트의 합성
4-펜틴-1,2-디올(13.5mmol)[reference J. Org. Chem. 2008, 73, 5965-5976.]을 피리딘으로 공비하고 피리딘(27ml)에 용해 후, 무수 아세트산(4.8ml, 50.8mmol)을 가하고 실온에서 14시간 반응시켰다. 반응 용액을 아세트산 에틸과 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 분액하고, 유기층을 황산 나트륨으로 건조, 여과 후 농축하였다. 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 4-펜틴-1,2-디아세테이트(800mg, 4.34mmol, 32%)를 얻었다.
(12-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(4-펜텐-1,2-디아세테이트)-1-프로피닐-2-니트로피롤의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤(354mg, 1mmol), 요오드화 구리(31mg, 0.16mmol), Pd(PPh3)4(58mg, 0.05mmol)에 DMF(5ml)를 가하고 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤의 용해 후, 트리에틸아민(208μl, 1.5mmol), 4-펜틴-1,2-디아세테이트(276mg, 1.5mmol)를 가하고 실온에서 14시간 반응시켰다. 반응 용액을 농축 후, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC 정제하여 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(4-펜텐-1,2-디아세테이트)-1-프로피닐-2-니트로피롤(400mg, 0.97mmol, 97%)을 얻었다.
(12-3)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(4-펜텐-1,2-디아세테이트)-1-프로피닐-2-니트로피롤 5'-삼인산의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(4-펜텐-1,2-디올)-1-프로피닐-2-니트로피롤(41mg, 0.1mmol)을 피리딘으로 2회 톨루엔으로 1회 공비하고, 프로톤 스펀지(33mg, 0.15mmol)를 가하여 인산 트리메틸(500μl)에 용해 후, 용액을 0℃로 냉각하고, 염화 포스포릴(13μl, 0.13mmol)을 가하여 0℃에서 1시간 교반하였다. 이에 트리-n-부틸아민(120μl), 비스-트리-n-부틸암모늄 피로포스페이트(1.0ml, 0.5M DMF solution)를 가하여 0℃에서 30분간 교반하고, 추가로 0.5M TBAF(0.5ml), 물(5.0ml)을 가하여 0℃에서 30분간 교반 후, 반응 용액을 동결 건조하였다. H2O(4.0ml)에 용해하고, 28% 암모니아수(20ml)를 가하여 실온에서 90분간 교반하였다. 이를 DEAE sephadex A-25 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC로 정제하여 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(4-펜텐-1,2-디아세테이트)-1-프로피닐-2-니트로피롤 5'-삼인산(24μmol, 24%)을 얻었다.
(12-4)화합물의 물성값
(12-4-1)4-펜틴-1,2-디아세테이트
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 5.05-4.98(m, 1H), 4.24-4.07(m, 2H), 2.91(t, 1H, J=2.7Hz), 2.53(dd, 1H, J=2.6, 6.4Hz), 2.01(s, 6H).
(12-4-2)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(4-펜텐-1,2-디올)-1-프로피닐-2-니트로피롤
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 7.92(d, 1H, J=2.2Hz), 7.28(d, 1H, J=2.2Hz), 6.54(t, 1H, J=5.6Hz), 5.27(d, 1H, J=4.5Hz), 5.11-5.04(m, 2H), 4.29-4.12(m, 3H), 3.86-3.82(m, 1H), 3.69-3.52(m, 2H), 2.74(d, 2H, J=6.3Hz), 2.47-2.38(m, 1H), 2.27-2.19(m, 1H), 2.04, 2.02(s, s, 3H, 3H). HR-MS(FAB, NBA matrix) for C18H23N2O9(M+H)+calcd. 411.1409, found 411.1403.
(12-4-3)1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-(4-펜텐-1,2-디아세테이트)-1-프로피닐-2-니트로피롤 5'-삼인산
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.79(d, 1H, J=2.1Hz), 7.39(d, 1H, J=2.1Hz), 6.77(t, 1H, J=6.0Hz), 4.66-4.61(m, 1H), 4.27-4.22(m, 3H), 3.98-3.91(m, 1H), 3.74-3.60(m, 2H), 3.20(q, 22H, J=7.3Hz), 2.72-2.46(m, 4H), 1.28(t, 32H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -9.83(d, 1P, J=19.8Hz), -10.66(d, 1P, J=20.0Hz), -22.53(t, 1P, J=20.1Hz). MS(ESI) for C14H21N2O16P3(M-H)-calcd. 566.24, found 565.04. UV(10mM sodium phosphate buffer pH 7.0) λmax=374nm(ε9,400).
(13)Diol9-dPnTP의 합성
(13-1)Diol9 링커의 합성
리튬 아세틸리드 에틸렌디아민 복합체(1.69g, 16.5mmol)를 DMSO(75ml)에 용해 후 0-10℃로 냉각하고, 11-브로모-1-안데센(3.24ml, 15mmol)을 가하여 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 용액을 물과 에테르로 분액하고, 유기층을 황산 나트륨으로 건조, 여과 후 농축하였다. 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(crude 16.5mmol). 이 crude(8.40mmol)에 OsO4(108mg, 0.42mmol), N-methylmorphorine-N-oxide(1.97g, 20mmol), acetone/H2O/tBuOH(4:1:1, 42ml)를 가하고 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 용액에 NaHSO3(295mg)를 가한 후 여과하고, 침전을 메탄올로 세정하여 여과액을 농축하였다. 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(crude). 이 crude(8.40mmol)를 피리딘으로 공비하고 피리딘(15ml)에 용해 후, 무수 아세트산(3ml, 32mmol)을 가하고 실온에서 14시간 반응시켰다. 반응 용액을 아세트산 에틸과 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 분액하고, 유기층을 황산 나트륨으로 건조, 여과 후 농축하였다. 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 Diol9 링커(877mg, 2.96mmol, 35%)를 얻었다.
(13-2)Diol9-dPn의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤(354mg, 1mmol), 요오드화 구리(31mg, 0.16mmol), Pd(PPh3)4(58mg, 0.05mmol)에 DMF(5ml)를 가하고 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤의 용해 후, 트리에틸아민(208μl, 1.5mmol), Diol9 링커(445mg, 1.5mmol)를 가하고 실온에서 14시간 반응시켰다. 반응 용액을 농축 후, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC 정제하여 Diol9-dPn(450mg, 0.86mmol, 86%)을 얻었다.
(13-3)Diol9-dPnTP의 합성
Diol9-dPn(45mg, 0.1mmol)을 피리딘으로 2회, 톨루엔으로 1회 공비하고, 프로톤 스펀지(33mg, 0.15mmol)를 가하여 인산 트리메틸(500μl)에 용해 후, 용액을 0℃로 냉각하고, 염화 포스포릴(13μl, 0.13mmol)을 가하여 0℃에서 1시간 교반하였다. 이에 트리-n-부틸아민(120μl), 비스-트리-n-부틸암모늄 피로포스페이트(1.0ml, 0.5M DMF solution)를 가하여 0℃에서 30분간 교반하고, 추가로 0.5M TBAF(0.5ml), 물(5.0ml)을 가하여 0℃에서 30분간 교반 후, 반응 용액을 동결 건조하였다. H2O(4.0ml)에 용해하고, 28% 암모니아수(20ml)를 가하여 실온에서 90분간 교반하였다. 이를 DEAE sephadex A-25 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC로 정제하여 Diol9-dPnTP(26μmol, 26%)를 얻었다.
(13-4)화합물의 물성값
(13-4-1)Diol9 링커
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 4.98-4.90(m, 1H), 4.15(dd, 1H, J=3.2, 8.7), 3.99(dd, 1H, J=6.5, 5.4), 2.71(t, 1H, J=2.7), 2.15-2.10(m, 8H), 1.99, 1.98(s, s, 3H, 3H), 1.51-1.23(m, 16H).
(13-4-2)Diol9-dPn
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 7.88(d, 1H, J=2.2Hz), 7.25(d, 1H, J=2.2Hz), 6.54(t, 1H, J=5.6Hz), 5.28(d, 1H, J=4.4Hz), 5.09(t, 1H, J=5.1Hz), 4.97-4.90(m, 1H), 4.26-3.95(m, 3H), 3.85-3.81(m, 1H), 3.68-3.52(m, 2H), 2.46-2.18(m, 4H), 1.99, 1.98(s, s, 3H, 3H), 1.51-1.24(m, 16H).
(13-4-3)Diol9-dPnTP
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.71(d, 1H, J=2.1Hz), 7.35(d, 1H, J=2.1Hz), 6.76(t, 1H, J=6.1Hz), 4.65-4.60(m, 1H), 4.26-4.20(m, 3H), 3.70-3.41(m, 3H), 3.20(q, 22H, J=7.3Hz), 2.68-2.37(m, 4H), 1.60-1.25(m, 50H). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.07(d, 1P, J=19.7Hz), -10.63(d, 1P, J=20.0Hz), -22.6(t, 1P, J=20.0Hz). MS(ESI-Tof) for C22H37N2O16P3·N(C2H5)3(M)+calcd. 779.26, found 780.26. UV(10mM sodium phosphate buffer pH 7.0) λmax=374nm(ε9,400).
(14)Bza3-dPnTP의 합성
(14-1)Bza3 링커의 합성
4-펜틴-1-올(2.8ml, 30mmol), 트리페닐포스핀(11.8g, 45mmol)에 디클로로메탄(40ml)을 가하고 0℃로 냉각 후, 디클로로메탄(20ml)에 용해시킨 사브롬화 탄소(14.9 g, 45mmol)를 가하였다. 용액을 실온으로 되돌린 후, 디클로로메탄과 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 분액하고, 유기층을 황산 나트륨으로 건조, 여과 후 농축하였다. 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(crude 30mmol). 이 crude(2.2g, 15mmol)를 DMF(7.5ml)에 용해시킨 4-히드록시벤즈알데히드(1.83g, 15mmol), 탄산 칼륨(2.07g, 15mmol), 요오드화 칼륨(250mg, 1.5mmol)에 가하고 70℃에서 하룻밤 교반시켰다. 반응 용액을 아세트산 에틸, 물, 몇 방울의 염산으로 분액하고, 유기층을 황산 나트륨으로 건조, 여과 후 농축하였다. 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 Bza3 링커(453mg, 2.41mmol, 16%)를 얻었다.
(14-2)Bza3-dPn의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤(354mg, 1mmol), 요오드화 구리(31mg, 0.16mmol), Pd(PPh3)4(58mg, 0.05mmol)에 DMF(5ml)를 가하고 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤의 용해 후, 트리에틸아민(208μl, 1.5mmol), Bza3 링커(282mg, 1.5mmol)를 가하고 실온에서 14시간 반응시켰다. 반응 용액을 농축 후, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC 정제하여 Bza3-dPn(236mg, 0.57mmol, 57%)을 얻었다.
(14-3)Bza3-dPnTP의 합성
Bza3-dPn(41mg, 0.1mmol)을 피리딘으로 2회, 톨루엔으로 1회 공비하고, 프로톤 스펀지(33mg, 0.15mmol)를 가하여 인산 트리메틸(500μl)에 용해 후, 용액을 0℃로 냉각하고, 염화 포스포릴(13μl, 0.13mmol)을 가하여 0℃에서 1시간 교반하였다. 이에 트리-n-부틸아민(120μl), 비스-트리-n-부틸암모늄 피로포스페이트(1.0ml, 0.5M DMF solution)를 가하여 0℃에서 30분간 교반하고, 추가로 0.5M TBAF(0.5ml), 물(5.0ml)을 가하여 0℃에서 30분간 교반 후, 반응 용액을 동결 건조하였다. 이를 DEAE sephadex A-25 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC로 정제하여 Bza3-dPnTP(30.5μmol, 30%)를 얻었다.
(14-4)화합물의 물성값
(14-4-1)Bza3 링커
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 9.86(s, 1H), 7.87-7.84(m, 2H), 7.14-7.10(m, 2H), 4.15(t, 2H, J=6.2Hz), 2.82(t, 2H, J=2.6Hz), 2.36-2.31(m, 2H), 1.96-1.87(m, 2H)
(14-4-2)Bza3-dPn
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 9.87(s, 1H), 7.92(d, 1H, J=2.1Hz), 7.90-7.84(m, 2H), 7.28(d, 1H, J=2.2Hz), 7.17-7.13(m, 2H), 6.55(t, 1H, J=5.6Hz), 5.29(d, 1H, J=4.4Hz), 5.10(t, 1H, J=5.1Hz), 4.27-4.18(m, 3H), 3.87-3.83(m, 1H), 3.69-3.53(m, 2H), 2.57(t, 2H, J=7.1Hz), 2.47-2.39(m, 1H), 2.27-2.19(m, 1H), 2.04-1.95(m, 2H).
(14-4-3)Bza3-dPnTP
1H NMR(300MHz, D2O) δ 9.77(s, 1H), 7.95-7.90(m, 2H), 7.69(d, 1H, J=2.1Hz), 7.25(d, 1H, J=2.1Hz), 7.21-7.16(m, 2H), 6.74(t, 1H, J=6.0Hz), 4.64-4.59(m, 1H), 4.36-4.20(m, 5H), 3.19(q, 19H, J=7.3Hz), 2.67-2.42(m, 4H), 2.14-2.05(m, 2H), 1.28(t, 28H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -9.98(d, 1P, J=19.9Hz), -10.65(d, 1P, J=20.1Hz), -22.55(t, 1P, J=20.0Hz). MS(ESI-Tof) for C21H25N2O16P3·N(C2H5)3(M)+calcd. 755.16, found 756.22. UV(10mM sodium phosphate buffer pH 7.0) λmax=288nm(ε21,300), 373nm(ε9,600).
(15)Bza6-dPnTP의 합성
(15-1)Bza6 링커의 합성
7-옥틴-1-올(2.60g, 20mmol), 트리페닐포스핀(7.87g, 30mmol)에 디클로로메탄(30ml)을 가하고 0℃로 냉각 후, 디클로로메탄(10ml)에 용해시킨 사브롬화 탄소(9.95g, 30mmol)를 가하였다. 용액을 실온으로 되돌린 후, 디클로로메탄과 5% 탄산 수소 나트륨 수용액으로 분액하고, 유기층을 황산 나트륨으로 건조, 여과 후 농축하였다. 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(crude 20mmol). 이 crude(20mmol)를 DMF(10ml)에 용해시킨 4-히드록시벤즈알데히드(2.44g, 20mmol), 탄산 칼륨(2.76g, 20mmol), 요오드화 칼륨(332mg, 2mmol)에 가하고 70℃에서 하룻밤 교반시켰다. 반응 용액을 아세트산 에틸, 물, 몇 방울의 염산으로 분액하고, 유기층을 황산 나트륨으로 건조, 여과 후 농축하였다. 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 Bza6 링커(729mg, 3.17mmol, 16%)를 얻었다.
(15-2)Bza6-dPn의 합성
1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤(354mg, 1mmol), 요오드화 구리(31mg, 0.16mmol), Pd(PPh3)4(58mg, 0.05mmol)에 DMF(5ml)를 가하고 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-4-요오드-2-니트로피롤의 용해 후, 트리에틸아민(208μl, 1.5mmol), Bza6 링커(276mg, 1.2mmol)를 가하고 실온에서 14시간 반응시켰다. 반응 용액을 농축 후, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC 정제하여 Bza6-dPn(138mg, 0.30mmol, 30%)을 얻었다.
(15-3)Bza6-dPnTP의 합성
Bza6-dPn(46mg, 0.1mmol)을 피리딘으로 2회, 톨루엔으로 1회 공비하고, 프로톤 스펀지(33mg, 0.15mmol)를 가하여 인산 트리메틸(500μl)에 용해 후, 용액을 0℃로 냉각하고, 염화 포스포릴(13μl, 0.13mmol)을 가하여 0℃에서 1시간 교반하였다. 이에 트리-n-부틸아민(120μl), 비스-트리-n-부틸암모늄 피로포스페이트(1.0ml, 0.5M DMF solution)를 가하여 0℃에서 30분간 교반하고, 추가로 0.5M TBAF(0.5ml), 물(5.0ml)을 가하여 0℃에서 30분간 교반 후, 반응 용액을 동결 건조하였다. 이를 DEAE sephadex A-25 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC로 정제하여 Bza6-dPnTP(27μmol, 27%)를 얻었다.
(15-4)화합물의 물성값
(15-4-1)Bza6 링커
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 9.85(s, 1H), 7.86-7.83(m, 2H), 7.12-7.09(m, 2H), 4.07(t, 2H, J=6.4Hz), 2.73(t, 2H, J=2.6Hz), 2.17-2.12(m, 2H), 1.48-1.42(m, 8H)
(15-4-2)Bza6-dPn
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 9.84(s, 1H), 7.89(d, 1H, J=2.1Hz), 7.86-7.81(m, 2H), 7.24(d, 1H, J=2.2Hz), 7.12-7.08(m, 2H), 6.53(t, 1H, J=5.6Hz), 5.28(d, 1H, J=3.8Hz), 5.10(t, 1H, J=5.3Hz), 4.22(m, 1H), 4.08(t, 2H, J=6.4Hz), 3.85-3.81(m, 1H), 3.66-3.53(m, 2H), 2.46-2.17(m, 4H), 1.77-1.73(m, 2H), 1.55-1.44(m, 6H).
(15-4-3)Bza6-dPnTP
1H NMR(300MHz, D2O) δ 9.71(s, 1H), 7.85-7.82(m, 2H), 7.63(d, 1H, J=2.1Hz), 7.14(d, 1H, J=2.1Hz), 7.11-7.07(m, 2H), 6.65(t, 1H, J=6.0Hz), 4.60-4.58(m, 1H), 4.25-4.17(m, 5H), 3.20(q, 18H, J=7.3Hz), 2.63-2.57(m, 1H), 2.44-2.38(m, 3H), 1.88-1.84(m, 2H), 1.63-1.54(m, 6H), 1.28(t, 27H, J=7.3Hz). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.25(d, 1P, J=19.4Hz), -10.68(d, 1P, J=19.8Hz), -22.62(t, 1P, J=19.8Hz). MS(ESI-Tof) for C24H31N2O16P3·N(C2H5)3(M)+calcd. 797.21, found 798.24. UV(10mM sodium phosphate buffer pH 7.0) λmax=289nm(ε20,500), 374nm(ε8,900).
(16)트리펩티드 결합-dPnTP의 합성
(16-1)트리펩티드 합성
Fmoc 고상 합성을 부피 5mL의 필터가 들어간 칼럼 튜브(PP제)로 행하였다. 2-chlorotrithylchloride resin(1.58mmol/mg, 250mg, 0.4mmol)을 튜브에 무게를 달고, 염화 메틸렌(DCM)을 2mL 가하여 셰이커로 20분 흔들어 팽윤시켰다(×2회). 1잔기째의 아미노산 커플링은 수지에 대해 Fmoc-아미노산(1.5equiv.), DIPEA(2.5equiv.)을 DCM 1.5mL에 용해시키고, 수지가 들어간 칼럼 튜브에 가하여 실온에서 2시간 교반하고 커플링을 행하였다. 반응 후, MeOH를 1mL 가하여 15분 교반한 후 반응액을 제거하고, 수지를 DCM(2mL)×4회, DMF(2mL)×4회, DCM(2mL)×2회′, DMF:MeOH=1:1(v/v)×2회, DCM:MeOH=1:1(v/v)×2회, MeOH×2회로 세정하였다. 진공 라인에서 충분히 건조 후 질량을 재어, 반응 전후의 resin의 질량으로부터 1잔기째의 도입량을 조사하였다. 2잔기 이후 커플링의 당량은 이 값을 기준으로 하여 반응시켰다. 상기의 조건으로 다시 수지를 팽윤 후, 20% 피페리딘/DMF액을 1.5mL 가하고 20분 교반함으로써 Fmoc기의 제거를 행하였다. DMF에서 피페리딘의 냄새가 없어질 때까지(2mL×8~10회 정도) 수지를 충분히 세정하였다(이들 탈Fmoc 조작을 2번 반복하였다). Fmoc-아미노산(2.5equiv.), HOBt(2.5equiv.), N,N′-Diisopropyl-carbodiimide(2.5equiv.)를 1.5ml의 DMF에 용해시키고, 칼럼에 가하여 실온에서 1시간 교반하여 반응시켰다. 반응액을 제거한 후, 수지를 DMF(2mL)×5, DCM(2mL)×5, DMF(2mL)×5회로 세정하였다. 이들 반응을 반복하여 tripeptide까지 신장 후 수지로부터의 절제는, 20% Hexafluoroisopropanol/DCM(혹은 1% TFA/DCM*)을 2mL 가하여 실온에서 10분 교반하고 여과를 행하여 펩티드를 포함하는 여과액을 회수하였다(3회 반복하였다). 여과액을 증발(evaporation)로 농축·건조하여 트리펩티드를 얻었다.
(16-2)Fmoc-Leu-Leu-Leu N-succinimidyl ester의 합성
Fmoc-Leu-Leu-Leu(292.5mg, 0.5mmol)를 5mL의 DMF에 용해하고, N-hydroxysuccinimide(89.3mg, 0.75mmol)와 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride(143.7mg, 0.75mmol)를 가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 냉수 중에 적하함으로써 흰 침전이 생기고, 이를 흡인 여과하였다. 결정을 물로 세정 후, 진공 라인에서 건조시켜 백색 분말의 목적물을 얻었다(255.8mg, 76%).
(16-3)Fmoc-Pro-Phe-Trp N-succinimidyl ester의 합성
Fmoc-Pro-Phe-Trp(202mg, 0.3mmol)를 3mL의 DMF에 용해하고, N-hydroxysuccinimide(53mg, 0.45mmol)와 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride(86mg, 0.45mmol)를 가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 냉수 중에 적하함으로써 흰 침전이 생기고, 이를 흡인 여과하였다. 결정을 물로 세정 후, 진공 라인에서 건조시켜 백색 분말의 목적물을 얻었다(163mg, 95%).
(16-4)Leu-Leu-Leu-hx-dPnTP의 합성
NH2-hx-dPnTP(196μmol)를 4mL의 DMF로 용해시켰다. 4mL의 DMF에 용해시킨 Fmoc-Leu-Leu-Leu N-succinimidyl ester를 반응액에 가하여 실온에서 반응시켰다. 22시간 후, 피페리딘을 500μl 반응액에 가하여 10분간 교반하고 Fmoc기의 제거를 행하였다. 반응액을 아세트산 에틸과 물로 추출하고, 수상을 아세트산 에틸로 2회 세정 후 동결 건조하였다. 조결정을 50mM TEAB에 용해시키고, 50mM TEAB로 팽윤시킨 DEAE 수지에 장입하여 DEAE 정제(수지: DEAE Sephadex A-25 column, gradient: 50mM-1M TEAB의 isogradient)를 행하였다. 목적물을 포함하는 분획을 동결 건조하고, HPLC 정제를 행하여(0-10분: 10-100% linear gradient of CH3CN in 100mM TEAA, pH 7.0) 목적물을 얻었다(34.7umol, 18%).
(16-5)Pro-Phe-Trp-hx-dPnTP의 합성
NH2 -hx-dPnTP(30μmol)를 800μl의 DMF에서 용해시켰다. 800μl의 DMF에 용해시킨 Fmoc-Pro-Phe-Trp N-succinimidyl ester(56.3mg, 73μmol)를 반응액에 가하여 실온에서 반응시켰다. 20시간 후, 피페리딘을 100μl 반응액에 가하여 10분간 교반하고 Fmoc기의 제거를 행하였다. 반응액을 아세트산 에틸과 물로 추출하고, 수상을 아세트산 에틸로 2회 세정 후 수상을 동결 건조하였다. 조결정을 50mM TEAB에 용해시키고, 50mM TEAB로 팽윤시킨 DEAE 수지에 장입하여 DEAE 정제(수지: DEAE Sephadex A-25 column, gradient: 50mM-1M TEAB의 isogradient)를 행하였다. 목적물을 포함하는 분획을 동결 건조하고, HPLC 정제를 행하여(0-10분: 10-100% linear gradient of CH3CN in 100mM TEAA, pH 7.0) 목적물을 얻었다(8.5μmol, 28%).
(16-6)화합물의 물성값
(16-6-1)Fmoc-Leu-Leu-Leu N-succinimidyl ester: 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.56(d, 1H, J=7.6Hz), 7.94　(d, 1H, J=8.1Hz), 7.88(d, 2H, J=7.4Hz), 7.70(d, 2H, J=7.1Hz), 7.48-7.28(m, 5H), 4.61(m, 1H), 4.38-4.17(m, 4H), 4.04(m, 1H), 2.79(s, 4H), 1.76-1.37(m, 9H), 0.92-0.79(m, 18H).　13C NMR(75MHz, DMSO-d6) δ 172.71, 172.33, 172.05, 169.88, 168.43, 155.79, 143.88, 143.69, 140.67, 127.01, 125.25, 120.06, 65.49, 52.94, 50.46, 48.31, 46.66, 25.42, 25.19, 24.11, 23.99, 23.03, 22.87, 22.59, 21.43, 20.97.
(16-6-2)Fmoc-Pro-Phe-Trp N-succinimidyl ester: 1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 10.94(s, 1H), 8.23(d, 1H, J=8.7Hz), 8.04-7.85(m, 5H), 7.64-7.43(m, 4H), 7.40-6.79(m, 24H), 4.67(m, 1H), 4.52(m, 1H), 4.33-4.05(m, 5H), 3.84(m, 2H), 3.31-3.14(m, 2H, superimposed by H2O signal), 2.26-2.08(m, 1H), 3.00(m, 2H), 2.88-2.72(m, 9H), 2.17(m, 1H), 1.92(m, 1H), 1.67(m, 5H).
(16-6-3)Leu-Leu-Leu-hx-dPnTP: 1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.81(d, 1H, J=2.1Hz), 7.39(d, 1H, J=2.1Hz), 6.75(t, 1H, J=6.0Hz), 4.61(m, 1H), 4.42(t, 1H, J=7.5Hz), 4.26(m, 4H), 4.14(s, 2H), 4.01(t, 1H, J=7.4Hz), 3.20(q, 17H, J=7.3Hz), 2.69-2.60(m, 1H), 2.51-2.43(m, 1H), 2.28(t, 1H, J=7.3Hz), 1.74-1.46(m, 13H), 1.28(t, 24H, J=7.3Hz), 1.06-0.85(m, 18H). 13C NMR(75MHz, DMSO-d6) δ 176.66, 173.83, 173.31, 170.28, 136.03, 129.83, 118.60, 104.72, 88.14, 85.73, 85.59, 75.16, 69.71, 64.95, 52.53, 52.36, 51.71, 46.64, 40.48, 39.99, 39.76, 39.70, 38.98, 35.45, 29.47, 27.89, 25.30, 24.79, 24.30, 24.27, 23.88, 22.05, 21.82, 21.56, 21.50, 21.35, 20.89, 8.21. 31P NMR(121MHz, D2O) δ -9.14(d, 1P, J=20.0Hz), -10.72(d, 1P, J=20.0Hz), -22.35(t, 1P, J=20.1Hz). MS(ESI) for C36H62N7O18P3(M-H)-calcd. 972.34, found 972.12. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax=365nm(ε10700).
(16-6-4)Pro-Phe-Trp-hx-dPnTP: 1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.67(s, 1H), 7.46-7.40(m, 2H), 7.33-7.06(m, 9H), 6.55(t, 1H, J=5.9Hz), 4.54-4.22(m, 3H), 4.37-4.31(m, 1H), 4.21-4.07(m, 5H), 3.38-3.25(m, 3H), 3.20(q, 19H, J=7.3Hz), 3.02-2.80(m, 6H), 2.57-2.48(m, 1H), 2.28-2.15(m, 4H), 1.99-1.93(m, 1H), 1.91-1.75(m, 1H), 1.58-1.46(m, 3H), 1.28(t, 29H, J=7.3Hz), 1.22-1.19(m, 2H), 1.09-1.00(m, 3H). 31P NMR(121MHz, D2O) δ -9.21(d, 1P, J=19.6Hz), -10.68(d, 1P, J=19.6Hz), -22.27(t, 1P, J=20.0Hz). MS(ESI) for C43H55N8O18P3(M-H)-calcd. 1064.28, found 1063.82. UV(10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) λmax=281nm(ε8,600), 287nm(ε8,200), 366nm(ε=10,500).
(17)숙신이미드에스테르의 합성
Figure pct00016
Conditions. (a)(b)(c)N-hydroxysuccinimide, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, CH2Cl2, rt. (d)N-hydroxysuccinimide, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, THF, DMF, rt.
(17-1)디페닐 아세트산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 합성
디페닐 아세트산(216mg, 1.02mmol), N-히드록시숙신이미드(177mg, 1.53mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(290mg, 1.51mmol)을 탈수 염화 메틸렌(5ml)에 녹이고 실온에서 7시간 교반하였다. 반응액을 염화 메틸렌(20ml)으로 희석한 후, 포화 탄산 수소 나트륨 수용액(10ml), 다음에 포화 식염수(10ml)로 세정하였다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고 감압 농축하였다. 중압 분취 액체 크로마토그래피(야마젠 AI-580 장치 및 하이플래시 칼럼(실리카 겔)을 이용하여 염화 메틸렌-메탄올의 기울기로 용출)에 의해 정제하여 백색 고체로서 목적물(156mg, 0.50mmol, 49%)을 얻었다.
<<이미 알려진 화합물>>Ref. J. Med. Chem. 2000, 51, 8168.
(17-2)디페닐 아세트산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 물성값
1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7.38-7.29(m, 10H), 5.35(s, 1H), 2.82(s, 4H).
(18)1-나프토에산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 합성
(18-1)1-나프토에산(176mg, 1.02mmol), N-히드록시숙신이미드(174mg, 1.51mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(288mg, 1.50mmol)을 탈수 염화 메틸렌(5ml)에 녹이고 실온에서 18시간 교반하였다. 반응액을 염화 메틸렌(10ml)으로 희석한 후, 포화 탄산 수소 나트륨 수용액(10ml), 이어서 포화 식염수(10ml)로 세정하였다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고 감압 농축하였다. 중압 분취 액체 크로마토그래피(야마젠 AI-580 장치 및 하이플래시 칼럼(실리카 겔)을 이용하여 염화 메틸렌-메탄올의 기울기로 용출)로 정제하여 백색 고체로서 목적물(131mg, 0.48mmol, 48%)을 얻었다.
<<이미 알려진 화합물>>Ref. Tetrahedron Letters 2003, 44(12) 2477-2480. (합성법은 다름)
(18-2)1-나프토에산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 물성값
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.62(dd, 1H, J=7.7, 1.0Hz), 8.40-8.35(m, 4H), 8.13(dd,1H, J=7.9, 0.7Hz), 7.79-7.66(m, 3H), 2.94(s, 4H).
(19)4-비페닐카르본산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 합성
(19-1)4-비페닐카르본산(200mg, 1.00mmol), N-히드록시숙신이미드(178mg, 1.55mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(287mg, 1.50mmol)을 탈수 염화 메틸렌(5ml)에 녹이고 실온에서 21시간 교반하였다. 반응액을 염화 메틸렌(20ml)으로 희석한 후, 포화 탄산 수소 나트륨 수용액(10ml), 이어서 포화 식염수(10ml)로 세정하였다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고 감압 농축하였다. 중압 분취 액체 크로마토그래피(야마젠 AI-580 장치 및 하이플래시 칼럼(실리카 겔)을 이용하여 염화 메틸렌-메탄올의 기울기로 용출)로 정제하여 DMF(2.5ml)에 용해하였다. 이를 물(50ml)에 넣어 재침전함으로써 백색 고체로서 목적물(139mg, 0.47mmol, 47%)을 얻었다.
<<이미 알려진 화합물>>Ref. Russ. J. Bioorg. Chem. 2009, 35, 342.(합성항은 다름)
(19-2)4-비페닐카르본산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 물성값
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 8.18(d, 2H, J=8.6Hz), 7.97(d, 2H, J=8.6Hz), 7.82-7.78(m, 2H), 7.57-7.44(m, 3H), 2.91(s, 4H).
(20)4'-히드록시-4-비페닐카르본산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 합성
(20-1)4'-히드록시-4-비페닐카르본산(214mg, 1.00mmol), N-히드록시숙신이미드(174mg, 1.50mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(288mg, 1.50mmol)을 탈수 THF(10ml) 및 탈수 DMF(4ml)에 녹이고 실온에서 5시간 교반하였다. 반응액을 물(50ml)에 넣고 생긴 침전을 여취하고 헥산으로 씻은 후, 진공 건조하여 목적물(207mg, 0.67mmol, 67%)을 백색 고체로서 얻었다.
<<이미 알려진 화합물>>Ref. J. Med. Chem. 2008, 51, 6665-6681.(합성항의 기술·인용 없음)
(20-2)4'-히드록시-4-비페닐카르본산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 물성값
1H NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 9.84(s, 1H), 8.11(dd, 2H, J=6.8, 1.8Hz), 7.88(dd, 2H, J=6.8, 1.8Hz), 7.68-7.64(m, 2H), 6.93-6.88(m, 2H), 2.90(s, 4H).
(21)9-안트라센카르본산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 합성
(21-1)9-안트라센카르본산(220mg, 0.99mmol), 탄산 디(N-숙신이미딜)(357mg, 1.39mmol) 및 트리에틸아민(220μl, 1.60mmol)을 탈수 염화 메틸렌(10ml)에 녹이고 실온에서 24시간 교반하였다. 반응액을 염화 메틸렌(10ml)으로 희석한 후, 포화 탄산 수소 나트륨 수용액(20ml), 이어서 포화 식염수(20ml)로 세정하였다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고 감압 농축하였다. 중압 분취 액체 크로마토그래피(야마젠 AI-580 장치 및 하이플래시 칼럼(실리카 겔)을 이용하여 염화 메틸렌-메탄올의 기울기로 용출)로 정제하여 백색 고체로서 목적물(66mg, 0.20mmol, 20%)을 얻었다.
(21-2)9-안트라센카르본산 N-히드록시 숙신이미드에스테르의 물성값
1H NMR(300MHz, DMSO-d6, 40℃) δ 8.97(s, 1H), 8.32-8.24(m, 4H), 7.78-7.63(m, 4H), 3.02(s, 4H).
(22)수식 dPnTP(R-hx-dPnTP)의 합성
Figure pct00017
Condition: N-hydoroxysuccinimide ester, triethylamine, 70% DMF-H2O, rt.
Figure pct00018
(22-1)디페닐메탄 수식 dPnTP(DPM-hx-dPnTP)의 합성
3-(β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-아미노헥산 아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(30μmol)의 40% DMF 수용액(3.0ml)에 디페닐 아세트산 숙신이미드에스테르(120μmol)의 DMF 용액(3.0ml) 및 트리에틸아민(6.2μl)을 가하여 실온에서 24시간 정치하였다. 반응 용액에 물(18ml)을 가하여 생긴 백색 침전을 Steriflip(Millipore)에 의해 여과하여 제거하였다. 여과액을 동결 건조한 후, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액(2.0ml)에 용해하고 Ultrafree(0.22μM, Millipore)에 의해 여과하였다. 여과액을 C18 칼럼(나카라이, COSMOSIL 140C19-OPN, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액 중에서 0-30% 아세토니트릴의 직선 기울기로 용출) 및 C8 HPLC(시세이도 CAPCELL PAK C8, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액 중에서 25-50% 아세토니트릴의 직선 기울기를 13분 걸쳐 용출)에 의해 정제하여 DPM-hx-dPnTP(수량 15.4μmol, 수율 51%)를 얻었다.
(22-2)나프탈렌 수식 dPnTP(NAP-hx-dPnTP)의 합성
3-(β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-아미노헥산 아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(30μmol)의 40% DMF 수용액(3.0ml)에 1-나프토에산 숙신이미드에스테르(120μmol)의 DMF 용액(3.0ml) 및 트리에틸아민(6.2μl)을 가하여 실온에서 66시간 정치하였다. 반응 용액에 물(18ml)을 가하여 생긴 백색 침전을 Steriflip(Millipore)에 의해 여과하여 제거하였다. 여과액을 동결 건조한 후, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액(3.0ml)에 용해하고 Ultrafree(0.22μM, Millipore)에 의해 여과하였다. 여과액을 C18 칼럼(나카라이, COSMOSIL 140C19-OPN, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액 중에서 0-30% 아세토니트릴의 직선 기울기로 용출) 및 C18 HPLC(시세이도 CAPCELL PAK C18, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액 중에서 15-50% 아세토니트릴의 직선 기울기를 13분 걸쳐 용출)에 의해 정제하여 NAP-hx-dPnTP(수량 16.4μmol, 수율 55%)를 얻었다.
(22-3)비페닐 수식 dPnTP(BPH-hx-dPnTP)의 합성
3-(β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-아미노헥산 아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(30μmol)의 40% DMF 수용액(3.0ml)에 4-비페닐카르본산 숙신이미드에스테르(120μmol)의 DMF 용액(3.0ml) 및 트리에틸아민(6.2μl)을 가하여 실온에서 51시간 정치하였다. 반응 용액에 물(18ml)을 가하여 생긴 백색 침전을 Steriflip(Millipore)에 의해 여과하여 제거하였다. 여과액을 동결 건조한 후, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액(2.0ml)에 용해하고 Ultrafree(0.22μM, Millipore)에 의해 여과하였다. 여과액을 C18 칼럼(나카라이, COSMOSIL 140C19-OPN, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액 중에서 0-30% 아세토니트릴의 직선 기울기로 용출) 및 C1 HPLC(시세이도 CAPCELL PAK C1, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액 중에서 20-50% 아세토니트릴의 직선 기울기를 13분 걸쳐 용출)에 의해 정제하여 BPH-hx-dPnTP(수량 10.0μmol, 수율 33%)를 얻었다.
(22-4)4-히드록시비페닐 수식 dPnTP(HBP-hx-dPnTP)의 합성
3-(β-D-리보푸라노실)-4-[3-(6-아미노헥산 아미드)-1-프로피닐]-2-니트로피롤 5'-삼인산(30μmol)의 40% DMF 수용액(3.0ml)에 4'-히드록시-4-비페닐카르본산 숙신이미드에스테르(120μmol)의 DMF 용액(3.0ml) 및 트리에틸아민(6.2μl)을 가하여 실온에서 45시간 정치하였다. 반응 용액에 물(18ml)을 가하여 생긴 백색 침전을 Steriflip(Millipore)에 의해 여과하여 제거하였다. 여과액을 동결 건조한 후, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액(2.0ml)에 용해하고 Ultrafree(0.22μM, Millipore)에 의해 여과하였다. 여과액을 C18 칼럼(나카라이, COSMOSIL 140C19-OPN, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액 중에서 0-30% 아세토니트릴의 직선 기울기로 용출) 및 C8 HPLC(시세이도 CAPCELL PAK C8, 100mM 트리에틸아민-아세트산 완충 용액 중에서 15-50% 아세토니트릴의 직선 기울기를 13분 걸쳐 용출)에 의해 정제하여 HBP-hx-dPnTP(수량 13.9μmol, 수율 46%)를 얻었다.
(22-5)수식 dPnTP(R-hx-dPnTP)의 물성값
(22-5-1)DPM-hx-dPnTP의 물성값
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.72(d, 1H, J=2.1Hz), 7.43-7.33(m, 6H), 7.26-7.21(m, 5H), 6.64(t, 1H, J=5.9Hz), 5.01(s, 1H), 4.53(m, 1H), 4.20(m, 3H), 4.14(m, 2H), 2.23-3.16(m, 1H and (CH3CH2)3N), 2.54(m, 1H), 2.36(m, 1H), 2.26(t, 1H, J=7.0Hz), 1.63-1.58(m, 2H), 1.53-1.49(m, 2H), 1.30-1.35(m, 1H and (CH3CH2)3N).
31P NMR(121MHz, D2O), δ -9.47(d, 1P, J=15.5Hz), -10.70(d, 1P, J=19.8Hz), -22.47(t, 1P, J=20.0Hz).
ESI-MS for [M-H]-(C32H38N4O16P3): calcd. 827.16, found: 827.02.
lmax=369nm, e260=2.40×103, e369=1.07×104.
(22-5-2)NAP-hx-dPnTP의 물성값
1H NMR(300MHz, D2O) δ 8.02-7.93(m, 3H), 7.65-7.48(m, 5H), 6.98(d, 1H, J=2.1Hz), 6.50(t, 1H, J=5.9Hz), 4.53(m, 1H), 4.18(m, 3H), 4.10(s, 2H), 3.49(t, 1H, J=6.4Hz), 2.58-2.49(m, 1H), 2.37-2.26(m, 3H), 1.79-1.67(m, 4H), 1.54-1.46(m, 2H).
31P NMR(121MHz, D2O), δ 9.91(d, 1P, J=19.4Hz), -10.77(d, 1P, J=20.0Hz), -22.56(t, 1P, J=20.0Hz).
lmax=369nm, e260=4.90×103, e369=9.35×103.
(22-5-3)BPH-hx-dPnTP의 물성값
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.76-7.68(m, 7H), 7.61(d, 1H, J=2.1Hz), 7.55-7.7.45(m, 3H), 7.04　(d, 1H, J=2.1Hz), 6.38(t, 1H, J=5.9Hz), 4.45(m, 1H), 4.16-4.10(m, 5H), 3.39(t, 2H, J=6.6Hz), 2.42(m, 1H), 2.32(t, 1H, J=6.5Hz), 2.19(m, 1H), 1.74-1.62(m, 4H), 1.45(m, 1H).
31P NMR(121MHz, D2O) δ -10.33(d, 1P, J=19.7Hz), -10.84(d, 1P, J=19.7Hz), -22.75(t, 1P, J=19.8Hz).
lmax=368nm, e260=2.46×104, e368=1.04×104.
(22-5-4)HBP-hx-dPnTP의 물성값
1H NMR(300MHz, D2O) δ 7.71(d, 2H, J=8.4Hz), 7.62-7.56(m, 5H), 6.99(d, 2H, J=7.5Hz), 6.97(s, 1H), 6.36(t, 1H, J=5.9Hz), 4.44(m, 1H), 4.15-4.09(m, 5H), 3.39(t, 2H, J=6.5Hz), 2.46-2.38(m, 1H), 2.32(t, 2H, J=6.3Hz), 2.18-2.12(m, 1H), 1.73-1.61(m, 4H), 1.29-1.24(m, 2H).
31P NMR(121MHz, D2O) δ -9.86(d, 1P, J=19.6Hz), -10.75(d, 1P, J=19.8Hz), -22.55(t, 1P, J=19.9Hz).
lmax=368nm, e260=1.41×104, e368=1.02×104.
<실시예 8: VEGF-165에 결합하는 DNA 앱타머의 제작(2)>
실시예 1에 기재된 방법을 기초로 하여 추가로 개량을 가한 방법을 이용하여 VEGF-165에 대해 보다 강고하게 결합하는 DNA 앱타머를 제작하였다.
(1)인공 염기 Ds를 중앙 영역의 특정 부위에 포함하는 1본쇄 DNA 라이브러리의 조제
실시예 1에서 조제한 1본쇄 DNA 라이브러리를 이용하였다.
(2)VEGF-165에 결합하는 Ds를 포함하는 1본쇄 DNA 앱타머의 제조
기본적인 방법은 실시예 1에 기재된 방법에 준한다. 이하, 여기서는 실시예 1과 다른 부분을 중심으로 설명하고 중복되는 부분에 대해서는 원칙적으로 그 기재를 생략한다.
A. 셀렉션 1라운드의 조작
(i)표적 단백질과 DNA 라이브러리의 결합
DNA의 분자 내에서의 고차 구조를 형성시키기 위해, 폴딩 처리(95℃, 3분간→실온, 10분간→빙상, 5분간→실온)를 행하였다. 그 후, Nonidet P-40을 포함하는 PBS 용액과 혼합하여 Nonidet P-40의 최종 농도가 0.005%가 되도록 조제하고, 그 핵산 용액을 스트렙트아비딘 자기 비즈와 혼합하여 25℃에서 30분간 전도 혼화하였다. 원심 조작과 자기 스탠드에 의해 얻은 상청액을 VEGF-165와 혼합하여 DNA-단백질 복합체를 형성시켰다.
(ii)표적 단백질에 결합한 DNA 서열의 선별
상술한 혼합 용액 중에 N-히드록시 숙신이미드에스테르(NHS)화된 Biotin화 시약을 첨가하여 단백질의 비오틴화를 행한 후, 미반응의 비오틴화 시약을 한외 여과에 의해 제거하고, 그 용액을 스트렙트아비딘 자기 비즈와 실온에서 혼합하여 DNA-단백질 복합체를 자기 비즈에 고정화하였다. 그 후, 자기 비즈를 1.0ml의 0.005% Nonidet P-40을 포함하는 PBS 용액(완충액 A)에 현탁하고 25℃에서 5분간 인큐베이션하는 조작을 5회 반복하였다.
또, 최종 7라운드째에는 3M 요소를 포함하는 완충액 A(1.0ml, 25℃, 5분간)에서 전도 혼화하는 조작을 3회 행하고, 그 후 완충액 A(1.0ml, 25℃, 5분간)에서 전도 혼화하는 조작을 2회 행함으로써, 세정 조건을 더욱 엄격하게 하였다. 세정 후의 자기 비즈에 200μl의 용출액(50mM NaOH)을 가하여 25℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 그 용액을 회수하고 이온 교환 수지에 의해 용액을 중화하였다. 회수된 용액 중의 DNA를 PCR에 의한 다음 셀렉션 라운드의 라이브러리 조제시의 주형으로 하였다.
(iii)1본쇄 DNA 라이브러리의 조제(증폭)
다음 라운드에 이용하는 1본쇄 DNA 라이브러리는 각 셀렉션 라운드 후의 DNA를 주형으로 하여 조제하였다. 구체적으로 Bartel 등에 의한(Nucleic Acids Res. 1995, 23: 4220-1) 수법에 기초하여 PCR 증폭을 행하고, 7M 요소를 포함하는 10% 폴리아라미드 변성 겔에 의해 증폭된 Ds를 포함하는 1본쇄 DNA 라이브러리를 분리하고, 겔로부터 용출·회수하여 다음 라운드의 라이브러리로서 이용하였다. 또, 1본쇄 DNA 라이브러리의 조제용 프라이머에는 하기 프라이머 세트를 이용하였다.
5'-프라이머: 5'-TTCTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC-3'(서열 번호 151)
3'-프라이머: 5'-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)12-AAGTAGTCACTAATCCGTTCGAGTCATGC-3'(서열 번호 152)
PCR은 Invitrogen사의 AccuPrime Pfx DNA 폴리메라제를 이용하여 400~600μl 부피로 행하였다. 반응 조성은 1×AccuPrime Pfx reaction mix(각종 dNTP 0.3mM, MgSO4 1mM 함유)에 추가로 0.1mM dNTPs(N=A, G, C, T, 최종 농도 0.4mM each dNTP) 및 0.5mM MgSO4(최종 농도 1.5mM)를 가하여 1μM 5'-프라이머, 1μM 3'-프라이머, 50μM dDsTP, 50μM Diol1-dPxTP, 0.05U/μl AccuPrime Pfx DNA 폴리메라제를 이용하고, PCR의 사이클 조건은 (94℃ 30초-65℃ 2분 30초)×12-26사이클이다.
B. 반복 공정에서의 선택 라운드의 조건
셀렉션 라운드는 7회 행하였다. 각 셀렉션 라운드의 조건을 표 7에 나타내었다.
Figure pct00019
단백질-DNA 복합체 형성 조건을 엄격하게 하기 위해, 서서히 단백질과 DNA의 농도를 낮춤과 동시에, 5~7라운드째에는 단백질-DNA 라이브러리를 혼합할 때에 경합하는 DNA 분자로서 지금까지 표적 단백질에 결합하는 DNA 앱타머로서 보고가 있는 DNA 단편을 경합 저해 분자(Competitor)로서 과잉량 가하였다. 이용한 DNA 단편의 염기 서열은 하기와 같다.
ContVG(28-mer): 5'-GCCCGTCTTCCAGACAAGAGTGCAGGGC-3'(서열 번호 153)
(3)셀렉션에 의해 얻어진 DNA 앱타머 서열의 동정
DNA 앱타머 서열의 동정은 하기의 방법을 이용하여 행하였다. 우선, In vitro 셀렉션 7라운드 종료 후에 회수한 1본쇄 DNA의 일부를 주형으로서 인공 염기 기질을 가하지 않고 인공 염기 부위를 천연형 염기로 치환하는 PCR을 행하였다. 얻어진 2본쇄 DNA 라이브러리를 이용하여 제3세대 시퀀서(Life Technologies사, Ion Torrent The Personal Genome Machine™(PGM™))에 의해 대장균에 의한 종래의 클로닝 조작을 행하지 않고 염기 서열을 결정하였다. Ds의 경우, 그 대부분이 A 또는 T로 치환되는 성질을 이용하여 Ds의 위치를 특정하여 목적으로 하는 서열군을 추출하고, 얻어진 DNA 앱타머의 염기 서열을 결정하였다. 구체적으로는 1μM의 5'-프라이머(5'-TTCTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC-3'; 서열 번호 상기 151) 및 3'-프라이머(5'-AAGTAGTCACTAATCCGTTCGAGTCATGC-3'; 서열 번호 154)를 이용하여 Clontech사의 1×Titanium Taq PCR buffer 중에서 0.3mM dNTPs(N=A, G, C, T), 50μM dPa' TP, 1×Titanium Taq의 반응 조성으로 PCR(100μl 부피)을 행하였다. PCR 사이클 조건은 (94℃ 30초-68℃ 2분)×20~25사이클이다.
얻어진 PCR 산물을 실리카 겔 멤브레인 칼럼으로 정제 후, Ion Fragment Library Kit(Life Technologies)에 의해 첨부한 설명서에 기재된 방법으로 라이브러리화하였다. 얻어진 DNA 라이브러리는 Ion Library Quantification Kit(Life Technologies)를 이용하여 정량하고 소정의 농도까지 희석한 후, Ion OneTouch™ Template Kit(Life Technologies)를 이용하여 처리함으로써, Life Technologies사의 The Personal Genome Machine™(PGM™) 해석용 주형 DNA를 조제하였다. Ion Sequencing Kit v2.0(Life Technologies)을 이용하여 Ion Torrent The Personal Genome Machine™에 의해 시퀀싱을 행하고, 얻어진 총 리드수를 CLCBio사의 CLC Genomics Workbench(version 4.7.2)를 이용하여 해석하였다. 구체적으로는 Ds를 포함하는 라이브러리 서열에 대해서는 5'-프라이머 27염기·태그 서열(각종)·43염기로 이루어지는 서열·3'-프라이머의 부분 서열 6염기(GCATGA)를 연속하여 포함하는 것, 또한 Ds를 포함하는 라이브러리의 상보 서열에 대해서는 3'-프라이머의 링커 및 폴리 T의 영역을 제외한 서열 29염기·43염기로 이루어지는 서열·태그 서열(각종)·5'-프라이머의 부분 서열 6염기(GTGGAC)를 연속하여 포함하는 서열을 각각 해석 대상의 서열로서 선별하였다. 그 후, 태그 서열마다 Ds의 위치에 따라 서열을 선별하고, 최종적으로는 합계수 92613의 리드 서열을 해석하였다. 이들 중에서 클론수(=리드수)가 많은 DNA 앱타머는 표적 물질에의 결합 능력이 특히 높은 DNA 앱타머이다. 그래서, 표 8에 클론수가 100 이상인 서열을 나타낸다.
Figure pct00020
*Total counts: 차세대 시퀀서에 의한 서열 해석에 의해 얻어진 총 리드수
Extracted counts: 총 리드수로부터 해석 대상이 되는 서열을 추출하였다.
<실시예 9: VEGF-165에 결합하는 DNA 앱타머의 결합 해석(2)>
표 8에 나타낸 서열로부터 5종류의 서열을 선택하고, GE 헬스케어사의 BIACORE3000를 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 측정에 의해 프라이머 영역을 일부 줄인 57-mer의 DNA 단편(표 9)을 이용하여 VEGF-165에 대한 결합 능력을 해석하였다. 또한, 대조군(control)으로서 이미 보고되어 있는 VEGF-165의 DNA 서열을 포함하는 57-mer의 DNA 단편도 작성하여 해석하였다.
Figure pct00021
*Bound=[단백질 인젝션 개시로부터 930초 후의 Resonance Units]/[고정화한 DNA의 Resonance Units]×[고정화한 DNA의 분자량]/[단백질의 분자량]. SPR의 측정 조건: 유속 20μl/min, 측정 온도 25℃, VEGF-165(10nM)의 인젝션 시간 480초, 해리를 모니터한 시간 480초.
기본적인 방법은 실시예 2에 기재된 방법에 준하였기 때문에, 여기서는 실시예 2와 다른 조건을 중심으로 설명하고 중복되는 부분에 대해서는 원칙적으로 생략하였다.
각 DNA 단편의 SA칩(GE 헬스케어)에의 고정화에 대해서는, PBS 용액으로 25nM이 되도록 희석한 DNA 용액을 폴딩 처리(95℃, 3분간→실온, 10분간→빙상, 5분간→실온)한 후, 최종 농도가 0.005%가 되도록 Nonidet P-40을 가하였다. 그 DNA 용액을 유속 5μl/min로 5μl(1분간 상당) 인젝션함으로써 달성하였다. 또한, 고정화 후, SA칩에 비특이적으로 흡착되어 있는 DNA 단편을 세정하였다. 고정화된 DNA 단편과 VEGF-165의 상호 작용 검출은 2.5nM, 5nM 및 10nM의 VEGF-165 용액을 Kinetic Injection 모드에 의해 인젝션함으로써 모니터하였다. 측정 조건은 유속 20μl/min, 단백질 인젝션은 8분간이다. VEGF-165에의 결합을 조사한 센서 그램을 도 15에 나타낸다.
본 측정 결과, 측정에 이용한 DNA 단편 중에서 VG20Ds-57이 VEGF-165에 대해 특히 강하게 결합하는 것이 명백해졌다. 또한, 이들 DNA 단편 중의 Ds를 천연 염기 A로 치환한 DNA 단편에서는 표적 단백에 대한 결합이 약해지는 것이 판명되었다.
측정에 이용한 DNA 단편에 대해, Biacore3000 부속의 BiaEvaluation 소프트에서 Langmulir with mass transfer의 반응 모델로 커브 피팅(curve fitting)을 행한 바, VG20Ds-57의 해리 상수(Kd)는 5.9pM이며, 기존 앱타머(contVG-57)의 해리 상수(46pM)보다 낮은 값을 나타내는 것이 명백해졌다. 또한, VG20Ds-57의 Ds염기를 천연 염기 A로 치환한 서열 VG20A-57의 해리 상수는 0.22nM이며, VG20Ds-57의 VEGF-165에의 결합이 Ds염기 의존인 것이 입증되었다.
<실시예 10: VG20Ds-57의 서열을 기초로 한 도프 셀렉션>
표적 단백질에의 결합이 강했던 VG20Ds-57의 태그와 랜덤 영역의 서열에 변이를 도입하여 셀렉션을 행함으로써, 앱타머의 최적화와 2차 구조 예측을 행하였다.
도프 셀렉션용 DNA 라이브러리는 VG20Ds-57의 서열을 기초로 하여 실시예 3과 마찬가지로 하여 작성하였다. 도프 셀렉션에 이용한 DNA 라이브러리는 프라이머 영역과 Ds염기 및 태그 서열 3염기 중의 1염기를 고정하고 그 이외의 태그 서열을 포함한 천연 염기 서열 부분은 55%가 원래 염기, 45%가 원래 염기와 다른 염기(3종류의 염기가 15%씩)가 되도록 하여 화학 합성을 행하고, 겔 정제에 의해 조제하였다. 서열은 하기와 같다.
5'-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCACGgtaaactgagtccgaaggggcDstgcagtgaDscccgaatgggtccg
GCATGACTCGAACGGATTAGTGACT-3'(서열 번호 330)
(대문자 고정 서열:소문자 Doped 서열)
a=A:55%; G:15%; C:15%, T:15%
g=A:15%; G:55%; C:15%, T:15%
c=A:15%; G:15%; C:55%, T:15%
t=A:15%; G:15%; C:15%, T:55%
이 라이브러리를 이용하여 실시예 1(2)과 동일한 순서로 각각의 표적 단백질에 결합하는 DNA 앱타머의 셀렉션을 행하였다. 셀렉션 조건은 표 10에 나타내었다.
Figure pct00022
4라운드 후의 셀렉션에 의해 얻어진 앱타머 서열의 시퀀스를 실시예 8(3)에 기재된 방법과 마찬가지로 하여 행하여 합계수 43719의 리드 서열을 해석하였다. 시퀀스 결과로부터 보존율이 높은 영역, co-variation이 일어나고 있는 영역을 동정하고, 그 정보로부터 2차 구조를 예측하였다(도 16a, b). 그 결과, 예를 들면 VG20Ds-57의 A11에서 C11의 변이와 같이 예측한 구조를 안정화하는 듯한 1염기의 변이가 확인되었다. 이 1염기 변이를 포함하는 47-mer까지 줄인 VEGF-165에 결합하는 DNA 단편(VGd1-2Ds-47; 서열 번호 198)(도 17a)을 이용하여 실시예 9와 동일한 수순에 의해 SPR로 결합 해석을 행하였다(도 17b, 도 18). 그 결과, VGd1-2Ds-47의 Kd는 4.6pM이며, 천연 염기로 이루어지는 기존 DNA 앱타머의 Kd값 44pM(contVG-47; 서열 번호 200)보다도 1자리수 낮았다. 이는 VGd1-2Ds-47이 기존 DNA 앱타머보다도 표적 단백질에 대해 약 10배의 강도로 결합할 수 있는 것을 나타내고 있다. 또한, VGd1-2Ds-47과 비표적 단백질(VEGF-121(Peprotech), EGF(Peprotech), Thrombin(Enzyme research laboratories), BSA(Sigma Aldrich)의 결합을 조사한 결과, VGd1-2Ds-47은 표적 단백질에 선택적으로 결합하는 것이 나타났다(도 17b).
나아가 앱타머를 줄인 여러 가지 변형 또는 Ds염기를 A로 치환한 변형을 표 11에 나타내는 바와 같이 각각 제작하였다.
Figure pct00023
항VEGF-165 앱타머(VGd1-2Ds-47)와 그 변형의 각 서열 및 SPR로부터 구한 각 DNA 단편의 VEGF-165에 대한 결합 능력 해석 결과
a)contVG의 서열은 이탤릭체 및 밑줄로 나타내었다.
b)Bound=[단백질 인젝션 개시로부터 930초 후의 Resonance Units]/[고정화한 DNA의 Resonance Units]×[고정화한 DNA의 분자량]/[VEGF-165의 분자량]. SPR의 측정 조건: 유속 20μl/min, 측정 온도 25℃, VEGF-165(10nM)의 인젝션 시간 480초, 해리를 모니터한 시간 480초. 센서 그램은 도 18에 나타낸다. 해리 상수는 글로벌 피팅에 의해 산출하였다.
표적 단백질과의 결합을 조사한 바, 5' 말단의 프라이머 영역을 줄인 45-mer의 변형(VGd1-2Ds-45; 서열 번호 202)에서는 Kd값이 16pM이었다(도 17b, 표 11). 이 45-mer의 DNA 단편의 Ds염기를 A로 치환한 변형(VGd1-2A-45; 서열 번호 203)의 결합 해석 결과로부터, VGd1-2Ds-45에서는 Ds22 및 Ds33의 2개의 Ds염기가 결합에 강하게 관여하고 있는 것이 판명되었다. 또, VGd1-2Ds-47에 대해서는 2개의 Ds염기에 끼워진 Stem-2가 특히 크게 결합에 관여하고 있는 것이 명백해졌다. 또한, 36-mer의 변형(VGd1-2Ds-36b; 서열 번호 212)에서는 Kd값이 17pM이었다(도 17b, 표 11). 이 결과로부터, VGd1-2Ds-47에 관련된 염기 서열을 가지는 항VEGF-165 앱타머에서는 서열 번호 212에 나타내는 염기 서열을 포함하는 DNA 앱타머이면 VEGF-165에의 결합 활성을 가지는 것이 나타났다.
본 발명의 핵산 앱타머에 있어서, 비천연형 뉴클레오티드는 원칙적으로 천연형 뉴클레오티드와는 염기 대합하지 않는다. 따라서, 핵산 앱타머의 염기 서열 중에 비천연형 뉴클레오티드(예를 들면, Ds)가 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상 존재함으로써 예측되는 2차 구조 후보의 몇 개는 배제되게 된다. 즉, 본 발명의 핵산 앱타머에 의하면, 종래의 핵산 앱타머와 비교하여 예측 2차 구조의 엄선이 가능해지고 보다 정확한 2차 구조를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 앱타머에 의하면, 보다 정확성이 높은 2차 구조를 예측할 수 있음으로써, 그 핵산 앱타머의 2차 구조에 기초한 임의의 염기 서열을 가지는 다른 파생형 핵산 앱타머를 구축할 수도 있다.
<실시예 11: IFN-γ에 결합하는 DNA 앱타머의 제작>
실시예 8과 동일한 방법을 이용하여 IFN-γ에 강고하게 결합하는 DNA 앱타머를 제작하였다. 기본적으로는 실시예 8에 기재된 방법과 동일하고, 이에 준하여 행하고 있다.
(1)인공 염기 Ds를 중앙 영역의 특정 부위에 포함하는 1본쇄 DNA 라이브러리의 조제
실시예 1에서 조제한 1본쇄 DNA 라이브러리를 이용하였다.
(2)IFN-γ에 결합하는 Ds를 포함하는 1본쇄 DNA 앱타머의 제조
기본적인 수순 등은 실시예 8에 기재된 방법에 준하였다. 따라서, 여기서는 실시예 8과 중복되는 부분에 대해서는 원칙적으로 기재를 생략하고 다른 부분을 중심으로 설명한다.
A. 셀렉션 1라운드의 조작
(i)표적 단백질과 DNA 라이브러리의 결합
DNA 분자 내에서의 고차 구조를 형성시키기 위해 폴딩 처리를 행하고, 그 후, Nonidet P-40을 포함하는 PBS 용액과 혼합하여 Nonidet P-40의 최종 농도가 0.005%가 되도록 조제하였다. 그 핵산 용액을 스트렙트아비딘 자기 비즈와 혼합하고 상청액을 IFN-γ(Peprotech)와 혼합하여 DNA-단백질 복합체를 형성시켰다.
(ii)표적 단백질에 결합한 DNA 서열의 선별
실시예 8에 기재된 방법에 준하여 행하였다.
(iii)1본쇄 DNA 라이브러리의 조제(증폭)
실시예 8에 기재된 방법에 준하여 행하였다. 셀렉션 라운드는 7회로 하고, 각 셀렉션 라운드의 조건을 상기 표 7에 나타내었다. 단백질-DNA 복합체 형성 조건을 엄격하게 하기 위해 경합 저해 분자(Competitor)로서 이하의 염기 서열을 가지는 DNA 단편을 과잉량 가하였다.
ContIF(26-mer): 5'-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGT-3'(서열 번호 228)
(3)셀렉션에 의해 얻어진 DNA 앱타머 서열의 동정
DNA 앱타머 서열의 동정은 실시예 8에 기재된 방법에 준하여 행하고, 최종적으로 합계수 21242의 리드 서열을 해석하였다. 이들 중에서 클론수(=리드수)가 많은 DNA 앱타머는 표적 물질에의 결합 능력이 특히 높은 DNA 앱타머이다. 그래서, 클론수가 100 이상이었던 서열을 표 12에 나타낸다.
Figure pct00024
*Total counts: 차세대 시퀀서에 의한 서열 해석에 의해 얻어진 총 리드수
Extracted counts: 총 리드수로부터 해석 대상이 되는 서열을 추출하였다.
<실시예 12: IFN-γ에 결합하는 DNA 앱타머의 결합 해석>
표 12에 나타낸 서열로부터 5종류의 서열을 선택하고, 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 프라이머 영역을 일부 줄인 57-mer의 DNA 단편(표 13)을 이용하여 IFN-γ에 대한 결합 능력을 해석하였다. 또한, 컨트롤로서 이미 보고되어 있는 IFN-γ의 DNA 서열을 포함하는 57-mer의 DNA 단편도 작성하여 해석하였다.
Figure pct00025
*Bound=[단백질 인젝션 개시로부터 930초 후의 Resonance Units]/[고정화한 DNA의 Resonance Units]×[고정화한 DNA의 분자량]/[단백질의 분자량]. SPR의 측정 조건: 유속 20μl/min, 측정 온도 25℃, IFN-γ(150nM)의 인젝션 시간 480초, 해리를 모니터한 시간 480초.
기본적인 방법은 실시예 9에 기재된 방법에 준하였기 때문에, 여기서는 실시예 9와 다른 조건을 중심으로 설명하고 중복되는 부분에 대해서는 원칙적으로 생략하였다. IFN-γ에의 결합을 조사한 센서 그램을 도 19에 나타낸다.
본 측정 결과, 측정에 이용한 DNA 단편 중에서 IF07b-57이 IFN-γ에 대해 가장 강하게 결합하는 것이 명백해졌다. 또한, 이들 DNA 단편 중의 Ds를 천연 염기 A로 치환한 DNA 단편에서는 표적 단백에 대한 결합이 약해지는 것도 판명되었다.
측정에 이용한 DNA 단편에 대해 실시예 9와 마찬가지로 커브 피팅을 행한 바, IF07b-57의 해리 상수(Kd)는 2nM이며, 기존 천연 염기로 이루어지는 앱타머(contIF-57)의 해리 상수(67nM)보다도 낮은 값을 나타내고 표적 단백질과 강하게 결합하는 것이 명백해졌다.
<실시예 13: IF07b-57의 서열을 기초로 한 도프 셀렉션>
실시예 10과 마찬가지로 표적 단백질에의 결합이 강했던 IF07b-57의 태그와 랜덤 영역의 서열에 변이를 도입하여 셀렉션을 행함으로써, 앱타머의 최적화와 2차 구조 예측을 행하였다. 기본적인 조작은 실시예 10에 기재된 방법에 준하였다. DNA 앱타머의 각 라운드의 셀렉션은 상기 표 10에 나타낸 조건으로 행하였다.
4라운드 후의 셀렉션에 의해 얻어진 앱타머 서열의 시퀀스를 행하여 73918의 리드 서열을 해석하였다. 시퀀스 결과로부터 저장률이 높은 영역, co-variation가 일어나고 있는 영역을 동정하고, 그 정보로부터 2차 구조를 예측하였다(도 20a, b).
그 결과, 예를 들면 IF07b-57의 G13에서 A13의 변이와 같이 예측한 구조를 안정화하는 1염기의 변이가 확인되었다. 이 1염기 변이를 포함하는 47-mer까지 줄인 IFN-γ에 결합하는 DNA 단편(IFd1-3Ds-49; 서열 번호 214)(도 21a)을 이용하여 SPR로 결합 해석을 행한 결과, IFd1-3Ds-49의 Kd는 1.6nM이며, 천연 염기로 이루어지는 기존 DNA 앱타머의 Kd값 76nM(cont IF-49; 서열 번호 224)보다도 높았다(도 21b, 도 22). 이는 IFd1-3Ds-49가 기존 DNA 앱타머보다도 표적 단백질에 40배 이상의 강도로 결합할 수 있는 것을 나타내고 있다. 또한, IFd1-3Ds-49와 비표적 단백질(VEGF-121(Peprotech), EGF(Peprotech), Thrombin(Enzyme research laboratories), BSA(Sigma Aldrich)의 결합을 조사한 결과, IFd1-3Ds-49는 표적 단백질인 IFN-γ에 선택적으로 결합하는 것이 나타났다(도 21a). 나아가 앱타머를 줄인 여러 가지 변형 또는 Ds염기를 A로 치환한 변형을 표 14와 같이 각각 제작하였다.
Figure pct00026
항IFN-γ 앱타머(IFd1-3Ds-49)와 그 변형의 각 서열 및 SPR로부터 구한 각 DNA 단편의 IFN-γ에 대한 결합 능력 해석 결과
a)contIF의 서열은 이탤릭체 및 밑줄로 나타내었다.
b)Bound=[단백질 인젝션 개시로부터 930초 후의 Resonance Units]/[고정화한 DNA의 Resonance Units]×[고정화한 DNA의 분자량]/[IFN-γ의 분자량]. SPR의 측정 조건: 유속 20μl/min, 측정 온도 25℃, IFN-γ(150nM)의 인젝션 시간 480초, 해리를 모니터한 시간 480초. 측정 버퍼: 1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4, 205mM NaCl, pH 7.4. 센서 그램은 도 22에 나타낸다. 해리 상수는 글로벌 피팅에 의해 산출하였다.
c)이들 해리 상수에 대해서는 비특이적인 흡착이 보였기 때문에, Rmax는 local fitting으로 하고 그 밖에는 글로벌 피팅에 의해 산출하였다.
표적 단백질과의 결합을 조사한 바, 5' 말단의 프라이머 영역을 줄인 45-mer의 변형(IFd1-3Ds-45; 서열 번호 215)에서는 Kd값이 15nM이었다(도 21b, 도 22). 이 결과로부터, 도 20b에서 나타내는 IFd1-3Ds-49에서 Stem-1이 IFN-γ에의 결합 활성에 필수적이 아닌 것을 나타내고 있다. 또한, 이 45-mer의 DNA 단편의 Ds염기를 A로 치환한 변형(IFd1-A2Ds-45; 서열 번호 219, IFd1-2DsA-45; 서열 번호 220, IFd1-DsADs-45; 서열 번호 221, IFd1-2ADs-45; 서열 번호 222, IFd1-3A-45; 서열 번호 223)의 결합 해석 결과로부터, IFd1-3Ds-45에서는 Ds29 및 Ds40의 2개의 Ds염기가 결합에 강하게 관여하고 있는 것이 판명되었다. 단, 결합에는 Ds29 또는 Ds40 중 어느 한쪽의 Ds염기를 가지고 있으면 되는 것도 판명되었다. 한편, Ds18은 결합에 필수적이 아닌 것도 판명되었다. IFd1-3Ds-49에서는 Stem-1, Stem-2의 구조 정보 이외에는 미지이지만, 4개의 G트랙트가 보존성이 높은 영역에서 보이고 있고 G-쿼텟 구조를 형성하고 있을 가능성도 있다. G쿼텟 구조는 여러 가지 기존 DNA 앱타머나 단백질과의 상호 작용에 중요한 모티프의 하나이다. 따라서, Ds염기를 도입함으로써 G-쿼텟 구조 등의 특이한 모티프의 다양성도 증강할 수 있다는 것이 시사되었다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고하여 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> RIKEN TagCyx Biotechnologies <120> Method for producing functional nucleic acid with nucleic acid library containing unnatural bases <130> PH-5384-PCT <150> JP 2011-253357 <151> 2011-11-18 <150> JP 2012-148962 <151> 2012-07-02 <160> 330 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 ctgtcaatcg atcgtatcag tccac 25 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 2 gcatgactcg aacggattag tgactac 27 <210> 3 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (41) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (42)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacaannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 4 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(55) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (57)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacatnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 5 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(43) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (45)..(59) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (61)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacagnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 6 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(37) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (39)..(53) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (55)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 6 ctgtcaatcg atcgtatcag tccactannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 7 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(37) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (39)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (46) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (47)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 7 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacttnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 8 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (53)..(59) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (61)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 ctgtcaatcg atcgtatcag tccactgnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 9 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(37) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (39)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (50)..(59) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (61)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 ctgtcaatcg atcgtatcag tccactcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 10 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (46) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (47)..(55) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (57)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (63) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (64)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacgannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 11 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(34) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (36)..(41) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (43)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (53)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacgtnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 12 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(38) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (40)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (50)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (63) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (64)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 ctgtcaatcg atcgtatcag tccaccannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 13 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (28)..(38) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (40)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (53) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (54)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (63) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (64)..(70) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacctnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn gcatgactcg aacggattag tgactac 97 <210> 14 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(37) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (39)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (55) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (56)..(61) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (62) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (63)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 ctgtcaatcg atcgtatcag tccaccagnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 15 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(37) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (39)..(44) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (46)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (53)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 ctgtcaatcg atcgtatcag tccaccatnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 16 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(44) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (46)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (53)..(58) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (59) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (60)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 16 ctgtcaatcg atcgtatcag tccactatnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 17 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(44) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (46)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (53)..(61) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (62) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (63)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacttann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 18 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (53)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (58)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 18 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacgctnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 19 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(50) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (52)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (58)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacccann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 20 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(49) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (50) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (51)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (58)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 20 ctgtcaatcg atcgtatcag tccaccctnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 21 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (50)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (58)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 21 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacggann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 22 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (48) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (49)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (58)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacggtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 23 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(46) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (47) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (48)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (58)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 ctgtcaatcg atcgtatcag tccaccgann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 24 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (29)..(46) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (47) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (48)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (58) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (59)..(71) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 ctgtcaatcg atcgtatcag tccaccgtnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn ngcatgactc gaacggatta gtgactac 98 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 25 aagtgttctg gagacnctta ggatgtcgcg gaggggtgcg gcctt 45 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 26 aaaaatgcga gggtcngtgg cgtaggttcg gaaattttgt tatgt 45 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 27 aaaaatgcgg gggtcngtgg cgtaggttcg gaaattttgt tatgt 45 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 28 atggaattgt ggggccggaa tctgttatgt ntgccaggaa ggagc 45 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 29 atggaaatgt ggggccggaa tctgttatgt ntgccaggaa ggagc 45 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 30 atcttgcacg cggggggttc tggtgtagga ncggagggaa agtgc 45 <210> 31 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 31 gaggaatgtc cagcgctggg nttggagggg ngtcggantg ggctc 45 <210> 32 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 32 gagggcggct taaacaaggg nttggggggg ngtcggtngt aaggc 45 <210> 33 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 33 gatgaagagg gtggcgtccg nacggggggg naggtatnca cgtag 45 <210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 34 gtctaagtan ggtgggnttg gcggggntgt cggatatact ttgac 45 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 35 cacaatattc gggnttggag gggngtcggg tggatagntg gtgct 45 <210> 36 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 36 ggtagggtaa gtaggtattg ccngtcgtag cntggatggc gtgccg 46 <210> 37 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 37 cgattcctta tcctaggact tntttccgcg cncacgtgct cagatt 46 <210> 38 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 38 cgattccttt tcctaggact tntttccgcg cncacgtgct cagatt 46 <210> 39 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 39 aacgggcggt gggcgncggg cagtattggg tcccgttgtg gggcc 45 <210> 40 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 40 aaggtctggg ggatancgta gctagggtcg aggtgtcacc ttggg 45 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 41 atcttcacta taacgtacgt tcgctcatct ntggtggtcg gtgga 45 <210> 42 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 42 aggcgcgggg gttttgggng caggcaacgg agccnggggg caaca 45 <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is synthetic base; 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<213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 71 cgatatggta gggttgtagg gnttggtggg gngccggtgg aaaccc 46 <210> 72 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 72 cgagtttggt tagtggtctg gnttagggag ancctcggtg aaatga 46 <210> 73 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 73 cgtcggccgg aatctggcag 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<222> (10)..(10) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 101 ttcgaaggan catgggnttg gcggggntgt cggagagcct tagaa 45 <210> 102 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 102 gcggaggtan tatgggnttg ggggggntgt cggaaatact tatgc 45 <210> 103 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 103 atgcaagaan ttagggnttg gaggggntgt cggttatatt ttaaa 45 <210> 104 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 104 gtgttaatan tatgggnttg ggggggntgt cggaaatgtt aagcc 45 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 105 gggnttggng gggntgtcgg 20 <210> 106 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 106 tgtctaagta nggtgggntt ggcggggntg tcgga 35 <210> 107 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 107 tgtctaagta aggtgggntt ggcggggntg tcgga 35 <210> 108 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 108 tgtctaagta nggtgggatt ggcggggntg tcgga 35 <210> 109 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 109 tgtctaagta nggtgggntt ggcggggatg tcgga 35 <210> 110 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 110 tgtctaagta aggtgggatt ggcggggatg tcgga 35 <210> 111 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 111 tgtctaagta ntgtgggntt ggaggggntg tcgga 35 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 112 acgcatgaac aaacttgctt g 21 <210> 113 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 113 acaatgaaac ttctgcgtac tcc 23 <210> 114 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(66) <223> n is a, c, g, t, or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 114 acgcatgaac aaacttgctt gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 115 tgaatctgaa atccaatgtt ccca 24 <210> 116 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 116 taccagccac gttgcggttc caag 24 <210> 117 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 117 acctcattgt tttaaccctt caag 24 <210> 118 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 118 gtactctgta agtatgttca caag 24 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 119 gtaccaacac attatcaact caag 24 <210> 120 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 120 acgcatgaac aaacttgctt gcgtacgcgg aggggggcgg cctgggaaca ttggatttca 60 gattcaggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 121 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 121 acgcatgaac aaacttgctt gcgtacgcgg tggggggcgg cctgggaaca ttggatttca 60 gattcaggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 122 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 122 acgcatgaac aaacttgctt gcgtacgcgg tggggggcgg cctgggaaca ttggatttca 60 gattccggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 123 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 123 acgcatgaac aaacttgctt ggaaccgcat cgtggctggt agtggccgaa tggggggtgg 60 tgagcgggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 124 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 124 acgcatgaac aaacttgctt ggaaccgcaa cgtggctggt agcggccgaa tggggggtgg 60 tgagcgggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 125 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 125 acgcatgaac aaacttgctt ggaaccgcaa cgtggctggt agtggccgaa tggggggtgg 60 tgagcgggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 126 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 126 acgcatgaac aaacttgctt gaagggttaa aacaatgagg tacgcggggg ggtgggtgta 60 ggtgtcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 127 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 127 acgcatgaac aaacttgctt gaagggttaa aactatgagg tacgcggggg ggtgggtgta 60 ggtgtcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 128 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 128 acgcatgaac aaacttgctt gaagggttga aactatgagg tacgcggggg ggtgggtgta 60 ggtgtcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 129 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 129 acgcatgaac aaacttgctt ggagggttaa aactatgagg tacgcggggg ggtgggtgta 60 ggtgtcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 130 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 130 acgcatgaac aaacttgctt gtgaacatgc ttactgagta cgcgggggtc ggtgggtgta 60 ggtggcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 131 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 131 acgcatgaac aaacttgctt gtgaacatgc ttactgagta cgcgggggtc ggagggtgta 60 ggtggcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 132 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 132 acgcatgaac aaacttgctt gtgaacatgc ttacagagta cgcgggggtc ggtgggtgta 60 ggtggcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 133 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 133 acgcatgaac aaacttgctt gtgaacatgc ttacagagta cgcgggggtc ggagggtgta 60 ggtggcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 134 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 134 acgcatgaac aaacttgctt gtgaacattc ttacagagta cgcgggggtc ggagggtgta 60 ggtggcagag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 135 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 135 acgcatgaac aaacttgctt gagttgataa tgtgttggta cgcggggggg ttgaggtgta 60 ggtttcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 136 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 136 acgcatgaac aaacttgctt gagttgatta tgtgttggta cgcggggggg tggaggtgta 60 ggtttcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 137 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 137 acgcatgaac aaacttgctt gatactaaga taaccgcggg gggggggagg tgtagtcgga 60 gggatcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 138 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 138 acgcatgaac aaacttgctt gcatgttgac ttcaaaagta cgcgggggtt tcgggctgca 60 ggtggcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 139 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 139 acgcatgaac aaacttgctt gcatgttgac ttcaaaagta cgcggggggg tggaggtgta 60 ggtttcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 140 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 140 acgcatgaac aaacttgctt gtaactacat gatacactag tacgcggggg gtgggggtgt 60 aggtgcggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 141 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 141 acgcatgaac aaacttgctt gcaatcggtg aacttaagtt acgcgggggt atagggtgta 60 ggttacggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 142 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 142 acgcatgaac aaacttgctt gctacattgg gtggtgtccg gcgggggggg taagtatgta 60 gggattggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 143 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 143 acgcatgaac aaacttgctt gtggacgggc aaggggtggg gtccgaaagg gggggcagga 60 tgcgttggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 144 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 144 acgcatgaac aaacttgctt gtagtcccgc tttgcggggg gtttgggtgc aggttgcgga 60 taagtgggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 145 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 145 acgcatgaac aaacttgctt ggatggtagt ggccggaagg ggggtaatat attaagttgg 60 ggattgggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 146 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 146 acgcatgaac aaacttgctt gaggggcatt tacgcggggg ggtgggtgca ggtatcggat 60 gtgaatggag tacgcagaag tttcattgt 89 <210> 147 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 147 tgtgggggtg gacgggccgg gtaga 25 <210> 148 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> t is biotinylated thymine <400> 148 tgtagtcact aatccgttcg agtcatgc 28 <210> 149 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 149 gtagtcacta atccgttcga gtcatgc 27 <210> 150 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> t is biotinylated thymine <400> 150 tacaatgaaa cttctgcgta ctcc 24 <210> 151 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 151 ttctgtcaat cgatcgtatc agtccac 27 <210> 152 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is a linker consisting of alkylen group; -(CH2)12-, not a base, and not a nucleotide <400> 152 tttttttttt tttttnaagt agtcactaat ccgttcgagt catgc 45 <210> 153 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 153 gcccgtcttc cagacaagag tgcagggc 28 <210> 154 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 154 aagtagtcac taatccgttc gagtcatgc 29 <210> 155 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 155 atcgagcgtg aggtccgaaa ggcgactctt ntaacatcaa gtaat 45 <210> 156 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 156 atacgcgggg gtgttgaagg gttagtcgga ngtagtgtgt acaga 45 <210> 157 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 157 aaagtgctgg gtccgnatgg cggggggtta ggcctctttg gggcg 45 <210> 158 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 158 aatcgcggtt ccgtgntggc gggtgaaggt tatggtttgg tgtgg 45 <210> 159 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 159 ggtaaactga gtccgaaggg gcntgcagtg ancccgaatg ggtccg 46 <210> 160 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 160 ggtgaatccg gcagagatca ctntacgctt gntgcctctt taattc 46 <210> 161 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 161 ggtttaggcg tctttagggg gtngaggtcg gnttttaccg cggtgt 46 <210> 162 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is a or synthetic base; 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tccacaagcc cgtcttccag acaagagtgc agggc 45 <210> 205 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 205 gtaaactgag tccgaagggg cntgcagtga ncccgaatgg gtccg 45 <210> 206 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 206 gtaaactgcg tccgaagggg cntgcagtga acccgaatgg gtccg 45 <210> 207 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 207 gtaaactgcg tccgaagggg catgcagtga ncccgaatgg gtccg 45 <210> 208 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 208 tttttgtaaa ctgcgtccga aggggcntgc agtgancccg aatgggtccg 50 <210> 209 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 209 actgcgtccg aaggggcntg cagtganccc gaatgggtcc g 41 <210> 210 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 210 gtccgaaggg gcntgcagtg ancccgaatg ggtccg 36 <210> 211 <211> 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<220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 216 tcgggtcgtt tantaatgta ggtntgggct aggcngctag tggat 45 <210> 217 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 217 atcagtccac tcgggtcgtt tantaatgta ggtntgggct aggcngctag tggatg 56 <210> 218 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 218 tgacctcggg tcatttanta atgtaggtnt gggctaggcn gctaggtca 49 <210> 219 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 219 tcgggtcatt taataatgta ggtntgggct aggcngctag tggat 45 <210> 220 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 220 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct aggcagctag tggat 45 <210> 221 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 221 tcgggtcatt tantaatgta ggtatgggct aggcngctag tggat 45 <210> 222 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 222 tcgggtcatt taataatgta ggtatgggct aggcngctag tggat 45 <210> 223 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 223 tcgggtcatt taataatgta ggtatgggct aggcagctag tggat 45 <210> 224 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 224 aatcgatcgt atcagtccac aatggggttg gttgtgttgg gtgttgtgt 49 <210> 225 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 225 cacaatgcta gagcattgcg tagaagcttg atatgttgct ggcccggac 49 <210> 226 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 226 ggggttggtt gtgttgggtg ttgtgt 26 <210> 227 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 227 gggtgtggtg tgtgtgtgtg tgttgt 26 <210> 228 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 228 ggggttggtt gtgttgggtg ttgtgt 26 <210> 229 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 229 gtaaactgcg tccgaagggg cntgcagtga ncccgaatgg gtccg 45 <210> 230 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a or synthetic base; 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279 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct aggcngctag tggat 45 <210> 280 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 280 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct aggcngttag tggat 45 <210> 281 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 281 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct 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304 tcgggtcgtt tangaacgta ggtntgggct aggcngttag tggat 45 <210> 305 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 305 tcgggtcatt tangaatgta ggtntgggct aggcngctag gggac 45 <210> 306 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 306 tcgggtcatt gantaatgta ggtntgggct aggcngctag tggat 45 <210> 307 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 307 tcgggtcatt tgngaatgta ggtntgggct aggcngctag tggat 45 <210> 308 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 308 tcgggtcatt tcntaatgta ggtntgggct aggcngctag tggat 45 <210> 309 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 309 tcgggtcttt tantaaagta ggtntgggct aggcngctag tggat 45 <210> 310 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 310 tcgggtcatt tcntaatgta ggtntgggct aggcngttag tggat 45 <210> 311 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 311 tcgggtcgtt tantaatgta ggtntgggct aggcngttag tggat 45 <210> 312 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 312 tcgggtcatt tgntaatgta ggtntgggct aggcngctag gggac 45 <210> 313 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 313 tcgggtcgtt tgntaacgta ggtntgggct aggcngttag tggat 45 <210> 314 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 314 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct aggcngctag tggag 45 <210> 315 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 315 tcgggtcact tantagtgta ggtntgggct aggcngttag tggat 45 <210> 316 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 316 tcgggtcatt tanaaatgta ggtntgggct aggcngctag tggat 45 <210> 317 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 317 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct aggcngttag gggac 45 <210> 318 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 318 tcgggtaatt tantaattta ggtntgggct aggcngctag tggat 45 <210> 319 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 319 tcgggtcaat tantattgta ggtntgggct aggcngttag tggat 45 <210> 320 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 320 tcgggtcatt tantaatgta ggtntggcgt aggcngctag tggat 45 <210> 321 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 321 tcgggtcatt gantaatgta ggtntgggct aggcngttag tggac 45 <210> 322 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 322 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct aggcngtatg tggat 45 <210> 323 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 323 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct aggcngttag tgggt 45 <210> 324 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 324 tcgggtcatt cangaatgta ggtntgggct aggcngctag tggac 45 <210> 325 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 325 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct aggcngttag tggaa 45 <210> 326 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 326 tcgggtcatt aantaatgta ggtntgggct aggcngttag tggat 45 <210> 327 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 327 tcgggtcatt tantaatgta ggtntgggct aggcngtcag tggac 45 <210> 328 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a or synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 328 tcgggtcatt tgngaatgta ggtntgggct aggcngctag tggac 45 <210> 329 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 329 ttgcactctg tgggggtgga cgggccgggt agata 35 <210> 330 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is synthetic base; Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine) <400> 330 ctgtcaatcg atcgtatcag tccacggtaa actgagtccg aaggggcntg cagtganccc 60 gaatgggtcc ggcatgactc gaacggatta gtgact 96

Claims (38)

  1. 천연형 뉴클레오티드;
    인공 염기 대합(pairing) 가능한 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드를 포함하고, 또한
    전사 또는 복제 가능한 핵산 앱타머.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 인공 염기가 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, 2-nitropyrrole-1-yl 및 2-formyl-1H-pyrrole-1-yl로 이루어지는 군에서 선택되는 핵산 앱타머.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 인공 염기의 인공 염기 대합 가능한 유도체를 포함하는 핵산 앱타머.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비천연형 뉴클레오티드의 함유율이 전체 뉴클레오티드 수의 20% 이하인 핵산 앱타머.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산이 DNA 또는 RNA인 핵산 앱타머.
  6. 청구항 1에 있어서,
    혈관 내피 세포 증식 인자를 표적 물질로 하는 핵산 앱타머.
  7. 청구항 6에 있어서,
    서열 번호 25~73, 80~104, 106~109, 111, 155~166(단, 서열 중의 n을 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl로 함), 175, 177, 179, 181, 183, 198, 201, 202, 205~209, 211, 212 및 229~278로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 핵산 앱타머.
  8. 청구항 7에 있어서,
    청구항 7에 기재된 어느 하나의 염기 서열, 그 5' 말단측에 인접하는 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열 및 그 3' 말단측에 인접하는 서열 번호 2로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 핵산 앱타머.
  9. 청구항 1에 있어서,
    인터페론γ를 표적 물질로 하는 핵산 앱타머.
  10. 청구항 9에 있어서,
    서열 번호 167~174(단, 서열 중의 n을 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl로 함), 186, 188, 190, 192, 194, 214~222 및 279~328로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 핵산 앱타머.
  11. 청구항 10에 있어서,
    청구항 10에 기재된 어느 하나의 염기 서열, 그 5' 말단측에 인접하는 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열 및 그 3' 말단측에 인접하는 서열 번호 2로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 핵산 앱타머.
  12. 천연형 뉴클레오티드와
    인공 염기 대합 가능한 인공 염기를 가지는 비천연형 뉴클레오티드로 구성되는 전사 또는 복제 가능한 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 포함하는 1본쇄 핵산 라이브러리.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자에서의 비천연형 뉴클레오티드의 함유율이 전체 뉴클레오티드의 20% 이하인 1본쇄 핵산 라이브러리.
  14. 청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
    1본쇄 핵산 분자의 5' 말단 및 3' 말단에 위치하고, 각각이 공통되는 기지의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 결합 영역 및 그 프라이머 결합 영역 사이에 위치하는 중앙 영역을 포함하는 1본쇄 핵산 라이브러리.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 중앙 영역의 적어도 한쪽 말단에 상기 프라이머 결합 영역에 인접하도록 배치되고, 그 중앙 영역의 염기 서열 상의 특정 위치에 배치된 하나 이상의 인공 염기의 위치 정보와 관련된 천연형 뉴클레오티드로 구성되는 식별 부위를 더 포함하는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자로 이루어지는 1본쇄 핵산 라이브러리.
  16. 핵산 앱타머의 제조 방법으로서,
    청구항 12 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 기재된 1본쇄 핵산 라이브러리와 표적 물질을 용액 중에서 혼합하여 1본쇄 핵산 분자와 표적 물질의 복합체를 형성시키는 복합체 형성 공정,
    상기 복합체를 회수하는 복합체 회수 공정,
    상기 회수된 복합체로부터 1본쇄 핵산 분자를 회수하는 1본쇄 핵산 분자 회수 공정,
    상기 회수된 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 증폭 공정 및
    상기 증폭 공정 후에 얻어진 핵산 분자를 핵산 앱타머로 조제하는 핵산 앱타머 조제 공정을 포함하는 상기 제조 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    핵산 앱타머 조제 공정에서 조제된 핵산 앱타머를 새로운 1본쇄 핵산 라이브러리에 이용하여 상기 복합체 형성 공정부터 핵산 앱타머 조제 공정까지를 새로 1회 이상 반복하는 반복 공정을 더 포함하는 제조 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 반복 횟수가 15회 이하인 제조 방법.
  19. 청구항 16 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 앱타머가 DNA 앱타머 또는 RNA 앱타머인 제조 방법.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 핵산 앱타머가 RNA 앱타머일 때에, 상기 증폭 공정이 역전사 단계, DNA 증폭 단계 및 전사 단계를 포함하는 제조 방법.
  21. 청구항 16 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인공 염기가 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, 2-nitropyrrole-1-yl 및 2-formyl-1H-pyrrole-1-yl에서 선택되는 제조 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 인공 염기의 인공 염기 대합 가능한 유도체를 포함하는 제조 방법.
  23. 청구항 14에 기재된 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법으로서,
    천연형 뉴클레오티드를 기질로서 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 상기 선택된 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 제1 증폭 공정,
    상기 제1 증폭 공정 후에 얻어지는 천연형 뉴클레오티드만으로 구성된 증폭 산물로부터 단일 클론을 얻는 클로닝 공정,
    천연형 뉴클레오티드 및 비천연형 뉴클레오티드를 기질로 하여 상기 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 상기 선택된 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 제2 증폭 공정,
    상기 클로닝 공정에서 얻어진 단일 클론을 프로브로 하여 상기 제2 증폭 공정 후에 얻어지는 증폭 산물로부터 단일 클론 유래의 1본쇄 핵산 분자를 단리하는 1본쇄 핵산 분자 단리 공정, 및
    상기 1본쇄 핵산 분자 단리 공정에서 단리된 단일 클론 유래의 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 염기 서열 결정 공정을 포함하는 상기 방법.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 1본쇄 핵산 분자 단리 공정에서 고상 담체에 고정화한 프로브를 이용하는 방법.
  25. 청구항 23 또는 청구항 24에 있어서,
    상기 1본쇄 핵산 분자 단리 공정에서 단리된 단일 클론 유래의 1본쇄 핵산 분자가 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  26. 청구항 15에 기재된 1본쇄 핵산 라이브러리로부터 선택되는 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열을 결정하는 방법으로서,
    천연형 뉴클레오티드를 기질로 하여 프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 상기 선택된 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자를 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 제3 증폭 공정,
    상기 증폭 공정 후에 얻어지는 천연형 뉴클레오티드만으로 구성된 증폭 산물로부터 단일 클론을 얻는 클로닝 공정,
    상기 클로닝 공정 후에 얻어지는 단일 클론의 염기 서열을 결정하는 염기 서열 결정 공정, 및
    상기 단일 클론의 염기 서열에서의 식별 영역의 염기 서열에 기초하여 그 단일 클론의 주형이 된 비천연형 뉴클레오티드 함유 1본쇄 핵산 분자의 염기 서열 상의 인공 염기의 위치를 결정하는 인공 염기 위치 결정 공정을 포함하는 상기 방법.
  27. 청구항 23 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인공 염기가 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, 2-nitropyrrole-1-yl 및 2-formyl-1H-pyrrole-1-yl로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 인공 염기의 인공 염기 대합 가능한 유도체를 포함하는 방법.
  29. 청구항 23 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1본쇄 핵산 라이브러리를 구성하는 1본쇄 핵산 분자가 DNA 또는 RNA인 방법.
  30. 청구항 26 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    1본쇄 핵산 분자가 RNA일 때에, 상기 증폭 공정 또는 제1~제3 증폭 공정이 역전사 단계, DNA 증폭 단계 및 전사 단계를 포함하는 방법.
  31. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 기재된 핵산 앱타머 및/또는 청구항 16 내지 22 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 핵산 앱타머를 유효 성분으로 하고, 그 핵산 앱타머의 표적 물질의 기능을 저해하는 의약 조성물.
  32. 청구항 6 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 기재된 핵산 앱타머를 유효 성분으로 하는 혈관 내피 세포 증식 인자의 기능 저해용 의약 조성물.
  33. 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 핵산 앱타머를 유효 성분으로 하는 인터페론γ의 기능 저해용 의약 조성물.
  34. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 기재된 핵산 앱타머 및/또는 청구항 16 내지 22 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 핵산 앱타머를 이용하여 시료 중에 존재하는 그 핵산 앱타머가 결합하는 표적 물질을 검출하는 방법.
  35. 비수식의 천연형 리보뉴클레오티드와
    인공 염기 대합 가능한 인공 염기를 가지는 비천연형 리보뉴클레오티드를 포함하고, 또한 복제 가능한 데옥시리보자임 또는 전사 가능한 리보자임.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 인공 염기가 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl, 2-nitropyrrole-1-yl 및 2-formyl-1H-pyrrole-1-yl로 이루어지는 군에서 선택되는 리보자임.
  37. 청구항 35에 있어서,
    상기 인공 염기의 인공 염기 대합 가능한 유도체를 포함하는 리보자임.
  38. 청구항 12 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 기재된 1본쇄 핵산 라이브러리 및
    프라이머 결합 영역에 결합하는 프라이머 세트를 포함하는 핵산 앱타머, 데옥시리보자임 또는 리보자임 제조용 키트.
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