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KR20140099269A - 혈청 대체물질 및 불안정한 인자를 포함하는 키트 - Google Patents

혈청 대체물질 및 불안정한 인자를 포함하는 키트 Download PDF

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KR20140099269A
KR20140099269A KR20147015315A KR20147015315A KR20140099269A KR 20140099269 A KR20140099269 A KR 20140099269A KR 20147015315 A KR20147015315 A KR 20147015315A KR 20147015315 A KR20147015315 A KR 20147015315A KR 20140099269 A KR20140099269 A KR 20140099269A
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KR
South Korea
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cells
kit
factor
cell
serum
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Ceased
Application number
KR20147015315A
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Inventor
아담 엘호피
앨런 웨버
Original Assignee
이센셜 파마수티컬스 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 이센셜 파마수티컬스 엘엘씨 filed Critical 이센셜 파마수티컬스 엘엘씨
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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 키트에 별도로 포장된 혈청 대체물질 및 하나 이상의 불안정 인자, 예컨대 성장 인자를 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 본원에 기재된 키트를 사용하지 않고 배양된 세포에 비해 배양물 중의 세포 성장을 개선시키는 이점을 제공하는 것으로 생각된다.

Description

혈청 대체물질 및 불안정한 인자를 포함하는 키트 {KIT COMPRISING SERUM REPLACEMENT AND LABILE FACTORS}
본원은 그 전체가 본원에 참고로 인용된 2011년 11월 11일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/558,740호를 우선권으로 주장한다.
발명의 분야
본 개시내용은, 일반적으로, 혈청 대체물질 및 하나 이상의 불안정 인자, 예컨대 성장 인자, 사이토카인 또는 호르몬을 포함하는 세포를 배양하기 위한 키트에 관한 것으로, 여기서 상기 혈청 대체물질 및 불안정 인자는 키트에 별도로 포장된다. 상기 키트는 성분들의 수명 연장과 개선된 효능 및 배양물 중의 세포 성장의 일관성을 제공한다.
인간 또는 동물 투여용 시험관내 실험 또는 생체외 배양을 위한 포유동물 세포 또는 곤충 세포와 같은 세포의 배양물은 인간 질환의 연구 및 치료에 유용한 도구이다. 세포 배양물은 바이러스 백신, 모노클로날 항체, 폴리펩타이드 성장 인자, 호르몬, 효소 및 종양 특이적 항원과 같은 다양한 생물학적 활성 생성물의 제조에 널리 사용된다. 그러나, 세포 배양물에 사용되는 배지 또는 방법의 대부분은 세포 성장 및/또는 미분화 세포 배양물의 유지에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 성분들을 포함한다. 예를 들면, 포유동물 또는 곤충 세포 배양 배지는, 성장 인자, 캐리어 단백질, 부착 및 분산 인자, 영양소, 및 배양 세포의 증식과 성장을 촉진하는 미량 원소들을 제공하기 위해, 종종 혈액-유래 혈청, 예컨대 태아소 혈청(FCS) 또는 우태혈청(FBS)으로 보강된다. 그러나, FCS 또는 FBS에서 발견되는 인자 예컨대 형질전환 성장 인자(TGF) 베타 또는 레티노산은 특정 세포 유형의 분화를 촉진하거나(문헌[Ke 등, Am J Pathol. 137:833-43, 1990]) 또는 배양물 중의 원치 않는 세포 활성을 촉진하는 세포내 의도하지 않은 다운스트림 신호전달을 개시할 수 있다(문헌[Veldhoen 등, Nat Immunol. 7(11):1151-6, 2006]).
또한, 특성화되지 않은 혈청 조성물의 성질 및 혈청의 로트-대-로트 변화는 혈청 대체물질 및 무혈청 배지 배양물을 사용하는 것이 바람직하다(문헌[Pei 등, Arch Androl. 49(5):331-42, 2003]). 게다가, 세포 배양물에서 성장시킨 치료적 용도를 위한 세포, 재조합 단백질 또는 백신의 경우, 동물-유래 성분의 부가는 인간에게 투여시 잠재적 바이러스 오염 및/또는 동물 단백질의 잠재적 면역원성 효과로 인해 바람직하지 않다.
혈청 대체물질은 세포 배양물에 대한 FCS의 영향을 최소화할 뿐만 아니라 인간 세포의 배양물에 사용되는 동물 단백질의 양을 최소화하기 위해 개발되었다. 혈청 대체물질, 예컨대 KNOCKOUTTM 혈청 대체물질(캘리포니아 칼스배드 소재 인비트로젠(Invitrogen))은, 혈청이 부족하고 세포 성장에 필수적인 영양소 및 다른 단백질들을 함유하는 화학적으로 규정된 배양물 배지라고 한다. KNOCKOUT SRTM는, 대부분이 상업적 제형에 포함되는 짧은 반감기를 갖는 단백질 인자들을 함유한다. KNOCKOUT SRTM는 부착 인자의 부족으로 인해 피더(feeder) 세포의 플레이팅에 있어서 FBS의 대체물질로 사용될 수 없으며, 따라서 상기 제형에 부적절한 세포 부착을 초래한다. PC-1TM 무혈청 배지(메릴랜드주 워커스빌 소재 론자(Lonza))는 특수 변형된 DMEM/F12 배지 베이스에서 제형화된 저-단백질, 무혈청 배지이고, 공지된 양의 인슐린, 트랜스페린, 지방산 및 특허 단백질을 갖는 완전한 HEPES 완충 시스템을 함유한다. PC-1 배지 중의 트랜스페린은 용액 중에서 2 내지 4주 반감기를 나타낸다.
Cellgro COMPLETETM (버지니아주 머내서스 소재 셀그로(Cellgro))는 DMEM/F12, RPMI 1640 및 맥코이(McCoy) 5A의 믹스(mix)를 기제로 한 무혈청 저-단백질 제형이다. 셀그로 컴플리트는 인슐린, 트랜스페린, 콜레스테롤, 성장 또는 부착 인자를 함유하지 않는다. 셀그로 컴플리트는 미량 원소 및 고분자량 탄수화물, 잉여 비타민, 비-동물 단백질원, 및 소혈청 알부민(1 g/L)의 혼합물을 포함한다. Cellgro FREETM (버지니아주 머내서스 소재 셀그로)는 임의의 호르몬이나 성장 인자도 함유하지 않은 무혈청 무단백질 성장 배지이다.
무혈청 배지는 또한 국제 특허 공보 번호 WO2009023194, WO2008137641, WO2006017370, WO2001011011, WO2007071389, WO2007016366, WO2006045064, WO2003064598, WO2001011011, US 특허 공보 번호 US20050037492, US20080113433, US20080299540, US 특허 번호 5,324,666, 6,162,643, 6,103,529, 6,048,728, 7,709,229 및 유럽 특허 출원 번호 EP2243827에 기술되어 있다.
US 특허 7,220,538은 친지질성 나노입자 및 기저 영양 배지를 포함하는 세포 배양물 배지를 기술하고 있다.
요약
본 개시내용은 시험관내 세포 배양물을 위한 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 별도의 용기에 포장된 혈청 대체물질 및 불안정 인자를 제공하며, 세포 배양물에 사용되는 경우, 본원에 기재된 키트에 제공된 시약을 사용하여 성장된 세포의 개선된 성장 및 일관성을 허용한다.
다양한 측면에서, 본 개시내용은 혈청 대체물질을 포함하는 제1 용기 및 적어도 하나의 불안정 인자, 예컨대 성장 인자를 포함하는 하나 이상의 독립된 용기, 및 사용 지침을 포함하는 시험관내 세포 배양물을 위한 개선된 키트를 제공한다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 i) 리포좀 및 ii) 기저 영양 배지를 포함한다. 관련 구현예에서, 리포좀은 나노입자이다.
다양한 구현예에서, 리포좀은 지질, 지방산, 스테롤 및/또는 유리 지방산을 포함한다. 다양한 구현예에서, 나노입자는 약 50 내지 500 nm, 약 100 내지 약 300 nm, 또는 약 100 내지 200 nm 범위의 평균 직경을 갖는다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 세포 배양 이전에 기저 배지에 부가된다. 표준 기저 배지는 당해 분야에 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하다. 이러한 배지의 예는, 비제한적으로, 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM), DMEM F12, 이스코브 변형 둘베코 배지, 햄(Ham) 영양소 혼합물 F-10, 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트 미디엄(Roswell Park Memorial Institute Medium)(RPMI), MCDB 131, 클릭(Click) 배지, 맥코이 5A 배지, 배지 199, 윌리엄(William) 배지 E, 및 곤충 배지 예컨대 그레이스(Grace) 배지 및 TNM-FH를 포함한다.
임의의 이들 배지는 선택적으로 염, 아미노산, 비타민, 완충액, 뉴클레오타이드, 항생제, 미량 원소, 및 글루코오스 또는 등가 에너지원으로 보충된다. 다른 임의의 보충물이 또한 당해분야의 숙련가에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배지 보충물은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하며 상세한 설명에서 더 상세히 기술된다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질 자체가 기저 배지의 요소들 및 상술된 바와 같은 보충물, 예를 들면, 염, 아미노산, 비타민, 완충액, 뉴클레오타이드, 항생제, 미량 원소, 및 글루코오스 또는 등가의 에너지 공급원을 포함하여 혈청 대체물질이 무혈청 완전한 배지로서 제공되도록 하는 것이 또한 고려된다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자는 냉동, 액체 또는 동결건조된 형태이다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자는 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 또는 호르몬(스테로이드 호르몬 또는 펩타이드 호르몬), 철 수송자, 펩타이드 인자 또는 스테로이드이다.
다양한 구현예에서, 호르몬은 인슐린, 소마토스타틴, 성장 호르몬, 하이드로코르티손, 덱사메토손 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌, 및 L-티록신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자는 인슐린 성장 인자(IGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 소마토스타틴, 및 트리아이오도-L-티로닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 키트에 사용이 고려되는 추가적인 성장 인자는 당해 분야에 공지되어 있고 상세한 설명에서 더 기술된다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자는 인간 불안정 인자이다. 다양한 실시양태에서, 불안정 인자는 설치류(예컨대, 마우스 또는 랫트) 불안정 인자이다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자는, 혈청 대체물질에 첨가되는 경우, 불안정 인자의 최종 농도가 약 0.05 내지 250 ng/ml, 약 0.05 내지 100 ng/ml, 약 0.05 내지 50 ng/ml, 약 0.05 내지 10 ng/ml, 약 0.1 내지 5 ng/ml, 약 0.5 내지 2.5 ng/ml, 또는 약 1 내지 5 ng/ml 범위이도록 포장된다. 불안정 인자는 또한 약 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ng/ml의 최종 농도로 고려된다.
다양한 구현예에서, 성장 인자는, 혈청 대체물질에 첨가되는 경우, 성장 인자의 최종 농도가 약 0.05 내지 250 ng/ml, 약 0.05 내지 100 ng/ml, 약 0.05 내지 50 ng/ml, 약 0.05 내지 10 ng/ml, 약 0.1 내지 5 ng/ml, 약 0.5 내지 2.5 ng/ml, 또는 약 1 내지 5 ng/ml 범위이도록 포장된다. 성장 인자는 또한 약 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ng/ml의 최종 농도로 고려된다. 다양한 구현예에서, 성장 인자는 설치류(예컨대, 마우스 또는 랫트) 성장 인자이다. 다양한 구현에에서, 성장 인자는 인간 성장 인자이다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 철 공급원 또는 철 수송자를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 철 공급원 또는 철 수송자는 트랜스페린, 락토페린, 제1철 설페이트, 제1철 시트레이트, 제2철 시트레이트, 제2철 암모늄 시트레이트, 제2철 암모늄 옥살레이트, 제2철 암모늄 푸마레이트, 제2철 암모늄 말레이트 및 제2철 암모늄 석시네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 구리 공급원 또는 구리 수송체(예컨대, GHK-Cu)를 추가로 포함한다. 예시적인 구리 공급원은, 비제한적으로, 구리 클로라이드 및 구리 설페이트를 포함한다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질 및 하나 이상의 불안정 인자는 배양물에서 세포의 분화를 야기하지 않도록 의도되는 것이 고려된다. 다양한 구현예에서, 혈청 대체 배지 및 하나 이상의 불안정 인자는 배양물에서 세포의 분화를 야기하지 않는다.
다양한 구현예에서, 키트는 세포 부착을 촉진하기 위한 제제를 포함하는 용기를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 세포 부착을 촉진하는 제제는 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 합성 미세캐리어 및 랩핑된 탄소 튜브로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 철 공급원, 구리 공급원 또는 세포 부착 제제는, 혈청 대체물질에 부가되는 경우, 철 공급원, 구리 공급원 또는 세포 부착 제제의 최종 농도가 약 0.05 내지 250 ng/ml, 약 0.05 내지 100 ng/ml, 약 0.05 내지 50 ng/ml, 약 0.05 내지 10 ng/ml, 약 0.1 내지 5 ng/ml, 약 0.5 내지 2.5 ng/ml, 또는 약 1 내지 5 ng/ml 범위이도록 포장된다. 또한, 철 공급원, 구리 공급원 또는 세포 부착 제제는 최종 농도가 약 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ng/ml이도록 고려된다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자 보충물은 2, 3, 4, 5종 또는 그 이상의 IGF, EGF, FGF, 트랜스페린, 소마토스타틴, 및 트리아이오도-L-티로닌를 포함하는 칵테일로서 제형화된다. 다양한 구현예에서, FGF는 염기성 FGF(bFGF, FGF-2) 또는 산성 FGF(aFGF, FGF-1)이다.
다양한 구현예에서, 칵테일 중의 성장 인자는 혈장 대체물질에 부가되는 경우 IGF의 최종 농도는 0.5 내지 3 ng/ml, EGF의 최종 농도는 1 내지 10 ng/ml, FGF의 최종 농도는 3 내지 10 ng/ml, 트랜스페린의 최종 농도는 3 내지 10 ng/ml, 소마토스타틴 및 트리아이오도-L-티로닌의 최종 농도는 5 내지 15 ng/ml이도록 포장된다. 다양한 구현예에서, IGF의 최종 농도는 1 ng/ml이다. 다양한 구현예에서, EGF 및 FGF의 최종 농도는 5 ng/ml이다. 다양한 구현예에서, 트랜스페린의 최종 농도는 5 ng/ml이다. 다양한 구현예에서, 소마토스타틴 및 트리아이오도-L-티로닌의 최종 농도는 10 ng/ml이다.
다양한 구현예에서, 키트는 혈청 대체물질에 부가되는 경우 비트로넥틴의 최종 농도가 100 내지 500 ng/ml이도록 포장된 비트로넥틴을 포함한다. 다양한 구현예에서, 비트로넥틴의 최종 농도는 250 ng/ml이다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 동물-성분이 없다.
다양한 구현예에서, 별도로 포장된 불안정 인자, 예컨대 성장인자는 혈청 대체물질 또는 기저 배지에 사전 포장된 경우의 동일한 불안정 인자보다 혈청 대체물질에 도입한 경우에 더 긴 반감기를 갖는다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 불안정 인자를 혈청 대체물질과 별도로 포장하면 불안정 인자를 포함하도록 사전 포장된 배지를 갖는 세포 배양물에 비해 세포 배양물 중의 세포의 성장 및 일관성을 향상시킨다. 예를 들면, 배양물 중의 세포의 외양이 일관적이고, 세포는 불안정 인자를 함유하도록 포장된 또 다른 배지에서의 세포의 성장에 비해 일정한 비율로 분산하는 것으로 생각된다.
다양한 구현예에서, 세포는 포유동물 세포 및 곤충 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, 세포는 포유동물 개체로부터 단리될 수 있다. 다양한 구현예에서, 세포는 세포주의 1차 배양물이다. 다양한 구현예에서, 세포는 만능 줄기세포, 배아 줄기 세포, 골수 기질 세포, 조혈 전구 세포, 림프 줄기세포, 골수 줄기세포, T 세포, B 세포, 대식세포, 간 세포, 췌장 세포, 및 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된다.
고려되는 포유동물 세포주는, 비제한적으로, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, T 세포주(예를 들면, 주카트(Jurkat)), B 세포주(예를 들면, BJAB, EW36, CA46, ST486 및 MC116, 라지(Raji), 나말바(Namalva) 및 다우디(Daudi)), 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6®, SP2/0, NS-0, U20S, HT1080, 하이브리도마, 암 세포주, 및 당해 분야에 공지된 다른 세포주를 포함한다. 고려되는 곤충 세포주는, 비제한적으로, Sf9, Sf21, HIGH FIVETM, EXPRESSF+®, S2, Tn5, TN-368, BmN, 슈나이더(Schneider) 2, D2, C6/36 및 KC 세포를 포함한다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질 및 하나 이상의 불안정 인자는 세포 배양물에 사용 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일 내에 조합된다.
일 구현예에서, 혈청 대체물질은 10 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml 또는 1L의 용적으로 포장된다. 관련 구현예에서, 혈청 대체물질은 1X, 5X, 10X 또는 20X용액에 포장된다.
다양한 구현예에서, 키트는 선택 또는 유도 인자, 예를 들면 항균, 항진균 또는 항-미생물제 등을 추가로 포함한다. 고려되는 예시적인 제제는, 비제한적으로, 겐타마이신, 암피실린, 암포테리신 B, 페니실린, 스트렙토마이신, 하이그로마이신 B, 카나마이신, 네오마이신, 메토트렉세이트, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG), 및 당해 분야에 공지된 다른 선택 또는 유도 인자, 또는 이들의 조합을 포함한다.
다양한 구현예에서, 용기는 튜브, 바이알, 앰풀, 및 병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 용기는 당해 분야에 공지된 물질, 예를 들면, 비제한적으로, 유리, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 및 다른 플라스틱으로 제조하는 것이 고려된다.
다양한 구현예에서, 용기는 단백질 활성의 손실을 방지하기 위해 코팅된다. 코팅은 용기 내의 성장 인자 또는 다른 단백질이 용기 벽에 부착되는 것을 방지하는 용기에 대한 첨가제를 포함한다. 첨가제는, 비제한적으로, 비-동물 유래 캐리어 단백질, 계면활성제, 아미노산, 및 당류를 포함한다. 첨가제는 성장 인자의 동결 건조 형태 또는 수성 형태에 적응되는 것으로 고려된다.
다양한 구현예에서, 키트는 별도의 용기에 포장된 세포를 추가로 포함한다.
또 하나의 측면에서, 본 개시내용은 시험관내 세포의 배양물을 위한 본원에 기재된 키트의 용도에 관한 것이다.
본원에 기재된 각각의 특징 또는 구현예, 또는 조합은 본 발명의 임의의 측면의 비제한적이고 실증적인 예이며, 따라서, 본원에 기재된 임의의 다른 특징 또는 구현예, 또는 조합과 조합될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 각각의 구현예 유형은 모든 가능한 조합을 열거하지 않고도 본원에 기재된 임의의 다른 특징, 또는 특징들의 조합과 조합되도록 의도된 비-제한적 특징의 예이다. 이와 같은 특징, 또는 특징들의 조합은 본 발명의 임의의 측면에 적용된다. 범위 안의 값의 예가 개시되는 경우, 이들 예 중 어느 하나를 범위의 가능한 종료점으로 생각할 수 있고, 이들 종료점들 사이의 어느 하나 또는 모든 값을 고려할 수 있으며, 상한 및 하한 종료점들 중 어느 하나 및 모든 조합을 계획할 수 있다.
도 1은 성장 인자가 혈청 대체물질과 함께 제조된 혈청 대체물질(SR)(세포 배양 상당한 시간 전에 조합된)을 함유한 배지를 가진 세포 배양물(배지+10% 공-제조된 SR)은 시험관내 자극 후에도 세포 증식을 촉진하지 않은 반면(도 1A), 세포 배양 직전에 부가된 성장 인자가 부가된 혈청 대체물질을 함유한 배양물(배지+10% SR+성장 인자)은 세포 증식을 일으켰다(도 1B). 증식은 450 nm에서의 광학 밀도(OD)의 증가로 표시되었다.
상세한 설명
본 개시내용은 혈청 대체물질 배지 및 불안정 인자를 포함하는 시험관내 세포 배양물을 위한 키트를 제공하며, 여기서 상기 혈청 대체물질 및 불안정 인자는 키트에 별도로 포장된다. 키트는 불안정 인자, 예컨대 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 등을 혈청 대체물질 또는 배지 조성물과 별도로 포장함으로써 불안정 인자를 포함하는 다른 무혈청 배지 또는 혈청 대체물질에 비해 개선된 세포 배양물 조건을 제공한다. 본 키트는 불안정 인자의 개별 포장이 성장 인자의 반감기를 개선하고 보다 효율적이고 일관된 배양물의 세포 성장을 제공한다는 점에서 다른 혈청 대체물질 또는 배지보다 이점이 있다. 이론에 구애되지 않고, 세포 배양 너무 오래 전에 불안정 인자를 출하하거나 첨가하는 경우에 배지에 성장 인자, 사이토카인 또는 호르몬 등과 같은 불안정 인자를 포함시키면 세포 배양에 사용할 때는 불안정 인자의 지속성 및 효능이 감소되며, 따라서, 시험관내 세포의 보다 낮은 최적 성장 또는 생존을 초래하는 것으로 여겨진다. 본 키트는 이러한 문제를 극복하며 종래 기술에 개시되지 않은 이점을 제공한다.
정의
본원에 사용된 "혈청 대체물질" 또는 "혈청 대체물질 배지"는 배양물 중의 세포 성장 및 생존을 촉진하기 위해 기저 배지와 함께 또는 완전한 배지로서 사용될 수 있는 조성물을 의미한다. 다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 시험관내 세포 배양물 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하는 임의의 혈청에 대한 대체물질로서 기저 또는 완전한 배지에 사용된다. 혈청 대체물질은 단백질 및 배양물 세포의 성장 및 생존을 위한 다른 인자를 포함하는 것을 고려한다. 다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 세포 배양에 사용하기 전에 기저 배지에 부가된다. 또한, 다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 무혈청 완전한 배지로서 세포 배양물에 유용하도록 기저 배지 및 기저 영양소 예컨대 염, 아미노산, 비타민, 미량 원소 등을 포함할 수 있다고 생각된다.
본원에 사용된 "기저 배지" 또는 "기저 영양 배지"는 정상 세포 대사에 필수적인 물 및 몇몇 벌크 무기 이온을 세포에 제공하고 세포내 및 세포외 삼투압 균형을 유지하는 기본적인 염 영양소 또는 염과 다른 원소들의 수용액을 지칭한다. 다양한 구현예에서, 기저 배지는 적어도 1개의 탄수화물을 에너지원으로서 포함하고/하거나 완충 시스템을 포함함으로써, 배지가 생리적 pH 범위 안에 유지되도록 한다. 상업적으로 이용가능한 기저 배지의 예는, 비제한적으로, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기저 배지 이글(BME), RPMl 1640, 햄 F-10, 햄 F-12, α-최소 필수 배지(αMEM), 글래스고우 최소 필수 배지(G-MEM), 이스코브 변형 둘베코 배지, 또는 만능 세포와 함께 사용하기 위해 변형된 일반적 목적의 배지, 예컨대 X-VIVO(론자(Lonza)) 또는 조혈 기저 배지를 포함한다. 기저 배지는 상세한 설명에서 더 상세히 기재되는 바와 같은 영양소로 보강될 수 있다. "완전한 배지"는 이미 기저 배지에 부가된 성장 보충물을 함유한 세포 배양 배지이다.
본원에 사용된 "불안정 인자"는 화학적 변화를 겪을 수 있는 특정 생화학적 반응 또는 신체 과정에서 작용하는 물질을 의미한다. 예시적인 불안정 인자는, 비제한적으로, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 호르몬(스테로이드 호르몬 및 펩타이드 호르몬), 철 수송자, 펩타이드 인자 및 스테로이드를 포함한다.
본원에 사용된 "성장 인자"는 세포의 성장, 증식 또는 분화를 촉진하는 제제를 지칭한다. 고려되는 성장 인자는, 비제한적으로, 사이토카인, 케모카인 또는 펩타이드 성장 인자 등과 같은 제제를 포함한다. 본 발명의 키트에 사용이 고려되는 성장 인자는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 상세한 설명에 더 상세히 설명된다. 다양한 구현예에서, 성장 인자는 인간 성장 인자이다. 다양한 구현예에서, 성장 인자는 설치류(예컨대, 마우스 또는 랫트) 성장 인자이다.
다양한 구현예에서, 성장 인자 또는 불안정 인자는 대부분의 세포 유형의 성장을 촉진하는 일반적이거나 비-특이적인 성장 인자이다. 일 구현예에서, 성장 인자는 인슐린 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 소마토스타틴, 트리아이오도-L-티로닌, 인터루킨(IL)-2, IL-6 또는 IL-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 성장 인자는 특정 세포 유형의 성장 촉진에 특이적이다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자는 단일 인자로서 공급되거나 또는 2개 이상의 불안정 인자들을 포함하는 혼합물로서 공급된다. 2개 이상의 불안정 인자들의 혼합물은 본원에서 불안정 인자 칵테일로서 지칭한다. 다양한 구현예에서, 불안정 인자 칵테일은 2개 이상의 성장 인자를 포함한다.
불안정 인자들을 포장하는 경우, 불안정 인자는 혈청 대체물질에 부가시 세포 배양에 사용하기에 적절한 최종 농도로 존재하도록 포장하는 것을 고려한다. 본원에서 불안정 인자의 농도를 지칭하는 경우, 혈청 대체물질 또는 세포 배양 배지에 사용되는 최종 농도의 인자를 지칭하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 "리포좀"는 내부 수성 공간을 둘러싼 외부 지질 이중층 또는 다층 막을 포함하는 밀폐된 구조를 말한다. 리포좀은 다층 또는 단일층일 수 있다. 리포좀은 직경이 5 내지 10 μM 내지 나노입자 크기 범위로 고려된다. 특정 구현예에서, 리포좀 나노입자는 직경이 약 50 내지 500 nm, 약 100 nm 내지 300 nm, 또는 약 100 내지 200 nm이다.
본원에 사용된 "개선된 세포 배양물"는 본원에 기재된 키트를 사용하여 배양시 본원에 기재된 키트를 사용하지 않고, 예컨대 제조시 배지에 첨가되는 성장 인자와 함께 혈청 대체물질을 포함하는 기저 배지를 사용한 세포 배양물에 비해(단, 배지 + 혈청 적당량의 세포 배양물은 아님) 증가된 세포 증식, 증가된 세포 성장, 감소된 세포사, 또는 증가된 단백질 생성(재조합 또는 내인성)을 지칭한다. 증가된 증식, 증가된 성장 및 세포사 변화는 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들면 성장 곡선 분석, 트립판 블루에 의한 현미경적 평가, 삼중 티미딘(3H) 증식 검정, MTT 검정, 레사주린(resazurin) 기반 검정 및 DNA 래더링(laddering) 분석을 사용하여 측정한다. 증가된 세포 단백질 생산은 총 단백질 또는 mRNA의 정량화, 또는 해당 특정 단백질 수준의 정량화를 비롯한 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 측정한다.
본원에 사용된 용어 "세포의 분화를 야기하지 않는" 또는 "세포의 분화를 야기하려고 의도되지 않은"는 배양 세포의 발달 상태를 말하는 것으로, 여기서 본원의 키트를 사용하여 배양된 세포는 또 다른 세포 유형의 특징을 취하지 않거나 또는 본원 키트의 사용 결과로서의 형태, 단백질 생산 프로파일 또는 세포 표면 마커 발현이 실질적으로 다르지 않다. 줄기세포 및 전구 세포의 경우, 분화되지 않도록 세포를 배양한다는 것은 세포가 배양 중에 증식할 수 있지만, 실질적으로 미분화 상태로 존재하고, 세포 배양 후 줄기 또는 전구 세포의 마커를 발현시키는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들면, 모집단에서 상당 부분의 줄기 세포 및 이의 유도체가 만능 세포의 형태적 특성을 표시하고, 다중 세포 유형으로 발달할 수 있는 경우에 줄기 세포 또는 다른 전구 세포는 "미분화"다. 만능 줄기세포의 특징은 US 특허 공보 번호 20050037492 및 국제 특허 공보 번호 WO 2001/011011에 기재되어 있다. 대안적으로, 세포가 이미 완전히 분화된 세포 유형 또는 세포주인 경우, 본원의 키트를 사용한 세포 배양물은 본원에 상기 규정된 바와 같은 세포 분화를 야기하지 않는다.
본원에 사용된 "동물-성분이 없는"은 성분들이 동물로부터 유래되지 않은 조성물을 지칭한다. 상기 성분들은 재조합으로 생산된 것이거나 동물에서 직접 단리되는 것이 아닌 다른 식물이나 다른 공급원에서 유도되는 것으로 생각된다. 본원에 사용된 "동물-성분이 없는"은 동물-계 세포주에서 불안정한 인자들의 재조합 생산을 허용한다.
본원에 사용된 "용기"는 예컨대 혈청 대체물질, 성장 인자 또는 부착 제제 등의 조성물을 보유하기 위한 그릇을 지칭한다. 본원에 기재된 키트에 유용한 조성물은 키트를 운반하기 위한 용기에 포장되어 있는 것으로 생각된다. 예시적인 용기는, 비제한적으로, 베셀(vessel), 바이알, 튜브, 앰풀, 병, 플라스크 등을 포함한다. 이는 상기 용기가 동결 건조, 액체 또는 냉동 형태의 혈청 대체물질, 성장 인자 또는 부착 제제를 포장하도록 구성된 것으로 생각된다. 상기 용기는 유리, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 및 다른 플라스틱 등을 비롯해 당해 분야에 잘 알려진 재료로 제조되는 것으로 생각된다.
본원에 사용된 용어 "사전-포장된" 또는 "불안정 인자로 사전-포장된"은 성장 인자와 같은 불안정 인자와 함께 제조되어 배지 및 성장 인자가 제조시에 조합되도록 한 혈청 대체물질 또는 배지, 또는 사용 예컨대 4개월, 5개월, 6개월, 또는 최대 1년 이상 상당한 기간 전에 불안정 인자가 첨가된 혈청 대체물질 또는 배지를 지칭한다. 예를 들면, 일부 상업적으로 판매되는 혈청 대체물질 또는 배지는 세포 성장을 촉진하는 인자들을 함유하여 생성물이, 판매시, 이미 혈청 대체물질 또는 배지에 조합된 예컨대 성장 인자 또는 트랜스페린 등 불안정 인자를 함유하도록, 즉 불안정 인자와 함께 사전-포장되도록 제조된다.
혈청 대체물질
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 i) 리포좀 및 ii) 기저 영양 배지를 포함한다.
리포좀은 다중층 또는 단일층일 수 있다. 리포좀은 5 내지 10 μM 직경 크기 내지 나노입자 크기의 범위로 고려된다. 일부 구현예에서, 리포좀은 나노입자이다. 특정 구현예에서, 나노입자는 약 50 내지 500 nm, 약 100 내지 약 300 nm, 또는 약 100 내지 200 nm 범위의 평균 직경을 갖는다. 리포좀 크기는 동적 광 산란법에 의해 전체 입자의 평균 직경 값으로서 입자 크기를 측정하는 제타사이저(Zetasizer)(영국 맬번 인스트루먼츠(Malvern Instruments))를 사용하는 것을 비롯해 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 리포좀은 지질, 지방산, 스테롤 및/또는 유리 지방산을 포함한다. 리포좀 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, (일련의 동심원 지질 이중층을 갖는) 다층 소포를 제조하기 위한 액체 수화 또는 용매 소구; 및 (단일 지질 층을 갖는) 단일층 소포를 제조하기 위한 위생, 프렌치 프레스(French press), 용매 주입, 세제 제거, 역상 증발, 칼슘 유도된 융합, 미세유동화 또는 동결-해동 방법을 포함한다.
리포좀 제제는 본원에 참고로 인용된 US 특허 7,220,538, US 특허 번호 6,217,899; US 특허 공보 번호 20100021531, 문헌[Lichtenberg 등, Methods Biochem Anal. 33:337-462, 1988]; 및 [G. Gregoriadis: "Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques," 2nd edition, Vol. I-III, CRC Press]에 기재되어 있다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 기저 배지에 첨가된다. 표준 기저 배지는 당해 분야에 공지되어 있으며 상업적으로 이용가능하다. 기저 배지의 예는, 비제한적으로, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), DMEM F12(1:1), 이스코브 변형 둘베코 배지, 햄 영양소 혼합물 F-10, 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트 미디엄(RPMI), MCDB 131, 클릭 배지, 맥코이 5A 배지, 배지 199, 윌리엄 배지 E, 및 곤충 배지 예컨대 그레이스 배지 및 TNM-FH를 포함한다.
임의의 이들 배지는 선택적으로 염(예컨대, 나트륨 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 아미노산, 비타민, 완충액(예컨대, 헤페스(HEPES)), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, 겐타마이신 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 규정됨), 및 글루코오스 또는 등가의 에너지원으로 보강된다. 기타 필요한 임의의 보충물이 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 당해 분야 통상의 숙련가에게 자명할 것이다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질 자체는 혈청 대체물질이 무혈청 완전 배지를 사용할 수 있도록 기저 배지의 요소 및 상기 기재된 보충물, 예를 들면, 염, 아미노산, 비타민, 완충액, 뉴클레오타이드, 항생제, 미량 원소, 및 글루코오스 또는 등가의 에너지원을 포함한다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 철 공급원 또는 철 수송자를 포함한다. 예시적인 철 공급원은, 비제한적으로, 제2철 및 제1철 염, 예컨대 제1철 설페이트, 제1철 시트레이트, 제2철 시트레이트, 제2철 암모늄 화합물, 예컨대 제2철 암모늄 시트레이트, 제2철 암모늄 옥살레이트, 제2철 암모늄 푸마레이트, 제2철 암모늄 말레이트 및 제2철 암모늄 석시네이트를 포함한다. 예시적인 철 수송자는, 비제한적으로, 트랜스페린 및 락토페린을 포함한다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질은 구리 공급원 또는 구리 수송자(예컨대, GHK-Cu)를 포함한다. 예시적인 구리 공급원은, 비제한적으로, 구리 클로라이드 및 구리 설페이트를 포함한다.
다양한 구현예에서, 철 공급원 또는 구리 공급원은 혈청 대체물질에 첨가되는 경우 불안정 인자의 최종 농도가 약 0.05 내지 250 ng/ml, 약 0.05 내지 100 ng/ml, 약 0.05 내지 50 ng/ml, 약 0.05 내지 10 ng/ml, 약 0.1 내지 5 ng/ml, 약 0.5 내지 2.5 ng/ml, 또는 약 1 내지 5 ng/ml 범위이도록 포장된다. 또한, 철 공급원 또는 구리 공급원은 약 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ng/ml의 최종 농도로 고려된다.
불안정 인자
키트에 사용하기 위해 고려되는 불안정 인자는 시험관내 세포의 성장과 증식을 촉진하는 데 효과적인 것으로 생각된다. 불안정 인자는, 비제한적으로, 사이토카인, 케모카인, 호르몬(스테로이드 호르몬 및 펩타이드 호르몬), 철 수송자, 펩타이드 인자, 스테로이드 또는 성장 자극 아민, 예컨대 히스타민을 포함한다. 다양한 구현예에서, 불안정 인자는 인간 불안정 인자이다. 다양한 구현예에서, 성장 인자는 설치류(예컨대, 마우스 또는 랫트) 불안정 인자이다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자 또는 성장 인자는 대부분의 세포 유형의 성장을 촉진하는 일반적이거나 비-특이적인 성장 인자이다. 다양한 구현예에서, 성장 인자는 특정 세포 유형에 특이적이며, 예를 들면, 세포 유형의 패밀리 또는 특정 유형의 세포, 예컨대 림프구 또는 T 세포의 성장을 촉진하다. 다양한 구현예에서, 성장 인자는 인간 성장 인자이다. 다양한 구현예에서, 불안정 인자 또는 성장 인자는 설치류(예컨대, 마우스 또는 랫트) 성장 인자이다.
키트에서 포장을 위해 고려되는 예시적인 성장 인자는, 비제한적으로, 골형성 단백질(BMP)-1, 골형성 단백질-2, 골형성 단백질-3, 골형성 단백질-4, 골형성 단백질-5, 골형성 단백질-6, 골형성 단백질-7, 골형성 단백질-8, 골형성 단백질-9, 골형성 단백질-10, 골형성 단백질-11, 골형성 단백질-12, 골형성 단백질-13, 골형성 단백질-14, 골형성 단백질-15, 뇌 유도된 신경친화성 인자, 섬모 신경친화성 인자, 사이토카인-유도된 중성구 화학주성 인자 1, 사이토카인-유도된 중성구 화학주성 인자 2α, 사이토카인-유도된 중성구 화학주성 인자 2β, β 내피 세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 표피 성장 인자, 상피-유도된 중성구 유인물질, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 8b, 섬유아세포 성장 인자 8c, 섬유아세포 성장 인자 9, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자(산성), 섬유아세포 성장 인자(염기성), 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질 α, 성장 관련 단백질 β, 성장 관련 단백질 γ, 헤파린 결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라틴생성세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유도된 내피 세포 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자 A 사슬, 혈소판 유도된 성장 인자 AA, 혈소판 유도된 성장 인자 AB, 혈소판 유도된 성장 인자 B 사슬, 혈소판 유도된 성장 인자 BB, 사전-B 세포 성장 자극 인자, 줄기세포 인자, 형질전환 성장 인자 α, 형질전환 성장 인자 β, 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β1.2, 형질전환 성장 인자 β2, 형질전환 성장 인자 β3, 잠재 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 II, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 III, 및 혈관 내피 성장 인자를 포함한다.
키트에 포장하기 위한 예시적인 사이토카인은, 비제한적으로, 인터루킨(IL) -1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN), IFN-γ, 종양 괴사 인자(TNF) 0, TNF1, TNF2, TNF-α, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 거핵구 콜로니 자극 인자(Meg-CSF), 트롬보포이에틴, 줄기세포 인자, 및 에리트로포이에틴을 포함한다. 키트에 사용하기 위해 고려되는 케모카인은, 비제한적으로, IP-10 및 기질 세포-유도된 인자 1α를 포함한다.
키트에 포장하기 위해 고려되는 예시적인 호르몬은, 비제한적으로, 스테로이드 호르몬 및 펩타이드 호르몬, 예컨대 인슐린, 소마토스타틴, 성장 호르몬, 하이드로코르티손, 덱사메토손 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌, 및 L-티록신을 포함한다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자는 인슐린 성장 인자(IGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 소마토스타틴, 트리아이오도-L-티로닌, 인터루킨(IL)-2, IL-6 및 IL-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
불안정 인자는 세포 배양물 중의 세포 유형에 적절한 농도로 포함되는 것으로 고려된다. 다양한 구현예에서, 성장 인자는 배지에 부가될 때 성장 인자 또는 사이토카인의 최종 농도가 약 0.05 내지 250 ng/ml, 약 0.05 내지 100 ng/ml, 약 0.05 내지 50 ng/ml, 약 0.05 내지 10 ng/ml, 약 0.1 내지 5 ng/ml, 0.5 내지 2.5 ng/ml, 또는 1 내지 5 ng/ml이도록 포장된다. 또한, 성장 인자 또는 사이토카인은 약 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ng/ml의 최종 농도이도록 고려된다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자는 본원에 기재된 2, 3, 4, 5, 6종, 또는 그 이상의 불안정 인자를 포함하는 칵테일로서 제형화된다. 다양한 구현예에서, 불안정 인자 보충물은 2, 3, 4, 5종, 또는 그 이상의 IGF, EGF, FGF, 트랜스페린, 소마토스타틴, 및 트리아이오도-L-티로닌을 포함하는 칵테일로서 제형화된다.
다양한 구현예에서, 칵테일 중의 성장 인자는 혈청 대체물질에 부가될 때 IGF의 최종 농도는 0.5 내지 3 ng/ml이고, EGF의 최종 농도는 1 내지 10 ng/ml이고, FGF의 최종 농도는 3 내지 10 ng/ml이고, 트랜스페린의 최종 농도는 3 내지 10 ng/ml이고, 소마토스타틴과 트리아이오도-L-티로닌의 최종 농도는 5 내지 15 ng/ml이도록 포장된다. 다양한 구현예에서, IGF의 최종 농도는 1 ng/ml이다. 다양한 구현예에서, EGF 및 FGF의 최종 농도는 5 ng/ml이다. 다양한 구현예에서, 트랜스페린의 최종 농도는 5 ng/ml이다. 다양한 구현예에서, 소마토스타틴 및 트리아이오도-L-티로닌의 최종 농도는 10 ng/ml이다.
혈청 대체물질 배지 및 하나 이상의 불안정 인자는 배양물에서 세포의 분화를 야기하지 않는 것으로 생각된다. 다양한 구현예에서, 혈청 대체물질 및 하나 이상의 불안정 인자는 배양물에서 세포의 분화를 야기하지 않는다.
다양한 구현예에서, 키트는 세포 부착을 촉진하는 인자를 포함하는 용기를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 세포 부착을 촉진하는 인자는 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 합성 미세캐리어 및 랩핑된 탄소 튜브로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 세포 부착 제제는 혈청 대체물질에 부가될 때 세포 부착 제제의 최종 농도가 약 0.05 내지 250 ng/ml, 약 5 내지 500 ng/ml, 약 50 내지 500 ng/ml, 약 100 내지 500 ng/ml, 약 0.05 내지 100 ng/ml, 약 0.05 내지 50 ng/ml, 0.05 내지 10 ng/ml , 0.1 내지 5 ng/ml , 0.5 내지 2.5 ng/ml , 또는 약 1 내지 5 ng/ml이도록 포장된다. 또한, 세포 부착 제제의 최종 농도는 약 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ng/ml인 것으로 생각된다.
다양한 구현예에서, 키트는 100 내지 500 ng/ml 범위의 최종 농도로 포장된 비트로넥틴을 포함한다. 다양한 구현예에서, 비트로넥틴의 최종 농도는 250 ng/ml이다.
합성 미세캐리어는 당해 분야에 공지되어 있으며, 하이드로겔, 알파-하이드록시산 패밀리 폴리머, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤 및 이들의 혼합물을 포함한다. 예시적인 미세캐리어는, 비제한적으로, 폴리(D,L-락타이드-코-글리코타이드) 미세캐리어, 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 마이크로구형체, 알기네이트 마이크로겔, 및 젤라틴 마이크로구형체를 포함한다. 예시적인 랩핑된 탄소 튜브, 예컨대 탄소 나노튜브(CNT)는 당해 분야에 공지되어 있고, 미국 특허 번호 5,753,088, 5,641,466; 5,292,813 및 5,558,903 및 US 특허 공보 번호 20090148417에 기재되어 있으며, 탄소 나노튜브, 예컨대 풀러렌, 탄소 버키볼(buckyball)(버크민스터풀러렌), 탄소 나노튜브, 탄소 나노섬유 및 탄소 나노입자에 대해 기재하고 있다. 탄소 나노튜브는 다층 껍질, 다중-벽 나노튜브 또는 단일 벽 나노튜브로서 유용하다. 일부 구현예에서, 탄소 나노튜브는 작용화된다. CNT에 연결된 예시적인 작용기는 티올 및 카복실 기를 포함한다. DNA 랩핑된 탄소 튜브는 문헌[Lee 등, Angewandte Chemie International Edition 48: 5116-5120, 2009]에 기재되어 있다.
다양한 구현예에서, 불안정 인자는 동결건조, 액체 또는 냉동 형태이다. 이러한 상이한 형태의 불안정 인자를 보존하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 단백질 또는 다른 물질을 동결건조시키는 방법은 문헌[Tang 등, Pharm Res. 21:191-200, (2004)] 및 [Chang 등, Pharm Res. 13:243-9 (1996)]에 기재되어 있다. 동결건조된 물질은 소정 부피의 순수한 물 또는 주사용 멸균수(WFI)(전형적으로 동결건조 중에 제거된 부피와 같음), 또는 다른 적절한 완충액을 다시 첨가하여 재구성할 수 있다(문헌[Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]). 액체 또는 냉동 제형을 위한 불안정 인자는 당해 분야 숙련가에 의해 결정되는 바와 같이 성장 인자의 응집 또는 침전을 방지하는 바람직한 농도로 적절히 완충된 용액으로 제조된다.
세포 배양물
본원에 기재된 키트는 바람직하게는 혈청 보충물 또는 시험관내 적절한 성장을 위해 규정된 배지를 전형적으로 필요로 하는 세포를 위한 시험관내 세포의 배양물에 유용한 것으로 생각된다. 이러한 세포는 진핵 세포 예컨대 포유동물 및 곤충 세포를 포함한다. 키트의 사용으로부터 이점을 얻는 것으로 고려되는 포유동물 세포는, 비제한적으로, 햄스터, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 소, 돼지, 마우스, 랫트, 토끼, 양 및 인간 세포를 포함한다. 곤충 세포는 스포도프테라 프루지페르다(유충), 아에데스 아에집티(모기), 아에데스 알보픽투스(모기), 드로소필라 멜라노가스테르(초파리), 및 봄빅스 모리로부터 유도된 세포를 포함한다.
혈청 대체물질로 배양된 세포들은 불멸화된 세포(세포주) 또는 비-불멸화된(1차 또는 2차) 세포인 것이 고려되고, 생체내에서 발견되는 다양한 임의의 세포 유형, 예를 들면, 섬유아세포, 케라틴생성세포, 상피 세포, 난소 세포, 내피 세포, 신경교 세포, 신경 세포, 형성된 혈액 성분(예컨대, 림프구, 골수 세포), 연골세포 및 다른 골-유도된 세포, 간세포, 췌장 세포, 및 이들 체세포 유형의 전구체일 수 있다.
다양한 구현예에서, 키트와 함께 사용하기 위해 고려되는 세포는 포유동물 개체로부터 단리된다. 포유동물 개체로부터 단리된 세포는, 비제한적으로, 만능 줄기세포, 배아 줄기 세포, 골수 기질 세포, 조혈 전구 세포, 림프 줄기세포, 골수 줄기세포, 림프구, T 세포, B 세포, 대식세포, 내피 세포, 신경교 세포, 신경 세포, 연골세포 및 다른 골-유도된 세포, 간세포, 췌장 세포, 체세포 유형의 전구체, 및 임의의 암종 또는 종양 유도된 세포를 포함한다.
다양한 구현예에서, 세포는 세포주이다. 예시적인 세포주는, 비제한적으로, 차이니즈 햄스터 난소 세포, 예컨대 CHOK1, DXB-11, DG-44, 및 CHO/-DHFR; 원숭이 신장 CV1, COS-7; 인간 배아 신장(HEK) 293; 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(TM4); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개과 신장 세포(MDCK); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간종양 세포(Hep G2; SK-Hep); 마우스 유선 종양(MMT); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; T 세포주(주카트(Jurkat)), B 세포주, 마우스 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6®, SP2/0, NS-0, U20S, HT1080, 하이브리도마, 종양 세포, 및 불멸화된 1차 세포를 포함한다.
예시적인 곤충 세포주는, 비제한적으로, Sf9, Sf21, HIGH FIVETM, EXPRESSF+®, S2, Tn5, TN-368, BmN, 슈나이더(Schneider) 2, D2, C6/36 및 KC 세포를 포함한다.
본원의 키트에 고려되는 혈청 대체물질 및 세포 배양 조건은 세포 성장에 적합한 임의의 배양 기재에 적응될 수 있다. 적당한 표면을 갖는 기재는 조직 배양 우물, 배양 플라스크, 롤러 병, 가스-투과성 용기, 평면 또는 평행 판 생물반응기 또는 세포 공장을 포함한다. 또한, 교반 탱크 용기내 현탁액에 유지된 미세캐리어 또는 입자에 세포들을 부착시키는 배양 조건이 고려된다.
세포 배양 방법은 동물 세포의 배양에서 일반적으로 기재되어 있다: 문헌[A Manual of Basic Technique, 6th Edition, 2010 (R. I. Freshney ed., Wiley & Sons)]; [General Techniques of Cell Culture (M. A. Harrison & I. F. Rae, Cambridge Univ. Press)], 및 [Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (K. Turksen ed., Humana Press)]. 다른 참조 문헌은 문헌[Creating a High Performance Culture (Aroselli, Hu. Res. Dev. Pr. 1996)] 및 [Limits to Growth (D. H. Meadows 등, Universe Publ. 1974)]을 포함한다. 조직 배양 공급 및 시약은 숙련가에게 널리 공지되어 있으며 상업적으로 이용가능하다.
세포들은 특정 세포주 또는 키트의 성분과 함께 사용되는 단리된 세포 유형에 적절한 밀도로 배양물 중에 존재하는 것으로 이해된다. 특정 구현예에서, 세포들은 1×103, 5×103, 1×104, 5×104, 1×105, 5×105, 1×106, 또는 5×106 세포/ml로 배양된다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질 및 하나 이상의 불안정 인자 또는 사이토카인은 세포 배양에 사용하기 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일 내에 조합된다.
불안정 인자를 혈청 대체물질과 별도로 포장하는 것은 불안정 인자를 포함하는 사전 포장된 배지에 비해 세포 배양 중의 불안정 인자의 효능을 개선하는 것으로 생각된다. 예를 들면, 불안정 인자의 반감기는 불안정 인자를 포함하는 배지에 비해 본원의 키트에서와 같이 사용되는 경우에 더 긴 것으로 생각된다. 게다가, 하나 이상의 불안정 인자를 혈청 대체물질과 별도로 포장하는 것은 불안정 인자로 사전-포장된 배지로 배양된 세포에 비해 세포 배양물 중의 세포의 성장을 개선하는 것으로 생각된다.
다양한 구현예에서, 혈청 대체물질 및 불안정 인자 조성물은 용기, 예컨대 밀봉된 병 또는 베셀 또는 본원에 개시된 다른 용기에 포장되며, 이때 라벨은 용기에 부착되거나 또는 조성물의 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용을 기술하고 있는 포장지에 포함된다. 다양한 측면에서, 조성물은 단위 투여 형태로 포장된다. 키트는 선택적으로 불안정 인자를 혈청 대체물질과 조합하거나 또는 다르게는 불안정 인자 및 혈청 대체물질을 기저 배지와 조합하기에 적합한 장치를 포함한다. 다양한 측면에서, 키트는 세포 배양을 위한 불안정 인자 및 혈청 대체물질의 용도를 설명하는 라벨을 함유한다.
또한, 키트를 적합한 포장재로 포장하는 것을 고려한다. 용어 "포장재"는 키트의 성분을 하우징시키는 물리적 구조를 지칭한다. 포장재는 성분들을 멸균 상태로 유지할 수 있고, 이러한 목적을 위해 통상적으로 사용되는 재료(예컨대, 종이, 골이 결쳐진 섬유, 유리 , 플라스틱, 호일, 앰풀, 및 당해 분야에 공지된 기타 재료들)로 제조될 수 있다.
본원 키트의 그 밖의 측면 및 세부사항은 제한적이라기보다 예시적인 것으로 의도된 하기 실시예들로부터 명백할 것이다.
실시예
실시예 1
신선한 불안정 인자를 함유한 혈청 대체물질은 시험관내 세포 증식을 촉진함
혈청 대체물질이 배양 세포의 성장을 촉진시키는 능력을 시험하기 위해, 표준 기법을 사용하여 마우스 비장으로부터 B 세포를 단리하고, 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS)(100 ng/ml)를 사용하여 증식시키기 위해 자극하였다.
간단히 말해서, 단일 세포 현탁액을 메쉬 스테인리스 스틸 스크린을 통해 기계적 파괴시켜 마우스로부터 단리하였다. 비장 샘플의 적혈구를 트리스-NH4Cl(pH 7.3) 중의 저 삼투압 충격에 의해 용해시키고, 세포를 HBSS 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 다시 세정하고, 기저 배지 및 필수 영양소를 함유하는 완전한 배지로서 여기서 사용된, 10% FBS(유타주 로건 소재 하이클론(HyClone)) 또는 혈청 대체물질을 함유하는 DMEM(라이프 테크놀로지스) 중의 5×106 생존가능한 세포/ml[2 mM L-글루타민(캘리포니아주 칼스배드 소재 라이프 테크놀로지스), 100 U/ml 페니실린(라이프 테크놀로지스), 100μg/ ml 스트렙토마이신(Life Technologies), 0.1 M 비-필수적인 아미노산 (Life Technologies) 및 5×10-5M 2-ME)]의 농도로 96-웰 플레이트(메사추세츠주 액톤 소재 커밍-코스타(Corning-Costar))에서 배양하였다. 도 1A에 사용된 혈청 대체물질은 사전-포장되거나, 또는 성능 실험 6개월 전에 조합된 불안정 인자와 함께 제조된 혈청 대체물질이다. 도 1B의 혈청 대체물질은 불안정 인자(FGF, EFG, 및 IGF 및 트랜스페린)가 배양 바로 전(예컨대, 1일 안)에 부가되었다. 세포를, 7.5% CO2를 함유하는 가습된 대기 하에 37℃로 배양하였다.
도 1A는 배지 + 10% FBS가 LPS에 의해 자극될 때 B 세포를 상당히 증식시키는 것을 보여주고 있다. 실험 6개월 이상 전에 함께 포장된 불안정 인자를 함유하는 혈청 대체물질 중의 B 세포의 배양물은 LPS 자극 후에도 B 세포를 증식시키기에 충분한 영양소를 제공하지 않았다(도 1A). 그에 반해, 불안정 인자가 세포 배양 직전에 부가된 혈청 대체물질에서 배양된 세포뿐만 아니라 10% FBS를 함유한 배지에서 배양된 세포까지 증식되었다(도　1B).
마우스에서 단리되고 상기 기재한 바와 같은 신선한 10% 혈청 대체물질 배지에서 배양된 T 세포 및 대식세포가 또한 각각 세포 배양물에서의 증식 또는 활성화를 나타내었다. 또한, 상기한 바와 같은 혈청 대체물질에 적응되어 배양된 CHO-K1 및 A-549 세포주는 우수한 증식 반응을 나타내었다.
이러한 결과는 배지 포장시 세포 배양물 배지에 불안정 인자를 포함시키는 것은 성장 인자의 경시적 파괴로 인해 배양물 중의 세포의 비효율적이고 손상된 성장 및 생존을 초래할 수 있음을 보여준다. 세포 배양물 배지의 사용 바로 직전에 불안정 인자를 혈청 대체물질에 부가하는 것은 혈청 대체물질 배지의 기능을 회복시켜 배양물 세포의 건강한 성장과 증식을 가능하게 한다.
실시예 2
혈청 대체물질 및 불안정 인자 중의 세포주 성장
무혈청 배지에서의 성장은 특정 세포주를 무혈청 환경에서 성장하도록 적응시키는 것을 필요로 한다. 세포주가 새로 부가된 불안정 인자를 포함하는 혈청 대체물질에서 성장하도록 적응될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 생존력 및 성장 분석을 수행하였다.
6 내지 10주간에 걸쳐 세포 적응을 실시하였다. CHO-K1 세포 및 A549-NFkB SEAP 세포를 2×104 세포/웰을 갖는 6개의 웰 플레이트에 접종하고, 모집단이 배로 될 때까지의 시간 및 72시간 후의 세포 생존율을 측정하였다. 24, 48 및 72 시간 후, 플레이트의 한 웰을 수확하고, 세포의 총 개수를 세포계산기로 계수하고, 수확된 세포의 생존율을 현미경 하에서 세포 형태로 평가하였다. 적응된 CHO 세포를 배지 + 10% 혈청 대체물질에서 성장시키고, 적응된 A549 세포를 배지 + 10% 혈청 대체물질에서 성장시켰다. 대조군 웰은 5% FBS를 함유한 배지에서 성장시켰다.
CHO 세포는 95% 생존력을 보였고(대조군, 96% 생존력), 세포 모집단은 약 30시간(대조군, 약 24 시간) 후에 2배로 되었다. A549 세포는 약 3.5일 후에 세포 배증을 보인 반면, 대조군 세포는 약 2.5일 후에 보였다. A549 생존력 및 대조군 생존력은 72시간 후에 약 98%이었다.
이러한 결과는 전형적으로 FBS를 함유하는 배지에서 성장한 세포주가 본원의 혈청 대체물질을 포함하는 배지에서 성장하도록 적응될 수 있음을 보여준다.
상술한 바와 같이, 신선한 불안정 인자를 배양물 배지에 부가하는 것은 배양물 세포의 증식 및 생존력을 향상시킬 수 있다. 신선한 불안정 인자를 부가하는 것이 혈청 대체물질 배지에 배양된 세포주에 유익한 효과를 미치는지 여부를 확인하기 위해, 불안정 인자를 배양물 배지에 단독으로 또는 함께 부가하고, 세포 증식을 제조자 프로토콜(미주리주 세인트 루이스 소재 시그마(Sigma))에 따라 레사주린(Resazurin) 형광 분석을 사용하여 측정하였다. 형광(레사주린 형광 단위, RFU)의 증가는 샘플에서 증가된 세포 증식을 나타낸다.
시험된 초기 성장 인자는 인슐린 성장 인자(IGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 표피 성장 인자(EGF)를 포함하였다. 10% 혈청 대체물질 배지 단독으로 또는 이와 함께 다음과 같이 세포 배양물 배지 중의 최종 농도로 기재된 성장 인자 중의 CHO 세포 (5×106 세포/ml)의 배양물은 측정된 RFU 결과를 나타내었다: (1) 대조군, 성장 인자 비함유 혈청 대체물질, 약 1000 RFU, (2) SR + 1 ng/ml IGF, 약 2000 RFU; (3) SR + VEGF 및 1 ng/ml IGF, 시험된 모든 VEGF 농도에서 약 2200 RFU; (4) SR + FGF 및 1 ng/ml IGF, 1.5 내지 3.5 ng/ml FGF에서 약 2700 RFU 및 5 ng/ml FGF에서 약 3000 RFU; (5) SR + EGF, 시험된 모든 EGF 농도에서 약 2100 RFU.
혈청 대체물질에 트랜스페린(최종 농도 5 ng/ml)을 단독으로 부가하면 CHO 세포의 성장을 조금 개선시키지만, 트랜스페린 외에 성장 인자(IGF 및 EGF)를 부가하면 배양물 세포의 성장에 개선된 효과가 있었다. 혈청 대체물질에 트랜스페린 + IGF 및 EGF의 부가는 세포 증식 속도를 FBS에서 배양된 세포 속도보다 50% 더 크게 하며, 예를 들면, FBS 대조군의 경우 약 18000 RFU인 것에 비해 SR + 성장 인자 및 트랜스페린의 경우는 약 15500 RFU이었다. 혈청 대체물질 + 부가된 인자의 경우에 관찰된 증식은 혈청 대체물질 단독 또는 다른 상업적으로 이용가능한 혈청 대체물질에 배해 크게 개선된 증식을 보여주었다. 예를 들면, 특정 혈청 대체물질이 FBS 중의 배양물보다 열등하고 이보다 더 일관성이 없음을 기술하고 있는 문헌[Lund 등, Cytotherapy 11 (2): 189-97, 2009] 참조.
FBS는 부착 세포가 플레이트에 더욱 효과적으로 부착되도록 하여 세포 성장을 개선하고 배양물의 기하급수적 성장에 도달하는 데 걸리는 시간을 단축시키는 부착성 인자와 같은 특정 인자를 제공한다. 부착성 인자를 혈청 대체물질에 부가하고, 부착성 CHO-K1 세포의 성장을 평가하였다. 적응된 CHO-K1 세포(5×106 세포/ml)를 대조군 배지(5% FBS) 또는 10% 혈청 대체물질 배지 + 250 ng/ml 최종 농도의 비트로넥틴에서 배양하고, 세포 부착 및 형태를 시각화하였다. 비트로넥틴의 존재 하에 배양된 세포는 FBS에서 배양된 대조군 세포와 비슷한 세포 형태를 나타내었고, 배양 후 약 24시간 즈음에 부착되었다. FBS 없이 혈청 대체물질에서 배양된 세포는 배양 후 약 96시간까지 부착되지 않았고 표면에 잘 분포되지 않았다.
성장 호르몬은 또한 배양물 배지에 사용되는 전형적인 FBS에 존재한다. 하나 이상의 호르몬의 부가가 본원에 기재된 혈청 대체물질을 함유하는 배지에서의 세포 성장을 향상시키는지를 확인하기 위해, 호르몬(소마토스타틴-10 mg/ml, 덱사메타존-20 ng/ml, 또는 3,3,5-트리아이오도-L-티로닌-10 ng/ml), 성장 인자(EGF-10 ng/ml, IGF-1 ng/ml, 및 FGF-5 ng/ml)(모든 농도는 배양 배지 중의 최종 농도로 제공됨)의 혼합물을 배양물 배지에 부가하였다. 대조군 세포는 배지 + 5% FBS에서 배양하였다.
IGF, 및 트랜스페린(5 ng/ml 최종) + 호르몬 믹스를 함유하는 혈청 대체물질에서의 CHO 세포의 배양물은 약 14000 RFU로 측정되는 증식을 초래한 반면, 대조군 증식은 약 20000 RFU이었다. 호르몬 믹스에서 덱사메타존의 제거는 CHO 세포 증식에 영향을 미치지 않는다. 호르몬을 함유하는 배양물 배지에 성장 인자 믹스(EGF, IGF 및 FGF)의 부가는 증식을 약 9500 RFU로 감소시켰다. 이러한 결과는 혈청 대체물질에 호르몬을 부가하는 것이 IGF 및 트랜스페린만을 함유하는 혈청 대체물질에서의 배양에 비해 세포의 증식을 향상시킬 수 있음을 보여준다.
본원에서 고려되는 키트에서 별도의 바이알 개수를 최소화하기 위해, 한 측면에서, 불안정 인자는 기저 혈청 대체물질 배지와 별도로 포장되는 불안정 인자를 2종 이상 포함하는 칵테일로 제형화된다. 본 개시내용 이전에, 단일 제형의 여러 불안정 인자를 세포 배양에 적절한 농도로 조합하는 것이 우수 의약품 제조 기준(GMP)에 따라 수행하는 데 불필요하고 복잡하며 어렵다는 것이 당해 분야의 지배적인 생각이었다. 필요한 모든 인자들을 조합하는 능력은 많은 제조업체의 생산 능력을 넘어서는 것이었다. 그러나, 본 발명자들은 당해 분야의 이러한 어려움을 극복하고 제조업체와 협력하여 본원의 키트에 사용되는 하나 이상의 불안정 인자를 포함하는 칵테일을 제조할 수 있는 방법을 고안하게 되었다.
상기 예시적인 실시예에 기재된 본 발명의 많은 변형 및 변화가 당해 분야 숙련가에게 발생할 것으로 예상된다. 따라서, 첨부된 특허청구범위에 나타나는 제한만을 본 발명에 두어야 한다.

Claims (34)

  1. 혈청 대체물질을 포함하는 제1 용기 및 적어도 하나의 불안정 인자를 포함하는 하나 이상의 별도의 용기, 및 사용 지침을 포함하는 시험관내 세포 배양을 위한 개선된 키트(kit).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 혈청 대체물질은, i) 리포좀 및 ii) 기저 영양 배지를 포함하는 키트.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 리포좀은 나노입자인 키트.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 나노입자는 약 50 nm 내지 약 500 nm의 평균 직경을 갖는 키트.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리포좀은 지질, 지방산, 스테롤 및/또는 유리 지방산을 포함하는 키트.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 불안정 인자는 냉동, 액체 또는 동결건조 형태인 키트.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 키트는, 2, 3, 4, 5 또는 6 개, 또는 그 이상의 불안정 인자를 포함하는 키트.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 불안정 인자는 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 스테로이드 호르몬, 펩타이드 호르몬, 철 수송자, 펩타이드 인자 및 스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 불안정 인자는 인슐린 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 소마토스타틴, 및 트리아이오도-L-티로닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 불안정 인자는, 성장 인자의 최종 농도가, 배지에 부가될 때 0.05 내지 250 ng/ml의 범위가 되도록 포장되는 키트.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 철 공급원 또는 철 수송자를 추가로 포함하는 키트.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 철 공급원 또는 철 수송자는 트랜스페린, 락토페린, 제1철 설페이트, 제1철 시트레이트, 제2철 시트레이트, 제2철 암모늄 시트레이트, 제2철 암모늄 옥살레이트, 제2철 암모늄 푸마레이트, 제2철 암모늄 말레이트 및 제2철 암모늄 석시네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 구리 공급원을 추가로 포함하는 키트.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혈청 대체물질 배지 및 하나 이상의 불안정 인자는 배양물에서 세포의 분화를 야기하지 않는 키트.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 부착을 촉진하기 위한 제제를 포함하는 용기를 추가로 포함하는 키트.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 세포 부착을 촉진하는 제제는 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 합성 미세캐리어 및 랩핑된 탄소 튜브로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 불안정 인자 보충물은 인슐린 성장 인자(IGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 트랜스페린, 소마토스타틴, 및 트리아이오도-L-티로닌 중 2종 이상을 포함하는 칵테일인 키트.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 IGF의 최종 농도는 0.5 내지 3 ng/ml이고, EGF의 최종 농도는 1 내지 10 ng/ml이고, FGF의 최종 농도는 3 내지 10 ng/ml이고, 트랜스페린의 최종 농도는 3 내지 10 ng/ml이고, 소마토스타틴의 최종 농도 및 트리아이오도-L-티로닌의 최종 농도는 5 내지 15 ng/ml인 키트.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 비트로넥틴의 최종 농도는 100 내지 500 ng/ml의 범위인 키트.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혈청 대체물질은 동물-성분이 없는 키트.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 별도로 포장된 불안정 인자는, 혈청 대체물질에서 사전-포장될 때의 동일한 불안정 인자보다, 혈청 대체물질에 도입될 때의 반감기가 더 긴 키트.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 혈청 대체물질로부터 분리된 하나 이상의 불안정 인자를 포장하는 것은 불안정 인자와 함께 사전-포장된 배지를 갖는 배양물에 비해 세포 배양물에서 세포의 성장을 개선하는 키트.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 만능 줄기세포, 배아 줄기 세포, 골수 기질 세포, 조혈 전구 세포, 림프 줄기세포, 골수 줄기세포, T 세포, B 세포, 대식세포, 간성 세포, 췌장 세포, 암종 세포 및 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 세포주는 CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, T 세포주, B 세포주, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, HT1080, 하이브리도마 및 암 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혈청 대체물질 및 하나 이상의 불안정 인자는 세포 배양물에 사용 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일 내에 조합되는 키트.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혈청 대체물질은 50 ml, 100 ml, 500 ml 또는 1L의 용적으로 포장되는 키트.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혈청 대체물질은 1X, 5X, 10X, 또는 20X 용액에서 포장되는 키트.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 선택 또는 유도 제제를 포함하는 용기를 추가로 포함하는 키트.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 용기는 튜브, 바이알, 앰풀, 및 병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 불안정 인자를 포함하는 용기는 단백질 활성의 손실을 방지하기 위해 코팅되는 키트.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 별도의 용기에 포장된 세포를 추가로 포함하는 키트.
  32. 제 1 항 또는 제 3 항 내지 제 31 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혈청 대체물질 및 불안정 인자는 기저 배지에 부가되는 키트.
  33. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 혈청 대체물질은 완전한 배지인 키트.
  34. 시험관내 세포의 배양물을 위한 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 하나의 항의 키트의 용도.
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