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KR20150130466A - 췌장암을 치료하는 방법 - Google Patents

췌장암을 치료하는 방법 Download PDF

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KR20150130466A
KR20150130466A KR1020157028505A KR20157028505A KR20150130466A KR 20150130466 A KR20150130466 A KR 20150130466A KR 1020157028505 A KR1020157028505 A KR 1020157028505A KR 20157028505 A KR20157028505 A KR 20157028505A KR 20150130466 A KR20150130466 A KR 20150130466A
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KR
South Korea
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seq
ser ser
sequence
antibody
notch3
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Withdrawn
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KR1020157028505A
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English (en)
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티모시 찰스 호이
춘 장
앤 엠. 카포운
Original Assignee
온코메드 파마슈티칼스, 인크.
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Publication date
Application filed by 온코메드 파마슈티칼스, 인크. filed Critical 온코메드 파마슈티칼스, 인크.
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Abstract

췌장암을 치료하는 신규 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 방법은 췌장암 세포에서 NOTCH mRNA 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 치료 유효 용량의 NOTCH 길항제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.

Description

췌장암을 치료하는 방법 {METHODS OF TREATING PANCREATIC CANCER}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 61/794,788의 우선권 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 일반적으로 췌장암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 방법은 췌장암 세포에서 NOTCH 유전자 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 치료 유효 용량의 NOTCH 길항제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
NOTCH 신호전달 경로는 배아 패턴 형성, 배아기 후 조직 유지 및 줄기 세포 생물학의 여러 중요 조절자 중 하나이다. 비조절 NOTCH 신호전달은 수많은 인간 암과 연관되어 있으며, 여기서 이는 종양 세포의 발생 운명을 변경시켜 이를 미분화 및 증식성 상태로 유지시킬 수 있다 (Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69). 따라서, 발암은, 줄기 세포 집단에 의한 정상 발생 및 조직 복구를 제어하는 항상성 메카니즘의 침해에 의해 진행될 수 있다 (Beachy et al., 2004, Nature 432:324).
NOTCH 수용체는 대형 세포외 도메인 내에 수많은 탠덤 표피 성장 인자 (EGF)-유사 반복부 및 3개의 시스테인-풍부 NOTCH/LIN-12 반복부를 함유하는 단일-통과 막횡단 수용체이다 (Wharton et al., 1985, Cell 43:567; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094; Artavanis et al., 1999, Science 284:770에서 검토됨). 4종의 포유동물 NOTCH 단백질이 확인되었고 (NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 및 NOTCH4), 이들 수용체에서의 돌연변이는 예외없이 발생 이상, 및 이하에서 상세하게 기재되는 바와 같은 여러 암을 비롯한 인간 병리상태를 야기한다 (Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103; Joutel & Tournier-Lasserve, 1998, Semin. Cell Dev. Biol. 9:619-25).
이상 NOTCH 신호전달은 다수의 인간 악성종양, 예를 들어 T-세포 급성 림프모구성 백혈병, 유방암, 자궁경부암, 신세포 암종, 두경부 편평 세포 암종과 관련이 있다. 이상 NOTCH 신호전달은 또한 췌장암의 발생과 관련이 있다. 예를 들어, 문헌 [Mazur et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107(30):13438-43 (2010), Wang et al., Cancer Res. 69(6):2400-7 (2009), Doucas et al., J. Surg. Oncol. 97(1):63-8 (2008), Yao and Qian, Med. Oncol. 27(3):1017-22 (2010); 및 Gungor et al., Cancer Res. 71(14):5009-19 (2011)]을 참조한다.
췌장암은 중앙 생존기간이 6개월이고 5-년 생존율이 3-5%로 낮은 네번째의 주요 암 사망 원인이고, 이러한 수치는 지난 25년 동안 비교적 변화없이 유지되고 있다 (Iovanna et al., Front. Oncol. 2012; 2: 6). 국부 질환으로 진단된 환자조차도, 5-년 생존율은 단지 15%이다. 췌장암의 치사 속성은 림프계 및 원위 기관으로 급속하게 파종하는 그의 성향으로부터 유래된다. 진단 시점에서의 잠복 또는 임상 전이의 존재와 함께 효과적인 화학요법의 부족은 췌장암을 가진 환자에서의 높은 사망률에 기여한다.
췌장암은 가장 본질적으로 약물-내성인 종양 중 하나이고, 화학요법제에 대한 내성은 췌장암에서의 치료 실패의 주요 원인이다. 겜시타빈은 진행성 췌장암을 갖는 환자를 위한 표준 화학요법 약물이다 (Burris et al., Eur. J. Cancer 1997, 33:S18-22). 최근의 5-FU, 이리노테칸 및 옥살리플라틴을 조합한 다중화학요법 (폴피리녹스(FOLFIRINOX))은 겜시타빈과 비교하여 전체 생존을 거의 배가시키는 것으로 밝혀졌지만, 관리가능하지만 증가된 독성은 양호한 수행 상태의 환자에 대한 그의 사용을 제한한다. 또한, 전체 생존은 12개월 미만이었다 (Conroy et al., N. Engl. J. Med. 2011, 364:1817-25). 따라서, 약물-내성을 극복할 수 있고 췌장암으로 진단된 환자에 대한 임상 결과를 개선할 수 있는, 신규하고 표적화된 치료 전략을 설계할 필요성이 존재한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 췌장암 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하는 것인 단계, 및 (b) 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준에 기초하여 환자를 선택하는 단계를 포함하는, NOTCH 억제제를 사용한 치료를 위한 췌장암 환자를 선택하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 췌장암으로 진단된 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하고, 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준은 상기 환자가 요법에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 것인, 췌장암으로 진단된 환자가 NOTCH 억제제-기반 요법에 반응할 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 췌장암으로 진단된 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하고, 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준은 상기 환자가 NOTCH 억제제를 사용한 치료에 대해 유리한 반응을 가짐을 예측하는 것인, 췌장암으로 진단된 환자에게 NOTCH 억제제를 투여해야 하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 췌장암으로 진단된 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하고, 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준은 상기 환자가 요법에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 것인, 췌장암으로 진단된 환자에게 NOTCH 억제제를 사용한 치료를 계속해야 하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 췌장암으로 진단된 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하고, 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준은 상기 환자가 상기 NOTCH 억제제를 사용한 치료에 대해 유리한 반응을 가짐을 예측하는 것인, 췌장암으로 진단된 환자에게 NOTCH 억제제를 사용한 치료를 계속해야 하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하고, 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준은 NOTCH 억제제의 치료 효능을 나타내는 것인, 환자에서 췌장암을 치료하기 위한 NOTCH 억제제의 치료 효능을 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 상기 환자에게 치료 유효량의 NOTCH 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 췌장암을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 췌장암 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하는 것인 단계, 및 (b) 종양 세포에서의 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준에 기초하여 환자 집단을 계층화하는 단계를 포함하는, NOTCH 억제제를 사용한 치료를 위한 췌장암 환자 집단을 계층화하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 NOTCH3 발현에 대한 참조 수준을 초과한 것으로 결정된다. 특정 실시양태에서, 각각의 바이오마커는 바이오마커에 대한 참조 수준을 초과한 수준에서 발현된 것으로 결정된다.
특정 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준은 바이오마커 mRNA 또는 바이오마커 단백질의 수준을 결정함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 종양 세포에서 NOTCH3 mRNA의 수준을 결정함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 mRNA 수준은 정량적 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 mRNA 수준은 (a) 서열 35, 서열 38, 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 프라이머; (b) 서열 36, 서열 39, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 프라이머; 및/또는 (c) 서열 37, 서열 40, 및 서열 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 사용하여 결정된다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 mRNA 수준은 (a) 서열 35의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 36의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 37의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브; (b) 서열 38의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 39의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 40의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브; 또는 (c) 서열 41의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 42의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 43의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 사용하여 결정된다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 mRNA 수준은 어레이 혼성화에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 종양 세포에 의해 발현된 NOTCH3 단백질의 수준을 결정함으로써 결정된다.
특정 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커는 MAML2를 추가로 포함하고, MAML2 발현 수준은 MAML2 발현에 대한 참조 수준을 초과한 것으로 결정된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3 및 MAML2로 이루어진다. 특정 실시양태에서, MAML2 발현 수준은 종양 세포에서 MAML2 mRNA의 수준을 결정함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, MAML2 발현 수준은 종양 세포에 의해 발현된 MAML2 단백질의 수준을 결정함으로써 결정된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에게 치료 유효량의 NOTCH 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 환자로부터의 췌장 종양 세포의 적어도 일부는 각각의 1종 이상의 바이오마커를 그 바이오마커에 대한 참조 수준을 초과한 수준에서 발현하고/거나 이전에 각각의 1종 이상의 바이오마커를 그 바이오마커에 대한 참조 수준을 초과한 수준에서 발현하는 것으로 결정되었으며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하는 것인, 환자에서 췌장암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 NOTCH3 mRNA의 수준으로 결정된다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 NOTCH3 단백질의 수준으로 결정된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커는 MAML2를 추가로 포함하고, MAML2 발현 수준은 MAML2 발현에 대한 참조 수준을 초과한다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3 및 MAML2로 이루어진다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 바이오마커의 참조 수준은 미리 결정된 값이다. 특정 실시양태에서, 바이오마커의 참조 수준은 대조 샘플에서의 그 바이오마커의 발현 수준이다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현에 대한 참조 수준은 췌장암 또는 췌장암의 하위세트에서 NOTCH3 발현에 대한 제25 백분위수, 제30 백분위수, 제40 백분위수, 제50 백분위수, 제60 백분위수, 제70 백분위수, 제75 백분위수 또는 제80 백분위수이다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현에 대한 참조 수준은 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제75 백분위수이다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현에 대한 참조 수준은 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제50 백분위수이다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현에 대한 참조 수준은 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제25 백분위수이다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현에 대한 참조 수준은 췌장 선암종, 전이성 췌장 종양, 간 및/또는 림프절 전이성 췌장 종양 또는 화학요법-내성 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제75 백분위수이다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현에 대한 참조 수준은 췌장 선암종, 전이성 췌장 종양, 간 및/또는 림프절 전이성 췌장 종양 또는 화학요법-내성 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제50 백분위수이다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현에 대한 참조 수준은 췌장 선암종, 전이성 췌장 종양, 간 및/또는 림프절 전이성 췌장 종양 또는 화학요법-내성 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제25 백분위수이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 환자로부터 신체 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 환자로부터의 신체 샘플 내 수준이다. 특정 실시양태에서, 샘플은 전혈, 혈장, 혈청 또는 조직이다. 특정 실시양태에서, 샘플은 췌장 종양 샘플이다. 특정 실시양태에서, 샘플은 간으로 전이된 췌장 종양으로부터의 것이다. 특정 실시양태에서, 샘플은 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직이다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 환자는 인간이거나 또는 상기 환자 집단은 인간 집단이다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 췌장암은 선암종이다. 특정 실시양태에서, 췌장암은 화학요법-내성이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 환자에게 NOTCH 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, NOTCH 억제제는 감마-세크레타제 억제제이다. 특정 실시양태에서, NOTCH 억제제는 항-NOTCH 항체이다.
특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 또는 인간 NOTCH3에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및 NOTCH3에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2의 EGF 반복부 10에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH3의 EGF 반복부 9에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH3의 EGF 반복부 9 및 NOTCH2의 EGF 반복부 10 둘 다에 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다.
특정 실시양태에서, NOTCH 억제제는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3의 길항제이다. 특정 실시양태에서, NOTCH 억제제는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 대한 리간드의 결합을 억제한다. 특정 실시양태에서, NOTCH 억제제는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3의 신호전달을 억제한다.
특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 ATCC에 PTA-9547로 기탁된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 (a) SSSGMS (서열 3)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIFYTT (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및 (b) RASQSVRSNYLA (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 (a) SSSGMS (서열 3)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 GIFFAI (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및 (b) RASQSVRSNYLA (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 (a) 서열 17, 서열 18 또는 서열 26에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 29 또는 서열 27에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 (a) 서열 17에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 29에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 (a) 서열 18에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 29에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 (a) 서열 18을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 (a) 서열 17을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 (a) 서열 17 또는 서열 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; (b) SSSGMS (서열 3)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIFYTT (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및 RASQSVRSNYLA (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체; 및 (c) ATCC에 PTA-9547로 기탁된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 대한 특이적 결합에 대해 경쟁한다.
특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 항체 단편이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 화학요법제이다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 뉴클레오시드 유사체 또는 유사분열 억제제이다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 겜시타빈, 파클리탁셀, 알부민 결합 파클리탁셀 또는 그의 조합이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 35-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진단 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 진단 조성물은 (a) 서열 35의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 36의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 37의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; (b) 서열 38의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 39의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 40의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 또는 (c) 서열 41의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 42의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 43의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플을 서열 35-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 NOTCH3 mRNA를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 샘플을 (a) 서열 35의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 36의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 37의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브; (b) 서열 38의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 39의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 40의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브; 또는 (c) 서열 41의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 42의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 43의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브와 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 35-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 샘플에서 NOTCH3 mRNA를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 (a) 서열 35의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 36의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 37의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; (b) 서열 38의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 39의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 40의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 또는 (c) 서열 41의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 42의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 43의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 35, 서열 36, 서열 38, 서열 39, 서열 41, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 프라이머를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 37, 서열 40, 및 서열 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 제공한다.
도 1. (도 1a) PN8 췌장 종양 세포, (도 1b) PN17 췌장 종양 세포, (도 1c) PN11 췌장 종양 세포, (도 1d) UM-PE13 유방 종양 세포, (도 1e) UM-T1 유방 종양 세포, (도 1f) OMP-Lu40 폐 종양 세포, 및 (도 1g) OMP-Lu53 폐 종양 세포에서의 OMP-59R5의 단일 작용제로서의 또는 화학요법제와 조합물로의 활성.
도 2. NOTCH3 유전자 발현과 OMP-59R5 종양 억제의 상관관계. (도 2a) 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5 항체에 의한 췌장 종양 억제의 정도는 췌장 종양 세포에서의 NOTCH3 유전자 발현의 수준과 유의하게 상호관련된다. (도 2b) 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5 항체 치료에 대해 반응성 (R) 및 비반응성 (NR)인 췌장 종양에서의 NOTCH3 유전자 발현의 분포. NOTCH3 유전자 발현 분포는 샘플 최소, 하위 사분위수, 중앙, 상위 사분위수 및 샘플 최대를 도시한 박스플롯으로 제시된다.
도 3. RNAseq에 의해 결정된 바와 같은, 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5 항체 치료에 대해 반응성 및 비반응성인 췌장 종양에서의 NOTCH3 유전자 발현. NOTCH3 유전자 발현은 RPKM (백만개의 맵핑된 판독치당 전사체 킬로베이스당 판독치)으로 측정되었다.
도 4. 예측 지표로서 NOTCH3 유전자 발현에 기초한, 췌장 종양에서의 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5 항체 치료에 대한 반응의 예측되는 확률.
도 5. 예측 지표로서 NOTCH3 및 MAML2 유전자 발현에 기초한, 췌장 종양에서의 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5 항체 치료에 대한 반응의 예측되는 확률.
도 6. 췌장 종양에서의 NOTCH3 발현. (도 6a) 췌장 종양에서의 NOTCH3 유전자 및 단백질 발현. (도 6b) 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5 항체 치료에 대해 반응성 (R) 및 비반응성 (NR)인 췌장 종양에서의 NOTCH3 단백질 발현의 분포. NOTCH3 단백질 발현 분포는 샘플 최소, 하위 사분위수, 중앙, 상위 사분위수 및 샘플 최대를 도시한 박스플롯으로 제시된다.
도 7. 췌장암 전이성 조직에서의 NOTCH3 유전자 발현. NOTCH3 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 측정하였다. NOTCH3 유전자 발현 분포는 특정한 종양 유형의 샘플 내에서 관찰되는 샘플 최소, 하위 사분위수, 중앙, 상위 사분위수 및 샘플 최대를 도시한 박스플롯으로 제시된다. 수직 점선은 모든 전이성 췌장 종양 샘플에 걸쳐 관찰된 제10, 제25, 제50, 제75, 및 제90 백분위수 NOTCH3 발현 값을 나타낸다.
도 8. 간 및 림프절 췌장암 전이성 조직 및 이종이식 종양에서의 NOTCH3 유전자 발현. NOTCH3 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 측정하였다. NOTCH3 유전자 발현 분포는 특정한 종양 유형의 샘플 내에서 관찰되는 샘플 최소, 하위 사분위수, 중앙, 상위 사분위수 및 샘플 최대를 도시한 박스플롯으로 제시된다. 수직 점선은 림프절 및 간 전이성 췌장 종양 샘플에서 관찰된 제10, 제25, 제50, 제75, 및 제90 백분위수 NOTCH3 발현 값을 나타낸다.
도 9. OMP-59R5는 췌장 종양에서 겜시타빈 및 아브락산(ABRAXANE)™ (단백질 결합 파클리탁셀)과 조합되어 활성이다.
본 발명은 넓게는 NOTCH 억제제를 사용하여 췌장암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 NOTCH 억제제를 사용한 치료를 위한 췌장암 환자 집단을 계층화하는 방법, NOTCH 억제제를 사용한 치료를 위한 췌장암 환자를 선택하는 방법, 췌장암으로 진단된 환자가 NOTCH 억제제-기반 요법에 반응할 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법, 췌장암으로 진단된 환자에게 NOTCH 억제제를 투여해야 하는지 여부를 결정하는 방법, 췌장암으로 진단된 환자에게 NOTCH 억제제를 사용한 치료를 계속해야 하는지 여부를 결정하는 방법, 및 환자에서 췌장암을 치료하기 위한 NOTCH 억제제의 치료 효능을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자로부터의 종양 세포에서 NOTCH3 유전자 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 환자로부터의 종양 세포에서 MAML2 유전자 발현 수준을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 NOTCH 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, NOTCH 억제제는 특이적으로 1종의 인간 NOTCH 수용체에 결합하거나, 또는 1종 초과의 인간 NOTCH 수용체에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 화학요법제와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 뉴클레오시드 유사체 또는 유사분열 억제제이다.
1. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에서 정의된다.
"NOTCH"는 특히 발생에 있어서 많은 세포 과정을 조절하는 막-결합 전사 인자이다. 리간드 결합에 반응하여, 그의 세포내 도메인 (ICD)이 2종의 프로테아제에 의해 방출된다. 방출된 세포내 도메인은 핵에 진입하고 DNA-결합 단백질과 상호작용하여 전사를 활성화한다. NOTCH의 세포외 도메인 및 관련 단백질은 최대 36개의 EGF-유사 도메인에 이어서 3개의 notch (DSL) 도메인을 함유한다. 세포내 도메인 (ICD)은 6개의 안키린 반복부, 및 PEST 도메인을 포함하는 카르복실-말단 연장을 함유한다. NOTCH1 및 NOTCH2 ICD는 추가로 전사활성화 도메인 (TAD)을 포함한다. "NOTCH"는 NOTCH 수용체 패밀리의 모든 구성원을 포괄한다. NOTCH 신호전달 경로 및 그에 의해 영향을 받는 상태의 설명은 예를 들어 WO 98/20142 및 WO 00/36089에서 찾아볼 수 있다.
포유동물에는 NOTCH 패밀리의 4종의 구성원: NOTCH1 (TAN1), NOTCH2, NOTCH3 및 NOTCH4/Int-4가 존재한다. 인간 NOTCH 단백질에 대한 예시적인 서열은 진뱅크 수탁 번호 NM_017617.3으로 제시된 mRNA 서열에 의해 코딩되고 진뱅크 수탁 번호 NP_060087로 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 NOTCH1; 진뱅크 수탁 번호 NM_024408로 제시된 mRNA 서열에 의해 코딩되고 진뱅크 수탁 번호 NP_077719로 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 NOTCH2; 진뱅크 수탁 번호 NM_000435.2의 mRNA 서열에 의해 코딩되고 진뱅크 수탁 번호 NP_000426의 아미노산 서열을 갖는 인간 NOTCH3; 및 진뱅크 수탁 번호 NM_004557의 mRNA 서열에 의해 코딩되고 진뱅크 수탁 번호 NP_004548의 아미노산 서열을 갖는 인간 NOTCH4를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "NOTCH 억제제", "NOTCH 길항제", "항-NOTCH 치료제" 또는 "항-NOTCH 작용제"는 NOTCH 경로의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나 또는 중화시키는 임의의 화합물을 포함한다. 예시적인 NOTCH 억제 화합물은 감마-세크레타제 억제제, 예컨대 III-31-C, N-[N-(3,5-디플루오로페나세틸)-L-알라닐]S-페닐글리신 t-부틸 에스테르) (DAPT), 화합물 E, D-나선형 펩티드 294, 이소쿠마린, BOC-Lys(Cbz)Ile-Leu-에폭시드 및 (Z-LL)2-케톤 (문헌 [Kornilova et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:16479-16473] 참조); 및 WO 01/90084, WO 02/30912, WO 01/70677, WO 03/013506, WO 02/36555, WO 03/093252, WO 03/093264, WO 03/093251, WO 03/093253, WO 2004/039800, WO 2004/039370, WO 2005/030731, WO 2005/014553, WO 2004/089911, WO 02/081435, WO 02/081433, WO 03/018543, WO 2004/031137, WO 2004/031139, WO 2004/031138, WO 2004/101538, WO 2004/101539 및 WO 02/47671 및 미국 특허 출원 번호 2003/0114496에 기재되어 있는 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 감마-세크레타제 억제제 화합물이 또한 미국 특허 번호 6,984,663 및 7,304,094에 기재되어 있다. 특정 항체 NOTCH 억제제가 본원 뿐만 아니라 WO 2010/005566, 및 WO 2010/005567에 기재되어 있고, 이는 모두 본원에 참조로 포함된다. NOTCH 억제제는 또한 NOTCH 리간드 길항제를 포함한다.
"NOTCH 억제제", "NOTCH 길항제", "항-NOTCH 치료제" 또는 "항-NOTCH 작용제"는 또한 NOTCH 수용체에 결합하는 항체를 포괄한다. 용어 "항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 상기의 조합을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예컨대 적어도 2개의 무손상 항체로부터 생성된 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포괄한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 그의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초하여 이뮤노글로불린의 임의의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 그의 하위부류 (이소형) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린은 상이하고 널리 공지되어 있는 서브유닛 구조 및 3차원 배위를 갖는다. 항체는 네이키드이거나 또는 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성동위원소 등에 접합될 수 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 또한 초가변 영역으로 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR에 의해 함께 근접해서 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지의 기술이 존재한다: (1) 교차-종 서열 가변성을 기반으로 하는 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기반으로 하는 접근법 (Al-lazikani et al., J. Molec. Biol. 1997, 273:927-948)). 또한, 이들 2가지 접근법의 조합이 CDR을 결정하기 위해 관련 기술분야에서 때때로 사용된다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 일부를 지칭하고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도의 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종 항체 집단을 지칭한다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정기에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 및 전장 모노클로날 항체 둘 다 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포괄한다. 또한 "모노클로날 항체"는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수의 방식으로 제조된 이러한 항체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 최소한의 비인간 (예를 들어 뮤린) 서열을 함유하는 특정 이뮤노글로불린 쇄, 키메라 이뮤노글로불린, 또는 그의 단편인 비인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린이다 (Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536). 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 내 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체를 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비인간 잔기 내에서 추가의 잔기 치환에 의해 추가로 변형시켜, 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 정밀화 및 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 이뮤노글로불린에 상응하는 CDR 영역을 모두 또는 실질적으로 모두 함유하는 적어도 1개, 전형적으로는 2 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이나, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 그것이다. 인간화 항체는 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 그것을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하는데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 5,225,539에 기재되어 있다.
용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조된 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 이러한 인간 항체의 정의는 무손상 또는 전장 항체, 그의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예컨대 예를 들어 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 이뮤노글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 이상의 종으로부터 유래된 것인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등) 중 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 한편, 불변 영역은 또 다른 종 (통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이어서 그 종에서의 면역 반응 도출을 회피한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 특정한 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우에, 에피토프는 인접 아미노산 및 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬배치되는 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 유지되는 반면에, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 특유한 공간 입체형태로 적어도 3개, 보다 통상적으로는 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
단백질에 "특이적으로 결합하는" 그러한 폴리펩티드 또는 다른 작용제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 폴리펩티드 또는 다른 작용제가 비관련 단백질을 비롯한 대안적 물질에 비해 단백질과 보다 빈번하게, 보다 빠르게, 더 긴 지속기간으로, 더 큰 친화도로, 또는 상기한 것의 일부의 조합으로 반응하거나 회합되는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합한다"는, 예를 들어 작용제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)가 단백질에 약 0.1mM 이하, 보다 통상적으로는 약 1μM 미만의 KD로 결합한다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합한다"는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)가 단백질에 때로는 적어도 약 0.1μM 이하, 적어도 약 0.01μM 이하, 때로는 적어도 약 1nM 이하의 KD로 결합한다는 것을 의미한다. 상이한 종에서 상동 단백질 사이의 서열 동일성으로 인해, 특이적 결합은 하나 초과의 종에서 특정한 단백질, 예컨대 NOTCH 수용체를 인식하는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 그의 서열의 특정 영역에서 상이한 파라로그 (예를 들어, 상이한 인간 NOTCH 단백질) 사이의 상동성으로 인해, 특이적 결합은 하나 초과의 파라로그 (예를 들어, 하나 초과의 인간 NOTCH 단백질)를 인식하는 폴리펩티드 또는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)를 포함할 수 있다. 제1 표적에 특이적으로 결합하는 작용제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 제2 표적에 특이적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있음이 이해된다. 따라서, "특이적 결합"은 배타적 결합, 즉 단일 표적에 대한 결합을 (포함할 수는 있지만) 필수적으로 요구하지 않는다. 따라서, 작용제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는, 특정 실시양태에서, 하나 초과의 표적 (예를 들어, 다중의 상이한 인간 NOTCH 단백질, 예컨대 NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 및/또는 NOTCH4)에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체의 다중 표적은 항체의 동일한 항원-결합 부위에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 특정 경우에 2개의 동일한 항원-결합 부위를 포함할 수 있고, 이들은 각각 2종 이상의 인간 프리즐드 수용체 (예를 들어, 인간 NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 및/또는 NOTCH4)에 특이적으로 결합한다. 특정의 대안적 실시양태에서, 항체는 이중특이적일 수 있고, 특이성이 상이한 적어도 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 비제한적 예로서, 이중특이적 항체는 1종의 NOTCH 수용체, 예컨대 인간 NOTCH2 상의 에피토프를 인식하는 1개의 항원-결합 부위를 포함할 수 있고, 추가로 제2 NOTCH 수용체, 예컨대 인간 NOTCH3 상의 상이한 에피토프를 인식하는 제2의, 상이한 항원-결합 부위를 포함한다. 일반적으로, 필수적이지는 않지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미한다.
용어 "암" 및 "암성"은 세포의 집단이 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 용어 암은 NOTCH-의존성 암을 포괄하는 것으로 이해된다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"종양" 및 "신생물"은 전암성 병변을 비롯한 양성 (비암성) 또는 악성 (암성)의 과도한 세포 성장 또는 증식으로 인해 생성된 임의의 조직 덩이를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "전이"는 새로운 위치에서 유사한 암성 병변의 발생과 함께, 암이 원래 부위로부터 신체의 다른 영역으로 확산 또는 이전되는 과정을 지칭한다. "전이성" 또는 "전이" 세포는 이웃 세포와의 부착성 접촉을 상실하고 혈류 또는 림프를 통해 원발성 질환 부위로부터 이동하여 이웃 신체 구조를 침습하는 것이다.
용어 "암 줄기 세포", "종양 줄기 세포" 또는 "고형 종양 줄기 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, (1) 광범위한 증식 능력을 갖고; 2) 감소된 증식 또는 발생 잠재력을 갖는 하나 이상의 유형의 분화된 자손이 생성되도록 비대칭 세포 분열을 할 수 있고; (3) 자가-재생 또는 자가-유지를 위해 대칭 세포 분열을 할 수 있는 고형 종양으로부터의 세포 집단을 지칭한다. "암 줄기 세포", "종양 줄기 세포" 또는 "고형 종양 줄기 세포"의 이러한 특성은 이들 암 줄기 세포에, 종양 형성에 실패한 대부분의 종양 세포에 비해 면역손상된 마우스에의 일련의 이식 시 촉지성 종양을 형성하는 능력을 부여한다. 암 줄기 세포는 무질서한 방식으로 자가-재생 대 분화를 거쳐, 돌연변이의 발생에 따라 경시적으로 변화할 수 있는 비정상 세포 유형을 갖는 종양을 형성한다.
용어 "암 세포", "종양 세포" 및 문법적 등가물은 대규모의 종양 세포 집단을 포함하는 비-종양발생 세포 및 종양발생 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 다를 비롯한, 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 총 세포 집단을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "종양 세포"는 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별되게 하는 재생 및 분화능이 결여된 종양 세포만을 지칭하는 경우에, "비-종양발생"이라는 용어로 변형될 것이다.
용어 "종양발생"은 자기 재생 특성 (추가의 종양발생 암 줄기 세포를 생성함) 및 고형 종양 줄기 세포가 종양을 형성하도록 모든 다른 종양 세포를 생성하는 증식 특성 (분화되어 비-종양발생 종양 세포를 생성함)을 비롯한, 고형 종양 줄기 세포의 기능적 특성을 지칭한다. 자기 재생 특성 및 모든 다른 종양 세포를 생성하는 증식 특성은 암 줄기 세포에, 일련의 이식 시 종양을 형성할 수 없는 비-종양발생 종양 세포에 비해 면역손상된 마우스에의 일련의 이식 시 촉지성 종양을 형성할 수 있는 능력을 부여한다. 비-종양발생 종양 세포는 고형 종양으로부터 종양 세포를 수득한 후 면역손상된 마우스에의 1차 이식 시 종양을 형성할 수 있지만, 비-종양발생 종양 세포는 일련의 이식 시 종양을 생성하지 않는 것으로 관찰되었다.
용어 "대상체"는 특정한 치료의 수용자가 되는, 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 정량적 및 정성적 데이터에 대해 본원에 사용된 "정상" 대상체 또는 "정상" 대상체로부터의 샘플은 의사에 의해 췌장암을 갖지 않는 것으로 평가되었거나 또는 평가될 대상체를 지칭한다.
"대조 샘플"은 대조 세포로부터 분리된 샘플을 의미한다. 대조 세포는 질환이 없을 수 있거나, 또는 췌장암 세포일 수 있다. 대조 세포는 동일한 대상체로부터 또는 또 다른 대상체로부터의 것일 수 있다. 대조 세포는 동일한 조직으로부터 또는 상이한 조직으로부터의 것일 수 있다. 대조 세포는 불멸화 세포주로부터의 것일 수 있다.
용어 "예후"는 본원에서 신생물성 질환, 예컨대 췌장암의 재발, 전이성 확산 및 약물 내성을 비롯하여, 암에 기인한 사망 또는 진행의 가능성의 예측을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 용어 "예측하는" 또는 "예측"은 대상체가, 결과가 불리한 예후 대비 유리한 예후의 유의하게 증진된 또는 감소된 확률을 갖는다는 것을 알아내는 것을 지칭한다. 이는 또한 NOTCH 억제제가, 치료적인 것으로 밝혀지지 않은 것 대비 치료상 유효할 수 있는 가능성을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 환자가 약물 또는 약물 세트에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성, 및 또한 이들 반응의 정도, 또는 원발성 종양의 외과적 제거 및/또는 화학요법 후에 특정 기간 동안 암 재발 없이 환자가 생존할 가능성을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정한 환자에 대한 가장 적절한 치료 양식을 선택하여 치료를 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 예측 방법은 환자가 NOTCH-기반 치료 요법, 예컨대 항-NOTCH 항체 치료, 주어진 약물 또는 약물 조합물, 예를 들어 감마-세크레타제 억제제 또는 또 다른 NOTCH 억제제를 사용한 화학요법에 유리하게 반응할 가능성이 있는지, 또는 NOTCH 억제제를 사용한 치료 프로토콜 및/또는 화학요법 또는 다른 치료 양식의 종결 후에 환자가 장기 생존할 가능성 여부를 예측하는데 있어서 유익한 도구이다.
용어 "치료 유효량"은 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 유효한 작용제 (예를 들어, 항체, 가용성 수용체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유기 소분자, 또는 다른 약물)의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 치료 유효량의 작용제는 암 세포의 수를 감소시킬 수 있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있거나; 예를 들어, 연부 조직 및 골 내로의 암의 확산을 비롯한 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제 또는 중지시킬 수 있거나; 종양 전이를 억제 및 중지시킬 수 있거나; 종양 성장을 억제 및 중지시킬 수 있거나; 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 수 있거나; 이환율 및 사망률을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질을 개선할 수 있거나; 종양의 종양발생성, 종양발생 빈도 또는 종양발생 능력을 감소시킬 수 있거나; 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킬 수 있거나; 종양발생 세포를 비-종양발생 상태로 분화시킬 수 있거나; 또는 이러한 효과의 조합을 나타낼 수 있다. 작용제가 기존의 암 세포의 성장을 방지하고/거나 사멸시키는 한, 이는 세포증식억제성 및/또는 세포독성으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "종양 성장을 억제한다"는 종양 세포 성장을 억제시킬 수 있는 임의의 메카니즘을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 증식을 지연시킴으로써 억제된다. 특정 실시양태에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 증식을 중단시킴으로써 억제된다. 특정 실시양태에서, 종양 세포 성장은 종양 세포를 사멸시킴으로써 억제된다. 특정 실시양태에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 아폽토시스를 유도함으로써 억제된다. 특정 실시양태에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 분화를 유도함으로써 억제된다. 특정 실시양태에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 영양소를 박탈함으로써 억제된다. 특정 실시양태에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 이동을 방지함으로써 억제된다. 특정 실시양태에서, 종양 세포 성장은 종양 세포의 침습을 방지함으로써 억제된다.
본원에 사용된 용어 "계층화"는 특정한 질환 병태 또는 상태의 특징을 기반으로 하여 상이한 부류 또는 층으로 대상체를 분류하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 췌장암을 갖는 대상체 집단을 계층화하는 것은 종양 세포에서의 NOTCH3 유전자 발현 수준을 기반으로 하고/거나 질환의 중증도 (예를 들어, 전암성, 악성, 전이성 등)를 기준으로 대상체를 할당하는 것을 수반한다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화하는" 또는 "완화하기 위한"과 같은 용어는 1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하고/거나, 지연시키고/거나, 증상을 경감시키고/거나, 진행을 중단시키는 치료적 수단 및 2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발생을 방지하고/하거나 지연시키는 예방적 또는 방지적 수단 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 것은 이미 장애를 갖고 있는 것; 장애를 갖기 쉬운 것; 및 장애를 방지해야 하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자가 다음 중 하나 이상을 나타내는 경우에 대상체는 본 발명의 방법에 따라 암이 성공적으로 "치료"된다: 암 세포의 수의 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 예를 들어 연부 조직 및 골 내로의 암의 확산을 비롯한 말초 기관으로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 감소된 이환률 및 사망률; 삶의 질 개선; 종양의 종양발생성, 종양발생 빈도 또는 종양발생 능력의 감소; 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소; 종양발생 세포의 비-종양발생 상태로의 분화; 또는 이들 효과의 일부 조합.
용어 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 상기 정의에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기반으로 하기 때문에, 특정 실시양태에서 폴리펩티드가 단일 쇄 또는 회합된 쇄로 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "생검" 또는 "생검 조직"은 샘플이 암성 조직을 함유하는지 결정하기 위한 목적으로 대상체로부터 분리되는 조직 또는 체액 샘플을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생검 조직 또는 체액은 대상체가 암을 갖는 것으로 의심되기 때문에 수득된다. 이후에, 생검 조직 또는 체액은 암의 존재 또는 부재에 대해 검사된다.
본 개시내용 및 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
실시양태가 표현 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B" 둘 다, "A 또는 B", "A" 및 "B"를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 하기 실시양태 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
2. NOTCH3 평가 방법
하기에 상세하게 제시되는 바와 같이, 인간 췌장 종양의 항-NOTCH2/3 항체 OMP-59R5에 대한 감수성은 증가된 NOTCH3 발현과 유의하게 상호관련된다. 놀랍게도, NOTCH3 mRNA 및 단백질 발현은 둘 다 인간 췌장 종양에서 OMP-59R5 감수성과 상호관련되었고, 상관관계는 NOTCH3 단백질 발현과 치료 감수성 사이에서보다 NOTCH3 mRNA 발현과 치료 감수성 사이에서 증가되었다. 이들 데이터는 NOTCH2 또는 NOTCH3 발현과 OMP-59R5 치료에 대한 종양 감수성 사이에 어떠한 유의한 상관관계도 없는 것으로 밝혀진 인간 유방 종양 및 결장 종양으로부터의 발현 데이터와 두드러지게 대조된다. 유사하게, 인간 췌장 종양에서 OMP-59R5 감수성과 NOTCH2 발현 사이에는 어떠한 상관관계도 관찰되지 않았다.
증가 또는 상승된 NOTCH3 발현 (예를 들어, NOTCH3 과다발현)과 췌장암에서 OMP-59R5 치료에 대한 감수성 (치료 효능) 사이의 상관관계를 활용하여, 종양 세포가 상승 또는 증가된 NOTCH3 발현, NOTCH3 과다발현 또는 미리 결정된 수준의 또는 그 초과의 NOTCH3 발현을 특징으로 하는 췌장암 환자를 OMP-59R5 요법을 위해 선택함으로써 췌장암을 치료하는 방법을 개선할 수 있다. 용어 "상승된 NOTCH3 발현," "증가된 NOTCH3 발현," 및 "NOTCH3 과다발현"은 일부 경우에 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 치료 효능은 또한, 종양 세포가 정상 또는 감소된 NOTCH3 발현, 또는 미리 결정된 수준 미만의 NOTCH3 발현을 특징으로 하는 췌장암 환자를 OMP-59R5 요법을 위해 선택하지 않음으로써 개선될 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 NOTCH3 발현 수준은 대조 샘플, 예를 들어 대조 세포에서의 발현 수준일 수 있다. 특정 실시양태에서, 미리 결정된 NOTCH3 발현 수준은 췌장암에서 NOTCH3 발현의 중앙 수준, 또는 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수일 수 있다.
특정 실시양태에서, 환자는 종양 세포 중 적어도 일부가 상승된 NOTCH3 발현 수준을 나타내는 췌장 종양을 갖는다. 한 실시양태에서, 상승된 NOTCH3 발현 수준은 췌장암에서 NOTCH3 발현의 중앙 수준 또는 그 초과의 수준이다. 또 다른 실시양태에서, 상승된 NOTCH3 발현 수준은 췌장암의 NOTCH3 유전자 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수 또는 그 초과인 수준이다. 특정 실시양태에서, 췌장암의 NOTCH3 발현의 중앙 수준은 췌장 선암종, 전이성 췌장암, 간 및/또는 림프절 전이성 췌장암, 화학요법-내성 췌장암, 또는 진행성, 불응성 또는 재발성 췌장암의 NOTCH3 발현의 중앙 수준이다. 특정 실시양태에서, 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수는 췌장 선암종, 전이성 췌장암, 간 및/또는 림프절 전이성 췌장암, 화학요법-내성 췌장암, 또는 진행성, 불응성 또는 재발성 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수이다.
특정 실시양태에서, 상승된 NOTCH3 발현 수준은 미리 결정된 표준 수준, 또는 참조 수준, 또는 대조 수준 또는 그 초과인 수준이다. 용어 "미리 결정된 표준," "참조 수준," 및 "대조 수준"은, 일부 경우에, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 한 실시양태에서, 미리 결정된 표준은 대조 샘플, 예를 들어 췌장 종양 또는 췌장암 세포를 포함하지 않는 췌장 세포를 함유하는 샘플에서 측정된 바와 같은 NOTCH3 발현 수준을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 미리 결정된 표준은 췌장 종양 세포, 예를 들어 선암종, 전이성 종양 세포 및 간 또는 림프절 전이성 종양 세포를 포함하는 샘플에서 측정된 바와 같은 NOTCH3 발현 수준을 나타낸다. 추가 실시양태에서, 미리 결정된 표준은 NOTCH 억제제, 예를 들어 OMP-59R5를 사용한 치료에 대해 반응하지 않는 췌장암 세포를 포함하는 샘플에서 측정된 바와 같은 NOTCH3 발현 수준을 나타낸다. 추가 실시양태에서, 미리 결정된 표준은 NOTCH 억제제, 예를 들어 OMP-59R5를 사용한 치료에 반응하는 췌장암 세포를 포함하는 샘플에서 측정된 바와 같은 NOTCH3 발현 수준을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 미리 결정된 표준은 단리된 세포주에서의 NOTCH3 발현 수준이다. 세포주는 췌장암 샘플로부터 유래된 것일 수 있다. 세포주는 또한 NOTCH3을 발현하도록 재조합적으로 조작될 수 있다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현에 대한 미리 결정된 표준 또는 참조 수준은 췌장암, 예를 들어 췌장 선암종, 전이성 췌장 종양, 간 및/또는 림프절 전이성 췌장 종양, 화학요법-내성 췌장암, 또는 진행성, 불응성 또는 재발성 췌장암에서 NOTCH3 유전자 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수이다.
특정 실시양태에서, 환자는 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부가 NOTCH3을 상승된 수준으로 발현하는 경우에 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 사용한 치료를 위해 선택되고/거나 그를 사용하여 치료된다. 특정 실시양태에서, 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부는 NOTCH3을 참조 수준 또는 그 초과인 수준으로 발현한다. 특정 실시양태에서, 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부는 NOTCH3을 췌장암에서 NOTCH3 발현의 중앙 수준 또는 그 초과인 수준으로 발현한다. 특정 실시양태에서, 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부는 NOTCH3을 췌장암의 NOTCH3 유전자 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수 또는 그 초과인 수준으로 발현한다. 특정 실시양태에서, 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부는 NOTCH3을 췌장암의 NOTCH3 유전자 발현에 대한 제25 백분위수 또는 그 초과인 수준으로 발현한다. 특정 실시양태에서, 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부는 또한 MAML2를 참조 수준 또는 그 초과인 수준, 또는 췌장암에서 MAML2 발현의 중앙 수준 또는 그 초과인 수준으로 발현한다. 한 실시양태에서, 환자는 OMP-59R5를 사용한 치료를 위해 선택되고/거나 그를 사용하여 치료된다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 OMP-59R5의 6개의 CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체를 사용한 치료를 위해 선택되고/거나 그를 사용하여 치료된다.
특정 실시양태에서, 환자는 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부가 (1) 참조 수준, (2) 췌장암에서 NOTCH3 mRNA의 중앙 수준; 및/또는 (3) 췌장암에서 NOTCH3 mRNA 수준에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수 또는 그 초과의 NOTCH3 mRNA 수준을 포함하는 경우에 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 사용한 치료를 위해 선택되고/거나 그를 사용하여 치료된다. 특정한 실시양태에서, 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부는 췌장암, 예를 들어 간 및/또는 림프절 전이성 췌장암에서의 NOTCH3 mRNA 수준에 대한 제25 백분위수 또는 그 초과인 NOTCH3 mRNA 수준을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부는 또한 췌장암에서 MAML2 mRNA의 참조 수준 또는 그 초과, 또는 중앙 수준 또는 그 초과의 MAML2 mRNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 OMP-59R5를 사용한 치료를 위해 선택되고/거나 그를 사용하여 치료된다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 OMP-59R5의 6개의 CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체를 사용한 치료를 위해 선택되고/거나 그를 사용하여 치료된다.
특정 실시양태에서, 환자는 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부가 (1) 참조 수준, (2) 췌장암에서 NOTCH3 단백질의 중앙 수준; 및/또는 (3) 췌장암에서 NOTCH3 단백질 수준에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수 또는 그 초과의 NOTCH3 단백질 수준을 포함하는 경우에 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 사용한 치료를 위해 선택되고/거나 그를 사용하여 치료된다. 특정한 실시양태에서, 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부는 췌장암, 예를 들어 간 및/또는 림프절 전이성 췌장암에서의 NOTCH3 단백질 수준에 대한 제25 백분위수 또는 그 초과인 NOTCH3 단백질 수준을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자의 췌장 종양 세포 중 적어도 일부는 또한 췌장암에서 MAML2 단백질의 참조 수준 또는 그 초과, 또는 중앙 수준 또는 그 초과의 MAML2 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 OMP-59R5를 사용한 치료를 위해 선택되고/거나 그를 사용하여 치료된다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 OMP-59R5의 6개의 CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체를 사용한 치료를 위해 선택되고/거나 그를 사용하여 치료된다.
NOTCH3 수준 또는 또 다른 관심 유전자/유전자 산물 (예를 들어, MAML2)의 발현을 검출하는 방법은 NOTCH3 발현 수준을 핵산 또는 단백질 수준에서 결정할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 이러한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 면역침전, 면역형광, 유동 세포측정법, 면역조직화학 (IHC), 핵산 혼성화 기술, 핵산 역전사 방법, 핵산 증폭 방법, 예컨대 PCR 또는 qRT-PCR, RNase 보호, 마이크로어레이, 일련의 유전자 발현 분석 (SAGE), 초고속 질량 분광측정법 (MS), 전체 트랜스크립톰 샷건 서열분석 (WTSS), 대규모 병렬 서명 서열분석 (MPSS), 계내 혼성화 및 노던 블롯팅을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
췌장암에서 NOTCH3의 중앙 또는 백분위수 발현 수준은 환자의 췌장 종양 세포에서 NOTCH3 발현을 측정하는 것과 관련하여 임의의 시점에 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 동시발생적으로 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 췌장암에서 NOTCH3의 중앙 또는 백분위수 발현 수준은 환자의 샘플에서 NOTCH3 발현 수준의 측정 전에 결정된다.
한 실시양태에서, NOTCH3 발현은 신체 샘플 내에서 측정된다. 본원에 사용된 어구 "신체 샘플"은 NOTCH3 발현 수준이 검출될 수 있는 세포, 조직, 또는 체액을 포함하는 임의의 샘플로 의도된다. 이러한 신체 샘플의 예는 혈액, 림프, 소변, 부인과 체액, 생검, 양수 및 도말을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 신체 샘플은 환자로부터 다양한 기술에 의해 수득될 수 있다. 다양한 신체 샘플을 수집하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 신체 샘플은 췌장 종양 샘플이다. 특정 실시양태에서, 신체 샘플은 고정된 샘플, 예를 들어 포르말린 고정, 파라핀-포매 (FFPE) 샘플, 또는 동결 샘플일 수 있다.
특정한 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 mRNA 수준에서 검출된다. mRNA의 발현을 결정하기 위한 다양한 방법은 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 마이크로어레이 분석, 일련의 유전자 발현 분석 (SAGE) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 췌장 종양 세포 내 mRNA 수준은 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR) 또는 마이크로어레이 분석을 사용하여 결정된다. 많은 발현 검출 방법은 단리된 RNA를 사용한다. mRNA의 단리에 대해서는 선택되지 않는 임의의 RNA 단리 기술이 RNA를 신체 샘플로부터 정제하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel, ed., 1999, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York] 참조). 추가로, 다수의 조직 샘플이 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술, 예컨대 예를 들어 촘진스키(Chomczynski)의 단일-단계 RNA 단리 과정 (미국 특허 번호 4,843,155)을 사용하여 용이하게 처리될 수 있다.
용어 "프로브"는 특이적으로 의도된 표적 생체분자, 예를 들어 NOTCH3의 뉴클레오티드 전사체에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 공지된 기술을 사용하여 통상의 기술자에 의해 합성될 수 있거나, 또는 적절한 생물학적 제제로부터 유도될 수 있다. 프로브는 검출가능한 표지로 표지되도록 특이적으로 설계될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질 (펩티드 포함), 항체 및 유기 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
췌장 종양 세포로부터의 NOTCH3 mRNA는 mRNA 서열분석 방법, 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 분석 및 프로브 어레이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 혼성화 또는 증폭 검정에서 검출될 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위한 한 방법은 단리된 mRNA를 검출될 유전자에 의해 코딩된 mRNA에 혼성화될 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것을 수반한다. 핵산 프로브는, 예를 들어, 전장 cDNA, 또는 그의 부분, 예컨대 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개의 뉴클레오티드 길이이고 엄격한 조건 하에 NOTCH3을 코딩하는 mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화하는데 충분한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. mRNA와 프로브의 혼성화는 해당 유전자가 발현되고 있다는 것을 나타낸다.
한 실시양태에서, 예를 들어 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에 흘려보내고, mRNA를 겔로부터 막, 예컨대 니트로셀룰로스로 이동시킴으로써 mRNA는 고체 표면 상에 고정되고 프로브와 접촉된다. 대안적 실시양태에서, 예를 들어 아피메트릭스(Affymetrix) 유전자 칩 어레이 (캘리포니아주 산타 클라라)에서, 프로브(들)가 고체 표면 상에 고정되고 mRNA가 프로브(들)와 접촉된다. 공지된 mRNA 검출 방법은 췌장 종양 세포에서 NOTCH3 mRNA를 결정하는데 사용하기 위해 용이하게 적합화될 수 있다.
샘플 내의 NOTCH3 mRNA 수준을 결정하기 위한 대안적 방법은, 예를 들어 RT-PCR (뮬리스(Mullis), 1987, 미국 특허 번호 4,683,202에 기재된 실험 실시양태), 리가제 연쇄 반응 (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189 193), 자가 지속 서열 복제 (Guatelli, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874 1878), 전사 증폭 시스템 (Kwoh, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173 1177), Q-베타 레플리카제 (Lizardi, 1988, Bio/Technology, 6:1197), 롤링 써클 복제 (리자르디(Lizardi), 미국 특허 번호 5,854,033) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭 과정에 이어서, 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술을 사용한 증폭된 분자의 검출을 수반한다. 이들 검출 계획은 핵산 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우에 이러한 분자를 검출하는데 특히 유용하다. 본 발명의 특정한 측면에서, NOTCH3 mRNA 수준은 정량적 형광성 RT-PCR (즉, 택맨(TaqMan)® 시스템)에 의해 평가된다. 이러한 방법은 전형적으로 NOTCH3 유전자 내의 인트론에 플랭킹되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용한다. 공지된 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 정량적 RT-PCR을 사용하여 샘플에서 NOTCH3 mRNA 수준을 결정하는데 적합한 프라이머 세트를 제공한다. 한 실시양태에서, 프라이머 세트는 서열 35, 36, 및 37의 서열을 포함하는 3개의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 프라이머 세트는 서열 38, 39, 및 40의 서열을 포함하는 3개의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 프라이머 세트는 서열 41, 42, 및 43의 서열을 포함하는 3개의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가 측면에서, 본 발명은 샘플을 서열 35-43의 서열을 포함하는 적어도 하나의 단리된 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 NOTCH3 mRNA의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 프라이머 세트는 표준 qRT-PCR 절차에 따라 샘플에서 NOTCH3 mRNA 수준을 정량화하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 마이크로어레이는 생물학적 샘플에서 NOTCH3 mRNA 수준을 결정하는데 사용된다. 마이크로어레이는 그의 재현성으로 인해 이러한 목적에 특히 적합하다. DNA 마이크로어레이는 관심 분자의 상이한 부분에 대해 지시된 다수의 유전자 또는 다수의 올리고뉴클레오티드 프로브의 발현 수준의 동시 측정을 위한 하나의 방법을 제공한다. 각각의 어레이는 고체 지지체에 부착된 재현가능한 패턴의 포획 프로브로 이루어진다. 표지된 RNA 또는 DNA는 어레이 상의 상보적 프로브에 혼성화된 후, 예를 들어 레이저 스캐닝에 의해 검출된다. 어레이 상의 각각의 프로브에 대한 혼성화 강도를 결정하고, 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 정량적 값으로 전환한다. 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,040,138, 5,800,992 및 6,020,135, 6,033,860, 및 6,344,316을 참조한다. 고-밀도 올리고뉴클레오티드 어레이가 샘플 내의 다수의 RNA에 대한 유전자 발현 프로파일을 결정하는데 특히 유용하다.
기계적 합성 방법을 사용하는 이들 어레이의 합성에 대한 기술은 예를 들어 미국 특허 번호 5,384,261에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 평면 어레이 표면이 바람직하지만, 어레이는 실질적으로 임의의 형상의 표면 또는 심지어 다수의 표면 상에서 제작될 수 있다. 어레이는 비드, 겔, 중합체 표면, 섬유 예컨대 광섬유, 유리 또는 임의의 다른 적절한 기재 상의 펩티드 또는 핵산일 수 있고, 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,770,358, 5,789,162, 5,708,153, 6,040,193 및 5,800,992를 참조한다. 어레이는 진단 또는 내포된 모든 장치의 다른 조작을 가능하게 하는 방식으로 포장될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,856,174 및 5,922,591을 참조한다.
종양 세포 내의 NOTCH3 단백질 수준을 검출하는 방법은 생물학적 샘플 내의 NOTCH3 단백질의 존재를 검출하는 임의의 방법을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 웨스턴 블롯, 슬롯 블롯, ELISA, 면역침전, 면역형광, 유동 세포측정법, 면역세포화학, 면역조직화학 (IHC) 및 질량 분광분석법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 면역검정 방법은 수동으로 또는 자동화 방식으로 수행될 수 있다. NOTCH3의 임의의 영역에 결합하는 항체는 본원에 기재된 검출 방법에 유용하다. 한 실시양태에서, 종양 샘플 내의 NOTCH3 단백질의 수준은 IHC를 사용하여 결정된다.
항체 결합을 검출하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. NOTCH3 단백질에 대한 항체 결합은, 항체 결합의 수준에 상응하며 따라서 NOTCH3 단백질의 수준에 상응하는 검출가능한 신호를 생성하는 화학 시약의 사용을 통해 검출될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 결합은 표지된 중합체에 접합된 2차 항체의 사용을 통해 검출된다. 표지된 중합체의 예는 중합체-효소 접합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 복합체 내의 효소는 전형적으로 항원-항체 결합 부위에서 발색체의 침착을 촉매화하는데 사용되며, 그로 인해 관심 돌연변이의 발현 수준에 상응하는 세포 염색이 일어난다. 특정한 관심 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 및 알칼리성 포스파타제 (AP)를 포함한다. 상업용 항체 검출 시스템, 예컨대 예를 들어 다코 엔비전(Dako Envision)+ 시스템 (다코 노스 아메리카, 인크.(Dako North America, Inc.), 캘리포니아주 카핀테리아) 및 마하(Mach) 3 시스템 (바이오케어 메디칼(Biocare Medical), 캘리포니아주 월넛 크릭)이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다.
항체 결합의 검출은 항체를 검출가능한 물질에 커플링시키는 것에 의해 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 또는 3H를 포함한다.
한 실시양태에서, NOTCH3 단백질 수준은 NOTCH3에 특이적으로 결합하는 작용제를 사용하여 결정된다. NOTCH3에 대한 특이적 결합을 디스플레이하는 임의의 분자 개체는 샘플 내의 NOTCH3 단백질의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 특이적 결합제는 항체, 항체 모방체 및 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 압타머)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 통상의 기술자는 요구되는 특이성의 정도가 NOTCH 3 단백질을 검출하는데 사용되는 특정한 검정에 의해 결정된다는 것을 이해한다. 예를 들어, 전장 NOTCH3 및 NOTCH3 ICD 둘 다에 특이적으로 결합하는 작용제는 크기를 기반으로 하는 폴리펩티드의 분리를 수반하는 방법, 예를 들어 웨스턴 블롯에서 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, NOTCH3 단백질의 수준은 NOTCH3에 특이적인 항체를 사용하여 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. NOTCH3 특이적 항체는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tagami et al., 2008 Mol. Cell. Biol., 28(1):165-176]을 참조한다. NOTCH3 특이적 항체는 또한 상업적 공급원으로부터 입수가능하다. 예를 들어, R&D 시스템스(R&D Systems), 항-인간 NOTCH3 폴리클로날 항체, 카탈로그 # BAF1559를 참조한다. 항-NOTCH3 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 추가 실시양태에서, 항체는 고정 및 포매 조직 샘플 내의 NOTCH3에 특이적으로 결합한다. 조직 샘플은 포르말린 고정 조직 샘플일 수 있다. 조직 샘플은 파라핀 포매 조직 샘플일 수 있다.
3. NOTCH 억제제
본 발명의 방법의 또 다른 측면은 NOTCH3 발현 수준이 결정된 췌장암 환자를 치료하기 위한 NOTCH 억제제 (예를 들어, 항-NOTCH 항체)의 용도이다. 특정 실시양태에서, NOTCH 억제제는 항-NOTCH 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 1종 이상의 인간 NOTCH 수용체의 EGF10 도메인 (또는 EGF10 도메인의 등가물)에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2의 EGF10 및/또는 인간 NOTCH3의 EGF9에 특이적으로 결합한다. EGF9는 다른 인간 NOTCH 수용체 NOTCH1, NOTCH2, 및 NOTCH4 내의 EGF10과 등가물인 인간 NOTCH3 내의 EGF이다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH2의 EGF10에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH2의 EGF10 및 NOTCH3의 EGF9에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH3의 EGF9에 특이적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH2 EGF10 내의 서열 HKGAL (서열 1)의 적어도 일부에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH3 EGF9 내의 서열 HEDAI (서열 2)의 적어도 일부에 결합한다. NOTCH2 및 NOTCH3에 결합하는 예시적인 항체는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,226,943에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 대한 리간드의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2에 대한 리간드의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH2 및 NOTCH3에 대한 리간드의 결합을 억제한다. 다른 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH3에 대한 리간드의 결합을 억제한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 DLL4, JAG1 또는 JAG2이다. 다른 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3의 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2의 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH2 및 NOTCH3의 신호전달을 억제한다. 다른 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH3의 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서 NOTCH2 및/또는 NOTCH3 신호전달은 DLL4, JAG1 또는 JAG2에 의해 유도된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 (a) SSSGMS (서열 3)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4)를 포함하는 중쇄 CDR2 및/또는 SIFYTT (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 QQYSNFPI (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) SSSGMS (서열 3), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및/또는 SIFYTT (서열 9), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 6), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1; GASSRAT (서열 7), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및/또는 QQYSNFPI (서열 8), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 (a) SSSGMS (서열 3)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 GIFFAI (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 QQYSNFPI (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 NOTCH2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) SSSGMS (서열 3), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2; 및/또는 GIFFAI (서열 5), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 6), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1; GASSRAT (서열 7), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2; 및/또는 QQYSNFPI (서열 8), 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 (a) SSSGMS (서열 3)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4)를 포함하는 중쇄 CDR2 및/또는 (G/S)(I/S)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N) (서열 10)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 QQYSNFPI (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 SIFYPT (서열 11)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 SSSFFAS (서열 12)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체는 SSFYAS (서열 13)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 SSFFAT (서열 14)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 SIFYPS (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 SSFFAN (서열 16)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 (a) 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 또는 서열 26에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 (신호 서열의 존재 또는 부재 하); 및/또는 (b) 서열 29, 서열 27 또는 서열 28에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 (신호 서열의 존재 또는 부재 하)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH2 및 NOTCH3에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 NOTCH3에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 서열 18 또는 서열 17에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 서열 29에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 (a) 서열 30, 서열 31, 또는 서열 32에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 중쇄 (신호 서열의 존재 또는 부재 하); 및/또는 (b) 서열 33, 또는 서열 34에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 경쇄 (신호 서열의 존재 또는 부재 하)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 서열 19에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및 서열 28에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 서열 30에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및 서열 28에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 (a) 서열 17에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열 29에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-NOTCH 항체는 서열 17에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 29에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 각각 서열 31 및 33의 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 (신호 서열의 존재 또는 부재 하), 또는 부다페스트 조약의 규정 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에 2008년 10월 15일자로 기탁되고 수탁 번호 PTA-9547이 할당된 DNA에 의해 코딩된 바와 같은 59R1 IgG2 항체를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 각각 서열 30 및 서열 33의 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 (신호 서열의 존재 또는 부재 하), 또는 ATCC에 2009년 7월 6일자로 기탁되고 수탁 번호 PTA-10170이 할당된 DNA에 의해 코딩된 바와 같은 59R5 IgG2항체를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 59R5 IgG2 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다 (리더 서열의 존재 또는 부재 하). 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 59R5 IgG2 항체이다. 59R5 IgG2 항체는 또한 본원에서 OMP-59R5로 지칭된다. OMP-59R5 항체에 관한 추가의 정보는, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,226,943에서 찾아볼 수 있다. 미국 특허 번호 8,226,943에서, OMP-59R5 항체는 일반적으로 "59R5" 또는 "59R5 IgG2 항체"로 지칭된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 18를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 항체는 특이적 결합에 대해 각각 서열 31 및 33의 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 (신호 서열의 존재 또는 부재 하), 또는 ATCC에 2008년 10월 15일자로 기탁되고 수탁 번호 PTA-9547이 할당된 DNA에 의해 코딩된 바와 같은 59R1 IgG2 항체와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 NOTCH2에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 NOTCH2 및 NOTCH3에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간 NOTCH3에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 대한 특이적 결합에 대해 서열 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 항체는 특이적 결합에 대해 각각 서열 30 및 33의 중쇄 및 경쇄를 포함하거나, 또는 ATCC에 2009년 7월 6일자로 기탁되고 수탁 번호 PTA-10170이 할당된 DNA에 의해 코딩된 바와 같은 59R5 항체와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 NOTCH2에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 NOTCH2 및 NOTCH3에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간 NOTCH3에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 IgG1 항체 또는 IgG2 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 59R1 또는 59R5 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 그의 에피토프와 중첩되는 에피토프에 결합한다.
본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체의 추가의 예는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 8,226,943에 개시되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH 수용체를 특이적으로 인식하는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하고 그에 결합할 수 있는 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항-NOTCH 항체는 동일한 인간 NOTCH 수용체 내의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식한다. 또 다른 실시양태에서, 이중특이적 항-NOTCH 항체는 인간 NOTCH 수용체 내의 또는 상이한 인간 NOTCH 수용체 상의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식한다.
대안적으로, 특정의 대안적 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 이중특이적 항체가 아니다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-NOTCH 항체는 단일특이적이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체가 함유하는 1개 이상의 항원-결합 부위 각각은 동일한 1종 이상의 인간 NOTCH 수용체에 결합할 수 있다 (또는 결합한다). 특정 실시양태에서, 단일특이적 항-NOTCH 항체의 항원-결합 부위는 1, 2, 3 또는 4종의 인간 NOTCH 수용체에 결합할 수 있다 (또는 결합한다).
본 발명의 방법의 또 다른 측면은 췌장암의 치료에서의 NOTCH 억제제 (예를 들어, 항-NOTCH 항체)의 용도이다. 특정 실시양태에서, NOTCH 억제제는 감마-세크레타제에 대한 억제제이다. 감마-세크레타제 억제제는 또한 NOTCH 수용체 활성화를 방지할 수 있기 때문에, 여러 형태의 감마-세크레타제 억제제가 항종양 효과에 대해 시험되었다. 첫번째로, 원래의 감마-세크레타제 억제제, IL-X (cbz-IL-CHO)가 Ras-형질전환된 섬유모세포에서 NOTCH1-의존성 항신생물성 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 트리펩티드 감마-세크레타제 억제제 (z-Leu-leu-Nle-CHO)는 흑색종 및 카포시 육종으로부터 마우스에서 세포주 및/또는 이종이식편 내의 종양 성장을 저지하는 것으로 보고되었다 (Curry CL et al., Oncogene 24:6333-44(2005). 디펩티드 감마-세크레타제 억제제 N-[N-(3,5-디플루오로페나세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르 (DAPT)를 사용한 치료는 또한 수모세포종 성장에서 현저한 감소를 발생시켰고, T-ALL 동물 모델에서 G0-G1 세포 주기 정지 및 아폽토시스를 유도하였다 (O'Neil J. et al., Blood 107:781-5 (2006)). 또 다른 감마-세크레타제 억제제, 디벤즈아제핀은 Apc-/- (min) 마우스의 장 선종에서 상피 세포 증식을 억제하고 배상 세포 분화를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (van Es JH, et al., Nature 435:959-63 (2005)). 보다 최근에, 트리펩티드 감마-세크레타제 억제제 또는 NOTCH3-특이적 소형 간섭 RNA에 의한 NOTCH3의 기능적 불활성화는 NOTCH3을 과다발현하는 종양 세포주에서 세포 증식을 저지하고 아폽토시스를 유도하였으나, 최소량의 NOTCH3 발현을 갖는 것에서는 그렇지 않았다 (Park JT et al., Cancer Res. 66: 6312-8 (2006)). 또한, NOTCH 억제제, MK0752 (머크(Merck)에 의해 개발됨, 뉴저지주 화이트하우스 스테이션)에 대한 I상 임상 시험이 재발된 또는 불응성 T-ALL 환자 및 진행성 유방암에 대해 착수되었다.
4. 치료 방법
상기 기재된 바와 같이, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 종양 세포가 NOTCH3 발현 (예를 들어, NOTCH3 mRNA 발현)의 증가된 수준, 예를 들어 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 중앙 수준 또는 그 초과의 수준, 췌장암의 NOTCH3 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수 또는 그 초과의 수준, 또는 대조 샘플의 NOTCH3 발현 수준 또는 그 초과의 수준을 보유하는 것으로 결정된 환자에서 췌장암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양 세포는 또한 MAML2 발현 (예를 들어, MAML2 mRNA 발현)의 증가된 수준, 예를 들어 췌장암에서 MAML2 발현에 대한 중앙 수준 또는 그 초과의 수준, 또는 대조 샘플의 MAML2 발현 수준 또는 그 초과의 수준을 보유하는 것으로 결정된다. 특정 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 종양 성장을 억제하고/거나, 분화를 유도하고/거나, 종양 부피를 감소시키는데 유용하다. 또한, 본 발명은 치료 유효량의 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 종양 세포가 본원에 기재된 바와 같은 증가된 수준의 NOTCH3을 발현하는 것으로 결정된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에세 췌장 종양의 종양발생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 내 암 줄기 세포의 빈도는 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)의 투여에 의해 감소된다.
한 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 종양 세포가 대조 샘플 또는 세포에서의 NOTCH3 발현 수준 또는 그 초과의 NOTCH3 발현 수준을 갖는 것을 특징으로 하는 췌장암을 치료하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 종양 세포가 췌장암의 NOTCH3 발현의 중앙 수준 또는 그 초과의 NOTCH3 유전자 발현 수준을 갖는 것을 특징으로 하는 췌장암을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료되는 췌장암은 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수 또는 그 초과의 NOTCH3 발현 수준을 갖는 것을 특징으로 하는 종양 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 췌장암의 NOTCH3 발현의 중앙 수준은 췌장 선암종, 전이성 췌장암 또는 간 및/또는 림프절 전이성 췌장암의 NOTCH3 발현의 중앙 수준이다. 특정 실시양태에서, 췌장암에서 NOTCH3 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수는 췌장 선암종, 전이성 췌장암 또는 간 및/또는 림프절 전이성 췌장암에서의 NOTCH3 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수이다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 qRT-PCR을 사용하여 결정된다. 특정 실시양태에서, NOTCH3 발현 수준은 본원에 기재된 프로브를 사용하여, 예를 들어 서열 35-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 결정된다.
한 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 종양 세포의 적어도 일부가 대조 세포에서의 MAML2 발현 수준 또는 그 초과의 MAML2 발현 수준을 나타내는 종양 세포를 포함하는 췌장암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 종양 세포의 적어도 일부가 췌장암의 MAML2 발현의 중앙 수준 또는 그 초과의 MAML2 발현 수준을 나타내는 종양 세포를 포함하는 췌장암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료되는 췌장암은 종양 세포의 적어도 일부가 췌장암에서의 MAML2 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수 또는 그 초과의 MAML2 발현 수준을 나타내는 종양 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 췌장암의 MAML2 발현의 중앙 수준은 췌장 선암종, 전이성 췌장암 또는 간 및/또는 림프절 전이성 췌장암의 MAML2 발현의 중앙 수준이다. 특정 실시양태에서, 췌장암에서 MAML2 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수는 췌장 선암종, 전이성 췌장암 또는 간 및/또는 림프절 전이성 췌장암에서의 MAML2 발현에 대한 제95, 제90, 제80, 제75, 제70, 제50, 제40, 제30, 제25 또는 제10 백분위수이다. 특정 실시양태에서, MAML2 발현 수준은 qRT-PCR을 사용하여 결정된다.
특정 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 사용하여 치료되는 췌장암은 췌장의 외분비 종양이다. 특정 실시양태에서, 치료되는 췌장암은 선방 세포 암종, 선암종, 선편평상피 암종, 거대 세포 종양, 관내 유두상-점액성 신생물 (IPMN), 점액성 낭선암종, 췌장모세포종, 장액성 낭선암종 또는 고형 및 가성유두상 종양이다. 특정 실시양태에서, 치료되는 췌장암은 선암종이다. 특정 실시양태에서, 치료되는 췌장암은 신경내분비 종양이다. 특정 실시양태에서, 췌장 신경내분비 종양은 가스트린종, 글루카곤종, 인슐린종, 비기능성 도세포 종양, VIP종 또는 소마토스타틴종이다. 특정 실시양태에서, 치료되는 췌장암은 신경내분비 종양이 아니다.
특정 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 사용하여 치료되는 췌장암은 절제가능한 종양, 국부 진행성 암 또는 전이성 췌장암이다. 특정 실시양태에서, 췌장암은 AJCC TNM 시스템에 따라 결정된 바와 같은 등급 1, 2, 3 또는 4 암이다.
한 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 이미 몇몇 형태의 치료를 거친 췌장암 환자를 치료하는데 특히 유용하다. 또 다른 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 기존에 암 요법으로 실패한 췌장암 환자를 치료하는데 사용된다. 실패한 암 요법은 화학요법, 보조 요법, 신보조 요법 및 그의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 화학요법 내성 종양을 치료하는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 화학요법 내성 췌장암을 치료하는데 사용된다.
한 실시양태에서, 치료 방법은 환자로부터의 췌장암 세포가 NOTCH3 유전자를 미리 결정된 표준 또는 그 초과, 예를 들어 췌장암에서의 NOTCH3 발현에 대한 중앙 수준 또는 그 초과로 발현하는지 여부를 결정하기 위해, 상기 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 먼저 시험하는 것을 수반한다. 샘플이 상승된 수준의 NOTCH3 발현을 나타내는 환자는 이어서 NOTCH 수용체 활성을 방해하는 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 사용하여 치료될 것이다. 투여되는 투여량은 치료될 특정한 상태, 투여 경로 및 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 임상적 고려사항에 의존할 것이다. 투여량은 유익한 효과, 예를 들어 종양 성장의 지연이 검출될 때까지 서서히 증가될 수 있다. 이어서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 단일 또는 다중 투여 요법으로 제공될 수 있고, 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 주어질 수 있다.
증가된 NOTCH3 발현을 갖는 췌장암의 치료는 임의의 투여 경로 및 투여 형태와 상용성이다. 치료될 특정한 상태에 따라, 특정 투여 형태는 다른 것들에 비해 보다 편리하거나 보다 효과적인 경향을 보일 것이다. 예를 들어, NOTCH 억제제는 비경구로, 국소로, 경구로, 경구적으로, 내부로, 비강내로, 직장으로, 질로, 설측으로 및 경피로 투여될 수 있다. 특정 투여 형태는 정제, 환제, 캡슐, 분말, 에어로졸, 좌제, 피부 패치, 현탁액, 용액 및 에멀젼을 비롯한 비경구 및 경구 액체를 포함한다. 지속 방출 투여 형태가 또한 사용될 수 있다. 모든 투여 형태는 관련 기술분야에서 표준인 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Easton, Pa. (1980)] 참조).
특정 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)의 투여는 정맥내 주사에 의해 또는 정맥내로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥내 주입에 의한다. 일부 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)의 투여는 비-정맥내 경로에 의해 이루어질 수 있다.
NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5) 치료제의 적절한 투여량은 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 항체 또는 NOTCH 억제제가 치료 목적 또는 방지 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 등에 의존하며, 이들 모두는 치료 의사의 판단 하에 있다. 항체 또는 다른 NOTCH 억제제는 한번에, 또는 수일 내지 수개월 동안 지속되는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유되거나 질환 상태의 축소 (예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적 투여 스케줄은 환자의 체내 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있고, 개개의 항체 또는 다른 NOTCH 억제제의 상대적 효력에 따라 달라질 것이다. 투여 의사는 최적 투여량, 투여 방법론 및 반복 속도를 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 항-NOTCH 항체 (예를 들어, OMP-59R5)의 투여량은 체중 kg당 0.01 μg 내지 100 mg이고, 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상 주어질 수 있다. 치료 의사는 체액 또는 조직 내에서의 항체 또는 작용제의 측정된 체류 시간 및 농도를 기반으로 하여 투여 반복 속도를 추정할 수 있다.
통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 사용된 용량은 달성하고자 하는 임상적 목표에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체 (예를 들어, OMP-59R5)의 각각의 용량은 약 0.25mg/kg 내지 약 15mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 각각의 용량은 약 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 0.5mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 1mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 2.5mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 5mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 7.5mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 10mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 12.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 15mg/kg이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 일부 경우에 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)의 투여와 연관된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있는 간헐적 투여 요법을 사용하여 환자에게 투여된다. 본원에 사용된 "간헐적 투여"는 주 1회 초과의 투여 간격, 예를 들어 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회 투여 등을 사용하는 투여 요법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인간 환자에서 췌장암을 치료하는 방법은 환자에게 유효 용량의 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 간헐적 투여 요법에 따라 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 환자에서 췌장암을 치료하는 방법은 환자에게 유효 용량의 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 간헐적 투여 요법에 따라 투여하는 것, 및 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)의 치료 지수를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 요법은 초기 용량의 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 환자에게 투여하고, 후속 용량의 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 2주마다 약 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 요법은 초기 용량의 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 환자에게 투여하고, 후속 용량의 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 3주마다 약 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 요법은 초기 용량의 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 환자에게 투여하고, 후속 용량의 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 4주마다 약 1회 투여하는 것을 포함한다.
일부 대안적 실시양태에서, 방법에 사용된 항-NOTCH 항체는 OMP-59R5, 또는 OMP-59R5의 6개의 CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체이고, 항체는 대략 2주 내지 3주마다 약 2.5 mg/kg 내지 약 7.5 mg/kg (예를 들어, 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 또는 약 7.5 mg/kg)의 투여량으로 대상체에게 정맥내로 투여된다.
특정 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 투여하는 것에 더하여, 방법 또는 치료는 적어도 1종의 추가의 치료제 또는 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 치료제 또는 요법은 항-NOTCH 치료제의 투여 전에, 그와 공동으로, 및/또는 그 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 추가의 치료제 또는 요법은 1, 2, 3종, 또는 그 초과의 추가의 치료제 또는 요법을 포함한다.
적어도 2종의 치료제와의 조합 요법은 종종, 필요하지 않더라도, 상이한 작용 메카니즘에 의해 작동하는 작용제를 사용한다. 상이한 작용 메카니즘을 갖는 작용제를 사용하는 조합 요법은 부가적 또는 상승작용적 효과를 생성할 수 있다. 조합 요법은 각각의 작용제를 단독요법에서 사용되는 것보다 더 낮은 용량으로 허용할 수 있으며, 그로 인해 독성 부작용을 감소시킬 수 있다. 조합 요법은 내성 암 세포가 발생할 가능성을 감소시킬 수 있다.
NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5) 및 추가의 치료제 또는 요법의 조합은 임의의 순서로 또는 공동으로 투여될 수 있음이 인식될 것이다. 일부 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 이전에 제2 치료제 또는 요법을 사용한 치료를 거친 환자에게 투여될 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5) 및 제2 치료제 또는 요법은 실질적으로 동시에 또는 공동으로 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체는 제2 치료제 (예를 들어, 화학요법)를 사용한 치료 과정을 거치는 동안 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 제공받을 수 있다. 특정 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 제2 치료제를 사용한 치료 1년 이내에 투여될 것이다. 특정의 대안적 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 제2 치료제를 사용한 임의의 치료의 10, 8, 6, 4, 또는 2개월 내에 투여될 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 제2 치료제를 사용한 임의의 치료의 4, 3, 2, 또는 1주 내에 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 제2 치료제를 사용한 임의의 치료의 5, 4, 3, 2, 또는 1일 내에 투여될 것이다. 또한, 2종 (또는 그 초과)의 작용제 또는 치료는 대상체에게 몇 시간 또는 몇 분 내에 (즉, 실질적으로 동시에) 투여될 수 있음이 인식될 것이다.
통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 사용되는 용량은 달성하고자 하는 임상적 목표에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 항-NOTCH 항체 (예를 들어, OMP-59R5)의 각각의 용량은 약 0.25 mg/kg 내지 약 15 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 각각의 용량은 약 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 0.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 1 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 2.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 7.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 10 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 12.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 15 mg/kg이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 췌장암을 치료하는 방법은 1종 이상의 화학요법제와 조합된 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)의 투여를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법 또는 치료는 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5) 및 화학요법제 또는 여러 다양한 화학요법제의 칵테일의 조합 투여를 수반한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 췌장암 환자에게 치료 유효량의 OMP-59R5 항체를 겜시타빈 및 아브락산™ (단백질 결합 파클리탁셀)과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 사용한 치료는 화학요법의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 그 후에 이루어질 수 있다. 조합 투여는 단일 제약 제제로의 또는 개별 제제를 사용하는 공-투여, 또는 임의의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 진료의가 경험적으로 결정한 바와 같이 사용될 수 있다. 또한, 이러한 화학요법에 대한 제조 및 투여 스케줄은 문헌 [Chemotherapy Service Editor M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다.
본 발명에 유용한 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시토신 아라비노시드, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (Ara-C); 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀; 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드; 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴; 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 화학요법제는 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤(Fareston)); 및 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소 (예를 들어, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드 및 이리노테칸, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물이다. 항대사물은, 정상적인 생화학적 반응에 요구되는 대사물과 유사하지만, 세포의 하나 이상의 정상적인 기능, 예컨대 세포 분열을 방해하기에 충분하게 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항대사물은 겜시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 소듐, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트 및 클라드리빈, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 췌장암 환자에게 항대사물과 조합된 OMP-59R5 항체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항대사물은 뉴클레오시드 유사체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 췌장암 환자에게 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5 항체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 튜불린에 결합하는 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 항유사분열제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 탁산이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체이다. 특정의 대안적 실시양태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 또는 빈데신, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 췌장암 환자에게 항유사분열제와 조합된 OMP-59R5 항체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항대사물은 탁산이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 췌장암 환자에게 아브락산™ (단백질 결합 파클리탁셀)과 조합된 OMP-59R5 항체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 치료는 NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5) 및 방사선 요법의 조합 투여를 수반한다. NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 사용한 치료는 방사선 요법의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 그 후에 이루어질 수 있다. 이러한 방사선 요법에 대한 투여 스케줄은 숙련된 진료의에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 방사선 치료 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)는 방사선 요법과 함께 투여된다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항체를 포함한다. 따라서, 치료는 EGFR, ErbB2, DLL4, 또는 NF-κB에 결합하는 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 추가의 종양-연관 항원에 대한 다른 항체와 함께, 항-NOTCH 항체 (예를 들어, OMP-59R5) 또는 다른 NOTCH 억제제의 조합 투여를 수반할 수 있다. 예시적인 항-DLL4 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,750,124에 기재되어 있다. 추가의 항-DLL4 항체는, 예를 들어 국제 특허 공개 번호 WO 2008/091222 및 WO 2008/0793326, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0014196; 2008/0175847; 2008/0181899; 및 2008/0107648에 기재되어 있다. 조합 투여는 단일 제약 제제로의 또는 개별 제제를 사용하는 공-투여, 또는 임의의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다.
또한, NOTCH 억제제 (예를 들어, OMP-59R5)를 사용한 치료는 1종 이상의 시토카인 (예를 들어, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자, 및/또는 성장 인자)과의 조합 치료를 포함할 수 있거나, 또는 종양, 암 세포의 외과적 제거 또는 치료 의사에 의해 필요한 것으로 여겨지는 임의의 다른 요법을 동반할 수 있다.
5. 항체 및 그의 생산
본 발명의 방법에 유용한 추가의 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 폴리클로날 항체는 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리클로날 항체는 동물 (예를 들어 토끼, 래트, 마우스, 당나귀 등)을, 안정한 에멀젼이 형성되도록 멸균 염수 중에 희석하고 아주반트 (예를 들어 완전 또는 불완전 프로인트 아주반트)와 조합시킨 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민 등에 임의로 접합시킨 관련 항원 (정제된 펩티드 단편, 전장 재조합 단백질, 융합 단백질 등)의 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 면역화하는 것에 의해 생성된다. 이어서 폴리클로날 항체는, 그와 같이 면역화된 동물의 혈액, 복수 등으로부터 회수된다. 수집된 혈액을 응고시키고, 혈청을 경사분리하고, 원심분리에 의해 정화시키고, 항체 역가에 대해 검정한다. 폴리클로날 항체는 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등을 비롯한 관련 기술분야의 표준 방법에 따라 혈청 또는 복수로부터 정제될 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법을 사용하여, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물을 상기 기재된 바와 같이 면역화하여, 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생산을 도출해낸다. 또한 림프구를 시험관내에서 면역화할 수 있다. 면역화 후에, 림프구를 단리하고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성하고, 이어서 이를 비융합 림프구 및 골수종 세포로부터 선택해 낼 수 있다. 이어서, 면역침전, 이뮤노블롯팅에 의해, 또는 시험관내 결합 검정 (예를 들어, 방사성면역검정 (RIA); 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA))에 의해 결정된 바와 같이, 선택된 항원에 대해 특이적으로 지시되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)을 사용한 시험관내 배양으로 또는 동물의 복수 종양으로서 생체내에서 증식시킬 수 있다. 이어서, 상기에 폴리클로날 항체에 대해 기재된 바와 같이 배양 배지 또는 복수액으로부터 모노클로날 항체를 정제할 수 있다.
대안적으로, 미국 특허 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 또한 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 예컨대 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 성숙한 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리하고, 통상의 절차를 사용하여 그의 서열을 결정한다. 이어서, 상기 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 적합한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이를, 다르게는 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시키면, 숙주 세포에 의해 모노클로날 항체가 생성된다. 또한 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597]에 기재된 바와 같이 목적하는 종의 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 목적하는 종의 재조합 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 단리할 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 재조합 DNA 기술을 사용하여 수많은 다양한 방식으로 추가로 변형시켜 대안적 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인으로 1) 예를 들어 인간 항체의 이러한 영역을 대체하여 키메라 항체를 생성하거나 또는 2) 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드를 대체하여 융합 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역을 말단절단 또는 제거하여 모노클로날 항체의 목적하는 항체 단편을 생성한다. 가변 영역의 부위-지정 또는 고밀도 돌연변이유발을 사용하여 모노클로날 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 이러한 항체는, 인간 대상체에게 투여하는 경우에 항원성 및 HAMA (인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시키기 위해 치료적으로 사용된다. 인간화 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 특정의 대안적 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항체는 인간 항체이다.
인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 직접 제조될 수 있다. 시험관내 면역화되거나 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 면역화 개체로부터 단리된 불멸화 인간 B 림프구를 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국 특허 5,750,373 참조). 또한, 인간 항체는 파지 라이브러리가 인간 항체를 발현하는 경우에, 예를 들어 문헌 [Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581]에 기재된 바와 같이 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 기술 및 사용은 또한 미국 특허 번호 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; 및 7,264,963; 및 문헌 [Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018] (이는 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 친화도 성숙 전략 및 쇄 셔플링 전략 (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 고친화도 인간 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
인간화 항체는 또한 면역화 시 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는, 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항체는 인간 NOTCH 수용체를 특이적으로 인식하는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 항체이다. 상이한 에피토프가 동일한 분자 (예를 들어, 동일한 인간 NOTCH 수용체) 내에 또는 상이한 분자 상에 존재할 수 있다. 이중특이적 항체는 무손상 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
대안적으로, 특정의 대안적 실시양태에서, 본 발명에 유용한 항체는 이중특이적 항체가 아니다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 유용한 항체는 단일특이적이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체가 함유하는 1개 이상의 항원-결합 부위 각각은 동일한 인간 NOTCH 수용체에 결합할 수 있다 (또는 결합한다). 특정 실시양태에서, 단일특이적 항체의 항원-결합 부위는 1, 2, 3 또는 4종의 인간 NOTCH 수용체에 결합할 수 있다 (또는 결합한다).
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 전장 항체에 비해 증가된 종양 침투를 디스플레이할 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81]). 특정 실시양태에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산된다. Fab, Fv, 및 scFv 항체 단편은 이.콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 모두 발현되고 이로부터 분비될 수 있어서, 이는 이들 단편의 다량 생산을 가능하게 한다. 이러한 항체 단편을 또한 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 선형 항체일 수 있고, 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 단일-쇄 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,946,778에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 또한, 상기 방법은, NOTCH 수용체에 대해 목적하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 효과적인 확인을 가능하게 하기 위한 Fab 발현 라이브러리의 구축을 위해 최적화될 수 있다 (Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)). (a) 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산되는 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 환원시키는 것에 의해 생성되는 Fab 단편, (c) 파파인 및 환원제에 의한 항체 분자의 처리에 의해 생성되는 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항체 단편이 관련 기술분야의 기술에 의해 생산될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술이 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
특히 항체 단편의 경우에, 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 그를 변형시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어 항체 단편 내 적절한 영역의 돌연변이에 의한 샐비지 수용체 결합 에피토프의 항체 단편 내로의 혼입, 또는 상기 에피토프의 펩티드 태그 내로의 혼입에 이은 말단 또는 중간에서의 항체 단편과의 융합 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의함)에 의해 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 항체는 이종접합체 항체이다. 이종접합체 항체는 2개의 공유적으로 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역 세포를 원치않는 세포에 대해 표적화하기 위해 제안되어 왔다 (미국 특허 번호 4,676,980). 항체는, 가교제를 수반하는 방법을 비롯하여, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
불변 Fc 영역이 몇몇 이펙터 기능을 매개한다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체계를 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민반응에 관여할 수 있다. 추가로, 항체 또는 가용성 수용체는, 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)와 결합하는 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위로, Fc 영역을 통해 세포와 결합할 수 있다. IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 비롯하여, 다양한 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 클리어런스, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해 (항체 의존성 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC로 불림), 염증 매개물의 방출, 태반 전달, 및 이뮤노글로불린 생산의 제어를 비롯한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 NOTCH 길항제 폴리펩티드 (항체 및 가용성 수용체를 포함하는 Fc)는 투여된 폴리펩티드의 생물학적 프로파일에 차례로 영향을 미치는 변경된 이펙터 기능을 제공한다. 예를 들어, (점 돌연변이 또는 다른 방법을 통한) 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜 종양 국재화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시켜 혈청 반감기 및 접합된 세포독소의 비특이적 회합을 감소시킬 수 있다. 증가된 항원 특이성 또는 항체 가요성으로 인한 증진된 국재화를 가능하게 하는 디술피드 연결 또는 올리고사카라이드 모이어티를 제거하기 위해 불변 영역의 또 다른 변형을 사용할 수 있다. 유사하게, 불변 영역에 대한 변형은 통상의 기술자의 범위 내인 널리 공지된 생화학 또는 분자 공학 기술을 사용하여 용이하게 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 Fc 영역 (항체 및 가용성 수용체를 포함하는 Fc)을 포함하는 NOTCH 길항제 폴리펩티드는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 어떠한 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성 및/또는 어떠한 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성도 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항체는 어떠한 이펙터 기능도 갖지 않는다.
본 발명은 또한 세포독성제에 접합된 NOTCH 길항제 폴리펩티드 (예를 들어, 항-NOTCH 항체)를 포함하는 면역접합체의 용도에 관한 것이다. 세포독성제는 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편), 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체) 등을 포함한다. 이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제를 포함한다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종은 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 비롯하여, 방사성접합된 항체의 생산에 이용가능하다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨릴렌 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 사용될 수 있다.
접합체 항체는 2개의 공유 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역 세포를 원치않는 세포에 대해 표적화하기 위해 제안되어 왔다 (미국 특허 번호 4,676,980). 항체는, 가교제를 수반하는 방법을 비롯하여, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
유용한 양이 수득되는 정도에 관계없이, 본 발명의 방법에 유용한 NOTCH 길항제 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 및 가용성 수용체)는 다수의 접합된 형태 (즉 면역접합체) 또는 비접합된 형태 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 비접합되거나 "네이키드" 형태로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 비롯한 대상체의 자연 방어 메카니즘을 동력화하여 악성 세포를 제거하기 위해 비접합된 형태로 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 다수의 널리-공지된 킬레이트화제 중 어느 하나 또는 직접 표지화를 사용하여 방사성동위원소, 예컨대 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re에 접합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물은 약물, 전구약물 또는 생물학적 반응 조절제, 예컨대 메토트렉세이트, 아드리아마이신 및 림포카인, 예컨대 인터페론과 커플링된 NOTCH 길항제 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 실시양태는 특정 생물독소, 예컨대 리신 또는 디프테리아 독소에 접합된 NOTCH 길항제 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 다른 실시양태에서, NOTCH 길항제 폴리펩티드는 다른 면역학적 활성 리간드 (예를 들어 항체 또는 그의 단편)과 복합체화될 수 있고, 생성된 분자는 신생물성 세포 및 이펙터 세포, 예컨대 T 세포 둘 다에 결합한다. 사용을 위한 접합 또는 비접합된 NOTCH 길항제 폴리펩티드의 선택은 신경내분비 종양의 유형 및 병기, 보조 치료 (예를 들어, 화학요법 또는 외부 방사선)의 사용 및 환자 상태에 의존할 것이다. 당업자는 본원의 교시에 비추어 이러한 선택을 용이하게 할 수 있음이 인식될 것이다.
폴리펩티드 및 유사체는 정상적으로는 단백질의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이들 유도체화된 모이어티는 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 또는 흡수를 개선할 수 있다. 모이어티는 또한 단백질의 임의의 바람직하지 않은 부작용 등을 감소 또는 제거할 수 있다. 이들 모이어티에 대한 검토는 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 찾아볼 수 있다.
유도체화에 가장 적합한 화학적 모이어티는 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체는 그것이 부착되는 단백질이 수성 환경, 예컨대 생리학적 환경에서 침전하지 않기 때문에 바람직하다. 일부 실시양태에서, 중합체는 치료 생성물 또는 조성물의 제조에 제약상 허용될 것이다. 통상의 기술자는 중합체/단백질 접합체가 치료적으로 사용될 것인지 여부, 그렇다면 목적하는 투여량, 순환 시간, 단백질분해에 대한 내성 및 기타 고려사항과 같은 고려사항에 기초하여 목적 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 유도체화의 유효성은 유도체를 목적하는 형태로 (즉, 삼투 펌프에 의해, 또는 주사 또는 주입에 의해, 또는 경구, 폐 또는 다른 전달 경로를 위해 추가로 제제화되어) 투여하고, 그의 유효성을 결정함으로써 확인될 수 있다. 적합한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (또한 단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조에서 이점을 가질 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 단리된 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 및 가용성 수용체)는 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법의 범위는 직접 단백질 합성 방법에서부터, 단리된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고 이들 서열을 적합한 형질전환된 숙주에서 발현시키는 방법에 이른다. 일부 실시양태에서, 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리 또는 합성함으로써 재조합 기술을 사용하여 DNA 서열을 구축한다. 임의로, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 서열을 돌연변이유발시켜, 그의 기능적 유사체를 제공할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984)] 및 미국 특허 번호 4,588,585를 참조한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용한 화학적 합성에 의해 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 구축할 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는, 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로 하고 관심 재조합 폴리펩티드를 생산할 숙주 세포에서 선호되는 코돈을 선택하여 설계할 수 있다. 단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해 표준 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구축할 수 있다. 또한, 특정한 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음, 라이게이션할 수 있다. 개개의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 어셈블리를 위한 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
일단 (합성, 부위 지정 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의해) 어셈블리되면, 특정한 단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 삽입되고, 목적하는 숙주에서의 단백질의 발현에 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 적절한 어셈블리는 뉴클레오티드 서열분석, 제한 맵핑, 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자를 높은 발현 수준으로 수득하기 위해서는, 유전자를 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결시켜야 한다.
특정 실시양태에서, NOTCH 길항제 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)를 증폭 및 발현시키기 위해 재조합 발현 벡터가 사용된다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구축물이다. 전사 유닛은 일반적으로 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전자 요소 또는 요소들, 예를 들어 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 하기 상세하게 기재되는 바와 같은 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함한다. 이러한 조절 요소는 전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로 복제 기점에 의해 부여되는 숙주에서의 복제 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 혼입될 수 있다. DNA 영역은 이들이 서로에 대해 기능적으로 관련되는 경우에 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 신호 펩티드 (분비 리더)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터는 코딩 서열의 전사를 제어하는 경우에 상기 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역이 허용되도록 위치된 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 효모 발현 시스템에서 사용이 의도되는 구조 요소는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열없이 발현되는 경우에, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 임의로는 후속적으로, 발현된 재조합 단백질로부터 절단되어 최종 생성물을 제공할 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 의존할 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합물이 사용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는, 예를 들어 SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 pCR 1, pBR322, pMB9 및 그의 유도체를 비롯한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 플라스미드, 보다 넓은 숙주 범위 플라스미드, 예컨대 M13 및 필라멘트형 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
NOTCH 길항제 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하의 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실루스(bacilli)를 포함한다. 고등 진핵 세포는 하기 기재된 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 무세포 번역 시스템이 또한 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌 [Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)]에 기재되어 있고, 그의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 항체 생산을 비롯한 단백질 생산 방법에 관한 추가의 정보는, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2008/0187954, 미국 특허 번호 6,413,746 및 6,660,501, 및 국제 특허 공개 번호 WO 04009823에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또한 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 단백질의 발현에 유리하게 사용된다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현은 이러한 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고, 적절하게 변형되고, 완전히 관능화되기 때문에 수행될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 문헌 [Gluzman (Cell 23:175, 1981)]에 기재된 COS-7 계통의 원숭이 신장 세포, 및 예를 들어 L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 비롯한 적절한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 발현시킬 유전자에 연결된 비전사 요소, 예컨대 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 기타 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 문헌 [Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)]에서 검토된다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 단백질을 임의의 적합한 방법에 따라 정제할 수 있다. 이러한 표준 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한다. 친화성 태그, 예컨대 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 단백질에 부착하여, 적절한 친화도 칼럼을 통과시킴으로써 정제를 용이하게 할 수 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 핵 자기 공명 및 X선 결정학과 같은 기술을 사용하여 물리적으로 특성화될 수 있다.
예를 들어, 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여, 배양 배지로 재조합 단백질을 분비하는 시스템으로부터의 상청액을 먼저 농축시킬 수 있다. 농축 단계 후에, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기질을 사용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계를 사용할 수 있다. 적합한 양이온 교환기는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 마지막으로, 소수성 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 매질, 예를 들어 펜던트 메틸 또는 다른 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 사용하는 하나 이상의 RP-HPLC 단계를 사용하여 NOTCH 길항제 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)를 추가로 정제할 수 있다. 또한, 균질한 재조합 단백질을 제공하기 위해 상기 정제 단계의 일부 또는 전부를 다양한 조합으로 사용할 수 있다.
박테리아 배양에서 생산된 재조합 단백질은, 예를 들어 세포 펠릿으로부터의 최초 추출에 이어서 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 최종 정제 단계에 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는, 동결-해동 순환, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
NOTCH 길항제 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)를 정제하기 위한 관련 기술분야에 공지된 방법은 또한, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2008/0312425, 2008/0177048, 및 2009/0187005에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
6. 제약 조성물
NOTCH 길항제 폴리펩티드 (예를 들어, 항-NOTCH 항체)는 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 비히클을 포함한다. 제약 조성물은 인간 환자에서 신경내분비 종양 성장을 억제하고 신경내분비 종양을 치료하는데 그 용도가 발견된다.
특정 실시양태에서, 제제는 저장 및 사용을 위해 정제된 NOTCH 길항제 (예를 들어, 항-NOTCH 항체)를 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어 담체, 부형제)과 조합함으로써 제조된다 (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). 적합한 제약상 허용되는 비히클은 비독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어 약 10개 아미노산 잔기 미만); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 동결된다. 특정의 대안적 실시양태에서, 제약 조성물은 동결건조된다.
본 발명의 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료를 위해 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는, 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말과 같은 (예컨대, 질 및 직장 전달을 포함한 점막으로의) 국소 투여; 폐 투여 (예를 들어, 네뷸라이저에 의한 것을 포함한, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의해; 기관내, 비강내, 표피 및 경피); 경구 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 주사 또는 주입을 비롯한 비경구 투여; 또는 두개내 (예를 들어, 척수강내 또는 뇌실내) 투여일 수 있다.
치료 제제는 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제제는 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입에 의한 투여를 위한 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 물 또는 비수성 매질 내 용액 또는 현탁액, 또는 좌제를 포함한다. 고체 조성물, 예컨대 정제에서, 주요 활성 성분은 제약 담체와 혼합된다. 본 발명의 화합물 또는 그의 비독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성하기 위한 통상의 정제화 성분은 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 기타 희석제 (예를 들어 물)를 포함한다. 이어서, 고체 예비제제 조성물을 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 분할한다. 신규 조성물의 정제, 환제 등을 코팅하거나 다르게는 배합하여 지속 작용의 이점을 부여하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분으로 덮힌 내부 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 2종의 성분은, 붕해에 내성을 제공하고 내부 성분이 무손상 상태로 위를 통과하게 하거나 또는 방출을 지연시키는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 이러한 물질은 다수의 중합체성 산, 및 중합체성 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
NOTCH 길항제 (예를 들어, 항-NOTCH 항체)는 또한 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐은 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 기재된 바와 같은 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된다.
특정 실시양태에서, 제약 제제는 리포솜과 복합체화된 NOTCH 길항제 (예를 들어, 항-NOTCH 항체)를 포함한다 (Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; 및 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545). 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다. 일부 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물과의 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 규정된 기공 크기의 필터를 통해 리포솜을 압출하여 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.
또한 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서 매트릭스는 성형품의 형태 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
7. 키트
본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트가 추가로 제공된다. "키트"는 샘플, 예를 들어 세포, 세포주, 종양 또는 조직에서 NOTCH3 유전자 발현의 수준을 특이적으로 검출하기 위한 적어도 하나의 시약, 예를 들어 핵산 프로브 등을 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 패키지 또는 용기)으로 의도된다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 판촉, 배부 또는 판매될 수 있다. 추가로, 키트는 키트를 설명하고 그의 사용에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트가 제공된다. 이러한 키트는 수동 및 자동화된 스크리닝 둘 다와 상용성이다. qRT-PCR 검정을 위해, 키트는 NOTCH3 유전자 발현의 검출을 위한 본원에 개시된 프로브를 적어도 포함한다. 키트는 RNA 추출, 역전사, 및/또는 PCR 증폭을 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 키트는 서열 35-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에 따라 사용된 시약의 활성 및 정확한 용법을 확인하기 위해 양성 및/또는 음성 대조군이 키트에 포함될 수 있다. 대조군은 NOTCH3 mRNA의 존재에 대해 양성 또는 음성인 것으로 공지되어 있는 샘플, 예컨대 RNA 제제, 포르말린 고정 조직 등을 포함할 수 있다. 대조군의 설계 및 사용은 통상의 기술자의 상용 능력 내에서 표준이고 충분하다.
본 발명의 방법의 임의의 또는 모든 단계가 수동으로 구현될 수 있거나, 또는 대안적으로 자동화된 방식으로 수행될 수 있다는 것이 추가로 인식될 것이다. 따라서, 신체 샘플 제조, 샘플 동결 또는 고정, RNA 추출 및/또는 NOTCH3 전사체 수준의 검출 단계는 자동화될 수 있다.
실시예
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 이러한 관점에서 다양한 변형 또는 변화가 통상의 기술자에게 제안될 것이고, 이는 본원의 취지 및 범위 내에 포함됨을 이해한다.
실시예 1
OMP-59R5 항-NOTCH2/3 수용체 항체를 단일 작용제로서 및 화학요법제와 조합물로 사용한 종양 성장의 생체내 방지
20,000개의 OMP-PN8 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 종양이 평균 부피 125 mm3에 달할 때까지 22일 동안 성장되게 하였다. 종양 보유 마우스를 4개의 군으로 무작위화하고, 대조 항체, OMP-59R5 (항-NOTCH2/3), 겜시타빈, 또는 OMP-59R5 및 겜시타빈 조합물로 처리하였다. 항체는 격주로 40 mg/kg으로 투여하였다. 겜시타빈은 매주 20 mg/kg으로 투여하였다. 종양 부피를 처리 후 표시된 날에 측정하였다. OMP-59R5는 단일 작용제로서 또는 겜시타빈과 조합되어 OMP-PN8 종양 성장을 강력하게 억제하였다 (도 1a).
항-NOTCH2/3 OMP-59R5 항체가 OMP-PN17 췌장 종양의 생체내 성장을 억제하는 능력은 실질적으로 동일한 방법을 사용하여 결정하였다. 도 1b에 제시된 바와 같이, OMP-59R5는 단일 작용제로서 또는 겜시타빈과 조합되어 OMP-PN17 종양 성장을 강력하게 억제하였다.
50,000개의 OMP-PN11 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 종양이 평균 부피 120 mm3에 달할 때까지 21일 동안 성장되게 하였다. 종양 보유 마우스를 4개의 군으로 무작위화하고, 대조 항체, OMP-59R5 (항-NOTCH2/3), 겜시타빈, 또는 OMP-59R5 및 겜시타빈 조합물로 처리하였다. 항체는 격주로 40 mg/kg으로 투여하였다. 겜시타빈은 매주 20 mg/kg으로 투여하였다. 종양 부피를 처리 후 표시된 날에 측정하였다. 도 1c에 제시된 바와 같이, OMP-59R5는 단일 작용제로서 또는 겜시타빈과 조합되어 OMP-PN11 종양 성장에 대해 어떠한 영향도 미치지 않았다.
20,000개의 UM-PE13 유방 (NOTCH3 높은 발현) 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 종양이 평균 부피 140 mm3에 달할 때까지 37일 동안 성장되게 하였다. 종양 보유 마우스를 4개의 군으로 무작위화하고, 대조 항체, OMP-59R5, 탁솔, 또는 OMP-59R5 및 탁솔 조합물로 처리하였다. 항체는 매주 20 mg/kg으로 투여하였다. 탁솔은 매주 10 mg/kg으로 투여하였다. 종양 부피를 처리 후 표시된 날에 측정하였다. 도 1d에 제시된 바와 같이, OMP-59R5는 단일 작용제로서 또는 탁솔과 조합되어 UM-PE13 종양 성장을 강력하게 억제하였다.
20,000개의 UM-T1 유방 (NOTCH3 높은 발현) 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 종양이 평균 부피 120 mm3에 달할 때까지 28일 동안 성장되게 하였다. 종양 보유 마우스를 4개의 군으로 무작위화하고, 대조 항체, OMP-59R5 항-NOTCH2/3 항체, 탁솔, 또는 OMP-59R5 및 탁솔 조합물로 처리하였다. 항체는 매주 20 mg/kg으로 투여하였다. 탁솔은 매주 10 mg/kg으로 투여하였다. 종양 부피를 처리 후 표시된 날에 측정하였다. 도 1e에 제시된 바와 같이, OMP-59R5는 단일 작용제로서 또는 탁솔과 조합되어 UM-T1 종양 성장에 대해 어떠한 영향도 미치지 않았다.
50,000개의 OMP-Lu40 폐 (NOTCH3 높은 발현) 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 종양이 평균 부피 140 mm3에 달할 때까지 33일 동안 성장되게 하였다. 종양 보유 마우스를 4개의 군으로 무작위화하고, 대조 항체, OMP-59R5 항-NOTCH2/3 항체, 탁솔, 또는 OMP-59R5 및 탁솔 조합물로 처리하였다. 항체는 매주 20 mg/kg으로 투여하였다. 탁솔은 매주 10 mg/kg으로 투여하였다. 종양 부피를 처리 후 표시된 날에 측정하였다. 도 1f에 제시된 바와 같이, OMP-59R5는 탁솔과 조합되어 OMP-Lu40 종양 성장을 강력하게 억제하였다.
50,000개의 OMP-Lu53 폐 (NOTCH3 높은 발현) 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 종양이 평균 부피 120 mm3에 달할 때까지 33일 동안 성장되게 하였다. 종양 보유 마우스를 4개의 군으로 무작위화하고, 대조 항체, OMP-59R5 항-NOTCH2/3 항체, 탁솔, 또는 OMP-59R5 및 탁솔 조합물로 처리하였다. 항체는 격주로 40 mg/kg으로 투여하였다. 탁솔은 매주 10 mg/kg으로 투여하였다. 종양 부피를 처리 후 표시된 날에 측정하였다. 도 1g에 제시된 바와 같이, OMP-59R5는 탁솔과 조합되어 OMP-Lu53 종양 성장에 대해 어떠한 영향도 미치지 않았다.
실시예 2
겜시타빈과 조합된 OMP-59R5에 의한 종양 성장 억제는 췌장 종양에서의 NOTCH3 유전자 발현 수준과 유의하게 상호관련되지만, 유방 또는 폐 종양에서는 그렇지 않다
표준 마이크로어레이 기술을 사용하여 실시예 1에 기재된 생체내 이종이식편 검정에서 검정된 췌장, 유방 및 폐 종양에서 NOTCH2 및 NOTCH3 유전자 발현 수준을 결정하였다. 발현 데이터는 아피메트릭스(Affymetrix)® U133 플러스 2 어레이를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수득하였다. 결과를 하기 표 1-3에 제시한다. 표는 또한, 실시예 1에 기재된 생체내 이종이식편 검정에서 화학요법제와 조합된 OMP-59R5 항-NOTCH2/3 항체를 사용한 처리에 대한 특정한 종양의 반응성 데이터를 포함한다. 표에 제시된 NOTCH2 및 3 유전자 발현 수준의 분석은 컷-오프 값 500을 기초로 하였다. 그러나, 분석으로부터의 전체적인 결론은 컷-오프 값을 300과 1000 사이로 다르게 한 경우에 동일하게 유지되었다. 유방 종양 및 폐 종양 샘플에서는 NOTCH3 발현과 생체내 처리 효능 사이에 어떠한 상관관계도 관찰되지 않았고: 높은 NOTCH3 유전자 발현을 갖는 14개의 유방 또는 폐 종양 중 오직 5개만이 반응성이었다. 추가로, 유방, 폐 또는 췌장 종양 샘플에서 NOTCH2 발현과 생체내 효능 사이에 어떠한 상관관계도 관찰되지 않았다. 놀랍게도, 췌장 종양에서, 높은 수준의 NOTCH3 유전자 발현과 OMP-59R5/겜시타빈 처리의 생체내 효능 사이에 매우 강한 상관관계가 존재하였고: 높은 NOTCH3 유전자 발현을 갖는 10개의 췌장 종양 중 9개가 OMP-59R5 및 겜시타빈을 사용한 처리에 대해 생체내 반응성이었다.
<표 1> 췌장 종양에서 NOTCH2 및 NOTCH3 유전자 발현 수준.
Figure pct00001
<표 2> 유방 종양에서 NOTCH2 및 NOTCH3 유전자 발현 수준.
Figure pct00002
<표 3> 폐 종양에서 NOTCH2 및 NOTCH3 유전자 발현 수준. NSCLC - 비소세포 폐암; SCLC - 소세포 폐암.
Figure pct00003
췌장 종양에서 높은 수준의 NOTCH3 유전자 발현과 OMP-59R5/겜시타빈 조합물 처리의 생체내 효능 사이의 놀라운 상관관계를 추가로 분석하였다. NOTCH3 유전자 발현 수준을 표준 멀티플렉스 전사체 서열분석 (예를 들어, RNASeq)을 사용하여 PN11, PN13, PN23, PN04, PN08, PN16, PN17, PN21, 및 PN25 췌장 종양 세포에서 결정하였다. 일루미나(Illumina)® HiSeq™ 2000 서열분석 시스템을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 RNASeq를 수행하였다. 도 2a는 인간 췌장 이종이식편 모델에서 증가된 NOTCH3 유전자 발현이 OMP-59R5/겜시타빈 조합물 처리에 의한 생체내 종양 억제와 유의하게 상호관련됨 (0.823; p<0.021)을 제시한다. 도 3은 반응성 췌장 종양에서 검출된 NOTCH3 유전자 발현이 비반응성 췌장 종양에서 검출된 발현 수준보다 유의하게 더 높음을 추가로 제시한다.
도 2b는 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5 항-NOTCH2/3 항체를 사용한 처리에 반응성 (R=반응자: pval <0.05 겜시타빈 처리 단독과 비교됨)인 인간 췌장 종양에서의, 및 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5 항-NOTCH2/3 항체를 사용한 처리에 비반응성 (NR=비반응자: pval >0.05 겜시타빈 처리 단독과 비교됨)인 것으로 발견된 이종이식편에 대해 검출된 NOTCH3 유전자 발현의 분포를 제시한다. 비반응성 췌장 종양에서 NOTCH3 유전자 발현 수준의 분포는 반응성 췌장 종양에서의 NOTCH3 유전자 발현 수준의 분포와 분명히 분리되는 것으로 나타났다.
로지스틱 회귀, 표준 통계 모델을 사용하여, RNASeq에 의해 췌장암에서 검출된 NOTCH3 유전자 발현 수준을 기반으로 하여, 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5를 사용한 처리에 대한 특정한 췌장암의 생체내 반응성을 예측하였다. 문헌 [Alan Agresti: An Introduction to Categorical Data Analysis, John Wiley and Sons, Inc. (1996)]. 분석 결과를 도 4에 제시한다. NOTCH3 유전자 발현 데이터 세트의 양성 예측 값 (PPV), 음성 예측 값 (NPV), 감수성 (SENS) 및 특이성 (SPEC)은 각각 83%, 75%, 83%, 및 75%였다.
겜시타빈과 조합된 OMP-59R5를 사용한 처리에 대한 췌장암의 생체내 반응성 예측의 정확성은, 췌장암으로부터의 통계적 분석 MAML2 유전자 발현 데이터에 포함시킴으로써 추가로 개선하였다. NOTCH3 및 MAML2 유전자 발현 데이터 세트에 로지스틱 회귀를 적용하여 수득한 결과를 도 5에 제시한다. NOTCH3 및 MAML2 유전자 발현 데이터 세트의 양성 예측 값 (PPV), 음성 예측 값 (NPV), 감수성 (SENS) 및 특이성 (SPEC)은 100%였다. 실험을 표준 RNASeq 방법에 의해 수득된 유전자 발현 데이터를 사용하여 교차-검증하였다.
실시예 3
췌장 종양 샘플에서의 NOTCH3 단백질 발현
NOTCH3 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 인간 췌장 종양에서 NOTCH3 단백질의 발현을 결정하였다 (도 6a). 본 분석에서 사용된 항-NOTCH3 항체 (셀 시그널링(Cell signaling) #5276)는 전장 NOTCH3 (FL: ~250kDa), 및 NOTCH3의 막횡단 및 세포내 영역 (TM=~98kDa)을 둘 다 검출하였다.
도 6b는 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5를 사용한 처리에 반응성 (R=반응자: pval <0.05 겜시타빈 처리 단독과 비교됨)인 인간 췌장 종양에서의, 및 실시예 1에 기재된 이종이식편 검정에서 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5를 사용한 처리에 비반응성 (NR=비반응자: pval >0.05 겜시타빈 처리 단독과 비교됨)인 것으로 발견된 이종이식편에 대한 NOTCH3 단백질 발현의 분포를 제시한다. 반응자 및 비반응자 사이에 NOTCH3 단백질 발현의 분포에서의 분리는 NOTCH3 유전자 발현의 분포에서의 분리보다 덜 현저하였다. 로지스틱 회귀를 췌장암에서의 NOTCH3 단백질 발현 데이터에 적용하여 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5를 사용한 처리에 대한 특정한 췌장암의 감수성을 예측하였다. NOTCH3 단백질 발현 데이터는 OMP-59R5 플러스 겜시타빈 처리에 대한 반응성의 예측에서, 상기 논의된 NOTCH3 유전자 발현 데이터의 성능과 유사한 성능을 생성하였다.
실시예 4
qRT-PCR에 의해 측정된 전이성 췌장 종양 샘플에서의 NOTCH3 유전자 발현
NOTCH3 유전자 발현을 전이성 췌장 종양 샘플에서 표준 정량적 qRT-PCR을 사용하여 결정하였다. 검정 프로브는 NOTCH3 RefSeq mRNA 서열 NM_000435.2를 사용하여 설계하였다. NOTCH3_A7은 2개의 잠재적인 전사체 중 하나를 검출하는 반면에, NOTCH3_A1은 Ensembl 데이터베이스에 의해 예측되는 전사체를 둘 다 검출한다. 프로브 및 qRT-PCR 검정은 인간 신선 동결 (FF) 및 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 인간 조직 샘플을 사용하여 검증하였다.
<표 3> NOTCH3 qRT-PCR 검정에 사용된 프로브의 뉴클레오티드 서열.
Figure pct00004
1차 췌장암 환자로부터의 대략 100개의 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 전이성 종양 조직을 이러한 코호트에서의 NOTCH3 발현 수준 및 분포를 결정하기 위해 공급하였다 (도 7). NOTCH3 유전자 발현은 NOTCH3_A7 프라이머/프로브 세트로 표준 정량적 RT-PCR 프로토콜을 사용하여 결정하였다. NOTCH3 수준이 샘플 연령, 성별, 환자 연령 등을 비롯한 인자와 상호관련되는지 결정하기 위해 ANOVA 통계적 분석을 수행하였다. NOTCH3 수준은, 유의성 및 보다 넓은 NOTCH3 유전자 발현 분포를 나타내는 간 전이 부위의 경우를 제외하고, 임의의 이들 인자와 상호관련되는 것으로 발견되지 않았다. 도 7은 검사된 모든 전이성 종양 샘플에 걸친 NOTCH3 유전자 발현에 대한 제10, 제25, 제50, 제75, 및 제90 백분위수를 디스플레이한다.
이종이식편 검정에 사용된 공급된 인간 간 및 림프절 전이성 췌장암 조직 및 원발성 인간 췌장 종양으로부터의 NOTCH3 유전자 발현 수준을 데이터 비교를 위해 정규화하였다. 데이터의 평균을 차감하고, 각각의 데이터 세트에서의 표준 편차로 나누었다. 회색 (연함) 점은 실시예 1에 기재된 이종이식편 검정에서 겜시타빈과 조합된 OMP-59R5를 사용한 처리에 비반응성인 인간 췌장 종양을 나타내고, 흑색 (짙음) 점은 이종이식편 검정에서 반응성인 인간 췌장 종양을 나타낸다 (도 8). 반응성 종양은 비반응성 종양보다 더 높은 수준의 NOTCH3 유전자 발현을 나타내었고, 이는 NOTCH3 유전자 발현이, 예를 들어 화학요법제와 조합된 OMP-59R5를 사용한 처리에 대한 췌장 종양의 생체내 반응성을 예측하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 도 8은 또한 검사된 인간 간 및 림프절 전이성 췌장암 조직에서의 NOTCH3 유전자 발현에 대한 제10, 제25, 제50, 제75, 및 제90 백분위수를 디스플레이한다.
실시예 6
겜시타빈 및 아브락산™과 조합된 OMP-59R5 항-NOTCH2/3 항체는 췌장 종양의 시험관내 성장을 억제한다
20,000개의 OMP-PN8 (NOTCH3 높은 발현) 종양 세포를 NOD-SCID 마우스에 주사하였다. 종양이 평균 부피 110 mm3에 달할 때까지 26일 동안 성장되게 하였다. 종양 보유 마우스를 3개의 군으로 무작위화하고 (군당 n = 9마리 마우스), 대조 항체, 겜시타빈 플러스 아브락산™ (알부민 결합 파클리탁셀), 또는 OMP-59R5 항-NOTCH2/3 항체 및 겜시타빈 플러스 아브락산™의 조합물로 처리하였다. OMP-59R5는 격주로 40 mg/kg으로 투여하였다. 겜시타빈은 매주 10 mg/kg으로, 아브락산™은 매주 30 mg/kg으로 투여하였다. 종양 부피를 처리 후 표시된 날에 측정하였다. OMP-59R5는 겜시타빈 플러스 아브락산™과 조합되어 OMP-PN8 종양 성장을 강력하게 억제하였고, 겜시타빈 플러스 아브락산™ 단독보다 더 활성이었다 (도 9). 상단 및 하단 그래프는 동일한 실험으로부터의 상이한 규모에 대해 수득된 데이터를 제시한다. 하단 그래프는 활성 처리 군에서만 수득된 데이터를 제시하였고, 대조 처리된 동물로부터 수득된 데이터는 제시하지 않았다. 결과는 NOTCH3 발현 수준이, 다양한 화학요법제와 조합된 OMP-59R5 항체를 사용한 처리에 대한 췌장 종양의 생체내 반응성을 예측하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
본원에 언급된 모든 공개물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 및 수탁 번호/데이터베이스 서열 (폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 둘 다 포함)은 각각의 개별 공개물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 또는 수탁 번호/데이터베이스 서열이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 같이 모든 목적상 그 전문은 동일한 범위로 본원에 참조로 포함된다.
<서열>
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
ATCC PTA-10170 20090706 ATCC PTA-9547 20081015 ATCC PTA-9548 20081015 ATCC PTA-9549 20081015
SEQUENCE LISTING <110> OncoMed Pharmaceuticals, Inc. KAPOUN, Ann M. 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signal sequence <400> 28 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Arg Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Ser Asn Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg <210> 29 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 59R1 Light chain VL of 59R1 IgG antibody <400> 29 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Phe Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 30 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 59R5 Heavy chain <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ile Phe Tyr Thr Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 260 265 270 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 305 310 315 320 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 325 330 335 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 340 345 350 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 370 375 380 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 405 410 415 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 31 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Predicted protein sequence of anti-NOTCH2/3 59R1 IgG2 heavy chain, plus signal sequence <400> 31 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Ser Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Phe Phe Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 32 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Predicted protein sequence of the heavy chain of anti-NOTCH2/3 59RGV (germlined variant of 59R1), plus signal sequence <400> 32 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Ser Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Phe Phe Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 33 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Predicted protein sequence of anti-NOTCH2/3 59R1 light chain, plus signal sequence <400> 33 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Arg Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Ser Asn Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 34 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Predicted protein sequence of the light chain of anti-NOTCH2/3 59RGV antibody (germlined variant of 59R1), plus signal sequence <400> 34 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Ser Val Arg Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 50 55 60 Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile 65 70 75 80 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Ser Asn Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 35 aggcagagtg gcgacctc 18 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 36 cgtccacgtt cacttcacaa ttc 23 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 37 aacccaggaa gacaggcaca gtcgt 25 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 38 ctgggtttga gggtcagaat 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 39 gggcactggc agttataggt 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 40 tgacgccatc cacgcatgtc 20 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 41 tgcaggatag caaggaggag ac 22 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 42 gcagcttggc agcctcatag 20 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 43 ctcgcgggcg gccaggaata ggg 23

Claims (31)

  1. (a) 췌장암 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하는 것인 단계, 및
    (b) 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준에 기초하여 환자를 선택하는 단계
    를 포함하는, NOTCH 억제제를 사용한 치료를 위한 췌장암 환자를 선택하는 방법.
  2. 췌장암으로 진단된 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하고, 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준은 상기 환자가 요법에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 것인, 췌장암으로 진단된 환자가 NOTCH 억제제-기반 요법에 반응할 가능성이 있는지 또는 NOTCH 억제제를 사용한 치료를 계속해야 하는지 여부를 결정하는 방법.
  3. (a) 환자로부터의 종양 세포에서 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 결정하며, 여기서 1종 이상의 바이오마커는 NOTCH3을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 상기 환자에게 치료 유효량의 NOTCH 억제제를 투여하는 단계
    를 포함하는, 환자에서 췌장암을 치료하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 바이오마커가 바이오마커에 대한 참조 수준을 초과한 수준에서 발현된 것으로 결정되는 것인 방법 .
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준이 바이오마커 mRNA 또는 바이오마커 단백질의 수준을 결정함으로써 결정되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 바이오마커 mRNA 수준이 정량적 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 또는 어레이 혼성화에 의해 결정되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 바이오마커가 NOTCH3이고, mRNA 수준이
    (a) 서열 35, 서열 38, 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 프라이머;
    (b) 서열 36, 서열 39, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 프라이머; 및/또는
    (c) 서열 37, 서열 40, 및 서열 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브
    를 사용하여 결정되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, NOTCH3 mRNA 수준이
    (a) 서열 35의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 36의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 37의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브;
    (b) 서열 38의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 39의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 40의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브; 또는
    (c) 서열 41의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 42의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 43의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브
    를 사용하여 결정되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 바이오마커가 MAML2를 추가로 포함하고, MAML2 발현 수준이 MAML2 발현에 대한 참조 수준을 초과한 것으로 결정되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커의 참조 수준이 미리 결정된 값이거나, 또는 대조 샘플에서의 그 바이오마커의 발현 수준인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, NOTCH3 발현에 대한 참조 수준이 췌장암 또는 췌장암 하위세트에서의 NOTCH3 발현에 대한 제25 백분위수, 제30 백분위수, 제40 백분위수, 제50 백분위수, 제60 백분위수, 제70 백분위수, 제75 백분위수 또는 제80 백분위수인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 환자로부터 샘플을 수득하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 샘플이 전혈, 혈장, 혈청 또는 조직인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 샘플이 췌장 종양 샘플인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직인 방법.
  16. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 NOTCH 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, NOTCH 억제제가 감마-세크레타제 억제제 또는 항-NOTCH 항체인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 항-NOTCH 항체가 인간 NOTCH2 및/또는 인간 NOTCH3에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 항-NOTCH 항체가 ATCC에 PTA-9547로 기탁된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 항-NOTCH 항체가 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체가
    (a) SSSGMS (서열 3)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIFYTT (서열 9) 또는 GIFFAI (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및 RASQSVRSNYLA (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
    (b) 서열 17, 서열 18 또는 서열 26에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 29 또는 서열 27에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 항-NOTCH 항체가
    (a) 서열 17 또는 서열 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
    (b) SSSGMS (서열 3)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 4)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIFYTT (서열 9)를 포함하는 중쇄 CDR3, 및 RASQSVRSNYLA (서열 6)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 7)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체; 및
    (c) ATCC에 PTA-9547로 기탁된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 항체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 인간 NOTCH2 및/또는 NOTCH3에 대한 특이적 결합에 대해 경쟁하는 것인 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NOTCH 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 항체 단편인 방법.
  23. 제3항 및 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하며; 임의로 여기서 제2 치료제가 화학요법제, 뉴클레오시드 유사체 또는 유사분열 억제제인 방법.
  24. 서열 35-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진단 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    (a) 서열 35의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 36의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 37의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열 38의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 39의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 40의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (c) 서열 41의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 42의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 43의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 진단 조성물.
  26. 샘플을 서열 35-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 NOTCH3 mRNA를 검출하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 샘플을
    (a) 서열 35의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 36의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 37의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브;
    (b) 서열 38의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 39의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 40의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브; 또는
    (c) 서열 41의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 서열 42의 서열을 갖는 역방향 프라이머, 및 서열 43의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브
    와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  28. 서열 35-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 샘플에서 NOTCH3 mRNA를 검출하기 위한 키트.
  29. 제28항에 있어서,
    (a) 서열 35의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 36의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 37의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열 38의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 39의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 40의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (c) 서열 41의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 서열 42의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 43의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 키트.
  30. 서열 35, 서열 36, 서열 38, 서열 39, 서열 41, 및 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 프라이머.
  31. 서열 37, 서열 40, 및 서열 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브.
KR1020157028505A 2013-03-15 2014-03-13 췌장암을 치료하는 방법 Withdrawn KR20150130466A (ko)

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