KR20170026284A

KR20170026284A - 신규한 인슐린 아날로그 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170026284A
Application number: KR1020160110301A
Authority: KR
Inventors: 김진영; 오의림; 이종수; 임형규; 최인영; 권세창
Original assignee: 한미약품 주식회사
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2016-08-29
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2036-08-29
Also published as: JP2018526001A; TW201710288A; EP3341404A1; US10647753B2; TWI781083B; US20170066811A1; WO2017039267A1; KR102762391B1; ES2978863T3; US20180282388A1; EA201890584A1; UA125928C2; ZA201802017B; CN108350056B; NZ741060A; AR105822A1; PH12018500690A1; JP2021168687A; JP7252280B2; AU2016317449B2

Abstract

본 발명은 신규한 인슐린 아날로그, 특히 천연형 인슐린에 비해 증가된 인 비트로 효력을 갖는 인슐린 아날로그, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체로부터 인슐린 아날로그를 생산하는 방법, 상기 인슐린 아날로그를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물, 및 상기 인슐린 아날로그 또는 상기 약학적 조성물을 이용하여 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다

Description

신규한 인슐린 아날로그 및 이의 용도 {Novel Insulin Analogs and use thereof}

본 발명은 신규한 인슐린 아날로그, 특히 천연형 인슐린에 비해 인 비트로(in vitro) 효력이 증가된 인슐린 아날로그 및 이의 용도에 관한 것이다.

인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로서, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다. 그러나 당뇨 환자의 경우 이러한 인슐린이 부족하거나 인슐린 저항성 및 베타 세포의 기능소실로 인하여 인슐린이 정상적인 기능을 수행하지 못한다. 그로 인해 당뇨 환자는 혈액 내의 포도당을 에너지원으로 이용하지 못하고 혈중 포도당 수준이 높은 고혈당 증세를 나타내어 결국 소변으로 당을 배출하게 되며, 이는 다양한 합병증의 원인이 되고 있다. 따라서 인슐린 생성에 이상이 있거나(Type I), 인슐린 내성으로 인한(Type II) 당뇨 환자는 인슐린 치료가 필요하며, 인슐린 투여로써 혈당을 정상 수준으로 조절할 수 있다.

인간 인슐린은 2개의 폴리펩티드 사슬, 즉 각각 21개 및 30개 아미노산 잔기를 포함하는 A-쇄 및 B-쇄로 구성되어 있으며, 이들은 2개의 이황화 다리로 상호 연결되어 있다. 인슐린의 경우 다른 단백질이나 펩티드 호르몬과 같이 생체 내 반감기가 극히 짧아 지속적인 치료 효과를 보이지 못하여, 효과를 발휘하기 위해서는 지속적으로 반복 투여를 해야 한다는 단점이 있다. 이러한 빈번한 투여는 환자에게 엄청난 고통과 불편함을 야기하게 되므로, 환자의 순응성, 안전성 및 편의성 측면에서 개선이 요구되고 있다.

이에 인슐린과 같은 단백질 약물의 생체 내 반감기를 증가시켜 투여 횟수를 줄임으로써 환자의 삶의 질과 치료적 효과를 높이기 위한 다양한 단백질 제형화 연구와 화학적 결합체 등에 대한 연구가 진행되고 있다.

인슐린은 인슐린 수용체와 결합하여 혈중의 당을 제거하는 것으로 알려져 있으며 천연형 인슐린의 서열을 변화시켜 그 효력을 조절할 수 있다. 인슐린의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나 특정 아미노산의 삭제를 통하여 인슐린의 생체 내 효력을 조절할 수 있으며, 고 활성의 인슐린 유도체는 적은 양으로도 천연형 인슐린과 동등 이상의 효력을 보일 수 있기 때문에 치료학적으로 매우 바람직한 형태가 될 수 있다. 특히, 인슐린에 함유된 A-쇄 및/또는 B-쇄의 아미노산 치환이 피하 주사 후 인슐린 작용의 약동학적 효과 측면에서 광범위하게 연구되고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 인슐린의 작용 효과를 높이고자 예의 노력한 결과, 인슐린 A-쇄 및/또는 B-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형된 인슐린 아날로그가 천연형 인슐린에 비해 현저히 증가된 인 비트로 효력을 나타내어 당뇨병의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 인슐린 아날로그, 특히 천연형 인슐린에 비해 인 비트로(in vitro) 효력이 증가된 인슐린 아날로그를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 3의 A-쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 4의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그를 제공한다:

[일반식 1]

Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7(서열번호: 3)

상기 일반식 1에서,

Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,

Xaa2는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,

Xaa3는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,

Xaa4는 알라닌, 티로신, 글루탐산, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산 또는 아스파라긴이고,

Xaa5는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티닌, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,

Xaa6는 알라닌, 티로신, 세린, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,

Xaa7은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임

[일반식 2]

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaa11-Lys-Thr(서열번호: 4)

상기 일반식 2에서,

Xaa8은 티로신, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하며,

Xaa9는 페닐알라닌이거나, 부존재하며,

Xaa10는 트레오닌이거나, 부존재하며,

Xaa11은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.

(여기서 서열번호 1의 A쇄 및 서열번호 2의 B쇄를 포함하는 펩티드는 제외됨).

보다 구체적인 하나의 양태에서, 상기 펩티드는 상기 일반식 1의 A-쇄를 포함하고, 상기 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9는 부존재하며, Xaa10이 트레오닌인 B-쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 펩티드는 상기 일반식 1의 A-쇄를 포함하고, 상기 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9는 페닐알라닌이고, Xaa10이 부존재하는 B-쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 글루탐산이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고, 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9가 페닐알라닌이고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린인 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 아스파라긴이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고, 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9가 페닐알라닌이고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린인 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 글루탐산이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고, 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9가 부존재하고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린인 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 알라닌이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고, 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 글루탐산, Xaa9가 부존재하고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린인 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서,

본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa4가 글루탐산이고 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa9가 페닐알라닌이거나;

서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa4가 아스파라긴이고 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa9가 페닐알라닌이거나,

서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa4가 글루탐산이고 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa9가 부존재하거나,

서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa4가 알라닌이고, 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa 8이 글루탐산이고, Xaa9가 부존재한 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

다른 양태에서, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 서열번호: 16, 18, 20 또는 22로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

다른 양태로서, 본 발명은 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 제공한다.

일 실시양태로서, 본 발명에 따른 핵산은 서열번호: 15, 17, 19, 및 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 인슐린 아날로그를 제조하는 방법을 제공한다:

a) 상기 인슐린 아날로그 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

b) 상기 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 수득하는 단계;

c) 상기 형질전환체를 배양하여 인슐린 아날로그 펩티드를 발현시키는 단계;

d) 발현된 인슐린 아날로그 펩티드를 분리 및 정제하는 단계.

또 다른 양태로서, 본 발명은 유효성분으로서 상기 인슐린 아날로그와, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

본 발명은 신규한 인슐린, 특히 천연형 인슐린에 비해 인 비트로 효력이 증가된 인슐린 아날로그에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "인슐린 아날로그(insulin analog)"란 천연형 인슐린의 일부 아미노산을 부가, 결실 또는 치환의 형태로 변형시킨 아날로그를 의미한다. 특히, 상기 변형을 통해 천연형에 비해 인 비트로 효력이 증가된 다양한 아날로그를 포함한다.

천연형 인슐린은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린(proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당 조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린은 2개의 폴리펩티드 사슬, 즉 각각 21개 및 30개 아미노산 잔기를 포함하는 A-쇄 및 B-쇄로 구성되어 있고, 이들은 2개의 이황화 다리로 상호 연결되어 있다. 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄는 각각 하기 서열번호: 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

A-쇄:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(서열번호: 1)

B-쇄:

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(서열번호: 2)

본 발명에 따른 인슐린은 유전자 재조합 기술로 만든 인슐린 아날로그이지만, 본 발명은 이것에만 국한되는 것이 아니라 천연형 인슐린에 비해 인 비트로 효력이 증가된 모든 인슐린을 포함한다. 바람직하게는 역방향 인슐린(inverted insulin), 인슐린 변이체(variants), 인슐린 단편(fragments) 등을 포함하며, 이들은 유전자 재조합법뿐만 아니라 고상(solid phase) 방법으로도 제조할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 인슐린과 동일한 생체 내의 혈당 조절기능을 보유한 펩티드로서, 이러한 펩타이드는 인슐린 아고니스트(agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어 "인슐린 아고니스트"는 인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체 내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.

본 발명에서 용어 "인슐린 유도체"는 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄의 아미노산 서열 각각에 대해 상동성을 보이며, 아미노산 한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예: alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예: deamination) 또는 수식(예: N-methylation)된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩티드를 의미할 수 있다. 또한, "인슐린 유도체"에는 천연형 인슐린과 아미노산 서열에 상동성이 없어도 인슐린 수용체와 결합하여 체내에서 혈당을 조절할 수 있는 펩티드 모사체(mimic) 및 저분자 혹은 고분자 화합물이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "인슐린 단편"은 인슐린에 하나 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산 (예: D형 아미노산)일 수 있고, 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한다.

본 발명에서 용어 "인슐린 변이체"는 인슐린과 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩티드로서 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한다.

본 발명의 인슐린 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 아미노 말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination)가 도입된 것으로 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩티드 역시 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄의 아미노산 서열(서열번호: 1 및 2)에서 아미노산의 치환, 부가 결실 또는 번역 후 변형(예를 들어, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 분자 내 공유결합)이 도입되어, 천연형에 비해 증가된 인비트로 효력을 갖는 임의의 펩티드를 포괄한다. 상기 아미노산의 치환 또는 부가 시에는 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep 및 Genzymepharmaceuticals가 포함될 수 있다. 이러한 아미노산이 포함된 펩티드와 전형적인 펩티드 서열은 상업화된 펩티드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company, Bachem이나 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매가능하다.

구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 상기와 같은 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄에서 특정 아미노산 잔기의 변형 또는 결실을 포함하는 것으로, 바람직하게는 천연형 인슐린의 A-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형되고 B-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형되고/되거나 결실된 것일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 인비트로 효력을 증가시키기 위해 서열번호: 1로 표시되는 A-쇄 아미노산 서열의 14번째 아미노산인 티로신을 글루탐산, 아스파라긴, 또는 알라닌으로 치환하거나, 서열번호: 2로 표시되는 B-쇄 아미노산 서열의 16번째 아미노산 서열인 티로신을 글루탐산으로 치환하고/하거나 25번째 아미노산인 페닐알라닌을 결실시키거나, 이들 모두를 포함할 수 있다.

더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 하기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 3의 A-쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 4의 B-쇄를 포함하는 신규한 펩티드일 수 있다:

[일반식 1]

상기 일반식 1에서,

Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘,글루탐산 또는 아스파라긴이고,

Xaa7은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.

[일반식 2]

상기 일반식 2에서,

Xaa9는 페닐알라닌이거나, 부존재하며,

Xaa10는 트레오닌이거나, 부존재하며,

여기서, 서열번호 1의 A-쇄 및 서열번호 2의 B-쇄를 포함하는 펩티드는 제외될 수 있다.

보다 구체적인 하나의 양태에서,

상기 일반식 1에서

Xaa1는 글리신이고,

Xaa2는 글루타민이고,

Xaa3는 세린이고,

Xaa4는 알라닌, 글루탐산, 또는 아스파라긴이고,

Xaa5는 류신이고,

Xaa6는 티로신이고,

Xaa7은 아스파라긴이며,

상기 일반식 2에서

Xaa8은 티로신 또는 글루탐산이고,

Xaa9는 페닐알라닌이거나, 부존재하며,

Xaa10는 트레오닌이고,

Xaa11은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 인슐린 아날로그 펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적인 하나의 양태에서,

상기 일반식 1에서

Xaa1는 글리신이고,

Xaa2는 글루타민이고,

Xaa3는 세린이고,

Xaa4는 글루탐산, 또는 아스파라긴이고,

Xaa5는 류신이고,

Xaa6는 티로신이고,

Xaa7은 아스파라긴이며,

상기 일반식 2에서

Xaa8은 티로신이고,

Xaa9는 페닐알라닌이거나, 부존재하며,

Xaa10는 트레오닌이고,

보다 구체적인 하나의 양태에서, 상기 펩티드는 상기 일반식 1의 A-쇄를 포함하고, 상기 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9는 부존재하며, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것인 B-쇄를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 펩티드는 상기 일반식 1의 A-쇄를 포함하고, 상기 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9는 페닐알라닌이고, Xaa10이 부존재하고, Xaa11은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 B-쇄를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 펩티드는 상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 글루탐산이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고, 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9가 페닐알라닌이고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 펩티드는 상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 아스파라긴이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고, 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9가 페닐알라닌이고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 양태에서, 상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 글루탐산이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고, 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9가 부존재하고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 양태에서, 상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 알라닌이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고, 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 글루탐산, Xaa9가 부존재하고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 하기를 포함한다.

i) 인슐린 아날로그 1: 서열번호: 3으로 표시되는 A-쇄 아미노산 서열의 14번째 아미노산이 글루탐산이고 서열번호: 4로 표시되는 B-쇄 아미노산 서열의 25번째 아미노산이 페닐알라닌인 펩티드로서, 서열번호: 16로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 15로 기재되는 염기 서열을 갖는 핵산으로부터 코딩된다.

ii) 인슐린 아날로그 2: 서열번호: 3으로 표시되는 A-쇄 아미노산 서열의 14번째 아미노산이 아스파라긴이고 서열번호: 4로 표시되는 B-쇄 아미노산 서열의 25번째 아미노산이 페닐알라닌인 펩티드로서, 서열번호: 18로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 17으로 기재되는 염기 서열을 갖는 핵산으로부터 코딩된다.

iii) 인슐린 아날로그 3: 서열번호: 3으로 표시되는 A-쇄 아미노산 서열의 14번째 아미노산이 글루탐산이고 서열번호: 4로 표시되는 B-쇄 아미노산 서열의 25번째 아미노산이 결실된 펩티드로서, 서열번호: 20으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 19로 기재되는 염기 서열을 갖는 핵산으로부터 코딩된다.

iv) 인슐린 아날로그 4: 서열번호: 3으로 표시되는 A-쇄 아미노산 서열의 14번째 아미노산이 알라닌이고 서열번호: 4로 표시되는 B-쇄 아미노산 서열의 16번째 아미노산 서열이 글루탐산이고 25번째 아미노산이 결실된 펩티드로서, 서열번호: 22으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 21로 기재되는 염기 서열을 갖는 핵산으로부터 코딩된다.

본 명세서에서 인슐린 아날로그와 관련하여 사용된 용어 "인 비트로 효력"은 인슐린 아날로그의 글루코스 흡수능(glucose uptake)을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 지방세포로 분화시킨 마우스 유래의 3T3 L1 세포를 대상으로 글루코스 흡수능에 대한 EC₅₀을 측정한 결과로 표시된다.

발명의 바람직한 실시예에서, 상기 방법에 따라 본 발명에 따른 인슐린 아날로그 1 내지 3의 인 비트로 효력을 측정한 결과, 천연형 인슐린에 비해 인슐린 아날로그 1은 238.4%, 인슐린 아날로그 2는 241.7%, 인슐린 아날로그 3은 705% 글루코스 흡수능을 나타내어 본 발명에 따른 인슐린 아날로그가 천연형 인슐린에 비해 2 내지 7배 획기적으로 증가한 인 비트로 효력을 나타냄을 확인하였다(표 1).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명에서 용어, "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)로, 게놈 DNA, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA를 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990). 본 발명의 핵산은 표준 분자생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 천연형 인슐린 유전자 서열(NM_000207.2, NCBI)로부터 PCR(중합효소 연쇄반응)을 통해 증폭할 수 있고, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 핵산은 바람직하게는 서열번호: 15, 17, 19 및 21로 기재되는 염기서열을 포함한다. 본 발명은 서열번호: 15, 17, 19, 및 21로 기재되는 염기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 핵산이 코딩한 펩티드가 인슐린의 생체 내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 것을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어, "상동성(homology)"은 천연형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 인슐린 아날로그를 수득할 수 있다.

본 발명에서 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명에서 용어, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5'-부위에 위치한다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예: tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합부위 및 전사/해독 종결서열을 포함하는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pPICZα 시리즈, pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 진핵세포를 숙주로 하는 경우에, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 우두바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 일반적으로 갖는다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 마커로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 사용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 회수되는 목적 단백질, 즉 단쇄 인슐린 아날로그, 프로인슐린 또는 인슐린 아날로그의 정제를 용이하게 하기 위하여 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6개 히스티딘(hexahistidine) 등이 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 태그 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6개 히스티딘 태그가 이용된 경우에는 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "형질전환(transformation)"이란 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환법 등이 있다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

목적 핵산인 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.

본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다. 바람직하게는, 숙주세포로 대장균을 사용한다.

발명의 바람직한 실시예에서는, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그 1 내지 4를 각각 코딩하는 핵산 서열을 PCR(중합효소 연쇄반응)로 증폭한 후 이로부터 증폭된 유전자 단편을 pET22b 벡터(Novagen)에 클로닝하였다. 인슐린 아날로그를 세포 내의 봉입체 형태로 발현시키기 위하여 pET22b 벡터를 제한 효소 NdeI 및 BamHI로 처리하여 신호 서열을 제거하고, 인슐린 아날로그의 PCR 증폭 산물을 동일한 제한효소 NdeI과 BamHI으로 처리하고 분리된 각각의 DNA를 T4 DNA 리가제를 이용하여, pET22b 클로닝 벡터에 삽입하였다. 상기 결과로 얻어진 발현 벡터를 각각 pET22b-인슐린 아날로그 1 내지 4로 명명하였다.

상기 발현 벡터 pET22b-인슐린 아날로그 1 내지 4는 T7 프로모터의 조절 하에 각각 서열번호: 16, 18, 20, 및 22의 아미노산 서열을 암호화하며, 숙주 세포 내에서 각각의 인슐린 아날로그 펩티드를 봉입체의 형태로 발현시켰다.

서열번호: 16, 18, 20, 및 22의 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 pET22b-인슐린 아날로그 1 내지 4를 각각 대장균에 형질전환시켜 이들을 봉입체 형태로 발현하는 형질전환체를 수득하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 인슐린 아날로그를 제조하는 방법을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 방법은

a) 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

c) 상기 형질전환체를 배양하여 인슐린 아날로그를 발현시키는 단계; 및

d) 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 인슐린 아날로그의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.

사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.

마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.

본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 인슐린 아날로그의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.

전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 인슐린 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 펩티드-N-글리코시다제는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.

숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 그에 도입된 재조합 벡터 pET22b-인슐린 아날로그 1 내지 3이 T7 프로모터의 조절 하에서 인슐린 아날로그 1 내지 3을 봉입체 형태로 발현시키는 것을 특징으로 한다. 따라서, 봉입체 형태로 발현된 인슐린 아날로그 1 내지 3을 적절한 방법에 의해 가용성 형태로 바꾼 후 분리, 정제 과정을 거치는 것이 바람직하다.

발명의 바람직한 실시예에서는, 형질전환체로부터 봉입체 형태로 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하기 위하여 하기 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

d-1) 배양액으로부터 형질전환체 세포를 수확하여 파쇄하는 단계;

d-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인슐린 아날로그 펩티드를 회수하여 리폴딩하는 단계;

d-3) 리폴딩된 인슐린 아날로그 펩티드를 양이온 결합 크로마토그래피로 정제하는 단계;

d-4) 정제된 인슐린 아날로그 펩티드를 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계;

d-5) 처리된 인슐린 아날로그 펩티드를 양이온 결합 크로마토그래피 및 음이온 결합 크로마토그래피로 순차적으로 정제하는 단계.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인슐린 아날로그를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그를 포함하는 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 그 외에도 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인슐린 아날로그 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 치료방법을 제공한다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린에 비해 현저히 증가된 인 비트로 효력을 나타내므로, 상기 인슐린 아날로그 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여함으로써 당뇨병의 치료를 도모할 수 있다.

본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여 및 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 유효성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린에 비해 현저히 증가된 인 비트로 효력을 나타내므로 소량의 투여만으로도 충분한 치료 효과를 기대할 수 있어 당뇨병의 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 인슐린 아날로그의 순도를 단백질 전기영동으로 분석한 결과로서, 대표적으로 인슐린 아날로그 1에 대한 결과이다.
레인 1: 크기 마커
레인 2: 인슐린 아날로그 1
도 2는 본 발명에 따른 인슐린 아날로그의 순도를 역상 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과로서, 대표적으로 인슐린 아날로그 1에 대한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 인슐린 아날로그의 펩타이드 지도화 분석 결과로서, 대표적으로 인슐린 아날로그 1에 대한 결과이다. 도 3에서 "USP 인슐린"은 대조군으로 사용된 천연형 인슐린을 의미한다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인슐린 아날로그 발현 벡터의 제작

천연형 인슐린의 A-쇄 및/또는 B-쇄의 아미노산을 변형시킨 인슐린 아날로그들을 제작하기 위해, 해당 변형이 도입된 인슐린 아날로그의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 합성한 후, 프로인슐린 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이때, 주형으로는 프로인슐린 cDNA(SC128255, OriGene)(참조 서열: BC005255.1 및 AAH05255)가 pET22b 벡터(Novagen)에 클로닝된 것을 사용하였으며, 인슐린의 원활한 재조합 발현을 위하여 클로닝된 프로인슐린 cDNA의 N-말단에 융합 파트너(N-terminal fusion partner)로 Met Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Arg의 아미노산 서열 (서열번호: 24)을 코딩하는 서열번호: 23의 염기 서열(ATG GCA ACA ACA TCA ACA GCA ACT ACG CGT)을 삽입하였다.

구체적으로, 본 발명에서는 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 변형을 포함하는 인슐린 아날로그를 합성하였다.

	아미노산 변형
인슐린 아날로그 1	A¹⁴ Tyr -> Glu
인슐린 아날로그 2	A¹⁴ Tyr -> Asn
인슐린 아날로그 3	A¹⁴ Tyr -> Glu + B²⁵ 결실
인슐린 아날로그 4	A¹⁴ Tyr -> Ala + B¹⁶ Tyr -> Glu, B²⁵ 결실

상기 표 1에서, 인슐린 아날로그 1은 서열번호: 1로 표시되는 천연형 인슐린의 A-쇄 아미노산 서열에서 14번째 아미노산인 티로신의 글루탐산으로의 치환을 포함하는 것이고,

인슐린 아날로그 2는 서열번호: 1로 표시되는 천연형 인슐린의 A-쇄 아미노산 서열에서 14번째 아미노산인 티로신의 아스파라긴으로의 치환을 포함하는 것이며,

인슐린 아날로그 3은 서열번호: 1로 표시되는 천연형 인슐린의 A-쇄 아미노산 서열에서 14번째 아미노산인 티로신의 글루탐산으로의 치환과 서열번호: 2로 표시되는 천연형 인슐린의 B-쇄 아미노산 서열에서 25번째 아미노산인 페닐알라닌의 결실을 포함하는 것이다.

인슐린 아날로그 4는 서열번호: 1로 표시되는 천연형 인슐린의 A-쇄 아미노산 서열에서 14번째 아미노산인 티로신의 알라닌으로의 치환과 서열번호: 2로 표시되는 천연형 인슐린의 B-쇄 아미노산 서열에서 16번째 아미노산인 티로신의 글루탐산으로의 치환과, 25번째 아미노산인 페닐알라닌의 결실을 포함하는 것이다.

상기 인슐린 아날로그 1 내지 4의 증폭을 위해 설계된 각각의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 하기 표 2에 나타내었다.

	서열	서열번호
인슐린 아날로그 1	5'-ccagcatctgctccctcgaacagctggagaactactg-3'	5
인슐린 아날로그 1	5'-cagtagttctccagctgttcgagggagcagatgctgg-3'	6
인슐린 아날로그 2	5'-cagcatctgctccctcaaccagctggagaactac-3'	7
인슐린 아날로그 2	5'-gtagttctccagctggttgagggagcagatgctg-3'	8
인슐린 아날로그 3	5'-ccagcatctgctccctcgaacagctggagaactactg-3'	5
	5'-cagtagttctccagctgttcgagggagcagatgctgg-3'	6
	5'-gcggggaacgaggcttctacacacccaagacccg-3'	9
	5'-cgggtcttgggtgtgtagaagcctcgttccccgc-3'	10
인슐린 아날로그 4	5'-cagcatctgctccctcgcccagctggagaactac-3'	11
	5'-gtagttctccagctgggcgagggagcagatgctg-3'	12
	5'-ctggtggaagctctcgagctagtgtgcggggaac-3'	13
	5'-gttccccgcacactagctcgagagcttccaccag-3'	14
	5'-gcggggaacgaggcttctacacacccaagacccg-3'	9
	5'-cgggtcttgggtgtgtagaagcctcgttccccgc-3'	10

상기 표 2에서, 서열번호: 5 및 6의 프라이머 쌍은 천연형 인슐린의 A-쇄 아미노산 서열에서 14번째 아미노산인 티로신을 글루탐산으로 치환하기 위한 것이고, 서열번호: 7 및 8의 프라이머 쌍은 천연형 인슐린의 A-쇄 아미노산 서열에서 14번째 아미노산인 티로신을 아스파라긴으로 치환하기 위한 것이며, 서열번호: 9 및 10의 프라이머 쌍은 천연형 인슐린의 B-쇄 아미노산 서열에서 25번째 아미노산인 페닐알라닌을 결실시키기 위한 것이며, 서열번호: 11 및 12의 프라이머 쌍은 천연형 인슐린의 A-쇄 아미노산 서열에서 14번째 아미노산인 티로신을 알라닌으로 치환하기 위한 것이며, 서열번호: 13 및 14의 프라이머 쌍은 천연형 인슐린의 B-쇄 아미노산 서열에서 16번째 아미노산인 티로신을 글루탐산으로 치환하기 위한 것이다.

해당 변형을 포함하는 인슐린 아날로그 증폭을 위한 PCR은 주형 DNA 150 ng, 100 pM 프라이머 각각 1 ㎖씩, 2.5 mM dNTP 5 ㎖, pfx 중합효소 10 단위(Invitrogen, USA) 및 10X 완충액을 혼합하여 반응용액을 제조하고, 95℃에서 30초간 초기 변성에 이어서 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 68℃에서 6분의 어닐링 과정을 18회 반복한 후 마지막으로 68℃에서 5분간 반응시켰다. 이로부터 수득된 PCR 증폭산물을 겔 추출 키트(퀴아젠, 독일)를 이용하여 추출한 후 제한효소 NdeI과 BamHI으로 처리하여 삽입 절편을 제조하였다. 이어서, pET22b 벡터(Novagen, USA)를 동일한 제한효소로 절단하고 동일한 겔 추출 키트를 이용하여 추출하였다. 이와 같이 준비된 벡터에 상기 삽입 절편을 T4 리가아제를 이용하여 연결시켜 발현 벡터 pET22b-인슐린 아날로그 1 내지 4을 제조하였다. 상기 발현 벡터는 T7 프로모터의 조절 하에서 인슐린 아날로그 1 내지 4의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하며, 숙주 내에서 인슐린 아날로그 단백질을 봉입체 형태로 발현시킬 수 있다.

이로부터 수득된 본 발명에 따른 발현 벡터 pET22b-인슐린 아날로그 1은 서열번호: 15로 기재되는 염기 서열을 갖는 핵산을 포함하고, 이는 서열번호: 16으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 인슐린 아날로그를 코딩하며,

발현 벡터 pET22b-인슐린 아날로그 2는 서열번호: 17로 기재되는 염기 서열을 갖는 핵산을 포함하고, 이는 서열번호: 18로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 인슐린 아날로그를 코딩하며,

발현 벡터 pET22b-인슐린 아날로그 3은 서열번호: 19로 기재되는 염기 서열을 갖는 핵산을 포함하고, 이는 서열번호: 20으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 인슐린 아날로그를 코딩하며,

발현 벡터 pET22b-인슐린 아날로그 4는 서열번호: 21로 기재되는 염기 서열을 갖는 핵산을 포함하고, 이는 서열번호: 22로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 인슐린 아날로그를 코딩한다.

하기 표 3에 각각의 인슐린 아날로그 1 내지 4의 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타내었다.

	서열		서열번호
인슐린 아날로그 1	DNA	TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC GAA CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA	15
인슐린 아날로그 1	단백질	Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn	16
인슐린 아날로그 2	DNA	TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC AAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA	17
인슐린 아날로그 2	단백질	Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asn Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn	18
인슐린 아날로그 3	DNA	TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC GAA CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA	19
인슐린 아날로그 3	단백질	Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn	20
인슐린 아날로그 4	DNA	TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC GAG CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC GCC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA	21
인슐린 아날로그 4	단백질	Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn	22

실시예 2: 재조합 인슐린 아날로그의 발현

T7 프로모터의 조절 하에서 본 발명에 따른 인슐린 아날로그의 재조합 발현을 하기와 같이 수행하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 각각의 인슐린 아날로그 발현 벡터로 대장균 BL21-DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB^-mB^-)galλDE3)(Novagen,USA)을 형질전환하였다. 형질전환은 상기 대장균 BL21-DE3의 제조사인 노바젠사에서 추천하는 방법에 따라 수행하였다. 인슐린 아날로그 발현 벡터가 형질전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여 50 ㎍/㎖의 암피실린 함유 2X LB(Luria Broth, LB) 배지에 접종한 후 37℃에서 15시간 동안 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1 ㎖씩을 크라이오-튜브(cryo-tube)에 분주하고 -140℃에 보관하였다. 이를 본 발명에 따른 인슐린 아날로그의 재조합 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그의 재조합 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알을 녹여 500 ㎖의 2X LB 배지에 접종하고 37℃에서 14 내지 16시간 동안 진탕 배양하였다. OD₆₀₀의 값이 5.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 50 L 발효기(MSJ-U2, B.E. MARUBISHI, 일본)를 이용하여 종 배양액을 17 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배스(bath) 발효를 시작하였다. 배양조건을 온도 37℃, 공기량 20 L/분(1 vvm), 및 교반 속도 500 rpm으로 설정하고 30% 암모니아수를 사용하여 pH를 6.7로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가 배지(feeding solution)를 첨가하여 유가 배양을 진행하였다. OD 값으로 균주의 성장을 모니터링하였고, OD 값이 100 이상에 도달하면 최종 농도 500 μM의 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)를 도입하였다. 배양은 IPTG 도입 후 약 23 내지 25시간까지 더 진행하며, 배양 종료 후 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수확하였고, 이를 이후의 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.

실시예 3: 재조합 인슐린 아날로그의 분리 및 정제

상기 실시예 2에서 형질전환체로부터 발현시킨 재조합 인슐린 아날로그를 분리, 정제하기 위하여, 먼저 불용성 봉입체 형태로 발현된 인슐린 아날로그를 가용성 형태로 바꾸기 위해 하기와 같이 세포를 파쇄하고 리폴딩을 수행하였다.

<3-1> 재조합 인슐린 아날로그의 회수 및 리폴딩

구체적으로, 세포 펠렛 100 g(wet weight)을 1 L 용해 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 9.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.2 M NaCl 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재부유한 후 미세용액화(microfluidizer) 프로세서 M-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C)를 이용해 15,000 psi의 압력을 가하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 7,000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 3 L 세척 완충액(0.5% 트리톤 X-100 및 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA)에 재부유하였다. 7,000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리하여 펠렛을 증류수에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심분리하였다. 이로부터 펠렛을 취하여 400 ㎖의 완충액(1 M Glycine, 3.78 g Cysteine-HCl, pH 10.6)에 재부유한 후 상온에서 1시간 동안 교반하였다.

재부유된 재조합 인슐린 아날로그를 회수하기 위하여 400 ㎖의 8 M 우레아를 추가한 후 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 가용화된 재조합 인슐린 아날로그의 리폴딩(refolding)을 위하여 7,000 rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하였고, 여기에 7.2 L의 증류수를 연동 펌프(peristaltic pump)를 이용하여 1000 ㎖/hr의 유속으로 첨가하면서 4℃에서 16시간 동안 교반하였다.

<3-2> 양이온 결합 크로마토그래피 정제

45% 에탄올이 포함된 20 mM 구연산나트륨 완충액(pH 2.0)으로 평형화된 양이온 교환 칼럼(Source S, GE Healthcare사)에 상기 실시예 <3-1>에서 리폴딩이 종결된 시료를 로우딩하여 결합시켰다. 이어서 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 구연산나트륨 완충액(pH 2.0)을 사용하여 농도가 0%→100%가 되도록 10X 칼럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 칼럼으로부터 용출하였다.

<3-3> 트립신 및 카복시펩티다제 B의 처리

상기 실시예 <3-2>에서 탈염 칼럼(Desalting column)으로 용출된 시료에서 염을 제거하고, 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 교체하였다. 얻어진 시료 단백질 양의 1000 몰비에 해당하는 트립신(trypsin)과 2000 몰비에 해당하는 카복시펩티다제(carboxypeptidase) B를 첨가한 후, 16℃에서 16시간 동안 교반하였다. 1 M 구연산나트륨(pH 2.0)을 이용하여 pH를 3.5로 낮추어 반응을 종결하였다.

<3-4> 양이온 결합 크로마토그래피 정제

상기 실시예 <3-3>에서 반응이 종결된 시료를 45% 에탄올이 포함된 20 mM 구연산나트륨 완충액(pH 2.0)으로 평형화된 양이온 교환 칼럼(Source S, GE Healthcare사)에 다시 로우딩하여 결합시켰다. 이어서 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 구연산나트륨 완충액(pH 2.0)을 사용하여 농도가 0%→100%가 되도록 10X 칼럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 칼럼으로부터 용출하였다.

<3-5> 음이온 결합 크로마토그래피 정제

상기 실시예 <3-4>에서 탈염 칼럼으로 용출된 시료에서 염을 제거하고, 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 교체하였다. 이로부터 수득된 시료에서 순수한 인슐린 아날로그를 분리하기 위해 10 mM 트리스 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 음이온 교환 칼럼(Source Q, GE Healthcare사)에 로우딩하여 결합시켰다. 이어서 0.5 M 염화나트륨이 포함된 10 mM 트리스 완충액(pH 7.5)을 사용하여 농도가 0%→100%가 되도록 10X 칼럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 칼럼으로부터 용출하였다.

정제된 인슐린 아날로그의 순도는 단백질 전기영동(SDS-PAGE)과, 역상 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 분석하였으며, 상기 결과를 각각 도 1 및 2에 나타내었다. 또한 아미노산의 변형은 펩티드 지도화(mapping)와 각 피크의 분자량 분석을 통하여 확인하였고, 이는 도 3에 나타내었다.

그 결과, 각각의 인슐린 아날로그가 목적하는 바에 따라 아미노산 서열이 변형이 되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 천연형 인슐린과 인슐린 아날로그의 인 비트로 효력 비교

상기 실시예 3에서 분리, 정제된 인슐린 아날로그의 인 비트로 효력을 측정하기 위하여, 지방세포로 분화시킨 마우스 유래의 3T3-L1 세포주를 이용한 글루코스 흡수능(glucose uptake, 또는 지질 합성능) 시험을 실시하였다.

3T3-L1 세포주(ATCC, CL-173)를 10% NBCS(신생 송아지 혈청)를 포함하는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco, Cat.No, 12430) 배지를 이용하여 주 2~3회 계대 배양하며 유지하였다. 3T3-L1 세포주를 분화용 배지(10% FBS를 포함한 DMEM)에 현탁한 후 48-웰 플레이트에 웰 당 5X10⁴세포가 되도록 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 지방세포로의 분화를 위하여 분화용 배지에 1 ㎍/㎖의 인간 인슐린(Sigma, Cat. No. I9278), 0.5 mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat. No.I5879), 1 μM 덱사메타손(Dexamethasone, Sigma, Cat. No. D4902)을 혼합하고, 기존 배지를 제거한 후 웰 당 250 ㎕씩 첨가하였다. 48시간 후 분화용 배지에 1 ㎍/㎖의 인간 인슐린만을 첨가한 배지로 다시 교환하였다. 이후, 48시간마다 1 ㎍/㎖의 인간 인슐린을 첨가한 분화용 배지로 교환하면서 7 내지 9일간 지방세포로의 분화가 유도되는 것을 확인하였다.

글루코스 흡수능 시험을 위하여, 지방세포로의 분화가 종결된 세포를 무혈청 DMEM 배지로 1회 수세한 후 250 ㎕씩 넣어 4시간 동안 혈청 고갈을 유도하였다. 인간 인슐린과 인슐린 아날로그를 5 μM부터 0.005 nM까지 무혈청 DMEM 배지로 10배씩 순차적으로 희석하여 준비하였다. 준비된 인슐린 시료를 세포에 각각 250 ㎕씩 첨가한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 배양이 끝난 배지의 글루코스 잔량을 측정하기 위해 200 ㎕의 배지를 취해 D-PBS로 각각 5배 희석한 후 GOPOD 분석(GOPOD Assay Kit, Megazyme, Cat. No. K-GLUC)을 진행하였다. 글루코스 표준용액의 흡광도를 기준으로 배지의 잔여 글루코스 농도를 환산하였고, 인슐린 아날로그의 글루코스 흡수능에 대한 EC₅₀를 각각 산출하여 하기 표 4에 나타내었다.

	글루코스 흡수능 (천연형 인슐린 대비 비율)
천연형 인간 인슐린	100%
인슐린 아날로그 1	238.4%
인슐린 아날로그 2	241.7%
인슐린 아날로그 3	705%

표 4에 나타난 바와 같이, 천연형 인간 인슐린과 대비하여 본 발명에 따른 인슐린 아날로그 1은 238.4%, 인슐린 아날로그 2는 241.7%, 및 인슐린 아날로그 3은 705%의 증가된 글루코스 흡수능이 관찰되었다.

상기 결과로부터 본 발명에 따른 인슐린 아날로그의 인 비트로 효력이 천연형 인슐린과 비교하여 2 내지 7배로 획기적으로 증가됨이 확인되었고, 이는 상기 인슐린 아날로그가 실제 생체 내에서 혈중 반감기가 획기적으로 증가하여 안정적인 인슐린 제제로 제공될 수 있으며 당뇨병 치료제로 효과적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> NOVEL INSULIN ANALOGS AND USE THEREOF <130> KPA140149-KR-P1 <150> KR 10-2015-0121819 <151> 2015-08-28 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin A-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is alanine, glycine, glutamine, histidine, glutamic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is alanine, glutamic acid, glutamine, histidine, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> Xaa is alanine, serine, glutamine, glutamic acid, histidine, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is alanine, tyrosine, glutamic acid, histidine, lysine, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is alanine, leucine, tyrosine, histidine, glutamic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19) <223> Xaa is alanine, tyrosine, serine, glutamic acid, histidine, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21) <223> Xaa is asparagine, glycine, histidine, or alanine <400> 3 Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa 1 5 10 15 Glu Asn Xaa Cys Xaa 20 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin B-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is tyrosine, glutamic acid, or aspartic acid, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25) <223> Xaa is phenylalanine, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> Xaa is threonine, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa is proline, glutamic acid, or aspartic acid, or is absent <400> 4 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr 20 25 30 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccagcatctg ctccctcgaa cagctggaga actactg 37 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cagtagttct ccagctgttc gagggagcag atgctgg 37 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cagcatctgc tccctcaacc agctggagaa ctac 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gtagttctcc agctggttga gggagcagat gctg 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gcggggaacg aggcttctac acacccaaga cccg 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cgggtcttgg gtgtgtagaa gcctcgttcc ccgc 34 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 cagcatctgc tccctcgccc agctggagaa ctac 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gtagttctcc agctgggcga gggagcagat gctg 34 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg gaac 34 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gttccccgca cactagctcg agagcttcca ccag 34 <210> 15 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin Analog 1 <400> 15 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaacag 240 ctggagaact actgcaactg a 261 <210> 16 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin Analog 1 <400> 16 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 17 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin Analog 2 <400> 17 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaaccag 240 ctggagaact actgcaactg a 261 <210> 18 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin Analog 2 <400> 18 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asn Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 19 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin Analog 3 <400> 19 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag 120 gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc 180 ctgcagaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct cgaacagctg 240 gagaactact gcaactga 258 <210> 20 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin Analog 3 <400> 20 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu 20 25 30 Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly 35 40 45 Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg 50 55 60 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 21 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin Analog 4 <400> 21 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag 120 gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc 180 ctgcagaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct cgcccagctg 240 gagaactact gcaactga 258 <210> 22 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin Analog 4 <400> 22 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu 20 25 30 Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly 35 40 45 Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg 50 55 60 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln Leu 65 70 75 80 Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal fusion partner <400> 23 atggcaacaa catcaacagc aactacgcgt 30 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal fusion partner <400> 24 Met Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Arg 1 5 10

Claims

하기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 3의 A-쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 4의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그 펩티드:
[일반식 1]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7(서열번호: 3)
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘,글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa2는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa3는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa4는 알라닌, 티로신, 글루탐산, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산 또는 아스파라긴이고,
Xaa5는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티닌, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa6는 알라닌, 티로신, 세린, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa7은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.
[일반식 2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaa11-Lys-Thr(서열번호: 4)
상기 일반식 2에서,
Xaa8은 티로신, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하며,
Xaa9는 페닐알라닌이거나, 부존재하며,
Xaa10는 트레오닌이거나, 부존재하며,
Xaa11은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함
(여기서 서열번호 1의 A-쇄 및 서열번호 2의 B-쇄를 포함하는 펩티드는 제외됨).
제1항에 있어서, 상기 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9는 부존재하며, Xaa10이 트레오닌인 것인 인슐린 아날로그 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9는 페닐알라닌이고, Xaa10이 부존재하는 인슐린 아날로그 펩티드.
제1항에 있어서,
상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 글루탐산이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고,
서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9가 페닐알라닌이고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린인 것인 인슐린 아날로그 펩티드.
제4항에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호: 16으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 인슐린 아날로그 펩티드.
제1항에 있어서,
상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 아스파라긴이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고,
서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9가 페닐알라닌이고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린인 것인 인슐린 아날로그 펩티드.
제6항에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호: 18로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 인슐린 아날로그 펩티드.
제1항에 있어서,
상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 글루탐산이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고,
서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 티로신이고, Xaa9가 부존재하고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린인 것인 인슐린 아날로그 펩티드.
제8항에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호: 20으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 인슐린 아날로그 펩티드.
제1항에 있어서,
상기 서열번호: 3의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa2가 글루타민이고, Xaa3이 세린이고, Xaa4가 알라닌이고, Xaa5가 류신이고, Xaa6이 티로신이고, Xaa7이 아스파라긴이고,
서열번호: 4의 B-쇄에서 Xaa8이 글루탐산, Xaa9가 부존재하고, Xaa10이 트레오닌이고, Xaa11은 프롤린인 인슐린 아날로그 펩티드.
제10항에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호: 22으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 인슐린 아날로그 펩티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그 펩티드를 코딩하는 핵산.
제12항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호: 15, 17, 19 또는 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 것인 핵산.
제12항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제14항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제15항에 있어서, 상기 형질전환체가 대장균인 것인 형질전환체.
하기 단계를 포함하는 제1항에 따른 인슐린 아날로그 펩티드를 제조하는 방법:
a) 제1항에 따른 인슐린 아날로그 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
b) 상기 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 수득하는 단계;
c) 상기 형질전환체를 배양하여 인슐린 아날로그 펩티드를 발현시키는 단계;
d) 발현된 인슐린 아날로그 펩티드를 분리 및 정제하는 단계.
제17항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호: 15, 17, 19 또는 21 로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 숙주세포가 대장균인 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 분리 및 정제가
d-1) 배양액으로부터 형질전환체 세포를 수확하여 파쇄하는 단계;
d-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인슐린 아날로그 펩티드를 회수하여 리폴딩하는 단계;
d-3) 리폴딩된 인슐린 아날로그 펩티드를 양이온 결합 크로마토그래피로 정제하는 단계;
d-4) 정제된 인슐린 아날로그 펩티드를 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계;
d-5) 처리된 인슐린 아날로그 펩티드를 양이온 결합 크로마토그래피 및 음이온 결합 크로마토그래피로 순차적으로 정제하는 단계를 포함하는 것인 방법.
유효성분으로서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그 펩티드와, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물.