KR20190017979A

KR20190017979A - 당화알부민의 측정 방법

Info

Publication number: KR20190017979A
Application number: KR1020197001184A
Authority: KR
Inventors: 료스케 고구마
Original assignee: 아사히 가세이 파마 가부시키가이샤
Priority date: 2016-07-28
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2019-02-20
Anticipated expiration: 2037-07-19
Also published as: CN109477839B; WO2018021098A1; EP3492920A4; JPWO2018021098A1; KR102194577B1; CN109477839A; EP3492920A1; US20190170762A1; JP6720311B2

Abstract

측정 방법이 다름으로 인해 측정치가 일치하지 않는 경우에 측정치를 일치시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 간편하면서도 저렴하게 단시간에 측정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법: A₁) 이하의 b), c) 및 e₀)∼h)를 포함하는 공정에 의해 회귀식 III을 결정하는 공정; b) 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)를 결정하는 공정; c) 2종 이상의 GA 인증 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 측정하는 공정; e₀) 절편을 제로로 하는 직선의 식 II₀을 작성하는 공정; f) 식 II₀을 이용하여, GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)를 2종 이상 결정하는 공정; g) GA값(F)을 2종 이상 결정하는 공정; 및 h) 회귀식 III을 작성하는 공정.

Description

당화알부민의 측정 방법

본 발명은, 당화알부민(GA)치의 측정 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 GA 인증치로 트레이스할 수 있는(Traceable) GA값의 측정 방법에 관한 것이다.

당뇨병을 진단 및 관리함에 있어서 매우 중요한 지표가 되는 당화단백질로서, 과거 약 1∼2개월의 평균 혈당치를 반영하는 헤모글로빈 A1c(HbA1C)이나, 보다 근래인 과거 약 2주간의 평균 혈당치를 반영하는 GA 등이 일상 검사에 도입되어 있다. 어느 당화단백질에나 복수의 측정 방법이 있으며, 각 방법에서 측정 대상이 다른 바, 값의 신뢰성 향상을 위해서 HbA1c의 측정법에 관해서는 국제임상화학연합(IFCC)에 의한 표준화가 이루어져, 세계에서 널리 이용되고 있는 NGSP값이 현재 일본 국내에서도 채용되고 있다.

한편, GA값의 측정에 관해서는 기준 측정법이 확립되어 있지 않아, 측정치의 트레이서빌리티(Traceability) 체계를 세울 수 없다고 하는 문제가 있었다. 그 때문에 일본임상화학회(JSCC)에 의해 「GA 측정의 표준법 확립」 프로젝트가 발족되고, 그 결과, 새롭게 개발된 동위체 희석 질량 분석법(ID-MS법)을 이용하는 GA 측정의 JSCC 권고법이 2008년에 발행되었다(비특허문헌 1). 또한, 이 JSCC 권고법에서의 표준화를 받아, 혈청 베이스의 인증 표준 물질도 2013년에 발매되었다(일본 사단법인 검사의학표준물질기구, 인증 표준물질명: 글리코알부민 측정용 상용 참조 표준물질: JCCRM611).

이와 같이, GA값의 표준화에서는, ID-MS법을 이용하는 JSCC 권고법이 기준법으로서 확립되어, 이러한 방법에 의한 측정치가 GA 인증치가 되지만, 임상 검사 현장에서는, GA값의 측정은, 간편하면서도 저렴한 정량 방법인, 흡광도 측정과 조합한 효소법에 의해 행해지고 있고(비특허문헌 1), 이 효소법에서는 효소법 독자의 검량 물질이 사용되고 있다(예컨대, 특허문헌 1∼2).

특허문헌 1 : WO2002/061119 특허문헌 2 : 일본 특허공개 2004-77457호 공보

비특허문헌 1 : 다케이(武井) 등, 임상화학, 2008, 37:178-191

GA값의 표준화가 확립됨으로써, 앞으로는 ID-MS법을 이용하는 JSCC 권고법에서의 측정에 의한 GA 측정치가 GA 인증치가 되지만, ID-MS법은 매우 시간이 걸리며 또한 고가의 기기도 필요한 측정 방법이다. 따라서, 임상 현장에서는 계속해서 흡광도 측정을 이용한 효소법에 의해서 GA값을 측정하고, 이 효소법에 의한 GA 측정치를, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 값으로 할 필요가 있다. 예컨대, ID-MS법으로 측정한 GA값이 인증치로서 정해진 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 효소법용 표준물질의 값과 연관시킨 트레이서빌리티 체계를 확립할 필요가 있다.

이 점, GA값의 표준화 과정에서, ID-MS법에 의해 얻어진 GA 인증치(mmol/mol)가, 효소법을 이용한 액체 크로마토그래피법(HPLC)의 값인 GA값(%), 즉, HPLC로 측정한 당화알부민 면적/알부민 면적(%)과 상관되는 것은 확인되었다(비특허문헌 1).

한편, 본 발명자는, 효소법에 의한 측정용의 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 흡광도 측정을 이용한 효소법에 의해, JSCC 권고법에서의 인증 표준물질(JCCRM 611)의 GA값(mmol/mol)을 측정한 바, 인증 표준물질에 기재된 GA 인증치와 반드시 일치하지는 않음을 알아냈다. 또한, 인증 표준물질의 GA 인증치의 레벨에 따라서, GA 인증치와, 흡광도 측정을 이용한 효소법에 의해 측정한 GA값(mmol/mol)의 괴리 정도가 다름을 알아냈다. 그 결과, 단순히 효소법용 표준물질을 이용하여 작성한 검량선에 기초하여, 상기 인증 표준물질(JCCRM 611)과 피험재료의 GA값을, 흡광도 측정을 이용한 효소법에 의해 측정하여, 인증 표준물질의 GA 인증치와 비교하더라도, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 피험재료의 GA값을 결정할 수 없음이 분명하게 되었다.

본 발명은 상기한 문제를 감안하여 이루어진 것으로, 측정 방법이 다름으로 인해 측정치가 일치하지 않는 경우에 측정치를 일치시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 또한 GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을, 간편하면서도 저렴하게 단시간에 측정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 상기한 불일치는, 효소법의 측정 대상물(GA를 프로테아제 분해하여 얻어지는 당화아미노산/당화펩티드)과, ID-MS법의 측정 대상물(GA를 가수분해하여 유리된 모든 「글루코오스가 결합한 리신 잔기(DOF-Lys)」)의 차이에 기인하는 것을 알아냈다. 프로테아제로는 모든 DOF-Lys 부위로 완전히 분해할 수 없기 때문에, ID-MS법과 효소법의 측정 대상 물질을 동일하게 하는 것은 매우 어렵다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는, ID-MS법으로 측정한 GA값이 인증치로서 정해진 인증 표준물질을 상위 기준으로 하여, 효소법 등에 의한 측정용 표준물질의 값과 연관시킨 트레이서빌리티 체계를 확립하고(도 1), 효소법에 의한 측정 대상물의 측정치를 ID-MS법에 의한 측정 대상물의 측정치와 일치시키는 방법을 알아냈다. 또한, 흡광도 측정을 이용한 효소법에 의해, 피험재료의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을, 간편하면서도 저렴하게 단시간에 측정하는 방법을 알아냈다. 즉 본 발명은 다음과 같다.

[1] 이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:

A₀)

피험재료의 GA값의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 인증치로,

피험재료의 GA 농도_[P]의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]로,

피험재료의 GA값의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 인증치로부터 피험재료에 설정한 GA값으로, 또는

피험재료의 GA 농도_[P]의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]로부터 피험재료에 설정한 GA 농도_[L]로

환산하기 위한 식을 결정하는 공정; 및

F₀)

GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]로부터 환산한 GA 농도_[P] 및 GA 인증 표준물질의 알부민 농도로부터 환산한 알부민 농도를 설정한 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 피험재료의 GA 농도_[P] 및 알부민 농도를 측정하고, 공정 A₀)에서 결정한 회귀식을 이용하여 GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 결정하는 공정

(상기 각 공정에 있어서, GA 농도_[L]는 글루코오스가 결합한 리신 잔기(DOF-Lys)의 농도이고, GA 농도_[P]는 당화아미노산 또는 당화펩티드의 농도이다).

[2] 이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:

A₁) 이하의 b), c) 및 e₀)∼h)를 포함하는 공정에 의해 회귀식 III을 결정하는 공정;

b) 이하의 식 1:

GA 농도_[L](A)

= GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)×GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C) (식 1)

을 이용하여, 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)를 결정하는 공정;

c) 2종 이상의 GA 인증 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 측정하는 공정;

e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:

D =α₀E (식 II₀)

을 작성하는 공정

(여기서, α₀은 임의의 플러스의 값이고, E는 GA 유래의 흡광도(D)과 비례하는 GA 농도_[P](E)이다);

f) 식 II₀을 이용하여, GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)를 2종 이상 결정하는 공정;

g) 이하의 식 2:

GA값(F)=GA 농도_[P](E)/알부민 농도(C) (식 2)

를 이용하여, GA값(F)을 2종 이상 결정하는 공정; 및

h) 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)와, 대응하는 2종 이상의 GA값(F)으로부터 회귀식 III:

B =γF+δ (회귀식 III)

을 작성하는 공정

[2-1] 식 II₀이 이하의 d) 및 e)를 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II인 [2]에 기재한 방법.

d) 2종 이상의 GA 유래의 흡광도(D)와 2종 이상의 GA 농도_[L](A)로부터 회귀식 I:

D =αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 공정;

e) 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D =αE (식 II)

를 작성하는 공정.

[2-2] 식 II₀이 이하의 e₁)을 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II₁인 [2]에 기재한 방법.

e₁) 절편을 제로로 하는 이하의 식 II₁:

D=α₁E (식 II₁)

을 작성하는 공정

(여기서, α₁=[공정 c)에 있어서 측정한 GA 인증 표준물질 중의 1종의 GA 인증 표준물질의 GA 유래의 흡광도(D)]/[공정 b)에 있어서 결정한 대응하는 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)]이다).

[3] 추가로 이하의 공정을 포함하는 [2]∼[2-2] 중 어느 것에 기재한 방법:

B) 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(G)를 측정하고, 식 II₀, 식 II 또는 식 II₁을 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](H)를 결정하는 공정; 및

C) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정함으로써 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정.

[4] 공정 C)가 이하의 공정 C1)∼C3)을 포함하는 [3]에 기재한 방법:

C1) GA 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(K)와 GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C)로부터 하기 식 3:

K=εC (식 3)

을 만족하는 ε를 결정하는 공정;

C2) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정하는 공정; 및

C3) 흡광도(I)로부터 식 3':

I=εJ (식 3')

을 이용하여 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정.

[5] 공정 b)에 앞서서, 이하의 공정 a1)∼a3):

a1) 이하의 식 4:

알부민 몰 인증치(L)

= 알부민 인증 표준물질의 알부민 인증치/알부민의 분자량 (식 4)

를 이용하여 알부민 몰 인증치(L)를 결정하는 공정;

a2) 알부민 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(M)를 측정하는 공정; 및

a3) 알부민 몰 인증치(L)와 흡광도(M)로부터, 하기 식 5:

M=θL (식 5)

를 만족하는 θ를 결정하는 공정

을 포함하고,

공정 C)가 이하의 공정 C2) 및 C4):

C4) 흡광도(I)로부터, 식 5':

I=θJ (식 5')

을 이용하여 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정

을 포함하는 [3]에 기재한 방법.

[6] 추가로 이하의 공정 F1)∼F4)를 포함하는 [2]∼[5] 중 어느 것에 기재한 방법:

F1) GA 인증 표준물질의 GA 유래의 흡광도(D)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 GA 농도_[P](N)를 결정하는 공정;

F2) 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(K)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 알부민 농도(O)를 결정하는 공정;

F3) 하기 식 6:

GA 인증 표준물질의 GA값(P)=GA 농도_[P](N)/알부민 농도(O) (식 6)

을 이용하여 GA값(P)을 결정하는 공정; 및

F4) GA값(P)과 상기 회귀식 III을 이용하여, 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값(Q)을 결정하는 공정.

[7] 이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:

A₂) 이하의 b), c), e₀), f) 및 i)를 포함하는 공정에 의해 회귀식 IV를 결정하는 공정;

b) 이하의 식 1:

GA 농도_[L](A)

e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:

D =α₀E (식 II₀)

을 작성하는 공정

(여기서, α₀은 임의의 플러스의 값이고, E는 GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다);

i) 2종 이상의 GA 농도_[L](A)와 GA 농도_[P](E)로부터 회귀식 IV:

A=κE+λ (회귀식 IV)

를 작성하는 공정

(상기 각 공정 중, GA 농도_[L]는 글루코오스가 결합한 리신 잔기(DOF-Lys)의 농도이고, GA 농도_[P]는 당화아미노산 또는 당화펩티드의 농도이다).

[7-1] 식 II₀이 이하의 d) 및 e)를 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II인 [7]에 기재한 방법.

D =αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 공정;

e) 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D =αE (식 II)

를 작성하는 공정.

[7-2] 식 II₀이 이하의 e₁)을 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II₁인 [7]에 기재한 방법.

e₁) 절편을 제로로 하는 이하의 식 II₁:

D =α₁E (식 II₁)

을 작성하는 공정

[8] 추가로 이하의 공정을 포함하는 [7]∼[7-2] 중 어느 것에 기재한 방법:

B) 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(G)를 측정하고, 식 II₀, 식 II 또는 식 II₁을 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](H)를 결정하는 공정;

[9] 추가로 이하의 공정을 포함하는 [7]∼[8] 중 어느 것에 기재한 방법:

F1) GA 인증 표준물질의 GA 유래의 흡광도(D)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 효소법에 의한 GA 농도_[P](N)를 결정하는 공정;

F5) GA 농도_[P](N)로부터 회귀식 IV를 이용하여 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](R)를 결정하는 공정; 및

F6) 하기 식 7:

GA 인증 표준물질의 GA값(Q₁') = GA 농도_[L](R)/알부민 농도(O) (식 7)

을 이용하여, 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값(Q₁')을 결정하는 공정.

[10] 이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:

A₃) 이하의 b)∼e₀) 및 j)∼o)를 포함하는 공정에 의해 회귀식 V를 결정하는 공정;

b) 이하의 식 1:

GA 농도_[L](A)

D =αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 공정;

e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:

D =α₀E (식 II₀)

을 작성하는 공정

(여기서, α₀는 임의의 플러스의 값이고, E는 GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다);

j) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA 유래의 흡광도(S)를 측정하고, 회귀식 I을 이용하여 대응하는 GA 농도_[L](T)를 결정하는 공정;

k) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 알부민 유래의 흡광도(U)를 측정하여, 알부민 농도(V)를 결정하는 공정;

l) 이하의 식 8:

GA값₁(W) = GA 농도_[L](T)/알부민 농도(V) (식 8)

을 이용하여, 2종 이상의 피험재료의 GA값₁(W)을 GA 농도_[L](T)로부터 결정하는 공정;

m) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA 유래의 흡광도(S)로부터, 식 II₀을 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](X)를 결정하는 공정;

n) 이하의 식 9:

GA값₂(Y) = GA 농도_[P](X)/알부민 농도(V) (식 9)

를 이용하여, 2종 이상의 피험재료의 GA값₂(Y)를 GA 농도_[P](X)로부터 결정하는 공정;

o) 2종 이상의 피험재료의 GA값₁(W)과 대응하는 2종 이상의 GA값₂(Y)로부터 회귀식 V:

W=πY+φ (회귀식 V)

를 작성하는 공정

[10-1] 식 II₀이 이하의 e)를 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II인 [10]에 기재한 방법.

e) 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D=αE (식 II)

를 작성하는 공정;

[10-2] 식 II₀이 이하의 e₁)을 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II₁인 [10]에 기재한 방법.

e₁) 절편을 제로로 하는 이하의 식 II₁:

D =α₁E (식 II₁)

을 작성하는 공정

[11] 추가로 이하의 공정을 포함하는 [10]∼[10-2] 중 어느 것에 기재한 방법:

[12] 추가로 이하의 공정을 포함하는 [10]∼[11] 중 어느 것에 기재한 방법:

F1') 피험재료의 GA 유래의 흡광도(S)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 GA 농도_[P](N')를 결정하는 공정;

F2') 공정 F1')에서 이용한 피험재료의 알부민 유래의 흡광도(U)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 알부민 농도(O')를 결정하는 공정; 및

F3') 하기 식 6':

피험재료의 GA값(P') = GA 농도_[P](N')/알부민 농도(O') (식 6')

을 이용하여 GA값(P')을 결정하는 공정.

F4') GA값(P')과 상기 회귀식 V를 이용하여, 공정 F1')에서 이용한 피험재료에 값 부여한 인증 GA값₁(W)로 트레이스할 수 있는 GA값(Q₂')을 결정하는 공정.

[13] 이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법

A₄) 이하의 b)∼e₀), j), m) 및 p)를 포함하는 공정에 의해 회귀식 VI을 결정하는 공정;

b) 이하의 식 1:

GA 농도_[L](A)

d) 2종 이상의 GA 유래의 흡광도(D)와 2종 이상의 GA 농도[L](A)로부터 회귀식 I:

D =αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 공정;

e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:

D =α₀E (식 II₀)

을 작성하는 공정

m) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA 유래의 흡광도(S)로부터, 식 II₀을 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](X)를 결정하는 공정; 및

p) 2종 이상의 피험재료의 GA 농도_[L](T)와 GA 농도_[P](X)로부터 회귀식 VI:

T = ψX+ω(회귀식 VI)

을 작성하는 공정

[13-1] 식 II₀이 이하의 e)를 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II인 [13]에 기재한 방법.

e) 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D =αE (식 II)

를 작성하는 공정.

[13-2] 식 II₀이 이하의 e₁)을 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II₁인 [13]에 기재한 방법.

e₁) 절편을 제로로 하는 이하의 식 II₁:

D =α₁E (식 II₁)

을 작성하는 공정

[14] 추가로 이하의 공정을 포함하는 [13]∼[13-2] 중 어느 것에 기재한 방법.

[15] 공정 b)에 앞서서, 추가로 이하의 공정 a1)∼a3):

a1) 하기 식 4:

알부민 몰 인증치(L)

를 이용하여 알부민 몰 인증치(L)을 결정하는 공정;

a2) 알부민 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(M)를 측정하는 공정;

a3) 알부민 몰 인증치(L)과 흡광도(M)로부터 하기 식 5:

M=θL (식 5)

를 만족하는 θ를 결정하는 공정;

을 포함하고, 공정 A₄)가 추가로 이하의 공정 k):

을 포함하고, 공정 A₄)가 공정 j) 및 k)보다 후에, 추가로 이하의 공정 l):

l) 이하의 식 8:

GA값₁(W) = GA 농도_[L](T)/알부민 농도(V) (식 8)

을 이용하여, 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA값₁(W)을 GA 농도_[L](T)로부터 결정하는 공정;

을 포함하고, 방법이 추가로 이하의 공정:

F1') 피험재료의 GA 유래의 흡광도(S)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 효소법에 의한 GA 농도_[P](N')를 결정하는 공정;

F2') 공정 F1')에서 이용한 피험재료의 알부민 유래의 흡광도(U)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 알부민 농도(O')를 결정하는 공정;

F5') GA 농도_[P](N')로부터 회귀식 VI을 이용하여, 피험재료의 GA 농도_[L](R')를 결정하는 공정; 및

F6') 하기 식 7':

피험재료의 GA값(Q₃') = GA 농도_[L](R')/알부민 농도(O') (식 7')

을 이용하여, 공정 F1')에서 이용한 피험재료에 설정한 GA 인증치₁(W)로 트레이스할 수 있는 GA값(Q₃')을 결정하는 공정;

을 포함하는 [13]∼[14] 중 어느 것에 기재한 방법.

[16] 3종 이상의 GA 인증 표준물질을 이용하는 [1]∼[15] 중 어느 것에 기재한 방법.

[17] 상기 GA 인증치가 동위체 희석 질량 분석(ID-MS)법에 의한 GA 인증치인 [1]∼[16] 중 어느 것에 기재한 방법.

[18] 상기 GA 인증치가 동위체 희석 질량 분석(ID-MS)법에 의한 GA 인증치이고, 상기 GA 인증 표준물질이 JCCRM 611인 [1]∼[16] 중 어느 것에 기재한 방법.

[19] [2], [2-1] 또는 [2-2]의 방법으로 결정된 회귀식 III, [7], [7-1] 또는 [7-2]의 방법으로 결정된 회귀식 IV, [10], [10-1] 또는 [10-2]의 방법으로 결정된 회귀식 V 및 [13], [13-1] 또는 [13-2]의 방법으로 결정된 회귀식 VI으로 이루어지는 군에서 선택되는 회귀식;

GA 측정용 시약;

알부민 측정용 시약; 및

표준물질

을 포함하는 GA값 측정용 키트.

[20]

[2], [2-1] 또는 [2-2]의 방법으로 결정된 식 III, [7], [7-1] 또는 [7-2]의 방법으로 결정된 식 IV, [10], [10-1] 또는 [10-2]의 방법으로 결정된 식 V 및 [13], [13-1] 또는 [13-2]의 방법으로 결정된 식 VI으로 이루어지는 군에서 선택되는 식이 설정된 연산부;

식 II₀, 식 II 또는 식 II₁에 의해서 GA 농도_[P]가 설정된 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하는 검량선 작성부, 혹은 식 II₀, 식 II 또는 식 II₁이 연산에 들어가 있는 검량선 작성부; 및

GA값을 측정하는 측정부

를 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 장치.

[21] 이하의 1) 표준물질과 2) 연산 프로그램을 이용하는 것을 특징으로 하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:

1) 상기 공정 e₀)에서 작성된 식 II₀, 공정 e)에서 작성된 식 II 또는 공정 e₁)에서 작성된 식 II₁에 의해서 GA 농도_[P]가 설정된 표준물질; 및

2) [2], [2-1] 또는 [2-2]의 방법으로 결정된 식 III, [7], [7-1] 또는 [7-2]의 방법으로 결정된 식 IV, [10], [10-1] 또는 [10-2]의 방법으로 결정된 식 V 및 [13], [13-1] 또는 [13-2]의 방법으로 결정된 식 VI으로 이루어지는 군에서 선택되는 식이 들어간 연산 프로그램.

또한, 상기 [2]∼[5]와 같이 인용하는 항 번호가 범위에서 표시되고, 그 범위 내에 [2-2] 등의 가지번호를 갖는 항이 배치되어 있는 경우에는, [2-2] 등의 가지번호를 갖는 항도 인용되는 것을 의미한다.

본 발명에 의하면, 측정 방법이 다름으로 인해 측정치가 일치하지 않는 경우에 측정치를 일치시키는 방법을 제공할 수 있다. 예컨대, 간편하면서도 저렴하고 단시간에 측정 가능한 효소법을 이용하여, 피험재료의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 측정하는 것이 가능하게 된다. 본 발명에 의하면, 또한, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을, 간편하면서도 저렴하게 단시간에 측정하는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 실시형태의 일 양태에 있어서 확립한 트레이서빌리티 체계도이다.
도 2는 실시예 1에 있어서 알부민 인증 표준물질의 단위 환산 후의 알부민 몰 인증치(L)을 횡축, 알부민 유래의 흡광도(M)를 종축에 플롯한 회귀직선식(식 5)이다.
도 3은 실시예 1에 있어서 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](A)를 횡축, 당화알부민 유래의 흡광도(D)를 종축에 플롯한 회귀직선식(I)이다.
도 4는 실시예 2에 있어서 회귀직선식(I)을 절편이 0이 되도록 평행 이동한 직선식(II)이다.
도 5는 실시예 2에 있어서 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 인증치(B)를 종축, 당화알부민치(F)를 횡축에 플롯한 회귀직선식(III)이다.
도 6은 실시예 3에 있어서 당화알부민 인증 표준물질의 알부민 농도(C)를 횡축, 알부민 흡광도(K)를 종축에 플롯한 회귀직선식(식 3)이다.
도 7은 실시예 6에 있어서 회귀직선식(I)을, 실시예 1에서 얻어진 당화알부민 인증 표준물질 HH의 당화알부민 농도_[L](A) 330.0 μmol/L을 기준으로 절편이 0이 되도록 기울기를 변경한 직선식(II_(d))이다.
도 8은 실시예 6에 있어서 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 인증치(B)를 종축, 당화알부민치(F_(d))를 횡축에 플롯한 회귀직선식(III_(d))이다.
도 9는 실시예 9에 있어서 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](A)를 종축, 당화알부민 농도_[P](E)를 횡축에 플롯한 회귀직선식(IV)이다.
도 10은 실시예 10에 있어서 피험재료의 당화알부민치(W)(설정치)를 종축, 당화알부민치(Y)를 횡축에 플롯한 회귀직선식(V)이다.
도 11은 실시예 11에 있어서 피험재료의 당화알부민 농도_[L](T)를 종축, 당화알부민 농도_[P](X)를 횡축에 플롯한 회귀직선식(VI)이다.
도 12는 실시예 12에 있어서 저값(L) 및 고값(H) 표준물질의 당화알부민 농도_[L](T-2)를 횡축, 당화알부민 유래의 흡광도(S-2)를 종축에 플롯한 회귀직선식(I-2)이다.
도 13은 실시예 12에 있어서 회귀직선식(I-2)을 절편이 0이 되도록 평행 이동한 직선식(II-2)이다.
도 14는 실시예 12에 있어서 저값(L) 및 고값(H) 표준물질의 당화알부민치(W-2)(설정치)를 종축, 당화알부민치(Y-2)(측정치)를 횡축에 플롯한 회귀직선식(III-2)이다.
도 15는 실시예 13에 있어서 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](A_(a))를 횡축, 당화알부민 유래의 흡광도(D_(a))를 종축에 플롯한 회귀직선식(I_(a))이다.
도 16은 실시예 13에 있어서 회귀직선식(I_(a))을 절편이 0이 되도록 평행 이동한 직선식(II_(a))이다.
도 17은 실시예 13에 있어서 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 인증치(B)를 종축, 당화알부민치(F_(a))를 횡축에 플롯한 회귀직선식(III_(a))이다.
도 18은 실시예 14에 있어서 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](A_(b))를 횡축, 당화알부민 유래의 흡광도(D_(b))를 종축에 플롯한 회귀직선식(I_(b))이다.
도 19는 실시예 14에 있어서 회귀직선식(I_(b))을 절편이 0이 되도록 평행 이동한 직선식(II_(b))이다.
도 20은 실시예 14에 있어서 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 인증치(B)를 종축, 당화알부민치(F_(b))를 횡축에 플롯한 회귀직선식(III_(b))이다.

이하, 본 발명의 실시형태(「본 실시형태」라고도 함)에 기초하여 본 발명에 관해서 상세히 설명한다. 이하의 실시형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명을 이 실시형태에만 한정한다는 취지가 아니다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태의, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법은, 회귀식 III을 결정하는 공정(A₁)을 포함한다.

본 실시형태에 있어서, 당화알부민(GA. 글리코알부민이라고도 함)이란, 이하에 상세히 설명하는 JSCC 권고법에 의해 정의되는, 「글루코오스가 결합한 리신 잔기, (Nε-(1-데옥시-D-프룩토오스-1-일)-L-리신, DOF-Lys)를 갖는 알부민」이다.

본 실시형태에 있어서 GA값이란, JSCC 권고법에 의해 정의되는 「알부민의 DOF-Lys와 알부민의 몰비」이다. GA값의 단위는 mmol/mol이며, 하기 식으로 산출할 수 있다.

GA값 = GA 농도/알부민 농도

여기서, GA 농도에 관해서는, 측정 원리의 차이에서, 효소법을 이용하여 측정한 경우의 GA 농도는 당화아미노산 혹은 당화펩티드의 농도를 가리키며, 본 실시형태에 있어서 GA 농도_[P]라고 하는 경우가 있다. 한편, ID-MS법을 이용하여 측정한 경우의 GA 농도는 DOF-Lys 농도를 가리키며, 본 실시형태에 있어서 GA 농도_[L]라고 하는 경우가 있다.

본 실시형태에 있어서 인증치란, 인증 표준물질에 표시된 값이며, 표준 측정 조작법을 이용하여 측정된다. 예컨대 GA 인증치란 GA 인증 표준물질에 표시된 값이다. 본 실시형태의 바람직한 양태에 있어서, GA 인증치란 ID-MS법에 의한 GA 인증치를 가리키며, 비특허문헌 1에 기재된 방법(JSCC 권고법)으로 값 부여된 인증 완료된 GA값을 가리킨다.

본 실시형태에 있어서 GA 측정의 JSCC 권고법이란, 비특허문헌 1에 기재된 방법을 가리키며, 혈청 알부민 분획을 가수분해하여 유리된 모든 DOF-Lys 및 리신을 ID-MS로 동시에 측정하는 GA 측정법이다. JSCC 권고법에 의한 GA값 측정은, 고가의 시약 및 LC-MS를 사용하고, 1회의 측정에 수일을 필요로 하는 매우 복잡한 측정 방법이다. 이것은, GA 중 59개의 리신 잔기 전부에 글루코오스가 결합하여 DOF-Lys를 형성하는 것이 아니라, 알부민의 펩티드 결합을 가수분해하는 조건 하에서 DOF-Lys도 분해하여 버리기 때문에, DOF-Lys의 안정화나 내부 표준물질로서의 DOF-Lys의 안정 동위체의 사용이 필요하게 되기 때문이다.

본 실시형태에 있어서 「인증 표준물질」이란, JIS Q 0030으로 정의되는 것과 같이, 「인증서가 붙은 표준물질이며, 하나 이상의 특성치가 그 특성치를 나타내는 단위를 정확한 현시(現示)로의 트레이서빌리티가 확립된 수순에 의해서 인증되고, 각 인증치에는 어느 표기된 신뢰 수준에서의 불확실성이 붙어 있는 것」을 가리킨다.

본 실시형태에 있어서 「GA 인증 표준물질」이란, 당화알부민을 측정하기 위한 인증 표준물질이며, 예컨대 일본의 일반 사단법인 검사의학표준물질기구가 제공하고 있는 글리코알부민 측정용 상용 참조 표준물질(JCCRM 611. M, H, HH의 3종의 다른 농도 레벨이 존재함)을 들 수 있다. 또한, 지역, 사용시의 기술 수준에 따라 그 기술 분야에서 약속된 당화알부민을 측정하기 위한 인증 표준물질이라도 좋다. 본 실시형태의 바람직한 양태에서는, GA 인증 표준물질로서 3종 이상의 GA 인증 표준물질을 이용할 수 있다. 예컨대, 3종의 다른 농도 레벨의 JCCRM 611인 M, H 및 HH를 이용할 수 있다.

본 실시형태에 있어서 「알부민 인증 표준물질」이란, 알부민을 측정하기 위한 인증 표준물질이며, 알부민이 포함되고, 알부민의 인증치가 설정되어 있는 인증 표준물질이라면 특별히 한정되지 않는다. 예컨대 일본의 일반 사단법인 검사의학표준물질기구가 제공하고 있는, IFCC 혈장단백 국제 표준물질(ERM-DA 470k/IFCC), 알부민 측정용 상용 참조 표준물질 JCCRM613-1 등을 들 수 있다. 또한, 지역, 사용시의 기술 수준에 따라 그 기술 분야에서 약속된 알부민을 측정하기 위한 인증 표준물질이라도 좋다.

본 실시형태에 있어서 「트레이스할 수 있는」「트레이스할 수 있게 되는」이란, JIS Q 0030에서 정의되어 있는 것과 같이, 「불확실성이 모두 표기된, 중단 없는 비교의 연쇄를 통하여, 통상은 국가 표준 또는 국제 표준인 정해진 표준에 관련될 수 있는 측정 결과 또는 표준의 값의 성질이 되는」것을 가리킨다. 본 실시형태의 일 양태에 있어서, 소정의 측정 결과가 트레이스할 수 있게 된다는 것은, ±5%의 범위에서 측정 결과가 인증 표준물질의 인증치에 링크하는 것을 말한다.

본 실시형태의 일 양태에 있어서, 회귀식 III을 결정하는 공정은 이하의 공정 b)∼h)를 포함한다.

공정 b)는, 식 1(GA 농도_[L](A) = GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)×GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C))을 이용하여, 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)를 결정하는 공정이다. 여기서, GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C)는 임의의 방법으로 측정 또는 결정할 수 있으며, 예컨대 효소법 등을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, GA 인증 표준물질의 인증서에 기재된 알부민 농도를 참고치로서 이용하여 공정 b)를 실시하는 것도 가능하다.

공정 c)는, 2종 이상의 GA 인증 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 측정하는 공정이다. 또한, GA 유래의 흡광도란, GA 측정용 시약 등에 의해서 얻어지는 GA에 기초한 흡광도이고, 실제로 피험재료를, GA 측정용 시약 등을 이용하여 측정했을 때에 얻어진 흡광도로부터 블랭크 흡광도를 뺀 값이나, HPLC 등으로 GA를 분리하여 GA 측정용 시약 등에 의해서 측정되는 흡광도이다.

흡광도의 측정은 공지된 임의의 수법을 이용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 일본 특허공개 2001-54398호 공보 등에 기재된 방법을 참조하여 GA의 측정용 시약을 이용하여 실시할 수 있다. GA의 측정용 시약으로서는, 산화 효소, 분해 효소, 발색제 등을 포함하고, GA를 산화/분해하는 등 하여 과산화수소를 생기게 하고, 그 과산화수소와 반응한 발색제의 흡광도를 측정하여 GA 농도를 측정할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. GA의 측정용 시약은, 후술하는 표준물질을 포함하여도 좋고, 희석액, 안정화제 등의 다른 성분을 포함하여도 좋다. 또한, 각 성분이 각각 다른 용기에 수용되어 있어도 좋다. 시약의 구체예에 관해서는 후술하는 실시예를 참조할 수 있으며, 예컨대, GA 시약 루시카(등록상표) GA-L 등을 이용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

공정 d)는, 2종 이상의 GA 유래의 흡광도(D)와 2종 이상의 GA 농도_[L](A)로부터 회귀식 I:

D=αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 공정이다. 공정 d)는, 예컨대 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 2종 이상의 GA 유래의 흡광도(D)를 종축에, 2종 이상의 GA 농도_[L](A)를 횡축에 플롯하여 회귀직선식을 설정함으로써 실시할 수 있다.

공정 e₀)은 절편을 제로로 하는 직선식 II₀:

D=α₀E (식 II₀)

을 작성하는 공정이다. 여기서, E는 GA 유래의 흡광도 D와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다. 공정 e₀)은 임의의 플러스의 기울기 α₀를 설정함으로써 실시할 수 있다. 또한, 공정 e₀)은 공정 c)를 실시한 후에 공정 d)를 행하지 않고서 실시할 수 있다.

공정 e)는, 공정 e₀)에 있어서의 기울기 α₀의 식 II₀으로서, 공정 d)에서 얻어진 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D=αE (식 II)

을 작성하는 공정이다. 여기서, E는 GA 유래의 흡광도 D와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다.

공정 e₁)은, 공정 e₀)에 있어서의 기울기 α₀의 식 II₀으로서, 공정 c)에 있어서 측정한 2종 이상의 GA 인증 표준물질 중의 1종의 GA 인증 표준물질의 GA 유래의 흡광도(D)와, 공정 b)에 있어서 결정한 대응하는 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)로부터 설정되는 점 및 원점의 2점을 지나는, 절편을 제로로 하는 식 II₁:

D=α₁E (식 II₁)

을 작성하는 공정이다. 여기서, 기울기 α₁은 [공정 c)에 있어서 측정한 GA 인증 표준물질 중의 1종의 GA 인증 표준물질의 GA 유래의 흡광도(D)]/[공정 b)에 있어서 결정한 대응하는 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)]이고, E는 GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다.

공정 e₁)은, 예컨대 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, GA 인증 표준물질 HH에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 종축에, 대응하는 GA 농도_[L](A)를 횡축에 플롯하여, 이 점과 원점의 2점을 지나는 직선식을 설정함으로써 실시할 수 있다.

공정 f)는, 식 II₀을 이용하여, GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)를 2종 이상 결정하는 공정이다. 공정 c)에 있어서 측정한 GA 유래의 흡광도(D)로부터, 식 II₀을 이용하여, 즉 D=α₀E의 식에 의해, 대응하는 GA 농도_[P](E)를 결정할 수 있다.

공정 g)는, 식 2(GA값(F) = GA 농도_[P](E)/알부민 농도(C))를 이용하여, GA값(F)을 2종 이상 결정하는 공정이다. 이 때, GA값의 단위를 mmol/mol로 하기 위해서 적절하게 단위 맞춤을 하여도 좋다. 예컨대, GA 농도_[P](μmol/L)를 알부민 농도(μmol/L)로 나누는 경우, 1000을 곱해 단위 맞춤을 할 수 있다.

공정 h)는, 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)와, 대응하는 2종 이상의 GA값(F)으로부터 회귀식 III:

B=γF+δ (회귀식 III)

을 작성하는 공정이다. 공정 h)는, 예컨대 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)를 종축에, 대응하는 2종 이상의 GA값(F)을 횡축에 플롯하여, 회귀직선식을 설정함으로써 실시할 수 있다.

이와 같이 회귀식 III을 설정함으로써, GA 인증 표준물질의 GA 인증치와, GA 인증 표준물질을 효소법으로 측정한 경우의 GA값을 상관시킬 수 있다.

본 실시형태의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법은, 추가로 이하의 공정 B) 및 C):

C) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정함으로써 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정

을 포함할 수 있다. 이들 공정에 의해, 인증치로부터 환산한 농도를 표준물질에 값 부여할 수 있다. 여기서, 알부민 유래의 흡광도란, 알부민 측정용 시약 등에 의해서 얻어지는 알부민에 기초한 흡광도이며, 실제로 피험재료를, 알부민 측정용 시약을 이용하여 측정했을 때에 얻어진 흡광도로부터 블랭크 흡광도를 뺀 값이나, HPLC 등으로 알부민을 분리하여 알부민 측정용 시약 등에 의해서 측정되는 흡광도이다.

본 실시형태에 있어서 「표준물질」이란, JIS Q 0035:2008에서 정의되는 것과 같이 「하나 이상의 규정 특성에 관해서, 충분히 균질하고 또한 안정적이며, 측정 프로세스에서의 사용 목적에 적합하도록 제작된 물질」을 가리킨다. 표준물질은, 교정 시료, 칼리브레이터, 검량선 작성용 물질이라고도 불리며, 검량선을 작성할 때에 이용하는 물질이다. 예컨대, 상기 공정 B) 및 C)에서 이용하는 표준물질로서, 효소법에 의해 GA 농도 및 알부민 농도를 측정할 때의 표준물질을 이용할 수 있다. 그와 같은 표준물질로서는, 예컨대 GA-L 칼리브레이터(아사히가세이파마(주)), 칼리브레이터(베이징스트롱바이오테크놀로지유한회사), Glycated albumin Calibrator(IVDLab CO., LTD), Glycated Serum Protein Assay Calibrators(Diazyme Laboratories) 및 당화백단백(糖化白蛋白) 칼리브레이터(닝보메디칼시스템바이오테크놀로지유한회사) 등을 들 수 있다.

공정 B)에 있어서, GA 유래의 흡광도(G)의 측정은 상기 공정 c)를 참조하여 실시할 수 있다. 측정한 흡광도(G)로부터, 식 II₀, 식 II 또는 식 II₁을 이용하여, 즉, G=α₀H, G=αH 또는 G=α₁H의 식에 의해, 대응하는 GA 농도_[P](H)를 결정할 수 있다.

공정 C)에 있어서, 알부민 유래의 흡광도(I)의 측정은 공지된 임의의 수법을 이용하여 실시할 수 있다. 예컨대 일본 특허공개 2009-159989호 공보 등에 기재된 방법을 참조하여 알부민의 측정용 시약을 이용하여 실시할 수 있다. 알부민의 측정용 시약으로서는, 색소 등을 포함하고, 알부민과 색소가 결합함으로써 생기는 색소 결합체의 흡광도를 측정하여, 알부민 농도를 측정할 수 있는 것이면 된다. 알부민의 측정용 시약은, 상기한 표준물질을 포함하여도 좋고, 희석액, 안정화제 등의 다른 성분을 포함하여도 좋다. 알부민의 측정 방법으로서는 예컨대 BCG법, BCP법, 개량 BCP법 등을 들 수 있다. BCG법이란, 알부민과 브로모크레졸 그린(BCG)이 결합한 색소 결합체를 생성하는 측정 원리를 이용한 측정 방법이다. BCP법이란, 알부민과 브로모크레졸 퍼플(BCP)이 결합한 색소 결합체를 생성하는 측정 원리를 이용한 측정 방법이다. BCG법과 비교하여 글로불린에 대한 특이성이 낮은 것을 특징으로 한다. 개량 BCP법이란, 상기 BCP법을 기본 원리로 하고, 오차의 요인인 SH기를 갖는 인간 머캅토알부민(HMA)의 영향을 피하기 위해서, 도데실황산나트륨(SDS) 및 5,5'-디티오비스(2-니트로안식향산)(DTNb)를 시약으로서 포함하는 방법을 말한다. 색소는, 브로모크레졸 퍼플, 브로모크레졸 그린 등 알부민과 결합하는 색소라면 어느 것을 이용하여도 좋다. 시약의 구체예에 관해서는 후술하는 실시예를 참조할 수 있으며, 예컨대 개량 BCP법에 의한 알부민 측정 시약인 루시카(등록상표) GA-L, BCG법에 의한 알부민 측정 시약인 당화백단백 측정 키트(베이징스트롱바이오테크놀로지유한회사) 및 Glycated serum albumin(IVDLab CO., LTD) 등을 이용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

일 양태에 있어서, 공정 C)는 이하의 공정 C1)∼C3):

K =εC (식 3)

을 만족하는 ε를 결정하는 공정;

C3) 흡광도(I)로부터, 식 3':

I =εJ (식 3')

을 이용하여 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정

을 포함하며, 이에 따라 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정할 수 있다.

공정 C1)에 있어서의 GA 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(K) 및 C2) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)는 공정 C)를 참조하여 측정할 수 있다.

다른 양태에 있어서, 본 실시형태의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법은, 공정 b)에 앞서서, 이하의 공정 a1)∼a3):

a1) 이하의 식 4:

알부민 몰 인증치(L)

를 이용하여 알부민 몰 인증치(L)을 결정하는 공정;

a3) 알부민 몰 인증치(L)과 흡광도(M)로부터 하기 식 5:

M = θL (식 5)

를 만족하는 θ를 결정하는 공정

을 포함하고,

공정 C)가 이하의 공정 C2) 및 C4):

C4) 흡광도(I)로부터 식 5':

I = θJ (식 5')

을 이용하여 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정;

을 포함하며, 이에 의해 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정할 수 있다.

공정 a1)은 후술하는 실시예를 참조하여 실시할 수 있으며, 예컨대, 알부민 인증 표준물질의 알부민 인증치(g/dL)를 알부민의 분자량으로 나눠, 알부민 몰 인증치(μmol/L)를 결정할 수 있다. 공정 a2) 및 C2)는 상기 공정 C)를 참조하여 실시할 수 있다. 알부민의 분자량은 약 66000이며, 보다 구체적으로는 공지된 문헌에 기재된 분자량을 이용할 수 있고, 예컨대(Geisow MJ et. Al. In: Villafranca JJ, ed. Techniques in proteinchemistry. San Diego, CA: Academic Press, 1991: 576-572)에 기재된 66438을 이용하여도 좋다.

본 실시형태의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법은, 추가로 이하의 공정 F1)∼F4):

F3) 하기 식 6:

GA 인증 표준물질의 GA값(P) = GA 농도_[P](N)/알부민 농도(O) (식 6)

을 이용하여 GA값(P)를 결정하는 공정; 및

F4) GA값(P)과 상기 회귀식 III을 이용하여, 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값(Q)을 결정하는 공정

을 포함할 수 있다. 이들 공정에 의해, 표준물질을 이용한 검량선으로 인증 표준물질을 측정하여 환산함으로써 인증치를 산출할 수 있음을 확인할 수 있다.

공정 F1) 및 F3)에 있어서의 표준물질은, 특별히 한정되지 않지만, 본 실시형태의 방법에 있어서, 공정 B) 및 C)와 공정 F1) 및 F2)를 함께 실시하는 경우, 공정 B) 및 C)에서 이용하는 표준물질과 공정 F1) 및 F2)에서 이용하는 표준물질은 동일하다.

공정 F1)에 있어서의 검량선의 작성은, GA 농도_[P]가 규정된 표준물질에 관해서, 공정 c)의 방법과 마찬가지로 GA 유래의 흡광도를 측정하여 실시할 수 있다.

공정 F2)에 있어서의 검량선의 작성은, 알부민 농도가 규정된 표준물질에 관해서, 공정 C)의 방법과 마찬가지로 알부민 유래의 흡광도를 측정하여 실시할 수 있다.

공정 F3)에서는, 공정 F1)에서 결정한 GA 농도_[P](N)를, 공정 F2)에서 결정한 알부민 농도(O)로 나눔으로써, GA 인증 표준물질의 GA값(P)을 결정한다. 이 때, GA값의 단위를 mmol/mol로 하기 위해서 적절하게 단위 맞춤을 하여도 좋다. 예컨대, GA 농도_[P](μmol/L)를 알부민 농도(μmol/L)로 나누는 경우, 1000을 곱해 단위 맞춤을 할 수 있다.

또한 공정 F4)에서, GA값(P), 회귀식 III을 이용하여, 즉, Q=γP+δ에 적용함으로써, 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값(Q)을 결정할 수 있다. 공정 F4)에서 얻어진 GA값(Q)이, 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 인증치와 일치하는 것을 확인함으로써, 회귀식 III을 이용하여 GA값의 트레이서빌리티 체계가 확립되었음을 확인할 수 있다. 즉, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을, 회귀식 III과 효소법을 이용하여 간편하게 측정할 수 있다는 것이 확인된다.

상기한 각 공정은, 각각의 공정에 있어서 필요한 측정치, 회귀식 등을 얻을 수 있는 한, 순서 무관으로 실시할 수 있다. 예컨대, 공정 b)와 c)는 순서 무관으로 실시할 수 있고, 공정 B)와 C)는 순서 무관으로 실시할 수 있고, 공정 F1)과 F2)는 순서 무관으로 실시할 수 있다.

본 실시형태의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법은, 공정 b)에 앞서서, 추가로 이하의 공정 a): 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(Z)를 측정함으로써 알부민 농도(C)를 결정하는 공정을 포함할 수 있다.

공정 a)는 상기 공정 C)를 참조하여 실시할 수 있으며, 예컨대 BCG법, BCP법 또는 개량 BCP법을 이용하여 실시할 수 있다.

일 양태에 있어서, 공정 a)는, 이하의 공정 a1)∼a5):

a1) 이하의 식 4:

알부민 몰 인증치(L)

를 이용하여 알부민 몰 인증치(L)을 결정하는 공정;

a3) 알부민 몰 인증치(L)과 흡광도(M)로부터 하기 식 5:

M = θL (식 5)

를 만족하는 θ를 결정하는 공정;

a4) 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(Z)를 측정하는 공정; 및

a5) 흡광도(Z)로부터 하기 식 5'':

Z = θC (식 5'')

을 이용하여 알부민 농도(C)를 결정하는 공정

을 포함할 수 있다.

공정 a1)∼a3)은 상술한 대로 실시할 수 있다. 공정 a4)는 공정 C)를 참조하여 실시할 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, 공정 A₂)를 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다. 공정 A₂)는 이하의 공정 b), c), e₀), f) 및 i)를 포함하며, 회귀식 IV를 결정하는 공정이다.

b) 이하의 식 1:

GA 농도_[L](A) = GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)×GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C) (식 1)

e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:

D =α₀E (식 II₀)

을 작성하는 공정

f) 식 II₀을 이용하여, GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)를 2종 이상 결정하는 공정; 및

i) 2종 이상의 GA 농도_[L](A)와 GA 농도_[P](E)로부터 회귀식 IV:

A = κE+λ (회귀식 IV)

를 작성하는 공정.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, 공정 A₂)에 포함되는 공정 e₀) 및 공정 f)에 있어서의 식 II₀이, 이하의 공정 d) 및 공정 e)를 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II인, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다.

D =αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 공정;

e) 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D =αE (식 II)

를 작성하는 공정.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, 공정 A₂)에 포함되는 공정 e₀) 및 공정 f)에 있어서의 식 II₀이, 이하의 공정 e₁)을 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II₁인, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다.

e₁) 절편을 제로로 하는 이하의 식 II₁:

D=α₁E (식 II₁)

을 작성하는 공정

공정 b), c), d), e₀), e), e₁) 및 f)는 상술한 것과 같이 실시할 수 있다.

공정 i)는, 예컨대 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 2종 이상의 GA 농도_[L](A)를 종축에, 2종 이상의 GA 농도_[P](E)를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식을 설정함으로써 실시할 수 있다.

이와 같이 회귀식 IV를 설정함으로써, GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]와, GA 인증 표준물질을 효소법으로 측정한 경우의 GA 농도_[P]를 상관시킬 수 있고, 이 회귀식 IV와 알부민 농도의 측정치를 이용하여, GA 인증 표준물질의 GA 인증치와, GA 인증 표준물질을 효소법으로 측정한 경우의 GA값을 상관시킬 수 있다.

상기한 회귀식 IV를 작성하는 공정을 포함하는 본 실시형태의 방법은, 공정 b)에 앞서서, 상술한: 공정 a); 공정 a1)∼a5); 또는 공정 a1)∼a3)과 공정 C2) 및 C4)를 실시할 수도 있다.

상기한 회귀식 IV를 작성하는 공정을 포함하는 본 실시형태의 방법은, 추가로 이하의 공정 B) 및 C)를 포함할 수 있다.

C) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정함으로써, 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정.

공정 B) 및 C)는 상술한 것과 같이 실시할 수 있다. 이들 공정에 의해, 인증치로부터 환산한 농도를 표준물질에 값 부여할 수 있다.

상기한 회귀식 IV를 작성하는 공정을 포함하는 본 실시형태의 방법은, 추가로 이하의 공정 F1), F2), F5) 및 F6)을 포함할 수 있다. 이들 공정에 의해, 표준물질을 이용한 검량선으로 인증 표준물질을 측정하고 환산하여 인증치를 산출할 수 있음을 확인할 수 있다.

F6) 하기 식 7:

공정 F1) 및 F2)은 상술한 것과 같이 실시할 수 있다.

공정 F5)에 있어서, 공정 F1)에서 얻은 GA 농도_[P](N)로부터 회귀식 IV를 이용하여, GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](R)를 결정하고, 추가로 공정 F6)에 있어서 GA 인증 표준물질의 GA값(Q₁')을 결정할 수 있다. 또한, 공정 F6)에 있어서, GA값의 단위를 mmol/mol로 하기 위해서 적절하게 단위 맞춤을 하여도 좋다. 예컨대, GA 농도_[P](μmol/L)를 알부민 농도(μmol/L)로 나누는 경우, 1000을 곱해 단위 맞춤을 할 수 있다.

공정 F5)에서 얻어진 GA값(Q₁')이, 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 인증치와 일치하는 것을 확인함으로써, 회귀식 IV를 이용하여 GA값의 트레이서빌리티 체계가 확립되었음을 확인할 수 있다. 즉, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을, 회귀식 IV와 효소법을 이용하여 간편하게 측정할 수 있다는 것이 확인된다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, 공정 A₃)을 포함하는 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다. 공정 A₃)은 이하의 공정 b)∼e₀) 및 j)∼o)를 포함하며, 회귀식 V를 결정하는 공정이다.

b) 이하의 식 1:

GA 농도_[L](A)

D =αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 공정;

e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:

D =α₀E (식 II₀)

을 작성하는 공정

k) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 알부민 유래의 흡광도(U)를 측정하여 알부민 농도(V)를 결정하는 공정;

l) 이하의 식 8:

GA값₁(W) = GA 농도_[L](T)/알부민 농도(V) (식 8)

n) 이하의 식 9:

GA값₂(Y) = GA 농도_[P](X)/알부민 농도(V) (식 9)

W = πY+φ (회귀식 V)

를 작성하는 공정.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, 공정 A₃)에 포함되는 공정 e₀) 및 공정 m)에 있어서의 식 II₀이, 하기에 나타내는 공정 e)를 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II인, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다.

e) 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D =αE (식 II)

를 작성하는 공정

(여기서, E는 GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다).

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, 공정 A₃)에 포함되는 공정 e₀) 및 공정 m)에 있어서의 식 II₀이, 하기에 나타내는 공정 e₁)을 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II₁인, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다.

e₁) 절편을 제로로 하는 이하의 식 II₁:

D =α₁E (식 II₁)

을 작성하는 공정

공정 b)∼d), e₀), e) 및 e₁)은 상술한 것과 같이 실시할 수 있다.

공정 j) 및 k)는 공정 B) 및 C)를 참조하여 실시할 수 있다. 또한, 본 실시형태에 있어서 「피험재료」는, 당화알부민을 함유하는 한 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것을 이용하여도 좋지만, 바람직하게는, 혈액 유래 성분, 예컨대 혈청, 혈장, 전혈, 혈액 성분을 가공하여 얻어진 것 등을 이용할 수 있다. 구체예로서는, 건강한 일반인 검체, 환자 검체, GA-L 관리 혈청(아사히가세이파마(주)), GA-L 칼리브레이터(아사히가세이파마(주)) 등을 들 수 있다.

공정 l)∼n)은, 각 공정의 수순에 따라서, 후술하는 실시예도 참조하여 실시할 수 있다. 공정 o)는, 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 2종 이상의 GA값₁(W)을 종축에, 대응하는 2종 이상의 GA값₂(Y)를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식을 설정함으로써 실시할 수 있다.

이 방법에 의하면, 회귀식 I을 경유하여 임의의 피험재료의 GA값₁(W)을 설정하고, 효소법 유래의 피험재료의 GA값₂(Y)와, 회귀식 V로 상관시킬 수 있다.

또한, 상기한 공정 f), m) 및 공정 B)는, 식 II₀ 대신에, 하기의 공정:

피험재료의 GA 유래의 흡광도(S)로부터, 회귀식 I을 이용하여 대응하는 GA 농도_[L](T)를 구하는 공정;

흡광도(S)와 GA 농도_[L](T)로부터 회귀식 I'을 작성하는 공정;

회귀식 I'의 절편을 제로로 하는 식 II'을 작성하는 공정;

을 포함하는 방법으로 작성되는 식 II'을 이용하여 실시할 수도 있다.

피험재료의 GA 유래의 흡광도(S)로부터 회귀식 I을 이용하여 대응하는 GA 농도_[L](T)를 구하는 공정;

흡광도(S)와 대응하는 GA 농도_[L](T)로부터 설정되는 점 및 원점의 2점을 통과하는, 절편을 제로로 하는 식 II''을 작성하는 공정

을 포함하는 방법으로 작성되는 식 II''을 이용하여 실시할 수도 있다.

또한, 상기한 공정 j)는, 회귀식 I 대신에, 하기의 공정:

흡광도(S)와 GA 농도_[L](T)로부터 회귀식 I'을 작성하는 공정

을 포함하는 방법으로 작성되는 회귀식 I'을 이용하여 실시할 수도 있다.

상기한 회귀식 V를 작성하는 공정을 포함하는 본 실시형태의 방법은, 공정 b)에 앞서서, 상술한: 공정 a); 공정 a1)∼a5); 또는 공정 a1)∼a3)과 공정 C2) 및 C4)를 실시할 수도 있다.

상기한 회귀식 V를 작성하는 공정을 포함하는 본 실시형태의 방법은, 추가로 이하의 공정 B) 및 C)를 포함할 수 있다.

상기한 회귀식 V를 작성하는 공정을 포함하는 본 실시형태의 방법은, 추가로 이하의 공정 F1')∼F4')을 포함할 수 있다. 이들 공정에 의해, 표준물질을 이용한 검량선으로 인증 표준물질을 측정하고 환산하여 인증치를 산출할 수 있음을 확인할 수 있다.

F3') 하기 식 6':

피험재료의 GA값(P') = GA 농도_[P](N')/알부민 농도(O') (식 6')

을 이용하여 GA값(P')을 결정하는 공정.

공정 F1')∼F4')은 상술한 공정 F1)∼F4)를 참조하여 실시할 수 있다.

공정 F4')에서 얻어진 GA값(Q₂')이, 공정 F1')에서 이용한 피험재료에 값 부여한 인증 GA값₁(W)과 일치하는 것을 확인함으로써, 회귀식 V를 이용하여 GA값의 트레이서빌리티 체계를 확립했음을 확인할 수 있다. 즉, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 회귀식 V와 효소법을 이용하여 간편하게 측정할 수 있음이 확인된다.

상기한 각 공정은, 각각의 공정에 있어서 필요한 측정치, 회귀식 등을 얻을 수 있는 한, 순서 무관으로 실시할 수 있다. 예컨대, 공정 b)와 c)는 순서 무관으로 실시할 수 있고, 공정 j)와 k)는 순서 무관으로 실시할 수 있고, 공정 B)와 C)는 순서 무관으로 실시할 수 있고, 공정 F1')과 F2')은 순서 무관으로 실시할 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한 공정 A₄)를 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다. 공정 A₄)는, 이하의 공정 b)∼d), e₀), j), m) 및 p)를 포함하며, 회귀식 VI을 결정하는 공정이다.

b) 이하의 식 1:

GA 농도_[L](A)

D =αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 공정;

e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:

D =α₀E (식 II₀)

을 작성하는 공정

T=ψX+ω (회귀식 VI)

을 작성하는 공정.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, 공정 A₄)에 포함되는 공정 e₀) 및 공정 m)에 있어서의 식 II₀이, 하기에 나타내는 공정 e)를 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II인, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다.

e) 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D =αE (식 II)

를 작성하는 공정

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, 공정 A₄)에 포함되는 공정 e₀) 및 공정 m)에 있어서의 식 II₀이, 하기에 나타내는 공정 e₁)을 포함하는 공정에 의해 작성되는 식 II₁인, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다.

e₁) 절편을 제로로 하는 이하의 식 II₁:

D =α₁E (식 II₁)

을 작성하는 공정

공정 b)∼d), e₀), e), e₁), j) 및 m)은 상술한 것과 같이 실시할 수 있다.

공정 p)는, 예컨대 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 2종 이상의 GA 농도_[L](T)를 종축에, 2종 이상의 GA 농도_[P](X)를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식을 설정함으로써 실시할 수 있다.

이 방법에 의하면, 회귀식 I을 경유하여 임의의 피험재료의 GA 농도_[L](T)를 결정하고, 식 II₀을 경유하여 임의의 피험재료의 GA 농도_[P](X)를 결정하여, 양자를 회귀식 VI으로 상관시킬 수 있다.

상기한 회귀식 VI을 작성하는 공정을 포함하는 본 실시형태의 방법은, 공정 b)에 앞서서, 상술한: 공정 a); 공정 a1)∼a5); 또는 공정 a1)∼a3)과 공정 C2) 및 C4)를 실시할 수도 있다.

상기한 회귀식 VI을 작성하는 공정을 포함하는 본 실시형태의 방법은, 추가로 이하의 공정 B) 및 C)를 포함할 수 있다.

상기한 회귀식 VI을 작성하는 공정을 포함하는 본 실시형태의 방법은, 공정 b)에 앞서서, 추가로 이하의 공정 a1)∼a3):

a1) 하기 식 4:

알부민 몰 인증치(L)

를 이용하여 알부민 몰 인증치(L)을 결정하는 공정;

a3) 알부민 몰 인증치(L)과 흡광도(M)로부터 하기 식 5:

M = θL (식 5)

를 만족하는 θ를 결정하는 공정

을 포함하고, 공정 A₄)가 추가로 이하의 공정 k):

k) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 알부민 유래의 흡광도(U)를 측정하여 알부민 농도(V)를 결정하는 공정

l) 이하의 식 8:

GA값₁(W) = GA 농도_[L](T)/알부민 농도(V) (식 8)

을 이용하여, 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA값₁(W)을 GA 농도_[L](T)로부터 결정하는 공정

을 포함하며, 방법이 추가로 이하의 공정:

F5') GA 농도_[P](N')로부터 회귀식 VI을 이용하여 피험재료의 GA 농도_[L](R')를 결정하는 공정; 및

F6') 하기 식 7':

피험재료의 GA값(Q₃') = GA 농도_[L](R')/알부민 농도(O') (식 7')

을 이용하여, 공정 F1')에서 이용한 피험재료에 설정한 GA 인증치₁(W)로 트레이스할 수 있는 GA값(Q₃')을 결정하는 공정

을 포함하는 것일 수 있다.

공정 a1)∼a3), k) 및 l)은 상술한 것과 같이 실시할 수 있다.

공정 F1'), F2'), F5') 및 F6')은 각각 공정 F1), F2), F5) 및 F6)을 참조하여 실시할 수 있다.

공정 F6')에서 얻어진 GA값(Q₃')이, 공정 F1')에서 이용한 피험재료에 설정한 GA 인증치₁(W)과 일치하는 것을 확인함으로써, 회귀식 VI을 이용하여 GA값의 트레이서빌리티 체계가 확립되었음을 확인할 수 있다. 즉, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 회귀식 VI과 효소법을 이용하여 간편하게 측정할 수 있음이 확인된다.

상기한 각 공정은, 각각의 공정에 있어서 필요한 측정치, 회귀식 등을 얻을 수 있는 한, 순서 무관으로 실시할 수 있다. 예컨대, 공정 b)과 c)는 순서 무관으로 실시할 수 있고, 공정 B)과 C)는 순서 무관으로 실시할 수 있고, 공정 F1')과 F2')은 순서 무관으로 실시할 수 있다.

이와 같이, 본 실시형태는, 회귀식 III, 회귀식 IV, 회귀식 V 또는 회귀식 VI을 결정하는 공정 A₀, 즉:

피험재료의 GA값의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 인증치로 환산하기 위한 회귀식(회귀식 III),

피험재료의 GA 농도_[P]의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]로 환산하기 위한 회귀식(회귀식 IV),

피험재료의 GA값의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 인증치로부터 피험재료에 설정한 GA값으로 환산하기 위한 회귀식(회귀식 V), 또는

피험재료의 GA 농도_[P]의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]로부터 피험재료에 설정한 GA 농도_[L]로 환산하기 위한 회귀식(회귀식 VI)

을 결정하는 공정; 및

공정 F₀:

을 포함하는, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다. 여기서 「GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]로부터 환산한 GA 농도_[P]」란, 「GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]에 연관된 GA 농도_[P]」와 동의이다.

본 실시형태의 방법에 의하면, GA값의 트레이서빌리티를 확립할 수 있다. 트레이서빌리티의 확립은, GA와 같은 당화단백질인 당화 헤모글로빈 A1c(HbA1c)에서는 이미 표준 측정 조작법의 측정치로부터, 일상 검사법인 효소법에의 트레이서빌리티가 확립되어 있는데, 이 HbA1c는 「β쇄의 N 말단 발린에 글루코오스가 결합한 헤모글로빈」이라고 정의되어 있어, 당화 부위가 명확하다. 또한, HbA1c의 표준 측정 조작법은, 엔드프로테아제 Glu-C에 의해 헤모글로빈을 당화헥사펩티드로 분해하여 정량하는 방법으로 정의되어 있다. 한편, 일상 검사법인 HbA1c 효소법은, 프로테아제의 작용에 의해 헤모글로빈 β쇄 N 말단의 당화디펩티드(프룩토실-발린-히스티딘)를 단편화하고, 단편화된 당화디펩티드를 측정하는 방법이다. 따라서, HbA1c의 경우, 기준 측정 조작법과 일상 검사인 효소법의 사이에서 측정 대상물은 1 분자의 헤모글로빈에 대하여 모두 1대1의 관계이기 때문에, 트레이서빌리티 체계의 확립은 매우 용이하다.

한편, GA의 정의는 상술한 대로 「DOF-Lys를 갖는 알부민」이며, 1 분자의 알부민당 59 곳 있는 리신 잔기의 어느 부위가 당화된 것이라도 좋다. 또한, GA의 표준 측정 조작법인 ID-MS법은 59 곳 있는 리신 잔기를 전부 단편화하여 측정한다. 한편, 일상 검사법인 GA 효소법에서는 프로테아제를 이용하지만, 프로테아제 처리로 모든 리신 잔기를 단편화하기는 어렵기 때문에, GA의 경우, 기준 측정 조작법과 일상 검사인 효소법의 사이에서 측정 대상물은 1 분자의 알부민에 대하여 1대1의 관계가 되지 않고, 차이가 있다. 이 때문에, GA의 트레이서빌리티 체계의 확립은 HbA1c의 경우와 같은 식으로 실시할 수 없었다.

본 실시형태의 방법에서 얻어진 각종 회귀식을 이용하여, 피험재료의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 간편하게 측정할 수 있다.

예컨대, 피험재료의 GA 농도_[P]와 알부민 농도를 각각 효소법에 의해 측정하여, 이들로부터 GA값을 결정한다.

상기 GA값과 회귀식 III 또는 회귀식 V로부터, 피험재료의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 간편하게 측정할 수 있고(회귀식 V의 경우, GA값을 Y에 대입), 또한

상기한 GA 농도_[P]와 회귀식 IV 또는 회귀식 VI으로부터 GA 농도_[L]를 구할 수 있고, 또한 이 GA 농도_[L]를 알부민 농도로 나눔으로써, 피험재료의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 간편하게 측정할 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는 또한:

회귀식 III, 회귀식 IV, 회귀식 V 및 회귀식 VI으로 이루어지는 군에서 선택되는 회귀식;

GA 측정용 시약;

알부민 측정용 시약; 및

표준물질

을 포함하는 GA값 측정용 키트에 관한 것이기도 하다. 이 측정 키트에 의하면, 피험재료의 GA 농도_[P]와 알부민 농도를 각각 효소법에 의해 측정하여, 피험재료의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 간편하게 측정할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 표준물질은, 바람직하게는 상기 공정 B) 및 공정 C)에 의해서 식 II₀, 식 II 또는 II₁을 이용하여 GA 농도_[P]가 설정된 표준물질이다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, ID-MS법에 의한 GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 동정(同定)을 행하는 컴퓨터 프로그램이며, 상기한 각 측정 방법에 있어서의 각 공정을 실행하는 프로그램에 관한 것이기도 하다. 예컨대, 본 실시형태의 프로그램은:

b) 이하의 식 1:

GA 농도_[L](A)

을 이용하여, 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)를 결정하는 단계;

c) 2종 이상의 GA 인증 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 입력하는 단계;

e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:

D =α₀E (식 II₀)

을 작성하는 단계

f) 식 II₀을 이용하여, GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)를 2종 이상 결정하는 단계;

g) 이하의 식 2:

GA값(F) = GA 농도_[P](E)/알부민 농도(C) (식 2)

를 이용하여, GA값(F)을 2종 이상 결정하는 단계; 및

B =γF+δ (회귀식 III)

을 작성하는 단계

를 실행하는 프로그램일 수 있다.

또한, 일 양태에 있어서, 상기 프로그램은,

단계 e₀)이 하기에 나타내는 단계 d)와 단계 e)이고,

단계 f)에 있어서의 식 II₀이 식 II인,

프로그램일 수도 있다.

D =αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 단계;

e) 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D =αE (식 II)

를 작성하는 단계.

또한, 일 양태에 있어서, 상기 프로그램은,

단계 e₀)이 하기에 나타내는 단계 e₁)이고,

단계 f)에 있어서의 식 II₀이 식 II₁인,

프로그램일 수도 있다.

e₁) 절편을 제로로 하는 이하의 식 II₁:

D=α₁E (식 II₁)

을 작성하는 단계

(여기서, α₁=[단계 c)에 있어서 측정한 GA 인증 표준물질 중의 1종의 GA 인증 표준물질의 GA 유래의 흡광도(D)]/[단계 b)에 있어서 결정한 대응하는 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)]이다).

본 실시형태의 프로그램은, 마찬가지로 상기한 본 실시형태의 다른 방법에 있어서의 각 공정을 실행하는 프로그램일 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 또한, ID-MS법에 의한 GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정용 장치이며, 상기한 각 측정 방법에 있어서의 각 공정을 실시하기 위한 수단을 구비하는 장치에 관한 것이기도 하다. 예컨대, 본 실시형태의 장치는:

b) 이하의 식 1:

GA 농도_[L](A)

을 이용하여, 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)를 결정하기 위한 수단;

c) 2종 이상의 GA 인증 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 측정하기 위한 수단;

e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:

D =α₀E (식 II₀)

을 작성하기 위한 수단

f) 식 II₀을 이용하여, GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)를 2종 이상 결정하기 위한 수단;

g) 이하의 식 2:

GA값(F) = GA 농도_[P](E)/알부민 농도(C) (식 2)

를 이용하여, GA값(F)을 2종 이상 결정하기 위한 수단; 및

B=γF+δ (회귀식 III)

을 작성하기 위한 수단

을 구비하는 장치일 수 있다.

또한, 일 양태에 있어서, 상기 장치는,

수단 e₀)이 하기에 나타내는 수단 d)와 수단 e)이고,

수단 f)에 있어서의, 식 II₀이 식 II인,

장치일 수도 있다.

D =αA+β (회귀식 I)

을 작성하는 수단;

e) 회귀식 I의 절편을 제로로 하는 식 II:

D =αE (식 II)

를 작성하는 수단.

또한, 일 양태에 있어서, 상기 장치는,

수단 e₀)이 하기에 나타내는 수단 e₁)이고,

수단 f)에 있어서의, 식 II₀이 식 II₁인,

장치일 수도 있다.

e₁) 절편을 제로로 하는 이하의 식 II₁:

D =α₁E (식 II₁)

을 작성하는 수단

(여기서, α₁=[수단 c)에 있어서 측정한 GA 인증 표준물질 중의 1종의 GA 인증 표준물질의 GA 유래의 흡광도(D)]/[수단 b)에 있어서 결정한 대응하는 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)]이다).

본 실시형태의 장치는, 마찬가지로 상기한 본 실시형태의 다른 방법에 있어서의 각 공정을 실시하기 위한 수단을 구비하는 장치일 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는:

식 III, 식 IV, 식 V 및 식 VI으로 이루어지는 군에서 선택되는 식이 설정된 연산부;

GA값을 측정하는 측정부

를 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 장치에 관한 것이기도 하다.

여기서, 각 식은 상기한 임의의 방법을 이용하여 결정할 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 이하의 1) 표준물질과 2) 연산 프로그램을 이용하는 것을 특징으로 하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법에 관한 것이기도 하다.

2) 식 III, 식 IV, 식 V 및 식 VI으로 이루어지는 군에서 선택되는 식이 들어간 연산 프로그램.

여기서, 2)에 있어서의 각 식은 상기한 임의의 방법을 이용하여 결정할 수 있다.

실시예

이어서, 본 실시형태를 실시예 및 비교예(실시예 등)에 의해 자세히 설명하지만, 본 발명은 이에 의해서 하등 한정되는 것이 아니다. 이하의 실시예 등에 있어서 당화알부민 농도_[L]는, 글루코오스가 결합한 리신 잔기(DOF-Lys)의 농도이고, 당화알부민 농도_[P]는, 당화아미노산 또는 당화펩티드의 농도이다.

본 실시예 1∼11 및 비교예 1에 있어서는 다음을 이용했다.

1) 당화알부민 인증 표준물질

일본의 일반 사단법인 검사의학표준물질기구가 제조·판매하고 있는 글리코알부민 측정용 상용 참조 표준물질(JCCRM 611-1)을 이용했다. 인증치(당화알부민치)가 낮은 쪽에서부터 순차로 M, H 및 HH이다.

2) 알부민 인증 표준물질

일본의 일반 사단법인 검사의학표준물질기구가 판매하고 있는 IFCC 혈장단백 국제 표준물질(ERM-DA 470k/IFCc)를 이용했다.

3) 측정 시약

알부민(ALB)(개량 BCP법) 및 당화알부민의 흡광도를 측정하는 시약은, 루시카 GA-L(아사히가세이파마(주))을 이용했다.

루시카 GA-L의 당화알부민 시약은 제1 시약(전처리액)과 제2 시약(효소액)으로 구성되고, ALB 시약은 제1 시약(전처리액)과 제2 시약(발색액)으로 구성되어 있다.

4) 표준물질

표준물질은, GA-L 칼리브레이터(아사히가세이파마(주))를 고값 표준물질로서 이용했다.

5) 측정 장치

흡광도 측정 및 흡광도에서 농도로의 환산을 행하는 장치로서, 7180형 히타치 자동 분석 장치(히타치하이테크필딩(주))를 사용했다.

6) 당화알부민 측정 방법

상기 5의 측정 장치를 이용하여, 샘플 4.5 μL, 제1 시약 180 μL, 제2 시약 45 μL의 10분 모드로 측정했다. 측광 0 포인트에서 샘플과 제1 시약의 샘플링 및 교반을 행하고, 측정을 시작하여, 제1 반응을 행했다. 그 후, 16 포인트에서 제2 시약의 샘플링 및 교반 후, 제2 반응을 행했다. 토탈 34 포인트까지 측정했다.

그 밖의 조작은 각각의 첨부 문서나 취급설명서에 따라서 행했다.

7) 당화알부민 흡광도의 계산 방법

당화알부민 흡광도(측정 샘플의 측정 흡광도 변화)는, 33 및 34 포인트의 평균 흡광도와 제2 시약 첨가 전의 15 및 16 포인트의 평균 흡광도를 이용하여, 하기 계산식에 의해 구했다.

ΔmAbs=(Ab1-(Ab2×0.8))/10

ΔmAbs: 당화알부민 흡광도 변화량

Ab1: 33 및 34 포인트의 평균 흡광도

Ab2: 15 및 16 포인트의 평균 흡광도

식 중 「0.8」은 다음 계산식에 의해 산출한 값이다.

제1 시약량(180 μL)/(제1 시약량(180 μL)+제2 시약량(45 μL))=0.8

8) 알부민 측정 방법

상기 5)의 측정 장치를 이용하여, 샘플 3.0 μL, 제1 시약 220 μL, 제2 시약 110 μL의 10분 모드로 측정했다. 0 포인트에서 샘플과 제1 시약의 샘플링 및 교반을 행하고, 측정을 시작하여, 제1 반응을 행했다. 그 후, 16 포인트에서 제2 시약의 샘플링 및 교반 후, 제2 반응을 행했다. 토탈 34 포인트까지 측정했다.

9) 알부민(ALB) 흡광도의 계산 방법

ALB 흡광도(측정 샘플의 측정 흡광도 변화)는, 33 및 34 포인트의 평균 흡광도와 제2 시약 첨가 전의 13 및 14 포인트의 평균 흡광도를 이용하여, 하기 계산식에 의해 구했다.

ΔmAbs=(Ab1-(Ab2×0.67))/10

ΔmAbs: ALB 흡광도 변화량

Ab1: 33 및 34 포인트의 평균 흡광도

Ab2: 13 및 14 포인트의 평균 흡광도

식 중 「0.67」은 다음 계산식에 의해 산출한 값이다.

제1 시약량(220 μL)/(제1 시약량(220 μL)+제2 시약량(110 μL))=0.67

[실시예 1]

<당화알부민 인증 표준물질의 알부민 농도의 결정>

1) 루시카 GA-L을 이용하여, 알부민 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(M) 및 당화알부민 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(K)를 측정했다.

2) 알부민 인증 표준물질의 알부민 인증치(3.72 g/dL)를 몰로 환산했다. 환산에 사용한 분자량은 66438을 이용한(Geisow MJ et. Al. In: Villafranca JJ, ed. Techniques in proteinchemistry. San Diego, CA: Academic Press, 1991: 576-572) 결과, 알부민 몰 인증치(L)는 559.9 μmol/L였다.

3) 상기 단위 환산 후의 알부민 몰 인증치(L)을 횡축, 알부민 유래의 흡광도(M)를 종축에 플롯함으로써, 회귀직선식(식 5) y=0.3351x을 작성했다(도 2).

4) 상기 회귀직선식(식 5)에 당화알부민 인증 표준물질의 알부민 흡광도(K)를 대입함으로써 당화알부민 인증 표준물질의 알부민 농도(C)를 결정했다.

<당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L]의 결정>

1) 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 인증치(B)는, 낮은 쪽에서부터 순차 M: 230, H; 365, HH: 564 mmol/mol였다. 각각의 당화알부민 인증치에 상기에서 결정한 알부민 농도(C)를 곱함으로써 당화알부민 농도_[L](A)를 결정했다.

<당화알부민 인증 표준물질 유래의 당화알부민 흡광도와 당화알부민 농도_[L]를 결부시키기 위한 회귀직선식의 결정>

1) 루시카 GA-L을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 유래의 흡광도(D)를 측정했다.

상기에서 구한 각 값을 표 1에 기재했다.

2) 상기 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](A)를 횡축, 당화알부민 유래의 흡광도(D)를 종축에 플롯하여, 회귀직선식(I) y=0.2344x-7.9194을 설정했다(도 3).

[실시예 2]

측정치와 인증치를 일치시키기 위해서 2 단계의 회귀직선식의 설정을 검토했다.

<회귀직선식(I)의 절편을 0으로 하는 직선식(II)의 설정>

1) 상기 회귀직선식(I)을 절편이 0이 되도록 평행 이동하여, 직선식(II) y=0.2344x를 설정했다(도 4).

<실측치를 인증치로 환산하기 위한 회귀직선식(III)의 설정>

1) 상기에서 산출한 직선식(II)에, 상기 당화알부민 유래의 흡광도(D)를 대입하여, 당화알부민 농도_[P](E)를 산출했다.

2) 상기 당화알부민 농도_[P](E)를 상기 알부민 농도(C)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(F)를 산출했다.

직선식(II)을 이용한 당화알부민 인증 표준물질의 각 값을 표 2에 기재했다.

3) 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 인증치(B)를 종축, 상기 당화알부민치(F)를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식(III) y=1.0177x+48.752를 설정했다(도 5).

[실시예 3]

<직선식(II)을 이용한 표준물질에 대한 값의 설정>

1) 표준물질의 당화알부민 유래의 흡광도(G)를 측정하고, 상기 직선식(II)에 대입하여, 표준물질의 당화알부민 농도_[P](H)를 산출했다.

2) 상기 당화알부민 인증 표준물질의 알부민 농도(C)를 횡축, 상기 당화알부민 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(K)를 종축에 플롯하여, 회귀직선식(식 3) y=0.3351x를 설정했다(도 6).

3) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정하고, 상기 회귀직선식(식 3)에 대입하여, 표준물질의 알부민 농도(J)를 산출했다.

직선식(II)을 이용한 표준물질의 각 값을 표 3에 기재했다.

[실시예 4]

<직선식(II)을 이용하여 당화알부민 농도 및 알부민 농도를 결정한 표준물질을 이용하여 산출한 측정치에 관해서, 추가로 회귀직선식(III)을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 인증치로 트레이스할 수 있는 값을 얻는 공정>

1) 실시예 3에 있어서 값을 설정한 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하고, 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[P](N)를 측정했다.

2) 실시예 3에 있어서 값을 설정한 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하고, 당화알부민 인증 표준물질의 알부민 농도(O)를 측정했다.

3) 상기 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[P](N)를 알부민 농도(O)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(P)를 산출했다.

4) 당화알부민치(P)를 회귀직선식(III)에 대입함으로써 당화알부민치(Q)를 얻었다.

직선식(II)을 이용한 당화알부민 인증 표준물질의 측정치 및 회귀직선식(III)을 이용하여 환산한 값을 표 4에 기재했다.

표 4로부터 알 수 있는 것과 같이, 직선식(II)으로부터 값을 설정한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 측정치(P)를 회귀직선식(III)으로 환산하여 얻어진 환산치(Q)는, 당화알부민 인증 표준물질에 규정되어 있는 인증치(B)와 잘 일치했다. 즉, 당화알부민 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 값의 설정을 행한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 인증치가 산출되었기 때문에, 일련의 연쇄적인 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 있었다.

[실시예 5]

<알부민 인증 표준물질의 검량선을 이용한, 표준물질에 대한 알부민 농도의 설정>

1) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정하고, 상기 회귀직선식(식5)에 대입하여, 표준물질의 알부민 농도(J')를 산출했다.

알부민 인증 표준물질의 검량선을 이용한 표준물질의 각 값을 표 5에 기재했다.

상기 회귀직선식(식 5)에 알부민 유래의 흡광도(I)를 대입하여 얻어진 표준물질의 알부민 농도(J')와 상기 알부민 농도(J)가 일치하므로, 회귀직선식(식 5)을 이용하더라도 표준물질의 알부민 농도를 구할 수 있음을 확인했다.

상기 알부민 농도(J) 대신에 알부민 농도(J')를 표준물질에 설정하고, 실시예 4와 같은 식으로 하여 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 있음을 확인했다.

[실시예 6]

<회귀직선식(I)의 절편을 0으로 하는 직선식(II_(d))의 설정>

1) 상기 회귀직선식(I)의 기울기를, 실시예 1에서 얻어진 당화알부민 인증 표준물질 HH의 당화알부민 농도_[L](A) 330.0 μmol/L를 기준으로, 절편이 0이 되도록 변경하여, 직선식(II_(d)) y=0.2103x를 설정했다(도 7).

<실측치를 인증치로 환산하기 위한 회귀직선식(III_(d))의 설정>

1) 직선식(II_(d))에, 상기 당화알부민 유래의 흡광도(D)를 대입하여, 당화알부민 농도_[P](E_(d))를 산출했다.

2) 상기 당화알부민 농도_[P](E_(d))를 상기 알부민 농도(C)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(F_(d))를 산출했다.

직선식(II_(d))을 이용한 당화알부민 인증 표준물질의 각 값을 표 6에 기재했다.

3) 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 인증치(B)를 종축, 상기 당화알부민치(F_(d))를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식(III_(d)) y=0.913x+48.752를 설정했다(도 8).

[실시예 7]

<직선식(II_(d))을 이용한 표준물질에 대한 값의 설정>

1) 표준물질의 당화알부민 유래의 흡광도(G)를 측정하고, 직선식(II_(d))에 대입하여, 표준물질의 당화알부민 농도_[P](H_(d))를 산출했다.

2) 실시예 3에 기재한 방법을 이용하여 표준물질의 알부민 농도(J)를 산출했다.

직선식(II_(d))을 이용한 표준물질의 각 값을 표 7에 기재했다.

[실시예 8]

<직선식(II_(d))을 이용하여 당화알부민 농도 및 알부민 농도를 결정한 표준물질을 이용하여 산출한 측정치에 관해서, 추가로 회귀직선식(III_(d))을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 인증치로 트레이스할 수 있는 값을 얻는 공정>

1) 실시예 7에 있어서 값을 설정한 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하고, 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[P](N_(d))를 측정했다.

2) 상기 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[P](N_(d))를 실시예 4에서 얻은 알부민 농도(O)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(P_(d))를 산출했다.

4) 당화알부민치(P_(d))를 회귀직선식(III_(d))에 대입함으로써 당화알부민치(Q_(d))를 얻었다.

직선식(II_(d))을 이용한 당화알부민 인증 표준물질의 측정치 및 회귀직선식(III_(d))을 이용하여 환산한 값을 표 8에 기재했다.

표 8로부터 알 수 있는 것과 같이, 직선식(II_(d))으로부터 값을 설정한 표준물질을 이용하고, 당화알부민 인증 표준물질의 측정치(P_(d))를 회귀직선식(III_(d))으로 환산하여 얻어진 환산치(Q_(d))는, 당화알부민 인증 표준물질에 규정되어 있는 인증치(B)와 잘 일치했다. 즉, 당화알부민 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 값의 설정을 한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 인증치가 산출되었기 때문에, 일련의 연쇄적인 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 있었다.

[실시예 9]

당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도를 이용한, 회귀식의 설정에 의한 트레이서빌리티 체계의 확립에 관해서 검토했다.

<회귀직선식(IV)의 설정>

1) 상기 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](A)를 종축, 상기 당화알부민 농도_[P](E)를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식(IV) y=0.9998x+33.783을 설정했다(도 9).

<직선식(II)에 의해 값을 설정한 표준물질을 이용하여 산출한 측정치를, 추가로 회귀직선식(IV)을 이용하여 환산하여 트레이스할 수 있는 값을 얻는 공정>

1) 실시예 3에서 직선식(II)에 의해 값을 설정한 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하고, 상기 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 유래의 흡광도(D)를 이용하여, 당화알부민 농도_[P](N)를 측정했다.

2) 당화알부민 농도_[P](N)를 회귀직선식(IV)에 대입함으로써 당화알부민 농도_[L](R)를 얻었다.

3) 상기 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](R)를 상기 알부민 농도(O)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(Q₁')를 산출했다.

직선식(II)을 이용한 당화알부민 인증 표준물질의 측정치 및 회귀직선식(IV)을 이용하여 환산한 값을 표 9에 기재했다.

표 9로부터 알 수 있는 것과, 직선식(II)으로부터 값을 설정한 표준물질을 이용하고, 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[P](N)를 회귀직선식(IV)으로 환산하여 얻어진 당화알부민 농도_[L](R)를 알부민 농도(O)로 나눔으로써 얻어진 당화알부민치(Q1')는, 당화알부민 인증 표준물질에 규정되어 있는 인증치(B)와 잘 일치했다. 즉, 당화알부민 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 값의 설정을 한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 인증치가 산출되었기 때문에, 일련의 연쇄적인 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 있었다.

본 실시예 10 및 11에 관해서 이하를 추가로 이용했다.

1) 피험재료

GA-L 관리 혈청 L, H(아사히가세이파마(주))를 이용했다.

농도가 낮은 순으로 L, H로 구성되어 있다.

[실시예 10]

피험재료를 이용한, 회귀식의 설정에 의한 트레이서빌리티 체계의 확립에 관해서 검토했다.

<피험재료에 대한 각종 값의 설정>

1) 피험재료의 당화알부민 유래의 흡광도(S)를 측정하고, 상기 회귀직선식(I)에 대입하여, 피험재료의 당화알부민 농도_[L](T)를 결정했다.

2) 피험재료의 알부민 유래의 흡광도(U)를 측정하고, 상기 회귀직선식(식 5)에 대입하여, 피험재료의 알부민 농도(V)를 결정했다.

3) 상기 당화알부민 농도_[L](T)를, 상기 알부민 농도(V)로 나누고, 1000을 곱함으로써, 당화알부민 인증 표준물질로부터 트레이스할 수 있는 당화알부민치(W)(설정치)를 산출했다.

<회귀직선식(V)의 설정>

1) 상기 피험재료의 당화알부민 유래의 흡광도(S)를 상기 직선식(II)에 대입하여, 피험재료의 당화알부민 농도_[P](X)를 산출했다.

2) 상기 당화알부민 농도_[P](X)를 상기 알부민 농도(V)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(Y)를 산출했다.

피험재료의 각 값을 표 10에 기재했다.

3) 상기 당화알부민치(W)(설정치)를 종축, 상기 당화알부민치(Y)를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식(V) y=0.9961x+47.467을 설정했다(도 10).

<직선식(II)을 이용하여, 값을 설정한 표준물질을 이용하여 산출한 측정치를, 추가로 회귀직선식(V)을 이용하여 트레이스할 수 있는 값을 얻는 공정>

1) 실시예 3에서 직선식(II)을 이용하여 값을 설정한 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하고, 피험재료의 당화알부민 농도_[P](N')를 측정했다.

2) 실시예 5에서 회귀직선식(식 5)을 이용하여 값을 설정한 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하고, 피험재료의 알부민 농도(O')를 측정했다.

3) 상기 피험재료의 당화알부민 농도_[P](N')를 알부민 농도(O')로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(P')를 산출했다.

4) 당화알부민치(P')를 회귀직선식(V)에 대입함으로써 당화알부민치(Q₂')를 얻었다.

직선식(II)을 이용한 피험재료의 측정치 및 회귀직선식(V)을 이용하여 환산한 값을 표 11에 기재했다.

표 11로부터 알 수 있는 것과 같이, 직선식(II)으로부터 값을 설정한 표준물질을 이용하고, 피험재료의 당화알부민치(P')를 회귀직선식(V)으로 환산하여 얻어진 환산치(Q₂')는, 피험재료에 설정한 당화알부민치(W)와 잘 일치했다. 즉, 당화알부민 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 값의 설정을 한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질로부터 설정한 피험재료의 설정치가 산출되었기 때문에, 일련의 연쇄적인 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 있었다.

[실시예 11]

피험재료의 당화알부민 농도를 이용한, 회귀식의 설정에 의한 트레이서빌리티 체계의 확립에 관해서 검토했다.

<회귀직선식(VI)의 설정>

1) 상기 피험재료의 당화알부민 농도_[L](T)를 종축, 당화알부민 농도_[P](X)를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식(VI) y=x+33.786을 설정했다(도 11).

<직선식(II)에 의해 값을 설정한 표준물질을 이용하여 산출한 피험재료의 측정치를, 추가로 회귀직선식(VI)을 이용하여 환산하여 트레이서빌리티 체계를 확립하는 공정>

1) 실시예 10에 있어서 값을 측정한 피험재료의 당화알부민 농도_[P](N')를 회귀직선식(VI)에 대입함으로써 당화알부민 농도_[L](R')를 얻었다.

2) 상기 피험재료의 당화알부민 농도_[L](R')를 실시예 10에서 얻은 알부민 농도(O')로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(Q₃')를 산출했다.

직선식(II)을 이용한 피험재료의 측정치를 회귀직선식(VI)을 이용하여 환산한 값을 표 12에 기재했다.

표 12로부터 알 수 있는 것과 같이, 직선식(II)으로부터 값을 설정한 표준물질을 이용하고, 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[P](N')를 회귀직선식(VI)으로 환산하여 얻어진 당화알부민 농도_[L](R')를 알부민 농도(O')로 나눔으로써 얻어진 당화알부민치(Q₃')는, 실시예 10에서 피험재료에 설정한 당화알부민치(W)와 잘 일치했다. 즉, 당화알부민 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 값의 설정을 한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질로부터 설정한 피험재료의 설정치가 산출되었기 때문에, 일련의 연쇄적인 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 있었다.

[실시예 12]

본 실시예 12에서는, 고값 표준물질(H)에 더하여 추가로 저값 표준물질(L)로서 Off the Clot Human Serum(Golden west Biologicals, Inc.)을 이용했다.

<표준물질의 알부민 농도의 산출>

1) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(U-2)를 측정하고, 상기 회귀직선식(식 3)에 대입하여, 표준물질의 알부민 농도(V-2)를 산출했다.

<회귀직선식의 설정>

1) 상기 표준물질의 당화알부민 유래의 흡광도(S-2)를 측정하고, 상기 회귀직선식(I)에 대입하여, 표준물질의 당화알부민 농도_[L](T-2)를 산출했다.

2) 상기 표준물질의 당화알부민 농도_[L](T-2)를 횡축, 당화알부민 유래의 흡광도(S-2)를 종축에 플롯하여, 회귀직선식(I-2) y=0.2344x-7.9194를 설정했다(도 12).

3) 상기 회귀직선식(I-2)을 절편이 0이 되도록 평행 이동하여, 직선식(II-2) y=0.2344x를 설정했다(도 13).

<측정치를 인증치로 환산하기 위한 회귀직선식의 설정>

1) 상기에서 산출한 직선식(II-2)에 상기 당화알부민 유래의 흡광도(S-2)를 대입하여 당화알부민 농도_[P](X-2)를 산출했다.

2) 상기 당화알부민 농도_[L](T-2)를 상기 알부민 농도(V-2)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(W-2)(설정치)를 산출했다.

3) 상기 당화알부민 농도_[P](X-2)를 상기 알부민 농도(V-2)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(Y-2)(측정치)를 산출했다.

저값(L) 및 고값(H) 표준물질의 각 값을 표 13에 기재했다.

4) 상기 당화알부민치(W-2)(설정치)를 종축, 상기 당화알부민치(Y-2)(측정치)를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식(III-2) y=0.9999x+43.977을 설정했다(도 14).

<직선식(II-2)을 이용하고, 값을 설정한 표준물질을 이용하여 산출한 측정치를, 추가로 회귀직선식(III-2)을 이용하여 트레이스할 수 있는 값을 얻는 공정>

1) 직선식(II-2)을 이용하여 값을 설정한 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하고, 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[P](N-2)를 측정했다.

2) 회귀직선식(식 3)을 이용하여 값을 설정한 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하고, 당화알부민 인증 표준물질의 알부민 농도(O-2)를 측정했다.

3) 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[P](N-2)를 알부민 농도(O-2)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(P-2)(측정치)를 산출했다.

4) 당화알부민치(P-2)(측정치)를 회귀직선식(III-2)에 대입함으로써 당화알부민치(Q-2)(환산치)를 얻었다.

직선식(II-2)을 이용한 당화알부민 인증 표준물질의 측정치 및 회귀직선식(III-2)을 이용하여 환산한 값을 표 14에 기재했다.

표 14로부터 알 수 있는 것과 같이, 직선식(II-2)으로부터 값을 설정한 표준물질을 이용하고, 당화알부민 인증 표준물질의 측정치(P-2)를 회귀직선식(III-2)으로 환산하여 얻어진 환산치(Q-2)는, 당화알부민 인증 표준물질에 규정되어 있는 인증치(B)와 잘 일치했다. 즉, 당화알부민 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 값의 설정을 한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 인증치가 산출되었기 때문에, 일련의 연쇄적인 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 있었다.

[실시예 13]

실시예 1에서 이용한 당화알부민 인증 표준물질 및 알부민 인증 표준물질과 다음을 이용하여 시험을 실시했다.

1) 측정 시약

알부민(ALB) 및 당화알부민의 흡광도를 측정하는 시약은, 당화백단백 측정 키트(베이징스트롱바이오테크놀로지유한회사)를 이용했다. 당화백단백 측정 시제합의 당화알부민 시약은 제1 시약과 제2 시약으로 구성되고, ALB 시약(BCG법)은 제1 시약으로 구성되어 있다.

2) 표준물질

표준물질은, 칼리브레이터(베이징스트롱바이오테크놀로지유한회사)를 이용했다.

3) 측정 장치

4) 당화알부민 측정 방법

상기 3의 측정 장치를 이용하여, 샘플 3.0 μL, 제1 시약 160 μL 및 제2 시약 40 μL의 10분 모드로 측정을 행했다. 측광 0 포인트에서 샘플과 제1 시약의 샘플링 및 교반을 행하고, 측정을 개시하고, 제1 반응을 행했다. 그 후, 16 포인트에서 제2 시약을 샘플링 및 교반 후, 제2 반응을 행했다. 토탈 34 포인트까지 측정했다.

5) 당화알부민 흡광도의 계산 방법

당화알부민 흡광도(측정 샘플의 측정 흡광도 변화)는, 33 및 34 포인트의 평균 흡광도와 제2 시약 첨가 전의 15 및 16 포인트의 평균 흡광도를 이용하여, 하기계산식에 의해 구했다.

ΔmAbs=(Ab1-(Ab2×0.8)/10

ΔmAbs: 당화알부민 흡광도 변화량

Ab1: 33 및 34 포인트의 평균 흡광도

Ab2: 15 및 16 포인트의 평균흡광도

식 중 「0.8」은 다음 계산식에 의해 산출한 값이다: 제1 시약량(160 μL)/(제1 시약량(160 μL)+제2 시약량(40 μL))=0.8

6) 알부민 측정 방법

상기 3의 측정 장치를 이용하여, 샘플 2.0 μL 및 제1 시약 200 μL의 5분 모드로 측정을 행했다. 0 포인트에서 샘플과 제1 시약의 샘플링 및 교반을 행하고, 측정을 시작하고, 반응을 행했다. 토탈 17 포인트까지 측정했다.

7) 알부민(ALB) 흡광도의 계산 방법

ALB 흡광도(측정 샘플의 측정 흡광도 변화)는, 8 및 9 포인트의 평균 흡광도를 이용하여 하기 계산식에 의해 구했다.

ΔmAbs=(Ab1)/10

ΔmAbs: ALB 흡광도 변화량

Ab1: 8 및 9 포인트의 평균 흡광도

<회귀직선식(I_(a))의 설정>

1) 실시예 1과 같은 식으로 검토한 결과의 각 값을 표 15에 기재했다.

2) 상기 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](A_(a))를 횡축, 당화알부민 흡광도(D_(a))를 종축에 플롯하여, 회귀직선식(I_(a)) y=0.1372x-2.1875를 설정했다.(도 15)

<회귀직선식(I_(a))의 절편을 0으로 하는 회귀직선식의 설정>

1) 상기 회귀직선식(I_(a))을 절편이 0이 되도록 평행 이동하여, 직선식(II_(a)) y=0.1372x(II(a))를 설정했다(도 16).

<회귀직선식(III_(a))의 설정>

1) 실시예 2와 같은 식으로 검토한 결과의 각 값을 표 16에 기재했다.

2) 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 인증치(B)를 종축, 상기 당화알부민치(F_(a))를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식(III_(a)) y=1.0065x+22.763을 설정했다.(도 17)

<회귀직선식(III_(a))을 이용한 표준물질에 대한 값의 설정>

실시예 3과 같은 식으로 검토한 결과의 각 값을 표 17에 기재했다.

<회귀직선식(III_(a))을 이용한 트레이서빌리티의 확립>

실시예 4와 같은 식으로 검토한 결과의 각 값을 표 18에 기재했다.

표 18로부터 알 수 있는 것과 같이, 실시예 4와 마찬가지로 직선식(II_(a))으로부터 값을 설정한 표준물질을 이용하고, 당화알부민 인증 표준물질의 측정치(P_(a))를 회귀직선식(III_(a))으로 환산하여 얻어진 환산치(Q_(a))는, 당화알부민 인증 표준물질에 규정되어 있는 인증치(B)와 잘 일치했다. 즉, 당화알부민 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 값의 설정을 한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 인증치가 산출되었기 때문에, 일련의 연쇄적인 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 있었다.

[실시예 14]

1) 측정 시약

알부민(ALB), 당화알부민의 흡광도를 측정하는 시약은 Glycated serum albumin(IVDLab CO., LTd)를 이용했다.

Glycated serum albumin의 당화알부민 시약은 제1 시약과 제2 시약으로 구성되고, ALB 시약(BCG법)은 제1 시약으로 구성되어 있다.

2) 표준물질

표준물질은 Glycated albumin Calibrator(IVDLab CO., LTD)를 이용했다.

3) 측정 장치

4) 당화알부민 측정 방법

상기 3의 측정 장치를 이용하여, 샘플 10.0 μL, 제1 시약 200 μL 및 제2 시약 50 μL의 10분 모드로 측정을 행했다. 측광 0 포인트에서 샘플과 제1 시약의 샘플링 및 교반을 행하고, 측정을 개시하고, 제1 반응을 행했다. 그 후, 16 포인트에서 제2 시약을 샘플링 및 교반 후, 제2 반응을 행했다. 토탈 34 포인트까지 측정했다.

5) 당화알부민 흡광도의 계산 방법

당화알부민 흡광도(측정 샘플 측정 흡광도 변화)는, 33 및 34 포인트의 평균흡광도와 제2 시약 첨가 전의 15 및 16 포인트의 평균 흡광도를 이용하여 하기 계산식에 의해 구했다.

ΔmAbs=(Ab1-(Ab2×0.8))/10

ΔmAbs: 당화알부민 흡광도 변화량

Ab1: 33 및 34 포인트의 평균 흡광도

Ab2: 15 및 16 포인트의 평균 흡광도

식 중 「0.8」은 다음 계산식에 의해 산출한 값이다.

제1 시약량(200 μL)/(제1 시약량(200 μL)+제2 시약량(50 μL))=0.8

6) 알부민 측정 방법

상기 3의 측정 장치를 이용하여, 샘플 2.0 μL 및 제1 시약 200 μL의 1분 모드로 측정을 행했다. 0 포인트에서 샘플과 제1 시약의 샘플링 및 교반을 행하고, 측정을 개시하고, 반응을 행했다. 토탈 4 포인트까지 측정했다.

7) 알부민(ALB) 흡광도의 계산 방법

ALB 흡광도(측정 샘플 측정 흡광도 변화)는, 3 및 4 포인트의 평균 흡광도를 이용하여 하기 계산식에 의해 구했다.

ΔmAbs=(Ab1)/10

ΔmAbs: ALB 흡광도 변화량

Ab1: 3 및 4 포인트의 평균 흡광도

<회귀직선식(I_(b))의 설정>

1) 실시예 1과 같은 식으로 검토한 결과의 각 값을 표 19에 기재했다.

2) 상기 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](A_(b))를 횡축, 당화알부민 흡광도(D_(b))를 종축에 플롯하여, 회귀직선식(I_(b)) y=0.2888x-6.4827을 설정했다(도 18).

<회귀직선식(I_(b))의 절편을 0으로 하는 회귀직선식의 설정>

1) 상기 회귀직선식(I_(b))을 절편이 0이 되도록 평행 이동하여, 직선식(II_(b)) y=0.2888x(II_(b))를 설정했다(도 19).

<회귀직선식(III_(b))의 설정>

1) 실시예 2와 같은 식으로 검토한 결과의 각 값을 표 20에 기재했다.

2) 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 인증치를 종축, 상기 당화알부민치(F_(b))를 횡축에 플롯하여, 회귀직선식(III_(b)) y=1.01x+31.856을 설정했다(도 20).

<회귀직선식(III_(b))을 이용한 표준물질에 대한 값의 설정>

실시예 3과 같은 식으로 검토한 결과의 각 값을 표 21에 기재했다.

<회귀직선식(III_(b))을 이용한 트레이서빌리티의 확립>

실시예 4와 같은 식으로 검토한 결과의 각 값을 표 22에 기재했다.

표 22로부터 알 수 있는 것과 같이, 실시예 4와 마찬가지로 직선식(II_(b))으로부터 값을 설정한 표준물질을 이용하고, 당화알부민 인증 표준물질의 측정치(P_(b))를 회귀직선식(III_(b))으로 환산하여 얻어진 환산치(Q_(b))는, 당화알부민 인증 표준물질에 규정되어 있는 인증치(B)와 잘 일치했다. 즉, 당화알부민 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 값의 설정을 한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 인증치가 산출되었기 때문에, 일련의 연쇄적인 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 있었다.

[비교예 1]

<회귀직선식(I)을 이용한 표준물질에 대한 값의 설정>

1) 표준물질의 당화알부민 유래의 흡광도(G)를 측정했다.

2) 상기 회귀직선식(I)에 상기 당화알부민 흡광도(G)를 대입하여 표준물질의 당화알부민 농도_[L](T_(c))를 산출했다.

3) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정했다.

4) 실시예 3의 회귀직선식(식 3)에 상기 알부민 흡광도(I)를 대입하여 표준물질의 알부민 농도(J)를 산출했다.

상기에서 구한 표준물질의 각 값을 표 23에 기재했다.

<회귀직선식(I)을 이용하여 값을 설정한 표준물질로부터 당화알부민 인증 표준물질을 측정한 결과>

1) 회귀직선식(I)을 이용하고, 값을 설정한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 흡광도로부터 당화알부민 농도에로 변환하는 검량선을 작성하고, 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](N_(c))를 측정했다.

2) 회귀직선식(I)을 이용하고, 값을 설정한 표준물질을 이용하여, 알부민 흡광도로부터 알부민 농도에로 변환하는 검량선을 작성하고, 당화알부민 인증 표준물질의 알부민 농도(O)를 측정했다.

3) 상기한 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민 농도_[L](N_(c))를 알부민 농도(O)로 나누고, 1000을 곱함으로써 당화알부민치(P_(c))를 산출했다.

회귀직선식(I)을 이용한 당화알부민 인증 표준물질의 각 값을 표 24에 기재했다.

4) 표 24로부터 알 수 있는 것과 같이, 회귀직선식(I)으로부터 값을 설정한 표준물질을 이용하더라도, 당화알부민 인증 표준물질의 당화알부민치의 측정치(P_(c))는, 당화알부민 인증 표준물질에 규정되어 있는 인증치(B)와 일치하지 않았다. 즉, 당화알부민 인증 표준물질을 상위 기준으로 하고, 상기 실시예의 방법으로 값의 설정을 한 표준물질을 이용하여, 당화알부민 인증 표준물질의 인증치가 산출되지 않았기 때문에, 이 방법으로는 일련의 연쇄적인 트레이서빌리티 체계를 확립할 수 없었다.

본 발명에 의하면, 측정 방법이 다름으로 인해 측정치가 일치하지 않는 경우에 측정치를 일치시키는 방법을 제공할 수 있게 된다. 예컨대, 간편하면서도 저렴하고 단시간에 측정 가능한, 흡광도 측정을 이용한 효소법에 의해, 피험재료의, GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 측정하는 것이 가능하게 된다. 따라서, 본 발명은, 당뇨병으로 대표되는, GA값이 관여하는 질환 또는 상태의 진단 및 관리에 특히 유용하여, 의료 분야, 시약 분야 등에 있어서의 산업상의 이용 가능성을 갖는다.

본 출원은 2016년 7월 28일에 출원된 일본 특허출원 제2016-148973호에 기초한 우선권을 주장하는 것이며, 그 내용은 여기에 참조로서 포함된다.

Claims

이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:
A₀)
피험재료의 GA값의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 인증치로,
피험재료의 GA 농도_[P]의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]로,
피험재료의 GA값의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 인증치로부터 피험재료에 설정한 GA값으로, 또는
피험재료의 GA 농도_[P]의 실측치를 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]로부터 피험재료에 설정한 GA 농도_[L]로,
환산하기 위한 식을 결정하는 공정; 및
F₀)
GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L]로부터 환산한 GA 농도_[P] 및 GA 인증 표준물질의 알부민 농도로부터 환산한 알부민 농도를 설정한 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 피험재료의 GA 농도_[P] 및 알부민 농도를 측정하고, 공정 A₀)에서 결정한 회귀식을 이용하여 GA 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값을 결정하는 공정
(상기 각 공정에 있어서, GA 농도_[L]는 글루코오스가 결합한 리신 잔기(DOF-Lys)의 농도이고, GA 농도_[P]는 당화아미노산 또는 당화펩티드의 농도이다).
이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:
A₁) 이하의 b), c) 및 e₀)∼h)를 포함하는 공정에 의해 회귀식 III을 결정하는 공정;
b) 이하의 식 1:
GA 농도_[L](A)
= GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)×GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C) (식 1)
을 이용하여, 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)를 결정하는 공정;
c) 2종 이상의 GA 인증 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 측정하는 공정;
e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:
D =α₀E (식 II₀)
을 작성하는 공정
(여기서, α₀은 임의의 플러스의 값이고, E는 GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다);
f) 식 II₀을 이용하여, GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)를 2종 이상 결정하는 공정;
g) 이하의 식 2:
GA값(F) = GA 농도_[P](E)/알부민 농도(C) (식 2)
를 이용하여, GA값(F)을 2종 이상 결정하는 공정; 및
h) 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)와, 대응하는 2종 이상의 GA값(F)으로부터 회귀식 III:
B=γF+δ (회귀식 III)
을 작성하는 공정
(상기 각 공정에 있어서, GA 농도_[L]는 글루코오스가 결합한 리신 잔기(DOF-Lys)의 농도이고, GA 농도_[P]는 당화아미노산 또는 당화펩티드의 농도이다).
제2항에 있어서, 추가로 이하의 공정을 포함하는 방법:
B) 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(G)를 측정하고, 식 II₀을 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](H)를 결정하는 공정; 및
C) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정함으로써 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정.
제3항에 있어서, 공정 C)가 이하의 공정 C1)∼C3)을 포함하는 방법:
C1) GA 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(K)와 GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C)로부터 하기 식 3:
K=εC (식 3)
을 만족하는 ε를 결정하는 공정;
C2) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정하는 공정; 및
C3) 흡광도(I)로부터 식 3':
I =εJ (식 3')
을 이용하여 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정.
제3항에 있어서, 공정 b)에 앞서서, 이하의 공정 a1)∼a3):
a1) 이하의 식 4:
알부민 몰 인증치(L)
= 알부민 인증 표준물질의 알부민 인증치/알부민의 분자량 (식 4)
를 이용하여 알부민 몰 인증치(L)을 결정하는 공정;
a2) 알부민 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(M)를 측정하는 공정; 및
a3) 알부민 몰 인증치(L)과 흡광도(M)로부터 하기 식 5:
M = θL (식 5)
를 만족하는 θ를 결정하는 공정
을 포함하고,
공정 C)가 이하의 공정 C2) 및 C4):
C2) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정하는 공정; 및
C4) 흡광도(I)로부터 식 5':
I = θJ (식 5')
을 이용하여 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정
을 포함하는 방법.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 이하의 공정 F1)∼F4)를 포함하는 방법:
F1) GA 인증 표준물질의 GA 유래의 흡광도(D)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 GA 농도_[P](N)를 결정하는 공정;
F2) 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(K)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 알부민 농도(O)를 결정하는 공정;
F3) 하기 식 6:
GA 인증 표준물질의 GA값(P) = GA 농도_[P](N)/알부민 농도(O) (식 6)
을 이용하여 GA값(p)를 결정하는 공정; 및
F4) GA값(P)과 상기 회귀식 III을 이용하여, 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값(Q)을 결정하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:
A₂) 이하의 b), c), e₀), f) 및 i)를 포함하는 공정에 의해 회귀식 IV를 결정하는 공정;
b) 이하의 식 1:
GA 농도_[L](A)
= GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)×GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C) (식 1)
을 이용하여, 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)를 결정하는 공정;
c) 2종 이상의 GA 인증 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 측정하는 공정;
e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:
D =α₀E (식 II₀)
을 작성하는 공정
(여기서, α₀은 임의의 플러스의 값이고, E는 GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다);
f) 식 II₀를 이용하여, GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)를 2종 이상 결정하는 공정;
i) 2종 이상의 GA 농도_[L](A)와 GA 농도_[P](E)로부터 회귀식 IV:
A = κE+λ (회귀식 IV)
를 작성하는 공정
(상기 각 공정 중, GA 농도_[L]는 글루코오스가 결합한 리신 잔기(DOF-Lys)의 농도이고, GA 농도_[P]는 당화아미노산 또는 당화펩티드의 농도이다).
제7항에 있어서, 추가로 이하의 공정을 포함하는 방법:
B) 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(G)를 측정하고, 식 II₀을 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](H)를 결정하는 공정;
C) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정함으로써 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정.
제7항 또는 제8항에 있어서, 추가로 이하의 공정을 포함하는 방법:
F1) GA 인증 표준물질의 GA 유래의 흡광도(D)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 효소법에 의한 GA 농도_[P](N)를 결정하는 공정;
F2) 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(K)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 알부민 농도(O)를 결정하는 공정;
F5) GA 농도_[P](N)로부터 회귀식 IV를 이용하여, GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](R)를 결정하는 공정; 및
F6) 하기 식 7:
GA 인증 표준물질의 GA값(Q₁') = GA 농도_[L](R)/알부민 농도(O) (식 7)
을 이용하여, 공정 F1)에서 이용한 GA 인증 표준물질의 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값(Q₁')을 결정하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:
A₃) 이하의 b)∼e₀) 및 j)∼o)를 포함하는 공정에 의해 회귀식 V를 결정하는 공정;
b) 이하의 식 1:
GA 농도_[L](A)
= GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)×GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C) (식 1)
을 이용하여, 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)를 결정하는 공정;
c) 2종 이상의 GA 인증 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 측정하는 공정;
d) 2종 이상의 GA 유래의 흡광도(D)와 2종 이상의 GA 농도_[L](A)로부터 회귀식 I:
D=αA+β (회귀식 I)
을 작성하는 공정;
e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:
D=α₀E (식 II₀)
을 작성하는 공정
(여기서, α₀은 임의의 플러스의 값이고, E는 GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다);
j) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA 유래의 흡광도(S)를 측정하고, 회귀식 I을 이용하여 대응하는 GA 농도_[L](T)를 결정하는 공정;
k) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 알부민 유래의 흡광도(U)를 측정하여, 알부민 농도(V)를 결정하는 공정;
l) 이하의 식 8:
GA값₁(W) = GA 농도_[L](T)/알부민 농도(V) (식 8)
을 이용하여, 2종 이상의 피험재료의 GA값₁(W)을 GA 농도_[L](T)로부터 결정하는 공정;
m) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA 유래의 흡광도(S)로부터, 식 II₀를 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](X)를 결정하는 공정;
n) 이하의 식 9:
GA값₂(Y) = GA 농도_[P](X)/알부민 농도(V) (식 9)
를 이용하여, 2종 이상의 피험재료의 GA값₂(Y)를 GA 농도_[P](X)로부터 결정하는 공정;
o) 2종 이상의 피험재료의 GA값₁(W)과, 대응하는 2종 이상의 GA값₂(Y)로부터 회귀식 V:
W = πY+φ (회귀식 V)
를 작성하는 공정
(상기 각 공정 중, GA 농도_[L]는 글루코오스가 결합한 리신 잔기(DOF-Lys)의 농도이고, GA 농도_[P]는 당화아미노산 또는 당화펩티드의 농도이다).
제10항에 있어서, 추가로 이하의 공정을 포함하는 방법:
B) 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(G)를 측정하고, 식 II₀을 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](H)를 결정하는 공정;
C) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정함으로써 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정.
제10항 또는 제11항에 있어서, 추가로 이하의 공정을 포함하는 방법:
F1') 피험재료의 GA 유래의 흡광도(S)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 GA 농도_[P](N')를 결정하는 공정;
F2') 공정 F1')에서 이용한 피험재료의 알부민 유래의 흡광도(U)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 알부민 농도(O')를 결정하는 공정; 및
F3') 하기 식 6':
피험재료의 GA값(P')=GA 농도_[P](N')/알부민 농도(O') (식 6')
을 이용하여 GA값(P')을 결정하는 공정.
F4') GA값(P')과 상기 회귀식 V를 이용하여, 공정 F1')에서 이용한 피험재료에 값 부여한 인증 GA값₁(W)로 트레이스할 수 있는 GA값(Q₂')을 결정하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 당화알부민(GA) 인증치로 트레이스할 수 있는 GA값의 측정 방법:
A₄) 이하의 b)∼e₀), j), m) 및 p)를 포함하는 공정에 의해 회귀식 VI을 결정하는 공정;
b) 이하의 식 1:
GA 농도_[L](A)
= GA 인증 표준물질의 GA 인증치(B)×GA 인증 표준물질의 알부민 농도(C) (식 1)
을 이용하여, 다른 GA 인증치를 갖는 2종 이상의 GA 인증 표준물질의 GA 농도_[L](A)를 결정하는 공정;
c) 2종 이상의 GA 인증 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(D)를 측정하는 공정;
d) 2종 이상의 GA 유래의 흡광도(D)와 2종 이상의 GA 농도_[L](A)로부터 회귀식 I:
D =αA+β (회귀식 I)
을 작성하는 공정;
e₀) 절편을 제로로 하는 이하의 직선의 식 II₀:
D =α₀E (식 II₀)
을 작성하는 공정
(여기서, α₀은 임의의 플러스의 값이고, E는 GA 유래의 흡광도(D)와 비례하는 GA 농도_[P](E)이다);
j) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA 유래의 흡광도(S)를 측정하고, 회귀식 I을 이용하여 대응하는 GA 농도_[L](T)를 결정하는 공정;
m) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA 유래의 흡광도(S)로부터, 식 II₀을 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](X)를 결정하는 공정; 및
p) 2종 이상의 피험재료의 GA 농도_[L](T)와 GA 농도_[P](X)로부터 회귀식 VI:
T = ψX+ω (회귀식 VI)
을 작성하는 공정
(상기 각 공정 중, GA 농도_[L]는 글루코오스가 결합한 리신 잔기(DOF-Lys)의 농도이고, GA 농도_[P]는 당화아미노산 또는 당화펩티드의 농도이다).
제13항에 있어서, 추가로 이하의 공정을 포함하는 방법:
B) 표준물질에 있어서의 GA 유래의 흡광도(G)를 측정하고, 식 II₀를 이용하여 대응하는 GA 농도_[P](H)를 결정하는 공정; 및
C) 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(I)를 측정함으로써 표준물질의 알부민 농도(J)를 결정하는 공정.
제13항 또는 제14항에 있어서, 공정 b)에 앞서서, 추가로 이하의 공정 a1)∼a3):
a1) 하기 식 4:
알부민 몰 인증치(L)
= 알부민 인증 표준물질의 알부민 인증치/알부민의 분자량 (식 4)
을 이용하여 알부민 몰 인증치(L)을 결정하는 공정;
a2) 알부민 인증 표준물질의 알부민 유래의 흡광도(M)를 측정하는 공정;
a3) 알부민 몰 인증치(L)과 흡광도(M)로부터 하기 식 5:
M = θL (식 5)
를 만족하는 θ를 결정하는 공정
을 포함하고, 공정 A₄)가 추가로 이하의 공정 k):
k) 2종 이상의 피험재료에 있어서의 알부민 유래의 흡광도(U)를 측정하여 알부민 농도(V)를 결정하는 공정
을 포함하고, 공정 A₄)가 공정 j) 및 k)보다 후에 추가로 이하의 공정 l):
l) 이하의 식 8:
GA값₁(W) = GA 농도_[L](T)/알부민 농도(V) (식 8)
을 이용하여, 2종 이상의 피험재료에 있어서의 GA값₁(W)을 GA 농도_[L](T)로부터 결정하는 공정
을 포함하고, 방법이 추가로 이하의 공정:
F1') 피험재료의 GA 유래의 흡광도(S)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 효소법에 의한 GA 농도_[P](N')를 결정하는 공정;
F2') 공정 F1')에서 이용한 피험재료의 알부민 유래의 흡광도(U)로부터, 표준물질을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여, 대응하는 알부민 농도(O')를 결정하는 공정;
F5') GA 농도_[P](N')로부터 회귀식 VI을 이용하여 피험재료의 GA 농도_[L](R')를 결정하는 공정; 및
F6') 하기 식 7':
피험재료의 GA값(Q₃')=GA 농도_[L](R')/알부민 농도(O') (식 7')
을 이용하여, 공정 F1')에서 이용한 피험재료에 설정한 GA 인증치₁(W)로 트레이스할 수 있는 GA값(Q₃')을 결정하는 공정
을 포함하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 3종 이상의 GA 인증 표준물질을 이용하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GA 인증치가 동위체 희석 질량 분석(ID-MS)법에 의한 GA 인증치인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GA 인증치가 동위체 희석 질량 분석(ID-MS)법에 의한 GA 인증치이고, 상기 GA 인증 표준물질이 JCCRM 611인 방법.
제2항의 방법으로 결정된 회귀식 III, 제7항의 방법으로 결정된 회귀식 IV, 제10항의 방법으로 결정된 회귀식 V 및 제13항의 방법으로 결정된 회귀식 VI으로 이루어지는 군에서 선택되는 회귀식;
GA 측정용 시약;
알부민 측정용 시약; 및
표준물질
을 포함하는 GA값 측정용 키트.