KR20190039099A

KR20190039099A - 히알루론 산의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정

Info

Publication number: KR20190039099A
Application number: KR1020197002718A
Authority: KR
Inventors: 마라 피타렐로; 프란체스코 보릴레; 빈센차 코르사
Original assignee: 피디아 파마슈티치 에스.피.에이.
Priority date: 2016-07-28
Filing date: 2017-07-27
Publication date: 2019-04-10
Anticipated expiration: 2037-07-27
Also published as: AU2017304290B2; CN109563178A; SMT202000437T1; EA039615B1; US20190224232A1; EA201990091A1; ES2811101T3; WO2018020458A1; IT201600079633A1; CN109563178B; PL3491027T3; AU2017304290A1; CA3030243A1; JP6980974B2; EP3491027A1; JP2019528055A; PT3491027T; US20210046103A1; EP3491027B1; US11395833B2

Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 (streptococcus) 또는 바실러스(bacillus)의 발효 브로스로부터 또는 닭벼슬로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정, 상기 공정을 이용하여 얻고 정제된 HA의 소듐 염 및 상기 HA의 소듐 염을 포함하는 약제학적, 화장품 및 영양 조성물에 관한 것이다.

Description

히알루론 산의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정

본 발명은 히알루론 산의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정에 관한 것이다.

히알루론 산 (HA)은, D-글루쿠론 산 및 N-아세틸-D-글루코사민의 교대 잔류물로 이루어진 설페이트 그룹이 없는 고-분자량 선형, 음이온성 다당류이다.

이것은 세포주변 겔 내, 척추동물 유기체의 결합 조직의 기본 물질 (주요 요소 중 하나를 나타냄) 내, 관절의 활액 내, 유리체액 내 및 탯줄 내에 자연적으로 존재한다.

그러므로 HA은, 무엇보다도 수많은 조직, 가령 피부, 힘줄, 근육 및 연골의 세포의 기계적인 지지와 같은 생물학적 유기체에서 중요한 역할을 한다.

HA는, 그의 막 수용체, 특히 CD44, CD54 및 CD168을 통해, 세포의 생리학 및 생물학, 가령, 예를 들어, 증식, 이주, 세포 분화 및 혈관형성에 관련되는 많은 상이한 과정을 조절하고, 다른 기능 가령 조직의 수화 및 관절의 윤활을 또한 행사하는 것이 또한 공지되어있다. 그것은 절대적으로 생체 적합하고, 그의 수많은 특별한 특징 덕분에, 조직 수복부터 점성 부가적인 요법까지, 피부-미용 약제부터 안내(intraocular) 수술까지, 조직 공학부터 세포 요법까지 등의 다양한 분야에서 폭넓게 사용된다.

HA의 물리-화학적 및 생물학적 특징은 극도로 가변적인 그의 분자 중량 (MW)과 밀접한 상관 관계가 있다: HA의 중량 평균 MW은 대략 20,000 내지 13x10⁶ Da 범위이고, 공급원 및 이것을 분리하기 위해 사용되는 제조 및 정제 방법에 관하여 급진적으로 변화하기 때문에 이 근사치가 필요하다는 것이 일반적으로 주장될 수 있다.

HA을 얻기 위한 기본적으로 두 가지 주요 방법이 있다:

동물 공급원으로부터의 제조: 역사적으로 HA은 동물 조직 가령 탯줄, 유리체액 또는 소 활액 및, 무엇보다도, 닭벼슬로부터 추출된다. 동물 공급원으로부터의 HA의 제조는 많은 제한이 있고, 이것은, 예를 들어, 다양한 유형의 불순물 (조직의 소화 이후 대다수의 유기 잔류물로부터 시작됨)을 제거하기 위해 수많은 통로가 필요하기 때문에 비싸고, 그러므로 동물 공급원으로부터의 HA의 제조는 가능하게는 초기 물질내에 존재하는 임의의 오염물 물질 (가령 바이러스)의 불활성화 및 제거를 보장하는 통로를 요구하고, 상당한 양의 원료의 유용성을 요구하고 큰 산출량을 생성하지 못하고;

미생물의 발효: 적합하게 자극된 및/또는 변형된, 몇몇 미생물, 특히 스트렙 토코커스(streptococcus) 또는 파스튜렐라( pasteurella ) 속 미생물은, 본 업계의 숙련가에게 공지되어있는 다양한 공정을 통해 분리된 배양 브로스에서 분비되는 HA을 제조하는 것을 할 수 있다. 또한 이 경우에서, 존재하는 "불순물" 가령, 예를 들어, 사용되는 미생물의 세포벽의 잔류물, 금속 이온, 핵산 및 임의의 다른 요망되지 않는 단백질성 물질을 제거하기 위해 수많은 통로가 필요하다. 이러한 제한에도 불구하고, 미생물의 발효로부터의 HA의 제조는, 현재까지, 가장 발달되고 폭넓게 사용되는 HA의 제조 방법이다. 새로운 방법은, 적합한 숙주 세포, 가령 몇몇 종류의 바실러스 (bacillus) ( 메가테리움 ( megaterium ) 및 섭틸리스 ( subtilis )) 내 및 대장균(escherichia coli ) 내 효소 HA-신타아제를 발현하는 유전자의 형질주입을 통한 바이오-기술을 통한 HA의 제조를 위해 연구된다. 하지만 임의의 잠재적으로 유해한 잔류물을 제거하기 위해 적합한 모든 절차가 이러한 제조 방법을 위해 또한 필요하다.

임의의 경우에서, 사용되는 방법에 관계없이, HA의 제조에서의 주요 통로는 명백하게 다당류의 추출 및 정제 단계이다. 공지되어있는 방법은 다양하고 극도로 분명하게 표현되고, HA을 얻기 위한 초기 공급원에 대하여 명백하게 조절된다. 가장 먼저, 공급원의 잔류물을 제거해야하고, 그 결과, 동물 조직로부터 추출을 위해 단백질 소화 단계, 및 그 다음 여과, 원심분리 및 세척이 있고; 발효를 위해, 원심분리 및 점진적 세척이 정상적으로 사용된다. 임의의 경우에서, 액체 분획이 얻어지고, 이로부터 다당류가 분리된다. 이 점에 있어서, 가장 잘 공지되어있고 확실하게 가장 폭넓게-적용되는, 무엇보다도 동물 공급원으로부터의 HA에 대한 절차는 용매를 이용한 침전이다: 간단히 말해서, 유기 용매 (에탄올, 아세톤)의 농도를 증가시키는 것이 상기 언급된 액체 분획 상에 사용되고, 히알루론 산의 침전을 초래하고, 그 다음 가용화 및 침전에 의하여 이후 정제된다.

대체 시스템은 다당류를 복합체화시키는 것 및 그의 침전을 초래하는 것을 목표로 4차 염, 세틸피리디늄 또는 세틸트리메틸암모늄의 사용을 예상한다. 최종 생성물을 얻기 이전에 그 다음 가용화 및 침전이 다시 필요하다.

기술의 개발은 또한 상기 기술된 주요 단계를 조합하여, 수율 면에서 능률적이고 순도 면에서 효과적인 공정을 만들었다: 현재까지, 하지만, 특히 HA을 기반으로 한 주사 가능한 약제학적 조성물의 투여 이후에 발생하는, 관할 관청 (가령 FDA)에 보고된 대략 수 백의 수많은 부작용이 여전히 있다.

이 다당류는 다음의 넓은 다양한 분야 및 병리학에서 사용된다: 보습 작용을 갖는 화장품 용도 (국소 또는 경구 투여에 의한)부터 진정 효과를 갖는 국소 피부화장품 용도까지, 주름 또는 상처든 피부 결함 (피내)의 교정을 위한 주사하는 장치로부터 더욱 엄격한 약리학적 용도 가령 뼈 및 관절 질환에서의 관절 내 사용, 또는 유리체액 대체물로서 안내(intraocular) 사용까지, 등.

반면, 손상된 조직을 포함하지 않는 화장품 용도를 위해, 화장품-등급 HA (낮은 순도)이 충분하지만, 주사 가능한 약제학적 용도 (특히 밀폐된 공동 가령 관절 및 눈에서)의 경우에서, 절대 순도의 정도가 필요한 것이 명백하다: 다양한 유형의 오염물, 가령 핵산 및/또는 단백질 및/또는 그람-양성 (예를 들어 바실러스 (bacillus), 스트렙토코커스(streptococcus), 엔테로코커스 ( enterococcus ) 및 스타필로코커스 (staphylococcus) 속)의 세포벽의 잔류 세균 톡신 가령 리포테이코 산 LTA 또는 그람-음성 (가령, 예를 들어, 대장균( escherichia coli ), 파스튜렐라( pasteurella ) 및 살모넬라(salmonella))의 세포벽의 잔류 세균 톡신 가령 지질다당류 LPS의 존재는 국소적 및 전신성 수준 모두에서 사이토카인 (특히 TNF 및 IL-1)의 방출의 결과로 일어나는 현저한 염증성 반응을 초래할 수 있고, 패혈성 쇼크의 형태에 도달하는 (가장 심각한 경우에서), 전체 유기체 내 반향과 함께 일반화된 염증성 반응 촉발할 수 있고, 이것은 상기 인용된 부작용의 수많은 보고를 설명한다. 실제로, LTA 및 LPS는 강력한 면역 반응을 초래할 수 있고, 가장 심각한 경우에서, 관절염, 신염, 수막염 또는 훨씬 치명적일 수 있는 결과를 갖는 열 및 쇼크를 초래할 수 있는 지질 부분 및 당류 부분으로 이루어진 중합체이다.

이전에 언급된 것과 같이, HA의 MW은 공급원 및 제조 방법에 관하여 달라진다는 것이 고려되어야 한다. 더욱 구체적으로, 본 명세서에서 명시된 MW은 "고유 점도" 방법을 이용하여 측정된 중량 평균 분자 중량을 나타낸다. MW의 다양성은 상이한 분야에서 HA의 사용을 결정한다: 예를 들어, 저 MW은 피부과 또는 피부화장품 제조 (약 200 kDA; Connectivine^®)에서 적용되는 반면, 관절 내 적용에 있어서, 성형 수술 또는 안내(intraocular) 적용에 사용되는 1500 kDA 이상의 MW까지의 더 높은 분자 중량 (정상적으로 700-1800 kDA의 범위 이내; Hyalgan^®, Hyalubrix^®Orthovisc^®)이 바람직하다. HA의 MW을 완벽하게 보정하는 것은, 중합체의 생물학적 및 물리-화학적 특성을 결정하기 때문일 뿐만 아니라, 30,000 Da 보다 낮은 MW을 갖는 HA이, 용도에 관계없이, 전혀 요망되지 않는 강력한 염증성 효과를 갖는다는 것이 충분히 입증되기 때문에 (EPO 138572) 매우 중요하다.

이것은, HA의 제조 및 정제 공정에서, 다음의 다양한 요소가 평가되고 제어되어야 한다는 것을 의미한다:

· 공정 수율: 선택되는 제조 공급원으로부터 HA의 최대한 가능한 양을 추출하는 것은 기본적이고;

· 모든 정제 단계의 정확도: 얻은 생성물은 염증성 과정을 일으킬 수 있는 임의의 오염물이 없어야 하고;

· MW의 분획화: 요망되는 MW 및 염증성 분획이 제거된 확실성이 얻어야 한다.

이러한 필요조건을 조합하는 수많은 시도가 최신 기술에서 공지되어있다. 이들 중 다음은 개략적으로 언급될 수 있다:

US 5925626: 에탄올을 이용한 침전 및, 염증성 분획이 없는 2 개 MW 분획 (50-100 kDa 및 500-730 kDa)의 형성에 의한 닭벼슬로부터 HA의 정제;

EP535200: 4차 아민으로의 염화 및 그 다음 용매 침전 (에탄올 또는 아세톤)에 의한 닭벼슬로부터 HA의 정제. 염증성 분획이 없는 및 구체적으로 안과 용도를 위한, 750 내지 1230 kDa 범위인 MW을 갖는 HA을 얻었다;

US 6489467: HCl을 사용한 강제적인 산성화, 그 다음 pH에서의 변화에 의한 스트렙토코커스(streptococcus)로부터 HA의 정제, 및 약 1700 kDa 의 MW을 갖는 HA 얻는 투석여과;

Choi et al. Biomaterials Research, 2014 , 18, 1-10: 투석여과 및 아세톤을 이용한 침전에 의한 스트렙토코커스 (streptococcus) 주에피데미쿠스(zooepidemicus)로부터의 HA의 정제. 900 내지 1100 kDa 범위인 MW을 갖는 HA을 얻었다;

EP2870255: 여과 및 한외여과에 의한 스트렙토코커스 (streptococcus) 주에피데미쿠스(zooepidemicus)로부터 HA의 정제, 60 내지 2400 kDa 범위인 MW에 도달하는 pH 변화, 및 에탄올을 이용한 최종 침전.

본 발명의 목적은

· 오염물이 없기 때문에 매우 고 순도 정도 및

· 정밀한 및 특정한 MW을 갖는 그의 제조를 가능하게 하는 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 새로운 공정에 관련된다.

히알루론 산 및 그의 소듐 염의 새로운 정제 공정은, 본 업계의 숙련가에게 폭넓게 공지되어있는 것과 같이 제조된 HA의 정제를 위한, 분명하게 표현되고 순차적인 다양한 단계를 포함한다: 두 생물학적 공급원으로부터, 특히 닭( gallus )의 속 새의 볏으로부터 (EP0138572, 이하 이러한 볏은, 새의 성별에 관계없이, 닭벼슬로서 명시될 것임) 및, 또한 바실러스 (bacillus) 섭틸리스 ( subtilis ) 및 바실러스 (bacillus) 메가테리움 ( megaterium ) (EP 2614088, EP2614087)으로부터 분자 공학 기술을 이용하여 제조된 HA에 적용 가능한, 스트렙토코커스(streptococcus)의 발효 공정으로부터; 이 공정은 바람직하게는 스트렙토코커스(streptococcus)의 발효 브로스로부터, 훨씬 더욱 바람직하게는 스트렙토코커스 (streptococcus) 에쿠이 ( equi ) 아종. 에쿠이 ( equi ), 68222, 돌연변이 H-1 (EP0716688)의 브로스로부터 얻은 HA에 적용 가능하다. 출원인은, 유럽 약전 (HA의 단행본: Ph , Eur , 5.0, 01/2005: 1472)에 의해 요구되는 모든 물리-화학적 규격과 부합하는 HA의 소듐 염 뿐만 아니라, 특히, 몇몇 순도 특성에 대해 어떻게 이 공정이 제조를 가능하게 하는지를 입증하였고, 매우 고도의 순도 를 갖는 히알루론 산을 보장하기 위하여, 출원인에 의해 청구된 명세서가 추가로 제한되어왔고, 이는 임의의 전-염증성 및 발열원 요소가 없기 때문에 완전한 안전에서 특히 모든 주사 가능한 약제학적 조성물 (관절 내, 피내 및 안내(intraocular))에서 사용될 수 있다. 본 발명의 새로운 공정 목적에 의하여 정제된 HA의 소듐 염은, 본 업계의 숙련가에게 공지되어있는 모든 유도체, 가령, 예를 들어, 중금속을 갖는 그의 염 (EP 0827514), 에스테르 (EP 0216453), 아미드 (EP 1095064) 설포네이트 (EP0940410) 및 가교결합된 생성물, 그 중에서도 자가-가교결합된 생성물 (EP0341745)의 제조에 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은, 정밀한 중량 평균 MW을 갖는 HA의 상이한 분획을 얻기 위하여 여전히 정제될 특정한 HA의 열 처리 단계 , 특히 스트렙토코커스 (streptococcus) 의 발효 브로스(이 HA을 함유함)에 또한 관련된다: 출원인은 실제로, 발효 브로스의 불활성화 단계를 따르거나 닭벼슬의 효소 소화와 동시에 일어나는 온도 및 처리 시간 (아래에 상세히 기술된 조건) 면에서 특정한 열 처리를 완벽하게 했고, 이는 요망되는 고유 점도를 갖는 최종 생성물이 얻어지는 것을 가능하게 한다. HA의 특정한 중량 평균 MW 값은 특정한 값의 고유 점도에 해당하고, 이 점도는 "고유 점도" 방법 ( Ph . Eur . 5.0, 01/2005: 1472)에 따른 유럽 약전의 HA의 해당하는 단행본 내에 기술된 것에 따라 계산된다.

본 발명의 추가의 목적은 상기 분획을 함유하는 약제학적, 화장품 및 영양 조성물, 더욱 구체적으로 다음에 관련된다:

- 관절염 관절의 점성-보충에서, 외상성 관절 손상에서, 연골하 손상에서 사용되기 위한, 매우 고/고/중 중량 평균 MW을 갖는 HA의 소듐 염을 함유하는 관절 내 사용을 위한 약제학적 조성물;

- 매우 고/고/중/저 중량 평균 MW을 갖는 HA의 소듐 염을 함유하는, 안내(intraocular) 사용 또는 눈 질환의 치료를 위한 안구 투여를 위한 사용을 위한 약제학적 조성물;

- 수술 후 유착의 예방에서 사용되는 매우 고/고/중/저 중량 평균 MW을 갖는 HA의 소듐 염을 함유하는 약제학적 조성물;

- 매우 고/고/중/저 중량 평균 MW을 갖는 HA의 소듐 염, 바람직하게는 중/저 중량 평균 MW을 갖는 HA의 소듐 염을 함유하는, 피부 궤양, 욕창, 화상, 상처 및 피부 병변의 치료에서의, 켈로이드 또는 위축성/비후성 상처의 치료에서의, 그러므로 온전한 또는 손상된 피부를 갖는 모든 유형의 피부 결함의 치료에서의, 및 피부 질환 가령 습진 및 다양한 종류의 피부염, 특히 아토피성 피부염 및 기저귀 발진, 건선의 치료를 위한 요법으로서의, 국소 또는 주사 사용 (피내 및/또는 근내)을 위한 약제학적 조성물;

- 매우 고/ 고/중 중량 평균 MW을 갖는 HA의 소듐 염을 함유하는 방광내 용도를 위한, 특히 간질성 방광염의 치료를 위한 약제학적 조성물;

- 피부-미용 분야 내 필러로서 또는 성형 수술 내 체형 보정으로서 매우 고/ 고/중 중량 평균 MW을 갖는 HA의 소듐 염을 함유하는 주사 용도를 위한 약제학적 조성물;

- 국소 및 경구 용도를 위한 화장품 조성물;

- 힘줄 영양, 피부 영양 및 위장 점막의, 경구 치료 또는 관절염 관절에서의 사용을 위한 매우 고/ 고/중/저 중량 평균 MW을 갖는 HA의 소듐 염을 함유하는 약제학적 또는 영양상의 조성물.

본 발명의 추가의 목적은, 패드, 직물, 부직포, 과립화물, 필름 및 겔의 형태로, 또한 다양한 유래의 세포 및/또는 혈액 요소, 가령, 예를 들어, 혈소판-유도체와 가능한 조합으로, 본 발명에 따라 정제된 HA을 이용하여 제조된 유도체를 포함하는 2/3-차원 생체물질에 또한 관련된다.

출원인은, 주로 단백질, 핵산에 의해 및/또는 다른/다양한 종류의 발열원에 의해 나타나는 히알루론 산의 선택되는 제조 공급원으로부터 유도되는 모든 불순물을 제거하는 주요 목적을 갖는 다음의 정제 공정을 완벽하게 했다. 특히, 본 발명의 목적은, 발효 브로스 내에 정상적으로 부재하지만 (공급원 균주로부터) 가능한 오염이 매우 중요한 안전 문제를 나타내는, 그람-양성 세균 가령 스트렙토코커스(streptococcus) 또는 바실러스(bacillus)로부터 (또는 세균 가령, 예를 들어, 엔테로콕사이(enterococci) 및 스타필로콕사이(staphylococci)로부터) 또는 그람-음성 세균 가령, 예를 들어 대장균( escherichia coli ) (또는 파스튜렐라(pasteurella) 및 살모넬라(salmonella))로부터 유도되는 세균 톡신의 완전한 제거이다: 최종 생성물로서 HA 내 톡신 (가령 LTA 또는 LPS)의 존재는, 치료된 관절 또는 조직의 염증/감염, 심지어 그들의 완전한 파괴 또는 괴사까지 초래할 수 있는, 고도의 전-염증성 요소의 제조를 결정할 수 있기 때문에 요구되는 필요한 순도를 실제로 박탈한다.

HA의 소듐 염의 새로운 정제 공정은 다음을 보장한다:

· 높은 공정 수율

· 생성물의 총 순도

· 요망되는 고유 점도 (따라서 MW)를 갖는 분획의 제조.

공정은 다음의 2 개 또는 3 개 단계로 이루어진다:

· 불활성화 (이 단계는 바실러스 (bacillus) 및 스트렙토코커스(Strepococcus)의 발효 브로스로부터 HA의 제조만을 위해 존재한다);

· 추출;

· 정제.

불활성화: 이 단계는 본 업계의 숙련가에게 공지되어있는 조건 하에 적합한 배양 배지를 함유하는 특정한 발효조에서 발효된 스트렙토코커스(streptococcus)로부터 (및 또한 바실러스(bacillus)로부터) HA의 제조에 관련되고; 이 공정은, 바람직하게는 HCl을 이용하여 4 및 5 사이의 값으로 pH를 감소시키기 위한, 배양 브로스의 산성화에 의한 세균의 불활성화 단계가 뒤따르고, 이 pH 값에서 실제로 스트렙토코커스(streptococcus)는 그의 대사 활성을 완전히 중단시킨다.

뒤이어 고 또는 중 점도를 갖는 또는 저 점도를 갖는 HA의 제조를 위해 가열하는 것에 의해 비활성 브로스의 열 처리 (아래에 기술된)를 하고; 이 처리는 매우 고 점도를 갖는 HA의 제조의 경우에서 수행되지 않는다. 상기 명시된 것과 같이, 실제로, 특정한 MW 범위는 특정한 점도 범위에 해당하고 이렇게 하여 출원인은, 아래에 입증된 것과 같은 절대 정밀도를 갖는 요망되는 분획의 제조를 가능하게 하는 공정을 개발했다.

바이오매스는, 0.5 μm와 같은 여과 정도를 갖는 필터 (프로필렌 필터가 바람직함)를 통해 가능한 추가의 그 다음 여과를 이용하여, 셀라이트 (규조토, 화학명: 실리카 다이옥사이드)의 패드 상에 비활성된 브로스를 여과하는 것에 의해 제거되고; 브로스는 바람직하게는 소다 (NaOH)를 이용하여 6.5-7.5의 pH에서 중화된다.

추출: 이 단계는 스트렙토코커스 (streptococcus) 및 바실러스(bacillus)로부터 HA의 제조 및 닭벼슬로부터 얻은 HA 모두에 공통적이고; 후자에서, 본 발명에 따른 공정은 EP 0138572에서 기술된 것에 따라 닭벼슬로부터 얻은 균질액으로부터 시작한다. 더욱 구체적으로, 균질액은 고 또는 배지 또는 저 점도를 갖는 HA의 제조를 위해 가열하는 것에 의해 (아래에 기술됨) 열 처리되고; 이 열 처리는, 본 업계의 숙련가에게 공지되어있는 것과 같은, 포스페이트 완충액 내 제조된 효소 파파인을 이용하여 효소 소화 (상기 균질액 - 이하 효소 소화 균질액으로서 정의된 - 이 처리됨)와 동시에 수행된다. 중화된 여과액 내에 존재하는 또는 열 처리를 겪은 효소 소화의 혼합물 내에 존재하는 비-정제된 히알루론 산 (이하 비-정제 HA을 함유하는 배지로서 정의됨)은 이어서, 교반 하에 추가의 셀라이트를 부가하는 것 이후에, CPC를 이용하여 (세틸 피리디늄 클로라이드, CPC-HA 염이 형성됨) 복합체화된다. 복합체는 제거된 액체 상으로부터 고체를 분리하기 위해 방치된다. 이후 고체 상으로 존재하는 HA는 NaCl 염유사 용액과 함께 교반 하에 가용화되고, 얻은 생성물 (이 배지에 가용성인 HA의 소듐 염)은 잔류 셀라이트를 분리하기 위한 여과포에 의하여 및 3 μm와 같은 여과 정도를 갖는 필터에 의하여 (폴리프로필렌 필터가 바람직함) 추가의 여과/정제하여 여과액을 수집한다. 이 특정한 절차는 아직 정제되지 않은 HA의 소듐 염의 "추출"로서 정의되고, 1 번에서 4 번까지 수행될 수 있다. 여과된 생성물을 수집하고 결합시키는 것 이후에, 이렇게 "추출된" 생성물은 200 내지 300 옹스트롬 범위인 기공(pore) 반경 덕분에 큰 크기의 분자를 흡수하기에 적합한 방향족 유형의 특정한 수지를 이용하여 처리되고, 이들은 다당류가 정제되는 유래의 시스템으로부터 및 또한 상기 공정에서 사용되는 물질로부터 유도되는 HA의 총 불순물을 낮추는데 결정적으로 기여한다. 가교결합된 폴리스티렌 매트릭스로 이루어진 수지가 바람직하게는 사용되고, 수지 DIAION HP20 (또는 HP20L) (MITSUBISHI CHEMICAL)이 특히 능률적인 것이 증명되었다. 상기 처리는 일정 기간 동안 교반 하에 수지 및 추출물을 방치시키는 것으로 이루어진다. 이후 얻은 생성물은 바람직하게는 폴리프로필렌 (HA 소듐 염으로부터 수지를 분리하기 위한)으로 제조된 필터/여과포에 의하여, 가능하게는 또한 3 μm-여과 정도 필터 상에서 여과된다.

정제: 이 최종 단계는, 추출" 단계에서 얻은 HA의 소듐 염의 에탄올 내 침전에 의해 가능하게는 선행될 수 있고 (특히 닭벼슬로부터 비롯될 때, 다당류를 추가로 정제하기 위하여 이 단계가 도입될 수 있음); 상기 용매의 제거 뒤이어 침전물의 물에서 재가용화, 이어서 다음의 "정제" 단계로 진행된다: 잔류 톡신의 전체 제거를 위하여 물에서 NaOH을 부가하는 것, 바람직하게는 HCl (37중량%)을 이용하여, 8 내지 9 범위인 pH까지 중화시키는 것 (용어 "중화"는 중성에 가까운 값으로 pH를 낮추려는 출원인의 의도를 명시하기 위해 이 단계에서 사용됨), 여과 바람직하게는 3 μm의 여과 정도를 갖는 필터에 의한 여과, 침전 및 에탄올을 이용한, 유기 용매, 바람직하게는 아세톤 내에서 최종 세척하는 적어도 한 번의 세척. 이와 같이 제조되고 정제된 HA의 소듐 염은 본 업계의 숙련가에게 공지되어있는 것과 같이 건조된다.

그러므로 본 발명의 목적은 그의 단계에서 아래에 도식화된 HA의 소듐 염 제조 및 정제 공정과 관련된다:

A. 불활성화 (스트렙토코커스 (streptococcus) 및 바실러스(bacillus)의 발효로부터 제조된 HA의 정제를 위한):

A1. 4-5의 pH로 발효 브로스를 산성화하는 것; HCl 1N이 바람직하게는 사용되고;

A2. 교반 하에, 브로스의 열 처리(매우 고 점도를 갖는 HA가 제조된다면 이 처리는 영향을 받지 않는다);

A3. 셀라이트 (화학명: 실리카 다이옥사이드; 20 내지 60g/리터의 브로스, 바람직하게는 30-40g/리터의 양으로)의 패드 상의 여과, 0.5 μm의 여과 정도를 갖는 필터, 바람직하게는 폴리프로필렌 필터를 이용하여 가능한 추가의 여과에 의한 바이오매스의 제거;

A4. pH 6.5-7.5로, 바람직하게는 20% 수용성 NaOH을 이용하여 중화하는 것.

B. 추출:

닭벼슬로부터 균질액의 경우에서, 해당하는 열 처리는 그의 효소 소화 및 그 다음 여과 (소화되지 않은 생물학적 잔류물을 제거하기 위함)와 동시에 먼저 수행되고, 뒤이어 다음의 공통 단계가 수행된다:

B1. 적어도 30 분 동안 교반 하에서, 셀라이트를 부가하는 것 (20 내지 60g/리터의 효소 소화의 브로스/리터, 즉, 리터 당 비-정제 HA을 함유하는 배지의 양으로) 및 세틸 피리디늄 클로라이드 (CPC)를 이용하여 복합체화시키는 것 (4-20g/리터/리터, 바람직하게는 5-15g/리터의 효소 소화), 이후 적어도 30 분 동안 침강시키는 것;

B2. 액체 상의 제거;

B3. NaCl (0.3M 수용액이 바람직하게는 사용됨) 내 고체 상으로 존재하는 HA을 4 내지 24 시간의 기간 동안 교반 하에 가용화하는 것, 여과포 및 3 μm의 여과 정도를 갖는 필터 (폴리프로필렌 필터가 바람직함)에 의하여 잔류 셀라이트를 분리하기 위한 여과 및 HA의 소듐 염으로서 제1 추출물을 수집하는 것; 이 절차는 1 번에서 4 번까지 반복되어야 하고;

B4. 추출물을 결합시키는 것;

B5. 결합된 추출물에 200-300 옹스트롬의 기공(pore) 반경을 갖는 방향족 유형의 수지의 부가(10 내지 60g/리터의 추출물의 양으로), 가교결합된 폴리스티렌 매트릭스로 구성된 수지가 바람직하고, 수지 DIAION HP20 (또는 HP20L)이 훨씬 더욱 바람직하고, 이 처리는 적어도 8 시간 동안 교반 하에 수행되고;

B6. HA의 소듐 염으로부터 수지를 분리하기 위한 여과포 (바람직하게는 폴리프로필렌으로 만들어짐)에 의한 적어도 한 번의 여과, 및 3 μm-여과 정도 필터를 이용하는 (이 여과를 위해, 폴리프로필렌 필터가 바람직함) 가능하게는 적어도 한 번의 여과.

C. 정제:

닭벼슬로부터 얻은 HA의 소듐 염의 경우에서, 이 단계는 가능하게는 이전 단계에서 얻은 HA의 소듐 염을 에탄올 내 침전시키는 것, 상기 용매를 제거하는 것 및 정제수 (Ph . Eur.8.0, 01/2009:0008) 내 침전물을 재-가용화하여 초기 부피를 회복시키는 것에 의해 선행될 수 있고, 선택되는 공급원에 관계없이, 이어서 다음의 정제 단계로 진행된다:

C1. 교반 하에 물에서, NaOH을 부가하는 것 (0.2-0.4 M 용액이 바람직하게는 사용됨);

C2. 8 내지 9 범위인 pH로, 바람직하게는 HCl(37%)을 이용하여 중화;

C3. 여과, 3 μm의 여과 정도를 갖는 필터가 바람직함 (폴리프로필렌 필터가 바람직함);

C4. 에탄올을 이용하여, 단계 C3.에서 얻은 HA의 소듐 염을 침전시키고 적어도 한 번 세척하고, 유기 용매, 바람직하게는 아세톤 내에서 최종 세척하는 것;

C5. 본 업계의 숙련가에게 공지되어있는 것과 같이 건조시키는 것, 바람직하게는 진공 하에서, 15 시간 이상 동안 25 및 40° 사이에서, HA의 소듐 염을 건조시키는 것.

HA의 소듐 염의 중량 평균 MW의 결정

본 발명의 열 처리 목적은, 아래에 기술된 특정한 범위 이내에 속하는 고유 점도 (IV)를 갖는 HA의 소듐 염의 제조를 가능하게 한다 (Ph . Eur. 5.0. 01/2005; Ph. Eur . 1472에서 기술된 방법에 따라 측정된 IV):

스트렙토코커스 (streptococcus) 또는 바실러스(bacillus) 의 발효 브로스로부터 HA의 열 처리 :

5-40 분 동안 60 ± 5°C: 이것은 고 점도를 갖는 HA, 그러므로 17-24 dl/g의 범위 이내의 최종 IV를 갖는 HA의 소듐 염의 제조를 가능하게 하고; 상기 열 처리는 바람직하게는 65°C에서 5-30 분 동안 수행되고;

5-40 분 동안 70 ± 5°C: 이것은 중 점도를 갖는 HA, 그러므로 10-15 dl/g의 범위 이내의 최종 IV를 갖는 HA의 소듐 염의 제조를 가능하게 하고; 상기 열 처리는 70°C에서 5-30 분 동안 바람직하게는 수행되고;

150-300 분 동안 90 ± 5°C: 이것은 저 점도를 갖는 HA, 그러므로 3-6 dl/g의 범위 이내의 최종 IV를 갖는 HA의 소듐 염의 제조를 가능하게 하고;

열 처리가 수행되지 않는다면, 발명의 목적에 따른 정제된, HA의 소듐 염의 최종 IV는 29 dl/g와 동등하거나 이상이고, 그러므로 정제된 생성물은 매우 고 점도를 갖는 HA의 소듐 염이다.

닭벼슬로부터 HA의 열 처리:

26-30 시간 동안 50-60°C: 이것은 고 점도를 갖는 HA, 그러므로 17-24 dl/g의 범위 이내의 최종 IV를 갖는 HA의 소듐 염의 제조를 가능하게 하고; 상기 열 처리는 55°C에서 28 시간 동안 바람직하게는 수행되고;

28-30 시간 동안 60-65°C: 이것은 중 점도를 갖는 HA, 그러므로 10-15 dl/g의 범위 이내의 최종 IV를 갖는 HA의 소듐 염의 제조를 가능하게 하고; 상기 열 처리는 60°C에서 30 시간 동안 바람직하게는 수행되고;

46-50 시간 동안 65-70°C: 이것은 저 점도를 갖는 HA, 그러므로 3-6 dl/g의 범위 이내의 최종 IV를 갖는 HA의 소듐 염의 제조를 가능하게 하고; 상기 열 처리는 65°C에서 48 시간 동안 바람직하게는 수행된다.

처리 종료 시, 본 업계의 숙련가는 샘플을 수집할 수 있고 얻은 점도를 확인할 수 있고, 도달된 결과에 기초하여, 요망되는 점도에 도달하기 위한 처리의 시간 및/또는 온도 (여전히 기술된 범위 이내)의 동작 또는 조절을 반복할 수 있다: 상기 기술된 IV의 범위에 도달하기 위한 처리 시간 및 온도는 실제로 초기 브로스/소화 내에 존재하는 HA의 농도 및 MW에 의존한다.

해당하는 평균 MW을 명시하기 위해 Mark- Houwink 식 (Terbojevich M. et al, Carbohydrate Research, 1986, 149, 363-377; Terbojevich M. et al, Carbohydrate Research, 1986, 157, 269-272)이 사용되고, 식은 MW과 VI를 관련시킨다. 그 결과, 점도는 특정한 MW 범위에 해당하는 범위이다:

약 1885 kDa에 해당하는 29 dl/g

약 920 내지 1450 kDa 범위에 해당하는 17-24 dl/g

약 450 내지 780 kDa 범위에 해당하는 10-15 dl/g

약 90 내지 231 kDa 범위에 해당하는 3-6 dl/g.

다음의 실험으로, 출원인은, 얻은 HA의 소듐 염의 순도 면에서, 본 발명의 공정 목적의 효능을 입증했다.

스트렙토코커스(streptococcus) 로부터 제조된 HA의 소듐 염의 정제

스트렙토코커스 (streptococcus) 에쿠이 ( equi ) 68222 돌연변이 H-1의 발효 공정 종료 시, EP 0716688의 실시예 3에서와 같이 발효된, 약 5 리터의 브로스가 수집되고 브로스의 ml 당 10⁹ 세균 세포의 양으로 대장균(E. Coli ) ATCC 8739으로 오염된다. 이후 이 브로스를, 실온에서 16 시간 보다 짧지 않은 시간 동안 개방 용기에서 방치한다 (세균으로부터 또는 아포가 공기 내에 존재할 수 있는 효모/곰팡이로부터 추가의 오염을 촉진시키기 위해). 이후 2 개 샘플로 나뉜다: 2.5 리터 (샘플 A)는 본 발명의 완전한 정제 공정 목적을 겪고, 반면 나머지 2-5 리터 (샘플 B)를, 아래에 기술된 것과 같이 단순 침전시킨다. 브로스의 샘플은 존재하는 미생물 및/또는 진균량의 정성적 및 정량적 분석 (Ph . Eur. 5.0; 2.6.12에 따라 수행되는 API 시스템에 의한)에 의한 미생물학적 제어 를 겪는다. 결과가 표 1에서 명시된다.

샘플 A: 브로스를 HCl 1 N을 이용하여 pH 4.3으로 산성화, 및 교반 하에 10 분 동안 65°C에서 열 처리에 의해 불활성화시킨다. 바이오매스를 셀라이트 (40g/l) 상에서의 여과에 의해 제거했고 20% 수용성 NaOH을 이용하여 pH 6.5로 중화했다. 뒤이어 30 분 동안 교반 하에 셀라이트 (20g/l의 브로스)를 부가하는 것 및 CPC (10g/l의 브로스)를 이용하여 복합체화시키는 것, 그 다음 1 시간 동안 침강시키는 것; 이후 액체 상을 사이퍼닝에 의해 제거하고, 여전히 20 시간 동안의 교반 하에, 수용성 NaCl 0.3 M 내 고체 상으로 존재하는 HA을 가용화시키는 것; 여과포 상에서의 여과를 이용하여 및 또한 3 μm의 여과 정도를 갖는 필터를 사용하여 이 공정을 계속하고 제1 추출물을 수집하는 것; 이 절차를 2번 반복하고 2 개 추출물을 결합시키는 것; 뒤이어 방향족 유형의 수지, DIAION HP20를 부가하는 것 (40g/l, 이 처리는, 8 시간 동안, 교반 하에 수행됨) 및 폴리프로필렌 여과포를 사용하여 여과해서 HA로부터 수지를 분리하는 추출 단계가 뒤따른다. 정제를 물에서 NaOH 0.4 M을 부가하는 것 (교반 하에)에 의해, 뒤이어 HCl (37%)을 이용하여 pH 8.5에서 중화시키는 것, 3 μm의 여과 정도를 갖는 폴리프로필렌에서 필터를 이용하여 여과하는 것에 의해 수행한다. HA의 소듐 염을 100% 에탄올을 이용하여 침전시키고, 80% 에탄올을 이용하여 세척하고, 아세톤에서 최종 세척을 수행하고; 얻고 정제된 HA의 소듐 염을 최종 건조시키는 것을 진공 하에서 25°C에서 20 시간 동안 수행한다.

샘플 B: 정확하게 샘플 A에 대한 것과 같이, 이 샘플을 HCl 1 N을 이용하여 pH 4.3에서 산성화 및 교반 하에 65°C에서 10 분 동안 열 처리에 의해 불활성화했다. 바이오매스를 셀라이트 상에서의 여과에 의해 브로스로부터 제거했고, 이후 에탄올을 이용해 여과액을 침전시켰고, 25°C에서, 진공 하에서 20 시간 동안 침전된 HA (정제되지 않은)을 건조시켰다.

정제된 HA은 비-발열성이어야 하고, 즉, 그의 투여 이후 체온의 증가를 초래할 수 있는 성분이 없어야 한다. 비-발열성을 평가하기 위한 테스트는 다양한 방식으로 수행될 수 있다: LAL 테스트 (소듐 히알루로네이트에 관련되는 단행본 내 Ph . Eur . 5.0에 의해 요구되는, 그람-음성으로부터 유도되는 엔도톡신 LPS의 생체 내 특이한 결정을 위한), 발열원 테스트 (발열원 물질의 성질에 대한 생체 내 비-차별 분석) 및 Endosafe ^® - IPT (약전에 의해 요구되지 않는 생체 내 테스트).

LAL 테스트 : LAL 테스트의 기초는, 주로 발열원 효과에 대한 책임이 있는, 그람-음성로부터 세균 엔도톡신의 존재 하에 리물루스 ( limulus ) 폴리페무스(polyphemus)의 혈액으로부터 겔로 추출된 유주세포의 용량이다. 이 테스트는 Ph . Eur . 5.0, 2.6.14에 따라 수행된다.

발열원 테스트 : 이 테스트는 발열원 물질의 존재를 결정하기 위한 가장 폭넓게-사용되는 분석 방법을 나타내고, 이는 생성물의 적은 투여량이 외이 정맥에 주사되는 토끼의 사용을 고려하고, 기준 온도는 주사 이후 3 시간이다. 온도의 상승은 생성물의 발열성의 징후이다. 이 테스트는 Ph. Eur. 5.0, 2.6.8에 따라 수행된다.

Endosafe ^® - IPT (Charles River Laboratories, Inc.): 고도의 전-염증성인 사이토카인 IL-1

의 생성을 자극할 수 있는 임의의 유형의 발열원의 존재를 검출할 수 있는 테스트. 이 테스트는 엔도톡신 ( LPS ) 또는 비- 엔도톡신 성질 ( LTA 및/또는 단백질 및/또는, 예를 들어 바이러스 또는 효모/곰팡이로부터의 발열원 유도체) 모두의 발열원의 식별을 가능하게 한다: 이 테스트는 2 개 단계로 이루어지고, 제1 단계에서, 샘플은 사람 혈액을 이용하여 배양되고 (존재한다면, 발열원은 혈액의 단핵구에 의해 IL-1

의 생성을 자극한다), 제2 단계는 450 nm에서 판독되는 특이적 테스트 ELISA에 의해 생성되는 IL-1

의 존재의 검출로 이루어진다 (Schindler S. et al, ALTEX, 2009, 26, 265-277).

샘플 A 및 B에 대해, LAL 테스트는 엔도톡신 LPS 외에 발열원 물질의 가능한 존재를 평가할 수 없는 반면, 다른 2 개 방법은, 상이한 민감도를 가질지라도, 임의의 성질의 발열원을 드러내기 때문에, 발열원 테스트 및 Endosafe^®- IPT를 사용하여 발열원의 분석을 수행했다. 실제로, IPT 테스트는 그람-양성 및 그람-음성 모두로부터 얻은 세균 잔류물을 확인하는 것을 가능하게 하고, 민감성에 관한 한 발열원 테스트를 능가한다. 게다가, IPT는 사람 조직 내 오염물의 톡신을 평가할 때 토끼에서의 테스트 보다 더욱 특정하다 (Hartung T. et al, ATLA, 2001, 29, 99-123). 두 샘플 모두에서, Ph . Eur . 5.0, 01/2005; 1472로부터와 같이 결정되는 총 단백질 함량을 또한 평가했다. 테스트의 결과는 표 2에서 보여진다.

결과

표 1: 이 표에서, 비-병원체 유기체 및 병원체 유기체 가령 B. 세레우스(cereus), 콜라이 ( coli ) 및 칸디다( candida ) 면에서 중요한 세균 및 또한 진균 충전량이 관찰될 수 있다.

그러므로 표는, 다양한 종류의 발열원, 가령 칸디다( candida )의 유도체에 더하여, 어떻게 그람-양성 및 그람-음성 모두로부터의 발열원 요소가 함유된 초기 브로스가 구체적으로 오염되었는지를 보여준다.

표 2

NR: 검출 불가능 (0.05 EEU/mg보다 낮음)

이러한 데이터는, 새로운 정제 공정은 다양한 종류의 발열원 물질로부터 HA을 정제를 할 수 있다는 것을 보여준다:

샘플 B의 IPT 테스트는 매우 높은 값의 발열원 톡신을 보여주고, HA Ph. Eur. 5.0, 01/2005: 1472의 단행본, 실제로, HA의 주사 투여를 위해, 0.05IU/mg (즉, 0,05EU/mg) 보다 낮은 엔도톡신의 최대 제한을 가능하게 한다는 것을 표 2로부터 알 수 있다. 샘플 B에서, 그러므로 이 제한 보다 적어도 100 배 더 높은 발열원 농도이다. 발열원 테스트를 위해 처리된 3 마리 토끼에서, 이 농도는 4.1°C의 종합적인 온도 증가를 초래한다. Ph . Eur . 5.0, 2.6.8 에 따라, 생성물은, 3 개 온도 상승의 합이 1.15°의 값을 초과하지 않는다면, 발열원 테스트를 만족시키고, 그러므로 샘플 B가 강력하게 발열성인 것을 입증했고, 따라서 IPT 테스트의 데이터를 확인했다. 최종적으로, 이 샘플은 스트렙토코커스(streptococcus)의 발효를 위해 사용되는 배지로부터, 및 완전히 제거되지 않은 동일한 세균으로부터 유도되는 매우 높은 총 단백질 %를 갖는다: HA Ph. Eur. 5.0, 01/2005: 1472의 단행본은, 비경구적 투여에 의해, 0.1%를 초과하지 않는 최대값으로 종합적인 단백질을 제한하고, 그러므로, 또한 이 경우에서, 샘플 B는 제한 값 보다 약 100 배 높은 단백질 값을 갖는다.

본 발명의 목적에 따라 정제된, 샘플 A는 HA의 소듐 염의 주사 투여를 위한 모든 필요조건을 만족시킨다: 1.15°C 보다 낮은 온도 상승을 갖는 생체 내 발열원, 0.05EU/mg보다 낮은 생체 내 톡신, 및 0.1% 보다 낮은 종합적인 단백질 함량 (Ph . Eur. 5.0, 01/2005: 1472).

이 결과는, 심지어 특히 오염된 샘플로부터, 엔도톡신 및 다양한 종류의 발열원 모두로부터 HA의 소듐 염의 총 정제를 보장하기 때문에 본 발명의 공정 목적의 유효성을 보여주고, 이렇게 하여, 아래에 입증된 것과 같은, 순도를 더욱 제한하는 것 면에서 또한 모든 필요조건을 만족시키는 생성물의 안전을 보장한다.

실시예 1: 10 - 15 dl /g의 범위 이내의 IV를 갖는 스트렙토코커스(streptococcus)로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제

EP0716688의 실시예 3에 따라 발효된 스트렙토코커스 (streptococcus) 에쿠이 (equi) (68222 돌연변이 H-1)의 발효 공정 종료 시, 5 리터의 브로스를 HCl 1N을 이용한 pH 4.5까지의 산성화에 의해 비활성화한다. 뒤이어 교반 하에 70°C까지 20 분 동안 온도 증가를 이용하여 브로스를 열 처리한다. 이후 브로스를 여과했고 200 g의 셀라이트를 여과포 상에 제조하는 Buchner 필터 내로 주입했다. 여과 종료 시, 생성물을 수용성 NaOH 20%를 이용하여 중화했고 pH를 7.0에서 고정했다. 100 g의 규조토 및 이어서 11 g/l의 브로스와 동등한 양으로 CPC를, 교반 하에, 30 분 동안 여과된 브로스에 부가했다. 전체 혼합물을 40 분 동안 방치하여 새롭게 형성된 CPC-HA 복합체의 침강을 가능하게 했다. 액체 상을 사이퍼닝에 의해 제거했다. 고체 상으로 존재하는 HA을 수용성 NaCl 0.3M의 용액에 의하여, 교반 하에 10 시간 동안 가용화했다. HA의 소듐 염을 여과포 및 3 μm (Pall)의 여과 정도를 갖는 여과 카트리지를 통해 최종적으로 여과했다. 200 g의 Diaion HP20 수지를 추출물에 부가했고 교반 하에 10 시간 동안 방치했다. 전체 혼합물을 프로필렌 포 상에 및 이후, 순차적으로, 3 μm 여과 정도를 갖는 필터 (Pall)를 통해 여과했다. 수용성 NaOH을 추출물의 용액에 부가하여, HCl (37%)을 이용하여 중화했고, pH를 8.5 값으로 만든다. 이후 추출물을 3 μm-여과 정도 필터를 통해 여과했다. HA의 소듐 염의 용액을 에탄올을 이용하여 침전시키고 교반 하에 30 분 동안 유지시킨다. 생성물을 10 분 동안 방치하고 상층액을 사이퍼닝에 의해 제거했다. 생성물을 에탄올을 이용하여 세척한다 (교반 하에 10 분 동안),이후 상층액을 사이퍼닝에 의해 제거한다 (대체에서, 5 리터보다 높은 브로스 양의 경우에서, 여과포 상의 여과에 의해 고체 생성물을 회수한다). 아세톤을 이용하여 최종 세척을 수행하고 여과포 상의 여과에 의해 고체를 회수한다. 얻은 생성물을 적합한 스테인레스 강 트레이 상에 위치시키고 22 시간 동안 25°C의 온도에서 진공 하에서 건조시킨다.

생성물의 분석은 다음을 얻었다 (Ph . Eur . 5.0, 01/2005: 1472에 따름):

IV: 14.5 dl/g (중량 평균 MW: 748,000 달톤)

단백질: 0.02%

세균 엔도톡신 (LAL 테스트): 0.012 EU/mg

수율: 본 발명의 목적 공정의 총 수율의 결정을 위해, 발효 종료 시 브로스 내에 존재하는 카르바졸 내 HA의 농도를 결정했고 (Ph . Eur . 5.0, 01/2005: 1472), 정제 공정 종료 시 얻은 최종 HA의 농도에 관련된다 (즉, 최종 생성물 vs 리터의 브로스 발효 종료 시 (이후 정제를 겪음)의 그램에서의 양 사이에서 비율을 계산하고, 이어서 단순 비율을 계산하여 정제된 HA vs 정제될 초기 HA의 백분율로서 표현된 수율 값을 얻는다).

이 경우에서, 발효 종료 시 브로스에서 3.3g/리터의 HA, 및 정제된 생성물로서 3.0g/리터를 결정했다. 그러므로 최종 수율은 90%보다 높았다.

실시예 2: 10 - 15 dl /g의 범위 이내의 IV를 갖는 닭벼슬로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제

EP0138572의 실시예 1에서 기술된 닭벼슬로부터 제조된 250 g의 건조 분말을, 교반 하에 10 분 동안 10 리터의 이염기성 소듐 포스페이트/이수화물 소듐 포스페이트/EDTA 완충액 (pH 6.5)에서 0.29 g의 파파인과 혼합시킨다. 이후 이 혼합물을 30 시간 동안 60°C까지 그의 온도를 증가시키는 것에 의해 열처리한다. 이후 결과로 얻은 균질액을 여과하고 200g의 셀라이트가 폴리프로필렌 여과포로 제조된 Buchner 내로 방출한다. 200 g의 셀라이트를 여과된 생성물에 교반 하에 부가했고 이후 2 리터의 수용성 CPC 용액 (29g/l로)을 상기 여과된 생성물에 부가했고, 30 분 동안 교반 하에 방치했다. 이후 혼합물을 40 분 동안 방치하여 새롭게 형성된 CPC-HA 복합체의 침강을 가능하게 했고 액체 상을 사이퍼닝에 의해 제거했다. 고체 상으로 존재하는 HA을 4 리터의 수용성 NaCl 0.3M의 용액을 이용하여, 교반 하에 10 시간 동안 가용화했다. HA의 소듐 염을 여과포 및 3 μm (Pall)의 여과 정도를 갖는 여과 카트리지를 통해 최종적으로 여과했다. 이 시점에서, 200 g의 Diaion HP20L 수지를 추출물 및 혼합물에 부가했고 교반 하에 10 시간 동안 방치했다. 전체 혼합물을 폴리프로필렌 포 상에 및 이후, 순차적으로, 3 μm-여과 정도를 갖는 필터 (Pall)를 통해 여과했다. 이후 얻은 HA의 소듐 염을 교반 하에 30 분 동안 1.8 부피의 에탄올을 이용하여 침전시키고; 생성물을 방치하고 상층액을 사이퍼닝에 의해 제거했다. 침전된 생성물을 5 리터의 정제수를 이용하여, 교반 하에 재-가용화한다.

수용성 NaOH 0.2 M을 얻은 용액에 부가하여, HCl (37%)을 이용하여 중화했고, pH를 8.2로 만든다. 3 μm-여과 정도 필터를 사용하여 여과를 계속한다. 이후 얻은 HA의 소듐 염을 교반 하에 30 분 동안 에탄올을 이용하여 침전시키고, 생성물을 10 분 동안 방치하고 상층액을 사이퍼닝에 의해 제거했다. 생성물을 에탄올을 이용하여 세척하고 (교반 하에 10 분 동안), 이후 상층액을 사이퍼닝에 의해 제거한다 (대체에서, 5 리터보다 높은 브로스 양의 경우에서, 여과포 상의 여과에 의해 고체 생성물을 회수한다). 아세톤을 이용하여 최종 세척을 수행하고 여과포 상의 여과에 의해 고체를 회수한다. 얻은 생성물을 적합한 스테인레스 강 트레이 상에 위치시키고 22 시간 동안 40°C의 온도에서 진공 하에서 건조시킨다.

IV: 14 dl/g (중량 평균 MW: 714,000 달톤)

단백질: 0.04%

세균 엔도톡신 (LAL 테스트): 0.012 EU/mg

수율: 이 경우에서, 총 공정 수율의 결정을 위해, 카르바졸 내 효소 소화의 리터 당 HA의 농도를 결정했고, 정제 공정 종료 시 얻은 최종 HA의 농도에 관련된다 (즉, 최종 생성물 vs 리터의 효소 소화 (이후 정제를 겪음)의 그램에서의 양 사이에서 비율을 계산하고, 단순 비율을 이후 계산하여 정제된 HA vs 정제될 초기 HA의 백분율로서 표현된 수율 값을 얻는다).

이 경우에서, HA의 최종 수율은 85%보다 높았다.

실시예 3: 3 - 6 dl /g의 범위 이내의 IV를 갖는 스트렙토코커스(streptococcus)로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제

절차는 실시예 1에서 기술된 것과 같지만, 열 처리는 90°C에서 250 분 동안 수행되었다. 최종 생성물을, 진공 하에서, 25 시간 동안 40°C에서 건조했다.

IV: 5 dl/g (중량 평균 MW: 181,000 달톤)

단백질: 0.015%

세균 엔도톡신 (LAL 테스트): 0.0075 EU/mg

수율: 이 경우에서, 발효 종료 시 브로스에서 3.3g/리터의 HA, 및 정제된 생성물로서 2.5g/리터를 결정했다. 그러므로 최종 수율은 75% 보다 높았다.

이러한 이유에서, 본 발명의 추가의 목적은 HA의 정제 공정에 관련된다 여기서, 공정 종료 시의 총 수율에 더하여 HA의 소듐 염에 대해 청구된 총 단백질의 최대값 및 톡신은 다음과 같다:

- 0.05% 의 단백질 vs Ph . Eur . 5.0, 01/2005: 1472 내에 규명된 0.1%;

- 002 IU / mg 의 엔도톡신 vs Ph . Eur . 5.0, 01/2005: 1472 내에 허용된 0.05 IU/mg의 최대 제한;

수율 : 75 내지 90%.

Claims

스트렙토코커스 (streptococcus) 또는 바실러스(bacillus)의 발효 브로스로부터 또는 닭벼슬로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한, 다음의 단계를 포함하는 공정:
B. 다음의 단계를 포함하는 추출:
B1. 적어도 30 분 동안 교반 하에서, 비-정제 HA을 함유하는 배지에 셀라이트를 부가하는 것 및 세틸 피리디늄 클로라이드 (CPC)를 이용하여 HA을 복합체화시키는 것, 이후 적어도 추가의 30 분 동안 침강시키는 것;;
B2. 단계 B1에서 형성된 액체 상의 제거;
B3. NaCl의 수용액 내 고체 상으로 존재하는 HA을 가용화하는 것 및 HA의 소듐 염으로서 제1 추출물을 수집하는 것; 이 절차 B3.은 1 번에서 4 번까지 수행됨;
B4. 단계 B3.으로부터 얻은 추출물을 결합시키는 것;
B5. B4의 결합된 추출물에 200 내지 300 옹스트롬 범위인 기공(pore) 반경을 갖는 방향족 수지를 부가하는 것, 가교결합된 폴리스티렌 매트릭스로 구성된 수지가 바람직함, 적어도 8 시간 동안 교반 하에 방치시키는 것;
B6. 단계 B5로부터 얻은 혼합물의 여과;
C. 다음의 단계를 포함하는 정제
C1. 단계 B6.으로부터 얻은 여과액에 NaOH의 수용액을 부가하는 것;
C2. 8 내지 9 범위인 pH로, 바람직하게는 HCl을 이용하여 중화;
C3. 적어도 한 번의 여과;
C4. 에탄올을 이용하여, 단계 C3.에서 얻은 HA의 소듐 염을 침전시키고 적어도 한 번 세척하고, 유기 용매, 바람직하게는 아세톤 내에서 최종 세척하는 것;
C5. 바람직하게는 진공 하에서, 15 시간 이상 동안 25 및 40° 사이에서, HA의 소듐 염을 건조시키는 것.
제1항에 있어서, 스트렙토코커스(streptococcus)의 발효 브로스는 스트렙토코커스 (streptococcus) 에쿠이 ( equi ) 아종 에쿠이 ( equi ) 68222, 돌연변이 H-1의 발효 브로스인 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제1항 내지 제2항에 있어서, 공정은 다음의 단계를 포함하는 발효 브로스의 불활성화의 이전 초기 단계 A.를 포함하는 스트렙토코커스 (streptococcus) 또는 바 실러스(bacillus)의 발효 브로스로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정:
A1. 바람직하게는 HCl을 이용하여, 발효 브로스를 pH 4-5로 산성화하는 것;
A2. 적어도 한 번의 여과에 의한 스트렙토코커스 (streptococcus) 또는 바실러스(bacillus)로부터의 바이오매스의 제거;
A3. pH 6.5-7.5로, 바람직하게는 NaOH에 의하여 중화하는 것.
제3항에 있어서, 불활성화 상은 고- 중- 또는 저-점도 HA을 제조하기 위해 가열하는 것에 의한 발효 브로스의 열 처리를 포함하는 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제4항에 있어서, 열 처리는, 17-24 dl/g의 범위 이내의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 HA의 소듐 염을 제조하기 위해, 60 ± 5°C까지 5-40 분 동안 브로스의 온도를 증가시키는 것에 의해 수행되고, 열 처리는 65°C에서 5-30 분 동안 바람직하게 수행되는 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제4항에 있어서, 열 처리는, 10-15 dl/g의 범위 이내의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 HA의 소듐 염의 제조를 위해 70 ± 5°C까지 5-40 분 동안 브로스의 온도를 증가시키는 것에 의해 수행되고, 열 처리는 70°C에서 5-30 분 동안 바람직하게 수행되는 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제4항에 있어서, 열 처리는, 3-6 dl/g의 범위 이내의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 HA의 소듐 염의 제조를 위해 90 ± 5°C까지 150-300 분 동안 브로스의 온도를 증가시키는 것에 의해 수행되는 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제1항에 있어서, 추출 단계는, 고-, 중- 또는 저-점도 HA을 제조하기 위해, 가열 및 동시 효소 소화에 의한 닭벼슬 균질액의 열 처리보다 선행되는 닭벼슬로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제8항에 있어서, 열 처리는, 17-24 dl/g의 범위 이내의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 HA의 소듐 염을 제조하기 위해 50-60°C까지 26-30 시간 동안 온도를 증가시키는 것에 의해 수행되고, 열 처리는 바람직하게는 55°C에서 28 시간 동안 수행되는 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제8항에 있어서, 열 처리는, 10-15 dl/g의 범위 이내의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 HA의 소듐 염을 제조하기 위해 60-65°C까지 28-30 시간 동안 온도를 증가시키는 것에 의해 수행되고, 열 처리는 바람직하게는 60°C에서 30 시간 동안 수행되는 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제8항에 있어서, 열 처리는, 3-6 dl/g의 범위 이내의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 HA의 소듐 염을 제조하기 위해 65-70 °C까지 46-50 시간 동안 온도를 증가시키는 것에 의해 수행되고, 열 처리는 바람직하게는 65°C에서 48 시간 동안 수행되는 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제1항, 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 단계 C.는 추출 단계 B.에서 얻은 HA의 소듐 염의 에탄올 내 침전, 용매의 제거 및 정제수 내 침전물의 가용화보다 선행되는 닭벼슬로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는, 스트렙토코커스 (streptococcus) 또는 바실러스(bacillus)의 발효 브로스로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정:
A. 다음의 단계를 포함하는, 발효 브로스의 불활성화:
A1. pH 4-5로 브로스를 산성화하는 것, HCl 1N이 바람직하게는 사용됨;
A2. 가능하게는 교반 하에, 브로스의 열 처리;
A3. 20 내지 60g/리터, 바람직하게는 30-40g/l의 브로스의 양으로 셀라이트의 패드 상의 여과에 의해 스트렙토코커스 (streptococcus) 또는 바실러스(bacillus)로부터 바이오매스의 제거, 가능하게는 0,5μm의 여과 정도를 갖는 필터를 이용하여 여과, 폴리프로필렌 필터가 바람직함;
A4. pH 6.5-7.5로, 바람직하게는 20% 수용성 NaOH을 이용하여 중화하는 것;
B. 다음의 단계를 포함하는 추출:
B1. 적어도 30 분 동안 교반 하에서, 20 내지 60 g/리터의 브로스의 양으로 셀라이트의 여과액 A3에 부가하는 것 및 CPC 4-20 g/리터, 바람직하게는 5-15g/리터를 이용하여 복합체화시키는 것, 및 이후 적어도 추가의 30 분 동안 침강시키는 것;
B2. 액체 상의 제거;
B3. 수용성 NaCl 0.3 M 내 고체 상으로 존재하는 HA을 4 내지 24 시간 범위인 기간 동안 교반 하에 가용화하는 것, 3 μm의 여과 정도를 갖는 필터에 의하여 여과하는 것 및 HA의 소듐 염으로서 제1 추출물을 수집하는 것; 이 절차 B3.는 1 번에서 4 번까지 수행됨;
B4. 추출물을 결합시키는 것;
B5. B4.의 결합된 추출물에, 추출물의 10 내지 60 g/리터의 양으로, 200 내지 300 옹스트롬 범위인 기공(pore) 반경을 갖는 방향족 수지, 가교결합된 폴리스티렌 매트릭스로 구성된 수지가 바람직함, 적어도 8시간 동안 교반 하에 방치시키는 것;
B6. 여과포, 가능하게는 또한 3 μm의 여과 정도를 갖는 필터를 포함하는 여과, 폴리프로필렌 필터가 바람직함;
C. 다음의 단계를 포함하는 정제
C1. 교반 하에 물에서, NaOH 0.2-0.4 M을, B6.의 여과된 생성물 에 부가하는 것;
C2. 8 내지 9 범위인 pH로, 바람직하게는 HCl을 이용하여 중화;
C3. 여과, 3 μm 와 같은 여과 정도가 바람직하고, 폴리프로필렌 필터가 더욱 바람직함;
C4. 에탄올을 이용하여, 단계 C3.에서 얻은 HA의 소듐 염을 침전시키고 적어도 한 번 세척하고, 유기 용매, 바람직하게는 아세톤 내에서 최종 세척하는 것;
C5. 본 업계의 숙련가에게 공지되어있는 것과 같이 건조시키는 것, 바람직하게는 진공 하에서, 15 시간 이상 동안 25 및 40° 사이에서, HA의 소듐 염을 건조시키는 것.
제1항에 있어서, 추출 단계 B.는, 고-, 또는 중- 또는 저-점도 HA을 제조하기 위해, 가열 및 동시 효소 소화에 의한 닭벼슬 균질액의 열 처리에 의해 선행되는 닭벼슬로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한, 다음을 포함하는 공정:
B. 다음의 단계를 포함하는 추출:
B1. 적어도 30 분 동안 교반 하에서, 20 내지 60g/리터의 효소 균질액의 양으로 셀라이트의 소화 효소에 부가하는 것 및 4 내지 20g/리터, 바람직하게는 5-15 g/리터의 양으로 CPC를 이용하여 복합체화시키는 것, 이후 적어도 추가의 30 분 동안 침강시키는 것;
B2. 액체 상의 제거;
B3. 수용성 NaCl 0.3 M 내 고체 상으로 존재하는 HA을 4 내지 24 시간 범위인 기간 동안 교반 하에 가용화하는 것, 3 μm의 여과 정도를 갖는 필터에 의하여 여과하는 것 및 HA의 소듐 염으로서 제1 추출물을 수집하는 것; 이 절차 B3.는 1 번에서 4 번까지 수행됨;
B4. 단계 B3.으로부터 얻은 추출물을 결합시키는 것;
B5. B4.의 결합된 추출물에, 추출물의 10 내지 60 g/리터의 양으로, 200 내지 300 옹스트롬 범위인 기공(pore) 반경을 갖는 방향족 수지, 가교결합된 폴리스티렌 매트릭스로 구성된 수지가 바람직함, 적어도 8시간 동안 교반 하에 방치시키는 것;
B6. 여과포, 가능하게는 또한 3 μm의 여과 정도를 갖는 필터를 포함하는 여과, 폴리프로필렌 필터가 바람직함;
C. 다음의 단계를 포함하는 정제:
C1. 교반 하에 물에서, NaOH 0.2-0.4 M을, B6.의 여과된 생성물에 부가하는 것;
C2. 8 내지 9 범위인 pH로, 바람직하게는 HCl을 이용하여 중화;
C3. 여과, 3 μm와 같은 여과 정도가 바람직하고, 바람직하게는 폴리프로필렌 필터를 사용함;
C4. 에탄올을 이용하여, 단계 C3.에서 얻은 HA의 소듐 염을 침전시키고 적어도 한 번 세척하고, 유기 용매, 바람직하게는 아세톤 내에서 최종 세척하는 것;
C5. 바람직하게는 진공 하에서, 15 시간 이상 동안 25 및 40° 사이의 온도에서, HA의 소듐 염을 건조시키는 것.
제14항에 있어서, 정제 단계 C.는 추출 단계 B.에서 얻은 HA의 소듐 염의 에탄올 내 침전, 용매의 제거 및 정제수 내 침전물의 가용화에 의해 선행되는 닭벼슬로부터 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정.
선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 공정의 수율은 75 내지 90%의 범위이고 총 단백질의 최대값 및 얻은 HA의 소듐 염의 톡신은 다음인 HA의 소듐 염의 제조 및 정제를 위한 공정:
a. 0.05%의 단백질;
b. 0.02 IU/mg의 엔도톡신.
29 dl/g이상의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 제1항 내지 제3항, 제13항 및 제16항 중 어느 한 항에 따라 제조되고 정제된 HA의 소듐 염.
17-24 dl/g의 범위 이내의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 제5항 및 제9항, 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따라 제조되고 정제된 HA의 소듐 염.
10-15 dl/g의 범위 이내의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 제6항, 제10항, 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따라 제조되고 정제된 HA의 소듐 염.
3-6 dl/g의 범위 이내의 최종 고유 점도 (IV)를 갖는 제7항, 제11항, 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따라 제조되고 정제된 HA의 소듐 염.
다음에서의 사용을 위한 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 약제학적, 화장품 및 영양 조성물
a. 관절염 관절, 외상성 관절 손상, 연골하 손상의 치료;
b. 눈 질환의 치료;
c. 수술 후 유착의 치료;
d. 피부 궤양, 욕창, 화상, 상처 및 피부 병변, 켈로이드 또는 위축성/비후성 상처, 온전한 또는 손상된 피부를 갖는 모든 유형의 피부 결함의 치료;
e. 피부 질환 가령 습진 및 다양한 종류의 피부염, 특히 아토피성 피부염 및 기저귀 발진, 건선의 치료;
f. 간질성 방광염의 치료.
피부-미용 분야에서 또는 성형 수술에서 체형 보정으로서의 사용을 위한 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 및 화장품 조성물.
국소 및 경구 용도를 위한 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 화장품 및 영양상의 조성물.
힘줄 영양, 피부 영양 및 위장 점막의, 경구 치료 또는 관절염 관절에서의 사용을 위한 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 및 영양상의 조성물.
중금속, 에스테르, 아미드, 설포네이트 및 가교결합된 생성물과의, HA 유도체, 바람직하게는 그의 염의 제조를 위한 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따라 제조되고 정제된 HA의 소듐 염, 그 중에서도 자가-가교결합된 생성물이 바람직함.
패드, 직물, 부직포, 과립화물, 필름 및 겔의 형태인, 2/3-차원 생체물질을 제조하기 위한, 제17항 내지 제20항 및 제25항 중 어느 한 항에 따라 제조되고 정제된 HA의 소듐 염, 또한 가능하게는 다양한 유래의 세포 및/또는 혈액 요소, 가령, 예를 들어, 혈소판-유도체와 결합됨.