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KR20190121782A - Aβ-유발 손상에 대한 억제 또는 경감제 - Google Patents

Aβ-유발 손상에 대한 억제 또는 경감제 Download PDF

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KR20190121782A
KR20190121782A KR1020197025731A KR20197025731A KR20190121782A KR 20190121782 A KR20190121782 A KR 20190121782A KR 1020197025731 A KR1020197025731 A KR 1020197025731A KR 20197025731 A KR20197025731 A KR 20197025731A KR 20190121782 A KR20190121782 A KR 20190121782A
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mice
hippocampus
induced damage
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준 리우
Original Assignee
준 리우
니폰 조키 세야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

백시니아 바이러스를 접종한 염증 조직으로부터의 추출물을 포함하는 해마에 있어서의 아밀로이드 베타(Aβ)-유발 손상에 대한 억제제 또는 경감제. 그리고 해마에 있어서의 Aβ-유발 손상을 억제 또는 경감시키기 위한 제제의 제조에 있어서 백시니아 바이러스를 접종한 염증 조직으로부터의 추출물의 사용.

Description

Aβ-유발 손상에 대한 억제 또는 경감제
본 발명은 백시니아 바이러스(vaccinia virus)를 접종한 염증 조직으로부터의 추출물(이하, "추출물"이라고도 언급될 수 있음)을 포함하는 해마에 있어서의 아밀로이드 베타(Aβ)-유발 손상에 대한 억제제 또는 경감제에 관한 것이다.
2016년 세계 알츠하이머 보고서에 따르면, 세계 인구는 기대 수명이 증가함에 따라 급속도로 고령화되고 있다. 전 세계적으로 치매에 걸린 인구는 4,700만명이며, 2050년까지 1억 3천 1백만명보다 더 증가할 것으로 예상된다고 보고되어 있다. 중국에서는 2030년까지 1천 6백만명을 넘어설 것으로 예상된다. 명백하게, 치매의 발병은 사람들의 삶의 질과 경제에 큰 영향을 초래한다.
알츠하이머 질환(AD)은 노인들 사이에서 가장 흔한 진행성 치매이다. 현재까지는, 그 복잡한 매커니즘으로 인해 AD의 관리에 유효한 효과적인 항치매 약물이 없다. 또한, 새로운 항치매 약물에 대한 발견, 개발 및 임상시험을 위해 막대한 연구 비용과 노력이 필요할 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 최근 알츠하이머 약물 솔라네주맙(solanezumab)에 대한 연구는 임상 최종 단계에서 수백만 달러를 지출한 후에 실패로 종료되었다. 따라서, AD에 대한 확립된 안전성 프로파일로 진행성 인지기능장애를 막기 위해 유망한 현재의 약물을 재평가하는 것이 매우 필요하다.
뉴로트로핀(Neurotropin)(상표명; Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd.의 제품)(이하, "NTP"라고 언급됨)은 요통, 대상포진 후 신경통, 목-어깨-팔 증후군, 아급성 척수-시신경병증(SMON)의 과민증 및 섬유근육통과 같은 만성 통증의 치료용으로 잘 알려진 진통제이며, 유효성분으로서 추출물을 함유한다. 최근, NTP(대부분의 실험은 시판 제품 "뉴로트로핀"보다 높은 농도의 추출물을 함유한 실험 제품을 사용하여 실시되었다. 그러나, "추출물"이라는 단어는 편의상 필요한 경우에 사용될 수도 있다.)는 SH-SY5Y 세포에서 BDNF 발현을 자극하고, NTP를 반복 경구 투여하면(3개월 동안 200NU/kg/일) 해마 BDNF 발현의 감소가 억제되어 다운증후군 모델인 Ts65Dn 마우스의 공간 인식을 개선하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1 참조). 또한, Nakajo 등은 장기간에 걸친 NTP 치료가 파열된 병변의 부피, 뇌부종 및 신경학적 결손의 정도를 감소시키며, 또한 C57BL/6J 마우스의 공간 학습을 향상시키는 것을 설명하고 있다(비특허문헌 2 참조). NTP의 임상 적용을 위한 예비 연구는 NTP가 치매를 갖는 노인 환자의 임상 증상을 개선할 수 있는 것을 나타내었다(비특허문헌 3 참조). 또한, Hoshino 등에 의해 NTP가 산화환원 조절 분자, 글루타티온 퍼옥시다아제 및 카탈라아제, 특히 티오레독신-1의 발현을 증가시킴으로써 과산화수소 및 담배 연기에 대한 세포보호 효과를 보여주는 것이 발견되었다. 또한, NTP는 세포의 티오레독신-1 함유량을 증가시키고, 세포로부터 티오레독신-1 방출을 조절하여 세포 내 산화 활성을 억제하였다(비특허문헌 4 참조). 그럼에도 불구하고, 뉴런 손상에 대한 NTP의 잠재적인 항산화 효과가 결정되어야할 것으로 남아있다. 또한, 산화적 스트레스는 AD에 대한 병인 기전에 있어서 결정적인 역할을 한다. 따라서, 본 발명자들은 AD의 치료를 위한 NTP의 투여에 대한 증거를 얻기 위해 HT22 세포 및 APP/PS1 마우스에서 NTP의 항산화 능력을 조사하였다. 본 출원의 발명자에 의해 실시된 본 연구(이하, "본 연구"라고 언급됨)에 있어서, 본 발명자들은 NTP가 Aβ 25-35-유발 신경 손상을 경감시키는 잠재적인 능력을 갖는지의 여부를 조사하기 위해 세포 모델로서 불멸화된 쥐의 해마 신경세포(HT22 세포)를 사용하였다. 보고된 바와 같이, Aβ25-35는 전장 Aβ와 유사한 신경 독성 효과를 갖는 가장 짧은 활성 단편이다. 또한, Aβ25-35는 쉽게 합성될 수 있어 과학적 연구에 널리 사용되어 왔다. 따라서, 본 발명자들은 연구에서 이 단편을 선택하였다.
생체 내에서, 본 발명자들은 NTP의 투여 후 APP/PS1 마우스의 해마에서 항산화제 및 Aβ 침착의 활성의 변화를 조사하고, 잠재적 기저의 기전을 더 조사하였다.
Fukuda Y, Berry TL, Nelson M, et al. Stimulated neuronal expression of brain-derived neurotrophic factor by Neurotropin. Mol Cell Neurosci 2010;45:226-233. Nakajo Y, Yang D, Takahashi JC, Zhao Q, Kataoka H, Yanamoto H. ERV enhances spatial learning and prevents the development of infarcts, accompanied by upregulated BDNF in the cortex. Brain Res 2015;1610:110-123. Kimura H, Nakamura S, Okamoto K, Toyama I, Watanabe M, Ikeuchi K. A pilot study for clinical applications of Neurotropin to senile patients with dementia. Jpn Pharmacol Ther 1987;15:407-423. Hoshino Y, Nakamura T, Sato A, Mishima M, Yodoi J, Nakamura H. Neurotropin demonstrates cytoprotective effects in lung cells through the induction of thioredoxin-1. Am J Resp Cell Mol 2007;37:438-446.
일 양태에 있어서, 본 발명은 백시니아 바이러스를 접종한 염증 조직으로부터의 추출물을 유효성분으로서 포함하는 제제에 관한 것으로, 해마에 있어서의 Aβ-유발 손상을 억제 또는 경감시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 또한 해마에서 Aβ-유발 손상을 억제 또는 경감시키기 위한 제제의 제조에 있어서 백시니아 바이러스로 접종된 염증 조직으로부터의 추출물의 사용에 관한 것이다.
바람직한 실시형태에 있어서, 상기 Aβ-유발 손상은 산화적 손상이다. 대안적으로, 상기 Aβ-유발 손상은 Aβ 침착에 의해 유발된다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 제제의 기능은 HIF-1α 및/또는 Bax의 발현 억제에 의해 유발된다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 제제는 알츠하이머 질환의 예방, 경감 또는 치료를 위한 제제이다.
추가의 실시형태에 있어서, 상기 염증 조직은 토끼의 피부 조직이다.
다른 추가의 실시형태에 있어서, 상기 제제는 주사제 또는 경구제이다.
도 1: HT22 세포를 CCK8 어세이에 의해 세포 생존율을 평가한 후, 16시간 동안 다양한 농도의 NTP로 처리하고, 이어서 24시간 동안 40μM Aβ25-35와 함께 배양하였다. 데이터는 대조군과의 상대 백분율로 표시하였고, 평균±SE(n=6)으로 나타내었다. ##P<0.01 대 대조군, *P<0.05 및 **P<0.01 대 Aβ25-35군.
도 2: (A) 대조군. (B) HT22 세포는 40μM Aβ25-35에 24시간 동안 노출시켰다. (C-E) HT22 세포를 16시간 동안 다양한 농도의 NTP(0.001, 0.01, 0.1UN/㎕)로 전처리한 후 24시간 동안 40μM Aβ25-35와 함께 배양하였다. 세포 아폽토시스는 유동세포 계측법으로 평가하였다. (F) 세포 사멸률의 통계 결과. (G-K) HT22 세포를 Hoechst 33342 및 프로피디움 요오드화물(PI)로 염색하고, 처리 후에 형광 현미경으로 관찰하였다. 사진에서 설명된 바와 같이, Aβ25-35 유발 아폽토시스는 응축된 강렬한 형광핵을 특징으로 한다. NTP®는 사멸 세포의 수를 현저하게 감소시킨다. 값은 대조군과의 상대적 백분율로 표시하였고, 평균±SE(n=6)로 나타내었다. ##P<0.01 대 대조군, *P<0.05 및 **P<0.01 대 Aβ25-35군.
도 3: (A) 대조군. (B) HT22 세포를 40μM Aβ25-35로 24시간 동안 처리하였다. (C-E) HT22 세포를 16시간 동안 다양한 농도의 NTP(0.001, 0.01, 0.1UN/㎕)로 전처리한 후 24시간 동안 40μM Aβ25-35와 함께 배양하였다. 세포를 H2DCFDA로 20분 동안 염색하고, 세포성 녹색 형광을 유동세포 계측기를 사용하여 측정하였다. (F) DCF 형광 강도의 통계 결과. (G-K) HT22 세포를 H2DCFDA로 20분 동안 염색하고, 세포 녹색 형광을 처리 후에 형광 현미경 하에서 검출하였다. 값은 평균±SE(n=6)로서 나타내었다. ##P<0.01 대 대조군, *P<0.05 및 **P<0.01 대 Aβ25-35 군.
도 4: (A) 대조군. (B) HT22 세포를 40μM Aβ25-35로 24시간 동안 처리하였다. (C) HT22 세포를 0.01UN/㎕ NTP로 16시간 동안 전처리한 후, 40μM Aβ25-35와 함께 24시간 동안 배양하였다. 미토콘드리아의 막전위(MMP, △Ψmt)는 JC-1 염색에 의해 측정하였다.
(F) JC-1 적색/녹색 형광 비율의 통계 결과. (E) 상기 처리 후의 HIF-1α, Bcl-2 및 Bax의 단백질 발현. 결과는 적어도 3번의 독립적인 실험으로부터 평균±SE로 나타내었다. ##P<0.01 대 대조군, * P<0.05 및 **P<0.01 대 Aβ25-35군. ##P<0.01 대 대조군, *P<0.05 및 **P<0.01 대 Aβ25-35군.
도 5: NTP-처리(TG+NTP), 대조군(TG)의 APP/PS1 형질전환 마우스 및 대조군의 야생형(WT) 마우스. 처리된 APP/PS1 마우스는 경구위관영양법 전달에 의해 3개월 동안 NTP(200NU/㎏/일)를 매일 투여받았다. 대조(TG) APP/PS1 형질전환 마우스 및 대조 야생형(WT) 마우스를 생리식염수(0.9% NaCl)로 처리하였다. (A) 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD) 활성. (B) 카탈라아제(CAT) 활성. (C) 글루타티온(GSH) 레벨. (D) 말론디알데히드(MDA) 레벨. 데이터는 각 그룹에서 평균±SE, n=6 해마로 나타내었다. #P<0.05 및 ##P<0.01 대 WT 마우스, *P<0.05 및 **P<0.01 대 TG 마우스.
도 6: (A) Aβ 플라크는 Bielschowsky 실버 염색법에 의해 검출되었다. (B) 면역조직화학을 이용한 HIF-1α의 정량. (C) HIF-1α, p-ERK1/2, p-JNK1/2 및 p-P38에 대한 웨스턴 블롯 및 정량 분석. 결과는 적어도 3번의 독립적인 실험에서 평균±SE로 나타내었다. ##P<0.01 대 WT 마우스, *P<0.05 및 **P<0.01 대 TG 마우스.
재료
추출물의 기본 추출 단계에 관하여, 예를 들면 다음의 단계가 사용된다.
(A) 백시니아 바이러스의 피내 접종에 의한 토끼, 마우스 등의 염증 피부 조직을 수집하고, 염증 조직을 분쇄하였다. 분쇄된 조직에 물, 페놀수, 생리 생리식염수 또는 페놀 첨가 글리세린수와 같은 추출 용제를 첨가하고, 수 일 동안 추출 처리를 실시한다. 이어서, 혼합물을 여과하거나 원심분리하여 조추출물(여액 또는 상등액)을 얻은 후, 조직 단편을 제거한다.
(B) (A)에서 얻어진 조추출물을 산성 pH로 조정하고, 가열하고, 이어서 여과하거나 원심분리하여 탈단백질 처리를 실시한다. 그 후, 탈단백질된 용액을 염기성 pH로 조정하고, 가열하고, 이어서 여과하거나 원심분리하여 탈단백질된 여액 또는 상등액을 얻는다.
(C) (B)에서 얻어진 여액 또는 상등액을 산성 pH로 조정하고, 활성탄 또는 카올린 등의 흡착제로 흡착시킨다.
(D) (C)에서 얻어진 흡착제에 물 등의 추출 용제를 첨가하고, 상기 혼합물을 염기성 pH로 조정하고, 상기 흡착 성분을 용출시켜 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출물(본 발명의 추출물)을 얻는다.
토끼, 소, 말, 양, 염소, 원숭이, 랫트, 마우스 등과 같은 백시니아 바이러스에 감염될 수 있는 다양한 동물이 백시니아 바이러스 백신접종 및 염증 조직 획득용 동물로서 사용될 수 있다. 그 중에서도, 토끼의 염증 피부 조직이 염증 조직으로서 바람직하다.
토끼목(Lagomorpha)에 속하는 한, 어떠한 토끼가 사용되어도 좋다. 그 예로는 굴토끼(Oryctolagus cuniculus), 집토끼(순치된 Oryctolagus cuniculus), 산토끼(일본 산토끼), 새앙토끼 및 눈덧신토끼가 포함된다. 이들 중에서, 집토끼를 사용하는 것이 적절하다. 일본에서는, 예로부터 번식하여 가축이나 실험 동물로서 빈번하게 사용되는 "가토"라고 불리는 가축 토끼가 존재하며, 이는 집토끼의 또 다른 이름이다. 집토끼에는 많은 품종이 있으며, 일본 백색종 및 뉴질랜드 백색종이라고 불리는 품종이 유리하게 사용된다.
본원에서 사용된 백시니아 바이러스는 임의의 균주에 존재할 수 있다. 그 예로는 리스터(Lister) 균주, 다이렌(Dairen) 균주, 이케다(Ikeda) 균주, EM-63 균주 및 뉴욕시보건국으로부터 제공되는 균주가 포함된다.
추출물의 제조 방법에 관한 보다 상세한 설명은, 예를 들면 WO2016/194816 호의 단락[0024]~[0027], [0031] 등에 기재되어 있다. Aβ25-35는 Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co.(중국 상하이)에 의해 합성되었다. 태아 소 혈청(FBS), 배지(DMEM), 뉴로베이살 배지 및 N2 보조제는 Gibco(미국 뉴욕)로부터 얻었다. 세포계수 키트-8(CCK-8)은 Dojin Kagaku(일본 큐슈 쿠마모토)로부터 획득하였다. 아폽토시스 검출 키트는 eBioscience(미국 캘리포니아 샌디에고)로부터 구입하였다. JC-1을 이용한 ROS 검출 키트 및 미토콘드리아 막전위 어세이 키트는 Beyotime Institute of Biotechnology(중국 상하이)으로부터 구입하였다. Hoechst 33342 및 프로피디움 요오드화물(PI)은 Invitrogen/Life Technologies(미국 캘리포니아 칼스배드)로부터 조달하였다. SOD, GSH, MDA 및 CAT 키트는 Jiancheng Bioengineering Institute(중국 난징)에 의해 공급받았다. p-Erk1/2, p-P38, p-JNK, Erk1/2, P38, JNK, Bcl-2, Bax 및 2차 항체 호스라디시 페록시다아제-(HRP-) 컨쥬게이션 염소 항-토끼 IgG에 대한 다음의 1차 항체는 Cell Signaling Technology(미국 매사추세츠 댄버스). HIF-1α에 대한 1차 항체는 Abcam(미국 매사추세츠 캠브리지)으로부터 얻었으며, Aβ1-42에 대한 1차 항체는 Sigma-Aldrich(미국 미주리 세인트 루이스)로부터 구입하였다. 화학발광 호스라디시 페록시다아제 기질은 Millipore(미국 매사추세츠 빌레리카)로부터 구입하였다. 다른 일상적인 실험 용품 및 시약은 Thermo Fisher, Invitrogen 및 MR Biotech에서 구입하였다. 다른 일상적인 실험 용품 및 시약은 Thermo Fisher, Invitrogen 및 MR Biotech로부터 획득하였다.
실시예
(1) 세포 배양, 분화, Aβ 25-35 준비 및 처리
HT22 세포의 배양 및 분화에 사용된 방법은 이전에 상세히 기재되어 있다(Liu J, Li L, 및 Suo WZ. HT22 hippocampal neuronal cell line possesses functional cholinergic properties. Life Sci 2009;84:267-271., 및 Zhao ZY, Luan P, Huang SX 등. Edaravone protects HT22 neurons from H2O2-induced Apoptosis by Inhibiting the MAPK Signaling Pathway. CNS Neurosci Ther 2013;19:163-169. 참조). 간략하게, HT22 세포는 10% FBS, 100U/㎕ 페니실린 및 100㎍/㎕ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양하고, 처리 전에 24시간 동안 N2 보충제를 갖는 뉴로베이살 배지에서 분화시켰다. Aβ25-35는 멸균 생리식염수에서 0.5mM 농도로 희석되고, 37℃에서 7일간 유지하여 펩타이드를 예비 숙성시켰다. 본 발명자들의 이전 연구에 따르면(Fan S, Zhang B, Luan P 등. PI3K/AKT/mTOR/p70S6K Pathway is involved in Aβ25-35-induced autophagy. Biomed Res Int 2015;2015:1-9. 참조), HT22 세포의 생존율은 세포가 40μM Aβ25-35에 24시간 동안 노출되었을 때에 현저하게 감소할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 후속 연구를 위해 Aβ25-35의 최적 농도로서 40μM을 선택하였다. HT22 세포는 16시간 동안 특정 용량의 NTP로 전처리되고, 이어서 24시간 동안 40μM Aβ25-35의 존재 또는 부재 하에 처리되었다.
(2) 세포독성 어세이
HT22 세포의 생존율을 평가하기 위해 CCK-8 어세이를 적용하였다. 간략하게, 상이한 처리 조정 후, CCK-8 시약 10㎕/well를 세포에 첨가하고, 그 후 어두운 상태에서 HT22 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 1.5시간 동안 배양하였다. 샘플의 흡광도는 다기능 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax M5, 미국)로 450nm에서 검출되었다.
(3) 유세포 분석에(FCM)에 의한 아폽토시스 어세이
HT22 세포의 세포 사멸은 이전에 설명된 바와 같이 아넥신 V-FITC 및 PI 아폽토시스 검출 키트를 이용한 유세포 분석에 의해 측정되었다(Zhao ZY, Luan P, Huang SX, 등. Edaravone protects HT22 neurons from H2O2-induced Apoptosis by Inhibiting the MAPK Signaling Pathway. CNS Neurosci Ther 2013;19:163-169. 참조). 간략하게, HT22 세포를 포스페이트 완충 생리식염수(PBS)를 사용하여 2회 세정하고, NTP의 존재 또는 부재 하에 Aβ25-35에 24시간 노출시킨 후 결합 완충액에서 아넥신 V-FITC 및 PI와 함께 배양하였다. 세포 현탁액은 유세포 분석기(FACSCalibur; BD, 미국 뉴저지 플랭클린 레이크스)를 이용한 유세포 분석에 적용하였다. 샘플당 10,000세포를 측정하였다. 유세포 분석과 병행하여, 형태학적 평가를 위해 Hoechst 33342 및 PI 염색을 행하였다. HT22 세포는 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하였다. PBS로 3회 세정한 후, 세포는 5mg/L Hoechst 33342 및 1mg/L PI로 염색하였다. 세포는 형광 현미경(BX51WI, Olympus, 미국) 하에서 관찰하였다.
(4) 세포 내 ROS 생성 측정
세포 내 ROS는 이전에 보고된 바와 같이 산화-민감성 형광 프로브(DCFH-DA)에 의해 측정되었다(Bao FX, Shi HY, Qi L 등. Mitochondrial Membrane Potential-dependent Endoplasmic Reticulum Fragmentation is an Important Step in Neuritic Degeneration. CNS Neurosci Ther 2016;22:648-660.). 간략하게, HT22 세포를 16시간 동안 NTP로 전처리한 후, 24시간 동안 40μM Aβ25-35에 노출시켰다. 처리 후, 세포를 피펫팅에 의해 수집하고, PBS로 2회 세정하고, 10μM DCFH-DA와 함께 37℃에서 20분 동안 배양하였다. FACSCalibur 유동세포 계측기를 사용하여 샘플당 10,000개의 세포를 검출하였다. 양성 세포에서 지오메트 형광 강도는 ROS의 수준을 나타낸다. 또한, DCF 형광 강도는 형광 현미경 하에서도 관찰되었다.
(5) 미토콘드리아 막전위의 계측(MMP, △Ψmt)
MMP는 제조자의 지시에 따라 JC-1로 미토콘드리아 막전위 분석 키트를 이용하여 계측하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 2회 세정하고, 이어서 5㎕/㎕ JC-1로 37℃에서 20분 동안 염색하였다. JC-1 염색 완충액으로 2회 세정한 후, 세포 현탁액을 수집하고, 유동세포 계측기를 사용하여 MMP를 모니터링하였다. 각각의 샘플로부터 대략 10,000개가 유동세포 계측 분석에 사용되었다.
(6) 동물 및 약물 관리 및 약물 투어
6개월된 수컷 APP/PS1 형질전환 마우스를 Jackson Laboratory(미국 메릴랜드)로부터 얻었고, 음식 및 물에 자유롭게 접근하여 유지시켰다. 이 연구에 사용된 마우스는 모두 Sun Yat-sen University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 처리되었다. 이 연구에서 피험체는 6개월된 APP/PS1 형질전환 마우스(TG, n=16) 및 야생형 리터메이트(WT, n=8)로 구성된다. 동물을 무작위로 마우스의 3개의 그룹으로 분류하였다: NTP-처리(TG+NTP), 대조군(TG)의 APP/PS1 형질전환 마우스 및 대조군의 야생형(WT) 마우스. 처리군 마우스는 경구위관영양 전달에 의해 3개월 동안 NTP(200NU/kg/일)를 매일 투여받았다. 나머지 마우스는 위약 대조군으로서 생리식염수(0.9% NaCl)로 처리하였다.
(7) SOD, MDA, GSH 및 CAT의 측정
수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD), 글루타티온(GSH) 및 카탈라아제(CAT), 및 말론디알데히드(MDA)의 활성은 제조사의 지시에 따라 시판 키트를 사용하여 결정되었다. 해마의 조직을 차가운 0.9% NaCl(9㎕)에서 초음파 처리하여 균질화하고, 4℃에서 10분 동안 4000g에서 원심분리하고, 상층액을 수집하고, 후속 분석을 위해 80℃에서 저장하였다. 상청액 중의 단백질 농도는 마이크로 BCA 단백질 어세이 키트를 사용하여 평가되었다.
(8) Bielschowsky 실버 염색법 및 면역조직화학기법
Bielschowsky 실버 염색법은 이전에 공개된 방법을 이용하여 고정된 단면에서 행하였다(Schwab C, Steele JC, McGeer PL. Dystrophic neurites are associated with the majority of early stage extracellular neurofibrillary tangles in parkinsonism dementia complex of Guam. Acta Neuropathol 1997;94:486-492., 및 Schwab C, Hosokawa M, Mcgeer PL. Transgenic mice overexpressing amyloid beta protein are an incomplete model of alzheimer disease. Exp Neurol 2004;188:52-64. 참조). 면역조직화학기법의 경우, 마우스의 뇌단면을 퍼옥시다아제 표지에 대한 제조사의 지시에 따라 DAB 키트를 이용하여 염색하였다. 이미지는 형광 현미경으로부터 획득하였다. 면역조직화학기법에 사용된 1차 항체는 마우스 항-HIF-1α(1: 800; Abcam, 미국 매사츄세츠)이었다. 노인성 플라크 및 HIF-1α 양성 세포의 표면적을 측정하고, Image J 소프트웨어를 사용하여 치상회의 백분율로서 비교하였다.
(10) 웨스턴 블롯 분석
처리 후, 프로테아제 저해제 각테일이 보충된 적당량의 끓는 변성용 용출 완충액(1% SDS, 1mM 소듐 오르토바나데이트, 10mM Tris-Cl, pH7.4)으로 HT22 세포를 용출시켰다. 마우스 해마의 샘플 단백질은 신속한 면역침전 어세이 완충액(50mM Tris[pH7.4], 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% 소듐 데옥시클로레이트, 0.1% 소듐 도데실 술페이트[SDS])에서 추출하였다. 웨스턴 블롯팅 및 반정량 분석법은 이전에 설명된 절차에 의해 행하였다. 사용된 1차 항체 및 희석률은 다음과 같이 열거되었다: HIF-1α, 1:2000; Bcl-2, 1:1000; Bax, 1:1000; Aβ1-42, 1:1000; p-JNK, 1:500; p-P38, 1:500; p-ERK1/2, 1:500; JNK, 1:1000; P38, 1:500; ERK1/2, 1:2000 및 β-actin, 1:1000.
(11) 통계 분석
모든 데이터는 평균±SE으로 나타내었고, 모든 통계 분석은 SPSS 16.0 소프트웨어(SPSS Inc., 미국 일리노이 시카고)를 사용하여 실시되었다. 사후 검정(post hoc test)을 이용한 일원 분산 분석(ANOVA)을 그룹간 편차 분석에 사용하고, 그룹간 차이를 Student's t-test를 이용하여 비교하였다. 차이는 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
(12) 결과
(i) 시험관 내에서 NTP에 의한 신경 보호
도 1에 나타낸 바와 같이, 0.001~0.1UN/㎕의 다양한 농도에서 NTP를 이용한 전처리는 Aβ25-35에 의해 유발된 세포독성을 억제하였다(P<0.05). 세포 아폽토시스의 유동세포 계측 분석은 0.001~0.1UN/㎕의 NTP를 투여하면 Aβ25-35에 의해 발생되는 세포 아폽토시스가 유의하게 억제될 수 있음을 입증하였다(P<0.05)(도 2A-F). Hoechst 33342 및 PI 염색에서 형광 현미경으로 유사한 효과가 관찰되었다(도 2G-K). 다음에, NTP가 ROS 수준을 경감시켰는지의 여부를 조사하였다. NTP 처리는 기하평균 DCF 형광을 감소시켰고, 그 영향은 0.001과 0.01UN/㎕의 농도에서 현저하게 유의 하였지만, 0.1UN/㎕의 투여량에서 ROS 생성의 유의한 차이는 관찰되지 않았으므로 고농도의 NTP가 세포 내 ROS 생성을 억제하는데 영향을 미치지 않을 수 있다(도 3A-F). 형광 현미경에 의한 ROS 수준의 관찰은 유세포 분석(도 3G-K)으로부터 얻어진 결과와 일치한다. 또한, JC-1 염색법은 미토콘드리아 막전위가 Aβ25-35군(도 4A-D)과 비교해서 0.01NU/㎕ NTP로 감쇠된 것으로 나타났다.
ii) 시험관 내에서 HIF-1α의 NTP 조절 및 아폽토시스 관련 분자
HT22 세포에서 Aβ25-35에 대한 NTP의 신경보호 능력의 메커니즘을 더 연구하기 위해, 본 발명자들은 이어서 HIF-1α, Bcl-2 및 Bax의 단백질 발현을 측정하였다. 도 4E에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석 NTP가 Bcl-2의 발현을 유의하게 향상시키는 것을 밝혀냈다. Bcl-2 유발와 달리, NTP는 HIF-1α 및 Bax의 발현을 억제하였다(P<0.01).
(iii) 생체 내에서 NTP에 의한 항산화 효과
NTP로 처리된 APP/PS1 마우스의 해마에 있어서 산화 스트레스 마커를 평가하였다. 대조군의 APP/PS1 마우스 그룹과 비교하여, NTP의 투여는 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD), 카탈라아제(CAT), 글루타티온(GSH)의 수준을 증가시켰고(각각 P<0.01, P<0.05, P<0.05), NTP-처리 APP/PS1 마우스의 해마에서 말론디알데히드(MDA) 함유량을 감소시켰으므로(P<0.01)(도 5), NTP는 항산화제 시스템의 균형을 조절하는 능력을 발휘한다는 것을 시사하였다.
(iv) 생체 내에서 해마에 있어서의 NTP의 Aβ 침착의 저해
APP/PS1 마우스의 해마에 있어서의 Aβ 침착에 대한 NTP 처리의 잠재적 효과를 조사하기 위해, 대조군의 야생형 마우스, 대조군 및 NTP 처리군의 APP/PS1 마우스의 해마의 관상 단면을 Bielschowsky 실버 염색법을 사용하여 측정하고, Aβ 단백질 수준의 측정을 위해 해마 조직을 수집하였다.
정량 분석은 Aβ 플라크 침전물의 표면적이 APP/PS1 마우스군(도 6A)(P<0.01)과 비교하여 NTP-처리군에서 유의하게 감소되는 것으로 나타났다. 이 결과에 따라, 본 발명자들은 NTP-처리 그룹의 해마에서 감소된 수준의 Aβ1-42 단백질을 관찰하였다(도 6C).
(v) 생체 내에서 NTP에 의한 HIF-1α 및 MAPK 패밀리 활성화의 억제
NTP의 신경보호 효과의 기본 메커니즘을 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 먼저 면역조직화학기법 및 웨스턴 블롯에 의해 해마에 있어서의 HIF-1α의 발현을 검출하였다. 그 결과, HIF-1α 발현이 NTP-처리 마우스에서 억제되는 것으로 나타났다(도 6B)(P<0.05). 도 6C에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 미토겐 활성 단백질 키나제(MAPK) 경로의 활성화를 더 조사하였다. 야생형 그룹과 비교해서, 본 발명자들은 APP/PS1 마우스에서 ERK1/2, JNK, 및 P38의 인산화가 촉진되는 것을 발견하였다. 그러나, NTP 처리는 p-ERK1/2, p-JNK 및 p-P38의 발현을 현저히 감소시켰다(P<0.01).
(산업상 이용 가능성)
시험관 내 실험으로부터의 본 발명자들의 결과들은 Aβ25-35-유발 산화 손상 및 세포 사멸에 대한 NTP 보호의 직접적인 증거를 제공한다. ROS 수준과 HIF-1α는 HT22 세포에서 유의하게 감소하였다. 동시에, 미토콘드리아 막전위가 증가하였다. 실제로, 미토콘드리아 기능은 AD 병인에서 중추적인 역할로서 인식되었다. 미토콘드리아 축적 막 손상은 세포 및 AD 마우스 모델에서 증가된 ROS 생성을 보조할 수 있다. 미토콘드리아 기능 장애는 3개월 정도 일찍 시작되었다. 특히, chen 등.은 산화 및 질산화 스트레스에 의해 유발된 미토콘드리아 손상이 cytochrome c의 방출을 통해 카스파제 캐스케이드를 촉발시켜 해마에 있어서의 세포 사멸을 유발한다는 것을 증명하였다. 생체 내 연구로부터 발견된 점은 NTP가 항산화제의 활성을 향상시키고, Aβ 침착의 형성을 감소시키는 것에 대한 보호 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. NTP의 메커니즘의 추가 연구를 위해, HIF-1α 및 스트레스 관련 미토겐 활성 단백질 키나제(MAPK) 신호의 발현을 조사하였다. 세린/트레오닌 단백질 키나제의 패밀리인 MAPK는 세포 성장, 분화 및 세포 사멸의 조절에 있어서 주요 신호 경로이다. Aβ-유발 산화스트레스는 이들 세포 신호전달 경로를 변화시키고, 세포에서 인산화 반응을 유발할 수 있다. JNK 및 P38의 활성화의 상향조정은 AD 뇌에서 연관되어 있고, MAPK 신호전달 경로는 Aβ 축적에 방응하여 활성화될 수 있다. Guo 등.은 MAPK 신호는 아니소마이신에 의해 활성화될 수 있고, 신경모세포종 세포에서 세포 내 Aβ 생성을 유발할 수 있는 것이 관찰되었다. 따라서, MAPK 캐스케이드의 조절장애는 AD에서 Aβ와 산화 스트레스 사이의 병리학적 연관성을 더 지지한다. 이 연구에서, 본 발명자들은 APP/PS1 마우스에서 ERK1/2, JNK 및 P38의 증가된 활성화를 발견하였다. 그러나, MAPK의 활성화는 NTP-처리 APP/PS1 마우스에서 감소되었으며, 이는 인산화 반응이 NTP에 의해 억제될 수 있는 것을 나타낸다.
요약하면, 본 발명자들의 결과는 Aβ25-35가 ROS 수준의 상향조정, 미토콘드리아 막전위의 하향조정 및 세포 아폽토시스의 촉진을 포함하는 해마의 신경 손상을 유발하는 것을 입증하였다. 대조적으로, NTP 처리는 HT22 세포에서 Aβ25-35에 의해 매개되는 손상을 반전시킬 수 있다. 또한, NTP는 APP/PS1 마우스의 해마에서 Aβ 플라크의 침착을 개선시키고, 항산화제의 활성을 변화시킬 수 있다. NTP의 신경보호 능력은 HIF-1α 및 MAPK 신호전달 경로의 억제와 관련이 있을 수 있다. 간략하게, NTP는 앞으로 AD의 예방 및 치료에 적용될 급진적 제거제로서 작용할 수 있다.

Claims (10)

  1. 백시니아 바이러스를 접종한 염증 조직으로부터의 추출물을 유효성분으로서 포함하는 제제로서, 해마에 있어서의 Aβ-유발 손상을 억제 또는 경감시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 제제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 Aβ-유발 손상은 산화적 손상인 것을 특징으로 하는 제제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 Aβ-유발 손상은 Aβ 침착에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 제제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기능은 HIF-1α의 발현 억제에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 제제.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기능은 Bax의 발현 억제에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 제제.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    알츠하이머 질환의 예방, 경감 또는 치료를 위한 제제인 것을 특징으로 하는 제제.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염증 조직은 토끼의 피부 조직인 것을 특징으로 하는 제제.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    주사제인 것을 특징으로 하는 제제.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    경구제인 것을 특징으로 하는 제제.
  10. 해마에 있어서의 Aβ-유발 손상을 억제 또는 경감시키기 위한 제제의 제조에 있어서 백시니아 바이러스를 접종한 염증 조직으로부터의 추출물의 사용.
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