KR20200143506A

KR20200143506A - 단리된 태반 세포를 사용한 뇌졸중 치료

Info

Publication number: KR20200143506A
Application number: KR1020207036016A
Authority: KR
Inventors: 앤디 제이틀린; 아자이 팔
Original assignee: 안트로제네시스 코포레이션
Priority date: 2008-08-20
Filing date: 2009-08-20
Publication date: 2020-12-23
Also published as: JP2012500262A; KR20110050681A; CA2734237C; KR20180108887A; ZA201101207B; KR20170061172A; RU2011110390A; US20100047351A1; EP2329012A1; CN102186971A; IL211312A0; RU2558778C2; EP2329012B1; CA2734237A1; AU2009283217B2; JP5950577B2; JP2020097604A; JP2015178498A; IL211312A; DK2329012T3

Abstract

뇌졸중 피해자에게 태반 줄기 세포, 태반 줄기 세포를 포함하는 세포들의 집단, 및/또는 태반 줄기 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 뇌졸중의 치료 방법이 본원에서 제공된다.

Description

단리된 태반 세포를 사용한 뇌졸중 치료{TREATMENT OF STROKE USING ISOLATED PLACENTAL CELLS}

본 출원은 2008년 8월 20일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/090,565를 우선권으로 청구하고, 이 출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

1. 기술분야

단리된 태반 세포, 예를 들어, 다능성(multipotent) 태반 세포, 이같은 단리된 태반 세포들의 집단, 및/또는 이러한 세포를 포함하는 조성물을 뇌 내부 또는 주변에서의 저산소성 손상 또는 혈류 파괴, 예를 들어, 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 증상 또는 이러한 파괴에 기인하는 결함, 예를 들어, 신경학적 결손이 있는 개체의 치료에서 사용하는 방법이 본원에서 제공된다.

2. 배경기술

"뇌 발작(brain attack)", 뇌혈관 사고 (CVA) 또는 급성 허혈성 뇌혈관 증후군으로 또한 알려진 뇌졸중은 뇌 또는 뇌간에 혈액을 공급하는 혈관에서의 장애로 인한 뇌 기능(들)의 손실이고, 이는 일반적으로 급속히 발생된다. 이러한 장애는 혈전증 또는 색전증에 의해 예를 들어 야기되는 허혈 (혈액 부족)일 수 있거나, 또는 출혈로 인한 것일 수 있다. 세계 보건 기구(World Health Organization)에 따르면, 뇌졸중은 "24시간 이상 지속되거나 사망에 의해 24시간 이내에 중단되는 뇌혈관 원인의 신경학적 결손"이다. 24시간 이상의 증상 지속으로 뇌졸중이 증상이 24시간 미만으로 지속되는 일과성 허혈 발작 (TIA: Transient Ischemic Attack)과 구별된다.

현재, 허혈성 뇌졸중의 치료는 허혈을 야기하는 차단을 감소 또는 경감시키기 위한 항혈소판 약제 예컨대 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 또는 항응고 약제, 예컨대 와르파린을 전형적으로 포함한다. 또한, 혈당 수준을 가능한 한 정상이 되게 하고, 뇌졸중 환자에게 충분한 산소 및 정맥 수액을 제공한다. 출혈성 뇌졸중의 치료는 혈압 저하 약물의 투여, 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID) 이외의 통증 약제의 투여, 칼슘 채널 차단제 (예를 들어, 니모디핀(Nimodipine))의 투여, 및 출혈 원인인 혈관 파열을 복원하기 위한 수술 (지시되는 경우) 중 하나 이상을 일반적으로 포함한다.

그러나, 이같은 치료에서는 진행 중인 신경학적 손상을 완화하는 것만이 시도되고, 손실된 기능을 복구하기 위해서는 아무것도 행해지지 않는다. N-메틸-D-아스파르테이트 수용제 길항제, 날메펜, 루벨루졸, 클로메티아졸, 칼슘 채널 차단제 (a-아미노-3-히드록시-5-메틸이속사졸-4-프로피온산 길항제, 세로토닌 작동제 (예를 들어, 레피노탄), 및 막횡단 칼륨 채널 조정제 포함), 티릴라자드, 항-ICAM-1 항체, 인간 항-백혈구 항체 (Hu23F2G), 항-혈소판 항체 (예를 들어, 압식시맙), 시티콜린 (외인성 형태의 시티딘-5'-디포스포콜린), 및 염기성 섬유모세포 성장 인자가 포함되는 수많은 비-세포성 신경보호제가 뇌졸중 치료에서의 효능에 대해 테스트되었지만, 실패하였다.

뇌졸중에 대한 효과적인 치료가 없다. 따라서, 어느 한쪽 상태로부터 발생하는 신경학적 손상을 완화할 뿐만 아니라, 신경 기능 및 예후를 개선하는 치료법이 요구된다.

3. 개요

한 측면에서, 단리된 태반 세포, 단리된 태반 세포들의 집단, 단리된 태반 줄기 세포를 포함하는 세포들의 집단 및 단리된 태반 세포를 포함하는 조성물을 개체의 중추 신경계 (CNS), 예를 들어 뇌 또는 척수 내부 또는 주변에서 혈류가 파괴된 개체의 치료에서 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴에 기인하는 개체에서의 증상 또는 신경학적 결손, 예컨대 저산소성 손상, 무산소성 손상, 뇌졸중 (예를 들어, 허혈성 또는 출혈성 뇌졸중), 비-뇌졸중 출혈 또는 TIA의 치료를 포함한다. 본원에서 구현되는 바와 같이, 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴에 기인하는 개체에서의 증상 또는 신경학적 결손의 치료는 이같은 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴를 동반할 수 있는 재관류 손상에 기인하는 증상 또는 신경학적 결손의 치료를 포함한다. 승인된 동물 뇌졸중 모델에서 허혈성 뇌졸중, 예를 들어, 무산소성 손상 또는 저산소성 손상의 성공적인 치료가 실연되었다. 실시예 1 및 실시예 2 참조.

한 측면에서, 치료적 유효량의 단리된 조직 배양 플라스틱-부착성 인간 태반 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 단리된 태반 세포에 다능성 세포 또는 줄기 세포의 특징이 있는, 개체의 뇌 내부 또는 주변에서 혈류가 파괴된 개체, 예를 들어, 개체의 뇌 또는 중추 신경계 (CNS) 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴에 기인하는 증상 또는 신경학적 결손이 있는 개체를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 혈류 파괴는 개체의 뇌 또는 CNS에 대한 무산소성 손상 또는 저산소성 손상을 초래한다.

특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 단리된 태반 줄기 세포이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 단리된 태반 다능성 세포이다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 CD34^-, CD10⁺ 및 CD105⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 태반 줄기 세포이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 다능성 태반 세포이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 골발생(osteogenic) 표현형의 세포 또는 연골발생(chondrogenic) 표현형의 세포로 분화되는 잠재력을 지닌다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 신경 표현형의 세포로 분화되는 잠재력을 지닌다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD200⁺이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 또는 CD45^-이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 또는 CD45^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 또는 CD45^-이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 및 CD45^-이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD90⁺, CD45^- 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD80^- 및 CD86^-이다.

더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 세포는 추가적으로 CD29⁺, CD38^-, CD44⁺, CD54⁺, CD80^-, CD86^-, SH3⁺ 또는 SH4⁺ 중 하나 이상이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 세포는 추가적으로 CD44⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, 또는 프로그래밍된 사멸-1 리간드 (Programmed Death-1 Ligand; PDL1)⁺, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상이다. 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, 및 PDL1⁺이다.

또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD200⁺ 및 HLA-G⁺이거나; CD73⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺이거나; CD200⁺ 및 OCT-4⁺이거나; CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이거나; CD73⁺ 및 CD105⁺이고, 상기 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체(embryoid-like body)의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; 또는 OCT-4⁺이고, 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; 또는 이들의 임의의 조합이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺이고, 추가적으로, CD200⁺ 및 HLA-G⁺이거나; CD73⁺, CD105⁺, 및 CD200⁺이거나; CD200⁺ 및 OCT-4⁺이거나; CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이거나; CD73⁺ 및 CD105⁺이고, 상기 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; 또는 OCT-4⁺이고, 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; 또는 이들의 임의의 조합이다.

구체적 실시양태에서, 상기 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺, CD105⁺, 및 CD200⁺ 태반 세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^- 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기 세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺ 태반 세포는 CD34^-, CD45^-, OCT-4⁺ 및 CD200⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다.

특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺, MHC-I⁺ 또는 ABC-p⁺ 중 하나 이상이고, 이때 ABC-p는 태반-특이적 ABC 전달체 단백질 (유방암 저항성 단백질 (BCRP) 및 미톡산트론 저항성 단백질 (MXR)로 또한 알려짐)이다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^- 및 OCT-4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD54⁺, SH2⁺, SH3⁺ 및 SH4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD54⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ 및 OCT-4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, HLA-1⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺ 및 ABC-p⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ 및 OCT-4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^-, 및 SSEA4^-이다. 구체적 실시양태에서, 상기 OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^-, 및 SSEA4^- 세포는 추가적으로 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺ 및 SH4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺ 및 CD34^-이고, SH3⁺ 또는 SH4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34^-이고, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 OCT-4⁺이다. 특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD34^-, CD105⁺ 및 CD200⁺이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29^-, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM^-, CD62-E^-, CD62-L^-, CD62-P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, β2-마이크로글로불린^low, HLA-I^low, HLA-II^-, HLA-G^low, 및/또는 PDL1^low 중 하나 이상이다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 적어도 CD29^- 및 CD54^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 적어도 CD44⁺ 및 CD106⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 적어도 CD29⁺이다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 하나 이상의 유전자를 등가 개수의 골수 유래 중간엽 줄기 세포보다 검출가능하게 더 높은 수준으로 발현하고, 이때 상기 하나 이상의 유전자는 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, 및 ZC3H12A 중 하나 이상이고, 상기 골수 유래 중간엽 줄기 세포는 상기 단리된 태반 세포에 진행된 계대 횟수와 등가인 횟수로 계대 배양되었다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 60％ DMEM-LG (예를 들어, 기브코(Gibco) 제품) 및 40％ MCDB-201 (예를 들어, 시그마(Sigma) 제품); 2％ 소 태아 혈청 (예를 들어, 하이클론 랩스(Hyclone Labs.) 제품); 1× 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS); 1× 리놀레산-소 혈청 알부민 (LA-BSA); 10^-9 M 덱사메타손 (예를 들어, 시그마 제품); 10^-4 M 아스코르브산 2-포스페이트 (예를 들어, 시그마 제품); 표피 성장 인자 10 ng/㎖ (예를 들어, R&D 시스템스 제품); 및 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/㎖ (예를 들어, R&D 시스템스 제품)를 포함하는 배지에서 약 3회 내지 약 35회 개체수 배가 동안 배양되는 경우 상기 하나 이상의 유전자를 발현한다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 60％ DMEM-LG (예를 들어, 기브코 제품) 및 40％ MCDB-201 (예를 들어, 시그마 제품); 2％ 소 태아 혈청 (예를 들어, 하이클론 랩스 제품); 1× 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS); 1× 리놀레산-소 혈청 알부민 (LA-BSA); 10^-9 M 덱사메타손 (예를 들어, 시그마 제품); 10^-4 M 아스코르브산 2-포스페이트 (시그마); 표피 성장 인자 10 ng/㎖ (예를 들어, R&D 시스템스 제품); 및 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/㎖ (예를 들어, R&D 시스템스 제품)를 포함하는 배지에서 약 3회 내지 약 35회 개체수 배가 동안 배양되는 경우 상기 하나 이상의 유전자를 발현한다.

치료 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 신경영양성 성장 인자 신경교 세포 유래 신경영양 인자 (GDNF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 간세포 성장 인자 (HGF), 태반 성장 인자 (PGF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 발현한다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 집단의 세포들 중 50％ 이상이 상기 단리된 태반 세포인 세포들의 집단 내에 포함된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 집단의 세포들 중 70％ 이상이 상기 단리된 태반 세포인 세포들의 집단 내에 포함된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 집단의 세포들 중 80％ 이상이 상기 단리된 태반 세포인 세포들의 집단 내에 포함된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 집단의 세포들 중 90％ 이상이 상기 단리된 태반 세포인 세포들의 집단 내에 포함된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 태반 세포에는 모체 유전자형을 지니는 세포가 실질적으로 없다; 예를 들어, 상기 집단 내의 태반 세포의 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 태아 유전자형을 지니고, 즉, 태아에서 기원한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 태반 세포를 포함하는 세포들의 집단에는 모체 유전자형을 지니는 세포가 실질적으로 없다; 예를 들어, 상기 집단 내의 세포의 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 태아 유전자형을 지니고, 즉 태아에서 기원한다.

특정 실시양태에서, 임의의 본원에 기술된 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포는 수용자, 예를 들어, 뇌졸중에 걸렸었거나 뇌졸중의 증상이 있는 개체에 대해 자가성이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 임의의 본원에 기술된 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포는 수용자, 예를 들어, 뇌졸중에 걸렸었거나 뇌졸중의 증상이 있는 개체에 대해 이종성이다.

치료 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 투여 전에 동결보존된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 태반 줄기 세포 은행으로부터 수득된다.

단리된 태반 세포의 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 성장 배지, 즉, 증식을 촉진하도록 제제화된 배지에서 배양하는 동안, 예를 들어, 성장 배지에서의 증식 동안 일반적으로 분화되지 않는다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 증식하기 위해 피더(feeder) 층을 필요로 하지 않는다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 피더 세포층의 부재 하에서의 배양 결과로 배양물 내에서 분화되지 않는다.

또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 혈액이 배출되었고 잔류 혈액을 제거하도록 관류되었거나; 혈액이 배출되었지만 잔류 혈액을 제거하도록 관류되지는 않았거나; 또는 혈액이 배출되거나 잔류 혈액을 제거하도록 관류되지 않은 산후 태반의 관류에 의해 수득된다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 태반 조직의 물리적 및/또는 효소에 의한 파괴에 의해 수득된다.

본원에서 제공되는 방법에 유용한, 태반 세포의 세포 표면 마커, 분자 마커 및 유전자 마커가 하기 섹션 5.4.2에 상세하게 기술되어 있다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 혈류 파괴는 뇌졸중이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 뇌졸중은 출혈성 뇌졸중, 예를 들어, 두개내 뇌출혈 또는 특발성 거미막하 출혈이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 파괴는 혈종이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 혈종은 경막 혈종, 경막하 혈종 또는 거미막하 혈종이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 혈종은 두개골에 대한 외부의 힘, 예를 들어, 두부 손상에 의해 야기된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 파괴는 일과성 허혈 발작 (TIA), 예를 들어, 재발 TIA이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 파괴는 혈관경련수축, 예를 들어, 출혈성 뇌졸중 후의 혈관경련수축이다.

방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 치료적 유효량은 상기 개체가 나타내는 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴 (예를 들어, 무산소성 손상 또는 저산소성 손상)의 하나 이상의 증상 또는 이러한 파괴에 기인하는 신경학적 결손의 제거, 이러한 증상 또는 결손에서의 검출가능한 개선, 이러한 증상 또는 결손의 중증도 축소, 또는 이러한 증상 또는 결손의 진행 속도저하를 초래하는 단리된 태반 세포의 개수이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 치료적 유효량의 단리된 태반 세포가 상기 개체에게 예방적으로, 예를 들어, 상기 혈류 파괴 이후의 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 2차 또는 후속 혈류 파괴에 의해 야기되는 신경학적 손상을 감소시키거나 제거하기 위해 투여된다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴, 예를 들어, 뇌졸중, 무산소성 손상 또는 저산소성 손상의 증상은 편마비 (한쪽 신체의 마비); 반신 불완전마비 (한쪽 신체 상에서의 쇠약); 안면 근육 쇠약; 무감각; 감각 감소; 후각, 미각, 청각, 또는 시각 변화; 후각, 미각, 청각, 또는 시각 상실; 눈꺼풀 처짐 (안검하수증); 안구 근육의 탐지가능한 쇠약; 구역 반사 감소; 삼키는 능력 감소; 빛에 대한 동공 반응성 감소; 안면 감각 감소; 균형 감소; 안구진탕; 호흡 속도 변화; 심박수 변화; 머리를 한쪽으로 돌리는 능력이 감소되거나 돌리지 못하는 흉쇄유돌근 쇠약; 혀 쇠약; 실어증 (언어를 말하거나 이해하지 못함); 실행증 (수의 운동 변화); 시야 결손; 기억력 결핍; 편측무시 또는 편측공간 무시 (병변 반대쪽의 시야 측의 공간에 대한 주의력 결핍); 사고 혼란; 혼동; 성욕과다 몸짓의 발생; 질병인식불능증 (결손의 존재를 지속적으로 부인함); 보행 곤란; 운동 협응 변화; 현기증; 불균형; 의식 상실; 두통; 및/또는 구토 중 하나 이상이다.

상기 기술된 치료 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 볼루스(bolus) 주사에 의해 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 정맥내 주입에 의해 투여된다. 구체적 실시양태에서, 상기 정맥내 주입은 약 1시간 내지 약 8시간에 걸친 정맥내 주입이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 두개내 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 복강내 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 동맥내 투여된다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 허혈 구역 내에 투여된다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 허혈 주위의 구역에 투여된다. 치료 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 근육내, 피내, 피하, 또는 안내 투여된다.

상기 기술된 치료 방법의 또 다른 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포를 포함하는 물질 조성물을 상기 개체 내로 수술에 의해 이식함으로써 상기 단리된 태반 세포가 투여된다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 물질 조성물은 매트릭스 또는 스캐폴드(scaffold)이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드는 히드로젤이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드는 세포제거(decellularized) 조직이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드는 합성 생분해성 조성물이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드는 발포체(foam)이다.

상기 기술된 치료 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 개체에게 1회 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 개체에게 2회 이상 분리된 투여로 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 1×10⁴ 개 내지 1×10⁵ 개의 단리된 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 1×10⁵ 개 내지 1×10⁶ 개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 1×10⁶ 개 내지 1×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 1×10⁷ 개 내지 1×10⁸ 개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 1×10⁶ 개 내지 약 2×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 2×10⁶ 개 내지 약 3×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 3×10⁶ 개 내지 약 4×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 4×10⁶ 개 내지 약 5×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 5×10⁶ 개 내지 약 6×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 6×10⁶ 개 내지 약 7×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 7×10⁶ 개 내지 약 8×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 8×10⁶ 개 내지 약 9×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 또는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 9×10⁶ 개 내지 약 1×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 1×10⁷ 개 내지 약 2×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 1.3×10⁷ 개 내지 약 1.5×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 3×10⁷ 개 이하의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 5×10⁶ 개 내지 약 2×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 20 ㎖의 용액 내의 약 150×10⁶ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다.

구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 5×10⁶ 개 내지 약 2×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 세포는 10％ 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란-40, 5％ 인간 혈청 알부민, 및 임의적인 면역억제제를 포함하는 용액 내에 함유된다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 5×10⁷ 개 내지 3×10⁹ 개의 단리된 태반 세포를 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 9×10⁸ 개의 단리된 태반 세포 또는 약 1.8×10⁹ 개의 단리된 태반 세포를 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 5×10⁷ 개 내지 1×10⁸ 개의 단리된 태반 세포를 두개내 투여하는 것을 포함한다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 9×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 두개내 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 기술된 치료 방법은 제2 치료제를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 제2 치료제는 신경보호제이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 제2 치료제는 NXY-059 (페닐부틸니트론의 디술포닐 유도체: 디소듐 4-((tert-부틸이미노)-메틸)벤젠-1,3-디술포네이트 N-옥시드, 또는 디소듐 4-((옥시도-tert-부틸-아자니우밀리덴)메틸)벤젠-1,3-디술포네이트; 디수펜톤(disufenton)으로 또한 알려짐)이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 제2 치료제는 혈전용해제이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 혈전용해제는 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA)이다. 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴가 출혈인 실시양태에서, 제2 치료제는 항고혈압 약물, 예를 들어, 베타 차단제 또는 이뇨 약물, 이뇨 약물과 칼륨-보존성 이뇨 약물의 조합물, 베타 차단제와 이뇨 약물의 조합물, 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제와 이뇨제의 조합물, 안지오텐신-II 길항제 및 이뇨 약물, 및/또는 칼슘 채널 차단제 및 ACE 억제제일 수 있다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 제2 치료제는 칼슘 채널 차단제, 글루타메이트 길항제, 감마 아미노부티르산 (GABA) 작동제, 항산화제 또는 유리 라디칼 소거제이다.

치료 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 하나 이상의 증상이 발생한 지 21-30일, 예를 들어, 21일 이내, 예를 들어, 뇌졸중, 무산소성 손상 또는 저산소성 손상의 증상이 발생한 지 21-30일, 예를 들어, 21일 이내에 상기 개체에게 투여된다. 치료 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 하나 이상의 증상이 발생한 지 14일 이내에 상기 개체에게 투여된다. 치료 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 하나 이상의 증상이 발생한 지 7일 이내에 상기 개체에게 투여된다. 치료 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 하나 이상의 증상이 발생한 지 48시간 이내에 상기 개체에게 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 하나 이상의 증상이 발생한 지 24시간 이내에 상기 개체에게 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 하나 이상의 증상이 발생한 지 12시간 이내에 상기 개체에게 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 상기 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 하나 이상의 증상이 발생한 지 3시간 이내에 상기 개체에게 투여된다.

3.1 정의

본원에서 사용된 용어 "약"은, 언급된 수치를 지칭할 때, 언급된 수치의±20％ 이내의 값을 가리킨다.

본원에서 사용된 용어 "무산소성 손상"은 뇌 또는 CNS의 구역에 대한 완전한 산소 부족으로 인해 야기되는 손상, 예를 들어, 신경학적 손상 또는 증상을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "저산소성 손상"은 뇌 또는 CNS의 구역에 대한 부분적인 산소 부족으로 인해 야기되는 손상, 예를 들어, 신경학적 손상 또는 증상을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "SH2"는 세포 마커 CD105 상의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 따라서, SH2⁺로 지칭되는 세포는 CD105⁺이다.

본원에서 사용된 용어 "SH3" 및 SH4"는 세포 마커 CD73 상의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 따라서, SH3⁺ 및/또는 SH4⁺로 지칭되는 세포는 CD73⁺이다.

태반은 태반 내에서 발달하는 태아의 유전자형을 지니지만, 또한 임신 기간 동안 모체 조직과 물리적으로 가깝게 접촉된다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "태아 유전자형"은 태아를 임신 중인 모체의 유전자형과 달리, 태아의 유전자형, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 특정한 단리된 태반 세포가 수득되는 태반과 관련된 태아의 유전자형을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "모체 유전자형"은 태아, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 특정한 단리된 태반 세포가 수득되는 태반과 관련된 태아를 임신 중인 모체의 유전자형을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "단리된 세포", 예를 들어, "단리된 줄기 세포"는 줄기 세포가 유래되는 조직, 예를 들어, 태반의 다른 상이한 세포로부터 실질적으로 분리된 세포를 의미한다. 예를 들어, 줄기 세포의 수집 및/또는 배양 동안, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상, 또는 99％ 이상의 세포, 예를 들어, 줄기 세포와 본래 회합되는 비-줄기 세포, 또는 상이한 마커 프로파일을 나타내는 줄기 세포가 줄기 세포로부터 제거되면, 세포가 "단리"된다.

본원에서 사용된 "다능성"은, 세포를 지칭할 때, 반드시 전체이지는 않지만 일부 유형의 신체 세포로, 또는 전체는 아니지만 일부 유형의 신체 세포의 특징이 있는 세포로 분화되는 능력이 있는 세포를 의미한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 신경발생, 연골발생 및/또는 골발생 세포의 특징이 있는 세포로 분화되는 능력이 있는 단리된 태반 세포는 다능성 세포이다.

본원에서 사용된 용어 "단리된 세포들의 집단"은 세포들의 집단이 유래되는 조직, 예를 들어, 태반의 다른 세포로부터 실질적으로 분리된 세포들의 집단을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "태반 줄기 세포"는, 형태학, 세포 표면 마커 또는 1차 배양 후의 계대 횟수와 관계 없이, 포유동물 태반으로부터 유래되는 줄기 세포 또는 전구 세포를 지칭한다. 그러나, 본원에서 사용된 용어 "태반 줄기 세포"는 영양모세포, 안지오블라스트(angioblast), 헤만지오블라스트(hemangioblast), 배아 생식 세포, 배아 줄기 세포, 주머니배의 속세포덩이로부터 수득된 세포, 또는 후기 배아의 생식 융기로부터 수득된 세포, 예를 들어, 배아 생식 세포를 지칭하지 않고, 태반 줄기 세포는 이러한 세포가 아니다. 세포가 줄기 세포의 속성, 예를 들어, 줄기 세포의 1가지 이상의 유형과 관련된 마커 또는 유전자 발현 프로파일; 배양에서 10-40회 이상 복제되는 능력, 및 3가지 배엽층 중 하나 이상의 분화된 세포의 특징을 나타내는 세포로 분화되는 능력을 나타내는 경우 세포가 "줄기 세포"로 간주된다. 용어 "태반 줄기 세포" 및 "태반-유래 줄기 세포"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 용어 "태반"은 제대를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 단리된 태반 세포는 분화 조건 하에 시험관 내에서 분화되거나, 생체 내에서 분화되거나, 또는 양쪽 모두이다.

본원에서 사용된 태반 세포는 마커가 배경을 초과하여 검출가능한 경우 이러한 특정 마커에 대해 "양성"이다. 예를 들면, 태반 세포는 예를 들어 CD73에 대해 양성인데, 이는 CD73이 배경보다 (예를 들어, 이소형(isotype) 대조군과 비교하여) 검출가능하게 큰 양으로 태반 세포 상에서 검출가능하기 때문이다. 마커가 세포를 하나 이상의 또 다른 세포 유형으로부터 구별하는데 사용될 수 있거나 또는 세포에 의해 발현되거나 존재하는 경우 세포를 선별 또는 단리하는데 사용될 수 있는 경우, 세포는 이러한 마커에 대해 또한 양성이다. 예를 들어, 항체-매개 검출의 상황에서, 특정 세포 표면 마커가 존재한다는 표시로서의 "양성"은 이러한 마커에 대해 특이적인 항체, 예를 들어, 형광-표지 항체로 이러한 마커가 검출가능하다는 것을 의미한다; "양성"은, 예를 들어, 세포측정기에서, 배경값을 검출가능하게 초과하는 신호를 일으키는 양으로 마커를 나타내는 세포를 또한 지칭한다. 예를 들어, 세포가 CD200에 대해 특이적인 항체로 검출가능하게 표지되고, 항체로부터의 신호가 대조군 (예를 들어, 배경값 또는 이소형 대조군)의 신호보다 검출가능하게 높은 경우 세포는 "CD200⁺"이다. 반대로, 동일한 상황에서의 "음성"은 세포 표면 마커가 대조군 (예를 들어, 배경값 또는 이소형 대조군)과 비교하여 이러한 마커에 대해 특이적인 항체를 사용하여 검출가능하지 않은 것을 의미한다. 예를 들어, 세포가 대조군 (예를 들어, 배경값 또는 이소형 대조군)보다 큰 정도로 CD34에 대해 특이적인 항체로 재현가능하게 검출가능하게 표지되지 않는 경우 세포는 "CD34^-"이다. 항체를 사용하여 검출되지 않거나 검출가능하지 않은 마커는 적합한 대조군을 사용하여 유사한 방식으로 양성 또는 음성인 것으로 결정된다. 예를 들면, RT-PCR, 슬롯 블롯(slot blot) 등과 같은 RNA 검출 방법에 의해 예를 들어 결정 시, 세포 또는 세포들의 집단으로부터의 RNA에서 검출된 OCT-4 RNA의 양이 배경값보다 검출가능하게 크면 세포 또는 세포들의 집단이 OCT-4⁺인 것으로 결정될 수 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체를 사용하여 분화 클러스터(cluster) ("CD") 마커가 검출된다. 특정 실시양태에서, RT-PCR을 사용하여 OCT-4가 검출가능하면, OCT-4가 존재하는 것으로 결정되고, 세포가 "OCT-4⁺"이다.

본원에서 사용된 "치료하다"는 질환, 장애 또는 상태, 또는 이의 임의의 파라메터 또는 증상의 치유, 교정, 개선, 중증도 축소 또는 경시적 감소를 포함한다.

4. 도면의 간단한 설명
도 1: 신체 거상 스윙 테스트(Elevated Body Swing Test)의 결과. 수직축: 편향된 스윙 활성 백분율. 수평축: 스윙 활성을 측정한 날. 기준선은 허혈 유도 전의 편향된 스윙 활성 백분율이다. 편향된 스윙 활성 백분율을 경색 후 제2일에 또한 평가한 후, 단리된 태반 세포를 두개내 투여하였고, 경색 후 제7일 및 제14일에 다시 평가하였다. 생존성 400K: 4×10⁵ 개의 생존성인 단리된 태반 세포. 비-생존성: 비-생존성 태반 줄기 세포. CsA: 사이클로스포린 A.
도 2: 비더슨 테스트(Bederson Test)의 결과. 수직축: 평균 신경학적 결손 점수. 수평축: 신경학적 결손이 평가된 날. 기준선은 허혈 유도 전의 신경학적 결손핍이다; 0은 결손이 없음을 가리킨다. 평균 신경학적 활성을 경색 후 제2일에 또한 평가한 후, 단리된 태반 세포를 투여하였고, 경색 후 제7일 및 제14일에 다시 평가하였다. 생존성 400K: 4×10⁵ 개의 생존성인 단리된 태반 세포. 비-생존성: 비-생존성 태반 줄기 세포. CsA: 사이클로스포린 A.
도 3: 신체 거상 스윙 테스트의 결과. 수직축: 편향된 스윙 활성 백분율. 수평축: 스윙 활성을 측정한 날. 기준선은 허혈 유도 전의 편향된 스윙 활성 백분율이다. 편향된 스윙 활성 백분율을 경색 후 제2일에 또한 평가한 후, 단리된 태반 세포를 정맥내 투여하였고, 경색 후 제7일 및 제14일에 다시 평가하였다. 비-생존성: 비-생존성 태반 줄기 세포. 4×10⁵ 개, 1×10⁶ 개, 4×10⁶ 개 또는 8×10⁶ 개의 생존성인 단리된 태반 세포를 투여하였다 (범례).
도 4: 비더슨 테스트의 결과. 수직축: 평균 신경학적 결손 점수. 수평축: 신경학적 결손이 평가된 날. 기준선은 허혈 유도 전의 신경학적 결손이다; 0은 결손이 없음을 가리킨다. 평균 신경학적 활성을 경색 후 제2일에 또한 평가한 후, 단리된 태반 세포를 정맥내 투여하였고, 경색 후 제7일 및 제14일에 다시 평가하였다. 비-생존성: 비-생존성 태반 줄기 세포. 4×10⁵ 개, 1×10⁶ 개, 4×10⁶ 개 또는 8×10⁶ 개의 생존성인 단리된 태반 세포를 투여하였다 (범례).
도 5: 변형된 신경 중증도 점수(Modified Neural Severity Score) 테스트의 결과. Y-축: 점수 (채점 방법에 대해 표 1 참조). X축: 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 수술 후의 일수. PDA: 태반 줄기 세포; FBC 대조군: 섬유모세포 대조군; 덱스트란, 세포가 없는 대조군; 1PDA, 1×10⁶ 개의 세포; 4PDA, 4×10⁶ 개의 세포; 8PDA, 8×10⁶ 개의 세포. Rx: 세포 또는 덱스트란의 투여.
도 6: 부착물-제거 몸감각 테스트의 결과. Y축: 테스트 부착 물품의 제거에 걸린 초수. X축: 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 수술 후의 일수. PDA: 태반 줄기 세포; FBC 대조군: 섬유모세포 대조군; 덱스트란, 세포가 없는 대조군; 1PDA, 1×10⁶ 개의 세포; 4PDA, 4×10⁶ 개의 세포; 8PDA, 8×10⁶ 개의 세포. Rx: 세포 또는 덱스트란의 투여.
도 7: 풋-폴트(foot-fault) 테스트의 결과. Y축: 금속 격자 상에서의 100걸음 중 풋-폴트 백분율. X축: 치료 (Rx) 후 풋-폴트 테스트가 수행된 일수. *: 비히클 대조군에 비해 4×10⁶개의 태반 줄기 세포 (PDA-4M)가 제공된 동물에 대한 풋-폴트 테스트에서의 유의한 (p < 0.05) 개선. #: 섬유모세포 대조군에 비해 4×10⁶개의 태반 줄기 세포 (PDA-4M)가 제공된 동물에 대한 풋-폴트 테스트에서의 유의한 (p < O.05) 개선.
도 8: 중간 대뇌 동맥 폐색 후 치료 후 제56일의 혈관형성 측정. 태반 줄기 세포 치료는 내피 세포 증식, 및 허혈성 경계 구역 (IBZ: ischemic boundary zone)에서의 혈관 밀도 및 혈관 경계선(vascular perimeter)을 유의하게 증가시킨다. N=10/군. 도 8A: 파라핀화 뇌 절편에서 검출된 항-BrdU 항체 염색. Y축: 허혈성 병변의 경계 내의 BrdU-양성 내피 세포 (EC)의 백분율; X축: 실험 조건 (MCAo-Dex: 중간 대뇌 동맥 폐색-덱스트란 (치료 전의 초기 조건); 세포 대조군: 섬유모세포의 투여; PDA-4M: 4×10⁶ 개의 태반 줄기 세포의 투여). #: 섬유모세포 대조군에 비해 PDA-4M 조건에서의 내피 세포 증식에서의 유의한 (p <0.05) 증가. *: 덱스트란 (비히클) 대조군에 비해 PDA-4M 조건에서의 내피 세포 증식에서의 유의한 (p <0.05) 증가. 도 8B: 태반 줄기 세포로의 치료 후의 허혈성 경계 구역에서의 혈관 밀도. Y축: ㎣ 당 혈관 개수; X축: 실험 조건 (MCAo-Dex: 중간 대뇌 동맥 폐색-덱스트란 (치료 전의 초기 조건); 세포 대조군: 섬유모세포의 투여; PDA-4M: 4×10⁶ 개의 태반 줄기 세포의 투여). #: 섬유모세포 대조군에 비해 PDA-4M 조건에서의 혈관 밀도에서의 유의한 (p <0.05) 증가. *: 덱스트란 (비히클) 대조군에 비해 PDA-4M 조건에서의 혈관 밀도에서의 유의한 (p <0.05) 증가. 도 8C: 허혈성 경계 구역 주변의 혈관 경계선에서의 증가. Y축: ㎜ 단위의 혈관 경계선의 길이; X축: 실험 조건 (MCAo-Dex: 중간 대뇌 동맥 폐색-덱스트란 (치료 전의 초기 조건); 세포 대조군: 섬유모세포의 투여; PDA-4M: 4×10⁶ 개의 태반 줄기 세포의 투여). #: 섬유모세포 대조군에 비해 PDA-4M 조건에서의 혈관 경계선 길이에서의 유의한 (p <0.05) 증가. *: 덱스트란 (비히클) 대조군에 비해 PDA-4M 조건에서의 혈관 경계선 길이에서의 유의한 (p <0.05) 증가.
도 9: 태반 줄기 세포 치료가 허혈성 뇌의 허혈성 경계에서 시냅토피신(Synaptophysin) 발현을 유의하게 증가시킨다. N=10/군. Y축: 시냅토피신이 검출된 파라핀화 뇌 절편 내의 시험 면적의 ％; X축: 실험 조건 (MCAo: 중간 대뇌 동맥 폐색 시점의 시냅토피신 발현; 세포 대조군: 섬유모세포의 투여; PDA-4M: 4×10⁶ 개의 태반 줄기 세포의 투여). *: 섬유모세포 세포 대조군에 비해 PDA-4M에서의 시냅토피신 발현 면적에서의 유의한 증가.

5. 상세한 설명

5.1 뇌 내부 및 주변에서의 혈류 파괴의 치료

치료적 유효량의 단리된 조직 배양 플라스틱-부착성 인간 태반 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 단리된 태반 세포에 다능성 세포 또는 줄기 세포의 특징이 있으며, 상기 단리된 태반 세포가 골수-유래 중간엽 세포, 지방(adipose)-유래 중간엽 줄기 세포, 또는 제대혈, 태반혈 또는 말초혈로부터 수득된 중간엽 세포가 아닌, 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류가 파괴된 개체의 치료 방법, 예를 들어, 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴에 기인하는 하나 이상의 증상 또는 신경학적 결손의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 손상은 저산소성 손상 또는 무산소성 손상이다. 본원에서 제공된 특정 실시양태에서, 상기 치료적 유효량은 상기 개체가 나타내는 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 하나 이상의 증상 또는 이러한 파괴에 기인하는 신경학적 결손의 제거, 이러한 증상 또는 결손에서의 검출가능한 개선, 이러한 증상 또는 결손의 중증도 축소, 또는 이러한 증상 또는 결손의 진행 속도저하를 초래하는 양이다.

구체적 실시양태에서, 하나 이상의 증상 또는 신경학적 결손, 예를 들어, 뇌졸중, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상의 증상은, 적어도 부분적으로 또는 전적으로, 혈류 파괴 후의 재관류 손상에 기인한다. 본원에서 사용된 "재관류 손상"은 중단된 혈액 공급이 허혈 기간 후 조직으로 되돌아올 때 야기되는 조직 손상을 지칭한다. 혈액이 보유하는 산소 및 영양이 허혈 동안 부재하는 것은 순환 회복이 정상적인 기능의 회복보다는 산화 스트레스의 유도를 통해 염증 및 산화성 손상을 초래하는 상태를 초래한다.

본원에서 사용된, 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료의 정황에서의 용어 "뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴"는 이러한 파괴가 있는 개체가 나타내는 하나 이상의 증상의 치료 및 이러한 파괴에 기인하는 개체의 신경학적 결손의 치료, 예를 들어, 뇌졸중, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상의 하나 이상의 증상의 치료를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 증상은 허혈 자체에 주로 또는 전적으로 기인하는 하나 이상의 증상이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 하나 이상의 증상은 허혈과 예를 들어 관련되는 재관류 손상에 주로 또는 전적으로 기인하는 하나 이상의 증상이다.

5.2 뇌졸중

본원에서 제공된 방법에 의해 치료가능한 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴는 침범된 개체에서 하나 이상의 검출가능한 증상 또는 신경학적 결손을 야기하는 임의의 혈류 파괴일 수 있다 (하기 참조). 특정 실시양태에서, 혈류 파괴는 뇌졸중, 예를 들어, 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중, 예를 들어, 두개내 뇌출혈이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 혈류 파괴는 뇌 외부에서의 출혈, 예를 들어, 경막 혈종, 경막하 혈종 또는 거미막하 혈종이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 혈류 파괴는 일과성 파괴이고, 예를 들어, 일과성 허혈 발작 (TIA)이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 혈류 파괴는 혈관경련수축이다. 구체적 실시양태에서, 대뇌 내에서 뇌 내부에서의 혈류 파괴가 발생한다. 더욱 구체적 실시양태에서, 대뇌의 두정엽, 전두엽, 측두엽, 또는 후두엽에서 혈류 파괴가 발생한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 소뇌에서 혈류 파괴가 발생한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 뇌간 또는 척주에서 혈류 파괴가 발생한다. 특정 실시양태에서, 혈류 파괴가 저산소성 손상 또는 무산소성 손상을 야기한다.

한 실시양태에서, 치료적 유효량의 본원에서, 예를 들어, 하기 섹션 5.4.2에 기술된 바와 같은 단리된 조직 배양 플라스틱-부착성 태반 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상, 예를 들어, 뇌졸중을 앓고 있는 개체 (예를 들어, 뇌졸중 피해자)의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 구체적 실시양태에서, 상기 치료적 유효량은 상기 개체가 나타내는 뇌졸중의 하나 이상의 증상의 제거, 이러한 증상에서의 검출가능한 개선, 이러한 증상의 중증도 축소, 또는 이러한 증상의 진행 속도저하를 초래하는 양이다. 단리된 태반 세포, 예를 들어, 다수의 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 집단은 본원의 다른 곳에서, 예를 들어, 하기 섹션 5.4.2에 기술된 단리된 태반 세포 중 임의의 것일 수 있다.

본원에 기술된 방법에 따라 치료가능한 뇌졸중은 임의의 원인에 기인하는 뇌졸중일 수 있다. 구체적 실시양태에서, 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 허혈성 뇌졸중은 혈전성 뇌졸중 또는 색전성 뇌졸중이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 뇌졸중은 전신선 관류 저하, 즉, 신체 모든 부분에 대한 혈류 감소로 인한 것이거나; 또는 정맥 혈전증으로 인한 것이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 심장 세동, 예를 들어, 심방 세동; 발작성 심방 세동; 류머티스성 질환; 승모판막 또는 대동맥판막 질환; 인공 심장판막; 심방 또는 심실의 심혈전; 동 기능부전 증후군; 지속적인 심방 조동; 심근경색증; 박출률이 28％ 미만인 만성 심근경색증; 박출률이 30％ 미만인 증후성 울혈성 심부전; 심근병증; 심내막염, 예를 들어, 리브만-삭스(Libman-Sacks) 심내막염, 소모성 심내막염 또는 감염성 심내막염; 유두상 섬유탄력종; 좌심방 점액종; 관상 동맥 우회 수술; 승모판 고리의 막의 석회화; 난원공 개존증; 심방 중격 동맥류, 혈전이 없는 좌심실 동맥류, 승모판막 협착증 또는 심방 세동이 없는 심장초음파검사 상에서의 분리형 좌심실 "스모크(smoke)"; 및/또는 오름 대동맥 또는 근위부 활에서의 복합 죽종에 의해 허혈성 뇌졸중이 야기된다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 뇌졸중은 출혈성 뇌졸중이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 출혈성 뇌졸중은 신경축내 출혈 (뇌 내부에서의 혈액 유출)에 의해 야기된다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 출혈성 뇌졸중은 신경축외 출혈 (두개골 내부이지만 뇌 외부의 혈액)에 의해 야기된다. 더욱 구체적 실시양태에서, 뇌졸중은 실질내 출혈, 뇌실내 출혈 (뇌실계 내부의 혈액), 경막외 혈종 (경질막과 두개골 사이의 출혈), 경막하 혈종 (경막하 공간에서의 출혈), 또는 거미막하 출혈 (거미막과 연질막 사이)에 의해 야기된다. 대부분의 출혈성 뇌졸중 증후군에는 특정 증상 (예를 들어 두통, 이전의 두부 손상)이 있다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 출혈성 뇌졸중은 고혈압, 외상, 출혈 장애, 아밀로이드 혈관병증, 불법 약물 사용 (예를 들어 암페타민 또는 코카인), 또는 혈관 기형에 의해 야기되거나 이와 관련된다.

또 다른 실시양태에서, 치료적 유효량의 단리된 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 혈류 파괴가 뇌졸중 이외의 직접적인 원인, 예를 들어, 폐쇄성 뇌 손상 또는 충격과 관련되지 않은 혈종에 의해 야기되는, 개체의 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류가 파괴된 개체의 치료 방법, 예를 들어, 개체의 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴에 기인하는 하나 이상의 증상 또는 신경학적 결손의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 구체적 실시양태에서, 상기 치료적 유효량은 상기 개체가 나타내는 파괴의 하나 이상의 증상의 제거, 이러한 증상에서의 검출가능한 개선, 이러한 증상의 중증도 축소, 또는 이러한 증상의 진행 속도저하를 초래하는 양이다. 뇌졸중과 같이, 단리된 태반 세포는 본원의 다른 곳에서, 예를 들어, 하기 섹션 5.4.2에 기술된 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포 중 임의의 것일 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 치료 방법은 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 하나 이상의 증상 또는 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴에 기인하는 신경학적 결손, 예를 들어, 뇌졸중, 혈종, 예를 들어, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상을 야기하는 것의 제거, 검출가능한 개선, 중증도 축소 또는 진행속도 저하를 초래한다. 구체적 실시양태에서, 상기 증상 또는 신경학적 결손은 편마비 (한쪽 신체의 마비); 반신 불완전마비 (한쪽 신체 상에서의 쇠약); 안면 근육 쇠약; 무감각; 감각 감소; 후각, 미각, 청각, 또는 시각 변화; 후각, 미각, 청각, 또는 시각 상실; 눈꺼풀 처짐 (안검하수증); 안구 근육의 쇠약; 구역 반사 감소; 삼키는 능력 감소; 빛에 대한 동공 반응성 감소; 안면 감각 감소; 균형 감소; 안구진탕; 호흡 속도 변화; 심박수 변화; 머리를 한쪽으로 돌리는 능력이 감소되거나 돌리지 못하는 흉쇄유돌근 쇠약; 혀 쇠약; 실어증 (언어를 말하거나 이해하지 못함); 실행증 (수의 운동 변화); 시야 결손; 기억력 결핍; 편측무시 또는 편측공간 무시 (병변 반대쪽의 시야 측의 공간에 대한 주의력 결핍); 사고 혼란; 혼동; 성욕과다 몸짓의 발생; 질병인식불능증 (결손의 존재를 지속적으로 부인함); 보행 곤란; 운동 협응 변화; 현기증; 불균형; 의식 상실; 두통; 및/또는 구토를 포함한다.

뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 중증도, 예를 들어, 뇌졸중, 또는 뇌졸중에 기인하는 뇌졸중 증상 및/또는 신경학적 결손의 중증도를 하나 이상의 광범위하게 인정되는 신경학적 기능 척도를 사용하여 평가할 수 있다.

예를 들어, 한 실시양태에서, 치료적 유효량의 단리된 부착성 인간 태반 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 치료적 유효량은 변형된 랜킨 척도(Modified Rankin Scale), NIH 뇌졸중 척도, 캐나다 신경학적 척도 (CNS: Canadian Neurological Scale), 글래스고 혼수 척도 (GCS: Glasgow Coma Scale), 반구 뇌졸중 척도, 헌트 앤 헤스(Hunt & Hess) 척도, 매튜(Mathew) 뇌졸중 척도, 간이 정신 상태 검사 (MMSE: Mini-Mental State Examination), 오르고고조(Orgogozo) 뇌졸중 척도, 옥스포드셔 커뮤니티 뇌졸중 프로젝트 분류(Oxfordshire Community Stroke Project Classification) (뱀포드(Bamford)), 스칸디나비아 뇌졸중 척도, 일본 혼수 척도 (JCS: Japan Coma Scale), 바텔 지수(Barthel Index) 및/또는 일본 뇌졸중 척도 (JSS: Japan Stroke Scale) 중 하나 이상에 의해 평가 시 개체의 신경학적 기능에서 검출가능한 개선 또는 검출가능하고 지속적인 개선을 초래하는데 충분한 태반 세포의 양인, 개체의 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류가 파괴된 개체, 예를 들어, 개체의 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴에 기인하는 증상 또는 신경학적 결손, 예를 들어, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상이 있는 개체의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 구체적 실시양태에서, 최초의 평가 후, 그리고 단리된 태반 세포의 1회 이상의 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일 이내, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 이내에 개선이 검출가능하다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 최초의 평가는 뇌졸중의 하나 이상의 증상이 발생되고 나서 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간 또는 23시간 이내, 또는 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 이내에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월, 또는 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 그 이상 동안, 개선 (어떤 방식으로 결정되었든)이 지속된다.

5.3 단리된 태반 세포의 투여

본원에서 제공되는 치료 방법에서 사용되는 단리된 태반 세포는 임의의 의학적으로 허용가능한 방법 또는 경로에 의해 개체의 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴에 의해 야기되거나 이에 기인하는 하나 이상의 증상 또는 신경학적 결손을 나타내는 개체에게 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 치료적 유효량의 단리된 태반 세포가 개체에게 두개내 투여되고, 예를 들어, 개체의 침범된 뇌 또는 CNS 내의 허혈 또는 출혈 부위에 투여된다. 두개내 투여를 위해, 예를 들어, CT 스캐닝, 자기 공명 영상화 (MRI) (예를 들어, T1-, T2-, 확산- 및/또는 관류-강조 MR), 코발트-55 양전자 방출 단층촬영, 또는 유사한 기술에 의해 뇌졸중 장소 (예를 들어, 침범 구역)가 가시화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포가 개체에게 정맥내 또는 동맥내 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 치료적 유효량의 단리된 태반 세포가 개체에게 근육내, 복강내, 피내, 피하, 안구내 또는 비경구 투여된다. 단리된 태반 세포가 볼루스 주사에 의해 또는 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 상기 정맥내 주입은 약 1시간 내지 약 8시간에 걸친 정맥내 주입이다. 특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포가 개체에게 조합 경로에 의해, 예를 들어, 두개내 투여 및 정맥내 주입에 의해 투여된다.

단리된 태반 세포의 치료적 유효량은 개체의 연령 및/또는 크기, 및 허혈 구역의 대략적인 부피에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 연속적인 자기 공명 영상화 영상 또는 전산화 단층촬영 (CT) 스캐닝에 의해, 허혈 구역의 대략적인 부피 및 위치를 추정할 수 있다.

단일 용량으로 예를 들어 투여되는 단리된 태반 세포의 개수는, 예를 들어, 투여 당 대략적으로, 또는 최소, 또는 최대 1×10⁵ 개, 5×10⁵ 개, 1×10⁶ 개, 5×10⁶ 개, 1×10⁷ 개, 5×10⁷ 개, 1×10⁸ 개, 5×10⁸ 개, 1×10⁹ 개, 5×10⁹ 개, 1×10¹⁰ 개, 5×10¹⁰ 개, 1×10¹¹ 개 또는 5×10¹¹ 개의 단리된 태반 세포일 수 있다. 구체적 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴를 앓고 있는 개체, 예를 들어, 뇌졸중, 무산소성 손상 또는 저산소성 손상을 앓고 있는 개체에게 약 5×10⁷ 개 내지 약 3×10⁹ 개의 단리된 태반 세포를 정맥내 투여할 수 있다. 더욱 구체적 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴를 앓고 있는 개체, 예를 들어, 뇌졸중, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상을 앓고 있는 개체에게 약 9×10⁷ 개의 단리된 태반 세포, 약 3.6×10⁸ 개의 단리된 태반 세포, 약 9×10⁸ 개의 단리된 태반 세포, 또는 약 1.8×10⁹ 개의 단리된 태반 세포를 정맥내 투여할 수 있다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 약 2×10⁸ 개의 단리된 태반 세포의 1회 용량이 개체에게 정맥내 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 약 8×10⁸ 개의 단리된 태반 세포의 1회 용량이 개체에게 정맥내 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 각각 약 2×10⁸ 개의 단리된 태반 세포를 포함하는 2회 용량이 개체에게 정맥내 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 각각 약 8×10⁸ 개의 단리된 태반 세포를 포함하는 2회 용량이 개체에게 정맥내 투여된다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴를 앓고 있는 개체, 예를 들어, 뇌졸중, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상을 앓고 있는 개체에게 약 5×10⁷ 개 내지 1×10⁸ 개의 단리된 태반 세포가 두개내 투여될 수 있다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 개체에게 약 9×10⁷ 개의 단리된 태반 세포가 두개내 투여된다.

뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴, 이러한 파괴의 증상, 및/또는 이러한 파괴에 기인하는 신경학적 손상을 앓고 있는 개체에게 단리된 태반 세포를 치료 과정 중에 1회, 또는 1회 초과, 예를 들어, 2회 이상 투여할 수 있다. 단리된 태반 세포는 두개내 투여에 적절한 부피로, 예를 들어, 약 100 ㎕, 200 ㎕, 300 ㎕, 400 ㎕, 500 ㎕, 600 ㎕, 700 ㎕, 800 ㎕, 900 ㎕, 1000 ㎕, 1.5 ㎖, 2 ㎖, 2.5 ㎖, 3 ㎖, 3.5 ㎖, 4 ㎖, 4.5 ㎖, 5 ㎖, 5.5 ㎖, 6.0 ㎖, 6.5 ㎖, 7 ㎖, 7.5 ㎖, 8 ㎖, 8.5 ㎖, 9 ㎖, 9.5 ㎖, 10 ㎖, 11 ㎖, 12 ㎖, 13 ㎖, 14 ㎖, 15 ㎖, 16 ㎖, 17 ㎖, 18 ㎖, 19 ㎖, 20 ㎖, 21 ㎖, 22 ㎖, 23 ㎖, 24 ㎖, 25 ㎖, 26 ㎖, 27 ㎖, 28 ㎖, 29 ㎖, 또는 약 30 ㎖의 제약상 허용가능한 용액으로 투여될 수 있다. 정맥내 투여를 위해, 다수의 단리된 태반 세포 (예를 들어, 약 1×10⁵ 개, 5×10⁵ 개, 1×10⁶ 개, 5×10⁶ 개, 1×10⁷ 개, 5×10⁷ 개, 1×10⁸ 개, 5×10⁸ 개, 1×10⁹ 개, 5×10⁹ 개, 1×10¹⁰ 개, 5×10¹⁰ 개, 1×10¹¹ 개 또는 5×10¹¹ 개의 단리된 태반 세포)가, 예를 들어, 정맥내 주입에 의해, 예를 들어, 대략적으로 또는 최대 100 ㎖, 150 ㎖, 200 ㎖, 250 ㎖, 300 ㎖, 350 ㎖, 400 ㎖, 450 ㎖, 500 ㎖, 550 ㎖, 600 ㎖, 650 ㎖, 700 ㎖, 750 ㎖, 800 ㎖, 850 ㎖, 900 ㎖, 950 ㎖, 1000 ㎖, 1.1 ℓ, 1.2 ℓ, 1.3 ℓ, 1.4 ℓ, 또는 1.5 ℓ로 전달될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 개체 (예를 들어, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴에 의해 야기되거나 이에 기인하는, 또는 재관류 손상의 하나 이상의 증상 또는 신경학적 결손이 있는 개체) 1 ㎏ 당 약 1×10⁶ 개 내지 약 2×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 2×10⁶ 개 내지 약 3×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 3×10⁶ 개 내지 약 4×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 4×10⁶ 개 내지 약 5×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 5×10⁶ 개 내지 약 6×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 6×10⁶ 개 내지 약 7×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 7×10⁶ 개 내지 약 8×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 상기 개체 1 ㎏ 당 약 8×10⁶ 개 내지 약 9×10⁶ 개의 단리된 태반 세포; 또는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 9×10⁶ 개 내지 약 1×10⁷ 개의 단리된 태반 세포가 상기 개체에게 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 1×10⁷ 개 내지 약 2×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 1.3×10⁷ 개 내지 약 1.5×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체 1 ㎏ 당 약 3×10⁷ 개 이하의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 20 ㎖의 용액 내의 약 15×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 태반 세포의 투여는 약 1 ℓ 이하의 용액 내의 수용자 1 ㎏ 당 7.5×10⁶ 개 이하의 단리된 태반 세포의 투여를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 5×10⁶ 개 내지 약 2×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것, 예를 들어, 두개내 투여하는 것을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체에게 1 ㎏ 당 약 5×10⁶ 개 내지 약 3×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 투여하는 것, 예를 들어, 두개내 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 세포는 10％ 덱스트란, 5％ 인간 혈청 알부민, 및 임의적인 면역억제제, 예를 들어, 사이클로스포린 A를 포함하는 용액 내에 함유된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 1×10⁹ 개 내지 약 3×10⁹ 개의 태반 다능성 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 세포는 10％ 덱스트란, 5％ 인간 혈청 알부민, 및 임의적인 면역억제제, 예를 들어, 사이클로스포린 A를 포함하는 용액 내에 함유된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 20 ㎖의 용액 내의 약 15×10⁷ 개 내지 약 25×10⁷ 개의 단리된 태반 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 단리된 태반 세포는, 예를 들어, 볼루스 또는 점적물로서, 정맥내 또는 동맥내 투여될 수 있다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 투여는 약 20 ㎖의 용액 내의 약 2억개의 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다.

단리된 태반 세포가 임의의 의학상 허용가능한 기간 동안 주입될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 예를 들어, 대략 또는 최대 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분 또는 55분에 걸쳐, 또는 대략 또는 최대 1시간, 또는 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간 또는 6시간에 걸쳐 상기 기술된 개수의 단리된 태반 세포가 예를 들어 정맥내 또는 동맥내 투여, 예를 들어, 주입될 수 있다.

단리된 태반 세포는 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류가 파괴된 개체에게 개체 내에서 개체의 파괴의 하나 이상의 증상 또는 이에 기인하는 신경학적 결손, 예를 들어, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상이 발생된 후 임의의 시점에 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 개체가 나타내는 최초의 증상 또는 신경학적 결손이 발생한 지 21일, 20일, 19일, 18일, 17일, 16일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일 또는 2일 이내에 투여된다; 바람직하게는, 단리된 태반 세포는 개체에서 최초의 검출가능한 증상 또는 신경학적 결손이 발생한 지 48시간, 47시간, 46시간, 45시간, 44시간, 43시간, 42시간, 41시간, 40시간, 39시간, 38시간, 37시간, 36시간, 35시간, 34시간, 33시간, 32시간, 21시간, 30시간, 29시간, 28시간, 27시간, 26시간, 25시간, 24시간, 23시간, 22시간, 21시간, 20시간, 19시간, 18시간, 17시간, 16시간, 15시간, 14시간, 13시간, 12시간, 11시간, 10시간, 9시간, 8시간, 7시간, 6시간, 5시간, 4시간, 3시간, 또는 2시간 이내에, 또는 개체에서 최초의 검출가능한 증상 또는 신경학적 결손이 발생한 지 1시간 이내에 투여된다.

또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 예방적으로, 예를 들어, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 상기 혈류 파괴의 하나 이상의 증상, 뇌졸중의 증상, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상이 나타나거나 검출가능하기 전에 투여된다.

단리된 태반 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체의 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류가 파괴된 개체의 치료는 개체에게 하나 이상의 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이같은 제2 치료제는 단리된 태반 세포를 투여하기 전에, 단리된 태반 세포를 투여하는 동안, 또는 단리된 태반 세포를 투여한 후에 투여될 수 있다. 상기 제2 치료제는 단리된 태반 세포가 투여되는 횟수보다 적게, 이러한 횟수보다 많이, 또는 이와 동일한 횟수로 투여될 수 있다.

제2 치료제는 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류가 파괴된 개체에 대한 치료 이점이 있는 임의의 작용제일 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 치료제는 뇌졸중, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상을 치료하는데 사용되는 작용제, 예를 들어, 약물이다. 구체적 실시양태에서, 제2 치료제는 신경보호제이다. 구체적 실시양태에서, 신경보호제는 디수펜톤 소듐 (NXY-059; 페닐부틸니트론의 디술포닐 유도체)이고, 이의 구조식이 하기에 제시된다:

.

개체가 출혈성 뇌졸중을 앓고 있는 또 다른 실시양태에서, 제2 치료제는 상기 개체의 혈압을 낮추는 치료제이다. 또 다른 실시양태에서, 제2 치료제는 혈전용해제이다. 구체적 실시양태에서, 혈전용해제는 조직 플라스미노겐 활성화제이다 (tPA). tPA는 천연 공급원으로부터의 tPA 또는 재조합 tPA일 수 있다. 더욱 구체적 실시양태에서, tPA는 개체에서 하나 이상의 증상 또는 신경학적 결손이 발생한 지 3시간 이내에 투여된다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, tPA는 뇌졸중 피해자에서 뇌졸중의 하나 이상의 증상이 발생한 지 3시간 이후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 뇌졸중 피해자가 두부 손상이 있는 경우, 또는 뇌졸중이 두부 손상에 의해 야기되는 경우, 혈전용해제의 사용이 금기된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 제2 치료제는 항응고제 또는 항혈소판 작용제이다. 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴가 출혈인 실시양태에서, 제2 치료제는 항고혈압 약물, 예를 들어, 베타 차단제 또는 이뇨 약물, 이뇨 약물과 칼륨-보존성 이뇨 약물의 조합물, 베타 차단제와 이뇨 약물의 조합물, 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제와 이뇨제의 조합물, 안지오텐신-II 길항제 및 이뇨 약물, 및/또는 칼슘 채널 차단제 및 ACE 억제제일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 두개내 압력을 감소시키기 위해 제2 치료제가 투여된다. 더욱 구체적 실시양태에서, 제2 치료제는 이뇨제이다.

투여된 단리된 태반 세포가 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류가 파괴된 개체에 대해 자가성이 아닌 실시양태에서, 제2 치료제는 면역억제제일 수 있다. 면역억제제는 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 항-T 세포 수용체 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날, 또는 항체 단편 또는 이의 유도체, 예를 들어, 무로노냅(Muromonab)-CD3), 항-IL-2 수용체 항체 (예를 들어, 바실릭시맵(Basiliximab) (SIMULECT®) 또는 다클리주맵(daclizumab) (ZENAPAX)®), 아자티오프린, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 시롤리무스, 칼시뉴린 억제제 등을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 면역억제제는 대식세포 염증 단백질 (MIP)-1α 또는 MIP-1β에 대한 중화 항체이다. 바람직하게는, 항-MIP-1α 또는 MIP-1β 항체는, 예를 들어, 투여 시에, 상기 개체 내의 MIP-1α 및/또는 MIP-1β의 양을 검출가능하게 감소시키는데 충분한 양으로 투여된다.

5.4 단리된 태반 세포 및 단리된 태반 세포 집단

뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴 (이에 기인하는 증상 및 신경학적 결손 포함)가 있는 개체의 치료에서 유용한 단리된 태반 세포는 조직 배양 기판에 부착하고, 다능성 세포 또는 줄기 세포의 특징이 있지만, 영양모세포는 아닌, 태반 또는 이의 일부분으로부터 수득가능한 세포이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 비-태반 세포 유형으로 분화되는 능력을 지닌다. 본원에 개시된 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 기원이 태아 또는 모체일 수 있다 (즉, 태아 또는 모체의 유전자형을 가질 수 있다). 바람직하게는, 단리된 태반 세포 및 단리된 태반 세포들의 집단은 태아에 기원이 있다. 본원에서 사용된 "태아 기원" 또는 "비-모체 기원"이라는 구절은 단리된 태반 세포 및 단리된 태반 세포들의 집단이 태아와 관련된, 즉 태아의 유전자형을 지니는 제대 또는 태반 구조물로부터 수득된다는 것을 가리킨다. 본원에서 사용된 "모체 기원"이라는 구절은 세포 또는 세포들의 집단이 모체와 관련된, 예를 들어, 모체 유전자형을 지니는 태반 구조물로부터 수득된다는 것을 가리킨다. 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포들을 포함하는 세포들의 집단은 기원이 단독으로 태아 또는 모체인 단리된 태반 세포를 포함할 수 있거나, 또는 태아 및 모체 기원 양쪽 모두의 단리된 태반 세포들의 혼합 집단을 포함할 수 있다. 단리된 태반 세포, 및 단리된 태반 세포들을 포함하는 세포들의 집단을 하기 논의된 형태학적 특징, 마커 특징, 및 배양 특징에 의해 확인 및 선별할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 태반 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포는 수용자, 예를 들어, 뇌졸중에 걸렸었거나 뇌졸중의 증상이 있는 개체에 대해 자가성이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 임의의 태반 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포는 수용자, 예를 들어, 뇌졸중에 걸렸었거나 뇌졸중의 증상이 있는 개체에 대해 이종성이다.

5.4.1 물리적 및 형태학적 특징

본원에 기술된 단리된 태반 세포는, 1차 배양 또는 세포 배양에서 배양될 때, 조직 배양 기판, 예를 들어, 조직 배양 용기 표면 (예를 들어, 조직 배양 플라스틱에, 또는 세포외 매트릭스 또는 리간드 예컨대 라미닌, 콜라겐 (예를 들어, 천연 또는 변성 콜라겐), 젤라틴, 피브로넥틴, 오르니틴, 비트로넥틴, 및 세포외 막 단백질 (예를 들어, MATRIGEL® (BD Discovery Labware (Bedford, Mass.)))로 코팅된 조직 배양 표면에 부착한다. 배양물 내의 단리된 태반 세포는 일반적으로 섬유모세포 모양의 성상 외관을 나타내고, 다수의 세포질 돌기가 중앙 세포 몸체로부터 확장된다. 그러나, 단리된 태반 세포가 섬유모세포보다 더 많은 수의 이같은 돌기를 나타내기 때문에 단리된 태반 세포는 동일한 조건 하에 배양된 섬유모세포로부터 형태학적으로 구별가능하다. 형태학적으로, 단리된 태반 세포는 조혈 줄기 세포로부터 또한 구별가능한데, 조혈 줄기 세포는 배양 시 더욱 둥근 형태 또는 자갈 형태를 일반적으로 나타낸다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는, 성장 배지에서 배양될 때, 배아-유사체가 발달된다. 배아-유사체는 증식 중인 단리된 태반 세포의 부착층의 상부 위에서 성장할 수 있는 세포들의 비-연속적인 덩어리(clump)이다. 세포들의 덩어리가 배아 줄기 세포의 배양물로부터 성장하는 세포들의 덩어리인 배아체를 닮았기 때문에, "배아 유사"라는 용어가 사용된다. 단리된 태반 세포의 증식 배양물에서 배아-유사체가 발달될 수 있는 성장 배지에는 DMEM-LG (예를 들어, 기브코 제품); 2％ 소 태아 혈청 (예를 들어, 하이클론 랩스 제품); 1× 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS); 1× 리놀레산-소 혈청 알부민 (LA-BSA); 10^-9 M 덱사메타손 (예를 들어, 시그마 제품); 10^-4 M 아스코르브산 2-포스페이트 (예를 들어, 시그마 제품); 표피 성장 인자 10 ng/㎖ (예를 들어, R&D 시스템스 제품); 및 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/㎖ (예를 들어, R&D 시스템스 제품)를 예를 들어 포함하는 배지가 포함된다.

5.4.2 세포 표면 마커, 분자 마커 및 유전학적 마커

본원에 개시된 치료 방법에서 유용한, 단리된 태반 세포, 예를 들어, 다능성 세포 또는 줄기 세포, 및 단리된 태반 세포들의 집단은 다능성 세포 또는 줄기 세포의 특징이 있고, 세포 또는 줄기 세포를 포함하는 세포들의 집단을 확인 및/또는 단리하는데 사용될 수 있는 다수의 마커를 발현하는, 조직 배양 플라스틱-부착성 인간 태반 세포이다. 단리된 태반 세포, 및 본원에 기술된 태반 세포 집단 (즉, 2가지 이상의 단리된 태반 세포)는 태반 또는 이의 임의의 일부분 (예를 들어, 양막, 융모막, 태반엽 등)으로부터 직접 수득되는 태반 세포 및 태반 세포-함유 세포 집단을 포함한다. 단리된 태반 세포 집단은 배양 중인 단리된 태반 세포들 (즉, 2가지 이상)의 집단, 및 컨테이너, 예를 들어, 백 내의 집단을 또한 포함한다. 본원에 기술된 단리된 태반 세포 집단은 골수-유래 중간엽 세포, 지방-유래 중간엽 줄기 세포, 또는 제대혈, 태반혈 또는 말초혈로부터 수득된 중간엽 세포가 아니다.

특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 단리된 태반 줄기 세포이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 단리된 태반 다능성 세포이다. 한 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 CD34^-, CD10⁺ 및 CD105⁺이다. 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 태반 줄기 세포이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 다능성 태반 세포이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 신경 표현형의 세포, 골발생 표현형의 세포, 및/또는 연골발생 표현형의 세포로 분화되는 잠재력을 지닌다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD200⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD45^- 또는 CD90⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD45^- 및 CD90⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 또는 CD45^-이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 및 CD45^-이고, 즉 세포는 CD34^-, CD10⁺, CD45^-, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 CD34^-, CD10⁺, CD45^-, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺ 세포는 추가적으로 CD80^- 및 CD86^-이다.

구체적 실시양태에서, 임의의 상기 기술된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 세포는 추가적으로 CD29⁺, CD38^-, CD44⁺, CD54⁺, SH3⁺ 또는 SH4⁺ 중 하나 이상이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 세포는 추가적으로 CD44⁺이다. 임의의 상기의 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포의 또 다른 구체적 실시양태에서, 세포는 추가적으로 CD117^-, CD133^-, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, 또는 PDL1⁺, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상이다.

또 다른 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 세포는 추가적으로 CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, 또는 PDL1⁺, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상이다. 또 다른 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 세포는 추가적으로 CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, 및 PDL1⁺이다.

특정 실시양태에서, 세포는 SSEA3^-, SSEA4^- 또는 ABC-p⁺ 중 하나 이상이다. 단리된 태반 세포는 HLA-ABC (MHC-1)를 또한 발현할 수 있다. 이러한 마커들이, 임의의 조합으로, 단리된 태반 세포, 예를 들어, 단리된 태반 줄기 세포 또는 단리된 다능성 세포를 확인하고, 단리된 태반 세포를 다른 세포 유형으로부터 구별하는데 사용될 수 있다. 단리된 태반 세포는 CD73 및 CD105를 발현할 수 있기 때문에, 중간엽 줄기 세포-유사 특징이 있을 수 있다. 예를 들어, CD34, CD38 및/또는 CD45의 발현 결여로 단리된 태반 세포가 조혈 줄기 세포가 아닌 것으로 확인된다.

본원에 개시된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포를 포함하는, 예를 들어, 이러한 세포에 대해 강화된, 단리된 태반 세포들의 집단, 또는 세포들의 집단, 예를 들어, 태반 세포들의 집단이 본원에서 또한 제공된다. 세포들의 집단이 본원에 개시된 치료 방법에서 유용한, 단리된 태반 세포를 포함하는 바람직한 세포 집단은, 예를 들어, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 98％ 이상의 단리된 CD10⁺, CD105⁺ 및 CD34^- 태반 세포를 포함한다; 즉, 상기 집단 내의 세포의 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 98％ 이상이 단리된 CD10⁺, CD105⁺ 및 CD34^- 태반 세포이다. 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD200⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 또는 CD45^-이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 및 CD45^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 임의의 상기 기술된 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD29⁺, CD38^-, CD44⁺, CD54⁺, SH3⁺ 또는 SH4⁺ 중 하나 이상이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포, 또는 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD44⁺이다. 상기의 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포를 포함하는 세포들의 집단 중 임의의 것의 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가적으로 CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, 또는 PDL1⁺, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상이다. 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 세포는 추가적으로 CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, 및 PDL1⁺이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺ 및 ABC-p⁺ 중 하나 이상, 또는 이들 모두인 단리된 태반 세포이고, 이때 상기 단리된 태반 세포는 태반 조직의 물리적 및/또는 효소에 의한 파괴에 의해 수득된다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺ 및 ABC-p⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺ 및 CD34^-이고, 이때 상기 단리된 태반 세포는 하기의 특성들 중 하나 이상을 지닌다: CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- 및 SSEA4^-. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺, CD34^-, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- 및 SSEA4^-이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- 및 SSEA4^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺ 및 CD34^-이고, SH2⁺ 또는 SH3⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺, CD34^-, SH2⁺ 및 SH3⁺이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- 및 SSEA4^-이고, SH2⁺ 또는 SH3⁺ 중 하나이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺ 및 CD34^-이고, SH2⁺ 또는 SH3⁺이며, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SSEA3^- 또는 SSEA4^- 중 하나 이상이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺, CD34^-, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SSEA3^-, 및 SSEA4^-이고, SH2⁺ 또는 SH3⁺이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ 및 OCT-4⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺, CD34^-, CD45^-, SSEA3^- 또는 SSEA4^-이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- 및 SSEA4^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- 및 SSEA4^-, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺, OCT-4⁺, CD34^- 또는 CD45^-이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺ 및 SH4⁺이고, 이때 상기 단리된 태반 세포는 추가적으로 OCT-4⁺, SSEA3^- 또는 SSEA4^- 중 하나 이상이다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 방법, 예를 들어, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료 방법, 뇌졸중의 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD200⁺ 또는 HLA-G⁺이다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD200⁺ 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가적으로 CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺ 또는 HLA-G⁺ 태반 세포는 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단에서 배아-유사체의 형성을 촉진한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 줄기 또는 다능성 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 줄기 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 세포 집단은 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기 세포를 포함하는, 예를 들어 이러한 세포에 대해 강화된 세포들의 집단이다. 구체적 실시양태에서, 상기 집단은 태반 세포들의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 집단 내의 세포의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 또는 약 60％ 이상이 단리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 세포이다. 바람직하게는, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 70％ 이상이 단리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 세포이다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포들의 약 90％, 95％, 또는 99％ 이상이 단리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 세포이다. 세포 집단의 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 또한 CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 또한 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단은 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 하나 이상의 배아-유사체를 생산한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD73⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^- 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD73⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺ 태반 세포는 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 단리된 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 세포 집단은 단리된 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이러한 세포에 대해 강화된 세포들의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 또는 약 60％ 이상이 단리된 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 70％ 이상이 단리된 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 90％, 95％ 또는 99％ 이상이 단리된 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포이다. 상기 집단의 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^-, CD45^- 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 하나 이상의 배아-유사체를 생산한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 태반 세포 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포 집단은 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺, HLA-G⁺ 또는 ABC-p⁺ 중 하나 이상이다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^- 및 OCT-4⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD54⁺, SH2⁺, SH3⁺ 및 SH4+이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD54⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ 및 OCT-4⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, HLA-G⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺ 및 ABC-p⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ 및 OCT-4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- 및 SSEA4^-이다. 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- 및 SSEA4^- 태반 세포는 추가적으로 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺ 및 SH4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺ 및 CD34^-이고, SH3⁺ 또는 SH4⁺이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34^-이고, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 OCT-4⁺이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD200⁺ 및 OCT-4⁺이다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 단리된 세포를 포함하는 테반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에 의한 하나 이상의 배아-유사체의 생산을 촉진한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 세포 집단은 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이러한 세포에 대해 강화된 세포들의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 또는 약 60％ 이상이 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포들의 약 70％ 이상이 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상이 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포이다. 단리된 집단의 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 이러한 세포 집단은 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 하나 이상의 배아-유사체를 생산한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 단리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 OCT-4⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD200⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ 및 CD200⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 상기 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 배아-유사체의 형성을 촉진한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 세포 집단은 단리된 CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺ 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이러한 세포에 대해 강화된 세포들의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 또는 약 60％ 이상이 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 70％ 이상이 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 90％, 95％ 또는 99％ 이상이 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포이다. 상기 집단의 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 OCT-4⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD200⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ 및 CD200⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD73⁺ 및 CD105⁺이고, 상기 CD73⁺, CD105⁺ 세포를 포함하는 단리된 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 OCT-4⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 세포 집단은 CD73⁺ 및 CD105⁺인 단리된 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이러한 세포에 대해 강화된 세포들의 집단이고, 상기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진한다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 또는 약 60％ 이상이 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 70％ 이상이 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 90％, 95％ 또는 99％ 이상이 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포이다. 상기 집단의 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 OCT-4⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD200⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ 및 CD200⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 상기 단리된 CD73⁺ 및 CD105⁺ 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 OCT-4⁺이고, 상기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진한다. 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^-, 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD200⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 OCT-4⁺ 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 세포 집단은 OCT-4⁺인 단리된 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이러한 세포에 대해 강화된 세포들의 집단이고, 상기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진한다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상, 약 50％ 이상, 또는 약 60％ 이상이 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 70％ 이상이 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 약 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상이 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포이다. 상기 집단의 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD200⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^- 및 CD45^-이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 단리된 HLA-A,B,C^-, CD45^-, CD133^- 및 CD34^- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에서 유용한 세포 집단은 단리된 세포 집단 내의 세포의 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상이 단리된 HLA-A,B,C^-, CD45^-, CD133^- 및 CD34^- 태반 세포인, 단리된 태반 세포들을 포함하는 세포들의 집단이다. 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 집단은 HLA-A,B,C^-, CD45^-, CD133^- 및 CD34^- 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 기원이 비-모체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 태반 세포들의 단리된 집단에는 모체 성분이 실질적으로 없다; 예를 들어, 태반 세포들의 단리된 집단 내의 세포의 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 기원이 비-모체이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 단리된 CD10⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD45^-, CD117^- 및 CD133^- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에서 유용한 세포 집단은 상기 세포 집단 내의 세포의 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상이 단리된 CD10⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD45^-, CD117^- 및 CD133^- 태반 세포인, 단리된 태반 세포들을 포함하는 세포들의 집단이다. 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 집단은 상기 단리된 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 CD10⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD45^-, CD117^- 및 CD133^- 태반 세포는 기원이 비-모체이고, 즉, 태아 유전자형을 지닌다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 태반 세포들의 단리된 집단 내의 세포의 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 기원이 비-모체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 집단은 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 단리된 CD10^-, CD33^-, CD44⁺, CD45^- 및 CD117^- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에서 유용한 세포 집단은 상기 세포 집단 내의 세포의 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상이 단리된 CD10^-, CD33^-, CD44⁺, CD45^- 및 CD117^- 태반 세포인, 단리된 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이러한 세포에 대해 강화된 세포들의 집단이다. 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 집단은 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 기원이 비-모체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 상기 세포의 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 기원이 비-모체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들이 집단은 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 단리된 CD10^-, CD13^-, CD33^-, CD45^- 및 CD117^- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에서 유용한 세포 집단은 상기 집단 내의 세포의 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상이 CD10^-, CD13^-, CD33^-, CD45^- 및 CD117^- 태반 세포인, 단리된 CD10^-, CD13^-, CD33^-, CD45^- 및 CD117^-태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이러한 세포에 대해 강화된 세포들의 집단이다. 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 집단은 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 기원이 비-모체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 상기 세포의 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 기원이 비-모체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 집단은 이러한 특징들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 HLA A,B,C⁺, CD45^-, CD34^- 및 CD133^-이고, 추가적으로 CD10⁺, CD13⁺, CD38⁺, CD44⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺ 및/또는 HLA-G⁺이고/이거나 CD117에 대해 음성이다. 또 다른 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에서 유용한 세포 집단은 상기 집단 내의 세포의 약 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 약 99％ 이상이 HLA A,B,C^-, CD45^-, CD34^-, CD133^-이고, 추가적으로 CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 및/또는 HLA-G에 대해 양성이고/이거나 CD117에 대해 음성인 단리된 태반 세포인, 단리된 태반 세포를 포함하는 세포들의 집단이다. 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 집단은 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 기원이 비-모체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 상기 세포의 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 기원이 비-모체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 집단은 이러한 마커들을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 항체 결합에 의해 결정 시 CD200⁺ 및 CD10⁺이고, 항체 결합 및 RT-PCR 양쪽 모두에 의해 결정 시 CD117^-인 단리된 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29^-, CD54⁺, CD200⁺, HLA-G⁺, HLA 클래스 I^- 및 β-2-마이크로글로불린^-인 단리된 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에서 유용한 단리된 태반 세포는 하나 이상의 세포 마커의 발현이 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기 세포)보다 2배 이상 더 높은 태반 세포이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 기원이 비-모체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 상기 세포의 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 기원이 비-모체이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, β2-마이크로글로불린^low, MHC-I^low, MHC-II^-,HLA-G^low 및/또는 PDL1^low 중 하나 이상인 단리된 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포이다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 적어도 CD29⁺ 및 CD54⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 적어도 CD44⁺ 및 CD106⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 적어도 CD29⁺이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 세포 집단은 단리된 태반 세포를 포함하고, 상기 세포 집단 내의 세포의 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62-E^-, CD62-L^-, CD62-P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, β2-마이크로글로불린^low, HLA-I^low, HLA-II^-, HLA-G^low, 및/또는 PDL1^low 중 하나 이상인 단리된 태반 세포이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 세포의 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62-E^-, CD62-L^-, CD62-P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, β2-마이크로글로불린^low, MHC-I^low, MHC-II^-, HLA-G^low 및 PDL1^low이다.

또 다른 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에서 유용한 단리된 태반 세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺ 및 ABC-p⁺ 중 하나 이상 또는 이들 모두인 단리된 태반 세포이고, 이때 ABC-p는 태반-특이적 ABC 전달체 단백질 (유방암 저항성 단백질 (BCRP) 및 미톡산트론 저항성 단백질 (MXR)로 또한 알려짐)이고, 상기 단리된 태반 세포는 제대혈이 배출되었고 잔류 혈액이 제거되도록 관류된 포유동물, 예를 들어, 인간 태반의 관류에 의해 수득된다.

유전자 프로파일링(profiling)에서, 단리된 태반 세포, 및 단리된 태반 세포들의 집단이 다른 세포, 예를 들어, 중간엽 줄기 세포, 예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기 세포와 구별된다는 것이 확인된다. 유전자의 발현이 골수 유래 중간엽 줄기 세포와 비교하여 단리된 태반 세포에서 또는 단리된 특정 제대 줄기 세포에서 유의하게 더 높은 하나 이상의 유전자의 발현을 기초로, 본원에 기술된 단리된 태반 세포가, 예를 들어, 중간엽 줄기 세포로부터 구별될 수 있다. 특히, 유전자의 발현이 등가 개수의 골수 유래 중간엽 줄기 세포보다 단리된 태반 세포에서 유의하게 더 높은 (즉, 2배 이상 더 높은) 하나 이상의 유전자의 발현을 기초로 본원에서 제공되는 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포가 중간엽 줄기 세포로부터 구별될 수 있고, 이때 이러한 하나 이상의 유전자는 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, 또는 이러한 유전자들 중 임의의 것의 조합이고, 세포들은 등가의 조건 하에 배양된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0275362를 참조하고, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 DMEM-LG (예를 들어, 기브코 제품); 2％ 소 태아 혈청 (예를 들어, 하이클론 랩스 제품); 1× 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS); 1× 리놀레산-소 혈청 알부민 (LA-BSA); 10^-9 M 덱사메타손 (예를 들어, 시그마 제품); 10^-4 M 아스코르브산 2-포스페이트 (예를 들어, 시그마 제품); 표피 성장 인자 10 ng/㎖ (예를 들어, R&D 시스템스 제품); 및 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/㎖ (예를 들어, R&D 시스템스 제품)를 포함하는 배지에서 약 3회 내지 약 35회 개체수 배가 동안 배양되는 경우 상기 하나 이상의 유전자를 발현한다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포-특이적 또는 단리된 제대 세포-특이적 유전자는 CD200이다.

이러한 유전자들에 대한 구체적인 서열을 2008년 3월 현재 진뱅크(GenBank)에서 접속 번호 NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARB1), NM_181847 (AMIGO2), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BC020196 (C11orf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ 10781), AY416799 (GATA6), BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTN1), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 또는 BC065328 (SLC12A8), BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN), 및 BC005001 (ZC3H12A)에서 확인할 수 있다.

더욱 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 세포들이 등가의 조건 하에 배양되는 경우 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, 및 ZC3H12A 각각을 등가 개수의 골수 유래 중간엽 줄기 세포보다 검출가능하게 높은 수준으로 발현한다.

상기 언급된 유전자들의 발현을 표준 기술에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 통상적인 기술에 의해 유전자(들)의 서열을 기초로 하는 프로브들을 개별적으로 선택하여 구축할 수 있다. 예를 들어, 유전자들 중 하나 이상에 대한 프로브를 포함하는 마이크로어레이, 예를 들어, 어피메트릭스(Affymetrix)의 GENECHIP® 인간 게놈 U133A 2.0 어레이, 또는 어피메트릭스의 GENECHIP® 인간 게놈 U133 플러스 2.0 (Santa Clara, California) 상에서 유전자의 발현을 평가할 수 있다. 특정 진뱅크 접속 번호에 대한 서열이 수정되더라도 이러한 유전자들의 발현을 평가할 수 있는데, 수정된 서열에 대해 특이적인 프로브가 주지된 표준 기술을 사용하여 쉽게 생성될 수 있기 때문이다.

이러한 유전자들의 발현 수준은 단리된 태반 세포들의 집단의 신원을 확증하는 것, 적어도 다수의 단리된 태반 세포들을 포함하는 것으로 세포 집단을 확인하는 것 등에 사용될 수 있다. 신원이 확증된, 단리된 태반 세포들의 집단은 클론성일 수 있고, 예를 들어, 단일한 단리된 태반 세포로부터 확장된 단리된 태반 세포들의 집단, 또는 줄기 세포들의 혼합 집단, 예를 들어, 여러 단리된 태반 세포들로부터 확장된 단리된 태반 세포들만을 포함하는 세포들의 집단, 또는 본원에 기술된 바와 같은 단리된 태반 세포들 및 하나 이상의 또 다른 유형의 세포를 포함하는 세포들의 집단일 수 있다.

이러한 유전자들의 발현 수준은 단리된 태반 세포들의 집단을 선별하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 열거된 유전자들 중 하나 이상의 발현이 중간엽 줄기 세포들의 등가 집단에서보다 세포들의 집단으로부터의 샘플에서 유의하게 더 높은 경우 세포들, 예를 들어, 클론-확장 세포들의 집단이 선별될 수 있다. 이같은 선별은 다수의 단리된 태반 세포 집단, 신원이 알려지지 않은 다수의 세포 집단 등으로부터의 집단의 선별일 수 있다.

단리된 태반 세포를 하나 이상의 이같은 유전자의 발현 수준을 기초로, 예를 들어 중간엽 줄기 세포 대조군에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준, 예를 들어, 등가 개수의 골수 유래 중간엽 줄기 세포에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교하여 선별할 수 있다. 한 실시양태에서, 등가 개수의 중간엽 줄기 세포를 포함하는 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 대조군으로 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 특정 조건 하에 테스트된 단리된 태반 세포에 대한 대조군은 상기 조건 하에서의 중간엽 줄기 세포에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 나타내는 수치이다.

본원에 기술된 단리된 태반 세포는 DMEM-LG (기브코), 2％ 소 태아 혈청 (FCS) (Hyclone Laboratories), 1× 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS), 1× 레놀렌산-소 혈청 알부민 (LA-BSA), 10^-9 M 덱사메타손 (시그마), 10^-4 M 아스코르브산 2-포스페이트 (시그마), 표피 성장 인자 (EGF) 10 ng/㎖ (R&D 시스템스), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/㎖ (R&D 시스템스), 및 100U 페니실린/1000U 스트렙토마이신을 예를 들어 포함하는 배지에서의 1차 배양에서 또는 증식 동안 상기 특성 (예를 들어, 세포 표면 마커 및/또는 유전자 발현 프로파일의 조합)을 디스플레이한다.

상기 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포들을 포함하는 세포들의 집단의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 또는 집단이 확장되었고, 예를 들어, 최소, 대략 또는 최대 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회 또는 20회 계대되거나, 또는 최소, 대략 또는 최대 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 12회, 14회, 16회, 18회, 20회, 22회, 24회, 26회, 28회, 30회, 32회, 34회, 36회, 38회 또는 40회 개체수 배가로 증식되었다. 본원에 개시된, 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포들을 포함하는 세포들의 집단의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 기원이 태아이다 (즉, 태아 유전자형을 지닌다).

단리된 태반 세포의 특정 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 성장 배지, 즉, 증식을 촉진하도록 제제화된 배지에서 배양되는 동안, 예를 들어, 성장 배지에서의 증식 동안 분화되지 않는다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 증식하기 위해 피더 층을 필요로 하지 않는다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 피더 세포층의 부재로 인해, 상기 단리된 태반 세포는 피더 층의 부재 하에 배양물에서 분화되지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에 유용한 세포는 다수의 단리된 태반 세포가 알데히드 데히드로게나제 활성 분석법에 의해 평가했을 때 알데히드 데히드로게나제 (ALDH)에 대해 양성인 단리된 태반 세포이다. 이같은 분석법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, [Bostian and Betts, Biochem. J., 173, 787, (1978)] 참조). 구체적 실시양태에서, 상기 ALDH 분석법은 ALDEFLUOR® (알다겐, 인크. (Ashland, Oregon))를 알데히드 데히드로게나제 활성의 마커로 사용한다. 구체적 실시양태에서, 상기 다수는 상기 세포 집단 내의 세포의 약 3％ 내지 약 25％이다. 또 다른 실시양태에서, ALDEFLUOR®를 알데히드 데히드로게나제 활성의 지표로 사용하는 알데히드 데히드로게나제 활성 분석법에 의해 평가했을 때 다수의 단리된 제대 세포가 알데히드 데히드로게나제에 대해 양성인, 단리된 제대 세포, 예를 들어, 다능성의 단리된 제대 세포의 집단이 본원에서 제공된다. 구체적 실시양태에서, 상기 다수는 상기 세포 집단 내의 세포의 약 3％ 내지 약 25％이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포들 또는 단리된 제대 세포들의 집단은 세포수가 대략 동일하고 동일한 조건 하에 배양된 골수 유래 중간엽 줄기 세포들의 집단보다 3배 이상, 또는 5배 이상 더 높은 ALDH 활성을 나타낸다.

본원에 기술된 단리된 태반 세포를 포함하는 임의의 세포 집단의 특정 실시양태에서, 상기 세포 집단 내의 태반 세포에는 모체 유전자형을 지니는 세포가 실질적으로 없다; 예를 들어, 상기 집단 내의 태반 세포의 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 태아 유전자형을 지닌다. 본원에 기술된 단리된 태반 세포를 포함하는 임의의 세포 집단의 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 태반 세포를 포함하는 세포들의 집단에는 모체 유전자형을 지니는 세포가 실질적으로 없다; 예를 들어, 상기 집단 내의 세포의 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상이 태아 유전자형을 지닌다.

임의의 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포들의 세포 집단의 구체적 실시양태에서, 세포, 또는 상기 집단 내의 세포의 약 95％ 또는 약 99％ 이상의 핵형이 정상이다. 임의의 상기 태반 세포 또는 세포 집단의 또 다른 구체적 실시양태에서, 세포, 또는 세포 집단 내의 세포는 기원이 비-모체이다.

임의의 상기 마커 조합을 보유하는, 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포들의 집단이 임의의 비율로 조합될 수 있다. 임의의 2가지 이상의 상기 단리된 태반 세포 집단이 조합되어 단리된 태반 세포 집단을 형성할 수 있다. 예를 들어, 단리된 태반 세포들의 집단이 상기 기술된 마커 조합들 중 하나에 의해 정의되는 단리된 태반 세포들의 제1 집단, 및 또 다른 상기 기술된 마커 조합에 의해 정의되는 단리된 태반 세포들의 제2 집단을 포함할 수 있고, 이때 상기 제1 집단과 제2 집단은 약 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2 또는 약 99:1의 비율로 조합된다. 유사한 방식으로, 상기 기술된 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포 집단 중 임의의 3가지, 4가지, 5가지 또는 그 이상이 조합될 수 있다.

뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에 유용한 단리된 태반 세포를, 효소 소화 (섹션 5.5.3 참조) 또는 관류 (섹션 5.5.4 참조)와 함께 또는 이러한 처리 없이, 태반 조직의 파괴에 의해 예를 들어 수득할 수 있다. 예를 들어, 제대혈이 배출되었고 잔류 혈액을 제거하도록 관류된 포유동물 태반을 관류시키는 단계; 상기 태반에 관류 용액을 관류시키는 단계; 및 상기 관류 용액을 수집하고, 이때 관류 후의 상기 관류 용액이 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단을 포함하는 단계; 및 상기 세포 집단으로부터 다수의 상기 단리된 태반 세포를 단리하는 단계를 포함하는 방법에 따라 단리된 태반 세포들의 집단이 생산될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 관류 용액이 제대 정맥 및 제대 동맥 양쪽 모두를 통과하고, 태반으로부터 삼출된 후 수집된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 관류 용액이 제대 정맥을 통과하고 제대 동맥으로부터 수집되거나, 또는 제대 동맥을 통과하고 제대 정맥으로부터 수집된다.

다양한 실시양태에서, 태반의 관류로부터 수득된 세포 집단 내에 함유된 단리된 태반 세포는 상기 태반 세포 집단의 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 99％ 이상 또는 99.5％ 이상이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 관류에 의해 수집된 단리된 태반 세포는 태아 및 모체 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 관류에 의해 수집된 단리된 태반 세포는 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 99％ 이상 또는 99.5％ 이상 태아 세포이다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 관류에 의해 수집된, 본원에 기술된 바와 같은 단리된 태반 세포들의 집단을 포함하고, 이때 조성물이 단리된 태반 세포를 수집하는데 사용된 관류 용액의 적어도 일부분을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다.

본원에 기술된 단리된 태반 세포들의 단리된 집단은 태반 조직을 조직-파괴 효소로 소화시켜 이러한 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단을 수득하고, 다수의 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 단리하거나 또는 실질적으로 단리함으로써 생산될 수 있다. 본원에 기술된 단리된 태반 세포를 수득하기 위해 전체 태반 또는 이의 임의의 일부분이 소화될 수 있다. 예를 들어, 구체적 실시양태에서, 상기 태반 조직은 전체 태반, 양막, 융모막, 양막과 융모막의 조합물, 또는 임의의 상기의 것들의 조합물이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 조직 파괴 효소는 트립신 또는 콜라게나제이다. 다양한 실시양태에서, 태반 소화로부터 수득된 세포들의 집단 내에 함유된 단리된 태반 세포는 상기 태반 세포 집단의 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 99％ 이상 또는 99.5％ 이상이다.

상기 기술된 태반 세포들의 단리된 집단, 및 단리된 태반 세포들의 집단은 대략, 최소, 또는 최대 1×10⁵ 개, 5×10⁵ 개, 1×10⁶ 개, 5×10⁶ 개, 1×10⁷ 개, 5×10⁷ 개, 1×10⁸ 개, 5×10⁸ 개, 1×10⁹ 개, 5×10⁹ 개, 1×10¹⁰ 개, 5×10¹⁰ 개, 1×10¹¹ 개 또는 이를 초과하는 개수의 단리된 태반 세포를 일반적으로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 치료 방법에서 유용한 단리된 태반 세포들의 집단은, 트리판 블루 배제에 의해 예를 들어 결정되는 바와 같이, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ 이상의 생존성인 단리된 태반 세포를 포함한다.

5.4.3 배양물에서의 성장

섹션 5.4.2에서 본원에 기술된 단리된 태반 세포의 성장은, 임의의 포유동물 세포에 대해서와 같이, 성장에 선택된 특정 배지에 부분적으로 좌우된다. 최적의 조건 하에, 단리된 태반 세포는 전형적으로 약 1일 내에 개수가 배가된다. 배양 동안, 본원에 기술된 단리된 태반 세포는 배양 시의 기판, 예를 들어 조직 배양 컨테이너 (예를 들어, 조직 배양 접시 플라스틱, 피브로넥틴-코팅 플라스틱 등)의 표면에 부착하여, 단층을 형성한다.

본원에 기술된 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단은, 적합한 조건 하에 배양될 때, 배아-유사체를 형성할 수 있고, 즉, 세포의 3차원 클러스터가 부착성 세포층의 상부에서 성장한다. 배아-유사체 내의 세포는 극초기 줄기 세포와 관련된 마커, 예를 들어, OCT-4, Nanog, SSEA3 및 SSEA4를 발현한다. 전형적으로 배아-유사체 내의 세포는 본원에 기술된 단리된 태반 세포가 부착성인 것과 같이 배양 기판에 대해 부착성이지 않지만, 배양 동안 이러한 부착성 세포에 계속 부착된다. 배아-유사체 세포는 생육력을 위해 부착성의 단리된 태반 세포에 의존적인데, 이는 부착성의 단리된 태반 세포의 부재 하에 배아-유사체가 형성되지 않기 때문이다. 따라서 부착성의 단리된 태반 세포는 부착성의 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 성장을 촉진한다. 이론에 의해 제한되기를 원치 않으면서, 배아 줄기 세포가 피더 세포층 상에서 성장하는 것과 같이 배아-유사체의 세포가 부착성의 단리된 태반 세포 상에서 성장하는 것으로 생각된다.

5.5 단리된 태반 세포를 수득하는 방법

5.5.1 줄기 세포 수집 조성물

태반 세포, 예를 들어, 상기 섹션 5.4.2에 기술된 단리된 태반 세포를 수집하고 단리하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 일반적으로, 이같은 세포는 생리학적으로 허용가능한 용액, 예를 들어, 세포 수집 조성물을 사용하여 포유동물 태반으로부터 수득된다. 예시적인 세포 수집 조성물이 관련된 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0190042 (발명의 명칭이 "Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs"임)에 상세하게 기술되어 있고, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

세포 수집 조성물은 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 단리된 태반 세포의 수집 및/또는 배양에 적절한 임의의 생리학적으로 허용가능한 용액, 예를 들어, 염수 용액 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수, 크렙(Kreb) 용액, 변형 크렙 용액, 이글(Eagle) 용액, 0.9％ NaCl 등), 배양 배지 (예를 들어, DMEM, H.DMEM 등) 등을 포함할 수 있다.

세포 수집 조성물은 단리된 태반 세포를 보존하는 경향이 있는, 즉, 수집 시간에서 배양 시간까지, 단리된 태반 세포의 사망을 방지하는 것, 또는 단리된 태반 세포의 사망을 지연시키는 것, 사망하는 세포 집단 내의 단리된 태반 세포의 수를 감소시키는 것 등의 경향이 있는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 이같은 성분은, 예를 들어, 아폽토시스 억제제 (예를 들어, 카스파제 억제제 또는 JNK 억제제); 혈관확장제 (예를 들어, 황산마그네슘, 항-고혈압 약물, 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP), 아드레노코르티코트로핀, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 소듐 니트로프루시드, 히드랄라진, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘, 포스포디에스테라제 억제제 등); 괴사 억제제 (예를 들어, 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노-말레이미드, 피롤리딘 디티오카르바메이트, 또는 클로나제팜); TNF-α 억제제; 및/또는 산소-운반 퍼플루오로카본 (예를 들어, 퍼플루오로옥틸 브로마이드, 퍼플루오로데실 브로마이드 등)일 수 있다.

세포 수집 조성물은 하나 이상의 조직-분해 효소, 예를 들어, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 중성 프로테아제, RNase, 또는 DNase 등을 포함할 수 있다. 이같은 효소에는 콜라게나제 (예를 들어, 콜라게나제 I, II, III 또는 IV, 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터의 콜라게나제 등); 디스파제, 써모리신, 엘라스타제, 트립신, 리베라제(LIBERASE), 히알루로니다제 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

세포 수집 조성물은 살균 유효량 또는 정균 유효량의 항생제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 특정 실시양태에서, 항생제는 마크롤리드 (예를 들어, 토브라마이신), 세팔로스포린 (예를 들어, 세팔렉신, 세프라딘, 세푸록심, 세프프로질, 세파클로르, 세픽심 또는 세파드록실), 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 페니실린 (예를 들어, 페니실린 V) 또는 퀴놀론 (예를 들어, 오플록사신, 시프로플록사신 또는 노르플록사신), 테트라사이클린, 스트렙토마이신 등이다. 특정 실시양태에서, 항생제는 그람(+) 및/또는 그람(-) 박테리아, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등에 대해 활성이다. 한 실시양태에서, 항생제는 젠타마이신 (예를 들어, 배양 배지 내의 약 0.005％ 내지 약 0.01％ (w/v))이다.

세포 수집 조성물은 하기 화합물들 중 하나 이상을 또한 포함할 수 있다: 아데노신 (약 1 mM 내지 약 50 mM); D-글루코스 (약 20 mM 내지 약 100 mM); 마그네슘 이온 (약 1 mM 내지 약 50 mM); 분자량이 20,000 달톤을 초과하는 거대분자 (한 실시양태에서, 내피 온전성 및 세포 생육력을 유지하는데 충분한 양으로 존재) (예를 들어, 합성 또는 천연 발생 콜로이드, 다당류 예컨대 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜 (약 25 g/ℓ 내지 약 100 g/ℓ, 또는 약 40 g/ℓ 내지 약 60 g/ℓ으로 존재)); 항산화제 (예를 들어, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 글루타티온, 비타민 C 또는 비타민 E (약 25 μM 내지 약 100 μM로 존재)); 환원제 (예를 들어, N-아세틸시스테인 (약 0.1 mM 내지 약 5 mM로 존재)); 세포 내로의 칼슘 유입을 방지하는 작용제 (예를 들어, 베라파밀 (약 2 μM 내지 약 25 μM로 존재)); 니트로글리세린 (예를 들어, 약 0.05 g/ℓ 내지 약 0.2 g/ℓ); 항응고제 (한 실시양태에서, 잔류 혈액의 응고를 방지하는데 충분한 양으로 존재) (예를 들어, 헤파린 또는 히루딘 (약 1000 유닛/ℓ 내지 약 100,000 유닛/ℓ의 농도로 존재)); 또는 아밀로리드 함유 화합물 (예를 들어, 아밀로리드, 에틸 이소프로필 아밀로리드, 헥사메틸렌 아밀로리드, 디메틸 아밀로리드 또는 이소부틸 아밀로리드 (약 1.0 μM 내지 약 5 μM로 존재)).

5.5.2 태반의 수집 및 취급

일반적으로, 인간 태반은 출산 후 이의 만출 직후에 회수된다. 바람직한 실시양태에서, 태반은 환자로부터 사전 동의 후에, 그리고 이 환자의 완전한 병력을 취하여 태반과 관련시킨 후에 회수된다. 바람직하게는, 병력이 분만 이후에 계속된다. 이같은 병력은 태반 또는 이로부터 수득된 단리된 태반 세포의 후속 사용을 조정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 인간 태반 세포는, 병력에 비추어서, 태반에 관련된 영아 또는 영아의 부모, 형제자매 또는 기타 친척의 개인화(personalized) 의약에 사용될 수 있다.

단리된 태반 세포의 회수 전에, 제대혈 및 태반혈이 제거된다. 특정 실시양태에서, 분만 후, 태반 내의 제대혈이 제거된다. 통상적인 제대혈 회수 공정이 태반에 적용될 수 있다. 전형적으로, 바늘 또는 캐뉼러(cannula)가, 중력의 보조와 함께, 태반을 방혈시키는데 사용된다 (미국 특허 번호 5,372,581 (Anderson), 미국 특허 번호 5,415,665 (Hessel 등) 참조). 바늘 또는 캐뉼러는 일반적으로 제대 정맥에 놓이고, 태반으로부터 제대혈이 배출되는 것을 돕도록 태반을 부드럽게 마사지할 수 있다. 이같은 제대혈 회수는 상업적으로, 예를 들어 <LifeBank USA> (Cedar Knolls, NJ)에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 제대혈 회수 동안의 조직 파괴를 최소화하도록 태반이 추가적인 조작 없이 중력에 의해 배수된다.

전형적으로, 제대혈의 회수 및 줄기 세포의 수집을 위해 (예를 들어, 관류 또는 조직 해리에 의해), 태반은 분만실 또는 출산실에서 또 다른 장소, 예를 들어 실험실로 수송된다. 바람직하게는 태반은 무균성의 단열 수송 장치 (태반의 온도를 20℃ 내지 28℃ 사이에서 유지시킴)에서 수송되고, 예를 들어, 근위부 제대를 집게로 집은 태반을 무균성 집-락(zip-lock) 플라스틱 백에 놓은 후, 이를 단열 컨테이너에 놓는다. 또 다른 실시양태에서, 실질적으로 계류 중인 미국 특허 번호 7,147,626에 기술된 바와 같이 제대혈 수집 키트 내에서 태반이 수송된다. 바람직하게는, 태반은 분만 후 4시간 내지 24시간 내에 실험실로 수송된다. 특정 실시양태에서, 근위부 제대가, 바람직하게는 태반 원반 내로의 삽입부의 4-5 ㎝ 이내에서, 제대혈 회수 전에 집게로 집어진다. 또 다른 실시양태에서, 근위부 제대는 제대혈 회수 후에, 그러나 태반의 추가적인 프로세싱 전에 집게로 집어진다.

세포 수집 전에, 무균성 조건 하에 실온 또는 5 내지 25℃의 온도에서 태반이 보관될 수 있다. 임의의 잔류 제대혈을 제거하기 위해 태반을 관류하기 전에 4시간 내지 24시간, 48시간 이하, 또는 48시간을 초과하는 시간의 기간 동안 태반이 보관될 수 있다. 한 실시양태에서, 만출 후 약 0시간 내지 약 2시간에 태반이 수확된다. 바람직하게는, 태반은 5 내지 25℃의 온도에서 항응고제 용액 내에서 보관된다. 적절한 항응고제 용액이 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 헤파린 또는 와파린 소듐(warfarin sodium)의 용액이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항응고제 용액은 헤파린 용액 (예를 들어, 1:1000 용액 내의 1％ w/w)을 포함한다. 바람직하게는, 방혈된 태반이 36시간 이하 동안 보관된 후, 태반 세포가 수집된다.

일단 일반적으로 상기와 같이 수집 및 제조되면, 포유동물 태반 또는 이의 일부분을 단리된 태반 세포를 수득하기 위해 임의의 당업계에 공지된 방식으로 처리할 수 있고, 예를 들어, 관류시키거나 또는 파괴할 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 조직 파괴 효소로 소화시킬 수 있다.

5.5.3 태반 조직의 물리적 파괴 및 효소에 의한 소화

한 실시양태에서, 줄기 세포가 포유동물 태반으로부터 이러한 기관의 일부분 또는 전체의 물리적 파괴에 의해 수집된다. 예를 들어, 태반, 또는 이의 일부분을 예를 들어 압착하거나, 베어내거나, 다지거나, 주사위꼴로 자르거나, 잘게 자르거나, 침연시킬 수 있다. 그 후, 조직을 배양하여 단리된 태반 세포들의 집단을 수득한다. 전형적으로, 배양 배지, 염수 용액, 또는 줄기 세포 수집 조성물을 예를 들어 사용하여 태반 조직을 파괴한다 (섹션 5.5.1 및 하기 참조).

물리적 파괴 및/또는 효소에 의한 소화 및 줄기 세포 회수 전에 태반이 구성요소들로 해부될 수 있다. 단리된 태반 세포는 전체 태반으로부터를 포함하여, 양막, 융모막, 제대, 태반엽, 또는 이들의 임의의 조합물의 전체 또는 일부분으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 단리된 태반 세포는 양막 및 융모막을 포함하는 태반 조직으로부터 수득된다. 전형적으로, 단리된 태반 세포는 태반 조직의 소형 덩어리, 예를 들어 부피가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 약 1000 ㎣인 태반 조직의 덩어리의 파괴에 의해 수득될 수 있다. 임의의 물리적 파괴 방법이 사용될 수 있고, 단 파괴 방법은, 예를 들어, 트리판 블루 배제에 의해 결정되는 바와 같이, 상기 기관 내의 세포의 다수, 더욱 바람직하게는 대다수, 더욱 바람직하게는 적어도 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％이 생존성이도록 한다.

일반적으로, 단리된 부착성 태반 세포는 태반 또는 이의 일부분으로부터 만출 후 처음 약 3일 이내의 임의의 시간에 수집될 수 있지만, 바람직하게는 만출 후 약 8시간 내지 약 18시간 사이에 수집된다.

구체적 실시양태에서, 파괴된 조직이 단리된 태반 세포의 증식에 적절한 조직 배양 배지에서 배양된다 (예를 들어, 태반 줄기 세포의 배양이 기술된 하기의 섹션 5.6 참조).

또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 하나 이상의 조직 소화 효소를 사용함으로써 달성될 수 있는 효소에 의한 소화를 포함하는 태반 조직의 물리적 파괴에 의해 수집된다. 또한 태반, 또는 이의 일부분이 물리적으로 파괴되고 하나 이상의 효소로 소화된 후, 생성된 물질이 세포 수집 조성물에 함침되거나, 이러한 조성물 내로 혼합될 수 있다.

바람직한 세포 수집 조성물은 하나 이상의 조직 파괴성 효소(들)를 포함한다. 태반 조직을 파괴하는데 사용될 수 있는 효소에는 파파인, 데옥시리보뉴클레아제, 세린 프로테아제, 예컨대 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 디스파제 또는 엘라스타제가 포함된다. 세린 프로테아제는 혈청 내의 알파 2 마이크로글로불린에 의해 억제될 수 있고, 따라서 소화에 사용된 배지는 일반적으로 혈청이 없다. 세포 회수 효율을 증가시키기 위해 EDTA 및 DNase가 효소 소화 절차에서 통상적으로 사용된다. 점성 소화물 내에 세포가 포획되는 것을 방지하도록 바람직하게는 소화물이 희석된다.

조직 소화 효소의 임의의 조합물이 사용될 수 있다. 트립신을 사용하는 소화에 대한 전형적인 농도에는 0.1％ 내지 약 2％ 트립신, 예를 들어, 약 0.25％ 트립신이 포함된다. 프로테아제는 조합되어, 즉 2가지 이상의 프로테아제가 동일한 소화 반응에서 사용될 수 있거나, 또는 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 및 태반 다능성 세포를 유리시키기 위해 순차적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 태반 또는 이의 일부분이 먼저 약 1 내지 약 2 ㎎/㎖의 적절한 양의 콜라게나제 I로 예를 들어 30분 동안 소화된 후, 약 0.25％ 농도의 트립신으로 예를 들어 10분 동안 37℃에서 소화된다. 바람직하게는 세린 프로테아제는 다른 효소의 사용 후에 이어서 사용된다.

또 다른 실시양태에서, 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포 수집 조성물, 또는 줄기 세포 수집 조성물로 줄기 세포를 단리하기 전의 조직이 파괴 및/또는 소화되어 있는 용액에 킬레이트제, 예를 들어, 에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 첨가함으로써 조직이 추가로 파괴될 수 있다.

소화 후, 소화물을 배양 배지로 예를 들어 3회 세정하고, 세정된 세포를 배양 플라스크 내로 파종한다. 그후, 세포를 차등 부착에 의해 단리하고, 예를 들어, 생육력, 세포 표면 마커, 분화 등에 대해 특성화한다.

전체 태반, 또는 태아 및 모체 세포 모두를 포함하는 태반의 일부분의 경우 (예를 들어, 태반의 일부분이 융모막 또는 태반엽을 함유하는 경우), 단리된 태반 세포는 태아 및 모체 양쪽에서 유래된 태반 세포의 혼합물을 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 모체 세포를 포함하지 않거나 무시할 수 있는 개수의 모체 세포를 포함하는 태반의 일부분 (예를 들어, 양막)의 경우, 이로부터 단리된 태반 세포는 거의 배타적으로 태아 태반 세포 (즉, 태아의 유전자형을 지니는 태반 세포)를 포함할 것이다.

차등 트립신처리 (하기 섹션 섹션 5.5.5 참조)에 이어서, 1개 이상의 새로운 배양 컨테이너에서 신선한 증식 배지에서 배양하는 것 (임의적으로 2차 차등 트립신처리 단계가 이어짐)에 의해 태반 세포, 예를 들어, 상기 5.4.2에 기술된 태반 세포가 파괴된 태반 조직으로부터 단리될 수 있다.

5.5.4 태반 관류

태반 세포, 예를 들어, 상기 5.4.2에 기술된 태반 세포를 포유동물 태반의 관류에 의해 또한 수득할 수 있다. 포유동물 태반을 관류하여 태반 세포를 수득하는 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,045,148 및 7,255,729 (Hariri), 및 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0275362 및 2007/0190042에 개시되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

관류 용액으로 세포 수집 조성물을 예를 들어 사용하여, 예를 들어, 태반 혈관을 통과하는 관류에 의해, 태반 세포를 수집할 수 있다. 한 실시양태에서, 제대 동맥과 제대 정맥 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 관류 용액을 통과시킴으로써 포유동물 태반이 관류된다. 태반을 통과하는 관류 용액의 흐름은 태반 내로의 중력 흐름을 예를 들어 사용하여 달성될 수 있다. 바람직하게는, 관류 용액을 펌프, 예를 들어, 연동(peristaltic) 펌프를 사용하여 태반을 통과하도록 밀어 넣는다. 예를 들어, 무균성 연결 기구, 예컨대 무균성 튜빙(tubing)에 연결된 캐뉼러, 예를 들어, 테플론(TEFLON)® 또는 플라스틱 캐뉼러가 제대 정맥에 삽관될 수 있다. 무균성 연결 기구는 관류 매니폴드(manifold)에 연결된다.

관류에 대비하여, 바람직하게는 태반은 제대 동맥 및 제대 정맥이 태반의 최고점에 위치하는 방식으로 놓인다 (예를 들어, 매달린다). 태반 혈관계 및 주변 조직에 관류 유체를 통과시킴으로써 태반이 관류될 수 있다. 관류 유체를 제대 정맥에 통과시키고 제대 동맥으로부터 수집함으로써, 또는 관류 유체를 제대 동맥에 통과시키고 제대 정맥으로부터 수집함으로써, 태반이 또한 관류될 수 있다.

예를 들어, 한 실시양태에서, 예를 들어, 가요성 연결부를 통해 관류 용액의 저장소에 연결된 피펫에, 제대 동맥 및 제대 정맥이 동시에 연결된다. 관류 용액이 제대 정맥 및 동맥 내로 통과된다. 관류 용액이 태반의 주변 조직 내로 혈관의 벽으로부터 삼출되고/되거나 이러한 벽을 통과하고, 임신 동안 모체의 자궁에 부착된 태반의 표면으로부터 적절한 개방형 용기에 수집된다. 또한 관류 용액이 제대 개구부를 통해 도입되어, 모체의 자궁 벽과 계면한 태반의 벽 내의 개구부에서 흘러 나오거나 스며나오게 될 수 있다. "팬(pan)" 방법으로 칭해질 수 있는 이러한 방법에 의해 수집된 태반 세포는 전형적으로 태아 및 모체 세포의 혼합물이다.

또 다른 실시양태에서, 관류 용액은 제대 정맥을 통과하여 제대 동맥으로부터 수집되거나, 또는 제대 동맥을 통과하여 제대 정맥으로부터 수집된다. "폐쇄 회로(closed circuit)" 방법으로 칭해질 수 있는 이러한 방법에 의해 수집된 태반 세포는 전형적으로 거의 배타적으로 태아 세포이다.

팬 방법을 사용하는 관류, 즉 관류액이 태반의 모체 측면으로부터 삼출된 후 수집되는 관류로 태아 및 모체 세포의 혼합물이 생성된다는 것이 이해될 것이다. 그 결과, 이러한 방법에 의해 수집된 세포는 태아 및 모체 기원 양쪽 모두의 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포의 혼합 집단을 포함할 수 있다. 반면에, 관류 유체가 1개 또는 2개의 태반 혈관을 통과하고 오직 나머지 혈관(들)만을 통하여 수집되는, 태반 혈관계만을 통과한 폐쇄 회로 방법의 관류로는 거의 배타적으로 태아 기원의 태반 세포의 집단이 수집된다.

한 실시양태에서, 폐쇄 회로 관류 방법이 하기와 같이 수행될 수 있다. 분만 후의 태반을 출산 후 약 48시간 이내에 수득한다. 제대를 집게로 집고, 집게 위로 절단한다. 제대는 폐기할 수 있거나, 또는 제대 줄기 세포를 예를 들어 회수하기 위해 및/또는 생체재료의 생산을 위해 제대막을 프로세싱하기 위해 프로세싱할 수 있다. 양막은 관류 동안 유지될 수 있거나, 또는, 예를 들어, 손가락으로의 비절개 박리를 사용하여, 융모막으로부터 분리될 수 있다. 양막이 관류 전에 융모막으로부터 분리되는 경우, 이는 예를 들어 폐기될 수 있거나 또는 프로세싱될 수 있고, 예를 들어, 효소에 의한 소화에 의해 줄기 세포를 수득하기 위해, 또는 양막 생체재료, 예를 들어, 미국 출원 공개 번호 2004/0048796 (이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 기술된 생체재료를 예를 들어 생산하기 위해, 프로세싱될 수 있다. 모든 눈에 보이는 혈병 및 잔류 혈액을, 예를 들어, 무균성 거즈를 사용하여, 태반에서 청소한 후, 예를 들어, 제대막을 부분적으로 절단하여 제대의 단면을 노출시킴으로써, 제대 혈관을 노출시킨다. 혈관을 확인하고, 예를 들어, 닫힌 악어입 집게를 각각의 혈관의 절단 끝부분을 통해 전진시킴으로써, 개방시킨다. 이어서, 관류 기구 또는 연동 펌프에 연결된 플라스틱 튜빙과 같은 장치를 각각의 태반 동맥 내로 삽입한다. 펌프는 목적에 적절한 임의의 펌프, 예를 들어, 연동 펌프일 수 있다. 그 후, 무균성 수집 저장소, 예를 들어, 250 ㎖ 수집 백과 같은 혈액 백에 연결된 플라스틱 튜빙을 태반 정맥 내로 삽입한다. 별법적으로, 펌프에 연결된 튜빙을 태반 정맥 내로 삽입하고, 수집 저장소(들)에 대한 튜브를 태반 동맥 중 하나 또는 양쪽 모두에 삽입한다. 그 후, 태반에 다량의 관류 용액, 예를 들어, 약 750 ㎖의 관류 용액을 관류한다. 그 후 관류액 내의 세포를, 예를 들어, 원심분리에 의해, 수집한다. 특정 실시양태에서, 관류 용액, 예를 들어, 100-300 ㎖ 관류 용액을 태반에 관류하여, 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 및/또는 태반 다능성 세포를 수집하기 위한 관류 전에 잔류 혈액을 제거한다. 또 다른 실시양태에서, 태반 세포를 수집하기 위한 관류 전에 잔류 혈액을 제거하기 위해 관류 용액이 태반에 관류되지 않는다.

한 실시양태에서, 근위부 제대를 관류 동안 집게로 집고, 더욱 바람직하게는 태반 원반 내로의 제대의 삽입부의 4-5 ㎝ 이내에서 집게로 집는다.

방혈 과정 동안 포유동물 태반으로부터의 관류 유체의 1차 수집물은 일반적으로 제대혈 및/또는 태반혈의 잔류 적혈구의 색을 띤다. 관류가 진행되고 잔류 제대혈 세포가 태반으로부터 세정됨에 따라 관류 유체는 더욱 무색이게 된다. 일반적으로, 30 내지 100 ㎖의 관류 유체가 처음에 태반을 방혈시키는데 적절하지만, 관찰된 결과에 따라 더 많거나 더 적은 관류 유체가 사용될 수 있다.

태반 세포를 단리하는데 사용된 관류 액체의 부피는 수집되는 세포의 수, 태반의 크기, 단일 태반에서 이루어질 수집 횟수 등에 따라 변할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 관류 액체의 양은 50 ㎖ 내지 5000 ㎖, 50 ㎖ 내지 4000 ㎖, 50 ㎖ 내지 3000 ㎖, 100 ㎖ 내지 2000 ㎖, 250 ㎖ 내지 2000 ㎖, 500 ㎖ 내지 2000 ㎖, 또는 750 ㎖ 내지 2000 ㎖일 수 있다. 전형적으로, 태반이 방혈 후 700-800 ㎖의 관류 액체로 관류된다.

태반을 수 시간 또는 수 일에 걸쳐 복수 회 관류할 수 있다. 태반이 복수 회 관류되는 경우, 태반이 컨테이너 또는 기타 적절한 용기에서 무균 조건 하에 유지 또는 배양될 수 있고, 항응고제 (예를 들어, 헤파린, 와파린 소듐, 쿠마린, 비스히드록시쿠마린)이 있거나 없고, 또한 항균제 (예를 들어, β-메르캅토에탄올 (0.1 mM); 항생제 예컨대 스트렙토마이신 (예를 들어, 40-100 ㎍/㎖), 페니실린 (예를 들어, 40 U/㎖), 암포테리신 B (예를 들어, 0.5 ㎍/㎖)이 있거나 없는 표준 관류 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수 ("PBS")와 같은 생리식염수) 또는 세포 수집 조성물로 관류될 수 있다. 한 실시양태에서, 관류 및 관류액의 수집 전에 태반이 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간, 또는 2일 또는 3일 또는 그 이상 동안 유지 또는 배양되도록, 단리된 태반을 관류액을 수집하지 않으면서 일정 기간 동안 유지 또는 배양한다. 관류된 태반은 1회 이상의 추가적인 시간(들) 동안, 예를 들어 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간, 또는 그 이상 동안 유지된 후, 예를 들어 700-800 ㎖의 관류 유체로 2번째로 관류될 수 있다. 태반은 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상으로 관류될 수 있고, 예를 들어, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 또는 6시간마다 관류될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 태반의 관류 및 관류 용액, 예를 들어, 세포 수집 조성물의 수집은 회수된 유핵 세포의 개수가 100개의 세포/㎖ 미만으로 떨어질 때까지 반복된다. 상이한 시점의 관류액들을 개별적으로 추가로 프로세싱하여, 시간-의존적인 세포, 예를 들어, 줄기 세포의 집단을 회수할 수 있다. 상이한 시점으로부터의 관류액들을 또한 풀링(pooling)할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 만출 후 약 8시간 내지 약 18시간 사이에 태반 세포가 한번에 또는 여러 번 수집된다.

바람직하게는, 상기 용액으로 관류되지 않았고, 태반 세포를 수득하도록 다른 방식 (예를 들어, 조직 파괴, 예를 들어 효소에 의한 소화)으로 처리되지도 않은 포유동물 태반으로부터 수득가능한 개수보다 유의하게 더 많은 태반 세포가 관류로 수집된다. 이러한 상황에서, "유의하게 더 많은"은 10％ 이상 더 많은 것을 의미한다. 예를 들어, 태반 또는 이의 일부분이 배양된 배양 배지로부터 수득가능한 태반 세포의 개수보다 유의하게 더 많은 태반 세포가 관류로 산출된다.

하나 이상의 프로테아제 또는 기타 조직 파괴성 효소를 포함하는 용액으로의 관류에 의해 태반으로부터 태반 세포가 단리될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 태반 또는 이의 일부분 (예를 들어 양막, 양막 및 융모막, 태반 소엽 또는 태반엽, 제대, 또는 임의의 상기의 것들의 조합)을 25-37℃로 만들고, 하나 이상의 조직 파괴성 효소와 함께 200 ㎖의 배양 배지에서 30 분 동안 인큐베이션한다. 관류액으로부터의 세포를 수집하고, 4℃로 만들고, 5 mM EDTA, 2 mM 디티오트레이톨 및 2 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 저온 억제제 혼합물로 세정한다. 수 분 후 태반 세포를 저온 (예를 들어 4℃)의 줄기 세포 수집 조성물로 세정한다.

5.5.5 태반 세포의 단리, 분류, 및 특성화

관류에 의해 또는 물리적 파괴, 예를 들어 효소에 의한 소화에 의해 수득되었는지 여부와 관계 없이, 단리된 태반 세포, 예를 들어, 상기 섹션 5.4.2에 기술된 세포를 먼저 피콜(Ficoll) 농도구배 원심분리에 의해 다른 세포로부터 정제 (즉, 단리)할 수 있다. 이같은 원심분리는 원심분리 속도 등에 대해 임의의 표준 프로토콜을 따를 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 태반으로부터 수집된 세포가 실온에서 15분 동안의 5000×g의 원심분리에 의해 관류액으로부터 회수되고, 이는 세포를 예를 들어 오염성 잔해물 및 혈소판으로부터 분리한다. 또 다른 실시양태에서, 태반 관류액을 약 200 ㎖로 농축하고, 부드럽게 피콜 상에 층상화하고, 22℃에서 20분 동안 약 1100×g로 원심분리하여, 세포의 저밀도 계면층을 추가적인 프로세싱을 위해 수집한다.

세포 펠릿이 신선한 줄기 세포 수집 조성물, 또는 세포 유지, 예를 들어, 줄기 세포 유지에 적절한 배지, 예를 들어, 2 U/㎖ 헤파린 및 2 mM EDTA (기브코BRL, NY)를 함유하는 IMDM 무혈청 배지에 재현탁될 수 있다. 예를 들어, 제조업자의 권장 절차에 따라 림포프렙(Lymphoprep) (Nycomed Pharma (Oslo, Norway))를 사용하여, 전체 단핵 세포 분획을 단리할 수 있다.

관류 또는 소화에 의해 수득된 태반 세포를, 예를 들어, 추가로 또는 처음에, 0.2％ EDTA가 있는 0.05％ 트립신 용액 (시그마 (St. Louis MO)을 예를 들어 사용하는 차등 트립신처리에 의해 단리할 수 있다. 조직 배양 플라스틱-부착성인 단리된 태반 세포는 플라스틱 표면으로부터 약 5분 이내에 전형적으로 탈착되는 반면, 기타 부착성 집단은 20-30분을 초과하는 인큐베이션을 전형적으로 필요로 하기 때문에 차등 트립신처리가 가능하다. 트립신처리 및 트립신 중화 (예를 들어, 트립신 중화 용액 (TNS, Cambrex) 등을 이용) 후에, 탈착된 태반 세포를 수확할 수 있다. 부착성 세포를 단리하는 한 실시양태에서, 예를 들어 약 5-10×10⁶ 개의 세포의 분취량을 여러 T-75 플라스크, 바람직하게는 피브로넥틴이 코팅된 T-75 플라스크 각각에 담는다. 이같은 실시양태에서, 세포를 시판되는 중간엽 줄기 세포 성장 배지 (MSCGM) (Cambrex)와 함께 배양하고, 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 5％ CO₂) 내에 놓을 수 있다. 10-15일 후, PBS로 세정함으로써 비-부착성 세포가 플라스크로부터 제거된다. 그 후, PBS를 MSCGM으로 교체한다. 바람직하게는 플라스크를 각종 부착성 세포 유형의 존재에 대해, 특히 섬유모세포 모양 세포의 클러스터의 확인 및 확장에 대해 매일 검사한다.

예를 들어, 광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하는 세포 형태학의 검사에 의해, 유세포 분석법, 세포 분류, 면역세포화학 (예를 들어, 조직 특이적 또는 세포 마커 특이적 항체로의 염색), 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 자기 활성화 세포 분류 (MACS)와 같은 표준 세포 검출 기술을 사용하여 형태학 및 세포 표면 마커에서의 변화를 측정함으로써, 및/또는 당업계에 주지된 기술, 예컨대 PCR 및 유전자 발현 프로파일링을 사용하여 유전자 발현에서의 변화를 측정함으로써, 포유동물 태반에서 수집된 세포의 개수 및 유형을 모니터링할 수 있다. 이러한 기술들은 하나 이상의 특정 마커에 대해 양성인 세포들을 확인하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, CD34에 대한 항체를 사용하여, 세포가 검출가능한 양의 CD34를 포함하는지 여부를 상기의 기술을 사용하여 결정할 수 있다; 세포가 검출가능한 양의 CD34를 포함하는 경우, 세포는 CD34⁺이다. 마찬가지로, RT-PCR에 의해 검출될 수 있기에 충분한 OCT-4 RNA 또는 성체 세포보다 유의하게 더 많은 OCT-4 RNA를 세포가 생산하는 경우, 세포는 OCT-4⁺이다. 세포 표면 마커 (예를 들어, CD34와 같은 CD 마커)에 대한 항체, 및 OCT-4와 같은 줄기 세포-특이적 유전자의 서열이 당업계에 주지되어 있다.

태반 세포, 특히 피콜 분리, 차등 부착 또는 이들의 조합에 의해 단리된 세포를 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 분류할 수 있다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 입자의 형광 성질을 기초로 하는, 세포가 포함되는 입자를 분리하기 위한 주지된 방법이다 ([Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165]). 개별적인 입자들 내의 형광 모이어티(moiety)의 레이저 여기로 작은 전하가 발생하여, 혼합물로부터 양성 입자와 음성 입자가 전자기적으로 분리되도록 한다. 한 실시양태에서, 세포 표면 마커-특이적 항체 또는 리간드가 상이한 형광 표지로 표지된다. 세포가 세포 분류기를 통해 프로세싱되어, 사용된 항체에 결합하는 능력을 기초로 세포가 분리된다. FACS로 분류된 입자들이 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별적인 웰 내로 직접 침착되어, 분리 및 클로닝을 용이하게 할 수 있다.

한 세포 분류 계획에서, 태반으로부터의 세포가, 예를 들어, 마커 CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 및/또는 HLA-G 중 하나 이상의 발현을 기초로 분류된다. 이는 배양 시의 세포의 부착 성질을 기초로 이같은 세포를 선별하는 절차와 함께 이루어질 수 있다. 예를 들어, 조직 배양 플라스틱 부착 선별이 마커 발현을 기초로 하는 분류 전 또는 후에 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 먼저 세포가 CD34의 발현을 기초로 분류된다; CD34^- 세포가 유지되고, 추가적으로 CD200⁺HLA-G⁺인 CD34^-세포가 모든 다른 CD34^- 세포로부터 분리된다. 또 다른 실시양태에서, 태반으로부터의 세포가 마커 CD200 및/또는 HLA-G의 발현을 기초로 분류된다; 예를 들어, 이러한 마커들 중 하나를 디스플레이하는 세포가 추가적인 사용을 위해 단리된다. 구체적 실시양태에서, CD200 및/또는 HLA-G를 예를 들어 발현하는 세포가 CD73 및/또는 CD105, 또는 항체 SH2, SH3 또는 SH4가 인식하는 에피토프의 발현, 또는 CD34, CD38 또는 CD45의 발현 결여를 기초로 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서, 태반 세포가 CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 및 CD45의 발현 또는 발현 결여에 의해 분류되고, CD200⁺, HLA-G⁺, CD73⁺, CD105⁺, CD34^-, CD38^- 및 CD45^-인 태반 세포가 추가적인 사용을 위해 다른 태반 세포들로부터 단리된다.

분류된 태반 세포들의 상기 실시양태들 중 임의의 것의 구체적 실시양태에서, 분류 후 남아 있는 세포 집단 내의 세포의 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상이 상기 단리된 태반 세포이다. 상기 섹션 5.4.2에 기술된 임의의 마커들 중 하나 이상에 의해 태반 세포가 분류될 수 있다.

구체적 실시양태에서, (1) 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, (2) CD10⁺, CD34^- 및 CD105⁺인 태반 세포가 다른 태반 세포로부터 분류된다 (즉, 단리된다). 또 다른 구체적 실시양태에서, (1) 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, (2) CD10⁺, CD34^-, CD105⁺ 및 CD200⁺인 태반 세포가 다른 태반 세포로부터 분류된다 (즉, 단리된다). 또 다른 구체적 실시양태에서, (1) 조직 배양 플라스틱에 부착성이고, (2) CD10⁺, CD34^-, CD45^-, CD90⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺인 태반 세포가 다른 태반 세포로부터 분류된다 (즉, 단리된다).

태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포의 항체-매개 검출 및 분류와 관련하여, 특정 마커에 대해 특이적인 임의의 항체를 세포의 검출 및 분류 (예를 들어, 형광-활성화 세포 분류)에 적절한 임의의 형광단 또는 기타 표지와 조합하여 사용할 수 있다. 특정 마커에 대한 항체/형광단 조합물에는 HLA-G (세로텍 (Raleigh, North Carolina)으로부터 입수가능), CD10 (BD 이뮤노사이토메트리 시스템스 (San Jose, California)로부터 입수가능), CD44 (BD 바이오사이언스 파밍겐 (San Jose, California)으로부터 입수가능), 및 CD105 (R&D 시스템스 ㅇ인크. (Minneapolis, Minnesota)로부터 입수가능)에 대한 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 접합 모노클로날 항체; CD44, CD200, CD117, 및 CD13에 대한 피코에리트린 (PE) 접합 모노클로날 항체 (BD 바이오사이언스 파밍겐); CD33 및 CD10에 대한 피코에리트린-Cy7 (PE Cy7) 접합 모노클로날 항체 (BD 바이오사이언스 파밍겐); 알로피코시아닌 (APC) 접합 스트렙타비딘 및 CD38에 대한 모노클로날 항체 (BD 바이오사이언스 파밍겐); 및 비오틴화 CD90 (BD 바이오사이언스 파밍겐)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 기타 항체에는 CD133-APC (Miltenyi), KDR-비오틴 (CD309, 아브캄), 사이토케라틴K-Fitc (시그마 또는 Dako), HLA ABC-Fitc (BD), HLA DR,DQ,DP-PE (BD), β-2-마이크로글로불린-PE (BD), CD80-PE (BD) 및 CD86-APC (BD)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

사용될 수 있는 기타 항체/표지 조합물에는 CD45-PerCP (페리딘 클로로필 단백질); CD44-PE; CD19-PE; CD10-F (플루오레세인); HLA-G-F 및 7-아미노-악티노마이신-D (7-AAD); HLA-ABC-F 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 제공된 단리된 태반 세포를 피코에리트린-Cy5 (PE Cy5) 접합 스트렙타비딘 및 CD117 또는 CD133에 대한 비오틴 접합 모노클로날 항체를 예를 들어 사용하여 CD117 또는 CD133에 대해 평가할 수 있다; 그러나, 이러한 시스템을 사용하면, 세포는 비교적 높은 배경값으로 인해 각각 CD117 또는 CD133에 대하여 양성으로 나타날 수 있다.

단리된 태반 세포가 단일 마커에 대한 항체로 표지되어, 검출 및 분류될 수 있다. 또한 태반 세포가 상이한 마커들에 대한 여러 항체로 동시에 표지될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 자기 비드를 사용하여 세포를 분리할 수 있다. 자기 비드 (직경 0.5-100 ㎛)에 결합하는 능력을 기초로 입자를 분류하는 방법인 자기 활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 세포들을 분류할 수 있다. 특정 세포 표면 분자 또는 합텐(hapten)을 특이적으로 인식하는 항체를 공유 결합으로 부가하는 것을 포함하여, 다양한 유용한 변형을 자기 미세구에 수행할 수 있다. 그후, 비드가 세포와 혼합되어 결합이 허용된다. 그후, 세포를 자기장에 통과시켜, 특정 세포 표면 마커가 있는 세포를 분리해 낸다. 한 실시양태에서, 이어서 이러한 세포들을 단리하고, 추가적인 세포 표면 마커에 대한 항체에 커플링된 자기 비드와 다시 혼합한다. 세포를 자기장에 다시 통과시켜, 양쪽 항체에 결합한 세포를 단리한다. 그후, 이같은 세포를 별도의 접시, 예컨대 클론성 단리를 위한 미량역가 접시 내로 희석할 수 있다.

단리된 태반 세포를 세포 형태학 및 성장 특성을 기초로 또한 특성화 및/또는 분류할 수 있다. 예를 들면, 단리된 태반 세포가, 예를 들어, 배양 시 섬유모세포 모양의 외관을 갖는 것으로 특성화되고/되거나 이러한 외관을 기초로 선별될 수 있다. 또한 단리된 태반 세포는 배아-유사체를 형성하는 능력이 있는 것으로 특성화되고/되거나 이러한 능력을 기초로 선별될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 섬유모세포 모양의 형상이고, CD73 및 CD105를 발현하며, 배양시 하나 이상의 배아-유사체를 형성하는 태반 세포가 다른 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 실시양태에서, 배양시 하나 이상의 배아-유사체를 생산하는 OCT-4⁺ 태반 세포가 다른 태반 세포로부터 단리된다.

또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포가 콜로니 형성 단위 분석법에 의해 확인 및 특성화될 수 있다. 콜로니 형성 단위 분석법은 MESEN CULT™ 배지 (스템 셀 테크놀로지스, 인크. (Vancouver British Columbia))와 같이 당업계에 통상적으로 공지되어 있다.

단리된 태반 세포를 생육력, 증식 잠재력 및 수명에 대해 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대 트리판 블루 배제 분석법, 플루오레세인 디아세테이트 흡수 분석법, 요오드화프로피듐 흡수 분석법 (생육력 평가용); 및 티미딘 흡수 분석법, MTT 세포 증식 분석법 (증식 평가용)을 사용하여 평가할 수 있다. 당업계에 주지된 방법에 의해, 예컨대 확장 배양 시 개체수 배가의 최대값을 결정함으로써, 수명을 결정할 수 있다.

단리된 태반 세포, 예를 들어, 상기 섹션 5.4.2에 기술된 단리된 태반 세포가 당업계에 공지된 기타 기술, 예를 들어, 원하는 세포의 선택적 성장 (양성 선별), 원치 않는 세포의 선택적 파괴 (음성 선별); 예를 들어 대두 응집소와의 혼합 집단 내에서의 차별적인 세포 응집성을 기초로 하는 분리; 냉동-해동 절차; 여과; 통상적 및 구역 원심분리; 원심분리성 정화 (카운터-스트리밍(counter-streaming) 원심분리); 단위 중량 분리; 역류(countercurrent) 분배; 전기 영동 등을 사용하여 다른 태반 세포로부터 또한 단리될 수 있다.

5.6 단리된 태반 세포의 배양

5.6.1 배양 배지

단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포들의 집단, 또는 태반 줄기 세포가 성장해 나오는 세포 또는 태반 조직을 사용하여 세포 배양을 시작하거나 파종할 수 있다. 일반적으로 세포는 세포외 매트릭스 또는 리간드 예컨대 라미닌, 콜라겐 (예를 들어, 천연 또는 변성), 젤라틴, 피브로넥틴, 오르니틴, 비트로넥틴, 및 세포외 막 단백질 (예를 들어, 마트리겔(MATRIGEL)® (BD Discovery Labware (Bedford, Mass.)))으로 코팅되거나 코팅되지 않은 무균성 조직 배양 용기로 옮겨진다.

단리된 태반 세포는 당업계에서 세포, 예를 들어, 줄기 세포의 배양에 허용가능한 것으로 인식되는 임의의 배지 및 임의의 조건에서 배양될 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지는 혈청을 포함한다. 단리된 태반 세포는, 예를 들어, ITS (인슐린-트랜스페린-셀레늄), LA+BSA (리놀레산-소 혈청 알부민), 덱사메타손 L-아스코르브산, PDGF, EGF, IGF-1, 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM-LG (둘베코(Dulbecco) 변형 필수 배지, 저(低)-글루코스)/MCDB 201 (병아리 섬유모세포 기초 배지); 10％ 소 태아 혈청 (FBS)을 포함하는 DMEM-HG (고(高)-글루코스); 15％ FBS를 포함하는 DMEM-HG; 10％ FBS, 10％ 말 혈청, 및 히드로코르티손을 포함하는 IMDM (이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지); 1％ 내지 20％ FBS, EGF, 및 헤파린을 포함하는 M199; 10％ FBS, 글루타맥스(GLUTAMAX)™ 및 젠타마이신을 포함하는 α-MEM (최소 필수 배지); 10％ FBS, 글루타맥스™ 및 젠타마이신을 포함하는 DMEM 등에서 배양될 수 있다.

태반 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 기타 배지에는 DMEM (고 또는 저 글루코스), 이글(Eagle) 기초 배지, 햄(Ham) F10 배지 (F10), 햄 F-12 배지 (F12), 이스코브 변형 둘베코 배지, 중간엽 줄기 세포 성장 배지 (MSCGM), 라이보비츠(Liebovitz) L-15 배지, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, 개량 DMEM (기브코), DMEM/MCDB201 (시그마), 및 CELL-GRO FREE가 포함된다.

배양 배지에 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청 (FBS), 바람직하게는 약 2-15％ (v/v); 말 혈청 (ES); 인간 혈청 (HS)); 베타-메르캅토에탄올 (BME), 바람직하게는 약 0.001％ (v/v); 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), 백혈병 억제 인자 (LIF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 에리트로포이에틴 (EPO); L-발린이 포함되는 아미노산; 및 미생물 오염을 제어하기 위한 하나 이상의 항생제 및/또는 항진균제, 예를 들어, 페니실린 G, 스트렙토마이신 술페이트, 암포테리신 B, 젠타마이신, 및 니스타틴이 예를 들어 포함되는 하나 이상의 성분이 단독으로 또는 조합되어 보충될 수 있다.

단리된 태반 세포는 표준 조직 배양 조건에서, 예를 들어, 조직 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트에서 배양될 수 있다. 현적(hanging drop) 방법을 사용하여 단리된 태반 세포가 또한 배양될 수 있다. 이러한 방법에서, 단리된 태반 세포가 약 5 ㎖의 배지 내에 약 1×10⁴ 개의 세포/㎖로 현탁되고, 1개 이상의 배지 액적이 조직 배양 컨테이너, 예를 들어, 100 ㎖ 페트리(Petri) 접시의 뚜껑의 내부에 놓인다. 액적은, 예를 들어, 단일 액적이거나, 또는 다수의 액적일 수 있다 (예를 들어, 멀티채널 피펫터 (multichannel pipetter)로부터). 뚜껑을 조심스럽게 뒤집고, 다량의 액체, 예를 들어, 접시 대기 내의 수분 함량을 유지하는데 충분한 무균성 PBS를 함유하는 접시 바닥 위에 놓고, 줄기 세포를 배양한다.

한 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 단리된 태반 세포에서 미분화 표현형을 유지하는 작용을 하는 화합물의 존재 하에 배양된다. 구체적 실시양태에서, 이러한 화합물은 치환된 3,4-디히드로피리디몰[4,5-d]피리미딘이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 화합물은 하기 화학 구조의 화합물이다:

이러한 화합물은 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포들의 집단과, 예를 들어 약 1 μM 내지 약 10 μM 사이의 농도로 접촉될 수 있다.

5.6.2 태반 세포의 확장 및 증식

일단 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포들의 집단 (예를 들어, 생체 내에서 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단과 정상적으로 회합되는 태반 세포의 50％ 이상으로부터 분리된 태반 세포 또는 태반 세포 집단)이 수득되면, 이러한 세포 또는 세포들의 집단이 시험관 내에서 증식 및 확장될 수 있다. 예를 들어, 단리된 태반 세포들의 집단이 조직 배양 컨테이너, 예를 들어, 접시, 플라스크, 멀티웰 플레이트 등에서, 세포가 70-90％ 전면성장으로 증식하는데 충분한 시간 동안, 즉 세포 및 이의 자손이 조직 배양 컨테이너의 배양 표면적의 70-90％를 차지할 때까지 배양될 수 있다.

단리된 태반 세포가 세포 성장을 허용하는 밀도로 배양 용기에 파종될 수 있다. 예를 들어, 세포는 저밀도 (예를 들어, 약 1,000개 내지 약 5,000개의 세포/㎠) 내지 고밀도 (예를 들어, 약 50,000개 이상의 세포/㎠)로 파종될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 공기 중 약 0 내지 약 5 부피％의 CO₂ 존재 하에 배양된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 세포는 공기 중 약 2 내지 약 25 ％의 O₂, 바람직하게는 공기 중 약 5 내지 약 20 ％의 O₂에서 배양된다. 바람직하게는 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 37℃에서 배양된다. 바람직하게는 세포는 인큐베이터에서 배양된다. 배양 배지는 정적일 수 있거나, 또는 생물반응기를 예를 들어 사용하여 진탕될 수 있다. 바람직하게는, 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포는 낮은 산화성 스트레스 하에 성장된다 (예를 들어, 글루타티온, 아스코르브산, 카탈라제, 토코페롤, N-아세틸시스테인 등이 첨가됨).

일단 100％ 미만, 예를 들어, 70％-90％ 전면성장이 수득되면, 세포가 계대될 수 있다. 예를 들어, 세포를 당업계에 주지된 기술을 사용하여 효소로 처리하여, 예를 들어 트립신처리하여, 조직 배양 표면으로부터 세포를 분리할 수 있다. 세포를 피펫팅에 의해 제거하고 세포를 계수한 후, 약 10,000-100,000개의 세포/㎠가 신선한 배양 배지를 함유하는 새로운 배양 컨테이너로 계대된다. 전형적으로, 새로운 배지는 단리된 태반 세포가 제거된 배지와 동일한 유형이다. 단리된 태반 세포는 대략, 최소, 또는 최대 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 12회, 14회, 16회, 18회 또는 20회, 또는 그 이상 계대될 수 있다.

5.6.3 단리된 태반 세포들의 집단

뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에 유용한, 단리된 태반 세포들, 예를 들어, 상기 섹션 5.4.2에 기술된 단리된 태반 세포들의 집단이 본원에서 또한 제공된다. 단리된 태반 세포들의 집단은 하나 이상의 태반으로부터 직접적으로 단리될 수 있다; 즉, 세포 집단은 관류액으로부터 수득되거나 관류액 내에 함유된, 또는 파괴된 태반 조직, 예를 들어, 태반 조직 소화물 (즉, 태반 또는 이의 일부분의 효소에 의한 소화에 의해 수득된 세포들의 수집물)로부터 수득되거나 이러한 소화물 내에 함유된 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단일 수 있다. 본원에 기술된 단리된 태반 세포가 또한 배양 및 확장되어 단리된 태반 세포들의 집단이 생산될 수 있다. 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 또한 배양 및 확장되어 태반 세포 집단이 생산될 수 있다.

본원에서 제공되는 치료 방법에 유용한 태반 세포 집단은 단리된 태반 세포, 예를 들어, 본원의 섹션 5.4.2에 기술된 단리된 태반 세포를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 태반 세포 집단 내의 세포의 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상이 단리된 태반 세포이다. 즉, 단리된 태반 세포들의 집단은, 예를 들어, 많게는 1％, 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％의 단리된 태반 세포가 아닌 세포를 포함할 수 있다.

예를 들어, 특정 마커 및/또는 특정 배양 또는 형태학적 특성을 나타내는 단리된 태반 세포 (효소에 의한 소화로부터 또는 관류로부터 유래되는지 여부와 관계 없음)를 선별함으로써, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에 유용한 단리된 태반 세포 집단이 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어, (a) 기판에 부착하고, (b) CD200 및 HLA-G를 발현하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, CD200 및 HLA-G를 발현하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, (a) 기판에 부착하고, (b) CD73, CD105, 및 CD200을 발현하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, CD73, CD105 및 CD200을 발현하는 태반 세포를 확인하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단의 생산 방법은 (a) 기판에 부착하고, (b) CD200 및 OCT-4를 발현하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, CD200 및 OCT-4를 발현하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, (a) 기판에 부착하고, (b) CD73 및 CD105를 발현하며, (c) 줄기 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, CD73 및 CD105를 발현하고, 줄기 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, (a) 기판에 부착하고, (b) CD73, CD105 및 HLA-G를 발현하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, CD73, CD105 및 HLA-G를 발현하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단의 생산 방법은 (a) 기판에 부착하고, (b) OCT-4를 발현하며, (c) 줄기 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하는 태반 세포를 선별하는 단계; 및 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, OCT-4를 발현하며, 줄기 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다.

또 다른 실시양태에서, (a) 기판에 부착하고, (b) CD10 및 CD105을 발현하고 CD34를 발현하지 않는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, CD10 및 CD105을 발현하고 CD34를 발현하지 않는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, (a) 기판에 부착하고, (b) CD10, CD105 및 CD200을 발현하고 CD34를 발현하지 않는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 실시양태에서, CD10, CD105 및 CD200을 발현하고 CD34를 발현하지 않는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, (a) 기판에 부착하고, (b) CD10, CD90, CD105 및 CD200을 발현하고 CD34 및 CD45를 발현하지 않는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, CD10, CD90, CD105 및 CD200을 발현하고 CD34 및 CD45를 발현하지 않는 태반 세포를 선별하고, 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성시킴으로써 세포 집단이 생산된다.

이같은 세포 집단, 또는 이들의 조합물은 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴, 예를 들어, 파괴의 증상 또는 이같은 파괴에 기인하는 신경학적 결손을 치료하는데 사용될 수 있다.

임의의 상기 실시양태에서, 단리된 세포 집단의 선별은 ABC-p (태반-특이적 ABC 전달체 단백질; 예를 들어, [Allikmets et al., Cancer Res. 58(23):5337-9 (1998)] 참조)를 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 중간엽 줄기 세포에 대해 특이적인 하나 이상의 특성, 예를 들어, CD44의 발현, CD90의 발현, 또는 상기의 것들의 조합 발현을 나타내는 세포를 선별하는 단계를 또한 포함할 수 있다.

상기 실시양태들에서, 기판은 세포, 예를 들어, 단리된 태반 세포의 배양 및/또는 선별이 달성될 수 있는 임의의 표면일 수 있다. 전형적으로, 기판은 플라스틱, 예를 들어, 조직 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트 플라스틱이다. 조직 배양 플라스틱은 생체분자, 예를 들어, 라미닌 또는 피브로넥틴으로 코팅될 수 있다.

세포, 예를 들어, 단리된 태반 세포는 세포 선별 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 태반 세포 집단에 대해 선별될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 세포 표면 마커에 대한 항체 또는 항체들을 사용하여, 예를 들어, 유세포 분석법 또는 FACS에서, 세포를 선별할 수 있다. 자기 비드와 조합하여 항체를 사용하여 선별이 달성될 수 있다. 특정 줄기 세포-관련 마커에 특이적인 항체가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, OCT-4 (아브캄 (Cambridge, MA)), CD200 (아브캄), HLA-G (아브캄), CD73 (BD 바이오사이언스 파밍겐 (San Diego, CA)), CD105 (아브캄; 바이오사이언스 인터내셔널 (Saco, ME)) 등에 대한 항체. 기타 마커에 대한 항체가 또한 시판되고, 예를 들어, CD34, CD38 및 CD45에 대한 항체가, 예를 들어, <스템셀 테크놀로지스> 또는 <바이오디자인 인터내셔널>로부터 입수가능하다.

단리된 태반 세포 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포, 또는 태반 세포가 아닌 세포를 포함할 수 있다.

본원에서 제공된 단리된 태반 세포 집단이 하나 이상의 비-줄기 세포 또는 비-태반 세포 집단과 조합될 수 있다. 예를 들어, 단리된 태반 세포들의 집단이 혈액 (예를 들어, 태반혈 또는 제대혈), 혈액-유래 줄기 세포 (예를 들어, 태반혈 또는 제대혈로부터 유래된 줄기 세포), 제대 줄기 세포, 혈액-유래 유핵 세포의 집단, 골수-유래 중간엽 세포, 골-유래 줄기 세포 집단, 미정제(crude) 골수, 성체 (체세포) 줄기 세포, 조직 내에 함유된 줄기 세포들의 집단, 배양된 줄기 세포, 완전히 분화된 세포들의 집단 (예를 들어, 연골세포, 섬유모세포, 양막 세포, 골모세포, 근육 세포, 심근 세포 등) 등과 조합될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에 유용한 세포들의 집단은 단리된 태반 세포 및 단리된 제대 세포를 포함한다. 단리된 태반 세포 집단 내의 세포는 각각의 집단 내의 전체 유핵 세포를 비교하여 약 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 ; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000; 또는 약 1:100,000,000의 비율로 또 다른 유형의 다수의 세포와 조합될 수 있다. 단리된 태반 세포 집단 내의 세포는 다수의 세포 유형의 다수의 세포와 또한 조합될 수 있다.

한 실시양태에서, 태반 세포들의 단리된 집단은 다수의 조혈 줄기 세포와 조합된다. 이같은 조혈 줄기 세포는, 예를 들어, 미처리 태반혈, 제대혈 또는 말초혈; 태반혈, 제대혈 또는 말초혈로부터의 전체 유핵 세포; 태반혈, 제대혈 또는 말초혈로부터의 CD34⁺ 세포들의 단리된 집단; 미처리 골수; 골수로부터의 전체 유핵 세포; 골수로부터의 CD34⁺ 세포들의 단리된 집단 등 내에 함유될 수 있다.

5.7 태반 세포 은행의 생산

산후 태반으로부터의 단리된 세포, 예를 들어, 상기 섹션 5.4.2에 기술된 단리된 태반 세포를 다수의 상이한 방식으로 배양하여, 단리된 태반 세포들의 로트(lot) 세트를 생산할 수 있고, 예를 들어, 이때 로트는 개별적으로 투여가능한 용량들의 세트이다. 이같은 로트는, 예를 들어, 태반 관류액으로부터 또는 효소로 소화 태반 조직으로부터의 세포로부터 수득할 수 있다. 다수의 태반으로부터 수득된, 태반 세포들의 로트 세트가, 예를 들어, 장기 보관을 위해 단리된 태반 세포들의 은행에 배열될 수 있다. 일반적으로, 조직 배양 플라스틱-부착성 태반 세포가 태반 물질의 초기 배양물로부터 수득되어 종자 배양물을 형성하고, 이는 제어된 조건 하에 확장되어 대략 등가의 배가수의 세포 집단을 형성한다. 로트는 바람직하게는 단일 태반의 조직으로부터 유래되지만, 다수의 태반의 조직으로부터 유래될 수 있다.

한 실시양태에서, 태반 세포 로트가 하기와 같이 수득된다. 먼저 태반 조직을, 예를 들어, 다져서, 파괴하고, 적절한 효소, 예를 들어, 트립신 또는 콜라게나제로 소화시킨다 (상기 섹션 5.5.3 참조). 바람직하게는 태반 조직은, 예를 들어, 단일 태반으로부터의 전체 양막, 전체 융모막, 또는 양쪽 모두를 포함하지만, 양막 또는 융모막의 일부분만을 포함할 수 있다. 소화된 조직을, 예를 들어, 약 1-3주, 바람직하게는 약 2주 동안 배양한다. 비-부착성 세포의 제거 후, 형성된 고밀도 콜로니를, 예를 들어, 트립신처리에 의해, 수집한다. 이러한 세포들을 수집하고, 편리한 부피의 배양 배지에 재현탁시킨 후, 확장 배양물에 파종하는데 사용한다. 확장 배양물은 분리된 세포 배양 장치들, 예를 들어, 셀 팩토리(Cell Factory) (NUNC™)의 임의의 배열일 수 있다. 세포들은 확장 배양물에 예를 들어 1×10³ 개, 2×10³ 개, 3×10³ 개, 4×10³ 개, 5×10³ 개, 6×10³ 개, 7×10³ 개, 8×10³ 개, 9×10³ 개, 1×10⁴ 개, 1×10⁴ 개, 2×10⁴ 개, 3×10⁴ 개, 4×10⁴ 개, 5×10⁴ 개, 6×10⁴ 개, 7×10⁴ 개, 8×10⁴ 개, 9×10⁴ 개, 또는 10×10⁴개의 세포/㎠가 파종되도록 임의의 정도로 세분될 수 있다. 바람직하게는, 약 1×10³ 개 내지 약 1×10⁴ 개의 세포/㎠가 각각의 확장 배양물에 파종하는데 사용된다. 확장 배양물의 수는 세포가 수득되는 특정 태반(들)에 따라 수가 더 크거나 작을 수 있다.

배양물 내의 세포의 밀도가 특정 값, 예를 들어, 약 1×10⁵ 개의 세포/㎠에 이를 때까지 확장 배양물이 성장된다. 세포를 이러한 시점에서 수집 및 동결보존할 수 있거나, 또는 상기 기술된 바와 같이 새로운 확장 배양물 내로 계대시킬 수 있다. 세포는 사용 전에, 예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회 또는 20회 계대될 수 있다. 바람직하게는 개체수 배가의 누적 횟수의 기록이 확장 배양(들) 동안 유지된다. 배양물로부터의 세포는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 12회, 14회, 16회, 18회, 20회, 22회, 24회, 26회, 28회, 30회, 32회, 34회, 36회, 38회 또는 40회 배가, 또는 60회 배가까지 확장될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 세포들의 집단을 개별적인 용량으로 나누기 전의 개체수 배가 횟수는 약 15 내지 약 30이다. 세포는 확장 프로세스 전반에 걸쳐 연속적으로 배양될 수 있거나, 또는 확장 동안 1회 이상 냉동될 수 있다.

개별적인 용량에 사용될 세포가 추후의 사용을 위해 동결, 예를 들어, 동결보존될 수 있다. 개별적인 용량은, 예를 들어, 약 1백만 내지 약 5천만 개의 세포/㎖를 포함할 수 있고, 전체적으로는 약 10⁶ 개 내지 10¹⁰ 개의 세포를 포함할 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 다수의 제1 개체수 배가를 위해 인간 산후 태반으로부터 1차 배양 태반 세포를 확장시키는 단계; 상기 태반 세포를 동결보존하여, 마스터 세포 은행(Master Cell Bank)을 형성시키는 단계; 다수의 제2 개체수 배가를 위해 마스터 세포 은행으로부터 다수의 태반 세포를 확장시키는 단계; 상기 태반 세포를 동결보존하여, 작업용 세포 은행(Working Cell Bank)을 형성시키는 단계; 다수의 제3 개체수 배가를 위해 작업용 세포 은행으로부터 다수의 태반 줄기 세포를 확장시키는 단계; 및 상기 태반 세포를 개별적인 용량으로 동결보존하는 단계를 포함하고, 이때 상기 개별적인 용량들이 총괄적으로 태반 세포 은행을 구성하는 방법에 의해 태반 세포 은행이 제조될 수 있다. 임의적으로, 상기 다수의 제3 개체수 배가로부터 다수의 태반 세포가 다수의 제4 개체수 배가를 위해 확장될 수 있고, 개별적인 용량으로 동결보존될 수 있으며, 이때 상기 개별적인 용량들이 총괄적으로 태반 세포 은행을 구성한다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 1차 배양 태반 세포는 태반 관류액으로부터의 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 1차 배양 태반 세포는 소화된 태반 조직으로부터의 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 1차 배양 태반 세포는 태반 관류액 및 소화된 태반 조직으로부터의 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 태반 세포 1차 배양물 내의 상기 태반 세포 모두는 동일한 태반으로부터의 것이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 이러한 방법은 상기 작업용 세포 은행으로부터의 상기 다수의 태반 세포로부터 CD200⁺ 또는 HLA-G⁺ 태반 세포를 선별하여 개별적인 용량을 형성시키는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 개별적인 용량은 약 10⁴ 개 내지 약 10⁵ 개의 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 개별적인 용량은 약 10⁵ 개 내지 약 10⁶ 개의 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 개별적인 용량은 약 10⁶ 개 내지 약 10⁷ 개의 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 개별적인 용량은 약 10⁷ 개 내지 약 10⁸ 개의 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 개별적인 용량은 약 10⁸ 개 내지 약 10⁹ 개의 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 개별적인 용량은 약 10⁹ 개 내지 약 10¹⁰ 개의 태반 세포를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 태반이 수득되는 공여자 (예를 들어, 모체)가 하나 이상의 병원체에 대해 테스트된다. 테스트된 병원체에 대해 모체가 양성이면, 태반으로부터의 전체 로트가 폐기된다. 이같은 테스트는 태반 세포 로트 생산 동안의 임의의 시점에, 예를 들어, 확장 배양 동안 수행될 수 있다. 존재에 대해 테스트되는 병원체에는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 (I형 및 II형), 사이토메갈로바이러스, 헤르페스바이러스 등이 비제한적으로 포함된다.

5.8 태반 세포의 보존

단리된 태반 세포, 예를 들어, 상기 섹션 5.4.2에 기술된 단리된 태반 세포를 보존할 수 있고, 즉 장기 보관을 허용하는 조건, 또는 예를 들어 아폽토시스 또는 괴사에 의한 세포 사망을 억제하는 조건 하에 놓을 수 있다.

관련된 미국 출원 공개 번호 2007/0190042 (이의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 아폽토시스 억제제, 괴사 억제제 및/또는 산소-운반 퍼플루오로카본을 포함하는 조성물을 사용하여, 태반 세포를 보존할 수 있다. 한 실시양태에서, 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변의 혈류 파괴의 치료에 유용한 세포 집단을 보존하는 방법은 상기 세포 집단을 아폽토시스 억제제 및 산소-운반 퍼플루오로카본을 포함하는 세포 수집 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 상기 아폽토시스 억제제는 아폽토시스 억제제와 접촉되지 않은 세포 집단과 비교하여 이러한 세포 집단에서 아폽토시스를 감소시키거나 방지하는데 충분한 양으로, 그리고 이에 충분한 시간 동안 존재한다. 구체적 실시양태에서, 상기 아폽토시스 억제제는 카스파제 억제제이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 아폽토시스 억제제는 JNK 억제제이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 JNK 억제제는 상기 세포의 분화 또는 증식을 조정하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 수집 조성물은 분리된 상 내의 상기 아폽토시스 억제제 및 상기 산소-운반 퍼플루오로카본을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 수집 조성물은 에멀션 내의 상기 아폽토시스 억제제 및 상기 산소-운반 퍼플루오로카본을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포 수집 조성물은 유화제, 예를 들어, 레시틴을 추가적으로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 아폽토시스 억제제 및 상기 퍼플루오로카본은 세포에 접촉하는 시점에 약 0℃ 내지 약 25℃ 사이이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 아폽토시스 억제제 및 상기 퍼플루오로카본은 세포에 접촉하는 시점에 약 2℃ 내지 10℃ 사이, 또는 약 2℃ 내지 약 5℃ 사이이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 세포 집단의 운반 도중에 수행된다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 세포 집단의 동결 및 해동 동안 수행된다.

태반 세포들의 집단은, 예를 들어, 상기 세포 집단을 아폽토시스 억제제 및 기관-보존 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 상기 아폽토시스 억제제는 아폽토시스 억제제와 접촉되지 않은 세포 집단과 비교하여, 이러한 세포 집단에서 아폽토시스를 감소시키거나 방지하는데 충분한 양으로, 그리고 이에 충분한 시간 동안 존재하는 방법에 의해 보존될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 기관-보존 화합물은 UW 용액 (미국 특허 번호 4,798,824에 기술됨; 비아스팬(ViaSpan)으로 또한 공지됨; [Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990)]를 또한 참조) 또는 미국 특허 번호 5,552,267 (스턴(Stern) 등)에 기술된 용액이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기관-보존 화합물은 히드록시에틸 전분, 락토비온산, 라피노스, 또는 이들의 조합물이다. 또 다른 실시양태에서, 세포 수집 조성물은 산소-운반 퍼플루오로카본을 2-상 내에 또는 에멀션으로서 추가적으로 포함한다.

이러한 방법의 또 다른 실시양태에서, 태반 세포는, 관류 동안, 아폽토시스 억제제 및 산소-운반 퍼플루오로카본, 장기-보존 화합물 또는 이들의 조합물을 포함하는 세포 수집 조성물과 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 조직 파괴 프로세스, 예를 들어, 효소에 의한 소화 동안 상기 세포가 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 태반 세포가 관류에 의한 수집 후에, 또는 조직 파괴, 예를 들어, 효소에 의한 소화에 의한 수집 후에 상기 세포 수집 화합물과 접촉된다.

전형적으로, 태반 세포 수집, 강화 및 단리 동안, 저산소증 및 기계적 스트레스로 인한 세포 스트레스를 최소화하거나 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 방법의 또 다른 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단이 상기 보존 동안 6시간 미만으로 수집, 강화 또는 단리 동안의 저산소성 조건에 노출되고, 이때 저산소성 조건은 정상적인 혈액 산소 농도보다 낮은 산소 농도이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 상기 보존 동안 2시간 미만 동안 상기 저산소성 조건에 노출된다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은, 수집, 강화 또는 단리 동안, 상기 저산소성 조건에 1시간 미만 또는 30분 미만 동안 노출되거나, 또는 저산소성 조건에 노출되지 않는다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포 집단은 수집, 강화 또는 단리 동안 전단 스트레스에 노출되지 않는다.

태반 세포가 동결보존될 수 있고, 예를 들어, 소형 컨테이너, 예를 들어, 앰풀 내의 동결보존 배지에 동결보존될 수 있다. 적절한 동결보존 배지에는 성장 배지가 예를 들어 포함되는 배양 배지, 또는 세포 동결 배지, 예를 들어 시판되는 세포 동결 배지, 예를 들어, C2695, C2639 또는 C6039 (시그마)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 동결보존 배지는 바람직하게는 DMSO (디메틸술폭시드)를, 예를 들어, 약 2％ 내지 약 15％ (v/v), 예를 들어, 약 10％ (v/v)의 농도로 포함한다. 동결보존 배지는 추가적인 작용제, 예를 들어, 메틸셀룰로스 및/또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 바람직하게는 태반 세포는 동결보존 동안 약 1℃/분으로 냉각된다. 바람직한 동결보존 온도는 약 -80℃ 내지 약 -180℃, 바람직하게는 약 -125℃ 내지 약 -140℃이다. 동결보존된 세포는 사용하기 위해 해동하기 전에 액체 질소로 옮겨질 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 일단 앰풀이 약 -90℃에 도달하면, 이를 액체 질소 보관 구역으로 옮긴다. 동결보존은 속도 제어 동결기를 사용하여 또한 이루어질 수 있다. 바람직하게는 동결보존된 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도, 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 해동된다.

5.9 단리된 태반 세포를 포함하는 조성물

본원에, 예를 들어, 섹션 5.4.2에 기술된 태반 세포가 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에서 사용하기 위한 생리학적으로 허용가능한 또는 의학적으로 허용가능한 화합물, 조성물 또는 기구와 조합될 수 있다. 본원에서 제공되는 치료 방법에 유용한 조성물은 본원에 기술된 태반 세포 (상기 섹션 5.4.2 참조) 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 조성물은 제약상 허용가능한 조성물, 예를 들어, 제약상 허용가능한 담체 내에 태반 세포를 포함하는 조성물이다. 하기 섹션 5.9.2 참조.

특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포를 포함하는 조성물이 추가적으로 매트릭스, 예를 들어, 세포제거 매트릭스 또는 합성 매트릭스를 포함한다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 매트릭스는 3차원 스캐폴드이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 매트릭스는 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 피브로넥틴, 펙틴, 오르니틴, 또는 비트로넥틴을 포함한다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 매트릭스는 양막 또는 양막-유래 생체재료이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 매트릭스는 세포외 막 단백질을 포함한다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 매트릭스는 합성 화합물을 포함한다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 매트릭스는 생활성(bioactive) 화합물을 포함한다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 생활성 화합물은 성장 인자, 사이토카인, 항체, 또는 5,000 달톤 미만의 유기 분자이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 치료 방법에서 유용한 조성물은 상기 태반 세포 중 임의의 것 또는 상기 태반 세포 집단 중 임의의 것에 의해 컨디셔닝된 배지를 포함한다.

5.9.1 동결보존된 단리된 태반 세포

뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에 유용한 단리된 태반 세포 집단이 추후의 사용을 위해 보존될 수 있고, 예를 들어, 동결보존될 수 있다. 세포, 예컨대 줄기 세포의 동결보존 방법은 당업계에 주지되어 있다. 단리된 태반 세포 집단은 개체에게 용이하게 투여가능한 형태로 제조될 수 있고, 예를 들어, 단리된 태반 세포 집단이 의학적 사용에 적절한 컨테이너 내에 함유된다. 이같은 컨테이너는, 예를 들어, 단리된 태반 세포 집단이 용이하게 분배될 수 있는 무균성 플라스틱 백, 플라스크, 병 또는 기타 컨테이너일 수 있다. 예를 들어, 컨테이너는 혈액 백, 또는 수용자에게 액체를 정맥내 투여하는데 적절한 또 다른 의학적으로 허용가능한 플라스틱 백일 수 있다. 바람직하게는 컨테이너는 조합된 세포 집단의 동결보존을 허용하는 것이다.

동결보존된 단리된 태반 세포 집단은 단일 공여자 또는 다수의 공여자로부터 유래된 단리된 태반 세포를 포함할 수 있다. 단리된 태반 세포 집단은 의도되는 수용자에 대해 HLA가 완전히 매칭(matching)되거나, 또는 HLA가 부분적으로 또는 완전히 미스매칭(mismatching)될 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 단리된 태반 세포가 컨테이너 내의 조직 배양 플라스틱-부착성 태반 세포 집단을 포함하는 조성물의 형태로 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료에 사용될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 단리된 태반 세포가 동결보존된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 컨테이너는 백, 플라스크, 또는 병이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 백은 무균성 플라스틱 백이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 백은, 예를 들어, 정맥내 주입에 의한, 상기 단리된 태반 세포 집단의 정맥내 투여에 적절하거나, 이를 허용하거나, 또는 이를 용이하게 한다. 백은 단리된 태반 세포와 하나 이상의 다른 용액, 예를 들어, 약물이 투여 전 또는 투여 동안 혼합되는 것을 허용하도록 서로 연결된 다중 공간(lumen) 또는 구획을 포함할 수 있다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 조성물은 조합된 세포 집단의 동결보존을 용이하게 하는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 집단은 생리학적으로 허용가능한 수성 용액 내에 함유된다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 생리학적으로 허용가능한 수성 용액은 0.9％ NaCl 용액이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 집단은 상기 세포 집단의 수용자에 대해 HLA가 매칭되는 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 조합된 세포 집단은 상기 세포 집단의 수용자에 대해 적어도 부분적으로 HLA가 미스매칭되는 태반 세포를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 다수의 공여자로부터 유래된다.

특정 실시양태에서, 컨테이너 내의 단리된 태반 세포는 동결보존되었고 컨테이너 내에 함유된 단리된 CD10⁺, CD34^-, CD105⁺ 태반 세포이다. 구체적 실시양태에서, 상기 CD10⁺, CD34^-, CD105⁺ 태반 세포는 또한 CD200⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 CD10⁺, CD34^-, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포는 또한 CD45^- 또는 CD90⁺이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 CD10⁺, CD34^-, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포는 또한 CD45^- 및 CD90⁺이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, 또는 PDL1⁺, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상이다. 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-카드헤린^low, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, 및 PDL1⁺이다.

또 다른 특정 실시양태에서, 상기 언급된 단리된 태반 세포는 동결보존되었고 컨테이너 내에 함유된 단리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 동결보존되었고 컨테이너 내에 함유된 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 동결보존되었고 컨테이너 내에 함유된 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 동결보존되었고 컨테이너 내에 함유된 CD73⁺, CD105⁺ 세포이고, 이때 상기 단리된 태반 세포는 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 태반 세포들의 집단과 함께 배양되는 경우 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 동결보존되었고 컨테이너 내에 함유된 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 동결보존되었고 컨테이너 내에 함유된 OCT-4⁺ 태반 세포이고, 이때 상기 세포는 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 태반 세포들의 집단과 함께 배양되는 경우 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진한다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 언급된 단리된 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 CD34^-, CD10⁺ 및 CD105⁺인 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 태반 줄기 세포이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 다능성 태반 세포이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 신경 표현형의 세포, 골발생 표현형의 세포 또는 연골발생 표현형의 세포로 분화되는 잠재력을 지닌다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 추가적으로 CD200⁺이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 또는 CD45^-이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 또는 CD45^-이다. 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 또는 CD45^-이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD90⁺ 및 CD45^-이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD90⁺, CD45^- 세포는 유세포 분석법에 의해 검출 시 추가적으로 CD80^- 및 CD86^-이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 세포는 추가적으로 CD29⁺, CD38^-, CD44⁺, CD54⁺, CD80^-, CD86^-, SH3⁺ 또는 SH4⁺ 중 하나 이상이다. 또 다른 더욱 구체적 실시양태에서, 세포는 추가적으로 CD44⁺이다. 상기 단리된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 태반 세포 중 임의의 것의 구체적 실시양태에서, 세포는 추가적으로 CD117^-, CD133^-, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^- 및/또는 PDL1⁺ 중 하나 이상이다.

상기 동결보존된 단리된 태반 세포들 중 임의의 것의 구체적 실시양태에서, 상기 컨테이너는 백이다. 다양한 구체적 실시양태에서, 상기 컨테이너는 대략, 최소 또는 최대 1×10⁶ 개의 상기 단리된 태반 세포, 5×10⁶ 개의 상기 단리된 태반 세포, 1×10⁷ 개의 상기 단리된 태반 세포, 5×10⁷ 개의 상기 단리된 태반 세포, 1×10⁸ 개의 상기 단리된 태반 세포, 5×10⁸ 개의 상기 단리된 태반 세포, 1×10⁹ 개의 상기 단리된 태반 세포, 5×10⁹ 개의 상기 단리된 태반 세포, 1×10¹⁰ 개의 상기 단리된 태반 세포, 또는 1×10¹⁰ 개의 상기 단리된 태반 세포를 포함한다. 상기 동결보존된 집단들 중 임의의 것의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 대략, 최소, 또는 최대 5회, 또는 최대 10회, 최대 15회, 또는 최대 20회 계대되었다. 상기 동결보존된 단리된 태반 세포들 중 임의의 것의 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포가 상기 컨테이너 내에서 확장되었다.

5.9.2 제약 조성물

단리된 태반 세포들의 집단, 또는 단리된 태반 세포들을 포함하는 세포들의 집단이 생체 내에서, 예를 들어, 본원에서 제공되는 치료 방법에서 사용하기 위한 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 이같은 제약 조성물은 제약상 허용가능한 담체, 예를 들어, 염수 용액 또는 생체내 투여를 위한 또 다른 허용되는 생리학적으로 허용가능한 용액 내에 단리된 태반 세포들의 집단, 또는 단리된 태반 세포들을 포함하는 세포들의 집단을 포함한다. 본원에 기술된 단리된 태반 세포를 포함하는 제약 조성물은 본원의 다른 곳에서 기술된 단리된 태반 세포 집단 또는 단리된 태반 세포 중 임의의 것 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 태아의 단리된 태반 세포, 모체의 단리된 태반 세포, 또는 태아 및 모체 양쪽 모두의 단리된 태반 세포를 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 제약 조성물은 단일 개체 또는 태반으로부터 또는 다수의 개체 또는 태반으로부터 수득된 단리된 태반 세포를 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 제약 조성물은 임의의 갯수의 단리된 태반 세포를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 예를 들어, 단리된 태반 세포의 단일 단위 용량은 대략, 최소 또는 최대 1×10⁵ 개, 5×10⁵ 개, 1×10⁶ 개, 5×10⁶ 개, 1×10⁷ 개, 5×10⁷ 개, 1×10⁸ 개, 5×10⁸ 개, 1×10⁹ 개, 5×10⁹ 개, 1×10¹⁰ 개, 5×10¹⁰ 개, 1×10¹¹ 개 또는 이를 초과하는 개수의 단리된 태반 세포를 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 제약 조성물은 50％ 이상의 생존성 세포를 포함하는 세포들의 집단을 포함한다 (즉, 집단 내의 세포의 50％ 이상이 기능성이거나 살아 있다). 바람직하게는, 집단 내의 세포의 60％ 이상이 생존성이다. 더욱 바람직하게는, 제약 조성물 내의 집단 내의 세포의 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상이 생존성이다.

본원에서 제공되는 제약 조성물은 하나 이상의 예를 들어 생착을 용이하게 하는 화합물 (예를 들어, 항-T-세포 수용체 항체, 면역억제제 등); 안정화제 예컨대 알부민, 덱스트란 40, 젤라틴, 히드록시에틸 전분, 플라즈마라이트(plasmalyte) 등을 포함할 수 있다.

주사용 용액으로 제제화되는 경우, 한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1％ 내지 1.5％ HSA 및 약 2.5％ 덱스트란을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 5％ HSA 및 10％ 덱스트란을 포함하고 면역억제제, 예를 들어, 사이클로스포린 A (예를 들어, 10 ㎎/㎏)를 포함하는 용액 내에 약 5×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 2×10⁷ 개의 세포/㎖를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물, 예를 들어, 용액은 다수의 세포, 예를 들어, 단리된 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포를 포함하고, 이때 상기 제약 조성물은 약 1.0±0.3×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 5.0±1.5×10⁶ 개의 세포/㎖를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1.5×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 3.75×10⁶ 개의 세포/㎖를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 50×10⁶ 개의 세포/㎖, 약 1×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 40×10⁶ 개의 세포/㎖, 약 1×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 30×10⁶ 개의 세포/㎖, 약 1×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 20×10⁶ 개의 세포/㎖, 약 1×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 15×10⁶ 개의 세포/㎖, 또는 약 1×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 10×10⁶ 개의 세포/㎖을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 가시적인 세포 덩어리를 포함하지 않거나 (즉, 대형 세포 덩어리가 없음), 또는 이같은 가시적인 덩이리가 실질적으로 없다. 본원에서 사용된 "대형 세포 덩어리"는 확대 없이 가시적인, 예를 들어, 육안으로 가시적인 세포 응집물을 의미하고, 일반적으로 약 150 ㎛를 초과하는 세포 응집물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 2.5％, 3.0％, 3.5％, 4.0％, 4.5％, 5.0％, 5.5％, 6.0％, 6.5％, 7.0％, 7.5％ 8.0％, 8.5％, 9.0％, 9.5％ 또는 10％ 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란-40을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 조성물은 약 7.5％ 내지 약 9％ 덱스트란-40을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 조성물은 약 5.5 ％ 덱스트란-40을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1％ 내지 약 15％ 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1％, 2％, 3％, 4％, 5％, 65, 75, 8％, 9％, 10％, 11％, 12％, 13％, 14％ 또는 15％ HSA를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 세포가 동결보존 및 해동되었다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포가 70 ㎛ 내지 100 ㎛ 필터로 여과되었다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 조성물은 가시적인 세포 덩어리를 포함하지 않는다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 조성물은 10⁶ 개의 세포 당 약 200개 미만의 세포 덩어리를 포함하고, 이때 상기 세포 덩어리는 현미경, 예를 들어, 광학 현미경 하에서만 가시적이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 조성물은 10⁶ 개의 세포 당 약 150개 미만의 세포 덩어리를 포함하고, 이때 상기 세포 덩어리는 현미경, 예를 들어, 광학 현미경 하에서만 가시적이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 조성물은 10⁶ 개의 세포 당 약 100개 미만의 세포 덩어리를 포함하고, 이때 상기 세포 덩어리는 현미경, 예를 들어, 광학 현미경 하에서만 가시적이다.

구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1.0±0.3×10⁶ 개의 세포/㎖, 약 5.5％ 덱스트란-40 (w/v), 약 10％ HSA (w/v), 및 약 5％ DMSO (v/v)를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 다수의 세포, 예를 들어, 다수의 단리된 태반 세포를 10％ 덱스트란-40을 포함하는 용액 내에 함유하고, 이때 제약 조성물은 약 1.0±0.3×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 5.0 ±1.5×10⁶ 개의 세포/㎖를 포함하고, 상기 조성물은 육안으로 가시적인 세포 덩어리를 포함하지 않는다 (즉, 대형 세포 덩어리를 포함하지 않는다). 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1.5×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 3.75×10⁶ 개의 세포/㎖를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 세포가 동결보존 및 해동되었다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 세포가 70 ㎛ 내지 100 ㎛ 필터로 여과되었다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 조성물은 10⁶ 개의 세포 당 약 200개 미만의 거대 세포 덩어리 (즉, 확대했을 때만 가시적인 세포 덩어리)를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 10⁶ 개의 세포 당 약 150개 미만의 거대 세포 덩어리를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 10⁶ 개의 세포 당 약 100개 미만의 거대 세포 덩어리를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 15％, 14％, 13％, 12％, 11％, 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％ 또는 2％ 미만의 DMSO, 또는 1％, 0.9％, 0.8％, 0.7％, 0.6％, 0.5％, 0.4％, 0.3％, 0.2％, 또는 0.1％ 미만의 DMSO를 포함한다.

세포들을 포함하는 조성물이 본원에 추가로 포함되고, 이때 상기 조성물은 본원에 개시된 방법들 중 하나에 의해 생산된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 제약 조성물이 세포를 포함하고, 이때 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포를 포함하는 용액을 여과하여, 여과된 세포-함유 용액을 형성시키는 단계; 여과된 세포-함유 용액을, 예를 들어, 동결보존 전에, ㎖ 당 약 1 내지 50×10⁶ 개, 1 내지 40×10⁶ 개, 1 내지 30×10⁶ 개, 1 내지 20×10⁶ 개, 1 내지 15×10⁶ 개, 또는 1 내지 10×10⁶ 개의 세포로 제1 용액으로 희석하는 단계; 및 생성된 여과된 세포-함유 용액을 덱스트란을 포함하지만 인간 혈청 알부민 (HSA)은 포함하지 않는 제2 용액으로 희석하여, 상기 조성물을 생산하는 단계에 의해 제약 조성물이 생산된다. 특정 실시양태에서, 상기 희석은 약 15×10⁶ 개 이하의 세포/㎖로의 희석이다. 특정 실시양태에서, 상기 희석은 약 10±3×10⁶ 개 이하의 세포/㎖로의 희석이다. 특정 실시양태에서, 상기 희석은 약 7.5×10⁶ 개 이하의 세포/㎖로의 희석이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 여과된 세포-함유 용액이 희석 전에 약 15×10⁶ 개 미만의 세포/㎖를 포함하는 경우, 여과가 임의적이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 여과된 세포-함유 용액이 희석 전에 약 10±3×10⁶ 개 미만의 세포/㎖를 포함하는 경우, 여과가 임의적이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 여과된 세포-함유 용액이 희석 전에 약 7.5×10⁶ 개 미만의 세포/㎖를 포함하는 경우, 여과가 임의적이다.

구체적 실시양태에서, 제1 용액으로의 희석과 제2 희석 용액으로의 희석 사이에 세포가 동결보존된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 제1 희석 용액은 덱스트란 및 HSA를 포함한다. 제1 희석 용액 또는 제2 희석 용액 내의 덱스트란은 임의의 분자량의 덱스트란, 예를 들어, 분자량이 약 10 kDa 내지 약 150 kDa인 덱스트란일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 희석 용액 또는 상기 제2 용액 내의 상기 덱스트란은 약 2.5％, 3.0％, 3.5％, 4.0％, 4.5％, 5.0％, 5.5％, 6.0％, 6.5％, 7.0％, 7.5％ 8.0％, 8.5％, 9.0％, 9.5％ 또는 10％ 덱스트란이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 제1 희석 용액 또는 상기 제2 희석 용액 내의 덱스트란은 덱스트란-40이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 제1 희석 용액 및 상기 제2 희석 용액 내의 덱스트란은 덱스트란-40이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 제1 희석 용액 내의 상기 덱스트란-40은 5.0％ 덱스트란-40이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 제1 희석 용액 내의 상기 덱스트란-40은 5.5％ 덱스트란-40이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 제2 희석 용액 내의 상기 덱스트란-40은 10％ 덱스트란-40이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, HSA를 포함하는 상기 용액 내의 상기 HSA는 1 내지 15％ HSA이다. 또른 구체적 실시양태에서, HSA를 포함하는 상기 용액 내의 상기 HSA는 약 1％, 2％, 3％, 4％, 5％, 6％, 7％, 8％, 9％, 10％, 11％, 12％, 13％, 14％ 또는 15 ％ HSA이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, HSA를 포함하는 상기 용액 내의 상기 HSA는 10％ HSA이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 제1 희석 용액은 HSA를 포함한다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 제1 희석 용액 내의 상기 HSA는 10％ HSA이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 제1 희석 용액은 냉동보호제를 포함한다. 더욱 구체적 실시양태에서, 상기 냉동보호제는 DMSO이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 제2 희석 용액 내의 상기 덱스트란-40은 약 10％ 덱스트란-40이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 세포를 포함하는 상기 조성물은 약 7.5％ 내지 약 9％ 덱스트란을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1.0±0.3×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 5.0±1.5×10⁶ 개의 세포/㎖을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1.5×10⁶ 개의 세포/㎖ 내지 약 3.75×10⁶ 개의 세포/㎖을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, (a) 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포를 포함하는 세포-함유 용액을 동결보존 전에 여과하여, 여과된 세포-함유 용액을 생산하는 단계; (b) 여과된 세포-함유 용액 내의 세포를 약 1 내지 50×10⁶ 개, 1 내지 40×10⁶ 개, 1 내지 30×10⁶ 개, 1 내지 20×10⁶ 개, 1 내지 15×10⁶ 개, 또는 1 내지 10×10⁶ 개의 세포/㎖로 동결보존하는 단계; (c) 세포를 해동시키는 단계; 및 (d) 여과된 세포-함유 용액을 덱스트란-40 용액으로 약 1:1 내지 약 1:11 (v/v) 희석하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제약 조성물이 제조된다. 특정 실시양태에서, 단계 (a) 전에 세포수가 약 10±3×10⁶ 개의 세포/㎖ 미만이면, 여과가 임의적이다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단계 (b)의 세포가 약 10±3×10⁶ 개의 세포/㎖로 동결보존된다. 더욱 구체적 실시양태에서, 단계 (b)의 세포가 약 5％ 내지 약 10％ 덱스트란-40 및 HSA를 포함하는 용액에서 동결보존된다. 특정 실시양태에서, 상기 단계 (b)에서의 희석은 약 15×10⁶ 개의 세포/㎖ 이하이다.

또 다른 실시양태에서, (a) 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포를 10％ HSA를 포함하는 5.5％ 덱스트란-40 용액에 현탁하여, 세포-함유 용액을 형성시키는 단계; (b) 세포-함유 용액을 70 ㎛ 필터로 여과하는 단계; (c) 세포-함유 용액을 5.5％ 덱스트란-40, 10％ HSA 및 5％ DMSO를 포함하는 용액으로 약 1 내지 50×10⁶ 개, 1 내지 40×10⁶ 개, 1 내지 30×10⁶ 개, 1 내지 20×10⁶ 개, 1 내지 15×10⁶ 개, 또는 1 내지 10×10⁶ 개의 세포/㎖로 희석하는 단계; (d) 세포를 동결보존하는 단계; (e) 세포를 해동시키는 단계; 및 (f) 세포-함유 용액을 10％ 덱스트란-40으로 1:1 내지 1:11 (v/v) 희석하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제약 조성물이 제조된다. 특정 실시양태에서, 상기 단계 (c)에서의 희석은 약 15×10⁶ 개의 세포/㎖ 이하이다. 특정 실시양태에서, 상기 단계 (c)에서의 희석은 약 10±3×10⁶ 개의 세포/㎖ 이하이다. 특정 실시양태에서, 상기 단계 (c)에서의 희석은 약 7.5×10⁶ 개의 세포/㎖ 이하이다.

또 다른 실시양태에서, 세포를 포함하는 조성물이 (a) 다수의 세포를 원심분리하여 세포를 수집하는 단계; (b) 세포를 5.5％ 덱스트란-40에 재현탁하는 단계; (c) 세포를 원심분리하여 세포를 수집하는 단계; (d) 세포를 10％ HSA를 포함하는 5.5％ 덱스트란-40 용액에 재현탁시키는 단계; (e) 세포를 70 ㎛ 필터로 여과하는 단계; (f) 세포를 5.5％ 덱스트란-40, 10％ HSA 및 5％ DMSO에서 약 1 내지 50×10⁶ 개, 1 내지 40×10⁶ 개, 1 내지 30×10⁶ 개, 1 내지 20×10⁶ 개, 1 내지 15×10⁶ 개, 또는 1 내지 10×10⁶ 개의 세포/㎖로 희석하는 단계; (g) 세포를 동결보존하는 단계; (h) 세포를 해동시키는 단계; 및 (i) 세포를 10％ 덱스트란-40으로 1:1 내지 1:11 (v/v) 희석하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 특정 실시양태에서, 상기 단계 (f)에서의 희석은 약 15×10⁶ 개의 세포/㎖ 이하이다. 특정 실시양태에서, 상기 단계 (f)에서의 희석은 약 10±3×10⁶ 개의 세포/㎖ 이하이다. 특정 실시양태에서, 상기 단계 (f)에서의 희석은 약 7.5×10⁶ 개의 세포/㎖ 이하이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 세포수가 약 10±3×10⁶ 개의 세포/㎖ 미만이면, 여과가 임의적이다.

본원에 기술된 단리된 태반 세포를 포함하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물은 임의의 본원에 기술된 단리된 태반 세포를 포함할 수 있다.

세포성 제품의 투여에 적절한 또 다른 주사가능한 제제가 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 실질적으로 또는 완전히 기원이 비-모체인, 즉 태아 유전자형을 지니는 단리된 태반 세포를 포함한다; 예를 들어, 약 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 약 100％ 이상이 기원이 비-모체이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 제약 조성물은 CD200⁺ 및 HLA-G⁺이거나; CD73⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺이거나; CD200⁺ 및 OCT-4⁺이거나; CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이거나; CD73⁺ 및 CD105⁺이고, 단리된 태반 세포의 집단을 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 태반 세포들의 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; 또는 OCT-4⁺이고, 단리된 태반 세포의 집단을 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 태반 세포들의 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; 또는 이들의 임의의 조합인 단리된 태반 세포들의 집단을 포함하고, 이때 상기 단리된 태반 세포의 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상이 기원이 비-모체이다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 CD10⁺, CD105⁺ 및 CD34^-이거나; CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 및 CD34^-이거나; CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-이고, CD90⁺ 또는 CD45^- 중 하나 이상이거나; CD10⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^- 및 CD45^-이거나; CD10⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^- 및 CD45^-이거나; CD200⁺ 및 HLA-G⁺이거나; CD73⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺이거나; CD200⁺ 및 OCT-4⁺이거나; CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이거나; CD73⁺ 및 CD105⁺이고, 단리된 태반 세포들을 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 태반 세포들의 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; OCT-4⁺이고, 단리된 태반 세포들을 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 태반 세포들의 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; 또는 CD117^-, CD133^-, KDR^-, CD80^-, CD86^-, HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^- 및/또는 PDL1⁺ 중 하나 이상이거나; 또는 이들의 임의의 조합인 단리된 태반 세포들의 집단을 포함하고, 이때 상기 단리된 태반 세포의 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상이 기원이 비-모체이다. 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 태반으로부터 수득되지 않은 줄기 세포를 추가적으로 포함한다.

본원에서 제공되는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물 내의 단리된 태반 세포는 단일 공여자 또는 다수의 공여자로부터 유래된 태반 세포를 포함할 수 있다. 단리된 태반 세포는 의도되는 수용자에 대해 HLA가 완전히 매칭되거나, 또는 HLA가 부분적으로 또는 완전히 미스매칭될 수 있다.

5.9.3 단리된 태반 세포를 포함하는 매트릭스

태반 줄기 세포, 또는 단리된 태반 세포들의 집단을 포함하는 매트릭스, 히드로젤, 스캐폴드 등을 포함하는 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 이같은 조성물은 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴의 치료를 위한 액체 현탁액 내의 세포 대신에 또는 이에 더하여 사용될 수 있다.

본원에 기술된 단리된 태반 세포가 천연 매트릭스, 예를 들어, 태반 생체재료 예컨대 양막 물질 상에 파종될 수 있다. 이같은 양막 물질은, 예를 들어, 포유동물 태반으로부터 직접 절개된 양막; 고정 또는 열-처리된 양막, 실질적으로 건조한 (즉, <20％ H₂O) 양막, 융모막, 실질적으로 건조한 융모막, 실질적으로 건조한 양막 및 융모막 등일 수 있다. 단리된 태반 세포가 파종될 수 있는 바람직한 태반 생체재료가 미국 출원 공개 번호 2004/0048796 (Hariri)에 기술되어 있고, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본원에 기술된 단리된 태반 세포가 주사에 예를 들어 적절한 히드로젤 용액에 현탁될 수 있다. 이같은 조성물에 적절한 히드로젤에는 자가-조립(self-assembling) 펩티드, 예컨대 RAD16이 포함된다. 한 실시양태에서, 세포를 포함하는 히드로젤 용액이, 예를 들어 주형 내에서, 세포가 내부에 분산되어 있는 이식용 매트릭스를 형성하도록 경화될 수 있다. 이같은 매트릭스 내의 단리된 태반 세포는 이식 전에 세포가 유사분열에 의해 확장되도록 또한 배양될 수 있다. 예를 들어, 히드로젤은 물 분자를 포획하는 3차원 개방형-격자 구조를 생성하도록 공유 결합, 이온 결합 또는 수소 결합을 통해 가교되어 젤을 형성하는 유기 중합체 (천연 또는 합성)이다. 히드로젤-형성 물질에는 다당류 예컨대 알기네이트 및 이의 염, 펩티드, 폴리포스파진, 및 폴리아크릴레이트 (이온 결합으로 가교됨), 또는 블록 중합체 예컨대 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체 (온도 또는 pH에 의해 가교됨)가 각각 포함된다. 일부 실시양태에서, 히드로젤 또는 매트릭스는 생분해성이다.

일부 실시양태에서, 제제는 원위치 중합성 젤을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2002/0022676 (이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨); [Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002)]; [Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003)] 참조).

일부 실시양태에서, 중합체는 수성 용액, 예컨대 물, 완충 염 용액, 또는 전하를 띤 측쇄(side-group)가 있는 수성 알코올 용액, 또는 이의 1가 이온성 염에 적어도 부분적으로 가용성이다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측쇄가 있는 중합체의 예는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트), 및 술폰화 중합체, 예컨대 술폰화 폴리스티렌이다. 아크릴산 또는 메타크릴산과 비닐 에테르 단량체 또는 중합체의 반응에 의해 형성된 산성 측쇄가 있는 공중합체가 또한 사용될 수 있다. 산성 기의 예는 카르복실산 기, 술폰산 기, 할로겐화 (바람직하게는 플루오르화) 알코올 기, 페놀성 OH 기, 및 산성 OH 기이다.

본원에 기술된 단리된 태반 세포 또는 이의 공동-배양물이 3차원 프레임워크 또는 스캐폴드 상에 파종되어 생체 내로 이식될 수 있다. 이같은 프레임워크는 조직 형성을 예를 들어 자극하는 임의의 1가지 이상의 성장 인자, 세포, 약물 또는 기타 성분과 조합되어 이식될 수 있다.

사용될 수 있는 스캐폴드의 예로는 부직 매트(mat), 다공성 발포체, 또는 자가-조립 펩티드가 포함된다. 부직 매트는 글리콜산 및 락트산의 합성 흡수성 공중합체 (예를 들어, PGA/PLA)로 구성된 섬유 (VICRYL, 에티콘, 인크. (Somerville, NJ.))를 사용하여 형성될 수 있다. 동결-건조 또는 냉동진공건조와 같은 공정에 의해 형성된, 폴리(ε-카프로락톤)/폴리(글리콜산) (PCL/PGA) 공중합체로 예를 들어 구성된 발포체 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,355,699 참조)가 또한 스캐폴드로 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 생체흡수성 물질 예컨대 PGA, PLA, PCL 공중합체 또는 블렌드, 또는 히알루론산으로부터 제조된 멀티필라멘트사로 예를 들어 구성될 수 있는 펠트 상에 파종되거나 또는 이와 접촉될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 단리된 태반 세포가 복합 구조물일 수 있는 발포체 스캐폴드 상에 파종될 수 있다. 이같은 발포체 스캐폴드는 유용한 형상, 예컨대 복구, 대체 또는 증대될 신체 내의 특정 구조물의 일부분의 형상으로 성형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프레임워크가 세포 부착을 증강시키기 위해 본 발명의 세포의 접종 전에, 예를 들어, 0.1 M 아세트산으로 처리된 후, 폴리리신, PBS, 및/또는 콜라겐에서 인큐베이션된다. 매트릭스의 외부 표면이, 예컨대 매트릭스의 플라즈마-코팅, 또는 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸 (예를 들어, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴-4-술페이트, 콘드로이틴-6-술페이트, 더마탄 술페이트, 케라틴 술페이트 등), 세포 매트릭스, 및/또는, 젤라틴, 알기네이트, 한천, 아가로스 및 식물 고무 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 기타 물질의 첨가에 의해, 세포의 부착 또는 성장 및 조직의 분화를 개선하기 위해 변형될 수 있다.

일부 실시양태에서, 스캐폴드는 이를 비-혈전형성성이도록 하는 물질을 포함하거나 이러한 물질로 처리될 수 있다. 이러한 처리 및 물질은 내피 성장, 이동, 및 세포외 매트릭스 침착을 또한 촉진하고 유지시킬 수 있다. 이러한 물질 및 처리의 예로는 천연 재료 예컨대 기저막 단백질 예컨대 라미닌 및 IV형 콜라겐, 합성 물질 예컨대 EPTFE, 및 분절형 폴리우레탄 실리콘, 예컨대 PURSPAN™ (더 폴리머 테크놀로지 그룹, 인크. (Berkeley, Calif.))이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 스캐폴드는 항-혈전제 예컨대 헤파린을 또한 포함할 수 있다; 또한 스캐폴드는 단리된 태반 세포의 파종 전에 표면 전하가 변경되도록 처리될 수 있다 (예를 들어, 플라즈마로 코팅됨).

한 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 약 0.5×10⁶ 개 내지 약 8×10⁶ 개의 세포/㎖로 적절한 스캐폴드 상에 파종되거나 이와 접촉된다.

5.10 불멸화 태반 세포주

성장-촉진 유전자, 즉, 성장-촉진 단백질의 생산 및/또는 활성이 외부 인자에 의해 조절가능하도록, 형질감염된 세포의 성장을 적합한 조건 하에 촉진하는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 임의의 적절한 벡터로의 형질감염에 의해 포유동물 태반 세포가 조건부로 불멸화될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 성장-촉진 유전자는 v-myc, N-myc, c-myc, p53, SV40 대형 T 항원, 폴리오마 대형 T 항원, E1a 아데노바이러스, 또는 인간 유두종바이러스의 E7 단백질과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 종양유전자이다.

성장-촉진 단백질의 외부 조절은 성장-촉진 유전자를 외부-조절가능 프로모터, 예를 들어, 형질감염된 세포의 온도 또는 세포와 접촉되는 배지의 조성을 변화시킴으로써 예를 들어 활성이 제어될 수 있는 프로모터의 제어 하에 놓음으로써 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 테트라사이클린 (tet)-제어 유전자 발현 시스템이 사용될 수 있다 ([Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992]; [Hoshimaru et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1518-1523, 1996] 참조). tet의 부재 하에, 이러한 벡터 내의 tet-제어 트랜스액티베이터(transactivator) (tTA)가 tet 오퍼레이터 서열에 융합된 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 최소 프로모터인 ph _CMV* _-1로부터의 전사를 강력하게 활성화시킨다. tTA는 대장균의 트랜스포존-10-유래 tet 저항성 오페론의 억제인자 (tetR)와 단순 포진 바이러스의 VP16의 산성 도메인의 융합 단백질이다. tet의 낮은 비-독성 농도 (예를 들어, 0.01-1.0 ㎍/㎖)에서 tTA에 의한 트랜스액티베이션(transactivation)이 거의 완전히 폐지된다.

한 실시양태에서, 벡터는 선별가능 마커, 예를 들어, 약물 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 함유한다. 박테리아 네오마이신 저항성 유전자 (neo ^R )가 본 발명에서 사용될 수 있는 이같은 마커이다. neo ^R 을 보유하는 세포는 당업자에게 공지된 수단, 예컨대 성장 배지에 예를 들어 100-200 ㎍/㎖의 G418을 첨가하는 것에 의해 선별될 수 있다.

형질감염은 레트로바이러스 감염이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 다양한 수단들 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 벡터에 대한 생산자 세포주로부터 수집된 컨디셔닝 배지와 N2 보충물을 함유하는 DMEM/F12의 혼합물과의 인큐베이션에 의해 세포 배양물이 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 제조된 태반 세포 배양물이 1 부피의 컨디셔닝 배지 및 2 부피의 N2 보충물 함유 DMEM/F12에서의 약 20시간 동안의 인큐베이션에 의해 시험관 내에서 예를 들어 5일 후에 감염될 수 있다. 그후, 선별가능 마커를 보유하는 형질감염된 세포가 상기 기술된 바와 같이 선별될 수 있다.

형질감염 후, 증식을 허용하는, 예를 들어, 세포의 30％ 이상이 24시간의 기간 내에 배가되도록 하는 표면 상에 배양물이 계대된다. 바람직하게는, 기판은 폴리오르니틴 (10 ㎍/㎖) 및/또는 라미닌 (10 ㎍/㎖)으로 코팅된 조직 배양 플라스틱으로 구성된 폴리오르니틴/라미닌 기판, 폴리리신/라미닌 기판 또는 피브로넥틴으로 처리된 표면이다. 그후, 하나 이상의 증식-강화 인자가 보충되었거나 보충되지 않았을 수 있는 성장 배지가 배양물에 3-4일마다 공급된다. 배양물이 50％ 미만의 전면성장일 때 증식-강화 인자가 성장 배지에 첨가될 수 있다.

80-95％ 전면성장되었을 때, 표준 기술을 사용하여, 예컨대 트립신처리에 의해 조건부로 불멸화된 태반 세포주가 계대될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 20회의 계대까지, 선별을 유지하는 것이 유리하다 (예를 들어, 네오마이신 저항성 유전자를 함유하는 세포에 대한 G418의 첨가에 의해). 또한 장기 보관을 위해 세포를 액체 질소 내에 동결시킬 수 있다.

상기 기술된 바와 같이 제조된 조건부로 불멸화된 인간 태반 세포주로부터 클론 세포주가 단리될 수 있다. 일반적으로, 이같은 클론 세포주를 표준 기술을 사용하여, 예컨대 제한 희석에 의해 또는 클로닝 링(cloning ring)을 사용하여 단리할 수 있고, 확장할 수 있다. 일반적으로, 상기 기술된 바와 같이 클론 세포주에 영양을 공급하고 계대시킬 수 있다.

클론성일 수 있지만 반드시 클론성일 필요는 없는, 조건부로 불멸화된 인간 태반 세포주는, 일반적으로, 분화를 촉진하는 배양 조건 하에 성장-촉진 단백질의 생산 및/또는 활성을 억제함으로써 분화되도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 성장-촉진 단백질을 코딩하는 유전자가 외부적으로 조절가능한 프로모터의 제어 하에 있는 경우, 조건, 예를 들어, 배지의 조성 또는 온도를 변형하여 성장-촉진 유전자의 전사를 억제할 수 있다. 상기 논의된 테트라사이클린-제어 유전자 발현 시스템에 대해, 테트라사이클린을 첨가하여 성장-촉진 유전자의 전사를 억제함으로써 분화가 달성될 수 있다. 일반적으로, 4-5일 동안의 1 ㎍/㎖ 테트라사이클린이 분화를 개시시키는데 충분하다. 추가적인 분화를 촉진하기 위해, 추가적인 작용제가 성장 배지에 포함될 수 있다.

5.11 키트

또 다른 측면에서, 키트의 나머지 내용물로부터 분리된 컨테이너 내에, 조직 배양 플라스틱 부착성 다능성 태반 세포, 예를 들어, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포, 및 이들의 단리된 집단, 예를 들어, 상기 섹션 5.4.2에 기술된 세포, 및 사용 설명서를 포함하는, CNS 내부 또는 주변에서의 혈류가 파괴되었던 개체, 예를 들어, 뇌졸중에 걸렸던 개체의 치료에 적절한 키트가 본원에서 제공된다. 바람직하게는, 태반 줄기 세포는 제약상 허용가능한 용액, 예를 들어, 두개내 투여에 적절한 용액 또는 정맥내 투여에 적절한 용액 내에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포는 본원에 기술된 CD10⁺, CD34^-, CD105⁺ 태반 세포, 예를 들어, CD10⁺, CD34^-, CD105⁺, CD200⁺ 태반 세포 중 임의의 것일 수 있다.

특정 실시양태에서, 키트는 태반 세포를 개체에게 전달하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 성분을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 키트는 개체에게 태반 세포를 두개내 전달하는 것을 용이하게 하는 성분을 포함한다. 이같은 실시양태에서, 키트는, 예를 들어, 개체에게 세포를 전달하는데 적절한 주사기 및 바늘; 침범된 CNS 조직을 가시화할 수 있게 하는 방사성 또는 비-방사성 화합물 (예를 들어, 코발트 55) 등을 포함할 수 있다. 이같은 실시양태에서, 태반 세포는 키트에서 백 내에 또는 하나 이상의 바이알 내에 함유될 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 키트는 개체에게 태반 세포를 정맥내 또는 동맥내 전달하는 것을 용이하게 하는 성분을 포함한다. 이같은 실시양태에서, 태반 세포는, 예를 들어, 병 또는 백 (예를 들어, 세포를 포함하는 용액을 약 1.5 ℓ까지 함유할 수 있는 혈액 백 또는 유사한 백) 내에 함유될 수 있고, 키트는 개체에게 세포를 전달하는데 적절한 튜빙 및 바늘을 추가적으로 포함한다.

추가적으로, 키트는 하나 이상의, 개체에서 통증 또는 염증을 감소시키는 화합물 (예를 들어, 진통제, 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 항염증 화합물 등)을 포함할 수 있다. 키트는 항균 또는 항바이러스 화합물 (예를 들어, 하나 이상의 항생제), 개체에서 불안을 감소시키는 화합물 (예를 들어, 알프라졸람), 개체에서 면역 응답을 감소시키는 화합물 (예를 들어, 사이클로스포린 A), 항히스타민제 (디펜히드라민, 로라타딘, 데스로라타딘, 퀘티아핀, 펙소페나딘, 세티리진, 프로메타진, 클로르페니라민, 레보세티리진, 시메티딘, 파모티딘, 라니티딘, 니자티딘, 록사티딘, 라푸티딘 등)을 또한 포함할 수 있다.

추가적으로, 키트는 1회용품, 예를 들어, 멸균 와이프(wipe), 1회용 종이 상품, 장갑 등을 포함할 수 있고, 이들은 개체를 전달에 대비시키는 것을 용이하게 하거나 또는 태반 세포 투여 결과로서의 개체에서의 감염 가능성을 감소시킨다.

6. 실시예

6.1 실시예 1: 두개내 투여된 단리된 태반 세포를 사용한 뇌졸중의 치료

본 실시예는 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴와 관련된 증상의 치료에서 단리된 태반 세포를 투여하는 것의 효능을 실연한다.

약 1 내지 약 2 ㎎/㎖의 콜라게나제 I로 예를 들어 30분 동안 효소에 의해 소화시킨 후, 약 0.25％ 농도의 트립신으로 10분 동안 37℃에서 소화시킴으로써 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 조직 배양 플라스틱-부착성 태반 세포를 수득하였다. 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트를 뇌졸중 모델로 사용하였다. 래트들은 뇌졸중의 효과 및 뇌졸중 증상에 대한 다양한 치료법의 효과를 연구하기 위한 확립된 동물 모델이다. 예를 들어, [Chen et al., "A Model of Focal Ischemic Stroke in the Rat: Reproducible Extensive Cortical Infarction", Stroke 17(4):738-743 (1986)] 참조. 조건 당 10마리의 동물이 사용되었다.

MCA 뇌졸중 수술: 모든 수술 절차를 무균 조건 하에 수행하였다. 동물들을 에퀴테신 (300 ㎎/㎏, 복강내)으로 마취하고, 통증 반사에 대해 점검하였다. MCA 폐색 수술을 깊게 마취된 동물에게 수행하였다. MCA 봉합 기술은 필라멘트를 목동맥을 지나 MCA의 접합부에 도달하도록 삽입함으로써, 총 목동맥으로부터, 뿐만 아니라 윌리스(Willis) 환으로부터의 혈류를 차단하는 것을 수반한다. 오른쪽 총 목동맥을 확인하고, 배쪽 정중선 경부 절개를 통해 단리하였다. 봉합 크기는 무균성, 비-흡수성 봉합사 (에티콘, 인크. (Somerville, NJ))로 만들어진 4-0이었고, 이때 봉합사 팁(tip)의 직경을 고무 시멘트를 사용하여 24 내지 26-게이지 크기로 점점 줄어들게 하였다. 약 15 내지 17 ㎜의 필라멘트를 바깥 및 속 목동맥으로부터 삽입하여 MCA를 차단하였다. 오른쪽 MCA가 1시간 동안 폐색되었다. 공개된 연구를 기초로, MCA의 1시간 폐색은 최대 경색을 초래한다. [Borlongan et al., Neurorep. 9(16):3615-3621 (1998)]; [Borlongan et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 52(1):225-229 (1995)]; [Borlongan et al., Physiol. Behav. 58(5):909-917 (1995)] 참조. 가열 패드 및 직장 온도계를 사용하여 체온을 정상 한계 내로 유지하였다. 성공적인 폐색 및 재관류를 결정하기 위해, 레이저 도플러(Doppler)를 사용하였다. 레이저 도플러 프로브를 MCA의 원위부 말단에 놓아 폐색 전, 동안 및 후의 뇌 혈류를 측정하였다.

부착성 태반 세포를 허혈 2일 후에 허혈 부위에 직접적으로 두개내 주사에 의해 투여하였다 (5 ㎕ 내의 약 400,000개의 세포). 래트에게 비히클 (10％ 덱스트란 및 5％ 인간 혈청 알부민) 단독, 4×10⁵ 개의 생존성 세포, 4×10⁵ 개의 생존성 세포 + 10 ㎎/㎏ 사이클로스포린 A, 또는 4×10⁵ 개의 비-생존성 세포 및 사이클로스포린 A를 투여하였다.

허혈 후 제7일 및 제14일에, 동물들을 뇌졸중-유도 운동 비대칭에 대해 분석하였다. 신체 거상 스윙 테스트 (EBST) 또는 비더슨 테스트를 사용하여 운동 비대칭을 평가하였다. [Borlongan & Sanberg, J. Neurosci 15(7):5372-5378 (1995)] 참조. EBST에서, 동물의 꼬리를 손으로 잡아 동물을 들어올리고, 스윙 거동의 빈도 및 방향을 기록하였다. 래트를 플렉시글래스(Plexiglass) 박스 내에 놓고, 약 2분 동안 적응시켰다. 래트를 꼬리 기저부로부터 약 1 인치에서 잡아서, 래트의 코가 표면으로부터 약 1 인치가 되게 하였다. 오른쪽 또는 왼쪽으로의 10° 미만의 머리 스윙으로 정의되는 수직축 또는 중간 위치로 래트를 유지시켰다. 래트가 자신의 머리를 수직축에서 오른쪽 또는 왼쪽으로 움질일 때마다 스윙을 기록하였다; 동물의 머리가 수직축으로부터 각각 오른쪽 또는 왼쪽으로 10° 이상 움직였을 때 오른쪽 스윙 또는 왼쪽 스윙을 계수하였다. 래트가 특정 쪽으로 더 노력한 경우, 단일 스윙만이 기록되었다. 단일 스윙 후, 동물을 다시 플렉시글래스 박스 내에 놓고, 30초 동안 자유롭게 이동하도록 한 후 다시 테스트하였다. 이러한 단계를 각각의 동물에 대해 20회 반복하였다 (조건 당 10마리의 동물).

전체 스윙 횟수를 계수하였고, 오른쪽 및 왼쪽 스윙의 수도 계수하였다. 스윙 횟수가 70％ 이상이면 스윙 거동이 편향된 것으로 간주되었다. 이원 변량 분석 (ANOVA)을 사용하여 결과를 분석하였고, 튜키(Tukey) HSD (정직한 유의차(honestly significant difference)) 테스트를 사용하여 사후 테스트를 수행하였다.

래트에서의 신경학적 결손의 태반 세포-유도 복구를 비더슨 신경학적 테스트를 사용하여 또한 평가하였고, 이는 감각운동 업무를 측정한다. [Bederson et al., Stroke 17:472-6 (1986)]; [Altumbabic, Stroke 29:1917-22 (1998)] 참조.

비더슨 테스트를 위해, 각각의 래트에 대한 신경학적 점수를 하기가 포함되는 4가지 테스트를 사용하여 수득하였다: (a) 자발적으로 같은쪽으로 회전하는 것을 관찰함 - 0점 (회전하지 않음) 내지 3점 (계속 회전함)으로 등급화; (b) 뒷다리가 2 내지 3 ㎝ 옆으로 옮겨진 후 이를 복위하는 동물의 능력을 측정하는, 반대쪽 뒷다리 움츠림 - 0점 (즉각적인 복위) 내지 3점 (수분 후 복위 또는 복위하지 않음)으로 등급화; (c) 평균대 걷기 능력 - 2.4 ㎝ 폭, 80 cm 길이의 평균대를 잘 건너는 래트에 대해 0점 내지 이러한 평균대에서 10초 동안 머무르지 못하는 래트에 대해 3점으로 등급화; 및 (d) 2 ㎜ 직경 강철 막대에 매달리는 능력을 측정하는, 양쪽 앞발 움켜잡기 - 정상적인 앞발 움켜잡기 거동을 나타내는 래트에 대해 0점 내지 앞발로 움켜잡을 수 없는 래트에 대해 3점으로 등급화. 제7일 및 제14일의 평가일에 약 15분의 기간에 걸쳐 수행된 4가지 테스트 모두로부터의 점수를 합쳐서, 0점 내지 12점의 신경학적 결손 점수를 제공하였고, 이때 더 낮은 점수는 신경학적으로 더욱 정상인 래트를 가리킨다.

결과

허혈 유도 직전인 제0일에, 모든 동물은 대략 정상적인 (편향되지 않은) 스위 거동을 나타냈다 (도 1, 기준선). 태반 세포 투여일인 허혈 2일 후, 예상대로, 모든 동물이 스윙 거동에서 거의 100％의 허혈-유도 편향을 나타냈다 (도 1). 제7일 및 제14일에, 생존성 태반 세포가 제공된 동물들이 유의한 개선을 나타내어, 각각 약 65％ 및 60％ 스윙 편향이 실연되었다 (도 1, 제7일 및 제14일). 비-생존성 태반 세포 및 사이클로스포린 A, 또는 비히클 단독이 제공된 동물은 통계적으로 유의한 개선을 나타내지 않았다.

허혈 유도 전에 제0일에 평가된 래트는 모두 신경학적으로 정상이었고, 비더슨 테스트에서 결손 점수가 0점이었다 (도 2, 기준선). 단리된 태반 세포가 투여된 날인 허혈 유도 2일 후, 비히클만 제공된 래트는 약 2.5점의 총계 평균 결손 점수를 나타냈다 (도 2, 제2일). 제7일 및 제14일에, 태반 세포가 제공된 래트는 신경학적 결손 점수에서 통계적으로 유의한 개선을 나타내어, 점수가 약 2.5점에서 각각 약 1.7점 및 1.1점으로 개선되었다. EBST와 같이, 비히클 단독 또는 비-생존성 태반 세포 및 사이클로스포린 A가 제공된 래트는 신경학적 결손 점수에서 통계적으로 유의한 개선을 나타내지 않았다.

결론적으로, 허혈의 인가된 동물 모델에서 허혈 유도 2일 후 4×10⁵ 개의 인간 태반 세포를 투여하는 것이 모델 동물에서 신경학적 기능을 유의하게 개선한다는 것이 2가지 신경학적 결손 테스트에 의해 실연되었다. 태반 세포에 대한 임의의 숙주 면역 반응을 억제하기 위한 사이클로스포린 A의 투여는 태반 세포로 인한 신경학적 개선에 필요한 것으로 보이지 않았다.

6.2 실시예 2: 정맥내 투여된 단리된 태반 세포를 사용한 뇌졸중의 치료

본 실시예는 뇌 또는 CNS 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴와 관련된 증상, 예를 들어, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상의 치료에서 단리된 태반 세포를 정맥내 투여하는 것의 효능을 실연한다. 예를 들어, 여기에서 제시되는 결과는 태반 세포의 정맥내 투여가 비-생존성 인간 태반 세포가 제공된 동물에 비교하여 생존성 인간 태반 세포가 투여된 동물에서 운동 테스트 및 신경학적 테스트 양쪽 모두에서 용량-의존적 거동 회복을 촉진한다는 것을 가리킨다.

단린된 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ 조직 배양 플라스틱-부착성 태반 세포를 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 효소에 의한 소화에 의해 수득하였다. 스프라그-돌리 래트를 뇌졸중 모델로 사용하였고, 중간 동맥 폐색을 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 폐색 후 제2일에, 대상 래트에게 약 5 ㎕ 비히클 (10％ 덱스트란 및 5％ 인간 혈청 알부민) 내의 4×10⁵ 개, 1×10⁶ 개, 4×10⁶ 개, 또는 8×10⁶ 개의 태반 세포, 또는 대조군으로서의 비히클 내의 비-생존성 세포를 투여하였다. 수술 전 제0일, 및 수술 후 제2일, 제14일, 제28일, 제56일 및 제84일에 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 신체 거상 스윙 테스트 (EBST)에 의해 래트를 평가하였다. 하기에 대해 대상 래트가 평가되는 변형된 비더슨 테스트를 수행하였다: (1) 뒷다리가 2 내지 3 ㎝ 옆으로 옮겨진 후 이를 복위하는 동물의 능력을 측정하는, 뒷다리 움츠림 - 0점 (즉각적인 복위) 내지 3점 (수분 후 복위 또는 복위하지 않음)으로 등급화; (2) 평균대 걷기 능력 - 2.4 ㎝ 폭, 80 cm 길이의 평균대를 잘 건너는 래트에 대해 0점 내지 이러한 평균대에서 10초 동안 머무르지 못하는 래트에 대해 3점으로 등급화; 및 (3) 2 ㎜ 직경 강철 막대에 매달리는 능력을 측정하는, 양쪽 앞발 움켜잡기 - 정상적인 앞발 움켜잡기 거동을 나타내는 래트에 대해 0점 내지 앞발로 움켜잡을 수 없는 래트에 대해 3점으로 등급화. 각각의 평가일에 약 15분의 기간에 걸쳐 수행된 3가지 테스트 모두로부터의 점수를 합쳐서, 평균 신경학적 결손 점수를 제공하였다 (가능한 최대 점수: 9점 ÷ 3가지 테스트 = 3점). EBST 및 비더슨 테스트의 결과를 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 이원 변량 분석 (ANOVA) 튜키 HSD 테스트에 의해 평가하였다.

부검 및 태반 세포의 이식 및 분화 평가를 위해 제84일에 래트를 사망시켰다. 간략하게, 20 ㎛ 냉동미세절단 조직 절편을 40× 확대로 검사하였고, PC-기반 이미지 툴 컴퓨터 프로그램을 사용하여 디지털화하였다. 뇌 절편을 맹검-코드화하였다. 조직 절편을 표준 ABC 방법을 사용하여 프로세싱하였다. 인간 태반-유래 줄기 세포 이식편 생존에 대한 세포 이식 및 분화 지수를 인간 특이적 항체 HuNu를 사용하여 평가하였고, 이는 설치류 세포 표면 마커 또는 기타 설치류 단백질과 교차 반응하지 않는다. 세포 이식편에서의 뉴런 표현형의 발현을 검출하기 위해, 뉴런 마커 MAP2를 사용하는 면역조직화학 분석이 사용되었다. 추가적인 뇌 절편을 GFAP 및 O4에 대해 프로세싱하여, 이식된 세포의 아교세포 및 희소돌기아교세포 표현형 발현을 드러냈다.

인간 태반-유래 세포의 정맥내 이식은 면역억제를 필요로 하지 않았다.

이러한 연구에 포함된 모든 동물은 기준선에서 정상적인 거동을 나타냈고, 뇌졸중 2일 후, 이식 전에 성공적인 대뇌 허혈 유도 기준에 도달하였다. 뇌졸중 후 제7일의 가장 빠른 이식후 테스트 시점에서 시작하여, 거동 테스트는 비-생존성 인간 태반-유래 세포가 제공된 뇌졸중 동물에 비해 생존성 인간 태반-유래 세포가 제공된 뇌졸중 동물에서 운동 및 신경학적 기능 양쪽 모두에서 용량-의존적인 유의한 개선을 드러냈다. 뇌졸중 후 84일까지의 시간에 걸쳐, 생존성 인간 태반-유래 세포가 제공된 뇌졸중 동물에서 양쪽 업무 모두에서의 추가적인 개선이 증가하는 경향이 있었다. 비-생존성 세포가 제공된 동물을 포함하여 어떠한 이식 동물에서도 뇌졸중-유도 거동 결손의 검출가능한 악화가 없었다. 이식편 성숙 기간 동안, 비-생존성 세포가 제공된 동물에서 자발적으로 거동이 회복되는 일반적인 경향이 있었지만, 이러한 비-특이적이고 이식편에 의해 매개되지 않은 기능 개선은 이식 수술 전 (즉, 뇌졸중 후 제2일)과 비교하여 통계적 유의성에 도달하지 않았다.

8백만 개의 고용량의 생존성 세포가 제공된 뇌졸중 동물이 이식후 초기 기간에 운동 및 신경학적 업무 양쪽 모두에서 가장 로버스트(robust)한 개선을 명확하게 나타냈다. 그러나, 시간이 지남에 따라, 더 낮은 용량의 생존성 세포가 제공된 뇌졸중 동물도 8백만 개의 고용량의 생존성 세포에 일반적으로 필적하는 거동 결손의 충분한 약화를 나타냈다.

허혈 유도 전에 제0일에 평가된 래트는 모두 신경학적으로 정상이었고, 결손 점수가 0점이었다 (도 3, 기준선). 태반 줄기 세포 투여일인 허혈 유도 2일 후, 예상대로, 모든 동물이 스윙 거동에서 거의 100％의 허혈-유도 편향을 나타냈다 (도 3). 생존성의 단리된 태반 세포가 제공된 동물은 대조군에 비해 제7일, 제14일, 제28일, 제56일 및 제84일 각각에 대해 EBST에서 유의한 용량-의존적 개선을 나타냈고, 추가적으로 용량들 간에 유의한 개선을 나타냈고 (p < 0.01), 단 모든 날짜에 대해 4×10⁶ 개 대 8×10⁶ 개의 단리된 태반 세포, 및 제7일의 4×10⁵ 개 대 1×10⁶ 개의 단리된 태반 세포 (p = 0.0454)는 예외였다. 도 3 참조. 비-생존성의 단리된 태반 세포가 제공된 동물은 대조군에 비해 통계적으로 유의한 개선을 나타내지 않았다.

비더슨 테스트에 대해, 허혈 유도 전에 제0일에 평가된 래트는 모두 신경학적으로 정상이었고, 결손 점수가 0점이었다 (도 4, 기준선). 단리된 태반 세포가 투여된 날인 허혈 유도 2일 후, 비-생존성 세포만 제공된 래트는 약 2.5 - 3.0점의 총계 평균 결손 점수를 나타냈다 (도 2, 제2일). 제7일, 제14일, 제28일, 제56일 및 제84일에, 단리된 태반 세포가 제공된 래트는 비-생존성 세포가 제공된 래트에 비해 신경학적 결손 점수에서 통계적으로 유의한 개선을 나타냈다 (각각의 경우에 p < 0.01). 추가적으로, 제7일 (4×10⁵ 개 대 8×10⁶ 개 및 1×10⁶ 개 대 8×10⁶ 개), 및 제14일 및 제28일 (4×10⁵ 개 대 4×10⁶ 개 및 4×10⁵ 개 대 8×10⁶ 개) 각각에 개선이 유의하게 (p < 0.01) 용량-의존적이었다. EBST와 같이, 비히클 단독 또는 비-생존성의 단리된 태반 세포 및 사이클로스포린 A가 제공된 래트는 신경학적 결손 점수에서 통계적으로 유의한 개선을 나타내지 않았다.

따라서, 단리된 태반 세포의 정맥내 투여는 운동 및 신경학적 테스트 양쪽 모두에서 용량-의존적 거동 회복을 촉진한다. 기능 개선이 빠르게는 투여 7일 후에 분명하였고, 이식 후 3개월의 기간에 걸쳐 더 양호하게 회복되는 경향이 증가하였다. 어떠한 대상 래트에서도 명백한 불리한 거동 부작용이 관찰되지 않았다.

따라서, 여기에서 제시된 결과는 뇌 내부 또는 주변에서의 혈류 파괴와 관련된 증상의 치료를 위한 단리된 태반 세포의 정맥내 투여의 안정성 및 효능을 실연한다. 예를 들어, 이식 동물들이 뇌졸중-유도 거동 이상의 어떠한 악화도 나타내지 않는다. 비-생존성 인간 태반-유래 세포가 제공된 동물과 비교하여, 생존성 세포가 제공된 동물은 뇌졸중-유도 거동 결손에서의 유의한 개선 및 허혈 반음영(ischemic penumbra) 내의 숙주 세포의 유의한 구출을 나타냈다. 또한, 어떠한 이식 동물에서도 종양 또는 이소성 조직 형성이 검출되지 않았다.

6.3 실시예 3: 정맥 경로에 의한 태반 세포를 사용한 뇌졸중의 치료 - 또 다른 신경학적 테스트에 의한 평가

본 실시예는 거상 스윙 테스트 및 비더슨 테스트 이외의 신경학적 테스트에 의해 평가되는, 태반 줄기 세포를 사용하여 뇌졸중을 치료하는 것의 유효성을 실연한다.

6.3.1 신경학적 테스트

중간 대뇌 동맥 폐색 수술을 위스타(Wistar) 래트 상에 하기와 같이 수행하였다. 수컷 위스타 래트 (270-300 g, 2-3개월령)에게 수술용 나일론 필라멘트를 속 목동맥 (ICA) 내로 전진시켜 MCA의 기원을 차단함으로써 유도된 2시간의 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAo)을 적용하였다. 간략하게, 래트를 전-마취를 위해 병에서 2％ 이소플루란으로 마취하고, 변형 플루오텍(FLUOTEC) 3 기화기 (프라서 할레이크(Fraser Harlake) (Orchard Park, New York))에 연결되어 조절되는 안면 마스크를 사용하여 2:1 N₂O:O₂ 혼합물 내의 1.5％ 이소플루란으로 자발적으로 호흡시켰다. 직장 온도를 피드백 조절되는 물 가열 시스템 (재순환 패드 및 K 모듈이고, 직장내 T형 열전대를 통해 모니터링됨)을 사용하여 수술 절차 전반에 걸쳐 37℃로 유지시켰다. 목의 중앙에서 1 ㎝를 절개하고, 오른쪽 총 목동맥 (CCA), 바깥 목동맥 (ECA), 및 속 목동맥 (ICA)을 수술용 현미경 (칼 자이스, 인크. (Thornwood, NY)) 하에 노출시켰다. 미세수술 클립 (코드만 & 셔틀프, 인크. (Randolf, MA))을 사용하여 CCA 및 ICA를 일시적으로 집었다. 불꽃 가까이에서 가열함으로써 팁이 둥글게 된 4-0 나일론 봉합사를 소형 천자를 통해 ECA 내로 삽입하였다. 미세수술 클립을 제거하였다. 동물의 체중에 따라 결정되는 길이의 나일론 봉합사를 ECA로부터 ICA의 내강 내로 봉합사가 MCA의 기원을 차단할 때까지 부드럽게 전진시켰다. 나일론 필라멘트를 ICA 내부에서 2시간 동안 유지시키고, 목 절개부를 닫았다. 동물을 우리로 옮겨 깨어나게 하였다. 2시간의 MCAo 후, 동물들을 이소플루란으로 다시 마취시키고, 팁이 ECA의 내강을 빠져나올 때까지 필라멘트의 회수에 의해 혈류 복원을 수행하였다. 그후, 절개부를 닫았다.

부착성 CD10⁺, CD34^-, CD105⁺, CD200⁺ 조직 배양 플라스틱-부착성 태반 세포를 정맥내 경로 (꼬리 정맥 주입)에 의해 투여하였다. MCAo가 적용된 동물들을 5가지 군 중 하나로 무작위화하였다: (1) 세포 대조군으로서의 인간 피부 섬유모세포, (2) 덱스트란 대조군, (3) 1×10⁶ 개, (4) 4×10⁶ 개 및 (5) 8×10⁶ 개 용량의 태반 세포 (MCAo 1일 후 투여됨). 거동 테스트 (부착물 테스트, 풋-폴트 테스트 및 mNSS)를 연구 치료 전의 MCAo 후 제1일 (기준선), 및 MCAo 후 제7일, 제14일, 제21일, 제28일, 제42일, 및 제56일에 수행하였다. 기능 회복에 대한 태반 세포의 용량-응답 효과를 하기 기술되는 3가지 거동 테스트로부터 측정하였다.

변형된 신경학적 중증도 점수 (mNSS 표 1)가 0점 내지 18점의 척도로 등급화된다 (정상 점수 0; 최대 결손 점수 18, 표 1). 테스트 수행 불능 또는 테스트된 반사의 결여에는 1점이 주어진다; 따라서, 점수가 높을수록 손상이 더욱 중증이다.

부착물-제거 몸감각 테스트: 모든 래트를 테스트 환경에 친숙하게 하였다. 초기 테스트에서, 부착물이 후면에 있는 2개의 소형 종이 조각 (동일한 크기, 1개월 이내의 테스트에 대해서는 113.1 ㎟; 1개월 이후의 테스트에 대해서는 56.6 ㎟)이 각각의 앞다리의 발목 상의 원위-요골 영역을 차지하는 양측 촉각 자극으로서 사용되었다. 그후, 래트를 우리로 돌려보냈다. 각각의 자극을 앞다리로부터 제거하는 시간을 5회/일의 시험에 대해 기록하였다.

풋-폴트 테스트: 동물들을 단색 바닥층보다 2.5 ㎝ 더 높은 거상된 격자 바닥 (45 ㎝ × 30 ㎝)에 놓았고, 이때 구명의 직경은 2.5 ㎝ × 2.5 ㎝였다. 동물들은 철사 프레임 상에 발을 놓으면서 격자 위에서 이동하려는 경향이 있다. 동물이 발을 부정확하게 놓은 경우, 앞다리가 격자 내의 구멍들 중 하나 사이로 떨어진다. 발이 떨어지거나 철사 사이에서 미끄러지는 경우, 이를 풋 폴트로 기록하였다. 총 100걸음 (각각의 앞다리의 이동)을 계수하였고, 왼쪽 앞다리에 대한 풋 폴트 총 횟수를 기록하였으며, 총 걸음수에 대한 왼쪽 발의 풋 폴트의 백분율을 결정하였다.

결과:

변형된 신경학적 중증도 점수 (mNSS): 4.0×10⁶ 개의 세포로 치료된 동물 군이 제7일-제56일에 비히클 대조군에 비해 mNSS 점수에서 개선을 나타냈다 (p <0.05) (도 5).

부착물-제거 몸감각 테스트: 4.0×10⁶ 개의 세포로 치료된 동물 군이 치료 후 제14일에 비히클 대조군 또는 세포 대조군에 비해 부착물-제거 몸감각 테스트에서 개선을 나타냈고 (p <0.05), 연구 기간에 걸쳐 개선이 지속되었다 (도 6). 추가적으로, 8.0×10⁶ 개의 세포로 치료된 동물이 치료 후 제42일 및 제56일에 개선을 나타냈다 (p <0.05).

풋-폴트 테스트: 4.0×10⁶ 개의 세포로 치료된 동물 군이 치료 후 제7일에 비히클 대조군 또는 세포 대조군에 비해 개선을 나타냈고, 개선이 연구 기간에 걸쳐 지속적이었다 (도 7).

상기 결과들을 기초로, 뇌졸중의 치료가 섬유모세포 대조군 및 덱스트란 대조군에 비해 래트에서 뇌졸중 후의 기능 결과를 용량-의존적으로 개선한다는 것이 실연되었다. 이러한 연구에서 사용된 래트에서의 태반 줄기 세포 치료의 최적 용량은 4×10⁶ 개인 것으로 결정되었다.

6.3.2 증식 및 시냅스 가소성 연구

태반 줄기 세포의 투여가 혈관신생을 촉진하였는지 여부를 평가하기 위해, 5-브로모-2-데옥시우리딘 (BrdU; 0.007 N NaOH 생리식염수 내의 50 ㎎/㎏, 시그마 (St, Louis MO))을 MCAo 24시간 후 시작하여 14일 동안 매일 실험 동물 내로 주사하였다. 실험 동물을 희생시키고, 폐색된 영역의 뇌 조직 절편을 수득하고, BrdU으로 염색하였다. 실험 동물을 케타민 (80 ㎎/㎏) 및 자일라진 (13 ㎎/㎏ 복강내 주사)으로 다시 마취하고, 발 꼬집기 반사에 의해 마취 깊이를 모니터링하였다. 마취 후, 2 ㎖ 혈액을 심장으로부터 회수하였다. 혈청을 제조하고, -20℃에서 보관하였다. 그후, 시몬 바리스탈틱(Simon Varistaltic) 펌프를 사용하여 염수 (래트에 대해 약 200 ㎖) 관류에 이어서 4％ 파라포름알데히드 (래트에 대해 약 50 ㎖) 관류로의 심장 천자를 동물에게 적용하였다.

뇌를 절개하고, 48-72시간 동안 4％ 파라포름알데히드에서 고정시킨 후, 면역염색을 위해 파라핀에 매립하였다. 래트 뇌 매트릭스 (액티베이셔널 시스템스 인크. (Warren, MI))를 사용하여, 각각의 전뇌를 2 ㎜ 두께의 관상 블럭으로 동물 당 총 7개의 블럭으로 절단하였다. 최적 용량 (4×10⁶ 개의 세포)의 태반 줄기 세포 치료, 덱스트란 MCAo 대조군 및 FBC 대조군으로부터 수득된 뇌 절편이 면역염색에 사용되었다. 표준 파라핀 블럭을 병변 중심부로부터 수득하였다 (브레그마(bregma) -1 ㎜에서 +1 ㎜). 일련의 6 ㎛ 두께 절편을 블럭으로부터 절단하였다. 3개의 관상 뇌 절편이 각각의 면역조직화학 염색에 사용되었다. 증식 중인 세포 마커인 BrdU에 대한 항체 (1:100, 뵈링거 만하임 (Indianapolis, IN)), 폰 빌레브란트 인자 (vWF, 1:400; 다코 (Carpenteria, CA)), 더블코르틴 (DCX, 이동 중인 신경모세포의 마커) (C-18, 염소 폴리클로날 IgG 항체, 1:200 희석, 산타 크루즈) 및 시냅토피신 (뵈링거 만하임 바이오케미카, 모노클로날 항체, 클론 SY 38, 1:40) 면역염색을 수행하였다. MCID 컴퓨터 영상화 분석 시스템 (이미징 리서치 (St. Catharines, Canada))을 통해 40× 대물렌즈 (올림푸스 BX40)를 사용하여 BrdU 면역염색 절편을 디지털화하였다. 허혈성 병변의 경계 영역 내에 위치하는 총 10개의 비대하고 벽이 얇은 혈관 내의 BrdU 양성 세포를 각각의 절편에서 계수하였다.

시냅토피신 면역반응성의 반-정량을 위해, 허혈 반음영 (피질 및 선조체)으로부터의 면역염색된 관상 절편 및 8개의 영상 영역을 20× 대물렌즈 하에 디지털화하였다. 양성 영역을 측정하였다. 양성 영역의 백분율로 데이터를 제시하였다. 결과:

FBC 대조군 및 덱스트란 대조군에 비해 허혈성 뇌에서 내피 세포 증식 및 혈관 밀도를 증가시킴으로써 측정되는 바와 같이 4×10⁶ 개의 태반 줄기 세포의 투여가 혈관형성을 유의하게 증가시키는 것으로 발견되었다 (도 8). 또한, FBC 대조군에 비해 허혈성 뇌에서의 증가된 시냅토파인신 발현에 의해 측정되는 바와 같이 4×10⁶ 개의 태반 줄기 세포의 투여가 시냅스 가소성을 유의하게 증가시킨다.

6.4 실시예 4: 다능성 태반 세포를 사용한 뇌졸중의 치료

62세의 개인이 좌측 상에서의 편마비; 안면 좌측 상에서의 근육 쇠약; 및 신체 좌측 상에서의 무감각 및 감각 감소를 나타냈다. 증상들이 제시 전 2시간에 걸쳐 발생되었다. 뇌졸중으로 진단되었다. 진단 1시간 이내의 개인에게 100-200 ㎖의 약 1×10⁷ 개의 세포/㎖ 농도의 다능성, 조직 배양 플라스틱-부착성 태반 세포를 투여하였다. 투여된 다능성 태반 세포는 >90％ CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺인 것으로 분석되었다. 투여 12시간 후, 24시간 후, 48시간 후, 4일 후 및 7일 후에 좌측 상에서의 근육 강도 또는 무감각에서의 식별가능한 개선에 대해 개인을 평가하였다. 선택적으로 2차 투여가 이루어졌다.

6.5 실시예 5: 뇌졸중, 저산소성 손상 또는 무산소성 손상의 치료를 위한 태반 세포 집단

다능성 CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ 및 CD200⁺ 태반 세포를 여과하여 덩어리를 제거하고, 물 내에 5.5％ (w/v) 덱스트란-40, 10％ (w/v) 인간 혈청 알부민 및 5％ (v/v) 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함하는 용액에서 10±3×10⁶ 개의 세포/㎖가 되게 하였다. 제제 내의 총 세포수는 세포 약 4-7×10⁹ 개였다.

이렇게 제제화된 세포를 50 ㎖ 동결 컨테이너 내에 20 ㎖ 분취량으로 분할하고, 동결시켰다. 분취된 세포를 사용하기 위해 1000 ㎖ 주입 백 내로 염화나트륨 내의 10％ 덱스트란-40으로 희석하였다.

등가물:

본원에 개시된 조성물 및 방법은 본원에 기술된 구체적 실시양태들에 의해 범주가 한정되지 않는다. 실제로, 기술된 것들에 더하여 조성물 및 방법의 다양한 변형이 상기의 상세한 설명 및 동반된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이같은 변형은 첨부된 청구항의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.

다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되고, 이들 각각의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

Claims

CD10⁺, CD34^-, 및 CD105⁺이거나;
CD200⁺ 및 HLA-G⁺이거나;
CD73⁺, CD105⁺, 및 CD200⁺이거나;
CD200⁺ 및 OCT-4⁺이거나;
CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이거나;
CD73⁺ 및 CD105⁺이고, 줄기 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체(embryoid-like body)의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; 또는
OCT-4⁺이고, 줄기 세포를 포함하는 태반 세포들의 집단이 배아-유사체의 형성을 허용하는 조건 하에 배양되는 경우 상기 집단에서 하나 이상의 배아-유사체의 형성을 촉진하거나; 또는
이들의 임의의 조합인
단리된 부착성 인간 태반 세포를 유효량으로 뇌 내부 또는 주변에서 혈류가 파괴된 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 뇌 내부 또는 주변에서 혈류가 파괴된 개체를 치료하는 방법.