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KR20210020132A - 무세포계에서 dna를 편집하는 방법 - Google Patents

무세포계에서 dna를 편집하는 방법 Download PDF

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KR20210020132A
KR20210020132A KR1020217001327A KR20217001327A KR20210020132A KR 20210020132 A KR20210020132 A KR 20210020132A KR 1020217001327 A KR1020217001327 A KR 1020217001327A KR 20217001327 A KR20217001327 A KR 20217001327A KR 20210020132 A KR20210020132 A KR 20210020132A
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Abstract

무세포계에서 DNA를 편집하는 방법은, (1) 무세포계에서 DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 공정; 및 (2) 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를 무세포계에서 증폭시키는 공정;을 포함하고, 여기에서 상기 DNA는 20℃∼80℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭된다.

Description

무세포계에서 DNA를 편집하는 방법
본 발명은 무세포계에서 DNA를 편집하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2018년 7월 30일에 출원된 일본 특허출원 2018-142274호에 기초해 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
게놈 편집은 표적 서열 특이적 뉴클레아제를 이용해 의도한 대로 표적 유전자를 개변하는 기술이다. 이용 가능한 뉴클레아제로는 CRISPR-Cas9, ZFN, TALEN 등의 엔도뉴클레아제가 알려져 있다. 게놈 편집 기술에 의해, 세균에서 인간에 이르기까지 많은 생물종에서, 세포내에서 목표한 DNA 서열을 편집하는 것이 가능해지고 있다(비특허 문헌 1∼3). 표적 서열 특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중가닥을 절단하는 효소인 것으로부터, 목적하는 편집된 게놈을 얻기 위해서는, DNA 이중가닥 절단에 이어 세포내에서의 DNA 수복 프로세스를 거칠 필요가 있다. 게놈에 새로운 DNA 서열을 삽입하는 경우에는 상동 재조합에 의한 수복 프로세스가 기능한다. 절단 부위에 상동적인 서열을 포함하는 DNA 단편을 DNA 이중가닥 절단시에 세포내에 존재하게 함으로써, 상동 서열을 이용한 재조합에 의해 원하는 DNA 서열을 절단 부위에 삽입할 수 있다. 또한, 수 염기의 짧은 서열을 결실시키는 경우에는, 비상동 말단 결합(NHEJ)에 의한 수복 프로세스가 기능한다. 이 경우에는 절단 부위가 NHEJ로 수복될 때 염기의 결실이나 변이가 일어나게 된다.
표적 서열 특이적 엔도뉴클레아제에 의한 DNA 이중가닥의 절단은, 세포내에서의 이들 수복 프로세스의 시초가 될 뿐만 아니라, 편집되지 않고 남겨진 DNA를 선택적으로 불활성화하는 카운터 셀렉션으로서의 기능도 담당하고 있다. 즉, 편집 후의 DNA는 더이상 표적 서열 특이적 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 일이 없기 때문에, 세포내에서 복제 프로세스를 거쳐 증폭하는데 있어서, 편집전의 DNA는 이중가닥 절단의 공격에 계속적으로 노출되어 세포내에서의 증폭이 억제된다.
대장균에서는 표적 서열 특이적 엔도뉴클레아제를 사용하지 않고, 세포내에서 DNA 서열을 개변하는 것도 가능하다. 그 예로는, 프로파지(prophage)의 RecET 재조합 효소를 이용한 계(비특허 문헌 4)나, λ 파지의 Red 재조합 효소를 이용한 계(비특허 문헌 5 및 6)가 알려져 있다. 이들 계에서는, 대장균내에 도입된 이중가닥 DNA 단편의 말단이 단일가닥화하고, 이 부분과 게놈상의 DNA 복제중에 노출되는 단일가닥 부분이 접합함으로써 재조합 반응이 유도된다. 이중가닥 DNA 단편이 아니라도, 짧은 단일가닥 DNA, 즉 올리고 DNA를 대장균내에 도입하는 것으로도 그 올리고 DNA가 노출 단일가닥과 접합해, 염기 치환을 게놈상에 도입하는 것이 가능하다(비특허 문헌 7).
대장균내에서의 이와 같은 올리고 DNA에 의한 염기 치환 효율은 낮지만, 최근에는 CRISPR-Cas9의 표적 서열 절단 시스템을 카운터 셀렉션으로서 이용함으로써 그 효율을 상승시키는 방법도 보고되고 있다(비특허 문헌 8).
한편, 무세포계에서 DNA를 편집하는 기술로는, 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR)을 이용한 기술이 종래부터 알려져 있다. 예를 들면, 염기 치환, 결실 또는 부가 등의 변이를 포함하는 프라이머 DNA를 이용해 PCR법에 의해 주형(template) DNA를 증폭시키거나 DNA 단편끼리의 연결 산물을 PCR법에 의해 증폭시켜, 세포를 사용하지 않고 DNA 서열을 인위적으로 편집한 산물을 조제하는 것이 가능하다.
CRISPR-Cas9에 의한 표적 서열 절단 시스템을 in vitro로 이용하는 것도 가능하다. 예를 들면, CRISPR-Cas9를 이용해 게놈의 100 kb 영역을 대장균 플라스미드에 클로닝한 것이 보고되고 있다(비특허 문헌 9). 이 보고에서는, CRISPR-Cas9에 의한 표적 부위에서의 게놈 절단 및 절단 단편과 플라스미드의 연결 반응을 시험관내에서 실시하고 있다.
또한, 무세포계에서 DNA 단편끼리를 연결하는 기술로는, In fusion법(특허 문헌 1), Gibson Assembly법(특허 문헌 2 및 3), Recombination Assembly법(특허 문헌 4) 등이 알려져 있다.
무세포계에서 DNA를 증폭시키는 기술로는 PCR법이 널리 이용되고 있지만, 사용되는 효소의 진행성(processivity)에 기인해 증폭할 수 있는 DNA의 길이에 제한이 있다. PCR법으로는, 통상, 50 kb를 초과하는 장쇄 DNA를 증폭시키기 힘들다.
이와 같은 장쇄 DNA를 무세포계에서 증폭시키는 방법으로, 복제 개시 서열(origin of chromosome(oriC))을 갖는 환상 DNA를 증폭시키기 위한 in vitro 재구성계가 보고되고 있다(특허 문헌 5∼7). 이 방법은 Replication Cycle Reaction(RCR)법으로 불리고, PCR법에 의해 증폭시키기 힘든 50 kb 이상의 장쇄 DNA를 증폭시키는 것도 가능하다.
전술한 바와 같은 세포를 이용한 DNA 편집법에서는, 배양, 반응에 필요한 효소의 세포내로의 도입 등에 고도의 기술을 필요로 할 뿐만 아니라, 많은 시간 및 노력을 필요로 한다. 또한, 편집에 의해 생기는 DNA 서열이 세포 독성을 나타내는 경우에는, 목적하는 산물을 얻을 수 없다는 문제도 생긴다. 또한, DNA를 세포에 도입하는 것 자체도 DNA가 장쇄가 될수록 곤란해진다.
특허 문헌 1: 미국 특허 제7,575,860호 명세서 특허 문헌 2: 미국 특허 제7,776,532호 명세서 특허 문헌 3: 미국 특허 제8,968,999호 명세서 특허 문헌 4: 국제 공개 제2019/009361호 특허 문헌 5: 국제 공개 제2016/080424호 특허 문헌 6: 국제 공개 제2017/199991호 특허 문헌 7: 국제 공개 제2018/159669호
비특허 문헌 1: Carroll, D. (2014) Genome Engineering with Targetable Nucleases. Annual Review of Biochemistry, 83, 409-439. 비특허 문헌 2: Mougiakos, I., Bosma, E.F., de Vos, W.M., van Kranenburg, R. and van der Oost, J. (2016) Next Generation Prokaryotic Engineering: The CRISPR-Cas Toolkit. Trends in Biotechnology, 34, 575-587. 비특허 문헌 3: Mougiakos, I., Bosma, E.F., Ganguly, J., van der Oost, J. and van Kranenburg, R. (2018) Hijacking CRISPR-Cas for high-throughput bacterial metabolic engineering: advances and prospects. Current Opinion in Biotechnology, 50, 146-157. 비특허 문헌 4: Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J.P. and Stewart, A.F. (1998) A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature genetics, 20, 123-128. 비특허 문헌 5: Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, 6640-6645. 비특허 문헌 6: Yu, D., Ellis, H.M., Lee, E.C., Jenkins, N.A., Copeland, N.G. and Court, D.L. (2000) An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, 5978-5983. 비특허 문헌 7: Ellis, H.M., Yu, D., DiTizio, T. and Court, D.L. (2001) High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98, 6742-6746. 비특허 문헌 8: Ronda, C., Pedersen, L.E., Sommer, M.O.A. and Nielsen, A.T. (2016) CRMAGE: CRISPR Optimized MAGE Recombineering. Scientific Reports, 6, 1-11. 비특허 문헌 9: Wang, H., Li, Z., Jia, R., Yin, J., Li, A., Xia, L., Yin, Y., Muller, R., Fu, J., Stewart, A.F., and Zhang, Y. (2017) ExoCET: exonuclease in vitro assembly combined with RecET recombination for highly efficient direct DNA cloning from complex genomes. Nucleic Acids Research, 10.1093/nar/gkx1296.
본 발명은, 최종적으로 DNA 편집 산물을 선택적으로 증폭시키는 공정까지 세포를 사용하지 않고 실시할 수 있는, 무세포계에서 DNA를 편집하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은, 예의 연구한 결과, 무세포계에서 등온으로 DNA를 증폭시키거나 또는 무세포계에서 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복해 DNA를 증폭시키는 기술과, 무세포계에서 이용 가능한 DNA 편집(개변) 기술을 조합함으로써, 세포를 이용하지 않고 DNA 편집 산물을 증폭시킬 수 있다는 것을 알아냈다. 또한, 미편집의 DNA를 특이적으로 절단하는 공정을 조합함으로써, DNA 편집 산물의 수율을 큰 폭으로 개선할 수 있다는 것을 알았다. 이들 지견에 근거해 한층 더 연구를 거듭하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하의 형태를 포함한다.
[1] 무세포계에서 DNA를 편집하는 방법으로서, 이하의 공정:
(1) 무세포계에서 DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 공정; 및
(2) 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를, 무세포계에서 증폭시키는 공정;을 포함하고,
여기에서 상기 DNA는 20℃∼80℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는, 상기 방법.
[2] 무세포계에서 DNA를 편집하는 방법으로서, 이하의 공정:
(1) 무세포계에서 DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 공정; 및
(2) 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를, 무세포계에서 증폭시키는 공정;을 포함하고,
여기에서 상기 DNA는 등온에서 인큐베이션하거나 또는 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는, [1]에 기재된 상기 방법.
[3] 무세포계에서 DNA를 편집하는 방법으로서, 이하의 공정:
(1) 무세포계에서 DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 공정; 및
(2) 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를, 무세포계에서 증폭시키는 공정;을 포함하고,
여기에서 상기 DNA는 20℃∼80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도에서 인큐베이션하거나 또는 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는, [1] 또는 [2]에 기재된 상기 방법.
[4] 공정 (2)를, 결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA를 특이적으로 절단하는 인공 DNA 절단 효소의 존재하에서 행하는, [1]∼[3]의 어느 하나에 기재된 방법.
[5] 인공 DNA 절단 효소가 인공 뉴클레아제 또는 RNA 유도형 뉴클레아제인, [4]에 기재된 방법.
[6] 인공 DNA 절단 효소가 CRISPR-Cas9인, [4]에 기재된 방법.
[7] DNA가 환상 DNA인, [1]∼[6]의 어느 하나에 기재된 방법.
[8] 공정 (2)가 이하의 공정:
(2-1) (a) 환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1 효소군, (b) 오카자키 절편(Okazaki fragment) 연결 반응을 촉매해, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2 효소군, 및 (c) 2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3 효소군을 함유하는 반응 용액과, 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 환상 DNA의 반응 혼합물을 조제하는 공정; 및
(2-2) 공정 (2-1)에서 조제한 반응 혼합물을, 20℃∼80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도에서 인큐베이션하거나 또는 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 공정;을 포함하는, [7]에 기재된 방법.
[9] 환상 DNA가 DnaA 활성을 갖는 효소와 결합 가능한 복제 개시 서열을 포함하는, [8]에 기재된 방법.
[10] 공정 (2)에 있어서, 환상 DNA가 롤링 써클 증폭에 의해 증폭되는, [7]에 기재된 방법.
[11] 공정 (1)이 이하의 공정:
(1-1) 인공 DNA 절단 효소를 DNA에 작용시킴으로써 해당 DNA를 표적 부위에서 절단해, 적어도 하나의 직쇄 DNA를 조제하는 공정;
(1-2) 공정 (1-1)에서 조제된 직쇄 DNA, 1종류 이상의 DNA 단편, 및 RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 갖는 단백질을 함유하는 반응 용액을 조제하는 공정; 및
(1-3) 상기 직쇄 DNA와 상기 1종류 이상의 DNA 단편을 염기서열이 상동인 영역끼리 또는 염기서열이 상보적인 영역끼리 서로 연결시켜, 주형 DNA의 표적 부위에 상기 1종류 이상의 DNA 단편이 삽입된 DNA를 형성시키는 공정;을 포함하는, [1]∼[10]의 어느 하나에 기재된 방법.
[12] 공정 (1)이 이하의 공정:
결실, 치환 또는 부가 도입용 단일가닥 DNA의 존재하에서 DNA 복제 반응을 행하는 공정을 포함하고, 여기에서 상기 단일가닥 DNA는 복제 반응의 조건하에서 해당 DNA의 표적 부위에 교잡(hybridization)할 수 있는, [1]∼[10]의 어느 하나에 기재된 방법.
[13] 공정 (2)에 있어서, DNA가 30℃ 이상에서의 인큐베이션 및 27℃ 이하에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는, [1]∼[12]의 어느 하나에 기재된 방법.
[14] 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA의 사이즈가 50 kb 이상인, [1]∼[13]의 어느 하나에 기재된 방법.
전술한 형태의 방법에 의하면, 세포를 이용하지 않고 DNA 편집 산물, 특히 장쇄 DNA 편집 산물을 증폭시키는 방법 등을 제공할 수 있다. 또한 전술한 형태의 방법에서는, 비교적 낮은 온도 조건하에서 DNA를 증폭시킬 수 있기 때문에, 종래의 DNA 증폭 기술과 조합하기 힘들었던 기술, 예를 들면 CRISPR-Cas9 등의 인공 DNA 절단 효소에 의한 서열 특이적인 DNA 절단 기술 등과 조합해, 효율적으로 DNA 편집 산물을 증폭시킬 수 있다.
도 1는, Cas9에 의한 서열 특이적 절단에 의한 장쇄 oriC DNA의 직쇄화, 상동 말단 서열을 이용한 DNA 분자 연결법(Recombination Assembly, RA)에 의한 직쇄화된 환상 DNA로의 직쇄 DNA의 삽입, 및 삽입 후의 환상 DNA의 RCR(Replication Cycle Reaction)에 의한 증폭을 나타낸 모식도이다.
도 2a는, pOri8(9.5 kb의 환상 DNA)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2b는, CRISPR-Cas9에 의해 pOri8이 서열 특이적으로 절단된 것을 나타낸 도면이다.
도 3a는, pMSR227(205 kb의 환상 DNA)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 3b는, CRISPR-Cas9에 의해 pMSR227이 서열 특이적으로 절단된 것을 나타낸 도면이다.
도 4는, CRISPR-Cas9의 존재하에서 RCR을 행함으로써 개변되지 않은 주형 DNA의 증폭을 저해하고, 목적하는 연결 산물을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 것을 나타낸 모식도이다.
도 5는, 주형 DNA를 절단하지만 lacZ가 삽입된 DNA를 절단하지 않는 CRISPR-Cas9를 반응계에 첨가해 RCR을 행함으로써, 높은 효율로 lacZ가 삽입된 환상 DNA를 증폭시킬 수 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 6a는, lacZ(3.3 kb)가 삽입된 pMSR227(205 kb)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 6b는, 제한 효소 XhoI 절단에 의해, lacZ가 삽입된 pMSR227의 구조를 확인한 도면이다.
도 7은, 실시예 3의 2 단편의 장쇄 DNA끼리를 2개의 어댑터 단편(adaptor fragment)을 개재한 RA에 의해 연결 환상화하는 공정을 나타낸 모식도이다.
도 8은, 실시예 3의 RA-RCR에 의한 장쇄 환상 DNA의 증폭을 나타낸 도면이다.
도 9는, 실시예 3의 183 kb의 연결 산물로 형질 전환한 대장균으로부터 회수한 플라스미드의 사이즈를 확인한 도면이다.
도 10은, 실시예 3에서 얻어진 183 kb의 연결 산물의 구조를 확인한 도면이다.
도 11a는, 실시예 4에서 사용한 lacZ 변이 pPKOZ(pPKOZ ins 및 pPKOZ mis)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 11b는, 실시예 4의 실험계를 나타낸 도면이다.
도 12는, 실시예 4에서 사용한 lacZ wt, lacZ ins 및 lacZ mis의 개시 코돈 하류의 부분 서열(각각의 염기서열을 서열 번호 58∼60에 나타낸다), 및 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드(30 mer)의 서열(서열 번호 17, SUE1355)을 나타낸 도면이다.
도 13a는, 염기 치환이 도입된 플라스미드의 증폭 효율(즉, 청색 콜로니의 비율)에 대한, 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드의 길이 및 농도의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 전기 영동의 결과를 나타낸다.
도 13b는, 염기 치환이 도입된 플라스미드의 증폭 효율(즉, 청색 콜로니의 비율)에 대한, 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드의 길이 및 농도의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과를 나타낸다.
도 14a는, 염기 치환이 도입된 플라스미드의 증폭 효율(즉, 청색 콜로니의 비율)에 대한, 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드의 농도의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 전기 영동의 결과를 나타낸다.
도 14b는, 염기 치환이 도입된 플라스미드의 증폭 효율(즉, 청색 콜로니의 비율)에 대한, 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드의 농도의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과를 나타낸다.
도 15a는, 염기 치환 도입전의 플라스미드를 특이적으로 절단하는 CRISPR-Cas9를 반응계에 첨가해 RCR을 행함으로써, 100%에 가까운 염기 치환 도입율이 얻어진 것을 나타낸 도면이다. 전기 영동의 결과를 나타낸 도면이다.
도 15b는, 염기 치환 도입전의 플라스미드를 특이적으로 절단하는 CRISPR-Cas9를 반응계에 첨가해 RCR을 행함으로써, 100%에 가까운 염기 치환 도입율이 얻어진 것을 나타낸 도면이다. 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과를 나타낸다.
도 16a는, p0ri93Zins의 구조를 나타낸 도면이다.
도 16b는, 장쇄 DNA에 대해, 염기 치환이 도입된 플라스미드의 증폭 효율(즉, 청색 콜로니의 비율)에 대한, 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드의 농도의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 전기 영동의 결과를 나타낸다.
도 16c는, 장쇄 DNA에 대해, 염기 치환이 도입된 플라스미드의 증폭 효율(즉, 청색 콜로니의 비율)에 대한, 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드의 농도의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과를 나타낸다.
도 17a는, 장쇄 DNA에 대해, 염기 치환 도입전의 플라스미드를 특이적으로 절단하는 CRISPR-Cas9를 반응계에 첨가해 RCR을 행함으로써, 100%에 가까운 염기 치환 도입율이 얻어진 것을 나타낸 도면이다. 전기 영동의 결과를 나타낸다.
도 17b는, 장쇄 DNA에 대해, 염기 치환 도입전의 플라스미드를 특이적으로 절단하는 CRISPR-Cas9를 반응계에 첨가해 RCR을 행함으로써, 100%에 가까운 염기 치환 도입율이 얻어진 것을 나타낸 도면이다. 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과를 나타낸다.
도 18a는, 실시예 9에서 사용한 pPKOZins의 개시 코돈 근방의 부분 서열(서열 번호 61), 및 개변(3 염기 치환)용 올리고 뉴클레오티드(60 mer)의 서열(서열 번호 56)을 나타낸 도면이다.
도 18b는, 실시예 9에서 사용한 pPKOZ의 개시 코돈 근방의 부분 서열(서열 번호 62), 및 개변(4 염기 삽입)용 올리고 뉴클레오티드(60 mer)의 서열(서열 번호 57)을 나타낸 도면이다.
도 18c는, 3 염기 치환된 또는 4 염기 삽입된 플라스미드의 증폭 효율(3 염기 치환의 경우에는 청색 콜로니, 4 염기 삽입의 경우에는 백색 콜로니의 비율)에 대한, 개변(3 염기 치환 또는 4 염기 삽입)용 올리고 뉴클레오티드의 농도의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 전기 영동의 결과를 나타낸다.
도 18d는, 3 염기 치환된 플라스미드의 증폭 효율(즉, 청색 콜로니의 비율)에 대한, 개변(3 염기 치환)용 올리고 뉴클레오티드의 농도의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과를 나타낸다.
도 18e는, 4 염기 삽입된 플라스미드의 증폭 효율(즉, 백색 콜로니의 비율)에 대한, 개변(4 염기 삽입)용 올리고 뉴클레오티드의 농도의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과를 나타낸다.
도 18f는, pPKOZ(wt)의 EcoRI 절단 부위를 나타낸 도면이다.
도 18g는, pPKOZ4ins의 EcoRI 절단 부위를 나타낸 도면이다.
도 18h는, 4 염기 삽입된 플라스미드를 제한 효소 처리에 의해 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 전기 영동의 결과를 나타낸다.
도 19a는, pK3OV_insAC의 구조를 나타낸다.
도 19b는, 실시예 10의 실험계를 나타낸 도면이다.
도 19c는, 실시예 10에서 사용한 pP3OV_insAC의 vioA ins의 서열(서열 번호 68), 및 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드(60 mer)의 서열(서열 번호 65, SUE4577)을 나타낸 도면이다.
도 19d는, 실시예 10에서 사용한 pP3OV_insAC의 vioC ins의 서열(서열 번호 69), 및 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드(60 mer)의 서열(서열 번호 66, SUE4381)을 나타낸 도면이다.
도 19e는, 2 부위 동시 염기 치환된 플라스미드의 비율(즉, 자색 콜로니의 비율)에 대한, 염기 치환 도입용 올리고 뉴클레오티드와의 반응 시간의 영향을 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 대장균 형질 전환 콜로니의 색판정 결과를 나타낸다.
I. 무세포계에서 DNA를 편집하는 방법
본 발명은, 무세포계에서 DNA를 편집하는 방법으로서, 이하의 공정:
(1) 무세포계에서 DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 공정; 및
(2) 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를, 무세포계에서 증폭시키는 공정;을 포함하고, 여기에서 상기 DNA는 20℃∼80℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는, 상기 방법(본 명세서에서, 본 발명의 방법이라고 부르는 경우가 있다)을 제공한다.
본 발명에 있어서, '무세포계에서 DNA를 편집한다'란, 세포를 사용하지 않고, DNA 중의 표적 부위를 개변하고, 얻어진 DNA를 증폭시키는 것을 말한다. 한편, 본 명세서에서, 개변되기 전의 DNA를 주형 DNA라고 하는 경우가 있다. 종래의 세포를 사용하는 계에서는, 세포외에서 개변된 DNA를 세포내에 도입하거나 또는 세포내에 존재하는 DNA를 개변하기 위해 필요한 효소 등을 세포내에 도입할 필요가 있어, 세포의 배양 등에 고도의 기술을 필요로 할 뿐만 아니라, 막대한 시간 및 노력을 필요로 한다는 문제가 있었다. 본 발명에 있어서는, DNA를 개변해 증폭시키는 과정에서 세포를 전혀 사용하지 않기 때문에, 개변된 DNA를 효율적으로 제작할 수 있다.
본 발명에 있어서, 주형 DNA는 단일가닥 또는 이중가닥의 어느 것이라도 된다. 주형 DNA가 단일가닥인 경우, 본 발명에 따른 방법의 공정 (1) 또는 (2)에서 이중가닥이 형성된다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해, 주형 DNA 중의 표적 부위가 개변된 이중가닥 DNA를 얻을 수 있다. 또한 주형 DNA는, 환상 DNA 또는 직쇄상 DNA일 수 있다.
결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA의 사이즈는, 공정 (1) 및 (2)에서 사용되는 기술에 의해 다를 수 있지만, 예를 들면 1 kb(1000 염기 길이) 이상, 5 kb 이상, 8.8 kb 이상, 9.5 kb 이상, 10 kb 이상, 20 kb 이상, 30 kb 이상, 40 kb 이상, 50 kb 이상, 60 kb 이상, 70 kb 이상, 80 kb 이상, 90 kb 이상, 100 kb 이상, 101 kb 이상, 183 kb 이상, 200 kb 이상, 205 kb 이상, 300 kb 이상, 500 kb 이상, 1000 kb 이상 또는 2000 kb 이상일 수 있다. 공정 (2)에서, 후술하는 RCR법을 이용하는 경우, 종래의 PCR법으로는 증폭할 수 없었던, 예를 들면 50 kb 이상, 60 kb 이상, 70 kb 이상, 80 kb 이상, 90 kb 이상, 100 kb 이상, 101 kb 이상, 183 kb 이상, 200 kb 이상, 205 kb 이상, 300 kb 이상, 500 kb 이상, 1000 kb 이상 또는 2000 kb 이상의 사이즈가 개변된 DNA를 얻을 수 있다. 한편, 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA의 사이즈의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 10000 kb 정도로 할 수 있다.
I-1. 공정 (1)
본 발명의 방법에서의 공정 (1)은, 무세포계에서 DNA를 개변하는 공정이다. '무세포계'란, 대장균 등의 세포를 직접 사용하지 않고, 그 대신에 대장균 등의 각 세포내에 존재하는 효소 등을 이용하는 계이다. 본 발명에서 DNA의 '개변'이란, DNA 사슬상의 임의의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되는 것, DNA 사슬상의 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실되는 것, DNA 사슬상의 뉴클레오티드 사이에 1개 이상의 뉴클레오티드가 삽입되는 것, 또는 DNA 사슬의 말단에 1개 이상의 뉴클레오티드가 부가되는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, 뉴클레오티드의 삽입 및 부가를 함께 '부가'라고 한다. 또한, 1개의 DNA 단편에 다른 DNA 단편을 연결하는 것도 부가에 포함된다.
결실, 치환 또는 부가되는 뉴클레오티드의 수는, 1개 이상의 임의의 수일 수 있다. 비한정적으로, 1 뉴클레오티드 이상, 2 뉴클레오티드 이상, 3 뉴클레오티드 이상, 4 뉴클레오티드 이상, 5 뉴클레오티드 이상, 8 뉴클레오티드 이상, 10 뉴클레오티드 이상, 12 뉴클레오티드 이상, 15 뉴클레오티드 이상, 18 뉴클레오티드 이상, 20 뉴클레오티드 이상이 바람직하다. 또한, 결실, 치환 또는 부가되는 뉴클레오티드의 수의 상한은, 주형 DNA의 사이즈에 의해 다를 수 있지만, 예를 들면 5000 뉴클레오티드 이하, 4000 뉴클레오티드 이하, 3000 뉴클레오티드 이하, 2000 뉴클레오티드 이하, 1000 뉴클레오티드 이하, 500 뉴클레오티드 이하, 300 뉴클레오티드 이하, 200 뉴클레오티드 이하, 150 뉴클레오티드 이하, 120 뉴클레오티드 이하, 100 뉴클레오티드 이하, 80 뉴클레오티드 이하, 70 뉴클레오티드 이하, 50 뉴클레오티드 이하, 30 뉴클레오티드 이하라도 된다. 본 발명의 방법에 의하면, 예를 들면 주형 DNA에 대해 1개 이상의 유전자 전체를 결실, 치환 또는 부가할 수도 있다. 1개의 DNA 중의 2 부위 이상에서 뉴클레오티드가 동시에 결실, 치환 또는 부가되어도 된다.
무세포계에서 DNA를 개변하기 위해서는, 특별히 제한은 없고, 당해 기술 분야에서 공지의 부위 특이적 변이 도입 기술을 이용할 수 있다. 또한, RA법(특허 문헌 4 참조) 등의 복수의 DNA를 연결하는 기술을 이용할 수도 있다. RA법으로는 구체적으로는, 예를 들면 우선 2종류 이상의 DNA 단편과, RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 갖는 단백질을 함유하는 반응 용액을 조제한다. 계속해서, 상기 반응 용액 중에서, 상기 2종류 이상의 DNA 단편을 염기서열이 상동인 영역끼리 또는 염기서열이 상보인 영역끼리 서로 연결시켜 직쇄상 또는 환상의 DNA를 얻는다.
부위 특이적 변이 도입 기술로는, 예를 들면 원하는 변이(예를 들면, 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 올리고 뉴클레오티드 등의 단일가닥 DNA의 존재하에서 DNA 복제 반응을 행함으로써, 해당 변이가 도입된 이중가닥 DNA를 제작하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 단일가닥 DNA는, 예를 들면 화학 합성 등의 정해진 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 2개 이상의 단일가닥 DNA를 이용해, 1개의 DNA 중의 2 부위 이상에 동시에 변이를 도입해도 된다. 한편, 본 명세서에 있어서, 변이 도입을 위해 사용되는 변이를 포함하는 단일가닥 DNA를, 변이 도입용 단일가닥 DNA라고도 한다.
예를 들면, 변이 도입용 단일가닥 DNA의 존재하에서 DNA 복제 반응을 행하는 방법에서는, 주형 DNA 복제 반응에서 노출된 단일가닥 영역에, 원하는 변이를 포함하도록 설계한 단일가닥 DNA가 어닐링되어 상보쇄 중에 도입된다. 얻어진 이중가닥 DNA를 주형으로 하여 DNA 복제 반응을 더 행함으로써, 양쪽 사슬에 변이를 포함하는 이중가닥 DNA를 얻을 수 있다.
DNA 복제 반응은, 공정 (2)의 설명에서 예로 든, 무세포계에서 DNA를 증폭시키기 위한 기술을 이용할 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, DNA 복제 반응을 후술하는 공정 (2)에서의 증폭 반응과 같은 반응으로 함으로써, 공정 (1)의 변이 도입과 공정 (2)의 DNA의 증폭을 공역시킬 수도 있다. 무세포계에서의 변이 도입과 DNA 증폭을 공역시킴으로써, DNA로의 변이 도입과 증폭을 하나의 반응으로 실시할 수 있다. 지금까지 무세포계에서의 DNA 복제 반응, 특히 RCR법에 있어서, 변이를 포함하는 단일가닥 DNA를 DNA에 도입시켜 부위 특이적으로 변이를 도입할 수 있다는 것은 알려져 있지 않았다.
종래의 프라이머를 이용하는 DNA 증폭 방법에서는, 프라이머가 증폭 영역을 규정하고 있어, 반응계에 변이 도입용 단일가닥 DNA를 추가하면, 그것도 유사 프라이머로서 작용할 수 있다. 그 결과, 변이를 포함하는 단일가닥 DNA로부터도 DNA 사슬이 합성되고, 이 DNA 사슬과 본래의 프라이머로부터 변이를 포함하는 단일가닥 DNA의 앞까지 진행해온 DNA 합성쇄의 사이에는 닉(nick)이 존재해, 전체 길이의 목적 산물은 얻을 수 없다. 닉을 연결하기 위해서는, 변이를 포함하는 단일가닥 DNA의 5' 말단을 인산화해 두고 리가아제(ligase)를 작용시킬 필요가 있어, 공정이 증가하게 된다. 따라서, 본 발명의 방법에서 변이 도입용 단일가닥 DNA를 이용하는 경우, DNA 복제 반응은 RCR법 등의 프라이머를 이용하지 않는 DNA 증폭 기술을 이용해 실시하는 것이 바람직하다.
부위 특이적 변이 도입에 사용하는 단일가닥 DNA의 길이는, DNA 복제 반응의 조건하에서 해당 단일가닥 DNA가 표적 부위에 교잡할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. DNA 복제 반응에 사용하는 방법에 따라 적절히 설정하면 되지만, 예를 들면 10 염기 이상, 15 염기 이상, 20 염기 이상, 30 염기 이상, 40 염기 이상, 50 염기 이상 또는 60 염기 이상이면서, 5000 염기 이하, 4000 염기 이하, 3000 염기 이하, 2000 염기 이하, 1000 염기 이하, 500 염기 이하, 100 염기 이하, 80 염기 이하, 75 염기 이하, 70 염기 이하 또는 65 염기 이하로 할 수 있다. 변이 도입용 단일가닥 DNA의 길이는, 예를 들면 40 염기∼75 염기, 50 염기∼70 염기 또는 55 염기∼65 염기로 할 수 있다. 한편, 변이 도입용 단일가닥 DNA가 표적 부위에 교잡하는 경우, 변이 도입용 단일가닥 DNA의 서열과 표적 부위의 서열이 완전하게는 일치하지 않는 것으로부터, 변이 도입용 단일가닥 DNA의 적어도 일부의 영역이 표적 부위에 교잡하면 된다. 변이 도입용 단일가닥 DNA는 양쪽 말단이 주형 DNA의 표적 부위에 어닐링하는 것이 바람직하다. 주형 DNA에 어닐링하는 길이는, 단일가닥 DNA의 길이에 의해 다를 수 있지만, 예를 들면 말단으로부터 5 염기 이상, 10 염기 이상, 20 염기 이상, 30 염기 이상, 40 염기 이상, 50 염기 이상, 60 염기 이상 또는 100 염기 이상일 수 있다.
변이 도입용 단일가닥 DNA의 반응계내에서의 농도는, DNA 복제 반응이 진행될 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. DNA 복제 반응에 사용하는 방법에 따라 적절히 설정하면 되지만, 예를 들면 DNA 복제 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 μM(μmol/L) 이상, 0.15 μM 이상, 0.2 μM 이상, 0.25 μM 이상 또는 0.3 μM 이상이면서, 3 μM 이하, 2.5 μM 이하, 2.0 μM 이하, 1.5 μM 이하, 1.0 μM 이하 또는 0.6 μM 이하로 할 수 있다. DNA 복제 반응으로서 RCR법을 이용하는 경우에는, 변이 도입용 단일가닥 DNA의 반응계내에서의 농도는, 예를 들면 DNA 복제 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 μM∼1.5 μM, 0.15 μM∼1.0 μM, 0.2 μM∼0.6 μM 또는 0.3 μM∼0.6 μM로 할 수 있다.
복수의 DNA를 연결하는 기술에 대해서도, 당해 기술 분야에서는 여러 가지 기술이 알려져 있다. 본 발명의 일 형태에 있어서, Recombination Assembly법(이하, RA법. 특허 문헌 4 참조)을 이용해 복수의 DNA를 연결할 수 있다.
이하, RA법에 의해 복수의 DNA를 연결하는 실시 형태에 대해 설명한다.
＜RA법＞
RA법은, 서로 염기서열이 상동인 영역(이하, 단순히 '상동 영역'이라고도 한다) 또는 서로 염기서열이 상보인 영역(이하, 단순히 '상보 영역'이라고도 한다)을 갖는 DNA 단편끼리를, 상동 영역끼리 또는 상보 영역끼리 서로 연결시킴으로써, 직쇄상 또는 환상의 DNA를 생산하는 방법이다. RA법은, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질의 존재하에서 연결 반응을 실시하기 때문에 연결 효율이 매우 뛰어나다.
한편, 본 명세서에 있어서, '염기서열이 상동이다'란 '염기서열이 동일하다'는 것을 의미하고, '염기서열이 상보이다'란 '염기서열이 서로 상보적이다'라는 것을 의미한다.
구체적으로 RA법은, 2종류 이상의 DNA 단편과, RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 갖는 단백질(이하, 'RecA 패밀리 재조합 효소 단백질'이라고도 한다)을 함유하는 반응 용액을 조제하고, 상기 반응 용액 중에서, 상기 2종류 이상의 DNA 단편을 염기서열이 상동인 영역끼리 또는 상보에 있어서 서로 연결시킨다. 이 방법에 의해, 직쇄상 또는 환상의 DNA가 얻어진다. 한편, 이후, 2개 이상의 DNA 단편이 연결된 직쇄상 또는 환상의 DNA를 '연결체'라고도 한다.
RA법에 있어서는, 연결시키는 DNA 단편은 직쇄상 이중가닥 DNA 단편이라도 되고, 단일가닥 DNA 단편이라도 된다. 즉, 직쇄상 이중가닥 DNA 단편끼리를 연결해도 되고, 직쇄상 이중가닥 DNA 단편과 단일가닥 DNA 단편을 연결해도 되고, 단일가닥 DNA 단편끼리를 연결해도 된다. 1종류 이상의 직쇄상 이중가닥 DNA 단편과 1종류 이상의 단일가닥 DNA 단편을 연결할 수도 있다. 직쇄상 이중가닥 DNA 단편끼리 또는 직쇄상 이중가닥 DNA 단편과 단일가닥 DNA 단편을 연결시키는 경우, 양자는 상동 영역에서 서로 연결된다. 단일가닥 DNA 단편끼리를 연결시키는 경우, 양자는 상보 영역에서 서로 연결된다.
RA법에서 연결시키는 DNA 단편의 적어도 1종류가 직쇄상 이중가닥 DNA 단편인 경우에는, 상기 반응 용액은 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 더 함유한다.
RA법에 의해 직쇄상 이중가닥 DNA 단편끼리를 연결하는 경우, 우선, 상동 영역을 갖는 제1 직쇄상 이중가닥 DNA 단편과 제2 직쇄상 이중가닥 DNA 단편에 대해 3'→5' 엑소뉴클레아제가 작용해 상동 영역을 단일가닥으로 한다. 단일가닥이 된 상동 영역에 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질이 작용하여 서로 상보적인 상동 영역끼리가 결합함으로써, 제1 직쇄상 이중가닥 DNA 단편과 제2 직쇄상 이중가닥 DNA 단편이 연결된다. 3'→5' 엑소뉴클레아제에 의한 DNA 사슬의 절제는, 제1 직쇄상 이중가닥 DNA 단편과 제2 직쇄상 이중가닥 DNA 단편의 어느 한쪽에만 행해져도 된다. 예를 들면, 단일가닥 상태가 된 제1 직쇄상 이중가닥 DNA 단편의 상동 영역이, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질의 존재하에서, 이중가닥 상태의 제2 직쇄상 이중가닥 DNA 단편의 상동 영역에 작용해 양자가 연결된다.
RA법에서 직쇄상 이중가닥 DNA 단편끼리 또는 직쇄상 이중가닥 DNA 단편과 단일가닥 DNA 단편을 연결시키는 경우, 우선, 이중가닥 DNA 단편을 엑소뉴클레아제에 의해 절제해 상동 영역을 단일가닥화하고, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질의 존재하에서 연결 반응을 더 실시하기 때문에 연결 효율이 매우 뛰어나다. 이 때문에, RA법에서는 종래는 곤란했던 다수의 직쇄상 이중가닥 DNA 단편을 한번의 반응으로 연결할 수 있다.
RA법에 있어서, 단일가닥 DNA 단편끼리를 연결시키는 경우에는, 각각의 단일가닥 DNA 단편상에서 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질이 신속하게 필라멘트를 형성함으로써, 엑소뉴클레아제에 의한 분해가 억제된다. 그 후, 이 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질의 작용에 의해 서로 상보적인 상동 영역끼리가 결합함으로써, 단일가닥 DNA 단편끼리가 연결된다.
RA법에서 연결시키는 DNA 단편의 수는, 2개(2 단편) 이상, 예를 들면 4개(4 단편) 이상, 5개(5 단편) 이상, 7개(7 단편) 이상, 10개(10 단편) 이상, 20개(20 단편) 이상일 수 있다. RA법에서 연결시키는 DNA 단편의 수의 상한은 특별히 없지만, 예를 들면 100개(100 단편) 이하의 수를 연결시킬 수 있다. RA법에서는, 반응 조건 등을 최적화함으로써, 예를 들면 50 단편 정도의 직쇄상 이중가닥 DNA 단편을 연결시킬 수도 있다. 한편, RA법에서 연결시키는 DNA 단편은, 모두 다른 종의 DNA 단편끼리를 연결시킬 수 있고, 동종의 DNA 단편을 2 단편 이상 포함하도록 연결시킬 수도 있다.
RA법에서 연결시키는 2종류 이상의 DNA 단편은, 각각, 다른 DNA 단편 중 적어도 1종류와 연결하기 위한 상동 영역 또는 상보 영역을 포함한다. RA법에서, 직쇄상 이중가닥 DNA 단편끼리 또는 직쇄상 이중가닥 DNA 단편과 단일가닥 DNA 단편을 연결시키는 경우, 우선, 엑소뉴클레아제에 의해 직쇄상 이중가닥 DNA 단편 중 단일가닥을 절제해 상동 영역을 단일가닥 상태로 한다. 이를 위해, 상동 영역은 직쇄상 이중가닥 DNA 단편의 말단에 존재하고 있는 것이 바람직하지만, 말단의 근방이라도 무방하다. 예를 들면, 상동 영역의 단부 중 직쇄상 이중가닥 DNA 단편의 말단측의 염기가, 이 말단으로부터 300 염기 이내에 있는 것이 바람직하고, 100 염기 이내에 있는 것이 보다 바람직하고, 30 염기 이내에 있는 것이 더 바람직하고, 10 염기 이내에 있는 것이 보다 더 바람직하다. 한편, 단일가닥 DNA 단편끼리를 연결시키는 경우에는, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질의 필라멘트에 의해 엑소뉴클레아제에 의한 분해가 억제되고 있기 때문에, 상보 영역은 단일가닥 DNA 단편의 어느 하나에 존재하고 있어도 된다.
상동 영역 또는 상보 영역의 염기서열은, 연결시키는 모든 DNA 단편에서 동일한 염기서열로 할 수도 있지만, 원하는 순서로 연결시키기 위해, 연결시키는 DNA 단편의 종류마다 각각 상이한 염기서열로 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 이중가닥 DNA 단편 A와 이중가닥 DNA 단편 B와 이중가닥 DNA 단편 C를 이 순서로 연결시키기 위해서는, 이중가닥 DNA 단편 A의 하류 말단과 이중가닥 DNA 단편 B의 상류 말단에 상동 영역 a를 마련하고, 이중가닥 DNA 단편 B의 하류 말단과 이중가닥 DNA 단편 C의 상류 말단에 상동 영역 b를 마련해 둔다. 이에 따라, 이중가닥 DNA 단편 A와 이중가닥 DNA 단편 B가 상동 영역 a에서 연결되고, 이중가닥 DNA 단편 B와 이중가닥 DNA 단편 C가 상동 영역 b에서 연결되어, 이중가닥 DNA 단편 A와 이중가닥 DNA 단편 B와 이중가닥 DNA 단편 C가 이 순서로 연결된 직쇄상의 DNA를 얻을 수 있다. 이 경우, 이중가닥 DNA 단편 C의 하류 말단과 이중가닥 DNA 단편 A의 상류 말단에 상동 영역 c를 더 마련함으로써, 이중가닥 DNA 단편 A와 이중가닥 DNA 단편 B가 상동 영역 a에서 연결되고, 이중가닥 DNA 단편 B와 이중가닥 DNA 단편 C가 상동 영역 b에서 연결되고, 이중가닥 DNA 단편 C와 이중가닥 DNA 단편 A가 상동 영역 c에서 연결되어, 이중가닥 DNA 단편 A와 이중가닥 DNA 단편 B와 이중가닥 DNA 단편 C가 이 순서로 연결된 환상의 DNA를 얻을 수 있다.
상동 영역 및 상보 영역은, 연결 반응의 반응 용액 중에서, 단일가닥끼리가 특이적으로 교잡 가능한 정도의 염기서열이면 되고, 염기쌍 길이, GC율 등은, 일반적으로 프로브나 프라이머의 설계 방법을 참고하여 적절히 결정할 수 있다. 일반적으로, 비특이적인 교잡을 억제해 목적하는 직쇄상 이중가닥 DNA 단편끼리를 정확하게 연결하기 위해서는, 상동 영역의 염기쌍 길이는 어느 정도의 길이가 필요하지만, 상동 영역의 염기쌍 길이가 너무 길면, 연결 효율이 저하될 우려가 있다. RA법에서는, 상동 영역 또는 상보 영역의 염기쌍 길이로는, 10 염기쌍(bp) 이상이 바람직하고, 15 bp 이상이 보다 바람직하고, 20 bp 이상이 더 바람직하고, 60 bp 이상이 특히 바람직하다. 또한, 상기 상동 영역 또는 상보 영역의 염기쌍 길이로는, 500 bp 이하가 바람직하고, 300 bp 이하가 보다 바람직하고, 200 bp 이하가 더 바람직하다.
RA법에 있어서, 서로 연결시키는 DNA 단편의 길이는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 직쇄상 이중가닥 DNA 단편의 경우에는, 50 bp 이상이 바람직하고, 100 bp 이상이 보다 바람직하고, 200 bp 이상이 더 바람직하다. 단일가닥 DNA 단편의 경우에는, 50 b 이상이 바람직하고, 100 b 이상이 보다 바람직하고, 200 b 이상이 더 바람직하다. RA법에서는, 325 kbp의 이중가닥 DNA 단편도 연결시킬 수 있다. 또한, 연결시키는 DNA 단편의 길이는 종류마다 상이해도 된다.
RA법에 있어서, 서로 연결시키는 직쇄상 이중가닥 DNA 단편은, 상동 영역의 전체 영역 또는 그 일부 영역이, 2개의 단일가닥 DNA가 교잡하고 있는 이중가닥 구조이면 된다. 즉, 이 직쇄상 이중가닥 DNA 단편은, 갭(gap)이나 닉이 없는 완전한 직쇄상 이중가닥 DNA 단편이라도 되고, 1 또는 복수의 부위가 단일가닥 구조인 직쇄상 DNA 단편이라도 된다. 예를 들면, 연결시키는 직쇄상 이중가닥 DNA 단편은, 평활 말단이라도 되고, 점착 말단이라도 무방하다. RA법에 의해, 평활 말단의 직쇄상 이중가닥 DNA 단편과 점착 말단의 직쇄상 이중가닥 DNA 단편을 연결시킬 수도 있다.
반응 용액내에 포함시키는 각 DNA 단편의 몰비는, 목적하는 연결체를 구성하는 각 DNA 단편의 분자수의 비에 일치시키는 것이 바람직하다. 연결 반응 개시시에서의 반응계내의 DNA 단편의 분자수를 일치시킴으로써, 연결 반응을 보다 효율적으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 모두 다른 종의 DNA 단편끼리를 연결시키는 경우에는, 반응 용액에 포함시키는 각 DNA 단편은, 몰 농도가 서로 동일한 것이 바람직하다.
반응 용액내에 포함시키는 DNA 단편의 총량은 특별히 한정되는 것은 아니다. 충분한 양의 연결체가 쉽게 얻어지는 것으로부터, 연결 반응 개시 시점에서 반응 용액내에 포함시키는 DNA 단편의 총농도는, 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 nM(nmol/L) 이상이 바람직하고, 0.1 nM 이상이 보다 바람직하고, 0.3 nM 이상이 더 바람직하고, 5.09 nM 이상이 특히 바람직하고, 6.7 nM 이상이 가장 바람직하다. 보다 연결 효율이 높고, 다단편의 연결에 적절한 것으로부터, 연결 반응 개시 시점에서 반응 용액내에 포함시키는 DNA 단편의 총농도는 100 nM 이하가 바람직하고, 96.027 nM 이하가 보다 바람직하고, 50 nM 이하가 더 바람직하고, 25 nM 이하가 특히 바람직하고, 20 nM 이하가 가장 바람직하다.
RA법에 있어서, 연결 반응에 의해 얻어지는 연결체의 크기는 특별히 한정되지 않는다. 얻어지는 연결체의 크기로는, 예를 들면 1 kb(1000 염기 길이) 이상이 바람직하고, 5 kb 이상이 보다 바람직하고, 10 kb 이상이 더 바람직하고, 13 kb 이상이 특히 바람직하고, 20 kb 이상이 가장 바람직하다. RA법에 의해, 183 kb 이상, 바람직하게는 208 kb 이상, 보다 바람직하게는 300 kb 이상, 더 바람직하게는 500 kb 이상, 특히 바람직하게는 2000 kb 이상의 길이의 연결체를 얻을 수도 있다. 한편, 연결 반응에 의해 얻어지는 연결체의 크기의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 10000 kb 정도로 할 수 있다.
RA법에서 이용되는 엑소뉴클레아제는, 직쇄상 DNA의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 효소이다. RA법에서 이용되는 엑소뉴클레아제로는, 직쇄상 DNA의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 효소 활성을 갖는 것이라면, 그 종류나 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 3' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 효소(3'→5' 엑소뉴클레아제)로는, 엑소뉴클레아제 III 패밀리형의 AP(apurinic/apyrimidinic) 엔도뉴클레아제 등의 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제와, DnaQ 슈퍼패밀리 단백질 등의 단일가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제를 들 수 있다. 엑소뉴클레아제 III 패밀리형의 AP 엔도뉴클레아제로는, 예를 들면 엑소뉴클레아제 III(대장균 유래), ExoA(엑소뉴클레아제 III의 고초균(Bacillus subtilis) 상동체), Mth212(엑소뉴클레아제 III의 고세균(Archaebacteria) 상동체), AP 엔도뉴클레아제 I(엑소뉴클레아제 III의 인간 상동체)을 들 수 있다. DnaQ 슈퍼패밀리 단백질로는, 예를 들면 엑소뉴클레아제 I(대장균 유래), 엑소뉴클레아제 T(RNase T), 엑소뉴클레아제 X, DNA 폴리메라아제 III 엡실론 서브유닛(DNA polymerase III epsilon subunit), DNA 폴리메라아제 I, DNA 폴리메라아제 II, T7DNA 폴리메라아제, T4DNA 폴리메라아제, 클레노브 DNA 폴리메라아제 5, Phi29 DNA 폴리메라아제, 리보뉴클레아제 III(RNase D), 올리고리보뉴클레아제(ORN) 등을 들 수 있다. 5' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 효소(5'→3' 엑소뉴클레아제)로는, λ 엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 VIII, T5 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 및 RecJ 엑소뉴클레아제 등을 이용할 수 있다.
RA법에 이용되는 엑소뉴클레아제로는, 직쇄상 이중가닥 DNA 단편 절제의 진행성(processivity)과 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질 존재하에서의 연결 효율의 밸런스가 양호하다는 점에서, 3'→5' 엑소뉴클레아제가 바람직하다. 그 중에서도, 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제가 보다 바람직하고, 엑소뉴클레아제 III 패밀리형의 AP 엔도뉴클레아제가 더 바람직하고, 엑소뉴클레아제 III가 특히 바람직하다.
RA법에서 반응 용액내에 함유시키는 엑소뉴클레아제로는, 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제와 단일가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제의 양쪽 모두인 것이 바람직하다. 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제에 단일가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제를 조합함으로써, 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제를 단독으로 이용한 경우보다 한층 더 연결 효율을 개선시킬 수 있다. 두 3'→5' 엑소뉴클레아제를 병용함으로써 연결 효율이 개선되는 이유는 분명하지 않지만, 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제는 3' 돌출 말단을 표적하기 힘든 경우가 많아, 이 3' 돌출 말단이 단일가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제에 의해 분해되는 결과, 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제와 RecA에 의한 연결 반응이 촉진되기 때문이라고 추측된다. 또한, 연결시키는 직쇄상 DNA 단편이, 평활 말단이나 5' 돌출 말단인 경우에도, 단일가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제의 병용에 의해 연결 효율이 개선되지만, 이는 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제와 RecA에 의해 형성된 연결체내에 부차적으로 형성되는 3' 돌출 말단이 단일가닥 DNA 특이적 3' 엑소뉴클레아제에 의해 분해되는 결과, 연결 효율이 보다 개선되는 것으로 추측된다.
RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액 중에서의 엑소뉴클레아제의 농도로는, 연결 반응 개시 시점에서, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 1∼1000 mU/μL가 바람직하고, 5∼1000 mU/μL가 보다 바람직하고, 5∼500 mU/μL가 더 바람직하고, 10∼150 mU/μL가 특히 바람직하고, 80∼150 mU/μL가 가장 바람직하다. 특히, 엑소뉴클레아제가 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제인 경우에는, 연결 반응 개시 시점에서의 반응 용액 중의 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제의 농도는, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 5 mU/μL∼500 mU/μL가 바람직하고, 5 mU/μL∼250 mU/μL가 보다 바람직하고, 5 mU/μL∼150 mU/μL가 더 바람직하고, 10 mU/μL∼150 mU/μL가 특히 바람직하고, 80∼150 mU/μL가 가장 바람직하다. 또한, 엑소뉴클레아제가 직쇄상 단일가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제인 경우에는, 연결 반응 개시 시점에서의 반응 용액 중의 직쇄상 단일가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제의 농도는, 반응 용액의 총용적에 대해, 1 mU/μL∼1000 mU/μL가 바람직하고, 100 mU/μL∼1000 mU/μL가 보다 바람직하고, 200 mU/μL∼1000 mU/μL가 더 바람직하다. 직쇄상 이중가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제와 단일가닥 DNA 특이적 3'→5' 엑소뉴클레아제를 병용하는 경우, 연결 반응 개시 시점에서의 반응 용액 중의 각 엑소뉴클레아제의 농도는 각각 전술한 각 엑소뉴클레아제의 바람직한 농도로 할 수 있다.
본 명세서에 있어서, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질이란, 단일가닥 상태 또는 이중가닥 상태의 DNA상에서 중합해 필라멘트를 형성하고, ATP(아데노신3인산) 등의 뉴클레오시드3인산에 대한 가수분해 활성을 갖고, 상동 영역을 찾아 상동 재조합을 행하는 기능(RecA 패밀리 재조합 효소 활성)을 갖는 단백질을 의미한다. RecA 패밀리 재조합 효소 단백질로는, 원핵생물 RecA 상동체, 박테리오파지 RecA 상동체, 고세균 RecA 상동체, 진핵생물 RecA 상동체 등을 들 수 있다. 원핵생물 RecA 상동체로는, 대장균 RecA; Thermus thermophiles, Thermus aquaticus 등의 Thermus 속균, Thermococcus 속균, Pyrococcus 속균, Thermotoga 속균 등의 고도호열균(高度好熱菌)에 유래하는 RecA; Deinococcus radiodurans 등의 방사선 내성균에 유래하는 RecA 등을 들 수 있다. 박테리오파지 RecA 상동체로는 T4파지 UvsX 등을 들 수 있고, 고세균 RecA 상동체로는 RadA 등을 들 수 있고, 진핵생물 RecA 상동체로는 Rad51 및 그 패럴로그(paralogue), Dcm1 등을 들 수 있다. 한편, 이들 RecA 상동체의 아미노산 서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 등의 데이터베이스로부터 입수할 수 있다.
RA법에서 이용되는 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질로는, 야생형 단백질이라도 되고, 야생형 단백질에 1∼30개의 아미노산을 결실, 부가 또는 치환하는 변이를 도입한, RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 유지하는 개변체라도 된다. 이 개변체로는, 야생형 단백질 중의 상동 영역을 찾는 기능을 항진시키는 아미노산 치환 변이를 도입한 개변체, 야생형 단백질의 N말단 또는 C말단에 각종 태그가 부가된 개변체, 내열성을 향상시킨 개변체(국제 공개공보 제2016/013592호) 등을 들 수 있다. 이 태그로는, 예를 들면 His 태그, HA(hemagglutinin) 태그, Myc 태그, 및 Flag 태그 등의 재조합 단백질의 발현 또는 정제에서 범용되는 태그를 이용할 수 있다. 한편, 야생형 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질이란, 자연계에서 분리된 생물에 유지되고 있는 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 의미한다.
RA법에서 이용되는 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질로는, RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 유지하는 개변체가 바람직하다. 이 개변체로는, 예를 들면 대장균 RecA의 203번째의 아미노산 잔기 페닐알라닌을 트립토판으로 치환한 F203W 변이체나, 각종 RecA 상동체 중, 대장균 RecA의 203번째의 페닐알라닌에 상당하는 페닐 알라닌을 트립토판으로 치환한 변이체를 들 수 있다.
RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액 중에서의 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질의 양은 특별히 한정되지 않는다. RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액 중에서의 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질의 농도로는, 연결 반응 개시 시점에서, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 μM∼100 μM(μmol/L)이 바람직하고, 0.1 μM∼100 μM이 보다 바람직하고, 0.1 μM∼50 μM이 더 바람직하고, 0.5 μM∼10 μM이 보다 더 바람직하고, 1.0 μM∼5.0 μM이 특히 바람직하다.
RecA 패밀리 재조합 효소 단백질이 RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 발휘하기 위해서는, 뉴클레오시드3인산 또는 디옥시뉴클레오티드3인산이 필요하다. 이 때문에, 본 발명에서 연결 반응을 행하는 반응 용액은, 뉴클레오시드3인산 및 디옥시뉴클레오티드3인산의 적어도 하나를 함유한다. RA법에서 연결 반응의 반응 용액에 함유시키는 뉴클레오시드3인산으로는, ATP, GTP(구아노신3인산), CTP(시티딘3인산), UTP(우리딘3인산), m5UTP(5-메틸우리딘3인산)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 바람직하고, ATP를 이용하는 것이 특히 바람직하다. RA법에서 연결 반응의 반응 용액에 함유시키는 디옥시뉴클레오티드3인산으로는, dATP(데옥시아데노신3인산), dGTP(데옥시구아노신3인산, dCTP(데옥시시티딘3인산) 및 dTTP(데옥시티미딘3인산)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 바람직하고, dATP를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 반응 용액에 함유되는 뉴클레오시드3인산 및 디옥시뉴클레오티드3인산의 총량은, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질이 RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 발휘하는데 충분한 양이라면 특별히 한정되지 않는다. RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액 중에서의 뉴클레오시드3인산 농도 또는 디옥시뉴클레오티드3인산 농도로는, 연결 반응 개시 시점에서, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 1 μM(μmol/L) 이상이 바람직하고, 10 μM 이상이 보다 바람직하고, 30 μM 이상이 더 바람직하고, 100 μM 이상이 특히 바람직하다. 한편, 반응 용액의 뉴클레오시드3인산 농도가 너무 높은 경우에는, 다단편의 연결 효율은 오히려 저하될 우려가 있다. 이 때문에, 연결 반응 개시 시점에서 반응 용액의 뉴클레오시드3인산 농도 또는 디옥시뉴클레오티드3인산 농도는, 반응 용액의 총용적에 대해, 1000 μM 이하가 바람직하고, 500 μM 이하가 보다 바람직하고, 300 μM 이하가 더 바람직하다.
RecA 패밀리 재조합 효소 단백질이 RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 발휘하기 위해서, 그리고 엑소뉴클레아제가 엑소뉴클레아제 활성을 발휘하기 위해서는, 마그네슘 이온(Mg2+)이 필요하다. 이 때문에, RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액은 마그네슘 이온원을 함유한다. 마그네슘 이온원은 반응 용액 중에 마그네슘 이온을 제공하는 물질이다. 예를 들면, 아세트산마그네슘[Mg(OAc)2], 염화마그네슘[MgCl2], 황산마그네슘[MgSO4] 등의 마그네슘염을 들 수 있다. 바람직한 마그네슘 이온원은 아세트산마그네슘이다.
RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액의 마그네슘 이온원 농도는, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질이 RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 발휘할 수 있고 또한 엑소뉴클레아제가 엑소뉴클레아제 활성을 발휘할 수 있는 농도이면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 연결 반응 개시 시점에서의 반응 용액의 마그네슘 이온원 농도로는, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 0.5 mM(mmol/L) 이상이 바람직하고, 1 mM 이상이 보다 바람직하다. 한편, 반응 용액의 마그네슘 이온원 농도가 너무 높은 경우에는, 엑소뉴클레아제 활성이 너무 강해져 다단편 연결 효율은 오히려 저하될 우려가 있다. 이 때문에, 연결 반응 개시 시점에서의 반응 용액의 마그네슘 이온원 농도로는, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 20 mM 이하가 바람직하고, 15 mM 이하가 보다 바람직하고, 12 mM 이하가 더 바람직하고, 10 mM 이하가 보다 더 바람직하다.
RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액은, 예를 들면 완충액에, DNA 단편과, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질과, 엑소뉴클레아제와, 뉴클레오시드3인산 및 디옥시뉴클레오티드3인산의 적어도 하나와, 마그네슘 이온원을 첨가함으로써 조제된다. 완충액으로는, pH 7∼9, 바람직하게는 pH 8에서 이용하는데 적합한 완충액이라면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Tris-HCl, Tris-아세트산(Tris-OAc), Hepes-KOH, 인산 완충액, MOPS-NaOH, Tricine-HCl 등을 들 수 있다. 바람직한 완충액은 Tris-HCl 또는 Tris-OAc이다. 완충액의 농도는 당업자가 적절하게 선택할 수 있어 특별히 한정되지 않지만, Tris-HCl 또는 Tris-OAc의 경우, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 10 mM(mmol/L)∼100 mM, 바람직하게는 10 mM∼50 mM, 보다 바람직하게는 20 mM의 농도를 선택할 수 있다.
RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에는, DNA 단편, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질, 엑소뉴클레아제, 뉴클레오시드3인산 및 디옥시뉴클레오티드3인산의 적어도 하나 및 마그네슘 이온원 외에, 뉴클레오시드3인산 또는 디옥시뉴클레오티드3인산의 재생 효소와 그 기질을 더 함유하는 것이 바람직하다. 반응 용액 중에서 뉴클레오시드3인산 또는 디옥시뉴클레오티드3인산을 재생할 수 있는 것으로부터, 다수의 DNA 단편을 보다 효율적으로 연결시킬 수 있다. 뉴클레오시드3인산 또는 디옥시뉴클레오티드3인산을 재생하기 위한 재생 효소와 그 기질의 조합으로는, 크레아틴 키나아제와 크레아틴인산염의 조합, 피루브산 키나아제와 포스포에놀피루브산의 조합, 아세테이트 키나아제와 아세틸인산의 조합, 폴리인산 키나아제와 폴리인산의 조합, 뉴클레오시드2인산 키나아제와 뉴클레오시드3인산의 조합을 들 수 있다. 뉴클레오시드2인산 키나아제의 기질(인산 공급원)이 되는 뉴클레오시드3인산은, ATP, GTP, CTP, UTP 중 어느 하나라도 무방하다. 그 외에도, 재생 효소로는 미오키나아제(myokinase)를 들 수 있다.
RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액 중의 뉴클레오시드3인산 재생 효소 및 그 기질의 농도는, 반응 용액 중에서 연결 반응시에 뉴클레오시드3인산의 재생이 가능하게 되는 충분한 농도라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 크레아틴 키나아제와 크레아틴인산염을 이용하는 경우, 본 발명에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에 함유시키는 크레아틴 키나아제의 농도를, 반응 용액의 총용적에 대해, 바람직하게는 1 ng/μL∼1000 ng/μL, 보다 바람직하게는 5 ng/μL∼1000 ng/μL, 더 바람직하게는 5 ng/μL∼500 ng/μL, 특히 바람직하게는 5 ng/μL∼250 ng/μL, 가장 바람직하게는 20 ng/μL∼250 ng/μL로 하고, 크레아틴인산염의 농도를, 반응 용액의 총용적에 대해, 바람직하게는 0.4 mM∼20 mM(mmol/L), 보다 바람직하게는 0.4 mM∼10 mM, 더 바람직하게는 1 mM∼7 mM, 특히 바람직하게는 4 mM∼7 mM로 할 수 있다.
다단편을 목적하는 순서로 연결시키는 경우, 상동 영역 또는 상보 영역의 염기서열은, 연결하는 DNA 단편의 조합마다 상이한 것이 바람직하다. 그러나, 동일한 온도 조건하에서는, G(구아닌 염기)와 C(시트신 염기)의 함유율이 높은 상동 영역은 단일가닥으로 2차 구조를 형성하기 쉽다. 한편, A(아데닌 염기)와 T(티민 염기)의 함유율이 높은 상동 영역에서는 교잡의 효율이 낮아지기 때문에, 연결 효율도 낮아질 우려가 있다. 단일가닥 DNA의 2차 구조 형성을 억제해 특이적 교잡을 촉진함으로써, DNA 단편의 연결을 촉진시킬 수 있다.
따라서, RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에는, 단일가닥 DNA의 2차 구조 형성을 억제해 특이적 교잡을 촉진하는 물질을 첨가하는 것이 바람직하다. 이 물질로는, 디메틸술폭시드(DMSO), 염화테트라메틸암모늄(TMAC)을 들 수 있다. DMSO는 GC가 풍부한 염기쌍의 2차 구조 형성을 억제하는 작용이 있다. TMAC는 특이적 교잡을 촉진하는 작용이 있다. RA법에 있어서, 연결 반응을 행하는 반응 용액에 단일가닥 DNA의 2차 구조 형성을 억제해 특이적 교잡을 촉진하는 물질을 함유시키는 경우, 이 물질의 농도는 해당 물질에 의한 DNA 단편의 연결 촉진 효과가 얻어지는 농도라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 이 물질로서 DMSO를 이용하는 경우, RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에 함유시키는 DMSO의 농도로는, 반응 용액의 총용적에 대해, 5 용량(v/v)%∼30 용량(v/v)%가 바람직하고, 8 용량%∼25 용량%가 보다 바람직하고, 8 용량∼20 용량%가 더 바람직하다. 이 물질로서 TMAC를 이용하는 경우, RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에 함유시키는 TMAC의 농도로는, 반응 용액의 총용적에 대해, 60 mM∼300 mM이 바람직하고, 100 mM∼250 mM이 보다 바람직하고, 100 mM∼200 mM이 더 바람직하고, 150 mM이 특히 바람직하다.
RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에는, 고분자 혼잡 효과를 갖는 물질을 더 첨가하는 것이 바람직하다. 고분자 혼잡 효과는 DNA 분자끼리의 상호작용을 증강해, DNA 단편의 연결을 촉진시킬 수 있다. 이러한 물질로는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 200∼20000, 폴리비닐 알코올(PVA) 200∼20000, 덱스트란 40∼70, 피콜 70, 소 혈청 알부민(BSA)을 들 수 있다. RA법에서, 연결 반응을 행하는 반응 용액에 고분자 혼잡 효과를 갖는 물질을 함유시키는 경우, 이 물질의 농도는 해당 물질에 의한 DNA 단편의 연결 촉진 효과를 얻어지는 농도라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 이 물질로서 PEG 8000를 이용하는 경우, RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에 함유시키는 PEG 8000의 농도로는, 반응 용액의 총질량에 대해, 2 질량(w/w)%∼20 질량(w/w)%가 바람직하고, 2 질량%∼10 질량%가 보다 바람직하고, 4 질량%∼6 질량%가 더 바람직하다.
RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에는, 알칼리 금속 이온원을 더 함유시켜도 된다. 알칼리 금속 이온원은, 반응 용액 중에 알칼리 금속 이온을 제공하는 물질이다. RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에 함유시키는 알칼리 금속 이온으로는, 나트륨 이온(Na+) 또는 칼륨 이온(K+)이 바람직하다. 알칼리 금속 이온원으로는, 예를 들면 글루탐산 칼륨[KGlu], 아스파라긴산 칼륨, 염화 칼륨, 아세트산 칼륨[KOAc], 글루탐산 나트륨, 아스파라긴산 나트륨, 염화 나트륨 및 아세트산 나트륨을 들 수 있다. RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에 함유시키는 알칼리 금속 이온원으로는, 글루탐산 칼륨 또는 아세트산 칼륨이 바람직하고, 특히 다단편의 연결 효율이 개선되는 것으로부터 글루탐산 칼륨이 바람직하다. 연결 반응 개시 시점에서의 반응 용액의 알칼리 금속 이온원 농도로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 반응 용액 중에 알칼리 금속 이온을 반응 용액의 총용적에 대해, 바람직하게는 10 mM(mmol/L) 이상, 보다 바람직하게는 30 mM∼300 mM의 범위내, 더 바람직하게는 50 mM∼150 mM의 범위내에서 제공하는 농도로 조정할 수 있다.
RA법에서 연결 반응을 행하는 반응 용액에는, 환원제를 더 함유시켜도 된다. 환원제로는, 예를 들면 디티오트레이톨(DTT), β-메르캅토에탄올(2-메르캅토에탄올), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 및 글루타티온을 들 수 있다. 바람직한 환원제는 DTT이다. 환원제는, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1.0 mM(mmol/L)∼15.0 mM(mmol/L), 바람직하게는 2.0 mM∼10.0 mM, 보다 바람직하게는 4.0 mM∼10.0 mM 함유되어도 된다.
RA법에서, 연결 반응은, 완충액에, 2종류 이상의 DNA 단편과, RecA 패밀리 재조합 효소 단백질과, 뉴클레오시드3인산과, 마그네슘 이온원과, 필요에 따라, 엑소뉴클레아제와, 뉴클레오시드3인산 재생 효소 및 그 기질의 세트, 단일가닥 DNA의 2차 구조 형성을 억제해 특이적 교잡을 촉진하는 물질, 고분자 혼잡 효과를 갖는 물질, 알칼리 금속 이온원 및 환원제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 함유시켜 조제한 반응 용액을, 이 반응 용액 중의 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질 및 엑소뉴클레아제가 각각의 효소 활성을 발휘할 수 있는 온도의 등온 조건하에서, 소정 시간 인큐베이션함으로써 실시한다. 연결 반응의 반응 온도로는, 25℃∼48℃의 온도 범위내인 것이 바람직하고, 27℃∼45℃의 온도 범위내인 것이 보다 바람직하다. 특히, 상동 영역 또는 상보 영역의 길이가 50 염기 이상인 경우에는, 연결 반응의 반응 온도는 30℃∼45℃의 온도 범위내인 것이 바람직하고, 37℃∼45℃의 온도 범위내인 것이 보다 바람직하고, 40℃∼43℃의 온도 범위내인 것이 더 바람직하고, 42℃가 특히 바람직하다. 한편, 상동 영역 또는 상보 영역의 길이가 50 염기 이하인 경우에는, 연결 반응의 반응 온도는 27℃∼43℃의 온도 범위내인 것이 바람직하고, 27℃∼37℃의 온도 범위내인 것이 보다 바람직하고, 27℃∼33℃의 온도 범위내인 것이 더 바람직하다. 한편, RA법에 있어서 '등온 조건하'란, 반응중에 설정한 온도에 대해 ±3℃ 또는 ±1℃의 온도 범위내로 유지하는 것을 의미한다. 연결 반응의 반응 시간은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 15분간∼6시간, 바람직하게는 15분간∼3시간, 보다 바람직하게는 1시간∼3시간으로 할 수 있다.
연결 반응에 의해 얻어진 연결체(직쇄상 또는 환상의 DNA)에는 갭이나 닉이 존재한다. 갭은 이중가닥 DNA에서 1개 또는 복수개가 연속된 뉴클레오티드가 결여된 상태이고, 닉은 이중가닥 DNA에서 이웃하는 뉴클레오티드 사이의 인산디에스테르 결합이 절단된 상태이다. 따라서, RA법에서는, 연결 반응 후, 얻어진 연결체내의 갭 및 닉을 갭 수복(gap repair) 효소군과 dNTP에 의해 수복하는 것이 바람직하다. 갭 및 닉을 수복함으로써, 연결체를 완전한 이중가닥 DNA로 할 수 있다.
구체적으로는, 연결 반응 후의 반응 용액에, 갭 수복 효소군과 dNTP를 첨가하고, 갭 수복 효소군이 효소 활성을 발휘할 수 있는 온도의 등온 조건하에서 소정 시간 인큐베이션함으로써, 연결체의 갭 및 닉을 수복할 수 있다. 갭 수복 효소군을 구성하는 효소는, 이중가닥 DNA의 갭 및 닉을 수복할 수 있는 효소군이라면, 그 종류나 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 갭 수복 효소군으로는, 예를 들면 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 효소와 DNA 리가아제 활성을 갖는 효소를 조합해 사용할 수 있다. DNA 리가아제로서 대장균 유래의 DNA 리가아제를 이용하는 경우, 그 보조인자인 NAD(니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드)가 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 mM∼1.0 mM(mmol/L), 바람직하게는 0.25 mM의 범위로 함유된다. 갭 수복 효소군에 의한 처리는, 예를 들면 25℃∼40℃, 바람직하게는 30℃에서, 5분간∼120분간, 바람직하게는 10분간∼60분간, 보다 바람직하게는 30분간 행해져도 된다.
dNTP는 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP의 총칭이다. 수복 반응의 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 dNTP의 농도는, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 mM(mmol/L)∼1 mM(mmol/L)의 범위이면 되고, 바람직하게는 0.05 mM∼1 mM의 범위이면 되고, 보다 바람직하게는 0.25 mM∼1 mM의 범위라도 된다.
RA법에 제공하는 DNA 단편의 조제에는, 제한 효소, 인공 DNA 절단 효소 등의 서열 특이적인 DNA 절단 효소를 사용할 수 있다. 주형 DNA가 길어져, 적절한 제한 효소를 선택하는 것이 곤란한 경우라도, 인공 DNA 절단 효소를 이용하면, DNA를 원하는 표적 부위에서 특이적으로 절단할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 인공 DNA 절단 효소란, 원하는 서열을 특이적으로 인식해 DNA를 절단하는 인공적으로 제작된 효소이며, 인공 뉴클레아제 및 RNA 유도형 뉴클레아제가 포함된다. 인공 뉴클레아제는, DNA와 특이적으로 결합하는 도메인과 DNA를 절단하는 도메인을 연결한 인공 효소로서, 예를 들면 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALE 뉴클레아제(TALEN) 등이 알려져 있다. 또한, RNA 유도형 뉴클레아제는, 표적 서열을 인식하는 가이드 RNA(gRNA)라고 불리는 짧은 RNA 및 DNA를 절단하는 효소의 복합체로서, CRISPR-Cas9 등이 알려져 있다. 본 발명에서는 어떤 인공 DNA 절단 효소를 이용해도 되지만, 인공 뉴클레아제 또는 RNA 유도형 뉴클레아제를 이용하는 것이 바람직하고, CRISPR-Cas9를 이용하는 것이 보다 바람직하다.
RA법에서 인공 DNA 절단 효소를 사용하는 일 실시 형태에서는, 공정 (1)은, 예를 들면 이하의 공정:
(1-1) 인공 DNA 절단 효소를 DNA에 작용시킴으로써, 해당 DNA를 표적 부위에서 절단해 적어도 하나의 직쇄 DNA를 조제하는 공정;
(1-2) 공정 (1-1)에서 조제된 직쇄 DNA, 1종류 이상의 DNA 단편 및 RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 갖는 단백질을 함유하는 반응 용액을 조제하는 공정; 및
(1-3) 상기 직쇄 DNA와 상기 1종류 이상의 DNA 단편을, 염기서열이 상동인 영역끼리 또는 염기서열이 상보적인 영역끼리 서로 연결시켜, 주형 DNA의 표적 부위에 상기 1종류 이상의 DNA 단편이 삽입된 DNA를 형성시키는 공정;
을 포함할 수 있다.
공정 (1-1)에서의 인공 DNA 절단 효소에 의해 처리되는 DNA(즉, 주형 DNA)는 직쇄상이라도 되고 환상이라도 된다. 인공 DNA 절단 효소를 이용함으로써 원하는 표적 부위에서 주형 DNA를 절단하는 것이 가능하다. 공정 (1-2)의 1종류 이상의 DNA 단편은, 공정 (1-1)에서 조제된 직쇄 DNA와 인공 DNA 절단 효소에 의한 절단 부위에서 연결시키기 위한 상동 영역 또는 상보 영역을 포함한다. 상동 영역 또는 상보 영역끼리가 연결됨으로써, 공정 (1-3)에서 얻어지는 연결 후의 DNA는, 주형 DNA에 대해 절단 부위에 다른 DNA 서열이 삽입된 형태가 된다. 공정 (1-2) 및 (1-3)에 대해서는, 상기의 통상적인 RA법과 마찬가지로 실시하면 된다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 공정 (1)은 In fusion법에 의해 복수의 DNA를 연결하는 공정일 수 있다.
In fusion법은, 각 이중가닥 DNA 단편의 말단 15 염기의 상동 서열을 인식해 융합시키는 기능을 갖는 In fusion 효소를 이용해 연결 반응을 실시하는 방법이다. 구체적으로는, 우선, PCR을 이용해, 연결시킬 목적의 이중가닥 DNA 단편의 말단에 동일한 염기서열로 이루어지는 상동 영역을 부가한다. 양쪽 말단에 15 염기의 상동 영역을 부가한 2개의 이중가닥 DNA 단편끼리를 In fusion 효소와 혼합해 인큐베이션함으로써 연결시킨다. In fusion법의 원리는, 예를 들면 Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 1 143-151에 설명되어 있다. 다카라 바이오사 등에서 시판중인 시약을 이용해 실시할 수도 있다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 공정 (1)은 Gibson Assembly법에 의해 복수의 DNA를 연결하는 공정일 수 있다.
Gibson Assembly법은, 제1 DNA 분자의 원위 영역과 제2 DNA 분자의 근위 영역을 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소로 분해해, 각각의 상동 영역(서로 특이적으로 교잡하기에 충분한 길이의 서열 동일성의 영역)을 단일가닥 상태로 한 후, 양자를 특이적으로 어닐링시켜 연결시킨 후, 갭이나 닉을 수복함으로써 완전한 이중가닥 DNA의 연결체를 얻는 방법이다. 즉, Gibson Assembly법은, 엑소뉴클레아제에 의한 단일가닥 3' 돌출부(overhang)의 형성과 단편간의 어닐링, DNA 폴리메라아제에 의한 어닐링한 단편의 사이의 갭의 수복, 및 DNA 리가아제에 의한 닉의 연결로 구성된다. New England Biolabs사 등에서 시판중인 시약을 이용해 실시할 수도 있다.
I-2. 공정 (2)
본 발명의 방법에서의 공정 (2)는, 공정 (1)에서 개변된 DNA를 무세포계에서 증폭시키는 공정으로서, 상기 DNA는 20℃∼80℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭된다. 그 중에서도, 상기 DNA는 등온에서 인큐베이션하거나 또는 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는 것이 바람직하고, 20℃∼80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도에서 인큐베이션하거나 또는 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는 것이 보다 바람직하다.
무세포계에서 DNA를 증폭시키기 위해서는, 당해 기술 분야에서 공지의 기술을 이용할 수 있다. 당해 기술 분야에서는, 등온에서 DNA를 증폭시키는 여러 가지 기술이 알려져 있다(예를 들면, J. Li and J. Macdonald, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 64, p. 196-211 (2015) 참조). 일 형태에 있어서, Replication Cycle Reaction법(이하, RCR법. 특허 문헌 5∼7 참조)를 이용해, DNA를 증폭시킬 수 있다. 공정 (2)를 RCR법에 의해 실시하는 경우, 주형 DNA는 환상 DNA이다.
RCR 외에 본 발명에서 사용할 수 있는 기술로는, 예를 들면 Helicase-dependent amplification(HDA)(Vincent, M., Xu, Y., Kong, H., 2004. EMBO Rep. 5 (8), 795-800), Recombinase polymerase amplification(RPA)(Piepenburg, O., Williams, C.H., Stemple, D.L., Armes, N.A., 2006. PLoS. Biol. 4 (7), e204), Rolling circle amplification(RCA)(Fire, A., Xu, S.Q., 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (10), 4641-4645), Ramification amplification(RAM)(Zhang, D.Y., Brandwein, M., Hsuih, T., Li, H.B., 2001. Mol. Diagn. 6 (2), 141-150), Multiple displacement amplifcation(MDA)(Dean, F.B., Nelson, J.R., Giesler, T.L., Lasken, R.S.,2001. Genome Res. 11 (6), 1095-1099, 및 Spits, C., Le Caignec, C., De Rycke, M., Van Haute, L., Van Steirteghem, A., Liebaers, I., Sermon, K., 2006. Nat. Protoc. 1 (4), 1965-1970), Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)(Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., Hase, T., 2000. Nucleic Acids Res. 28 (12), E63) 등을 들 수 있다. 어떤 방법이라도 정해진 방법에 의해 실시할 수 있다. 어느 방법을 이용할지는, 증폭시키는 DNA의 형상(직쇄상 또는 환상) 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
공정 (2)에 있어서, 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를 등온에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭시키는 경우, 등온 조건으로는, DNA 증폭 반응 또는 DNA 복제 반응이 진행될 수 있는 것이라면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 DNA 폴리메라아제의 최적 온도에 포함되는 일정한 온도이다. 등온 조건으로는, 예를 들면 20℃ 이상, 25℃ 이상 또는 30℃ 이상의 일정한 온도, 및 80℃ 이하, 65℃ 이하, 60℃ 이하, 50℃ 이하, 45℃ 이하, 40℃ 이하, 35℃ 이하 또는 33℃ 이하의 일정한 온도를 들 수 있다. 또한 등온 조건은, 예를 들면 20℃∼80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도, 20℃∼65℃의 범위에 포함되는 일정한 온도, 25℃∼50℃의 범위에 포함되는 일정한 온도, 25℃∼40℃의 범위에 포함되는 일정한 온도, 30℃∼33℃의 범위에 포함되는 일정한 온도, 또는 30℃ 정도일 수 있다. 본 명세서에서 '등온에서 인큐베이션한다', '등온 조건하에서 보온한다', '등온에서 반응시킨다' 등의 용어는, 반응중에 설정한 온도에 대해 ±7℃, ±5℃, ±3℃ 또는 ±1℃의 온도 범위내로 유지하는 것을 의미한다. 보온 시간은 목적하는 환상 DNA의 증폭 산물의 양에 따라 적절히 설정할 수 있지만, 예를 들면 1시간∼24시간, 바람직하게는 18시간∼21시간으로 할 수 있다.
공정 (2)에 있어서, 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭시키는 경우, 제1 온도는 환상 DNA의 복제 개시가 가능한 온도이며, 제2 온도는 복제 개시가 억제되고 DNA의 신장 반응이 진행되는 온도이다. 제1 온도는 30℃ 이상, 예를 들면 30℃∼80℃, 30℃∼50℃, 30℃∼40℃ 또는 37℃일 수 있다. 제1 온도에서의 인큐베이션은, 특별히 한정되지 않지만, 1 사이클당 10초∼10분간이라도 되고, 1분간이 바람직하다. 제2 온도는 27℃ 이하, 예를 들면 10℃∼27℃, 16℃∼25℃ 또는 24℃일 수 있다. 제2 온도에서의 인큐베이션은, 특별히 한정되지 않지만, 증폭하는 환상 DNA의 길이에 맞춰 설정하는 것이 바람직하고, 예를 들면 1 사이클에 대해, 1000 염기당 1초간∼10초간이라도 된다. 온도 사이클의 사이클수는 특별히 한정되지 않지만, 10 사이클∼50 사이클, 20 사이클∼45 사이클, 25 사이클∼45 사이클, 40 사이클이라도 된다.
본 발명의 방법에서는, 공정 (1)의 뒤에, 인공 DNA 절단 효소에 의해, 결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA를 특이적으로 절단하는 공정을 포함해도 된다. 결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA가 절단되면, 전술한 DNA 증폭 기술에서는 해당 DNA가 증폭되지 않기 때문에, 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA의 수율을 큰 폭으로 개선할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 상이한 서열을 절단하는 2종류 이상의 인공 DNA 절단 효소를 사용해도 된다. 예를 들면, 공정 (1)에서 2종류 이상의 주형 DNA를 이용한 경우, 각 주형 DNA를 특이적으로 절단하는 2종류 이상의 인공 DNA 절단 효소를 사용할 수 있다. 또는, 공정 (1)에서 1종류의 주형 DNA를 이용해 2 부위 이상의 변이를 도입한 경우, 각 변이 도입 부위에 대해 변이가 도입되지 않은 서열을 특이적으로 절단하는 2종류 이상의 인공 DNA 절단 효소를 사용할 수 있다.
여기에서, '결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA를 특이적으로 절단한다'란, 결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA를 절단하지만, 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA는 절단하지 않는 것을 의미한다. 이와 같은 인공 DNA 절단 효소는, 정해진 방법에 의해 조제할 수 있다. 예를 들면, 인공 DNA 절단 효소로서 CRISPR-Cas9를 이용하는 경우, 결실, 치환 또는 부가전의 서열을 포함하는 영역에 결합하도록 가이드 RNA를 설계함으로써, 결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA를 특이적으로 절단할 수 있다.
이와 같은 인공 DNA 절단 효소에 의한 결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA의 특이적 절단은, 공정 (1) 이후 공정 (2) 이전에 행해도 된다.
또한 인공 DNA 절단 효소는, 통상, 열처리에 의해 불활성화되기 쉬워, PCR 반응과 같은 94℃ 이상의 고온에서의 인큐베이션을 필요로 하는 DNA 증폭 반응계에서는 기능하지 않는 경우가 있다. 본 발명의 방법에서의 공정 (2)는, 94℃ 이상의 고온에서의 인큐베이션을 포함하지 않기 때문에, DNA 증폭 반응과 동시에 인공 DNA 절단 효소에 의한 처리를 실시할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시 형태에 있어서, 공정 (2)를, 결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA를 특이적으로 절단하는 인공 DNA 절단 효소의 존재하에서 실시해도 된다. 이 경우, 반응 공정을 증가시키지 않고, 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA의 수율을 큰 폭으로 개선할 수 있다.
이하, 본 발명의 일 형태로서 RCR법에 의해 DNA를 증폭시키는 실시 형태에 대해 설명한다.
＜RCR법＞
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 방법의 공정 (2)는 RCR법에 의해 실시할 수 있다. RCR법은, 이하의 공정을 포함하는 환상 DNA의 증폭 방법이다.
(2-1) (a) 환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1 효소군, (b) 오카자키 절편 연결 반응을 촉매해, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2 효소군, 및 (c) 2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3 효소군을 함유하는 반응 용액과, 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 환상 DNA의 반응 혼합물을 조제하는 공정;
(2-2) 공정 (2-1)에서 조제한 반응 혼합물을, 등온, 즉, 20℃∼80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도에서 인큐베이션하거나 또는 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 공정.
1. 환상 DNA
RCR법에서 주형으로 이용하는 환상 DNA는 이중가닥인 것이 바람직하다. 주형으로 이용하는 환상 DNA로는, 미생물의 환상 염색체 등의 천연의 환상 DNA, 천연의 환상 DNA를 효소 처리 등에 의해 절단한 것 등에 다른 DNA 단편을 연결하고, 그것을 환상화한 환상 DNA, 천연에서 직쇄상으로 존재하는 DNA를 환상화 처리한 환상 DNA, 전부 인공적으로 합성한 환상 DNA 등을 예시할 수 있다. 환상 DNA는, 복제 개시 단백질이 결합 가능한 복제 개시 서열을 포함해도 되고, 포함하지 않아도 되지만, 복제 개시 단백질이 결합 가능한 복제 개시 서열을 포함하는 것이 바람직하고, DnaA 활성을 갖는 효소와 결합 가능한 복제 개시 서열(oriC)을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
복제 개시 서열과 거기에 결합 가능한 복제 개시 단백질의 조합은, 당해 기술 분야에서 공지이며(예를 들면, Cell, Volume 54, Issue 7, Pages 915-918 (1988) 참조), 본 발명에서는 이들 중 어느 것을 이용해도 된다. 이와 같은 조합의 예로는, oriC와 DnaA 활성을 갖는 효소(예를 들면, 대장균, 고초균 등의 세균에 존재하는 복제 개시 서열과 DnaA 단백질), pSC101의 복제 개시 서열과 pSC101 repA, P1의 복제 개시 서열과 P1 repA, F의 복제 개시 서열과 E 단백질, R1의 복제 개시 서열과 R1 repA, R6K oriγ와 π 단백질, λ의 복제 개시 서열과 λO 단백질, φ82의 복제 개시 서열과 φ82 O 단백질, φ80의 복제 개시 서열과 φ80 O 단백질, RK2의 복제 개시 서열과 RK2 trfA 단백질, P4의 복제 개시 서열과 α 단백질 등을 들 수 있다.
복제 개시 단백질 및 복제 개시 서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 등의 공적 데이터베이스에 등록되어 있는 서열 정보에 기초해 입수할 수 있다. 또한 복제 개시 서열은, 복제 개시 단백질과 결합 가능한 DNA 단편을 클로닝하고, 그 염기서열을 해석함으로써 얻을 수도 있다.
본 발명에서 주형으로 이용하는 환상 DNA는, 원래 복제 개시 서열을 포함하는 환상 DNA라도 되고, 원래는 복제 개시 서열을 포함하지 않는 환상 DNA에 복제 개시 서열을 도입한 것이라도 된다.
주형으로 이용하는 환상 DNA가 복제 개시 단백질이 결합 가능한 복제 개시 서열을 포함하지 않는 경우, DNA 재조합 중간체(D-loop)의 형성 또는 전사 중간체(R-loop)의 형성을 개재해 DNA의 복제가 개시된다.
본 발명에서 주형으로 이용하는 환상 DNA는, 목적에 따라, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린 등의 약제 내성 마커 유전자 서열을 포함하는 것이라도 된다.
본 발명에서 주형으로 이용하는 환상 DNA는, 정제된 것이라도 되지만, 환상 DNA를 포함하는 균체 추출물 등의 현탁액의 형태라도 된다. 또한, 1종류의 환상 DNA를 주형으로 이용해도 되지만, 예를 들면 DNA 라이브러리와 같은 복수 종류의 환상 DNA의 혼합물을 1개의 시험관내에서 주형으로 이용해도 된다.
1 반응당 이용하는 주형 DNA의 양에 특별히 제한은 없고, 1 반응당 1 분자의 환상 DNA를 주형으로 이용할 수도 있다.
본 발명에서 주형으로 이용하는 환상 DNA의 길이에 제한은 없지만, 예를 들면 1 kb(1000 염기 길이) 이상, 5 kb(5000 염기 길이) 이상, 8 kb(8,000 염기 길이) 이상, 8.8 kb(8,800 염기 길이) 이상, 9.5 kb(9,500 염기 길이) 이상, 10 kb(10,000 염기 길이) 이상, 50 kb(50,000 염기 길이) 이상, 100 kb(100,000 염기 길이) 이상, 101 kb(101,000 염기 길이) 이상, 183 kb(183,000 염기 길이) 이상, 200 kb(200,000 염기 길이) 이상, 205 kb(205,000 염기 길이) 이상, 500 kb(500,000 염기 길이) 이상, 1000 kb(1,000,000 염기 길이) 이상 또는 2000 kb(2,000,000 염기 길이) 이상의 길이로 할 수 있다. 한편, 환상 DNA의 길이의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 10000 kb 정도로 할 수 있다.
본 발명에서는, 전술한 환상 DNA를 주형으로 이용해, 이를 적어도 10배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배 또는 10000배로 증폭시킬 수 있다.
2. 제1, 제2 및 제3 효소군
2-1. 제1 효소군
본 명세서에서 제1 효소군이란, 환상 DNA의 복제를 촉매하는 효소군을 의미한다.
2-1-1. 환상 DNA가 복제 개시 서열을 포함하는 경우
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1 효소군으로는, 예를 들면 Kaguni JM & Kornberg A. Cell. 1984, 38:183-90에 기재된 효소군을 이용할 수 있다. 구체적으로, 제1 효소군으로는 이하: 복제 개시 단백질(예를 들면, DnaA 활성을 갖는 효소), 1종 이상의 핵상체(nucleoid) 단백질, DNA 자이레이스(gyrase) 활성을 갖는 효소 또는 효소군, 단일가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB)), DNA 헬리카제(helicase) 활성을 갖는 효소(예를 들면, DnaB형 헬리카제 활성을 갖는 효소), DNA 헬리카제 로더(helicase loader) 활성을 갖는 효소, DNA 프리마제(primase) 활성을 갖는 효소, DNA 클램프 활성을 갖는 효소, 및 DNA 폴리메라아제 III* 활성(DNA 폴리메라아제 III 전효소(holoenzyme)로부터 클램프를 제외한 것)을 갖는 효소 또는 효소군으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소 또는 효소군의 하나 이상, 혹은 이들 효소 또는 효소군의 모든 조합을 예시할 수 있다.
복제 개시 단백질은, 환상 DNA에 존재하는 복제 개시 서열에 대해 개시 활성을 갖는 단백질이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 또한 DnaA 활성을 갖는 효소는, 대장균의 개시 단백질인 DnaA와 같은 개시 활성을 갖는 효소라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 DnaA를 바람직하게 이용할 수 있다. 복제 개시 단백질은 단량체로서, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 nM(nmol/L)∼10 μM(μmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 1 nM∼5 μM, 1 nM∼3 μM, 1 nM∼1.5 μM, 1 nM∼1.0 μM, 1 nM∼500 nM, 50 nM∼200 nM, 50 nM∼150 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 100 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
핵상체 단백질은, 핵상체에 포함되는 단백질을 말한다. 본 발명에서 이용하는 1종 이상의 핵상체 단백질은, 대장균의 핵상체 단백질과 같은 활성을 갖는 효소라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 IHF, 즉 IhfA 및 IhfB로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 복합체(헤테로다이머 또는 호모다이머)나, 대장균 유래의 HU, 즉 hupA 및 hupB의 복합체를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 IHF는 헤테로/호모다이머로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 5 nM(nmol/L)∼400 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5 nM∼200 nM, 5 nM∼100 nM, 5 nM∼50 nM, 10 nM∼50 nM, 10 nM∼40 nM, 10 nM∼30 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 20 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 대장균 유래의 HU는 반응 용액 중에 1 nM∼50 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5 nM∼50 nM, 5 nM∼25 nM의 범위로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
DNA 자이레이스 활성을 갖는 효소 또는 효소군으로는, 대장균의 DNA 자이레이스와 같은 활성을 갖는 효소라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 GyrA 및 GyrB로 이루어지는 복합체를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 GyrA 및 GyrB로 이루어지는 복합체는 헤테로테트라머로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 20 nM(nmol/L)∼500 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20 nM∼400 nM, 20 nM∼300 nM, 20 nM∼200 nM, 50 nM∼200 nM, 50 nM∼100 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 50 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
단일가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB))로는, 대장균의 단일가닥 DNA 결합 단백질과 같은 활성을 갖는 효소라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 SSB를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 SSB는 호모테트라머로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 20 nM(nmol/L)∼1000 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20 nM∼500 nM, 20 nM∼300 nM, 20 nM∼200 nM, 50 nM∼500 nM, 50 nM∼400 nM, 50 nM∼300 nM, 50 nM∼200 nM, 50 nM∼150 nM, 100 nM∼500 nM, 100 nM∼400 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 400 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
DnaB형 헬리카제 활성을 갖는 효소로는, 대장균의 DnaB와 같은 활성을 갖는 효소라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 DnaB를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 DnaB는 호모헥사머로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 5 nM(nmol/L)∼200 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5 nM∼100 nM, 5 nM∼50 nM, 5 nM∼30 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 20 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
DNA 헬리카제 로더 활성을 갖는 효소로는, 대장균의 DnaC와 같은 활성을 갖는 효소라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 DnaC를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 DnaC는 호모헥사머로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 5 nM(nmol/L)∼200 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5 nM∼100 nM, 5 nM∼50 nM, 5 nM∼30 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 20 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
DNA 프리마제 활성을 갖는 효소로는, 대장균의 DnaG와 같은 활성을 갖는 효소라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 DnaG를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 DnaG는 단량체로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 20 nM(nmol/L)∼1000 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20 nM∼800 nM, 50 nM∼800 nM, 100 nM∼800 nM, 200 nM∼800 nM, 250 nM∼800 nM, 250 nM∼500 nM, 300 nM∼500 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 400 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
DNA 클램프 활성을 갖는 효소로는, 대장균의 DnaN와 같은 활성을 갖는 효소라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 DnaN를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 DnaN는 호모다이머로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 10 nM(nmol/L)∼1000 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 10 nM∼800 nM, 10 nM∼500 nM, 20 nM∼500 nM, 20 nM∼200 nM, 30 nM∼200 nM, 30 nM∼100 nM의 범위로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
DNA 폴리메라아제 III* 활성을 갖는 효소 또는 효소군으로는, 대장균의 DNA 폴리메라아제 III* 복합체와 같은 활성을 갖는 효소 또는 효소군이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ 및 HolE의 어느 하나를 포함하는 효소군, 바람직하게는 대장균 유래의 DnaX, HolA, HolB 및 DnaE의 복합체를 포함하는 효소군, 더 바람직하게는 대장균 유래의 DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ 및 HolE의 복합체를 포함하는 효소군을 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 DNA 폴리메라아제 III* 복합체는 헤테로 다량체로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 2 nM(nmol/L)∼50 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 2 nM∼40 nM, 2 nM∼30 nM, 2 nM∼20 nM, 5 nM∼40 nM, 5 nM∼30 nM, 5 nM∼20 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 5 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
2-1-2. 환상 DNA가 복제 개시 서열을 포함하지 않는 경우
환상 DNA가 복제 개시 서열을 포함하지 않고, 복제 개시에 D-loop를 이용하는 경우, 제1 효소군으로는, 예를 들면 재조합 효소(예를 들면, RecA 또는 그 상동체(예를 들면, T4파지의 UvsX)), 재조합 효소의 DNA로의 도입에 기능하는 효소(예를 들면, RecO 및 RecR 또는 이들의 상동체(예를 들면, UvsX에 대해서는 UvsY), D-loop로의 헬리카제 도입에 기능하는 프라이모솜 단백질군(예를 들면, PriA, PriB, PriC 및 DnaT)을 이용할 수 있다.
환상 DNA가 복제 개시 서열을 포함하지 않고, 복제 개시에 R-loop를 이용하는 경우, 제1 효소군으로는, 예를 들면 RNA 폴리메라아제, R-loop로의 헬리카제 도입에 기능하는 프라이모솜 단백질군(예를 들면, PriA, PriB, PriC 및 DnaT)을 이용할 수 있다.
2-2. 제2 효소군
본 명세서에서 제2 효소군이란, 오카자키 절편 연결 반응을 촉매해 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 효소군을 의미한다.
본 발명에서 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA란, DNA 복제 반응에 의해 합성된 2개의 환상 DNA가 연결된 상태에 있는 것을 말한다.
오카자키 절편 연결 반응을 촉매해, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2 효소군으로는, 예를 들면 DNA 폴리메라아제 I 활성을 갖는 효소, DNA 리가아제 활성을 갖는 효소, 및 RNaseH 활성을 갖는 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 효소 또는 이들 효소의 조합을 예시할 수 있다.
DNA 폴리메라아제 I 활성을 갖는 효소로는, 대장균의 DNA 폴리메라아제 I과 같은 활성을 갖는 것이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 DNA 폴리메라아제 I을 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 DNA 폴리메라아제 I은 단량체로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 10 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20 nM∼200 nM, 20 nM∼150 nM, 20 nM∼100 nM, 40 nM∼150 nM, 40 nM∼100 nM, 40 nM∼80 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 50 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
DNA 리가아제 활성을 갖는 효소로는, 대장균의 DNA 리가아제와 같은 활성을 갖는 것이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 DNA 리가아제 또는 T4파지의 DNA 리가아제를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 DNA 리가아제는 단량체로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 10 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 15 nM∼200 nM, 20 nM∼200 nM, 20 nM∼150 nM, 20 nM∼100 nM, 20 nM∼80 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 50 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
RNaseH 활성을 갖는 효소로는, RNA:DNA 하이브리드의 RNA 사슬을 분해하는 활성을 갖는 것이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 RNaseH를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 RNaseH는 단량체로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.2 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 0.2 nM∼200 nM, 0.2 nM∼100 nM, 0.2 nM∼50 nM, 1 nM∼200 nM, 1 nM∼100 nM, 1 nM∼50 nM, 10 nM∼50 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 10 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
2-3. 제3 효소군
본 명세서에서 제3 효소군이란, 2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 효소군을 의미한다.
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3 효소군으로는, 예를 들면 Peng H & Marians KJ. PNAS. 1993, 90: 8571-8575에 기재된 효소군을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 제3 효소군으로서 이하: 토포이소머라아제 IV 활성을 갖는 효소, 토포이소머라아제 III 활성을 갖는 효소 및 RecQ형 헬리카제 활성을 갖는 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 효소 또는 이들 효소의 조합을 예시할 수 있다.
토포이소머라아제 III 활성을 갖는 효소로는, 대장균의 토포이소머라아제 III와 같은 활성을 갖는 것이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 토포이소머라아제 III를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 토포이소머라아제 III는 단량체로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 20 nM(nmol/L)∼500 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20 nM∼400 nM, 20 nM∼300 nM, 20 nM∼200 nM, 20 nM∼100 nM, 30 nM∼80 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 50 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
RecQ형 헬리카제 활성을 갖는 효소로는, 대장균의 RecQ와 같은 활성을 갖는 것이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 RecQ를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 RecQ는 단량체로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 20 nM(nmol/L)∼500 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20 nM∼400 nM, 20 nM∼300 nM, 20 nM∼200 nM, 20 nM∼100 nM, 30 nM∼80 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 50 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
토포이소머라아제 IV 활성을 갖는 효소로는, 대장균의 토포이소머라아제 IV와 같은 활성을 갖는 것이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 ParC와 ParE의 복합체인 대장균 유래의 토포이소머라아제 IV를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 토포이소머라아제 IV는 헤테로테트라머로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 nM(nmol/L)∼50 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 0.1 nM∼40 nM, 0.1 nM∼30 nM, 0.1 nM∼20 nM, 1 nM∼40 nM, 1 nM∼30 nM, 1 nM∼20 nM, 1 nM∼10 nM, 1 nM∼5 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 5 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
상기 제1, 제2 및 제3 효소군은 시판중인 것을 이용해도 되고, 미생물 등으로부터 추출해, 필요에 따라서 정제한 것을 이용해도 된다. 미생물로부터의 효소의 추출 및 정제는 당업자가 이용 가능한 방법을 이용해 적절히 실시할 수 있다.
상기 제1, 제2 및 제3 효소군으로 전술한 대장균 유래 효소 외의 것을 이용하는 경우는, 상기 대장균 유래의 효소에 대해 특정된 농도 범위에 대해, 효소 활성 단위로서 상당하는 농도 범위에서 이용할 수 있다.
상기 효소의 무세포 단백질 발현계를 포함하는 반응 용액을, 그대로 주형이 되는 환상 DNA와 혼합해, 환상 DNA의 복제 또는 증폭을 위한 반응 혼합액을 형성해도 된다. 무세포 단백질 발현계는, 상기 효소를 코딩하는 유전자의 염기서열에 상보적인 서열로 이루어지는 RNA를 포함하는 총RNA(total RNA), mRNA 또는 in vitro 전사 산물 등을 주형 RNA로 하는 무세포 번역계라도 되고, 각 효소를 코딩하는 유전자 또는 각 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터 등을 주형 DNA로 하는 무세포 전사 번역계라도 된다.
이하, RCR법 I∼V로서 RCR법에 의해 환상 DNA를 증폭시키는 실시 형태를 설명한다. 한편, RCR법 I∼V에 있어서, 'DnaA 활성을 갖는 효소와 결합 가능한 복제 개시 서열' 및 'oriC'는 '복제 개시 서열'로, 'DnaA 활성을 갖는 효소'는 '복제 개시 서열에 결합 가능한 복제 개시 단백질'로, 각각 바꾸어 읽을 수 있다.
＜RCR법 I＞
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에서의 RCR법은, 상기 제1∼제3 효소군을 함유하는 반응 용액과 주형이 되는 환상 DNA의 반응 혼합물을 형성하는 공정을 포함한다(특허 문헌 5 참조).
제1∼제3 효소군을 함유하는 반응 용액의 조성은, DNA 복제 반응을 진행할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 트리스 염산 완충액 등의 완충액에, rNTP, dNTP, 마그네슘 이온원, ATP원 등을 첨가한 용액에, 제1∼제3 효소군을 첨가한 것 등을 이용할 수 있다. 또한, 상기 반응 용액은, 부차적 산물의 생성을 억제하는 성분 등의 추가 성분을 더 포함하는 것이라도 된다. 구체적인 반응 용액으로는, 후술하는 실시예에 기재된 것을 예시할 수 있다.
RCR법 I은, 상기 반응 혼합물을 등온 조건하에서 보온하는 공정을 더 포함한다. 등온 조건으로는, DNA 복제 반응을 진행할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 DNA 폴리메라아제의 최적 온도인 20∼80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도로 할 수 있고, 25℃∼50℃의 범위에 포함되는 일정한 온도로 할 수 있고, 30℃∼33℃ 정도로 할 수 있다. 보온 시간은, 목적하는 환상 DNA의 증폭 산물의 양에 따라 적절하게 설정할 수 있지만, 예를 들면 1시간∼24시간으로 할 수 있고, 16시간∼21시간으로 할 수 있다.
RCR법 I은 상기 반응 혼합물을 등온 조건하에서 보온하는 공정 이후에, 목적에 따라, 환상 DNA의 증폭 산물을 정제하는 공정을 포함해도 된다. 환상 DNA의 정제는, 당업자가 이용 가능한 방법을 이용해 적절히 실시할 수 있다.
RCR법 I을 이용해 증폭한 환상 DNA는, 반응 후의 반응 혼합물을 그대로 혹은 적절하게 정제한 것을, 형질 전환 등의 이후의 목적에 이용할 수 있다.
＜RCR법 II＞
일 실시 형태에 있어서, 본 발명에서의 RCR법은, 이하의 공정:
(II-1) 주형이 되는 환상 DNA와, 이하:
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1 효소군;
오카자키 절편 연결 반응을 촉매해, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2 효소군;
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3 효소군;
완충액;
ATP;
GTP, CTP 및 UTP;
dNTP;
마그네슘 이온원; 및
알칼리 금속 이온원;을 함유하는 반응 용액의 반응 혼합물을 형성하는 공정을 포함하고,
여기에서 상기 환상 DNA는 DnaA 활성을 갖는 효소와 결합 가능한 복제 개시 서열(origin of chromosome(oriC))을 포함한다(특허 문헌 6 참조).
본 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 상기 공정 (II-1)의 전에, 반응 용액을 프리인큐베이션하는 공정을 더 포함해도 된다. 즉, 본 발명의 방법은, 이하의 공정:
(II-1-1) 이하:
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1 효소군;
오카자키 절편 연결 반응을 촉매해, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2 효소군;
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3 효소군;
완충액;
ATP;
GTP, CTP 및 UTP;
dNTP;
마그네슘 이온원; 및
알칼리 금속 이온원;을 함유하는 반응 용액을 프리인큐베이션하는 공정; 및
(II-1-2) 상기 반응 용액과 주형이 되는 환상 DNA의 반응 혼합물을 형성하는 공정을 포함할 수 있다. 여기에서 상기 환상 DNA는 DnaA 활성을 갖는 효소와 결합 가능한 복제 개시 서열(origin of chromosome(oriC))을 포함한다.
프리인큐베이션은, 예를 들면 0℃∼40℃, 10℃∼40℃, 15℃∼37℃ 또는 16℃∼30℃의 범위에서, 5분간∼60분간, 5분간∼45분간, 5분간∼30분간, 15분간∼60분간, 15분간∼45분간, 15분간∼30분간 보온함으로써 행해도 된다. 프리인큐베이션은, 반응 용액의 온도가 상기 온도 범위내로 유지되면 프리인큐베이션 중에 약간 변동되어도 된다.
이론에 의해 제한되는 것은 아니지만, RCR법 II에서는 복제 사이클이 반복되어 환상 DNA가 지수적으로 증폭된다. 본 발명의 방법에서는, 전술한 환상 DNA를 주형으로서 이용해, 이를 적어도 10배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배 또는 10000배로 증폭할 수 있다.
반응 용액과 혼합하는 환상 DNA에 대해서는, 상기 '1. 환상 DNA'의 항목에 기재한 바와 같다. 1 반응당 이용하는 주형 DNA의 양에 특별히 제한은 없고, 예를 들면 반응 개시시에 반응 용액의 총용적에 대해, 10 ng/μL 이하, 5 ng/μL 이하, 1 ng/μL 이하, 0.8 ng/μL 이하, 0.5 ng/μL 이하, 0.3 ng/μL 이하의 농도로 반응 용액 중에 존재시켜도 된다. 한편, 1 반응당 이용하는 주형 DNA의 양의 하한은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 7.5 fg/μL, 0.67 pg/μL, 1 pg/μL, 10 pg/μL, 14 pg/μL, 50 pg/μL 또는 75 pg/μL로 할 수 있다. 한편, 반응 개시시에, 1 반응당 1 분자의 환상 DNA를 주형으로서 존재시켜 증폭에 이용할 수도 있다.
반응 용액에 포함되는 완충액은, pH 7∼9, 바람직하게는 pH 8에서 이용하는데 적합한 완충액이면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Tris-HCl, Tris-OAc, Hepes-KOH, 인산 완충액, MOPS-NaOH, Tricine-HCl 등을 들 수 있다. 바람직한 완충액은 Tris-HCl 또는 Tris-OAc이다. 완충액의 농도는 당업자가 적절하게 선택할 수 있어 특별히 한정되지 않지만, Tris-HCl 또는 Tris-OAc의 경우, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 10 mM(mmol/L)∼100 mM(mmol/L), 10 mM∼50 mM, 20 mM의 농도를 선택할 수 있다.
ATP는 아데노신3인산(adenosine triphosphate)을 의미한다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 ATP의 농도는, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 mM(mmol/L)∼3 mM(mmol/L)의 범위이면 되고, 바람직하게는 0.1 mM∼2 mM, 0.1 mM∼1.5 mM, 0.5 mM∼1.5 mM의 범위이면 되고, 보다 바람직하게는 1 mM라도 된다.
GTP, CTP 및 UTP는, 각각 구아노신3인산(guanosine triphosphate), 시티딘3인산(cytidine triphosphate) 및 우리딘3인산(uridine triphosphate)을 의미한다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 GTP, CTP 및 UTP의 농도는, 각각 독립적으로, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 mM(mmol/L)∼3.0 mM(mmol/L)의 범위이면 되고, 바람직하게는 0.5 mM∼3.0 mM, 0.5 mM∼2.0 mM의 범위라도 된다.
dNTP는, 데옥시아데노신3인산(dATP), 데옥시구아노신3인산(dGTP), 데옥시시티딘3인산(dCTP) 및 데옥시티미딘3인산(dTTP)의 총칭이다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 dNTP의 농도는, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 mM(mmol/L)∼1 mM(mmol/L)의 범위이면 되고, 바람직하게는 0.05 mM∼1 mM, 0.1 mM∼1 mM의 범위이면 되고, 보다 바람직하게는 0.25 mM∼1 mM의 범위라도 된다.
마그네슘 이온원은, 반응 용액 중에 마그네슘 이온(Mg2+)을 제공하는 물질이다. 예를 들면, Mg(OAc)2, MgCl2, MgSO4 등을 들 수 있다. 바람직한 마그네슘 이온원은 Mg(OAc)2이다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 마그네슘 이온원의 농도는, 예를 들면 반응 용액 중에 마그네슘 이온을 반응 용액의 총용적에 대해, 5 mM(mmol/L)∼50 mM(mmol/L)의 범위로 제공하는 농도이면 되고, 1 mM이 바람직하다.
알칼리 금속 이온원은, 반응 용액 중에 알칼리 금속 이온을 제공하는 물질이다. 알칼리 금속 이온으로는, 예를 들면 나트륨 이온(Na+), 칼륨 이온(K+)을 들 수 있다. 알칼리 금속 이온원의 예로는, 글루탐산 칼륨, 아스파라긴산 칼륨, 염화 칼륨, 아세트산 칼륨, 글루탐산 나트륨, 아스파라긴산 나트륨, 염화 나트륨 및 아세트산 나트륨을 들 수 있다. 바람직한 알칼리 금속 이온원은 글루탐산 칼륨 또는 아세트산 칼륨이다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 알칼리 금속 이온원의 농도는, 반응 용액 중에 알칼리 금속 이온을 반응 용액의 총용적에 대해, 100 mM(mmol/L) 이상, 바람직하게는 100 mM∼300 mM의 범위에서 제공하는 농도이면 되고, 보다 바람직하게는 50 mM로 제공하는 농도라도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 선행하는 출원과의 균형에 있어서는, 상기 알칼리 금속 이온원의 농도로부터 150 mM이 제외되어도 된다.
RCR법 II에 이용하는 반응 용액은, 단백질의 비특이 흡착 억제제 또는 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 함유해도 된다. 바람직하게, 반응 용액은 단백질의 비특이 흡착 억제제 및 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 함유해도 된다. 단백질의 비특이 흡착 억제제 및 핵산의 비특이 흡착 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 비특이 흡착 억제제가 반응 용액 중에 존재함으로써 반응 효율이 향상된다. 단백질의 비특이 흡착 억제제 및 핵산의 비특이 흡착 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 비특이 흡착 억제제가, 단백질끼리 및 단백질과 환상 DNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 비특이 흡착이나, 단백질 및 환상 DNA의 용기 표면에의 부착을 억제함으로써 반응 효율이 향상된다고 생각된다.
단백질의 비특이 흡착 억제제란, 본 발명의 방법에서의 증폭 반응과는 관계없는 단백질이다. 이와 같은 단백질로는, 예를 들면 소 혈청 알부민(BSA), 리소자임, 젤라틴, 헤파린 및 카세인 등을 들 수 있다. 단백질의 비특이 흡착 억제제는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.02 mg/mL∼2.0 mg/mL의 범위, 바람직하게는 0.1 mg/mL∼2.0 mg/mL, 0.2 mg/mL∼2.0 mg/mL, 0.5 mg/mL∼2.0 mg/mL의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 0.5 mg/mL로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
핵산의 비특이 흡착 억제제란, 본 발명의 방법에서의 증폭 반응과는 관계없는 핵산 분자 또는 핵산 유사 인자이다. 이와 같은 핵산 분자 또는 핵산 유사 인자로는, 예를 들면 tRNA(트랜스퍼 RNA), rRNA(리보솜 RNA), mRNA(메신저 RNA), 글리코겐, 헤파린, 올리고 DNA, poly(I-C)(폴리이노신-폴리시티딘), poly(dI-dC)(폴리데옥시이노신-폴리데옥시시티딘), poly(A)(폴리아데닌) 및 poly(dA)(폴리데옥시아데닌) 등을 들 수 있다. 핵산의 비특이 흡착 억제제는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 ng/μL∼500 ng/μL의 범위, 바람직하게는 10 ng/μL∼500 ng/μL, 10 ng/μL∼200 ng/μL, 10 ng/μL∼100 ng/μL의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 50 ng/μL로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 선행하는 출원과의 균형에 있어서는, 핵산의 비특이 흡착 억제제로서 tRNA를 선택하는 경우, tRNA의 농도로부터 50 ng/μL가 제외되어도 된다.
본 발명의 방법에 이용하는 반응 용액은, DNA의 안정화 인자를 더 함유하고 있어도 된다. DNA의 안정화 인자가 반응 용액 중에 존재함으로써, DNA의 절단이 억제되어 주형 DNA 및 증폭 산물을 보호할 수 있을 것으로 생각된다. DNA의 안정화 인자의 첨가에 의해, 목적 산물의 수율 향상으로 이어진다. 특히, 주형 DNA가 장쇄 환상 DNA인 경우에는, 주형 DNA 및 증폭 산물이 분해되기 쉽기 때문에, DNA의 안정화 인자의 첨가는 유익하다. DNA의 안정화 인자는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 글루코오스, 수크로오스, 디메틸술폭시드(DMSO), 소 혈청 알부민(BSA), 글리콜에테르디아민4아세트산(EGTA), 바소쿠프로인디술폰산2나트륨(BDA), 페니실라민, 타이론(Tiron, 1,2-디히드록시벤젠-3,5-술포네이트), 디에틸렌트리아민5아세트산(DTPA), 에틸렌디아민4아세트산(EDTA), Dps 단백질(대장균 유래), 메탈로티오네인 단백질(인간 유래)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이라도 된다. 이 중에서도 DTPA, Tiron, BDA, Dps 단백질 및 BSA는, 환상 DNA 증폭 반응의 효율화 작용도 가지므로 특히 바람직하다. DTPA 또는 Tiron은 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 mM(mmol/mL)∼0.3 mM(mmol/mL), 바람직하게는 0.05 mM∼0.25 mM의 범위로 포함되어도 되고, 보다 바람직하게는 0.25 mM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. BDA는, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 mM(mmol/mL)∼0.5 mM(mmol/mL), 바람직하게는 0.05 mM∼0.3 mM의 범위로 포함되어 있어도 되지만 이것으로 한정되지 않는다. Dps 단백질은 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.3 μM(μmol/mL)∼3.0 μM(μmol/mL), 바람직하게는 0.3 μM∼1.5 μM의 범위로 포함되어 있어도 되지만 이것으로 한정되지 않는다. BSA는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.02 mg/mL∼2.0 mg/mL의 범위, 바람직하게는 0.1 mg/mL∼2.0 mg/mL, 0.2 mg/mL∼2.0 mg/mL, 0.5 mg/mL∼2.0 mg/mL의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 0.5 mg/mL로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
RCR법 II에 이용하는 반응 용액은, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 또는 RecG형 헬리카제를 더 함유하고 있어도 된다. 바람직하게는, 반응 용액은 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 RecG형 헬리카제를 더 함유하고 있어도 된다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 RecG형 헬리카제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이 반응 용액 중에 존재함으로써, 증폭 반응중에 이중가닥 절단 등에 의해 생기는 직쇄상 DNA의 양을 저감시켜, 목적하는 슈퍼 코일 산물의 수율을 향상시키는 효과가 있다.
RCR법 II에 이용하는 반응 용액은, RecG형 헬리카제 또는 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 함유하고 있어도 된다. 바람직하게는, 반응 용액은 RecG형 헬리카제 및 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 함유하고 있어도 된다. RecG형 헬리카제 및 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이 반응 용액 중에 존재함으로써, 증폭 반응중에 생기는 저분자의 부차적인 증폭 산물의 양을 저감시켜, 목적하는 슈퍼 코일 산물의 수율을 향상시키는 효과가 있다.
RCR법 II에 이용하는 반응 용액은, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 또는 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 함유하고 있어도 된다. 바람직하게는, 반응 용액은 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 함유하고 있어도 된다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이 반응 용액 중에 존재함으로써, 증폭 반응중에 이중가닥 절단 등에 의해 생기는 직쇄상 DNA의 양을 저감시켜, 목적하는 슈퍼 코일 산물의 수율을 향상시키는 효과가 있다.
직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 직쇄상 DNA의 5' 말단 혹은 3' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 효소이다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 직쇄상 DNA의 5' 말단 혹은 3' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 활성을 갖는 것이라면, 그 종류나 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, RecBCD, λ 엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제 VIII, T5 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제 및 Plasmid-SafeTM ATP-Dependent DNase(epicentre) 등을 이용할 수 있다. 바람직한 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는 RecBCD이다. 직쇄상 DNA 엑소뉴클레아제는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.001 U/μL∼1.0 U/μL, 바람직하게는 0.005 U/μL∼1.0 U/μL, 0.01 U/μL∼1.0 U/μL, 0.05 U/μL∼1.0 U/μL, 0.08 U/μL∼1.0 U/μL 또는 0.1 U/μL∼1.0 U/μL의 범위로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 직쇄상 DNA 엑소뉴클레아제에 대한 효소 활성 단위(U)는, 37℃, 30분의 반응에서, 직쇄상 DNA의 1 nmol의 데옥시리보 뉴클레오티드를 산가용성으로 하는데 필요한 효소량을 1U로 한 단위이다.
RecG형 헬리카제는, 신장 반응의 종결시에 복제 포크(folk)끼리가 충돌해 발생하는 부차적인 DNA 구조를 해소하는 헬리카제라고 생각되는 효소이다. RecG형 헬리카제는, 대장균 유래의 RecG와 같은 활성을 갖는 것이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 RecG를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 RecG는 단량체로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 100 nM(nmol/L)∼800 nM(nmol/L)의 범위, 바람직하게는 100 nM∼500 nM, 100 nM∼400 nM, 100 nM∼300 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 60 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. RecG형 헬리카제는, 상기 대장균 유래의 RecG에 대해 특정된 농도 범위에 효소 활성 단위로서 상당하는 농도 범위로 이용할 수 있다.
단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 단일가닥 DNA의 5' 말단 혹은 3' 말단의 뉴클레오티드를 순차적으로 가수분해하는 효소이다. 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 단일가닥 DNA의 5' 말단 또는 3' 말단의 뉴클레오티드를 순차적으로 가수분해하는 활성을 갖는 것이라면, 그 종류나 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 엑소뉴클레아제 I(exo I), RecJ, 엑소뉴클레아제 T 등을 이용할 수 있다. 바람직한 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는 exo I이다. 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 U/μL∼1.0 U/μL의 범위, 바람직하게는 0.15 U/μL∼1.0 U/μL, 0.2 U/μL∼1.0 U/μL 또는 0.2 U/μL∼0.5 U/μL의 범위로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. exo I에 대한 효소 활성 단위(U)는, 37℃, 30분의 반응에서, 단일가닥 DNA의 10 nmol의 데옥시리보 뉴클레오티드를 산가용성으로 하는데 필요한 효소량을 1U로 한 단위이다. RecJ에 대한 효소 활성 단위(U)는, 37℃, 30분의 반응에서, 단일가닥 DNA의 0.05 nmol의 데옥시리보 뉴클레오티드를 산가용성으로 하는데 필요한 효소량을 1U로 한 단위이다.
RCR법 II에 이용하는 반응 용액은 암모늄염을 더 함유하고 있어도 된다. 암모늄염의 예로는, 황산 암모늄, 염화 암모늄 및 아세트산 암모늄을 들 수 있다. 특히 바람직한 암모늄염은 황산 암모늄 또는 아세트산 암모늄이다. 암모늄염은 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 mM(mmol/L)∼100 mM(mmol/L)의 범위, 바람직하게는 0.1 mM∼50 mM, 1 mM∼50 mM, 1 mM∼20 mM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 4 mM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
제2 효소군의 하나로서, DNA 리가아제 활성을 갖는 효소로서 대장균 유래의 DNA 리가아제를 이용하는 경우, 그 보인자(補因子)인 NAD(니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드)가 반응 용액 중에 함유된다. NAD는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 mM(mmol/L)∼1.0 mM(mmol/L)의 범위, 바람직하게는 0.1 mM∼1.0 mM, 0.1 mM∼0.5 mM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 0.25 mM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
RCR법 II에 이용하는 반응 용액은 환원제를 더 함유하고 있어도 된다. 바람직한 환원제의 예로는, DTT, β-메르캅토 에탄올(2-메르캅토 에탄올), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 및 글루타티온을 들 수 있다. 바람직한 환원제는 DTT이다. 환원제는, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1.0 mM(mmol/L)∼15.0 mM(mmol/L)의 농도로, 바람직하게는 2.0 mM∼10.0 mM, 4.0 mM∼8.0 mM의 농도로 포함되어 있어도 된다.
RCR법 II에 이용하는 반응 용액은, ATP를 재생하기 위한 효소 및 기질을 더 함유하고 있어도 된다. ATP 재생계의 효소와 기질의 조합으로는, 크레아틴 키나아제와 크레아틴인산염, 및 피루브산 키나아제와 포스포에놀피루브산을 들 수 있다. ATP 재생계의 효소로는 미오키나아제를 들 수 있다. 바람직한 ATP 재생계의 효소와 기질의 조합은 크레아틴 키나아제 및 크레아틴인산염이다.
반응 용액 중에 함유되는 제1, 제2 및 제3 효소군에 대해서는, 상기 '2. 제1, 제2 및 제3 효소군'의 항목에 기재한 바와 같다.
일 형태에 있어서, RCR법 II에 이용하는 제1 효소군은, DnaA 활성을 갖는 효소, 1종 이상의 핵상체 단백질, DNA 자이레이스 활성을 갖는 효소 또는 효소군, 단일가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB)), DnaB형 헬리카제 활성을 갖는 효소, DNA 헬리카제 로더 활성을 갖는 효소, DNA 프리마제 활성을 갖는 효소, DNA 클램프 활성을 갖는 효소, 및 DNA 폴리메라아제 III* 활성을 갖는 효소 또는 효소군의 조합을 포함하고 있어도 된다. 여기에서, 1종 이상의 핵상체 단백질은 IHF 또는 HU라도 되고, DNA 자이레이스 활성을 갖는 효소 또는 효소군은 GyrA 및 GyrB로 이루어지는 복합체라도 되고, DnaB형 헬리카제 활성을 갖는 효소는 DnaB 헬리카제라도 되고, DNA 헬리카제 로더 활성을 갖는 효소는 DnaC 헬리카제 로더라도 되고, DNA 프리마제 활성을 갖는 효소는 DnaG 프리마제라도 되고, DNA 클램프 활성을 갖는 효소는 DnaN 클램프라도 되고, DNA 폴리메라아제 III* 활성을 갖는 효소 또는 효소군은 DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ 및 HolE의 어느 하나를 포함하는 효소 또는 효소군이라도 된다.
다른 형태에 있어서, RCR법 II에 이용하는 제2 효소군은, DNA 폴리메라아제 I 활성을 갖는 효소 및 DNA 리가아제 활성을 갖는 효소의 조합을 포함하고 있어도 된다. 또는, 제2 효소군은, DNA 폴리메라아제 I 활성을 갖는 효소, DNA 리가아제 활성을 갖는 효소, 및 RNaseH 활성을 갖는 효소의 조합을 포함하고 있어도 된다.
또 다른 형태에 있어서, RCR법 II에 이용하는 제3 효소군은, 토포이소머라아제 III 활성을 갖는 효소 및 토포이소머라아제 IV 활성을 갖는 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 포함하고 있어도 된다. 또는, 제3 효소군은, 토포이소머라아제 III 활성을 갖는 효소 및 RecQ형 헬리카제 활성을 갖는 효소의 조합을 포함하고 있어도 된다. 또는, 제3 효소군은, 토포이소머라아제 III 활성을 갖는 효소, RecQ형 헬리카제 활성을 갖는 효소, 및 토포이소머라아제 IV 활성을 갖는 효소의 조합이라도 된다.
일 형태에 있어서, 공정 (II-2)는 유중수적형 에멀션내에서 실시해도 된다. 유중수적형 에멀션은, 공정 (II-1)에서 형성한 반응 혼합물에 미네랄 오일 및 계면활성제를 첨가해 혼합함으로써 조제할 수 있다. 미네랄 오일 및 계면활성제의 종류 및 양은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다.
RCR법 II는, 공정 (II-2) 이후에, 제1∼제3 효소군을 함유하지 않는 반응 용액으로 5배 이상으로 희석한 후, 재보온하는 공정을 더 포함해도 된다. 효소군의 희석에 의해 새로운 복제 개시가 억제되는 한편, 진행 도중의 복제 신장, 카테난 형성, 분리 반응은 잔류 효소의 효과로 계속 진행된다. 또한, 반응중에 닉 등이 들어가 생긴 부생성물도, 이 과정에서 잔류 리가아제 등의 효과에 의해 수복 가능하다. 따라서, 증폭 중간체나 부생성물로부터 최종 산물으로의 이행이 특이적으로 유도되어, 목적하는 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA의 수율 향상을 기대할 수 있다.
RCR법 II는, 공정 (II-2)의 다음에, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 엑소뉴클레아제로 처리하는 공정을 더 포함해도 된다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 엑소뉴클레아제로 처리함으로써, 증폭 반응중에 생긴 부산물인 직쇄상 DNA를 분해해 제거할 수 있다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 엑소뉴클레아제의 종류 및 이용하는 양은 전술한 바와 같이 해도 무방하다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 엑소뉴클레아제에 의한 처리는, 예를 들면 25℃∼40℃에서 30분간∼3시간 행해도 된다.
RCR법 II는, 공정 (II-2)의 다음에, 갭 수복 효소로 처리하는 공정을 더 포함해도 된다. 갭 수복 효소는, 이중가닥 DNA에 있어서 1개 또는 복수의 연속된 뉴클레오티드가 결여된 상태인 갭, 또는 이중가닥 DNA에 있어서 이웃하는 뉴클레오티드 사이의 인산 디에스테르 결합이 절단된 상태의 닉을 수복해, 완전한 이중가닥 슈퍼 코일 DNA로 하는 효소군이다. 갭 수복 효소로 처리함으로써, 증폭 반응중에 부산물로서 생긴 갭 또는 닉이 들어간 DNA를 수복해, 목적하는 슈퍼 코일 산물의 수율을 향상시키는 효과가 있다.
갭 수복 효소는, 이중가닥 DNA의 갭 또는 닉을 수복할 수 있는 효소군이라면, 그 종류나 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 엑소뉴클레아제 III, DNA 폴리메라아제 I, DNA 리가아제, DNA 자이레이스 활성을 갖는 효소 또는 효소군의 조합을 사용할 수 있다. 엑소뉴클레아제 III 활성을 갖는 효소는 5 mU/μL∼100 mU/μL의 농도로 이용해도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 엑소뉴클레아제 III에 대한 효소 활성 단위(U)는, 37℃, 30분의 반응에서, 이중가닥 DNA의 1 nmol의 데옥시리보 뉴클레오티드를 산가용성으로 하는데 필요한 효소량을 1U로 한 단위이다. DNA 폴리메라아제 I, DNA 리가아제, DNA 자이레이스 활성을 갖는 효소 또는 효소군은, 각각 전술한 제1 또는 제2 효소군에서 정한 농도로 이용해도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 갭 수복 효소에 의한 처리는, 예를 들면 25℃∼40℃에서, 5분간∼120분간, 바람직하게는 10분간∼60분간 실시해도 된다.
RCR법 II는, 공정 (II-2)의 이후에, 목적에 따라, 환상 DNA의 증폭 산물을 정제하는 공정을 포함해도 된다. 환상 DNA의 정제는 당업자가 이용 가능한 방법을 이용해 적절히 실시할 수 있다.
RCR법 II를 이용해 증폭한 환상 DNA는, 반응 후의 반응 혼합물을 그대로 혹은 적절하게 정제한 것을, 형질 전환 등의 이후의 목적에 이용할 수 있다.
＜RCR법 III＞
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 이하의 공정:
(III-1) 주형이 되는 환상 DNA와, 이하:
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1 효소군,
오카자키 절편 연결 반응을 촉매해, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2 효소군, 및
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3 효소군을 포함하는 반응 용액의 반응 혼합물을 형성하는 공정; 및
(III-2) 공정 (III-1)에서 형성한 반응 혼합물을 반응시키는 공정;
을 포함하고,
여기에서 상기 환상 DNA는, DnaA 활성을 갖는 효소와 결합 가능한 복제 개시 서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하고, oriC에 대해 각각 외측을 향해 삽입된 한 쌍의 ter 서열, 및, XerCD가 인식하는 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열을 더 포함하고,
여기에서 상기 환상 DNA가 ter 서열을 갖는 경우, 상기 공정 (III-1)의 반응 용액은 ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질을 더 포함하고, 상기 환상 DNA가 XerCD가 인식하는 염기서열을 갖는 경우, 상기 공정 (III-1)의 반응 용액은 XerCD 단백질을 더 포함한다(특허 문헌 7 참조).
RCR법 III는 환상 DNA를 복제 또는 증폭한다. 본 명세서에 있어서, 환상 DNA를 복제한다는 것은, 주형이 되는 환상 DNA와 동일한 분자를 발생시키는 것을 의미한다. 환상 DNA의 복제는, 반응 후의 반응물 중의 환상 DNA의 양이, 반응 개시시의 주형이 되는 환상 DNA의 양에 대해 증가하고 있는 것으로부터 확인할 수 있다. 바람직하게는, 환상 DNA의 복제는, 반응 개시시의 환상 DNA의 양에 대해, 반응물 중의 환상 DNA의 양이 적어도 2배, 3배, 5배, 7배, 9배로 증대하는 것을 말한다. 환상 DNA를 증폭한다는 것은, 환상 DNA의 복제가 진행되고, 반응물 중의 환상 DNA의 양이 반응 개시시의 주형이 되는 환상 DNA의 양에 대해 지수적으로 증대하는 것을 의미한다. 따라서, 환상 DNA의 증폭은, 환상 DNA의 복제의 일 형태이다. 본 명세서에 있어서 환상 DNA의 증폭은, 반응 개시시의 주형이 되는 환상 DNA의 양에 대해, 반응물 중의 환상 DNA의 양이 적어도 10배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배 또는 10000배로 증대하는 것을 말한다.
반응 용액과 혼합하는 환상 DNA에 대해서는, 상기 '1. 환상 DNA'의 항목에 기재한 바와 같다. 1 반응당 이용하는 주형 DNA의 양에 특별히 제한은 없고, 예를 들면 반응 개시시에 반응 용액의 총용적에 대해, 10 ng/μL 이하, 5 ng/μL 이하, 1 ng/μL 이하, 0.8 ng/μL 이하, 0.5 ng/μL 이하, 0.1 ng/μL 이하, 75 pg/μL 이하, 50 pg/μL 이하, 14 pg/μL 이하, 5 pg/μL 이하, 1 pg/μL 이하, 0.67 pg/μL 이하, 0.5 pg/μL 이하, 50 fg/μL 이하, 7.5 fg/μL 이하, 5 fg/μL 이하, 0.5 fg/μL 이하의 농도로 반응 용액 중에 존재시켜도 된다. 한편, 반응 개시시에, 1 반응당 1 분자의 환상 DNA를 주형으로서 존재시켜 복제 또는 증폭에 이용할 수도 있다.
RCR법 III에 이용하는 주형이 되는 환상 DNA는, oriC에 대해 각각 외측을 향해 삽입된 한 쌍의 ter 서열, 및, XerCD가 인식하는 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열을 포함한다. 상기 환상 DNA가 ter 서열을 갖는 경우, 공정 (III-1)의 반응 용액은 ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질을 더 포함하고, 상기 환상 DNA가 XerCD가 인식하는 염기서열을 갖는 경우, 공정 (III-1)의 반응 용액은 XerCD 단백질을 더 포함한다.
ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질 및 XerCD로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질은 시판중인 것을 이용해도 되고, 미생물 등으로부터 추출해, 필요에 따라 정제한 것을 이용해도 된다. 미생물로부터의 효소의 추출 및 정제는, 당업자가 이용 가능한 방법을 이용해 적절히 실시할 수 있다.
DNA상의 ter 서열 및 ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질의 조합은, 복제 종결을 실시하는 메커니즘이다. 이 메커니즘은, 복수 종의 세균에서 발견되고 있으며, 예를 들면 대장균에서는 Tus-ter 시스템(Hiasa, H., and Marians, K. J., J. Biol. Chem., 1994, 269: 26959-26968; Neylon, C., et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., September 2005, p. 501-526), 바실러스속 세균에서는 RTP-ter 시스템(Vivian, et al., J. Mol. Biol., 2007, 370: 481-491)으로 알려져 있다. RCR법 III에 있어서는, 이 메커니즘을 이용함으로써, 부산물인 DNA 멀티머의 생성을 억제하는 것이 가능하다. DNA상의 ter 서열 및 ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질의 조합에 대해, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다.
바람직한 형태에 있어서 RCR법 III는, ter 서열 및 Tus 단백질의 조합을 이용한다. Tus 단백질과의 조합으로 이용하는 ter 서열은, 5'-GN[A/G][T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3'(서열 번호 23), 보다 바람직하게는 5'-G[T/G]A[T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3'(서열 번호 24), 5'-GTATGTTGTAACTA-3'(서열 번호 25), 5'-AGTATGTTGTAACTAAAG-3'(서열 번호 26), 5'-GGATGTTGTAACTA-3'(서열 번호 27), 5'-GTATGTTGTAACGA-3'(서열 번호 28), 5'-GGATGTTGTAACTA-3'(서열 번호 29), 5'-GGAAGTTGTAACGA-3'(서열 번호 30) 또는 5'-GTAAGTTGTAACGA-3'(서열 번호 31)를 포함하는 서열이라도 된다. Tus 단백질의 유래는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 대장균 유래의 Tus 단백질이다. Tus 단백질은, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 2 nM∼200 nM, 2 nM∼100 nM, 5 nM∼200 nM, 5 nM∼100 nM, 10 nM∼100 nM, 20 nM∼100 nM, 20 nM∼80 nM의 범위로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 바람직한 형태에 있어서 RCR법 III는, ter 서열 및 RTP 단백질의 조합을 이용한다. RTP 단백질과의 조합으로 이용하는 ter 서열은, 5'-AC[T/A][A/G]ANNNNN[C/T]NATGTACNAAAT-3'(서열 번호 32), 바람직하게는 5'-ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAAT-3'(서열 번호 33), 5'-ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAATTTTCA-3'(서열 번호 34), 5'-GAACTAATTAAACTATGTACTAAATTTTCA-3'(서열 번호 35) 또는 5'-ATACTAATTGATCCATGTACTAAATTTTCA-3'(서열 번호 36)를 포함하는, 23∼30 염기 길이의 서열이다. ter 서열로서 서열 번호 10∼12의 서열을 포함하고, 23∼30 염기의 길이를 갖는 서열을 선택하는 경우, 해당 서열은, 서열 번호 13 또는 14에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것이라도 된다. RTP 단백질의 유래는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 바실러스속 세균 유래의 RTP 단백질, 보다 바람직하게는 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 RTP 단백질이다. Tus 단백질은, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 2 nM∼200 nM, 2 nM∼100 nM, 5 nM∼200 nM, 5 nM∼100 nM, 10 nM∼100 nM, 20 nM∼100 nM, 20 nM∼80 nM의 범위로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
ter 서열에 대해 'oriC에 대해 외측을 향해 삽입한다'란, ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질의 조합의 작용에 의해, oriC로부터 외측을 향하는 방향의 복제에 대해서는 복제를 허용하는 한편, oriC를 향해 들어오는 방향의 복제에 대해서는 복제를 허용하지 않고 정지하는 방향에서 ter 서열을 삽입하는 것을 의미한다. 따라서, ter 서열에 대해 'oriC에 대해 각각 외측을 향해 삽입된 한 쌍의'란, 한쪽이 oriC의 5'측에 서열 번호 1∼14로 나타내는 서열 중 어느 1개를 포함하는 서열이 삽입되고, 다른 한쪽이 oriC의 3'측에 서열 번호 1∼14로 나타내는 서열의 상보 서열을 포함하는 서열이 삽입된 상태를 의미한다.
ter 서열은, oriC에 대해 각각 외측을 향해 한 쌍 삽입되어 있는 한, 어느 위치에 존재해도 된다. 예를 들면, 한 쌍의 ter 서열은, oriC에 대해 대극이 되는 영역에 존재하고 있어도 되고, oriC의 양측의 근방 또는 인접한 영역에 존재하고 있어도 된다. oriC의 양측의 근방 또는 인접한 영역에 존재하는 경우는, oriC와 한 쌍의 ter 서열을 기능성 카세트로서 조제할 수 있기 때문에, oriC 및 한 쌍의 ter 서열의 DNA로의 도입이 간편하게 되어, 주형이 되는 환상 DNA의 조제 코스트가 저감된다는 이점이 있다.
DNA상의 XerCD가 인식하는 서열 및 XerCD 단백질의 조합은, DNA 멀티머의 분리를 실시하는 메커니즘에서 기능한다(Ip, S. C. Y., et al., EMBO J., 2003, 22: 6399-6407). XerCD 단백질은, XerC와 XerD의 복합체이다. XerCD 단백질이 인식하는 서열로는 dif 서열, cer 서열, psi 서열이 알려져 있다(Colloms, et al., EMBO J., 1996, 15(5):1172-1181; Arciszewska, L. K., et al., J. Mol. Biol., 2000, 299:391-403). 본 실시 형태의 방법에서는, 이 메커니즘을 이용함으로써, 부산물인 DNA 멀티머의 생성을 억제하는 것이 가능하다. DNA상의 XerCD가 인식하는 서열 및 XerCD 단백질의 조합에 대해, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 또한, XerCD에는 그 촉진 인자가 알려져 있고, 예를 들면 dif에서의 기능은 FtsK 단백질에 의해 촉진된다(Ip, S. C.Y., et al., EMBO J., 2003, 22:6399-6407). 일 형태에 있어서, RCR법 III에서의 반응 용액 중에 FtsK 단백질을 포함해도 된다.
XerCD가 인식하는 서열은, 5'-GGTGCG[C/T][A/G][T/C]AANNNNNNTTATG[T/G]TAAA[T/C]-3'(서열 번호 37), 5'-GGTGCG[C/T]A[T/C]AANNNNNNTTATG[T/G]TAAAT-3'(서열 번호 38), 5'-GGTGCGC[A/G][T/C]AANNNNNNTTATGTTAAA[T/C]-3'(서열 번호 39), 5'-GGTGCG[C/T][A/G]CAANNNNNNTTATG[T/G]TAAA[T/C]-3'(서열 번호 40), 5'-GGTGCGCATAANNNNNNTTATGTTAAAT-3'(서열 번호 41), 5'-GGTGCGTACAANNNNNNTTATGGTAAAT-3'(서열 번호 42), 5'-GGTGCGCGCAANNNNNNTTATGTTAAAC-3'(서열 번호 43), 5'-GGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAAT-3'(서열 번호 44/dif 서열), 5'-GGTGCGTACAAGGGATGTTATGGTAAAT-3'(서열 번호 45/cer 서열) 또는 5'-GGTGCGCGCAAGATCCATTATGTTAAAC-3'(서열 번호 46/psi 서열), 또는 이들 중 어느 하나의 상보 서열을 포함하는 서열이라도 된다. 서열 번호 15∼24의 1∼11번째의 염기 부분은 XerC 결합 부위이며, 서열 번호 15∼24의 18∼28번째의 염기 부분은 XerD 결합 부위이다. 서열 번호 15∼21의 12∼17번째의 염기 부분(NNNNNN으로 나타나는 6 염기 부분)은, XerC 또는 XerD의 결합 영역이 아니기 때문에, 서열은 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 서열 번호 15∼21의 12∼17번째의 염기(NNNNNN으로 나타나는 6 염기 부분)의 서열은, 서열 번호 22∼24의 12∼17번째의 염기의 서열에 대해, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것이라도 된다.
XerCD 단백질은, 바람직하게는 대장균 유래의 XerCD 단백질이다. XerCD 단백질은, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5 nM∼200 nM, 5 nM∼150 nM, 10 nM∼200 nM, 10 nM∼150 nM, 20 nM∼200 nM, 20 nM∼150 nM, 20 nM∼100 nM의 범위로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
XerCD가 인식하는 서열은, 환상 DNA상의 어느 위치에 존재하고 있어도 된다. 예를 들면, XerCD가 인식하는 서열은, oriC에 대해 대극이 되는 영역에 존재하고 있어도 되고, oriC의 근방 또는 인접한 영역에 존재하고 있어도 된다. oriC의 근방 또는 인접한 영역에 존재하는 경우는, oriC와 XerCD가 인식하는 서열을 기능성 카세트로서 조제할 수 있기 때문에, oriC 및 XerCD가 인식하는 서열의 DNA로의 도입이 간편하게 되어, 주형이 되는 환상 DNA의 조제 코스트가 저감된다는 이점이 있다.
본 명세서에 있어서, 2개의 염기서열의 동일성 %는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있다. 또한, 컴퓨터 프로그램을 이용해 동일성 %를 결정할 수도 있다. 이와 같은 서열 비교 컴퓨터 프로그램으로는, 예를 들면 미국 국립 의학 라이브러리의 웹 사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html로부터 이용할 수 있는 BLASTN 프로그램(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10): 버젼 2.2. 7, 또는 WU-BLAST2.0 알고리즘 등을 들 수 있다. WU-BLAST2.0에 대한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷 사이트: http://blast.wustl.edu에 기재되어 있는 것을 이용할 수 있다.
반응 용액 중에 함유되는 제1, 제2 및 제3 효소군에 대해서는, 상기 '2. 제1, 제2 및 제3 효소군'의 항목에 기재한 바와 같다.
일 형태에 있어서, RCR법 III에 이용하는 제1 효소군은, DnaA 활성을 갖는 효소, 1종 이상의 핵상체 단백질, DNA 자이레이스 활성을 갖는 효소 또는 효소군, 단일가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB)), DnaB형 헬리카제 활성을 갖는 효소, DNA 헬리카제 로더 활성을 갖는 효소, DNA 프리마제 활성을 갖는 효소, DNA 클램프 활성을 갖는 효소, 및 DNA 폴리메라아제 III* 활성을 갖는 효소 또는 효소군의 조합을 포함하고 있어도 된다. 여기에서, 1종 이상의 핵상체 단백질은 IHF 또는 HU라도 되고, DNA 자이레이스 활성을 갖는 효소 또는 효소군은 GyrA 및 GyrB로 이루어지는 복합체라도 되고, DnaB형 헬리카제 활성을 갖는 효소는 DnaB 헬리카제라도 되고, DNA 헬리카제 로더 활성을 갖는 효소는 DnaC 헬리카제 로더라도 되고, DNA 프리마제 활성을 갖는 효소는 DnaG 프리마제라도 되고, DNA 클램프 활성을 갖는 효소는 DnaN 클램프라도 되고, 그리고, DNA 폴리메라아제 III* 활성을 갖는 효소 또는 효소군은 DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ 및 HolE 중 어느 하나를 포함하는 효소 또는 효소군이라도 된다.
다른 형태에 있어서, RCR법 III에 이용하는 제2 효소군은, DNA 폴리메라아제 I 활성을 갖는 효소 및 DNA 리가아제 활성을 갖는 효소의 조합을 포함하고 있어도 된다. 또는, 제2 효소군은, DNA 폴리메라아제 I 활성을 갖는 효소, DNA 리가아제 활성을 갖는 효소 및 RNaseH 활성을 갖는 효소의 조합을 포함하고 있어도 된다.
또 다른 형태에 있어서, RCR법 III에 이용하는 제3 효소군은, 토포이소머라아제 III 활성을 갖는 효소 및 토포이소머라아제 IV 활성을 갖는 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 포함하고 있어도 된다. 또는, 제3 효소군은, 토포이소머라아제 III 활성을 갖는 효소 및 RecQ형 헬리카제 활성을 갖는 효소의 조합을 포함하고 있어도 된다. 또는, 제3 효소군은, 토포이소머라아제 III 활성을 갖는 효소, RecQ형 헬리카제 활성을 갖는 효소 및 토포이소머라아제 IV 활성을 갖는 효소의 조합이라도 된다.
반응 용액은, 완충액, ATP, GTP, CTP, UTP, dNTP, 마그네슘 이온원 및 알칼리 금속 이온원을 포함하는 것이라도 된다.
반응 용액에 포함되는 완충액은, pH 7∼9, 바람직하게는 pH 8에서 이용하는데 적합한 완충액이라면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Tris-HCl, Hepes-KOH, 인산 완충액, MOPS-NaOH, Tricine-HCl 등을 들 수 있다. 바람직한 완충액은 Tris-HCl이다. 완충액의 농도는, 당업자가 적절하게 선택할 수 있어 특별히 한정되지 않지만, Tris-HCl의 경우, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 10 mM(mmol/L)∼100 mM(mmol/L), 10 mM∼50 mM, 20 mM의 농도를 선택할 수 있다.
ATP는 아데노신3인산을 의미한다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 ATP의 농도는, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 mM(mmol/L)∼3 mM(mmol/L)의 범위이면 되고, 바람직하게는 0.1 mM∼2 mM, 0.1 mM∼1.5 mM, 0.5 mM∼1.5 mM의 범위이면 되고, 보다 바람직하게는 1 mM여도 된다.
GTP, CTP 및 UTP는, 각각 구아노신3인산, 시티딘3인산 및 우리딘3인산을 의미한다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 GTP, CTP 및 UTP의 농도는, 각각 독립적으로, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 mM(mmol/L)∼3.0 mM(mmol/L)의 범위이면 되고, 바람직하게는 0.5 mM∼3.0 mM, 0.5 mM∼2.0 mM의 범위라도 된다.
dNTP는, 데옥시아데노신3인산(dATP), 데옥시구아노신3인산(dGTP), 데옥시시티딘3인산(dCTP) 및 데옥시티미딘3인산(dTTP)의 총칭이다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 dNTP의 농도는, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 mM(mmol/L)∼1 mM(mmol/L)의 범위이면 되고, 바람직하게는 0.05 mM∼1 mM, 0.1 mM∼1 mM의 범위이면 되고, 보다 바람직하게는 0.25 mM∼1 mM의 범위라도 된다.
마그네슘 이온원은, 반응 용액 중에 마그네슘 이온(Mg2+)을 제공하는 물질이다. 예를 들면, Mg(OAc)2, MgCl2, MgSO4 등을 들 수 있다. 바람직한 마그네슘 이온원은 Mg(OAc)2이다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 마그네슘 이온원의 농도는, 예를 들면 반응 용액 중에 마그네슘 이온을 반응 용액의 총용적에 대해, 5 mM(mmol/L)∼50 mM(mmol/L)의 범위에서 제공하는 농도이면 되고, 1 mM이 바람직하다.
알칼리 금속 이온원은, 반응 용액 중에 알칼리 금속 이온을 제공하는 물질이다. 알칼리 금속 이온으로는, 예를 들면 나트륨 이온(Na+), 칼륨 이온(K+)을 들 수 있다. 알칼리 금속 이온원의 예로는, 글루탐산 칼륨, 아스파라긴산 칼륨, 염화 칼륨, 아세트산 칼륨, 글루탐산 나트륨, 아스파라긴산 나트륨, 염화 나트륨 및 아세트산 나트륨을 들 수 있다. 바람직한 알칼리 금속 이온원은 글루탐산 칼륨 또는 아세트산 칼륨이다. 반응 개시시에 반응 용액 중에 함유되는 알칼리 금속 이온원의 농도는, 반응 용액 중에 알칼리 금속 이온을 반응 용액의 총용적에 대해, 100 mM(mmol/L) 이상, 바람직하게는 100 mM∼300 mM의 범위에서 제공하는 농도이면 되고, 보다 바람직하게는 50 mM로 제공하는 농도라도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 선행하는 출원과의 균형에 있어서는, 상기 알칼리 금속 이온원의 농도로부터 150 mM이 제외되어도 된다.
반응 용액은 단백질의 비특이 흡착 억제제 또는 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 함유하고 있어도 된다. 바람직하게는, 반응 용액은 단백질의 비특이 흡착 억제제 및 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 함유하고 있어도 된다. 단백질의 비특이 흡착 억제제 및 핵산의 비특이 흡착 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 비특이 흡착 억제제가 반응 용액 중에 존재함으로써, 단백질끼리 및 단백질과 환상 DNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 비특이 흡착이나, 단백질 및 환상 DNA의 용기 표면으로의 부착을 억제할 수 있어, 반응 효율의 향상을 기대할 수 있다.
단백질의 비특이 흡착 억제제란, 본 실시 형태의 방법에서의 복제 또는 증폭 반응과는 관계없는 단백질이다. 이와 같은 단백질로는, 예를 들면 소 혈청 알부민(BSA), 리소자임, 젤라틴, 헤파린 및 카세인 등을 들 수 있다. 단백질의 비특이 흡착 억제제는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.02 mg/mL∼2.0 mg/mL의 범위, 바람직하게는 0.1 mg/mL∼2.0 mg/mL, 0.2 mg/mL∼2.0 mg/mL, 0.5 mg/mL∼2.0 mg/mL의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 0.5 mg/mL로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
핵산의 비특이 흡착 억제제란, RCR법 III에서의 복제 또는 증폭 반응과는 관계없는 핵산 분자 또는 핵산 유사 인자이다. 이와 같은 핵산 분자 또는 핵산 유사 인자로는, 예를 들면 tRNA(트랜스퍼 RNA), rRNA(리보솜 RNA), mRNA(메신저 RNA), 글리코겐, 헤파린, 올리고 DNA, poly(I-C)(폴리이노신-폴리시티딘), poly(dI-dC)(폴리데옥시이노신-폴리데옥시시티딘), poly(A)(폴리아데닌) 및 poly(dA)(폴리데옥시아데닌) 등을 들 수 있다.
핵산의 비특이 흡착 억제제는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 ng/μL∼500 ng/μL의 범위, 바람직하게는 10 ng/μL∼500 ng/μL, 10 ng/μL∼200 ng/μL, 10 ng/μL∼100 ng/μL의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 50 ng/μL로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 선행하는 출원과의 균형에 있어서는, 핵산의 비특이 흡착 억제제로서 tRNA를 선택하는 경우, tRNA의 농도로부터 50 ng/μL가 제외되어도 된다.
반응 용액은 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 또는 RecG형 헬리카제를 더 함유하고 있어도 된다. 바람직하게는, 반응 용액은 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 RecG형 헬리카제를 더 함유하고 있어도 된다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 RecG형 헬리카제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이 반응 용액 중에 존재함으로써, 복제 또는 증폭 반응중에 이중가닥 절단 등에 의해 발생하는 직쇄상 DNA의 양을 저감시켜, 목적하는 슈퍼 코일 산물의 수율 향상을 기대할 수 있다.
직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 직쇄상 DNA의 5' 말단 혹은 3' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 효소이다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 직쇄상 DNA의 5' 말단 혹은 3' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 활성을 갖는 것이라면, 그 종류나 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, RecBCD, λ 엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제 VIII, T5 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제, 및 Plasmid-SafeTM ATP-Dependent DNase(epicentre)등을 이용할 수 있다. 바람직한 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는 RecBCD이다. 직쇄상 DNA 엑소뉴클레아제는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 U/μL∼1.0 U/μL의 범위, 바람직하게는 0.08 U/μL∼1.0 U/μL 또는 0.1 U/μL∼1.0 U/μL의 범위로 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. 직쇄상 DNA 엑소뉴클레아제에 대한 효소 활성 단위(U)는, 37℃, 30분의 반응에서, 직쇄상 DNA의 1 nmol의 데옥시리보 뉴클레오티드를 산가용성으로 하는데 필요한 효소량을 1U로 한 단위이다.
RecG형 헬리카제는, 신장 반응의 종결시에 복제 포크끼리가 충돌해 발생하는 부차적인 DNA 구조를 해소하는 헬리카제라고 생각되는 효소이다. RecG형 헬리카제는, 대장균 유래의 RecG와 동일한 활성을 갖는 것이라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 RecG를 바람직하게 이용할 수 있다. 대장균 유래의 RecG는 단량체로서 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 100 nM(nmol/L)∼800 nM(nmol/L)의 범위, 바람직하게는 100 nM∼500 nM, 100 nM∼400 nM, 100 nM∼300 nM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 60 nM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다. RecG형 헬리카제는, 상기 대장균 유래의 RecG에 대해 특정된 농도 범위에 효소 활성 단위로서 상당하는 농도 범위로 이용할 수 있다.
반응 용액은 암모늄염을 더 함유하고 있어도 된다. 암모늄염의 예로는, 황산 암모늄, 염화 암모늄 및 아세트산 암모늄을 들 수 있다. 특히 바람직한 암모늄염은 황산 암모늄이다. 암모늄염은 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 mM(mmol/L)∼100 mM의 범위, 바람직하게는 0.1 mM∼50 mM, 1 mM∼50 mM, 1 mM∼20 mM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 4 mM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
제2 효소군의 하나로서, DNA 리가아제 활성을 갖는 효소로서 대장균 유래의 DNA 리가아제를 이용하는 경우, 그 보인자인 NAD(니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드)가 반응 용액 중에 함유된다. NAD는 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 mM(mmol/L)∼1.0 mM의 범위, 바람직하게는 0.1 mM∼1.0 mM, 0.1 mM∼0.5 mM의 범위로 포함되어 있어도 되고, 보다 바람직하게는 0.25 mM 포함되어 있어도 되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
RCR법 III에 이용하는 반응 용액은 환원제를 더 함유하고 있어도 된다. 바람직한 환원제의 예로는, DTT, β-메르캅토 에탄올, 글루타티온을 들 수 있다. 바람직한 환원제는 DTT이다.
또한, RCR법 III에 이용하는 반응 용액은, ATP를 재생하기 위한 효소 및 기질을 함유하고 있어도 된다. ATP 재생계의 효소와 기질의 조합으로는, 크레아틴 키나아제와 크레아틴인산염, 및 피루브산 키나아제와 포스포에놀피루브산을 들 수 있다. ATP 재생계의 효소로는 미오키나아제를 들 수 있다. 바람직한 ATP 재생계의 효소와 기질의 조합은 크레아틴 키나아제 및 크레아틴인산염이다.
상기 공정 (III-2)는, 공정 (III-1)에서 형성한 반응 혼합물을 반응시키는 공정이다. 공정 (III-2)는, 예를 들면 15℃∼80℃, 15℃∼50℃, 15℃∼40℃의 온도 범위에서 반응 혼합물을 반응시키는 공정이라도 된다. 바람직하게는, 공정 (III-2)는 등온 조건하에서 보온하는 공정이라도 된다. 등온 조건으로는, DNA 복제 반응을 진행할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 DNA 폴리메라아제의 최적 온도인 20℃∼80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도로 할 수 있고, 25℃∼50℃의 범위에 포함되는 일정한 온도로 할 수 있고, 25℃∼40℃의 범위에 포함되는 일정한 온도로 할 수 있고, 30℃∼33℃ 정도로 할 수 있다. 본 명세서에서 '등온 조건하에서 보온한다', '등온에서 반응시킨다'의 용어는, 반응중에 상기 온도 범위로 유지하는 것을 의미한다. 보온 시간은, 목적하는 환상 DNA의 복제 산물 또는 증폭 산물의 양에 따라 적절히 설정할 수 있지만, 예를 들면 1∼24시간으로 할 수 있고, 16∼21시간으로 할 수 있다.
또는, 상기 공정 (III-2)로서, 공정 (III-1)에서 형성한 반응 혼합물을, 30℃ 이상에서의 인큐베이션 및 27℃ 이하에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서, 인큐베이션하는 공정을 포함해도 된다. 30℃ 이상에서의 인큐베이션은, oriC를 포함하는 환상 DNA의 복제 개시가 가능한 온도 범위라면 특별히 한정은 없고, 예를 들면 30℃∼80℃, 30℃∼50℃, 30℃∼40℃, 37℃라도 된다. 30℃ 이상에서의 인큐베이션은, 특별히 한정되지 않지만, 1 사이클당 10초∼10분간이라도 되고, 1분간이라도 된다. 27℃ 이하에서의 인큐베이션은, 복제 개시가 억제되고, DNA의 신장 반응이 진행되는 온도라면 특별히 한정은 없고, 예를 들면 10℃∼27℃, 16℃∼25℃, 24℃라도 된다. 27℃ 이하에서의 인큐베이션은, 특별히 한정되지 않지만, 증폭하는 환상 DNA의 길이에 맞춰 설정하는 것이 바람직하고, 예를 들면 1 사이클에 대해, 1000 염기당 1초간∼10초간이라도 된다. 온도 사이클의 사이클수는 특별히 한정되지 않지만, 10 사이클∼50 사이클, 20 사이클∼45 사이클, 25 사이클∼45 사이클, 40 사이클이라도 된다.
RCR법 III는, 상기 반응 혼합물을 등온 조건하에서 보온하는 공정 이후에, 목적에 따라, 환상 DNA의 복제 산물 또는 증폭 산물을 정제하는 공정을 포함해도 된다. 환상 DNA의 정제는 당업자가 이용 가능한 방법을 이용해 적절히 실시할 수 있다.
RCR법 III를 이용해 복제 또는 증폭한 환상 DNA는, 반응 후의 반응 혼합물을 그대로 혹은 적절하게 정제한 것을, 형질 전환 등의 이후의 목적에 이용할 수 있다.
＜RCR법 IV＞
XerCD와 dif의 조합과 마찬가지로, Cre와 그 인식 서열 loxP의 조합을 이용해도 DNA 멀티머의 분리를 유도할 수 있는 것이 알려져 있다(Ip, S. C. Y., et al., EMBO J., 2003, 22: 6399-6407). 본 발명자들은, RCR법 III에서의 XerCD와 dif의 조합 대신, DNA 멀티머 분리 효소 및 그 인식 서열의 조합을 이용해도, 부생성물인 DNA 멀티머의 생성을 억제할 수 있다는 것을 알아냈다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 이하의 공정:
(IV-1) 주형이 되는 환상 DNA와, 이하:
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1 효소군,
오카자키 절편 연결 반응을 촉매해, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2 효소군, 및
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3 효소군을 포함하는 반응 용액의 반응 혼합물을 형성하는 공정; 및
(IV-2) 공정 (IV-1)에서 형성한 반응 혼합물을 반응시키는 공정;
을 포함하고,
여기에서 상기 환상 DNA는, DnaA 활성을 갖는 효소와 결합 가능한 복제 개시 서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하고, oriC에 대해 각각 외측을 향해 삽입된 한 쌍의 ter 서열, 및, DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열을 더 포함하고,
여기에서 상기 환상 DNA가 ter 서열을 갖는 경우, 상기 공정 (IV-1)의 반응 용액은 ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질을 더 포함하고, 상기 환상 DNA가 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열을 갖는 경우, 상기 공정 (IV-1)의 반응 용액은 DNA 멀티머 분리 효소를 더 포함한다(특허 문헌 7 참조).
즉, RCR법 IV는, RCR법 III에서의 'XerCD'를 'DNA 멀티머 분리 효소'로, 'XerCD가 인식하는 염기서열'을 'DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열'로 각각 확장한 범위의 방법이다. 따라서, RCR법 III의 각 구성에 대해 ＜RCR법 III＞의 항목에서 기재한 설명은, RCR법 IV에 대해서도 적용된다.
DNA 멀티머 분리 효소는, 유전자의 재조합을 발생시킴으로써 DNA 멀티머의 분리를 유도할 수 있는 효소이다. 특정의 염기서열을 인식하고, 해당 염기서열의 부위에서 유전자의 재조합을 발생시킬 수 있는 부위 특이적 재조합 효소는, DNA 멀티머 분리 효소로서 이용할 수 있다. DNA 멀티머 분리 효소에 의해 인식되는 특정의 염기서열을 'DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열'이라고 기재한다. DNA 멀티머 분리 효소 및 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열의 조합에 의한 유전자의 재조합에 의해, DNA 멀티머의 분리를 유도할 수 있다. RCR법 IV에 있어서는, 이 메커니즘을 이용함으로써, 부산물인 DNA 멀티머의 생성을 억제하는 것이 가능하다. DNA 멀티머 분리 효소는, 시판중인 것을 이용해도 되고, 미생물 등으로부터 추출해, 필요에 따라 생성한 것을 이용해도 된다. 미생물로부터의 효소의 추출 및 정제는 당업자가 이용 가능한 방법을 이용해 적절히 실시할 수 있다.
DNA 멀티머 분리 효소와 해당 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열의 조합은, XerCD와 dif 서열, Cre와 loxP 서열(Siegel, R. W., et al.., FEBS Lett., 2001, 499(1-2): 147-153; Araki, K., et al., Nucleic Acids Res.: 1997, 25(4): 868-872), 출아 효모(Saccharomyces verevisiae) 유래의 재조합 효소 FLP와 FRT 서열(Broach, J. R., et al., Cell, 1982, 29(1): 227-234), 박테리오파지 D6 유래의 재조합 효소 DreO와 rox 서열(Anastassiadis, K., et al., Dis. Model. Mech., 2009, 2: 508-515), 지고사카로미세스·룩시이(zygosacchromyces rouxii) 유래의 재조합 효소 R과 RS 서열(Araki, H., et al., J. Mol. Biol., 1985, 182(2): 191-203), 세린 재조합 효소 패밀리(예를 들면, Gin, γδ, Tn3 및 Hin)와 이들의 인식 서열(Smith, M. C., et al., Mol. Microbiol., 2002, 44: 299)을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.
XerCD와 dif 서열에 대해서는, ＜RCR법 III＞의 항목에서 전술한 바와 같다.
Cre 및 loxP 서열의 조합에 대해, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. Cre는, 바람직하게는 박테리오파지 P1 유래의 Cre 단백질이다. Cre는, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 0.01 mU/μL∼200 mU/μL의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 0.1 mU/μL∼150 mU/μL, 0.1 mU/μL∼100 mU/μL, 0.5 mU/μL∼100 mU/μL, 0.5 mU/μL∼80 mU/μL, 0.1 mU/μL∼50 mU/μL, 1 mU/μL∼50 mU/μL, 1 mU/μL∼30 mU/μL의 범위로 포함되어 있어도 되지만 이것으로 한정되지 않는다.
Cre가 인식하는 loxP 서열은, loxP 컨센서스(consensus)인 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'(서열 번호 47), 또는 변이 loxP 서열(소문자 부분은 컨센서스에 대한 변이 염기)인 5'-ATAACTTCGTATAGtATACATTATACGAAGTTAT-3'(서열 번호 48/lox511), 5'-ATAACTTCGTATAGgATACtTTATACGAAGTTAT-3'(서열 번호 49/lox2272), 5'-ATAACTTCGTATAtacctttcTATACGAAGTTAT-3'(서열 번호 50/loxFAS), 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAcggta-3'(서열 번호 51/lox RE), 5'-taccgTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'(서열 번호 52/lox LE), 또는 이들 중 어느 하나의 상보 서열을 포함하는 서열이라도 된다.
출아 효모(Saccharomyces verevisiae) 유래의 재조합 효소 FLP는, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5 nM∼200 nM, 5 nM∼150 nM, 10 nM∼200 nM, 10 nM∼150 nM, 20 nM∼200 nM, 20 nM∼150 nM, 20 nM∼100 nM의 범위로 포함되어 있어도 되지만 이것으로 한정되지 않는다. FLP가 인식하는 FRT 서열은, 5'-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3'(서열 번호 53) 또는 그 상보 서열을 포함하는 서열이라도 된다.
박테리오파지 D6 유래의 재조합 효소 DreO는, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5 nM∼200 nM, 5 nM∼150 nM, 10 nM∼200 nM, 10 nM∼150 nM, 20 nM∼200 nM, 20 nM∼150 nM, 20 nM∼100 nM의 범위로 포함되어 있어도 되지만 이것으로 한정되지 않는다. DreO가 인식하는 rox 서열은, 5'-TAACTTTAAATAATGCCAATTATTTAAAGTTA-3'(서열 번호 54) 또는 그 상보 서열을 포함하는 서열이라도 된다.
지고사카로미세스·룩시이(zygosacchromyces rouxii) 유래의 재조합 효소 R은, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5 nM∼200 nM, 5 nM∼150 nM, 10 nM∼200 nM, 10 nM∼150 nM, 20 nM∼200 nM, 20 nM∼150 nM, 20 nM∼100 nM의 범위로 포함되어 있어도 되지만 이것으로 한정되지 않는다. 효소 R이 인식하는 RS 서열은, Araki, H. 등(J. Mol. Biol., 1985, 182(2): 191-203)이 개시하는 서열, 또는 그 상보 서열을 포함하는 서열이라도 된다.
세린 재조합 효소 패밀리(γδ, Tn3, Gin 및 Hin)는, 반응 용액 중에 반응 용액의 총용적에 대해, 1 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)의 범위로 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5 nM∼200 nM, 5 nM∼150 nM, 10 nM∼200 nM, 10 nM∼150 nM, 20 nM∼200 nM, 20 nM∼150 nM, 20 nM∼100 nM의 범위로 포함되어 있어도 되지만 이것으로 한정되지 않는다. γδ, Tn3과 이들의 인식 서열 res는, Grindley N. D. F.. 등(Cell, 1982, 30: 19-27)이 개시하는 서열, 또는 그 상보 서열을 포함하는 서열이라도 된다. Gin와 그 인식 서열은, Kahmann. R. 등(Cell, 1985, 41: 771-780)이 개시하는 서열, 또는 그 상보 서열을 포함하는 서열이라도 된다. Hin과 그 인식 서열은, Glasgow. A. C. 등(J. Biol. Chem., 1989, 264: 10072-10082)이 개시하는 서열, 또는 그 상보 서열을 포함하는 서열이라도 된다.
DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 서열은, 환상 DNA상의 어느 위치에 존재하고 있어도 된다. 예를 들면, DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 서열은, oriC의 근방 또는 인접한 영역에 존재하고 있어도 되고, oriC에 대해서 대극이 되는 영역에 존재하고 있어도 된다.
＜RCR법 V＞
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 이하의 공정:
(V-1) oriC 트랜스포존과 트랜스포사제를 완충액 중에 첨가해 oriC 트랜스포좀을 형성하고, 여기에서 oriC 트랜스포존은 DnaA 활성을 갖는 효소와 결합 가능한 복제 개시 서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는 선상 DNA로서 그 양쪽 말단에 Outside end(OE) 서열을 포함하는 선상 DNA이다;
oriC 트랜스포좀과 oriC를 포함하지 않는 환상 DNA를 완충액 중에서 반응시켜 전이 반응을 실시하는;
것에 의해, oriC를 포함하는 환상 DNA를 조제하는 공정;
(V-2) 공정 (V-1)에서 얻어진 oriC를 포함하는 환상 DNA와, 이하:
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1 효소군,
오카자키 절편 연결 반응을 촉매해, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2 효소군, 및
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3 효소군을 포함하는 반응 용액의 반응 혼합물을 형성하는 공정; 및
(V-3) 공정 (V-2)에서 형성한 반응 혼합물을 반응시키는 공정;
을 포함한다(특허 문헌 7 참조).
이론에 의해 제한되는 것은 아니지만, RCR법 V는 트랜스포존을 이용해 oriC를 포함하지 않는 환상 DNA에 oriC를 도입함으로써 oriC를 포함하는 환상 DNA를 조제하고, 해당 oriC를 포함하는 환상 DNA를 복제 또는 증폭하는 것이다. 환상 DNA의 복제 및 증폭에 대한 정의는, RCR법 III에 대해 전술한 바와 같다.
반응 용액과 혼합하는 oriC를 포함하는 환상 DNA에 대해서는, 상기 '1. 환상 DNA'의 항목에 기재한 바와 같다. 1 반응당 이용하는 oriC를 포함하는 환상 DNA의 양은, RCR법 III에서의 주형 DNA의 양에 대해 전술한 바와 같다.
또한, 반응 용액 중에 함유되는 효소군, 반응 용액 중에 함유되어도 되는 다른 성분에 대한 설명은, RCR법 III와 동일하다. 또한, 상기 공정 (V-3)은, RCR법 III에서의 공정 (V-2)와 동일하게 실시한다. 환상 DNA의 복제 산물 또는 증폭 산물을 정제하는 공정을 더 포함하는 것, 및 RCR법 V를 이용해 복제 또는 증폭한 환상 DNA의 이용에 대해서도, RCR법 III와 동일하다.
oriC 트랜스포존의 양단의 OE 서열은, 트랜스포사제가 인식하고, OE 서열로서 이용 가능하다는 것이 당업자에게 알려진 서열이라면 어떠한 서열이라도 된다. 바람직한 형태에 있어서, OE 서열은, 서열 번호 55(5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3')로 나타나는 서열 또는 그 상보 서열을 포함하고, 공정 (1)의 선상 DNA의 5' 말단에 서열 번호 55로 나타나는 서열을 포함하는 OE 서열이 삽입되어 있으며, 해당 선상 DNA의 3' 말단에 서열 번호 55로 나타나는 서열의 상보 서열을 포함하는 OE 서열이 삽입되어 있다.
상기 공정 (V-1)에 있어서 oriC 트랜스포좀 형성에 이용하는 oriC 트랜스포존의 농도는, 반응 용액의 총용적에 대해, 20 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)라도 되고, 바람직하게는 40 nM∼160 nM이라도 된다.
트랜스포사제는, OE 서열을 인식해 트랜스포좀을 형성하고, 환상 DNA 중에 트랜스포존 DNA를 전이시키는 효소라면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 트랜스포사제를 바람직하게 이용할 수 있다. 특히 바람직한 것은 고활성 Tn5 변이(E54K, L372P) 단백질이다(Goryshin, I. Y., and Reznikoff, W. S., J. Biol. Chem., 1998, 273: 7367-7374). 트랜스포사제는, 시판중인 것을 이용해도 되고, 미생물 등으로부터 추출해, 필요에 따라 정제한 것을 이용해도 된다. 미생물로부터의 효소의 추출 및 정제는, 당업자가 이용 가능한 방법을 이용해 적절히 실시할 수 있다. 트랜스포사제로서 고활성 Tn5 변이(E54K, L372P) 단백질을 이용하는 경우, 상기 공정 (V-1)에 있어서 oriC 트랜스포좀 형성에 이용하는 농도는, 반응 용액의 총용적에 대해, 50 nM(nmol/L)∼200 nM(nmol/L)라도 되고, 바람직하게는 80 nM∼150 nM이라도 된다.
공정 (V-1)에서 이용하는 완충액은, pH 6∼9, 바람직하게는 pH 7.5에서 이용하는데 적합한 완충액이라면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Tris-아세트산(Tris-OAc), Tris-HCl, Hepes-KOH, 인산 완충액, MOPS-NaOH, Tricine-HCl 등을 들 수 있다. 바람직한 완충액은 Tris-OAc 또는 Tris-HCl이다. 완충액의 농도는, 당업자가 적절하게 선택할 수 있어 특별히 한정되지 않지만, Tris-OAc 또는 Tris-HCl의 경우, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 10 mM(mmol/L)∼100 mM(mmol/L), 10 mM∼50 mM, 20 mM의 농도를 선택할 수 있다.
공정 (V-1)에 있어서 oriC 트랜스포좀을 형성하는 공정은, 30℃ 정도의 온도에서 30분 정도 보온함으로써 실시한다.
공정 (V-1)의 전이 반응은, 트랜스포사제의 최적 온도, 예를 들면 37℃에서 실시한다. 전이 반응을 실시하는 시간은, 당업자가 적절하게 선택할 수 있고, 예를 들면 15분 정도여도 된다. 또한, 공정 (V-1)의 전이 반응에 있어서, tRNA를 첨가해도 된다. 공정 (V-1)의 전이 반응에 있어서 tRNA를 첨가하는 농도는, 예를 들면 반응 용액의 총용적에 대해, 10 ng/μL∼200 ng/μL, 30 ng/μL∼100 ng/μL, 50 ng/μL의 농도를 선택할 수 있다.
일 형태에 있어서, 공정 (V-2)의 oriC를 포함하는 환상 DNA는, oriC에 대해서 각각 외측을 향해 삽입된 한 쌍의 ter 서열, 및, XerCD나 Cre 등의 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열을 더 포함해도 된다. 이 경우, 상기 환상 DNA가 ter 서열을 갖는 경우, 상기 공정 (V-2)의 반응 용액은 ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질을 더 포함하고, 상기 환상 DNA가 XerCD나 Cre 등의 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열을 갖는 경우, 상기 공정 (V-2)의 반응 용액은 XerCD나 Cre 등의 DNA 멀티머 분리 효소를 더 포함한다.
또는 다른 형태에 있어서, oriC에 대해 각각 외측을 향해 삽입된 한 쌍의 ter 서열, 및, XerCD나 Cre 등의 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열을, oriC 트랜스포존의 일부에 포함하도록 조제하고, 한 쌍의 ter 서열 및 XerCD나 Cre 등의 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열에 대해서도 트랜스포존을 이용해 환상 DNA에 도입해도 된다. 즉, 이 형태는, 공정 (V-1)의 선상 DNA가 oriC에 대해 각각 외측을 향해 삽입된 한 쌍의 ter 서열, 및, XerCD나 Cre 등의 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열을 더 포함하고, 해당 선상 DNA가 ter 서열을 갖는 경우, 상기 공정 (V-2)의 반응 용액은 ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질을 더 포함하고, 상기 환상 DNA가 XerCD나 Cre 등의 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열을 갖는 경우, 상기 공정 (V-2)의 반응 용액은 XerCD 단백질을 더 포함하는 것이다.
여기에서, oriC에 대해 각각 외측을 향해 삽입된 한 쌍의 ter 서열 및 XerCD나 Cre 등의 DNA 멀티머 분리 효소가 인식하는 염기서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 서열, 및 ter 서열에 결합해 복제를 저해하는 활성을 갖는 단백질 및 XerCD나 Cre 등의 DNA 멀티머 분리 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상에 대한 정의 및 설명은, RCR법 III 또는 RCR법 IV에 대해 전술한 바와 같다.
일 형태에 있어서, RCR법 V는 (V-4) 공정 (V-3)의 반응물에 있어서 복제 또는 증폭된 환상 DNA로부터 oriC 트랜스포존을 제거하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다.
oriC 트랜스포존을 제거하는 공정은, 반응 용액의 총용적에 대해, 0.1 nM(nmol/L)∼30 nM(nmol/L), 바람직하게는 1 nM∼20 nM, 보다 바람직하게는 3 nM∼10 nM의 트랜스포사제에 의한 처리, 및 Exo III와 같은 직쇄상 이중가닥 DNA 의존성 단일가닥 DNA 엑소뉴클레아제에 의한 DNA 말단의 단일가닥화의 처리를 포함하고 있어도 된다. 트랜스포사제에 의한 처리에 이용하는 완충액은, 공정 (V-1)에서 이용하는 완충액을 이용해도 된다. 단일가닥 DNA 엑소뉴클레아제에 의한 처리에 이용되는 완충액은, 단일가닥 DNA 엑소뉴클레아제가 작용하는 조건이라면 어떠한 조성의 완충액을 이용해도 된다.
또한, oriC 트랜스포존을 제거하는 공정은, oriC 트랜스포존의 서열에 포함되는 제한 효소 부위에 대응하는 제한 효소에 의한 처리를 더 포함하고 있어도 된다. 이 처리는, oriC 트랜스포존을 특이적으로 절단하는 것을 목적으로 한다. 따라서, 이 경우, oriC 트랜스포존에는 포함되지만, 복제·증폭된 환상 DNA 중 oriC 트랜스포존 영역 이외의 영역에는 포함되지 않는 제한 효소 부위에 대응하는 제한 효소를 선택한다. oriC 트랜스포존에 포함되는 영역 특이적인 이중가닥 절단에는, 제한 효소 대신에 CRISPR-Cas9를 이용해도 된다. 이 경우, 가이드 RNA에는 oriC 트랜스포존에 포함되는 영역 특이적인 서열을 지정한다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 공정 (2)는, 롤링 써클 증폭(이하, 'RCA법'(Rolling Circle Amplification)이라고도 한다)에 의해 실시할 수 있다.
RCA법은, 사슬 치환 활성을 갖는 DNA 폴리메라아제 및 제1 및 제2 프라이머를 사용해 환상 DNA를 증폭시키는 방법이다. RCA법은, 정해진 방법에 의해 실시하면 되며, 예를 들면 이하의 순서로 실시할 수 있다. 우선, 제1 프라이머를 환상 DNA에 교잡시키고, 그 곳을 개시점으로 하여 사슬 치환 활성을 갖는 DNA 폴리메라아제에 의한 신장 반응을 실시한다. 사슬 치환 활성을 갖는 DNA 폴리메라아제는, 환상 DNA의 폴리메라아제 반응 개시점에 도달해도, 이미 합성된 사슬을 풀면서 합성을 진행시킨다. 그 결과, 증폭 산물로서 본래의 환상 DNA의 일주(一周)만큼의 DNA 서열이 반복해 연결된 단일가닥 DNA가 얻어진다. 이 단일가닥 DNA에, 제2 프라이머를 교잡시킨다. 1개의 단일가닥 DNA에는, 복수의 제2 프라이머가 교잡할 수 있다. 복수의 제2 프라이머로부터 사슬 치환 활성을 갖는 DNA 폴리메라아제에 의한 신장 반응을 실시하면, 상류에 교잡한 제2 프라이머로부터 합성된 DNA가 하류에 교잡한 제2 프라이머로부터 합성된 DNA를 풀면서 상보쇄의 합성이 진행된다. 단일가닥이 된 제2 프라이머로부터 합성된 DNA에는, 제1 프라이머가 교잡해 새로운 복제 반응이 일어난다. 이렇게 하여, 본래의 환상 DNA의 서열이 지수함수적으로 증폭되어, 본래의 환상 DNA의 서열이 반복해 연결된 DNA 다량체가 얻어진다. 이것을 적당한 DNA 절단 효소에 의해 절단해, DNA 리가아제에 의해 환상화시킴으로써, 단량체의 본래 환상 DNA의 복제 산물이 얻어진다. 단량체의 본래의 환상 DNA 복제 산물은, DNA 다량체를 Cre-loxP 등의 부위 특이적 재조합 시스템을 이용해 환상화시킴으로써도 얻어진다.
'제1 프라이머'는 대상으로 하는 환상 DNA에 결합하는 프라이머이며, '제2 프라이머'는 제1 프라이머가 결합하는 환상 DNA와는 상보적인 서열에 결합하는 프라이머이다. 제1 및 제2 프라이머로서 랜덤 프라이머를 이용해도 된다. 프라이머의 길이는, 통상, 6 염기∼9 염기 정도이면 된다.
사슬 치환 활성을 갖는 DNA 폴리메라아제로는, 공지의 효소를 사용할 수 있고, 예를 들면 Phi29 박테리오파지 DNA 폴리메라아제, Bst DNA 폴리메라아제, Csa DNA 폴리메라아제, 96-7 DNA 폴리메라아제 등을 들 수 있다. 시판중인 효소를 이용해도 된다. 반응 조건은, 사용하는 DNA 폴리메라아제에 따라 적절히 설정하면 된다.
II. 무세포계에서 DNA를 편집하기 위한 키트
본 발명은, 무세포계에서 DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하기 위해 필요한 성분, 및 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를 무세포계에서 증폭시키기 위해 필요한 성분을 포함하는 키트를 제공한다.
DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하기 위해 필요한 성분은, 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용되는 기술에 따라 다를 수 있지만, 예를 들면 원하는 변이(예를 들면, 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 단일가닥 DNA(예를 들면, 화학 합성된 올리고 뉴클레오티드), DNA 폴리메라아제 등을 들 수 있다. 또한 RA법을 사용하는 경우에는, 본 발명의 키트에 포함되는 성분으로는, 예를 들면 RecA 패밀리 재조합 효소 단백질, 엑소뉴클레아제, 뉴클레오시드3인산 또는 디옥시뉴클레오티드3인산의 재생 효소 및 그 기질, 뉴클레오시드3인산, 디옥시뉴클레오티드3인산, 마그네슘 이온원, 알칼리 금속 이온원, 디메틸술폭시드, 염화테트라메틸암모늄, 폴리에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨 및 완충액을 들 수 있다.
결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를 무세포계에서 증폭시키기 위해 필요한 성분은, 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용되는 기술에 따라 다를 수 있다. 예를 들면, RCR법을 사용하는 경우에는, 본 발명의 키트에 포함되는 성분으로는, 예를 들면 복제 개시 단백질, 1종 이상의 핵상체 단백질, DNA 자이레이스 활성을 갖는 효소 또는 효소군, 단일가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB)), DNA 헬리카제 활성을 갖는 효소(예를 들면, DnaB형 헬리카제 활성을 갖는 효소), DNA 헬리카제 로더 활성을 갖는 효소, DNA 프리마제 활성을 갖는 효소, DNA 클램프 활성을 갖는 효소, 및 DNA 폴리메라아제 III* 활성을 갖는 효소 또는 효소군으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소 또는 효소군의 하나 이상을 들 수 있다.
본 발명의 키트는, 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용되는 기술에 따라, 반응 버퍼 또는 그 농축물 등의 추가의 구성품을 포함해도 된다. 추가의 구성품으로는, 예를 들면 상기 RCR법 I∼V를 실시하는데 있어서 필요한 성분을 들 수 있다.
본 발명의 키트는, 결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA를 특이적으로 절단하기 위한 인공 DNA 절단 효소를 더 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 키트는, 상기 키트를 이용해 본 발명의 방법을 실시하기 위해 프로토콜이 기재된 서면을 포함해도 된다. 상기 프로토콜은, 키트를 수용한 용기의 표면에 기재되어 있어도 된다.
《실시예》
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다. 한편, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 범위로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] CRISPR-Cas9의 서열 특이성의 확인
9.5 kb의 플라스미드(pOri8) 또는 205 kb의 플라스미드(pMSR227)를 이용해, CRISPR-Cas9에 의한 절단의 서열 특이성을 확인했다. pOri8(도 2a) 및 pMSR227(도 3a)는, Su'etsugu et al, Nucleic Acids Res. 2017 Nov 16; 45(20): 11525-11534에 기재되어 있는 플라스미드이다.
10 ng/μL의 pOri8 또는 pMSR227, 100 nM gRNA_Km(IDT사 Alt-R(등록상표) CRISPR-Cas9 System에 따라 조제한 가이드 RNA; 인식 서열: UGGUUAAUUGGUUGUAACAC(서열 번호 1)), 20 nM Cas9(Alt-R(등록상표) S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3 NLS, IDT사), 0.8 U/μL RNase inhibitor murine(M0314, New England Biolabs사), 및 R8 버퍼(혼합물의 합계가 10μL가 되도록 첨가)(조성은 표 2)를 혼합해, 30℃에서 30분간 인큐베이션했다. 제한 효소 SacI(pOri8의 경우) 또는 XhoI(pMSR227의 경우)를 10 U 첨가해 37℃에서 1시간 인큐베이션했다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응 용액의 총용적에 대한 농도이다. 0.5% 아가로스겔 전기 영동을 실시해, SYBR green I 염색에 의해 DNA 단편을 검출했다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, 카나마이신 내성 유전자 하류에 인식 서열을 갖는 gRNA_Km 의존적으로 pOri8의 슈퍼 코일 DNA가 절단되어 직쇄화 되었다. SacI 처리 결과, 예상대로, 9.5 kb의 단편의 절단에 의해 5.6 kb 및 3.8 kb의 단편이 생겼다.
또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, Cas9 및 gRNA_Km 의존적으로 pMSR227의 슈퍼 코일 DNA가 절단되어 직쇄화 되었다. XhoI 처리 결과, 7.6 kb 단편이 예상대로 소실되어 있었다. XhoI에 의한 7.6 kb 단편의 절단으로 발생하는 6.8 kb 단편은 다른 XhoI 단편과 겹쳐 있었지만, 밴드가 두꺼워진 것이 확인되었다.
[실시예 2] CRISPR-RCR
RA 반응 후의 DNA의 증폭 반응에 있어서, CRISPR-Cas9의 존재하에서 RCR을 행함으로써, 개변되지 않은 주형 DNA의 증폭을 저해해, 목적하는 연결 산물을 특이적으로 증폭시킬 수 있는지를 확인했다(도 4).
우선, 주형 DNA(pOri8 또는 pMSR227)를, 이하의 반응에 의해 Cas9로 절단해 직쇄화했다. 10 ng/μL pOri8(9.5 kb) 또는 pMSR227(205 kb), 100 nM gRNA_Km, 20 nM Cas9, 0.8 U/μL RNase inhibitor murine, 및 R8 버퍼(혼합물의 합계가 5μL가 되도록 첨가)를 혼합해, 30℃에서 30분간 인큐베이션했다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다.
다음으로, 이하의 RA 반응에 의해, Cas9 절단 단편과 lacZ 단편(하기 방법에 의해 조제)을 연결시켰다. Cas9 절단 단편 5 ng을 포함하는 상기 Cas9 절단 반응액(0.5 μL), lacZ 단편(pOri8의 경우는 1.7 ng, pMSR227의 경우는 0.09 ng), 50 ng/μL tRNA(R8759, Sigma-Aldrich사), RA 반응액(하기 조성; 혼합물의 합계가 5 μL가 되도록 첨가)을 혼합해, 42℃에서 1시간, 계속해서 65℃에서 2분간 인큐베이션한 후, 얼음 위에 가만히 두었다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는 반응액의 총용적에 대한 농도이다.
lacZ 단편의 조제: pPKOZ(Su'etsugu et al, Nucleic Acids Res. 2017 Nov 16; 45(20): 11525-11534)를 주형으로 하고, 프라이머 SUE1510 및 SUE1511를 이용해 PCR을 실시해 lacZ 전(pre)단편을 조제했다. lacZ 전단편을 주형으로 하고, 프라이머 SUE1638 및 SUE1639를 이용해 PCR을 실시해, 카나마이신 내성 유전자 하류의 CRISPR-Cas9 절단 말단의 60 염기쌍(pOri8 및 pMSR227에서 공통의 서열)과 상동적인 말단을 갖는 lacZ 단편을 조제했다.
Figure pct00001
RA 반응액의 조성: 1 μM의 야생형 RecA(RecA의 대장균 발현주로부터, 폴리에틸렌이민 침전, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제), 80 mU/μL의 엑소뉴클레아제 III(2170A, 다카라 바이오사), 1 U/μL의 엑소뉴클레아제 I(M0293, New England Biolabs사), 20 mM의 Tris-HCl(pH 8.0), 4 mM의 DTT, 1 mM의 아세트산 마그네슘, 50 mM의 글루탐산 칼륨, 100 μM의 ATP, 150 mM의 염화테트라메틸암모늄(TMAC), 5 질량%의 PEG 8000, 10 용량%의 DMSO, 20 ng/μL의 크레아틴 키나아제(10127566001, Sigma-Aldrich사), 4 mM의 크레아틴 인산. 한편, RA 반응액 중의 각 성분의 농도는, RA 반응액의 총용적에 대한 농도이다.
RA 반응 산물에 대해, 이하와 같이 RCR 증폭 반응을 실시했다. RCR 반응액 ver. 2(하기 조성, 한편, RCR 반응액 ver. 2 중의 각 성분의 농도는, RCR 반응액 ver. 2의 총용적에 대한 농도이다.; 혼합물의 합계가 4.5 μL가 되도록 첨가), 100 nM gRNA_Km, 및 1 nM Cas9를 혼합해, 30℃에서 30분간 프리인큐베이션했다. 한편, 반응액 중의 gRNA_Km 및 Cas9의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다. CRISPR-Cas9의 비존재하에서 반응을 실시하는 경우에는, 100 nM gRNA_Km 및 1 nM Cas9를 첨가하지 않고, 그만큼 RCR 반응액 ver. 2를 첨가했다. 계속해서, RA 반응 산물 0.5 μL를 첨가해 37℃에서 1분간 인큐베이션 및 24℃에서 30분간 인큐베이션의 사이클을 40회 실시하고, R8 버퍼로 5배 희석해 30℃에서 30분간 더 인큐베이션했다. RCR 산물 1 μL분을 0.5% 아가로스겔 전기 영동에 제공해, SYBR Green I 염색에 의해 검출했다.
Figure pct00002
표 중, SSB는 대장균 유래 SSB, IHF는 대장균 유래 IhfA 및 IhfB의 복합체, DnaG는 대장균 유래 DnaG, Clamp는(대장균 유래 DnaN), PolIII*는 대장균 유래 DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ 및 HolE로 이루어지는 복합체인 DNA 폴리메라아제 III* 복합체, Dna B는 대장균 유래 DnaB, DnaC는 대장균 유래 DnaC, DnaA는 대장균 유래 DnaA, RNaseH는 대장균 유래 RNaseH, Ligase는 대장균 유래 DNA 리가아제, PolI는 대장균 유래 DNA 폴리메라아제 I, GyrA는 대장균 유래 GyrA, GyrB는 대장균 유래 GyrB, Topo IV는 대장균 유래 ParC 및 ParE의 복합체, Topo III는 대장균 유래 토포이소머라아제 III, RecQ는 대장균 유래 RecQ, RecG는 대장균 유래 RecG, RecJ는 대장균 유래 RecJ, ExoI는 대장균 유래 ExoI, ExoIII는 대장균 유래 ExoIII를 나타낸다.
SSB는, SSB의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전 및 이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
IHF는, IhfA 및 IhfB의 대장균 공발현주(共發現株)로부터, 황산암모늄 침전 및 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
DnaG는, DnaG의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
Clamp는, DnaN(Clamp)의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
PolIII*는, DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ 및 HolE의 대장균 공발현주로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
DnaB, DnaC는, DnaB 및 DnaC의 대장균 공발현주로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
DnaA는, DnaA의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전, 투석 침전 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
GyrA, GyrB는, GyrA의 대장균 발현주와 GyrB의 대장균 발현주의 혼합물로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
Topo IV는, ParC의 대장균 발현주와 ParE의 대장균 발현주의 혼합물로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
Topo III는, Topo III의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전 및 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
RecQ는, RecQ의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
RecG는 RecG의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제해 조제했다.
RecJ는, 시판의 효소를 이용했다(M0264, New England Biolabs사).
ExoI는, 시판의 효소를 이용했다(상기 RA 반응액의 조성 참조).
ExoIII는, 시판의 효소를 이용했다(상기 RA 반응액의 조성 참조).
RNaseH, Ligase, PolI는 시판의 대장균 유래의 효소를 이용했다(다카라 바이오사).
또한, RCR 산물을 대장균에 형질 전환해, 콜로니의 청백 판정을 행함으로써, RCR 산물중의 lacZ 삽입 산물의 비율을 조사했다. pOri8에 대해서는, RCR 산물 1 μL를 TE 버퍼로 10배 희석해, 그 중 1 μL를 이용해 케미컬법에 의해 대장균 DH5α주를 형질 전환했다. pMSR227에 대해서는, RCR 산물 1 μL를 TE 버퍼로 10배 희석해, 그 중 2 μL를 이용해 전기천공(electroporation)법에 의해 대장균 HST08주를 형질 전환했다. 형질 전환 후의 대장균을, LB 플레이트의 총용적에 대해, 50 μg/mL 카나마이신, 0.1 mM(mmol/L) IPTG, 40 μg/mL X-gal을 포함하는 LB 플레이트상에 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양했다. 전체 콜로니수에 대한 청색 콜로니의 수의 비율을 계수했다.
결과를 도 5에 나타낸다. pOri8의 경우, 목적하는 lacZ 삽입 산물인 13 kb 슈퍼 코일 DNA가 RA 의존적으로 RCR 증폭되었다. 개변전의 9.5kb 슈퍼 코일 DNA의 증폭은 gRNA와 Cas9의 존재하에서 억제되었다. 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과에서도, gRNA+Cas9의 비존재하에서는 6% 미만인 청색 콜로니의 비율(도면에서 'Blue colony')이, gRNA+Cas9 존재하에서는 95%까지 상승했다. 한편, 도면에서 'Input'은 RCR 증폭을 행하지 않은 샘플을 나타낸다.
또한 pMSR227의 경우, gRNA+Cas9 존재하에서의 RCR에 의해, 목적하는 lacZ 삽입 산물이라고 생각되는 208 kb 슈퍼 코일 DNA가 증폭되었다. 또한 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과, gRNA+Cas9의 비존재하에서는 0%였던 청색 콜로니의 비율이, 13 콜로니 중 12 콜로니까지 상승해, 목적하는 lacZ 삽입 산물이 높은 효율로 얻어진 것이 확인되었다.
또한, pMSR227(205kb)로의 lacZ(3.3 kb) 삽입 개변을 행한 샘플로부터 얻어진 청색 콜로니로부터, 플라스미드를 추출해 제한 효소 XhoI 절단에 의한 구조 확인을 행했다(도 6a). 예상대로, 개변전에 보여진 7.6 kb의 단편이 소실되고, 11 kb 부근의 밴드가 진해져 있어, lacZ 삽입 산물인 것이 확인되었다(도 6b).
[실시예 3] 장쇄 DNA의 무세포 합성
RCR 증폭법 및 RA 연결법을 이용해, 2개의 장쇄 환상 DNA를 연결해 보다 긴 환상 DNA의 증폭을 실시했다(도 7).
우선, pOri80(85 kb)와 pOri93Cm(94 kb)을, 이하의 방법에 의해, 각각 CRISPR-Cas9에 의해 특정 부위에서 절단해 직쇄화했다. 10 ng/μL pOri80(85 kb) 또는 pOri93Cm(94 kb), 100 nM gRNA_Km(pOri80의 경우) 또는 gRNA_007(pOri93Cm의 경우; IDT사 Alt-R(등록상표) CRISPR-Cas9 System에 따라 조제한 가이드 RNA; 인식 서열: CCUUUAGUUACAACAUACUC(서열 번호 2)), 20 nM Cas9, 0.8 U/μL RNase inhibitor murine, 및 R8 버퍼(혼합물의 합계가 5μL가 되도록 첨가)를 혼합해, 30℃에서 30분간 인큐베이션했다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다.
여기에서, pOri93Cm은 이하의 방법에 의해 조제했다. 대장균주(DGF-298WΔ100::revΔ234::SC)의 게놈 DNA의 XbaI 분해물 중, 93 kb의 게놈 단편을, oriC 및 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 유전자를 포함하는 연결용 단편(Cm-oriC 단편, 1.3 kb; 서열 번호 11)과 RA에 의해 연결시켜 환상으로 했다. Cm-oriC 단편의 양쪽 말단의 60 염기쌍의 서열은, 각각 93 kb의 게놈 단편의 양쪽 말단과 상동 서열이다. 환상 DNA를 RCR 증폭 후, 대장균 형질 전환해, 얻어진 대장균 콜로니로부터 정제한 슈퍼 코일 플라스미드를 pOri93Cm로 했다.
얻어진 2개의 장쇄 DNA 단편을, lacZ 어댑터(3.4 kb) 및 Am 어댑터(1.1 kb)를 이용해, 이하와 같이 RA 반응 실시해 연결했다. pOri80 Cas9 절단 단편 5 ng(0.5 μL), pOri93Cm Cas9 절단 단편 5 ng(0.5 μL), lacZ 어댑터(3.4 kb, 27 pg), Am 어댑터(1.1 kb, 86 ng), 50 ng/μL tRNA, RA 반응액(실시예 2 참조; 혼합물의 합계가 5 μL가 되도록 첨가)을 혼합해, 42℃에서 3시간, 이어서 65℃에서 2분간 인큐베이션한 후, 얼음 위에 가만히 두었다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다.
여기에서, 각 어댑터의 양쪽 말단의 60 염기쌍의 서열은, 2개의 장쇄 DNA 단편의 양쪽 말단과 상동 서열이며, RA에 의해 4개의 단편이 연결 환상화되어 전체 길이 183 kb의 DNA가 형성된다(도 7).
lacZ 어댑터는, pPKOZ를 주형으로 프라이머 SUE175 및 SUE1823를 이용해 PCR을 실시해 조제했다.
Am 어댑터는, pUC4K 플라스미드(GE Healthcare)를 주형으로 프라이머 SUE1753와 SUE1822를 이용해 PCR을 실시해 조제했다.
연결 환상화 후, 이하와 같이 RCR 증폭 반응을 실시했다. RCR 반응액 ver. 2(혼합물의 합계가 4.5 μL가 되도록 첨가), 100 nM gRNA_Km, 100 nM gRNA_007, 및 2 nM Cas9를 혼합해, 30℃에서 30분간 프리인큐베이션했다. 한편, 반응액 중의 gRNA_Km, gRNA_007 및 Cas9의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다. CRISPR-Cas9 비존재하에서 반응을 실시하는 경우에는, 100 nM gRNA_Km, 100 nM gRNA_007 및 2 nM Cas9를 첨가하지 않고, 그만큼 RCR 반응액 ver. 2를 첨가했다. 계속해서, RA 반응 산물 0.5 μL를 첨가해, 37℃에서 1분간 인큐베이션 및 24℃에서 30분간 인큐베이션의 사이클을 40회 실시하고, R8 버퍼로 5배 희석해 30℃에서 30분간 더 인큐베이션했다. RCR 산물 1 μL분을 0.5% 아가로스겔 전기 영동에 제공해, SYBR Green I 염색에 의해 검출했다.
또한, RCR 산물을 대장균에 형질 전환해, 콜로니의 청백 판정을 행함으로써, RCR 산물중의 목적 연결 산물의 비율을 조사했다. RCR 산물 1 μL를 TE 버퍼로 10배 희석해, 그 중 2 μL를 이용해 전기천공법에 의해 대장균 HST08주를 형질 전환했다. 형질 전환 후의 대장균을, LB 플레이트의 총용적에 대해, 12.5 μg/mL 클로람페니콜, 0.1 mM IPTG, 40 μg/mL X-gal을 포함하는 LB 플레이트상에 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양했다. 전체 콜로니수에 대한 청색 콜로니의 수의 비율을 계수했다(Blue colony).
결과를 도 8에 나타낸다. gRNA 및 Cas9 비존재하에서 RCR을 실시한 경우, 개변전의 94 kb 및 85 kb의 슈퍼 코일 DNA가 주로 증폭되었다. 그에 비해, gRNA 및 Cas9 존재하에서 RCR을 실시한 경우, 94 kb 및 85 kb의 DNA 증폭은 억제되고, 컨트롤로서 RCR 증폭한 205 kb 슈퍼 코일 DNA(pMSR227)에 가까운 사이즈의 DNA 증폭을 볼 수 있었다. 한편, 도면에서 'Input'은, RCR 증폭전의 샘플을 나타낸다.
이 증폭 산물을 이용해 대장균을 형질 전환해, 클로람페니콜 내성 콜로니 중 lacZ 유전자를 갖는 콜로니를 청백 판정에 의해 검출한 결과, 21 콜로니 모두가 목적하는 청색 콜로니였다(도면에서 'Blue colony on Cm plate').
얻어진 청색 콜로니를 8개 선택하고, 거기에서 플라스미드를 추출해 아가로스겔 전기 영동에 의해 사이즈를 확인한 결과, 그 전부가 예상된 205 kb 슈퍼 코일 DNA에 가까운 사이즈였다(도 9).
또한, 얻어진 플라스미드의 하나(pOri183라고 명명한다)를 제한 효소 SacI로 절단해, 펄스필드겔 전기 영동을 행함으로써 그 구조를 확인했다(도 10). 염기서열로부터 예상된 절단 패턴(밴드의 오른쪽에 나타낸 사이즈)과 거의 일치하는 결과가 얻어졌다. 한편, 사이즈 마커로서 Ladder marker 뿐만 아니라, 구조가 알려진 pMSR227의 슈퍼 코일(SC) 산물 및 그 XhoI 절단 산물도 동시에 영동을 행했다.
[실시예 4] RCR와 공역한 염기 치환 도입법의 구축
우선, 올리고 DNA를 이용한 염기 치환 도입법을 RCR에 적용할 수 있는지를 조사했다.
실험계를 도 11b 및 12에 나타낸다. lacZ 변이 pPKOZ(pPKOZins 및 pPKOZmis; 도 11a)는, pPKOZ(8.8 kb)를 주형으로 하여 QuikChange PCR법에 의해 조제했다.
pPKOZins의 조제에는, SUE818 및 SUE819를 프라이머로 이용했다. pPKOZins는 lacZ의 코딩 영역에 1 염기의 삽입을 갖는 플라스미드이다(도 12). 프레임 시프트 변이에 의해 야생형 lacZ가 발현하지 않기 때문에, pPKOZins로 형질 전환된 대장균의 콜로니는 청백 판정에서 청색을 나타내지 않는다(도 11b).
pPKOZmis의 조제에는, SUE1415 및 SUE1416를 프라이머로 이용했다. pPKOZmis는, lacZ의 코딩 영역에 1 염기의 치환을 갖는 플라스미드이다(도 12). 넌센스 변이에 의해 야생형 lacZ가 발현하지 않기 때문에, pPKOZmis로 형질 전환된 대장균의 콜로니는 청백 판정에서 청색을 나타내지 않는다(도 11b).
이들 변이형 lacZ를 야생형으로 되돌리기 위한 올리고 DNA로서, SUE1354∼SUE1357를 이용했다.
Figure pct00003
lacZ 프레임 시프트 변이를 갖는 pPKOZins를 주형으로 하여, 이하와 같이, 20∼60 mer의 개변용 올리고 DNA의 존재하에서 RCR 반응을 행했다. RCR 반응액 ver. 1(하기 조성, 한편, RCR 반응액 ver. 1 중의 각 성분의 농도는, RCR 반응액 ver. 1의 총용적에 대한 농도이다. 혼합물의 합계가 5 μL가 되도록 첨가), 1 또는 3 μM 개변용 올리고 DNA(20∼60 mer) 및 75 pg/μL pPKOZins를 혼합해, 30℃에서 18시간 인큐베이션했다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다. RCR 산물 1 μL분을 0.5% 아가로스겔 전기 영동에 제공해, SYBR Green I 염색에 의해 검출했다.
Figure pct00004
RCR 반응액 ver. 1의 각 성분은, RCR 반응액 ver. 2의 것과 동일하다.
또한, RCR 산물을 대장균에 형질 전환하고, 콜로니의 청백 판정을 행함으로써, RCR 산물중의 lacZ 변이가 야생형으로 개변된 것의 비율을 조사했다. RCR 산물 0.25 μL를 이용해, 케미컬법에 의해 대장균 DH5α주를 형질 전환했다. 형질 전환 후의 대장균을, 25 μg/mL 카나마이신, 0.1 mM IPTG, 40 μg/mL X-gal을 포함하는 LB 플레이트상에 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양했다. 전체 콜로니수에 대한 청색 콜로니의 수를 계수했다.
결과를 도 13a 및 도 13b에 나타낸다. 40 mer 또는 60 mer의 개변용 올리고 DNA를 3 μM 첨가한 경우를 제외하고, 충분한 증폭을 볼 수 있었다(도 13a). 도면에서 'Input'은, 주형 DNA를 3.8 ng 흘린 것을 나타낸다.
또한, 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정을 행한 결과, 60 mer의 개변용 올리고를 1 μM 첨가한 샘플에서 가장 높은 5.5%의 효율로 lacZ 변이가 야생형으로 개변된 것이 확인되었다(도 13b).
[실시예 5] 올리고 DNA 60 mer에서 농도 검토(ins/mis)
개변 효율을 개선하기 위해, 올리고 DNA의 사용 농도를 검토했다.
이하의 방법에 의해, pPKOZins 또는 pPKOZmis를 주형으로 하고, 상이한 농도의 60 mer의 개변용 올리고 DNA의 존재하에서, RCR 반응을 행했다. RCR 반응액 ver. 1(혼합물의 합계가 5μL가 되도록 첨가), 0∼3 μM 60 mer 개변용 올리고 DNA(SUE1357), 75 pg/μL pPKOZins 또는 14 pg/μL pPKOZmis를 혼합해, 30℃에서 19시간 인큐베이션했다. RCR 산물 1μL분을 0.5% 아가로스겔 전기 영동에 제공해, SYBR Green I 염색에 의해 검출했다.
또한, RCR 산물을 대장균에 형질 전환해, 콜로니의 청백 판정을 행함으로써, RCR 산물중의 lacZ 변이가 야생형으로 개변된 것의 비율을 조사했다. RCR 산물 0.25 μL를 이용해, 케미컬법에 의해 대장균 DH5α주를 형질 전환했다. 형질 전환 후의 대장균을, LB 플레이트의 총용적에 대해, 25 μg/mL 카나마이신, 0.1 mM IPTG, 40 μg/mL X-gal을 포함하는 LB 플레이트상에 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양했다. 전체 콜로니수에 대한 청색 콜로니의 수를 계수했다.
결과를 도 14a 및 도 14b에 나타낸다. 도 14a에서 'Input'은, pPKOZins를 3.8 ng, pPKOZmis를 0.72 ng 흘린 것을 나타낸다. 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과, pPKOZins 또는 pPKOZmis 전부에서, 0.3 μM의 개변용 올리고 DNA를 첨가한 샘플에서 가장 높은 20% 이상의 효율로 lacZ 변이가 야생형으로 개변된 것이 확인되었다(도 14b).
[실시예 6] CRISPR-Cas9를 이용한 ROGE의 효율화
실시예 5와 같은 실험계에서, CRISPR-Cas9의 존재하에서 RCR을 행함으로써, lacZ 변이가 야생형으로 개변되는 효율을 높일 수 있는지를 검토했다.
이하와 같이, pPKOZins를 주형으로 하여, 0.3 μM의 60 mer의 개변용 올리고 DNA의 존재하에서, RCR 반응을 행했다. RCR 반응액 ver. 1(혼합물의 합계가 5 μL가 되도록 첨가), 0.3 μM 60 mer 개변용 올리고 DNA(SUE1357), 0∼20 nM Cas9, 100 nM gRNA_Zins(IDT사 Alt-R(등록상표) CRISPR-Cas9 System에 따라 조제한 가이드 RNA; 인식 서열: ACCAUGAUUACGGAUUCACU(서열 번호 20), 7.5 fg/μL pPKOZins를 혼합해, 30℃에서 21시간 인큐베이션했다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다. R8 버퍼로 5배 희석해 30℃에서 30분간 더 인큐베이션했다. RCR 산물 2.5 μL분을 0.5% 아가로스겔 전기 영동에 제공해, SYBR Green I 염색에 의해 검출했다.
여기에서, gRNA_Zins는, 개변전의 lacZins 서열을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA이다.
또한, RCR 산물을 대장균에 형질 전환해, 콜로니의 청백 판정을 행함으로써, RCR 산물중의 lacZ 변이가 야생형으로 개변된 것의 비율을 조사했다. RCR 산물 0.25 μL를 이용해, 케미컬법에 의해 대장균 DH5α주를 형질 전환했다. 형질 전환 후의 대장균을, LB 플레이트의 총용적에 대해, 25 μg/mL 카나마이신, 0.1 mM IPTG, 40 μg/mL X-gal을 포함하는 LB 플레이트상에 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양했다. 전체 콜로니수에 대한 청색 콜로니의 수를 계수했다.
결과를 도 15a 및 도 15b에 나타낸다. 개변용 올리고 DNA의 비존재하에서는, Cas9 및 gRNA_Zins의 양쪽 모두의 첨가에 의해, RCR에 의한 슈퍼 코일 DNA의 증폭이 현저히 억제되었다(도 15a). 그에 대해, 개변용 올리고 DNA의 존재하에서는, CRISPR-Cas9를 첨가해도, 증폭되는 슈퍼 코일 DNA 산물이 검출되었다(도 15a). 또한 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과, Cas9 및 gRNA_Zins의 첨가에 의해, 개변용 올리고 DNA의 존재하에서는, 거의 모든 증폭 산물이 lacZ 야생형으로 개변된 것이 확인되었다(도 15b).
[실시예 7] 장쇄 DNA ROGE
실시예 5와 같은 실험계에서, 올리고 DNA를 이용한 염기 치환 도입법을 장쇄 DNA의 RCR에 적용할 수 있는지를 검토했다.
이하와 같이, lacZins 변이를 갖는 101 kb의 oriC 함유 환상 DNA(pOri93Zins)(도 16a)를 주형으로 하여 RCR 반응을 실시했다. RCR 반응액 ver. 1(혼합물의 합계가 5μL가 되도록 첨가), 0∼3 μM 60 mer 개변용 올리고 DNA(SUE1357), 3 ng/μL lambda DNA, 0.67 pM pOri93Zins를 혼합해, 33℃에서 18시간 인큐베이션한 후, R8 버퍼에서 5배 희석해 30℃에서 30분간 더 인큐베이션했다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다. RCR 산물 2.5 μL분을 0.5% 아가로스겔 전기 영동에 제공해, SYBR Green I 염색에 의해 검출했다.
여기에서, pOri93Zins는 이하의 방법에 의해 조제했다. 대장균주(DGF-298WΔ100::revΔ234::SC)의 게놈 DNA의 XbaI 분해물 중 93 kb의 게놈 단편을, oriC, 카나마이신 내성 유전자 및 lacZins 변이 유전자를 포함하는 연결용 단편(KOZins 단편)과 RA에 의해 연결시켜 환상화했다. KOZins 단편(8.6 kb)은, pKOZins를 주형으로 하여 프라이머 SUE1745와 SUE1746를 이용한 PCR에 의해 조제했다. KOZins 단편의 양쪽 말단의 서열은, 각각 93 kb의 게놈 단편의 양쪽 말단과 상동 서열이다. RA 후의 환상 DNA를 RCR에 의해 증폭시킨 후, 대장균에 형질 전환해, 얻어진 대장균 콜로니로부터 정제한 슈퍼 코일 플라스미드를 pOri93Zins로 했다.
Figure pct00005
또한, RCR 산물을 대장균에 형질 전환해, 콜로니의 청백 판정을 행함으로써, RCR 산물중의 lacZ 변이가 야생형으로 개변된 것의 비율을 조사했다. RCR 산물 0.2 μL분을 이용해, 전기천공법에 의해 대장균 HST08주를 형질 전환했다. 형질 전환 후의 대장균을, LB 플레이트의 총용적에 대해, 25 μg/mL 카나마이신, 0.1 mM IPTG, 40 μg/mL X-gal을 포함하는 LB 플레이트상에 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양했다. 전체 콜로니수에 대한 청색 콜로니의 수를 계수했다.
결과를 도 16b 및 도 16c에 나타낸다. 개변용 올리고 DNA의 농도가 1 μM 이상인 경우, 증폭 반응의 저해가 인정되었다(도 16b). 한편, 도 16b에서 'Input'은, 주형 DNA 0.02 ng을 흘린 것을 나타낸다.
또한 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과, 0.3 μM의 개변용 올리고 DNA의 존재하에서, 증폭 산물의 5.4%에서 lacZins 변이가 lacZ 야생형으로 개변된 것이 나타났다(도 16c).
[실시예 8] CRISPR-Cas9를 이용한 장쇄 DNA ROGE의 효율화
실시예 6와 동일한 실험계에서, CRISPR-Cas9에 의한 개변 효율의 상승이 장쇄 DNA의 RCR에 적용될 수 있는지를 검토했다.
불필요한 직쇄상 DNA를 제거하는 처리를 한 pOri93Zins 환상 DNA를 주형으로 하여, 이하와 같이, 0.3 μM의 60 mer의 개변용 올리고 DNA의 존재하에서, RCR 반응을 행했다.
RCR 반응액 ver. 1(혼합물의 합계가 5μL가 되도록 첨가), 0.3 μM 60 mer 개변용 올리고 DNA(SUE1357), 3 ng/μL lambda DNA, 10 nM Cas9, 100 nM gRNA_Zins(IDT사 Alt-R(등록상표) CRISPR-Cas9 System에 따라 조제한 가이드 RNA; 인식 서열: ACCAUGAUUACGGAUUCACU(서열 번호 20), 1 pM pOri93Zins를 혼합했다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다. 계속해서, 37℃ 1분간→24℃ 30분간의 온도 사이클로 40 사이클 인큐베이션한 후, R8 버퍼로 5배 희석해 30℃에서 30분간 더 인큐베이션했다. RCR 산물 2.5 μL분을 0.5% 아가로스겔 전기 영동에 제공해, SYBR Green I 염색에 의해 검출했다.
또한, RCR 산물을 대장균에 형질 전환해, 콜로니의 청백 판정을 행함으로써, RCR 산물중의 lacZ 변이가 야생형으로 개변된 것의 비율을 조사했다. RCR 산물 0.2 μL분을 이용해, 전기천공법에 의해 대장균 HST08주를 형질 전환했다. 형질 전환 후의 대장균을, 25 μg/mL 카나마이신, LB 플레이트의 총용적에 대해, 0.1 mM IPTG, 40 μg/mL X-gal을 포함하는 LB 플레이트상에 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양했다. 전체 콜로니수에 대한 청색 콜로니의 수를 계수했다.
결과를 도 17a 및 도 17b에 나타낸다. 개변용 올리고 DNA의 비존재하에서는, Cas9 및 gRNA_Zins의 양쪽 모두의 첨가에 의해, RCR에 의한 슈퍼 코일 DNA의 증폭이 현저히 억제되었다(도 17a). 이에 비해, 개변용 올리고 DNA의 존재하에서는, CRISPR-Cas9를 첨가해도, 증폭되는 슈퍼 코일 DNA 산물이 검출되었다(도 17a).
또한 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과, Cas9 및 gRNA_Zins의 첨가에 의해, 개변용 올리고 DNA의 존재하에서는, 거의 모든 증폭 산물이 lacZ 야생형으로 개변된 것이 확인되었다(도 17b).
[실시예 9] 복수 염기 치환 및 삽입
실시예 5와 동일한 실험계에서, 개변용 올리고 DNA를 이용해, 복수의 염기를 치환 또는 삽입이 가능한지를 검토했다.
복수 염기 치환에서는, pPKOZins를 주형으로 하고, 3 염기 치환에 의해 동의 코돈이 되는 개변용 올리고 DNA를 이용했다. pPKOZins는 lacZ의 코딩 영역으로의 1 염기의 삽입에 의해 프레임 시프트 변이를 갖고, 대장균 콜로니는 백색을 나타낸다. 개변용 올리고의 3 염기 치환 부위 근방에는, 이 1 염기 삽입을 야생형의 서열로 되돌리는 서열을 포함하고 있다. 개변에 의해 야생형(청색 대장균 콜로니)이 된 플라스미드는, 동시에 3 염기 치환이 도입되고 있을 것으로 예상된다(도 18a).
한편, 복수 염기 삽입에서는, pPKOZ를 주형으로 하여, 4 염기 삽입에 의해 EcoRI 인식 서열이 발생하는 개변용 올리고를 이용했다(도 18b). 4 염기 삽입에 의해 프레임 시프트 변이가 유도되어 lacZ 유전자가 합성되지 않기 때문에, 대장균의 콜로니는 백색을 나타낼 것으로 예상된다. 한편, pPKOZ는 이미 1 부위의 EcoRI 사이트를 갖기 때문에(도 18f), 4 염기 삽입에 의해 플라스미드는 EcoRI 사이트를 2 부위 갖게 된다(도 18g).
pPKOZins 또는 pPKOZ를 주형으로 하여, 이하와 같이 상이한 농도의 개변용 올리고 DNA의 존재하에서 RCR 반응을 행했다. RCR 반응액 ver. 1(혼합물의 합계가 5 μL가 되도록 첨가), 0 μM∼0.6 μM 60 mer 개변용 올리고 DNA(SUE4386 또는 SUE4387), 50 pg/μL pPKOZins 또는 pPKOZ를 혼합했다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다. 계속해서, 반응액을 33℃에서 18시간 인큐베이션한 후, R8 버퍼로 5배 희석해 30℃에서 30분간 더 인큐베이션했다. RCR 산물 2.5 μL분을 0.5% 아가로스겔 전기 영동에 제공해, SYBR Green I 염색에 의해 검출했다.
Figure pct00006
또한, RCR 산물을 대장균에 형질 전환해, 콜로니의 청백 판정을 행함으로써, pPKOZins를 이용한 경우에는 청색 콜로니의 비율, pPKOZ를 이용한 경우에는 백색 콜로니의 비율을 조사했다. RCR 산물 0.25 μL를 이용해, 케미컬법에 의해 대장균 DH5α주를 형질 전환했다. 형질 전환 후의 대장균을, LB 플레이트의 총용적에 대해, 25 μg/mL 카나마이신, 0.1 mM IPTG, 40 μg/mL X-gal을 포함하는 LB 플레이트상에 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양했다. 전체 콜로니수에 대한 청색 콜로니 또는 백색 콜로니의 수를 계수했다.
결과를 도 18c, 도 18d 및 도 18e에 나타낸다. 대장균 형질 전환 콜로니의 청백 판정의 결과, pPKOZins 또는 pPKOZ의 어느 쪽에 대해서도, 0.3 μM의 개변용 올리고 DNA를 첨가한 샘플에서 가장 높은 효율(각각 7.3%, 3.6%)로 lacZ가 개변된 것이 확인되었다(도 18d 및 도 18e).
실제로 목적하는 서열로 개변되고 있는지를 확인하기 위해, pPKOZins를 주형으로 한 개변 실험에서의 청색 콜로니로부터 얻어진 플라스미드 4개를, 시퀀스 해석한 결과 전부에 목적하는 3 염기 치환이 도입되고 있었다.
또한, pPKOZ를 주형으로 한 4 염기 삽입 실험에서의 백색 콜로니로부터 얻어진 플라스미드 7개에 대해, 이하와 같은 제한 효소 처리에 의해 4 염기 삽입을 확인했다. 10×H 버퍼(혼합물의 합계가 20 μL가 되도록 첨가), 0.75 U/μL EcoRI, 플라스미드 각각 2 μL를 혼합해, 37℃에서 1시간 인큐베이션했다. 미개변으로 상정되는 청색 콜로니로부터 얻어진 플라스미드에 대해서도 동일한 제한 효소 처리를 실시했다. 제한 효소 처리 산물 4 μL분을 0.5% 아가로스겔 전기 영동에 제공해, SYBR Green I 염색에 의해 검출했다.
결과를 도 18h에 나타낸다. 제한 효소 처리를 실시한 7개의 개변 플라스미드 전부에서 예상대로 2 부위 절단에 의한 2 단편이 검출되어, 목적하는 4 염기 삽입 서열로 개변되었던 것을 확인했다. 미개변의 플라스미드(wt)에서는, 1 부위 절단만이 검출되었다(도 18h).
[실시예 10] 복수 부위 동시 염기 치환
비올라세인(violacein)의 생합성 경로를 이용해 이하와 같은 시험을 행했다. 비올라세인은, 5개의 유전자 산물(vioA, vioB, vioC, vioD, vioE)을 이용해 트립토판을 기초로 생산되는 2차 대사산물이다. 대장균내에서, 5개의 유전자가 모든 기능을 갖추었을 경우에 콜로니는 자색을 나타낸다(도 19b). vioC 결손에서는 비올라세인 생합성 중간 산물까지 생산되고, 콜로니는 흑갈색을 나타낸다(도 19b). 또한, vioA 결손 또는 vioA, vioC 이중 결손에서는 색을 나타내는 산물은 합성되지 않고, 콜로니는 백색인 상태이다(도 19b). 이와 같은 콜로니색의 변화를 이용해, vioA, vioC 이중 결손 변이 플라스미드에 대해, vioA 및 vioC의 2 부위의 떨어진 영역을 동시 염기 치환함으로써, vioA, vioC 야생형 플라스미드로 되돌릴 수 있는지를 자색 콜로니 출현을 지표로 검출을 시도했다.
사용하는 플라스미드 pK3OV_insAC는, vioA 및 vioC의 코딩 영역에 각각 1 염기의 삽입을 갖는다(도 19a). 이 pK3OV_insAC는 pK3OV를 주형으로 하고, RCR 반응과 공역한 1 염기 삽입을 2회 연속해 실시함으로써 조제했다. 첫번째는 올리고 DNA로서 SUE4384(서열 번호 64)를 이용해 vioC에 1 염기 삽입을 실시해, 발생한 흑갈색 콜로니로부터 플라스미드 pK3OV_insC를 조제, 계속해서 두번째는 pK3OV_insC를 주형으로, SUE4579(서열 번호 63)를 이용해 vioA에 1 염기 삽입을 도입해, 발생한 백색 콜로니로부터 플라스미드 pK3OV_insAC를 조제했다. 프레임 시프트 변이에 의해 vioA 및 vioC가 발현되지 않기 때문에, pK3OV_insAC로 형질 전환된 대장균의 콜로니는 백색으로, 색은 나타내지 않는다.
pK3OV는 pETM6-vioABECD(Jones et al., Sci. Rep. (2015)5, 11301)의 vioABECD 유전자를 코딩하는 DNA 영역을, 서열 번호 67로 나타내는 oriC, 카나마이신 내성 유전자, 및 LacI를 포함하는 3.5 kb의 DNA 단편과 RA 반응에 의해 연결 환상화함으로써 조제했다.
이 변이형 vioA 및 vioC를 야생형으로 되돌리는 올리고 DNA로서, SUE4577(서열 번호 65) 및 SUE4381(서열 번호 66)를 이용했다(도 19c 및 도 19d).
vioA 및 vioC에 프레임 시프트 변이를 갖는 pK3OV_insAC를 주형으로 하여, 이하와 같이 RCR 반응을 행했다. RCR 반응액 ver. 1(혼합물의 합계가 5 μL가 되도록 첨가), 0.15 μM 60 mer 개변용 올리고 DNA(SUE4577 및 SUE4381), 및 50 pg/μL pK3OV_insAC를 혼합해, 33℃에서 6시간, 12시간 또는 18시간 인큐베이션했다. 한편, 반응액 중의 각 성분의 농도는, 반응액의 총용적에 대한 농도이다.
Figure pct00007
그 후, RCR 산물을 대장균에 형질 전환해, 콜로니의 색판정을 행함으로써, RCR 산물중의 vioA 및 vioC 변이가 야생형으로 개변된 것의 비율을 조사했다. RCR 산물 1 μL를 직접 이용해, 케미컬법에 의해 대장균 BL21 Star(DE3)주(Thermo Fisher Scientific사)를 형질 전환했다. 형질 전환 후의 대장균을, LB 플레이트의 총용적에 대해, 25 μg/mL 카나마이신 및 10 μM IPTG를 포함하는 LB 플레이트상에 파종하고 30℃에서 하룻밤 배양했다. 전체 콜로니수에 대한 자색 콜로니의 수를 계수했다.
결과를 도 19e에 나타낸다. 각 시간에서의 RCR 산물에 의한 대장균 형질 전환의 결과, 0.3%∼0.7% 정도의 효율로 자색 콜로니가 검출되었다. 이것으로부터, vioA 변이 및 vioC 변이의 2 부위가 동시에 야생형으로 개변된 것이 확인되었다(도 19e).
《산업상 이용 가능성》
본 실시 형태의 방법에 의하면, 세포를 이용하지 않고 DNA 편집 산물, 특히 장쇄 DNA 편집 산물을 증폭시키는 방법 등을 제공할 수 있다.
《서열목록 자유텍스트》
서열 번호 1: gRNA_Km
서열 번호 2: gRNA_007
서열 번호 3: SUE1510
서열 번호 4: SUE1511
서열 번호 5: SUE1638
서열 번호 6: SUE1639
서열 번호 7: SUE1753
서열 번호 8: SUE1756
서열 번호 9: SUE1822
서열 번호 10: SUE1823
서열 번호 11: Cm-oriC 단편
서열 번호 12: SUE818
서열 번호 13: SUE819
서열 번호 14: SUE1415
서열 번호 15: SUE1416
서열 번호 16: SUE1354
서열 번호 17: SUE1355
서열 번호 18: SUE1356
서열 번호 19: SUE1357
서열 번호 20: gRNA_Zins
서열 번호 21: SUE1745
서열 번호 22: SUE1746
서열 번호 23: ter 서열(컨센서스)
서열 번호 24: ter 서열(컨센서스)
서열 번호 25: ter 서열(terA, B, D, E 또는 H)
서열 번호 26: ter 서열(terA, B, D, E 또는 H)
서열 번호 27: ter 서열(terC)
서열 번호 28: ter 서열(terF)
서열 번호 29: ter 서열(terG)
서열 번호 30: ter 서열(terI)
서열 번호 31: ter 서열(tarJ)
서열 번호 32: ter 서열(바실러스, 컨센서스)
서열 번호 33: ter 서열(고초균, 컨센서스)
서열 번호 34: ter 서열(고초균, 컨센서스)
서열 번호 35: ter 서열(terVII)
서열 번호 36: ter 서열(terIX)
서열 번호 37: XerCD에 의해 인식되는 서열(컨센서스)
서열 번호 38: XerCD에 의해 인식되는 서열(컨센서스, dif 및 cer)
서열 번호 39: XerCD에 의해 인식되는 서열(컨센서스, dif 및 psi)
서열 번호 40: XerCD에 의해 인식되는 서열(컨센서스, cer 및 psi)
서열 번호 41: dif 서열
서열 번호 42: cer 서열
서열 번호 43: psi 서열
서열 번호 44: dif 서열
서열 번호 45: cer 서열
서열 번호 46: psi 서열
서열 번호 47: loxP 컨센서스 서열
서열 번호 48: lox511 서열
서열 번호 49: lox2272 서열
서열 번호 50: loxFAS 서열
서열 번호 51: lox RE서열
서열 번호 52: lox LE서열
서열 번호 53: FRT 서열
서열 번호 54: rox 서열
서열 번호 55: Outside End(OE) 서열
서열 번호 56: SUE4386
서열 번호 57: SUE4387
서열 번호 58: lacZ wt의 개시 코돈 하류의 부분 서열
서열 번호 59: lacZ ins의 개시 코돈 하류의 부분 서열
서열 번호 60: lacZ mis의 개시 코돈 하류의 부분 서열
서열 번호 61: pPKOZins의 개시 코돈 부근의 부분 서열
서열 번호 62: pPKOZ의 개시 코돈 부근의 부분 서열
서열 번호 63: SUE4579
서열 번호 64: SUE4384
서열 번호 65: SUE4577
서열 번호 66: SUE4381
서열 번호 67: pK3OV 제작용 DNA 단편(3.5 kb)
서열 번호 68: vioA ins
서열 번호 69: vioC ins
SEQUENCE LISTING <110> OriCiro Genomics, Inc. <120> METHOD OF EDITING DNA IN CELl-FREE SYSTEM <130> OSP93286 <150> JP2018-142274 <151> 2018-07-30 <160> 69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for gRNA_Km <400> 1 ugguuaauug guuguaacac 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for gRNA_007 <400> 2 ccuuuaguua caacauacuc 20 <210> 3 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE1510 <400> 3 cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa ctttagttac aacatactac 60 gacaggtttc ccgactg 77 <210> 4 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE1511 <400> 4 agccgccgtc ccgtcaagtc agcgtaatgc tctgccagtg ctttagttac aacatacttt 60 tccttacgcg aaatacgg 78 <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE1638 <400> 5 ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa 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acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaagaagat ccggcagaag aatggagtat 840 gttgtaacta aagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttataca gatcgtgcga 900 tctactgtgg ataactctgt caggaagctt ggatcaaccg gtagttatcc aaagaacaac 960 tgttgttcag tttttgagtt gtgtataacc cctcattctg atcccagctt atacggtcca 1020 ggatcaccga tcattcacag ttaatgatcc tttccaggtt gttgatctta aaagccggat 1080 ccttgttatc cacagggcag tgcgatccta ataagagatc acaatagaac agatctctaa 1140 ataaatagat cttcttttta atacccagga tccatttaac ataatataca ttatgcgcac 1200 ctttagttac aacatactca ggtctttctc aagccgacct agagcgaaaa aacaataata 1260 aaccctgccg gatgcgatgc tgacgcatct tatccggc 1298 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE818 <400> 12 gattacggat tcactcggcc gtcgttttac 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE819 <400> 13 gtaaaacgac ggccgagtga atccgtaatc 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE1415 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sequence (terJ) <400> 31 gtaagttgta acga 14 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for ter sequence (Bacillus) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> w is a or t <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> r is a or g <220> <221> misc_feature <222> (6)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> y is t or c <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 acwrannnnn ynatgtacna aat 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for ter sequence (Bacillus subtilis) <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> r is a or g <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> w is a or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> y is c or t <400> 33 actaattraw cyatgtacta aat 23 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for ter sequence (Bacillus subtilis) <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> r is a or g <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> w is a or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> y is c or t <400> 34 actaattraw cyatgtacta aattttca 28 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for ter sequence (terVII) <400> 35 gaactaatta aactatgtac taaattttca 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for ter sequence (terIX) <400> 36 atactaattg atccatgtac taaattttca 30 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide recognized by XerCD <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> r is a or g <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> y is c or t <400> 37 ggtgcgyrya annnnnntta tgktaaay 28 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide recognized by XerCD (dif and cer) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> k is g or t <400> 38 ggtgcgyaya annnnnntta tgktaaat 28 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide recognized by XerCD (dif and psi) <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> r is a or g <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> y is c or t <400> 39 ggtgcgcrya annnnnntta tgttaaay 28 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide recognized by XerCD (dif and psi) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> r is a or g <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> y is c or t <400> 40 ggtgcgyrca annnnnntta tgktaaay 28 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for dif sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 ggtgcgcata annnnnntta tgttaaat 28 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for cer sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 ggtgcgtaca annnnnntta tggtaaat 28 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for psi sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 43 ggtgcgcgca annnnnntta tgttaaac 28 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for dif sequence <400> 44 ggtgcgcata atgtatatta tgttaaat 28 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for cer sequence <400> 45 ggtgcgtaca agggatgtta tggtaaat 28 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for psi sequence <400> 46 ggtgcgcgca agatccatta tgttaaac 28 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for loxP consensus sequence <400> 47 ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 48 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for lox511 sequence <400> 48 ataacttcgt atagtataca ttatacgaag ttat 34 <210> 49 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for lox2272 sequence <400> 49 ataacttcgt ataggatact ttatacgaag ttat 34 <210> 50 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for loxFAS sequence <400> 50 ataacttcgt atataccttt ctatacgaag ttat 34 <210> 51 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for lox RE sequence <400> 51 ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for lox LE sequence <400> 52 taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 53 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for FRT sequence <400> 53 gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34 <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for rox sequence <400> 54 taactttaaa taatgccaat tatttaaagt ta 32 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for Outside End (OE) sequence <400> 55 ctgtctctta tacacatct 19 <210> 56 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE4386 <400> 56 ggaaacagct atgaccatga ttacggatag cctggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 60 <210> 57 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE4387 <400> 57 ggaaacagct atgaccatga ttacggatga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 60 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for partial sequence of lacZ wt <400> 58 atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaa 39 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for partial sequence of lacZ ins <400> 59 atgaccatga ttacggattc actcggccgt cgttttacaa 40 <210> 60 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for partial sequence of lacZ mis <400> 60 atgaccatga ttacggatta actggccgtc gttttacaa 39 <210> 61 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for partial sequence of pPKOZins <400> 61 ggaaacagct atgaccatga ttacggattc actcggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 60 g 61 <210> 62 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for partial sequence of pPKOZ <400> 62 ggaaacagct atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 60 <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE4579 <400> 63 gtgtgtgcaa ttacattagc tcgttcaagt ggcattagaa ggttacgcaa tagatgtcta 60 <210> 64 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE4384 <400> 64 gcctgacggc aatctatcta gcgaaacaag gggcacgaag ttcacattat agaaaaacgt 60 <210> 65 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE4577 <400> 65 ggatagtgtg tgcaattaca ttagctcgtt caagggcatt agaaggttac gcaatagatg 60 <210> 66 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for SUE4381 <400> 66 ggcagcctga cggcaatcta tctagcgaaa caagggcacg aagttcacat tatagaaaaa 60 <210> 67 <211> 3450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for pK3OV preparation <400> 67 tgatgcctcc gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta atgataccga tgaaacgaga 60 gaggatgctc acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg aacgttgtga 120 gggtaaacaa ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc agggtcaatg 180 ccagcgcttc gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc atcctgcgat 240 gcagatccgg aacataatgg tgcagggcgc tgacttccgc gtttccagac tttacgaaac 300 acggaaaccg aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca gacgttttgc agcagcagtc 360 gcttcacgtt cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa ccagtaaggc aaccccgcca 420 gcctagccgg gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcta gtcatgcccc gcgcccaccg 480 gaaggagctg actgggttga aggctctcaa gggcatcggt cgagatcccg gtgcctaatg 540 agtgagctaa cttacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 600 gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 660 gcgccagggt ggtttttctt ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg cccttcaccg 720 cctggccctg agagagttgc agcaagcggt ccacgctggt ttgccccagc aggcgaaaat 780 cctgtttgat ggtggttaac ggcgggatat aacatgagct gtcttcggta tcgtcgtatc 840 ccactaccga gatgtccgca ccaacgcgca gcccggactc ggtaatggcg cgcattgcgc 900 ccagcgccat ctgatcgttg gcaaccagca tcgcagtggg aacgatgccc tcattcagca 960 tttgcatggt ttgttgaaaa ccggacatgg cactccagtc gccttcccgt tccgctatcg 1020 gctgaatttg attgcgagtg agatatttat gccagccagc cagacgcaga cgcgccgaga 1080 cagaacttaa tgggcccgct aacagcgcga tttgctggtg acccaatgcg accagatgct 1140 ccacgcccag tcgcgtaccg tcttcatggg agaaaataat actgttgatg ggtgtctggt 1200 cagagacatc aagaaataac gccggaacat tagtgcaggc agcttccaca gcaatggcat 1260 cctggtcatc cagcggatag ttaatgatca gcccactgac gcgttgcgcg agaagattgt 1320 gcaccgccgc tttacaggct tcgacgccgc ttcgttctac catcgacacc accacgctgg 1380 cacccagttg atcggcgcga gatttaatcg ccgcgacaat ttgcgacggc gcgtgcaggg 1440 ccagactgga ggtggcaacg ccaatcagca acgactgttt gcccgccagt tgttgtgcca 1500 cgcggttggg aatgtaattc agctccgcca tcgccgcttc cactttttcc cgcgttttcg 1560 cagaaacgtg gctggcctgg ttcaccacgc gggaaacggt ctgataagag acaccggcat 1620 actctgcgac atcgtataac gttactggtt tcacattcac caccctgaat tgactctctt 1680 ccgggcgcta tcatgccata ccgcgaaagg ttttgcgcca ttcgatggtg tccgggatct 1740 cgacgctctc ccttatgcga ctcctgcatt aggaagcagc ccagtagtag gttgaggccg 1800 ttgagcaccg ccgccgcaag gaatggtgca tgcaaggaga tggcgcccaa cagtcccccg 1860 gccacggggc ctgccaccat acccacgccg aaacaagcgc tcatgagccc gaagtggcga 1920 gcccgatctt ccccatcggt gatgtcggcg atataggtta aataccctgt agcggtatag 1980 ataaaacgtt ggtttgcaaa aaaaatcctt agctttcgct aaggatctgc attagaaaaa 2040 ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt 2100 ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc 2160 aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt 2220 cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg 2280 tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg 2340 ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc 2400 gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg 2460 gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa 2520 tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt 2580 acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac 2640 catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg 2700 cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg 2760 agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca 2820 agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac acgttccttg tattacgtta caagtataac 2880 acaaagtttt ttatgttgtc aagtttatgt aagcagacag ttttattgtt catgatgata 2940 tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga cacaacgtgg ctttgaagat 3000 ccggcagaag aatggagtat gttgtaacta aagataactt cgtataatgt atgctatacg 3060 aagttataca gatcgtgcga tctactgtgg ataactctgt caggaagctt ggatcaaccg 3120 gtagttatcc aaagaacaac tgttgttcag tttttgagtt gtgtataacc cctcattctg 3180 atcccagctt atacggtcca ggatcaccga tcattcacag ttaatgatcc tttccaggtt 3240 gttgatctta aaagccggat ccttgttatc cacagggcag tgcgatccta ataagagatc 3300 acaatagaac agatctctaa ataaatagat cttcttttta atacccagga tcctttagtt 3360 acaacatact caggtctttc tcaagccgac cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga 3420 tgccggccac gatgcgtccg gcgtagccta 3450 <210> 68 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for vioA that one base inserted <400> 68 ggatagtgtg tgcaattaca ttagctcgtt caagtggcat tagaaggtta cgcaatagat 60 g 61 <210> 69 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic nucleotide for vioC that one base inserted <400> 69 ggcagcctga cggcaatcta tctagcgaaa caaggggcac gaagttcaca ttatagaaaa 60 a 61

Claims (14)

  1. 무세포계에서 DNA를 편집하는 방법으로서, 이하의 공정:
    (1) 무세포계에서 DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 공정과,
    (2) 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를, 무세포계에서 증폭시키는 공정을 포함하고,
    여기에서 상기 DNA는 20℃∼80℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는, 상기 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    무세포계에서 DNA를 편집하는 방법으로서, 이하의 공정:
    (1) 무세포계에서 DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 공정과,
    (2) 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를, 무세포계에서 증폭시키는 공정을 포함하고,
    여기에서 상기 DNA는 등온에서 인큐베이션하거나 또는 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는, 상기 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    무세포계에서 DNA를 편집하는 방법으로서, 이하의 공정:
    (1) 무세포계에서 DNA의 표적 부위에 결실, 치환 또는 부가를 도입하는 공정과,
    (2) 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA를, 무세포계에서 증폭시키는 공정을 포함하고,
    여기에서 상기 DNA는 20℃∼80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도에서 인큐베이션하거나 또는 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는, 상기 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (2)를, 결실, 치환 또는 부가가 도입되지 않은 DNA를 특이적으로 절단하는 인공 DNA 절단 효소의 존재하에서 행하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    인공 DNA 절단 효소가, 인공 뉴클레아제 또는 RNA 유도형 뉴클레아제인, 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    인공 DNA 절단 효소가 CRISPR-Cas9인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA가 환상 DNA인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    공정 (2)가, 이하의 공정:
    (2-1) (a) 환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1 효소군, (b) 오카자키 절편 연결 반응을 촉매해, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2 효소군, 및 (c) 2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3 효소군을 함유하는 반응 용액과, 공정 (1)에서 결실, 치환 또는 부가가 도입된 환상 DNA의 반응 혼합물을 조제하는 공정과,
    (2-2) 공정 (2-1)에서 조제한 반응 혼합물을, 20℃∼80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도에서 인큐베이션하거나 또는 65℃ 이하의 2개의 온도에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 공정을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    환상 DNA가, DnaA 활성을 갖는 효소와 결합 가능한 복제 개시 서열을 포함하는, 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    공정 (2)에서, 환상 DNA가 롤링 써클 증폭에 의해 증폭되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (1)이, 이하의 공정:
    (1-1) 인공 DNA 절단 효소를 DNA에 작용시킴으로써, 상기 DNA를 표적 부위에서 절단해, 적어도 하나의 직쇄 DNA를 조제하는 공정과,
    (1-2) 공정 (1-1)에서 조제된 직쇄 DNA, 1종류 이상의 DNA 단편, 및 RecA 패밀리 재조합 효소 활성을 갖는 단백질을 함유하는 반응 용액을 조제하는 공정과,
    (1-3) 상기 직쇄 DNA와 상기 1종류 이상의 DNA 단편을 염기서열이 상동인 영역끼리 또는 염기서열이 상보적인 영역끼리 서로 연결시켜, 주형 DNA의 표적 부위에 상기 1종류 이상의 DNA 단편이 삽입된 DNA를 형성시키는 공정을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (1)이, 결실, 치환 또는 부가 도입용 단일가닥 DNA의 존재하에서 DNA 복제 반응을 실시하는 공정을 포함하고,
    여기에서 상기 단일가닥 DNA는 복제 반응의 조건하에서 상기 DNA의 표적 부위에 교잡할 수 있는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (2)에서, DNA가 30℃ 이상에서의 인큐베이션 및 27℃ 이하에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클하에서 인큐베이션하는 온도 조건하에서 증폭되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    결실, 치환 또는 부가가 도입된 DNA의 사이즈가, 50 kb 이상인, 방법.
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