[go: up one dir, main page]

KR20210071017A - Gm1 강글리오시드증 치료에 유용한 조성물 - Google Patents

Gm1 강글리오시드증 치료에 유용한 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20210071017A
KR20210071017A KR1020217012705A KR20217012705A KR20210071017A KR 20210071017 A KR20210071017 A KR 20210071017A KR 1020217012705 A KR1020217012705 A KR 1020217012705A KR 20217012705 A KR20217012705 A KR 20217012705A KR 20210071017 A KR20210071017 A KR 20210071017A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
aav
seq
glb1
gly
gangliosidosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
KR1020217012705A
Other languages
English (en)
Inventor
제임스 엠. 윌슨
크리스티안 힌더러
네이선 카츠
Original Assignee
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 filed Critical 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
Publication of KR20210071017A publication Critical patent/KR20210071017A/ko
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

AAVhu68 캡시드 및 리소좀 베타-갈락토시다제 유전자(예를 들어, 갈락토시다제 베타 1 유전자, GBL1)를 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)가 제공된다(즉, rAAVhu68.GBL1). 또한 예를 들어, 평균 수명 증가, 영양관 필요성 감소, 발작 발생 및 빈도 감소, 신경인지적 저하로의 진행 감소 및/또는 신경인지적 발달 개선을 포함한 GM1 강글리오시드증의 증상을 개선하기 위한 유효량의 rAAVhu68.GBL1을 함유하는 조성물이 제공된다.

Description

GM1 강글리오시드증 치료에 유용한 조성물
전자 양식으로 제출된 자료의 참조에 의한 결합
출원인은 전자 양식으로 함께 제출된 서열 목록 자료를 참조로 본원에 포함한다. 이 파일은 "18-8537PCT_SequenceListing_ST25.txt"라고 표시되며, 2019년 8월 29일 생성되고 크기는 144,703 바이트이다.
이후로 GM1이라고 언급되는 GM1 강글리오시드증은 GM1 강글리오시드 및 케라탄 술페이트의 분해 시 첫번째 단계를 촉매하는 효소인 리소좀산 베타 갈락토시다제(β-gal)를 암호화하는 GLB1 유전자에서 돌연변이에 의해 야기된 열성 리소좀 저장 질환이다(Brunetti-Pierri and Scaglia, 2008, GM1 gangliosidosis: Review of clinical, molecular, and therapeutic aspects, Molecular Genetics and Metabolism, 94: 391-96). GLB1 유전자는 염색체 3에 위치하며 2 개의 교대로 스프라이싱된 mRNA인 β-gal 리소좀 효소를 암호화하는 2.5 kb 전사체 및 엘라스틴 결합 단백질(EBP)을 암호화하는 2.0　kb 전사체로 이어진다(Oshima et al. 1988, Cloning, sequencing, and expression of cDNA for human β-galactosidase, Biochemical and Biophysical Research Communications, 157: 238-44; Morreau et al. 1989, Alternative splicing of beta-galactosidase mRNA generates the classic lysosomal enzyme and a beta-galactosidase-related protein, Journal of Biological Chemistry, 264: 20655-63). β-gal은 88 kDa 형태로 번역후 글리코실화되고 성숙 64 kDa 리소좀 효소로 처리되는 85　kDa 전구체로서 합성된다(D'Azzo et al. 1982, Molecular defect in combined beta-galactosidase and neuraminidase deficiency in man, Proceedings of the National Academy of Sciences, 79: 4535-39). 리소좀 내에서 효소는 보호 단백질 카텝신 A(PPCA) 및 뉴라미니다제 하이드롤라제와 복합체화된다.
잔류 β-gal을 거의 또는 전혀 생산하지 않는 GLB1 대립유전자를 보유하는 환자에서, GM1 강글리오시드는 뇌 전체에 걸쳐 뉴런에 축적되어, 빠르게 진행하는 신경퇴행성 질환을 초래한다(Brunetti-Pierri and Scaglia 2008). 질환 발병으로 이어지는 분자 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않지만, 가설은 심각한 뉴런 공포형성, 뉴런 세포자멸사(Tessitore et al. 2004, GM1-Ganglioside-Mediated Activation of the Unfolded Protein Response Causes Neuronal Death in a Neurodegenerative Gangliosidosis, Molecular Cell, 15: 753-66), 미엘린 결핍을 초래하는 비정상적인 축상형질 수송(van der Voorn et al. 2004, The leukoencephalopathy of infantile GM1 gangliosidosis: oligodendrocytic loss and axonal dysfunction, Acta Neuropathologica, 107: 539-45), 교란된 뉴런-핍지교 상호작용(Folkerth 1999, Abnormalities of Developing White Matter in Lysosomal Storage Diseases, Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 58: 887-902; Kaye et al. 1992, Dysmyelinogenesis in animal model of GM1 gangliosidosis', Pediatric Neurology, 8: 255-61), 및 염증 반응(Jeyakumar et al. 2003, Central nervous system inflammation is a hallmark of pathogenesis in mouse models of GM1 and GM2 gangliosidosis, Brain, 126: 974-87)의 영역에서 성상교세포증 및 미세아교세포증에 의해 동반된 뉴런 세포 사멸 및 탈미엘린화를 포함한다.
현재 GM1에 대한 질환-변형 요법은 없다. 영양관 배치, 호흡기 요법 및 항간질 약물을 포함한 지지적 치료 및 증상 치료가 현재 치료 접근법이다(Jarnes Utz et al. 2017, Infantile gangliosidoses: Mapping a timeline of clinical changes, Molecular Genetics and Metabolism, 121: 170-79). 글루코실세라마이드 신타제 억제제인 미글루스타트를 사용한 기질 감소 요법(SRT)은 GM1 및 GM2 환자에서 평가되었다. 미글루스타트가 일반적으로 잘 용인되지만, 증상 관리 또는 질환 진행에 현저한 개선을 초래하지 않았고 일부 환자는 용량 제한 위장관 부작용을 경험한다(Shapiro et al., 2009, Regier et al., 2016b). 케톤유발 식이와 조합하여 사용되는 경우, 미글루스타트는 잘 용인되고 일부 환자에서 생존을 증가시키는 것으로 나타났다(Jarnes Utz et al., 2017). 그러나, 미글루스타트를 사용한 무작위화 대조군 연구가 수행되지 않았고 미글루스타트가 GM1 강글리오시드증의 치료를 위해 승인되지 않았다는 점에 주의해야 한다. 이 질환에서 골수 또는 제대혈을 사용한 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)의 경험은 제한적이다. 2형 GM1 환자에서 수행된 골수 이식은 증상 발현 전 단계의 청소년 발병 GM1-강글리오시드증 환자에서 백혈구 β-갈락토시다제 수준의 정상화를 초래하였으며, 장기 임상 결과는 개선되지 않았다(Shield et al., 2005, Bone marrow correcting β-galactosidase activity does not influence neurological outcome in juvenile GM1-gangliosidosis. Journal of Inherited Metabolic Disease. 28(5):797-798.). HSCT를 달성하기까지시간이 느리기 때문에 빠르게 진행하는 1형 GM1 질환에 적합하지 않다(Peters and Steward, 2003, Hematopoietic cell transplantation for inherited metabolic diseases: an overview of outcomes and practice guidelines. Bone Marrow Transplantation. 31:229.).
파보바이러스 계열의 구성원인 아데노 연관 바이러스(AAV)는 약 4.7 킬로베이스(kb) 길이의 단일 가닥 선형 DNA(ssDNA) 게놈을 갖는 작은 비외피성 이십면체 바이러스이다. 야생형 게놈은 DNA 가닥의 양 끝에 있는 도립 말단 반복부(ITR), 및 2 개의 오픈 리딩 프레임(ORF): rep 및 cap를 포함한다. Rep는 AAV 수명 주기에 필요한 rep 단백질을 암호화하는 4 개의 중첩 유전자로 구성되고, cap는 캡시드 단백질의 중첩 뉴클레오티드 서열: VP1, VP2 및 VP3을 함유하며, 이는 자체 어셈블리되어 이십면체 대칭의 캡시드를 형성한다.
AAV는 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 할당되는데, 바이러스가 정제된 아데노바이러스 스톡에서 오염물로 발견되었기 때문이다. AAV의 수명 주기는 감염 후 AAV 게놈이 숙주 염색체에 부위 특이적으로 통합되는 잠재기 및 아데노바이러스 또는 단순 포진 바이러스 감염 후 통합된 게놈이 후속적으로 구출되고, 복제되고, 감염성 바이러스로 패키징되는 감염기를 포함한다. 비병원성, 비분열 세포를 포함한 광범위한 숙주 감염성, 및 잠재적인 부위 특이적 염색체 통합 특성은 AAV를 유전자 전달을 위한 매력적인 도구로 만든다.
바람직한 것은 비정상적인 GLB1 유전자와 연관된 병태의 치료를 위한 대안적인 치료제이다.
GM1 강글리오시드증과 연관된 증상의 치료 및/또는 감소를 필요로 하는 인간 환자에서 GM1 강글리오시드증과 연관된 증상을 치료하고/하거나 감소시키는 데 유용한 치료적, 재조합(r), 복제-결함, 아데노 연관 바이러스(AAV)가 제공된다. rAAV는 바람직하게는 복제-결함이고 본원에 사용된 바와 같이 rAAV.GLB1로 명명될 수 있는 표적화된 인간 세포에서 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 인간(h) β-갈락토시다제를 암호화하는 GLB1 유전자를 포함하는 벡터 게놈을 운반한다. 특정 구현예에서, rAAV는 AAVhu68 캡시드를 포함한다. 이는 rAAV가 본원에서 rAAVhu68.GLB1로 명명되지만, 특정 경우에 용어 rAAVhu68.GLB1 벡터, rAAVhu68.hGLB1, rAAVhu68.hGLB1 벡터, AAVhu68.GLB1, 또는 AAVhu68.GLB1 벡터가 동일한 작제물을 참조하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 AAVhu68 게놈 서열을 함유하지 않기 때문에, AAVhu68 캡시드에 대해 완전히 외인성이다. 특정 구현예에서, AAVhu68 캡시드 이외의 캡시드가 활용될 수 있다. 추가 구현예에서, AAV 캡시드는 벡터 게놈을 중추신경계(CNS, 예를 들어, 뉴런, 신경교 세포, 상피 세포 또는 CNS의 다른 세포)에 전달하는 데 적합하다. 추가적으로, rAAV의 생산(예를 들어, 생성 및/또는 정제)에 사용하기 위한 방법, 벡터(바이러스 또는 비바이러스 벡터, 예컨대 플라스미드), 및 세포가 제공된다.
특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 4의 아미노산 24 내지 677의 신호 펩티드 및 성숙 GLB1 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 암호화한다. 특정 구현예에서, 천연 인간 GLB1 신호 펩티드, 예를 들어 서열번호: 4의 아미노산 1 내지 23의 아미노산 서열이 사용된다.
특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7 또는 서열번호: 8로부터 선택된 핵산 서열, 또는 서열번호: 6, 서열번호: 7 또는 서열번호: 8과 적어도 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, GLB1 핵산 서열은 서열번호: 4의 아미노산 24 내지 677 또는 이의 기능적 단편을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, GLB1 핵산 서열은 서열번호: 4의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 암호화한다.
특정 구현예에서, 조절 서열은 인간 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터를 포함한다.
특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14 또는 서열번호: 15로부터 선택된 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 제형 완충액 및 rAAV.GLB1(예를 들어, rAAVhu68.GLB1)를 포함하는 수성 약제학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 제형 완충액은 완충 염수 및 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 또는 이의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 인공 뇌척수액; 및 계면활성제를 포함한다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 현탁액의 약 0.0005% 내지 약 0.001%를 포함한다. 추가 구현예에서, 백분율(%)은 중량(w) 비(즉, w/w)를 기준으로 계산된다. 특정 구현예에서, 조성물은 7.2 내지 7.8의 pH에 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 6.2 내지 7.7의 pH에 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 6.0 내지 7.5의 pH에 있다. 일 구현예에서, pH는 약 7이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV.GLB1(예를 들어, rAAVhu68.GLB1), 또는 이를 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 GM1 강글리오시드증이 있는 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 GM1 강글리오시드증이 있는 인간 환자에게 rAAV.GLB1을 전달하는 것을 수반한다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1 또는 조성물은 CT-유도된 후두하 주사를 통해 대수조(cisterna magna)로 투여된다. 특정 구현예에서, 방법은 rAAV.GLB1 또는 조성물을 단일 용량으로 인간 환자에게 전달하는 것을 수반한다.
특정 구현예에서, rAAV.GLB1(예컨대, rAAVhu68.GLB1) 또는 이를 포함하는 조성물은 대수조내 주사(ICM)를 통해 환자에게 투여가능하다. 특정 구현예에서, 생후 18 개월 이하의 유아 강글리오시드증 환자에게 투여가능한 rAAV.GLB1(예를 들어, rAAVhu68.GLB1) 또는 이를 포함하는 조성물이 제공된다. GM1 강글리오시드증의 증상, 예를 들어, GM1 신경학적 증상을 개선하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여가능한 rAAV.GLB1(예를 들어, rAAVhu68.GLB1) 또는 이를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, GM1 강글리오시드증의 개선은 평균 수명 증가, 영양관 필요성 감소, 발작 발생 및 빈도 감소, 신경인지적 저하로의 진행 감소 및/또는 신경인지적 발달 개선을 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 명백하다.
도 1a는 5' ITR, 인간 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터, 키메라 인트론, 인간 β-갈락토시다제(β-gal)를 암호화하는 GLB1 유전자, SV40 후기 polyA 신호, 및 3' ITR을 나타내는 AAV 벡터 게놈(즉, "AAVhu68.Ubc.hGLB1co.SV40")의 개략도를 제공한다.
도 1b는 시스 플라스미드에 의해 운반되는 AAV 벡터 게놈, pAAV.UbC.hGLB1co.SV40.KanR을 함유하는 시스-플라스미드의 개략도를 제공한다. GLB1, β-갈락토시다제; ITR, 도립 말단 반복부; KanR, 카나마이신 내성; Ori, 복제 기점; PolyA, 폴리아데닐화; 및 UbC, 유비퀴틴 C.
도 1c는 4 개의 단백질을 암호화하는 전장 AAV2 레플리카제(AAV2 Rep) 및 AAVhu68 VP1 캡시드 유전자(이는 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 암호화함)에 대한 코딩 서열을 포함하는 트랜스-플라스미드의 개략도를 제공한다. AAV2, 아데노 연관 바이러스 혈청형 2; AAVhu68, 아데노 연관 바이러스 혈청형 hu68; Cap, 캡시드; KanR, 카나마이신 내성; Ori, 복제 기점; 및 Rep, 레플리카제.
도 2a 및 2b는 상이한 프로모터를 사용하여 인간 β-gal을 발현하는 rAAVhu68.GLB1로 처리된 야생형 마우스의 뇌 및 뇌척수액(CSF)에서 각각 β-gal 활성을 도시한다. 야생형 마우스를 CB7, EF1a 또는 UbC 프로모터(그룹 당 n = 10)로부터 인간 GLB1을 발현하는 rAAVhu68.GLB1의 단일 ICV 주사로 처리하였다. 미처리된 야생형 마우스(n = 5)를 대조군으로 제공하였다. rAAVhu68.GLB1 투여 후 14 일에 뇌(전두 피질) 및 CSF를 수집하였고, 형광생성 기질을 사용하여 β-gal 활성을 측정하였다. *p < 0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 클러스컬-월리스(Kruskal-Wallis) 검정 이어서 듄(Dunn) 검정.
도 3a - 3e는 혈청 및 말초 기관 β-gal 활성을 도시한다. β-gal 활성울 형광생성 기질을 사용하여 혈청(도 3a) 뿐만 아니라 폐(도 3b), 간(도 3c), 심장(도 3d) 및 비장 샘플(도 3e)에서 각각 측정하였다. PBS: 포스페이트 완충 염수(비히클), AAV: 아데노 연관 바이러스(AAVhu68.UbC.hGLB1). *p < 0.05, **p<0.01 클러스컬-월리스 검정 이어서 듄 검정. NS: 유의하지 않음.
도 4a - 4b는 뇌 및 CSF에서 β-gal 활성을 도시한다. 뇌(전두 피질) 및 CSF를 부검 시 수집하였고 형광생성 기질을 사용하여 β-gal 활성을 측정하였다. PBS: 포스페이트 완충 염수(비히클), AAV: 아데노 연관 바이러스(AAVhu68.UbC.hGLB1). *p < 0.05, **p<0.01 클러스컬-월리스 검정 이어서 듄 검정. NS: 유의하지 않음.
도 5는 rAAVhu68.GLB1-처리된 GLB1-/- 마우스의 뇌에서 헥소사미니다제(HEX) 활성의 감소를 도시한다. 뇌(전두 피질)를 부검 시 수집하였고 형광생성 기질을 사용하여 HEX 활성을 측정하였다. PBS: 포스페이트 완충 염수(비히클), AAV: 아데노 연관 바이러스(AAVhu68.UbC.hGLB1). *p < 0.05, **p<0.01 클러스컬-월리스 검정 이어서 듄 검정. NS: 유의하지 않음.
도 6은 β-gal 활성 및 항-β-gal 항체 사이의 상관관계를 도시한다. β-gal 활성 및 혈청 항-β-gal 항체를 부검 시 AAV-처리된 마우스로부터 수집된 혈청 샘플에서 측정하였다. 각 점은 개별 동물을 나타낸다.
도 7a - 7g는 AAV-처리된 GLB1-/- 마우스에서 보행 이상의 교정을 도시한다. 도 7a 및 7b는 평균 5 개월령의 미처리된 GLB1-/- 마우스(n = 12) 및 GLB1+/- 대조군(n = 22)을 연속 2 일 동안 CatWalk 시스템을 사용하여 평가하였음을 도시한다. 평균 보행 속도(도 7a) 및 뒷발자국 길이(도 7b)를 적어도 3 회 시험에 걸쳐 각 동물에 대해 정량화하였다. **p < 0.01 만 휘트니(Mann Whitney) 검정. 도 7c 및 7d는 4 개월령 GLB1+/- (n = 15) 또는 비히클로 처리된 GLB1-/- (n = 15) 마우스 및 AAV-처리된 GLB1-/- 마우스(n = 14)를 CatWalk 시스템을 사용하여 평가하였음을 도시한다. 평균 보행 속도(도 7c) 및 뒷발자국 길이(도 7d)를 시험 둘째 날에 적어도 3 회 시험에 걸쳐 각 동물에 대해 정량화하였다. *p < 0.05, **p<0.01 클러스컬-월리스 검정 이어서 듄 검정. NS: 유의하지 않음. 도 7e-g는 AAV-처리된 GLB1-/- 마우스(도 7g) 및 비히클-처리된 GLB1+/- (도 7e) 및 GLB1-/- (도 7f) 대조군에 대한 대표적인 뒷발자국을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 보행 속도 및 보행 매개변수 사이의 상관관계를 도시한다. GLB1+/- 대조군(n = 22)을 연속 2 일 동안 CatWalk 시스템을 사용하여 평가하였다. 시험 둘째 날에 적어도 3 회 시험으로 측정된 보행 매개변수를 기록하였다. 상관관계 분석은 보행 속도 및 보행 매개변수 예컨대 보폭 사이의 강한 상관관계를 입증하였다(스피어만(Spearman) r = 0.7432, p < 0.001, 도 8a). 대조적으로, 뒷발자국 길이는 속도 독립적이었다(스피어만 r = -0.1239, p = 0.423, 도 8b).
도 9a - 9f는 ICV 주사에 의해 4 개 용량 중 하나의 rAAVhu68.UbC.GLB1(1.3　Х　1011　GC, 4.4 Х 1010 GC, 1.3 Х 1010 GC 또는 4.4　Х 109 GC) 또는 비히클을 받은 GLB1-/- 마우스의 β-gal 활성(도 9a), 체중(도 9b), 신경학적 검사 점수(신경 검사 점수, 도 9c), 뒷발자국 길이(도 9d), 및 뒷다리의 유각 시간(swing time)(도 9e) 및 보폭(도 9f)을 제공한다. 비히클(Het + 비히클이 투여된 GLB1+/- 마우스는 대조군으로 역할을 한다. 보다 상세한 내용은 실시예 4, 섹션 A에 제공되어 있다.
도 10a - 10b는 AAVhu68(서열번호: 2)의 vp1 캡시드 단백질(정렬 시 hu.68.vp1로 표시)과 AAV9(서열번호: 20), AAVhu31(정렬 시 hu.31로 표시, 서열번호: 21) 및 AAVhu32(정렬 시 hu.32로 표시, 서열번호: 22)의 아미노산 서열을 나타내는 정렬을 제공한다. AAV9, AAVhu31 및 AAVhu32와 비교하여, 2 개의 돌연변이(A67E 및 A157V)가 AAVhu68에서 중요한 것으로 밝혀졌으며 도면에서 원으로 표시되어 있다.
도 11a - 11e는 AAVhu68(서열번호: 1)의 vp1 캡시드 단백질과 AAV9(서열번호: 23), AAVhu31(서열번호: 24) 및 AAVhu32(서열번호: 25)를 암호화하는 핵산 서열의 정렬을 제공한다.
도 12a는 rAAVhu68.GLB1 약물 재료를 생산하기 위한 제조 공정의 예시적인 흐름도를 제공한다. AEX, 음이온 교환; CRL, Charles River Laboratories; ddPCR, 액적 디지털 폴리머라제 연쇄 반응; DMEM, 듈베코(Dulbecco)의 변형된 이글(Eagle) 배지; DNA, 데옥시리보핵산; FFB, 최종 제형 완충액; GC, 게놈 카피; HEK293, 인간 배아 신장 293 세포; ITFFB, 척수강내 최종 제형 완충액; PEI, 폴리에틸렌이민; Ph. Eur., 유럽 약전; SDS-PAGE, 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; TFF, 접선 유동 여과; USP, 미국 약전; WCB, 제조용 세포 은행.
도 12b는 rAAVhu68.GLB1 약물 생성물을 생산하기 위한 제조 공정의 예시적인 흐름도를 제공한다. Ad5, 아데노바이러스 혈청형 5; AUC, 분석용 초원심분리; BDS, 벌크 약물 물질; BSA, 소 혈청 알부민; CZ, Crystal Zenith; ddPCR, 액적 디지털 폴리머라제 연쇄 반응; E1A, 초기 영역 1A(유전자); ELISA, 효소 결합 면역흡착 분석; FDP, 최종 약물 생성물; GC, 게놈 카피; HEK293, 인간 배아 신장 293 세포; ITFFB, 척수강내 최종 제형 완충액; KanR, 카나마이신 내성(유전자); MS, 질량 분광법; NGS, 차세대 서열분석; Ph. Eur., 유럽 약전; qPCR, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응; SDS-PAGE, 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; TCID50 50% 조직 배양 감염 용량; UPLC, 초성능 액체 크로마토그래피; USP, 미국 약전.
GM1 강글리오시드증(GM1)을 치료하기 위한 아데노 연관 바이러스(AAV) 기반 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. AAVhu68 캡시드를 갖고 정상 인간 β-갈락토시다제(GLB1) 효소를 암호화하는 벡터 게놈(rAAVhu68.GLB1)을 전달하는 재조합 AAV(rAAV)의 유효량의 게놈 카피(GC)가 환자에게 전달된다. 바람직하게는, 이 rAAVhu68.GLB1은 수성 완충액으로 제형화된다. 특정 구현예에서, 현탁액은 척수강내 주사에 적합하다. 특정 구현예에서, rAAVhu68.GLB1은 AAVhu68.UbC.GLB1(또한 AAVhu68.UbC.hGLB1로도 명명됨)이며, 여기서 GLB1 유전자(즉, β-갈락토시다제(또한 본원에 사용된 바와 같은 GLB1 효소, β-gal, 또는 갈락토시다제로도 명명됨) 코딩 서열)는 인간 유비퀴틴 C(UbC)로부터 유래된 프로모터를 포함하는 조절 서열의 제어 하에 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 대수조내 주사(ICM)를 통해 전달된다.
본원에서 AAVhu68로 명명되는 클레이드 F 아데노 연관 바이러스의 캡시드를 암호화하는 핵산 서열은 AAVhu68 캡시드 및 벡터 게놈을 운반하는 재조합 AAV(rAAV)의 생산에 활용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터 게놈"은 바이러스 캡시드, 예를 들어, AAV 캡시드에 패키징되고, 숙주 세포 또는 환자의 세포에 전달될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 극단 5' 및 3' 단부에서 벡터 게놈을 AAV 캡시드에 패키징하는 데 필요한 도립 말단 반복부(ITR) 서열을 갖고 이들 사이에 발현을 지시하는 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 바와 같은 GLB1 유전자를 함유하는 발현 카세트이다. AAVhu68에 관한 추가의 상세한 내용은 WO 2018/160582에 제공되어 있으며, 그 전문이 본원 및 상세한 설명에 참조로 포함된다. 본원에 기재된 rAAVhu68.GLB1은 GLB1 유전자를 포함하는 벡터 게놈을 뇌, 해마, 운동 피질, 소뇌, 및 운동 뉴런을 포함하는 중추신경계(CNS) 내의 세포로 전달하는 데 매우 적합하다. 이들 rAAVhu68.GLB1은 CNS 내의 다른 세포 및 CNS 외부의 특정 다른 조직 및 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, AAVhu68 캡시드는 벡터 게놈을 CNS에 전달하는 데 또한 적합한 또 다른 캡시드, 예를 들어, AAVcy02, AAV8, AAVrh43, AAV9, AAVrh08, AAVrh10, AAVbb01, AAVhu37, AAVrh20, AAVrh39, AAV1, AAVhu48, AAVcy05, AAVhu11, AAVhu32, 또는 AAVpi02로 대체될 수 있다.
I. GM1 및 치료용 GLB1 유전자
GM1 강글리오시드증(즉, GM1)은 임상 표현형에 기초하여 다음과 같이 3 가지 유형으로 분류될 수 있다: (1) 출생부터 6 개월까지 발병, 생후 1-2 세까지 빠르게 진행하는 저긴장, 중증 중추신경계(CNS) 퇴행 및 사망을 동반하는 1형 또는 유아 형태; (2) 7 개월에서 3 세까지 발병, 뒤처진 운동 및 인지 발달, 및 느린 진행을 동반하는 2형 후기 유아 또는 청소년; 및 (3) 후기 발병(3-30 세), 미상 핵에서 글리코스핑고지질의 국소 침착으로 인한 진행성 추최외로 장애를 동반하는 3형 성인 또는 만성 변이(Brunetti-Pierri and Scaglia, 2008. GM1 gangliosidosis: Review of clinical, molecular, and therapeutic aspects, Molecular Genetics and Metabolism, 94: 391-96). 생후 6 개월 전에 증상이 발병한 유아 GM1 대상체는 운동 및 인지 장애 둘 다의 빠르고 예측가능한 진행을 균일하게 나타낸다. 대다수의 환자는 생후 몇 년 이내에 사망한다(중앙 생존기간 46 개월, Jarnes Utz et al., 2017). 공유된 근본적인 병리생리학에도 불구하고, 성인(3형) GM1 표현형은 가변적이고 질환 과정은 현저하게 경미하다. 대부분의 3형 GM1 환자는 소아 말기에 신경학적 증상이 처음으로 발생하며, 성인기에는 거의 후속 진행되지 않는다.
각 유형의 심각성은 GLB1 유전자에 의해 암호화된 돌연변이체 β-gal의 잔류 활성(Brunetti-Pierri and Scaglia, 2008)과 반비례로 관련된다. 130 개 초과의 질환-유발 GLB1 돌연변이가 인간에서 식별되었다(Hofer et al., 2010, Phenotype determining alleles in GM1 gangliosidosis patients bearing novel GLB1 mutations. Clinical Genetics. 78(3):236-246; 및 Caciotti et al., 2011, M1 gangliosidosis and Morquio B disease: An update on genetic alterations and clinical findings. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1812(7):782-790.). 다수의 GLB1 돌연변이가 유전적으로 및 생화학적으로 분석되고 임상 표현형과 상관관계가 있었던 반면(Gururaj et al., 2005, Magnetic Resonance Imaging Findings and Novel Mutations in GM1 Gangliosidosis. Journal of Child Neurology. 20(1):57-60; Caciotti et al., 2011; 및 Sperb et al., 2013, Genotypic and phenotypic characterization of Brazilian patients with GM1 gangliosidosis. Gene. 512(1):113-116), 많은 GLB1 돌연변이가 특성화되지 않은 채 남아있다. 대체로 환자의 유전자형은 다양한 양의 잔류 효소 활성을 초래하지만, 일반적으로 잔류 효소 활성이 높을수록 표현형은 덜 심각해진다(Ou et al., 2018, SAAMP 2.0: An algorithm to predict genotype-phenotype correlation of lysosomal storage diseases. Clinical Genetics. 93(5):1008-1014.). GM1의 진단은 β-gal 및 뉴라미니다제의 생화학적 분석 및/또는 GLB1 분자 분석에 의해 확인된다. 그러나, 잔류 효소 활성 그 자체가 GLB1 유전자에서 돌연변이에 의해 야기된 질환 하위유형을 예측할 수 없으므로, 이환된 개인의 임상 제시를 예측하는 데 있어서 유전자형-표현형 상관관계를 사용하는 데 제한이 있다(Hofer et al., 2010, Caciotti et al., 2011, Ou et al., 2018). 예측 값은 통상적으로 심각한 초기 발병 표현형을 제시하는 2 개의 심각한 돌연변이(즉, GLB1 효소 활성을 나타내지 않는 돌연변이)를 보유하는 개인에게 가장 적합하다(Caciotti et al., 2011, Sperb et al., 2013). 형제자매 일치에 대한 데이터는 드물기는 하지만 유아 GM1이 있는 형제자매에서 임상 과정이 발병 및 우세한 질환 징후에 대한 시간 측면에서 유사함을 나타낸다(Gururaj et al., 2005).
본원에 제공된 유전자 요법 벡터, 즉, rAAV.GLB1(예를 들어, rAAVhu68.GLB1, rAAVhu68.UbC.GLB1), 또는 이를 포함하는 조성물은 정상 수준의 기능적 베타-갈락토시다제의 결핍과 연관된 병태를 치료하는 데 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, 유전자 요법 벡터는 환자 치료에 사용하기에 적합한 본원에 기재된 바와 같은 rAAV를 지칭한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터 또는 조성물은 1형 GM1을 치료하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터 또는 조성물은 2형 GM1을 치료하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터 또는 조성물은 3형 GM1을 치료하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터 또는 조성물은 1형 및 2형 GM1을 치료하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터 또는 조성물은 생후 18 개월 이하인 GM1 환자를 치료하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터 또는 조성물은 3형을 제외한 GM1을 치료하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터 또는 조성물은 정상 수준의 기능적 β-갈락토시다제의 결핍와 연관된 신경학적 병태의 치료에 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터 또는 조성물은 GM1 강글리오시드증와 연관된 증상을 개선하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터 또는 조성물은 GM1 강글리오시드증과 연관된 신경학적 증상을 개선하는 데 유용하다.
특정 구현예에서, 환자는 유아 강글리오시드증이 있으며 생후 18 개월 이하이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1을 받는 환자는 생후 1 개월 내지 18 개월이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1을 받는 환자는 생후 4 개월 내지 18 개월이다. 특정 구현예에서, 유아는 생후 4 개월 미만이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1을 받는 환자는 생후 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 또는 약 18 개월이다. 특정 구현예에서, 환자는 영아, 예를 들어, 생후 18 개월 내지 3 세이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1을 받는 환자는 3 세 내지 6 세, 3 세 내지 12 세, 3 세 내지 18 세, 3 세 내지 30 세이다. 특정 구현예에서, 환자는 18 세 초과이다.
특정 구현예에서, 치료 후에 하기를 포함한 GM1 강글리오시드증과 연관된 증상의 개선이 관찰된다: 예를 들어, 수명(생존) 증가; 영양관 필요성 감소; 발작 발생, 빈도, 및 길이 감소, 발작 발병 지연; 예를 들어, PedsQL에 의해 측정된 바와 같은 삶의 질 개선; 신경인지적 저하로의 진행 감소 및/또는 신경인지적 발달 개선, 예를 들어, 베일리(Bayley) 영유아 발달 검사 척도, 제3판(BSID-III) 및 바인랜드(Vineland) 적응 행동 척도, 제2판(바인랜드-II)에 의해 측정된 바와 같은 발달 개선 또는 적응 행동, 인지, 언어(수용적 및 표현적 의사소통), 및 운동 기능(대근육 운동, 소근육 운동)의 개선; 운동 이정표에 대한 조기 달성 연령 및 후기 상실 연령; 뇌 조직 부피(대뇌 피질 및 다른 더 작은 구조) 및 심실 부피의 증가 지연, 뇌량, 미상 및 경막 뿐만 아니라 소뇌 피질을 포함한 뇌 하부구조의 크기 감소 지연, 및 뇌 위축 및 체적 변화의 안정화; 시상 및 기저핵에서 비정상적인 T1/T2 신호 강도의 진행 지연; CSF 및 혈청에서 β-gal 효소(GLB1) 활성 증가; CSF GM1 농도 감소; 혈청 및/또는 소변 케라탄 술페이트 수준의 감소, 헥소사미니다제 활성 감소; 뇌에서 염증 반응 감소; 비정상적인 간 및 비장 부피 지연; 비정상적인 EEG 및 시각 유발 전위(VEP) 지연; 및/또는 연하곤란, 보행 기능, 운동 기술, 언어 및/또는 호흡기 기능의 개선.
특정 구현예에서, 환자는 본원에 기재된 AAV 요법 없이 적격하지 않았을 rAAV.GLB1 주사 후 공동 요법을 받는다. 이러한 공동 요법은 효소 대체 요법, 기질 감소 요법(예를 들어, 미글루스타트(OGT 918, N-부틸-데옥시노지리마이신 사용), 탄가닐(tanganil)(아세틸-DL-류신) 치료, 호흡기 요법, 영양관 사용, 항간질 약물), 또는 골수 또는 제대혈을 사용한 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)을 포함할 수 있다.
임의적으로, 면역억제 공동 요법은 필요로 하는 대상체에서 사용될 수 있다. 이러한 공동 요법을 위한 면역억제제는 글루코코르티코이드, 스테로이드, 항대사물, T-세포 억제제, 마크롤라이드(macrolide)(예를 들어, 라파마이신 또는 라파로그), 및 알킬화제, 항대사물, 세포독성 항생제, 항체, 또는 이뮤노필린에 대한 활성 제제를 포함한 세포정지제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 면역 억제제는 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체-(CD25-) 또는 CD3-유도 항체, 항-IL-2 항체, 시클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α(종양 괴사 인자-알파) 결합제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역억제 요법은 rAAV.GLB1 투여 전 또는 후 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일, 또는 그 이상 일에 시작될 수 있다. 이러한 면역억제 요법은 1, 2 개, 또는 그 이상의 약물(예를 들어, 글루코코르티코이드, 프레드넬리손, 미코페놀레이트 모페틸(MMF) 및/또는 시롤리무스(즉, 라파마이신))의 투여를 수반할 수 있다. 이러한 면역억제 약물은 필요로 하는 환자/대상체에게 동일한 용량 또는 조정된 용량으로 1 회, 2 회 또는 그 이상 투여될 수 있다. 이러한 요법은 동일한 날에 2 개 이상의 약물(예를 들어, 프레드넬리손, 미코페놀레이트 모페틸(MMF) 및/또는시롤리무스(즉, 라파마이신))의 공투여를 수반할 수 있다. 이들 약물 중 하나 이상은 rAAV.GLB1 투여 후 동일한 용량 또는 조정된 용량으로 계속될 수 있다. 이러한 요법은 필요에 따라 약 1 주(7 일), 약 60 일, 또는 그 이상 동안 계속될 수 있다. 특정 구현예에서, 타크롤리무스가 없는 레지멘이 선택된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 rAAV.GLB1(예를 들어, rAAV.GLB1, rAAV.UbC.GLB1)의 "유효량"은 GM1 강글리오시드증과 연관된 증상의 개선을 달성하는 양이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 rAAV.GLB1의 "유효량"은 다음 평가변수 중 하나 이상을 달성하는 양이다: 뇌척수액(CSF)에서 GLB1 약력학 및 생물학적 활성 증가, 혈청에서 GLB1 약력학 및 생물학적 활성 증가, 환자의 평균 수명(생존) 증가, GM1 강글리오시드증의 질환 진행 지연(달성 연령, 상실 연령 및 연령 적절한 발달 및 운동 이정표를 유지하거나 또는 획득하는 환자의 백분율 중 하나 이상에 의해 평가됨), 및 베일리 영유아 발달 검사 척도(BSID, 예를 들어, BSID 제3판(BSID-III))의 등가 연령 인지, 대근육 운동, 소근육 운동, 수용적 및 표현적 의사소통 점수의 변화, 바인랜드 적응 행동 척도의 각 영역에 대한 표준 점수 변화 중 하나 이상에 기초한 신경인지적 발달 개선. 청소년 및 성인의 경우, 본원에 제공된 바와 같은 rAAV.GLB1의 "유효량"은 일부 구현예에서 연하곤란, 보행 기능, 운동 기술, 언어 및/또는 호흡기 기능을 개선하고, 바인랜드 적응 행동 척도, 제2판(바인랜드-II)의 각 영역에 대한 표준 점수를 변화시키고, 발작 빈도 및 발작 발병 연령을 감소시키고, 생후 24 개월에 영양관 독립 가능성 개선하는 양일 수 있다. 연령 적절한 발달 및 운동 이정표의 예는 세계보건기구(WHO)에 의해 제공된다. 예를 들어, Wijnhoven T.M., et al. (2004). Assessment of gross motor development in the WHO Multicentre Growth Reference Study. Food Nutr Bull. 25(1 Suppl):S37-45, 뿐만 아니라 하기 표 참조. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 rAAV.GLB1(예컨대, rAAVhu68, GLB1)의 "유효량"은 CSF 및 혈청 GLB1 활성, CSF GM1 농도, 및 혈청 및 소변 케라탄 술페이트에 대한 rAAV.GLB1의 약력학적 효과; 뇌 MRI 변화; 간 및 비장 부피 모니터링; EEG 및 시각 유발 전위(VEP)에 대한 모니터링을 달성하는 양이다.
Figure pct00001
본원에 기재된 rAAV.GLB1, 및 이를 포함하는 조성물은 인간 β-갈락토시다제(또한 정상 GLB1 효소로도 명명될 수 있음) 또는 이의 기능적 단편을 암호화하고 발현하는 GLB1 유전자(즉, β-gal 코딩 서열)를 함유한다. GLB1 효소는 β-갈락토시드를 모노사카라이드로 가수분해하는 것을 촉매한다. 인간 β-갈락토시다제의 아미노산 서열(2034 bp, 677 aa, Genbank #AAA51819.1, EC3.2.1.23)은 본원에서 서열번호: 4로 재현되며, 이는 또한 β-갈락토시다제, 이소형 1로 인식된다. 예를 들어, UniProtKB - P16278(BGAL_HUMAN) 참조. 특정 구현예에서, GLB1 효소는 서열번호: 4의 아미노산 24 내지 아미노산 677의 서열을 가질 수 있다(즉, 신호 펩티드가 없는 성숙 GLB1 효소). 특정 구현예에서, GLB1 효소는 서열번호: 4의 아미노산 31 내지 아미노산 677의 서열을 가질 수 있다(즉, β-갈락토시다제, 이소형 3). 특정 구현예에서, GLB1 효소는 서열번호: 26의 아미노산 서열을 갖는 이소형 2이다. 전장 β-갈락토시다제의 기능을 보유하는 임의의 단편은 본원에 기재된 바와 같은 GLB1 유전자에 의해 암호화될 수 있고, "기능적 단편"으로 지칭된다. 예를 들어, β-갈락토시다제의 기능적 단편은 전장 β-갈락토시다제의 적어도 약 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상의 활성을 가질 수 있다(즉, 서열번호: 4의 아미노산 24 내지 아미노산 677의 서열을 갖는 β-갈락토시다제일 수 있는 정상 GLB1 효소, 또는 3 개의 이소형 중 임의의 하나). β-갈락토시다제 활성을 평가하는 방법은 실시예 뿐만 아니라 간행물에서 찾을 수 있다. 예를 들어, Radoslaw Kwapiszewski, Determination of Acid β-Glactosidase Activity: Methodology and Perspectives. Indian J Clin Biochem. 2014 Jan; 29(1): 57-62 참조. 특정 구현예에서, 기능적 단편은 절두된 β-갈락토시다제이며, 전장 β-갈락토시다제의 N 말단 및/또는 C 말단에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 개 또는 그 이상의 아미노산이 결여되어 있다. 특정 구현예에서, 기능적 단편은 전장 β-갈락토시다제에 비해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 개 또는 그 이상의 보존적 아미노산 치환(들)을 함유한다. 본원에 사용된 바와 같이, 보존적 아미노산 치환은 주어진 아미노산을 유사한 생화학적 특성(예를 들어 전하, 소수성 및 크기)을 갖는 상이한 아미노산으로 변경하는 단백질에서의 아미노산 대체이다.
일 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 5의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 6의 서열을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 7의 서열을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 8의 서열을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 6과 적어도 95% 동일 내지 99.9% 동일한 서열을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 6과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 99.9% 동일한 서열을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 7과 적어도 95% 동일 내지 99.9% 동일한 서열을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 7과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 99.9% 동일한 서열을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 8과 적어도 95% 동일 내지 99.9% 동일한 서열을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 8과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 99.9% 동일한 서열을 갖도록 조작된다. 추가 구현예에서, 조작된 서열은 전장 β-갈락토시다제 또는 이의 기능적 단편을 암호화한다. 또한 추가 구현예에서, 조작된 서열은 서열번호: 4의 아미노산 24 내지 아미노산 677 또는 이의 기능적 단편을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 조작된 서열은 서열번호: 4의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 암호화한다.
특정 구현예에서, GLB1 유전자는 신호(리더) 펩티드 및 GLB1 성숙 단백질, 서열번호: 4의 아미노산 24 내지 677을 포함하는 GLB1 효소를 암호화한다. 리더 서열은 바람직하게는 인간 기원의 것 또는 인간 리더 서열의 유도체이며, 약 15 내지 약 28 개 아미노산, 바람직하게는 약 20 내지 25 개 아미노산, 또는 약 23 개 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 천연 신호 펩티드(서열번호: 4의 아미노산 1 내지 23)이다. 특정 구현예에서, GLB1 효소는 천연 리더 서열(서열번호:4의 아미노산 1-23) 대신에 외인성 리더 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 리더는 인간 IL2 또는 돌연변이된 리더로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 인간 세르핀F1 분비 신호는 리더 펩티드로 사용될 수 있다.
II. AAVhu68
AAVhu68(이전에 AAV3G2로 명명됨)은 서열번호: 2의 넘버링에 기초하여 vp1의 위치 67 및 157에서 2 개의 암호화된 아미노산에 의해 또 다른 클레이드 F 바이러스 AAV9와 다르다. 대조적으로, 다른 클레이드 F AAV(AAV9, hu31, hu31)는 위치 67에 Ala 및 위치 157에 Ala를 갖는다. 서열번호: 2의 넘버링에 기초하여 위치 157에 발린(Val 또는 V) 및 임의적으로, 서열번호: 2의 넘버링에 기초하여 위치 67에 글루탐산(Glu 또는 E)을 갖는 신규 AAVhu68 캡시드 및/또는 조작된 AAV 캡시드가 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "클레이드"는 AAV의 그룹과 관련하여 AAV vp1 아미노산 서열의 정렬에 기초하여 적어도 75%(적어도 1000 개의 복제물)의 부트스트랩 값 및 0.05 이하의 포아송(Poisson) 교정 거리 측정에 의해 이웃 결합(Neighbor-Joining) 알고리즘을 사용하여 결정 시 서로 계통발생적으로 관련된 AAV의 그룹을 지칭한다. 이웃 결합 알고리즘은 문헌에 기재되었다. 예를 들어, M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, New York (2000) 참조. 이 알고리즘을 구현하는 데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 예를 들어, MEGA v2.1 프로그램은 변형된 Nei-Gojobori 방법을 구현한다. 이러한 기술 및 컴퓨터 프로그램, 및 AAV vp1 캡시드 단백질의 서열을 사용하여, 당업자는 선택된 AAV가 본원에서 식별된 클레이드 중 하나, 또 다른 클레이드에 함유되거나, 또는 이들 클레이드 외부에 있는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun; 78(10): 6381-6388을 참조하며, 이는 클레이드 A, B, C, D, E 및 F를 식별하고, 신규 AAV, GenBank 수탁 번호 AY530553 내지 AY530629의 핵산 서열을 제공한다. 또한 WO 2005/033321 참조.
특정 구현예에서, AAVhu68 캡시드는 다음 중 하나 이상을 추가로 특징으로 한다. AAVhu68 캡시드 단백질은 다음을 포함한다: 서열번호: 2의 1 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생산된 AAVhu68 vp1 단백질, 서열번호: 1로부터 생산된 vp1 단백질, 또는 서열번호: 2의 1 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호: 1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp1 단백질; 서열번호: 2의 적어도 약 아미노산 138 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생산된 AAVhu68 vp2 단백질, 서열번호: 1의 적어도 뉴클레오티드 412 내지 2211을 포함하는 서열로부터 생성된 vp2 단백질, 또는 서열번호: 2의 적어도 약 아미노산 138 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호: 1의 적어도 뉴클레오티드 412 내지 2211과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp2 단백질; 및/또는 서열번호: 2의 적어도 약 아미노산 203 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생산된 AAVhu68 vp3 단백질, 서열번호: 1의 적어도 뉴클레오티드 607 내지 2211을 포함하는 서열로부터 생성된 vp3 단백질, 또는 서열번호: 2의 적어도 약 아미노산 203 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호: 1의 적어도 뉴클레오티드 607 내지 2211과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된vp3 단백질.
AAVhu68 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 전형적으로 전장 vp1 아미노산 서열(아미노산(aa) 1 내지 736)을 암호화하는 동일한 핵산 서열에 의해 암호화된 대체 스플라이스 변이체로 발현된다. 임의적으로 vp1-암호화 서열은 vp1, vp2 및 vp3 단백질을 발현하기 위해 단독으로 사용된다. 대안적으로, 이 서열은 vp1-고유 영역(약 aa 1 내지 약 aa 137) 및/또는 vp2-고유 영역(약 aa 1 내지 약 aa 202)이 없는 AAVhu68 vp3 아미노산 서열(약 aa 203 내지 736)을 암호화하는 핵산 서열, 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(예를 들어, 서열번호: 1의 약 뉴클레오티드(nt) 607에서 약 nt 2211까지 전사된 mRNA), 또는 서열번호: 2의 aa 203 내지 736을 암호화하는 서열번호: 1과 적어도 70% 내지 적어도 99%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열 중 하나 이상과 공발현될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, vp1-암호화 및/또는 vp2-암호화 서열은 vp1-고유 영역(약 aa 1 내지 약 137)이 없는 서열번호: 2의 AAVhu68 vp2 아미노산 서열(약 aa 138 내지 736)을 암호화하는 핵산 서열, 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(예를 들어, 서열번호: 1의 nt 412에서 2211까지 전사된 mRNA), 또는 서열번호: 2의 약 aa 138 내지 736을 암호화하는 서열번호: 1과 적어도 70% 내지 적어도 99%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열과 공발현될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, rAAVhu68은 서열번호: 2의 vp1 아미노산 서열을 암호화하는 AAVhu68 핵산 서열, 및 임의적으로 예를 들어, vp1 및/또는 vp2-고유 영역이 없는 vp3 단백질을 암호화하는 추가 핵산 서열로부터 캡시드를 발현하는 생산 시스템에서 생산된 rAAVhu68 캡시드를 갖는다. 단일 핵산 서열 vp1을 사용하여 생산된 rAAVhu68은 vp1 단백질, vp2 단백질 및 vp3 단백질의 이종 집단을 생산한다. 보다 특히, AAVhu68 캡시드는 서열번호: 2에서 예측된 아미노산 잔기로부터 변형된 vp1 단백질 내, vp2 단백질 내 및 vp3 단백질 내의 하위집단을 함유한다. 이들 하위집단은 최소한 탈아미드화된 아스파라긴(N 또는 Asn) 잔기를 포함한다. 예를 들어, 아스파라긴 - 글리신 쌍에서 아스파라긴은 고도로 탈아미드화된다.
일 구현예에서, AAVhu68 vp1 핵산 서열은 서열번호: 1의 서열, 또는 이에 상보적인 가닥, 예를 들어, 상응하는 mRNA 또는 tRNA를 갖는다. 특정 구현예에서, vp2 및/또는 vp3 단백질은 예를 들어, 선택된 발현 시스템에서 vp 단백질의 비를 변경하기 위해 vp1과 상이한 핵산 서열로부터 추가적으로 또는 대안적으로 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, vp1-고유 영역(약 aa 1 내지 약 aa 137) 및/또는 vp2-고유 영역(약 aa 1 내지 약 aa 202)이 없는 서열번호: 2의 AAVhu68 vp3 아미노산 서열(약 aa 203 내지 736)을 암호화하는 핵산 서열, 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(서열번호: 1의 약 nt 607 내지 약 nt 2211)가 또한 제공된다. 특정 구현예에서, vp1-고유 영역(약 aa 1 내지 약 137)이 없는 서열번호: 2의 AAVhu68 vp2 아미노산 서열(약 aa 138 내지 736)을 암호화하는 핵산 서열, 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(서열번호: 1의 nt 412 내지 2211)가 또한 제공된다.
그러나, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 암호화하는 다른 핵산 서열은 rAAVhu68 캡시드를 생산하는 데 사용하기 위해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호: 1의 핵산 서열 또는 서열번호: 2를 암호화하는 서열번호: 1과 적어도 70% 내지 99% 동일, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호: 1의 핵산 서열 또는 서열번호: 2의 vp2 캡시드 단백질(약 aa 138 내지 736)을 암호화하는 서열번호: 1의 약 nt 412 내지 약 nt 2211과 적어도 70% 내지 99%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호:1의 약 nt 607 내지 약 nt 2211의 핵산 서열 또는 서열번호: 2의 vp3 캡시드 단백질(약 aa 203 내지 736)을 암호화하는 서열번호: 1의 nt 607 내지 약 nt 2211과 적어도 70% 내지 99%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다.
DNA(게놈 또는 cDNA), 또는 RNA(예를 들어, mRNA)를 포함하여 이 AAVhu68 캡시드를 암호화하는 핵산 서열을 설계하는 것은 당업계의 기술 내에 있다. 특정 구현예에서, AAVhu68 vp1 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 1에 제공된다. 또한, 도 11a-11e 참조. 다른 구현예에서, 서열번호: 1과 70% 내지 99.9% 동일성의 핵산 서열은 AAVhu68 캡시드 단백질을 발현하기 위해 선택될 수 있다. 특정 다른 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호: 1과 적어도 약 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 동일하거나, 또는 적어도 99% 내지 99.9% 동일하다. 이러한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 설계될 수 있는 선택된 시스템(즉, 세포 유형)에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 이 최적화는 온라인(예를 들어, GeneArt), 공개된 방법, 또는 코돈 최적화 서비스를 제공하는 회사, 예를 들어, DNA2.0(캘리포니아주 멘로 파크 소재)을 통해 이용가능한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 한 가지 코돈 최적화 방법은 예를 들어, 미국 국제 특허 공개 번호 WO 2015/012924에 기재되어 있으며, 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2014/0032186호 및 미국 특허 공개 번호 제2006/0136184호 참조. 적절하게, 생성물에 대한 오픈 리딩 프레임(ORF)의 전체 길이가 변형된다. 그러나, 일부 구현예에서, ORF의 단편만이 변경될 수 있다. 이들 방법 중 하나를 사용함으로써, 임의의 주어진 폴리펩티드 서열에 빈도를 적용하고 폴리펩티드를 암호화하는 코돈-최적화 코딩 영역의 핵산 단편을 생산할 수 있다. 코돈에 대한 실제 변화를 수행하거나 또는 본원에 기재된 바와 같이 설계된 코돈-최적화 코딩 영역을 합성하기 위해 다수의 옵션이 이용가능하다. 이러한 변형 또는 합성은 당업자에게 잘 알려진 표준 및 일상적인 분자 생물학 조작을 사용하여 수행될 수 있다. 한 가지 접근법에서, 각각 80-90 개 뉴클레오티드 길이이고 원하는 서열 길이에 걸친 일련의 상보적 올리고뉴클레오티드 쌍이 표준 방법에 의해 합성된다. 이들 올리고뉴클레오티드 쌍은 어닐링 시, 부착 단부를 함유하는 80-90 개 염기 쌍의 이중 가닥 단편을 형성하도록 합성되며, 예를 들어, 쌍의 각 올리고뉴클레오티드는 쌍의 다른 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 넘어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 염기로 확장되도록 합성된다. 각 쌍의 올리고뉴클레오티드의 단일 가닥 단부는 또 다른 쌍의 올리고뉴클레오티드의 단일 가닥 단부와 어닐링하도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드 쌍은 어닐링하도록 허용된 다음, 이들 이중 가닥 단편 중 대략적으로 5 내지 6 개를 부착 단일 가닥 단부를 통해 함께 어닐링하도록 허용된 다음, 함께 결찰되어 표준 박테리아 클로닝 벡터, 예를 들어, 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen Corporation에서 입수가능한 TOPO® 벡터로 클로닝된다. 그 다음에 작제물은 표준 방법에 의해 서열분석된다. 함께 결찰된 80 내지 90 개 염기 쌍 단편 중 5 내지 6 개 단편, 즉, 약 500 개 염기 쌍의 단편으로 이루어진 여러 이들 작제물은 전체 원하는 서열이 일련의 플라스미드 작제물로 나타나도록 제조된다. 그 다음에 이러한 플라스미드의 삽입물은 적절한 제한 효소로 절단되고 함께 결찰하여 최종 작제물을 형성한다. 그 다음에 최종 작제물은 표준 박테리아 클로닝 벡터로 클로닝되고, 서열분석된다. 추가 방법은 당업자에게 즉시 명백할 것이다. 또한, 유전자 합성은 용이하게 상업적으로 이용가능하다.
특정 구현예에서, AAVhu68 캡시드는 서열번호: 1의 핵산 서열 또는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 서열을 사용하여 생산되며, 본원에 기재된 바와 같은 변형(예를 들어, 탈아미드화된 아미노산)이 있는 서열번호: 2의 vp1 아미노산 서열을 암호화한다. 특정 구현예에서, vp1 아미노산 서열은 서열번호: 2에서 재현된다.
본원에 사용된 바와 같이 vp 캡시드 단백질을 지칭하기 사용될 때, 용어 "이종" 또는 이의 임의의 문법적 변형은 동일하지 않은, 예를 들어, 상이한 변형된 아미노산 서열을 갖는 vp1, vp2 또는 vp3 단량체(단백질)를 갖는 요소로 이루어진 집단을 지칭한다. 서열번호: 2는 AAVhu68 vp1 단백질의 암호화된 아미노산 서열을 제공한다. vp1, vp2 및 vp3 단백질(대안적으로 이소형으로 명명됨)과 관련하여 사용될 때 용어 "이종"은 캡시드 내의 vp1, vp2 및 vp3 단백질의 아미노산 서열에서의 차이를 지칭한다. AAV 캡시드는 예측된 아미노산 잔기로부터 변형된 vp1 단백질 내, vp2 단백질 내 및 vp3 단백질 내의 하위집단을 함유한다. 이러한 하위집단은 최소한 특정 탈아미드화된 아스파라긴(N 또는 Asn) 잔기를 포함한다. 예를 들어, 특정 하위집단은 아스파라긴 - 글리신 쌍에서 적어도 1, 2, 3 또는 4 개의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴(N) 위치를 포함하고 임의적으로 다른 탈아미드화된 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 탈아미드화는 아미노산 변화 및 다른 임의적인 변형을 초래한다.
본원에 사용된 바와 같이, vp 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 적어도 하나의 정의된 특징을 공통으로 갖고 참조 그룹의 모든 구성원보다 적은 적어도 하나의 그룹 구성원으로 이루어진 vp 단백질의 그룹을 지칭한다. 예를 들어, vp1 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 어셈블리된 AAV 캡시드에서 적어도 하나의 vp1 단백질 및 모든 vp1 단백질보다 적다. vp3 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 어셈블리된 AAV 캡시드에서 모든 vp3 단백질보다 적은 하나의 vp3 단백질일 수 있다. 예를 들어, vp1 단백질은 vp 단백질의 하위집단일 수 있고; vp2 단백질은 vp 단백질의 별도의 하위집단일 수 있고, vp3은 어셈블리된 AAV 캡시드에서 vp 단백질의 또한 추가의 하위집단이다. 또 다른 예에서, vp1, vp2 및 vp3 단백질은 상이한 변형, 예를 들어, 아스파라긴 - 글리신 쌍에서 예를 들어 적어도 1, 2, 3 또는 4 개의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴을 갖는 하위집단을 함유할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 고도로 탈아미드화된은 참조 아미노산 위치에서 예측된 아미노산 서열과 비교 시, 참조된 아미노산 위치에서 적어도 45% 탈아미드화, 적어도 50% 탈아미드화, 적어도 60% 탈아미드화, 적어도 65% 탈아미드화, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 최대 약 100% 탈아미드화된 것을 지칭한다(예를 들어, 서열번호: 2(AAVhu68)의 넘버링에 기초하여 아미노산 57에서 아스파라긴의 적어도 80%는 총 vp1 단백질에 기초하여 탈아미드화될 수 있으며 총 vp1, vp2 및 vp3 단백질에 기초하여 탈아미드화될 수 있음). 이러한 백분율은 2D-겔, 질량 분광법 기술, 또는 다른 적합한 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
이론에 얽매이길 바라지 않고, AAV 캡시드의 vp 단백질에서 적어도 고도로 탈아미드화된 잔기의 탈아미드화는 사실상 주로 비효소적인 것으로 여겨지며, 선택된 아스파라긴을 탈아미드화하는 캡시드 단백질 내의 작용기, 및 더 적은 정도로, 글루타민 잔기에 의해 야기된다. 대다수의 탈아미드화 vp1 단백질의 효율적인 캡시드 어셈블리는 이러한 이벤트가 캡시드 어셈블리 후에 발생하거나 또는 개별 단량체(vp1, vp2 또는 vp3)의 탈아미드화가 구조적으로 잘 용인되고 대체로 어셈블리 동역학에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 일반적으로 세포 진입 전에 내부에 위치하는 것으로 고려되는 VP1-고유(VP1-u) 영역(~aa 1-137)에서의 포괄적인 탈아미드화는 VP 탈아미드화가 캡시드 어셈블리 전에 발생할 수 있음을 시사한다. N의 탈아미드화는 C-말단 잔기의 백본 질소 원자를 통해 발생하여 Asn의 측쇄 아미드 기 탄소 원자에 대한 친핵성 공격을 수행할 수 있다. 중간 고리 폐쇄된 숙신이미드 잔기가 형성되는 것으로 여겨진다. 그 다음에 숙신이미드 잔기는 빠른 가수분해를 수행하여 최종 산물 아스파르트산(Asp) 또는 이소 아스파르트산(IsoAsp)을 야기한다. 따라서, 특정 구현예에서, 아스파라긴(N 또는 Asn)의 탈아미드화는 Asp 또는 IsoAsp로 이어지며, 예를 들어, 하기 예시된 바와 같이 숙신이미드 중간체를 통해 상호전환될 수 있다.
Figure pct00002
본원에 제공된 바와 같이, VP1, VP2 또는 VP3에서 각각의 탈아미드화된 N은 독립적으로 아스파르트산(Asp), 이소아스파르트산(IsoAsp), 아스파르테이트, 및/또는 Asp 및 IsoAsp의 상호전환 블렌드, 또는 이의 조합일 수 있다. α- 및 이소아스파르트산의 임의의 적합한 비가 존재할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 비는 10:1 내지 1:10 아스파르트산 대 이소아소파르트산, 약 50:50 아스파르트산:이소아스파르트산, 또는 약 1:3 아스파르트산:이소아스파르트산, 또는 또 다른 선택된 비일 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 글루타민(Q)은 글루탐산(Glu), 즉, α-글루탐산, γ-글루탐산(Glu), 또는 α- 및 γ-글루탐산의 블렌드로 탈아미드화될 수 있으며, 공통 글루타리니미드 중간체를 통해 상호전환될 수 있다. α- 및 γ-글루탐산의 임의의 적합한 비가 존재할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 비는 10:1 내지 1:10 α 대 γ, 약 50:50 α:γ, 또는 약 1:3 α:γ, 또는 또 다른 선택된 비일 수 있다.
Figure pct00003
따라서, rAAV는 최소한 적어도 하나의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴을 포함하는 적어도 하나의 하위집단을 포함하여, 탈아미드화된 아미노산을 갖는 vp1, vp2 및/또는 vp3 단백질의 rAAV 캡시드 내에 하위집단을 포함한다. 또한, 다른 변형이 특히 선택된 아스파르트산(D 또는 Asp) 잔기 위치에 이성질체화를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 변형은 Asp 위치에 아미드화를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, AAV 캡시드는 적어도 4 개 내지 적어도 약 25 개의 탈아미드화된 아미노산 잔기 위치를 갖는 vp1, vp2 및 vp3의 하위집단을 함유하며, 이 중 적어도 1% 내지 10%가 vp 단백질의 암호화된 아미노산 서열과 비교하여 탈아미드화된다. 이들 중 대다수는 N 잔기일 수 있다. 그러나, Q 잔기가 또한 탈아미드화될 수 있다.
특정 구현예에서, rAAV는 실시예 1에 제공되고 본원에 참조로 포함된 표에 제시된 위치에 2, 3, 4 개 또는 그 이상의 탈아미드화된 잔기의 조합을 포함하는 하위집단이 있는 vp1, vp2 및 vp3 단백질을 갖는 AAV 캡시드를 갖는다. rAAV에서 탈아미드화는 2D 겔 전기영동, 및/또는 질량 분광법(MS), 및/또는 단백질 모델링 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 온라인 크로마토그래피는 Acclaim PepMap 칼럼 및 NanoFlex 소스(Thermo Fisher Scientific)가 있는 Q Exactive HF에 결합된 Thermo UltiMate 3000 RSLC 시스템(Thermo Fisher Scientific)으로 수행될 수 있다. MS 데이터는 Q Exactive HF에 대한 데이터 종속 상위 20 가지 방법을 사용하여 획득되며, 조사 스캔(200-2000 m/z)으로부터 가장 풍부한 아직 서열분석되지 않은 전구체 이온을 동적으로 선택한다. 서열분석은 예측 자동 이득 제어로 결정된 1e5 이온의 표적 값을 갖는 더 높은 에너지 충돌 해리 단편화를 통해 수행되고 전구체의 단리는 4 m/z의 창으로 수행하였다. 조사 스캔은 m/z 200에서 120,000의 해상도로 획득하였다. HCD 스펙트럼에 대한 해상도는 최대 이온 주입 시간 50 ms 및 정규화된 충돌 에너지 30으로 m/z200에서 30,000으로 설정될 수 있다. S-렌즈 RF 수준을 50으로 설정하여 소화로부터 펩티드에 의해 차지되는 m/z 영역의 최적 전송을 제공할 수 있다. 전구체 이온은 단편화 선택으로부터 단일, 미할당, 또는 6 이상의 전하 상태로 제외될 수 있다. 획득된 데이터의 분석을 위해 BioPharma Finder 1.0 소프트웨어(Thermo Fischer Scientific)가 사용될 수 있다. 펩티드 맵핑의 경우, 검색을 고정된 변형으로 설정된 카바미도메틸화; 및 가변적 변형, 10-ppm 질량 정확성, 높은 프로테아제 특이성, 및 MS/MS 스펙트럼에 대한 0.8의 신뢰 수준으로 설정된 산화, 탈아미드화, 및 인산화와 함께 단일 진입 단백질 FASTA 데이터베이스를 사용하여 수행하였다. 적합한 프로테아제의 예는 예를 들어, 트립신 또는 키모트립신을 포함할 수 있다. 탈아미드화된 펩티드의 질량 분광계 식별은 탈아미드화가 온전한 분자 +0.984 Da(-OH 및 -NH2 기 사이의 질량 차이)의 질량에 추가되기 때문에 비교적 간단하다. 특정 펩티드의 탈아미드화 퍼센트는 탈아미드화된 펩티드의 질량 영역을 탈아미드화 및 천연 펩티드 영역의 합계로 나누어 결정된다. 가능한 탈아미드화 부위의 수를 고려하여, 상이한 부위에서 탈아미드화된 동중 종은 단일 피크에서 공동 이동할 수 있다. 결과적으로, 다중 잠재적인 탈아미드화 부위를 갖는 펩티드로부터 유래하는 단편 이온을 사용하여 탈아미드화의 다중 부위를 찾아내거나 또는 구별할 수 있다. 이 경우에, 관찰된 동위원소 패턴 내에서 상대적 강도를 사용하여 상이한 탈아미드화된 펩티드 이성질체의 상대적 풍부도를 구체적으로 결정할 수 있다. 이 방법은 모든 이성질체 종에 대한 단편화 효율이 동일하고 탈아미드화의 부위에 독립적임을 가정한다. 이러한 예시적 방법에 대한 다수의 변형이 사용될 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 예를 들어, 적합한 질량 분광기는 예를 들어, 4중극자 비행 시간 질량 분광기(QTOF), 예컨대 Waters Xevo 또는 Agilent 6530 또는 궤도 기기, 예컨대 Orbitrap Fusion 또는 Orbitrap Velos(Thermo Fisher)를 포함할 수 있다. 적합한 액체 크로마토그래피 시스템은 예를 들어, Waters 또는 Agilent systems로부터의 Acquity UPLC 시스템(1100 또는 1200 시리즈)를 포함한다. 적합한 데이터 분석 소프트웨어는 예를 들어, MassLynx(Waters), Pinpoint and Pepfinder(Thermo Fischer Scientific), Mascot(Matrix Science), Peaks DB(Bioinformatics Solutions)를 포함할 수 있다. 또 다른 기술은 예를 들어, 2017년 6월 16일 온라인 공개된 X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267에 기재될 수 있다.
탈아미드화 이외에, 하나의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 전환되지 않는 다른 변형이 발생할 수 있다. 이러한 변형은 아세틸화된 잔기, 이성질체화, 인산화, 또는 산화를 포함할 수 있다.
탈아미드화의 조절: 특정 구현예에서, AAV는 탈아미드화를 감소시키기 위해 아스파라긴-글리신 쌍의 글리신을 변경하도록 변형된다. 다른 구현예에서, 아스파라긴은 상이한 아미노산, 예를 들어, 더 느린 속도로 탈아미드화되는 글루타민; 또는 아미드 기가 결여된 아미노산(예를 들어, 글루타민 및 아스파라긴은 아미드 기를 함유함); 및/또는 아민 기가 결여된 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘은 아민 기를 함유함)으로 변경된다. 본원에 사용된 바와 같이, 아미드 또는 아민 측기가 결여된 아미노산은 예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 시스틴, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판, 및/또는 프롤린을 지칭한다. 기재된 바와 같은 변형은 암호화된 AAV 아미노산 서열에서 발견된 아스파라긴-글리신 쌍 중 1, 2, 또는 3 개에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 변형은 4 개의 아스파라긴 - 글리신 쌍 모두에서 이루어지지 않는다. 따라서, 더 낮은 탈아미드화 속도를 갖는 AAV 및/또는 조작된 AAV 변이체의 탈아미드화를 감소시키는 방법. 추가적으로, 또는 대안적인 하나 이상의 다른 아미드 아미노산이 AAV의 탈아미드화를 감소시키기 위해 비아미드 아미노산으로 변경될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이체 AAV 캡시드는 아르기닌 - 글리신 쌍에 돌연변이를 함유하여, 글리신이 알라닌 또는 세린으로 변경되도록 한다. 돌연변이체 AAV 캡시드는 1, 2 또는 3 개의 돌연변이체를 함유할 수 있으며 여기서 참조 AAV는 자연적으로 4 개의 NG 쌍을 함유한다. 특정 구현예에서, AAV 캡시드는 1, 2, 3 또는 4 개의 이러한 돌연변이체를 함유할 수 있으며 여기서 참조 AAV는 자연적으로 5 개의 NG 쌍을 함유한다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 AAV 캡시드는 NG 쌍에 단일 돌연변이만을 함유한다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 AAV 캡시드는 2 개의 상이한 NG 쌍에 돌연변이를 함유한다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 AAV 캡시드는 AAV 캡시드에서 구조적으로 별개의 위치에 위치한 2 개의 상이한 NG 쌍인 돌연변이를 함유한다. 특정 구현예에서, 돌연변이는 VP1-고유 영역에 있지 않다. 특정 구현예에서, 돌연변이 중 하나는 VP1-고유 영역에 있다. 임의적으로, 돌연변이체 AAV 캡시드는 NG 쌍에 변형을 함유하지 않지만, 하나 이상의 아스파라긴, 또는 NG 쌍의 외부에 위치한 글루타민에서 탈아미드화를 최소화 또는 제거하기 위한 돌연변이를 함유한다.
특정 구현예에서, 야생형 AAV 캡시드에서 하나 이상의 NG를 제거하는 AAV 캡시드를 조작하는 것을 포함하는 rAAV의 효능을 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, "NG"의 "G"에 대한 코딩 서열은 또 다른 아미노산을 암호화하도록 조작된다. 하기의 특정 예에서, "S" 또는 "A"가 치환된다. 그러나, 다른 적합한 아미노산 코딩 서열이 선택될 수 있다. 본원에 참조로 포함된 실시예 1의 표 참조.
AAVhu68 캡시드 단백질에서, 4 개의 잔기(N57, N329, N452, N512)는 일상적으로 다양한 로트에 걸쳐 >70% 및 대부분의 경우에 >90%의 탈아미드화 수준을 나타낸다. 추가의 아스파라긴 잔기(N94, N253, N270, N304, N409, N477, 및 Q599)는 또한 다양한 로트에 걸쳐 최대 ~20%의 탈아미드화 수준을 나타낸다. 탈아미드화 수준은 처음에 트립신 소화를 사용하여 식별되고 키모트립신 소화로 확인되었다.
AAVhu68 캡시드는 서열번호: 2의 예측된 아미노산 잔기로부터 변형을 갖는 vp1 단백질 내, vp2 단백질 내 및 vp3 단백질 내의 하위집단을 함유한다. 이들 하위집단은 최소한 특정 탈아미드화된 아스파라긴(N 또는 Asn) 잔기를 포함한다. 예를 들어, 특정 하위집단은 서열번호: 2의 아스파라긴 - 글리신 쌍에서 적어도 1, 2, 3 또는 4 개의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴(N) 위치를 포함하고 임의적으로 다른 탈아미드화된 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 탈아미드화는 아미노산 변화 및 다른 임의적인 변형을 초래한다. 서열번호: 3은 변형된 AAVhu68 캡시드의 아미노산 서열을 제공하며, 탈아미드화 또는 달리 변형된 아미노산의 일부 백분율을 가질 수 있는 위치를 예시한다. 이들 및 다른 변형의 다양한 조합이 본원에 기재되어 있다.
다른 구현예에서, 방법은 rAAV의 수율을 증가시키고, 따라서 세포 용해 전에, 또는 세포를 용해할 필요 없이 상청액에 존재하는 rAAV의 양을 증가시키는 것을 수반한다. 이 방법은 AAVhu68 vp1 캡시드 단백질의 아미노산 넘버링을 갖는 정렬에 기초하여 위치 67에 Glu, 위치 157에 Val, 또는 둘 다를 갖는 캡시드 단백질을 발현하도록 AAV VP1캡시드 유전자를 조작하는 것을 수반한다. 다른 구현예에서, 방법은 위치 157에 Val을 갖는 캡시드 단백질을 발현하도록 VP2 캡시드 유전자를 조작하는 것을 수반한다. 또 다른 구현예에서, rAAV는 vp1 및 vp2 캡시드 단백질 위치 67에 Glu 및 위치 157에 Val을 모두 포함하는 변형된 캡시드를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "AAV9 캡시드"는 다중 AAV9 vp 단백질로 구성된 자기-어셈블리된 AAV 캡시드이다. AAV9 vp 단백질은 전형적으로 서열번호: 23의 핵산 서열 또는 이에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%인 서열에 의해 암호화된 대체 스플라이스 변이체로 발현되며, GenBank 수탁: AAS99264의 vp1 아미노산 서열을 암호화한다. 특정 구현예에서, "AAV9 캡시드"는 AAS99264와 99% 동일하거나 또는 서열번호: 20과 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 AAV를 포함한다. 또한 US7906111 및 WO 2005/033321 참조. 본원에 사용된 바와 같은 "AAV9 변이체"는 예를 들어, WO2016/049230, US 8,927,514, US 2015/0344911, 및 US 8,734,809에 기재된 것들을 포함한다.
캡시드를 생성하는 방법, 이에 따른 코딩 서열, 및 rAAV의 생산 방법이 기재되었다. 예를 들어, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(10), 6081-6086(2003) 및 US 2013/0045186A1 참조.
핵산, 또는 이의 단편을 언급할 때 용어 "실질적인 상동성" 또는 "실질적인 유사성"은 또 다른 핵산(또는 이의 상보적 가닥)과 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬될 때, 정렬된 서열의 적어도 약 95 내지 99%에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있음을 나타낸다. 바람직하게는, 상동성은 전장 서열, 또는 이의 오픈 리딩 프레임, 또는 적어도 15 개 뉴클레오티드 길이인 또 다른 적합한 단편에 걸쳐 있다. 적합한 단편의 예가 본원에 기재되어 있다.
핵산 서열의 맥락에서 용어 "서열 동일성" "서열 동일성 퍼센트" 또는 "동일성 퍼센트"는 최대 상응으로 정렬될 때 동일한 2 개의 서열에서의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 게놈의 전장, 유전자 코딩 서열의 전장에 걸쳐 있을 수 있거나, 또는 적어도 약 500 내지 5000 개 뉴클레오티드의 단편이 바람직하다. 그러나, 더 작은 단편 사이의 동일성, 예를 들어 적어도 약 9 개 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 약 20 내지 24 개 뉴클레오티드, 적어도 약 28 내지 32 개 뉴클레오티드, 적어도 약 36 개 이상의 뉴클레오티드의 동일성이 또한 바람직할 수 있다. 유사하게, "서열 동일성 퍼센트"는 단백질의 전장, 또는 이의 단편에 걸쳐 아미노산 서열에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 적합하게, 단편은 적어도 약 8 개 아미노산 길이이며 최대 약 700 개 아미노산일 수 있다. 적합한 단편의 예가 본원에 기재되어 있다.
아미노산 또는 이의 단편을 언급할 때, 용어 "실질적인 상동성" 또는 "실질적인 유사성"은 또 다른 아미노산(또는 이의 상보적 가닥)과 적절한 아미노산 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬될 때, 정렬된 서열의 적어도 약 95 내지 99%에서 아미노산 서열 동일성이 있음을 나타낸다. 바람직하게는, 상동성은 전장 서열, 또는 이의 단백질, 예를 들어, cap 단백질, rep 단백질, 또는 적어도 8 개 아미노산, 보다 바람직하게는, 적어도 15 개 아미노산 길이인 이의 단편에 걸쳐 있다. 적합한 단편의 예가 본원에 기재되어 있다.
용어 "고도로 보존된"이란 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는, 97% 초과의 동일성을 의미한다. 동일성은 당업자에게 알려진 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램으로 재분류하여 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
일반적으로, 2 개의 상이한 아데노 연관 바이러스 사이의 "동일성", "상동성", 또는 "유사성"을 언급할 때, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열을 참조하여 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은 참조 서열과 비교하여 누락 또는 추가 염기 또는 아미노산에 대한 교정을 종종 함유하는 다중 핵산 서열 또는 단백질(아미노산) 서열을 지칭한다. 예에서, AAV 정렬은 공개된 AAV9 서열을 참조점으로 사용하여 수행된다. 정렬은 공개적으로 또는 상업적으로 이용가능한 다양한 다중 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 수행된다. 이러한 프로그램의 예는 "Clustal Omega", "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "MAP", 및 "MEME"를 포함하며, 인터넷 상의 웹 서버를 통해 접근가능하다. 이러한 프로그램에 대한 다른 소스는 당업자에게 알려져 있다. 대안적으로, 벡터 NTI 유틸리티가 또한 사용된다. 또한 상기 기재된 프로그램에 함유된 것들을 포함하여 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 당업계에 알려진 다수의 알고리즘이 있다. 또 다른 예로서, GCG 버전 6.1의 프로그램인 Fasta™을 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 비교할 수 있다. Fasta™은 질의 및 검색 서열 사이에 가장 중첩된 영역의 정렬 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 사이의 서열 동일성 퍼센트는 본원에 참조로 포함된 GCG 버전 6.1에 제공된 바와 같이 디폴트 매개변수(단어 크기 6 및 점수 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)와 함께 Fasta™을 사용하여 결정될 수 있다. 아미노산 서열에 대해 다중 서열 정렬 프로그램, 예를 들어, "Clustal Omega", "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", 및 "Match-Box" 프로그램이 또한 이용가능하다. 일반적으로, 이들 프로그램 중 임의의 것이 디폴트 설정으로 사용되지만, 당업자는 필요에 따라 이들 설정을 변경시킬 수 있다. 대안적으로, 당업자는 참조된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공된 것과 같은 적어도 동일성 또는 정렬 수준을 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 활용할 수 있다. 예를 들어, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690(1999) 참조.
III. rAAV
재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)는 유전자 전달에 적합한 비히클로서 기재되었다. 전형적으로, rAAV에 의한 전달을 위한 이식유전자(예를 들어, GLB1 유전자)를 포함하는 외인성 발현 카세트는 천연 AAV 공급원으로부터 기능적 rep 유전자 및 cap 유전자를 대체하여, 복제 무능 벡터를 초래한다. 이러한 rep 및 cap 기능은 벡터 생산 시스템 동안 트랜스로 제공되지만 최종 rAAV에는 부재한다.
상기 나타낸 바와 같이, 최소한 벡터 게놈을 캡시드로 패키징하는 데 필요한 AAV 도립 말단 반복부(ITR), GLB1 유전자 및 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 벡터 게놈 및 AAV 캡시드를 갖는 rAAV가 제공된다. 특정 구현예에서, AAV 캡시드는 AAVhu68로부터 유래한다. 본원의 예는 단일 가닥 AAV 벡터 게놈을 활용하지만, 특정 구현예에서, 자기 상보성(sc) AAV 벡터 게놈을 함유하는 rAAV가 본 발명에서 활용될 수 있다.
필요한 조절 제어 요소는 rAAV를 차지하는 세포에서 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 유전자(예를 들어, GLB1)에 작동가능하게 연결된다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 트랜스에서 또는 관심 유전자를 제어하기 위한 거리에서 작용하는 발현 제어 서열을 모두 포함한다. 이러한 조절 서열은 전형적으로 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, polyA, 자기 절단 링커(예를 들어, 푸린, 푸린-F2A, IRES) 중 하나 이상을 포함한다. 하기 예는 GLB1 유전자의 발현을 위해 CB7 프로모터(예를 들어, 서열번호:10), EF1a 프로모터(예를 들어, 서열번호: 11), 또는 인간 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터(예를 들어, 서열번호: 9)를 활용한다. 그러나, 특정 구현예에서, 다른 프로모터, 또는 추가 프로모터가 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, GLB1 유전자 이외에, 또 다른 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 비-AAV 서열이 포함될 수 있다. 이러한 유전자 산물은 예를 들어 관심있는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 기능적 RNA 분자(예를 들어, miRNA, miRNA 억제제) 또는 다른 유전자 산물일 수 있다. 유용한 유전자 산물은 miRNA를 포함할 수 있다. miRNA 및 다른 작은 간섭 핵산은 표적 RNA 전사체 절단/분해 또는 표적 메신저 RNA(mRNA)의 번역 억제를 통해 유전자 발현을 조절한다. miRNA는 전형적으로 최종 19-25 개의 비-번역된 RNA 산물로 자연적으로 발현된다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역된 영역(UTR)과 서열-특이적 상호작용을 통해 활성을 나타낸다. 이러한 내인성으로 발현된 miRNA는 헤어핀 전구체를 형성하여 후속적으로 miRNA 듀플렉스, 및 추가로 "성숙" 단일 가닥 miRNA 분자로 처리된다. 이 성숙 miRNA는 성숙 miRNA에 대한 상보성에 기초하여 예를 들어 3'UTR 영역에서 표적 mRNA의 표적 부위를 식별하는 다중단백질 복합체인 miRISC를 유도한다.
AAV 벡터 게놈은 전형적으로 시스-작용 5' 및 3' 도립 말단 반복부(ITR) 서열을 포함한다(예를 들어, B. J. Carter, in "Handbook of Parvovirusees", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990) 참조). ITR 서열은 약 145 개 염기 쌍(bp) 길이이다. 바람직하게는, 실질적으로 ITR을 암호화하는 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 어느 정도의 사소한 변형이 허용가능하다. 이들 ITR 서열을 변형하는 능력은 당업계의 기술 내에 있다. (예를 들어, Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); 및 K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 532 (1996)과 같은 텍스트 참조). 본 발명에 이용되는 이러한 분자의 예는 이식유전자를 함유하는 "시스-작용" 플라스미드이며, 여기서 선택된 이식유전자 서열 및 연관된 조절 요소는 5' 및 3' AAV ITR 서열이 측면에 있다. 일 구현예에서, ITR은 캡시드를 공급하는 것과 상이한 AAV로부터 유래한다. 일 구현예에서, ITR 서열은 AAV2로부터 유래한다. ΔITR로 명명되는 5' ITR의 단축된 버전이 기재되었으며 여기서 D-서열 및 말단 분해 부위(trs)는 삭제된다. 다른 구현예에서, 전장 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다. 그러나, 다른 AAV 공급원으로부터의 ITR이 선택될 수 있다. ITR의 공급원이 AAV2로부터 유래하고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 공급원으로부터 유래하는 경우, 생성된 rAAV는 위형(pseudodtype)으로 명명될 수 있다. 그러나, 이들 요소의 다른 구성이 적합할 수 있다.
특정 구현예에서, 추가적 또는 대안적인 프로모터 서열은 예를 들어, 선택된 5' ITR 서열 및 코딩 서열 사이에 위치한 발현 제어 서열(조절 서열)의 일부로 포함될 수 있다. 구성적 프로모터, 조절가능한 프로모터(예를 들어, WO 2011/126808 및 WO 2013/04943 참조), 조직 특이적 프로모터(예를 들어, 뉴런 특이적 프로모터 또는 신경교 세포 특이적 프로모터, 또는 CNS 특이적 프로모터), 또는 생리학적 단서에 반응성인 프로모터가 본원에 기재된 rAAV에 활용될 수 있다. 프로모터(들)는 상이한 공급원, 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 급초기 인핸서/프로모터, SV40 초기 인핸서/프로모터, JC 폴리모바이러스 프로모터, 미엘린 염기성 단백질(MBP) 또는 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 단순 포진 바이러스(HSV-1) 잠재 연관 프로모터(LAP), 라우스 육종 바이러스(RSV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 뉴런 특이적 프로모터(NSE), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 프로모터, hSYN, 멜라닌 응집 호르몬(MCH) 프로모터, CBA, 기질 금속단백질 프로모터(MPP), 및 닭 베타-액틴 프로모터로부터 선택될 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 CB7 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터 이외에, 벡터 게놈은 하나 이상의 다른 적절한 전사 개시 서열, 전사 종결 서열, 인핸서 서열, 효율적인 RNA 처리 신호 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호; 세포질 mRNA 예를 들어 WPRE를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 바람직한 경우, 암호화된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 함유할 수 있다. 적합한 인핸서의 예는 CMV 인핸서이다. 다른 적합한 인핸서는 원하는 표적 조직 표시에 적합한 것들을 포함한다. 일 구현예에서, 조절 서열은 하나 이상의 발현 인핸서를 포함한다. 일 구현예에서, 조절 서열은 2 개 이상의 발현 인핸서를 함유한다. 이들 인핸서는 동일할 수 있거나 또는 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 인핸서는 CMV 급초기 인핸서를 포함할 수 있다. 이 인핸서는 서로 인접하게 위치한 2 개의 카피에 존재할 수 있다. 대안적으로, 인핸서의 이중 카피는 하나 이상의 서열에 의해 분리될 수 있다. 또한 또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 인트론, 예를 들어, 닭 베타-액틴 인트론을 추가로 함유한다. 특정 구현예에서, 인트론은 인간 베타-글로빈 스플라이스 공여자 및 면역글로불린 G(IgG) 스플라이스 수용자 요소로 이루어진 하이브리드 인트론인 키메라 인트론(CI)이다. 다른 적합한 인트론은 예를 들어 WO 2011/126808에 기재된 바와 같이 당업계에 알려진 것들을 포함한다. 적합한 polyA 서열의 예는 예를 들어, SV40, SV50, 소 성장 호르몬(bGH), 인간 성장 호르몬, 및 합성 polyA를 포함한다. 임의적으로, 하나 이상의 서열은 mRNA를 안정화시키기 위해 선택될 수 있다. 이러한 서열의 예는 변형된 WPRE 서열이며, polyA 서열의 상류 및 코딩 서열의 하류에 조작될 수 있다(예를 들어, MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619 참조). 특정 구현예에서, WPRE 서열은 존재하지 않는다.
특정 구현예에서, 5' AAV ITR - 프로모터 - 임의적인 인핸서 - 임의적인 인트론 - GLB1 유전자 - polyA - 3' ITR을 포함하는 벡터 게놈이 구축된다. 특정 구현예에서, ITR은 AAV2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 하나 초과의 프로모터가 존재한다. 특정 구현예에서, 인핸서는 벡터 게놈에 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 초과의 인핸서가 존재한다. 특정 구현예에서, 인트론은 벡터 게놈에 존재한다. 특정 구현예에서, 인핸서 및 인트론이 존재한다. 특정 구현예에서, 인트론은 인간 베타-글로빈 스플라이스 공여자 및 면역글로불린 G(IgG) 스플라이스 수용자 요소로 이루어진 하이브리드 인트론인 키메라 인트론(CI)이다. 특정 구현예에서, polyA는 SV40 폴리 A(즉, 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 유전자로부터 유래된 폴리아데닐화(PolyA) 신호)이다. 특정 구현예에서, polyA는 토끼 베타-글로빈(RBG) poly A이다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 5' AAV ITR - CB7 프로모터 - GLB1 유전자 - RBG poly A - 3' ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 5' AAV ITR - EF1a 프로모터 - GLB1 유전자 - SV40 poly A - 3' ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 5' AAV ITR - UbC 프로모터 - GLB1 유전자 - SV40 poly A - 3' ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 5를 갖는다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 6을 갖는다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 7을 갖는다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 8을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 12의 서열 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 또는 99%, 내지 약 99.9% 동일한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 13의 서열 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 또는 99%, 내지 약 99.9% 동일한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 14의 서열 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 또는 99%, 내지 약 99.9% 동일한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 15의 서열 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 또는 99%, 내지 약 99.9% 동일한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 16의 서열 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 또는 99%, 내지 약 99.9% 동일한 서열을 갖는다.
IV. rAAV 생산
AAV 바이러스 벡터(예를 들어, 재조합(r) AAV)를 생산하는 데 사용하기 위해, 벡터 게놈은 임의의 적합한 벡터, 예를 들어, 패키징 숙주 세포로 전달되는 플라스미드로 운반될 수 있다. 본 발명에 유용한 플라스미드는 특히 원핵 세포, 곤충 세포, 포유류 세포에서 시험관내 복제 및 패키징에 적합하도록 조작될 수 있다. 적합한 형질감염 기술 및 패키징 숙주 세포는 알려져 있고/있거나 당업자에 의해 용이하게 설계될 수 있다. 예시적인 생산 공정은 도 12a - 12b에 제공되어 있다.
벡터로서 사용하기에 적합한 AAV를 생성 및 단리하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 예를 들어, Grieger & Samulski, 2005, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications, Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, Recent developments in adeno-associated virus vector technology, J. Gene Med. 10:717-733; 및 하기 인용된 참고문헌을 참조하며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 유전자를 비리온으로 패키징하기 위해, ITR은 유전자를 함유하는 핵산 분자와 동일한 작제물에서 시스에 필요한 유일한 AAV 성분이다. cap 및 rep 유전자는 트랜스로 공급될 수 있다.
일 구현예에서, 선택된 유전적 요소는 형질감염, 전기천공법, 리포솜 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA 코팅된 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합을 포함한 임의의 적합한 방법에 의해 AAV 패키징 세포로 전달될 수 있다. 안정된 AAV 패키징 세포가 또한 만들어질 수 있다. 이러한 작제물을 제조하는 데 사용되는 방법은 핵산 조작의 숙련자에게 알려져 있으며 유전자 조작, 재조합 조합, 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012) 참조.
용어 "AAV 중간체" 또는 "AAV 벡터 중간체"는 그 안에 패키징된 원하는 게놈 서열이 결여된 어셈블리된 rAAV 캡시드를 지칭한다. 이들은 또한 "빈" 캡시드로 명명될 수 있다. 이러한 캡시드는 발현 카세트의 검출가능한 게놈 서열을 함유하지 않거나, 또는 유전자 산물(예를 들어, β-gal)의 발현을 달성하기에 불충분한 부분적으로 패키징된 게놈 서열만을 함유할 수 있다. 이러한 빈 캡시드는 관심 유전자를 숙주 세포로 전달하는 기능이 없다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV.GLB1 또는 조성물은 AAV 중간체가 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 없을 수 있으며, 즉, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0.1% 미만의 AAV 중간체를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 재조합 아데노 연관 바이러스(AAV)는 알려진 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2 참조. 이러한 방법은 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 기능적 rep 유전자; 최소한 AAV 도립 말단 반복부(ITR) 및 이식유전자로 구성된 발현 카세트; 및 발현 카세트를 AAV 캡시드 단백질로 패키징하는 것을 허용하는 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 수반한다. 캡시드를 생성하는 방법, 이를 위한 코딩 서열, 및 rAAV 바이러스 벡터의 생산 방법이 기재되었다. 예를 들어, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(10), 6081-6086 (2003) 및 US 2013/0045186A1 참조.
일 구현예에서, 재조합 AAV(예컨대 rAAVhu68)를 생산하는 데 유용한 생산 세포 배양물이 제공된다. 이러한 세포 배양물은 숙주 세포에서 AAV캡시드 단백질을 발현하는 핵산; AAV캡시드에 패키징하기에 적합한 핵산 분자, 예를 들어, AAV ITR 및 세포(예를 들어, 필요한 환자의 세포)에서 유전자 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 GLB1 유전자를 함유하는 벡터 게놈; 및 벡터 게놈을 재조합 AAV 캡시드로 패키징하는 것을 허용하는 충분한 AAV rep 기능 및 아데노바이러스 헬퍼 기능을 함유한다. 일 구현예에서, 세포 배양물은 포유류 세포(예를 들어, 특히 인간 배아 신장 293 세포) 또는 곤충 세포(예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda; Sf9) 세포)로 구성된다. 특정 구현예에서, 배큘로바이러스는 벡터 게놈을 재조합 AAVhu68 캡시드로 패키징하는 데 필요한 헬퍼 기능을 제공한다.
임의적으로 rep 기능은 캡시드 공급원 AAV인 AAVhu68 이외의 AAV에 의해 제공된다. 특정 구현예에서, rep 기능의 적어도 일부는 AAVhu68로부터 유래한다. 또 다른 구현예에서, rep 단백질은 AAVhu68 rep 이외의 이종 rep 단백질, 예를 들어 비제한적으로, AAV1 rep 단백질, AAV2 rep 단백질, AAV3 rep 단백질, AAV4 rep 단백질, AAV5 rep 단백질, AAV6 rep 단백질, AAV7 rep 단백질, AAV8 rep 단백질; 또는 rep 78, rep 68, rep 52, rep 40, rep68/78 및 rep40/52; 또는 이의 단편; 또는 또 다른 공급원이다. 이들 AAVhu68 또는 돌연변이체 AAV 캡시드 서열 중 임의의 것은 숙주 세포에서 이의 발현을 지시하는 외인성 조절 제어 서열의 제어 하에 있을 수 있다.
일 구현예에서, 세포는 적합한 세포 배양물(예를 들어, HEK 293 또는 Sf9) 또는 현탁액에서 제조된다. 본원에 기재된 유전자 요법 벡터를 제조하는 방법은 유전자 요법 벡터의 생산, 벡터의 생산, 및 벡터의 정제를 위해 사용된 플라스미드 DNA의 생성과 같은 당업계에 잘 알려진 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 요법 벡터는 rAAV이고 생성된 플라스미드는 관심 유전자를 포함하는 AAV 벡터 게놈을 암호화하는 AAV 시스-플라스미드, AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 트랜스-플라스미드, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드이다. 벡터 생성 과정은 세포 배양 개시, 세포 계대, 세포 시딩, 플라스미드 DNA로 세포의 형질감염, 형질감염후 무혈청 배지로 배지 교환, 및 벡터-함유 세포 및 배양 배지의 수확과 같은 방법 단계를 포함할 수 있다. 수확된 벡터-함유 세포 및 배양 배지는 조질 세포 수확물로 본원에서 지칭된다. 또한 또 다른 시스템에서, 유전자 요법 벡터는 배큘로바이러스-기반 벡터로의 감염에 의해 곤충 세포로 도입된다. 이러한 생산 시스템에 대한 검토를 위해, 일반적으로, 예를 들어, Zhang et al., 2009, Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production, Human Gene Therapy 20:922-929를 참조하며, 각 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이들 및 다른 AAV 생산 시스템을 제조 및 사용하는 방법은 또한 하기 미국 특허에 기재되어 있으며, 각 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다: 제5,139,941호; 제5,741,683호; 제6,057,152호; 제6,204,059호; 제6,268,213호; 제6,491,907호; 제6,660,514호; 제6,951,753호; 제7,094,604호; 제7,172,893호; 제7,201,898호; 제7,229,823호; 및 제7,439,065호.
이후에 조질 세포 수확물은 rAAV 수확물의 농도, rAAV 수확물의 정용여과, rAAV 수확물의 미세유동화, rAAV 수확물의 뉴클레아제 소화, 미세유동화된 중간체의 여과, 크로마토그래피에 의한 조질 정제, 초원심분리에 의한 조질 정제, 접선 유동 여과에 의한 완충액 교환, 및/또는 벌크 rAAV를 제조하기 위한 제형 및 여과와 같은 방법 단계에 적용될 수 있다.
높은 염 농도에서 2 단계 친화성 크로마토그래피 정제 후 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 사용하여 rAAV 약물 생성물을 정제하고 빈 캡시드를 제거한다. 이러한 방법은 2016년 12월 9일 출원된 WO 2017/160360, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/065970 및 이의 우선권 서류, 2016년 4월 13일 출원된 미국 특허 출원 번호 제62/322,071호, 및 2015년 12월 11일 출원된 미국 특허 출원 번호 제62/226,357호에 보다 상세하게 기재되어 있으며 "AAV9에 대한 확장가능한 정제 방법"이라는 발명의 명칭으로 본원에 참조로 포함된다.
빈 입자 함량 및 전체 입자 함량을 계산하기 위해, 선택된 샘플(예를 들어, 본원의 예에서 게놈 카피(GC) 수 = 입자 수인 요오딕사놀 구배-정제된 제제)에 대한 VP3 밴드 부피가 로딩된 GC 입자에 대해 플롯팅된다. 생성된 선형 방정식(y = mx+c)을 사용하여 테스트 물품 피크의 밴드 부피에서 입자 수를 계산한다. 그 다음에 로딩된 20 μL 당 입자(pt) 수에 50을 곱하여 입자 (pt)/mL를 제공한다.　 Pt/mL을 GC/mL로 나누어 입자 대 게놈 카피의 비(pt/GC)를 제공한다.　 Pt/mL-GC/mL은 빈 pt/mL를 제공한다.　 빈 pt/mL을 pt/mL로 나누고 100을 곱하여 빈 입자의 백분율을 제공한다.
일반적으로, 빈 캡시드 및 패키징된 벡터 게놈을 갖는 rAAV 입자를 검정하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Grimm et al.,　Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al.,　Molec. Ther.(2003) 7:122-128 참조. 변성된 캡시드를 테스트하기 위해, 방법은 처리된 AAV 스톡을 3 개의 캡시드 단백질을 분리할 수 있는 임의의 겔, 예를 들어, 완충액 중 3-8% Tris-아세테이트를 함유하는 구배 겔로 이루어진 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용한 다음, 샘플 물질이 분리될 때까지 겔을 실행하고, 상기 겔을 나일론 또는 니트로셀룰로스 막, 바람직하게는 나일론 위에 블롯팅하는 것을 포함하다. 그 다음에 항-AAV 캡시드 항체는 변성된 캡시드 단백질에 결합하는 1차 항체, 바람직하게는 항-AAV 캡시드 모노클로날 항체, 가장 바람직하게는 B1 항-AAV-2 모노클로날 항체로 사용된다(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293). 그 다음에 1차 항체에 결합하고 1차 항체와의 결합을 검출하기 위한 수단을 함유하는 2 차 항체, 보다 바람직하게는 공유 결합된 검출 분자를 함유하는 항-IgG 항체, 가장 바람직하게는 서양고추냉이 퍼옥시다제에 공유 결합된 양 항-마우스 IgG 항체가 사용된다. 결합을 검출하는 방법은 1차 및 2차 항체 사이의 결합을 반정량적으로 결정하기 위해 사용되며, 바람직하게는 방사성 동위원소 방출, 전자기 방사, 또는 비색 변화를 검출할 수 있는 검출 방법, 가장 바람직하게는 화학발광 검출 키트가 사용된다. 예를 들어, SDS-PAGE의 경우, 칼럼 분획으로부터의 샘플을 취하여 환원제(예를 들어, DTT)를 함유하는 SDS-PAGE 로딩 완충액에서 가열하고, 캡시드 단백질을 프리캐스트 구배 폴리아크릴아미드 겔(예를 들어, Novex) 상에서 분해하였다. Silver 염색은 제조업체의 지침에 따라 SilverXpress(Invitrogen, CA) 또는 다른 적합한 염색 방법, 즉 SYPRO 루비 또는 쿠마시 염색을 사용하여 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 칼럼 분획에서 AAV 벡터 게놈(vg)의 농도는 정량적 실시간 PCR(Q-PCR)에 의해 측정될 수 있다. 샘플을 희석하고 DNase I(또는 또 다른 적합한 뉴클레아제)로 소화하여 외인성 DNA를 제거한다. 뉴클레아제의 비활성화 후, 샘플을 추가로 희석하고 프라이머 및 프라이머 사이의 DNA 서열에 특이적인 TaqMan™ 형광생성 프로브를 사용하여 증폭한다. 정의된 수준의 형광에 도달하는 데 필요한 주기의 수(임계 주기, Ct)는 Applied Biosystems Prism 7700 서열 검출 시스템에서 각 샘플에 대해 측정된다. rAAV에 함유된 것과 동일한 서열을 함유하는 플라스미드 DNA를 이용하여 Q-PCR 반응에서 표준 곡선을 생성한다. 샘플에서 수득된 주기 임계(Ct) 값을 사용하여 플라스미드 표준 곡선의 Ct 값으로 정규화함으로써 벡터 게놈 역가를 결정한다. 디지털 PCR에 기초한 종점 검정이 또한 사용될 수 있다.
일 측면에서, 광범위 스펙트럼 세린 프로테아제, 예를 들어, 프로테이나제 K(예컨대 Qiagen에서 시판중임)를 활용하는 최적화된 q-PCR 방법이 사용된다. 보다 특히,　 최적화된 qPCR 게놈 역가 검정은 DNase I 소화 후, 샘플을 프로테이나제 K 완충액으로 희석하고 프로테이나제 K로 처리 후 열 불활성화로 처리한다는 점을 제외하고 표준 검정과 유사하다.　 적합하게 샘플을 샘플 크기와 동일한 양의 프로테이나제 K 완충액으로 희석한다.　 프로테이나제 K 완충액은 2 배 이상 농축될 수 있다. 전형적으로, 프로테이나제 K 처리는 약 0.2 mg/mL이지만, 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL로 달라질 수 있다.　 처리 단계는 일반적으로 약 55℃에서 약 15 분 동안 수행되지만, 저온(예를 들어, 약 37℃ 내지 약 50℃)에서 더 긴 기간(예를 들어, 약 20 분 내지 약 30 분)에 걸쳐, 또는 고온(예를 들어, 최대 약 60℃)에 짧은 기간(예를 들어, 약 5 내지 10 분) 동안 수행될 수 있다. 유사하게, 열 불활성화는 일반적으로 약 95℃에서 약 15 분 동안 수행되지만, 온도는 낮아지고(예를 들어, 약 70 내지 약 90℃) 시간은 연장될 수 있다(예를 들어, 약 20 분 내지 약 30 분).　 그 다음에 샘플을 희석하고(예를 들어, 1000 배) 표준 검정으로 기재된 바와 같은 TaqMan 분석에 적용한다.　
추가적으로, 또는 대안적으로, 액적 디지털 PCR(ddPCR)이 사용될 수 있다. 예를 들어, ddPCR에 의해 단일 가닥 및 자기 상보성 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하는 방법이 기재되었다. 예를 들어, M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14 참조.
요약하면, 게놈-결핍 AAVhu68 중간체로부터 패키징된 게놈 서열을 갖는 rAAVhu68 입자를 분리하는 방법은 재조합 AAVhu68 바이러스 입자 및 AAVhu68 캡시드 중간체를 포함하는 현탁액을 고속 성능 액체 크로마토그래피에 적용하는 것을 수반하며, 여기서 AAVhu68 바이러스 입자 및 AAVhu68 중간체는 약 10.2의 pH에서 평형화된 강한 음이온 교환 수지에 결합되고, 약 260 나노미터(nm) 및 약 280 nm에서 자외선 흡광도에 대한 용리액을 모니터링하면서 염 구배에 적용된다. rAAVhu68에 대해 덜 최적이지만, pH는 약 10.0 내지 10.4 범위 내에 있을 수 있다. 이 방법에서, AAVhu68 전체 캡시드는 A260/A280의 비가 변곡점에 도달했을 때 용리되는 분획으로부터 수집된다. 일 예에서, 친화성 크로마토그래피 단계의 경우, 정용여과된 생성물은 AAV2/hu68 혈청형을 효율적으로 포획하는 Capture SelectTM Poros-AAV2/9 친화성 수지(Life Technologies)에 적용될 수 있다. 이러한 이온성 조건 하에, 상당한 백분율의 잔류 세포 DNA 및 단백질이 칼럼을 통해 유동하지만, AAV 입자는 효율적으로 포획된다.
또한 본원에는 본원에 기재된 바와 같은 벡터 게놈 및/또는 rAAV.GLB1을 생산하기 위한 생산 벡터(예컨대 플라스미드) 또는 숙주 세포가 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 요법 벡터를 생성 및/또는 패키징하기 위해 벡터 게놈을 숙주 세포로 운반하는 생산 벡터.
rAAV.GLB1(예를 들어, rAAVhu68.GLB1)은 적합한 생리적으로 호환가능한 조성물(예를 들어, 완충 염수)에 현탁된다. 이 조성물은 저장을 위해 동결되고, 나중에 해동되고 임의적으로 적합한 희석제로 희석될 수 있다. 대안적으로, rAAV.GLB1은 동결 및 해동 단계를 거치지 않고 환자에게 전달하기에 적합한 조성물로 제조될 수 있다.
V. 조성물 및 용도
본원에는 적어도 하나의 rAAV 스톡(예를 들어, rAAVhu68 스톡 또는 돌연변이체 rAAVhu68 스톡) 및 임의적인 담체, 부형제 및/또는 방부제를 함유하는 조성물이 제공된다. rAAV 스톡은 예를 들어, 농도 및 투여량 단위의 논의에서 하기 기재된 양과 같은 동일한 복수의 rAAV를 지칭한다.
특히, 조성물은 GM1 강글리오시드증의 치료를 위한 것이다. 일 구현예에서, 조성물은 GM1 강글리오시드증이 있는 환자 또는 생후 18 개월 이하인 유아 강글리오시드증이 있는 환자에게 투여하기에 적합하다. 일 구현예에서, 조성물은 GM1 강글리오시드증의 증상을 개선하거나, 또는 GM1 강글리오시드증의 신경학적 증상을 개선하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 조성물은 GM1 강글리오시드증의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV.GLB1 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 어구 "약제학적으로 허용되는"은 숙주에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 원치않은 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다.
특정 구현예에서, 본원에는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV.GLB1 및 전달 비히클을 포함하는 조성물이 제공된다. 리포솜, 나노캡슐, 미세입자, 미세구체, 지질 입자, 소포 등과 같은 전달 비히클은 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노구체, 또는 나노입자 등에서 캡슐화된 rAAV 전달된 벡터 게놈은 전달을 위해 제형화될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 대상체/환자에게 전달하기에 적합한 최종 제형을 포함하며, 예를 들어, 생리적으로 호환가능한 pH 및 염 농도로 완충된 수성 액체 현탁액이다. 임의적으로, 하나 이상의 계면활성제가 제형에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 희석된 농축물로 수송될 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 동결건조되고 투여 시 재구성될 수 있다.
적합한 계면활성제, 또는 계면활성제의 조합은 무독성인 비이온성 계면활성제 중에서 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들어, 중성 pH를 가지며 평균 분자량이 8400인 폴록사머 188로도 알려진 Pluronic® F68 [BASF]과 같은 1차 하이드록실 기에서 종결하는 이작용성 블록 공중합체 계면활성제가 선택된다. 다른 계면활성제 및 다른 폴록사머, 즉, 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2 개의 친수성 쇄가 옆에 있는 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 쇄로 구성된 비이온성 트리블록 공중합체, SOLUTOL HS 15(Macrogol-15 하이드록시스테아레이트), LABRASOL(폴리옥시 카프릴릭 글리세라이드), 폴리옥시 10 올레일 에테르, TWEEN(폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르), 에탄올 및 폴리에틸렌 글리콜이 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 제형은 폴록사머를 함유한다. 이들 공중합체는 통상적으로 문자 "P"(폴록사머의 경우) 이어서 3 자리 숫자로 명명되며, 처음 2 자리 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적인 분자 질량을 제공하고, 마지막 자리 숫자 x 10은 폴리옥시에틸렌 함량 백분율을 제공한다. 일 구현예에서 폴록사머 188이 선택된다. 일 구현예에서, 계면활성제는 현탁액의 최대 약 0.0005% 내지 약 0.001%(중량 비 기준, w/w%)의 양으로 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 계면활성제는 현탁액의 최대 약 0.0005% 내지 약 0.001%(부피 비 기준, v/v%)의 양으로 존재할 수 있다. 또한 또 다른 구현예에서, 계면활성제는 현탁액의 최대 약 0.0005% 내지 약 0.001%의 양으로 존재할 수 있으며, 여기서 n%는 현탁액 100 mL 당 n 그램을 나타낸다.
rAAV.GLB1은 세포를 형질감염시키고 과도한 부작용 없이 또는 의학적으로 허용되는 생리학적 효과와 함께 치료적 이점을 제공하기에 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여되며, 이는 의학 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 통상적이고 약제학적으로 허용되는 투여 경로는 원하는 기관(예를 들어, 뇌, CSF, 간(임의적으로 간동맥을 통해), 폐, 심장, 눈, 신장)으로의 직접 전달, 경구, 흡입, 비강내, 척수강내, 기관내, 동맥내, 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 실질내, 뇌실내, 척수강내, ICM, 요추 천자 다른 비경구 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 투여 경로는 원하는 경우 조합될 수 있다.
rAAV.GLB1의 투여량은 치료중인 병태, 환자의 연령, 체중 및 건강과 같은 요인에 따라 달라지며, 따라서 환자마다 다를 수 있다. 예를 들어, rAAV.GLB1의 치료적으로 효과적인 인간 투여량은 일반적으로 약 1 x 109 내지 1 x 1016 벡터 게놈 카피의 농도를 함유하는 약 25 내지 약 1000 마이크로리터 내지 약 100 mL의 범위 내에 있다. 특정 구현예에서, 약 1 mL 내지 약 15 mL, 또는 약 2.5 mL 내지 약 10 mL, 또는 약 5 mL 부피의 현탁액이 전달된다. 특정 구현예에서, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15 mL 부피의 현탁액이 전달된다.
일부 구현예에서, 조성물은 단일 용량으로 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물은 다중 용량으로 투여하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 환자 당 rAAV.GLB1의 약 8 x 1012 게놈 카피(GC) 내지 환자 당 rAAV.GLB1의 약 3 x 1014 GC의 용량이 본원에 기재된 부피로 투여된다. 특정 구현예에서, 환자 당 rAAV.GLB1의 약 2 x 1012 GC 내지 환자 당 rAAV.GLB1의 약 3 x 1014 GC, 또는 환자 당 rAAV.GLB1의 약 2 x 1013 GC 내지 환자 당 rAAV.GLB1의 약 3 x 1014 GC, 또는 환자 당 rAAV.GLB1의 약 8 x 1013 GC 내지 환자 당 rAAV.GLB1의 약 3 x 1014 GC, 또는 환자 당 rAAV.GLB1의 약 9 x 1013 GC, 또는 총 약 8.9 x 1012 내지 2.7 x 1014 GC의 용량이 부피로 투여된다.
특정 구현예에서, 뇌 질량 g 당 rAAV.GLB1의 1 x 1010 GC(GC/뇌 질량 g) 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g의 용량이 본원에 기재된 바와 같은 부피로 투여된다. 특정 구현예에서, 3.4 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g, 또는 1.0 x 1011 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g, 또는 약 1.1 x 1011 GC/뇌 질량 g, 또는 약 1.1 x1010 GC/뇌 질량 g 내지 약 3.3 x 1011 GC/뇌 질량 g의 용량이 부피로 투여된다. 특정 구현예에서, 뇌 질량 그램 당 약 3.0 x109, 약 4.0 x109, 약 5.0 x109, 약 6.0 x109, 약 7.0 x109, 약 8.0 x109, 약 9.0 x109, 약 1.0 x1010, 약 1.1 x1010, 약 1.5 x1010, 약 2.0 x1010, 약 2.5 x1010, 약 3.0 x1010, 약 3.3 x1010, 약 3.5 x1010, 약 4.0 x1010, 약 4.5 x1010, 약 5.0 x1010, 약 5.5 x1010, 약 6.0 x1010, 약 6.5 x1010, 약 7.0 x1010, 약 7.5 x1010, 약 8.0 x1010, 약 8.5 x1010, 약 9.0 x1010, 약 9.5 x1010, 약 1.0 x1011, 약 1.1 x1011, 약 1.5 x1011, 약 2.0 x1011, 약 2.5 x1011, 약 3.0 x1011, 약 3.3 x1011, 약 3.5 x1011, 약 4.0 x1011, 약 4.5 x1011, 약 5.0 x1011, 약 5.5 x1011, 약 6.0 x1011, 약 6.5 x1011, 약 7.0 x1011, 약 7.5 x1011, 약 8.0 x1011, 약 8.5 x1011, 약 9.0 x1011 GC의 용량이 부피로 투여된다. 특정 구현예에서, 용량은 GM1 동물 모델에 제시된 최소 유효 용량을 반영하며 뇌 질량 그램 당 게놈 카피에 기초하여 인간 환자에서 사용하기 위해 조정된다. 일 구현예에서, 인간 환자에서 사용하기 위한 용량은 하기 표에 나열된 추정된 뇌 질량을 사용하여 계산된다.
Figure pct00004
투여량은 임의의 부작용에 대한 치료 이점의 균형을 맞추기 위해 조정되며 이러한 투여량은 rAAV.GLB1이 이용되는 치료적 적용에 따라 달라질 수 있다. 이식유전자 산물(예를 들어, β-gal)의 발현 수준을 모니터링하여 rAAV.GLB1, 바람직하게는 소형유전자(예를 들어, GLB1 유전자)를 함유하는 rAAV에서 생성된 투여량 빈도를 결정할 수 있다. 임의적으로, 치료적 목적을 위해 기재된 것과 유사한 투여량 레지멘이 본 발명의 조성물을 사용한 면역화에 활용될 수 있다.
복제-결함 바이러스 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수량을 포함하여 약 1.0 x 109 GC 내지 약 1.0 x 1016 GC(대상체를 치료하기 위해), 바람직하게는 인간 환자의 경우 1.0 x 1012 GC 내지 1.0 x 1014 GC의 범위 내에 있는 복제-결함 바이러스(예를 들어, rAAV.GLB1, rAAVhu68.GLB1, 또는 rAAVhu68.UbC.GLB1)의 양을 함유하도록 투여량 단위로 제형화될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수량을 포함하여 용량 당 적어도 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 또는 9x109 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수량을 포함하여 용량 당 적어도 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 또는 9x1010 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수량을 포함하여 용량 당 적어도 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 또는 9x1011 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수량을 포함하여 용량 당 적어도 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수량을 포함하여 용량 당 적어도 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, 또는 9x1013 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수량을 포함하여 용량 당 적어도 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 또는 9x1014 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수량을 포함하여 용량 당 적어도 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 또는 9x1015 GC를 함유하도록 제형화된다. 일 구현예에서, 인간 적용의 경우 용량은 범위 내의 모든 정수 또는 분수량을 포함하여 용량 당 1x1010 내지 약 1x1012 GC 범위일 수 있다.
이러한 상기 용량은 치료할 영역의 크기, 사용된 바이러스 역가, 투여 경로, 및 방법의 원하는 효과에 따라 범위 내의 모든 수를 포함하여 약 25 내지 약 1000 마이크로리터, 또는 그 이상 부피 범위의 다양한 부피의 담체, 부형제 또는 완충제 제형으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 담체, 부형제 또는 완충제의 부피는 적어도 약 25 μL이다. 일 구현예에서, 부피는 약 50 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 75 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 100 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 125 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 150 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 175 μL이다. 또한 또 다른 구현예에서, 부피는 약 200 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 225 μL이다. 또한 또 다른 구현예에서, 부피는 약 250 μL이다. 또한 또 다른 구현예에서, 부피는 약 275 μL이다. 또한 또 다른 구현예에서, 부피는 약 300 μL이다. 또한 또 다른 구현예에서, 부피는 약 325 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 350 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 375 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 400 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 450 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 500 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 550 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 600 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 650 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 700 μL이다. 또 다른 구현예에서, 부피는 약 700 내지 1000 μL이다.
특정 구현예에서, 용량은 약 1 x 109 GC/뇌 질량 g 내지 약 1 x 1012 GC/뇌 질량 g의 범위 내에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 용량은 약 3 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 약 3 x 1011 GC/뇌 질량 g의 범위 내에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 용량은 약 5 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 약 1.85 x 1011 GC/뇌 질량 g의 범위 내에 있을 수 있다.
일 구현예에서, 바이러스 작제물은 적어도 약 최소 1x109 GC 내지 약 1 x 1015, 또는 약 1 x 1011 내지 5 x 1013 GC의 용량으로 전달될 수 있다. 이러한 용량 및 농도의 전달에 적합한 부피는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 약 1 μL 내지 150 mL의 부피가 선택될 수 있으며, 성인의 경우 더 많은 부피가 선택된다. 전형적으로, 신생아의 경우 적합한 부피는 약 0.5 mL 내지 약 10 mL이며, 더 자란 유아의 경우, 약 0.5 mL 내지 약 15 mL가 선택될 수 있다. 영아의 경우, 약 0.5 mL 내지 약 20 mL의 부피가 선택될 수 있다. 어린이의 경우, 최대 약 30 mL의 부피가 선택될 수 있다. 십대 이전 및 십대의 경우, 최대 약 50 mL의 부피가 선택될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 환자는 선택된 약 5 mL 내지 약 15 mL, 또는 약 7.5 mL 내지 약 10 mL의 부피로 척수강내 투여를 받을 수 있다. 다른 적합한 부피 및 투여량이 결정될 수 있다. 투여랑을 조정하여 임의의 부작용에 대한 치료 이점의 균형을 맞출 수 있으며 이러한 투여량은 rAAV.GLB1이 이용되는 치료 적용에 따라 달라질 수 있다.
상기 기재된 rAAV.GLB1은 공개된 방법에 따라 숙주 세포로 전달될 수 있다. 바람직하게는 생리적으로 호환가능한 담체에 현탁된 rAAV는 인간 또는 비인간 포유류 환자에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 환자에게 투여하는 경우 rAAV는 염수, 계면활성제, 및 생리적으로 호환가능한 염 또는 염의 혼합물을 함유하는 수용액에 적합하게 현탁된다. 적합하게, 제형은 생리적으로 허용되는 pH, 예를 들어, pH 6 내지 9, 또는 pH 6.0 내지 7.5, 또는 pH 6.2 내지 7.7, 또는 pH 6.5 내지 7.5, pH 7.0 내지 7.7, 또는 pH 7.2 내지 7.8, 또는 약 7.0의 범위로 조정된다. 특정 구현예에서, 제형은 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 또는 약 7.8의 pH로 조정된다. 특정 구현예에서, 약 7.28 내지 약 7.32, 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.2 내지 약 7.7, 약 7.5 내지 약 7.8, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 또는 약 7.8의 pH가 척수강내 전달에 바람직할 수 있지만; 정맥내 전달의 경우, 약 6.8 내지 약 7.2의 pH가 바람직할 수 있다. 그러나, 광범위한 범위 및 이러한 하위범위 내의 다른 pH가 다른 전달 경로를 위해 선택될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 애쥬번트(adjuvant)를 포함한다. 적합한 담체는 전달 바이러스가 지시되는 적응증의 관점에서 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 담체는 염수를 포함하며, 다양한 완충 용액(예를 들어, 포스페이트 완충 염수)으로 제형화될 수 있다. 다른 예시적인 담체는 멸균 염수, 락토스, 수크로스, 칼슘 포스페이트, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참깨유, 및 물을 포함한다. 완충제/담체는 rAAV가 주입 튜빙에 달라붙는 것을 방지하지만 생체내 rAAV 결합 활성을 방해하지 않는 성분을 포함해야 한다. 적합한 계면활성제, 또는 계면활성제의 조합은 무독성인 비이온성 계면활성제 중에서 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들어 중성 pH를 가지며, 평균 분자량이 8400인 폴록사머 188(또한 제품명 Pluronic® F68 [BASF], Lutrol® F68, Synperonic® F68, Kolliphor® P188로도 알려짐)과 같은 주로 하이드록실 기에서 종결하는 이작용성 블록 공중합체 계면활성제가 선택된다. 다른 계면활성제 및 다른 폴록사머, 즉, 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2 개의 친수성 쇄가 측면에 있는 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 쇄로 구성된 비이온성 트리블록 공중합체, SOLUTOL HS 15(Macrogol-15 하이드록시스테아레이트), LABRASOL(폴리옥시 카프릴릭 글리세라이드), 폴리옥시 -올레일 에테르, TWEEN(폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르), 에탄올 및 폴리에틸렌 글리콜이 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 제형은 폴록사머를 함유한다. 이들 공중합체는 통상적으로 문자 "P"(폴록사머의 경우) 이어서 3 자리 숫자로 명명되며, 처음 2 자리 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적인 분자 질량을 제공하고, 마지막 자리 숫자 x 10은 폴리옥시에틸렌 함량 백분율을 제공한다. 일 구현예에서 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 최대 약 0.0005% 내지 약 0.001%의 양으로 존재할 수 있다.
일 예에서, 제형은 예를 들어, 물 중에 나트륨 클로라이드, 나트륨 비카르보네이트, 덱스트로스, 마그네슘 술페이트(예를 들어, 마그네슘 술페이트ㆍ7H2O), 칼륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드(예를 들어, 칼슘 클로라이드ㆍ2H2O), 2염기성 나트륨 포스페이트, 및 이의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 완충 염수를 함유할 수 있다. 적합하게, 척수강내 전달을 위해, 삼투압은 뇌척수액과 호환가능한 범위 내에 있으며(예를 들어, 약 275 밀리오스몰/리터(mOsm/L) 내지 약 290 mOsm/L); 예를 들어, emedicine.medscape.com/-article/2093316-overview를 참조한다. 임의적으로, 척수강내 전달을 위해, 시판중인 희석제가 현탁제로서, 또는 또 다른 현탁제 및 다른 임의적인 부형제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Elliotts B® 용액 [Lukare Medical] 참조. 각 10 mL의 Elliotts B 용액은 다음을 함유한다:
Figure pct00005
전해질 농도:
Figure pct00006
성분의 분자식 및 분자량은 다음과 같다:
Figure pct00007
Elliotts B 용액의 pH는 6 내지 7.5이고, 삼투압은 리터 당 288 mOsmol이다(계산됨).
특정 구현예에서, 척수강내 최종 제형 완충액(ITFFB) 제형 완충액은 완충 염수 및 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 또는 이의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 인공 뇌척수액; 및 계면활성제를 포함한다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 현탁액의 약 0.0005% 내지 약 0.001%를 포함한다. 추가 구현예에서, 백분율(%)은 중량(w) 비(즉, w/w)를 기준으로 계산된다.
특정 구현예에서, rAAVhu68.GLB1을 함유하는 조성물(예를 들어, ITFFB 제형)은 6.0 내지 7.5, 또는 6.2 내지 7.7, 또는 6.8 내지 8, 또는 7.2 내지 7.8, 또는 7.5 내지 8의 범위의 pH에 있다. 특정 구현예에서, 최종 제형은 약 7, 또는 7 내지 7.4 , 또는 7.2의 pH에 있다. 특정 구현예에서, 척수강내 전달을 위해, 7.5 이상, 예를 들어, 7.5 내지 8, 또는 7.8의 pH가 바람직할 수 있다.
특정 구현예에서, 약 7의 pH가 척수강내 전달 뿐만 아니라 다른 전달 경로에 바람직하다.
특정 구현예에서, 제형은 나트륨 비카르보네이트를 포함하지 않는 완충 염수 수용액을 함유할 수 있다. 이러한 제형은 물 중에 나트륨 포스페이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 마그네슘 클로라이드 및 이의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 완충 염수 수용액, 예컨대 Harvard 완충액을 함유할 수 있다. 수용액은 상품명 Lutrol® F68로 이전에 판매된 BASF에서 시판중인 폴록사머인 Kolliphor® P188을 추가로 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 수용액은 7.2의 pH를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 수용액은 약 7의 pH를 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제형은 1 mM 나트륨 포스페이트(Na3PO4), 150 mM 나트륨 클로라이드(NaCl), 3mM 칼륨 클로라이드(KCl), 1.4 mM 칼슘 클로라이드(CaCl2), 0.8 mM 마그네슘 클로라이드(MgCl2), 및 0.001% 폴록사머(예를 들어, Kolliphor®) 188을 포함하는 완충 염수 수용액을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 제형은 약 7.2의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제형은 약 7의 pH를 갖는다. 예를 들어, harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html 참조. 특정 구현예에서, Harvard 완충액은 Harvard 완충액으로 관찰된 더 나은 pH 안정성으로 인해 바람직하다. 하기 표는 Harvard 완충액 및 Elliot B 완충액을 비교한다.
뇌척수액(CSF) 조성물
Figure pct00008
특정 구현예에서, 제형 완충액은 Pluronic F68을 갖는 인공 CSF이다. 다른 구현예에서, 제형은 하나 이상의 투과 증진제를 함유할 수 있다. 적합한 투과 증진제의 예는 예를 들어, 만니톨, 나트륨 글리코콜레이트, 나트륨 타우로콜레이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 살리실레이트, 나트륨 카프릴레이트, 나트륨 카프레이트, 나트륨 라우릴 술페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우렐 에테르, 또는 EDTA를 포함할 수 있다.
임의적으로, 본 발명의 조성물은 rAAV 및 담체(들) 이외에, 다른 통상적인 약제학적 성분, 예컨대 방부제, 또는 화학적 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 방부제는 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 상기 정의된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 적합하게, 본원에 기재된 조성물은 약제학적으로 적합한 담체에 현탁되고/되거나 주사, 삼투 펌프, 척수강내 카테터를 통해 대상체에게 전달하기 위해, 또는 또 다른 장치 또는 경로에 의한 전달을 위해 설계된 적합한 부형제와 혼합된 유효량의 하나 이상의 AAV를 포함한다. 일 예에서, 조성물은 척수강내 전달을 위해 제형화된다. 일 구현예에서, 조성물은 대수조내 주사(ICM)를 통한 투여를 위해 제형화된다. 일 구현예에서, 조성물은 CT-유도된 후두하 주사를 통해 대수조에 투여하기 위해 제형화된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "척수강내 전달" 또는 "척수강내 투여"는 약물이 뇌척수액(CSF)에 도달하도록 척추관, 보다 구체적으로 지주막하 공간으로 주사를 통해 약물을 투여하는 경로를 지칭한다. 척수강내 전달은 요추 천자, 심실내(뇌실내(ICV) 포함), 후두하/수조내, 및/또는 C1-2 천자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 요추 천자에 의해 지주막하 공간 전체에 확산시키기 위한 물질이 도입될 수 있다. 또 다른 예에서, 주사는 대수조로 도입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수조내 전달" 또는 "수조내 투여"는 약물을 대수조 소뇌숨뇌의 뇌척수액으로, 보다 구체적으로 후두하 천자를 통해 직접적으로 또는 대수조로의 직접 주사에 의해 또는 영구적으로 위치된 튜브를 통해 투여하는 경로를 지칭한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 rAAV.GLB1(예를 들어, rAAVhu68.GLB1) 및 제형 완충액을 포함하는 수성 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 전달된다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1은 AAV 캡시드(예를 들어, AAVhu68 캡시드) 및 5' AAV ITR - 프로모터 - 임의적인 인핸서 - 임의적인 인트론 - GLB1 유전자 - polyA - 3' ITR을 포함하는 벡터 게놈을 갖는다. 특정 구현예에서, ITR은 AAV2로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 하나 초과의 프로모터가 존재한다. 특정 구현예에서, 인핸서는 벡터 게놈에 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 초과의 인핸서가 존재한다. 특정 구현예에서, 인트론은 벡터 게놈에 존재한다. 특정 구현예에서, 인핸서 및 인트론이 존재한다. 특정 구현예에서, polyA는 SV40 poly A이다. 특정 구현예에서, polyA는 토끼 베타-글로빈(RBG) poly A이다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 5' AAV ITR - CB7 프로모터 - GLB1 유전자 - RBG poly A - 3' ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 5' AAV ITR - EF1a 프로모터 - GLB1 유전자 - SV40 poly A - 3' ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 5' AAV ITR - UbC 프로모터 - GLB1 유전자 - SV40 poly A - 3' ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 5를 갖는다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 6을 갖는다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 7을 갖는다. 특정 구현예에서, GLB1 유전자는 서열번호: 8을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 12의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 13의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 14의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 15의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 16의 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 최종 제형 완충액은 완충 염수 및 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 또는 이의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 인공 뇌척수액; 및 계면활성제를 포함한다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 현탁액의 약 0.0005% 내지 약 0.001%이다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 Pluronic F68이다. 특정 구현예에서, Pluronic F68은 현탁액의 약 0.0001%의 양으로 존재한다. 특정 구현예에서, 조성물은 척수강내 전달을 위해 7.5 내지 7.8 범위의 pH에 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 척수강내 전달을 위해 6.2 내지 7.7, 또는 6.9 내지 7.5, 또는 약 7 범위의 pH에 있다. 일 구현예에서, 백분율(%)은 중량비 또는 부피비를 기준으로 계산된다. 또 다른 구현예에서, 백분율은 "최종 부피 100ml 당 그램"을 나타낸다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물의 처리는 감각 긴경 독성 및 준임상 감각 뉴런 병변과 관련하여 잘 견뎌낸 동물 및/또는 인간 환자에서 DRG 감각 뉴런의 최소 내지 경미한 무증상 퇴행을 갖는다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 치료된 대상체/환자에서 기능적 및 임상적 결과를 개선하는 데 유용하다. 이러한 결과는 조성물의 투여 후 약 30 일, 약 60 일, 약 90 일, 약 4 개월, 약 5 개월, 약 6 개월, 약 7 개월, 약 8 개월, 약 9 개월, 약 10 개월, 약 11 개월, 약 12 개월, 약 13 개월, 약 14 개월, 약 15 개월, 약 16 개월, 약 17 개월, 약 18 개월, 약 19 개월, 약 20 개월, 약 21 개월, 약 22 개월, 약 23 개월, 약 24 개월, 약 2.5 년, 약 3 년, 약 3.5 년, 약 4 년, 약 4.5 년 및 그 다음에 최대 약 5 년까지 매년 측정될 수 있다. 측정 빈도는 약 1 개월마다, 약 2 개월마다, 약 3 개월마다, 약 4 개월마다, 약 5 개월마다, 약 6 개월마다, 약 7 개월마다, 약 8 개월마다, 약 9 개월마다, 약 10 개월마다, 약 11 개월마다, 또는 약 12 개월마다일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 미치료된 대조군과 비교하여 치료된 대상체에서 측정된 약력학 및 임상 효능을 나타낸다.
특정 구현예에서, 약력학 효능, 임상 효능, 기능적 결과, 또는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 통해 측정될 수 있다: (1) 생존, (2) 영양관 독립성, (3) 발작 일지, 예를 들어, 발작의 개시, 발병, 빈도, 길이, 및 유형, (4) 예를 들어 PedsQL에 의해 측정된 삶의 질, (5) 신경인지 및 행동 발달, (6) 예를 들어 혈청 또는 CSF에서 β-gal 효소 발현 또는 활성, 및 (7) 본원에 기재된 바와 같은 다른 매개변수. 베일리 유아 발달 척도 및 바인랜드 척도를 사용하여 적응 행동, 인지, 언어, 운동 기능, 및 건강 관련 삶의 질에서의 발달 및/또는 변화에 대한 조성물의 효과를 정량화할 수 있다.
특정 구현예에서, 신경인지적 발달은 다음 중 하나 이상에 기초한다: 베일리 영유아 발달 검사 척도의 등가 연령 인지, 대근육 운동, 소근육 운동, 수용적 및 표현적 의사소통 점수의 변화; 바인랜드 적응 행동 척도의 각 영역에 대한 표준 점수의 변화; 및 소아 삶의 질 척도 및 소아 삶의 질 유아 척도(PedsQL 및 PedsQL-IS)에서 총 점수의 변화에 따른 소아 삶의 질.
BSID(베일리 유아 발달 척도)는 주로 1-42 개월의 유아 및 영아의 발달을 평가하는 데 사용된다(Albers and Grieve, 2007, Test Review: Bayley, N. (2006). Bayley Scales of Infant and Toddler Development-Third Edition. San Antonio, TX: Harcourt Assessment. Journal of Psychoeducational Assessment. 25(2):180-190). 이는 표준화된 일련의 발달 놀이 과제로 이루어되며 성공적으로 완료된 항목의 원시 점수를 척도 점수 및 복합 점수로 변환하고 점수를 전형적으로 동일한 연령의 발달중인 어린이로부터 취한 표준과 비교함으로써 발달 지수를 도출한다. Bayley-III은 다음과 같은 3 개의 주요 하위세트를 갖는다: 익숙하고 생소한 물체에 대한 관심, 떨어진 물체 찾기, 및 가상 놀이와 같은 항목을 포함하는 인지 척도; 언어의 이해 및 표현을 평가하는 언어 척도(예를 들어 지시를 따르고 물체에 이름을 붙이는 능력); 및 대근육 및 소근육 운동 기술(예를 들어 잡기, 앉기, 블록 쌓기, 및 계단 오르기)을 측정하는 운동 척도. 가장 최신 버전은 BSID-III이다.
바인랜드: 다음 5 가지 영역에 걸쳐 출생부터 성인기(0-90년)까지의 적응 행동 평가: 의사소통, 일상 생활 기술, 사회화, 운동 기술, 및 부적응 행동. 가장 최신 버전은 바인랜드 III이다. 바인랜드-II에서 바인랜드-III으로의 개선은 발달 장애를 더 잘 이해할 수 있도록 질문을 포함한다.
BSID 및 바인랜드는 유아 GM1 강글리오시드증 환자의 유일한 전향적 연구로부터의 데이터에 기초하여 선택되었다(Brunetti-Pierri and Scaglia, 2008, GM1 gangliosidosis: Review of clinical, molecular, and therapeutic aspects. Molecular Genetics and Metabolism. 94(4):391-396.). BSID-III에서의 등가 연령 점수는 인지 및 대근육 운동 영역 모두에 대해 생후 28 개월까지 테스팅 척도의 바닥으로 감소를 나타내었고, 바인랜드-II 적응 행동 척도에서의 점수는 정상보다 훨씬 낮았지만 생후 28 개월까지 측정가능하게 남아있었다. 이들 도구는 바닥 효과를 나타내었지만 이러한 심각하게 손상된 집단에서 발달 변화를 측정하는 데 적절한 척도인 것으로 나타났으며, 척도의 교차 문화 타당성으로 인해 국제 연구에 적절하다.
PedsQOL 및 PedsQL-IS: 심각한 소아 질환의 경우와 마찬가지로, 가족에게 질환 부담은 상당하다. Pediatric Qualirt of Life Inventory™은 자녀와 부모의 삶의 질을 평가하는 검증된 도구이다(부모 대리 보고서에 따름). 건강한 어린이 및 청소년에서 검증되었으며 다양한 소아 질환에 사용되었다(Iannaccone et al., 2009, The PedsQL in pediatric patients with Spinal Muscular Atrophy: feasibility, reliability, and validity of the Pediatric Quality of Life Inventory Generic Core Scales and Neuromuscular Module. Neuromuscular disorders:NMD. 19(12):805-812; Absoud et al., 2011, Paediatric UK demyelinating disease longitudinal study (PUDDLS)." BMC Pediatrics. 11(1):68; 및 Consolaro and Ravelli, 2016, hapter 5 - Assessment Tools in Juvenile Idiopathic Arthritis. Handbook of Systemic Autoimmune Diseases. R. Cimaz and T. Lehman, Elsevier. 11: 107-127). 따라서, PedsQL은 환자와 가족의 삶의 질에 미치는 rAAV.GLB1의 영향을 평가하기 위해 포함된다. 2 세 이상 자녀를 둔 부모에게 적용될 수 있고 따라서 5 년 추적 기간에 걸쳐 자녀가 나이가 들면 유익할 수 있다. Pediatric Quality of Life Inventory™ 유아 척도(Varni et al., 2011, "The PedsQL™ Infant Scales: feasibility, internal consistency reliability, and validity in healthy and ill infants." Quality of Life Research. 20(1):45-55.)는 부모에 의해 완료된 검증된 모듈식 기기이며 구체적으로 1-24 개월의 건강하고 아픈 유아를 대상으로 건강 관련 삶의 질을 측정하도록 설계된 기기이다.
표적 집단에서 질환의 중증도를 고려해 볼 때, 대상체는 등록에 의해 운동 기술을 달성하고, 다른 운동 이정표를 개발한 후 상실하였거나, 또는 아직 운동 이정표 발달 징후를 나타내지 않았을 수 있다. 평가는 모든 이정표에 대한 달성 연령 및 상실 연령을 추적한다. 운동 이정표 달성은 섹션 I GM1 및 치료 GLB1 유전자 하에 본원에 제공된 표에 요약된 WHO 기준에 기초하여 6 개의 총 이정표에 대해 정의된다. 유아 GM1 강글리오시드증이 있는 대상체가 생후 수개월 내에 증상이 발생할 수 있고, 첫번째 WHO 운동 이정표(도움 없이 앉아있기)의 획득이 전형적으로 생후 4 개월 전(중앙값: 5.9 개월)에 나타나지 않음을 고려해 볼 때, 이 평가변수는 특히 치료 시 더 명백한 증상을 나타낸 대상체에서 치료 이점 정도를 평가하는 민감성이 부족할 수 있다. 이러한 이유로, 유아에게 적용될 수 있는 연령 적절한 발달 이정표의 평가가 또한 포함된다(Scharf et al., 2016, Developmental Milestones. Pediatr Rev. 37(1):25-37; quiz 38, 47.). 한 가지 단점은 임상의 및 부모에 의해 사용하도록 의도되고, 정상 범위를 참조하지 않고 전형적인 이정표 획득 연령에 대한 기술을 조직한다는 점이다. 그러나, 데이터는 유아 GM1 질환이 있는 미치료된 어린이 또는 정상적인 어린이에서 전형적인 획득 시간에 비해 시간 경과에 따라 발달 이정표의 체류, 획득, 또는 상실을 요약하는 데 유용할 수 있다.
질환이 진행됨에 따라 어린이는 발작을 일으킬 수 있다. 발작 활성 발병은 rAAV.GLB1 처리가 발작 발병을 예방하거나 또는 지연시킬 수 있는지 또는 이 집단에서 발작 사건 빈도를 감소시킬 수 있는지 여부를 결정할 수 있게 한다. 부모는 발작 발병, 빈도, 길이, 및 유형을 추적하는 발작 일지를 보관해야 한다.
특정 구현예에서, 약력학 효능, 임상 효능, 기능적 결과, 또는 임상 결과는 또한 질환의 CNS 징후, 예를 들어, 시간 경과에 따라 MRI에서 측정된 체적 변화를 포함할 수 있다. 모든 강글리오사이도스의 유아 표현형은 대두증의 일관된 패턴을 가지며 뇌 조직 부피(대뇌 피질 및 다른 더 작은 구조) 및 심실 부피 모두와 함께 두개내 MRI 부피가 빠르게 증가하는 것으로 나타났다. 추가적으로, 뇌량, 미상 및 경막 뿐만 아니라 소뇌 피질을 포함한 다양한 더 작은 뇌 하부구조는 일반적으로 질환이 진행됨에 따라 크기가 감소한다(Regier et al., 2016s, and Nestrasil et al., 2018, 본원에 인용됨). rAAV.GLB1 처리는 위축 및 체적 변화의 안정화 증거와 함께 CNS 질환 징후 진행을 늦추거나 또는 중지시킬 수 있다. 시상 및 기저핵에서 T1/T2 신호 강도의 변화(정상/비정상)는 또한 GM1 및 GM2 강글리오시드증이 있는 환자에서 시상 구조의 변화에 대한 보고된 증거에 기초하여 포함될 수 있다(Kobayashi and Takashima, 1994, Thalamic hyperdensity on CT in infantile GM1-gangliosidosis." Brain and Development. 16(6):472-474). 특정 구현예에서, 약력학 효능, 임상 효능, 기능적 결과, 또는 임상 결과는 MRI에 의해 측정 시 총 뇌 부피, 뇌 하부구조 부피, 측뇌실 부피의 변화; 및/또는 시상 및 기저핵 활성에서 T1/T2 신호 강도의 변화를 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 약력학 효능, 임상 효능, 기능적 결과, 또는 임상 결과는 바이오마커, 예를 들어, rAAV.GLB1의 약력학 및 생물학적 활성, CSF 및 혈청에서 측정될 수 있는 β-gal 효소(GLB1) 활성, CSF GM1 농도, 혈청 및 소변 케라탄 술페이트 수준, 헥소사미니다제 활성 감소, 및 유아 GM1 강글리오시드증에서 일관되고 빠른 위축을 나타내는 뇌 MRI를 포함할 수 있다(Regier et al., 2016b, 본원에 인용됨).
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 예를 들어, 달성 연령, 상실 연령, 및 연령 적절한 발달 및 운동 이정표를 유지하거나 또는 획득하는 어린이의 백분율(세계보건기구 [WHO] 기준에 의해 정의됨)에 의해 평가 시 질환 진행을 늦추는 데 유용하다.
특정 구현예에서, 약력학 효능, 임상 효능, 기능적 결과, 또는 임상 결과는 간 및 비장 부피; 및/또는 EEG 및 시각 유발 전위(VEP)를 포함할 수 있다.
VI. 약제학적 조성물을 뇌척수액으로 전달하기 위한 장치 및 방법
일 측면에서, 본원에 제공된 rAAV 또는 조성물은 이 섹션에 제공되고 본원에 참조로 포함된 WO 2018/160582에 기재된 방법 및/또는 장치를 통해 척수강내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 다른 장치 및 방법이 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 방법은 척수 바늘을 통해 환자의 대수조에 CT-유도된 후두하 주사 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 컴퓨터 단층촬영(CT)은 축을 따라 만들어진 일련의 평면 이미지로부터 컴퓨터에 의해 신체 구조의 3차원 이미지가 구축되는 방사선촬영을 지칭한다.
치료 당일에, 적절한 농도의 rAAV.GLB1을 준비한다. 적절한 농도로 rAAV.GLB1 5.6 mL를 함유하는 주사기를 시술실로 전달한다. 연구 약물 투여를 위해 다음 사람들이 참석한다: 시술을 수행하는 중재의사; 마취전문의 및 호흡기 기술자(들); 간호사 및 보조 의사; CT(또는 수술실) 기술자; 현장 조사 코디네이터. 약물 투여 전에, 요추 천자를 수행하여 미리 결정된 부피의 CSF를 제거한 다음 요오드화 조영제를 척수강내로(IT) 주사하여 대수조의 관련 해부학의 시각화를 돕는다. 정맥내(IV) 조영제는 척수강내 조영제에 대한 대안으로 바늘 삽입 전 또는 도중에 투여될 수 있다. IV 또는 IT 조영제를 사용하려는 결정은 중재의사의 재량에 있다. 대상체를 마취시키고 삽관하고 시술대에 배치한다. 주사 부위를 멸균 기술을 사용하여 준비하고 멸균한 천으로 덮는다. 척수 바늘(22-25 G)을 형광투시 지침 하에 대수조로 전진시킨다. 큰 유도 바늘을 사용하여 바늘 배치를 보조할 수 있다. 바늘 배치를 확인한 후, 확장 세트를 척수 바늘에 부착하여 CSF로 채울 수 있게 한다. 중재의사의 재량에 따라, 조영제 물질을 함유하는 주사기를 확장 세트에 연결하고 소량을 주입하여 대수조에서 바늘 배치를 확인할 수 있다. 바늘 배치를 CT 지침 +/- 조영제 주사로 확인한 후, rAAV.GLB1 5.6 mL를 함유하는 주사기를 확장 세트에 연결한다. 주사기 조영제를 1-2 분에 걸쳐 서서히 주입하여, 5.0 mL의 부피를 전달한다. 바늘을 대상체에서 서서히 제거한다.
본원에 기재된 척수강내 방법에 대한 추가적 또는 대안적 투여 경로는 예를 들어, 전신, 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 또는 근육내 투여를 포함한다.
일 구현예에서, 용량은 CSF 구획 크기의 근사치를 제공하는 뇌 질량에 의해 조정될 수 있다. 추가 구현예에서, 용량 전환은 성체 마우스의 경우 0.4 g, 어린 레서스 마카크의 경우 90 g, 및 생후 4-18 개월 아이의 경우 800　g의 뇌 질량에 기초한다. 하기 표는 뮤린 MED 연구, NHP 독성학 연구, 및 동등한 인간 용량에 대한 예시적인 용량을 제공한다.
Figure pct00009
특정 구현예에서, rAAV.GLB1은 단일 용량으로 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 다중 용량(예를 들어 2 회 용량)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 6 개월 미만 유아의 경우, 며칠, 몇 주, 또는 몇 개월 간격으로 전달된 다중 용량이 바람직할 수 있다.
특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 약 1 x 109 GC/뇌 질량 g 내지 약 5 x 1011 GC/뇌 질량 g이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 약 1 x 109 GC/뇌 질량 g 내지 약 3 x 1011 GC이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 약 1 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 약 3 x 1011 GC/뇌 질량 g이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 용량은 1 x 1010 GC/뇌 질량 내지 3.33 x 1011 GC/뇌 질량이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 용량은 1 x 1011 GC/뇌 질량 내지 3.33 x 1011 GC/뇌 질량이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 1.11 Х 1010 GC/뇌 질량 g 내지 3.33 Х 1011 GC/뇌 질량 g이다.
특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 1 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 3.4 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 1.0 x 1011 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 약 1.1 x 1011 GC/뇌 질량 g이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 적어도 1.11 Х 1010 GC/뇌 질량 g이다. 다른 구현예에서, 상이한 용량이 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 대상체는 인간 환자이다. 이 경우, rAAV.GLB1의 단일 용량은 약 1 x 1012 GC 내지 약 3 x 1014 GC이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 9 x 1012 GC 내지 3 x 1014 GC이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 용량은 5 x 1013 GC 내지 3 x 1014 GC이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 8.90 Х 1013 GC 내지 2.70 Х 1014 GC이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 환자 당 8 x 1012 게놈 카피(GC) 내지 환자 당 3 x 1014 GC이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 환자 당 2 x 1013 GC 내지 환자 당 3 x 1014 GC이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 환자 당 8 x 1013 GC 내지 환자 당 3 x 1014 GC이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 환자 당 약 9 x 1013 GC이다. 특정 구현예에서, rAAV.GLB1의 단일 용량은 적어도 8.90 x 1013 GC이다. 다른 구현예에서, 상이한 용량이 선택될 수 있다.
조성물은 약 1 x 109 게놈 카피(GC) 내지 약 5 x 1014 GC(체중 70 kg의 평균 대상체를 치료하기 위해) 범위에 있는 AAV의 양을 함유하도록 투여량 단위로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 1 x 109 게놈 카피(GC) 내지 5 x 1013 GC; 1 x 1010 게놈 카피(GC) 내지 5 x 1014 GC; 1 x 1011 GC 내지 5 x 1014 GC; 1 x 1012 GC 내지 5 x 1014 GC; 1 x 1013 GC 내지 5 x 1014 GC; 8.9 x 1013 GC 내지 5 x 1014 GC; 또는 8.9 x 1013 GC 내지 2.7 x 1014 GC 범위의 AAV의 양을 함유하도록 투여량 단위로 제형화된다. 특정 구현예에서, 조성물은 적어도 1 x 1013 GC, 2.7 x 1013 GC, 또는 8.9 x 1013 GC로 AAV의 양을 함유하도록 투여량 단위로 제형화된다.
일 구현예에서, 약 15 mL(이하) 내지 약 40 mL CSF가 제거되고 rAAV.GLB1이 CSF와 혼합되고/되거나 호환가능한 담체에 현탁되고 대상체에게 전달되는 척추 천자가 수행된다. 일 예에서, rAAV.GLB1 농도는 1 x 1010 게놈 카피(GC) 내지 5 x 1014 GC; 1 x 1011 GC 내지 5 x 1014 GC; 1 x 1012 GC 내지 5 x 1014 GC; 1 x 1013 GC 내지 5 x 1014 GC; 8.9 x 1013 GC 내지 5 x 1014 GC; 또는 8.9 x 1013 GC 내지 2.7 x 1014 GC, 그러나 약 1 x 109 GC, 약 5 x 109 GC, 약 1 x 1010 GC, 약 5 x 1010 GC, 약 1 x 1011 GC, 약 5 x 1011 GC, 약 1 x 1012 GC, 약 5 x 1012 GC, 약 1.0 x 1013 GC, 약 5 x 1013 GC, 약 1.0 x 1014 GC, 또는 약 5 x 1014 GC와 같은 다른 양이다. 특정 구현예에서, GC의 농도는 척추 천자 당 GC로 예시된다. 특정 구현예에서, CG의 농도는 mL 당 GC로 예시된다.
공동 요법은 본원에 제공된 rAAV.GLB1 조성물과 함께 전달될 수 있다. 본 출원에서 앞서 기재된 것과 같은 공동 요법이 본원에 참조로 포함된다.
이러한 공동 요법 중 하나는 면역 조절제일 수 있다. 이러한 공동 요법을 위한 면역억제제는 글루코코르티코이드, 스테로이드, 항대사물, T-세포 억제제, 마크롤라이드(예를 들어, 라파마이신 또는 라파로그), 및 알킬화제, 항대사물, 세포독성 항생제, 항체, 또는 이뮤노필린에 대한 활성 제제를 포함하는 세포정지제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 면역 억제제는 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체-(CD25-) 또는 CD3-유도 항체, 항-IL-2 항체, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α(종양 괴사 인자-알파) 결합제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역억제 요법은 유전자 요법 투여 전에 시작될 수 있다. 이러한 요법은 동일한 날에 2 개 이상의 약물(예를 들어, 프레드넬리손, 미코페놀레이트 모페틸(MMF) 및/또는 시롤리무스(즉, 라파마이신))의 공투여를 수반할 수 있다. 이들 약물 중 하나 이상은 유전자 요법 투여 후, 동일한 용량 또는 조정된 용량으로 계속될 수 있다. 이러한 요법은 필요에 따라 약 1 주, 약 15 일, 약 30 일, 약 45 일, 60 일 동안, 또는 그 이상일 수 있다.
예를 들어, GM1에서 영양이 우려되는 경우, 위루형성술 관 배치가 적절하다. 호흡기 기능이 악화됨에 따라, 기관절개 또는 비침습적 호흡 지원이 제공된다. 휠체어 및 다른 장비가 삶의 질을 개선시킬 수 있다.
단어 "포함하다", "포함한다", 및 "포함하는"은 배타적이기 보다는 포괄적으로 해석되어야 한다. 단어 "이루어지다", "이루어진", 및 이의 변이는 포괄적이기 보다는 배타적으로 해석되어야 한다. 명세서에서 다양한 구현예가 "포함하는" 언어를 사용하여 제시되지만, 다른 상황 하에, 관련된 구현예는 또한 "로 이루어진" 또는 "로 본질적으로 이루어진" 언어를 사용하여 해석되고 기재되도록 의도된다.
용어 "발현"은 가장 광범위한 의미로 본원에 사용되며 RNA 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩티드 또는 단백질의 생산과 관련된다. 발현은 일시적일 수 있거나 또는 안정적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "NAb 역가"는 표적화된 에피토프(예를 들어, AAV)의 생리적 효과를 중화시키는 중화 항체(예를 들어, 항-AAV Nab)가 얼마나 많이 생산되는지에 대한 측정치이다. 항-AAV NAb 역가는 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381-390에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, AAV 또는 조성물의 투여는 GM1 강글리오시드증의 증상을 개선시키거나, 또는 GM1 강글리오시드증의 신경학적 증상을 개선시켰다. 일부 구현예에서, 치료 후에, 환자는 평균 수명 증가, 영양관 필요성 감소, 발작 발생 및 빈도 감소, 신경인지적 저하로의 진행 감소 및/또는 신경인지적 발달 개선 중 하나 이상을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현 카세트"는 코딩 서열, 프로모터를 포함하고, 이에 대한 다른 조절 서열을 포함할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 2 개 이상의 발현 카세트를 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 용어 "이식유전자"는 "발현 카세트"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 바이러스 벡터를 생성하기 위한 이러한 발현 카세트는 바이러스 게놈 및 본원에 기재된 것들과 같은 다른 발현 제어 서열의 패키징 신호가 측면에 있는 본원에 기재된 유전자 산물에 대한 코딩 서열을 함유한다.
단백질 또는 핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "이종"은 단백질 또는 핵산이 사실상 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 전형적으로 재조합적으로 생산되며 새로운 기능적 핵산을 제조하도록 배열된 관련없는 유전자로부터의 2 개 이상의 서열을 갖는다. 예를 들어, 일 구현예에서, 핵산은 상이한 유전자로부터 코딩 서열의 발현을 지시하도록 배열된 하나의 유전자로부터의 프로모터를 갖는다. 따라서, 코딩 서열과 관련하여, 프로모터는 이종이다.
"복제-결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 유전자(예를 들어, GLB1)를 함유하는 발현 카세트를 포함하는 벡터 게놈이 바이러스 캡시드(예를 들어, AAV 또는 보카바이러스) 또는 외피에 패키징 되어 있는 합성 또는 인공 바이러스 입자를 지칭하며, 여기서 바이러스 캡시드 또는 외피 내에 또한 패키징된 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제 결함이며; 즉, 자손 비리온을 생성할 수 없지만 표적 세포를 감염시키는 능력을 유지한다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하지 않지만(게놈은 인공 게놈의 증폭 및 패키징에 필요한 신호가 측면에 있는 관심 유전자만을 함유하는 "실질이 없는" 것으로 조작될 수 있음), 이들 유전자는 생산 동안 공급될 수 있다. 따라서, 복제에 필요한 바이러스 효소의 존재를 제외하고 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 발생할 수 없으므로 유전자 요법에 사용하기에 안전한 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, "유효량"은 벡터 게놈으로부터 유전자 산물의 양을 표적 세포에서 전달 및 발현하는 rAAV 조성물의 양을 지칭한다. 유효량은 인간 환자 보다는 동물 모델에 기초하여 결정될 수 있다. 적합한 뮤린 또는 NHP 모델의 예가 본원에 기재되어 있다.
용어 "단수형"은 하나 이상, 예를 들어, "인핸서"를 지칭하며, 하나 이상의 인핸서(들)를 나타내는 것으로 이해된다는 점에 유의해야 한다. 이와 같이, 용어 단수형, "하나 이상," 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
상기 기재된 바와 같이, 수치 값을 한정하는 데 사용될 때 용어 "약"은 달리 명시되지 않는 한 ±10% 변동을 의미한다.
상기 기재된 바와 같이, 용어 "증가하다" "감소하다" "줄이다" "개선하다" "향상시키다" "지연시키다" "초기에" "늦추다" "중지하다" 또는 이의 임의의 문법적 변이, 또는 변경을 나타내는 임의의 유사한 용어는 달리 명시되지 않는 한 상응하는 참조(예를 들어, 미치료된 대조군, GM1 환자 또는 특정 단계의 GM1 환자 또는 건강한 대상체 또는 GM1이 없는 건강한 대상체의 상응하는 수준)에 비해 약 5 배, 약 2 배, 약 1 배, 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5%의 변동을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "환자" 또는 "대상체"는 인간, 수의학 또는 농장 동물, 가축 또는 애완동물, 및 임상 연구에 일반적으로 사용되는 동물을 포함한 포유류 동물을 지칭한다. 일 구현예에서, 이들 방법 및 조성물의 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 환자는 GM1이 있다.
본 명세서에 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 및 공개된 텍스트를 참조하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지며, 본 출원에 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 지침과 함께 당업자에게 제공된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시이며 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1: AAVhu68 + 탈아미드화
변형에 대해 AAVhu68을 분석하였다. 간단히 말해서, AAVhu68을 이 연구와 관련되지 않은 벡터 게놈을 사용하여 생산하였으며, 각각을 293 세포에서 통상적인 삼중 형질감염 방법을 사용하여 생산하였다. 이러한 기술에 대한 일반적인 설명을 위해, 예를 들어, Bell CL, et al., The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. J Clin Invest. 2011;121:2427-2435를 참조한다. 간단히 말해서, 예를 들어, AAV2 도립 말단 반복부가 측면에 있는 패키징될 서열을 암호화하는 플라스미드(닭 β-액틴 프로모터, 인트론 및 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 유전자로부터 유래된 폴리 A로부터 발현된 이식유전자)를 AAV2 rep 유전자 및 AAVhu68 cap 유전자를 암호화하는 플라스미드 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(pAdΔF6)로 HEK293 세포를 삼중 형질감염시켜 패키징하였다. 생성된 AAV 바이러스 입자를 CsCl 구배 원심분리를 사용하여 정제하고 농축하고 나중에 사용하기 위해 동결시킬 수 있다.
변성 및 알킬화: 해동된 바이러스 제제(단백질 용액) 100 μg에 1M 디티오트레이톨(DTT) 2 μl 및 8M 구아니딘 하이드로클로라이드(GndHCl) 2μl를 첨가하고 90℃에서 10 분 동안 배양한다. 용액을 실온으로 냉각시킨 다음 신선하게 제조된 1M 요오도아세트아미드(IAM) 5μl를 첨가하고 암실에서 30 분 동안 실온에서 배양한다. 30 분 후, 1M DTT 1 μl를 첨가하여 알킬화 반응을 급랭한다.
소화: 변성된 단백질 용액에 20mM 암모늄 비카르보네이트, pH 7.5-8을 최종 GndHCl 농도를 800mM로 희석하는 부피로 첨가한다. 트립신 용액을 1:20 트립신 대 단백질 비로 첨가하고 37℃에서 밤새 배양한다. 소화 후, TFA를 최종 0.5%로 첨가하여 소화 반응을 급랭한다.
질량 분광법: 조합된 소화 혼합물 대략 1 마이크로그램을 UHPLC-MS/MS에 의해 분석한다. LC를 UltiMate 3000 RSLCnano System(Thermo Scientific)에서 수행한다. 이동상 A는 0.1% 포름산을 함유한 MilliQ 물이다. 이동상 B는 0.1% 포름산을 함유한 아세토니트릴이다. LC 구배를 15 분에 걸쳐 4% B에서 6% B, 이어서 25 분 동안 10% B로 실행한 다음(총 40 분), 46 분 동안 30% B로 실행한다(총 86 분). 샘플을 칼럼에 직접 로딩한다. 칼럼 크기는 75 cm x 15 um I.D.이고 2 미크론 C18 매질(Acclaim PepMap)로 패킹한다. LC는 소스를 사용하는 나노플렉스 전기분무 이온화를 통해 4중극-Orbitrap 질량 분광계(Q-Exactive HF, Thermo Scientific)에 연결된다. 칼럼을 35℃로 가열하고 2.2 kV의 전기분무 전압을 인가한다. 질량 분광계를 상위 20 개 이온에서 탠덤 질량 스펙트럼을 획득하도록 프로그래밍한다. 전체 MS 분해능은 120,000이고 MS/MS 분해능은 30,000이다. 정규화된 충돌 에너지를 30으로 설정하고, 자동 이득 조절을 1e5로 설정하고, 최대 충전 MS를 100 ms로 설정하고, 최대 충전 MS/MS를 50 ms로 설정한다.
데이터 처리: 질량 분광계 RAW 데이터 파일을 BioPharma Finder 1.0(Thermo Scientific)으로 분석하였다. 간단히 말해서, 모든 검색은 10 ppm 전구체 질량 허용오차, 5ppm 단편 질량 허용오차, 트립신 절단, 최대 1 회 누락된 절단, 시스테인 알킬화의 고정된 변형, 메티오닌/트립토판 산화의 가변 변형, 아스파라긴/글루타민 탈아미드화, 인산화, 메틸화, 및 아미드화가 필요하였다.
하기 표에서, T는 트립신을 지칭하고 C는 키모트립신을 지칭한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
AAVhu68 캡시드 단백질의 경우, 4 개의 잔기(N57, N329, N452, N512)가 일상적으로 >70%의 탈아미드화 수준을 나타내며 대부분의 경우 다양한 로트에 걸쳐 >90%를 나타낸다. 추가의 아스파라긴 잔기(N94, N253, N270, N304, N409, N477, 및 Q599)가 또한 다양한 로트에 걸쳐 최대 ~20%의 탈아미드화 수준을 나타낸다. 탈아미드화 수준은 처음에 트립신 소화를 사용하여 식별하였고 키모트립신 소화로 검증하였다.
따라서, AAVhu68 캡시드 단백질을 포함하는 AAV는 AAV가 상이한 수준의 탈아미드화를 나타내는 AAVhu68 캡시드 단백질을 함유할 수 있기 때문에 캡시드 단백질의 이종 집단을 포함할 수 있다. 다양한 수준의 탈아미드화를 갖는 AAVhu68 vp1 단백질의 이종 집단은 서열번호:2의 1 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생산된 vp1 단백질, 서열번호: 1로부터 생산된 vp1 단백질, 또는 서열번호:2의 1 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호:1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp1 단백질일 수 있다. 다양한 수준의 탈아미드화를 갖는 AAVhu68 vp2 단백질의 이종 집단은 서열번호:2의 적어도 약 아미노산 138 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생산된 vp2 단백질, 서열번호:1의 적어도 뉴클레오티드 412 내지 2211을 포함하는 서열로부터 생성된 vp2 단백질, 또는 서열번호:2의 적어도 약 아미노산 138 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호:1의 적어도 뉴클레오티드 412 내지 2211과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp2 단백질일 수 있다. 다양한 수준의 탈아미드화를 갖는 AAVhu68 vp3 단백질의 이종 집단은 서열번호:2의 적어도 약 아미노산 203 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생산된 vp3, 서열번호:1의 적어도 뉴클레오티드 607 내지 2211을 포함하는 서열로부터 생성된 vp3 단백질, 또는 서열번호:2의 적어도 약 아미노산 203 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호:1의 적어도 뉴클레오티드 607 내지 2211과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp3 단백질일 수 있다.
성체 레서스 마카크는 ICM-투여된 AAVhu68.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG(3.00 x 1013 GC)였고 28 일 후에 부검하여 벡터 형질도입을 평가하였다. AAVhu68의 형질도입을 뇌의 광범위한 영역에서 관찰하였다(데이터는 제시되지 않음). 따라서, AAVhu68 캡시드는 CNS에서 교차 교정 가능성을 제공한다.
실시예 2: 제조 - 성분 및 재료
벡터를 사이토메갈로바이러스 인핸서(CB7)가 있는 닭 베타 액틴 프로모터 [서열번호: 10], 인간 신장 개시 인자 1 알파 프로모터(EF1a) [서열번호: 11] 또는 AAV2 도립 말단 반복부가 측면에 있는 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UbC) [서열번호: 9] (1229bp, GenBank #D63791.1)]로부터 발현된 인간 GLB1에 대한 코딩 서열을 함유하는 시스-플라스미드로부터 구축한다. 인간 GLB1에 대한 다양한 코딩 서열 [서열번호: 4의 aa 서열]을 구축한다. 야생형 서열은 서열번호: 5에서 재현된다. 다양한 조작된 GLB1 코딩 서열을 생성하였고 서열번호: 6, 7, 또는 8로 제공한다.
벡터를 부착성 HEK 293 세포의 삼중 형질감염에 의해 AAV 혈청형 hu68 캡시드에 패키징하고 이전에 Lock, M., et al. Rapid, Simple, and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy 21, 1259-1271 (2010)에 기재된 바와 같이 요오딕사놀 구배 원심분리에 의해 정제한다. AAV 혈청형 Hu68 캡시드는 전문이 본원에 참조로 포함된 WO2018/160582에 기재되어 있다.
보다 특히, 인간 HEK293 WCB 세포를 다음으로 삼중 플라스미드 형질감염시켜 AAVhu68.GLB1을 생산한다: 1) AAV 시스 벡터 게놈 플라스미드, 2) pAAV2/hu68.KanR로 명명된 AAV2 레플리카제(rep) 및 AAVhu68 캡시드(cap)를 암호화하는 AAV 트랜스 플라스미드, 및 3) pAdΔF6.KanR로 명명된 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드.
AAV 시스 벡터 게놈 플라스미드의 서열 요소 설명:
ㆍ 도립 말단 반복부(ITR): ITR은 벡터 게놈의 모든 성분이 측면에 있는 AAV2(130bp, GenBank # NC001401)로부터 유래된 동일한 역 상보적 서열이다. ITR 서열은 AAV 및 아데노바이러스 헬퍼 기능이 트랜스에 제공될 때 벡터 게놈의 벡터 DNA 복제 기점 및 패키징 신호 둘 다로 기능한다. 이와 같이, ITR 서열은 벡터 게놈 복제 및 패키징에 필요한 유일한 시스 서열을 나타낸다.
ㆍ 프로모터: 인간 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터로부터 유래된 조절 요소: 이 유비쿼터스 프로모터(1229 bp, GenBank #D63791.1)를 선택하여 임의의 CNS 세포 유형에서 이식유전자 발현을 구동시켰다.
ㆍ 코딩 서열: 최대화된 인간 코돈 사용에 기초한 GLB1 유전자는 베타-갈락토시다제를 암호화한다. GLB1 효소는 강글리오시드로부터 β-연결된 갈락토스(2034 bp, 677 aa, Genbank #AAA51819.1, EC3.2.1.23)의 가수분해를 촉매한다.
ㆍ 키메라 인트론(CI) - 인간 베타-글로빈 스플라이스 공여자 및 면역글로불린 G(IgG) 스플라이스 수용자 요소로 이루어진 하이브리드 인트론
ㆍ SV40 폴리아데닐화 신호(239 bp, Genbank # KP659662.1): SV40 폴리아데닐화 신호는 시스에서 유전자 mRNA의 효율적인 폴리아데닐화를 용이하게 한다. 이 요소는 전사 종결, 초기 전사체의 3' 단부에서의 특이적 절단 사건 및 긴 폴리아데닐 꼬리의 첨가를 위한 신호로 기능한다.
AAVhu68 트랜스 플라스미드: pAAV2/hu68.KanR
AAV2/hu68 트랜스 플라스미드 pAAV2/hu68.KanR을 펜실베니아 대학교 James M. Wilson 박사의 실험실에서 구축하였다. AAV2/hu68 트랜스 플라스미드는 AAV 벡터 게놈의 복제 및 패키징에 필요한 4 개의 야생형(WT) AAV2 레플리카제(Rep) 단백질을 암호화한다. AAV2/hu68 트랜스 플라스미드는 또한 3 개의 WT AAVhu68 비리온 단백질 캡시드(Cap) 단백질을 암호화하며, AAV 벡터 게놈을 수용하기 위해 AAV 혈청형 hu68의 비리온 셸로 어셈블리한다. AAVhu68 서열은 인간 심장 조직 DNA로부터 수득하였다.
AAV2/hu68 트랜스 플라스미드를 생성하기 위해, pBluescript KS 벡터로부터 유래된 플라스미드 백본 상의 야생형 AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자를 암호화하는 플라스미드 pAAV2/9n으로부터 AAV9 cap 유전자를 제거하고 AAVhu68 cap 유전자로 대체하였다. 암피실린 내성(AmpR) 유전자를 또한 카나마이신 내성(KanR) 유전자로 대체하여, pAAV2/hu68.KanR을 생성하였다. 정상적으로 rep 발현을 구동하는 AAV p5 프로모터를 rep의 5'단부에서 cap의 3' 단부까지 이동시켜, rep의 상류에 있는 절두된 p5 프로모터를 뒤에 남긴다. 이 절두된 프로모터는 rep 발현을 하향 조절하게 하여, 결과적으로, 벡터 생산을 최대화한다(도 1c). 플라스미드의 모든 성분 부분은 직접 서열분석에 의해 검증하였다.
pAd델타F6(KanR) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드
플라스미드 pAdDeltaF6(KanR)은 15,774 bp 크기이다. 플라스미드는 AAV 복제에 중요한 아데노바이러스 게놈 영역, 즉 E2A, E4, 및 VA RNA(아데노바이러스 E1 기능은 HEK293 세포에 의해 제공됨)를 함유하지만, 다른 아데노바이러스 복제 또는 구조적 유전자를 함유하지 않는다. 플라스미드는 아데노바이러스 도립 말단 반복부와 같은 복제에 주요한 시스 요소를 함유하지 않고 따라서 감염성 아데노바이러스가 생성되지 않을 것으로 예상된다. 플라스미드는 Ad5의 E1, E3 결실 분자 클론으로부터 유래되었다(pBHG10, pBR322 기반 플라스미드). 결실은 Ad5 DNA에 도입되어 불필요한 아데노바이러스 유전자의 발현을 제거하고 아데노바이러스 DNA의 양을 32kb에서 12kb까지 줄였다. 마지막으로, 암피실린 내성 유전자를 카나마이신 내성 유전자로 대체하여 pAdeltaF6(KanR)을 생성하였다. HEK293 세포에 존재하는 E1과 함께 이 플라스미드에 남아있는 E2, E4 및 VAI 아데노바이러스 유전자는 AAV 벡터 생산에 필요하다.
AAVhu68.GM1은 HEK293 세포의 일시적 형질감염 후 하류 정제에 의해 제조된다. 제조 공정 흐름도는 도 12a - 12b에 제시되어 있다. 생성물 제조에 들어가는 주요 시약은 흐름도의 좌측에 표시되어 있고 공정중 품질 평가는 흐름도의 우측에 도시되어 있다. 각 생산 및 정제 단계의 설명이 또한 제공되어 있다.
세포 배양 및 수확: 세포 배양 및 수확 제조 공정은 4 가지 주요 제조 단계를 포함한다: 세포 시딩 및 확장, 일시적 형질감염, 벡터 수확 및 벡터 정화(도 12a).
세포 시딩 및 확장: 완전히 특성화된 HEK293 세포주가 생산 공정에 사용된다.
일시적 형질감염: 대략적으로 4 일 성장 후(DMEM 배지 + 10% FBS), 세포 배양 배지를 신선한 무혈청 DMEM 배지로 교체하고 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)-기반 형질감염 방법을 사용하여 3 개의 생산 플라스미드로 형질감염시킨다. 처음에, 시스(벡터 게놈) 플라스미드, 트랜스(rep 및 cap 유전자) 플라스미드, 및 헬퍼 플라스미드를 GMP-등급 PEI(PEIPro HQ, PolyPlus Transfection SA)를 사용한 비로 함유하는 DNA/PEI 혼합물을 제조한다. 이 플라스미드 비는 소규모 최적화 연구에서 AAV 생산에 최적인 것으로 결정되었다. 잘 혼합한 후, 용액을 실온에서 최대 25 분 동안 방치시킨 다음, 무혈청 배지를 첨가하여 반응을 급랭하고, 마지막으로 iCELLis 생물반응기에 첨가한다. 반응기는 온도- 및 DO-제어되며, 세포를 5 일 동안 배양한다.
벡터 수확: 배지를 생물반응기에서 무균적으로 펌핑함으로써 일회용 생물공정 백을 사용하여 형질감염된 세포 및 배지를 PALL iCELLis 생물반응기로부터 수확한다. 수확 후, 세제, 엔도뉴클레아제, 및 MgCl2(엔도뉴클레아제에 대한 보조인자)를 첨가하여 벡터를 방출하고 패키징되지 않은 DNA를 소화시킨다. (일회용 생물공정 백 내의) 생성물을 37℃에서 2 시간 동안 온도-제어 일회용 믹서에서 배양하여 형질감염 절차의 결과로 수확물에 존재나는 잔류 세포 및 플라스미드 DNA의 효소적 소화에 충분한 시간을 제공한다. 이 단계를 수행하여 최종 벡터 약물 생성물(DP)에서 잔류 DNA 양을 최소화한다. 배양 후, NaCl을 500 mM의 최종 농도까지 첨가하여 여과 및 하류 접선 유동 여과(TFF) 동안 생성물의 회수를 돕는다.
벡터 정화: 연동 펌프에 의해 구동된 멸균 폐쇄형 튜빙 및 백 세트로서 직렬로 연결된 사전 필터 및 심층 필터 캡슐(1.2/0.22 μm)을 사용하여 생성물에서 세포 및 세포 파편을 제거한다. 정화는 하류 필터 및 크로마토그래피 칼럼이 오염으로부터 보호된다는 것을 보장하고 바이오버든(bioburden) 감소 여과는 여과 트레인의 끝에서, 상류 생산 공정 동안 잠재적으로 도입된 임의의 바이오버든이 하류 정제 전에 제거된다는 것을 보장한다.
정제 공정: 정제 공정은 4 가지 주요 제조 단계를 포함한다: TFF에 의한 농축 및 완충액 교환, 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 및 TFF에 의한 농축 및 완충액 교환. 이러한 공정 단계는 개요 공정 다이어그램에 도시되어 있다(도 12b). 이러한 공정 각각에 대한 일반적인 설명은 하기에 제공되어 있다.
대규모 접선 유동 여과: 정화된 생성물의 부피 감소(20-배)는 맞춤형 멸균 폐쇄형 생물공정 튜빙, 백 및 막 세트를 사용하여 TFF에 의해 달성된다. TFF 원리는 적합한 다공성(100 kDa)의 막에 평행한 압력 하에 용액을 흐르게 하는 것이다. 압력 차이는 막을 통해 더 작은 크기의 분자를 폐수 스트림으로 효과적으로 구동시키면서 막 기공보다 더 큰 분자를 유지한다. 용액을 재순환함으로써, 평행류가 막 표면을 휩쓸고 가서, 막에 대한 결합을 통해 막 기공 오염 및 생성물 손실을 방지한다. 적절한 막 기공 크기 및 표면적을 선택함으로써, 액체 샘플의 부피를 빠르게 감소시키면서 원하는 분자를 유지하고 농축할 수 있다. TFF 적용에서 정용여과는 액체가 막을 통해 폐수 스트림으로 통과하는 것과 동일한 속도로 재순환 샘플에 신선한 완충액을 첨가하는 것을 수반한다. 정용여과의 부피가 증가함에 따라, 더 많은 양의 소분자가 재순환 샘플에서 제거된다. 이 정용여과는 정화된 생성물의 적당한 정제를 초래하지만, 또한 후속 친화성 칼럼 크로마토그래피 단계와 호환가능한 완충액 교환을 달성한다. 따라서, 본 발명자들은 농축을 위해 100 kDa, PES 막을 활용한 다음 20 mM Tris pH 7.5 및 400 mM NaCl로 구성된 최소 4 정용부피의 완충액으로 정용여과한다. 그 다음에 정용여과된 생성물을 1.2/0.22 μm 심층 여과 캡슐로 추가로 정화하여 임의의 침전된 물질을 제거한다.
친화성 크로마토그래피: 정용여과된 생성물을 AAVhu68 혈청형을 효율적으로 포획하는 PorosTM Capture-SelectTM AAV 친화성 수지(Life Technologies)에 적용한다. 이러한 이온성 조건 하에, 상당한 백분율의 잔류 세포 DNA 및 단백질을 칼럼을 통해 흘려보내면서, AAV 입자를 효율적으로 포획한다. 적용 후, 칼럼을 5 부피의 저염 엔도뉴클레아제 용액(250 U/mL 엔도뉴클레아제, 20 mM Tris pH 7.5 and 40 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2)으로 처리하여 임의의 남아있는 숙주 세포 및 플라스미드 핵산을 제거한다. 칼럼을 세척하여 추가의 공급 불순물을 제거한 후 낮은 pH 단계 용리(400 mM NaCl, 20 mM 나트륨 시트레이트, pH 2.5)을 수행하여 중화 완충액(200 mM Bis Tris 프로판, pH 10.2)의 1/10 부피를 수집하여 즉시 중화한다.
음이온 교환 크로마토그래피: 빈 AAV 입자를 포함한 공정중 불순물의 추가 감소를 달성하기 위해, Poros AAV 용리 풀을 50-배 희석하여(20 mM Bis Tris 프로판, 0.001% Pluronic F68, pH 10.2) 이온 강도를 감소시키고 CIMultusTM QA 모노리스 매트릭스(BIA Separations)에 대한 결합을 가능하게 한다. 저염 세척 후, 벡터 생성물을 60 칼럼 부피(CV) NaCl 선형 염 구배(10-180 mM NaCl)를 사용하여 용리한다. 이 얕은 염 구배는 벡터 게놈을 함유하는 입자(전체 입자)에서 벡터 게놈이 없는 캡시드 입자(빈 입자)를 효율적으로 분리하고 전체 입자에 대해 풍부화된 제제를 생성한다. 전체 입자 피크 용리액을 수집하고, 중화하고 20 mM Bis Tris 프로판, 0.001% Pluronic F68, pH 10.2에서 20-배 희석하고 그 자리에서 세정된 동일한 칼럼에 다시 적용한다. 10-180 mM NaCl 염 구배를 다시 적용하고 적절한 완전 입자 피크를 수집한다. 피크 면적을 평가하고 대략적인 벡터 수율을 결정하기 위해 이전 데이터와 비교한다.
중공 섬유 접선 유동 여과에 의한 농축 및 완충액 교환: 풀링된 음이온 교환 중간체를 농축하고, TFF를 사용하여 완충액을 교환한다. 이 단계에서, 100 kDa 막 중공 섬유 TFF 막을 사용한다. 이 단계 동안, 생성물을 표적 농도로 만든 다음 완충액을 척수강내 최종 제형 완충액(ITFFB, 즉, 0.001% Pluronic® F68을 함유한 인공 CSF)으로 교환한다. 생성물을 멸균 여과하고(0.22 μm), 멸균 용기에 저장하고, 최종 충전을 위해 방출할 때까지 격리 장소에서 ≤-60℃에서 동결시킨다.
최종 충전: 동결된 생성물을 해동하고, 풀링하고, 최종 제형 완충액을 사용하여 표적 농도(TFF를 통한 희석 및 농축 단계)로 조정한다. 생성물을 0.22 μm 필터를 통해 최종적으로 여과하고 결정할 충전 부피로 멸균 West Pharmaceutical's Crystal Zenith(환형 올레핀 중합체) 바이알 및 클림프 씰이 있는 마개에 충전한다. 바이알을 개별적으로 라벨링한다. 라벨링된 바이알을 ≤-60℃에서 저장한다.
실시예 3
인간 β-gal을 발현하는 최적화된 AAV 벡터를 개발하였고 CSF에 벡터 투여의 영향을 뮤린 질환 모델을 사용하여 뇌 효소 활성, 리소좀 저장 병변 및 신경학적 징후에 대해 평가하였다.
A. 재료 및 방법:
동물 절차: 모든 동물 절차는 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. GLB1 녹다운(knockout) 마우스는 RIKEN BioResource Research Center에서 수득하였다. 마우스는 C57BL/6J 배경에서 이형접합 담체로 유지하였다. ICV 주사를 위해, 벡터를 멸균 포스페이트 완충 염수(Gibco)에 5 μL의 부피로 희석하였고, 3 mm 깊이로 침투를 제한하기 위해 바늘 베이스에 부착된 플라스틱 튜빙과 함께 맞춤형 기밀 주사(Hamilton) 및 접합된 10 mm 27-게이지 바늘을 사용하여 이소플루란 마취된 마우스에 손으로만 주사를 수행하였다. 이소플루란 마취된 마우스에서 턱밑 혈액 수집을 수행하였다. 혈액을 혈청 분리기 튜브에 수집하고, 응고시키고, 원심분리에 의해 분리한 후 분취하고 ≤-60℃에서 동결시켰다. 부검 시, 마우스를 케타민 및 크실라진으로 진정시키고 폴리에틸렌 튜빙에 연결된 32-게이지 바늘을 사용하여 후두하 천자에 의해 CSF를 수집하였다. 경추 탈구에 의해 안락사를 수행하였다. CSF, 심장, 폐, 간 및 비장을 드라이 아이스에 즉시 동결시키고 ≤-60℃에서 저장하였다. 뇌를 제거하고, 전두엽의 관상 슬라이스를 수집하고 생화학 연구를 위해 동결하였다. 나머지 뇌를 조직학적 분석에 사용하였다.
벡터는 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 생성하였다.
빈:전체 입자 비: 벡터 샘플을 12 mm 광학 경로 길이의 2-채널 차콜-에폰 조각이 있는 셀에 로딩한다. 공급된 희석 완충액을 각 셀의 참조 채널에 로딩한다. 그 다음에 로딩된 셀을 AN-60Ti 분석 로터에 배치하고 흡광도 및 RI 검출기가 장착된 Beckman-Coulter ProteomeLab XL-I 분석 원심분리기에 로딩한다. 20℃에서 전체 온도 보정 후, 로터를 12,000 rpm의 최종 실행 속도로 작동시킨다. 280 nm 스캔에서의 흡광도를 대략 5.5 시간 동안 대략 3 분 마다 기록한다(각 샘플에 대해 총 110 회 스캔). 원시 데이터를 c(s) 방법을 사용하여 분석하고 분석 프로그램 SEDFIT에서 구현한다. 생성된 크기 분포를 그래프로 표시하고 피크를 통합한다. 각 피크와 연관된 백분율 값은 모든 피크하 총 면적의 피크 면적 분율을 나타내고 280 nm에서 생성된 원시 데이터에 기초하며; 많은 실험실은 이들 값을 사용하여 빈:전체 입자 비를 계산한다. 그러나, 빈 입자 및 전체 입자는 이 파장에서 상이한 흡광 계수를 갖기 때문에, 이에 따라 원시 데이터를 조정할 수 있다. 흡광 계수 조정 전 및 후의 빈 입자 및 전체 단량체 피크 값의 비를 사용하여 빈:전체 입자 비를 결정한다.
복제 가능 AAV 검정: 샘플을 생산 공정 동안 잠재적으로 일어날 수 있는 복제 가능 AAV2/hu68(rcAAV)의 존재에 대해 분석한다. 세포-기반 성분은 HEK293 세포(P1)의 단일 층을 테스트 샘플 및 야생형(WT) 인간 아데노바이러스 5형(Ad5)의 희석액으로 접종하는 것으로 이루어진다. 테스트된 생성물의 최대 양은 벡터 생성물의 1.0 x 1010 GC이다. 아데노바이러스의 존재로 인해, rcAAV는 세포 배양물에서 증폭된다. 2 일 후, 세포 용해물이 생성되고 Ad5는 열-비활성화된다. 그 다음에 정화된 용해물을 두번째 라운드의 세포(P2)로 전달하여 민감도를 향상시킨다(다시 Ad5의 존재 하에). 2 일 후, 세포 용해물이 생성되고, Ad5는 열-비활성화된다. 그 다음에 정화된 용해물을 세번째 라운드의 세포(P3)로 전달하고 민감도를 최대화한다(다시 Ad5의 존재 하에). 2 일 후, 세포를 용해하여 DNA를 방출한 다음, qPCR에 적용하여 AAVhu68 cap 서열을 검출한다. Ad5-의존적 방식으로 AAVhu68 cap 서열의 증폭은 rcAAV의 존재를 나타낸다. AAV2 rep 및 AAVhu68 cap 유전자를 함유하는 AAV2/hu68 대리 양성 대조군의 사용은 결정될 검정의 검출 한계를 가능하게 한다(0.1, 1, 10, 및 100 IU). rAAV(1.0 Х1010, 1.0 x 109, 1.0 x 108, 및 1.0 x 107 GC)의 연속 희석을 사용하여, 테스트 샘플에 존재하는 rcAAV의 대략적인 양을 정량화할 수 있다.
시험관내 효능: ddPCR GC 역가를 유전자 발현과 관련시키기 위해, 시험관내 관련 효능 생물검정을 수행한다. 간단히 말해서, 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 37℃/5% CO2에서 밤새 배양한다. 다음 날, 세포를 연속으로 희석된 AAV 벡터로 감염시키고 최대 3 일 동안 37℃/5% CO2에서 배양한다. 세포 상청액을 수집하고 형광생성 기질의 절단에 기초하여 β-gal 활성에 대해 분석한다.
총 단백질, 캡시드 단백질, 단백질 순도 및 캡시드 단백질 비: 벡터 샘플을 먼저 비신코닌산(BCA) 검정을 사용하여 소 혈청 알부민(BSA) 단백질 표준 곡선에 대한 총 단백질을 정량화한다. 샘플의 동일한 부분을 키트에 제공된 Micro-BCA 시약과 혼합하여 결정한다. 동일한 절차를 BSA 표준의 희석에 적용한다. 혼합물을 60°C에서 배양하고 흡광도를 562 nm에서 측정한다. 표준 곡선은 4-매개변수 맞춤을 사용하여 알려진 농도의 표준 흡광도에서 생성된다. 알려지지 않은 샘플을 4-매개변수 회귀에 따라 정량화한다. rAAV 순도의 반정량적 결정을 제공하기 위해, 샘플을 게놈 역가에 대해 정규화하고, 5.0 x 109 GC를 환원 조건 하에 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분리한다. 그 다음에 SDS-PAGE 겔을 SYPRO Ruby 염료로 염색한다. 임의의 불순물 밴드를 밀도계에 의해 정량화한다. 3 개의 AAV-특이적 단백질(VP1, VP2, 및 VP3) 이외에 보이는 염색된 밴드는 단백질 불순물로 간주된다. 불순물 질량 퍼센트 뿐만 아니라 오염 밴드의 대략적인 분자량을 기록한다. 또한 SDS-PAGE 겔을 사용하여 VP1, VP2, 및 VP3 단백질을 정량화하고 비율을 결정한다.
효소 활성 검정: 조직을 강철 비드 균질기(TissueLyzer, Qiagen)를 사용하여 0.9% NaCl, pH 4.0에서 균질화하였다. 3 회 동결-해동 주기 후, 샘플을 원심분리에 의해 정화하였고 단백질 함량을 BCA 검정에 의해 정량화하였다. 혈청 샘플을 효소 검정에 직접 사용하였다. β-gal 활성 검정을 위해, 1 μL 샘플을 0.15 M NaCl, 0.05% Triton-X100, 0.1 M 나트륨 아세테이트, pH 3.58 중 0.5 mM 4-메틸움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드(Sigma M1633) 99 μL와 조합하였다. 반응물을 37℃에서 30 분 동안 배양한 다음, 290 mM 글리신, 180 mM 나트륨 시트레이트, pH 10.9 150 μL를 첨가하여 중단시켰다. 형광을 4MU의 표준 희석과 비교하였다. β-gal 활성은 단백질(조직) mg 당 또는 혈청 또는 CSF ml 당 시간 당 유리된 4MU nmol로 표현한다. 기질로서 1 mM 4-메틸움베릴페릴 N-아세틸-β-D-글루코사미니드(Sigma M2133) 및 조직 용해물의 경우 1 μL 및 혈청의 경우 2 μL의 샘플 부피를 사용하여 HEX 검정을 β-gal 활성 검정과 동일한 방식으로 수행하였다.
조직학: 뇌를 4% 파라포름알데히드에서 밤새 고정하고, 15% 및 30% 수크로스에서 평형화한 다음, OCT 포매 배지에서 동결시켰다. 동결절편을 필리핀(filipin)(Sigma, 10 μg/mL) 또는 GFAP 또는 LAMP1에 대한 항체로 염색하였다.
항-β-gal 항체 ELISA: 고결합 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 PBS 중 1 μg/mL 농도의 재조합 인간 β-gal(R&D Systems)로 웰 당 100 μL로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 2 시간 동안 실온에서 PBS 중 2% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 중복 웰을 PBS 중 1:1,000으로 희석된 혈청 샘플과 함께 1 시간 동안 실온에서 배양하였다. 플레이트를 세척하고, 차단 용액 중 1:5,000으로 희석된 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체와 함께 1 시간 동안 배양하고, TMB 기질을 사용하여 현상하였다.
보행 분석: 보행 분석운 제조업체의 지침에 따라 CatWalk XT 시스템(Noldus)을 사용하여 수행하였다. 마우스를 연속 2 일 동안 테스트하였다. 테스팅 당일에 각 동물에 대해 적어도 3 회 완료 시험을 획득하였다. 5 초 초과 지속된 시험, 또는 동물이 정지하거나 돌아서기 전에 장치의 전체 길이를 횡단하지 않았던 시험은 분석에서 제외하였다.
B. 결과:
사이토메갈로바이러스 인핸서(CB7)가 있는 닭 베타 액틴 프로모터, 인간 신장 개시 인자 1 알파 프로모터(EF1a) 또는 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UbC)에 의해 구동된 인간 GLB1 cDNA로 이루어진 이식유전자 카세트를 설계하였다. 각 카세트를 AAVhu68 캡시드에 패키징하였고, 단일 용량의 1011 게놈 카피(GC)를 뇌실내(ICV) 주사에 의해 야생형 마우스에게 투여하였다. 주사 2 주 후, β-gal 활성을 뇌 및 CSF에서 측정하였다(도 2a - 2b). UbC 프로모터를 운반하는 벡터는 뇌 및 CSF 모두에서 β-gal 활성의 통계적으로 유의한 상승을 달성하였으며, 효소 활성은 미처리된 야생형 마우스보다 뇌에서 거의 2-배, 및 CSF에서 10-배 더 컸다. 따라서 AAVhu68.UbC.hGLB1 벡터를 추가 연구를 위해 선택하였다.
최적화된 벡터의 효능을 GLB1-/- 마우스 모델에서 평가하였다. GM1 강글리오시드증의 마우스 모델은 네오마이신 내성 카세트를 GLB1 유전자의 6번째 및/또는 15번째 엑손에 표적화된 삽입시켜 개발하였다. Hahn, C.N., et al. Generalized CNS disease and massive GM1-ganglioside accumulation in mice defective in lysosomal acid beta-galactosidase. Human molecular genetic 6, 205-211 (1997) 및 Matsuda, J., et al. Beta-galactosidase-deficient mouse as an animal model for GM1-gangliosidosis. Glycoconjugate journal 14, 729-736 (1997). 유아 GM1 강글리오시드증 환자와 유사하게, 이들 마우스는 기능적 β-gal을 발현하지 않고 뇌에서 GM1 강글리오시드의 빠른 축적을 나타낸다. 뇌 GM1 저장은 생후 첫 주에 이미 명백하며, 생후 3 개월까지, GLB1-/- 마우스는 8 개월령 유아 GM1 환자와 유사한 정도로 뇌에서 GM1 축적을 갖는다(Hahn 1997, 상기 인용됨). GLB1-/- 마우스의 임상 표현형은 유아 GM1 강글리오시드증의 임상 표현형을 가장 밀접하게 모델링하며, 생후 4 개월까지 운동 이상을 보이고 생후 10 개월까지 안락사를 필요로 하는 중증 신경학적 증상(예를 들어, 운동실조 또는 마비)을 제시한다(Hahn 1997; Matsuda 1997, 상기 인용됨). 종종 골 기형 및 간비장비대가 발생하는 유아 GM1 환자와는 달리 GLB1-/- 마우스 모델은 임의의 말초 기관 병발을 나타내지 않는다(Hahn 1997; Matsuda 1997, 상기 인용됨. 따라서 GLB1-/- 마우스는 유아 GM1 강글리오시드증의 신경학적 특징의 대표적인 모델이지만, 전신 질환 징후는 아니다.
GLB1-/- 마우스를 생후 1 개월에 처리하고, 전형적으로 진행성 질환이 있는 유아 GM1 강글리오시드증 환자와 유사한 뇌 GM1 수준과 연관된 현저한 보행 이상이 발생하는 경우, 생후 4 개월까지 관찰하였다(Matsuda 1997, 상기 인용됨). GLB1-/- 마우스를 AAVhu68.UbC.hGLB1(n = 15) 또는 비히클(n = 15)의 1.0 x 1011 게놈 카피(GC)의 단일 ICV 주사로 처리하였다. 비히클(n = 15)로 처리된 이형접합(GLB1+/-) 마우스 그룹을 정상 대조군으로 제공하였다. 혈청을 주사 당일(0 일) 및 10, 28, 60 및 90 일에 수집하였다. 운동 기능을 CatWalk XT 보행 분석 시스템(Noldus)을 사용하여 처리 90 일 후에 평가한 후, 동물을 안락사시키고 조직학적 및 생화학적 분석을 위해 조직을 ㅍ수집하였다.
1 마리의 AAV-처리된 마우스는 ICV 주사 절자 도중에 사망하였다. 모든 다른 마우스는 90-일 연구 종점까지 생존하였다. CSF로의 AAV 전달은 말초 혈액에서 벡터 분포 및 유의한 간 형질도입을 초래하였다. (Hinderer, C., et al. Intrathecal gene therapy corrects CNS pathology in a feline model of mucopolysaccharidosis I. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therap 22, 2018-2027 (2014); Gray, S.J., Nagabhushan Kalburgi, S., McCown, T.J. & Jude Samulski, R. Global CNS gene deliver and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates. Gene therapy 20, 450-459 (2013); Haurigot, V., et al. Whole body correction of mucopolysaccharidosis IIIA by intracerebrospinal fluid gene therapy. The Journal of clinical investigation (2013); Hinderer, C., et al. Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna. Molecular therapy. Methods & clinical development 1, 14051 (2014); Hordeaux, J., et al. Toxicology Study of Intra-Cisterna Magna Adeno-Associated Virus 9 Expressing Human Alpha-L-Iduronidase in Rhesus Macaques. Molecular therapy. Methods & clinical development 10, 79-88 (2018)). AAVhu68.UbC.hGLB1로 처리된 GLB1-/- 마우스는 벡터 투여 10 일 후 이형접합(GLB1+/-) 대조군보다 큰 혈청 β-gal 활성을 나타내었다(도 3a). 인간 β-gal에 대한 혈청 항체는 90 일까지 AAVhu68.UbC.hGLB1로 처리한 15 마리 마우스 중 5 마리에서 관찰가능하였다. 상승된 혈청 β-gal 활성은 2 마리를 제외한 모든 마우스에 대해 연구 내내 지속되었으며, 모두 인간 β-gal에 대한 항체를 개발하였다(도 6). 심장, 폐, 간 및 비장을 포함한 말초 기관은 또한 상승된 β-gal 활성을 나타내었다(도 3b-3e). 인간 이식유전자 산물에 대한 항체가 개발된 일부 동물은 말초 기관에서 β-gal 활성이 낮았다.
부검 시 수집된 CSF는 AAVhu68.UbC.hGLB1로 처리된 GLB1-/- 마우스에서 이형접합 대조군을 초과하는 β-gal 활성을 입증하였다(도 4b). 벡터-처리된 마우스의 뇌에서 β-gal 활성은 이형접합 대조군과 유사하였다(도 4a). 항-β-gal 항체는 뇌 또는 CSF β-gal 수준에 영향을 미치지 않는 것으로 보였다.
뇌 이상의 교정은 생화학적 및 조직학적 검정을 사용하여 평가하였다. 리소좀 효소는 리소좀 저장 설정에서 빈번하게 상향조절되며, GM1 강글리오시드증 환자에서 확인된 관찰이다(Van Hoof, F. & Hers, H.G. The abnormalities of lysosomal enzymes in mucopolysaccharidoses. European journal of biochemistry 7, 34-44(1968)). 따라서, 리소좀 효소 헥소사미니다제(HEX)의 활성을 뇌 용해물에서 측정하였다. HEX 활성은 비히클-처리된 GLB1-/- 마우스의 뇌 샘플에서 상승하였으며 벡터-처리된 동물에서 정규화되었다(도 5).
뇌 절편을 GM1 강글리오시드에 결합하는 형광 분자인 필리핀으로 염색하고, 또한 리소좀-연관 막 1(단백질 LAMP1)에 대해 면역염색하여 리소좀 저장 병변을 평가하였다. 또한 필리핀은 비에스테르화 콜레스테롤에 결합하지만, 이전 연구는 필리핀 염색이 주로 GLB1-/- 마우스에서 GM1 축적을 반영함을 입증하였다(Arthur, J.R., Heinecke, K.A. & Seyfried, T.N. Filipin recognizes both GM1 and cholesterol in GM1 gangliosidosis mouse brain. Journal of lipid research 52, 1345-1351 (2011)). 필리핀 염색은 비히클-처리된 GLB1-/- 마우스의 피질, 해마 및 시상의 뉴런에서 뚜렷한 GM1 축적을 입증하였으며 AAVhu68.UbC.hGLB1로 처리된 마우스에서 정규화되었다(데이터는 제시되지 않음). LAMP1 면역조직화학은 GLB1-/- 마우스의 피질 및 시상에서 리소좀 막 염색 증가를 입증하였으며, 벡터-처리된 마우스에서 감소되었다(데이터는 제시되지 않음). 글리오시스를 성상세포 마커인 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP)에 대한 염색으로 평가하였다. 벡터 처리된 GLB1-/- 마우스는 비히클-처리된 대조군에 비해 시상에서 현저하게 감소된 성상교세포증을 나타내었다(데이터는 제시되지 않음).
벡터-처리된 GLB1-/- 마우스에서 신경학적 기능을 평가하기 위해, 보행 분석을 생후 4 개월(벡터 또는 비히클 투여 후 3 개월)에 수행하였다. 미처리된 GLB1-/- 마우스는 이전에 생후 3-4개월까지 임상적으로 명백한 보행 이상을 나타내는 것에 유의하였다. 미처리된 GLB1-/- 마우스 및 정상 대조군의 코호트에서 CatWalk 시스템을 사용하여 수행된 정량적 보행 평가는 느린 자발적 보행 속도, 보폭 차이, 및 단계 주기의 일부 단계의 지속기간을 포함한 다양한 이상을 밝혀내었다(도 7c 및 7d). GLB1-/- 마우스의 상당히 느린 보행 속도로 인해, 이러한 많은 명백한 차이의 해석은 대부분의 보행 매개변수의 속도 의존성에 의해 복잡해졌다(도 8a 및 8b)(Batka, R.J., et al. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical record (Hoboken, N.J.: 2007) 297, 1839-1864 (2014)). 또한 GLB1-/- 마우스는 뒷발의 배치에서 일관된 이상을 나타내었으며, 이는 증가된 뒷발자국 길이로 측정될 수 있다(도 7d). 이 이상은 이전 보고서(Batka, et al, 상기 인용됨)와 일치하게 보행 속도와 무관한 것으로 밝혀졌으며, 이는 GLB1-/- 마우스에서 속도 독립적 보행 기능장애를 평가하는 데 유용한 보행 특징이다(도 8a 및 8b). 연속 2 일 동안 동일한 마우스 코호트를 사용하여 수행된 테스트는 느린 자발적 보행 속도 및 증가된 뒷발자국 길이가 미처리된 GLB1-/- 마우스에서 재현가능한 관찰임을 입증하였다(도 7a 및 7b). 비히클 처리된 GLB1-/- 마우스는 미처리된 동물에서 이전에 식별된 것과 유사한 보행 이상을 나타내었다(도 7a-7g). 보행 속도 및 발자국 길이는 벡터-처리된 GLB1-/- 마우스에서 정규화되었다(도 7a-7g).
C. 논의
이 연구는 생후 4 주에 AAV 벡터로 처리된 GLB1-/- 마우스에서 뉴런 저장 병변의 감소를 입증하였다. 이는 이러한 모델에서 두드러진 뇌 저장 병변이 나타난지 1 주 후이다(Hahn 1997, 본원에 인용됨). 이러한 결과는 CSF로의 AAVhu68.hGLB1 투여가 뇌 β-gal 활성을 증가시키고, 뉴런 리소좀 저장 병변을 줄이고, 신경학적 저하를 방지함을 시사하며, 유전자 전달은 뇌에서 GM1 저장을 방지 및 역전시킬 수 있다.
실시예 4: 동물 모델
A. GLB1-/- 마우스 모델에서 AAVhu68.UbC.GLB1의 최소 유효 용량(MED) 식별
상이한 용량의 rAAVhu68.UbC.GLB1이 GLB1-/- 마우스 모델에서 CNS 병변 및 신경학적 징후에 미치는 영향을 평가하였다. 효능을 혈청 효소 활성, 뇌 병변 감소, 자동 보행 분석(예를 들어 CatWalk 시스템을 통해)에 의해 측정된 신경학적 징후 및 블라인드 리뷰어에 의해 수행된 표준화된 신경학적 검사(예를 들어, 자세, 운동 기능, 감각 및 반사의 9 점 평가), 및 생존에 의해 평가하였다. 또한 안전성 분석(혈액 수집 및 분석 포함)을 수행하였다. 4 주령 GLB1-/- 마우스는 ICV 주사에 의해 4 개 용량 중 하나의 rAAVhu68.UbC.GLB1(1.3　Х　1011　GC, 4.4 Х 1010 GC, 1.3 Х 1010 GC 또는 4.4　Х 109 GC) 또는 비히클을 받았다(그룹 당 n　=　24). 비히클로 처리된 이형접합 한배 새끼(n = 24)를 정상 대조군으로 제공하였다.
혈청 β-gal 효소 활성, 보행 분석 및 신경학적 검사를 60 일마다 각 그룹에 대한 동물의 절반에서 수행한 반면 체중을 120 일의 관찰 기간에서 적어도 30 일마다 측정하였다. 결과는 도 9a-9f로 플롯팅되고 하기에 간략하게 기재되어 있다.
모든 처리된 마우스는 건강해 보였으며, 정상 체중 증가를 나타낸다. 관찰 기간 동안, 그룹 사이에 체중의 유의한 차이는 검출되지 않았다(도 9b).
혈청 효소 발현은 실시예 3에 논의된 연구와 일치하였다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, 비히클 처리된 GLB1-/- 마우스(음성 대조군으로 제공됨)의 β-gal 효소 활성은 약 10 nmol/mL/시간으로 유지된 방면 양성 대조군 그룹(비히클 처리된 GLB1+/- 마우스임)은 약 100 nmol/mL/h 효소 활성을 입증하였다. 마우스 당 4.4 x 1010 GC의 용량으로 rAAVhu68.UbC.GLB1 처리 시, β-gal 효소 활성은 60 일 및 120 일 모두에서 음성 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 마우스 당 1.3 x 1011 GC로 더 높은 용량의 rAAVhu68.UbC.GLB1은 60 일에 양성 대조군보다 더 많은 β-gal 효소 활성을 초래하였으며 120 일에 추가 상승을 초래하였다.
GM1 마우스의 보행 표현형이 또한 실시예 3에 나타낸 이전 결과와 일치하였다. 신경학적 검사 점수, 뒷발자국 길이, 뒷다리 유각 시간, 및 뒷다리 보폭을 획득하였고 결과는 도 9c-9f에 플롯팅되어 있다. 모든 4 개의 플롯팅된 매개변수에 대해, 음성 대조군 및 양성 대조군 사이에 유의한 통계적 차이가 있으며, 이는 이러한 매개변수가 효능을 평가하는 데 우수한 지표로 제공될 수 있음을 나타낸다. 비히클 처리된 GLB1-/- 마우스와 비교하여, rAAVhu68.UbC.GLB1의 4.4 x 1010 GC로 처리된 마우스는 뒷발자국 길이, 뒷다리 유각 시간 및 뒷다리 보폭에서 유의한 개선을 나타내었다. 1.3 x 1011 GC로 뒷다리에서 더 높은 용량은 증가된 유각 시간 및 더 긴 보폭을 제공하였으며, 이는 성공적인 교정을 나타낸다. 신경학적 검사는 보행 분석에 비해 더 민감하다. 증가된 용량에 따른 감소된 신경학적 점수에 의해 나타낸 투여량 의존적 개선은 도 9c에 나타낸 바와 같이 관찰된 반면, rAAVhu68.UbC.GLB1의 1.3 x 1010 GC로 처리는 음성 대조군과 비교하여 총 점수에서 통계적 유의성을 나타내었다. 표현형 교정의 증거는 마우스 당 1.3 x 1010 GC의 낮은 용량에서 관찰하였다.
모든 미처리된 동물이 살아서 남아있을 것으로 예상될 때, 적어도 추가 150 일 동안 이 동물 코호트에서 동일한 매개변수 세트를 계속 수집한다. 미처리된 Glb1-/- 마우스에 대한 생존 변화를 평가한다.
상기 문단에서 논의된 동물의 처음 절반을 처리 후 270일에 희생시킨다. 나머지 동물 절반을 처리 후 150 일에 희생시킨다. 또 다른 24 마리 마우스가 기준선 부검 대조군으로 제공된다. 모든 희생된 동물에 대해 처리 및 미처리 동물 사이에서 조직학적 및 생화학적 비교를 수행한다. 부검 후, 뇌를 절편화하고 LAMP1에 대해 염색하여 리소좀 저장 병변을 평가하며, 자동화 영상 시스템을 사용하여 정량화한다. β-gal 활성을 뇌, 혈청 및 말초 기관에서 측정한다. 안전성 분석을 위해, 부검 시 완전 혈액 계수 및 혈청 화학 패널을 위해 혈액을 수집하고, 뇌, 척수, 심장, 폐, 간, 비장, 신장 및 생식선을 공인된 수의학 병리학자에 의해 조직병리학의 평가를 위해 수집한다. 비히클-처리된 GLB1-/- 마우스에 비해 뇌 저장 병변의 유의한 감소를 달성하는 rAAVhu68.UbC.GLB1의 최저 용량을 최소 유효 용량(MED)으로 선택한다.
B. 비인간 영장류(NHP)에서 독성학 연구
레서스 원숭이는 환자 집단(생후 4-18 개월 유아)의 크기 및 CNS 해부학을 가장 잘 복제하고 임상 투여 경로(ROA)를 사용하여 처리될 수 있기 때문에 독성학 연구를 위해 선택하였다. 소아 시험 집단을 대표하기 위해 어린 동물을 선택하였다. 일 구현예에서, 어린 레서스 원숭이는 생후 15 내지 20 개월이다. 대표적인 벡터 분포 및 형질도입 프로파일을 초래하는 크기, 해부학, 및 ROA의 유사성은 독성을 정확하게 평가한다. 또한, 설치류 모델에서 보다 NHP에서 더 엄격한 신경학적 평가를 수행하여 CNS 독성을 더 민감하게 검출한다.
ICM 투여 후 AAVhu68.UbC.GLB1의 독성학을 조사하기 위해 120 일 GLP-준수 안전성 연구를 어린 레서스 마카크에서 수행한다. 120-일 평가 기간은 분비된 이식유전자 산물이 ICM AAV 투여 후 안정한 정체 수준에 도달하기에 충분한 시간을 허용하기 때문에 선택하였다. 연구 설계는 하기 표에 요약되어 있다. 레서스 마카크는 다음 3 가지 용량 수준 중 하나를 받는다: 총 3.0 Х 1012 GC, 총 1.0 Х 1013 GC, 또는 총 3.0 Х 1013 GC(n=6/용량) 또는 비히클(n=4). 용량 수준은 뇌 질량(마우스의 경우 0.4 g 및 레서스 원숭이의 경우 90 g으로 가정)에 의해 조정될 때 MED 연구에서 평가된 것과 동등하도록 선택하였다. 기준선 신경학적 검사, 임상 병리학(차등 세포 계수, 임상 화학, 및 응고 패널), CSF 화학 및 CSF 세포학을 수행한다. AAVhu68.UbC.GLB1 또는 비히클 투여 후, 동물을 고통 징후 및 비정상적인 거동에 대해 매일 모니터링한다.
혈액 및 CSF 임상 병리학 평가 및 신경학적 검사를 rAAVhu68.UbC.GLB1 또는 비히클 투여 후 30 일 동안 매주 수행하고, 그 후 30 일마다 수행한다. 기준선에서 및 그 후 각 30-일 시점에서, AAVhu68에 대한 중화 항체 및 AAVhu68 및 AAVhu68.UbC.GLB1 이식유전자 산물에 대한 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 인터페론 감마(IFN-γ) 효소-결합 면역스폿(ELISpot) 검정에 의해 평가한다.
레서스 마카크 우수 실험실관리 기준(GLP) 독성학 연구
Figure pct00013
rAAVhu68.UbC.GLB1 또는 비히클 투여 후, 동물의 절반을 60 일에 안락사시키고 절반을 120 일에 안락사시킨다. 조직을 포괄적인 현미경 조직병리학 검사를 위해 수확한다. 조직병리학 검사는 중추신경계 조직(뇌, 척수, 및 배근신경절) 및 간에 초점을 맞추는데 이들이 AAVhu68 벡터의 ICM 투여 후 가장 심하게 형질도입된 조직이기 때문이다. 게다가, 림프구를 비장 및 골수에서 수확하여 부검 시 이들 기관에서 캡시드 및 이식유전자 산물 모두에 반응성인 T 세포의 존재를 평가한다.
벡터 생체분포를 조직 샘플에서 정량적 PCR에 의해 평가한다. 벡터 게놈을 혈청 및 CSF 샘플에서 정량화한다.
C. 비임상 AAV 연구에서 감각 뉴런 독성
AAV의 전신 및 척수강내(IT) 투여를 평가하는 비임상 연구는 배근신경절(DRG) 내의 감각 뉴런의 효율적인 형질도입을 일관되게 입증하였으며, 일부 경우, 이들 세포를 수반하는 독성의 증거를 입증하였다. 척수강내 투여는 중심 축삭이 CSF에 노출되기 때문에 감각 뉴런 형질도입을 허용할 수 있거나, 또는 DRG가 척추 CSF에 노출되기 때문에 rAAV가 세포체에 직접 도달할 수 있다.
DRG 감각 뉴런의 최소 내지 경미한 무증상 퇴행은 평가된 모든 용량에서 AAVhu68.UbC.GLB1 GLP NHP 독성학에서 보일 것으로 예상된다. 다른 AAV 프로그램에 대한 기존 비임상 및 임상 데이터에 기초하여, 감각 뉴런 결과는 인간에서 이상 반응으로 번역되지 않고, 따라서 무증상 감각 뉴런 병변이 비임상 연구에서 최대 허용 용량(MTD)을 결정하는 데 사용되지 않을 것으로 기대된다. 그러나, 인간에서 감각 뉴런 독성의 실제 위험은 알려져 있지 않다. 현재 시험은 전형적으로 전신으로 투여된 것보다 낮은 용량의 AAVhu68.UbC.GLB1이 필요하고, 더 낮은 정도의 감각 뉴런 독성을 초래하는 것으로 보이는 ICM 투여 경로를 사용함으로써 이전 AAV 임상 시험의 안전성 프로파일을 추가로 개선시키도록 설계된다. 이 연구는 감각 변화 뿐만 아니라 신경 전도 연구에 대한 상세한 모니터링을 이용하여 심지어 준임상 DRG 독성을 검출한다. 유아 GM1 강글리오시드증의 중증도를 고려해볼 때, AAVhu68.UbC.GLB1의 ICM 투여에 대한 위험-이익 프로파일은 감각 뉴런 독성의 알려지지 않은 위험에도 불구하고 유리하게 남아있을 것으로 예상된다.
실시예 5: 유아 GM1 강글리오시드증이 있는 소아 대상체의 대수조(ICM)로 전달된 단일 용량의 rAAVhu68.GLB1의 안전성 및 내약성을 평가하기 위한 1/2 상 공개 표지 다기관 용량 증가 연구
유아 형태의 GM1 강글리오시드증이 있는 생후 1 개월 내지 18 개월의 소아 대상체는 가장 높은 미충족 필요성이 있는 집단 및 운동 및 인지 장애 둘 다 빠르고 예측가능한 저하를 특징으로 하는 가장 파괴적인 질환 과정을 나타내므로 이들을 1/2 상 연구를 위해 선택한다(Jarnes Utz et al., 2017, Infantile gangliosidoses: Mapping a timeline of clinical changes. Molecular Genetics and Metabolism. 121(2):170-179). 유아 GM1 강글리오시드증이 있는 환자는 전형적으로 생후 6 개월 전에 신경학적 징후와 함께 증상이 발병하며, 일부 환자는 출생 시 저긴장, 정신운동 지연 또는 다른 증상 징후를 제시한다(Caciotti et al., 2011, GM1 gangliosidosis and Morquio B disease: An update on genetic alterations and clinical findings. Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Molecular Basis of Disease. 1812(7):782-790). 유아 GM1이 있는 대다수의 환자는 생후 몇 년 이내에 사망한다(연구 및 지지적 치료 수준에 따라 중앙 생존기간 19-46개월(Regier et al., 2016, MRI/MRS as a surrogate marker for clinical progression in GM1 gangliosidosis. American Journal of Medical Genetics Part A. 170(3):634-644.; Regier et al., 2016, The GM1 and GM2 Gangliosidoses: Natural History and Progress toward Therapy. Pediatric endocrinology reviews: PER. 13 Suppl 1:663-673; 및 Jarnes Utz et al., 2017). 결과적으로 이들 환자는 잠재적으로 가장 유리한 위험/이익 프로파일을 갖는 집단을 나타낸다. 추가적으로 이들 환자에서 예측가능하고 빠른 저하는 강력한 연구 설계를 뒷받침하고 합리적인 추적 기간 내에서 기능적 결과의 평가를 허용한다. 이 그룹의 경우, 치료는 근본적인 병리학을 안정화시켜, 질환 진행을 안정화시키고, 생존을 연장하고, 기술(예컨대 후천적 발달 이정표, 신경인지 및/또는 운동 기술) 상실을 방지하고, 신경인지 및 행동 저하 진행을 지연시키는 것으로 예상된다.
성체 비인간 영장류에서 수행된 투여 절차에 대한 비임상 안전성 연구는 생후 4 개월 이상 유아의 가장 대표적인 크기 및 대수조 해부학이다. 그러나, 증상 발병 후 빠른 질환 과정 및 증상 발병 시 초기 연령을 고려해 볼 때, 치료는 유전자 요법의 잠재적인 이익을 최대화하기 위해 가능한 한 초기에 수행되어야 한다. 여기서 활용되는 하한 연령은 치료 및, 구체적으로 ICM 절차가 안전하게 수행될 수 있음을 보장하기 위해 등록 시 생후 1 개월이다. 생후 1 또는 2 주 유아의 영상 스캔을 주의깊게 검토한 후, 펜실베니아 대학의 전문 중재 방사선전문의는 치료에 대한 근거가 뒷받침된다면 1 개월령 유아에서 CT-유도된 ICM 투여를 수행하는 데 특별한 해부학적 우려가 없음을 나타내었다. 상기 논의된 바와 같이, 유아(1형) GM1이 있는 환자는 발작이 발병하는 전형적인 연령에 따른 빠른 질환 과정 및 생후 18 개월까지 진행성 질환의 다른 징후를 갖는다(Jarnes Utz et al., 2017). 진행성 신경학적 질환으로 인해 낮은 수준의 임상 기능으로 질환의 안정화를 넘어 AAVhu68.GLB1로부터 이로운 제한된 잠재력을 가질 수 있는 대상체의 등록을 방지하기 위해 18 개월의 상한 연령을 선택하였다. 자연사 연구는 유아 GM1 강글리오시드증이 있는 환자가 2 세까지 대부분의 발달 이정표를 상실함을 나타낸다.
상기 언급된 바와 같이 증상 발병 후 질환의 빠르고 파괴적인 과정을 고려해 볼 때, 치료는 유전자 요법의 잠재적인 이익을 최대화하기 위해 가능한 한 빨리 수행되어야 한다. 형제자매 일치에 대한 데이터는 유아 GM1이 있는 형제자매에서의 임상 과정이 발병 및 우세한 질환 징후까지의 시간 측면에서 유사함을 시사한다(Gururaj et al., 2005. Magnetic Resonance Imaging Findings and Novel Mutations in GM1 Gangliosidosis. Journal of Child Neurology. 20(1):57-60). 따라서, GM1 강글리오시드증의 유전적 및 생화학적 진단이 확인된 증상 발현 전 단계의 유아는 생후 6 개월 또는 이전에 증상 발병(저긴장)이 문서화된 영향을 받은 나이가 많은 형제자매가 있는 경우 연구에 포함될 수 있다.
연구는 단일 용량의 AAVhu68.GLB1을 유아 형태의 GM1이 있는 소아 대상체의 대수조(ICM)로 전달한 후 안전성, 내약성, 및 탐구 효능 평가변수를 평가하는 AAVhu68.GLB1의 1/2 상 공개 표지 용량 증가 연구이다. 이 연구는 유아 형태의 GM1 강글리오시드증(1형)이 있는 최대 12 명의 소아 대상체가 등록하며, 대상체는 단일 용량의 ICM-투여된 AAVhu68.GLB1을 받는다. 안전성, 내약성, 약력학 및 임상 결과를 평가하기 위해 대상체를 2 년 동안 추적하며, 이식유전자 발현 및 임상 반응의 장기 결과 및 내구성을 평가하기 위해 치료후 총 5 년 동안 추가 장기 추적(LTFU)을 수행한다. 치료 후 5 년까지 LTFU는 이식유전자 발현의 내구성을 평가하고, FDA 산업 지침 초안: 인간 유전자 요법 제품 투여 후 장기 추적(2018년 7월), 유럽, 브라질 및 다른 지역 규제에 따라 치료가 미치료 환자보다 우수한 기능 수준에서 생존을 연장하고 대상체를 안정화하는 데 효과적인지 여부를 평가한다. 연구 완료 시, 대상체를 초대하여 안전성(종양학 사건에 대한 모니터링), 생존 및 임상 결과를 포함한 장기 결과에 대해 계속 모니터링하도록 환자 등록부에 등록할 수 있다. AAVhu68.GLB1의 후속 개발은 경미한 후기 발병 형태의 질환이 있는 환자 치료로 확장하는 것을 포함한다.
2 개 용량의 rAAVhu68.GLB1을 대상체의 시차를 둔 순차적 투약으로 평가한다. rAAVhu68.GLB1 용량 수준은 뮤린 MED 연구 및 GLP NHP 독성학 연구로부터의 데이터에 기초하여 결정되며 저용량(코호트 1에 투여됨) 및 고용량(코호트 2에 투여됨)으로 이루어진다. 고용량은 동등한 인간 용량으로 조정된 NHP 독성학 연구에서 최대 허용 용량(MTD)에 기초한다. 인간 대상체에 대해 선택된 고용량이 동등한 인간 용량의 1/3 내지 절반이 되도록 안전 여유가 적용된다. 저용량은 동물 연구에서 동등하게 조정된 MED를 초과하는 용량이면 전형적으로 선택된 고용량보다 2-3 배 적다. 이는 두 용량 수준이 치료적 이익일 부여할 잠재력을 가지고 있음을 보장할 것이며, 허용된다면 용량이 높을수록 유리한 것으로 예상될 것으로 이해한다. 저용량 이어서 고용량의 순차적 평가는 테스트된 두 용량의 최대 허용 용량(MTD)의 식별을 가능하게 한다. 마지막으로, 확장 코호트(코호트 3)는 rAAVhu68.GLB1의 MTD를 받는다. 코호트 3(MTD)에서 6 명의 대상체는 시차를 둔 투약 없이 동시에 등록한다. 코호트 3은 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 및 rAAVhu68.GLB1을 사용한 조합 치료를 받을 수 있다. 허용된다면, 용량이 높을수록 유리할 것으로 예상될 것이다.
이 연구의 주요 초점은 rAAVhu68.GLB1의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. ICM AAVhu68 전달의 NHP 연구는 일부 동물에서 DRG 감각 뉴런의 최소 내지 경미한 무증상 퇴행을 입증하였으며, 따라서 상세한 검사를 수행하여 감각 신경 독성을 평가하고, 감각 신경 수행 연구를 이 시험에서 이용하여 준임상 감각 뉴런 병변을 모니터링한다. 참고로, 감각 뉴런 기능 상실(잠재적인 배근신경절 독성으로 인함)은 30 일, 3 개월, 6 개월, 12 개월, 18 개월, 24 개월 및 그 후 매년 간격으로 수행된 감각 신경 수행 연구에 의해 평가된다. 감각 뉴런 병변이 비임상 NHP 연구에서 AAV 투여 후 2 - 4 주 이내에 보이는 것을 고려해 볼 때, 치료 후 3 개월에 걸친 더 빈번한 평가는 인간에서 유사한 사건의 평가를 가능하게 하여, 독성 동역학에서 잠재적인 가변성을 허용한다. 연구 전반에 걸친 추적을 통해 인간에서 시간 과정이 상이하거나, 또는 임상 후유증이 관찰된 경우 후기 효과를 평가하여 얼마나 오래 지속되고 시간 경과에 따라 개선, 안정 또는 악화되는지 여부를 평가할 수 있다.
약력학 및 효능 평가변수를 또한 이 연구에서 평가하고, 이 집단에서 의미있는 기능적 및 임상적 결과를 입증할 가능성을 선택하였다. 평가변수는 진정 및/또는 LP가 필요한 경우를 제외하고 30 일, 90 일, 6 개월, 12 개월, 18 개월, 24 개월 및 그 다음에 매년 최대 5 년 추적 기간에 측정한다. 장기 추적 단계 동안, 측정 빈도는 12 개월마다 1 회로 감소한다. 이러한 시점을 선택하여 rAAVhu68.GLB1의 안전성 및 내약성에 대한 철저한 평가를 용이하게 하였다. 미치료된 유아 GM1 환자에서 질환 진행의 빠른 속도를 고려하여 초기 시점 및 6 개월 간격을 또한 선택하였다. 이 접근법은 미처리된 비교기 데이터가 존재하고 미치료된 환자가 유의한 저하를 나타낼 것으로 예상되는 동안 추적 기간에 걸쳐 치료된 대상체에서 약력학 및 임상 효능 측정의 철저한 평가를 허용한다.
2차 및 탐구 효능 평가변수는 PedsQL 및 신경인지 및 행동 발달에 의해 측정 시 생존, 영양관 독립성, 발작 발생 및 빈도, 삶의 질을 포함한다. 베일리 유아 발달 척도 및 바인랜드 척도를 사용하여 적응 행동, 인지, 언어, 운동 기능, 및 건강 관련 삶의 질의 발달 및 변화에 대한 rAAVhu68.GLB1의 효과를 정량화한다. 각 측정값을 GM1 질환 집단 또는 관련 집단에서 사용하였고 부모 및 가족의 조언에 기초하여 추가로 상세히 논하여 그들에게 가장 유의하고 영향을 미치는 측정값을 선택한다. 평가를 표준화하기 위해, 실험에 참여하는 현장은 숙련된 신경심리학자에 의해 다양한 규모의 투여를 훈련받는다.
표적 집단에서 질환의 중증도를 고려해 볼 때, 대상체는 등록에 의해 운동 기술을 달성하거나, 다른 운동 이정표를 개발한 후 상실하였거나, 또는 아직 운동 이정표 발달 징후를 나타내지 않을 수 있다. 평가는 모든 이정표에 대한 달성 연령 및 상실 연령을 추적한다. 운동 이정표 달성은 WHO 기준에 기초하여 6 가지 총 이정표에 대해 정의된다.
유아 GM1 강글리오시드증이 있는 대상체가 생후 몇 개월 이내에 증상이 발생할 수 있고, 첫번째 WHO 운동 이정표(도움 없이 앉아있기) 획득이 전형적으로 생후 4 개월 전(중앙값: 생후 5.9 개월)에 나타나지 않는다는 점을 고려해 볼 때, 이 평가변수는 특히 치료 시 더 명백한 증상이 있는 대상체에서 치료 이익 정도를 평가하는 민감성이 부족할 수 있다. 이러한 이유로, 유아에게 적용될 수 있는 연령 적절한 발달 이정표 평가가 또한 포함된다(Scharf et al., 2016, Developmental Milestones. Pediatr Rev. 37(1):25-37; quiz 38, 47.). 이러한 데이터는 유아 GM1 질환이 있는 미치료된 어린이 또는 정상적인 어린이에서 전형적인 획득 시간에 비해 시간 경과에 따라 발달 이정표의 유지, 획득, 또는 상실을 요약하는 데 유익할 수 있다.
질환이 진행됨에 따라, 어린이는 발작을 일으킬 수 있다. 발작 활성 발병은 rAAVhu68.GLB1 처리가 발작 발병을 예방 또는 지연시키거나 또는 이 집단에서 발작 사건 빈도를 감소시킬 수 있는지 여부를 결정하는 것을 가능하게 한다. 부모는 발작의 발병, 빈도, 길이, 및 유형을 추적하는 발작 일지를 보관하도록 요청받는다. 이러한 항목은 각 방문 시 임상의와 논의하고 해석한다.
질환의 CNS 징후에 대한 rAAVhu68.GLB1의 효과를 평가하기 위해 체적 변화를 시간 경과에 따라 MRI에서 측정한다. 모든 강글리오사이도스의 유아 표현형은 대두증의 일관된 패턴을 가지고 있으며 뇌 조직 부피(대뇌 피질 및 다른 더 작은 구조) 및 심실 부피와 함께 두개내 MRI 부피가 빠르게 증가하는 것으로 나타났다. 추가적으로, 뇌량, 미상 및 경막 뿐만 아니라 소뇌 피질을 포함한 다양한 더 작은 뇌 하부구조는 일반적으로 질환이 진행함에 따라 크기가 감소한다(Regier et al., 2016, 및 Nestrasil et al., 2018, 본원에 인용됨). rAAVhu68.GLB1 처리는 위축 및 체적 변화에서 안정화의 증거로 CNS 질환 징후의 진행을 늦추거나 또는 중지시킬 것으로 예상된다. 시상 및 기저핵에서 T1/T2 신호 강도의 변화(정상/비정상)를 평가하는 탐구 평가변수는 GM1 및 GM2 강글리오시드증이 있는 환자에서 시상 구조의 변화에 대한 보고된 증거에 기초한다(Kobayashi and Takashima, 1994, Thalamic hyperdensity on CT in infantile GM1-gangliosidosis. Brain and Development. 16(6):472-474).
시험을 위한 바이오마커는 CSF 및 혈청에서 측정될 수 있는 β-gal 효소(GLB1) 활성, 및 유아 GM1 강글리오시드증에서 일관된 빠른 위축을 입증하는 뇌 MRI를 포함한다(Regier et al., 2016b, 본원에 인용됨). 수집된 샘플의 CSF 및 혈청에서 추가 바이오마커를 조사한다.
A. 1차 목적:
ㆍ 대수조(ICM)에 단일 용량 투여 후 2년 동안 rAAVhu68.GLB1의 안전성 및 내약성 평가.
B. 2차 목적:
ㆍ CSF 및 혈청에서 GLB1 활성에 기초하여 단일 ICM 용량 후 24 개월에 걸쳐 rAAVhu68.GLB1의 약력학 및 생물학적 활성 평가. 이 평가는 CSF GM1 농도, 및 혈청 및 소변 케라탄 술페이트 수준, 헥소사미니다제 활성을 추가로 포함할 수 있다.
ㆍ 생존에 대한 rAAVhu68.GLB1의 영향 평가
ㆍ 생후 24 개월에 영양관 의존성 확률에 대한 rAAVhu68.GLB1의 영향 평가
ㆍ 달성 연령, 상실 연령, 및 연령 적절한 발달 및 운동 이정표(세계보건기구 [WHO] 기준에 의해 정의됨)를 유지하거나 또는 획득하는 어린이의 백분율에 의해 평가된 질환 진행 평가
ㆍ 다음에 기초한 신경인지적 발달에 대한 rAAVhu68.GLB1의 영향 평가:
o 베일리 영유아 발달 검사 척도의 등가 연령 인지, 대근육 운동, 소근육 운동, 수용적 및 표현적 의사소통 점수의 변화
o 바인랜드 적응 행동 척도의 각 영역에 대한 표준 점수의 변화
C. 탐구 목적:
ㆍ 다음에 의해 측정 시 단일 ICM 용량 후 24 개월 동안 rAAVhu68.GLB1의 효능에 대한 추가 평가:
o 발작 일지에 의해 평가된 발작의 발병 연령 및 빈도
o 소아 삶의 질 척도 및 소아 삶의 질 유아 척도(PedsQL 및 PedsQL-IS) 에 대한 총 점수의 변화에 의해 소아 삶의 질에 대한 rAAVhu68.GLB1의 영향 평가
ㆍ 다음에 의해 측정 시 단일 ICM 용량 후 24 개월 동안 rAAVhu68.GLB1의 약력학적 효과에 대한 추가 평가:
o MRI에 의해 측정 시 총 뇌 부피, 뇌 하부구조 부피, 및 측뇌실 부피의 변화
o 시상 및 기저핵 활성에서 T1/T2 신호 강도의 변화
ㆍ 간 및 비장 부피에 대한 rAAVhu68.GLB1의 효과 평가.
ㆍ EEG, ECHO 및 시각 유발 전위(VEP)에 대한 rAAVhu68.GLB1의 효과 평가.
D. 연구 설계:
rAAVhu68.GLB1의 다기관 공개 표지 단일군 용량 증가 연구(하기 표). 유아 GM1 강글리오시드증이 있는 최대 총 12 명의 소아 대상체가 2 개 용량 코호트에 등록되고, ICM 주사에 의해 투여된 단일 용량의 rAAVhu68.GLB1을 받는다. 안전성 및 내약성을 2 년 동안 평가하고, 안전성 및 내약성, 약력학(이식유전자 발현의 내구성) 및 임상 결과의 내구성에 대한 장기 평가를 위해 모든 대상체를 rAAVhu68.GLB1 투여 후 5년 동안 추적한다.
Figure pct00014
잠재적인 대상체를 투약 전 -35 내지 -1 일에 스크리닝하여 연구에 대한 적격성을 결정한다. 포함/제외 기준을 충족하는 이러한 대상체를 1 일 아침 또는 기관 관행에 따라 병원에 입원시킨다. 대상체는 1 일에 단일 ICM 용량의 rAAVhu68.GLB1을 받고 관찰을 위해 투여 후 적어도 24 시간 동안 병원에 머무른다. 후속 평가는 투약 후 7, 14 및 30 일에 수행한 다음, 첫 해에는 60 일마다 두번째 해에는 90 일마다 수행한다. rAAVhu68.GLB1의 안전성 및 내약성을 이상 반응(AE) 및 심각한 이상 반응(SAE)의 평가, 활력 징후, 신체 검사, 감각 신경 전도 연구, 및 실험실 평가(화학, 혈액학, 응고 연구, CSF 분석)를 통해 모니터링한다. AAV 및 이식유전자 산물의 면역원성을 또한 평가한다. 효능 평가는 생존, 인지, 운동 및 사회적 발달 측정, 시각 기능 및 EEG의 변화, 간 및 비장 부피의 변화, 및 CSF, 혈청 및 소변에서의 바이오마커를 포함한다.
연구는 rAAVhu68.GLB1이 단일 ICM 주사로 투여된 다음 3 개의 코호트로 이루어진다:
ㆍ 코호트 1(저용량): 3 명의 적격한 대상체(대상체 #1 내지 #3)를 등록시키고 첫번째 및 두번째 대상체 사이에 4-주 안전성 관찰 기간에 따라 저용량의 rAAVhu68.GLB1을 투여한다. 안전성 검토 트리거(SRT)가 관찰되지 않으면, 코호트 1의 세번째 대상체에게 rAAVhu68.GLB1을 투여한 지 4 주 후에 독립적인 안정성 위원회에 의해 모든 이용가능한 안전성 데이터를 평가한다.
ㆍ 코호트 2(고용량): 진행하기로 결정되면, 3 명의 적격한 대상체(대상체 #4 내지 #6)를 등록시키고 네번째 및 다섯번째 대상체 사이에 4-주 안정성 관찰 기간에 따라 고용량의 rAAVhu68.GLB1을 투여한다. SRT가 관찰되지 않으면, 독립적인 안전성 위원회는 코호트 2의 세번째 대상체에게 rAAVhu68.GLB1을 투여한 지 4 주 후에 코호트 1의 대상체로부터의 안전성 데이터를 포함한 모든 이용가능한 안전성 데이터를 평가한다.
ㆍ 코호트 3(MTD): 안전성 위원회에 의해 긍정적인 권고가 있을 때까지, 최대 6 명의 추가 대상체를 등록시키고 단일 ICM 용량의 rAAVhu68.GLB1을 MTD로 투여한다. 이 코호트에서 대상체에 대한 투약은 대상체 사이에 4-주 안정성 관찰 기간에 따라 시차를 두지 않으며, 이 코호트에서 처음 3 명의 대상체의 투약 후 안정성 위원회 검토가 필요하다.
E. 포함 기준:
1. 등록 시 생후 > 1 개월 및 <18 개월인 경우
2. 정상 하한 미만의 GLB1 유전자 및 베타-갈락토시다제 효소 활성에서 동형접합 또는 복합 이형접합 돌연변이 또는 결실의 식별에 기초하여 GM1 강글리오시드증의 생화학적 및 분자 진단이 문서화된 경우
3. 검사 시 저긴장 또는 부모/보호자로부터 도출된 병력과 함께 생후 6 개월까지 증상 발병이 문서화된 경우
또는
증상 발현 전 단계이고 생후 6 개월까지 증상이 발병된 유아 GM1 강글리오시드증의 진단이 확인된 형제자매가 있는 경우
F. 제외 기준:
1. GM1 강글리오시드증 또는 조사자의 의견이 연구 결과 해석을 혼란스럽게 할 수 있는 2차 원인에 기인한 것이 아닌 임의의 임상적으로 유의한 신경인지 결함이 있는 경우.
2. 조사자의 의견에 따라, 대상체를 과도한 위험에 처하게 하거나 또는 대상체 안전성 또는 연구 결과의 조사 제품 평가 또는 해석을 방해할 수 있는 임의의 조건(예를 들어, 임의의 병력, 임의의 현재 질환 증거, 신체 검사 시 임의의 결과, 또는 임의의 실험실 이상)이 있는 경우.
3. 등록 30 일 이내에 입원이 필요한 임의의 급성 질병이 있는 경우.
4. 등록 30 일 이내에 치료 또는 입원이 필요한 호흡기 문제가 있는 경우.
5. 형광투시 영상에 대한 사용 금지 사유를 포함하여 ICM 투여 절차에 대한 임의의 사용 금지 사유가 있는 경우.
6. MRI 또는 요추 천자에 대한 임의의 사용 금지 사유가 있는 경우.
7. 스크리닝 전 4 주 이내 또는 해당 임상 연구에 사용된 조사 제품의 5 회 반감기 이내 중 더 긴 기간 동안 조사 제품을 사용한 임의의 다른 임상 연구에 등록한 경우(미글루스타트 오프 라벨(off-label)을 받는 환자가 적격함).
G. 투여 경로 및 절차
단일 용량으로서 rAAVhu68.GLB1은 대수조에 CT-유도된 후두하 주사를 통해 대상체에게 1 일에 투여된다.
1 일에 연구와 연관된 임상시험 약제학(Investigational Pharmacy)에 의해 적절한 농도의 rAAVhu68.GLB1을 준비한다. 적절한 농도로 rAAVhu68.GLB1 5.6 mL를 함유하는 주사기를 시술실로 전달한다. 연구 약물 투여를 위해 다음 사람들이 참석한다: 시술을 수행하는 중재의사; 마취전문의 및 호흡기 기술자(들); 간호사 및 보조 의사; CT(또는 수술실) 기술자; 현장 조사 코디네이터.
약물 투여를 연구하기 전에, 요추 천자를 수행하여 미리 결정된 부피의 CSF를 제거한 다음 요오드화 조영제를 척수강내로(IT) 주사하여 대수조의 관련 해부학의 사각화를 돕는다. 정맥내(IV) 조영제는 척수강내 조영제에 대한 대안으로 바늘 삽입 전에 또는 도중에 투여될 수 있다. IV 또는 IT 조영제를 사용하려는 결정은 중재의사의 재량에 있다. 대상체를 마취시키고 삽관하고 시술대에 배치한다. 주사 부위를 멸균 기술을 사용하여 준비하고 멸균한 천으로 덮는다. 척수 바늘(22-25 G)을 형광투시 지침 하에 대수조로 전진시킨다. 큰 유도 바늘을 사용하여 바늘 배치를 보조할 수 있다. 바늘 배치를 확인한 후, 확장 세트를 척수 바늘에 부착하여 CSF로 채울 수 있게 한다. 중재의사의 재량에 따라, 조영제 물질을 함유하는 주사기를 확장 세트에 연결하고 소량을 주입하여 대수조에서 바늘 배치를 확인할 수 있다. 바늘 배치를 CT 지침 +/- 조영제 주사로 확인한 후, rAAVhu68.GLB1 5.6 mL를 함유하는 주사기를 확장 세트에 연결한다. 주사기 조영제를 1-2 분에 걸쳐 서서히 주입하여, 5.0 mL의 부피를 전달한다. 바늘을 대상체에서 서서히 제거한다.
rAAVhu68.GLB1의 대수조(ICM)로의 단일 용량은 투여 후 2년 동안 안전하고 견딜 수 있다.
AAVhu68.GLB1의 대수조(ICM)로의 단일 용량은 생존을 증가시키고/시키거나, 생후 24 개월에 영양관 의존성의 가능성을 감소시키고/시키거나, 달성 연령, 상실 연령, 및 연령 적절한 발달 및 운동 이정표를 유지하거나 또는 획득하는 어린이의 백분율에 의해 평가 시 질환 진행을 감소시킨다.
치료는 신경인지 기능 상실을 늦춘다.
본 명세서에 인용된 모든 문서는 2018년 10월 1일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/739,811호, 및 2019년 4월 17일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/835,178호와 같이 본원에 참조로 포함된다. 유사하게, "18-8537PCT_SequenceListing_ST25.txt"로 표시된 함께 제출된 서열 목록, 및 그 안의 서열 및 텍스트가 참조로 포함된다. 본 발명이 특정 구현예를 참조하여 기재되었지만, 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
(서열 목록 프리 텍스트)
하기 정보는 숫자 식별기호 <223> 하에 프리 텍스트를 함유하는 서열에 제공된다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> COMPOSITIONS USEFUL FOR TREATING GM1 GANDLIOSIDOSIS <130> 18-8537PCT <150> US 62/739,811 <151> 2018-10-01 <150> US 62/835,178 <151> 2019-04-17 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVhu68 vp1 capsid of Homo Sapiens origin <220> <221> CDS <222> (1)..(2211) <400> 1 atg gct gcc gat ggt tat ctt cca gat tgg ctc gag gac aac ctc agt 48 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 gaa ggc att cgc gag tgg tgg gct ttg aaa cct gga gcc cct caa ccc 96 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 aag gca aat caa caa cat caa gac aac gct cgg ggt ctt gtg ctt ccg 144 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 ggt tac aaa tac ctt gga ccc ggc aac gga ctc gac aag ggg gag ccg 192 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 gtc aac gaa gca gac gcg gcg gcc ctc gag cac gac aag gcc tac gac 240 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 cag cag ctc aag gcc gga gac aac ccg tac ctc aag tac aac cac gcc 288 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 gac gcc gag ttc cag gag cgg ctc aaa gaa gat acg tct ttt ggg ggc 336 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 aac ctc ggg cga gca gtc ttc cag gcc aaa aag agg ctt ctt gaa cct 384 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 ctt ggt ctg gtt gag gaa gcg gct aag acg gct cct gga aag aag agg 432 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 cct gta gag cag tct cct cag gaa ccg gac tcc tcc gtg ggt att ggc 480 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Val Gly Ile Gly 145 150 155 160 aaa tcg ggt gca cag ccc gct aaa aag aga ctc aat ttc ggt cag act 528 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 ggc gac aca gag tca gtc ccc gac cct caa cca atc gga gaa cct ccc 576 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 gca gcc ccc tca ggt gtg gga tct ctt aca atg gct tca ggt ggt ggc 624 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 gca cca gtg gca gac aat aac gaa ggt gcc gat gga gtg ggt agt tcc 672 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 tcg gga aat tgg cat tgc gat tcc caa tgg ctg ggg gac aga gtc atc 720 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 acc acc agc acc cga acc tgg gcc ctg ccc acc tac aac aat cac ctc 768 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 tac aag caa atc tcc aac agc aca tct gga gga tct tca aat gac aac 816 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 gcc tac ttc ggc tac agc acc ccc tgg ggg tat ttt gac ttc aac aga 864 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 ttc cac tgc cac ttc tca cca cgt gac tgg caa aga ctc atc aac aac 912 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 aac tgg gga ttc cgg cct aag cga ctc aac ttc aag ctc ttc aac att 960 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 cag gtc aaa gag gtt acg gac aac aat gga gtc aag acc atc gct aat 1008 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 aac ctt acc agc acg gtc cag gtc ttc acg gac tca gac tat cag ctc 1056 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 ccg tac gtg ctc ggg tcg gct cac gag ggc tgc ctc ccg ccg ttc cca 1104 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 gcg gac gtt ttc atg att cct cag tac ggg tat cta acg ctt aat gat 1152 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 gga agc caa gcc gtg ggt cgt tcg tcc ttt tac tgc ctg gaa tat ttc 1200 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 ccg tcg caa atg cta aga acg ggt aac aac ttc cag ttc agc tac gag 1248 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 ttt gag aac gta cct ttc cat agc agc tat gct cac agc caa agc ctg 1296 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 gac cga ctc atg aat cca ctc atc gac caa tac ttg tac tat ctc tca 1344 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 aag act att aac ggt tct gga cag aat caa caa acg cta aaa ttc agt 1392 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 gtg gcc gga ccc agc aac atg gct gtc cag gga aga aac tac ata cct 1440 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 gga ccc agc tac cga caa caa cgt gtc tca acc act gtg act caa aac 1488 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 aac aac agc gaa ttt gct tgg cct gga gct tct tct tgg gct ctc aat 1536 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 gga cgt aat agc ttg atg aat cct gga cct gct atg gcc agc cac aaa 1584 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 gaa gga gag gac cgt ttc ttt cct ttg tct gga tct tta att ttt ggc 1632 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 aaa caa gga act gga aga gac aac gtg gat gcg gac aaa gtc atg ata 1680 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 acc aac gaa gaa gaa att aaa act acc aac cca gta gca acg gag tcc 1728 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 tat gga caa gtg gcc aca aac cac cag agt gcc caa gca cag gcg cag 1776 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 acc ggc tgg gtt caa aac caa gga ata ctt ccg ggt atg gtt tgg cag 1824 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 gac aga gat gtg tac ctg caa gga ccc att tgg gcc aaa att cct cac 1872 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 acg gac ggc aac ttt cac cct tct ccg ctg atg gga ggg ttt gga atg 1920 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 aag cac ccg cct cct cag atc ctc atc aaa aac aca cct gta cct gcg 1968 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 gat cct cca acg gct ttc aac aag gac aag ctg aac tct ttc atc acc 2016 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 cag tat tct act ggc caa gtc agc gtg gag att gag tgg gag ctg cag 2064 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 aag gaa aac agc aag cgc tgg aac ccg gag atc cag tac act tcc aac 2112 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 tat tac aag tct aat aat gtt gaa ttt gct gtt aat act gaa ggt gtt 2160 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 tat tct gaa ccc cgc ccc att ggc acc aga tac ctg act cgt aat ctg 2208 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 taa 2211 <210> 2 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Val Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 3 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hu68vp1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa may be W (Trp, tryptophan), or oxidated W. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa may be D (asp, aspartic acid), or isomerized D. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa may be D (asp, aspartic acid), or isomerized D. <220> <221> misc_feature <222> (113)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (149)..(149) <223> Xaa may be S (Ser, serine), or Phosphorilated S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (149)..(149) <223> Xaa may be S (Ser, serine), or Phosphorylated S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (247)..(247) <223> Xaa may be W (Trp, tryptophan), or oxidated W (e.g., kynurenine). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (253)..(253) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (259)..(259) <223> Xaa represents Q, or Q deamidated to glutamic acid (alpha-glutamic acid), gamma-glutamic acid (Glu), or a blend of alpha- and gamma-glutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (270)..(270) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (297)..(297) <223> Xaa represents D (Asp, aspartic acid) or amindated D to N (Asn, asparagine) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (304)..(304) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (306)..(306) <223> Xaa may be W (Trp, tryptophan), or oxidated W (e.g., kynurenine). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (314)..(314) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (319)..(319) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (329)..(329) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (332)..(332) <223> Xaa may be K (lys, lysine), or acetylated K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (336)..(336) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (384)..(384) <223> Xaa may be D (asp, aspartic acid), or isomerized D. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (404)..(404) <223> Xaa may be M (Met, Methionine), or oxidated M. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (409)..(409) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (436)..(436) <223> Xaa may be M (Met, Methionine), or oxidated M. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (452)..(452) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (477)..(477) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (499)..(499) <223> Xaa may be S (Ser, serine), or Phosphorylated S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (512)..(512) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (515)..(515) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (518)..(518) <223> Xaa may be M (Met, Methionine), or oxidated M. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (524)..(524) <223> Xaa may be M (Met, Methionine), or oxidated M. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (559)..(559) <223> Xaa may be M (Met, Methionine), or oxidated M. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (569)..(569) <223> Xaa may be T (Thr, threonine), or Phosphorylated T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (586)..(586) <223> Xaa may be S (Ser, serine), or Phosphorylated S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (599)..(599) <223> Xaa represents Q, or Q deamidated to glutamic acid (alpha-glutamic acid), gamma-glutamic acid (Glu), or a blend of alpha- and gamma-glutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (605)..(605) <223> Xaa may be M (Met, Methionine), or oxidated M. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (619)..(619) <223> Xaa may be W (Trp, tryptophan), or oxidated W (e.g., kynurenine). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (628)..(628) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (640)..(640) <223> Xaa may be M (Met, Methionine), or oxidated M. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (651)..(651) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (663)..(663) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (666)..(666) <223> Xaa may be K (lys, lysine), or acetylated K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (689)..(689) <223> Xaa may be K (lys, lysine), or acetylated K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (693)..(693) <223> Xaa may be K (lys, lysine), or acetylated K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (695)..(695) <223> Xaa may be W (Trp, tryptophan), or oxidated W. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (709)..(709) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (735)..(735) <223> Xaa may be Asn, or deamidated to Asp, isoAsp, or Asp/isoAsp <400> 3 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Xaa Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Xaa Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Xaa Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Xaa Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Xaa His Ala 85 90 95 Xaa Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Xaa Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Xaa Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Xaa Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Val Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Xaa Ala Leu Pro Thr Tyr Xaa Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Xaa Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Xaa Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Xaa Trp Gln Arg Leu Ile Asn Xaa 290 295 300 Asn Xaa Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Xaa Phe Lys Leu Phe Xaa Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Xaa Gly Val Xaa Thr Ile Ala Xaa 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Xaa 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Xaa Leu Arg Thr Gly Xaa Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Xaa Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Xaa Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Xaa Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Xaa Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Xaa 500 505 510 Gly Arg Xaa Ser Leu Xaa Asn Pro Gly Pro Ala Xaa Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Xaa Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Xaa Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Xaa Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Xaa Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Xaa Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Xaa Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Xaa 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Xaa Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Xaa Lys Asp Xaa Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Xaa Glu Asn Ser Xaa Arg Xaa Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Xaa Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Xaa Leu 725 730 735 <210> 4 <211> 677 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <220> <221> mat_peptide <222> (24)..(677) <400> 4 Met Pro Gly Phe Leu Val Arg Ile Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu -20 -15 -10 Leu Leu Gly Pro Thr Arg Gly Leu Arg Asn Ala Thr Gln Arg Met Phe -5 -1 1 5 Glu Ile Asp Tyr Ser Arg Asp Ser Phe Leu Lys Asp Gly Gln Pro Phe 10 15 20 25 Arg Tyr Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Arg Val Pro Arg Phe Tyr 30 35 40 Trp Lys Asp Arg Leu Leu Lys Met Lys Met Ala Gly Leu Asn Ala Ile 45 50 55 Gln Thr Tyr Val Pro Trp Asn Phe His Glu Pro Trp Pro Gly Gln Tyr 60 65 70 Gln Phe Ser Glu Asp His Asp Val Glu Tyr Phe Leu Arg Leu Ala His 75 80 85 Glu Leu Gly Leu Leu Val Ile Leu Arg Pro Gly Pro Tyr Ile Cys Ala 90 95 100 105 Glu Trp Glu Met Gly Gly Leu Pro Ala Trp Leu Leu Glu Lys Glu Ser 110 115 120 Ile Leu Leu Arg Ser Ser Asp Pro Asp Tyr Leu Ala Ala Val Asp Lys 125 130 135 Trp Leu Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Lys Pro Leu Leu Tyr Gln Asn 140 145 150 Gly Gly Pro Val Ile Thr Val Gln Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Tyr 155 160 165 Phe Ala Cys Asp Phe Asp Tyr Leu Arg Phe Leu Gln Lys Arg Phe Arg 170 175 180 185 His His Leu Gly Asp Asp Val Val Leu Phe Thr Thr Asp Gly Ala His 190 195 200 Lys Thr Phe Leu Lys Cys Gly Ala Leu Gln Gly Leu Tyr Thr Thr Val 205 210 215 Asp Phe Gly Thr Gly Ser Asn Ile Thr Asp Ala Phe Leu Ser Gln Arg 220 225 230 Lys Cys Glu Pro Lys Gly Pro Leu Ile Asn Ser Glu Phe Tyr Thr Gly 235 240 245 Trp Leu Asp His Trp Gly Gln Pro His Ser Thr Ile Lys Thr Glu Ala 250 255 260 265 Val Ala Ser Ser Leu Tyr Asp Ile Leu Ala Arg Gly Ala Ser Val Asn 270 275 280 Leu Tyr Met Phe Ile Gly Gly Thr Asn Phe Ala Tyr Trp Asn Gly Ala 285 290 295 Asn Ser Pro Tyr Ala Ala Gln Pro Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro 300 305 310 Leu Ser Glu Ala Gly Asp Leu Thr Glu Lys Tyr Phe Ala Leu Arg Asn 315 320 325 Ile Ile Gln Lys Phe Glu Lys Val Pro Glu Gly Pro Ile Pro Pro Ser 330 335 340 345 Thr Pro Lys Phe Ala Tyr Gly Lys Val Thr Leu Glu Lys Leu Lys Thr 350 355 360 Val Gly Ala Ala Leu Asp Ile Leu Cys Pro Ser Gly Pro Ile Lys Ser 365 370 375 Leu Tyr Pro Leu Thr Phe Ile Gln Val Lys Gln His Tyr Gly Phe Val 380 385 390 Leu Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gln Asp Cys Ser Asn Pro Ala Pro Leu 395 400 405 Ser Ser Pro Leu Asn Gly Val His Asp Arg Ala Tyr Val Ala Val Asp 410 415 420 425 Gly Ile Pro Gln Gly Val Leu Glu Arg Asn Asn Val Ile Thr Leu Asn 430 435 440 Ile Thr Gly Lys Ala Gly Ala Thr Leu Asp Leu Leu Val Glu Asn Met 445 450 455 Gly Arg Val Asn Tyr Gly Ala Tyr Ile Asn Asp Phe Lys Gly Leu Val 460 465 470 Ser Asn Leu Thr Leu Ser Ser Asn Ile Leu Thr Asp Trp Thr Ile Phe 475 480 485 Pro Leu Asp Thr Glu Asp Ala Val Arg Ser His Leu Gly Gly Trp Gly 490 495 500 505 His Arg Asp Ser Gly His His Asp Glu Ala Trp Ala His Asn Ser Ser 510 515 520 Asn Tyr Thr Leu Pro Ala Phe Tyr Met Gly Asn Phe Ser Ile Pro Ser 525 530 535 Gly Ile Pro Asp Leu Pro Gln Asp Thr Phe Ile Gln Phe Pro Gly Trp 540 545 550 Thr Lys Gly Gln Val Trp Ile Asn Gly Phe Asn Leu Gly Arg Tyr Trp 555 560 565 Pro Ala Arg Gly Pro Gln Leu Thr Leu Phe Val Pro Gln His Ile Leu 570 575 580 585 Met Thr Ser Ala Pro Asn Thr Ile Thr Val Leu Glu Leu Glu Trp Ala 590 595 600 Pro Cys Ser Ser Asp Asp Pro Glu Leu Cys Ala Val Thr Phe Val Asp 605 610 615 Arg Pro Val Ile Gly Ser Ser Val Thr Tyr Asp His Pro Ser Lys Pro 620 625 630 Val Glu Lys Arg Leu Met Pro Pro Pro Pro Gln Lys Asn Lys Asp Ser 635 640 645 Trp Leu Asp His Val 650 <210> 5 <211> 2034 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgccggggt tcctggttcg catcctcctt ctgctgctgg ttctgctgct tctgggccct 60 acgcgcggct tgcgcaatgc cacccagagg atgtttgaaa ttgactatag ccgggactcc 120 ttcctcaagg atggccagcc atttcgctac atctcaggaa gcattcacta ctcccgtgtg 180 ccccgcttct actggaagga ccggctgctg aagatgaaga tggctgggct gaacgccatc 240 cagacgtatg tgccctggaa ctttcatgag ccctggccag gacagtacca gttttctgag 300 gaccatgatg tggaatattt tcttcggctg gctcatgagc tgggactgct ggttatcctg 360 aggcccgggc cctacatctg tgcagagtgg gaaatgggag gattacctgc ttggctgcta 420 gagaaagagt ctattcttct ccgctcctcc gacccagatt acctggcagc tgtggacaag 480 tggttgggag tccttctgcc caagatgaag cctctcctct atcagaatgg agggccagtt 540 ataacagtgc aggttgaaaa tgaatatggc agctactttg cctgtgattt tgactacctg 600 cgcttcctgc agaagcgctt tcgccaccat ctgggggatg atgtggttct gtttaccact 660 gatggagcac ataaaacatt cctgaaatgt ggggccctgc agggcctcta caccacggtg 720 gactttggaa caggcagcaa catcacagat gctttcctaa gccagaggaa gtgtgagccc 780 aaaggaccct tgatcaattc tgaattctat actggctggc tagatcactg gggccaacct 840 cactccacaa tcaagaccga agcagtggct tcctccctct atgatatact tgcccgtggg 900 gcgagtgtga acttgtacat gtttataggt gggaccaatt ttgcctattg gaatggggcc 960 aactcaccct atgcagcaca gcccaccagc tacgactatg atgccccact gagtgaggct 1020 ggggacctca ctgagaagta ttttgctctg cgaaacatca tccagaagtt tgaaaaagta 1080 ccagaaggtc ctatccctcc atctacacca aagtttgcat atggaaaggt cactttggaa 1140 aagttaaaga cagtgggagc agctctggac attctgtgtc cctctgggcc catcaaaagc 1200 ctttatccct tgacatttat ccaggtgaaa cagcattatg ggtttgtgct gtaccggaca 1260 acacttcctc aagattgcag caacccagca cctctctctt cacccctcaa tggagtccac 1320 gatcgagcat atgttgctgt ggatgggatc ccccagggag tccttgagcg aaacaatgtg 1380 atcactctga acataacagg gaaagctgga gccactctgg accttctggt agagaacatg 1440 ggacgtgtga actatggtgc atatatcaac gattttaagg gtttggtttc taacctgact 1500 ctcagttcca atatcctcac ggactggacg atctttccac tggacactga ggatgcagtg 1560 cgcagccacc tggggggctg gggacaccgt gacagtggcc accatgatga agcctgggcc 1620 cacaactcat ccaactacac gctcccggcc ttttatatgg ggaacttctc cattcccagt 1680 gggatcccag acttgcccca ggacaccttt atccagtttc ctggatggac caagggccag 1740 gtctggatta atggctttaa ccttggccgc tattggccag cccggggccc tcagttgacc 1800 ttgtttgtgc cccagcacat cctgatgacc tcggccccaa acaccatcac cgtgctggaa 1860 ctggagtggg caccctgcag cagtgatgat ccagaactat gtgctgtgac gttcgtggac 1920 aggccagtta ttggctcatc tgtgacctac gatcatccct ccaaacctgt tgaaaaaaga 1980 ctcatgcccc cacccccgca aaaaaacaaa gattcatggc tggaccatgt atga 2034 <210> 6 <211> 2031 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered coding sequence for human GLB1 <400> 6 atgccgggct ttctggtgcg cattctgctg ctgctgctgg tgctgctgct gctgggcccg 60 acccgcggcc tgcgcaacgc gacccagcgc atgtttgaaa ttgattatag ccgcgatagc 120 tttctgaaag atggccagcc gtttcgctat attagcggca gcattcatta tagccgcgtg 180 ccgcgctttt attggaaaga tcgcctgctg aaaatgaaaa tggcgggcct gaacgcgatt 240 cagacctatg tgccgtggaa ctttcatgaa ccgtggccgg gccagtatca gtttagcgaa 300 gatcatgatg tggaatattt tctgcgcctg gcgcatgaac tgggcctgct ggtgattctg 360 cgcccgggcc cgtatatttg cgcggaatgg gaaatgggcg gcctgccggc gtggctgctg 420 gaaaaagaaa gcattctgct gcgcagcagc gatccggatt atctggcggc ggtggataaa 480 tggctgggcg tgctgctgcc gaaaatgaaa ccgctgctgt atcagaacgg cggcccggtg 540 attaccgtgc aggtggaaaa cgaatatggc agctattttg cgtgcgattt tgattatctg 600 cgctttctgc agaaacgctt tcgccatcat ctgggcgatg atgtggtgct gtttaccacc 660 gatggcgcgc ataaaacctt tctgaaatgc ggcgcgctgc agggcctgta taccaccgtg 720 gattttggca ccggcagcaa cattaccgat gcgtttctga gccagcgcaa atgcgaaccg 780 aaaggcccgc tgattaacag cgaattttat accggctggc tggatcattg gggccagccg 840 catagcacca ttaaaaccga agcggtggcg agcagcctgt atgatattct ggcgcgcggc 900 gcgagcgtga acctgtatat gtttattggc ggcaccaact ttgcgtattg gaacggcgcg 960 aacagcccgt atgcggcgca gccgaccagc tatgattatg atgcgccgct gagcgaagcg 1020 ggcgatctga ccgaaaaata ttttgcgctg cgcaacatta ttcagaaatt tgaaaaagtg 1080 ccggaaggcc cgattccgcc gagcaccccg aaatttgcgt atggcaaagt gaccctggaa 1140 aaactgaaaa ccgtgggcgc ggcgctggat attctgtgcc cgagcggccc gattaaaagc 1200 ctgtatccgc tgacctttat tcaggtgaaa cagcattatg gctttgtgct gtatcgcacc 1260 accctgccgc aggattgcag caacccggcg ccgctgagca gcccgctgaa cggcgtgcat 1320 gatcgcgcgt atgtggcggt ggatggcatt ccgcagggcg tgctggaacg caacaacgtg 1380 attaccctga acattaccgg caaagcgggc gcgaccctgg atctgctggt ggaaaacatg 1440 ggccgcgtga actatggcgc gtatattaac gattttaaag gcctggtgag caacctgacc 1500 ctgagcagca acattctgac cgattggacc atttttccgc tggataccga agatgcggtg 1560 cgcagccatc tgggcggctg gggccatcgc gatagcggcc atcatgatga agcgtgggcg 1620 cataacagca gcaactatac cctgccggcg ttttatatgg gcaactttag cattccgagc 1680 ggcattccgg atctgccgca ggataccttt attcagtttc cgggctggac caaaggccag 1740 gtgtggatta acggctttaa cctgggccgc tattggccgg cgcgcggccc gcagctgacc 1800 ctgtttgtgc cgcagcatat tctgatgacc agcgcgccga acaccattac cgtgctggaa 1860 ctggaatggg cgccgtgcag cagcgatgat ccggaactgt gcgcggtgac ctttgtggat 1920 cgcccggtga ttggcagcag cgtgacctat gatcatccga gcaaaccggt ggaaaaacgc 1980 ctgatgccgc cgccgccgca gaaaaacaaa gatagctggc tggatcatgt g 2031 <210> 7 <211> 2031 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered coding sequence for human GLB1 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (90)..(90) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (111)..(111) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (114)..(114) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (126)..(126) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (135)..(135) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (141)..(141) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (147)..(147) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (156)..(156) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (159)..(159) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (162)..(162) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (177)..(177) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (180)..(180) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (183)..(183) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (186)..(186) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (207)..(207) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (210)..(210) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (225)..(225) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (228)..(228) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (231)..(231) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (237)..(237) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (252)..(252) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (255)..(255) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (273)..(273) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (279)..(279) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (282)..(282) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (297)..(297) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (312)..(312) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (324)..(324) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (327)..(327) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (330)..(330) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (333)..(333) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (342)..(342) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (345)..(345) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (348)..(348) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (351)..(351) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (354)..(354) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (360)..(360) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (363)..(363) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (366)..(366) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (369)..(369) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (372)..(372) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (384)..(384) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (399)..(399) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (402)..(402) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (405)..(405) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (408)..(408) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (411)..(411) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (417)..(417) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (420)..(420) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (432)..(432) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (438)..(438) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (441)..(441) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (444)..(444) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (447)..(447) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (450)..(450) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (456)..(456) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (465)..(465) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (468)..(468) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (471)..(471) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (474)..(474) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (486)..(486) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (489)..(489) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (492)..(492) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (495)..(495) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (498)..(498) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (501)..(501) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (513)..(513) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (516)..(516) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (519)..(519) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (531)..(531) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (534)..(534) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (537)..(537) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (540)..(540) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (546)..(546) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (549)..(549) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (555)..(555) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (570)..(570) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (573)..(573) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (582)..(582) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (600)..(600) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (603)..(603) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (609)..(609) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (618)..(618) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (624)..(624) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (633)..(633) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (636)..(636) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (645)..(645) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (648)..(648) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (651)..(651) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (657)..(657) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (660)..(660) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (666)..(666) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (669)..(669) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (678)..(678) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (684)..(684) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (693)..(693) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (696)..(696) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (699)..(699) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (705)..(705) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (708)..(708) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (714)..(714) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (717)..(717) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (720)..(720) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (729)..(729) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (732)..(732) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (735)..(735) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (738)..(738) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (747)..(747) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (753)..(753) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (759)..(759) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (762)..(762) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (768)..(768) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (780)..(780) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (786)..(786) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (789)..(789) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (792)..(792) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (801)..(801) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (813)..(813) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (816)..(816) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (822)..(822) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (834)..(834) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (840)..(840) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (846)..(846) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (849)..(849) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (858)..(858) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (864)..(864) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (867)..(867) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (870)..(870) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (873)..(873) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (876)..(876) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (879)..(879) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (891)..(891) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (894)..(894) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (897)..(897) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (900)..(900) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (903)..(903) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (906)..(906) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (909)..(909) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (915)..(915) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (930)..(930) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (933)..(933) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (936)..(936) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (945)..(945) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (957)..(957) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (960)..(960) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (966)..(966) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (969)..(969) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (975)..(975) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (978)..(978) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (984)..(984) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (987)..(987) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (990)..(990) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1005)..(1005) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1008)..(1008) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1011)..(1011) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1014)..(1014) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1020)..(1020) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1023)..(1023) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1029)..(1029) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1032)..(1032) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1047)..(1047) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1050)..(1050) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1053)..(1053) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1080)..(1080) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1083)..(1083) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1089)..(1089) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1092)..(1092) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1098)..(1098) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1101)..(1101) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1104)..(1104) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1107)..(1107) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1110)..(1110) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1119)..(1119) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1125)..(1125) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1131)..(1131) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1134)..(1134) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1137)..(1137) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1146)..(1146) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1152)..(1152) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1155)..(1155) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1158)..(1158) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1161)..(1161) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1164)..(1164) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1167)..(1167) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1176)..(1176) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1182)..(1182) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1185)..(1185) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1188)..(1188) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1191)..(1191) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1200)..(1200) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1203)..(1203) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1209)..(1209) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1212)..(1212) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1215)..(1215) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1227)..(1227) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1242)..(1242) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1248)..(1248) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1251)..(1251) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1257)..(1257) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1260)..(1260) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1263)..(1263) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1266)..(1266) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1269)..(1269) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1281)..(1281) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1287)..(1287) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1290)..(1290) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1293)..(1293) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1296)..(1296) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1299)..(1299) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1302)..(1302) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1305)..(1305) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1308)..(1308) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1314)..(1314) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1317)..(1317) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1326)..(1326) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1329)..(1329) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1335)..(1335) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1338)..(1338) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1341)..(1341) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1347)..(1347) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1353)..(1353) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1359)..(1359) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1362)..(1362) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1365)..(1365) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1371)..(1371) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1380)..(1380) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1386)..(1386) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1389)..(1389) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1398)..(1398) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1401)..(1401) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1407)..(1407) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1410)..(1410) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1413)..(1413) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1416)..(1416) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1419)..(1419) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1425)..(1425) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1428)..(1428) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1431)..(1431) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1443)..(1443) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1446)..(1446) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1449)..(1449) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1458)..(1458) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1461)..(1461) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1482)..(1482) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1485)..(1485) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1488)..(1488) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1491)..(1491) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1497)..(1497) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1500)..(1500) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1503)..(1503) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1506)..(1506) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1509)..(1509) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1518)..(1518) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1521)..(1521) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1530)..(1530) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1539)..(1539) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1542)..(1542) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1548)..(1548) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1557)..(1557) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1560)..(1560) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1563)..(1563) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1566)..(1566) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1572)..(1572) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1575)..(1575) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1578)..(1578) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1584)..(1584) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1590)..(1590) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1596)..(1596) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1599)..(1599) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1614)..(1614) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1620)..(1620) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1629)..(1629) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1632)..(1632) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1641)..(1641) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1644)..(1644) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1647)..(1647) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1650)..(1650) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1662)..(1662) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1671)..(1671) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1677)..(1677) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1680)..(1680) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1683)..(1683) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1689)..(1689) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1695)..(1695) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1698)..(1698) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1707)..(1707) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1722)..(1722) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1725)..(1725) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1731)..(1731) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1737)..(1737) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1743)..(1743) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1755)..(1755) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1764)..(1764) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1767)..(1767) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1770)..(1770) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1779)..(1779) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1782)..(1782) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1785)..(1785) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1788)..(1788) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1791)..(1791) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1797)..(1797) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1800)..(1800) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1803)..(1803) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1809)..(1809) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1812)..(1812) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1824)..(1824) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1830)..(1830) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1833)..(1833) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1836)..(1836) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1839)..(1839) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1845)..(1845) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1851)..(1851) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1854)..(1854) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1857)..(1857) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1863)..(1863) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1872)..(1872) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1875)..(1875) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1881)..(1881) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1884)..(1884) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1893)..(1893) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1899)..(1899) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1905)..(1905) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1908)..(1908) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1911)..(1911) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1917)..(1917) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1923)..(1923) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1926)..(1926) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1929)..(1929) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1935)..(1935) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1938)..(1938) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1941)..(1941) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1944)..(1944) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1947)..(1947) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1959)..(1959) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1962)..(1962) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1968)..(1968) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1971)..(1971) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1980)..(1980) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1983)..(1983) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1989)..(1989) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1992)..(1992) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1995)..(1995) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1998)..(1998) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (2016)..(2016) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (2022)..(2022) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (2031)..(2031) <223> n is a, c, g, or t <400> 7 atgccnggnt tyytngtnmg nathytnytn ytnytnytng tnytnytnyt nytnggnccn 60 acnmgnggny tnmgnaaygc nacncarmgn atgttygara thgaytayws nmgngaywsn 120 ttyytnaarg ayggncarcc nttymgntay athwsnggnw snathcayta ywsnmgngtn 180 ccnmgnttyt aytggaarga ymgnytnytn aaratgaara tggcnggnyt naaygcnath 240 caracntayg tnccntggaa yttycaygar ccntggccng gncartayca rttywsngar 300 gaycaygayg tngartaytt yytnmgnytn gcncaygary tnggnytnyt ngtnathytn 360 mgnccnggnc cntayathtg ygcngartgg garatgggng gnytnccngc ntggytnytn 420 garaargarw snathytnyt nmgnwsnwsn gayccngayt ayytngcngc ngtngayaar 480 tggytnggng tnytnytncc naaratgaar ccnytnytnt aycaraaygg nggnccngtn 540 athacngtnc argtngaraa ygartayggn wsntayttyg cntgygaytt ygaytayytn 600 mgnttyytnc araarmgntt ymgncaycay ytnggngayg aygtngtnyt nttyacnacn 660 gayggngcnc ayaaracntt yytnaartgy ggngcnytnc arggnytnta yacnacngtn 720 gayttyggna cnggnwsnaa yathacngay gcnttyytnw sncarmgnaa rtgygarccn 780 aarggnccny tnathaayws ngarttytay acnggntggy tngaycaytg gggncarccn 840 caywsnacna thaaracnga rgcngtngcn wsnwsnytnt aygayathyt ngcnmgnggn 900 gcnwsngtna ayytntayat gttyathggn ggnacnaayt tygcntaytg gaayggngcn 960 aaywsnccnt aygcngcnca rccnacnwsn taygaytayg aygcnccnyt nwsngargcn 1020 ggngayytna cngaraarta yttygcnytn mgnaayatha thcaraartt ygaraargtn 1080 ccngarggnc cnathccncc nwsnacnccn aarttygcnt ayggnaargt nacnytngar 1140 aarytnaara cngtnggngc ngcnytngay athytntgyc cnwsnggncc nathaarwsn 1200 ytntayccny tnacnttyat hcargtnaar carcaytayg gnttygtnyt ntaymgnacn 1260 acnytnccnc argaytgyws naayccngcn ccnytnwsnw snccnytnaa yggngtncay 1320 gaymgngcnt aygtngcngt ngayggnath ccncarggng tnytngarmg naayaaygtn 1380 athacnytna ayathacngg naargcnggn gcnacnytng ayytnytngt ngaraayatg 1440 ggnmgngtna aytayggngc ntayathaay gayttyaarg gnytngtnws naayytnacn 1500 ytnwsnwsna ayathytnac ngaytggacn athttyccny tngayacnga rgaygcngtn 1560 mgnwsncayy tnggnggntg gggncaymgn gaywsnggnc aycaygayga rgcntgggcn 1620 cayaaywsnw snaaytayac nytnccngcn ttytayatgg gnaayttyws nathccnwsn 1680 ggnathccng ayytnccnca rgayacntty athcarttyc cnggntggac naarggncar 1740 gtntggatha ayggnttyaa yytnggnmgn taytggccng cnmgnggncc ncarytnacn 1800 ytnttygtnc cncarcayat hytnatgacn wsngcnccna ayacnathac ngtnytngar 1860 ytngartggg cnccntgyws nwsngaygay ccngarytnt gygcngtnac nttygtngay 1920 mgnccngtna thggnwsnws ngtnacntay gaycayccnw snaarccngt ngaraarmgn 1980 ytnatgccnc cnccnccnca raaraayaar gaywsntggy tngaycaygt n 2031 <210> 8 <211> 2034 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered coding sequence for human GLB1 <400> 8 atgcccggct ttctcgtgcg gattctcctg ctgctgctgg tgcttctgct gctgggccct 60 accagaggcc tgagaaacgc cacccagcgg atgttcgaga tcgactacag ccgggacagc 120 ttcctgaagg acggccagcc cttccggtac atcagcggca gcatccacta cagcagagtg 180 ccccggttct actggaagga ccggctgctg aagatgaaga tggccggcct gaacgccatc 240 cagacctacg tgccctggaa cttccacgag ccttggcctg gccagtacca gttcagcgag 300 gaccacgacg tggaatactt tctgcggctg gcccacgagc tgggcctgct cgtgattctg 360 aggcctggcc cttacatctg cgccgagtgg gagatgggag gactgcctgc ttggctgctg 420 gaaaaagaga gcatcctgct gcggagcagc gaccccgatt atctggccgc cgtggataag 480 tggctgggcg tgctgctgcc caagatgaag cccctgctgt accagaacgg cggacccgtg 540 atcaccgtgc aggtggaaaa cgagtacggc agctacttcg cctgcgactt cgactacctg 600 cggttcctgc agaagcggtt cagacaccac ctgggcgacg acgtggtgct gttcacaaca 660 gacggcgccc acaagacctt tctgaagtgt ggcgctctgc agggcctgta caccaccgtg 720 gattttggca ccggcagcaa tatcaccgac gcctttctga gccagcggaa gtgcgagcca 780 aagggccccc tgatcaacag cgagttctac accggctggc tggaccactg gggccagcct 840 cacagcacca tcaagacaga ggccgtggcc agcagcctgt acgacatcct ggctagaggc 900 gccagcgtga acctgtacat gtttatcggc ggcaccaact tcgcctactg gaacggcgcc 960 aacagccctt atgccgccca gcccaccagc tacgactacg atgcccctct gtctgaggcc 1020 ggcgacctga ccgagaagta ctttgccctg cggaacatca tccagaaatt cgagaaggtg 1080 cccgagggcc ccatcccccc tagcacacct aagttcgcct acggcaaagt gaccctggaa 1140 aagctgaaaa ccgtgggagc cgccctggac atcctgtgtc ctagcggccc tatcaagagc 1200 ctgtaccccc tgaccttcat ccaagtgaag cagcactacg gcttcgtgct gtaccggacc 1260 accctgcccc aggactgtag caatcctgcc ccactgagca gccccctgaa cggcgtgcac 1320 gatagagcct acgtggccgt ggatggcatc ccacaggggg tgctggaacg gaacaatgtg 1380 atcaccctga acatcaccgg caaggctggc gccaccctgg acctgctggt ggaaaacatg 1440 ggcagagtga actacggcgc ctacatcaac gacttcaagg gcctggtgtc caacctgacc 1500 ctgagcagca acatcctgac cgactggacc atcttcccac tggacaccga ggatgccgtg 1560 cggagccatc tgggaggatg gggacacaga gatagcggcc accacgatga agcctgggcc 1620 cacaacagca gcaactacac cctgcctgcc ttctacatgg gcaacttcag catccccagc 1680 ggcatccccg acctgccaca ggacaccttt atccagttcc ccggctggac aaagggacaa 1740 gtgtggatca atggcttcaa cctgggcaga tactggcccg ccagaggccc tcagctgacc 1800 ctgtttgtgc cccagcacat tctgatgacc agcgccccca acaccatcac cgtgctggaa 1860 ctggaatggg ccccctgcag cagcgacgac cctgaactgt gtgccgtgac cttcgtggac 1920 aggcccgtga tcggcagcag cgtgacctac gaccacccca gcaagcccgt ggaaaagcgg 1980 ctgatgcctc ccccacccca gaagaacaag gactcctggc tggatcacgt gtga 2034 <210> 9 <211> 1229 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg 60 ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag 120 cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag 180 gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg 240 aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat 300 gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt 360 cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct 420 ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc 480 caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt ggggggagcg 540 cagcaaaatg gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga 600 ggtcgttgaa acaaggtggg gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc ttgaggcctt 660 cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc tggggaccct 720 gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt 780 tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc 840 gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg 900 cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat 960 cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt tctttggtcg 1020 gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg 1080 ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca 1140 atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct 1200 tttttgttag acgaagcttt attgcggta 1229 <210> 10 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chicken beta actin promoter with a cytomegalovirus enhancer (CB7) <400> 10 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc 420 ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg 480 cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg 540 ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa 600 agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc 660 gggcgg 666 <210> 11 <211> 1180 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> human elongation initiation factor 1 alpha promoter (EF1a) <400> 11 tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 60 gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 120 tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 180 agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc 240 cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat 300 tacttccacc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg 360 ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg 420 gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc 480 tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg 540 gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc 600 cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg 660 agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc 720 tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc 780 agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag 840 gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc 900 gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga 960 ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat 1020 ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta 1080 attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac 1140 agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga 1180 <210> 12 <211> 4205 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> UbC.GLB1.SV40 vector genome <400> 12 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatct ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg 240 gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg 300 ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag 360 gacattttag gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga 420 acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt 480 gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg 540 ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg 600 ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg 660 gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt 720 ggggggagcg cagcaaaatg gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg 780 cgggctgtga ggtcgttgaa acaaggtggg gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc 840 ttgaggcctt cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc 900 tggggaccct gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg 960 gggcggcagt tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc 1020 tcgtcgtgtc gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc 1080 ggtaggtgtg cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc 1140 tctcctgaat cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt 1200 tctttggtcg gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat 1260 gcgctcgggg ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc 1320 atttgggtca atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc 1380 gtttttggct tttttgttag acgaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct 1440 aacgcagtca gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagaag ttggtcgtga 1500 ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca atagaaactg 1560 ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac 1620 atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaattacag ctcttaaggc 1680 tagagtactt aatacgactc actataggct agaattcacg cgtgccacca tgcccggctt 1740 tctcgtgcgg attctcctgc tgctgctggt gcttctgctg ctgggcccta ccagaggcct 1800 gagaaacgcc acccagcgga tgttcgagat cgactacagc cgggacagct tcctgaagga 1860 cggccagccc ttccggtaca tcagcggcag catccactac agcagagtgc cccggttcta 1920 ctggaaggac cggctgctga agatgaagat ggccggcctg aacgccatcc agacctacgt 1980 gccctggaac ttccacgagc cttggcctgg ccagtaccag ttcagcgagg accacgacgt 2040 ggaatacttt ctgcggctgg cccacgagct gggcctgctc gtgattctga ggcctggccc 2100 ttacatctgc gccgagtggg agatgggagg actgcctgct tggctgctgg aaaaagagag 2160 catcctgctg cggagcagcg accccgatta tctggccgcc gtggataagt ggctgggcgt 2220 gctgctgccc aagatgaagc ccctgctgta ccagaacggc ggacccgtga tcaccgtgca 2280 ggtggaaaac gagtacggca gctacttcgc ctgcgacttc gactacctgc ggttcctgca 2340 gaagcggttc agacaccacc tgggcgacga cgtggtgctg ttcacaacag acggcgccca 2400 caagaccttt ctgaagtgtg gcgctctgca gggcctgtac accaccgtgg attttggcac 2460 cggcagcaat atcaccgacg cctttctgag ccagcggaag tgcgagccaa agggccccct 2520 gatcaacagc gagttctaca ccggctggct ggaccactgg ggccagcctc acagcaccat 2580 caagacagag gccgtggcca gcagcctgta cgacatcctg gctagaggcg ccagcgtgaa 2640 cctgtacatg tttatcggcg gcaccaactt cgcctactgg aacggcgcca acagccctta 2700 tgccgcccag cccaccagct acgactacga tgcccctctg tctgaggccg gcgacctgac 2760 cgagaagtac tttgccctgc ggaacatcat ccagaaattc gagaaggtgc ccgagggccc 2820 catcccccct agcacaccta agttcgccta cggcaaagtg accctggaaa agctgaaaac 2880 cgtgggagcc gccctggaca tcctgtgtcc tagcggccct atcaagagcc tgtaccccct 2940 gaccttcatc caagtgaagc agcactacgg cttcgtgctg taccggacca ccctgcccca 3000 ggactgtagc aatcctgccc cactgagcag ccccctgaac ggcgtgcacg atagagccta 3060 cgtggccgtg gatggcatcc cacagggggt gctggaacgg aacaatgtga tcaccctgaa 3120 catcaccggc aaggctggcg ccaccctgga cctgctggtg gaaaacatgg gcagagtgaa 3180 ctacggcgcc tacatcaacg acttcaaggg cctggtgtcc aacctgaccc tgagcagcaa 3240 catcctgacc gactggacca tcttcccact ggacaccgag gatgccgtgc ggagccatct 3300 gggaggatgg ggacacagag atagcggcca ccacgatgaa gcctgggccc acaacagcag 3360 caactacacc ctgcctgcct tctacatggg caacttcagc atccccagcg gcatccccga 3420 cctgccacag gacaccttta tccagttccc cggctggaca aagggacaag tgtggatcaa 3480 tggcttcaac ctgggcagat actggcccgc cagaggccct cagctgaccc tgtttgtgcc 3540 ccagcacatt ctgatgacca gcgcccccaa caccatcacc gtgctggaac tggaatgggc 3600 cccctgcagc agcgacgacc ctgaactgtg tgccgtgacc ttcgtggaca ggcccgtgat 3660 cggcagcagc gtgacctacg accaccccag caagcccgtg gaaaagcggc tgatgcctcc 3720 cccaccccag aagaacaagg actcctggct ggatcacgtg tgatgactcg aggccgcttc 3780 gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa 3840 aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct 3900 gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggaga 3960 tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtaaaatc gataaggatc 4020 ttcctagagc atggctacgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa 4080 cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg 4140 cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg 4200 cgcag 4205 <210> 13 <211> 4081 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a.GLB1.SV40 vector genome <400> 13 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatcc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctaggctttt 240 gcaaaaagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg 300 gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 360 cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 420 gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 480 cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 540 cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 600 tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 660 tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc 720 cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat 780 ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt 840 ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga 900 tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca 960 gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta 1020 gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc 1080 ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc 1140 cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 1200 gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac 1260 ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc 1320 tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac 1380 tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt 1440 tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca 1500 ggtgtcgtga ggaattagct tggtactaat acgactcact atagggagac ccaagctggc 1560 taggtaagct tggtaccgag ctcggatcaa ttcacgcgtg ccaccatgcc cggctttctc 1620 gtgcggattc tcctgctgct gctggtgctt ctgctgctgg gccctaccag aggcctgaga 1680 aacgccaccc agcggatgtt cgagatcgac tacagccggg acagcttcct gaaggacggc 1740 cagcccttcc ggtacatcag cggcagcatc cactacagca gagtgccccg gttctactgg 1800 aaggaccggc tgctgaagat gaagatggcc ggcctgaacg ccatccagac ctacgtgccc 1860 tggaacttcc acgagccttg gcctggccag taccagttca gcgaggacca cgacgtggaa 1920 tactttctgc ggctggccca cgagctgggc ctgctcgtga ttctgaggcc tggcccttac 1980 atctgcgccg agtgggagat gggaggactg cctgcttggc tgctggaaaa agagagcatc 2040 ctgctgcgga gcagcgaccc cgattatctg gccgccgtgg ataagtggct gggcgtgctg 2100 ctgcccaaga tgaagcccct gctgtaccag aacggcggac ccgtgatcac cgtgcaggtg 2160 gaaaacgagt acggcagcta cttcgcctgc gacttcgact acctgcggtt cctgcagaag 2220 cggttcagac accacctggg cgacgacgtg gtgctgttca caacagacgg cgcccacaag 2280 acctttctga agtgtggcgc tctgcagggc ctgtacacca ccgtggattt tggcaccggc 2340 agcaatatca ccgacgcctt tctgagccag cggaagtgcg agccaaaggg ccccctgatc 2400 aacagcgagt tctacaccgg ctggctggac cactggggcc agcctcacag caccatcaag 2460 acagaggccg tggccagcag cctgtacgac atcctggcta gaggcgccag cgtgaacctg 2520 tacatgttta tcggcggcac caacttcgcc tactggaacg gcgccaacag cccttatgcc 2580 gcccagccca ccagctacga ctacgatgcc cctctgtctg aggccggcga cctgaccgag 2640 aagtactttg ccctgcggaa catcatccag aaattcgaga aggtgcccga gggccccatc 2700 ccccctagca cacctaagtt cgcctacggc aaagtgaccc tggaaaagct gaaaaccgtg 2760 ggagccgccc tggacatcct gtgtcctagc ggccctatca agagcctgta ccccctgacc 2820 ttcatccaag tgaagcagca ctacggcttc gtgctgtacc ggaccaccct gccccaggac 2880 tgtagcaatc ctgccccact gagcagcccc ctgaacggcg tgcacgatag agcctacgtg 2940 gccgtggatg gcatcccaca gggggtgctg gaacggaaca atgtgatcac cctgaacatc 3000 accggcaagg ctggcgccac cctggacctg ctggtggaaa acatgggcag agtgaactac 3060 ggcgcctaca tcaacgactt caagggcctg gtgtccaacc tgaccctgag cagcaacatc 3120 ctgaccgact ggaccatctt cccactggac accgaggatg ccgtgcggag ccatctggga 3180 ggatggggac acagagatag cggccaccac gatgaagcct gggcccacaa cagcagcaac 3240 tacaccctgc ctgccttcta catgggcaac ttcagcatcc ccagcggcat ccccgacctg 3300 ccacaggaca cctttatcca gttccccggc tggacaaagg gacaagtgtg gatcaatggc 3360 ttcaacctgg gcagatactg gcccgccaga ggccctcagc tgaccctgtt tgtgccccag 3420 cacattctga tgaccagcgc ccccaacacc atcaccgtgc tggaactgga atgggccccc 3480 tgcagcagcg acgaccctga actgtgtgcc gtgaccttcg tggacaggcc cgtgatcggc 3540 agcagcgtga cctacgacca ccccagcaag cccgtggaaa agcggctgat gcctccccca 3600 ccccagaaga acaaggactc ctggctggat cacgtgtgat gactcgaggc cgcttcgagc 3660 agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa 3720 atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 3780 taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggagatgtg 3840 ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt aaaatcgata aggatcttcc 3900 tagagcatgg ctacgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc 3960 tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 4020 caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 4080 g 4081 <210> 14 <211> 4202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UbC.GLB1.SV40 - 2 <400> 14 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatct ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg 240 gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg 300 ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag 360 gacattttag gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga 420 acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt 480 gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg 540 ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg 600 ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg 660 gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt 720 ggggggagcg cagcaaaatg gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg 780 cgggctgtga ggtcgttgaa acaaggtggg gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc 840 ttgaggcctt cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc 900 tggggaccct gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg 960 gggcggcagt tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc 1020 tcgtcgtgtc gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc 1080 ggtaggtgtg cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc 1140 tctcctgaat cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt 1200 tctttggtcg gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat 1260 gcgctcgggg ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc 1320 atttgggtca atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc 1380 gtttttggct tttttgttag acgaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct 1440 aacgcagtca gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagaag ttggtcgtga 1500 ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca atagaaactg 1560 ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac 1620 atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaattacag ctcttaaggc 1680 tagagtactt aatacgactc actataggct agaattcacg cgtgccacca tgccgggctt 1740 tctggtgcgc attctgctgc tgctgctggt gctgctgctg ctgggcccga cccgcggcct 1800 gcgcaacgcg acccagcgca tgtttgaaat tgattatagc cgcgatagct ttctgaaaga 1860 tggccagccg tttcgctata ttagcggcag cattcattat agccgcgtgc cgcgctttta 1920 ttggaaagat cgcctgctga aaatgaaaat ggcgggcctg aacgcgattc agacctatgt 1980 gccgtggaac tttcatgaac cgtggccggg ccagtatcag tttagcgaag atcatgatgt 2040 ggaatatttt ctgcgcctgg cgcatgaact gggcctgctg gtgattctgc gcccgggccc 2100 gtatatttgc gcggaatggg aaatgggcgg cctgccggcg tggctgctgg aaaaagaaag 2160 cattctgctg cgcagcagcg atccggatta tctggcggcg gtggataaat ggctgggcgt 2220 gctgctgccg aaaatgaaac cgctgctgta tcagaacggc ggcccggtga ttaccgtgca 2280 ggtggaaaac gaatatggca gctattttgc gtgcgatttt gattatctgc gctttctgca 2340 gaaacgcttt cgccatcatc tgggcgatga tgtggtgctg tttaccaccg atggcgcgca 2400 taaaaccttt ctgaaatgcg gcgcgctgca gggcctgtat accaccgtgg attttggcac 2460 cggcagcaac attaccgatg cgtttctgag ccagcgcaaa tgcgaaccga aaggcccgct 2520 gattaacagc gaattttata ccggctggct ggatcattgg ggccagccgc atagcaccat 2580 taaaaccgaa gcggtggcga gcagcctgta tgatattctg gcgcgcggcg cgagcgtgaa 2640 cctgtatatg tttattggcg gcaccaactt tgcgtattgg aacggcgcga acagcccgta 2700 tgcggcgcag ccgaccagct atgattatga tgcgccgctg agcgaagcgg gcgatctgac 2760 cgaaaaatat tttgcgctgc gcaacattat tcagaaattt gaaaaagtgc cggaaggccc 2820 gattccgccg agcaccccga aatttgcgta tggcaaagtg accctggaaa aactgaaaac 2880 cgtgggcgcg gcgctggata ttctgtgccc gagcggcccg attaaaagcc tgtatccgct 2940 gacctttatt caggtgaaac agcattatgg ctttgtgctg tatcgcacca ccctgccgca 3000 ggattgcagc aacccggcgc cgctgagcag cccgctgaac ggcgtgcatg atcgcgcgta 3060 tgtggcggtg gatggcattc cgcagggcgt gctggaacgc aacaacgtga ttaccctgaa 3120 cattaccggc aaagcgggcg cgaccctgga tctgctggtg gaaaacatgg gccgcgtgaa 3180 ctatggcgcg tatattaacg attttaaagg cctggtgagc aacctgaccc tgagcagcaa 3240 cattctgacc gattggacca tttttccgct ggataccgaa gatgcggtgc gcagccatct 3300 gggcggctgg ggccatcgcg atagcggcca tcatgatgaa gcgtgggcgc ataacagcag 3360 caactatacc ctgccggcgt tttatatggg caactttagc attccgagcg gcattccgga 3420 tctgccgcag gataccttta ttcagtttcc gggctggacc aaaggccagg tgtggattaa 3480 cggctttaac ctgggccgct attggccggc gcgcggcccg cagctgaccc tgtttgtgcc 3540 gcagcatatt ctgatgacca gcgcgccgaa caccattacc gtgctggaac tggaatgggc 3600 gccgtgcagc agcgatgatc cggaactgtg cgcggtgacc tttgtggatc gcccggtgat 3660 tggcagcagc gtgacctatg atcatccgag caaaccggtg gaaaaacgcc tgatgccgcc 3720 gccgccgcag aaaaacaaag atagctggct ggatcatgtg tgactcgagg ccgcttcgag 3780 cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 3840 aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 3900 ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 3960 gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg taaaatcgat aaggatcttc 4020 ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc 4080 ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 4140 ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 4200 ag 4202 <210> 15 <211> 4206 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> UbC.GLB1.SV40 - 3 <400> 15 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatct ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg 240 gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg 300 ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag 360 gacattttag gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga 420 acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt 480 gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg 540 ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg 600 ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg 660 gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt 720 ggggggagcg cagcaaaatg gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg 780 cgggctgtga ggtcgttgaa acaaggtggg gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc 840 ttgaggcctt cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc 900 tggggaccct gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg 960 gggcggcagt tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc 1020 tcgtcgtgtc gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc 1080 ggtaggtgtg cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc 1140 tctcctgaat cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt 1200 tctttggtcg gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat 1260 gcgctcgggg ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc 1320 atttgggtca atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc 1380 gtttttggct tttttgttag acgaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct 1440 aacgcagtca gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagaag ttggtcgtga 1500 ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca atagaaactg 1560 ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac 1620 atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaattacag ctcttaaggc 1680 tagagtactt aatacgactc actataggct agaattcacg cgtgccacca tgccggggtt 1740 cctggttcgc atcctccttc tgctgctggt tctgctgctt ctgggcccta cgcgcggctt 1800 gcgcaatgcc acccagagga tgtttgaaat tgactatagc cgggactcct tcctcaagga 1860 tggccagcca tttcgctaca tctcaggaag cattcactac tcccgtgtgc cccgcttcta 1920 ctggaaggac cggctgctga agatgaagat ggctgggctg aacgccatcc agacgtatgt 1980 gccctggaac tttcatgagc cctggccagg acagtaccag ttttctgagg accatgatgt 2040 ggaatatttt cttcggctgg ctcatgagct gggactgctg gttatcctga ggcccgggcc 2100 ctacatctgt gcagagtggg aaatgggagg attacctgct tggctgctag agaaagagtc 2160 tattcttctc cgctcctccg acccagatta cctggcagct gtggacaagt ggttgggagt 2220 ccttctgccc aagatgaagc ctctcctcta tcagaatgga gggccagtta taacagtgca 2280 ggttgaaaat gaatatggca gctactttgc ctgtgatttt gactacctgc gcttcctgca 2340 gaagcgcttt cgccaccatc tgggggatga tgtggttctg tttaccactg atggagcaca 2400 taaaacattc ctgaaatgtg gggccctgca gggcctctac accacggtgg actttggaac 2460 aggcagcaac atcacagatg ctttcctaag ccagaggaag tgtgagccca aaggaccctt 2520 gatcaattct gaattctata ctggctggct agatcactgg ggccaacctc actccacaat 2580 caagaccgaa gcagtggctt cctccctcta tgatatactt gcccgtgggg cgagtgtgaa 2640 cttgtacatg tttataggtg ggaccaattt tgcctattgg aatggggcca actcacccta 2700 tgcagcacag cccaccagct acgactatga tgccccactg agtgaggctg gggacctcac 2760 tgagaagtat tttgctctgc gaaacatcat ccagaagttt gaaaaagtac cagaaggtcc 2820 tatccctcca tctacaccaa agtttgcata tggaaaggtc actttggaaa agttaaagac 2880 agtgggagca gctctggaca ttctgtgtcc ctctgggccc atcaaaagcc tttatccctt 2940 gacatttatc caggtgaaac agcattatgg gtttgtgctg taccggacaa cacttcctca 3000 agattgcagc aacccagcac ctctctcttc acccctcaat ggagtccacg atcgagcata 3060 tgttgctgtg gatgggatcc cccagggagt ccttgagcga aacaatgtga tcactctgaa 3120 cataacaggg aaagctggag ccactctgga ccttctggta gagaacatgg gacgtgtgaa 3180 ctatggtgca tatatcaacg attttaaggg tttggtttct aacctgactc tcagttccaa 3240 tatcctcacg gactggacga tctttccact ggacactgag gatgcagtgc gcagccacct 3300 ggggggctgg ggacaccgtg acagtggcca ccatgatgaa gcctgggccc acaactcatc 3360 caactacacg ctcccggcct tttatatggg gaacttctcc attcccagtg ggatcccaga 3420 cttgccccag gacaccttta tccagtttcc tggatggacc aagggccagg tctggattaa 3480 tggctttaac cttggccgct attggccagc ccggggccct cagttgacct tgtttgtgcc 3540 ccagcacatc ctgatgacct cggccccaaa caccatcacc gtgctggaac tggagtgggc 3600 accctgcagc agtgatgatc cagaactatg tgctgtgacg ttcgtggaca ggccagttat 3660 tggctcatct gtgacctacg atcatccctc caaacctgtt gaaaaaagac tcatgccccc 3720 acccccgcaa aaaaacaaag attcatggct ggaccatgta tgaatgactc gaggccgctt 3780 cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga 3840 aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc 3900 tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag 3960 atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat cgataaggat 4020 cttcctagag catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga 4080 acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 4140 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 4200 gcgcag 4206 <210> 16 <211> 4362 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Vector genome CB7.CI.GLB1.RBG <220> <221> repeat_region <222> (1)..(130) <223> 5" ITR from AAV2 <220> <221> repeat_region <222> (4232)..(4362) <223> 5" ITR from AAV2 <400> 16 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180 atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta 420 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600 gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660 tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 720 ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780 gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 840 aaagcgaagc gcgcggcggg cggggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc 900 tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg 960 agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt 1020 gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg 1080 gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc 1140 gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt 1200 gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg 1260 aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg 1320 gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg 1380 ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg 1440 caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg 1500 cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt 1560 ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg 1620 aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc 1680 ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc 1740 cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg 1800 gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat 1860 gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat 1920 tttggcaaag aattcacgcg tgccaccatg cccggctttc tcgtgcggat tctcctgctg 1980 ctgctggtgc ttctgctgct gggccctacc agaggcctga gaaacgccac ccagcggatg 2040 ttcgagatcg actacagccg ggacagcttc ctgaaggacg gccagccctt ccggtacatc 2100 agcggcagca tccactacag cagagtgccc cggttctact ggaaggaccg gctgctgaag 2160 atgaagatgg ccggcctgaa cgccatccag acctacgtgc cctggaactt ccacgagcct 2220 tggcctggcc agtaccagtt cagcgaggac cacgacgtgg aatactttct gcggctggcc 2280 cacgagctgg gcctgctcgt gattctgagg cctggccctt acatctgcgc cgagtgggag 2340 atgggaggac tgcctgcttg gctgctggaa aaagagagca tcctgctgcg gagcagcgac 2400 cccgattatc tggccgccgt ggataagtgg ctgggcgtgc tgctgcccaa gatgaagccc 2460 ctgctgtacc agaacggcgg acccgtgatc accgtgcagg tggaaaacga gtacggcagc 2520 tacttcgcct gcgacttcga ctacctgcgg ttcctgcaga agcggttcag acaccacctg 2580 ggcgacgacg tggtgctgtt cacaacagac ggcgcccaca agacctttct gaagtgtggc 2640 gctctgcagg gcctgtacac caccgtggat tttggcaccg gcagcaatat caccgacgcc 2700 tttctgagcc agcggaagtg cgagccaaag ggccccctga tcaacagcga gttctacacc 2760 ggctggctgg accactgggg ccagcctcac agcaccatca agacagaggc cgtggccagc 2820 agcctgtacg acatcctggc tagaggcgcc agcgtgaacc tgtacatgtt tatcggcggc 2880 accaacttcg cctactggaa cggcgccaac agcccttatg ccgcccagcc caccagctac 2940 gactacgatg cccctctgtc tgaggccggc gacctgaccg agaagtactt tgccctgcgg 3000 aacatcatcc agaaattcga gaaggtgccc gagggcccca tcccccctag cacacctaag 3060 ttcgcctacg gcaaagtgac cctggaaaag ctgaaaaccg tgggagccgc cctggacatc 3120 ctgtgtccta gcggccctat caagagcctg taccccctga ccttcatcca agtgaagcag 3180 cactacggct tcgtgctgta ccggaccacc ctgccccagg actgtagcaa tcctgcccca 3240 ctgagcagcc ccctgaacgg cgtgcacgat agagcctacg tggccgtgga tggcatccca 3300 cagggggtgc tggaacggaa caatgtgatc accctgaaca tcaccggcaa ggctggcgcc 3360 accctggacc tgctggtgga aaacatgggc agagtgaact acggcgccta catcaacgac 3420 ttcaagggcc tggtgtccaa cctgaccctg agcagcaaca tcctgaccga ctggaccatc 3480 ttcccactgg acaccgagga tgccgtgcgg agccatctgg gaggatgggg acacagagat 3540 agcggccacc acgatgaagc ctgggcccac aacagcagca actacaccct gcctgccttc 3600 tacatgggca acttcagcat ccccagcggc atccccgacc tgccacagga cacctttatc 3660 cagttccccg gctggacaaa gggacaagtg tggatcaatg gcttcaacct gggcagatac 3720 tggcccgcca gaggccctca gctgaccctg tttgtgcccc agcacattct gatgaccagc 3780 gcccccaaca ccatcaccgt gctggaactg gaatgggccc cctgcagcag cgacgaccct 3840 gaactgtgtg ccgtgacctt cgtggacagg cccgtgatcg gcagcagcgt gacctacgac 3900 caccccagca agcccgtgga aaagcggctg atgcctcccc caccccagaa gaacaaggac 3960 tcctggctgg atcacgtgtg atgactcgag gacggggtga actacgcctg aggatccgat 4020 ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca tctgacttct 4080 ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca 4140 ctcggaagca attcgttgat ctgaatttcg accacccata atacccatta ccctggtaga 4200 taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 4260 tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc 4320 gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc ag 4362 <210> 17 <211> 973 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> chicken beta-actin intron <400> 17 gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg 60 cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc 120 ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg tggggagcgc cgcgtgcggc 180 tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc 240 agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag 300 gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg 360 tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag ttgctgagca cggcccggct 420 tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg 480 cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag 540 gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc 600 cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt tgtcccaaat ctgtgcggag 660 ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc gcggggcgaa gcggtgcggc 720 gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt cgccgcgccg ccgtcccctt 780 ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct gccttcgggg gggacggggc 840 agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt 900 catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat 960 cattttggca aag 973 <210> 18 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CB promoter <400> 18 tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc 60 caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg 120 gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag 180 gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc 240 ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gg 282 <210> 19 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CMV Immediate early Promoter <400> 19 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 20 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoded AAV9 vp1 amino acid sequence <400> 20 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 21 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoded AAVhu31 vp1 amino acid sequence <400> 21 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ser Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Gly Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Ser Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 22 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoded AAVhu32 vp1 amino acid sequence <400> 22 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ser Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 23 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV9 vp1 coding sequence <400> 23 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60 gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120 aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180 aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300 caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480 aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540 tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600 cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660 gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780 tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840 tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900 ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960 caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020 acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080 gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140 acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260 cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320 gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380 ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440 ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500 tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560 ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620 ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680 accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740 gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800 atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860 aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920 aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980 gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040 gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100 tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160 tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211 <210> 24 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVhu31 vp1 coding sequence <400> 24 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60 gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120 aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180 aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300 caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480 aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540 tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600 cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660 gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780 tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840 tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900 ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960 caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020 acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080 gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140 acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260 cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320 gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380 ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440 ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500 tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560 ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620 ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680 accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740 gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800 atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860 aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920 aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980 gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040 gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100 tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160 tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211 <210> 25 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVhu32 vp1 coding sequence <400> 25 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60 cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120 gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccggcaa cggactcgac 180 aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300 caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480 aaatcgggtt cacagcccgc taaaaagaaa ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540 tcagtccccg accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600 cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660 gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780 tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840 tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900 ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960 caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020 acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080 gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140 acgcttaatg atgggagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260 cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320 gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380 ctaaaattca gcgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440 ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500 tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560 ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620 ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680 accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740 gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800 atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860 aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc taatgggagg gtttggaatg 1920 aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980 gctttcaata aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040 gtggagattg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100 tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160 tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211 <210> 26 <211> 546 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Pro Gly Phe Leu Val Arg Ile Leu Pro Leu Leu Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Pro Thr Arg Gly Leu Arg Asn Ala Thr Gln Arg Met Phe 20 25 30 Glu Ile Asp Tyr Ser Arg Asp Ser Phe Leu Lys Asp Gly Gln Pro Phe 35 40 45 Arg Tyr Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Arg Val Pro Arg Phe Tyr 50 55 60 Trp Lys Asp Arg Leu Leu Lys Met Lys Met Ala Gly Leu Asn Ala Ile 65 70 75 80 Gln Thr Leu Pro Gly Ser Cys Gly Gln Val Val Gly Ser Pro Ser Ala 85 90 95 Gln Asp Glu Ala Ser Pro Leu Ser Glu Trp Arg Ala Ser Tyr Asn Ser 100 105 110 Ala Gly Ser Asn Ile Thr Asp Ala Phe Leu Ser Gln Arg Lys Cys Glu 115 120 125 Pro Lys Gly Pro Leu Ile Asn Ser Glu Phe Tyr Thr Gly Trp Leu Asp 130 135 140 His Trp Gly Gln Pro His Ser Thr Ile Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser 145 150 155 160 Ser Leu Tyr Asp Ile Leu Ala Arg Gly Ala Ser Val Asn Leu Tyr Met 165 170 175 Phe Ile Gly Gly Thr Asn Phe Ala Tyr Trp Asn Gly Ala Asn Ser Pro 180 185 190 Tyr Ala Ala Gln Pro Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Ser Glu 195 200 205 Ala Gly Asp Leu Thr Glu Lys Tyr Phe Ala Leu Arg Asn Ile Ile Gln 210 215 220 Lys Phe Glu Lys Val Pro Glu Gly Pro Ile Pro Pro Ser Thr Pro Lys 225 230 235 240 Phe Ala Tyr Gly Lys Val Thr Leu Glu Lys Leu Lys Thr Val Gly Ala 245 250 255 Ala Leu Asp Ile Leu Cys Pro Ser Gly Pro Ile Lys Ser Leu Tyr Pro 260 265 270 Leu Thr Phe Ile Gln Val Lys Gln His Tyr Gly Phe Val Leu Tyr Arg 275 280 285 Thr Thr Leu Pro Gln Asp Cys Ser Asn Pro Ala Pro Leu Ser Ser Pro 290 295 300 Leu Asn Gly Val His Asp Arg Ala Tyr Val Ala Val Asp Gly Ile Pro 305 310 315 320 Gln Gly Val Leu Glu Arg Asn Asn Val Ile Thr Leu Asn Ile Thr Gly 325 330 335 Lys Ala Gly Ala Thr Leu Asp Leu Leu Val Glu Asn Met Gly Arg Val 340 345 350 Asn Tyr Gly Ala Tyr Ile Asn Asp Phe Lys Gly Leu Val Ser Asn Leu 355 360 365 Thr Leu Ser Ser Asn Ile Leu Thr Asp Trp Thr Ile Phe Pro Leu Asp 370 375 380 Thr Glu Asp Ala Val Arg Ser His Leu Gly Gly Trp Gly His Arg Asp 385 390 395 400 Ser Gly His His Asp Glu Ala Trp Ala His Asn Ser Ser Asn Tyr Thr 405 410 415 Leu Pro Ala Phe Tyr Met Gly Asn Phe Ser Ile Pro Ser Gly Ile Pro 420 425 430 Asp Leu Pro Gln Asp Thr Phe Ile Gln Phe Pro Gly Trp Thr Lys Gly 435 440 445 Gln Val Trp Ile Asn Gly Phe Asn Leu Gly Arg Tyr Trp Pro Ala Arg 450 455 460 Gly Pro Gln Leu Thr Leu Phe Val Pro Gln His Ile Leu Met Thr Ser 465 470 475 480 Ala Pro Asn Thr Ile Thr Val Leu Glu Leu Glu Trp Ala Pro Cys Ser 485 490 495 Ser Asp Asp Pro Glu Leu Cys Ala Val Thr Phe Val Asp Arg Pro Val 500 505 510 Ile Gly Ser Ser Val Thr Tyr Asp His Pro Ser Lys Pro Val Glu Lys 515 520 525 Arg Leu Met Pro Pro Pro Pro Gln Lys Asn Lys Asp Ser Trp Leu Asp 530 535 540 His Val 545

Claims (27)

  1. AAVhu68 캡시드 및 표적화된 인간 세포에서 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 인간 β-갈락토시다제를 암호화하는 GLB1 유전자를 포함하는 벡터 게놈을 갖는 아데노 연관 바이러스(AAV).
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 β-갈락토시다제가 신호 펩티드 및 서열번호: 4의 아미노산 24 내지 677의 아미노산 서열을 갖는 성숙 β-갈락토시다제를 포함하는, AAV.
  3. 제2항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 서열번호: 4의 아미노산 1 내지 23의 아미노산 서열을 갖는, AAV.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLB1 유전자가 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7 또는 서열번호: 8로부터 선택된 서열, 또는 서열번호: 4의 아미노산 24 내지 677의 성숙 β-갈락토시다제를 암호화하는 서열번호: 5 내지 8 중 임의의 하나와 적어도 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 갖는, AAV.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열이 인간 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터를 포함하는, AAV.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 또는 서열번호: 16으로부터 선택된 서열을 갖는, AAV.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAVhu68 캡시드가 서열번호: 1의 핵산 서열 또는 서열번호: 2의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열로부터 생성되거나, 또는 상기 AAVhu68이 하기를 포함하는 것인, AAV:
    서열번호:2의 1 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생성된 vp1 단백질, 서열번호: 1로부터 생성된 vp1 단백질, 또는 서열번호:2의 1 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호:1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp1 단백질로부터 선택된 AAVhu68 vp1 단백질의 이종 집단,
    서열번호:2의 적어도 약 아미노산 138 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생성된 vp2 단백질, 서열번호:1의 적어도 뉴클레오티드 412 내지 2211을 포함하는 서열로부터 생성된 vp2 단밸질, 또는 서열번호:2의 적어도 약 아미노산 138 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호:1의 적어도 뉴클레오티드 412 내지 2211과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp2 단백질로부터 선택된 AAVhu68 vp2 단백질의 이종 집단, 및
    서열번호:2의 적어도 약 아미노산 203 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생성된 vp3, 서열번호:1의 적어도 뉴클레오티드 607 내지 2211을 포함하는 서열로부터 생성된 vp3 단백질, 또는 서열번호:2의 적어도 약 아미노산 203 내지 736의 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호:1의 적어도 뉴클레오티드 607 내지 2211과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp3 단백질로부터 선택된 AAVhu68 vp3 단백질의 이종 집단.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 AAV 및 제형 완충액을 포함하는 수성 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제형 완충액이 하기를 포함하는, 약제학적 조성물:
    완충 염수 및 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 또는 이의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 인공 뇌척수액; 및
    계면활성제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 계면활성제가 약제학적 조성물의 0.0005% w/w 내지 약 0.001% w/w로 존재하는, 약제학적 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 7.5 내지 7.8, 또는 6.2 내지 7.7, 또는 약 7 범위의 pH에 있는, 약제학적 조성물.
  12. 대수조내 주사(ICM)를 통해 환자에게 투여하기에 적합한 GM1 강글리오시드증의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 AAV 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물.
  13. GM1 강글리오시드증이 있는 환자 또는 생후 18 개월 이하인 유아 강글리오시드증이 있는 환자에게 투여하기에 적합한 GM1 강글리오시드증의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 및 제12항 중 어느 한 항에 따른 AAV 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  14. GM1 강글리오시드증의 증상을 개선하거나, 또는 GM1 강글리오시드증의 신경학적 증상을 개선하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여하기에 적합한 GM1 강글리오시드증의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 및 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 AAV 또는 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 GM1 강글리오시드증의 개선이 평균 수명 개선, 영양관 필요성 감소, 발작 발생 및 빈도 감소, 신경인지적 저하로의 진행 감소 및/또는 신경인지적 발달 개선을 포함하는, GM1 강글리오시드증의 치료에 사용하기 위한 AAV 또는 조성물.
  16. 상기 AAV 또는 조성물이 CT-유도된 후두하 주사를 통해 대수조로 투여되는 것인, GM1 강글리오시드증의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 및 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 AAV 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  17. 상기 AAV 또는 조성물이 단일 용량으로 투여되는 것인, GM1 강글리오시드증의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 AAV 또는 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  18. 상기 AAV가 환자 당 2 x 1012 GC 내지 환자 당 3 x 1014 GC의 용량, 또는 환자 당 8 x 1012 게놈 카피(GC) 내지 환자 당 3 x 1014 GC의 용량, 임의적으로 환자 당 2 x 1013 GC 내지 환자 당 3 x 1014 GC, 환자 당 8 x 1013 GC 내지 환자 당 3 x 1014 GC, 또는 환자 당 약 9 x 1013 GC의 용량으로 투여되는 것인, GM1 강글리오시드증의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 및 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 AAV 또는 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  19. 상기 투여가 AAV를 1 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g의 용량, 임의적으로 3.4 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g, 1.0 x 1011 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g, 또는 약 1.1 x 1011 GC/뇌 질량 g의 용량으로 전달하는 것을 포함하는 것인, GM1 강글리오시드증의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 AAV 또는 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  20. GM1 강글리오시드증의 치료를 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제7항 및 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 AAV 또는 제8항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  21. GM1 강글리오시드증이 있는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 AAV 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 GM1 강글리오시드증이 있는 환자를 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 AAV 또는 약제학적 조성물이 대수조내 주사(ICM), 임의적으로 CT-유도된 후두하 주사를 통해 대수조로 투여되는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 방법이 AAV 또는 약제학적 조성물을 단일 용량으로 전달하는 것을 수반하는, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 생후 18 개월 이하인 유아 강글리오시드증 있는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 또는 조성물의 투여가 GM1 강글리오시드증의 증상을 개선하거나, 또는 GM1 강글리오시드증의 신경학적 증상을 개선하며, 임의적으로 치료 후, 환자가 평균 수명 증가, 영양관 필요성 감소, 발작 발생 및 빈도 감소, 신경인지적 저하로의 진행 감소 및/또는 신경인지적 발달 개선 중 하나 이상을 갖는, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV를 환자 당 2 x 1012 GC 내지 환자 당 3 x 1014 GC, 또는 환자 당 8 x 1012 게놈 카피(GC) 내지 환자 당 3 x 1014 GC의 용량, 임의적으로 환자 당 2 x 1013 GC 내지 환자 당 3 x 1014 GC, 환자 당 8 x 1013 GC 내지 환자 당 3 x 1014 GC, 또는 환자 당 약 9 x 1013 GC의 용량으로 투여하는, 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV를 1 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g의 용량, 임의적으로 3.4 x 1010 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g, 1.0 x 1011 GC/뇌 질량 g 내지 3.4 x 1011 GC/뇌 질량 g, 약 1.1 x 1011 GC/뇌 질량 g의 용량으로 투여하는, 방법.
KR1020217012705A 2018-10-01 2019-09-30 Gm1 강글리오시드증 치료에 유용한 조성물 Pending KR20210071017A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862739811P 2018-10-01 2018-10-01
US62/739,811 2018-10-01
US201962835178P 2019-04-17 2019-04-17
US62/835,178 2019-04-17
PCT/US2019/053797 WO2020072354A1 (en) 2018-10-01 2019-09-30 Compositions useful for treating gm1 gangliosidosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210071017A true KR20210071017A (ko) 2021-06-15

Family

ID=69165478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217012705A Pending KR20210071017A (ko) 2018-10-01 2019-09-30 Gm1 강글리오시드증 치료에 유용한 조성물

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20230040603A1 (ko)
EP (1) EP3860659A1 (ko)
JP (2) JP7534290B2 (ko)
KR (1) KR20210071017A (ko)
CN (1) CN113438954A (ko)
AU (1) AU2019351815A1 (ko)
BR (1) BR112021006060A2 (ko)
CA (1) CA3114175A1 (ko)
CL (1) CL2021000798A1 (ko)
CO (1) CO2021005443A2 (ko)
IL (1) IL281923A (ko)
MX (1) MX2021003869A (ko)
PE (1) PE20211596A1 (ko)
SA (1) SA521421639B1 (ko)
SG (1) SG11202102942VA (ko)
WO (1) WO2020072354A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3165057A1 (en) * 2020-02-02 2021-08-05 James M. Wilson Compositions useful for treating gm1 gangliosidosis
CN116096377A (zh) * 2020-05-05 2023-05-09 杜克大学 跨物种相容的腺相关病毒组合物及其使用方法
CN116926047A (zh) * 2022-03-31 2023-10-24 北京锦篮基因科技有限公司 功能性β-半乳糖苷酶变体、AAV介导的人β-半乳糖苷酶表达载体及其用途
WO2024040258A2 (en) * 2022-08-19 2024-02-22 Codexis, Inc. Engineered beta- galactosidase polypeptides
CN120035662A (zh) * 2022-10-12 2025-05-23 新型医药公司 用于治疗、预防或改善GM1神经节苷脂沉积症或Morquio综合征B的药物组合物及其施用方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6268213B1 (en) 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
US5869305A (en) 1992-12-04 1999-02-09 The University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
EP1007637B1 (en) 1997-04-14 2004-06-30 Cell Genesys, Inc. Methods for increasing the efficiency of recombinant aav product
WO1999061643A1 (en) 1998-05-27 1999-12-02 University Of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions by using an iodixananol gradient
DE69941905D1 (de) 1998-11-10 2010-02-25 Univ North Carolina Virusvektoren und verfahren für ihre herstellung und verabreichung.
NZ522841A (en) 2000-06-01 2004-12-24 Univ North Carolina Surgically implantable matrix with a viral vector dried onto it for controlled release of recombinant parvovirus vectors
CA2465868C (en) 2001-11-13 2017-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
US20070015238A1 (en) 2002-06-05 2007-01-18 Snyder Richard O Production of pseudotyped recombinant AAV virions
WO2005012877A2 (en) 2003-08-01 2005-02-10 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for antibody engineering
US8005620B2 (en) 2003-08-01 2011-08-23 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for biopolymer engineering
CN102174574B (zh) 2003-09-30 2016-08-03 宾夕法尼亚大学托管会 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用
CN101203613B (zh) 2005-04-07 2012-12-12 宾夕法尼亚大学托管会 增强腺相关病毒载体功能的方法
WO2007120542A2 (en) 2006-03-30 2007-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid library and aav capsid proteins
LT2158322T (lt) * 2007-06-06 2017-08-25 Genzyme Corporation Lizosomų kaupimo ligų genų terapija
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
MX342858B (es) 2010-03-29 2016-10-13 The Trustees Of The Univ Of Pennsylvania * Sistema de ablacion transgenica inducida farmacologicamente.
US8927514B2 (en) 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
FR2977562B1 (fr) 2011-07-06 2016-12-23 Gaztransport Et Technigaz Cuve etanche et thermiquement isolante integree dans une structure porteuse
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
ES2856090T3 (es) 2014-09-24 2021-09-27 Hope City Variantes de vectores de virus adenoasociados para la edición genómica de alta eficacia y sus métodos
CA3019315A1 (en) * 2015-04-23 2016-10-27 University Of Massachusetts Modulation of aav vector transgene expression
US11098286B2 (en) 2015-12-11 2021-08-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for AAV9
PT3589730T (pt) 2017-02-28 2024-02-28 Univ Pennsylvania Vetor de vírus adenoassociado (aav) de clado f e suas utilizações

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022512589A (ja) 2022-02-07
MX2021003869A (es) 2021-09-08
JP2024161415A (ja) 2024-11-19
CO2021005443A2 (es) 2021-04-30
CA3114175A1 (en) 2020-04-09
BR112021006060A2 (pt) 2021-07-20
SG11202102942VA (en) 2021-04-29
JP7534290B2 (ja) 2024-08-14
AU2019351815A1 (en) 2021-05-06
SA521421639B1 (ar) 2025-04-21
CL2021000798A1 (es) 2021-08-27
WO2020072354A1 (en) 2020-04-09
US20230040603A1 (en) 2023-02-09
IL281923A (en) 2021-05-31
EP3860659A1 (en) 2021-08-11
CN113438954A (zh) 2021-09-24
PE20211596A1 (es) 2021-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102697086B1 (ko) 척수근 위축증의 치료에 유용한 조성물
KR20210071017A (ko) Gm1 강글리오시드증 치료에 유용한 조성물
KR20250036262A (ko) Ii형 점액다당류증의 치료를 위한 유전자 요법
US20230365955A1 (en) Compositions and methods for treatment of fabry disease
KR102823833B1 (ko) 뮤코다당류증 iiia형에 대한 유전자 요법
CN115803064A (zh) 用于drg特异性降低转基因表达的组合物
KR20220020261A (ko) 이염성 백질이영양증의 치료에 유용한 조성물
KR20200104864A (ko) 뮤코다당류증 iiib형에 대한 유전자 요법
KR20220105158A (ko) 이식유전자 발현의 drg-특이적 감소를 위한 조성물
JP2025032175A (ja) クラッベ病の治療に有用な組成物
KR20220145838A (ko) Gm1 강글리오사이드증을 치료하는 데 유용한 조성물
US20240408157A1 (en) Compositions and methods for treatment of fabry disease
CN116669774A (zh) 用于治疗法布里病的组合物和方法
WO2025035143A1 (en) Compositions and methods for treatment of spinal muscular atrophy

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20210427

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20220921

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20250421

Patent event code: PE09021S01D