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KR20220020378A - 종양 치료용 약물 조성물, 키트 및 방법 - Google Patents

종양 치료용 약물 조성물, 키트 및 방법 Download PDF

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KR20220020378A
KR20220020378A KR1020227001346A KR20227001346A KR20220020378A KR 20220020378 A KR20220020378 A KR 20220020378A KR 1020227001346 A KR1020227001346 A KR 1020227001346A KR 20227001346 A KR20227001346 A KR 20227001346A KR 20220020378 A KR20220020378 A KR 20220020378A
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tumor
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쉬사 저우
버나드 로이즈만
그레이스 궈잉 저우
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임비라 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 대상체의 종양을 치료하기 위한 조성물을 개시하는데, 이는 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀 및 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 치료 유효량의 종양 용해성 단순 포진 바이러스를 포함한다. 여기서 엑소좀 모티프는 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열과 작업 가능하게 연결되어 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA가 상기 엑소좀에 패키징 되는 것을 강화한다.

Description

종양 치료용 약물 조성물, 키트 및 방법
본 발명은 종양을 치료하기 위한 약물 조성물에 관한 것으로, 특히 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀 및 치료 유효량의 종양 용해성 단순 포진 바이러스(oHSV)를 포함하는 약물 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀 및 oHSV의 키트, 및 상기 약물 조성물 및 상기 키트를 사용하여 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
암은 질환으로서 여러 방면의 적이고, 지정된 치료 방법에 굴복할 수 있으며, 다양한 요법에 내성이 발생할 수 있다. 종양내의 세포 하위 집합은 통상적인 치료 방법에 내성을 발생하고, 질환의 재발을 유발할 수 있다.
수술로 암을 치료하는 것은 통상적인 국소 치료이다. 혈액계의 일부 악성 종양(예를 들어 백혈병, 림프종 등) 외에, 기타 다양한 악성 종양에는 수술로 제거할 수 있는 한가지 또는 여러 가지 유형 고형종양을 더 갖는다. 그러나, 수술에는 항상 일정한 위험이 있고, 종종 다른 합병증 또는 잠재적인 장기 기능 장애가 있다.
지금까지, 암의 비수술적 치료(주로 통상적인 화학 요법, 표적 생물학적 요법 및 방사선 요법)는 완전히 만족스러운 결과를 얻지 못하였다. 지속적으로 존재하는 문제에는 낮은 표적 선택성, 약물 내성, 전이성 질환을 효과적으로 해결할 수 없는 것과 심각한 부작용이 포함된다. 반면, 전체적으로 숙주 면역력을 자극하여 종양에 대한 전신 반응을 유도하는 현재의 면역 요법은 많은 임상적 전망을 제공한다.
종양 용해성 단순 포진 바이러스(oHSV)는 고형종양의 치료를 위해 광범위하게 연구되고 있다. 종양 용해성 단순 포진 바이러스는 전체적으로 전통적인 암 요법에 비해 많은 장점을 갖는다. 구체적으로, oHSV는 일반적으로 선천성 면역 억제를 쉽게 받도록 하는 돌연변이를 포함한다. 따라서, 암세포에서 복제될 수 있으나 정상 세포에서 복제될 수 없는 것은, 이러한 암세포에서 감염에 대한 한가지 또는 여러 가지 선천적 면역 반응이 손상되지만 정상 세포에서 이러한 면역 반응은 완전하기 때문이다. oHSV는 일반적으로 종양 개체에 직접 전달되고, 바이러스는 종양 개체에서 복제될 수 있다. 바이러스는 표적 조직에 전달되고 전신적으로 투여되지 않기 때문에 이러한 항암제는 어떠한 부작용도 없다. 바이러스의 하나의 특징은 획득성 면역 반응을 유도할 수 있어 여러 번 투여되지 않도록 하는 것이다. oHSV는 종양에 여러 번 투여되었지만 그 효과가 상실되거나 부작용(예: 염증 반응)을 유발한다는 증거는 없다. HSV는 대형 DNA 바이러스로서, 외래 DNA를 이들의 게놈에 추가하고 종양에 투여한 후 이러한 유전자의 발현을 조절할 수 있다. oHSV와 함께 사용하기 적합한 외인성 유전자는 종양에 대한 획득성 면역 반응을 유도하는데 도움이 될 수 있는 유전자이다.
세포 선천적 면역 반응의 결함을 극복하는 것은 이 바이러스가 항암제로서 종양을 용해시킬 수 있는 종양 범위를 결정한다. 결실된 서열이 많을수록 치료할 수 있는 암세포의 범위는 좁고 oHSV의 유효성은 결실된 바이러스 유전자의 기능에 의해 결정된다. 가장 최근의 대부분 oHSV에 적어도 하나의 세포 유전자를 추가하여 그 항암 활성을 지원한다.
oHSV 요법의 성공은 암세포의 손상 정도에 의해 결정된다. oHSV 요법의 초기 개발 과정에서, HSV는 고형종양의 모든 암세포를 단독으로 죽일 수 없음을 인식하였고, oHSV 치료가 모든 암세포를 효과적으로 제거할 가능성은 거의 없으며, 임상 시험에서, oHSV의 종양 파괴에는 종양에 대한 획득성 면역 반응이 포함되어야 한다. 추가 연구에 따르면, 감염된 종양 세포 파편으로 인한 항종양 면역 반응은 사이토카인을 추가하여 증폭될 수 있다. 사이토카인 유전자가 없는 oHSV 및 면역 자극성 사이토카인을 넣은 oHSV의 비교 결과는 이러한 추측을 확인하였고 결국 GM-CSF를 oHSV에 넣어 흑색종 치료에 사용되었다.
면역 자극성 사이토카인을 코딩하는 유전자를 넣으면 종양에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있지만, T세포에 의해 유발되는 세포 독성을 효과적으로 향상시킬 수 없고, 후자는 항종양 작용에 필수적이다. 종양은 PD-1 및 CTLA4 억제 경로를 통해 면역계를 침묵시킨다. PD-1는 활성화된 T세포 및 기타 조혈 세포에서 발현되지만, CTLA4는 조절성 T세포를 포함하는 활성화된 T세포에서 발현된다. 종양은 PD-1 및 CTLA4 억제 경로를 사용하여 숙주 면역 반응을 도피한다.
비록 임상 전 및 임상 환경에서 광범위한 연구 및 테스트를 진행하였지만, 종양을 치료하기 위한 방법은 여전히 충족되지 않은 요구가 존재한다.
한편, 본 발명은 약물 조성물에 관한 것으로, CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀 및 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 치료 유효량의 종양 용해성 단순 포진 바이러스(oHSV)를 포함한다.
엑소좀은 엑소좀 패키징과 관련된 모티프(이하 또한 “엑소좀 모티프”라고 지칭함)를 포함하되, 이 모티프는 선택적으로 링커를 통해 CTLA4를 표적화하는 miRNA에 작업 가능하게 연결된다. 일 실시형태에서, 상기 엑소좀은 억제량의 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 포함하는데, 여기서 CTLA4를 표적화하는 miRNA는 CTLA4의 mRNA를 결합하는 시드 서열을 포함하고; 엑소좀 모티프는 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열과 작업 가능하게 연결되어 CTLA4를 표적화하는 miRNA가 엑소좀에 패키징 되는 것을 강화한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열의 다운스트림에 위치하고 이와 공유 연결된다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열의 다운스트림에 위치하고 링커를 통해 이와 연결된다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열 외의 하나 또는 복수개의 핵산을 돌연변이시켜 획득한 것이다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 두 개의 단일 엑소좀 모티프의 조합을 통해 생성된 더블 모티프이다. 일부 실시형태에서, 작업 가능하게 연결될 경우, CTLA4를 표적화하는 miRNA와 엑소좀 모티프는 적어도 하나 또는 두 개의 뉴클레오티드를 공유한다.
oHSV는 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 재조합 종양 용해성 HSV-1이다.
본 발명의 다른 양태는 약물 조성물에 관한 것으로, CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀, 치료 유효량의 oHSV 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 엑소좀은 엑소좀 패키징과 관련된 모티프를 포함하고, 이 모티프는 선택적으로 링커를 통해 CTLA4를 표적화하는 miRNA에 작업 가능하게 연결된다. oHSV는 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현한다.
본 발명의 또 다른 양태는 종양을 치료하기 위한 키트에 관한 것으로, CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀 및 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV를 포함한다. 키트는 엑소좀 및 oHSV를 사용하여 종양을 치료하는 설명을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상체의 종양을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법은 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀 및 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 치료 유효량의 oHSV를 대상체에게 동시에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상체에게 oHSV 요법의 효능을 향상시키는 방법에 관한 것으로, oHSV 요법 외에, 이 방법은 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
이하 설명을 열독하면 본 발명의 다른 양태를 쉽게 획득할 수 있다.
도 1. 도 A는 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 코딩하는 플라스미드의 모식도이다. 이 플라스미드는 EGFP를 코딩하는 서열로 구성되고, 3'-UTR에는 설계된 CTLA4 유전자를 표적화하는 miRNA(miR-CTLA-4)를 코딩하는 서열이 포함된다. 도 B는 마우스의 CTLA4 유전자를 표적화하는 miRNA의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 볼드체, 이탤릭체, 밑줄로 돌출 표시된 뉴클레오티드는 엑소좀 패키징과 관련된 모티프(엑소좀 모티프)를 나타낸다. 도 C는 설계된 miRNA에 의한 CTLA4의 하향 조절을 도시한다. 24웰 플레이트에 접종된 HEp-2세포를 0.25 μg의 CTLA4(1#-10#)에 대한 miRNA 또는 비표적 miRNA(NT)를 코딩하는 10개의 DNA 서열을 발현하는 플라스미드 및 0.25 μg의 His 표기된 마우스CTLA4(His-표기된 CTLA4)를 코딩하는 플라스미드와 공동 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후 세포를 획득하였다. 본 분양의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법을 사용하여 CTLA4 및 GAPDH의 축적을 측정하였다.
도 2. miR-CTLA-4를 운반하는 엑소좀의 특성화. T150플라스크에 접종된HEp-2세포를 10 μg miR-CTLA-4-3# 플라스미드 또는 비표적 miRNA(NT)를 발현하는 플라스미드로 형질감염시킨 후, 무혈청 배지에서 배양하였다. 48시간 후 배지를 수집하고 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 엑소좀을 정제하였다. 정제된 엑소좀에 대해 두 개의 시리즈의 분석을 수행하였다. 먼저(도 A) 엑소좀을 생성하는 동일한 양의 세포 및 동일한 양의 엑소좀을 용해시키고, 변성 겔에서 전기영동하며, 항CD9, Flotilin-1 및 Calnexin의 항체로 탐지하였다. 일반적으로, 정제된 엑소좀에는 CD9, Flotilin-1이 함유되지만, Calnexin은 결실된다. 형질감염된 세포에 의해 생성된 엑소좀의 크기 분포(도 B)는 재료 및 방법의 설명에 따라 수행되었다.
도 3. MFC종양 성장에 대한 miR-CTLA-4를 운반하는 엑소좀을 단독으로 투여하거나(도 A) T1012G(도 B), T2850(도 C) 또는 T3855(도 D)와 동시에 투여하는 영향. MFC종양 세포를 C57BL/6J마우스의 오른쪽에 피하 주사하였다. 평균 80 mm3의 MFC종양을 8마리 동물을 하나의 군으로 나누고, 10 μg 엑소좀을 단독으로 투여하거나 50 μl 1×107 pfu T1012G, T2850 또는 T3855와 동시에 주사하였다. 모든 연구는 동시에 이루어지고, 결과는 4개의 도면에 표시되었다. 종양 부피는 각 군에서 8마리 동물의 평균치 ±SEM으로 표시되었다.
정의
용어 “일” 또는 “하나”의 개체는 이 개체의 하나 또는 복수개를 지칭하는 바; 예를 들어, “엑소좀”은 하나 또는 복수개의 엑소좀을 나타내는 것을 유의해야 한다. 따라서, 용어 “하나”, “하나 또는 복수개” 및 “적어도 하나”는 본문에서 교환하여 사용할 수 있다.
“상동성” 또는 “동일성” 또는 “유사성”은 두 개의 펩티드 사이 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 각 서열에서 비교할 수 있는 위치를 비교하여 상동성을 결정할 수 있다. 비교 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 경우, 분자는 이 위치에서 상동하다. 서열 사이의 상동 정도는 서열이 공유하는 매칭 또는 상동 위치의 개수와 관련된다. “관련되지 않는” 또는 “비상동성” 서열은 본문의 서열 중 하나와 40％보다 작은 동일성을 공유하고, 바람직하게는 25％보다 작은 동일성을 공유한다.
하나의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 하나의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)이 다른 하나의 서열과 특정 백분율(예를 들어 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％)의 “서열 동일성”을 갖는 것은, 비교할 경우, 두 개의 서열을 비교할 경우 이 백분율의 염기(또는 아미노산)는 동일함을 지칭한다. 이러한 비교 및 백분율의 상동성 또는 서열 동일성은 본 기술분야에서 공지된 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “링커”는 두 개 또는 더 많은 동일하거나 상이한 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열의 짧은 세그먼트를 지칭하고, 여기서 상기 뉴클레오티드는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)로부터 선택된다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “치료”는 치료성 치료 및 예방성 조치를 지칭하고, 종양의 진행과 같은 바람직하지 않은 생리적 변화 또는 문란을 예방하거나 완화(감소)시키는 것을 목적으로 한다. 유리하거나 원하는 임상 결과는, 검출 가능 여부에 관계없이 증상 완화, 질환 중증도 감소, 종양 상태 안정화(즉 악화 없음), 종양 성장 억제, 종양 부피 감소, 종양 진행 지연 또는 감속, 종양 상태 개선 또는 감소 및 증상 소실(부분적이든 전체적이든)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 치료가 필요한 환자에는 이미 종양이 있는 사람, 및 종양에 쉽게 걸리는 사람을 포함된다.
“대상체” 또는 “개체” 또는 “동물” 또는 “환자” 또는 “포유 동물”은 진단, 예후 또는 치료가 필요한 임의의 대상체, 특히 포유 동물 대상체를 지칭한다. 포유 동물의 대상에는 인간, 가축, 농장 동물 및 동물원 동물, 스포츠 동물 또는 애완 동물이 포함되고, 예를 들어 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 젖소 등이다. 본문의 대상체는 바람직하게 인간이다.
본문에 사용된 바와 같이, “치료가 필요한 환자” 또는 “치료가 필요한 대상체”와 같은 문구는 검출, 진단 절차 및/또는 치료에 사용되는 본 발명의 조성물의 투여로부터 이익을 얻은 대상체, 예컨대 포유 동물 대상체를 포함한다.
본 발명은 특히 안티센스 올리고머 및 유사체를 사용하여 CTLA4를 코딩하는 핵산 분자의 기능 또는 작용을 조절한다. 본 발명의 올리고머와 그의 표적 핵산의 혼성화는 일반적으로 “안티센스”로 지칭된다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태의 실시에 포함되는 것으로 간주되는 바람직한 메커니즘은 본문에서 “안티센스 억제”로 지칭된다. 이러한 안티센스 억제는 일반적으로 올리고뉴클레오티드 사슬 또는 세그먼트의 수소 결합 기반 혼성화를 기반으로 하여 적어도 하나의 사슬 또는 세그먼트가 절단, 분해되거나 기타 방식으로 작업이 불가능하도록 한다. 이 방면에서, 현재 특정 핵산 분자 및 이러한 안티센스 억제에 사용되는 기능을 표적화하는 것이 바람직하다.
간섭된 RNA의 기능은 예를 들어 단백질 번역 사이트로의 RNA 전위, RNA 합성 사이트로부터 멀어지는 세포 내 사이트로의 RNA 전위, RNA로부터의 단백질 번역, 한가지 또는 여러 가지 RNA를 생성하기 위한 RNA의 스플라이싱, 및 RNA에 참여하거나 RNA에 의해 촉진되는 촉매 활성 또는 복합체 형성을 포함할 수 있다. 표적 핵산 기능에 대한 이러한 간섭의 하나의 바람직한 결과는 CTLA4의 발현을 조절하는 것이다. 본 발명의 맥락에서, “조절” 및 “발현 조절”은 유전자를 코딩하는 핵산 분자(예를 들어 DNA 또는 RNA)의 양 또는 수준을 감소(억제)하는 것을 의미한다. mRNA는 일반적으로 바람직한 표적 핵산이다.
본 발명의 맥락에서, “혼성화”는 상보적 올리고머 사슬의 페어링을 지칭한다. 본 발명에서, 바람직한 페어링 메커니즘은 수소 결합과 관련되고, 올리고머 화합물 사슬의 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기(핵염기) 사이의 Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역방향 Hoogsteen 수소 결합일 수 있다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 상보적 핵염기이고, 수소 결합을 형성하여 페어링된다. 혼성화는 다양한 상황에서 발생할 수 있다.
본 발명에서, 문구 “엄격한 혼성화 조건” 또는 “엄격한 조건”은 본 발명의 화합물이 표적 서열에 혼성화되지만 최소 개수의 다른 서열에 혼성화되는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 상이한 상황에서 상이하며, 본 발명의 맥락에서, 올리고머 화합물은 표적 서열에 혼성화되는 “엄격한 조건”은 올리고머의 성질 및 조성 및 이들이 연구되는 측정법에 의해 결정된다.
본문에 사용된 바와 같이, “상보적”은 올리고머 화합물의 두 개의 핵염기 사이에서 정확하게 페어링되는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 만약 올리고뉴클레오티드(올리고머 화합물)의 특정 위치의 핵염기가 표적 핵산의 특정 위치의 핵염기와 수소 결합을 형성하면, 상기 표적 핵산은 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드 분자이고, 다음, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 수소 결합의 위치는 상보적 위치로 간주된다. 각 분자의 충분한 개수의 상보적 위치가 서로 결합하여 수소 결합을 형성할 수 있는 핵염기에 의해 점유될 경우, 올리고뉴클레오티드 및 별도의 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 서로 상보적이다. 따라서, “특이적으로 혼성화되는” 및 “상보적”은 충분한 정도의 정확한 페어링 또는 상보성을 나타내는 충분한 개수의 핵염기가 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에서 안정하고 특이적으로 결합하도록 하는 용어이다.
본 분야에서 안티센스 올리고머의 서열은 표적 핵산의 서열에 100％ 상보적일 필요는 없고 특이적으로 혼성화될 수 있음을 이해해야 한다. 이 밖에, 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 복수개의 세그먼트에 혼성화되어 삽입되거나 인접한 세그먼트가 혼성화 이벤트(예를 들어링 구조 또는 헤어핀 구조)에 참여하지 않도록 한다. 바람직하게는 본 발명의 안티센스 화합물은 표적 핵산 내의 표적 영역과 적어도 70％, 또는 적어도 75％, 또는 적어도 80％, 또는 적어도 85％의 서열 상보성을 갖고, 보다 바람직하게는 이들이 적어도 90％의 서열 상보성을 포함하며, 나아가 보다 바람직하게는 표적화되는 표적 핵산 서열 내의 표적 영역과 적어도 95％ 또는 적어도 99％의 서열 상보성을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 올리고머의 20개의 핵염기 중 18개는 표적 영역과 상보적이어서 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물은 90％의 상보성을 대표한다. 이 실시예에서, 나머지 비상보적 핵염기는 상보적 핵염기와 클러스터링되거나 산포될 수 있고, 서로 인접하거나 상보적 핵염기에 인접할 필요가 없다. 따라서, 길이가 18개인 핵염기의 안티센스 올리고머는 4개의 비상보적 핵염기를 갖고, 표적 핵산과 완전히 상보적인 두 개의 영역으로 플랭킹되며, 표적 핵산과 77.8％의 전체 상보성을 가지므로, 본 발명의 범위에 속한다. 본 분야에 공지된 BLAST 프로그램(기본 로컬 비교 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 사용하여 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물 영역의 상보적 백분율을 통상적으로 결정할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 “올리고뉴클레오티드”는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)의 올리고머 또는 중합체 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 및 동족체를 지칭한다. 이 용어는 천연적으로 존재하는 핵염기, 당 및 공유 뉴클레오시드 사이(백본) 결합으로 구성된 올리고뉴클레오티드, 및 유사한 기능을 갖는 비천연적으로 존재하는 일부 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 천연 형태보다 우수하고, 이는 예컨대 향상된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 향상된 친화력 및 뉴클레아제의 존재 하에서 증가된 안성성과 같은 필요한 성질을 갖기 때문이다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “microRNA”, “miRNA” 또는 “miR”은 전사 후 유전자 발현을 조절하는 기능을 하는 RNA를 지칭하고, 일반적으로 표적 신령 RNA(mRNA)와 결합하여 본 3’비번역 영역(3’UTRs)의 상보적 서열을 전사하여 일반적으로 유전자 침묵을 야기한다. miRNA는 일반적으로 길이가 21 또는 22개의 뉴클레오티드와 같은 작은 RNA 분자이다. 용어 “microRNA”, “miRNA” 및 “miR”은 교환하여 사용할 수 있다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “종양”은 제어 불가능하게 성장하는 형질전환된 세포(즉 과증식성 질환)를 포함하는 악성 조직을 지칭한다. 종양은 백혈병, 림프종, 골수종, 형질세포종 등; 및 고형종양을 포함한다. 본 발명에 따라 치료할 수 있는 고형종양의 실시예는 악성 종양 및 암, 예를 들어 흑색종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관 내피육종, 활막종, 중피종, 유윙종양(Ewing’s tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암, 기저세포암, 선암, 땀샘종, 피지암, 유두암, 유두선암, 낭성선암, 수질암, 기관지암, 신세포암, 간암, 담관암, 융모막암, 정상피종, 배아암, 윌름스종양(Wilms’ tumor), 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 위암 및 위전위암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “CTLA4”는 “세포 독성 T림프구 관련 단백질4”를 지칭하고, 공동 자극을 억제하고 T세포에 억제 신호를 전달하여 T세포 활성화된 많은 공동 억제 분자 중 하나를 약화시킬 수 있다. CTLA4의 아미노산서열은 NCBI로부터 획득할 수 있고, 수탁번호는 NP_033973.2 또는 NP_001268905.1이다. CTLA4는 또한 Ctla-4, Cd152 또는 Ly-56으로 지칭된다. CTLA4의 NCBI 서열의 수탁번호는 NC_000067.6이고, 유전자ID는 12477이다. 인간 CTLA4유전자는 면역 글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 233개의 아미노산 단백질을 코딩한다. CTLA4는 두 개의 소수성 영역으로 플랭킹된 하나의 V형 도메인으로 구성된다. CTLA4는 또한 면역 시냅스의 구조를 변화시킬 수 있고, T세포 증식 및 분화에 중요한 역할을 한다. CTLA4의 다형성은 I형 당뇨병, 담도 간경변 및 그레이브스병(Graves' disease)을 포함하는 여러 가지 질환의 감수성과 관련이 있다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “IL-12”는 효과적인 항종양 효과를 갖는 사이토카인 “인터루킨12”를 지칭한다. 따라서, IL-12는 TH-1형 면역 반응을 유도하여 장기간 지속되는 항종양 효과를 제공할 수 있다. 보고에 따르면, IL-12는 체내 항혈관신생 활성을 갖고, 항종양 효과에도 도움이 된다. 마지막으로, IL-12는 높은 수준의 IFN-γ 생성을 자극할 수 있고, 여러 가지 면역 조절 작용을 가지며, CTL의 자극, 세포의 천연 살해 및 대식세포의 활성화 및 II형 MHC 항원의 발현을 유도/향상시키는 능력을 포함한다. IFN-γ는 T세포를 종양 부위로 전이시키는 과정에서 중요한 역할을 한다. 종양내 IFN-γ 수준의 증가는 종양 부하의 크기 감소와 관련된다.
프로그램성 세포 사멸1(PD-1)은 세포 사멸을 겪는 마우스T세포주의 감소 혼성화에 의해 확인된 50-55 kDa I형 막횡단 수용체(Ishida et al., 1992, Embo J. 11:3887-95)이다. CD28유전자 패밀리의 구성원인 PD-1은 활성화된 T세포, B세포 및 골수계 세포에서 발현된다(Greenwald et al., 2005.Annu. Rev. Immunol. 23:515-48; Sharpe et al., 2007, Nat. Immunol. 8:239-45). 인간 및 쥐PD-1은 약 60％의 아미노산 동일성을 갖고, 네 개의 잠재적인 N-글리코실화 사이트 및 Ig-V 도메인을 정의하는 잔기의 보수성을 갖는다. PD-1은 T세포 활성화를 부정적으로 조절하고, 이 억제 기능은 세포질 도메인의 면역 수용체 티로신 기반 억제성 모티프(ITIM)와 관련된다(Parry et al., 2005, Mol. Cell. Biol. 25:9543-53). PD-1의 이러한 억제 기능을 파괴하면 자가 면역을 발생할 수 있다.
본문에 사용된 바와 같이, “항체” 또는 “항원 결합 폴리펩티드”는 한가지 또는 여러 가지 항원을 특이적으로 인식하고 결합하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 지칭한다. 항체는 완전한 항체 및 이의 임의의 항원 결합 세그먼트 및 단일 사슬일 수 있다. 따라서, 용어 “항체”는 항원 결합 생물학적 활성을 갖는 면역 글로불린 분자의 적어도 일부를 갖는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 실시예는, 중쇄 또는 경쇄의 상보적 결정 영역(CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역, 프레임워크(FR) 영역 또는 이의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 일부를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 용어 항체는 활성화될 경우 항원 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 더 포함한다.
“치료 유효량”은 본 발명의 종양 용해성 바이러스 및/또는 엑소좀이 상술한 “치료”에 충분한 양으로 투여됨을 지칭한다. 특정된 개체의 질환 또는 병증 치료에서 치료학적 유효량은 질환의 증상 및 중증도에 따라 결정되고, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 이 밖에, 체외 또는 체내 측정을 선택적으로 사용하여 최적의 투여량 범위를 결정할 수 있다. 제제에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질환 또는 병증의 중증도에 따라 결정되고, 종사자의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정하여야 한다. 체외 또는 동물 모델 테스트 시스템에서 얻은 투여량-반응 곡선에서 유효 투여량을 추론할 수 있다.
CTLA4를 표적화하는 miRNA
용어 “CTLA4를 표적화하는 복수개의 miRNA”, “CTLA4를 표적화하는 하나의 miRNA”, “CTLA4를 표적화하는 miRNA”는 본문에서 교환하여 사용할 수 있고, 코딩 단백질CTLA4의 mRNA를 표적화하거나 특이적으로 결합하는 작은 비코딩 RNA(microRNA 또는 miRNA)를 설계하여 CTLA4가 세포에서 전사, 번역 및 역발현 손실, 감소 및 제거되도록 한다. 상술한 바와 같이, miRNA는 반드시 100％ 특이도로 표적 mRNA에 결합하는 것은 아니다. miRNA는 시드 서열(5'말단의 2 내지 8개의 뉴클레오티드)을 갖는 것으로 알려져 있고, 표적 mRNA에 결합하는 특이성을 결정하며, 나머지 뉴클레오티드는 표적 mRNA와 완전히 상보적일 필요는 없다. 따라서, 일 실시형태에서, miRNA는 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 또는 SEQ ID NO: 4에서의 임의의 하나의 시드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CTLA4를 표적화하는 miRNA는 세포에 전달된 후 세포에서 CTLA4 단백질의 발현을 차단한다.
CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀
엑소좀은 세포막에서 나온 작고, 상대적 크기가 균일한 소포이다. 예를 들어, 엑소좀은 약 30 내지 약 100 nm의 직경을 갖는다. 이들은 여러 가지 주요 단백질(예를 들어CD9, CD63, CD81, CD82, 아넥신, Flotillin 등)을 함유하고, 이 밖에 이들은 단백질, mRNA, 긴 넌코딩 RNA 및 miRNA를 패키징한다. 엑소좀은 페이로드를 하나의 세포에서 다른 세포에 전달한다. 수용체 세포에 진입한 후, 엑소좀 페이로드는 세포질에 방출된다.
일부 실시형태에서, CTLA4를 표적화하는 miRNA는 엑소좀을 통해 세포에 전달된다. 따라서, 일 실시형태에서, 상술한 임의의 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀을 제공한다. 본 발명은 본문에서 언급된 “엑소좀 모티프”의 뉴클레오티드 서열 세그먼트를 사용하여 엑소좀으로의 miRNA의 패키징을 촉진하거나 향상시킨다. 일 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 표 1에서 결정된 임의의 서열로부터 선택된다.
표 1 본 발명의 miRNA와 함께 사용하는 엑소좀 모티프의 서열
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일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 조합하여 사용된다. 예를 들어, 표에서 결정된 두 개 또는 더 많은 엑소좀 모티프를 조합하여 더블 엑소좀 모티프를 형성한다. 모티프는 하나의 엑소좀 모티프의 5'말단을 다른 하나의 엑소좀 모티프의 3'말단에 연결시켜 선형으로 조합될 수 있다. 이 경우, 하나의 엑소좀 모티프의 5'말단의 첫번째 뉴클레오티드가 다른 하나의 엑소좀 모티프의 3'말단의 마지막 하나의 뉴클레오티드와 동일할 경우, 동일한 뉴클레오티드 중 하나는 생략되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, “GGAG”(SEQ ID NO. 21)는 “GGAC”(SEQ ID NO. 22)와 조합되어 더블 엑소좀 모티프 “GGAGGAC”(SEQ ID NO. 48)를 형성한다. 그러나 하나의 엑소좀 모티프의 5'말단의 첫번째 뉴클레오티드가 다른 하나의 엑소좀 모티프의 3'말단의 마지막 하나의 뉴클레오티드와 상이할 경우, 두 개의 엑소좀 모티프는 하나의 링커를 통해 연결되거나 공유 결합을 통해 연결된다. 예를 들어, “GGAC”(SEQ ID NO. 22) 및 “GGAG”(SEQ ID NO. 21)는 링커 “UG”를 통해 연결되어 더블 엑소좀 모티프 “GGACUGGGAG”(SEQ ID NO. 49)를 형성할 수 있고, “GGAC”(SEQ ID NO. 22) 및 “GGAG”(SEQ ID NO. 21)는 또한 공유 결합을 통해 연결되어 더블 엑소좀 모티프 “GGACGGAG”(SEQ ID NO. 51)를 형성할 수 있다. 본 발명은 3배 또는 더 많은 배수의 엑소좀 모티프, 즉 SEQ ID NO. 21 내지 SEQ ID NO. 47 중 세 개 또는 더 많은 모티프로 구성된 엑소좀 모티프를 더 고려하였다. 따라서, 본문에 사용된 용어 "엑소좀 모티프"는 엑소좀으로의 miRNA 패키징을 향상 또는 촉진시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 의미하고, SEQ ID NO. 21 내지 SEQ ID NO. 47의 임의의 단일 엑소좀 모티프 및 단일 모티프의 조합에 의해 생성된 더블(예를 들어 SEQ ID NO.48-52에서의 임의의 하나), 3배 또는 더 많은 배수의 임의의 엑소좀 모티프를 포함한다.
본 발명에서, 엑소좀 모티프는 miRNA의 시드 서열에 작업 가능하게 연결된다. 용어 “작업 가능한 연결”은 조절 서열(예를 들어 엑소좀 모티프)과 핵산 서열(예를 들어 miRNA의 시드 서열) 사이의 기능성 연결을 지칭하고, miRNA 가 엑소좀에 패키징되는 것을 향상 또는 촉진시킨다. 예를 들어, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열이 기능적 관계에 있을 경우, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 작업 가능하게 연결된다. 작업 가능하게 연결된 RNA서열은 서로 인접할 수 있거나, 링커를 통해 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 miRNA의 시드 서열의 다운스트림에 위치한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 miRNA의 시드 서열의 업스트림에 위치한다. 일부 실시형태에서, miRNA의 시드 서열은 엑소좀 모티프에 의해 플랭킹된다. 일 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 miRNA의 시드 서열에 작업 가능하게 연결된다. 일 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 miRNA의 시드 서열 외의 하나 또는 복수개의 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시켜 획득한 것이다. 일 실시형태에서, 엑소좀 모티프를 갖는 CTLA4를 표적화하는 miRNA는 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 또는 SEQ ID NO. 8의 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 일 실시형태에서, 엑소좀 모티프를 갖는 CTLA4를 표적화하는 miRNA는 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 또는 SEQ ID NO. 8의 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 miRNA의 시드 서열의 다운스트림에 위치하고, 시드 서열의 3'말단의 마지막 뉴클레오티드 및 엑소좀 모티프의 5'말단의 첫번째 뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드를 공유하며, 예를 들어 뉴클레오티드 “G”이다. 예를 들어, SEQ ID NO. 6은 엑소좀 모티프와 시드 서열 사이의 뉴클레오티드 “G”의 공유를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 miRNA의 시드 서열의 다운스트림에 위치하고, 시드 서열의 3'말단의 마지막 두 개의 뉴클레오티드 및 엑소좀 모티프의 5'말단의 처음 두 개의 뉴클레오티드는 두 개의 동일한 뉴클레오티드를 공유하며, 예를 들어, 두 개의 뉴클레오티드 “GG”이다. 예를 들어, SEQ ID NO. 8은 엑소좀 모티프와 시드 서열 사이의 두 개의 뉴클레오티드 “GG”의 공유를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 엑소좀 모티프는 miRNA의 시드 서열의 다운스트림에 위치하고, 이는 링커(예를 들어 “GC”)를 통해 시드 서열에 연결된다. 예를 들어, SEQ ID NO. 7은 엑소좀 모티프와 시드 서열이 링커 “GC”를 통해 연결되어 있음을 나타낸다.
시드 서열 및 엑소좀 모티프 외에, miRNA는 mRNA의 표적 영역과의 결합을 촉진하는 별도의 핵산 서열을 포함한다. 이러한 별도의 핵산은 일반적으로 엑소좀 모티프의 다운스트림에 위치하고, 예컨대 1 내지 10개의 뉴클레오티드와 같은 복수개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 별도의 핵산 서열은 바람직하게 표적 mRNA의 상응한 세그먼트에 상보적이지만, 상술한 바와 같이, 100％ 상보적일 필요는 없다.
엑소좀으로의 miRNA 전이 방법은 본 분야에서 획득할 수 있는 것이고, 예를 들어 실시예에서 서술한 miRNA 발현 벡터 및 CTLA4를 코딩하는 플라스미드로 세포를 형질감염시키는 것이다. 엑소좀의 분리, 확인 또는 특성화는 본 분야에서 기술적으로 가능하다. 예를 들어 CD9, CD63, CD81, CD82, 아넥신, Flotillin과 같은 여러 가지 단백질 엑소좀의 마커로 사용할 수 있다. miRNA를 엑소좀에 패키징하는 다른 방법은 또한 본 발명에 적용될 수 있다.
본 발명의 엑소좀은 CTLA4를 표적화하는 억제량의 miRNA를 함유한다. 억제량은 토론된 miRNA가 종양 세포에 전달되면 단백질CTLA4의 발현을 억제하기에 충분한 양을 지칭한다.
하기 표는 본 발명의 실시예에서 사용되는 miRNA, 시드 서열 및 miRNA-모티프의 핵산 서열을 나열하였다.
표 2 miRNA, 시드 서열 및 엑소좀 모티프에 연결된 miRNA의 핵산 서열
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종양 용해성 단순 포진 바이러스(oHSV)
본문에 사용된 바와 같이, 종양 용해성 단순 포진 바이러스(oHSV)는 본 분야에 공지된, 종양 세포를 효과적으로 파괴하는데 사용되도록 설계되는 임의의 종양 용해성 I형 단순 포진 바이러스(HSV-1)를 지칭한다. 이 밖에, 본 발명에서 사용되는 oHSV는 또한 유전자에 의해 조작될 수 있음으로써, 천연 oHSV의 하나 또는 복수개의 특징을 삭제할 수 있다. 이 밖에 대안적으로, 천연적으로 존재하는 oHSV는 유전자 조작되어 하나 또는 복수개의 코딩 서열의 외래 세그먼트를 바이러스의 게놈에 도입함으로써, 면역 치료 또는 면역 자극 특성과 같은 바이러스의 한가지 또는 여러 가지 추가 기능을 제공할 수 있다. 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 본 발명의 결실된 뉴클레오티드의 정확한 시작 위치 및 종료 위치는 HSV-1바이러스의 균주 및 게놈 이성질체에 따라 결정되고, 본 분야에 공지된 기술에 의해 용이하게 결정될 수 있음을 이해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결실은 게놈에서 뉴클레오티드117005 내지 132096이 절제를 초래한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 HSV-1의 독주17(GenBank 수탁 번호 NC 001806.2), 독주KOS 1.1(GenBank 수탁 번호 KT899744) 또는 독주F(GenBank 수탁 번호 GU734771.1)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, oHSV는 HSV-1의 독주F이다.
일부 실시형태에서, oHSV는 유전자 조작된 HSV-1 F독주로서, GM-CSF, IL-2, IL-5, IL-12, IL-15, IL-24 및 IL-27로부터 선택되는 면역 자극제를 발현한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 단지 IL-12의 유전자 조작된 HSV-1 F독주를 발현한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현하는 유전자 조작된 HSV-1 F독주이다.
방법 및 요법
본 발명의 일 양태는 대상체의 종양을 치료하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀 및 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 치료 유효량의 oHSV를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 양태는 대상체에게 oHSV 요법의 효능을 향상시키는 방법에 관한 것으로, oHSV 요법 외에, 상기 방법은 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 본 발명의 엑소좀을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 IL-12만 발현한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에서, CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀 및 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV의 투여는 대상체에게 약물 조성물을 투여함으로써 수행되고, 상기 약물 조성물은 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀, 치료 유효량의 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에서, CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀 및 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV의 투여는 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀 및 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV를 대상체에게 각각 투여함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV의 투여 전, 동시에 또는 이후에 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀을 투여한다. 이 경우, 약 12 내지 72시간 내에 두 가지 형태로 대상체에게 투여될 수 있도록 예상된다. 그러나, 일부 경우, 치료 시간을 현저하게 연장하고, 단독 투여 사이에 며칠(2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 몇주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)의 시간을 사이에 두는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시형태에서, CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀은 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV와 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀은 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물의 형태로 투여되고, 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV는 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 치료 유효량의 oHSV 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 실시형태에서, CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 치료 유효량의 엑소좀 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물, 및 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 치료 유효량의 oHSV 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물은 단일 키트에 패키징될 수 있다.
일부 실시형태에서, 임의의 약물 조성물은 종양내, 정맥내, 근육내, 경피 또는 피내와 같은 비경구 또는 비경구 투여된다. 일부 실시형태에서, 임의의 약물 조성물은 바람직하게 종양내 투여된다.
일부 실시형태에서, 종양을 치료하는 방법은 예를 들어 종양 성장 억제 및/또는 종양 부피 감소 방면에서 oHSV 요법의 항종양 효능을 향상시킨다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 종양을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 상술한 치료 유효량의 엑소좀 및 치료 유효량의 oHSV를 조합하여 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양을 치료하는 방법은 종양과 관련된 증상의 발병, 발전 및/또는 재발을 방지한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 대상체에서 종양과 관련된 증상을 예방하는 방법은 상술한 치료 유효량의 엑소좀 및 치료 유효량의 oHSV를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, oHSV는 유전자 조작된 HSV-1 F독주로서, GM-CSF, IL-2, IL-5, IL-12, IL-15, IL-24 및 IL-27로부터 선택되는 면역 자극제를 발현한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 단지 IL-12의 유전자 조작된 HSV-1 F독주를 발현한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현하는 유전자 조작된 HSV-1 F독주이다.
본 발명의 방법으로 다양한 종양, 특히 고형종양을 치료하는 것으로 고려한다. 본 발명에 따라 치료할 수 있는 고형종양의 실시예는 악성 종양 및 암, 예를 들어 흑색종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관 내피육종, 활막종, 중피종, 유윙종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암, 기저세포암, 선암, 땀샘종, 피지암, 유두암, 유두선암, 낭성선암, 수질암, 기관지암, 신세포암, 간암, 담관암, 융모막암, 정상피종, 배아암, 윌름스종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 위암 및 위전위암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
약물 조성물 및 키트
본 발명의 일 양태는 약물 조성물을 제공하는데, 상술한 치료 유효량의 엑소좀, 치료 유효량의 oHSV 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이 약물 조성물은 대상체의 종양을 예방하거나 치료하는데 사용된다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제에서 약물 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 제1 약물 조성물을 제공하는데, 상술한 치료 유효량의 엑소좀 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이 밖에, 본 발명은 제2 약물 조성물을 더 제공하는데, 상술한 치료 유효량의 oHSV 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이러한 양태에서, 본 발명은 키트를 제공하는데, 단일 패키징된 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물을 포함한다. 이 키트는 의사가 임상 사용에서 참조할 수 있는 사용 설명을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, oHSV는 유전자 조작된 HSV-1 F독주로서, GM-CSF, IL-2, IL-5, IL-12, IL-15, IL-24 및 IL-27로부터 선택되는 면역 자극제를 발현한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 단지 IL-12의 유전자 조작된 HSV-1 F독주를 발현한다. 일부 실시형태에서, oHSV는 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현하는 유전자 조작된 HSV-1 F독주이다.
통상적인 저장 및 사용 조건에서, 이러한 제제/조성물은 미생물의 성장을 방지하는 방부제를 포함한다. 주사 용도에 적합한 약물 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 및 분산액을 임시적으로 제조하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우, 이 형태는 반드시 멸균 상태여야 하고, 일정한 유동성을 가져야 주사하기 용이한 정도에 도달한다. 이 형태는 생산 및 저장 조건에서 안정적으로 유지되어야 하고, 미생물(예를 들어 박테리아 및 곰팡이) 오염 방지를 수행하여야 한다.
담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 분산된 경우, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제를 사용하여 필요한 입자 크기를 유지하고 계면 활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지한다. 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살과 같은 다양한 항세균제 및 항진균제를 통해 미생물의 작용을 예방할 수 있다. 많은 경우, 당, 염화나트륨 또는 인산염 완충 식염수와 같은 등장제를 포함하는 것이 가장 좋다. 조성물에서 흡수를 지연시키는 시약(예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)을 사용하여 주사 가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
수용액으로 비경구 투여하는 경우, 예를 들어, 용액은 적절하게 완충되어야 하고(필요한 경우), 먼저 충분한 식염수 또는 포도당으로 등장시킨다. 이러한 특정된 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복강내 투여에 적용된다. 이와 관련하여, 본 발명의 내용에 따르면, 멸균 수성 매질을 사용할 수 있는 것은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 공지된 내용이다. 예를 들어, 1회 투여량을 1 mL의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000 mL의 피하 관류 용액에 첨가하거나 권장하는 주입 위치에 주사할 수 있다(예를 들어 “Remington's Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580을 참조). 치료 대상체의 상태에 따라, 투여량은 불가피하게 일부 변화를 발생할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 투여 책임자는 개체 대상체에 대한 적절한 투여량을 결정한다. 이 밖에, 인체 투여에 있어서, 제제는 FDA에서 요구하는 멸균성, 비발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
활성 화합물을 필요한 양에 따라 상기에서 나열된 다양한 기타 성분과 필요에 따라 적합한 용매에 합병시킨 후, 여과하고 멸균하여 멸균 및 주사 가능한 용액을 제조한다. 일반적으로, 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기에서 나열된 필수 기타 성분을 함유하는 멸균 담체에 통합하여 분산액을 제조한다. 멸균 주사 용액을 제조하는 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이고, 이는 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 기타 필요한 성분의 분말을 생성한다.
본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로 조제될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산부가염(단백질의 유리 아미노기와 형성), 무기산(예를 들어 염산 또는 인산) 또는 유기산(예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등)과 형성된 염을 포함한다. 유리 카르복실기와 형성된 염은 또한 무기 염기(예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철) 및 유기 염기(예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등)로부터 유도될 수 있다. 조제될 경우, 용액은 투여량 포뮬러와 매칭되는 방식 및 치료적 유효량으로 투여될 것이다. 제제는 다양한 제형(예를 들어 주사 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등)으로 투여되기 용이하다.
본문에 사용된 바와 같이, “담체”는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 담체, 코팅제, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁제, 콜로이드 등을 포함한다. 약물 활성 물질에 사용되는 이러한 매질 및 약제의 사용은 본 분야에서 공지된 것이다. 활성 성분과 상용되지 않는 임의의 통상적인 매질 또는 시약 외에, 다른 매질 또는 시약은 상기 치료 조성물에 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 보조 활성 성분은 또한 조성물에 통합될 수 있다.
문구 “약학적으로 허용 가능한”은 인간에게 투여될 경우 알레르기 또는 유사한 거부반응을 일으키지 않는 분자 개체 및 성분을 지칭한다. 단백질을 활성 성분으로 하는 수성 조성물의 제조는 본 분야에 공지된 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사제로 제조되고, 액체 용액 또는 현탁액이든; 주사 전에 액체에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있다.
실시예
우리는 보조 요법의 발전을 설명하였고, 이 요법은 miRNA(특히 코딩 CTLA4 검사 포인트를 표적화하도록 설계된 mRNA)를 종양 세포에 운반하고 방출하도록 조작된 엑소좀으로 구성된다.
엑소좀은 크기 및 단백질 함량에 근거하여 정의되는 치료 응용 목적으로 사용되는 세포외 소포이다. 이들은 이들을 생성하는 세포에서 RNA 및 단백질을 패키징하고, 화물을 이들을 노출시키는 세포에 운송한다. 본 보고서에 설명된 연구에서, 필요한 엑소좀의 유효 페이로드는 miRNA이다.
miRNA는 효과적인 도구이고, 원칙적으로 특정 단백질을 코딩하는 RNA의 복제를 제어하는데 사용될 수 있다. 목적은 세포 독성 T림프구 관련 단백질4의 복제를 방지할 수 있고 엑소좀을 통해 감염된 세포에 전달할 수 있는 miRNA를 설계하는 것이다. 우리는 CTLA4를 코딩하는 mRNA를 표적화하는 10개의 miRNA를 설계하였다. 10개의 miRNA에서, miR-CTLA4-1#, miR-CTLA4-2#, miR-CTLA4-3# 및 miR-CTLA4-6#는 감수성 세포에 형질감염된 후 CTLA4의 축적을 효과적으로 차단할 수 있다. 엑소좀으로의 miRNA의 패키징을 촉진시키기 위하여 우리는 miR-CTLA4-3#의 서열을 엑소좀 패키징 모티프에 합병한다. 우리의 이전 연구에 따르면, miR-CTLA4-3#은 엑소좀에 패키징 될 수 있고, 엑소좀을 통해 감수성 세포에 성공적으로 전달되며, 감수성 세포에서 적어도 72시간 동안 안정적으로 유지된다. 이 밖에, 엑소좀을 통해 종양에 전달된 miR-CTLA4-3#은 CTLA4의 발현을 효과적으로 감소시켰다.
RNA를 엑소좀에 통합시키는 것은 서열 의존적이고, hnRNPA2B1(한가지 엑소좀의 성분)에 의해 촉진된다. hnRNPA2B1은 엑소좀 RNA로 나뉘고, 두 가지 공지된 엑소좀 패키징 모티프(엑소좀 모티프) 중 하나를 포함한다. hnRNPA2B1의 주요 기능은 mRNA를 조절하여 신경 세포의 축삭에 수송하는 것이고, 이는 RNA 수송 서열(RTS)이라고 지칭하는 21-nt RNA 서열에 결합되어 매개된다. 이 서열은 두 개의 엑소좀 모티프를 포함한다.
우리는 쥐T1, T2 및 T3 시리즈 oHSV의 종양 용해 활성에 상대적으로 내성이 있는 쥐 종양을 확인하였다. oHSV의 T1시리즈는 면역 조절제(이하 또한 “T1012G”라고 지칭함)를 발현하지 않는 HSV-1 F독주이다. oHSV의 T2시리즈는 IL-12만을 발현하는 HSV-1 F독주(이하 또한 “T2850”이라고 지칭함)이다. oHSV의 T3시리즈는 IL-12 및 항PD-1 항체(이하 또한 “T3855”이라고 지칭함)를 동시에 발현하는 HSV-1 F독주이다.
실시예는, T3855(또는 T2850) 및 CTLA4를 코딩하는 mRNA를 표적화하도록 설계된 miRNA를 운반하는 엑소좀을 포함하는 조성물을 통해 종양에 전달함으로써 T2850(특히 T3855)의 항종양 효능을 향상시키고, 종양 부피르 감소시킬 수 있다.
재료 및 방법
상동 마우스 모델. MFC 종양의 상동 마우스는 Balb/c이다.
miR-CTLA-4를 발현하는 플라스미드. Life Technologies의 BLOCK-iT™ RNAi Designer를 사용하여 마우스 CTLA4에 대한 표적 miRNA 서열을 설계하고, Ige Biotechnology(중국 광주)에서 합성한다. 합성된 miRNA 세그먼트를 BamHI 및 XhoI 제한 효소로 소화하고, pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg 대조 플라스미드(Invitrogen)의 상응한 사이트에 클로닝한다. miRNA의 서열은 다음과 같다.
miR-CTLA4-1#:
5’-AACCTTCAGTGGAGTTGGCGAGTTTTGGCCACTGACTGACTcGCCAACCACTGAAGGTT-3’(SEQ ID NO. 53);
miR-CTLA4-2#:
5’-CTTCAGTGGAGTTGGCGAGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCTCGCCCtCCACTGAAG-3’(SEQ ID NO. 54);
miR-CTLA4-3#:
5’-ACTGTGCTGCGGAGGACAAATGTTTTGGCCACTGACTGACATTTGTCCCGCAGCACAGT-3’(SEQ ID NO. 55);
miR-CTLA4-4#:
5’-CGACATTCACGGAGGAGAATAGTTTTGGCCACTGACTGACTATTCTCCCGTGAATGTCG-3’(SEQ ID NO. 56);
miR-CTLA4-5#:
5’-GAACCTCACCCTCCAAGGACTGTTTTGGCCACTGACTGACAGTCCTTGGGGTGAGGTTC-3’(SEQ ID NO. 57);
miR-CTLA4-6#:
5’-ATCCAAGGACTGGGAGCTGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACAGCTCAGTCCTTGGAT-3’(SEQ ID NO. 58);
miR-CTLA4-7#:
5’-ACTCATGTACCCTCCGCCATAGTTTTGGCCACTGACTGACTATGGCGGGGTACATGAGT-3’(SEQ ID NO. 59);
miR-CTLA4-8#:
5’-GGCAACGGGAGGCGGAGTTATGTTTTGGCCACTGACTGACATAACTCCCTCCCGTTGCC-3’(SEQ ID NO. 60);
miR-CTLA4-9#:
5’-GGGCAACGGGACGGAGATTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAAATCTCTCCCGTTGCCC-3’(SEQ ID NO. 61);
miR-CTLA4-10#:
5’-TGACTGTGCTGCGGCGGACAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTGTCCGCCAGCACAGTCA-3’(SEQ ID NO. 62);
밑줄은 성숙한 miRNA 서열을 나타낸다.
His 태그가 있는 마우스 CTLA4 발현 플라스미드(mCTLA4-his)는 YouBio Biotechnology(중국 장사)에서 구입하였다.
세포주. HEp-2세포는 미국 균종 수탁센터에서 획득하였고, 5%(vol/vol)의 소태아혈청(FBS)이 보충된 DMEM(Life Technologies)에서 통상적으로 배양되었다. MFC(마우스 전위암) 세포는 JOINN Laboratories, Inc.(중국 북경)에서 제공하였다. B16(마우스 흑색종)은 심천국제생물의학연구소(중국 심천)에서 제공하였다.
항체. 본 연구에 사용된 항체는 항-His-태그(Cat No. 66005-1-Ig, Proteintech Group) 및 항-GAPDH(Cat No.2118, Cell Signaling Technology)이다.
엑소좀 분리. miR-CTLA-4를 발현하는 10 μg 의 플라스미드로 HEp-2세포(5×106)를 형질감염시켰다. 4시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS로 3회 세척하여 혈청 내 엑소좀의 잠재적인 오염을 제거하고, 세포를 무혈청 배지에서 48시간 동안 더 배양하였다. 상층액을 수집하여 권장 투여량의 전체 엑소좀 분리 키트 시약(Thermo Fisher Cat No. 4478359)과 혼합하고, 4℃에서 하룻밤 저장한 후, 1시간 동안 원심 분리한다. 다음 침전된 엑소좀을 200 μl PBS에 재현탁시키거나 RIPA 완충액에 분해시킨 후, 제조사의 설명에 근거하여 강화된 BCA 단백질 검출 키트(Beyotime Biotechnology, 중국)를 사용하여 BCA 검출에 의해 정량화하였다. 표준 곡선에 대한 보정을 통해 엑소좀 단백질 함량을 결정하고, 이 표준 곡선은 소 혈청 알부민의 표준 농도에 대한 562 nm에서의 흡광도를 플롯팅하여 얻었다.
엑소좀 크기 및 정량 분석. qNano 시스템(Izon, 크라이스트처치, 뉴질랜드)을 사용하여 엑소좀 크기 분포 분석을 수행하였다. Izon의 qNano 기술(www.izon.com)은 단일 분자가 전기영동을 통해 나노포어를 통과하는 세포외 소포를 검출하였다. 실제로, 이는 평균 입자 크기 없이도 75 내지 150 nm의 엑소좀 크기를 가진 소포를 입자별로 정확하게 특성화 할 수 있다. 정제된 엑소좀을 0.05% Tween-20이 함유된 PBS에 1: 10이 되도록 희석하고, 강력하게 흔들며, 제조사의 설명에 근거하여 NP150(A45540) 나노포어 구경을 사용하여 측정하였다. 데이터 처리 및 분석은 Izon Control Suite 소프트웨어 v3.3(Izon Science)에서 수행되었다.
웨스턴 블롯 분석. 웨스턴 블롯팅으로 His 태그가 있는 CTLA-4, GAPDH 및 엑소좀 마커 단백질을 검출하였다. 세포를 수확하고 1 mM 프로테아제 억제제 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)(Beyotime) 및 포스파타제 억제제(Beyotime)가 보충된 RIPA 용해 완충액(Beyotime)으로 용해시켰다. 세포 용해물을 열변성시키고, SDS-PAGE로 분리하여 폴리불화비닐리덴막(Millipore)으로 전이시켰다. 단백질은 이하 방법으로 검출하였다. 먼저 적절한 1차 항체와 함께 배양한 후, 양고추냉이 과산화효소 결합 2차 항체(Pierce) 및 ECL 시약과 함께 배양하고, 필름에 노출시키거나 ChemiDoc Touch Imaging System(Bio-Rad)으로 이미지를 캡처한 후, ImageLab 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. ImageJ 소프트웨어를 사하여 상응한 밴드의 밀도를 정량화하였다.
oHSV 구성체. 예시적인 oHSV(예를 들어 T2850 및 T3855)의 구성체는 재조합 종양 용해성 I형 단순 포진 바이러스(HSV-1)에 관한 것으로, (a)변형된 HSV-1게놈, 여기서 상기 변형은 야생형 HSV-1게놈의 UL56유전자의 프로모터 및 US1유전자의 프로모터 사이의 서열 결실을 포함하여 (i)모든 이중 카피 유전자의 하나의 카피가 결실되고, (ii)상기 결실된 바이러스 DNA에 존재하는 모든 오픈 리딩 프레임(ORF)에 필요한 서열은 완전하며; 및 (b)면역 자극제 및/또는 면역 치료제를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 여기서 상기 외인성 핵산 서열은 변형된 HSV-1게놈의 적어도 결실된 영역에 안정적으로 부가된다. 면역 자극제 또는 면역 치료제를 코딩하는 하나의 외인성 핵산 서열만이 삽입될 경우, 이 외인성 핵산 서열은 바람직하게 게놈의 결실된 영역에 삽입된다. 면역 자극제 및/또는 면역 치료제를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열이 삽입될 경우, 제1 외인성 핵산 서열은 바람직하게 게놈의 결실된 영역에 삽입된다. 두번째 또는 더 많은 외인성 핵산 서열은 게놈의 L성분에 삽입된다. WO2017/181420은 종양 용해성 단순 포진 바이러스(oHSV)의 구성 및 특성에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다.
결과
miR-CTLA-4를 포함하는 엑소좀(miR-CTLA-4 exo)의 설계 및 생산
제1 시리즈 실험의 목적은 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 함유하는 엑소좀을 설계하고 생성하는 것이다. 이를 위해, 우리는 먼저 10개의 miRNA를 구축하였고, 각각 miR-CTLA4-1#, miR-CTLA4-2#, miR-CTLA4-3#, miR-CTLA4-4#, miR-CTLA4-5#, miR-CTLA4-6#, miR-CTLA4-7#, miR-CTLA4-8#, miR-CTLA4-9# 및 miR-CTLA4-10#이라고 명명하였다. 도 1A에 도시된 각 miRNA의 서열은 miRNA시드 서열의 다운스트림에 엑소좀 패키징 관련 모티프(exo-motifs)로 도시되는 별도의 서열을 포함한다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 miRNA를 miRNA 발현 담체의 EGFP를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 클로닝하였고, “pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg 대조군 플라스미드”라고 명명하였다.
다음, miRNA를 테스트하기 위해, HEp-2세포를 상기 miRNA 발현 담체(miRmCTLA4-1#, miRmCTLA4-2#, miRmCTLA4-3#, miRmCTLA4-4#, miRmCTLA4-5#, miRmCTLA4-6#, miRmCTLA4-7#, miRmCTLA4-8#, miRmCTLA4-9#, miRmCTLA4-10#) 및 C말단에서 His로 표기된 CTLA4를 코딩하는 플라스미드(mCTLA4-His)와 공동 형질감염시켰다. 도 1B에 도시된 바와 같이, CTLA4 축적을 억제하는 과정에서, miR-CTLA4-3#은 10개의 구성체에서 가장 효과적인 것이다. 결과는 miR-CTLA4-3#이 더 높은 효율로 CTLA4의 축적을 억제함을 나타낸다. miR-CTLA4-1#, miR-CTLA4-2#, miR-CTLA4-4#, miR-CTLA4-5#, miR-CTLA4-6# 및 miR-CTLA4-7#은 중간 정도의 효과를 나타내지만, 비표적(NT), miR-CTLA4-8#, miR-CTLA4-9# 및 miR-CTLA4-10# 플라스미드는 CTLA4의 축적에 영향을 미치지 않는다(도 1C). 따라서, miR-CTLA4-3#을 선택하여 더 연구하였다.
다음 단계에서, 우리는 선택된 miR-CTLA-4를 코딩하는 엑소좀을 구축하였다. miR-CTLA4-3#을 코딩하는 10 μg 플라스미드 또는 비표적 miRNA(NT)를 발현하는 플라스미드를 사용하여 T150플라스크에 접종된 HEp-2세포를 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포외 배지를 수확하고 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 엑소좀을 정제하였다.
miR-CTLA-4를 운반하는 엑소좀의 특성화
miR-CTLA-4를 운반하는 엑소좀을 특성화하기 위해 복수개의 실험을 수행하였다. 먼저, 엑소좀을 생성하는 동일한 양의 세포 및 동일한 양의 엑소좀을 용해시키고, 변성 겔에서 전기영동하며, CD9, Flotilin-1 및 Calnexin을 갖는 항체로 탐지하였다. 예상한 바와 같이, 결과(도 2A)는 엑소좀에 CD9 및 Flotilin-1이 함유되지만, Calnexin이 함유되지 않음을 나타낸다.
다음, 10 μg의 miR-CTLA4를 코딩하는 플라스미드 또는 비표적 miRNA를 발현하는 플라스미드를 형질감염시킨 HEp-2 세포로부터 엑소좀을 정제하고, Izon의 qNano 기술을 사용하여 나노입자 추적 분석을 통해 엑소좀의 크기를 분석 및 측정하였다. 결과(도 2B)는 형질감염된 세포에 의해 생성된 엑소좀의 평균 직경은 100 내지 200 nm임을 나타낸다.
miR-CTLA-4를 운반하는 엑소좀 및 oHSV를 이식된 MFC 종양에 동시에 투여하여 T3 oHSV의 종양 용해 활성을 향상시키지만, T1 또는 T2 oHSV의 종양 용해 활성을 향상시키지 않음
본 시리즈의 실험의 첫번째 단계에서, miR-CTLA4-3#의 플라스미드를 사용하여 HEp-2의 반복 배양물을 형질감염시키고, 세포를 48 h 동안 배양하였다. 다음, 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 HEp-2에서 생성된 엑소좀(miR-CTLA-4 exo)을 정제하였다.
두번째 단계에서, 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 oHSV T1012G, T2850및 T3855를 구축하였다. 다음 8개의 군, 8마리/군 C57BL/6J 마우스의 오른쪽에 마우스 전위암(MFC) 세포를 피하 주사하여 종양을 생성하였다. 종양이 평균 80 mm3에 도달하면, 종양내에 1×107 pfu의 T1012G(도 3B), T2850(도 3C) 또는 T3855(도 3D)를 1회 단독으로 주사하거나 10 μg miR-CTLA-4 엑소좀과 각각 조합하여 주사하였다.
마지막으로, 주사 후 26일까지 종양 부피를 매 3일 또는 4일에 1회 측정하였다. 결과는 주사 후 각 군에서 종양 부피가 점차적으로 증가함을 나타낸다. 도 3A는 miRNA-CTLA4 exo를 주사한 마우스의 종양 부피가 대조군의 종양 부피만큼 빠르게 증가하였고, 주사 후 26일째, miRNA-CTLA4 exo를 주사한 마우스의 종양 부피는 대조군의 종양 부피보다 큼을 나타낸다. 도 3B는 주사 후 대조군, T1012G군 및 T1012G+miRNA-CTLA4 exo군의 종양 부피가 점차적으로 증가함을 나타낸다. 주사 26일 후, T1012G+miRNA-CTLA4 exo를 주사한 마우스의 종양 부피는 대조군 및 T1012G군의 종양 부피보다 작았다. 도 3C에서, T2850군 및 T2850+miRNA-CTLA4 exo군의 종양 부피는 대조군의 종양 부피보다 늦게 증가하였다. 주사 26일 후, T2850군 및 T2850+miRNA-CTLA4 exo군의 종양 부피는 모두 대조군의 종양 부피보다 작았고, T2850+miRNA-CTLA4 exo군의 종양 부피는 T2850군의 종양 부피와 현저한 차이가 없었다. 도 3D에서, T3855+miRNA-CTLA4 exo군의 종양 부피는 가장 늦게 증가하였고, 다음으로 T3855군, 마지막으로 대조군이다. 주사 26일 후, 대조군의 종양 부피는 가장 컸고, 다음으로 T3855군의 종양 부피이며, T3855+miRNA-CTLA4 exo군의 종양 부피는 가장 작았다.
이 시리즈의 실험 결과는, T2850 및 T3855가 종양 성장을 효과적으로 억제할수 있는 동시에 T3855 및 miRNA-CTLA4 exo의 종양내 투여는 T3855의 항종양 효능을 향상시키고, 종양의 성장을 억제하는 것을 나타낸다.
결과는, miR-CTLA4-3#이 CTLA-4를 표적화하고 CTLA-4의 발현을 하향 조절함을 나타낸다. 우리는 또한 miR-CTLA4-3#이 엑소좀에 패키징되고, 정제된 엑소좀에는 CD9, Flotilin-1이 함유되지만 Calnexin이 결실됨을 설명하였다. 플라스미드 miR-CTLA4-3# 또는 비표적 miRNA(NT)로 형질감염된 Hep-2세포에 의해 생성된 엑소좀의 직경은 평균 100-200 nm이다. 본문의 결과는 또한 IL-12를 단독으로 발현하거나 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV가 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. 마지막으로, 우리는 종양에 CTLA4를 표적화하는 miRNA를 운반하는 엑소좀 및 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현하는 oHSV를 동시에 투여하여 oHSV의 항종양 효능을 향상시키고 종양 성장을 억제할 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 바람직한 실시형태 및 선택적 특징을 통해 개시되었지만, 본문에서 제시된 내용에 대한 수정, 개선 및 변경은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 인식할 수 있고, 이러한 수정, 개선 및 변경은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되는 것을 이해해야 한다. 본문에서 제공하는 재료, 방법 및 실시예는 바람직한 실시형태의 대표이고, 예시적이며, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
본문에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 모두 인용을 통해 전체가 본문에 명확하게 통합되고, 그 정도는 매 하나가 단독으로 인용을 통해 통합되는 것과 동일하다. 충돌이 발생하면, 본 명세서(정의 포함)를 우선한다. 본문에서 설명적으로 설명된 개시 내용은 본 명세서에서 구체적으로 개시되지 않은 어떠한 요소, 제한이 없는 경우 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 “포함”, “포함”, “함유” 등은 광범위하게 열독되어야 하고 제한을 받지 않는다. 이 밖에, 본문에서 사용하는 용어 및 표현은 설명적인 것으로 제한적인 용어가 아니고, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 표시 및 상기 특징의 어떠한 균등물 또는 일부를 배제하려는 의도는 없지만, 본 발명이 보호하고자 하는 범위 내에서 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 인식해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Shenzhen International Institute for Biomedical Research <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR TREATING TUMORS <130> 191545-21D-KRP <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-CTLA4-1# seed Sequence <400> 1 accuuca 7 <210> 2 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-CTLA4-2# seed Sequence <400> 2 uucagug 7 <210> 3 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-CTLA4-3# seed Sequence <400> 3 cugugcu 7 <210> 4 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-CTLA4-6# seed Sequence <400> 4 uccaagg 7 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-CTLA4-1# + exo-motif <400> 5 aaccuucagu ggaguuggcg a 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-CTLA4-2# + exo-motif <400> 6 cuucagugga guuggcgagc a 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-CTLA4-3# + exo-motif <400> 7 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<220> <223> exo-motif <400> 36 cgcc 4 <210> 37 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 37 cggg 4 <210> 38 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 38 cggc 4 <210> 39 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 39 cccu 4 <210> 40 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 40 cccg 4 <210> 41 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 41 ccca 4 <210> 42 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 42 uccu 4 <210> 43 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 43 uccg 4 <210> 44 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 44 ucca 4 <210> 45 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 45 gccu 4 <210> 46 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 46 gccg 4 <210> 47 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 47 gcca 4 <210> 48 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 48 ggaggac 7 <210> 49 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 49 ggacugggag 10 <210> 50 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 50 ggaggag 7 <210> 51 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 51 ggacggag 8 <210> 52 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exo-motif <400> 52 ggaggcggag 10 <210> 53 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequences of miR-CTLA4-1# <400> 53 aaccttcagt ggagttggcg agttttggcc actgactgac tcgccaacca ctgaaggtt 59 <210> 54 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequences of miR-CTLA4-2# <400> 54 cttcagtgga gttggcgagc agttttggcc actgactgac tgctcgccct ccactgaag 59 <210> 55 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequences of miR-CTLA4-3# <400> 55 actgtgctgc ggaggacaaa tgttttggcc 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Claims (42)

  1. 치료 유효량의 엑소좀,
    치료 유효량의 종양 용해성 단순 포진 바이러스 및
    약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 대상체의 종양을 치료하기 위한 약물 조성물에 있어서,
    상기 엑소좀은 억제량의 CTLA4를 표적화하는 miRNA 및 엑소좀 모티프를 포함하고, 상기 엑소좀 모티프는 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열과 작업 가능하게 연결되어 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA가 상기 엑소좀에 패키징되는 것을 강화하며, 또한
    상기 종양 용해성 단순 포진 바이러스는 면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는 대상체의 종양을 치료하기 위한 약물 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 4의 핵산 서열에서의 임의의 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 엑소좀 모티프는 SEQ ID NO. 21 내지 SEQ ID NO. 49로부터 선택되는 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀 모티프는 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열의 다운스트림에 위치하고 이와 공유 연결되는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀 모티프는 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열 외의 하나 또는 복수개의 핵산을 돌연변이시켜 획득한 것임을 특징으로 하는 약물 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀 모티프는 두 개의 단일 엑소좀 모티프의 조합을 통해 생성된 더블 모티프이고, 여기서 상기 두 개의 단일 엑소좀 모티프에서의 임의의 하나는 SEQ ID NO. 21 내지 SEQ ID NO. 47의 핵산 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 더블 모티프는 SEQ ID NO. 48의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    작업 가능하게 연결될 경우, 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA 및 상기 엑소좀 모티프는 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 두 개의 뉴클레오티드를 공유하거나 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 링커는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)로부터 선택되는 두 개 또는 더 많은 뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 링커는 -GC-인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    작업 가능하게 연결될 경우, 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA 및 상기 엑소좀 모티프는 SEQ ID NO. 7의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 자극제는 GM-CSF, IL-2, IL-5, IL-12, IL-15, IL-24 및 IL-27로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 면역 자극제는 IL-12인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 단순 포진 바이러스는 IL-12를 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 단순 포진 바이러스는 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 단순 포진 바이러스는 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현하는 HSV-1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 HSV-1은 HSV-1의 F독주인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    천연 백본의 117005 내지 132096의 뉴클레오티드 서열 세그먼트가 삭제된 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 악성 종양인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 악성 종양은 흑색종, 섬유육종, 점액육종, 연골육종, 골형성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관 내피육종, 활막종, 중피종, 유윙종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암, 기저세포암, 선암, 땀샘종, 피지암, 유두암, 유두선암, 낭성선암, 수질암, 기관지암, 신세포암, 간암, 담관암, 융모막암, 정상피종, 배아암, 윌름스종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 위암 및 위전위암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. (a)억제량의 CTLA4를 표적화하는 miRNA 및 엑소좀 모티프를 포함하되, 상기 엑소좀 모티프는 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열과 작업 가능하게 연결되어 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA가 패키징되는 것을 강화하는 치료 유효량의 엑소좀,
    (b)면역 자극제를 발현하거나 면역 자극제 및 항PD-1 항체를 발현하는 치료 유효량의 종양 용해성 단순 포진 바이러스 및 선택적으로
    (c)사용 설명을 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체의 종양을 치료하기 위한 키트.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 4의 핵산 서열에서의 임의의 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체의 종양을 치료하기 위한 키트.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    상기 엑소좀 모티프는 SEQ ID NO. 21 내지 SEQ ID NO. 49로부터 선택되는 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀 모티프는 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열의 다운스트림에 위치하고 이와 공유 연결되는 것을 특징으로 하는 키트.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀 모티프는 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA의 시드 서열 외의 하나 또는 복수개의 핵산을 돌연변이시켜 획득한 것임을 특징으로 하는 키트.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀 모티프는 두 개의 단일 엑소좀 모티프의 조합을 통해 생성된 더블 모티프이고, 여기서 상기 두 개의 단일 엑소좀 모티프에서의 임의의 하나는 SEQ ID NO. 21 내지 SEQ ID NO. 47의 핵산 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 더블 모티프는 SEQ ID NO. 48의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    작업 가능하게 연결될 경우, 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA 및 상기 엑소좀 모티프는 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 두 개의 뉴클레오티드를 공유하거나 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 키트.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 링커는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)로부터 선택되는 두 개 또는 더 많은 뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 키트.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 링커는 -GC-인 것을 특징으로 하는 키트.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    작업 가능하게 연결될 경우, 상기 CTLA4를 표적화하는 miRNA 및 상기 엑소좀 모티프는 SEQ ID NO. 7의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 자극제는 GM-CSF, IL-2, IL-5, IL-12, IL-15, IL-24 및 IL-27로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 면역 자극제는 IL-12인 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 단순 포진 바이러스는 IL-12를 발현하는 것을 특징으로 하는 키트.
  36. 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 단순 포진 바이러스는 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 단순 포진 바이러스는 IL-12 및 항PD-1 항체를 발현하는 HSV-1인 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 HSV-1은 HSV-1의 F독주인 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제38항에 있어서,
    천연 백본의 117005 내지 132096의 뉴클레오티드 서열 세그먼트가 삭제된 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제22항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 악성 종양인 것을 특징으로 하는 키트.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 악성 종양은 흑색종, 섬유육종, 점액육종, 연골육종, 골형성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관 내피육종, 활막종, 중피종, 유윙종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암, 기저세포암, 선암, 땀샘종, 피지암, 유두암, 유두선암, 낭성선암, 수질암, 기관지암, 신세포암, 간암, 담관암, 융모막암, 정상피종, 배아암, 윌름스종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 위암 및 위전위암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  42. 제22항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 키트.
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