KR20220034742A

KR20220034742A - Taci-fc 융합 단백질 및 그 용도

Info

Publication number: KR20220034742A
Application number: KR1020217043204A
Authority: KR
Inventors: 지아민 팡; 웬시앙 왕; 린 리
Original assignee: 레메젠 코, 리미티드
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2022-03-18
Also published as: JP2022539785A; EP3868403A1; AU2019479685B2; AU2019479685A1; CN113573732A; EP3868403A4; US20220002381A1; WO2021128027A1; CA3131790A1

Abstract

최적화된 TACI-Fc 융합 단백질, 및 전신 홍반성 루푸스를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 그의 용도, 및 상기 TACI-Fc 융합 단백질을 이용하여 전신 홍반성 루푸스를 치료하기 위한 투여 요법 또는 치료 방법이 제공된다.

Description

ＴＡＣＩ―ＦＣ 융합 단백질 및 그의 용도

본 발명은 자가면역 질환 치료를 위한 B 림프구 자극인자 수용체-항체 융합 단백질 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질, 및 전신 홍반성 루푸스의 치료용 의약의 제조에서 이의 용도, 및 이를 이용한 자가면역 질환의 치료용 투여 요법에 관한 것이다.

전신 홍반성 루푸스(SLE)는 B 림프구의 비정상적 활성화 및 다량의 자가항체를 생성하는 형질 세포 및 기억 효과기 세포(memory effector cell)로의 비정상적 분화를 특징으로 하는 만성, 다중-계-관련 자가면역 질환이다. 이것은 인간의 건강을 심각하게 위협한다. 현재, SLE에 대해 임상적으로 덜 특이적인 치료법이 있으며, SLE의 통상적인 치료는 글루코코르티코이드 및 면역억제제를 주로 기반으로 하고, 코르티코스테로이드는 모든 치료 방법의 기초이다. 시클로포스파미드는 현재 중증 루푸스 신염 치료에 중요한 약물이지만, 이의 임상적 사용은 큰 부작용으로 인해 제한되고 있다. 또한, 1955년 FDA 승인을 받은 하이드록시클로로퀸은 치료 효과가 미흡하다.

연구들은, BlyS 녹아웃(knockout) 마우스는 성숙한 B 림프구를 감소시키고 면역글로불린을 감소시킨 반면에, BlyS 형질전환 마우스는 심각한 B 림프구 증식, 항-dsDNA 자가항체의 높은 역가, 단백뇨 및 신장에서 면역 복합체의 침착과 같은 루푸스 유사 징후를 보여주었음을 나타내고 있다. 두개의 SLE 마우스 모델 MRL/lpr 및 NZB/WF1에 있어서, 질환 발병 시, 혈청 BlyS 수치가 증가하였으며, 이것은 신장 손상과 관련이 있고, BlyS의 효과를 차단하는 것은 루푸스 유사 질환이 있는 마우스의 생존을 크게 향상시킬 수 있다. 일부 SLE 환자의 혈청 및 혈장에는 정상인보다 유의하게 더 높은 수준 및 더 높은 생물학적 활성의 BlyS가 있다. 동물 실험 및 인간 시험관 내 실험의 결과는 BlyS의 과발현이 SLE의 발병에 관련된 중요한 메커니즘 중 하나임을 시사한다. 따라서, BlyS를 표적으로 하고 B 림프구를 제거하는 것은 SLE에 대한 매우 유망한 치료 전략이 되고 있다.

현재, SLE의 치료를 위해 BlyS를 표적으로 하는 생물 제제는 연구에서 인기있는 부분이 되었다. SLE 치료를 위한 BLyS 길항제(antagonist)는 BLyS 단일클론 항체, BLyS 수용체와 IgG-Fc 세그먼트로 구성된 융합 단백질, BAFF-R에 결합할 수 있지만 신호 전달을 시작할 수 없는 BLyS 모방체, 및 비-작용성(non-agonistic) BLyS 수용체 항체 등이 포함될 수 있다.

B 림프구 자극제(BLyS, B lymphocyte stimulator)는 1999년에 발견된 TNF 슈퍼패밀리의 새로운 구성원이며 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및 호중구에 의해 주로 분비된다. BlyS는 B 림프구의 성숙을 조절하고, 면역글로불린 분류의 전환을 촉진하며, T 세포 활성화를 돕고, 해당 수용체에 결합하여 자가면역에 참여하는 기능을 발휘한다. BLyS는 285개의 아미노산으로 구성되며, 세포 표면에서 타입 II 막 관통 단백질로 발현되며, 전단 후 방출되는 17kb 가용성 단편은 생물학적 활성을 가지며 동종삼량체로서 순환에 참여한다. 현재 3개의 BLyS 수용체가 알려져 있다: BCMA(B 세포 성숙 항원), BAFF-R(BAFF 수용체, BR3) 및 TACI(막 관통 활성화제 및 칼슘 조절제 및 사이클로필린 리간드 상호작용제, TACI). BAFF-R은 BLyS에 대한 특이적 수용체인 반면에, TACI 및 BCMA는 BLyS에 결합하는 것 외에도 APRIL에도 또한 결합할 수 있다. BlyS의 3가지 수용체는 BlyS에 결합할 때 서로 다른 역할을 한다. 생쥐의 과도기 기간에서 B 세포의 성숙을 촉진하고, 생쥐와 인간에서 성숙한 B 세포의 수명을 연장하며, T 세포 활성화를 돕는 BLyS의 역할은 주로 BAFF-R을 통해 달성된다. TACI 수용체는 마우스 B 세포의 활성화에 이중 효과가 있다. 한편으로, TACI 결여된 마우스는 증가된 말초 B 세포, 증가된 항원 합성, 자가면역 및 심지어 치명적인 림프구 증식을 나타내어, TACI가 BlyS의 억제 수용체임을 시사한다. 한편, TACI는 T세포 독립 항원(TI)의 면역 반응에 참여한다. BCMA는 형질모세포의 생존을 유지하고 성숙한 B 세포의 항원 제시를 촉진하는 기능이 있다. TACI 수용체는 BLyS와 APRIL 모두에 강한 친화력을 가지므로, 다른 두 융합 단백질에 비해 TACI-Fc 융합 단백질이 선호되며 약물 구조가 선호되는 경우 선택되고 있다.

TACI는 미국의 저명한 학술 기관인 St. Jude Children's Hospital의 과학자 Von Bulow와 Bram에 의해 처음 발견되었으나, 이후의 연구에서는 TACI의 세포외 영역의 천연 서열은 취약한 분해의 문제가 있고, 의약품 제조에 적합하지 않음을 발견하였다. 그 이후로, 유명한 미국 생명 공학 회사인 Genentech, Amgen 및 ZymoGenetics를 포함하여 여러 회사에서 원래의 TACI 분자에 개선을 해왔다. 현재, 스위스의 자이모제네틱스(ZymoGenetics)와 머크 세로노(Merck Serono)에 의해 개발된 TACI 융합 단백질 아타시셉트(Atacicept)는 SLE, 류마티스성 관절염, 림프종 및 기타 질병에 대한 임상 시험을 거쳤다. 중등도 내지 중증도의 SLE 예방을 위한 아타시셉트의 효능 및 안전성에 대한 3상 임상 시험(NCT00624338)은 위약군과 비교하여, 아타시셉트 75mg 용량과 위약군(58% 및 60%; OR 0.89(0.48, 1.67), p=0.724)은 유의적인 차이가 없었고, 아타시셉트 150mg 용량은 효능을 나타내었음(43% 및 60%; OR 0.49(0.26, 0.92), p=0.027)을 보여주었다. 그러나, 폐렴과 폐출혈로 인한 2명의 피험자의 사망은 안전성 문제를 시사했다. 임상 결과, 저용량의 아타시셉트는 효능이 없었는 반면에, 고용량의 아타시셉트는 심각한 안전성 문제를 초래했다.

국제적으로, SLE 치료제의 개발은 순조롭게 진행되지 않고 있다. 2011년 3월 9일까지 GSK에 의해 개발된 Blys-특이적 억제제 벨리무맙(belimumab)은 50년 만에 FDA 승인을 받은 전신 홍반성 루푸스 치료제로, SLE 임상 치료의 새로운 장을 열었다. 이 약물은 2018년 전 세계적으로 4억 7,300만 파운드의 매출을 기록한, 현재 유일한 Blys 항체이다. 일주일에 한 번 200mg의 용량으로 벨리무맙의 피하 주사 제형은 표준 치료를 받고 있는 활성 자가 항체가 있는 양성 전신 홍반성 루푸스(SLE) 성인 환자에 사용하도록 FDA의 승인을 받았다. 임상 시험은, 벨리무맙은 52주 전신 홍반성 루푸스 질환 활성 지수를 유의하게 감소시킬 수 있고, SLE 환자의 질병 재발을 감소시킬 수 있음을 보여주고 있다. 그 결과들은, 벨리무맙 치료를 통해 관해(remission)에 도달한 환자의 비율은 시간이 지남에 따라 점차 증가했으며, 10년차 총 관해율은 65.2%(n=126)이었음을 보여주고 있다. 기준선 프레드니손 용량이 7.5mg/d 이상인 환자에서는, 이들 중 32.6%(14/43)가 10년차에 용량을 7.5mg/d 이하로 줄였으며; 기준선 프레드니손 용량이 7.5mg/d 이하인 환자에서는, 이들 중 9.5%(9/95)가 10년차에 용량을 7.5mg/d 이상으로 증량했다.

CN101323643B 및 그의 패밀리 특허 US8193316B2는 TACI 천연 서열이 분해되는 이유를 찾았으며, 유전 공학을 이용하여 최적화된 TACI-Fc 융합단백질을 구축하였고(CN101323643B 및 US8193316B2의 전체 내용은 참고문헌으로 인용됨), 절단된 TACI 및 면역글로불린의 Fc 영역으로 이루어진 융합 단백질을 구체적으로 개시하고 있다. 테스트 결과들은, 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질은 자가면역 질환 억제에 대한 생물학적 활성이 더 우수하고, SLE, 류마티스성 관절염, 시신경 척수염(NMO, neuromyelitis optica), 시신경 척수염 스펙트럼 장애(NMOSD, neuromyelitis optica spectrum disorder) 등과 같은 자가면역 질환에 대한 잠재적인 치료 가능성이 있음을 보여준다. 또한, CN102085368B는 전신 홍반성 루푸스의 치료를 위한 약제의 제조에서 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질의 용도를 개시하고 있으며(CN102085368B의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨), 이것은 이전 동물 실험을 통해서 좋은 내성과 안전성을 갖는 것으로 입증되었다.

전신 홍반성 루푸스의 치료를 위한 현재의 방법은 매우 제한적이며, 더 나은 치료 효과를 가지며 심각한 안전성 위험이 없는 새로운 치료법을 개발할 필요가 있다. 본 발명은 이러한 필요를 해결한다.

본 발명은 감소된 ADCC 및 CDC 효과를 갖는 서열 최적화를 통하여 절단된(truncated) TACI 및 최적화된 면역글로불린 Fc로 이루어진 융합 단백질에 관한 것으로, 이것은 인간 자가면역계 질환의 치료에 우수한 생물학적 활성 및 안전성을 갖는다. 융합 단백질은 B 림프구 증식과 T 림프구 성숙을 차단하는 2개의 생물학적 활성 분자들 BLyS 및 APRIL을 억제하여, 전신 홍반성 루푸스 및 류마티스성 관절염 등 자가면역 질환 치료의 목적을 달성한다. 융합 단백질은 TACI의 세포외 도메인 중 아미노산 13 내지 118 및 인간 면역글로불린의 Fc 영역을 포함한다. TACI의 세포외 도메인 중 아미노산 13 내지 118은 서열 번호 1 중 아미노산 1 내지 106에서 제시되거나, 또는 서열 번호 1 중 아미노산 1 내지 106과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 상동성을 갖는다. 인간 면역글로불린의 Fc 영역은 서열 번호 1 중 아미노산 107 내지 333에서 제시되거나, 또는 서열 번호 1 중 아미노산 107 내지 333과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 상동성을 갖는다.

일부 실시 양태에서, TACI-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 1에서 제시되어 있다. 상기 단백질은 감소된 ADCC 및 CDC 효과를 갖는 최적화를 통해, TACI의 세포외 영역 중 아미노산 13 내지 118 및 최적화된 Fc 단편으로 이루어진다.

일부 실시 양태에서, 치료될 환자는 중등도(moderate) 내지 중증도(severe)의 전신 홍반 루푸스를 갖는다.

서열 번호 1로 표시되는 TACI-Fc 융합 단백질에 있어서, 막-결합된 BlyS 또는 APRIL(A Proliferation-Inducing Ligand)로 인한 항체-의존성 세포-매개 독성(antibody-dependent cell-mediated toxicity, ADCC) 효과를 피하기 위하여, IgG1에서 유래한 Fc 단편의 서열이 최적화되었다. Fc 단편 중 CH2 영역에 있는 아미노산 120 내지 123은 Fcy 수용체에 대한 친화도를 감소시키기 위해, 류신(L)-류신(L)-글리신(G)-글리신(G)에서 알라닌(A)-글루탐산(E)-글리신(G)-알라닌(A)으로 돌연 변이되었다. 또한, Fc 단편 중 CH2 영역의 아미노산 216 내지 217도 알라닌(A)-프롤린(P)에서 세린(S)-세린(S)으로 또한 돌연변이되어, 보체 결합 또는 고정을 감소시켜, 보체 의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 효과를 감소시켰다.

서열 번호 1의 서열은 다음과 같다:

001 SRVDQEERFP QGLWTGVAMR SCPEEQYWDP LLGTCMSCKT ICNHQSQRTC

051 AAFCRSLSCR KEQGKFYDHL LRDCISCASI CGQHPKQCAY FCENKLRSPV

101 NLPPELDKTH TCPPCPAPEA EGAPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV

151 DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL

201 NGKEYKCKVS NKALPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS

251 LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK

301 SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

액상 제제에 있어서, 2개의 TACI-Fc 융합 단백질 단량체는 Fc 힌지 영역에서 사슬간 이황화 결합의 형성으로 인해 이중 가닥(double-stranded) 구조를 형성할 수 있다.

본 발명의 TACI-Fc 융합 단백질은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당해 분야의 통상적인 방법에 의해 전신 홍반성 루푸스(SLE) 치료용 의약으로 제조될 수 있다.

본 발명의 의약은 특별히 제한되지는 않지만, 피하 주사, 복강내 주사, 근육내 주사 또는 정맥 주사, 바람직하게는 피하 주사를 포함하는 방식으로 투여되는 동결건조된 제제 또는 액상 제제를 포함하는, 다양한 임상적으로 허용가능한 제형으로 제조될 수 있다.

일 양태에서, 본 발명의 TACI-Fc 융합 단백질 제제는 바람직하게는 투여 당 60 mg 이상, 또는 투여 당 70 mg 이상, 또는 투여 당 80 mg 이상의 용량으로 피하 주사에 의해 투여된다. 보다 바람직하게는, 투여량은 투여 당 약 50 내지 240 mg, 투여 당 60 내지 240 mg, 투여 당 70 내지 240 mg, 또는 투여 당 80 내지 240 mg, 및 보다 바람직하게는 투여 당 50 mg, 55 mg, 60 mg, 65 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 85 mg, 90 mg, 95 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg, 140 mg, 145 mg, 150 mg, 155 mg, 160 mg, 165 mg, 170 mg, 175 mg, 180 mg, 190 mg, 195 mg, 200 mg, 205 mg, 210 mg, 215 mg, 220 mg, 225 mg, 350 mg, 또는 240 mg이다.

특정 실시 양태에서, 본 발명의 TACI-Fc 융합 단백질은 6 내지 10일 내지 11 내지 14일마다 1회 환자에게 투여된다.

특정 실시 양태에서, 본 발명의 TACI-Fc 융합 단백질은 매주 1회, 2주마다, 3주마다, 또는 4주마다 1회 환자에게 투여된다.

본원에 사용된 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 투여되는 환자에게 효과를 나타내기에 충분한 용량을 지칭한다. 투여되는 실제 양뿐만 아니라 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 개인의 상태 및 질병의 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방(용량 결정 등)은 일반적으로 치료하고자 하는 질환, 환자의 개별 상태, 전달 부위, 투여 방법, 및 의사에게 알려진 다른 요인 등을 고려하여 일반의 및 기타 의사에 의해 궁극적으로 결정된다.

특정 실시 양태에서, 본 발명의 TACI-Fc 융합 단백질은 연속 12주, 24주, 36주, 48주, 60주, 72주 동안 환자에게 투여된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 TACI-Fc 융합 단백질은 서열 번호 1에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 재조합 TACI-Fc 융합 단백질의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현할 수 있는, 벡터를 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 상기 재조합 TACI-Fc 융합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물/융합 단백질은 특별히 제한되지 않지만, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 류마티스성 관절염(RA), 시신경 척수염(NMO) 및 시신경 척수염 스펙트럼 장애(NMOSD)를 포함하는 자가면역 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물/융합 단백질로 치료되는 전신 홍반성 루푸스는 경증도(mild) 내지 중등도(moderate)의 전신 홍반성 루푸스 또는 중등도 내지 중증도(severe)의 전신 홍반성 루푸스이다.

US8193316B2에 개시된 TACI-Fc 융합 단백질에 대한 추가적인 구조적 최적화는 안전성이 크게 개선된 TACI-Fc 융합 단백질을 얻고, 이것은 환자의 생명을 위험에 빠뜨릴 수 있는 심각한 안전성 위험 없이 더 높은 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 대규모 임상 시험에서, 본 발명자는 본 발명의 TACI-Fc 융합 단백질은 아타시셉트에 비해 유효량 투여 시, 융합 단백질의 세포 독성을 최소화할 수 있고, 투여 기간 동안 환자에게 초래되는 부작용을 감소시킬 수 있으며, 심각한 안정성 위험이 없고, 전신 홍반성 루푸스 환자를 치료하여 일부 환자의 생식 능력을 예기치 않게 회복시켜 예상치 못한 기술적 효과를 달성했다.

도 1: TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1)(녹색, 채워진 점)/리툭시맙(적색, 비어있는 점)의 ADCC 효과 곡선(이펙터(effector)-표적 비율(E:T)=10:1)의 오버레이(overlay).
도 2: TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1)(녹색, 채워진 점)/리툭시맙(적색, 비어있는 점)의 ADCC 효과 곡선(이펙터(effector)-표적 비율(E:T)=20:1)의 오버레이.

실시예 1. TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1)의 ADCC 효과의 비교 시험

1.1 실험 재료

재료	제조사	배치 No
RPMI 1640 배지	Gibco	A10491
리툭시맙	Roche	10001031283948
96-웰 플레이트	Costar	3599
PBMC 세포	Hemacare	PB009C-1
LDH 검출 키트	Roche	1164793001
FBS	Excellbio	FND500
TritonX-100	Solarbio	T8200

1.2 실험 원리

Raji 세포는 표면에서 APRIL을 발현하고, TACI는 APRIL 및 BlyS의 공동-수용체(co-receptor)이다. 따라서, Raji 세포 표면의 APRIL은 TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1)의 TACI 말단에 결합할 수 있다. TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1)의 Fc 말단이 결정성 단편 γ 수용체(Fc γ 수용체, FcyR)의 결합 부위를 가지면, 이것은 이펙터(effector) 세포의 FcyR에 결합하여 ADCC 효과를 유발할 수 있다. 리툭시맙은 ADCC 효과를 유도할 수 있는 CD20(Cluster of Differentiation 20) 단일클론 항체이기 때문에 테스트에서 양성 대조군으로 사용되었다. Raji 세포는 표면에서 CD20을 발현하므로, 따라서, 리툭시맙은 Raji 세포 표면의 CD20에 결합하여 ADCC 효과를 유발할 수 있다. 실험 결과는 도 1 및 도 2에 나와 있다. 대조군인 리툭시맙은 ADCC 효과를 유도하고 억제율은 농도 의존적이다. 대조군과 비교하여 TACI-Fc 융합 단백질은 각각의 농도에서 ADCC 효과를 유도하지 않았다.

실시예 2: TACI-Fc 융합 단백질의 CDC 효과 비교 시험

2.1 실험 재료

재료	제조사	배치 No
RPMI 1640 배지	Gibco	A10491
리툭시맙	Roche	10001031283948
인간 혈청 보체	기증자
Celltiter glo-luminescent cell viability assay(발광 세포 생존 분석)	Promega	G7572
흰색 바닥이 있는 투명 96-웰 플레이트	Costar	3610

2.2 실험 원리

Raji 세포 표면에서 APRIL은 TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1)의 TACI 말단에 결합할 수 있다. TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1)의 Fc 말단이 보체 결합 부위를 가지면, 이것은 CDC 효과를 유발할 수 있다. 리툭시맙은 CDC 효과를 유도할 수 있기 때문에 테스트에서 양성 대조군으로 사용되었다. Raji 세포는 표면에서 CD20을 발현하므로, 따라서 리툭시맙은 Raji 세포 표면에서 CD20에 결합하여 CDC 효과를 유발할 수 있다. Raji 세포에 결합하지 않는 단일클론 항체는 음성 대조군으로 사용되었다.

2.3 실험 절차

Raji 세포의 농도를 10,000 세포/웰로 조절한 이후에, 상기 세포를 96-웰 플레이트에 첨가하고, CO₂ 배양기에서 20분 동안 배양하였다. 그런 다음, 농도 구배가 다른 일련의 희석된 샘플이 첨가된 다음, 상기 세포는 CO₂ 배양기에서 20분 동안 배양되었다. 그런 다음, 10% 정상 인간 혈청 보체가 첨가되었고, 그런 다음 상기 세포는 CO₂ 배양기에서 2시간 동안 배양되었다. ATP법을 이용하여 10분간 발색시킨 후, 마이크로플레이트 리더가 판독을 위해 사용되었다. 혈청 대조군 값을 뺀 후, GraphPad Prism 7.00을 사용하여, 가로축은 lg의 농도(ng/ml), 세로축은 억제율(%)로 4-PL 곡선을 그렸다. 실험 결과는 다음과 같다.

표 3: CDC 효과의 결과

최종 농도 (ng/ml)	억제율 %
최종 농도 (ng/ml)	리툭시맙	TACI-Fc 융합 단백질 (서열 번호 1)	음성 대조군
30000	38.17	4.88	5.60
3000	24.65	2.01	9.63
300	11.85	9.12	-0.14
30	4.83	1.85	-0.76
3	-0.68	2.27	-0.66

실험 결과

1. 세포 대조군과 비교하여, 각 혈청 보체군 및 약물 대조군은 뚜렷한 사멸 효과를 보이지 않았다.

2. 양성 대조군(10% 혈청 보체-리툭시맙)은 40%의 가장 높은 억제율을 가지며 유의한 농도 의존적 효과를 갖는다.

3. 투여군(10% 혈청 보체-TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1))은 10% 미만의 가장 높은 억제율을 가지며 농도-의존적 효과를 갖지 않는다.

4. 음성 대조군(10% 혈청 보체-RC48)은 10% 미만의 가장 높은 억제율을 가지며 농도-의존적 효과를 갖지 않는다.

리툭시맙은 CDC 효과를 유도할 수 있고, 억제율은 분명히 농도-의존적인 반면에, TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1)은 기본적으로 CDC 효과를 유도하지 않음을 알 수 있다.

실시예 3: 전신 홍반성 루푸스 환자에 대한 치료의 임상 효과 시험

실험 목적은 중등도 내지 중증도 SLE 환자의 치료의 표준 병용 요법에 있어서 위약과 비교하여, 표준 병용 요법에 있어서 TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호: 1에 나타낸 아미노산 서열을 가짐)의 안전성 및 유효성을 예비적으로 평가하고, 용량-효과 관계를 분석하여 후속 임상 시험을 위한 용량 기준을 제공하는 것이다. 본 실험에서 유효 피험자 수는 249명이며, 효과가 없는 피험자는 투여 일정에 따라 투여를 중단한다.

2. 포함 기준

1. 1997년 American College of Rheumatology에 의해 개정된 11개의 SLE 표준 중 적어도 4개를 충족시키는 활성 SLE로 진단된 환자;

2. 18세 내지 65세의 남성 및 여성, 성별 비율 제한이 없는 피험자;

3. 순응도가 좋으며 그리고 시험 전에 사전 동의서를 제공한, 입원 환자 또는 외래 환자

4. 스크리닝 기간 동안 SELENA-SLEDAI 점수 8점 이상을 갖는 개체. 보체 및/또는 항-ds-DNA 항체 점수가 낮은 사람들의 경우, SELENA-SLEDAI의 임상 증상 점수(낮은 보체 및/또는 항-ds-DNA 항체 제외)는 6점 이상이어야 한다.

5. 자가항체 혈청학적 검사에서 양성인 개체. 양성은 연구소 실험실의 명확한 기준값 범위에서 정의한 ANA 양성 및/또는 항-이중-가닥 DNA(anti-double-stranded DNA) 항체 양성으로 정의되며 임계값은 허용되지 않는다.

6. 첫 번째 날(즉, 시험 약물이 처음으로 투여되는 날) 전에 적어도 30일 동안 안정적인 표준 치료 요법을 갖는 개체. 상기 표준 치료 요법은 하기 용법 중 어느 하나(단독 또는 조합)의 안전한 사용을 의미한다: 코르티코스테로이드, 항말라리아제, 비-스테로이드성 항염증제(NSAID), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 (마이코페놀레이트 모페틸, 나트륨 마이코페놀레이트를 포함), 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 타크롤리무스, 시클로스포린.

3. 배제 기준

1. 중증 루푸스 신염(소변 단백질 > 6g/24시간 또는 혈청 크레아티닌 > 2.5mg/dL 또는 221umol/L로 정의됨) 또는 혈액 투석이 필요하거나 고용량 코르티코스테로이드(프레드니손 > 100mg/일 또는 동등) 지난 2개월 동안 ≥14일인 개체.

2. 지난 2개월 동안 SLE에 의해 유발되거나 SLE에 의해 유발되지 않은 중추 신경계 질환(간질, 정신병, 기질성 뇌 증후군, 뇌혈관 사고, 뇌염, 중추 신경계 혈관염 포함)이 있는 개체;

3. 심장, 간, 신장 및 기타 중요 기관, 혈액, 내분비계에 중증 질환 및 질환 병력이 있는 개체; 심각도에 대한 평가 기준은 다음을 포함한다: a. ALT 또는 AST ≥ 정상 범위 상한의 2배; b. 내인성 크레아티닌 제거율 < 30 mL/분; c. 백혈구 수<2.5 × 10⁹/L; d. 헤모글로빈 < 85g/L; e. 혈소판 수 < 50 × 10⁹/L.

4. 현재 활성 간염을 앓고 있거나 중증의 간 질환 또는 질환 이력이 있는 개체. B형 간염: HBsAg 양성인 환자는 제외된다. HBsAg가 음성이고 항-HBc 항체가 양성인 개체의 경우, HBV-DNA 검사에 따라 분류되어, HBV-DNA가 양성인 환자는 제외되어 연구 참여가 허용되지 않으며, HBV-음성인 환자는 연구에 참여하도록 허용될 수 있다. C형 간염: C형 간염 항체가 양성인 환자는 제외된다.

5. 면역결핍, 조절되지 않는 중증 감염, 및 활동성 또는 재발성 소화성 궤양이 있는 환자;

6. 임산부, 모유 수유 중인 여성, 및 향후 12개월 이내에 가임력이 있는 남성 또는 여성;

7. 알레르기 반응: 인간 유래 생물학적 제제에 대해 알레르기 병력이 있는 개체;

8. 지난 달에 생백신 접종을 받은 자

9. 초기 스크리닝 28일 전 및/또는 연구 화합물의 반감기 5배 이내(둘 중 더 긴 것) 에 임의의 임상 시험에 참여한 자;

10. 1년 이내에 리툭산(Rituxan) 또는 에팔리주맙(Epalizumab)과 같은 B-세포 표적 요법을 받은 자;

11. 1년 이내에 종양 괴사 인자 억제제 및 인터루킨 수용체 차단제를 투여받은 자;

12. 감마 글로불린 정맥 주사(IVIG), 프레드니손 ≥100 mg/d를 14일 이상 투여받았거나 또는 1개월 이내에 혈장 교환을 받은 자;

13. 스크리닝 기간 동안 활동성 감염(예: 대상 포진, HIV 감염, 활동성 결핵 등)이 있는 자;

14. 우울증 또는 자살 충동이 있는 정신병자;

15. 연구자가 이 시험에 참여하기에 부적합하다고 생각하는 개체.

IV. 그룹화

처리군: 재조합 TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1에서 제시된 아미노산 서열) 동결건조된 분말 제제; 강도: 주사당 80 mg; 피하 주사, 투여량: 투여 당 80mg, 160mg 또는 240mg (80mg, 160mg 또는 240mg의 표시는 동결건조된 분말 제제에서 활성 성분 TACI-Fc 융합 단백질의 질량을 나타냄), 48주 연속적으로 1주일에 1회 투여됨.

대조군: 재조합 TACI-Fc 융합 단백질 동결건조된 분말의 모사체, 48주 연속적으로 주 1회 피하 투여됨.

구체적인 그룹화는 다음과 같다:

표 4: 각각의 센터별 사례의 분포(무작위 사례)

		RC18 240mg (N=62)	RC18 160mg (N=63)	RC18 80mg (N=62)	위약 (N=62)	전체 (N=249)
개요
	스크리닝된 사례					356
	등록된 사례	62	63	62	62	249
	완료된 사례	46	44	45	36	171
	FAS	62	63	62	62	249
	PPS	48	46	48	50	192
	SS	62	63	62	62	249

FAS: 전체 분석 세트, 적격 케이스 및 그만둔 케이스 세트를 말하지만, 제외된 케이스는 포함하지 않는다.

PPS: 테스트 프로토콜을 충족하고, 양호한 순응도를 가지며, CRF 요구 사항에 따라 채워진 연결을 완료하는 경우

SS: 하나 이상의 치료를 받고 안전 지표에 의해 기록된 실제 데이터가 있는 경우

V. 종료점 지수(endpoint index)

임상 시험 효과의 평가 방법은 다음과 같다.

1차 종료점 표지자 및 평가 시간	No	표지자	평가 시간	종료점 표지자의 선택
1차 종료점 표지자 및 평가 시간	1	투여 후 12개월에서의 SLE 반응 지수. SLE 반응은 다음과 같이 정의된다: a. SELENA-SLEDAI 점수 하락 ≥ 4점; b. BILAG 점수에서 A 등급에 도달한 신규 장기가 없거나 또는 B 등급을 초과하지 않은 신규 장기가 없다. c. 의사의 종합 평가(PGA)는 기준선에서 0.3포인트 이상 증가하지 않는다. 의사의 종합 평가는 100mm VAS(시각 아날로그 척도)를 사용하여 약물 투여 전후의 포괄적인 질병 상태를 평가한다.	48 주	유효 지수
2차 종료점 표지자 및 평가 시간	No	표지자	평가 시간	종료점 표지자의 선택
2차 종료점 표지자 및 평가 시간	1	(1) 투여 후 SELENA-SLEDAI 점수가 4점 이상 감소한 피험자의 비율. (2) 투여 후 기준선에서 의사의 종합 평가 점수의 변화. (3) 투여 후 44-48주에 프레드니손 용량이 7.5 mg/d 이하이거나 기준선에서 용량이 25% 이상 감소한 피험자의 비율. (4) 기준선 대비 혈청학적 검사지수(IgG, IgA, IgM, total B cell(CD19+), 항-dsDNA 항체, 보체(C3, C4))의 변화	48 주	유효 지수

VI. 임상시험 결과

FAS(전체 분석 세트)에 의해 분석된 임상 시험 데이터는 치료군(TACI-Fc 융합 단백질: 서열 번호 1)이 유의적으로 더 높은 반응을 가짐을 보여준다. 구체적인 데이터는 다음과 같다.

치료 투여량	48주에 효능 (SRI4)
240 mg 그룹	75.8%, p <0.0001
160 mg 그룹	68.3%, p = 0.0001
80 mg 그룹	71.0%, p <0.0001
대조군	33.9%, p <0.0001

48주차의 SELENA-SLEDAI 점수는 치료군(TACI-Fc 융합 단백질: 서열 번호 1)에서 더 많은 환자가 4점 이상의 감소(SELENA-SLEDAI 점수)를 갖는다는 것을 나타낸다. 세부 내용은 다음과 같다: 80mg 투여 그룹(75.8%, p=0.003), 160mg 투여 그룹(77.8%, p=0.001), 240mg 투여 그룹(79.0%, p<0.001), 위약 그룹(50.0%).

하기와 같이, PGA 점수가 악화된 환자는 더 이상 발견되지 않았다: 80mg 용량 그룹(96.8%, p <0.001), 160mg 용량 그룹(92.1%, p = 0.013), 240mg 용량 그룹(96.8%, p <0.001) 및 위약 그룹(75.8%).

PPS(프로토콜 세트 당) 및 FAS(전체 분석 세트)의 분석 결과는 일치한다.

임상 유해 사례(AE) 및 심각한 유해 사례(SAE)에 대한 데이터는 다음과 같다:

표 7: AE 및 SAE의 발생

그룹	AE의 발생	SAE의 발생
240 mg 그룹	93.5%	12.9%
160 mg 그룹	92.1%	15.9%
80 mg 그룹	90.3%	12.9%
Placebo 그룹	82.3%	16.1%

240mg 그룹에서는, 시험약과 무관한 사망이 1명 있었다. 가장 흔한 이상 반응은 상기도 감염 및 주사 부위 반응이다.

또한, 임상 시험 중에, TACI-Fc(서열 번호 1) 치료 그룹에서 11건의 예상치 못한 임신이 있었는 반면에(240mg 투여 그룹에서 4건, 160mg 투여 그룹에서 3건, 및 240mg 투여 그룹에서 4건), 위약 그룹에서는 임신 사례가 없었다. 11건의 임신 중에서, 10건은 선택적 중절을, 1건은 임신 및 출산을 선택했다.

따라서, 재조합 TACI-Fc 융합 단백질(서열 번호 1)의 3가지 용량 그룹은 임상 데이터에 의해 입증된 바와 같이, 매우 유의한 치료 효과를 달성하였고, 안전하고 효과적이다. 치료 그룹의 환자에 대한 투여는 내약성이 좋으며, 전신 홍반성 루푸스 환자를 치료함으로써 일부 환자의 임신 능력이 예기치 않게 회복될 수 있다.

<110> REMEGEN CO., LTD. <120> TACI-FC FUSION PROTEIN AND USE THEREOF <130> PCT-CN2019-128099 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 1 Ser Arg Val Asp Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly 1 5 10 15 Val Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu 20 25 30 Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg 35 40 45 Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly 50 55 60 Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile 65 70 75 80 Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu 85 90 95 Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Asp Lys Thr His Thr Cys 100 105 110 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 145 150 155 160 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 195 200 205 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 245 250 255 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 260 265 270 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 275 280 285 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 290 295 300 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 305 310 315 320 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims

필요로 하는 개체에게 재조합 TACI-Fc 융합 단백질의 약제학적 제제의 치료적 유효 함량을 투여 당 50 mg 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함하는 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 방법으로서, 상기 재조합 TACI-Fc 융합 단백질은 TACI의 세포외 도메인 중 아미노산 13 내지 118 및 인간 면역글로불린 중 상기 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 용량은 투여 당 60 mg 이상, 또는 투여 당 70 mg 이상, 또는 투여 당 80 mg 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 용량은 투여 당 약 50 내지 240 mg, 투여 당 60 내지 240 mg, 투여 당 70 내지 240 mg, 또는 투여 당 80 내지 240 mg, 및 바람직하게는, 투여 당 50 mg, 55 mg, 60 mg, 65 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 85 mg, 90 mg, 95 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg, 140 mg, 145 mg, 150 mg, 155 mg, 160 mg, 165 mg, 170 mg, 175 mg, 180 mg, 190 mg, 195 mg, 200 mg, 205 mg, 210 mg, 215 mg, 220 mg, 225 mg, 230 mg, 235 mg, 또는 240 mg인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필요로 하는 개체에게 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회 투여하는 것을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 필요로 하는 개체에게 매주 1회 투여하는 것을 포함하는 방법.
제3항 또는 제5항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 동결건조된 제제 또는 액상 제제인 방법.
제6항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 동결건조된 제제인 방법.
제6항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 피하 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 또는 정맥내 주사, 및 바람직하게는 피하 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 피하 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
제3항 또는 제5항 또는 제7항 또는 제9항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 상기 필요로 하는 개체에게 연속적으로 12주, 24주, 36주, 48주, 60주, 72주 또는 그 이상 동안 투여되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 상기 필요로 하는 개체에게 연속적으로 48주 이상 동안 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 TACI-Fc 융합 단백질 2개는 액상 약제학적 제제에서 Fc 힌지 영역에 형성된 사슬간 이황화 결합을 통해 이중 가닥 구조를 형성하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 TACI의 세포외 도메인 중 아미노산 13 내지 118은 서열 번호 1 중 아미노산 1 내지 106에서 제시된 서열을 갖거나, 또는 서열 번호 1 중 아미노산 1 내지 106과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 서열을 갖는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 인간 면역글로불린 중 Fc 영역은 서열 번호 1 중 아미노산 107 내지 333에서 제시된 서열을 갖거나, 또는 서열 번호 1 중 아미노산 107 내지 333과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 서열을 갖는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 재조합 TACI-Fc 융합 단백질은 서열 번호 1로 제시된 서열을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전신 홍반성 루푸스는 경증도 내지 중등도의 전신 홍반성 루푸스 또는 중등도 내지 중증도의 전신 홍반성 루푸스인 방법.
서열 번호 1로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 TACI-Fc 융합 단백질.
서열 번호 1로 제시된 재조합 TACI-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
제17항의 융합 단백질을 발현할 수 있거나 또는 제18항의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 벡터.
제17항의 재조합 TACI-Fc 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제20항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 액상 제제인 약제학적 조성물.
제21항에 있어서, 상기 TACI-Fc 융합 단백질 2개는 상기 약제학적 조성물에서 상기 Fc 힌지 영역에 형성된 사슬간 이황화 결합을 통해 이중 가닥 구조를 형성하는 것인 약제학적 조성물.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 단위 당 상기 재조합 TACI-Fc 융합 단백질 80 내지 240 mg을 함유하는 제제로 제조된 것인 약제학적 조성물.
제23항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 동결건조된 제제 또는 액상 제제이고, 그리고 투여 당 약 80 내지 240 mg의 용량으로 피하 경로에 의해 투여되는 것인 약제학적 조성물.
제24항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 시신경 척수염, 및 시신경 척수염 스펙트럼 장애의 치료에 사용되는 것인 약제학적 조성물.
제17항의 재조합 TACI-Fc 융합 단백질 또는 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의, 자가면역 질환의 치료용 의약의 제조에서의 용도.
제26항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 시신경 척수염 및 시신경 척수염 스펙트럼 장애를 포함하는 것인 용도.