KR20220111845A

KR20220111845A - 신규 미생물 스트렙토코커스 균주 및 이로부터 유래한 히알루로니데이즈

Info

Publication number: KR20220111845A
Application number: KR1020210015121A
Authority: KR
Inventors: 최혜원; 박주웅
Original assignee: 바이오스트림테크놀러지스(주)
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-08-10
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: KR102581542B1

Abstract

본 발명은 히알루론산 분해 효소를 생산하는 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptacoccus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP), 이로부터 수득한 히알루론산 분해 효소를 이용한 저분자 히알루론산의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주는 용혈 독성이 없고, 스트렙토코커스 속에 속하는 다른 종의 균주가 생산하는 히알루로니데이즈와 분자량이 상이한 신규한 히알루로니데이즈를 생산한다. 상기 효소는 히알루론산에 대해 높은 기질 특이성을 통해 고분자 히알루론산을 저분자 히알루론산으로 분해시킨다. 따라서, 상기 균주로부터 생산된 히알루로니데이즈는 식품, 화장품, 의약품 등 여러 산업분야에 적용 가능한 저분자 히알루론산을 생산하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 미생물 스트렙토코커스 균주 및 이로부터 유래한 히알루로니데이즈{NOVEL STREPTOCOCCUS STRAIN AND HYALURONIDASE DERIVED FROM THE SAME}

본 발명은 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 균주, 상기 균주가 생산하는 히알루로니데이즈 및 이를 이용한 저분자 히아루론산의 제조 방법에 관한 것이다.

히알루론산은 D-글루쿠로닉산(D-glucuronic acid)과 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)의 이당류 단위(disaccharide subunit)가 반복하여 이루어지는 다양한 길이의 다당류이다. 히알루론산은 동물의 피부에 많이 존재하며 높은 점성과 친수성의 특징을 가진다. 또한, 히알루론산은 피부 조직, 관절 연골 조직 등에서 중요한 구성 요소로 세포간의 연결, 지지에 도움을 준다. 뿐만 아니라, 히알루론산이 가지는 보습효과와 윤활효과로 인해, 의약품(관절윤활제), 식품(히알루론산 건강기능식품), 화장품(보습제, 성형외과 필러) 등 폭넓은 분야에서 응용되고 있다(KR10-1654810 B1).

히알루론산의 분자량은 백 Da에서 수백만 Da으로 다양하다. 또한, 히알루론산 수용액은 점성, 탄성 및 보습성을 가지며 이는 히알루론산의 분자량과 그 농도에 따라 정도가 달라진다. 고분자 히알루론산은 점도가 높고 피부 침투력이 낮아 제품 생산에 사용 시 그 기능성이 부족하다는 단점이 있다(신은지 등., 히알루론산나트륨의 분자량 크기에 따른 Collagen 합성, 항염증 및 피부 흡수에 미치는 영향., 대한화장품학회지., 2016, 105, 235-245). 이와 같은 이유로 고분자 히알루론산을 저분자 히알루론산으로 분해하는 방법에 대한 다양한 연구들이 이루어지고 있다.

히알루론산을 분해하는 방법은 크게 고온가열, 초음파와 같은 물리적 분해, 산 가수분해와 같은 화학적 분해, 분해 효소와 같은 생물학적 분해로 나눌 수 있다. 그러나, 고온가열 분해 시, 고온으로 인한 변성가능성이 있으며, 강산을 이용한 산 가수분해나 초음파를 이용한 분해 시, 단당이 많이 생성되어 분자의 크기가 균일 하지 않다는 단점을 가진다. 반면, 분해 효소를 이용할 경우, 온도, 반응 시간과 같이 반응 조건을 조절하여 다양한 분자량의 히알루론산을 제조할 수 있으며, 강산, 강염기를 사용하지 않아 분해 시 위험성, 환경오염이 적다는 강점이 있다(KR10-1736790 B1).

KR

10-1654810

B1

KR

10-1736790

B1

신은지 등., 히알루론산나트륨의 분자량 크기에 따른 Collagen 합성, 항염증 및 피부 흡수에 미치는 영향., 대한화장품학회지., 2016, 105, 235-245.

이에, 본 연구자들은 히알루론산을 분해할 수 있는 히알루론산 분해 효소(히알루로니데이즈, hyaluronidase)를 개발하기 위해 연구한 결과, 식품, 화장품, 의약품 등 여러 산업분야에 적용 가능한 저분자 히알루론산을 생산하는 히알루로니데이즈와 해당 효소를 생산할 수 있는 미생물을 동정하였고, 이로부터 수득한 히알루로니데이즈를 이용하여 저분자 히알루론산을 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 서열번호 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 히알루론산 분해 효소를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 배양하는 단계 및 배양액으로부터 히알루로산 분해 효소를 정제하는 단계를 포함하는, 히알루론산 분해 효소를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 고분자 히알루론산에 상기 히알루론산 분해 효소를 처리하는 단계를 포함하는 저분자 히알루론산 제조 방법을 제공한다.

도 1은 용혈 독성이 없는 신규한 균주를 분리하기 위하여 채집한 균주를 혈청고체배지에 이식하여 배양한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주를 동정하기 위하여 16s rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주를 동정하기 위하여 당 발효 및 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주(좌측)와 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주(우측)의 용혈성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 비용혈성을 확인하기 위하여 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균체 또는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균체의 현탁액 및 상등액과 배양 배지, 생리식염수, NCN 버퍼, 1% 계면활성제(SDS)를 각각 적혈구와 반응시켜 용혈성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 온도별 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 pH별 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 금속염에 의한 효소 활성 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 효소 반응 속도 상수를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 분자량을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 N-말단 아미노산 서열분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 반응 시간에 따른 고분자 히알루론산의 분해 과정을 나타낸 도면이다.
도 13은 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈에 의한 고분자 히알루론산의 최종 분해 산물을 MALDI-TOF로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈에 의한 고분자 히알루론산의 최종 분해 산물을 LC-MS로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 제공한다. 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16s rRNA를 포함하며, 비용혈성인 것을 특징으로 한다.

스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스는 히알루론산을 생산하는 그람 양성 구균으로서, 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi)의 아종으로, 베타 용혈(β-hemolysis)을 일으킨다. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 종에 속하는 균주에는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079, CCUG 23256, LMG16030 등이 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "용혈"은 적혈구가 파괴되어 내용물(세포질)이 주변 액체(예:혈장) 안으로 용해되는 것을 말한다. 용혈성으로 균주들을 분류하기도 하는데, 알파, 베타 및 감마 용혈이 있다. 알파용혈은 적혈구의 헤모글로빈을 산화시켜 혈액한천배지에 녹색 얼룩을 만든다. 베타용혈을 일으키는 종은 주변의 혈액세포들을 파괴함으로써 혈액한천배지를 파열시켜 투명한 얼룩을 만든다.

본 발명자들은 용혈성이 없고 히알루론산 분해 효소를 생산하는 균주를 선별하여, 상기 균주가 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다(도 1 내지 도 3). 신규 동정된 균주는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주와 달리 용혈 독성을 나타내지 않는다(도 4 및 도 5). 본 발명자들은 상기 균주를 "스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909"로 명명하고, 상기 동일한 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2020년 7월 14일자로 기탁번호 KCTC 14238BP로 기탁하였다.

본 발명의 다른 측면은 서열번호 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 히알루론산 분해 효소를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서 상기 히알루론산 분해 효소는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)로부터 수득되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "히알루론산(hyaluronic acid, 또는 히알루로난(hyaluronan), HA)"은 분자량이 50,000 Da 내지 13,000,000 Da에 이르는 아미노산과 우론산(uronic acid)으로 이루어진 복잡한 다당류의 하나로, 반복단위인 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민이 (1-3)과 (1-4)로 번갈아 결합되어 이루어진 고분자 화합물이다.

히알루론산은 보습 효과, 물리적 마찰에 대한 윤활 효과 및 세균 침입에 대한 보호 효과 등의 다양한 효능과 우수한 물성을 가지고 있어 화장품 첨가제, 관절염치료제, 안과수술용 수술보조제 및 외과수술 후의 유착저해제 등의 화장품, 의약품 및 의약부외품의 소재, 식품 등에 광범위하게 사용되고 있다. 또한, 생리 활성 물질들의 이동을 주관하며 세포와의 특이한 작용에 의해 세포의 분화 및 성장을 유도하는 중개자 역할뿐 만 아니라, 세포외 기질에서는 콜라겐, 엘라스틴, 황산콘드로이틴(chondroitin sulphate) 등의 조직을 지탱하는 단백질 및 당 단백질들의 지지체 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 히알루론산이 식물과 화장품에 사용될 경우, 분자량이 큰 히알루론산은 체내 흡수 및 피부 내로의 흡수가 용이하지 않은 단점이 있다. 이러한 히알루론산은 소의 안구, 닭벼슬, 동물의 완충조직, 태반, 암세포 및 피부 등에 다량 함유되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "히알루론산 분해 효소"는 히알루론산을 가수분해하는 효소이다. 상기 효소는 다양한 생물에서 발견되며 작용 기전에 따라 3종류로 나뉜다. 히알루로네이트 4-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.1.35)는 엔도-β-N-아세틸글루코스아미니다아제(hyaluronoglucosaminidase)로, β-1,4-글루코사이드 결합상에서 작용하는 하이드롤라제(hydrolase)이다. 사당류(tetrasaccharide)를 주로 생성하며, 고환, 리소좀 및 벌독에 분포되어 있다. 히알루로네이트 3-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.1.36)는 엔도-β-글루쿠로니다제(hyaluronoglucuronidase)로서, β-1,3-글루코사이드 결합상에서 작용하는 하이드롤라제이다. 사당류를 주로 생성하며, 거머리 또는 구충에서 발견된다. 히알루로네이트 라이아제(hyaluronate lyase, EC 4.2.2.1)는 세균에 존재하는 히알루로니데이즈로서 β-1,4-글루코사이드 결합상에서 작용하고, β-제거기전을 통해서 4,5-불포화된 이당류를 생성시킨다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 균주에서 수득한 히알루로니데이즈의 분자량은 약 127 kDa임을 확인하였다(도 10). 또한, 상기 히알루로니데이즈는 서열번호 2의 N-말단 서열을 포함할 수 있다(도 11). 본 발명에서 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)에서 정제한 히알루로니데이즈는 "BST909 히알루로니데이즈"로 병용 기재될 수 있다. 또한, BST909 히알루로니데이즈는 히알루로니데이즈 전구체, 성숙형 히알루로니데이즈 및 활성을 갖는 이의 절단된 형태를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, BST909 히알루로니데이즈는 15℃ 내지 45℃에서 분해 활성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는 40℃일 수 있다. 히알루로니데이즈의 반응 온도가 40℃까지 상승할수록 효소의 분해 활성이 높아졌으며, 45℃에서 활성이 급격히 감소하였다. 이를 통해, BST909 히알루로니데이즈의 최적반응온도가 40℃임을 확인하였다(도 6).

본 발명의 일 실시예에서, BST909 히알루로니데이즈는 pH 4.0 내지 pH 9.0에서 분해 활성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, pH 7.0일 수 있다(도 7).

본 발명의 일 실시예에 따르면, BST909 히알루로니데이즈는 Ag²⁺, Ni²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺및 Cu²⁺로부터 선택되는 어느 하나에 의해 분해 활성이 저해될 수 있다. 구체적으로, 상기 효소를 Ag²⁺, Ni²⁺, Fe²⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, K⁺, Na⁺또는 EDTA를 포함하는 완충용액을 사용하여 고분자 히알루론산과 반응시킨 결과, Ag²⁺, Ni²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺또는 Cu²⁺와 반응시킨 효소의 분해 활성이 크게 감소하였다.이를 통해, Ag²⁺, Ni²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺및 Cu²⁺는 BST909 히알루로니데이즈 활성을 억제시킴을 확인하였다(도 8).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, BST909 히알루로니데이즈는 히알루론산을 특이적으로 분해할 수 있다. 구체적으로, 상기 효소를 히알루론산, 콘드로이친 설페이트(chondroitin sulfate) A, 콘드로이친 설페이트 C, 더마탄 설페이트(dermatan sulgate), 잔탄(xanthan) 또는 아가로즈(agarose) 등의 다당류 기질 용액과 반응시켜 다당류의 분해 정도를 비교하였다. 그 결과, 히알루론산만을 특이적으로 분해하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, BST909 히알루로니데이즈는 히알루론산에 대해 기질 특이성을 나타내는 것을 알 수 있다(표 1).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, BST909 히알루로니데이즈는 약 0.0015 mM의 미하엘리스 반응속도상수(Km)와 약 50 mM/분의 최대반응속도(Vmax)를 갖는다. 구체적으로, 상기 효소를 농도별 고분자 히알루론산 기질용액과 35℃, 150 rpm, 1시간 조건으로 반응시킨 후, 232 nm에서 흡광도를 측정한 값을 다당류 히아루론산의 단위체인 N-아세틸-D-글루코사민을 농도별로 232 nm에서 흡광도를 측정한 값과 비교하여 시간당 분해속도를 계산하였다. 그 결과, Km 값이 약 0.0015 mM로서 기질에 대한 친화성이 높으며, Vmax 값이 약 50 mM/분으로 반응속도가 높은 것을 확인하였다(도 9).

본 발명의 또 다른 측면은, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 배양하는 단계 및 배양액으로부터 히알루로산 분해 효소를 정제하는 단계를 포함하는 히알루론산 분해 효소를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 고분자 히알루론산은 통상의 방법에 따라 생물조직으로부터의 추출 또는 미생물로부터의 발효에 의해 제조될 수 있으며, 상업적으로 판매하고 있는 고분자 히알루론산일 수 있다. 고분자 히알루론산은 12,00 kDa 내지 2,600 kDa 크기일 수 있으며, 바람직하게는 1,200 kDa 내지 2,200 kDa일 수 있다. 하지만 이에 제한되지 않는다.

또한 본 명세서에서 히알루론산은 히알루로네이트를 포함할 수 있다. 상기 "히알루로네이트"는 히알루론산의 염의 형태로서, 히알루론산에서 지질, 단백질 및 핵산 등를 제거하여 생산되므로 분자 크기가 히알루론산보다 작다. 예를 들어, 히알루로산의 나트륨염, 칼륨염, 마크네슘염, 칼슘염 및 아연염이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 저분자 히알루론산 제조 방법에 있어서 상기 BST909 히알루로니데이즈의 처리는 고분자 히알루론산에 3.5 unit/mL의 BST909 히알루로니데이즈를 30℃, 200 rpm, pH 7.0의 10 mM 인산염 완충용액에서 0.5시간 내지 3시간 동안 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 저분자 히알루론산은 300 Da 내지 100 kDa 일 수 있다. 또는 상기 저분자 히알루론산은 380 Da 내지 50,000 Da일 수 있다. 또는, 상기 저분자 히알루론산은 380 Da 내지 10,000 Da일 수 있다. 또는, 상기 저분자 히알루론산은 380 Da 내지 5,000 Da일 수 있다. 바람직하게는 생산된 저분자 히알루론산은 약 760 Da의 사당류일 수 있다. 또한, 생산된 저분자 히알루론산은 약 380 Da 내지 400 Da의 이당류일 수 있다.

구체적으로, 본 명세서의 일 실시예에서 상기 조건으로 BST909 히알루로니데이즈를 처리한 결과, 3시간 반응 시 고분자 히알루론산이 이당류 히알루론산으로 분해되었음을 확인하였다(도 12 내지 도 14).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 비용혈성 균주 탐색 및 동정

비용혈성 균주를 분리하기 위하여 모래, 풀 등 자연 물질을 THB(todd hewitt broth) 액체배지에 접종하여 35℃, 150 rpm의 조건으로 배양하였다. 그 후, THB 고체배지에 배양액을 도말하여 콜로니(colony)를 수득하였다. 각 콜로니를 혈청고체배지(blood agar plate, BAP, 아산제약)에 이식하여 35℃에서 배양한 뒤, 이식된 콜로니 주위에 투명환을 생성하지 않는, 용혈성이 없는 균을 분리하였다(도 1). THB는 BD Difco의 제품을 사용하였으며, 고체배지 제작 시 한천(BD Difco)을 15 g/L의 농도로 혼합하여 멸균 후 20 mL씩 페트리디쉬에 분주하여 굳힌 것을 사용하였다.

상기 방법을 통해 분리된 균을 "BST909"로 명하고, (주)바이오닉스에 상기 균의 16s rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 동정을 의뢰하였다. 그 결과, 1순위 동정 결과가 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ATCC43079)임을 확인함으로써, BST909가 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주에 속하는 균임을 알 수 있었다(도 2).

또한 상기 균주를 API STREP20 키트(Biomerieux) 및 API ZYM 키트(Biomerieux)를 이용하여 해당 균주의 특성을 확인하였다. API STREP20 키트를 이용하여 분석한 결과, 99.6%ID로 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)로 동정되었다(99.6%ID, T Index 0.31)(도 3). 이때, % ID는 상대적 근접성을 나타내며, 이 수치가 높을수록 동정결과에 대한 신뢰성이 높다. 또한, T Index는 생화학 특성에 대한 근접성을 나타내며, 이 수치가 1에 가까울수록 전형적인 균임을 의미한다.

실시예 2. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 비용혈성 확인

상기 실시예 1을 통해 동정된 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)는 비용혈성을 갖는 것을 특징으로 한다. 하지만 상기 균주가 속한 종인 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주는 베타-용혈성을 갖는 균주이다. 따라서, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079와 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 용혈성 차이를 실험을 통해 다시 확인하였다.

먼저, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주 또는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 각 콜로니를 혈청배지(아산제약)에 이식하여 35℃에서 배양한 후, 이식된 콜로니 주위에 투명환 생성을 확인하였다. 그 결과, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주의 콜로니에는 투명환이 생성된 반면, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 콜로니에는 투명환이 생성되지 않은 것을 확인하였다(도 4).

또한, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주 또는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주를 각각 THB(BD Difco)에 배양하여 배양액의 원심분리 후 얻은 균체 현탁액(cell), 상등액(sup.)과 배양 배지(THB), 생리식염수(saline,0.89% NaCl 수용액), NCN 완충용액(3 mM sodium citrate, 0.9% NaCl, pH 6.8)를 1% 적혈구 용액과 함께 35℃에서 18시간 반응시켰다. 이때, 1% 적혈구 용액은 Innovative research에서 구입한 10% 양적혈구(sheep red blood cells) 용액을 NCN 완충용액에 희석하여 제조하였다.

반응 종료 후, 원심분리를 통해 상등액을 분리하여 반응액의 색상(상단) 및 540 nm에서 흡광도(하단)를 측정하여 적혈구의 용혈 정도를 비교하였다. 1% 적혈구 용액은 음성 대조군으로서, 어떤 용액과도 반응시키지 않은 적혈구 용액이며, 0.1% SDS(계면활성제)를 이용하여 적혈구 용액을 완전 용해시킨 용액을 양성 대조군으로 하여 실험군 용액과 비교하였다. 구체적인 시험법은 "Purification and characterization of hemolysin from Porphyromonas gingivalis A7436"(FEMS Microbiol Lett., 176, 387-394)을 참조하였다.

그 결과, 양성 대조군인 0.1% SDS 용액 반응물이 가장 붉고, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 배양액 반응물이 짙은 붉은색을 나타냈다. 그에 비하여, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주 배양액 또는 일반 시험용액(일반 생리식염수, NCN 완충용액, 배양 배지) 반응물의 색상은 비교적 붉지 않은 것을 확인하였다(도 5, 상단). 반응물의 흡광도 비교시, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079의 반응물이 약 50% 용혈을 일으킨 반면, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 반응물은 일반 생리식염수, NCN 완충용액, 배양 배지와 유사한 정도의 용혈이 관찰되었다. 또한, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주의 반응물은 반응에 사용한 1% 적혈구 용액 자체 보다도 낮은 540 nm 흡광도를 가지는 것을 확인하였다(도 5, 하단).

따라서, 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주는 일반 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 ATCC43079 균주와 다르게 용혈성이 없는 새로운 특성을 가진 균주임을 알 수 있었다.

실시예 3. 신규한 히알루로니데이즈 제조

실시예 3.1. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주 배양

멸균된 THB 액체배지(BD Difco) 20 mL에 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주를 접종하여 35℃, 150 rpm, 6시간의 조건으로 배양하였다. 상기 조건으로 배양된 균 배양액의 약 20 mL를 멸균된 THB 액체배지 200 mL에 접종하여 35℃, 150 rpm, 12시간의 조건으로 배양하였다. 상기 조건으로 배양된 배양액 200 mL 중 약 150 mL를 3.5 L의 멸균된 히알루로니데이즈 생산배지에 접종하였다. 히알루로니데이즈 생산배지의 1 L당 조성은 트립톤 13.5 g, 효모 추출물 7.0 g, 소이톤 6.5 g, K₂SO₄ 1.4 g, Na₂HPO₄ 6.5 g, 안티폼 1.0 g, MgSO₄ 2.5 g, 글루코스 72.0 g이다.

히알루로니데이즈 생산배지의 접종 후, 발효기를 이용하여 배양 조건을 35℃, pH 7.0(5 M NaOH 투입하여 조절), 300 rpm, 공기 유량 1.5 L/분(lpm)로 조절하여 12-14시간 배양 후 종료하였다.

실시예 3.2. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주로부터 히알루로니데이즈 수득

상기 실시예 3.1에서 수득한 배양액을 4℃, 8000 rpm, 30분 조건으로 원심분리하여 가라앉은 균체는 제거하고 상등액만 회수하였다. 회수한 상등액에서 황산암모늄을 이용하여 단백질을 침전시키고, 이온교환칼럼을 통해 단백질을 정제하여 최종적으로 히알루로니데이즈를 획득하였다(이하, BST909 히알루로니데이즈라고 한다).

구체적으로, 원심분리를 이용하여 상등액에 황산암모늄 최종 농도를 포화 60%(g/L)로 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 황산암모늄 60% 포화 용액을 4℃, 8000 rpm, 30분의 조건으로 원심분리하여 침전된 단백질을 회수하였다. 회수한 침전 단백질을 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액으로 현탁한 후, 12-14 kDa 멤브레인을 이용하여 약 24시간 투석하였다.

투석하여 얻은 단백질 용액을 Hi Prep DEAE FF 16/10 column(GE), AKTA pure FPLC(Cytiva) 기기를 사용하여 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액을 NaCl 0 M에서 1 M까지 선형농도구배 방식으로 용출하였다.

유속 2 mL/분으로 용출하면서 농도별 용출용액의 히알루론산(HA) 분해 활성과 단백질 함량을 비교하였다. 히알루론산 분해 활성이 높은 구간의 용출용액을 모아 NaCl 성분을 제거하기 위하여 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액, 12-14 kDa 멤브레인을 이용하여 투석을 진행하였다.

상기 정제 및 투석 과정으로 얻어진 히알루론산 분해 활성을 나타내는 용액을 상기 FPLC 기기와 Hi Trap Butyl FF column(GE)를 통해 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액을 황산암모늄 40%(g/L)에서 0%(g/L)까지 선형농도구배 방식으로 용출하였다. 유속 1.5 mL/분으로 용출하면서 농도별 용출용액의 히알루론산 분해 활성과 단백질 함량을 비교하였다. 히알루론산 분해 활성이 높은 구간의 용출용액을 모아 황산암모늄 성분을 제거하기 위하여 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에서 12-14 kDa 멤브레인을 이용하여 투석을 진행하였다. 정제과정 중에는 SDS-PAGE를 이용하여 진행과정을 확인하였다.

실시예 4. 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주가 생산하는 히알루로니데이즈의 최적 활성 조건 확인

상기 실시예 3의 방법으로 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909에서 수득된 히알루로니데이즈(이하, BST909 히알루로니데이즈라고 함)의 최적 반응시간, 최적 반응 온도, 기질의 pH에 따른 활성 차이, 금속염에 의한 활성 저해, 다당류 분해능, 반응속도상수, 분자량을 확인하였다. 실험에 사용하는 히알루론산 용액은 고분자 히알루론산(sodium hyaluronate, Kewpie, HA-LQH)을 1% 농도로 10 mM SPB(sodium phosphate buffer, pH 7.0, 3% NaCl 함유)에 용해한 것을 기질용액으로 사용하였다.

실시예 4.1. BST909 히알루로니데이즈의 최적 반응 온도 확인

BST909 히알루로니데이즈의 최적 반응 온도를 확인하기 위하여, BST909 히알루로니데이즈 용액을 1% 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH) 기질용액과 함께 항온 수조를 이용하여 각 온도별 환경에서 1시간 동안 반응시킨 후, 232 nm에서의 흡광도를 측정하여 히알루론산의 분해 정도를 비교하였다.

그 결과, 40℃까지 반응 온도가 상승할수록 효소의 분해 활성이 증가하였으나, 45℃에서 활성이 급격히 감소하는 것을 확인하였다(도 6). 따라서, 본 효소의 최적 반응 온도가 40℃임을 알 수 있었다.

실시예 4.2. BST909 히알루로니데이즈의 최적 반응 pH 확인

BST909 히알루로니데이즈의 최적 반응 pH를 확인하기 위하여, 기질로 사용할 1% 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH) 용액을 pH 별로 제조된 완충용액을 이용하여 pH 별로 제조하여, 효소 용액과 함께 35℃, 150 rpm, 1시간의 동일 조건으로 반응시켰다. 각 pH에 따른 기질용액은 10 mM sodium acetate, pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0 완충용액, 10 mM SPB(sodium phosphate buffer), pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0 또는 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, pH 9.0 완충용액을 사용하여 제조하였다. 반응이 끝난 후, 232 nm에서의 흡광도를 측정하여 히알루론산의 분해 정도를 비교하였다.

그 결과, BST909 히알루로니데이즈는 10 mM SPB(pH 7.0)을 이용하여 제작한 1% 고분자 히알루론산 용액과 반응 활성이 가장 높은 것을 확인하였다(도 7). 따라서, 본 효소의 최적 pH는 7.0임을 알 수 있었다.

실시예 4.3. 금속염에 의한 BST909 히알루로니데이즈의 활성 저해 비교

금속염에 의한 BST909 히알루로니데이즈의 활성 저해 정도를 비교하기 위하여, 효소 용액을 각 금속염 5 mM 용액과 1:1의 비율로 혼합하여 30℃, 150 rpm, 1시간 조건으로 반응시켰다. 그 후, 1% 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH) 용액과 30℃, 150 rpm, 1시간 조건으로 추가 반응시킨 후, 80℃의 항온 수조에서 20분간 가열하여 반응을 중지시켰다. 그 후, 232 nm에서의 흡광도를 측정하여 히알루론산의 분해 정도를 비교하였다.

그 결과, 바륨(Ba²⁺), 칼슘(Ca²⁺), 망간(Mn²⁺), 마그네슘(Mg²⁺), 칼륨(K⁺), 나트륨(Na⁺)과 같은 금속염 및 EDTA와 반응 시에는 히알루론산 분해 활성 정도가 유사하였으나, 은(Ag²⁺), 니켈(Ni²⁺), 철(Fe²⁺), 아연(Zn²+) 및 구리(Cu²⁺)와 같은 금속염 및 SDS와 반응한 효소는 그 분해 활성이 크게 감소하는 것을 확인하였다(도 8).

실시예 5. BST909 히알루로니데이즈의 다당류에 대한 분해능 확인

BST909 히알루로니데이즈의 타 다당류에 대한 분해능을 확인하기 위하여, 먼저 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH)과 콘드로이틴 설페이트 A/C, 더마탄 설페이트, 잔탄, 아가로즈와 같은 다당류를 1% 농도로 259 mM SPB(pH 7.0)에 용해시켜 다당류 기질용액을 제작하였다. 제작한 다당류 기질용액 100 ㎕, 증류수 600 ㎕, 259 mM SPB(pH 7.0) 200 ㎕, 효소용액 100 ㎕를 혼합하여 37℃, 150 rpm, 16시간 조건으로 반응시킨 후, 100℃의 항온수조에서 10분, 냉수에서 10분간 반응시켜 효소반응을 중지시켰다. 상기 반응액을 4℃, 15000 g, 15분 조건으로 원심분리 한 후, 상등액을 회수하여 232 nm에서 흡광도를 측정하여 다당류의 분해 정도를 비교하였다.

그 결과, BST909 히알루로니데이즈는 소듐 히알루론산에만 분해능을 가지고 그 외의 다당류에는 분해 활성이 없는 것을 확인하였다(표 1).

기질		RA(%)
1	sodium hyaluronate	100.00
2	chondroitin sulfate A	0.812
3	chondroitin sulfate C	1.753
4	dermatan sulfate	1.596
5	xanthan	-1.070
6	agarose	-3.859

실시예 6. BST909 히알루로니데이즈의 반응속도상수 분석

BST909 히알루로니데이즈의 반응속도상수를 확인하기 위하여, 0% 내지 1%의 농도로 고분자 히알루론산(Kewpie, HA-LQH)을 10 mM SPB(pH 7.0, 3% NaCl)에 용해하여 사용하였다.

각 농도별 고분자 히알루론산 기질용액을 BST909 히알루로니데이즈와 함께 35℃, 150 rpm, 1시간의 조건으로 반응시켰다. 232 nm에서 흡광도를 측정한 값을 다당류 히아루론산의 단위체인 N-아세틸-D-글루코사민을 농도별로 232 nm에서 흡광도를 측정한 값과 비교하여 시간당 분해 속도를 계산하였다.

상기 반응을 통해 얻어진 기질(고분자 히알루론산) 농도와 이에 대한 분해 반응속도값을 이용하여 라인위버-버크 방정식을 작성하고, 미하엘리스 반응속도상수(Km) 및 최대반응속도(Vmax) 값을 계산하였다. 그 결과, Km 값이 0.0015 mM로서 기질에 대한 친화성이 높으며, Vmax 값이 50 mM/분으로 반응속도가 높은 것을 확인하였다(도 9).

실시예 7. BST909 히알루로니데이즈의 분자량 확인

BST909 히알루로니데이즈의 분자량을 확인하기 위하여 상기 실시예 3.2에서 수득한 BST909 히알루로니데이즈를 SDS-PAGE를 통해 분자량을 대략적으로 확인하였다. 그 결과, BST909 히알루로니데이즈의 분자량은 약 127 kDa으로 확인되었다(도 10).

상기 SDS-PAGE를 통해 분리한 단백질을 경기바이오센터에 의뢰하여 N-말단 서열 분석을 진행하였다. 그 결과, 히알루로네이트 리이아제 전구체 HylB(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus SzAM60)와 86.5%의 유사성을 갖는 것을 확인하였다(도 11). 또한, 상기 N-말단 서열을 NCBI BLAST를 이용하여 검색 시, N-말단의 LWLSPMATGTEKK 서열(서열번호 3)이 히알루로네이트 리이아제 전구체 HylB를 포함한 다양한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 균주의 히알루로네이트 리이아제의 아미노산 서열에 존재하는 것을 확인하였다. 하지만, 스트렙토코커스 속에 속하는 여러 종의 균이 가지는 히알루로니데이즈의 분자량은 116 kDa(Streptococcus Agalactiae, Streptococcus Dysglactiae), 54 kDa(Streptococcus Uberis), 55 kDa(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) 등으로 다양하나 BST909 히알루로니데이즈와는 차이가 있다.

이를 통해, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주에서 분리한 BST909 히알루로니데이즈가 일반 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 균주의 히알루로니데이즈와는 다른 신규한 효소임을 확인하였다.

실시예 8. BST909 히알루로니데이즈를 이용하여 저분자 히알루론산의 제조 방법

상기 실시예 3.2에서 수득된 BST909 히알루로니데니즈를 35 unit/mL로 제조하여 사용하였으며, 효소 반응은 기질량의 10%(v/v)의 효소액을 첨가(효소의 최종 역가는 3.5 unit/mL)하여 30℃에서 200 rpm으로 교반하면서 수행하였다. HPLC 분석은 YMC-Pack Polyamine II(PB12S05-2546WT, YMC)컬럼을 사용하여 자외선 흡광도 210 nm에서 수행하였고, 이동상은 1 M NaH₂PO₄를 사용하였으며, 5 mM에서 1 M까지 선형농도구배 방식으로 용출하였다.

또한, 유속은 1.0 mL/분에서 측정하였다. BST909 히알루로니데이즈 반응시간에 따른 고분자 히알루론산의 분해 과정을 도 12에 나타내었고, 경기바이오센터에 의뢰하여 MALDI-TOF와 LC-MS로 최종 분해 산물을 분석한 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.

그 결과, 도 12 내지 도 14에 나타난 바와 같이, BST909 히알루로니데이즈와 3시간 반응시 1,200 kDa 내지 2,200 kDa의 고분자 히알루론산이 약 380 Da ~ 400 Da의 이당류 및 약 760 Da의 사당류로 분해되었음을 확인하였다.

따라서, BST909 히알루로니데이즈는 고분자 히알루론산을 분해하여 저분자 히알루론산을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.

한국생명공학연구원

KCTC14238BP

20200714

<110> Biostream Technologies Co., Ltd. <120> NOVEL STREPTOCOCCUS STRAIN AND HYALURONIDASE DERIVED FROM THE SAME <130> SPD20-149BST <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1503 <212> RNA <213> Streptococcus equi <400> 1 ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt ggaacgcaca gatgatacgt 60 agcttgctac aattatctgt gagtcgcgaa cgggtgagta acgcgtaggt aacctagctt 120 atagcggggg ataactattg gaaacgatag ctaataccgc ataaaagtgg ttgacccatg 180 ttaactattt aaaaggagca acagctccac tatgagatgg acctgcgttg tattagctag 240 ttggtagggt aaaggcctac caaggcgacg atacatagcc gacctgagag ggtgaacggc 300 cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg 360 caatgggggg aaccctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa 420 agctctgttg ttagagaaga acagtgatgg gagtggaaag tccatcatgt gacggtaact 480 aaccagaaag ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtcccgagcg 540 ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt tgataagtct gaagttaaag 600 gcagtggctt aaccattgta tgctttggaa actgttaaac ttgagtgcag aaggggagag 660 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Gln 1010 1015 1020 Ala Lys Glu Val Val Asn Gly Gln Leu Ser Leu Glu Lys Ser Gly Leu 1025 1030 1035 1040 Tyr Leu Tyr Gln Lys Val Gly Asn Asp Phe Lys Gln Leu Ser Phe Lys 1045 1050 1055 Ala Leu Ser <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyaluronidase fragment sequence <400> 3 Leu Trp Leu Ser Pro Met Ala Thr Gly Thr Glu Lys Lys 1 5 10

Claims

스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP).
제1항에 있어서,
상기 균주의 16s rRNA가 서열번호 1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP).
제1항에 있어서,
상기 균주가 비용혈성인 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP).
서열번호 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 히알루론산 분해 효소.
제4항에 있어서,
상기 히알루론산 분해 효소는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)로부터 수득되는 것인, 히알루론산 분해 효소.
제4항에 있어서,
상기 히알루론산 분해 효소가 15℃ 내지 45℃에서 고분자 히알루론산 분해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 분해 효소.
제4항에 있어서,
상기 히알루론산 분해 효소가 pH 4.0 내지 pH 9.0에서 분해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 분해 효소.
제4항에 있어서,
상기 히알루론산 분해 효소가 Ag²⁺, Ni²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺및 Cu²⁺로부터 선택되는 어느 하나에 의해 분해 활성이 저해되는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 분해 효소.
스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus) BST909 균주(기탁번호: KCTC 14238BP)를 배양하는 단계;
배양액으로부터 히알루로산 분해 효소를 정제하는 단계를 포함하는
히알루론산 분해 효소를 제조하는 방법.
고분자 히알루론산에 제4항의 히알루론산 분해 효소를 처리하는 단계를 포함하는 저분자 히알루론산 제조 방법.
제10항에서,
상기 저분자 히알루론산은 크기가 380 Da 내지 100 kDa인 것인, 저분자 히알루론산의 제조 방법.