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KR20220119637A - 치료용 백신을 위한 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법 - Google Patents

치료용 백신을 위한 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법 Download PDF

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KR20220119637A
KR20220119637A KR1020227023312A KR20227023312A KR20220119637A KR 20220119637 A KR20220119637 A KR 20220119637A KR 1020227023312 A KR1020227023312 A KR 1020227023312A KR 20227023312 A KR20227023312 A KR 20227023312A KR 20220119637 A KR20220119637 A KR 20220119637A
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South Korea
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peptides
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KR1020227023312A
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브느와 그렐리에르
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트랜스진
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Abstract

본 발명은 일반적으로 치료용 백신, 즉 개인 맞춤형 암 백신을 위한 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법으로서, 상기 재조합 폭스바이러스는 다수의 펩티드 융합, 즉 신생펩티드의 발현 각각을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하고, 상기 방법은 서버 (1)의 처리 수단 (11)에 의해 (a) 후보 펩티드의 제 1 하위집합을 선별하는 단계로서, 상기 펩티드는 TMS 역치 미만의 막통과 점수를 제시하는, 단계; (b) 상기 제 1 하위집합으로부터 발현 카세트(들)에 이르기까지 다수의 가능한 배분 중에 후보 펩티드의 최적의 배분을 결정하는 단계로서, 상기 최적의 배분는 적어도 2가지 발현 카세트가 있는 경우 적어도 2가지 발현 카세트의 수치요법 점수 사이의 가장 낮은 범위를 제시하는, 단계; (c) 각 발현 카세트에 대해, 카세트 슬로트 점유 규칙의 함수로서 후보 펩티드의 최적의 슬로트 배정을 결정하여 가장 낮은 TM 점수를 갖는 펩티드 융합을 선택하는 단계; 및 (d) 상기 재조합 폭스바이러스의 생성을 위한 하나 이상의 발현 카세트(들)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 전달 서열을 결정하는 단계를 수행하는 것을 포함함을 특징으로 하는, 방법에 관한 것이다.

Description

치료용 백신을 위한 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법
본 발명은 일반적으로 하나 또는 다수의 펩티드 융합의 발현 각각을 위한 하나 이상의 발현 카세트(들)를 포함하는 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법, 이러한 재조합 폭스바이러스를 제조하는 방법, 뿐만 아니라 질환을 치료하거나 예방하는, 특히 암을 치료하거나 예방하기 위한 이러한 재조합 폭스바이러스 및 이의 용도에 관한 것이다.
지난 수십년 동안, 수많은 항원을 발현시킨 치료용 백신은 이러한 항원에 대한 선천적 및 특이적 면역 반응을 자극할 목표로 생산되어 왔다. 예를 들면, 많은 초창기 암 백신은 종양에서 과발현되는 가장 공통적으로 확인된 종양 관련 항원 (TAA) (예로, MUC-1, WT1, PSA, CEA)에 대응하는 면역계를 감작시키도록 구축되었다. 그러나, 이러한 TAA는 비-종양 세포에서 잔류하는 발현이 있을 수 있고, 따라서 이들 전통적인 접근법의 효능은 이러한 "자가" 항원에 대한 자가-내성으로 인해 제한될 것으로 예상된다. 또한, 다른 연구진은 후보 백신의 효능을 개선하고 다양한 질환 관련 항원에 대한 광범위하게 특이적인 T 세포 반응을 유도하는 다중에피토프 폴리펩티드의 용도에 중점을 두었다 (예로, Depla et. al., 2008, J. Virol. 82(1): 435-450). CTL 에피토프를 식별하는 기술학은 다수의 다중에피토프 포함 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 합성하고, 이들의 DNA 플라스미드 및 바이러스성 벡터를 통한 전달은 이제 쉽게 시행된다.
더욱이, 암 항원의 동일한 집합을 집단의 모두에게 전달하는 전통적인 패러다임은 질환 위험성 및 면역적 반응에서 개인적 다양성을 무시하는 것이다. 중요하게, 인간이 백신에 대해 다르게 반응하고, 숙주의 면역 반응이 인구집단에서 유의하게 변화하는 점은 무시될 수 없다 (Relman, 2008, J. Infect. Dis. 198(1): 4-5; Plotkin, 2008, Clin. Infect. Dis. 47(3): 401-9). 최근에는 진료 시 면역 체크포인트 차단제의 도입으로, 실제로 일부 치료가 일부 환자에게 효과적이지만 다른 환자에게는 아닌 점이 의료진에게 분명해졌다.
면역학, 유전학, 분자생물학 및 생물정보학의 진보는 더욱 개인화된 접근법으로 인도하였다. 이제 게놈 시퀸싱 분야의 기술학적 발전 (예로, 차세대 시퀸싱 (NGS))은 선례가 없는 속도 및 비용으로 종양의 전체 게놈 또는 엑솜 (게놈의 코딩 영역)의 서열 결정을 가능하게 하였다. 종양의 분자 특성화는 돌연변이는 암 생성기전 및 암 세포의 증식 과정 동안 높은 속도의 증식, 복구 메커니즘의 결여 및 클론 선택의 결과로서 돌연변이가 일어나는 점을 입증하였다. 일반적으로, 종양 게놈에서 돌연변이의 축적은 암성 조직에 특이적인 비정상 단백질의 발현을 유도한다. 이들은 신생항원 (neoantigen)으로 지칭된다. 대부분의 공통적인 종양 관련 항원과는 대조적으로, 종양 신생항원은 종양 세포에만 존재하고 정상 세포에 존재하지 않으며, 흉선에서 항원 특이적 T 세포의 결실 (deletion)을 유도하지 못한다. 따라서, 이들은 자가-단백질에 대한 자가-내성 및 자가면역 반응의 위험을 감지하지 않는 강한 면역 반응을 유도할 것으로 예상된다. 따라서, 종양 신생항원은 일상적인 진료에서 채택에는 많은 과학적 및 기술적 도전을 극복하도록 요구되지만, 종양에 특이적으로 적응된 치료용 백신을 설계하기 위한 이상적인 표적일 수 있다. 구체적으로, 대다수 암 돌연변이는 확률적 현상의 결과이고, 각 환자에게 특이적이다.
다른 주제보다, 종양 돌연변이의 확인, 이러한 돌연변이가 도입된 신생항원의 설계, 개인 맞춤형 백신의 제조 및 테스트와 동시에 질환이 진행되기 때문에, 환자의 병상에서 즉각적인 임상적 충분량의 전달을 보장하도록 효과적인 제조 공정을 달성하는데 성공적인 번역이 부수된다.
따라서, 국제특허출원 제 WO 2018/234506호에서는 신생펩티드 (각각 적어도 하나의 종양 특이적 돌연변이를 포함함)를 인코딩하는 재조합 폭스바이러스를 포함하는 개인 맞춤형 암 백신, 및 상기 개인 맞춤형 암 백신을 제조하는 방법이 제안되었다. 폭스바이러스는 생애 주기가 세포질에서 일어나는 이중가닥 DNA 바이러스이고, 세포성 기작 및 이의 자가 바이러스 단백질을 사용하여 복제한다.
보다 자세하게, 이러한 방법은 소위 개인 맞춤형 암 백신에 의해 인코딩되는데 적합한 신생펩티드를 확인하는 단계, 및 상기 재조합 폭스바이러스를 생성하는 단계를 포함한다. 이러한 목적으로, 재조합 폭스바이러스의 게놈에서 삽입될 상기 펩티드 인코딩하는 핵산 분자는 무작위로 배열되지만, 대상체에서 발현을 허용하는 적합한 조절 요소의 제어 하의 하나 이상의 "발현 카세트" (바람직하게 3가지 카세트, 각각 최대 10개의 펩티드를 보유하는 융합을 인코딩함)는 융합 길이의 견지에서의 균형을 중시한다. 재조합 폭스바이러스 자체의 생성은 전형적으로 부모 폭스바이러스 및 펩티드 발현 카세트를 포함하는 "전달" 플라스미드 사이의 상동성 재조합, 뿐만 아니라 발현 카세트의 클로닝에 필요한 연접 재조합 부위 및 제한효소 부위와 같은 추가의 특징을 통해 수행된다. 도입된 펩티드 발현 카세트를 갖는 재조합 폭스바이러스의 선별 과정은 재조합 상태를 세밀하게 검증하는 분석 (예컨대 PCR)이 요구되지만, 폭스바이러스 게놈 내의 발현 카세트의 삽입을 반영하는 선별 또는 채색 마커를 인코딩하는 리포터 유전자의 사용에 의해 용이하게 될 수 있다.
그러나, 소수성 펩티드 및 막통과 (TM) 도메인을 보유하는 펩티드의 발현은 재조합 바이러스의 생성 또는 생산을 방해하여 일부 백신 후보의 개발을 무산시킬 수 있음이 의심되어 왔다. TM 도메인이 주어진 펩티드 내에 있을 때 (펩티드내 TM) 상기 펩티드는 단순히 제거될 수 있지만, TM 도메인이 발현 카세트에 의해 인코딩되는 융합 내의 2가지 특정한 펩티드 (펩티드간 TM)의 연결부에 생성될 수 있음도 관찰되었으며, 이는 펩티드의 순서를 변경할 것을 요구한다. 폭스바이러스의 또 다른 특징은 상동성 재조합 과정에 대한 민감성이다. 이것은 제어 하에서 유전자 조작을 위한 장점이지만, 예기치 못한 상동성인 영역이 도입될 때 여전히 문제가 된다.
이러한 문제를 다루는 단순한 방식은 TM 및 높은 소수성 지표를 갖는 펩티드를 단순히 제거하는 것이지만, 이것은 국제특허출원 제 WO 2018/234506호의 실시예 1에 설명된 바와 같이 매우 효과적인 것은 아니다. 이 실시예는 3가지 발현 카세트에 배분된 30개 펩티드의 집합을 발현하도록 설계된 재조합 MVA이 복잡하게 생성되는 방식을 나타낸다. 잠재적인 펩티드간 (펩티드 역전에 의함) 및 펩티드내 (TM 포함 펩티드에 의함) TM 분절이 억압되어 발현하는 재조합 MVA를 생성하도록 허용하지 않았다. 펩티드 융합의 소수성 점수도 감소되지 않았다 (133 점 내지 28.5점). 이것은 심지어 TM이 없는 펩티드 및 낮은 소수성 지표를 갖는 펩티드를 선별할 때도, 재조합 폭스바이러스의 생성 또는 생산이 매우 낮은 점을 설명한다.
미국 특허 제 US 5,972,597호 미국 특허 제 US 6,440,422호 미국 특허 제 US 6,686,152호 미국 특허 제 US 6,998,252호 국제특허출원 제 WO 2O03/008533호 국제특허출원 제 WO 2007/077256호 국제특허출원 제 WO 2007/147528호 국제특허출원 제 WO 2008/138533호 국제특허출원 제 WO 2008/138649호 국제특허출원 제 WO 2009/004016호 국제특허출원 제 WO 2009/065546호 국제특허출원 제 WO 2009/100521호 국제특허출원 제 WO 2010/130753호 국제특허출원 제 WO 2012/001075호 국제특허출원 제 WO 2013/022764호 국제특허출원 제 WO 2014/053571호 국제특허출원 제 WO 2016/087457호 국제특허출원 제 WO 2018/234506호
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결론적으로 다수의 펩티드 또는 하나 이상의 펩티드 융합(들)의 발현을 위한 최적화된 발현 카세트를 설계하는 해법이 필요하다. 본 발명은 다음의 성질, 소수성 및 소수성 관련 단백질 특징, 막통과 도메인을 형성하는 성향 및 서열 상동성을 기초로 하고, 융합 내의 나머지 펩티드와 대비한 펩티드의 위치를 기초로 한 방법을 제안하고 있다. 실시예 섹션에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 발명은 재조합 폭스바이러스 생성의 수율을 증가시킨다.
이러한 기술적인 문제는 청구범위에서 정의된 바와 같은 구현예를 제공하여 해결된다.
본 발명의 다른 추가의 양태, 특징 및 장점은 본 발명의 바람직한 구현예의 다음의 설명으로부터 자명해질 것이다. 이들 구현예는 본 발명의 목적으로 주어진다.
제 1 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법으로서, 상기 재조합 폭스바이러스는 하나 또는 다수의 펩티드 융합의 발현 각각을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하고, 서버의 처리 수단에 의해
(a) 후보 펩티드의 제 1 하위집합을 선별하는 단계로서, 상기 펩티드는 TMS 역치 미만의 막통과 점수를 제시하는, 단계;
(b) 다수의 가능한 배분 중에 상기 제 1 하위집합으로부터 발현 카세트(들)에 이르기까지 후보 펩티드의 최적의 배분을 결정하는 단계로서, 상기 최적의 배분는 적어도 2가지 발현 카세트가 있는 경우 적어도 2가지 발현 카세트의 수치요법 점수 사이의 가장 낮은 범위를 제시하는, 단계;
(c) 각 발현 카세트에 대해, 카세트 슬로트 점유 규칙의 함수로서 후보 펩티드의 최적의 슬로트 배정을 결정하여 가장 낮은 TM 점수를 갖는 펩티드 융합을 선택하는 단계; 및
(d) 상기 재조합 폭스바이러스의 생성을 위한 하나 이상의 발현 카세트(들)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 전달 서열을 결정하는 단계
를 수행하는 것을 포함함을 특징으로 하는, 방법에 관한 것이다.
유리하고 비-제한적인 특징에 따르면,
단계 (a)의 상기 펩티드는 상동성 역치 미만의 연속적인 영역을 제시한다.
단계 (a)는 TMS 역치 초과의 막통과 점수 및/또는 상동성 역치 초과의 예측된 면역원성 잠재력에 따라 더 높은 순위의 후보로의 상동성인 영역을 제시하는 경우 펩티드를 제거하는 단계, 및 제 1 하위집합으로 개시되거나 선택되지 않은 후보 펩티드로서 확인된 후보 펩티드 집합의 제 2 하위집합을 선별하는 단계를 포함한다.
단계 (b)는 가능한 배분의 수가 서버의 처리 수단의 자원의 주어진 최대의 수 함수를 초과하는 경우, 다수의 가능한 배분 중의 최대 수의 가능한 배분의 적어도 한 번의 반복 중에서 제 1 하위집합으로부터 발현 카세트(들)에 이르기까지 후보 펩티드의 상기 최적의 배분을 결정하도록 시도하는 단계를 포함한다.
단계 (b)는 상기 최대 수의 가능한 배분의 반복 중의 각 가능한 배분에 대해, 적어도 하나의 발현 카세트가 주어진 역치 초과의 수치요법 점수를 제시하는 경우, 상기 최대 수의 가능한 배분의 또 다른 반복을 고려하거나, 가장 높은 수치요법 점수를 제시하는 제 1 하위집합의 후보 펩티드로부터 나온 후보 펩티드를 제 2 하위집합으로부터 나온 후보 펩티드로 교체하는 단계, 및 다시 펩티드 선별을 진행하는 단계를 포함한다.
단계 (c)는 TMSK7 역치 초과의 점수를 갖는 적어도 하나의 TM 패치를 드러내는 임의의 펩티드 융합을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
단계 (c)는 적어도 하나의 막통과 도메인이 발현 카세트에 있는 후보 펩티드의 임의의 가능한 슬로트 배정에서 검출되는 경우, 가장 높은 막통과 점수를 제시하는 제 1 하위집합의 후보 펩티드로부터 나온 후보 펩티드를 제 2 하위집합으로부터 나온 후보 펩티드로 교체하는 단계, 및 단계 (b)에 이어진 단계 (c)를 반복하는 단계를 포함한다.
상기 카세트 슬로트 점유 규칙은 펩티드의 막통과 점수에 따라, 및 동등한 막통과 점수의 경우 이들의 수치요법 점수에 따라 카세트 내의 후보 펩티드의 가능한 슬로트 위치를 정의한다.
발현 카세트에 배분되는 후보 펩티드는 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하지 않거나 생산하지 않는 적어도 3가지 클래스의 위험에 따라 분류되고, 상기 카세트 슬로트 점유 규칙은 카세트의 각 슬로트 위치에 대해 이러한 슬로트 위치에 배정되어야 할 후보 펩티드의 클래스를 정의한다.
상기 발현 카세트에 배분된 후보 펩티드의 최적의 슬로트 배정은 주어진 역치 미만의 막통과 점수를 제시한다.
선택된 후보 펩티드의 수가 10개 미만인 경우 단일 발현 카세트, 선택된 후보 펩티드의 수가 10개 내지 14개인 경우 2가지 발현 카세트, 및 선택된 후보 펩티드의 수가 15개 내지 30개인 경우 3가지 발현 카세트가 존재한다.
제 2 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 폭스바이러스를 포함하는 치료용 백신을 제조하는 방법으로서,
- 상기 재조합 폭스바이러스를 설계하기 위해 제 1 양태에 따른 방법을 수행하는 단계; 및
- 상기 재조합 폭스바이러스를 생성하는 단계
를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
유리하고 비-제한적인 특징에 따르면,
상기 방법은 상기 재조합 폭스바이러스의 제조 단계를 추가로 포함하고, 상기 제조 단계는 적합한 생산자 세포에서 적합한 규모로의 증폭 단계, 세포 배양물로부터 생산된 재조합 폭스바이러스의 회수 단계, 및 선택적으로 회수된 재조합 폭스바이러스의 정제 단계를 추가로 포함한다.
상기 재조합 폭스바이러스는 신생펩티드를 인코딩하고, 개인 맞춤형 암 백신으로서 사용하기 위한 것이다.
제 3의 양태에 따르면, 본 발명은 제 2 양태에 따른 방법에 따라 획득된 개인 맞춤형 암 백신에 관한 것이고, 상기 개인 맞춤형 암 백신은 바람직하게 이를 필요로 하는 대상체에서 대상체의 암을 치료하거나 이의 재발을 예방하는데 사용되는, 상기 재조합 폭스바이러스의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물이다.
도 1은 본 발명에 따라 펩티드(들) 융합의 발현을 위한 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법의 일반 모식도를 나타낸다. 주요한 단계 (a) 내지 (d)는 회색 박스로 표시된다 (HSK7: 융합 수치요법 점수; HSK7Thresh: HSK7 역치; TM 패치: 막통과 패치; TMSK7: 융합 TMS 역치).
도 2는 서버 1, 데이터 처리 수단 11, 저장 수단 12 및 인터페이스 13로 구성된 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 구조를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 방법에서 재조합 폭스바이러스에 의한 발현에 적합한 후보 펩티드를 선별하는 단계 (a)의 구현예를 도시하는 흐름도를 나타낸다 (TMS: 막통과 점수; TMSThresh: 펩티드 TMS 역치; N: 후보 펩티드의 총수; Nmax: 펩티드의 최대의 수).
도 4는 본 발명에 따른 방법에서 후보 펩티드의 최적의 카세트간 배분을 결정하는 단계 (b)의 구현예를 도시하는 흐름도를 나타낸다 (L: 저; M: 중; H: 고). 클래스 L, M 및 H는 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하지 않거나 생산하지 않을 위험을 말한다 (TMS: 막통과 점수; HS: 수치요법 점수; HSK7: 융합 수치요법 점수; HSK7Thresh: HSK7 역치; Nmin: 펩티드의 최소의 수; R: 범위; RThresh: 범위 역치; iter: 반복).
도 5는 카세트간 배분에서 펩티드의 총수 및 펩티드 클래스에 따라 펩티드 대 카세트를 배분하기 위한 표의 예시를 나타낸다 (L: 저; M: 중; H: 고).
도 6은 펩티드의 막통과 점수 및 수치요법 점수에 따른 펩티드의 순위를 매기는 예를 나타낸다 (TMS: 막통과 점수; HS: 수치요법 점수; L: 저; M: 중; H: 고).
도 7은 각 발현 카세트에 대해 후보 펩티드의 최적의 슬로트 배정을 결정하는 단계 (c)의 구현예를 도시하는 흐름도를 나타낸다 (TMS: 막통과 점수; TM 패치: 막통과 패치; TMSK7Thresh: 융합 TMS 역치; iter: 반복).
도 8은 펩티드의 수에 의존하는 슬로트 점유 규칙의 예를 나타낸다.
도 8a는 카세트의 펩티드의 수 n 및 펩티드의 클래스에 의존하는 10개 슬로트의 점유 규칙의 구현예를 나타낸다 (연회색; "저" 클래스; 회색: "중" 클래스; 진한 회색: "고" 클래스).
도 8b는 가능한 조합의 수를 보여주는, 카세트의 펩티드의 수 n 및 펩티드의 클래스에 따른 슬로트 점유의 표를 나타낸다.
도 9는 재조합 폭스바이러스에 삽입될 DNA 전달 서열을 결정하도록, 본 발명에 따른 역번역 단계 (d)의 구현예를 도시하는 흐름도를 나타낸다.
도 10은 개인 맞춤형 암 백신을 설계하기 위한 매뉴얼 접근법을 사용하여 획득된 3가지 발현 카세트 (A, B 및 C)를 보유하는 재조합 폭스바이러스의 예를 나타낸다 (각 카세트에서 10개 및 6개의 신생펩티드를 각각 발현하는 pTG19247 및 pTG19266) (TM 도메인: 막통과 도메인; HSK7: 융합 수치요법 점수; PCR: 중합효소 연쇄반응).
일반적인 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
용어 "a" 및 "an"은 달리 문맥상 명백하게 진술하지 않는 한 관사의 문법적 객체의 "하나" 또는 하나 이상" (즉, 2개, 3개, 4개, 5개 등을 포함한 적어도 하나)을 말한다.
용어 "및/또는"은 본원에서 사용될 때 "및", "또는" 및 "상기 용어로 연결된 요소 모두 또는 임의의 이들의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "예컨대", "예로"는 설명적 목적을 위한 것이고, 따라서 비제한적이다.
용어 "약" 또는 "대략"은 본원에 주어진 값 또는 범위가 결정적이지 않고, 주어진 값 또는 범위의 10% 이내, 바람직하게 8% 이내, 더욱 바람직하게 5% 이내로 달라질 수 있어 이러한 값 또는 범위를 결정하는데 사용된 장치 또는 방법의 내재한 오차 변동, 또는 테스트된 대상체에서 존재하는 변동을 포함함을 나타내는데 사용된다.
산물, 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때, 본원에 사용된 용어 "포함하는 (comprising)" (및 "포함하다" 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는" (및 "갖는다" 및 "갖는다"와 같은 갖는 임의의 형태), "포함하는 (including)" (및 "포함하다" 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태) 또는 "포함하는 (containing)" (및 "포함하다" 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태)는 개방되어 있고, 추가적인, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. "필수적으로 구성되는"은 필수적으로 중요한 임의의 구성성분 또는 단계를 제외하는 것을 의미한다. "구성되는"은 다른 구성성분 또는 단계의 하나 이상의 미량 요소를 제외하는 것을 의미한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합으로 공유 결합된 아미노산 잔기의 중합체를 말하도록 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있으며, 자연 발생 아미노산 및/또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 비-아미노산으로 개입될 수 있다. 아미노산의 최대의 수에 관한 제한을 두지 않는다. 일반적인 표시로서, 용어 펩티드는 바람직하게 짧은 중합체 (예로, 적어도 9개의 아미노산 잔기를 포함함)를 말하는 한편, 폴리펩티드 또는 단백질은 더 긴 중합체 (예로, 전형적으로 50개 이상의 아미노산 잔기를 포함함)를 가리킨다. 이들 용어는 고유의 종합체, 변형된 중합체 (유도체, 유사체, 변이체 또는 돌연변이체로도 지정됨), 뿐만 아니라 이들의 단편을 포괄한다. 본 발명의 맥락에서, 폴리펩티드는 또한 특히 다양한 펩티드 융합, 뿐만 아니라 다량체 (예로, 이량체)의 형태로 일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 본원에 사용된 용어 펩티드는 또한 신생펩티드를 포괄한다.
용어 "신생펩티드 (neopeptide)"는 본원에 기재된 바, 적어도 하나의 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 펩티드를 말한다.
본원에 사용된 용어 "융합"은 예를 들면 둘 이상의 신생펩티드의 조합, 하나의 신생펩티드에 대한 하나의 신호 펩티드의 융합 등과 같은 단일 폴리펩티드 사슬로서 하나 이상의 펩티드의 조합을 말한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 상호교환적으로 사용되고, 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA) 또는 혼합된 폴리리보- 폴리데옥시리보뉴클레오티드에서 적어도 9개의 뉴클레오티드 잔기의 중합체를 정의한다. 이들 용어는 이들의 단일가닥 또는 이중가닥, 선형 또는 고리형, 천연 또는 합성, 변형되지 않은 또는 변형된 버전 (예로, 유전적으로 변형된 폴리뉴클레오티드, 최적화된 폴리뉴클레오티드), 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 키메라 혼합물 (예로, RNA-DNA 하이브리드)을 포괄한다. 예시적인 DNA 핵산은 상보적인 DNA (cDNA), 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 벡터, 바이러스성 DNA (예로, 바이러스 게놈, 바이러스 벡터), 올리고뉴클레오티드, 프로브, 프라이머, 코딩 DNA, 비-코딩 DNA 또는 임의의 이들의 단편 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 RNA 핵산은 메신저 RNA (mRNA), 메신저 RNA 전구체 (프리-mRNA), 코딩 RNA 또는 비-코딩 RNA 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본원에 기재된 핵산 서열은 당해 기술분야에서 공지된 표준 방법에 의해, 자동화된 DNA 합성기 (예컨대 바이오서치사, 어플라이드 바이오시스템사 등으로부터 시판되는 장치)를 사용하여 합성되거나, 당해 기술분야에서 널리 공지된 분자생물학 기법 (예로, 클로닝, PCR 등)을 사용하여 자연 발생 공급원 (예로, 게놈, cDNA 등) 또는 인공적인 공급원 (예컨대 시판되는 라이브러리, 플라스미등 등)으로부터 획득될 수 있다.
일반적인 방식으로, "일치도"는 2가지 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열 사이의 아미노산 대 아미노산 또는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 상응성을 말한다. 2가지 서열 사이의 일치도 백분율은 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열이 공유하는 일치하는 위치의 수 함수이다. 다양한 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘은 예를 들어 단백질 서열 및 구조의 아틀라스에 있는 NCBI 또는 ALIGN에서 입수가능한 블라스트 프로그램과 같이 아미노산 서열 사이의 일치도 백분율을 결정하도록 당해 기술분야에서 사용가능하다 (Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9). 뉴클레오티드 서열 사이의 일치도를 결정하기 위한 프로그램은 또한 특수화된 데이터베이스 (예로, 진뱅크, 위스콘신 서열 분석 패키지, BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램)에서 사용가능하다.
용어 "바이러스", "바이러스 입자", "바이러스 벡터" 및 "비리온"은 상호교환적으로 사용되고, 바이러스 입자 내에 포장될 수 있는 야생형 바이러스 게놈의 적어도 하나의 요소를 포함하는 비히클을 의미하는 것으로 광범위하게 이해될 것이다. 이 용어는 바이러스 게놈 및 바이러스 입자를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "폭스바이러스"는 폭스비리대 과에 속하는 바이어스를 말한다.
용어 "재조합"은 유전적 조작을 말한다. 바이러스, 명확하게 본원에 기술된 폭스바이러스와 연결하여 사용될 때, 이것은 바이러스가 이의 게놈 내에 삽입된, 자연 발생 바이러스 게놈에서 발견되지 않거나 이에 의해 발현되지 않는 적어도 하나의 외인성 핵산 분자 (재조합 유전자 또는 핵산으로도 불림)을 포함하도록 조작된 점을 가리킨다. 그럼에도 불구하고, 외인성 핵산은 재조합 바이러스가 도입되는 대상체에게 상동성 또는 이종성일 수 있다. 유리하게 본 발명의 맥락에서, 상기 외인성 핵산은 바람직하게 융합으로 배열된 다수의 펩티드를 각각 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트(들)이다.
용어 "로부터 획득된", "기원하는" 또는 "기원하다"는 구성성분의 고유의 공급원 (예로, (신생)에피토프, (신생)펩티드, (신생)항원, 핵산 분자, 바이러스 등) 또는 시료의 고유의 공급원 (예로, 대상체 또는 대상체군)을 확인하는데 사용되지만, 예를 들면 화학적 합성 또는 재조합 수단에 의할 수 있는 구성성분/시료가 만들어지는 방법을 제한하도록 의미하지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 자연 환경으로부터 제거된 (즉, 자연적으로 회합되거나 자연에서 발견되는 적어도 하나의 다른 구성성분(들)로부터 분리됨) 구성성분 (예로, 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 등)을 말한다. 보다 구체적으로, 이것은 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 구성성분을 말한다. 예를 들면, 핵산 분자는 자연에서 정상적으로 화합하는 서열과 분리될 때 (예로, 염색체 또는 게놈으로부터 해리됨) 단리되지만, 이종성 서열과 (예로, 재조합 벡터 내에) 회합될 수 있다. 합성 구성성분은 자연적으로 단리될 수 있다.
용어 "대상체"는 일반적으로 본원에 개시된 임의의 산물 또는 방법이 필요하거나 유익할 수 있는 척추동물 유기체를 말한다. 전형적으로, 유기체는 포유동물, 구체적으로 애완동물, 사육 동물, 스포츠 동물 및 영장류 동물 (인간 및 비-인간)로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 유기체를 말할 때 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 남성 및 여성 뿐만 아니라 태아, 신생아, 유아, 청년, 성인 및 노인을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "투여하는" (또는 "투여된" 등과 같은 임의의 형태의 투여)은 본원에 기재된 양식에 따라 대상체에게 구성성분 (예로, 재조합 폭스바이러스)의 전달을 말한다.
재조합 폭스바이러스의 설계
제 1 양태에서, 본 발명은 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법으로서, 상기 재조합 폭스바이러스는 하나 또는 다수의 펩티드, 바람직하게 하나 또는 다수의 펩티드 융합의 발현 각각을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 일반 모식도는 도 1에 나타낸다.
본원에서 재조합 폭스바이러스를 "설계하는 것"은 구체적으로 확인된 "후보" 펩티드의 집합, 하나 이상의 발현 카세트에서 이들의 배분 및 펩티드 융합에서 이들의 슬로트 배정을 결정하고, DNA 전달 서열을 갖는 재조합 폭스바이러스가 치료용 백신으로서의 용도, 명확하게 감염성 질환 또는 암과 같은 증식성 질환을 치료하는데 적합하도록 이러한 DNA 전달 서열을 결정하는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 적어도 4가지 단계, (a) 본원에 기재된 바와 같은 상이한 판정기준을 기초로 하여 선택되는 재조합 폭스바이러스에 의한 발현에 적합한 펩티드의 제 1 하위집합을 선별하는 단계; (b) 카세트-간 배분의 단계 (예로, 하나 이상의 발현 카세트(들)에 후보 펩티드의 배분); (c) 카세트-내 슬로트 배정의 단계 (예로, 각 발현 카세트에 대해 발현 카세트에 배분된 후보 펩티드의 최적의 배정을 결정하는, 다른 말로 하면 발현 카세트 내에 후보 펩티드의 순서을 정하는 것); 및 (d) 재조합 폭스바이러스의 생성을 위해 하나 이상의 발현 카세트(들)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 전달 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 다른 말로 하면, 본 발명의 방법은 펩티드의 목록으로부터 후보 펩티드를 선택하고, 하나 이상의 발현 카세트(들) 내의 펩티드 융합 및 재구분을 만들고, 폭스바이러스 명세에 따라 발현 카세트의 뉴클레오티드 서열을 생성하도록 허용한다.
도 2를 참조하여, 본 발명의 상기 재조합 폭스바이러스의 설계는 서버 1의 데이터 처리 수단 11 (예를 들면, 프로세서)에 의해 수행되도록 의도된다. 상기 서버 1은 명확하게 펩티드 데이터베이스를 저장하기 위한 데이터 저장 수단 12 (즉, 메모리) 및 인터페이스 13 (즉, 스크린, 마우스, 키보드, 추가의 장치와의 연결기 등)을 추가로 포함할 수 있다.
폭스바이러스
일 구현예에서, 본 발명의 설계 방법에에 의해 생성되는 재조합 폭스바이러스는 척추동물 숙주에게 유도되는, 오르토폭스바이러스 (Orthopoxvirus), 카프리폭스바이러스 (Capripoxvirus), 조류폭스바이러스 (Avipoxvirus), 파라폭스바이러스 (Parapoxvirus), 레포리폭스바이러스 (Leporipoxvirus) 및 수이폭스바이러스 (Suipoxvirus)와 같은 다수의 속을 포함하는 코르도폭스비리내 아과로부터 획득된다. 바람직한 구현예에서, 본원에 사용되는 재조합 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스 속, 훨씬 더 바람직하게는 백시니아 바이러스 (VV) 종에 속하는 폭스바이러스로부터 생성된다. 본 발명의 맥락에서 웨스턴 리저브 (WR), 코펜하겐 (Cop), 리스터, LIVP, 웨스, 타슈켄트, 티안탄, 브라이튼, 앙카라, MVA (변형된 백시니아 바이러스 앙카라), LC16M8, LC16M0 균주 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 백시니아 바이러스 균주가 사용될 수 있고, 구체적으로 WR, 코펜하겐, 웨스 및 MVA 백시니아 바이러스가 선호된다. 다양한 폭스비리대의 게놈 서열은 당해 기술분야에 있는 진뱅크와 같은 특수화된 데이터은행에서 사용가능하다 (예로, 기탁번호 NC_006998, M35027 및 U94848이 WR, 코펜하겐 및 MVA 게놈의 서열을 제공함). 또 다른 구현예에서, 본원에 사용되는 재조합 폭스바이러스는 파라폭스바이러스로부터 생성될 수 있고, 구체적으로 하나의 슈도폭스바이러스 (PCPV) 종이 선호된다. PCPV는 전형적으로 130 kb 내지 150 kb 크기의 선형 및 이중가닥 DNA 분절인 게놈을 소유한다.
본원에 사용되는 적당한 폭스바이러스는 국제특허출원 제 WO 2018/234506에 기재되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 야생형 균주뿐만 아니라 임의의 이의 유도체 (즉, 야생형 균주와 비교하여, 예로 바이러스 게놈 내에서 연속적이거나 연속적이지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드(들)의 절단, 결실, 치환 및/또는 삽입에 의해 변형된 폭스바이러스)를 사용할 수 있다. 예시적인 변형은 바람직하게 DNA 대사, 숙주 병독성 또는 IFN 경로에 관여하는 바이러스 유전자에 있다 (예로, Guse et. al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther. 11(5): 595-608 참조). 구체적으로 파손될 적합한 유전자는 티미딘 키나제 (TK) 인코딩 유전자 (유전자좌 J2R; 진뱅크 기탁번호 AAA48082)이다. 대안적으로 또는 조합하여, 본원에 사용되는 폭스바이러스는 바이러스성 리보뉴클레오티드 환원효소 (RR)를 인코딩하는 적어도 하나 또는 둘 다의 유전자를 변경시킴으로써 변형될 수 있다. 바이러스성 효소는 14L 및 F4L 유전자좌에 의해 각각 인코딩되는 R1 및 R2로 지정된 2가지 이종성 소단위체로 구성된다. 다양한 폭스바이러스의 게놈에서 14L 및 F4L 유전자의 서열 및 이의 위치는 공개된 데이터베이스로 사용가능하다. 본원에 사용된 유전자 명명법은 코펜하게 백시니아 바이러스의 것이다. 본원에서 이것은 달리 표지되지 않는 한 다른 폭스피리대의 상동성인 유전자에도 사용될 수 있으며, 코펜하겐 및 다른 백시니아 균주 사이의 상응성은 당업자에게 사용가능하다. 설명적 목적으로, TK, 또는 TK 및 RR에 결함이 있는 백시니아 바이러스 (VV)는 문헌에 기재되어 있다 (예로, 국제특허출원 제 WO 2009/065546호 참조).
바람직하게, 본 발명의 설계 방법에 의해 설계되는 재조합 폭스바이러스는 복제 결함성 폭스바이러스, 바람직하게 복제 결함성 백시니아 바이러스이고, 이것이 인간 세포에서 유의한 정도로 복제할 수 없음을 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 맥락에서 사용되는 적당한 폭스바이러스는 매우 약화된 표현형을 갖는 MVA이다 (Mayr et. al., 1975, Infection 3: 6-14; Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-51). MVA 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 인코딩된 바이러스 단백질의 아미노산 서열은 당해 기술분야에서 예로 Antoine et. al., 1998, Virol. 244: 365-96 및 진뱅크 (기탁번호 U94848)로부터 입수가능하다,
다수의 펩티드(들)
본원에 사용된 용어 "다수"는 수가 많은 상태 (예로, 적어도 5개 초과)를 말한다. 재조합 폭스바이러스에 의해 인코딩될 수 있는 펩티드의 수 (즉, 다수의 펩티드)는 선택된 폭스바이러스의 유형 (예로, MVA) 및 폭스바이러스 매개된 발현 (예로, 이하 본원에 기술된 바와 같은 짧거나 긴 융합 및 조절 요소의 발현)에 의존하여 제한되지 않는다. 설명적 목적으로, 5개 내지 500개의 펩티드가 재조합 폭스바이러스에 의해 발현될 수 있으며, 바람직하게 7개 내지 100개, 더욱 바람직하게 9개 내지 40개, 훨씬 더 바람직하게 10개 내지 35개이고, 약 30개의 펩티드 (예로, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개 또는 33개)가 선호된다.
재조합 폭스바이러스에 의해 인코딩되기 위해, 본 발명에 따른 방법에 의해 선택되는 펩티드의 길이는 전형적으로 12개 아미노산 잔기 내지 약 150개 아미노산 잔기의 길이에 포함되지만, 당연히 이 길이는 펩티드마다 달라질 수 있다. 설명적 목적으로, 각 펩티드(들)은 13개 내지 101개의 아미노산 잔기, 바람직하게 16개 내지 90개의 아미노산 잔기, 우선적으로 17개 내지 85개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게 18개 내지 80개의 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게 20개 내지 40개의 아미노산 잔기의 길이일 수 있다.
신생펩티드
본 발명의 방법은 구체적으로 개인 맞춤형 암 백신의 개발에 적응되고, 환자를 기초로 하여 환자에서 적어도 하나의 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 후보 펩티드의 집합, 즉 후보 신생펩티드를 식별하여 제공하도록 허용한다. 따라서, 신생펩티드는 본원에 설명된 바와 같이 비-자가 특성을 갖는다 (자가-단백질에서 발견되지 않음). 이러한 비-자가-특성으로 인해, 이러한 펩티드(들)은 종양 특이적 T 림프구에 의해 인식될 것으로 예상된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 다수의 신생펩티드를 선별하기 위해 수행된다. 전형적으로, "신생펩티드"는 신생펩티드의 단편에 상응하여 MHC 의존성 T 세포 인식에 기여하는 (또는 대상체의 세포 표면에서 MHC 분자에 의해 제시됨) 최소의 면역 결정기 (즉, "신생에피토프"), 및 침묵하지 않는 적어도 하나의 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 펩티드이다. 전형적으로, 종양 특이적 돌연변이는 신생에피토프 내에 위치하고, 이의 정상적인 환경 (신생에피토프가 나오는 신생항원의 환경)에 자연적으로 존재하는 연접하는 서열(들)로 (어느 하나 또는 둘 다의 측면에) 둘러싸인다.
본원에 사용된 용어 "신생항원"은 암 세포의 발암기전 과정 동안 출현하는 항원을 말한다. 따라서, 신생항원은 암 세포 또는 환자로부터 획득된 조직에서 발견되지만, 환자 또는 건강한 개인으로부터 획득된 정상 세포 또는 조직의 시료에서는 발견되지 않는다. 전형적으로, 종양 특이적 돌연변이는 바람직하게 암 세포 (예로, 종양 시료)에 포함된 DNA에 존재하지만, 비-암성 세포 (예로, 비-종양 시료)에 포함된 DNA에는 부재한다.
용어 "돌연변이"는 테스트 서열 (예로, 신생항원) 및 기준 서열 (자가-항원) 사이의 적어도 하나의 서열 차이에 관한 것이다. 종양 특이적 돌연변이의 여러 유형은 미스센스 돌연변이, 결실, 삽입, 구조틀 변위 (framshift) 돌연변이 및 스플라이싱 부위의 돌연변이를 포함하여 본 발명에 의해 포괄된다 (국제특허출원 제 WO 2018/234506호 참조). 본 발명의 맥락에서, 종양 특이적 돌연변이는 바람직하게 침묵하지 않고, 상응하는 자가-항원과 관련하여 아미노산 수준의 변경으로 번역시킨다. 더욱 바람직하게, 이것은 미스센스 또는 구조틀 변위 돌연변이이다. "미스센스" 돌연변이는 인코딩된 아미노산 서열에 영향을 주는 특이적 코돈 내에서 하나의 뉴클레오티드의 또 다른 뉴클레오티드로의 치환으로부터 생성되어, 하나의 아미노산의 변경을 유도한다. 단백질 서열에 영향을 주는 또 다른 방식은 핵산 분자에서 뉴클레오티드의 수를 변경시키는 하나 이상의 뉴클레오티드(들) (예로, DNA 조각)의 삽입 또는 결실이다. 삽입 및 결실 돌연변이는 번역 구조틀의 변경 (소위 구조틀 변위 돌연변이)을 유도하지만, 구조틀을 맞춘 인델의 경우에는 반드시 그러하지 않다 (예로, 다수의 3개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실은 적어도 하나의 코돈의 첨가 또는 억압을 생성할 것임). 돌연변이가 초기에 뉴클레오티드 서열에서 일어나는 경우, 거의 전체 아미노산 서열이 변경될 수 있다. 또한, 구조틀 변위 돌연변이는 종결 신호로 번역되는 종결 코돈의 생성을 유도할 수 있고, 다음으로 생성된 단백질은 절단될 것이다. (새로이 (de novo) 생성된 종결 코돈의 하류 부분이 결실됨). 또한, 미스센스 돌연변이는 비정상 스플라이싱 및 이에 따른 비정상 단백질 서열을 유도하는 mRNA의 스플라이싱 부위에 위치할 수 있다.
신생펩티드 구현예와 관련하여, 선택되는 신생펩티드 중 적어도 70% (예로, 80%, 85%, 90%, 95% 및 심지어 100%)는 신생펩티드의 중간에 (예로, 변이된 아미노산이 정확하게 신생펩티드의 중간에 (신생펩티드가 홀수의 아미노산을 갖는 경우) 또는 2개의 중간 위치 중 하나에 (신생펩티드가 짝수의 아미노산을 갖는 경우), 또는 변이된 아미노산의 측면 상에 동일한 수의 아미노산이 연접되어 정확한 중간 위치의 각 측면 상의 임의의 2개 내지 5개의 아미노산에 위치함) 집중되는 단일 미스센스 돌연변이를 갖는다.
그러나, 돌연변이는 적어도 일부 신생펩티드에서 N-말단 또는 C-말단과 근접하여, 특히 구조틀 변위 돌연변이의 경우 또는 미스센스 돌연변이가 신생항원의 N- 또는 C-말단에서 또는 이와 근접하여 일어날 때 위치할 수 있다.
물론, 신생항원 길이는 펩티드 구현예와 연결하여 상기 기술된 특징을 공유한다. 바람직하게, 제한되지 않는 설명적 목적으로, 미스센스 돌연변이를 포함하는 신생항원은 개별적으로 20개 내지 40개, 바람직하게는 25개 내지 35개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 구체적으로, 25개, 27개 또는 29개 잔기의 개별 신생항원이 선호된다 (바람직하게, 미스센스 돌연변이는 돌연변이의 각 측면 상에 12개 (이십오량체), 13개 (이십칠량체) 또는 14개 (이십구량체) 아미노산이 연접된 신생펩티드의 N-말단으로부터 시작하는 13번 (이십오량체), 14번 (이십칠량체) 또는 5번 (이십구량체) 위치에 위치함).
펩티드 융합
설명된 바와 같이, 본 발명의 방법은 하나 이상의 융합(들)의 형태로 본 발명의 방법에 따라 할당되는 다수의 펩티드 (예로, 신생펩티드)의 재조합 폭스바이러스에 의한 발현을 고려한다. 본 발명의 맥락에서, "하나 이상의 펩티드 융합" ("펩티드들의 융합" 또는 "펩티드 융합"으로도 불림)은 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다. "융합"은 관여된 펩티드의 수와는 상관없이, 단일 폴리펩티드 사슬로서 상기 펩티드(들)의 조합을 의미한다. 단일 펩티드의 경우, 상기 단일 펩티드의 "융합"은 이미 단일 폴리펩티드 사슬이기 때문에 펩티드 자체를 말하는 것으로 이해되어야 한다. 펩티드의 수는 각 융합마다 달라질 수 있으며, 1개 내지 20개의 펩티드, 바람직하게 2개 내지 15개의 펩티드, 바람직하게 3개 내지 12개, 더욱 바람직하게 4개 내지 11개, 훨씬 더 바람직하게 5개 내지 10개의 펩티드 (예로, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개)를 포함하는 융합이 선호된다.
펩티드 융합에서 펩티드의 위치는 "슬로트"로 불린다.
특정 구현예는 ER (세포질세망)을 통한 가공 및/또는 분비를 증진하도록 펩티드 융합 (예로, 하나 이상의 펩티드로 구성됨)의 N-말단에서 신호 펩티드의 존재를 고려한다. 상기 신호 펩티드는 자체가 펩티드 융합에 융합된다. 간략하게, 신호 펩티드는 보통 15개 내지 35개의 필수적인 소수성 아미노산을 포함하고, 번역 개시 코돈 하류에 있는 폴리펩티드의 N-말단에 삽입된 다음 특이적 ER 위치한 엔도펩티다제에 의해 제거되어 성숙한 폴리펩티드를 제공한다. 적당한 신호 펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이들은 면역글로불린, 조직 플라스미노겐 활성인자, 인슐린, 광견병 당단백질, HIV 바이러스 외투 당단백질 또는 홍역 바이러스 F 당단백질 (gp)의 신호 펩티드와 같이 세포성 또는 바이러스성 폴리펩티드로부터 획득될 수 있거나, 합성될 수 있다. 하나 이상의 신호 펩티드 서열이 재조합 폭스바이러스에 사용될 경우, 상이한 기원의 신호 펩티드 (예로, 광견병 또는 홍역 F gp)를 선택하고/거나, 높은 정도의 서열 일치도 (예로, 75% 초과)를 나타내는 상동성인 서열을 변질시켜 생산 공정을 저하시킬 수 있는 상동성 재조합 사건을 제한할 수 있다 (국제특허출원 제 WO 2008/138649 참조).
본 발명의 맥락에서, 융합은 둘 이상의 펩티드를 포함하는 경우 변환 (예로, 화학적 작용)이 관여할 수 있고, 펩티드 융합은 직접적으로 (즉, 둘 사이에 추가적인 아미노산 잔기가 없음), 또는 링커를 통해 펩티드의 접근성을 개선할 수 있다. 전형적으로, 링커는 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 알라닌 (Ala 또는 A) 및/또는 프롤린 (Pro 또는 P)과 같은 아미노 잔기의 짧은 스트레치로 구성된다. 본 발명의 맥락에서 바람직한 링커는 2개 내지 10개의 아미노산을 포함하고, 주로 글리신 및 세린인 3개, 5개 또는 10개의 아미노산 (예로, GSG, GST, GAS 또는 GTS와 같은 하나 이상의 아미노산 모티브로 구성됨)이 선호된다. 융합된 펩티드 둘 사이에 링커의 포함 여부의 필요성을 평가하는 것은 당업자의 역량에 속한다. 바람직한 구현예에서, 펩티드는 각 펩티드 사이 (예로, 펩티드 1 및 펩티드 2 사이, 펩티드 2 및 펩티드 3 사이)에, 및 선택적으로 첫 번째 펩티드의 N-말단에서 링커를 사용한 융합으로 배열된다. 하나의 재조합 폭스바이러스에 포함된 링커 핵산 서열은 코돈 중복성 (G 잔기를 인코딩하는데 사용가능한 4가지 코돈, S 잔기를 인코딩하는 6가지, T 잔기를 인코딩하는 4가지 등)의 장점을 이용하여 퇴화될 수 있고, 따라서 재조합 폭스바이러스 내의 서열 일치도를 감소시키는데 기여하고 생산 공정 동안 일어날 수 있는 바람직하지 않은 재조합 사건을 제한한다.
본 발명의 특정 구현예는 또한 펩티드 (또는 이들의 융합(들))의 발현 또는 이러한 펩티드 (또는 이들의 융합)를 발현하는 감염된 숙주 세포의 검출을 촉진하기 위하여 태그 (전형적으로 사용가능한 항-혈청 또는 화합물에 의해 인식될 수 있는 짧은 펩티드 서열)의 존재를 고려한다. 매우 다양한 태그 펩티드가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있으며, PK 태그, FLAG 옥타펩티드, MYC 태그, HIS 태그 (보통 4개 내지 10개 히스티딘 잔기의 스트레치) 및 e-태그 (미국 특허 제 US 6,686,152호)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 태그 펩티드(들)은 독립적으로 단백질의 N-말단에, 대안적으로 이의 C-말단에, 또는 대안적으로 내부에 또는 여러 개의 태그가 채용될 때 임의의 이들 위치에 위치할 수 있다. 태그 펩티드는 항-태그 항체를 사용한 면역검출 검정법에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 각 융합은 다른 융합(들)과 상이하게 설계될 수 있고, 펩티드 신호, 링커, 태그 등과 같은 요소의 존재, 서열, 수 및/또는 위치에 의해 서로 구별될 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 각 융합은 그러나 (a) 이의 N-말단에서의 신호 펩티드, (b) 첫 번째 펩티드의 N-말단, 각 펩티드의 사이 및 마지막 펩티드의 C-말단에서의 링커 및 (c) 이의 C-말단에서의 태그를 포함한다.
펩티드 융합(들)의 발현
본 발명에 따르면, 각 펩티드 융합은 "발현 카세트"로도 지칭되는, 특유한 조절 요소 (명확하게 프로모터 및 종결 서열)의 조절 하에 배치된다. 전형적으로, "발현 카세트"는 대상체의 발현을 허용하는 적합한 조절 요소의 조절 하에, 하나 이상의 펩티드(들) (예로, 신생펩티드(들)) 또는 펩티드 융합을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 말로 하면, 본원에 기술된 펩티드 융합을 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트 각각은 숙주 세포 또는 대상체의 발현에 적합한 조절 요소를 장착하고 있다. 본원에 사용된 용어 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 주어진 숙주 세포 또는 대상체에서, 핵산(들) 또는 이의 유도체 (즉, mRNA)의 복제, 증식, 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 운반을 포함하는 발현을 허용하거나, 이에 기여하거나 이를 조정하는 임의의 요소를 말한다.
당업자라면 조절 요소의 선택이 발현 카세트 자체, 이것이 삽입되는 바이러스, 숙주 세포 또는 대상체, 원하는 발현 수준 등과 같은 요인에 의존할 수 있음을 이해할 것이다. 프로모터는 특히 중요하다. 구체적으로, 폭스바이러스 프로모터는 본원에 기재된 재조합 폭스바이러스와 같은 폭스바이러스로부터 나온 주어진 핵산의 발현을 유도하는데 적응되어 있다. 대표적인 예는 백시니아 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et. al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28), TK, p28, p11, pB2R, pA35R 및 K1L 프로모터, 차크라바티 등에 기술된 프로모터와 같은 합성 프로모터 (Chakrabarti et. al., 1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et. al., 1997, J. Virol. Methods 66: 135-8; 및 Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8), 뿐만 아니라 초기/후기 키메라 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
당업자라면 프로모터에 추가하여 조절 요소가 전사 (예로, 폴리 A 전사 종결 서열), mRNA 운반 (예로, 본원에 기술된 바와 같은 신호 서열), 안정성 (예로, 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열), 번역 (예로, 개시인자 Met, 삼분 리더 서열, IRES 리보좀 결합 부위, 신호 펩티드 등), 및 확인 및 정제 (예로, 본원에 기술된 바와 같은 태그 펩티드)의 적절한 개시, 조절 및/또는 종결을 위한 추가적인 요소를 추가로 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 선별된 모든 펩티드는 1가지 내지 5가지 발현 카세트로 군집되고, 1개 내지 20개 펩티드의 1가지 내지 3가지 발현 카세트, 바람직하게 2가지 또는 3가지 발현 카세트, 더욱 바람직하게 3가지 카세트가 선호된다. 구체적인 바람직한 구현예에서, 재조합 폭스바이러스는 각각 5개 내지 10개 펩티드의 융합을 인코딩하는 3가지 발현 카세트를 포함하고, 각각 대략 10개의 펩티드가 선호된다. 설명적 목적으로, 재조합 폭스바이러스가 3가지 발현 카세트를 포함하는 경우, 이들 각각은 각 펩티드 융합을 인코딩하는 핵산 서열을 조절하는데 상이한 프로모터를 사용할 것이고, 예를 들면 제 1 카세트의 경우 pH5R 프로모터, 제 2 카세트의 경우 pC11R 프로모터 및 제 3 카세트의 경우 p7.5K 프로모터이다.
설계 방법의 단계 (a): 재조합 폭스바이러스에 의한 발현에 적합한 후보 펩티드의 확인 및 선별
본 발명에 따른 설계 방법은 도 3에 나타낸 바와 같이, 먼저 재조합 폭스바이러스에 의해 발현되는 펩티드의 확인 및 순위 매김 (단계 (a0)), 및 후보 펩티드의 선별을 요구한다.
설명된 바와 같이, 본 발명의 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법은 관심있는 펩티드의 집합이 사용가능한 것으로 가정한다. 단계 (a0)는 상기 펩티드의 확인 및 순위 매김을 통해 관심있는 펩티드 집합의 선별을 허용한다. 상기 관심있는 펩티드의 집합은 또한 "입력 파일로부터의 펩티드"에 의해 설계될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 관심있는 펩티드는 하나 이상의 판정기준, 예로 펩티드의 예측적 면역원성 잠재력에 따라 확인되고/거나 순위가 매겨진다. 명확하게, "면역원성 잠재력"은 펩티드가 일단 대상체에게 (예로, 이러한 펩티드 또는 펩티드 융합을 인코딩하는 재조합 폭스바이러스를 통해) 전달되는 경우 면역 반응을 상승시키는 성능을 말한다. 본 발명의 맥락에서, 면역 반응은 체액성, 또는 CD4+ (예로, Th1, Th2 및/또는 Th17) 및/또는 CD8+ T 세포 반응 (예로, CTL 반응)을 포함하는 T 세포 반응 (또는 둘 다)일 수 있다. 펩티드 또는 펩티드 융합의 면역원성 잠재력의 실리콘 (in silico) 예측을 위한 매우 많은 예측 알고리즘이, 명확하게 T 세포 반응을 상승시키는 성능을 예측하도록 존재한다 (예로, Nielsen et. al., 2010, Immunology 130(3): 319-28). MHC 분자에 대한 펩티드 결합 친화도 예측에 의존하는 알고리즘은 본 발명의 맥락에서 적당하다. 설명적 목적으로, SVMHC, NetMHCⅡ, T에피토프/지지됨, 사이프페이티 (syfpeithi), 에피톨키트 등을 인용할 수 있다. 후보 펩티드의 수는 카세트에 의해 실제 발현되는 최종 펩티드의 수보다 더 많을 수 있다 (예를 들면, 제안되는 10개 내지 35개의 최종 펩티드를 갖기 위하여 수백 개의 후보 펩티드가 있을 수 있음).
단계 (a)는 상기 식별되고 순위가 매겨진 펩티드를 개별적으로 평가하고, 후보 펩티드를 선별한다. "후보"는 재조합 폭스바이러스를 생성하는데 적합한 것을 의미한다.
일 구현예에서, 후보 펩티드의 선별은 하나 이상의 판정기준을 기초로 하는 필터링 수단을 통해 수행된다. 이러한 단계에서, 처리 수단 (11) (도 2)은 관심있는 펩티드의 집합의 하나 이상의 하위집합을 작성한다. 이들 펩티드는 제거되어 아웃 목록에 배치될 수 있거나, 재조합 폭스바이러스를 생성하는데 적합한 것으로서 고려될 수 있다. 펩티드가 재조합 폭스바이러스를 생성하는데 적합한 것으로서 고려되는 경우, 상기 식별된 후보 펩티드는 제 1 하위집합 (최상의 (TOP) 목록) 또는 제 1 하위집합 (엑스트라 목록)에 배치하고, 여기서 상기 최상의 목록은 가장 높게 예측되는, 재조합 폭스바이러스를 생성하는 후보 펩티드의 최대의 수를 포함하고, 상기 엑스트라 목록은 남아있는 후보 펩티드를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 관심있는 펩티드의 집합 또는 입력 파일로부터 얻은 집합은 독립적으로 또는 추가적으로 막통과 (TM) 분절을 보유하는 이들의 성향에 상응하는 판정기준을 기초로 하여 필터링된다. 본원에 사용된 "TM 분절" 또는 "TM 도메인"은 대략 20개의 아미노산 잔기의 짧은 소수성 알파 나선인 것으로서 정의될 수 있다. 막통과 점수 ("TM 점수" 또는 "TMS")는 누적 합산 방법을 사용하여 전체 아미노산 서열에 대한 평가가능한 값으로 로칼 위상적 예측을 해석하도록 계산된 점수이다. 이것은 펩티드가 이의 서열 내의 적어도 하나의 TM 분절(들)을 제시하거나 형성하는 확률을 나타낸다 (즉, 내부의 TM). 유리하게, 이것은 0 (예측된 TM 도메인이 없음)부터 n * (n + 1) / 2까지 변화되고, n은 예측 도구에 의해 평가된 로칼 단편의 수이고, n * (n + 1) / 2는 n 요소의 누적합으로부터 나온 최대의 점수이다. TMS가 더 높을수록, 펩티드 서열이 TM 도메인을 제시하거나 형성할 확률이 더욱 중요하다. TM 점수는 TMHMM (막통과 숨은 마르코프 모델; Krogh et. al., 2001, J. Mol. Biol. 305: 567-80), DAS-TM 필터 알고리즘이 잠재적인 TM 분절의 위치가 획득될 수 있는 질문에 대한 고정밀 소수성 프로파일을 제공하는 DAS (밀집한 정렬 표면), 또는 막통과 도메인을 생산하는 성향에서 소수성 및 소수성 모멘트 간의 관계를 기초로 하고 (Eisenberg et. al., Nature, 1982년 9월 23일; 299(5881): 371-4), 소수성 및 소수성 모멘트 간의 상관성이 단백질 절편을 구형, 막통과형 또는 표재형으로서 정의하는 방법과 같은, 당업자에게 널리 공지되어 있는 다수의 예측 도구를 사용하여 결정될 수 있다.
전형적으로, TM 점수는 각 개별 펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하여 계산된다. 바람직하게, TM 점수 계산은 아이젠버그에 의해 정의된 바와 같이, 막통과 분절을 생산하는 성향에서 소수성 및 소수성 모멘트 간의 관계를 기초로 한다. TMS 계산은 바람직하게 11개 아미노산의 윈도우를 이론적인 단편 유형을 계산하는데 사용하는, 아이젠버그의 표준화된 척도를 기초로 한 (Eisenberg et. al., 1984, Annual review of biochemistry 53.1: 595-623) 막위치 (membpos) 함수를 사용하여 수행된다. 바람직하게, 상기 막위치 함수는 아미노산 서열 및 단백질 회전각을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 2가지 판정기준을 기초로 한다. 본 발명의 상기 양태에서, 불연속 값 "1"은 막통과형의 속성이고, 불연속 값 "0"는 구형 또는 표재형의 속성이다. 다음으로 TM 점수는 선형의 서열에서 TM 패치의 공간적 위치를 고려하는데 사용되는 "연속성 역치"를 포함하는 로칼 불연속 값의 누적 합계를 계산함으로써 전산화된다. 연속성 역치의 증가는 누적 계산에서 불연속 값 "0"의 발생을 허용한다. 상기 증가분 계산은 임의의 오차를 회피하도록 양방향으로 수행된다. 따라서, TM 점수는 TM 패치의 합계이다. 가장 높은 점수가 사용되고, TM 점수에 해당한다.
예를 들면, 펩티드 TVHHRIVGCSLAVICGVLYGSTFQVPIIYI에 대한 TMS는 O 및 1의 연속성 역치를 사용하여 계산되었다 (표 1). 연속성 역치 0을 사용하여, 계산된 TM 패치는 양방향으로 36_3_1이고, TM 점수는 40점이다. 연속성 역치 1을 사용하여, 계산된 TM 패치는 일 방향으로 36_8 (TM 점수는 = 44점)이고, 나머지 방향으로 36_7 (TM 점수는 = 43점)이다. 2가지 TM 점수가 상이하여 가장 높은 점수가 사용되고, 연속성 역치 1의 경우에 TM 점수는 44점이다. 이러한 예에서, 연속성 역치를 3 이상으로 확장시킴으로써, 로칼 패치는 전혀 고려되지 않고, TMS는 더 높아진다. 하기 표 1은 TMS 및 TM 패치 계산의 설명이다. H (소수성), uH (소수성 모멘트) 및 막위치 (예측된 위치)는 막위치 함수로부터 나온 결과이다. 역치가 너무 낮은 경우 TMS 계산의 방해를 초래할 수 있는 영역*.
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바람직한 구현예에서, 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법은 후보 펩티드의 제 1 하위집합 (최상의 목록)을 선별하는 단계로서, 상기 후보 펩티드는 TMS 역치 미만의 막통과 점수를 제시하는, 단계를 포함한다. 상기 방법은 펩티드가 TMA 역치를 초과하는 막통과 점수를 제시하는 경우 펩티드를 제거하는 단계 (아웃 목록), 및 제 1 하위집합으로 개시되거나 선택되지 않은 후보 펩티드로서 확인된 후보 펩티드 집합의 제 2 하위집합 (엑스트라 목록)을 선별하는 단계를 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 제 2 하위집합의 후보 펩티드는 역치 40점, 더욱 바람직하게 역치 30점 미만의 막통과 점수를 제시하고, 구체적으로 역치 25점이 선호된다 (예로, 바람직한 TM 점수의 역치: 24점, 23점, 22점, 21점, 20점, 19점, 18점, 17점, 16점, 15점, 14점, 13점, 12점, 11점, 10점 등).
설명적 목적으로, 아이젠버그 등에 의해 기재된 방법에 따라 결정된 바, 역치 25점 미만의 TM 점수를 갖는 관심있는 펩티드는 유지되고, 제 1 및 제 2 하위집합을 포함한 후보 펩티드의 집합에 배치된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 관심있는 펩티드의 집합 또는 입력 파일로부터 나온 펩티드는 독립적으로 또는 추가적으로 펩티드 사이의 재조합 사건을 제한하기 위하여 펩티드 서열 상동성에 상응하는 판정기준을 기초로 하여 필터링된다. 상동성은 펩티드 또는 단백질 사이의 아미노산 서열 일치도를 설명한다.
X개 이상의 일치하는 아미노산을 갖는 연속적인 영역을 보유하는 서열을 갖는 펩티드는 상동성인 것으로 고려되고, 여기서 X는 12, 더욱 바람직하게 11, 더욱 바람직하게 10, 더욱 바람직하게 9, 더욱 바람직하게 8, 더욱 바람직하게 7, 더욱 바람직하게 6, 훨씬 더 바람직하게 5이다. 이러한 상동성인 연속적인 영역을 갖는 펩티드 중에 단 하나의 펩티드가 유지되고, 상기 펩티드는 가장 높은 순위 점수 (예로, 예측된 면역원성 잠재력)로 선택된다. 유지되지 않는 펩티드는 제거되고, 아웃 목록에 배치된다. 예를 들면, 상동성인 5개 이상의 아미노산의 연속적인 서열을 갖는 3가지 펩티드를 포함하는 펩티드 목록에서, 가장 높은 면역원성 잠재력 순위 점수를 갖는 펩티드는 유지되고, 여기서 나머지 둘은 제거된다.
중복은 상동성의 특이적 경우이다. 이것은 주어진 펩티드에 존재하는 돌연변이 (예로, 주어진 신생펩티드의 종양 특이적 돌연변이)가 여러 에피토프의 일부일 때 또는 이들에게 다수의 HLA 유형의 점수가 주어질 때 일어날 수 있다. 바람직하게, 이러한 중복된 펩티드 중에 단 하나의 펩티드가 유지되고, 상기 펩티드는 가장 높은 면역원성 잠재력 순위 점수로 선택되며, 나머지 중복된 펩티드(들)은 제거된다.
바람직한 구현예에서, 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법은 후보 펩티드의 제 1 하위집합을 선별하는 단계로서, 상기 후보 펩티드는 상동성 역치 미만의 연속적인 영역을 제시하는, 단계를 포함한다. 바람직하게, 상동성 역치 5점 미만의 연속적인 영역을 제시하는 관심있는 펩티드는 유지되고, 제 1 및 제 2 하위집합을 포함한 후보 펩티드의 집합에 배치된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 선별 단계 (a)는 후보 펩티드의 제 1 하위집합을 선별하는 단계로서. 상기 후보 펩티드는 TMS 역치 미만 (예로, 25점 미만)의 막통과 점수를 제시하는, 단계를 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 단계 (a)의 상기 펩티드는 상동성 역치 (예로, 5점 미만)의 연속적인 영역을 제시한다. 바람직하게, 필터링 단계는 다음의 순서: (1) TMS 역치; (2) 상동성 역치로 순차적으로 수행된다.
따라서, 출력은 최대 3가지 목록이다 (바람직하게 각 목록은 여전히 이들의 면역원성에 따라 순위가 매겨질 것임).
1. 아웃 목록은 제거된 펩티드를 포함하고;
2. 최상의 목록은 재조합 폭스바이러스를 생성하는 후보 펩티드의 최대의 수를 포함하고, 상기 펩티드는 가장 높은 면역원성 예측 순위 점수를 갖으며 (제 1 하위집합);
3. 엑스트라 목록은 남아있는 적격한 후보 (제 2 하위집합)를 포함한다.
실제적으로, 단계 (a)는 전형적으로 먼저 TMS 역치를 초과하는 TM 점수를 제시하는 후보 (예로, 역치 25점 이상의 TM 점수를 갖는 후보) 및/또는 상동성인 영역을 갖는 후보 펩티드 (예로, 적격한 펩티드와 공통적인 5개 이상의 연속적 아미노산을 갖는 후보)를 제거한 다음 N개의 남아있는 후보 펩티드로부터 최대 Nmax개의 최상의 후보 펩티드를 제 1 하위집합으로서 선택하고 (여기서 Nmax는 재조합 폭스바이러스에 의해 발현되는 최대의 수의 펩티드, 예컨대 약 30개임).
그러나,
- 제 2 하위집합은 없을 수 있으며 (N < Nmax인 경우, 제 1 하위집합은 N개의 펩티드만을 포함함);
- 막통과 점수 및/또는 후보 펩티드의 펩티드 서열 상동성이 너무 높기 때문에 제 1 하위집합로 선별된 펩티드의 수가 Nmin개 펩티드 미만인 경우 (여기서 Nmin은 재조합 폭스바이러스를 생성하는 최소의 수의 펩티드, 예컨대 약 5개임), 재조합 폭스바이러스를 생성하는 것이 불가능하게 되고, 방법은 실패한다.
설계 방법의 단계 (b): 카세트간 배분
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 다수의 가능한 배분 중에 상기 제 1 하위집합으로부터 하나 이상의 발현 카세트(들)에 이르기까지 후보 펩티드의 최적의 배분을 결정하는 단계 (b)를 추가로 포함한다.
단계 (b)는 폭스바이러스 생성 및 생산에 위험이 될 수 있는 펩티드의 과부하로 인한 임의의 오차를 회피하기 위하여 각 발현 카세트에서 펩티드의 질과 양의 균형을 맞춘다 (도 4).
단계 (b)의 일 구현예에서, 단계 (a)에서 생성된 제 1 하위집합 (최상의 목록)의 선별된 펩티드는 펩티드 TM 점수 및 펩티드 수치요법 점수 (HS)를 기초로 하여 상이한 클래스로 분류된다. 구체적으로, 최상의 목록 하위집합의 펩티드는 바람직하게 3가지 클래스, "저" (L), "중" (M) 및 "고" (H)로 분류된다. 이러한 클래스는 (각 펩티드 단독으로) 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하지 않거나 생산하지 않는 위험을 말한다.
단어 "저", "중" 및 "고"는 상대적이고, 클래스가 최상의 목록 하위집합의 펩티드를 비교하도록 허용하는 점을 단지 표현하는 것으로 이해되어야 한다. 다른 말로 하면, L 펩티드 (L 클래스의 펩티드)는 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하는데 가장 취약하고, H 펩티드 (H 클래스의 펩티드)는 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하는데 가장 덜 취약하고, M 펩티드 (M 클래스의 펩티드)는 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하는데 L 펩티드보다 덜 취약하지만, 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하는데 H 펩티드보다 더욱 취약하다.
더욱 바람직하게, 최상의 목록의 펩티드는 이들의 TM 점수에 따라 (바람직하게 15점 미만) 순위가 매겨진다. 동등한 TM 점수의 경우에, 펩티드는 이들의 수치요법 점수에 따라 순위가 매겨진다. 주어진 펩티드 또는 펩티드 융합의 수치요법 점수는 상기 펩티드 또는 융합에 대해 결정된 수치요법 점수를 상기 펩티드 또는 상기 융합에 존재하는 잔기의 수로 나누기 함으로써 계산된다. 일반적인 방식으로, 주어진 펩티드의 수치요법 점수는 예를 들면 국제특허출원 제 WO 2018/234506호에 기재된 바와 같이, 상기 펩티드의 각 아미노산 잔기의 소수성/친수성 점수의 합계에 의해 결정되고, 펩티드 융합의 소수성은 상기 융합에 포함된 각 펩티드에 대해 결정된 소수성 점수의 합계에 해당한다. 기술적으로, 재조합 폭스바이러스에 의해 인코딩되는 하나 이상의 펩티드 또는 이들의 융합 펩티드의 아미노산 서열은 자연에서 친수성이다. 주어진 서열의 친수성 또는 소수성 특성은 당해 기술분야에서 사용가능한 많은 방법 및 알고리즘에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특이적 서열의 소수성 점수 및/또는 수치요법 점수를 계산하는 것은 당업자의 역량에 속한다. 예를 들면, 이러한 점수는 카이트/두리틀 방법 (Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-32), 임의의 다른 적합한 방법 (예로, 특히 Rose et. al., 1993, Ann. Rev. Biomol. Struc. 22: 381-415; Kallol et. al., 2003, J. Chromat. 1000: 637-55; Sweet et. al., 1983, J. Mol. Biol. 171: 479-88) 또는 알고리즘 (예로, 콜로라도주 또는 생물정보학 월드 등에 의해 개발된 엑스파시 프로트 스케일 프로테인; 단백질 소수성 플롯)을 사용하여 결정될 수 있다.
상기에 설명된 바와 같이 클래스를 결정하는 수준은 상대적이고, 관여된 특정한 역치가 없으며, 유리하게 각 클래스의 펩티드의 수 (L, M 및 H)는 단지 펩티드의 수 N의 함수이다.
바람직한 구현예에서, 각 클래스에 배분되는 각 클래스의 후보 펩티드의 수는 도 5에 제공된 표를 포함하나 이에 한정되지 않는 제 1 배분 표에 따른다. 이러한 도면에서, 보다 구체적으로 "펩티드의 Nb" 열은 각 재조합 폭수바이러스가 포함할 펩티드의 수를 표시한다 (본원에서, 펩티드의 수는 1개 및 30개 사이에 포함됨). 열 "클래스 당 총수"는 전체 재조합 폭스바이러스가 선택된 펩티드의 수 함수로서 발현할 각 클래스의 펩티드의 수를 나타낸다. 도 6은 펩티드 순위 매김 및 이들의 클래스의 결정의 예를 제공한다. 본원에서, 펩티드의 수는 30개이다. 도 5는 30개의 펩티드 중에는 6개의 H, 6개의 M 및 18개의 L 펩티드가 있음을 나타낸다. 30개의 펩티드는 이들의 TM 점수에 따라 순위가 매겨지고, 동등힌 TM 점수의 경우에 이들의 수치요법 점수에 따른다. 본원에서, 3개의 펩티드는 0점 초과의 TM 점수를 갖고, 이들은 H 클래스에 배치된다. 나머지 27개의 펩티드가 TM 점수 0점을 갖기 때문에, 이들의 수치요법 점수는 이들의 순위 매김을 위해 고려된다. 27개 펩티드의 경우에, 0.32 및 0.64 사이에 포함된 HS를 갖는 3개의 펩티드는 H 클래스에 배치되고, -0.21 및 0.07 사이에 포함된 HS를 갖는 6개의 펩티드는 M 클래스에 배치되고, -0.31 및 -0.25 사이에 포함된 HS를 갖는 18개의 펩티드는 L 클래스에 배치된다.
바람직한 구현예에서, 단계 (b)는 다수의 가능한 배분 중에 분류된 펩티드의 제 1 하위집합으로부터 상이한 발현 카세트에 이르기까지 ("카세트간 배분") 후보 펩티드의 최적의 배분을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. "배분"은 단순하게 각 선택된 펩티드에 대해, 카세트 내의 이들의 순서와 독립적으로 이러한 펩티드를 인코딩하는 카세트를 지정하는 것을 의미한다 ("카세트내 슬로트 배정"). 배분의 사전 설정은 최상의 제 1 하위집합의 총 후보 펩티드의 수 (N), 및 각 카세트에서 각 클래스로부터 나온 펩티드의 허용된 수를 기초로 한다.
"최적의" 배분은 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하지 않거나 생산하지 않는 가장 낮은 전반적인 위험을 갖는 배분을 의미하고, 이러한 최적의 배분에 도달하기 위한 판정기준은 하기에 설명될 것이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 카세트의 수는 제 1 하위집합의 선별된 펩티드의 수 함수로서 결정되고, 전형적으로 제 1 하위집합이 적어도 15개의 펩티드를 포함하는 경우 3가지 카세트 (카세트 당 적어도 5개), 제 1 하위집합이 10개 내지 14개의 펩티드를 포함하는 경우 2가지 카세트 (카세트 당 5개 내지 7개), 제 1 하위집합이 10개 미만의 펩티드를 포함하는 경우 (단 선택된 펩티드의 최소의 수가 설명된 바와 같은 경우, 전형적으로 5개 펩티드) 1가지 카세트 (카세트 당 적어도 5개)이다. 1가지 카세트의 경우, 배분이 평범하고, 2가지 카세트의 경우는 각 펩티드에 대해 단지 이분적 선택이 되어, 조합의 수가 낮게 유지되고 이들 모두가 시도될 수 있다. 3가지 카세트의 경우에, 조합의 수는 극도로 증가되어, 방법은 바람직하게 단지 배치, 즉 가능한 조합의 주어진 최대의 수의 반복 ("iter")을 통해 작동하고, 상기 최대의 수는 한 번에, 즉 30초와 같은 허용가능한 처리 시간 내에 다룰 수 있는 가능한 후보 펩티드 배분 (예를 들면, 가능한 후보 펩티드 배분 모두 중에 무작위로 선택됨)의 가장 높은 수를 정의한다. 다른 말로 하면, 다수의 가능한 배분 중에 상기 가능한 배분의 최대의 수의 반복에서 제 1 하위집합으로부터 발현 카세트(들)에 이르기까지 상기 후보 펩티드의 최적의 배분을 결정하도록 시도된다.
이러한 최대의 수는 서버 1의 처리 수단 11의 자원 (즉, 전산화 성능)의 함수이다. 실제로, 처리 수단 11이 더 강력할수록, 조합은 더 신속하게 처리될 수 있다. 전형적인 데스트탑 컴퓨터 (최대 4 GB의 램을 갖는 2-코아, 4-트레드 CPU)의 경우, 상기 주어진 수는 전형적으로 15,000개의 배치이다 (처리 시간: 28,9초). 본원에서 선호되는 장비인 전문적인 서버 (24 GB의 램을 갖는 8-코아, 16-트레드 CPU)의 경우, 상기 최대의 수는 전형적으로 30,000개의 배치이다 (처리 시간: 20.7초). 슈퍼컴퓨터 (136 GB의 램을 갖는 56-트레드 CPU)의 경우, 상기 최대의 수는 최대 60,000개의 배치일 수 있다 (처리 시간: 42.4초). 다음의 설명에서, 본 발명자들은 최대의 수로서 30,000개 배치의 바람직한 예를 다룰 것이다.
이러한 배치로 전혀 만족하지 못하는 경우에 (하기 참조), 적어도 제 2의 반복 (즉, 추가의 배치의 주어진 최대의 수 - 예를 들면 30,000개)이 시도된다. 반복을 통한 처리는 일반적으로 3가지 카세트의 경우에 일어나지만, 실제로 방법은 가능한 조합이 주어진 수 n개보다 적은 경우 한 번의 반복으로 모든 가능한 배치를 처리할 수 있는 점을 주목한다. 다른 말로 하면, 단계 (b)는 바람직하게 가능한 배분의 수 (상기 다수의 가능한 배분의 크기)를 상기 최대의 수와 비교하는 단계를 포함하고, 가능한 배분의 수가 상기 최대의 수를 초과하는 경우에, 다수의 가능한 배분 중에 상기 최대의 수의 가능한 배분의 선택 (구체적으로 무작위 선택)에서 상기 제 1 하위집합으로부터 상기 발현 카세트(들)에 이르기까지 상기 후보 펩티드의 최적의 배분을 결정하도록 반복적으로 시도한다.
바람직하게, 각 카세트에 배분된 후보 펩티드의 수는 배분 표에 따르고, 예를 들면 도 5를 참조한다. 상기 표는 또한 유리하게 서버 1의 저장 수단 12에 의해 저장된다. 설명된 바와 같이 도 5의 표에 따르면, 선택된 펩티드의 수가 3으로 나눌 수 있는 경우에, 각 카세트는 동일한 수의 펩티드를 수용할 것이고, 이외에도 2가지 카세트 사이에는 최대 하나의 펩티드가 상이할 것이다. 예를 들면, 26개의 펩티드, 26개 ≥ 15개의 경우에, 3가지 카세트가 사용되어 제 1 및 제 2 카세트에서 9개의 펩티드 및 제 3 카세트에서 8개의 펩티드를 갖는다.
또한, 도 5의 표는 각 클래스 (L, M 또는 H)의 펩티드의 수 (n)를 정의하고, 각 카세트 (A, B 및 C)는 카세트에 배분된 펩티드의 수 함수로서 포함할 것이다. 예를 들면, 펩티드가 13개인 경우 제 1 카세트는 3개의 L 펩티드, 2개의 M 펩티드 및 2개의 H 펩티드를 포함하는 7개의 펩티드를 발현할 것이고, 제 2 카세트는 2개의 L 펩티드, 2개의 M 펩티드 및 2개의 H 펩티드를 포함하는 6개의 펩티드를 발현할 것이다. 전반적으로 오른쪽 열에 제시된 바와 같이, 폭스바이러스는 5개의 L 펩티드, 4개의 M 펩티드 및 4개의 H 펩티드를 포함할 것이다.
더욱 바람직한 구현예에서, 단계 (b)는 각 배치에 대한 및 융합 수치요법 역치 (HSK7Thresh)와 비교한 각 발현 카세트의 내용물의 수치요법 점수 ("발현 카세트의 수치요법 점수" 또는 간단히 "융합 수치요법 점수"로도 명명됨)를 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 수치요법 역치는 0.2 이하, 바람직하게 0.19 미만, 바람직하게 0.18 미만, 바람직하게 0.17 미만, 바람직하게 0.16 미만, 훨씬 더 바람직하게 0.15 미만이다. 각 발현 카세트의 내용물은 배치에 있는 카세트에 배분된 후보 펩티드(들)를 말한다. 카세트의 수치요법 점수는 단지 이러한 카세트가 포함하는 후보 펩티드(들)에 의해, 이들의 순서 (이 단계에서 아직 정의되지 않음)와는 상관없이 정의되는 것으로 이해되어야 한다.
적어도 하나의 발현 카세트가 상기 역치 초과의 수치요법 점수를 제시하는 경우, 해당하는 배치로 만족되지 않아 제거된다.
모든 배치가 제거된 경우,
- 본 발명자들이 반복을 통해 작업하는 경우 (즉, 가능한 배분의 수가 주어진 최대의 수를 초과함), 설명된 바와 같이 적어도 한 번의 추가의 반복, 다른 말로 하면 다수의 가능한 배분 중에 상기 가능한 배분의 최대의 수의 새로운 선별이 시도될 수 있으며,
- 이외에도, 또는 충분한 반복이 이미 시도된 경우 (예를 들면, 세 번째 반복), 가장 높은 수치요법 점수를 갖는 개별 펩티드가 제거되고 (아웃 목록에 배치됨), 바람직하게 존재하는 경우 제 2 하위집합 (엑스트라 목록)으로부터의 첫 번째 펩티드로 교체된다. 엑스트라 목록이 없는 경우에, 배치의 생성이 N-1 펩티드를 갖는 최상의 목록으로부터 다시 수행된다. 다음으로 단계 (b)는 (가능하게는 다시 반복을 통해) 반복된다.
적어도 하나의 배치로 만족하는 경우에, 상이한 발현 카세트 사이에 수치요법 점수의 가장 낮은 범위를 갖는 배분이 선택된다. "범위 (R)은 배치의 적어도 2가지 발현 카세트의 수치요법 점수 사이의 가장 높은 간격, 즉 (HSK7)max - (HSK7)min을 의미한다. 범위가 진정으로 낮은 경우 (예를 들면, 도 4에 나타낸 바와 같이 역치 범위 미만 (RThresh), 보통 0.005로 설정됨), 이러한 "낮은 범위"를 갖는 다수의 상이한 배치가 고려될 수 있고, 즉 카세트 당 후보 펩티드의 하나 이상의 최적의 배분이 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 다수의 가능한 배분 중에 상기 제 1 하위집합으로부터 발현 카세트(들)에 이르기까지 후보 펩티드의 최적의 배분을 결정하는 단계를 포함하고, 적어도 2가지 발현 카세트의 수치요법 점수 사이의 가장 낮은 범위를 제시한다.
설계 방법의 단계 (c): 카세트내 슬로트 배정
도 7에 상술된 단계 (c)에서, 처리 수단 11은 각 발현 카세트에 대해, 카세트 슬로트 점유 규칙의 함수로서 후보 펩티드의 최적의 슬로트 배정을 결정하고, 여기서 상기 후보 펩티드는 단계 (b)에서 기술된 바와 같이 발현 카세트에 배분된다. 카세트 내의 후보 펩티드의 "슬로트 배정"은 발현 카세트에서 펩티드의 순서를 의미한다. 다른 말로 하면, 카세트의 각 "슬로트"에 대해 펩티드는 이 카세트에 배분되는 펩티드 중에 선택된다.
"최적의" 슬로트 배정은 다시 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하지 않거나 생산하지 않는 가장 낮은 전반적인 위험을 갖는 배정을 의미하고, 이러한 최적의 슬로트 배정에 도달하기 위한 판정기준은 하기에 설명될 것이다.
막통과 도메인을 생성할 위험은 각 카세트에 대해 슬로트 점유 규칙으로 모든 가능한 펩티드 조합을 생성함으로써 평가될 수 있다. 실제로 TM 분절은 2개의 특정한 펩티드의 연결부 (펩티드간 TM)에 의해 생성될 수 있는 것으로 관찰되었다. 이러한 경우에, 융합에서 펩티드의 순서를 변경하는 것은 TM의 존재를 제거하는 옵션이다. 예를 들면, TM 분절이 펩티드 2의 N-말단에서 펩티드 1의 융합으로부터 생성되는 경우, 펩티드를 역전시키는 것 (펩티드 1의 N-말단에서 펩티드 2의 융합)은 TM 분절을 갖을 위험을 없앨 수 있다. 따라서, 이러한 단계는 개별 펩티드의 모든 조합을 수행하여 융합 단백질을 형성한다.
바람직한 구현예에서, 단계 (c)는 펩티드의 막통과 점수에 따라 및 동등한 막통과 점수의 경우에는 이들의 수치요법 점수에 따라, 카세트 내의 펩티드의 가능한 슬로트 위치를 정의하는 카세트 슬로트 점유 규칙을 기초로 하여 각 발현 카세트에 대한 후보 펩티드의 최적의 슬로트 배정을 결정한다. 더욱 바람직하게, 발현 카세트에 배분된 후보 펩티드는 임의의 재조합 폭스바이러스를 생성하지 않거나 생산하지 않는 위험의 적어도 3가지 클래스에 따라 분류되고, 여기서 상기 카세트 슬로트 점유 규칙은 카세트의 각 슬로트 위치에 대해, 이러한 슬로트 위치에 배정되어야 할 후보 펩티드의 클래스를 정의한다.
"슬로트 점유 규칙"은 단계 (b)에서 정의된 바와 같은 막통과 및 수치요법 점수를 기초로 하여 펩티드 클래스, "저" (L), "중" (M) 및 "고" (H)에 따라 카세트 내의 펩티드의 슬로트 위치를 정의하는 규칙을 의미한다.
"카세트 슬로트 점유 규칙"은 가능한 조합의 수를 감소시키는 현명한 방식이다. 실제로, 10개 펩티드의 카세트의 경우, 10!가지, 즉 3.6백만 개 이상의 가능한 카세트내 슬로트 배정이 있다.
개념은 이러한 저, 중 및 고 클래스에 따라 슬로트를 선택하여 가능한 조합의 수를 제한하면서 총 TM 점수를 최소화하는 것이다. 실제로, 각 펩티드는 가능한 슬로트의 감소된 수를 갖고, 가능한 조합의 수를 상당히 감소시킨다.
도 8a 및 도 8b는 슬로트 점유 규칙의 2가지 가능성을 나타낸다. 예를 들면, 도 8a는 H 펩티드가 바람직하게 융합의 말단 (카세트 내부의 TM을 만들 위험이 없음)에 및 제 3 슬로트 (나머지 H 펩티드와 분리됨)에 배치되는 것을 보여준다.
단계 (b)에서 개발된 N = 13의 예를 추적하기 위하여, 도 8b는 제 1 카세트 (7개의 펩티드)에서 3개의 저 클래스 펩티드가 슬로트 Ⅱ, Ⅳ 및 Ⅵ에 배치되고, 3개의 중 클래스 펩티드가 슬로트 Ⅰ 및 Ⅴ에 배치되고, 2개의 고 클래스 펩티드가 슬로트 Ⅲ 및 Ⅶ에 배치되고; 제 2 카세트 (6개의 펩티드)에서 2개의 저 클래스 펩티드는 슬로트 Ⅱ 및 Ⅳ에 배치되고, 2개의 중 클래스 펩티드는 슬로트 Ⅰ 및 Ⅴ에 배치되고, 2개의 고 클래스 펩티드는 슬로트 Ⅲ 및 Ⅵ에 배치되는 것을 나타낸다. 제 1 카세트의 경우 3!×2!×2! = 24의 가능한 조합만이 있고 (7! = 5040을 대신함), 제 2 카세트의 경우 2!×2!×2! = 8의 가능한 조합이 있는 (6! = 720을 대신함) 점을 주목한다. 심지어 카세트에서 10개 펩티드 (첫 번째 줄)의 최악의 경우에 6!×2!×2! = 2880의 가능한 조합이 3.6백만 개를 대신하여 존재한다.
바람직한 구현예에서, 단계 (c)에서 생성된 각 조합은 재조합 바이러스의 생성 및 생산을 손상시킬 TM 도메인을 생성할 위험에 대해 평가된다. 보다 구체적으로, 이 단계는 각 펩티드 융합에 대한 TM 패치를 계산하는 것, 상기 TM 패치를 역치와 비교하는 것, 및 상기 역치 초과의 점수를 갖는 적어도 하나의 TM 패치를 드러내는 임의의 융합을 제거하는 것을 포함한다. 훨씬 더 구체적으로, 이 단계는 각 펩티드 융합에 대한 TM 패치를 계산하는 것, 상기 TM 패치를 펩티드 융합 TMS 역치 (TMSK7)와 비교하는 것, 및 TMSK7 초과의 점수를 갖는 적어도 하나의 패치를 드러내는 임의의 펩티드 융합을 제거하는 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 TM 패치는 융합 TMS 역치 60점 이하이고, 더욱 바람직하게 역치 50점이고, 구체적으로 역치 40점이 선호된다 (예로, 바람직한 TM 패치의 역치: 40점, 39점, 38점, 37점, 36점, 35점, 34점, 33점, 32점, 31점, 30점 등).
모든 펩티드 융합이 제거된 경우, 다음으로 카세트내 슬로트 배정은 카세트간 배분 단계를 통과하였던 다음 순서의 펩티드 배치로 수행하여야 한다. 다른 배치가 사용가능한 경우에, 단계 (b)에서 제안된 것과 유사하게, 가장 높은 막통과 점수를 갖는 펩티드는 유리하게 최상의 목록으로부터 제거되고, 엑스트라 목록으로부터의 첫 번째 펩티드로 대체된다. 다음으로 최상의 목록은 이전의 단계 (b)에서 재처리된다. 엑스트라 목록이 없는 경우에, 최상의 목록이 남아있는 요소 (N-1)로 사용된다.
모든 펩티드 융합이 TMSK7 역치를 만족시키는 경우에, 전반적인 TMS는 전산화되고, 다음으로 각 펩티드 융합에 대한 최상의 조합은 상기 전반적인 TMS를 기초로 하여 순위가 매겨진다. 바람직한 구현예에서, 단계 (c)는 가장 낮은 TM 점수를 갖는 펩티드 융합의 선별을 포함한다.
설계 방법의 단계 (d): 역번역
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 재조합 폭스바이러스에 삽입되는 적어도 하나의 발현 카세트(들)를 포함하는 DNA (핵산 분자) 전달 서열을 결정하는, 소위 "역번역" 단계 (d)를 추가로 포함한다 (도 9). 바람직하게, DNA 전달 서열은 재조합 폭스바이러스의 생성을 용이하게 하는 요소 (예로, 제한효소 부위 및/또는 재조합 팔)도 포함할 수 있다.
이러한 기능은 코돈 최적화된 융합 단백질을 인코딩하는 각 발현 카세트를 (아미노산부터 뉴클레오티드 서열까지) 역번역시키고, 이들을 재조합 폭스바이러스를 생성하는데 사용될 플라스미드 (즉, 트랜스퍼 플라스미드)를 생산하는데 요구된 미리 정의된 DNA 골격 내로 삽입시킨다. 이러한 최종 DNA 서열은 "전달 서열"로 불린다.
출력 (구체적으로 인터페이스 13)은 유리하게, 플라스미드 합성 외부업체로 보내는 예를 들면 FASTA 형식으로 파일 내에 기록된 독특한 전달 서열이다. 이러한 전달 서열을 생성하는 단계 (d)는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 자세하게 논의되지 않을 것이다.
역번역 단계 (d)는 맞춤 재단되어 최적화되고, 하나 이상의 펩티드 융합 (들)의 발현에 유용하며, 중간 클로닝 단계, 재조합 폭스바이러스 게놈 내의 삽입 부위(들) 및 재조합 폭스바이러스의 생성을 고려하는 다양한 특징에 관한 최적의 DNA 서열을 제공할 수 있다 (plasmidFeatures.yml 입체구조 파일에 의한 설계).
일 구현예에서, 각 펩티드 융합은 "가장 빈번한" 코돈 용법에 따라 DNA로 역번역되고, 이의 예상된 삽입 부위에서 DNA 전달 서열의 도안에 이식된다. 다음으로 JSON 형식의 파일은 역번역 이후에 기록된다. 이것은 최적화되지 않은 전달 서열, 최적화되어야 하는 영역의 좌표를 포함하고, 정보는 plasmidFeatures.yml 입체구조 파일의 "custMots" 섹션을 형성한다. 다음으로 코돈 최적화 단계는 각 발현 카세트에 대해 수행된다 (예로, 진옵티마이저TM 도구를 사용함; 써모피셔사). 다음으로 최적화된 서열은 다시 작동 디렉토리로 도입되고, 전달 서열 골격 내에 재이식된다. 이러한 단계는 주어진 PMY ID의 전달 서열 어셈블러 (TransferSeqAssembler) 기능을 전개시킬 TSAssembler.sh 스크립트를 사용하여 수행된다.
최적화된 코돈 특징에 추가하여, 이 파일은 또한 "custMots" (맞춤 동기) 섹션 하에 서열 최적화 공정에 관한 정보를 포함한다. 또한, 최적화는 발현 수준에 부정적으로 영향을 줄 것으로 예상되는 집중된 영역 및/또는 "음성" 서열에 존재하는 최적이 아닌 드문 코돈 클러스터를 억압함으로써 수행될 수 있다. 이러한 음성 서열 요소는 매우 높은 (> 80%) 또는 매우 낮은 (< 30%) GC 함량; AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 스트레치; 불안정한 직렬 또는 역전된 반복서열; 내부의 숨은 조절 서열 (예컨대 내부 TATA 박스, 카이 부위, 리보좀 진입 부위 및/또는 스플라이싱 공여체/수여체 부위) 및/또는 5TNT 서열 (TTTTT{N}T)을 갖는 영역을 포함하나 이에 한정되지 않는다..
또 다른 구현예에서, 파일은 또한 펩티드 융합(들)의 최적의 발현에 적합한 조절 요소, 구체적으로 프로모터 및 폴리 A를 도입하여 본원에 기재된 기능적인 발현 카세트(들)를 생성한다.
또 다른 구현예에서, 파일은 또한 DNA 전달 서열에 이러한 DNA 전달의 후속적인 클로닝 및 본원에 기술된 재조합 폭스바이러스의 생성에 유용한 추가적인 요소를 도입할 수 있다. 바람직하게, 이러한 추가적인 요소는 후속적인 클로닝 단계를 허용하는 적당한 제한효소 부위를 포함한다. 바람직하게, 이러한 제한효소 부위는 각 발현 카세트 및/또는 DNA 전달 서열의 5' 및 3'에 위치한다. 바람직하게, 이러한 제한효소 부위는 펩티드 융합 인코딩하는 핵산 서열 내에 존재하지 않는다.
추가의 구현예에서, 파일은 또한 DNA 전달 서열에 폭스바이러스 게놈의 선택된 삽입 부위에 적응된 재조합 팔을 도입할 수 있다. 바람직하게, 부모 게놈에서 삽입 부위의 양쪽 측면 상에 존재하는 서열에 상동성인 (예로, 90% 내지 100% 일치함) 폭스바이러스 서열의 스트레치에 해당하는 2개의 재조합 팔은 하나 이상의 발현 카세트(들)의 5' 및 3' DNA 전달 서열에 도입된다. 재조합 팔의 길이는 달라질 수 있다. 바람직하게, 각 재조합 팔은 상동성 폭스바이러스 서열 중 적어도 150 bp, 바람직하게 적어도 200 bp, 더욱 바람직하게 적어도 300 bp, 훨씬 더 바람직하게 적어도 300 bp 내지 600 bp를 포함하고, 구체적으로 350 bp 내지 500 bp (예로, 대략 350 bp 또는 500 bp) 또는 300 bp 내지 400 bp가 선호된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법으로서, 상기 재조합 폭스바이러스는 하나 또는 다수의 펩티드 융합의 발현 각각을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 방법은 서버 1의 처리 수단 11에 의해
(a) 후보 펩티드의 제 1 하위집합을 선별하는 단계로서, 상기 펩티드는 TMS 역치 미만의 막통과 점수를 제시하는, 단계;
(b) 다수의 가능한 배분 중에 상기 제 1 하위집합으로부터 발현 카세트(들)에 이르기까지 후보 펩티드의 최적의 배분을 결정하는 단계로서, 상기 최적의 배분는 적어도 2가지 발현 카세트가 있는 경우 적어도 2가지 발현 카세트의 수치요법 점수 사이의 가장 낮은 범위를 제시하는, 단계;
(c) 각 발현 카세트에 대해, 카세트 슬로트 점유 규칙의 함수로서 후보 펩티드의 최적의 슬로트 배정을 결정하여 가장 낮은 TM 점수를 갖는 펩티드 융합을 선택하는 단계; 및
(d) 상기 재조합 폭스바이러스의 생성을 위한 하나 이상의 발현 카세트(들)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 전달 서열을 결정하는 단계
를 수행하는 것을 포함한다.
재조합 폭스바이러스의 생성
제 2 양태에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 재조합 폭스바이러스를 제조하는 방법을 설명하고 있다. 이러한 두 번째 방법은 상기 재조합 폭스바이러스를 설계하는 제 1 양태에 따른 방법을 수행한 다음 (설계된 바와 같은) 상기 재조합 폭스바이러스를 생성하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 이러한 재조합 폭스바이러스를 생성하는 단계는 첫 번째 방법의 단계 (d)에서 획득된 DNA 전달 서열을 포함하는 DNA 트랜스퍼 플라스미드의 생성, 및 가능하게 재조합 폭스바이러스의 제조와 함께 상기 펩티드 발현하는 재조합 폭스바이러스의 생성을 포함한다.
재조합 폭스바이러스를 제작하는 일반적인 조건은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들면, 국제특허출원 제 WO 2018/234506호; 제 WO 2007/147528호; 제 WO 2010/130753호; 제 WO 03/008533호; 미국 특허 제 US 6,998,252호; 제 US 5,972,597호; 및 제 US 6,440,422호 참조). 전형적으로, DNA 전달 서열은 트랜스퍼 플라스미드에 클로닝되고, 재조합 폭스바이러스는 바이러스 게놈 내의 삽입 부위에 적응된 재조합 팔로 5' 및 3'에서 연접된 펩티드 발현 카세트(들)를 포함하는 상기 트랜스퍼 플라스미드 사이의 상동성 재조합에 의해 생성된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 트랜스퍼 플라스미드를 생성하는 단계 (예로, 통상적인 분자생물학 방법에 의함) 및 상기 트랜스퍼 플라스미드를 적합한 숙주 세포 내로, 명확하게는 폭스바이러스 게놈 (즉, 부모 바이러스)과 함께 도입하는 단계를 포함한다. 변형된 폭스바이러스를 생성하도록 허용하는 상동성 재조합이 바람직하게 적절한 숙주 세포 (예로, HeLa 또는 CEF 세포)에서 수행된다. 바람직하게, 트랜스퍼 플라스미드는 숙주 세포 내로 형질감염되기 이전에 직선화되고, 부모 바이러스는 바람직하게 감염에 의해 도입된다.
부모 폭스바이러스는 야생형 폭스바이러스 또는 용어 "폭스바이러스"와 연결하여 상기 기술된 변형된 (예로, 약화된) 폭스바이러스일 수 있다. 다음으로 삽입은 직선화된 트랜스퍼 플라스미드로의 증식허용 세포의 형질감염 및 부모 폭스바이러스로의 감염을 요구하는, 부모 게놈 및 직선화된 트랜스퍼 플라스미드 둘 다에 존재하는 상동성인 서열의 스트레치 사이의 상동성 재조합에 의해 수행된다.
단계 (d)에서 생성된 DNA 전달 서열은 독립적으로 폭스바이러스 게놈의 임위에 삽입될 수 있다. 다양한 삽입 부위는 예로 폭스바이러스 게놈의 필수적이지 않은 바이러스 유전자, 유전자간 영역 또는 비-코딩 부분에서 고려될 수 있다. 종양용해성 백시니아 바이러스의 경우, (TK 인코딩하는) J2R 유전자좌는 구체적으로 본 발명의 맥락에서 적절하며, 재조합 팔은 폭스바이러스 게놈 내로 DNA 전달 서열의 삽입 시 J2R 유전자좌를 적어도 부분적으로 결실시켜 TK 결함성 재조합 폭스바이러스를 생성하도록 설계된다. 추가적으로 또는 TK 삽입과는 독립적으로, 적절한 재조합 팔을 사용하여 RR 결함성 재조합 폭스바이러스를 생성하는 (RR 인코딩하는) 14L 유전자좌 내의 삽입도 고려할 수 있다. MVA의 경우, 결실 Ⅲ 및/또는 결실 Ⅱ은 구체적으로 하나 이상의 발현 카세트(들)의 삽입에 적응된다. 본 발명의 맥락에서 폭스바이러스 게놈 내 또는 상이한 부위 (예로, WR 또는 코펜하겐 백시니아 바이러스의 경우 TK 및 RR, 또는 MVA의 경우 결실 Ⅱ 및 Ⅲ) 내의 동일한 삽입 부위에서 하나 이상의 발현 카세트(들)를 삽입하는 것을 고려할 수 있다.
특정 구현예에서, 재조합 폭스바이러스의 확인은 선별 및/또는 검출가능한 유전자의 사용에 의해 용이하게 될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 트랜스퍼 플라스미드는 구체적으로 선별 배지에서 성장을 (예로, 마이코페놀산, 크산틴 및 하이폭산틴의 존재 하에) 허용하는 GPT 유전자 (구아닌 포스포리보실 전이효소를 인코딩함)가 선호되는 선별 마커을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 재조합 폭스바이러스를 생성하는 단계는 펩티드 발현 카세트(들)를 위해 선택된 삽입 부위에 클로닝되는, 검출가능한 유전자 산물을 인코딩하는 리포터 유전자, 명확하게는 형광성 리포터 유전자를 포함하는 부모 폭스바이러스의 사용을 포함한다. 바람직하게, 리포터 유전자는 증식허용 세포 내에서 이의 발현을 허용하는 프로모터, 예로 백시니나 프로모터의 전사 조절 하에 배치된다. 이러한 구현예는 부모 폭스바이러스와 관련하여 재조합 폭스바이러스의 선별을 용이하게 한다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 형광성 리포터의 대표적인 예는 GFP (녹색 형광성 단백질), eGFP (증진된 녹색 형광성 단백질), AmCyan 1 형광성 단백질 및 mCherry를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, mCherry (587　nm 및 610　nm에서 흡수/방출 피크를 갖는 디스코소마 버섯으로부터 기원한 단량체 형광성 단백질)에 의존할 때, mCherry 인코딩 서열을 대신하여 펩티드 인코딩하는 핵산 분자(들) 또는 발현 카세트(들)를 삽입하였던 재조합 바이러스는 흰색 플라크를 발생시키는 반면, mCherry 발현 카세트를 보유하는 부모 바이러스는 적색 플라크를 발생시킬 것이다. 재조합 폭스바이러스의 선별은 직접적 영상화 (재조합 폭스바이러스의 경우 흰색 플라크, 반면 부모 바이러스는 적색으로 보임)에 의할 수 있거나, APC (알로피코시아닌) 태그화 항-백시니아 바이러스 항체를 사용한 표지화 이후에 FACS와 같은 선별 수단에 의해 또한 촉진될 수 있다. 매우 다양한 항-백시니아 항체가 시판하는 공급업체로부터 입수가능하다.
재조합 폭스바이러스를 생성하는 단계는 리포터 (예로, mCherry) 뉴클레오티드 서열에서 적어도 하나의 이중가닥 파손을 생성할 수 있는 엔도뉴클레아제에 의한 추가 절단 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 엔도뉴클레아제는 폭스바이러스 게놈은 절단하지 않는다. 상기 엔도뉴클레아제는 단백질 형태이거나 발현 벡터에 의해 발현될 수 있다. 적합한 엔도뉴클레아제는 바람직하게 아연 핑커 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 군집된 규칙적 간격의 짧은 팰린드롬 반복서열 (CRISPR)/Cas9 뉴클레아제 및 형광성 리포터 유전자 내의 독특하게 절단되는 제한효소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바이러스 편집화를 위한 CRISPR/CAS9 시스템의 용도는 당해 기술분야에 기재되어 있으며 (Yuan et. al., 2015, J. Virol. 89, 5176-9; Yuan et. al., 2016, Viruses 8: 72, doi:10.3390), 핵 국소화 신호가 없는 Cas9를 인코딩하는 플라스미드뿐만 아니라 적합한 가이드 RNA의 사용을 요구한다. 이러한 연구에서, 부모 바이러스로의 감염에 추가하여, 증식허용 세포는 트랜스퍼 플라스미드, Cas9 발현하는 플라스미드 및 가이드 RNA (예로, mCherry 표적화된 가이드 RNA)로 형질감염될 수 있다.
재조합 폭스바이러스의 선별은 다음으로 육안으로 (이론상 재조합 폭스바이러스에 해당하는 흰색 플라크의 직접적 단리, 반면 채색된 플라크는 부모에 해당하고, 색상은 리포터 유전자에 의존함) 또는 통상적인 선별 수단 (선택적으로 상기에 기술된 적절한 항체를 사용한 표지화 단계 이후에 FACS)을 사용하여 수행된다.
일반적으로, 설계 방법이 없는 통상적인 기법으로는 낮은 백분율의 흰색 플라크가 획득되고 (약 1%), 50개 내지 100개의 부모 바이러스에 대해 약 1개의 재조합 폭스바이러스가 획득되는 반면 (약 1% 내지 2%), 본 발명의 방법은 흰색 플라크의 존재 증가 및 재조합 폭스바이러스의 수 증가에 의해 반영되는 바와 같이, 재조합 폭스바이러스의 생성을 증가시킨다. 바람직하게, 상기 재조합 폭스바이러스를 생성하는 방법은 적어도 2%, 바람직하게 적어도 3%, 더욱 바람직하게 적어도 4%의 흰색 플라크, 및 적어도 50%, 바람직하게 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 70%, 훨씬 더 바람직하게 80%의 재조합 폭스바이러스의 수율에 도달하도록 허용한다.
재조합 폭스바이러스는 다음으로 이와 같이 생성된 흰색 플라크의 분석 단계에 의해 확인되어 (바람직하게, PCR에 의한 분석) 폭스바이러스 게놈에서 발현 카세트(들)의 삽입을 검증할 수 있다.
재조합 폭스바이러스의 제조
일단 본 발명의 방법에 의해 생성되면, 재조합 폭스바이러스는 통상적인 기법을 사용하여 생산/증폭될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 상기 재조합 폭스바이러스를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 제조 단계는 적합한 생산자 세포에서 적합한 규모로의 증폭 단계, 세포 배양물로부터 생산된 재조합 폭스바이러스의 회수 단계 및 회수된 재조합 폭스바이러스의 선택적인 정제 단계를 포함한다. 이러한 단계는 당해 기술분야에서 통상적이다 (예로, 국제특허출원 제 WO 2007/147528호 또는 제 WO 2018/234506호 참조).
간략하게, 증폭 단계는 생산자 (예로, 증식허용) 숙주 세포의 배양, 배양된 생산자 숙주 세포의 감염, 및 재조합 폭스바이러스 (예로, 감염성 바이러스 입자)의 생산을 허용하도록 적합한 조건 하에 감염된 숙주 세포의 배양을 포함한다. 생산자 세포의 선택은 증폭될 재조합 폭스바이러스의 유형에 의존한다. MVA는 엄격하게 숙주가 제한되고, 전형적으로 조류 세포, 일차 조류 세포 (예컨대 수정된 계란으로부터 획득된 닭 배아로부터 제조된 닭 배아 섬유모세포 (CEF)), 또는 예로 오리 TERT 유전자 (예로, 국제특허출원 제 WO 2007/077256호, 제 WO 2009/004016, WO2010/130756호 및 제 WO 2012/001075호 참조)를 갖는 불멸화된 조류 세포주 상에서 증폭되거나; 성장인자 및 사료층으로부터 점진적인 단절에 의해 배아 세포로부터 획득된다 (예로, Olivier et. al., 2010, mAbs 2(4): 405-15에 기재된 Eb66). 다른 백시니아 바이러스 또는 다른 폭스바이러스 균주의 경우, 조류 일차 세포 (예컨대 CEF) 및 조류 세포주에 추가하여, 많은 다른 비-조류 세포주도 HeLa (ATCC-CRM-CCL-2TM 또는 ATCC-CCL-2.2TM) 세포와 같은 인간 세포주를 포함하여 생산에 사용가능하다 (예로, 국제특허출원 제 WO 2010/130753호 참조).
생산자 세포는 바람직하게 동물 또는 인간 기원의 산물이 없는 화학적으로 정의된 배지를 사용하여, 동물- 또는 인간 유래한 산물이 없는 배지에서 배양된다. 이러한 배지는 시판되어 입수가능하다 (예로, VP-SFM 배지 (인비트로겐사)가 CEF를 배양하는데 적절함). 생산자 세포는 바람직하게 감염 이전에 30℃ 내지 38℃에 포함된 온도 (더욱 바람직하게 약 37℃)에서, 1일 내지 8일 동안 (바람직하게, CEF의 경우 1일 내지 5일 동안 및 불멸화된 세포의 경우 2일 내지 7일 동안) 배양된다.
재조합 폭스바이러스에 의한 생산자 세포의 감염은 생산자 세포의 생산적 감염을 허용하도록 적절한 조건 하에 (예로, 적절한 감염 다중도 (MOI)) 이루어진다. 폭스바이러스의 증폭에 사용되는 적합한 MOI는 전형적으로 0.001 내지 1 (더욱 바람직하게 약 0.05)이다. 감염 단계는 생산자 세포를 배양하는데 사용된 배지와 동일하거나 상이할 수 있는 배지에서 수행될 수 있다.
감염된 생산자 세포는 다음으로 자손 바이러스성 벡터 (예로, 감염성 바이러스 입자)가 생산될 때까지 당업자에게 널리 공지된 적절한 조건 하에 배양된다. 감염된 생산자 세포의 배양은 또한 바람직하게 생산자 세포를 배양하는데 및/또는 감염 단계에 사용된 배지와 동일하거나 상이할 수 있는 배지에서, 바람직하게 30℃ 내지 37℃의 온도에서 1일 내지 5일 동안 수행된다.
폭스바이러스 입자는 배양 상청액 및/또는 생산자 세포로부터 수집될 수 있다. 세포 배양 상청액 및 생산자 세포는 풀을 형성되거나 별도로 수집될 수 있다. 생산자 세포로부터의 회수는 생산자 세포 막의 파손을 허용하여 바이러스를 방출시키는 단계를 요구할 수 있다. 다양한 기법이 당업자에게 사용가능하며, 냉동/해동, 저장성 용해, 초음파 파쇄, 미세 유동화 또는 고속 균질화를 포함하나 이에 한정되지 않고, 후자 (예로, 실버슨 L4R을 사용함)가 선호된다.
폭스바이러스 입자는 다음으로 당해 기술분야에 널리 공지된 정제 단계를 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 다양한 정제 단계는 정화, 효소 처리 (예로, 엔도뉴클레아제, 프로테아제 등), 크로마토그래피 및 여과 단계를 포함하여 고려될 수 있다. 적절한 방법은 당해 기술분야에 기재되어 있다 (예로, 국제특허출원 제 WO 2007/147528호; 제 WO 2008/138533호, 제 WO 2009/100521호, 제 WO 2010/130753호; 제 WO 2013/022764호).
바람직한 구현예에서, 상기 제조 단계는 테스트 및 환자의 치료에 적합한 용량으로 배분되도록 재조합 폭스바이러스의 적어도 109개 pfu, 바람직하게 적어도 5 × 109개 pfu, 바람직하게 대략 1010개 pfu 이상의 생산에 도달한다.
무장한 재조합 폭스바이러스
본 발명의 특정 구현예는 또한 펩티드 인코딩 발현 카세트(들)에 추가하여 바이러스 게놈에 삽입된 추가적인 치료 유전자(들)를 포함하는 재조합 폭스바이러스를 포함한다. 다양한 치료 유전자, 특히 바이러스의 항-종양 효능을 강화하거나 숙주의 면역을 보강할 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자가 고려될 수 있다. 바람직한 치료 유전자는 자살 유전자 (약물 전구체를 세포독성 약물로 전환할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자) 및 면역자극성 유전자 (면역계 또는 효과기 세포를 특이적 또는 비-특이적 방식으로 자극할 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 치료 유전자)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
재조합 폭스바이러스 조성물
제 3 양태에 따르면, 본 발명은 본원에 기술된 다수의 펩티드 (예로, 신생펩티드) 융합의 발현 각각을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 본 발명의 제 2 양태에 따른 방법을 사용하여 획득된 재조합 폭스바이러스를 포함하는 조성물을 제안하고 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 제 3 양태에 따른 조성물은 본원에 기술된 (또는 본원에 기술된 방법에 따라 획득된) 재조합 폭스바이러스 및 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약제학적 조성물의 형태이다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 상기 재조합 폭스바이러스의 치료적 유효량을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 비히클"은 포유동물 및 구체적으로 인간 대상체의 투여에 적격한 임의의 및 모든 담체, 용매, 희석제, 부형제, 아쥬반트, 분산 매질, 코팅제, 항세균제 및 항진균제 및 흡수제 등을 포함하도록 의도된다.
"치료적 유효량"은 본 발명에 따라 치료된 대상체에서 본원에 언급된 것 중 적어도 하나를 포함하여 임상적 상태의 관찰가능한 개선을 생산하는데 요구되는 재조합 폭스바이러스의 양에 해당한다.
이러한 치료적 유효량은 폭스바이러스의 특징 (바이러스의 유형, 생체유용성 및 용량을 포함함), 질환의 중증도 및 경과 (예를 들면 암의 등급), 대상체 자신 (연령, 성별, 병력, 일반적인 신체 조건 등을 포함함), 바이러스 제형물에서 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제의 특성, 및 치료 양식 (투여 결로, 투여 빈도, 동시적 투약의 유형 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 폭스바이러스의 적절한 용량은 관련 상황에 비추어 의사에 의해 일상적으로, 예를 들면 바이러스의 투여에 대한 대상체의 반응을 모니터링하고, 이에 따라 용량을 조절함으로써 결정되고 적응될 수 있다. (추가적인 정보를 위해, Remington, The Science and Practice of Pharmacy; Gennaro ed., Pharmaceutical Press, London, UK; 예로, 제 22판 또는 후속 개정판 참조).
설명적 목적으로, 개별 용량에 적합한 치료적 유효량은 폭스바이러스 및 사용된 정량적 기법에 따라 대략 105개 내지 대략 1013개의 vp (바이러스 입자), iu (감염 단위) 또는 pfu (플라크 형성 단위)로 달라질 수 있다. 일반 지침으로서, 본 발명의 맥락에서 재조합 폭스바이러스의 대략 106개 pfu 내지 1011개 pfu의 개별 용량이 구체적으로 적당하고, 더욱 바람직하게 대략 5 × 106개 pfu 내지 대략 5 × 109개 pfu, 훨씬 더 바람직하게 대략 107개 pfu 내지 대략 109개 pfu의 용량이며, 대략 5 × 107개 pfu 또는 108개 pfu를 포함하는 개별 용량이 선호된다. 개별 용량은 종양내 주사와 같은 국소 투여(들)를 위해 팩터 2 내지 20으로 감소될 수 있다. 시료에 존재하는 바이러스의 정량은 일상적인 적정 기법에 의해, 예로 증식허용 세포 (예로, BHK-21 또는 CEF)의 감염에 이어진 플라크 수의 계수법, 면역염색법 (예로, 항-바이러스 항체를 사용함), A260 흡광도 (vp 역가)의 측정, 정량적 면역형광법 (iu 역가) 또는 특이적 바이러스 프라이머 및 프로브를 사용한 qPCR에 의해 결정될 수 있다.
다양한 제형물은 본 발명의 맥락에서, 냉동 (예로, -70℃, -20℃), 냉장 (예로, 4℃) 또는 주변 (예로, 20℃ 내지 25℃) 온도로 제조 및 장기간 보관 (즉, 적어도 6개월)의 조건 하에 바이러스 안정성을 보장하도록 액체 또는 냉동건조된 것으로 고려될 수 있다. 재조합 폭스바이러스는 유리하게 인간 또는 동물 용도에 적절한 희석제에 넣어둔다. 적합한 희석제의 대표적인 예는 멸균수, 생리학적 식염수 (예로, 염화나트륨), 링거 용액, 포도당, 트레할로스 또는 사카로스 용액, 행크 용액, 및 기타 수용성 생리학적 평형화 염 용액을 포함한다.
바람직하게, 폭스바이러스 조성물은 인간 용도에 적합하게 완충화된다. 트리스 (트리(히드록시메틸)메틸아민), 트리스-HCl (트리(히드록시메틸)메틸아민)-HCl), 포스페이트 완충액 (예로, PBS; Na2HPO4 및 KH2PO4의 혼합물; Na2HPO4 및 NaH2PO4의 혼합물과 같은 완충액, 및 바이카보네이트 완충액은 구체적으로 생리학적 또는 약간 염기성 pH (예로, 대략 pH 7 내지 대략 pH 9)를 유지하는데 적절하다. 완충액 (예로, 트리스-HCl)은 바람직하게 10 mM 내지 50 mM의 농도로 존재한다.
또한, 1가 염을 포함하여 적당한 삼투압을 보장하는 것이 유리할 수 있다. 상기 1가 염은 명확하게 NaCl 및 KCl로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게 상기 1가 염은 명확하게 10 mM 내지 500 mM 농도의 NaCl이다.
필요한 경우, 조성물은 또한 동결보호제를 포함하여 저온에서 보관이 용이할 수 있다. 적합한 동결보호제는 예를 들면 0.5% 내지 20% (중량 g/부피 L, w/v로 지칭됨), 바람직하게 5% 내지 15% (w/v)의 다양한 농도에서의 슈크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 약 10%가 선호된다. 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 고분자량 중합체의 존재는 구체적으로 진공 건조화 및 냉동 건조화 단계 동안 재조합 폭스바이러스를 보호하도록 동결건조된 제형물에 적합하다.
설명적 목적으로, NaCl 및/또는 당을 포함하는 완충화된 제형물은 구체적으로 폭스바이러스 (예로, 사카로스 5 % (W/V), 소듐 글루타메이트 10 mM 및 NaCl 50 mM을 갖는 트리스 10 mM pH 8; 또는 글리세롤 (10%) 및 NaCl을 갖는 포스페이트 완충 식염수), 뿐만 아니라 국제특허출원 제 WO 2016/087457호에 기재된 것의 보존에 적응되어 있다.
치료 용도 및 치료 방법
본원에 기술된 및 본 발명에 따른 방법에 의해 획득된 재조합 폭스바이러스 및 이의 조성물은 구체적으로 (치료용 백신으로서) 치료적 목적에 적합하다. 이러한 용도는 예방 및/또는 요법 목적을 포괄한다. 전형적으로, ≪예방 (prophylaxis)≫은 질환 또는 병리학적 병태 (예로, 과증식성 (암) 또는 감염성 질환)의 가능성을 예방하거나, 억제하거나, 감소시키거나, 이의 발병을 지연시키는 접근법을 나타내는 반면, 요법은 임상 결과를 포함한 유익한 또는 원하는 결과를 획득하는 접근법을 말한다.
본원에 기술된 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물에 의해 제공되는 유익한 효과는 기저선 상태를 능가하거나 본원에 기술된 양식에 따라 치료되지 않은 경우 예상된 상태를 능가하는 임상적 상태의 관찰가능한 개선으로 증명될 수 있다. 임상적 상태의 개선은 의사 또는 기타 의료진에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 관련된 임상적 측정에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 본 발명의 목적으로, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 질환으로부터 유발된 하나 이상의 증상을 완화하는 것, 질환의 정도를 감소시키는 것, 질환을 안정화하는 것 (예로, 질환 진행을 예방하거나 지연시키는 것, 종양 크기를 감소시키는 것 등), 질환의 확산 (예로, 전이)를 예방하거나 지연시키는 것, 질환의 재발을 예방하거나 지연시키는 것, 재발의 위험을 감소시키는 것, 질환 (일부 또는 전부)를 진정시키는 것, 질환의 중증도를 감소시키는 것, 질환을 치료하는데 요구되는 하나 이상의 다른 투약의 용량을 감소시키는 것, 삶의 질을 증가시키는 것 및/또는 생존을 연장하는 것 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
임상적 유익을 평가하는데 사용가능한 적절한 측정, 예컨대 혈액 테스트, 생물학적 체액 및 생검의 분석, 뿐만 아니라 의학적 영상화 기법은 의학 연구실 및 병원에서 일상적으로 수행되고, 매우 다양한 키트가 시판되어 입수가능하다. 이들은 투여 이전에 (기저선), 및 치료 과정 동안 및 치료의 중단 이후의 다양한 시점에 수행될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 일시적이거나 (투여의 중단 이후의 1개월 내지 2개월 동안), 유지될 수 있다 (수개월 또는 수년 동안). 대상체마다 상당히 달라질 수 있는 임상적 상태의 자연적 경과로서, 치료적 유익은 치료된 각 대상체에서 관찰될 필요가 없지만, 대상체의 유의한 수에서는 필요하다 (예로, 2가지 실험군 사이의 통계적으로 유의한 차이는 투키 매개변수 테스트, 크루스칼-월리스 테스트, 만 및 휘트니에 따른 U 테스트, 스튜던트 t-테스트, 윌콕슨 테스트 등과 같은 당해 기술분야에 공지된 임의의 통계적 테스트에 의해 결정될 수 있음).
바람직한 구현예에서, 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물은 과증식성 질환의 치료를 위한 용도이다. 본원에 사용된 용어 "과증식성 질환"은 암 및 일부 심혈관 질환을 포함한 세포의 비정상적 증식 및 확산이 관여한다 (예로, 혈관벽 등의 평활근 세포의 증식으로부터 유발된 협착). 본원에 사용된 용어 "암"은 임의의 용어 "종양", "악성암", "신생물"와 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 조절되지 않은 세포 성장 및 확산으로부터 유발된 임의의 질환 또는 병리학적 병태를 포괄한다. 이러한 용어는 임의의 유형의 조직, 장기 또는 세포, 임의의 병기의 악성암 (예로, 병변 이전부터 4기까지)을 포함하도록 의미한다. 전형적으로, 종양 특히 악성 종양은 정상 조직과 비교하여 구조적 체제 및 기능적 조화의 부분적 또는 완전한 결여를 나타내고, 일반적으로 주변 조직으로 침입 (확산)하고/거나 더 먼 부위로 전이하는 성향을 나타낸다.
구체적으로, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하거나 이의 재발을 예방하기 위한 용도의 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 암을 치료하거나 이의 재발을 예방하는 약제의 제조를 위한 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료 방법으로서, 치료가 필요한 대상체에서 본 발명의 제 2 양태에 따른 방법을 사용하여 획득된 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물을 상기 대상체에서 암을 치료하거나 이의 재발을 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
구체적으로 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개인 맞춤형 암 백신으로서 용도를 위한 재조합 폭스바이러스 또는 조성물을 설계하고 생성하기 위해 수행된다. 본원에 적용된 용어 "개인 맞춤형"은 개인 수준 (구체적인 대상체) 또는 하위집단 수준 (공통적인 특징을 공유하는, 예로 특이적 질환, 특이적 표현형 특징을 갖거나, 동일한 약물을 복용하거나, 예로 면역계에서 동일한 결함을 보이는 사람의 소집단) 둘 중 하나를 말한다. 구체적으로, 이러한 맥락에서 적당한 재조합 폭스바이러스는 실시예 섹션에서 설명된 바와 같이 다수의 신생펩티드 융합의 발현 각각에 대해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 본원에 기술된 방법에 의해 설계될 것이다.
본 발명의 맥락에서 치료될 수 있는 암의 대표적인 예는, 골암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 식도의 암, 구인두암, 폐암, 두경부의 암, 피부암, 흑색종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 직장암, 항문 주변암, 전립샘암, 림프종, 내분비암, 갑상샘암, 연조직의 육종, 만성 또는 급성 백혈병, 방광암, 신장암, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 교종 등을 포함한다. 본 발명은 구체적으로 고형 종양의 치료에 적당하다. 구체적으로, 전이성 고형암 또는 재발의 위험이 높은 암을 포함하여 진행암의 치료에도 유용하다. 본원에 기술된 양식에 따라 치료되기 위한, 바람직한 암은 예를 들면 별아교세포종, 배아 종양, 생식세포 종양, 중추신경계 비전형 기형/막대형 종양, 두개인두종, 뇌실막종, 교종 및 교모세포종, 뿐만 아니라 두경부암과 같은 뇌암을 포함한다. 본원에 기술된 양식에 따라 치료되기 위한 다른 유형의 암은 난소암, 뿐만 아니라 폐암, 구체적으로 NSCLC이고, 구체적으로 샘암종, 편평세포 암종 및 거대세포 암종이 선호된다.
예를 들면, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 본 발명에 따라 치료된 대상체에서, 종양 성장, 증식 및 전이를 억제거하나 지연시키는 것, 종양 침입 (주변 조직으로 종양 세포의 확산)을 예방하거나 지연시키는 것, 종양 병변의 수를 감소시키는 것, 종양 크기를 감소시키는 것, 전이의 수 또는 정도를 감소시키는 것, 전반적인 생존 (OS)을 연장시키는 것, 진행되지 않는 생존 (PFS)를 증가시키는 것, 진정 기간을 증가시키는 것, 질환 상태를 안정화하는 것 (즉, 악화되지 않음), 질환의 재발을 예방하는 것, 또 다른 치료에 대한 더 나은 반응을 제공하는 것, 삶의 질을 개선하는 것 및/또는 항-종양 반응 (예로, 비-특이적 (선천적) 및/또는 세포독성 T 세포 반응과 같은 특이적임)을 유도하는 것 중 하나 이상과 상관될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물은 감염성 질환의 치료를 위한 용도이다. 본원에 사용된 용어 "감염성 질환"은 병원성 유기체 (예로, 세균, 기생충, 바이러스, 진균 등)로의 감염으로부터 유발된 질환을 말한다. 본 발명은 또한 치료 방법으로서, 치료가 필요한 대상체에서 본 발명의 제 2 양태에 따른 방법을 사용하여 획득된 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물을 상기 대상체에서 감염성 질환을 치료하거나 이의 재발을 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서 치료될 수 있는 감염성 질환의 대표적인 예는 만성 HBV (B형 간염 바이러서) 감염 및 HPV (인간 파필로마 바이러스) 감염을 포함한다. 구체적으로, 이러한 맥락에서 적당한 재조합 폭스바이러스는 병원성 유기체로부터 획득된 다수의 면역원성 펩티드 융합의 발현 각각에 대해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 본원에 기술된 방법에 의해 설계되고 생성될 것이다. 방법이 감염성 질환을 치료할 목적일 때, 치료적 유익은 예를 들면 치료된 대상체의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 정량되는 감염한 병원성 유기체의 양의 감소, 감염성 질환의 안정화된 상태 (악화되지 않음), 특이적 혈청 마커의 수준 감소 (예로, 만성 B형 또는 C형 간염에서 보통 관찰되는 불량한 간 병태와 관련된 알라닌 아미노전이효소 (ALT) 및/또는 아스파테이트 아미노전이효소 (AST)의 감소), 감염성 질환의 발생과 관련된 임의의 항원 수준의 감소, 병원성 유기체에 대한 항체의 출현 및 항체 수준의 변화, 면역 세포에 의한 신호 방출 (예로, 사이토카인), 치료된 대상체의 통상적 요법 (예로, 항생제, 뉴클레오시드 유사체 등)에 대한 반응의 개선, 및/또는 조합 치료를 받지 않은 경우 예상된 생존과 비교하여 생존 연장에 의해 증명될 수 있다.
재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물의 투여
임의의 통상적인 투여 경로가 적용가능하고, 비경구 경로가 선호된다. 비경구 경로는 주사 또는 주입으로서 투여를 위해 의도되고, 전신뿐만 아니라 국소 경로를 포괄한다. 구체적으로, 적합한 투여 경로는 정맥내 (정맥 내로), 혈관내 (혈관 내로), 동맥내 (동맥 내로), 피부내 (진피 내로), 피하 (피부 하에), 근육내 (근육 내로), 복강내 (복막 내로), 대뇌내 (뇌 내로) 및 종양내 (종양 또는 이의 근접부 내로) 경로, 뿐만 아니라 난절 (scarification)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 점막 투여도 본 발명에 의해 고려되고, 경구/영양 공급, 비강내, 기관내, 비인두, 폐내, 질내 또는 직장내 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 국소 투여는 피부 또는 조직의 표면 (예로, 안약, 귀약 등)에 직접적으로 적용된다. 또한, 흡입은 특히 치료될 종양이 호흡관 및 폐에 있을 때 고려될 수 있다. 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물은 바람직하게 정맥내, 피하 근육내 또는 종양내 주사에 의해 환자에게 투여된다.
투여는 예를 들면 카테터, 전기 주사기, 쿼드라퓨즈 주사 바늘, 무바늘 주사 장치 (예로, 바이오젝터 TM 장치), 주입 펌프, 스프레이 등을 포함하여, 표준 바늘 및 주사기 또는 당해 기술분야에 사용가능한 전달을 촉진하거나 개선할 수 있는 임의의 장치를 사용할 수 있다. 전기천공법은 또한 경피 수단 (예로, 패치 및 미세바늘 등)을 사용하여 수행될 수 있다.
재조합 폭스바이러스는 단일 용량으로 또는 더욱 바람직하게 연장된 기간에 걸쳐 다수의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 휴식 기간 이후에 반복되는 투여의 순차적인 주기를 통해 진행하는 것이 가능하다. 각 폭스바이러스 투여 사이의 간격은 수시간 내지 6개월 (예로, 24시간, 48시간, 72시간, 1주, 2주, 3주 1개월, 2개월 등)일 수 있다. 또한, 간격은 규칙적이거나 (예로, 6회 투여 동안 주 당 1회 투여, 다음으로 1회 내지 14회 동안 매 3주마다 1회 투여), 아닐 수 있다. 용량은 각 투여에 대해 상기에 기술된 범위 내에서 달라질 수 있다. 설명적 목적으로, 바람직한 치료 일정은 임상적 유익이 관찰될 때까지 대략 1주 또는 3주 간격으로 및 이후에 매 1개월 내지 6개월마다 5 × 106개 내지 5 × 109개 pfu의 재조합 MVA의 1회 내지 40회 (예로, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 15회, 20회, 25회, 30회, 35회, 40회) 투여가 관여한다.
조합 요법
본원에 기술된 방법 및 치료적 용도의 추가의 구현예에서, 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물은 전술된 암의 치료에서 유용성을 갖는 하나 이상의 추가적인 항암 요법/요법들과 조합하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 추가적인 항암 요법/요법들은 수술, 방사선 요법, 화학요법, 동결 요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 면역요법 및 사이토카인 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 추가적인 항암 요법/요법들은 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물을 사용하기 이전에, 이후에, 필수적으로 동시에 또는 산재된 방식으로 표준 관행에 따라 대상체에게 투여된다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 수술과 조합하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 재조합 폭스바이러스 조성물은 종양의 일부 또는 전부의 수술적 절제 이후에 (예로, 예를 들면 절제된 영역 내의 국소 투여에 의해) 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물은 방사선 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 당업자라면 적당한 방사선 요법 프로토콜 및 매개변수를 쉽게 제형화할 수 있다 (예를 들면, Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 제 2판. JB Lippincott Co. 참조; 당업자에게 쉽게 자명해질 특유한 적응 및 변형을 사용함). 암 치료에 사용될 수 있는 방사선 유형은 당해 기술분야에서 널리 공지되어 있으며, 전자 빔, 선형 가속기로부터 또는 코발트 또는 세슘와 같은 방사능 공급원으로부터의 고-에너지 광자, 광자 및 중성자를 포함한다. 방사선 동위원소의 용량 범위는 광범위하게 달라질 수 있으며, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 세기 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다. 연장된 기간 동안 규칙적인 X-선 용량 (3주 내지 6주) 또는 높은 단일 용량이 본 발명에 의해 고려된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물은 암을 치료하는데 사용가능한 화학요법과 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 화학요법제의 대표적인 예는 알킬화제, 토포이소머라제 I 저해제, 토포이소머라제 Ⅱ 저해제, 파프 저해제, 백금 유도체, 타이로신 키나제 수용체의 저해제, 사이클로포스파미드, 항대사물, DNA 손상 제제 및 항세포분열제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
추가의 구현예에서, 재조합 폭스바이러스 또는 이의 조성물은 항-신생물 항체뿐만 아니라 siRNA 및 안티센스 폴리뉴클레오티드와 같은 면역치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 대표적인 예는 무엇보다도 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-LAG3 등과 같은 특이적 면역 체크포인트를 차단하는 단일클론 항체 (예로, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 펨브로리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, AMP-224MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559 등), 표피 성장인자를 차단하는 단일클론 항체 (구체적으로, 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 트라스투주맙 (허셉틴TM) 등) 및 혈관 내피 성장인자를 차단하는 단일클론 항체 (구체적으로, 베박시주맙 및 라니비주맙)를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 재조합 폭스바이러스의 투여는 치료되지 않은 경우와 비교하여 치료된 대상체에서 생존 시간을 예로 적어도 3개월까지 증가시킨다. 대안적으로, 이것은 상기 종양에 대한 T 세포 반응 (CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응)을 생성시킨다.
재조합 폭스바이러스 조성물 및 하나 이상의 추가적인 항암 요법의 투여는 수분 내지 수주 범위의 간격으로 일 수 있다. 예를 들면, 대상체에게 재조합 폭스바이러스 및 추가적인 항암 요법을 순차적으로 또는 산재된 방식으로 제공할 수 있지만, 동일한 기간 이내의 요법 둘 다의 동시적 투여도 고려된다. 치료 과정은 일상적으로 의사에 의해 결정될 수 있고, 다양한 프로토콜이 본 발명에 의해 포괄된다. 예를 들면, 재조합 폭스바이러스 조성물의 1회 내지 10회 투여가 수술 및 화학요법/방사선 요법 이후에 수행될 수 있다. 더욱이, 치료 과정 이후에, 치료 주기의 반복 이전에 항암 치료가 투여되지 않는 기간을 두는 것이 고려된다.
실시예
재조합 MVA의 생성
MVA 트랜스퍼 플라스미드는 MVA 게놈의 결실 Ⅲ에서 상동성 재조합에 의해 전달되는 뉴클레오티드 서열의 삽입을 허용하도록 설계된다. 이것은 MVA 결실 Ⅲ를 둘러싸는 연접 서열 (BRG3 및 BRD3) 사이에 삽입된 트랜스퍼 서열을 포함한다.
상동성 재조합은 mCherry 형광성 단백질을 인코딩하는 유전자를 이의 결실 Ⅲ 내에 포함하는 부모 MVA를 사용하여 수행하였다. MVA mCherry의 장점은 초기 출발 MVA mCherry 바이러스 (부모 바이러스)에 의해 감염된 세포로부터 발현 카세트를 성공적으로 도입시킨 재조합 바이러스에 의해 감염된 세포를 구별하는 것이다. 실제로, mCherry 유전자는 결실 Ⅲ 내의 발현 카세트의 성공적인 재조합의 경우 제거되고, 바이러스 플라크는 흰색으로 보인다.
재조합이 백시니아 바이러스에서 비교적 빈번한 사건이지만, 1% 내지 5%의 재조합 플라크만이 삽입된 DNA를 포함한다. 따라서, 상동성 재조합의 효능을 증가시키기 위하여, 엔도뉴클레아제에 의한 추가의 절단 단계를 추가하였다. 예를 들면, 엔도뉴클레아제는 MVA의 mCherry 유전자에서 특이적으로 이중가닥 파손을 생성하여 재조합 MVA의 선별 효율을 증가시키는데 사용될 수 있다 (예로, 보통 5% 내지 50%의 바이러스 플라크가 발현 카세트를 포함함).
MVA의 생성은 국제특허출원 제 WO 2018/234506호에 기재된 바와 같이, 일차 닭 배아 섬유모세포 (CEF)에서 상동성 재조합에 의해 수행하였다. 발현 카세트의 존재 및 부모 MVA 오염의 부재는 PCR에 의해 검증하였다.
1. 신생펩티드의 재구분의 수동적 처리
본 실험의 목적은 최대 30개의 신생펩티드를 3개의 융합 단백질로서 발현하는 재조합 MVA 백신의 설계를 평가하는 것이었다.
a. 재료 및 방법
데이터세트
30개의 인간 신생펩티드 (이십구량체)의 목록은 공개된 데이터베이스 COSMIC (암의 체세포 돌연변이의 카탈로그, Tate et. al., 2019, Nucleic Acids Res., 47(D1): D941-D947)로부터 선택된 30개의 체세포 돌연변이로부터 생성하였다. 하기 표 2는 COSMIC으로부터 선별된 30가지 체세포 돌연변이의 목록을 나타낸다.
Figure pct00002
소프트웨어
막통과 도메인 (TM)의 예측 및 각 발현 카세트 (HSK7) 산물의 수치요법 점수의 계산은 진니어스 소프트웨어 (버전 8.1.9, 바이오매터스사)를 사용하여 수행하였다.
b. 결과
30개의 신생펩티드를 갖는 구조물: pTG19247
10개의 신생펩티드를 각각 인코딩하는 3가지 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 구조물 pTG19247을 생성하였다 (도 10). 30개 신생펩티드의 풀은 공개적으로 사용가능한 환자의 데이터세트 (연구 PRJEB3132, 인간 폐 샘암종 시료의 엑솜 시퀸싱 및 이들의 정상 대응물)로부터 이들의 예측된 면역원성을 기초로 하여 선택하였다. 재구분은 각 펩티드 사이에 링커가 없이 알파벳 순서로 시행하였다. 각 카세트는 신호 펩티드 (광견병 및 홍역 F 당단백질로부터 획득됨)를 포함하고, 각각 pH5R, pB2R 및 p11k7.5 프로모터의 조절 하에 배치된다. 융합의 제작을 용이하게 하기 위하여, 선택된 신생펩티드 사이에 링커를 포함하지 않는다. 상응하는 바이러스의 생성은 CEF에서 상동성 재조합에 의해 수행하였다.
pTG19247를 사용한 재조합 MVA의 생산 동안, 낮은 비율의 흰색 플라크 (약 1%)를 획득하였다. 5개의 플라크만을 선택하여 클로닝하였으며, PCR 분석은 재조합 바이러스에 해당하는 플라크가 없음을 보여주었다 (흰색 플라크는 인위적으로 mCherry 리포터 유전자의 신호를 없앤 부모 바이러스의 존재로부터 유도됨) (도 10).
3가지 융합 단백질의 함량 분석은 융합 단백질에서 막통과 도메인의 존재 (발현 카세트 B의 경우 2개 및 발현 카세트 C의 경우 3개) 및 발현 카세트에 대한 비교적 높은 수치요법 점수 (HSK7 > 0.5)를 나타내었다. 이러한 생화학적 성질의 영향을 평가하기 위하여, TM 도메인 및/또는 높은 HSK7에 관여된 12개의 펩티드는 데이터세트로부터 제거되고, 남아있는 18개의 신생펩티드의 집합을 생성하였다.
18개의 신생펩티드를 갖는 구조물: pTG19266
pTG19247로부터 나온 18개의 "TM이 없는" 신생펩티드를 기초로 하여 구조물 pTG19266을 제작하였다. 펩티드는 6개 신생펩티드의 융합 단백질을 각각 코딩하는 3가지 발현 카세트로 나누어 각 발현 카세트의 부하를 맞추었다. 각 융합에서, 펩티드는 또한 G 및또는 T 및/또는 S 잔기의 짧은 서열 (오량체) (예로, GSTSG, GSGSG 등)로 구성된 링커에 의해 분리되어 융합 단백질 내의 신생펩티드 사이의 상호작용을 제한한다.
새로운 조합으로 설계된 융합의 펩티드 서열은 예상된 바와 같이 TM 도메인이 없고, 발현 카세트에 대해 최대 약 0.2로의 HSK7 감소를 보여주었다 (도 10).
재조합 MVA는 pTG19266 플라스미드를 사용하여 생성하였고, 흰색 플라크의 비교적 낮은 백분율 (18%)에도 불구하고 PCR로 분석된 6개의 클론 (6개 중)는 진정한 재조합체로서 검증되었다.
c. 결론
본 실험은 융합 단백질로서 여러 신생펩티드를 보유하는 재조합 MVA 백신을 생성하는데 요구되는 조건을 평가하도록 설계되었다. 막통과 (TM) 도메인의 부재 및 중간 수치요법 점수 (≤ 0.2)가 최대 18개 신생펩티드를 보유하는 재조합 MVA를 생성하는데 요구되는 것으로 여겨졌다. 다음의 단계는 신생펩티드 선별 및 재구분의 공정을 TM 및 HSK7 판정기준에 따라 자동화하는 것일 수 있다.
2. 백디자인R (VacDesignR)로의 전달 서열 설계
a. 재료 및 방법
데이터세트
신생펩티드의 3가지 목록은 3가지 비-소세포 폐암 시료 (P2918, V1035 및 V1055) 및 이들의 정상 대응물 (혈액)으로부터 확인하였다. 돌연변이는 시퀀싱 연구실에 의해 종양으로부터의 엑솜 및 정상 조직으로부터의 엑솜을 비교하여 확인하였다. 순위 매김은 전문적 의견을 기반으로 하는 연구진 (온코커뮤니티)에 의해 수행되었다.
백디자인R 매개변수
다음의 기본 매개변수는 이러한 데이터세트 상에서 백디자인R을 전개하는데 사용하였다.
- 펩티드 TM 점수 역치 (TMSThresh): 25
- 융합 TM 점수 역치 (TMSK7Thresh): 40
- 융합 수치요법 점수 역치 (HSK7Thresh): 0.2
- 백신 당 펩티드의 최대의 수 (Nmax): 30
- 백신 당 펩티드의 최소의 수 (Nmin): 5
b. 백디자인R로부터의 결과
백디자인R로부터의 결과는 발현 카세트, 조절 요소, 종결인자 및 클로닝 제한효소 부위를 포함하는 전달 서열 골격 내의 신생펩티드의 위치 맵이다. 발현 카세트에 있는 신생펩티드의 상대 위치만 3가지 시료의 경우 표 8에 나타낸다. 각 융합 펩티드에서 수치요법 수단 및 TM의 예측된 수, 뿐만 아니라 흰색 세포 (플라크)의 백분율로서의 재조합 바이러스 생산 결과, 및 PCR에 의해 검증된 재조합 바이러스 클론의 절대 수를 나타낸다.
다음의 섹션은 30개 이상의 신생펩티드가 입력 데이타에서 사용가능한 시료 V1055에 대한 중간 결과만을 설명할 것이다. 2가지 다른 시료는 30개 미만의 신생펩티드를 갖는 초기 목록을 갖고, 이는 더 적은 양의 신생펩티드로의 전달 서열을 생성하였으며, 유사한 단계를 모든 시료에 사용하였다.
펩티드 선별
첫 번째 단계는 백디자인R의 tmCalc에 의한 TM (막통과) 점수 및 TM 패치의 계산으로 구성된다. 이러한 단계는 표 3에 나타낸 바와 같은 전체 입력 테이타세트 상에서 수행된다. TM 점수는 TM 패치에 기록된 로칼 TM 영역의 합계이다 (예로, TM 패치 '36_1'은 로칼 TM 점수 36 및 1을 각각 갖는 2개의 영역을 기록함. 이러한 TM 점수는 36 + 1 = 37임). 하기 표 3은 백디자인R에 의한 TMS 점수 및 TM 패치 계산 이후에 시료 V1055로부터의 신생펩티드의 순위를 매긴 목록을 나타낸다. 순위 매김은 예측 제공자에 의해 주어진 예측된 면역원성을 기초로 한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
역치 초과의 TM 점수 (TM 점수 ≥ 25)를 갖는 신생펩티드는 필터링되어 아웃 목록으로 보내진다 (표 4). 이러한 목록에서 이유는 Filter_Code 및 Filter_Reason 영역 둘 다로서 기록된다. 예로서, Filter_ Code "1"은 TMS 점수 >수 > 역치"를 의미한다. 하기 표 4는 시료 V1055의 경우에 백디자인R의 필터링 단계 이후에 아웃 목록의 내용을 나타낸다.
Figure pct00005
신생펩티드의 나머지 목록은 30개 이상이기 때문에, 2가지 목록이 신생펩티드 선별 단계의 결과로서 작성되었으며, 아웃 목록에 추가하여 하위함수 리스트크레아토R (listCreatoR)는 신생펩티드를 2가지 목록으로 나눈다.
일단 입력 목록이 필터링되면, 가장 높은 순위를 갖는 신생펩티드는 전달 서열의 일부인 것으로 선별되어 최상의 목록으로 보내진다 (표 5). 또한, 수치요법 점수가 최상의 목록의 각 신생펩티드에 대해 계산된다. 이 점수는 펩티드 잔기의 수치요법 점수의 평균에 해당한다. 하기 표 5는 시료 V1055의 경우 백디자인R에 의한 신생펩티드의 선별 단계 이후에 최상의 목록의 내용을 나타낸다.
Figure pct00006
나머지 후보는 엑스트라 목록에 저장되고 (표 6), 필요하면 첫 번째 최상의 목록을 처리하는 동안 신생펩티드가 실격된 경우 엑스트라 후보의 풀로서 사용될 수 있다. 하기 표 6은 시료 V1055의 경우 백디자인R의 신생펩티드 선별 단계 이후에 엑스트라 목록의 내용을 나타낸다.
Figure pct00007
카세트간 배분
최상의 목록의 일부인 30개의 신생펩티드는 3가지 발현 카세트로 나누었다. 백디자인R에서 미리 정의된 재구분 규칙은 수치요법 및 신생펩티드 사이의 막통과 도메인을 형성할 위험의 견지에서 3가지 융합 단백질의 균형을 맞추는데 사용하였다. 따라서, 고 (H), 중 (M) 및 저 (L)의 상대적 분류를 30개의 신생펩티드에 적용하였다. 재구분 규칙과 관련하여, 각 발현 카세트는 10개의 신생펩티드, 2개의 높은 클래스, 2개의 중간 클래스 및 6개의 낮은 클래스로 구성될 것이다. 각 클래스로부터 펩티드의 선택은 무작위로 30,000회 시행되어 3가지 발현 카세트 조성의 30,000개의 배치를 생성하였다. 다음으로 수치요법 수단은 각 신생펩티드 세트 및 각 배치에 대해 계산되었으며, 범위도 계산하였다. 역치 초과의 적어도 하나의 카세트 수치요법 점수 (HSK7)를 갖는 배치는 제거하였다. 가장 낮은 범위의 HSK7을 갖는 배치는 다음을 단계를 위해 유지하였다. 시료 V1055의 예에서, 카세트내 슬로트 배정 단계에서 선택된 최고의 배치는 카세트 수치요법 점수 0.028 범위를 갖는다 (표 7) 하기 표 7은 시료 V1055의 경우 카세트간 배분 단계 이후에 최고의 배치를 나타낸다. 순위 열은 면역원성 예측을 말한다. HSK7 값은 점수의 계산에서 신호 펩티드 및 링커를 고려한다.
Figure pct00008
카세트내 슬로트 배정
이 단계에서, 각 발현 카세트는 신생펩티드의 조성을 기초로 하고, 백디자인R으로 작성된 슬로트 점유 규칙에 따라 작성된다. 10개의 신생펩티드를 코딩하는 각 발현 카세트의 경우, 총 2,880개의 융합이 생성된다. 시료 P2918, V1047 및 V1055의 경우에 최종 구조물의 신생펩티드의 내용은 표 8에 나타낸다. TMS 및 TM 패치는 2개의 연속적인 신생펩티드 사이에 발생할 수 있는 임의의 TM 도메인을 검출하도록 각 펩티드 융합에 대해 계산된다. 따라서, 로칼 TM 영역이 검출되는 경우 (TM 패치 > TMSK7Thresh), 융합은 거부되었다. 하기 표 8은 구조물 P2918, V1047 및 V1055의 경우에 백디자인R의 결과를 나타낸다. 융합에서 각 신생펩티드의 위치가 표시된다 (슬로트 I 내지 X). 각 카세트의 경우 TM 패치 및 HSK7가 표시된다. 바이러스 생산 계량도 각 구조물에 대한 흰색 플라크% 및 PCR 결과로서 표시된다.
Figure pct00009
최대 3가지 융합 단백질의 형태로 14개, 21개 및 30개의 신생펩티드를 각각 코딩하는 3가지 시료 P2918, V1047 및 V1055의 경우에 플라스미드가 생성되었다. 최종 전달 서열은 이전에 정의된 규정에 따르고, 즉 TM 도메인이 없고, 융합 수치요법 점수 (HSK7)가 0.2 미만이다.
이러한 플라스미드를 갖는 재조합 MVA의 생성은 도구에 의해 증진되었다. 흰색 플라크의 백분율 범위는 12% 내지 22%이고, 재조합 클론의 수는 13개, 19개 및 24개이었다. PCR에 의해 여전히 발견되는 유일한 부모 클론은 V1055로부터 나온 플라스미드이고, 수가 제한된다 (3). 시료 V1055의 경우에 신생펩티드의 초기 목록에서 가장 높은 순위 30개 중 유일한 펩티드가 TMS 문제로 인해 제거됨을 주목하여야 한다. 이것은 재조합 MVA 바이러스를 생성하는 31번째로 교체되었다.
c. 결론
자동화된 도구, 백디자인R의 사용은 3가지 융합 단백질에서 최대 30개의 신생펩티드를 코딩하는 재조합 MVA의 생성을 강력하게 개선하였다. MVA 생성은 최상의 순위가 매겨진 후보보다 관심이 적은 펩티드를 과선별하는 비용 문제로 인해 개선되지 못하였다. 이러한 개선은 최적화된 개인 맞춤형 백신의 설계에 도움이 되었다.
상기 인용된 특허, 간행물 및 데이터베이스 입력의 개시내용 모두는 본원에서 이들의 전문이 참고문헌으로 구체적으로 통합된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 상세한 설명 및 도면으로부터 및 청구범위로부터 자명해질 것이다. 다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하도록 도입된다. 그러나, 본 발명에 비추어, 당업자라면 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고도 개시되어 있는 구체적인 구현예에서 변경이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.

Claims (13)

  1. 재조합 폭스바이러스를 설계하는 방법으로서, 상기 재조합 폭스바이러스는 하나 또는 다수의 펩티드 융합의 발현 각각을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하고, 서버 (1)의 처리 수단 (11)에 의해
    (a) 후보 펩티드의 제 1 하위집합을 선별하는 단계로서, 상기 펩티드는 TMS 역치 미만의 막통과 점수를 제시하는, 단계;
    (b) 다수의 가능한 배분 중에 상기 제 1 하위집합으로부터 상기 발현 카세트(들)에 이르기까지 상기 후보 펩티드의 최적의 배분을 결정하는 단계로서, 상기 최적의 배분는 적어도 2가지 발현 카세트가 있는 경우 상기 적어도 2가지 발현 카세트의 수치요법 점수 사이의 가장 낮은 범위를 제시하는, 단계;
    (c) 각 발현 카세트에 대해, 카세트 슬로트 점유 규칙의 함수로서 상기 후보 펩티드의 최적의 슬로트 배정을 결정하여 가장 낮은 TM 점수를 갖는 상기 펩티드 융합을 선택하는 단계; 및
    (d) 상기 재조합 폭스바이러스의 생성을 위한 상기 하나 이상의 발현 카세트(들)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 전달 서열을 결정하는 단계
    를 수행하는 것을 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    단계 (a)의 상기 펩티드는 상동성 역치 미만의 연속적인 영역을 제시하는, 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    단계 (a)는 TMS 역치 초과의 막통과 점수 및/또는 상동성 역치 초과의 예측된 면역원성 잠재력에 따라 더 높은 순위의 후보로의 상동성 영역을 제시하는 경우 펩티드를 제거하는 단계, 및 상기 제 1 하위집합으로 개시되거나 선택되지 않은 후보 펩티드로서 확인된 상기 후보 펩티드 집합의 제 2 하위집합을 선별하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)는 가능한 배분의 수가 상기 서버 (1)의 상기 처리 수단 (11)의 자원의 주어진 최대의 수 함수를 초과하는 경우, 상기 다수의 가능한 배분 중의 상기 최대 수의 가능한 배분의 적어도 한 번의 반복 중에서 상기 제 1 하위집합으로부터 상기 발현 카세트(들)에 이르기까지 상기 후보 펩티드의 상기 최적의 배분을 결정하도록 시도하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    단계 (b)는 상기 최대 수의 가능한 배분의 반복 중의 각 가능한 배분에 대해, 적어도 하나의 발현 카세트가 주어진 역치 초과의 수치요법 점수를 제시하는 경우, 상기 최대 수의 가능한 배분의 또 다른 반복을 고려하거나, 가장 높은 수치요법 점수를 제시하는 상기 제 1 하위집합의 후보 펩티드로부터 나온 상기 후보 펩티드를 상기 제 2 하위집합으로부터 나온 후보 펩티드로 교체하는 단계, 및 단계 (a)의 상기 펩티드 선별을 다시 진행하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (c)는 TMSK7 역치 초과의 점수를 갖는 적어도 하나의 TM 패치를 드러내는 임의의 펩티드 융합을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    단계 (c)는 적어도 하나의 막통과 도메인이 발현 카세트에 있는 상기 후보 펩티드의 임의의 가능한 슬로트 배정에서 검출되는 경우, 가장 높은 막통과 점수를 제시하는 상기 제 1 하위집합의 후보 펩티드로부터 나온 상기 후보 펩티드를 상기 제 2 하위집합으로부터 나온 후보 펩티드로 교체하는 단계, 및 단계 (b)에 이어진 단계 (c)를 반복하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 카세트 슬로트 점유 규칙은 상기 펩티드의 막통과 점수에 따라, 및 동등한 막통과 점수의 경우 이들의 수치요법 점수에 따라 카세트 내의 후보 펩티드의 가능한 슬로트 위치를 정의하는, 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 발현 카세트에 배분된 후보 펩티드는 재조합 폭스바이러스를 생성하지 않거나 생산하지 않는 적어도 3가지 클래스의 위험에 따라 분류되고, 상기 카세트 슬로트 점유 규칙은 카세트의 각 슬로트 위치에 대해 이러한 슬로트 위치에 배정되어야 할 후보 펩티드의 클래스를 정의하는, 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택된 후보 펩티드의 수가 10개 미만인 경우 단일 발현 카세트, 상기 선택된 후보 펩티드의 수가 10개 내지 14개인 경우 2가지 발현 카세트, 및 상기 선택된 후보 펩티드의 수가 15개 내지 30개인 경우 3가지 발현 카세트가 존재하는, 방법.
  11. 재조합 폭스바이러스를 포함하는 치료용 백신을 제조하는 방법으로서,
    - 상기 재조합 폭스바이러스를 설계하기 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계; 및
    - 상기 재조합 폭스바이러스를 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 방법은 상기 재조합 폭스바이러스의 제조 단계를 추가로 포함하고, 상기 제조 단계는 적합한 생산자 세포에서 적합한 규모로의 증폭 단계, 상기 세포 배양물으로부터 상기 생산된 재조합 폭스바이러스의 회수 단계, 및 선택적으로 상기 회수된 재조합 폭스바이러스의 정제 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서,
    상기 재조합 폭스바이러스는 신생펩티드를 인코딩하고, 이를 필요로 하는 대상체에서 상기 대상체의 암을 치료하거나 이의 재발을 예방하는데 사용되는, 방법.
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