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KR20220157911A - Gdf15 변이체를 포함하는 비알코올성 지방간질환 또는 비알코올성 지방간염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Gdf15 변이체를 포함하는 비알코올성 지방간질환 또는 비알코올성 지방간염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR20220157911A
KR20220157911A KR1020220062116A KR20220062116A KR20220157911A KR 20220157911 A KR20220157911 A KR 20220157911A KR 1020220062116 A KR1020220062116 A KR 1020220062116A KR 20220062116 A KR20220062116 A KR 20220062116A KR 20220157911 A KR20220157911 A KR 20220157911A
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KR
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leu
gly
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KR1020220062116A
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임세영
양지은
김도훈
김수경
심보라
이윤지
양나연
김준환
Original Assignee
주식회사유한양행
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Publication date
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Abstract

본 발명은 GDF15 (Growth differentiation factor-15) 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 것이다.

Description

GDF15 변이체를 포함하는 비알코올성 지방간질환 또는 비알코올성 지방간염의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition For Preventing or Treating Non-Alcoholic Fatty Liver Disease or Non-Alcoholic Steatohepatitis Comprising Growth Differentiation Factor-15 Variant}
본 발명은 GDF15 (Growth differentiation factor-15) 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 것이다.
GDF15는 MIC-1(Macrophage inhibitory cytokine-1), PBMP(Placental bone morphogenetic protein) 및 NAG-1(Nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1)로도 불리며, TGF-β 수퍼패밀리(transforming growth factor-beta superfamily)의 구성원 중 하나인 단백질이다.
최근, GDF15가 뇌 조직에서 특이적으로 발현되는 GFRAL(GDNF Family receptor alpha-like) 및 RET(Ret proto-oncogene)과의 결합을 통해 식이섭취를 억제하여 체중 감소를 유도한다는 연구결과가 보고된 바 있다(Tsai VW, et al., PLoS One 2013; 8 (2): e55174; US 8,192,735). 또한, 여러 연구에서 다양한 비만 동물 모델에 GDF15를 투여하여 우수한 체중 감소 효과를 입증하였으며, 이외에 추가적인 혈당 강하, 지질 수치 개선, 인슐린 저항성 개선 등 대사적 장점을 확인하였다.
하지만, 야생형의 GDF15는 체내에서 반감기가 짧아서 이를 의학적으로 사용할 경우 투여 빈도수가 높다는 문제점이 있다. 이에, GDF15의 체내 반감기를 증가시키기 위한 지속형 제제의 개발이 이루어지고 있다.
한편, 비음주자에게 발생하는 알코올성 간장애와 유사한 지방간을 포괄하는 모든 지방간 질환은 비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)라 칭해진다. 비알코올성 지방간질환 환자에서는 간의 지방산 합성이 항상 활성화되어 있으며, 지방산 합성의 활성화는 대사 증후군에 기인하는 지방간 형성에 관여하는 중요한 인자이다.
비알코올성 지방간질환은 일반적으로 예후 양호하다고 생각되는 단순성 지방간과, 단순성 지방간에 지속적으로 염증이나 섬유화가 동반되어 예후 불량으로 판단되고 있는 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)으로 대별되며, NASH는 NAFLD 중증형의 한 형태라 할 수 있다. 통계에 따르면, 지방간 인구의 약 30% 정도가 NASH 소견을 보이고 NASH 환자의 10-29%가 간경화, 더 나아가서는 간암 또는 사망으로 발전된다고 보고되었다. 하지만 비알코올성 지방간염이 간경화 및 간암으로 진행되는 중증형 질환임에도 불구하고, 현재까지 탁월한 임상적 NASH개선의 증거를 지닌 약물이 없는 상황이기 때문에, 비알코올성 지방간염의 예방 또는 치료에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되는 상황이다.
본 발명자들은 GDF15의 특정 위치에 돌연변이를 도입하여 향상된 활성을 나타내는 GDF15 변이체를 이용하여 대사증후군 예방 또는 치료 효과를 평가하는 중, NASH 동물 모델에서 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 및 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 개선 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
US 2019-0000923 (2019.01.03)
Li Ding, et al., BBRC 2018; 498:388-394 Zhang Zechusan et al., J Hepatol 2020; 72:976-989
본 발명의 목적은 GDF15 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 하기 식 (I)로 표시되는 GDF15 (Growth differentiation factor-15) 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:
N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 (I)
상기 식 (I)에서,
N-말단 확장 도메인은 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이고;
코어 도메인은 서열번호 20이거나, 서열번호 20의 아미노산 서열 중 15번째, 50번째, 58번째, 97번째 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드이며;
상기 15번째 아미노산인 아르기닌(arginine, R)이 알라닌(alanine, A), 아스파르트산(aspartic acid, D), 아스파라긴(asparagine, N), 시스테인(cysteine, C), 글루탐산(glutamic acid, E), 글루타민(glutamine, Q), 글리신(glycine, G), 히스티딘(histidine, H), 이소루신(isoleucine, I), 루신(leucine, L), 리신(lysine, K), 메티오닌(methionine, M), 페닐알라닌(phenylalanine, F), 프롤린(proline, P), 세린(serine, S), 트레오닌(threonine, T), 트립토판(tryptophan, W), 티로신(tyrosine, Y) 또는 발린(valine, V)으로 치환되고,
상기 50번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine, N)이 알라닌, 아르기닌(arginine, R), 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린으로 치환되며,
상기 58번째 아미노산인 세린(serine, S)이 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린으로 치환되고, 또는
상기 97번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린으로 치환됨.
본 발명에 따른 GDF15 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 포함하는 조성물을 통해, 비알코올성 지방간질환 (NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (NASH)의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-1, FM9-2, FM9-3, FM9-4, FM9-5 및 FM9-6)의 링커 타입 및 길이에 따른 활성을 비교한 도면이다.
도 2는 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM11-1, FM11-2, FM11-3, FM11-4, FM11-5 및 FM11-6)의 링커 타입 및 길이에 따른 활성을 비교한 도면이다.
도 3은 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 콜린결핍-고지방 식이 (choline-deficient, L-amino acid defined, high-fat diet) 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델 (CDAHF식이 유도 NASH 마우스 모델)에서의 체중 변화량(%)을 비교한 도면이다.
도 4는 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서 상대적 간 무게 감소 효과를 비교한 도면이다(###p<0.001 vs. 정상대조군 (Normal vehicle) (Student's t-test) 및 ***p<0.001, 그리고 ****p<0.0001 vs. CDAHF식이 대조군 (CDAHF vehicle) (One-way ANOVA)).
도 5는 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서의 간손상 관련 혈액지표 개선효과를 비교한 도면이다(###p<0.001 vs. 정상대조군 (Normal vehicle) (Student's t-test) 및 *p<0.05, 그리고 **p<0.01 vs. CDAHF식이 대조군 (CDAHF vehicle) (One-way ANOVA)).
도 6은 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서의 간 조직 NAFLD activity score (NAS)에 대한 개선효과를 나타낸 도면이다(###p<0.001 vs. 정상대조군 (Normal vehicle) (Student's t-test) 및 **p<0.01 vs. CDAHF식이 대조군 (CDAHF vehicle) (One-way ANOVA)).
도 7은 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서 개체별 steatosis 및 hypertrophy score를 나타낸 도면이다.
도 8은 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서 간 중성지방 수치를 비교한 도면이다(###p<0.001 vs. 정상대조군 (Normal vehicle) (Student's t-test) 및 ***p<0.001 vs. CDAHF식이 대조군 (CDAHF vehicle) (One-way ANOVA)).
도 9는 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서 H&E 염색한 간 조직사진을 비교한 도면이다.
도 10은 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서의 Picro sirus stain (PSR) 결과를 비교한 도면이다(###p<0.001 vs. 정상대조군 (Normal vehicle) (Student's t-test) 및 ***p<0.001, 그리고 ****p<0.0001 vs. CDAHF식이 대조군 (CDAHF vehicle) (One-way ANOVA)).
도 11은 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 ob/ob 마우스 모델에서의 체중 변화량을(%) 비교한 도면이다.
도 12는 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 ob/ob 마우스 모델에서 간 무게(g) 및 상대적 간 무게(%) 감소 효과를 비교한 도면이다(####p<0.0001 vs. 정상대조군 (Lean vehicle) (Student's t-test) 및 ****p<0.0001 vs. ob/ob 대조군 (ob/ob vehicle) (One-way ANOVA)).
도 13은 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체, FM9-6) 반복투여에 의한 ob/ob 마우스 모델에서의 간손상 관련 혈액지표 개선효과를 비교한 도면이다(###p<0.001, 그리고 ####p<0.0001 vs. 정상대조군 (Lean vehicle) (Student's t-test) 및 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 그리고 ****p<0.0001 vs. ob/ob 대조군 (ob/ob vehicle) (One-way ANOVA)).
본 발명은 일 측면에서, GDF15 (Growth differentiation factor-15) 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
GDF15 변이체
하기 식 (I)로 표시되는 GDF15 변이체를 제공한다:
N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 (I)
상기 식 (I)에서,
N-말단 확장 도메인은 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이고;
코어 도메인은 서열번호 20이거나, 서열번호 20의 아미노산 서열 중 15번째, 50번째, 58번째, 97번째 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드이며;
상기 15번째 아미노산인 아르기닌(arginine, R)이 알라닌(alanine, A), 아스파르트산(aspartic acid, D), 아스파라긴(asparagine, N), 시스테인(cysteine, C), 글루탐산(glutamic acid, E), 글루타민(glutamine, Q), 글리신(glycine, G), 히스티딘(histidine, H), 이소루신(isoleucine, I), 루신(leucine, L), 리신(lysine, K), 메티오닌(methionine, M), 페닐알라닌(phenylalanine, F), 프롤린(proline, P), 세린(serine, S), 트레오닌(threonine, T), 트립토판(tryptophan, W), 티로신(tyrosine, Y) 또는 발린(valine, V)으로 치환될 수 있고,
상기 50번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine, N)이 알라닌, 아르기닌(arginine, R), 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린으로 치환될 수 있으며,
상기 58번째 아미노산인 세린(serine, S)이 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린으로 치환될 수 있고, 또는
상기 97번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "코어 도메인"이란, 서열번호 1의 GDF15의 아미노산 서열에서 7번째부터 112번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 20이거나, 서열번호 20의 아미노산 서열 중 15번째, 50번째, 58번째, 97번째 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 제1 코어 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 코어 도메인은 하기 (1) 내지 (6)의 변이들로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 변이를 포함할 수 있다:
(1) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 15번째 아미노산인 아르기닌(arginine, R)이 아스파라긴(asparagine, N)으로 치환됨;
(2) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 50번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine, N)이 루신(leucine, L)으로 치환됨;
(3) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 58번째 아미노산인 세린(serine, S)이 리신(lysine, K), 아르기닌(arginine, R), 아스파라긴(asparagine, N), 아스파르트산(aspartic acid, D), 글루탐산(glutamic acid, E), 시스테인(cysteine, C) 또는 루신(leucine, L)으로 치환됨;
(4) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 97번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 루신(leucine, L)으로 치환됨;
(5) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 50번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine, N) 및 97번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 시스테인(cysteine, C) 또는 세린(serine, S)으로 치환됨; 및
(6) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 15번째 아미노산인 아르기닌(arginine, R)이 아스파라긴(asparagine, N)으로 치환되고, 58번째 아미노산인 세린(serine, S)이 리신(lysine, K) 또는 아르기닌(arginine, R)으로 치환됨.
이때, 상기 코어 도메인은 서열번호 6 내지 19 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 표현 "ΔN2"는 "delta N2"로도 표시될 수 있으며, 서열번호 1로 표시되는 인간 GDF15의 아미노산 서열 중 1번째 및 2번째 아미노산이 결실된 것을 의미한다. 상기 ΔN2는 N-말단 확장 도메인으로서 표현될 경우 "NGDH"로 표시될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 표현 "ΔN3, WS insertion, G4N, D5S, H6T"는 "delta N3, WS insertion, G4N, D5S, H6T"로도 표시될 수 있으며, 서열번호 1로 표시되는 인간 GDF15의 아미노산 서열 중 1번째 내지 3번째 아미노산이 결실되고, 그 자리에 트립토판 및 세린이 삽입되며, 4번째 아미노산인 글리신이 아스파라긴으로 치환되며, 5번째 아미노산인 아스파르트산이 세린으로 치환되고, 6번째 아미노산인 히스티딘이 트레오닌으로 치환된 것을 의미한다. 상기 ΔN3, WS insertion, G4N, D5S, H6T는 N-말단 확장 도메인으로서 표현될 경우, "WSNST"로 표시될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 표현 "△N3, G4N, D5S, H6T"는 "delta N3, G4N, D5S, H6T"로도 표시될 수 있으며, 서열번호 1로 표시되는 인간 GDF15의 아미노산 서열 중 1번째 내지 3번째 아미노산이 결실되고, 4번째 아미노산인 글리신이 아스파라긴으로 치환되며, 5번째 아미노산인 아스파르트산이 세린으로 치환되고, 6번째 아미노산인 히스티딘이 트레오닌으로 치환된 것을 의미한다. 상기 "△N3, G4N, D5S, H6T는 N-말단 확장 도메인으로서 표현될 경우, "NST"로 표시될 수 있다.
상기 GDF15 변이체는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 확장 도메인 및 서열번호 6 내지 20 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 코어 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 GDF15 변이체는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 확장 도메인 및 서열번호 6 내지 20 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 코어 도메인을 포함할 수 있다. 나아가, 상기 GDF15 변이체는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 확장 도메인 및 서열번호 6 내지 19 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 코어 도메인을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 GDF15 변이체는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 확장 도메인 및 서열번호 8, 9 또는 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 코어 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 GDF15 변이체는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 확장 도메인 및 서열번호 8, 9 또는 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 코어 도메인을 포함할 수 있다. 나아가, 상기 GDF15 변이체는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 확장 도메인 및 서열번호 6, 7 및 10 내지 19 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 코어 도메인을 포함할 수 있다. 이때, 상기 GDF15 변이체는 서열번호 21 내지 39 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
지속형 GDF15 융합 단백질
상기 지속형 GDF15 융합 단백질은 상기 GDF15 변이체와 인간 IgG Fc 또는 이의 변이체가 결합된다.
상기 인간 IgG Fc 또는 이의 변이체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 또는 이의 변이체일 수 있다. 구체적으로, 상기 인간 IgG Fc 또는 이의 변이체는 인간 IgG1 Fc 또는 이의 변이체일 수 있으며, 상기 인간 IgG1 Fc는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 인간 IgG Fc 또는 이의 변이체는 서열번호 41과 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 인접 아미노산 서열 또는 CH3 도메인을 포함하는 Fc의 단편일 수 있다. 특정 구현예에서 상기 인간 IgG Fc 또는 이의 변이체는 서열번호 41과 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 인접 아미노산 서열 또는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc의 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 인간 IgG Fc 또는 이의 변이체는 서열번호 41과 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 인접 아미노산 서열 또는 부분적 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc의 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 인간 IgG Fc 또는 이의 변이체는 서열번호 41과 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 IgG Fc 또는 이의 변이체는 IgG1 Fc 서열을 포함하는 제1폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 가공된 돌출부(protuberance)를 포함하는 CH3 서열을 포함하는 상기 제1폴리펩타이드; 및 IgG1 Fc 서열을 포함하는 제2폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 가공된 공동(cavity)을 포함하는 CH3 서열을 포함하는 상기 제2폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1폴리펩타이드의 돌출부와 상기 제2폴리펩타이드의 공동의 배치를 통해 제2폴리펩타이드와 이종이량체화되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 제1폴리펩타이드는 가공된 공동을 포함하는 또 다른 IgG Fc 폴리펩타이드(예를 들면, 제2폴리펩타이드)를 결합시킬 수 있는 가공된 돌출부를 포함할 수 있다. 상기 제2폴리펩타이드는 가공된 돌출부를 포함하는 또 다른 IgG Fc 폴리펩타이드(예를 들면, 제1폴리펩타이드)를 결합시킬 수 있는 가공된 공동을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제1폴리펩타이드의 돌출부 및 제2폴리펩타이드의 공동은 IgG Fc의 CH3 도메인으로 가공될 수 있다. 이때, 제1폴리펩타이드의 돌출부 및 제2폴리펩타이드의 공동은 GDF15 변이체에 연결되거나 결합되지 않는다.
상기 가공된 돌출부는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 Fc의 아미노산 서열 내 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다. 이때, 아미노산의 위치의 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 상기 치환은 아미노산 잔기 347, 366 및 394로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 존재할 수 있다. 예를 들면, 상기 치환은 Q347W/Y, T366W/Y T394W/Y 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 가공된 공동은 인간 IgG1 Fc 서열 내 상응하는 아미노산의 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있으며, 상기 치환은 아미노산 잔기 366, 368, 394, 405, 및 407로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 존재할 수 잇다. 예를 들면, 상기 치환은 T366S, L368A, T394S, F405T/V/A, Y407T/V/A 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
바람직하게는, 상기 돌출부는 T366W/Y 치환을 포함할 수 있고, 상기 공동은 T366S, L368A, Y407T/V/A 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 돌출부는 T366W/Y 치환을 포함할 수 있으며, 상기 공동은 Y407T/V/A 치환을 포함할 수 있다. 또한, 상기 돌출부는 T366Y 치환을 포함할 수 있고, 상기 공동은 Y407T 치환을 포함할 수 있다. 상기 돌출부는 T366W 치환을 포함할 수 있고, 상기 공동은 Y407A 치환을 포함할 수 있다. 상기 돌출부는 T394Y 치환을 포함할 수 있고, 상기 공동은 Y407T 치환을 포함할 수 있다.
상기 제1폴리펩타이드가 서열번호 42, 44 및 46 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 제2폴리펩타이드가 서열번호 43, 45 및 47 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 돌출부는 "크놉(Knob)"으로 지칭되고, 공동은 "홀(hole)"로 지칭된다.
상기 제1폴리펩타이드는 가공된 돌출부(protuberance)를 포함하는 Fc '크놉'(knob)이고, 제2폴리펩타이드는 가공된 돌출부(protuberance)를 포함하는 Fc '홀'(hole)이다. 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드는 비-공유 상호작용 (예를 들면, 소수성 효과, 예컨대, Fc의 크놉과 홀 영역 사이의 소수성 상호작용), 공유 결합(예를 들면, 이황화 결합, 예컨대, 제1폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 내 Fc의 힌지 영역 사이의 1 또는 2 또는 그 이상의 이황화 결합), 또는 비-공유 상호작용 및 공유 결합 모두를 통해 물리적으로 결합될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "이량체"란, 적어도 2종의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 복합체를 의미한다. 이들 폴리펩타이드의 각각은 N-말단 및 C-말단을 포함한다. 적어도 2종의 폴리펩타이드는 공유 및 비-공유 상호작용 (예를 들면, 정전기, π-효과, 반데르발스력, 및 소수성 효과)의 하나 또는 둘 모두를 통해 서로 연계될 수 있다. 상기 2종의 폴리펩타이드가 동일한 아미노산 서열을 가지거나 또는 상이할 수 있고, 2종의 폴리펩타이드가 동일한 2개의 폴리펩타이드를 갖는 경우 (동종)이량체로 지칭되며, 2종의 폴리펩타이드가 상이한 2개의 폴리펩타이드를 갖는 경우, 이종이량체로 지칭된다.
상기 인간 IgG Fc 또는 이의 변이체는 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체일 수 있으며, 상기 이종이량체는 A-1(서열번호 42) 및 A-2(서열번호 43)을 이용한 이종이량체, B-1(서열번호 44) 및 B-2(서열번호 45)를 이용한 이종이량체 또는 C-1(서열번호 46) 및 C-2(서열번호 47)을 이용한 이종이량체일 수 있다.
또한, 상기 IgG Fc 또는 이의 변이체는 지속형 GDF15 융합 단백질의 특성을 개선하기 위해 추가 돌연변이를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드로 이루어진 이종이량체에 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 IgG Fc 또는 이의 변이체는 IgG 효과 기능(Effector function)을 폐지하는(예를 들면, 감소하는 또는 제거하는) 돌연변이(들)을 포함할 수 있다. 구체적으로, Fc 파트너 서열은 효과 기능 예컨대 보체-의존적 세포독성 (CDC), 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존적 세포 식균작용 (ADCP)을 폐지하는 돌연변이(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 A-1 및 A-2를 이용한 IgG Fc 또는 이의 변이체(이종이량체)에 IgG1 효과 기능성의 제거를 위해 E233A, L235A 돌연변이가 도입될 수 있다. N297A 돌연변이를 포함하는 B-1 및 B-2를 이용한 이종이량체는 N-연결된 글리칸(N-linked glycan)의 제거를 위해 사용될 수 있다. C-1 및 C-2를 이용한 이종이량체는 IgG1 효과 기능성 및 N-연결된 글리칸의 제거를 위해, L234A, L235A, N297A 돌연변이가 도입될 수 있다.
상기 GDF15 변이체와 IgG Fc 또는 이의 변이체의 결합은 GDF15 변이체의 N-말단에 IgG Fc 또는 이의 변이체의 제1폴리펩타이드의 C-말단 또는 상기 제2폴리펩타이드의 C-말단이 결합되는 것일 수 있다. 또한, 상기 GDF15 변이체와 IgG Fc 또는 이의 변이체의 결합은 GDF15 변이체의 C-말단에 IgG Fc 또는 이의 변이체의 제1폴리펩타이드의 N-말단 또는 상기 제2폴리펩타이드의 N-말단이 결합되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 GDF15 변이체와 IgG Fc 또는 이의 변이체의 결합은 GDF15 변이체의 N-말단에 IgG Fc 또는 이의 변이체의 제1폴리펩타이드의 C-말단이 결합되는 것일 수 있다.
또한, 상기 GDF15 변이체와 IgG Fc 또는 이의 변이체의 결합은 링커를 통해 이루어지는 것일 수 있다. 상기 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 라이신 및 글루탐산 잔기를 포함하고, 10 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 상기 링커는 (G4S)n을 포함할 수 있으며, 이때 n은 1 내지 10의 정수 또는 2 내지 7의 정수일 수 있다. 예를 들면, 상기 n은 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, n이 5의 정수인 (G4S)5를 포함하는 링커를 사용하였다.
다만, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 (G4S)n 이외의 적합한 링커의 예로서, 상기 링커는 GS(G4S)n, GS(EEEA)n, (EEEA)n, GS(EAAAK)n, (EAAAK)n 또는 GSGGSS(PT)n을 포함할 수 있으며, 이때, n은 1 내지 10의 정수일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, n이 6의 정수인 GS(EEEA)6을 포함하는 링커 또는 n이 5의 정수인 GS(EAAAK)5를 포함하는 링커를 사용하였다.
구체적으로, 상기 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 48), GSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 92), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 93), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 94), GSEEEAEEEAEEEAEEEAEEEAEEEA(서열번호: 95), GSGGSSPTPTPTPTPTPTPTPTPTPT(서열번호: 96) 또는 GSEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(서열번호: 97)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 48), GSEEEAEEEAEEEAEEEAEEEAEEEA(서열번호: 95) 또는 GSEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(서열번호: 97)일 수 있다.
상기 지속형 GDF15 융합 단백질은 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드로 이루어진 이종이량체 하나 당 하나의 GDF15 변이체를 포함한다. 상기 GDF15 변이체는 적어도 하나의 N-연결된 글리칸(N-linked glycan)을 포함할 수 있다.
상기 지속형 GDF15 융합 단백질은 i) 서열번호 21 내지 39 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15 변이체, ii) 서열번호 42, 44 및 46 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 제1폴리펩타이드 및 iii) 서열번호 43, 45 및 47 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 제2폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 지속형 GDF15 융합 단백질은 i) 서열번호 21 내지 39 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15 변이체, ii) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 링커, iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 제1폴리펩타이드 및 iv) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 제2폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 지속형 GDF15 융합 단백질은 i) 서열번호 21 내지 39 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15 변이체, ii) 서열번호 92 내지 97 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 링커, iii) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 제1폴리펩타이드 및 iv) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 제2폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
융합단백질 이량체
상기 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체는 지속형 GDF15 융합 단백질 두 개를 포함한다. 구체적으로, 상기 2개의 지속형 GDF15 융합 단백질은 GDF15-GDF15 상호 작용을 통해 이량체화되며, 이를 "융합단백질 이량체"라고 명명하였다.
복합체
상기 복합체는 GDF15 (Growth differentiation factor-15) 변이체 및 IgG Fc를 포함하고, 상기 복합체는 하기 식 (II)로 표시된다:
IgG Fc - (L)m - N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 (II)
상기 m은 0 또는 1의 정수이고,
L은 서열번호 48, 92, 93, 94, 95, 96 및 97로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 링커이고,
IgG Fc는 서열번호 42, 44 또는 46의 아미노산 서열을 포함하고,
N-말단 확장 도메인 및 코어 도메인은 앞서 정의된 바와 같다.
하나의 실시예에서, 상기 N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인은 서열번호 21 내지 39로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 복합체는 서열번호 50-91 및 98-109로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다.
핵산분자, 발현벡터 및 숙주세포
상기 GDF15 변이체 또는 상기 지속형 GDF15 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "단리된 핵산 분자"는 전체 핵산이 공급원 세포로부터 단리될 때 그와 함께 자연에서 발견되는 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 약 50% 이상으로부터 분리되었거나, 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는, 보다 큰 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 단리된 핵산 분자에는 임의의 다른 오염 핵산 분자, 또는 폴리펩타이드 생산 또는 그의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도에서 그의 사용을 저해하는 그의 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물이 실질적으로 존재하지 않는다.
이때, 상기 GDF15 변이체 또는 상기 지속형 GDF15 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자는 코돈의 중복(redundancy)으로 인해 서로 상이한 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 단리된 핵산분자는 상기 GDF15 변이체 또는 상기 지속형 GDF15 융합 단백질을 생산할 수 있는 한 목적에 따라 적절히 변형되거나, N 말단 또는 C 말단에 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다.
상기 GDF15 변이체 또는 상기 지속형 GDF15 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "발현벡터"란, 숙주 세포의 형질전환에 적합하고 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 지시하거나 제어하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 상기 벡터는 선형(linear) 핵산, 플라스미드, 파지미드(phagemids), 코스미드(cosmids), RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 상기 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 및 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "이종 핵산 서열의 발현" 또는 "발현"은, 삽입된 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역, 및 융합 단백질 생산물 또는 항체 또는 항체 단편의 생산을 의미한다.
유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 유용한 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호 서열을 포함할 수 있다.
상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "숙주세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어, "형질전환된" 및 "형질감염된"은 당업계에 공지된 많은 기술에 의한 세포 내로의 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.
상기 숙주세포는 본 발명의 DNA 서열로 형질 전환되거나 형질 감염시킬 수 있으며, 목적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주 세포는 불사의 하이브리도마 세포(immortal hybridoma cells), NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cells), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CAP 세포 (인간 양수 유래 세포), 또는 COS 세포를 포함할 수 있다.
약학 조성물
본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 직접적으로(예, 조직 부위에 주입, 이식 또는 국부적으로 투여함으로써, 국소적으로) 또는 시스템적으로(예, 비경구 또는 경구로) 임의의 적절한 수단에 의하여 동물에게 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 정맥 내, 피하, 눈(ophthalmic), 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내(intraorbital), 뇌 내(intracerebral), 두개 내(intracranial), 척추 내(intraspinal), 뇌실 내(intraventricular), 수막강 내(intrathecal), 조내(intracistenal), 캡슐 내(intracapsular), 비 내(intranasal) 또는 에어로졸 투여와 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 약학 조성물은 예를 들면, 수성(aqueous) 이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함할 수 있다. 이에 따라, 담체 또는 운반체(vehicle)가 생리학적으로 허용가능하므로 조성물에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있다. 따라서, 제제를 위한 체액과 같은 담체로 일반적으로 생리식염수를 포함할 수 있다.
또한, 투여 빈도는 사용되는 제제 내의 GDF15 변이체의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 약학 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 약학 조성물은 단일 용량으로서, 시간 간격을 둔 2회 이상의 용량으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 정밀화는 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 그들에 의해 일상적으로 수행되는 업무 영역 내에 해당한다.
또한, 단위 투여량은 인간에 있어서 0.01 ㎍/kg 내지 100 mg/kg이며, 구체적으로, 1 ㎍/체중kg 내지 10 mg/kg이다. 상기 함량이 최적량이긴 하나, 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있으며, 최적의 투여량은 통상적인 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 융합 단백질의 투여는 주기적인 급속 주입(periodic bolus injections)에 의하거나, 외측 공급원(external reservoir) (예, 정맥주사 보유주머니(intravenous bag)) 또는 내측(예, 생체부식성 임플란트(bioerodable implant))으로부터의 지속적인 정맥 내, 피하, 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.
조성물의 투여
본 발명의 조성물은 치료하고자 하는 질환에 적당한 모든 경로에 의해 투여할 수 있다. 적합한 경로에는 경구, 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 흡입, 피내, 수막강내, 경막, 및 주입 기술 포함), 경피, 직장, 비내, 국소 (볼 및 설하 포함), 질, 복강내, 폐내 및 비내 투여가 포함된다. 국소 투여는 경피 패치 또는 이온삼투요법 장치와 같이 경피 투여를 이용하는 것을 포함할 수 있다. 약물의 제형화는 다음 문헌에 논의되어 있다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (1995) Mack Publishing Co., Easton, PA]. 약물 제형화의 기타 예는 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Vol 3, 2nd Ed., New York, NY].
바람직한 경로는, 예를 들어 수용자의 상태에 따라서 다양할 수 있다. 경구 투여하는 경우에는, 이를 제약상 허용되는 담체, 활택제 또는 부형제와 함께, 환제, 캅셀제, 정제 등으로서 제형화할 수 있다. 비경구 투여하는 경우에는, 이를 제약상 허용되는 비경구 비히클 또는 희석제와 함께, 단위 투여 주사제 형태로 제형화할 수 있다.
예방 또는 치료
본 발명의 조성물은 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료에 사용된다. 본 발명에 따른 조성물은 간지방 축적을 억제하는 효과가 있다.
「비알코올성 지방간질환」이란, 비알코올성 지방간 및 비알코올성 간지방증과 동일한 의미이다. 비알코올성 지방간질환에는, 비알코올성 지방간염(NASH) 및 단순성 지방간이 포함된다. 비알코올성 지방간질환은, 예를 들면, 분명한 음주력이 없음에도 불구하고, 간 조직 소견은 알코올성 간 장애와 유사한 주로 대적성의 간지방 침착을 특징으로 하는 간 장애로, 예후 양호한 단순성 지방간과 진행성의 비알코올성 지방간염을 포함하는 개념으로 정의된다.
본 발명은 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료를 위한 GDF15 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체의 용도를 제공한다. 본 발명은 GDF15 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 개체는 비알코올성 지방간질환 또는 비알코올성 지방간염을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
"치료"는 임의의 주관적 또는 객관적 매개변수, 예를 들어 경감; 관해; 환자에 대해 더 용인 가능한 증상 또는 손상 생성, 병리 또는 병태의 감소; 퇴보 또는 쇠퇴 속도의 늦춤; 덜 쇠약하게 하는 최종 퇴보 지점의 생성; 환자의 신체적 또는 정신적 웰빙의 개선을 포함하는 손상, 병리 또는 병태의 치료 또는 개선에서의 임의의 성공 징후를 지칭한다. 증상의 치료 또는 개선은 신체 검사, 신경정신병학적 검사 및/또는 정신 의학적 평가를 포함하는 객관적 또는 주관적 매개변수에 기반할 수 있다.
"유효량"은 일반적으로 증상의 중증도, 빈도를 감소시키거나, 증상, 근본적인 원인을 제거하거나 증상의 발생 또는 근본적인 원인을 예방하거나, 질환 상태로부터 초래되거나 또는 이와 관련된 손상을 개선시키거나 또는 교정하는 데 충분한 양이다. 일부 구현예에서, 유효량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량이다. "치료적 유효량"은 질환 상태 또는 증상, 특히 질환 상태와 관련된 상태 또는 증상을 교정하거나, 또는 질환 상태 또는 어떠한 방법으로든 질환과 관련된 임의의 다른 바람직하지 않은 증상의 진행을 달리 예방하거나, 방해하거나, 지연시키거나 또는 반전시키는 데 충분한 양이다. "예방적 유효량"은 대상체에게 투여될 때, 의도된 예방적 효과, 예를 들어, 질환 상태 개시의 예방 또는 지연, 또는 질환 상태 또는 관련 증상의 개시(또는 재발) 가능성 감소를 갖는 약제학적 조성물의 양이다. 본 발명에 따른 조성물의 치료적 유효량은 생물학적 또는 의학적 반응의 관찰 가능한 수준, 예를 들어 혈당, 인슐린, 트라이글리세라이드 또는 콜레스테롤 수준의 저하; 체중 감소; 또는 내당능, 에너지 소비량 또는 인슐린 민감성의 개선을 뒷받침하는 GDF15 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체의 양을 의미할 수 있다.
제품
상기 언급된 질병 및 장애의 치료에 유용한 GDF15 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체 및 GLP-1 수용체 작용제를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 이러한 키트는 복합 제형으로 공동-제형화하는 경우 단일 용기를 포함한다. 이러한 키트가 GDF15 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 포함하는 용기를 포함한다.
키트는 상기 용기와 연합되거나 그 위에 표지 또는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 상업적 패키지 내에 통상적으로 포함되는 지시 사항을 지칭할 수 있고, 이러한 치료 제품의 적응증, 활용, 투여량, 투여, 금기 사항 및/또는 사용에 관한 경고에 관한 정보를 포함하고 있다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 블리스터 팩 (blister pack) 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 선택된 질환, 예를 들어 비알코올성 지방간질환 또는 지방간염의 예방 또는 치료하는 데 사용된다는 것을 표시한다. 부가적으로, 제약상 허용되는 완충제, 예를 들어 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
추가로, GDF15 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 필요로 하는 환자에게 동시에, 순차적으로, 또는 별개로 투여하는 것에 관한 지시 사항을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 지속형 GDF15 융합 단백질 생산
실시예 1.1: 유전자 클로닝
우수한 활성 및 정제 후 순도 개선을 보이는 두 변이체(FM9+Fc_hole, FM11+Fc_hole)에 대한 융합 캐리어 및 링커 최적화 연구를 위하여 각 GDF15 서열에 효과 기능(effector function)을 최소화 하기 위한 융합 캐리어(서열번호 46 및 47) 및 다양한 링커(서열번호 92, 93, 94, 95, 96 및 97)를 도입한 지속형 GDF15융합 단백질을 디자인하였으며, 이를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure pat00001
구체적으로, Fc_크놉(knob)-(G4S)5-GDF15 변이체의 구조를 갖는 제1폴리펩타이드(FM series) 및 Fc_홀(Fc_hole) 구조를 갖는 제2폴리펩타이드를 생산하기 위해, 서열번호 98에서 109중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 제1폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 제2폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 pcDNA3.3 (Invitrogen) 발현벡터를 이용하여 유전자 클로닝을 진행하였다. 이때, 서열번호 98에서 109 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 ㈜마크로젠사에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 1.2: 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체)의 발현 및 정제
상기 실시예 1.1에서 클로닝한 pcDNA3.3 발현벡터를 ExpiCHO 세포주(Invitrogen)에 일시적 형질감염(transient transfection)시킨 후, 8일차에 세포배양액을 회수(harvest)하여 정제하였다. 상기 회수한 세포배양액(harvest cell culture fluid, HCCF) 내 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드를 정제하기 위해, Protein A resin을 이용한 친화성(Affinity) 정제를 수행하였다.
구체적으로, 1X PBS(pH 7.4)로 평형 상태가 이루어진 MabSelect SuRe Protein A resin(GE Healthcare)에 상기 회수한 세포배양액을 로딩하여 결합(binding)시켰다. 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드의 결합이 완료된 후, 상기 MabSelect SuRe Protein A resin을 1X PBS(pH 7.4)로 세척한 후, 최종 물질을 얻기 위해, 0.1 M 농도의 글리신(pH 3.5) 용액을 사용하여 용리(elution)하였다.
제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드를 1 M Tris-HCl 용액을 이용하여 약 pH 8.0 수준으로 중화하였다. 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드가 크놉 인 홀(knob-in-hole) 상호작용을 통해 완전히 이량체화되었으며, 이를 "지속형 GDF15 융합 단백질"로 명명하였다. 두 분자의 지속형 GDF15 융합 단백질은 GDF15-GDF15 상호 작용을 통해 다시 이량체화되며, 이를 "융합단백질 이량체"라고 명명하였다.
또한 고순도의 지속형 GDF15융합 단백질을 얻기 위하여, 1단계 정제를 완료한 풀링(pool)을 가지고 음이온 교환(Anion exchange, AEX) resin, 양이온 교환(Cation exchange, CEX) resin을 이용한 2단계 이온 교환(Ion exchange, IEX) 정제를 수행하였다.
구체적으로, 음이온 교환(AEX)의 경우, 1X PBS(pH7.4)로 평형 상태가 이루어진 POROS HQ 50 ㎛ Strong anion exchange resin(Thermofisher)에 상기 1단계 풀링을 로딩하여 결합시켰다. 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드의 결합이 완료된 후, 상기 POROS HQ 50 ㎛ Strong Anion Exchange resin을 1X PBS(pH7.4)로 세척한 후, 최종 물질을 얻기 위해, 1M 염화나트륨을 함유하는 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 용액을 사용하여 농도 구배에 의해 용리(elution)하였다. 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography) 분석을 이용하여 순도가 95% 이상의 기준을 충족시키는 분획을 풀링(pooling)하였다.
또한, 양이온 교환(CEX)의 경우, 20 mM 인산나트륨(pH6.5) 용액으로 평형 상태가 이루어진 POROS XS Strong Cation Exchange resin(Thermofisher)에 상기 1단계 풀링을 등전점(Isoelectric point)에 따라 pH조절 후 로딩하여 결합시켰다. 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드의 결합이 완료된 후, 상기 POROS XS Strong Cation Exchange resin을 20 mM 인산나트륨(pH6.5) 용액으로 세척한 후, 최종 물질을 얻기 위해, 1 M 농도의 염화나트륨을 함유하는 20 mM 인산나트륨(pH6.5) 용액을 사용하여 농도 구배에 의해 용리(elution)하였다. 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography) 분석을 이용하여 순도가 95% 이상의 기준을 충족시키는 분획을 풀링(pooling)하였다.
실시예 2: 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체)의 활성 측정
두 변이체(FM9+Fc_hole, FM11+Fc_hole)의 링커 타입 및 길이에 따른 GDF15활성 비교 평가를 수행하였다. 상기 GDF15 활성은 Bright-GloTM luciferase assay kit(Promega) 및 GFRAL/RET/SRE-luc가 과발현된 HEK293 세포주(Human embryonic kidney 293)를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 1×105 개의 GFRAL/RET/SRE-luc가 과발현된 HEK293 세포를 96-웰-플레이트(96-well-plate)의 각 웰에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 96-웰-플레이트의 각 배지를 50 ㎕의 무혈청배지로 교체하고 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 배양하였다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 지속형 GDF15 융합 단백질을 무혈청배지를 이용하여 2000 nM 농도에서부터 3배수 계열 희석(serial dilution) 하여 준비하였다. 그 후, 교체된 무혈청배지 50 ㎕ 및 GFRAL/RET/SRE-luc 세포주가 들어있는 각 웰에 지속형 GDF15 융합 단백질 희석액 50 ㎕를 첨가하여 실제 농도가 1000 nM에서 3배 계열 희석되도록 한 후, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후, Bright-GloTM 기질에 Bright-GloTM 버퍼를 첨가하여 만든 Bright-GloTM 용액을 각 웰에 100 ㎕씩 처리하고 1분간 상온에서 반응시켰다.
그 후, 발광(Luminescence) 측정이 가능한 마이크로플레이터 리더(microplate reader, Perkin Elmer, Wallac Victor X5)로 반응값(Relative light unit, RLU)을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2와 도면 1, 2에 나타내었다. 이때, FM9-6+Fc_hole의 시험관 내 GDF15 활성을 기준(Emax 100%)으로 GDF15 서열, 링커 타입 및 길이에 따른 지속형 GDF15융합 단백질의 활성을 비교하였다.
[표 2]
Figure pat00002
그 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 각 지속형 GDF15 융합 단백질은 링커 GS(EEEA)6(서열번호: 95)를 제외하고는 유사한 활성을 나타내었으며, 링커 GS(EEEA)6(서열번호: 95)로 연결된 지속형 GDF15 융합 단백질들(FM9-4+Fc_hole, FM11-4+Fc_hole)의 경우 상대적으로 낮은 EC50 값과 높은 Emax 수치를 나타내는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2).
실시예 3: 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체)의 콜린결핍-고지방 식이 (choline-deficient, L-amino acid defined, high-fat diet) 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델 (CDAHF식이 유도 NASH 마우스 모델) 에서의 항 지방간염 효과 평가
실시예 3.1: 콜린결핍-고지방 식이 (choline-deficient, L-amino acid defined, high-fat diet) 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델 (CDAHF식이 유도 NASH 마우스 모델)
비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 및 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 동물 모델은 식이 유도 모델, 화학물질 유도 모델, 유전자 변형 모델 및 복합 모델, 이 네 가지 유형으로 나눌 수 있다. 이 중 고지방이 함유된 식이 유도 모델은 과도한 양의 지질이 간에 쌓여 지방간을 유발하는 것이 주요 발병 메커니즘으로 이 모델은 인간 NAFLD와 유사하며 가장 흔한 NAFLD 동물 모델이다. 특히, CDAHF식이(choline-deficient, L-amino acid defined, high-fat diet)는 과당보다 훨씬 큰 비알코올성 지방간 유발인자로 간의 지질축적 및 콜레스테롤 축적을 가속화하여 간의 염증성 변화 및 섬유화가 추가적으로 나타난다.
5주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(Shizuoka Laboratory Center Inc., Japan)는 중앙실험동물(Central Lab. Animal Inc., Seoul, Republic of Korea)에서 구입하였다. 상기 C57BL/6J 마우스는 정상 사료(Teklad Certified Irradiated Global 18% Protein Rodent Diet, 2918C, Harlan Co., USA)로 1주간 적응사육 시킨 후, 6주령부터 CDAHF식이(choline-deficient, L-amino acid defined, high-fat diet, Research Diets, Cat# A06071302, USA)를 6주간 급이하여 약물 처리를 개시하였다. 약물 처리일 전날에 개별 마우스의 체중을 기준으로 군을 분리(군당 n=8)하였다. 그 후, FM9-6+Fc_hole 0.1, 1, 그리고 3 nmol/kg를 매일(QD) 총 8주간 피하투여 하였다. 체중은 실험기간(56일) 동안 주 2회 측정하였고, 이때 vehicle 처리는 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline, Gibco, USA)를 투여하였다. 시험물질을 투여하는 동안 CDAHF식이를 8주간 동시에 공급하여, 총 14주간 CDAHF식이를 급이하였다.
실시예 3.2: CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서의 체중, 간 무게, 및 간손상 관련 혈액지표에 대한 개선효과
FM9-6+Fc_hole 8주간 반복 투여한 결과, CDAHF식이 대조군(CDAHF vehicle) 대비 (5.1%), FM9-6+Fc_hole 0.1 nmol/kg 투여군에서 약 -0.04%***, FM9-6+Fc_hole 1 nmol/kg 투여군에서 약 -13.0%****, 그리고 FM9-6+Fc_hole 3 nmol/kg 투여군에서 약 -13.8%****의(***p<0.001, 및 ****p<0.0001 vs. CDAHF식이 대조군(CDAHF vehicle); Two-way ANOVA 분석법을 이용) 체중감소 효과를 나타냈다(도 3). 또한, 절식 체중을 고려한 상대적 간 무게(%)를 평가했을 때, FM9-6+Fc_hole 용량 의존적인 상대적 간 무게 감소를 확인하였다(도 4).
혈액 내 간손상 지표를 관찰했을 때, CDAHF식이유도 NASH 마우스(CDAHF vehicle)에서 정상대조군(Chow vehicle) 대비 ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase), ALP (alkaline phosphatase), 및 총 빌리루빈 (total bilirubin)이 유의적으로 증가하였다. FM9-6+Fc_hole를 투여했을 때, 용량의존적인 간손상 지표의 개선을 확인하였으며, FM9-6+Fc_hole 1 nmol/kg 투여군에서 통계학적으로 유의적인 AST 및 total bilirubin의 감소를, FM9-6+Fc_hole 3 nmol/kg에서 투여군에서 통계학적으로 유의적인 ALT, AST, ALP, 및 총 빌리루빈의 감소를 확인했다(도 5).
실시예 3.3: CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서의 조직학적 개선효과
정상대조군(Chow vehicle) 대비 CDAHF식이유도 NASH 마우스(CDAHF vehicle)에서 NAFLD activity score (NAS)가 유의적으로 증가하였고, FM9-6+Fc_hole 3 nmol/kg를 투여했을 때 유의적인 NAS 개선효과를 확인하였다(도 6). NAS를 항목별로 살펴보았을 때, FM9-6+Fc_hole 1 및 3 nmol/kg 투여군에서 steatosis score 및 hypertrophy score가 CDAHF식이 대조군(CDAHF vehicle)보다 더 낮은 score를 나타내는 것을 확인하였다(도 7). 간 조직의 중성지방을 분석했을 때 정상대조군 대비 CDAHF식이 대조군에서 약 1.7배 증가했으며, FM9-6+Fc_hole 투여에 의해 용량의존적으로 간 중성지방 수치가 감소하는 것을 확인하였고, 특히 FM9-6+Fc_hole 1 및 3 nmol/kg 투여군에서 통계학적인 유의성을 나타냈다(도 8). 또한, 간 조직의 H&E 염색 사진을 관찰했을 때, FM9-6+Fc_hole 1 및 3 nmol/kg 투여군에서 steatosis 감소를 육안으로 확인하였다(도 9).
PSR (Picro sirus stain) 분석법은 간 조직 내 콜라겐을 염색하는 분석법으로, 개체별 간 무게를 고려하여 total PSR contents (mg)로 도면 10에 나타냈다. 정상대조군(Chow vehicle) 대비 CDAHF식이 대조군(CDAHF vehicle)에서 유의적인 PSR 증가를 확인했고, FM9-6+Fc_hole 투여에 의해 용량의존적으로 total PSR contents가 감소했으며, 이는 FM9-6+Fc_hole 투여를 통해 간섬유화 진행이 억제됨을 의미한다. FM9-6+Fc_hole 1 및 3 nmol/kg 투여군에서 통계학적인 유의성을 나타냈다(도 10).
결론적으로 CDAHF식이유도 NASH 마우스 모델에서 FM9-6+Fc_hole을 투여했을 때 간 지방증 및 간 섬유화의 진행을 억제시켰고, 이는 비알코올성 지방간염이 개선되었음을 의미한다.
실시예 4: 지속형 GDF15 융합 단백질(이량체)의 ob/ob 마우스 모델 (유전자 변형에 의한 비만과 간 지방변성을 갖는 모델) 에서의 항 지방간염 효과 평가
실시예 4.1: ob/ob 마우스 모델
간세포 지방의 생성 및 제거는 다양한 유전자에 의해 조절되며, 그의 돌연변이, 결실, 과발현 또는 변형은 지방의 대사에 영향을 미칠 수 있어 지방간을 형성한다. 따라서 동물의 유전자에 인위적으로 관여하면 NAFLD 동물 모델을 만들 수 있다.
특히, ob/ob 마우스 모델은 렙틴(leptin) 유전자가 결핍된 유전자 변형모델로써 렙틴에 의한 식욕 억제가 조절되지 않아 자연적으로 비만이 발생하며 이로 인해 인슐린저항성에 의한 간지방변성을 갖는다.
5주령의 수컷 ob/ob(B6.Cg-Lepob/J) 마우스 와 C57BL/6J 마우스 (The Jackson laboratory, USA)는 라온바이오(Raonbio. Yong-in, Republic of Korea)에서 구입하였다. 상기 ob/ob 마우스와 C57BL/6J 마우스는 정상 사료(Teklad Certified Irradiated Global 18% Protein Rodent Diet, 2918C, Harlan Co., USA)로 적응사육 및 시험 종료 시까지 급이 하였고, 4주간 적응사육 후 약물 처리를 개시하였다. 약물 처리일 전날에 개별 마우스의 체중을 기준으로 군을 분리(군당 n=6)하였다. 그 후, FM9-6+Fc_hole 1 nmol/kg 와 대조물질로써 세마글루타이드 (Semaglutide) 30 nmol/kg(지속형 GLP-1 유도체)를 3일 간격(Q3D)으로 총 4주간 피하투여 하였다. 체중은 실험기간(26일) 동안 주 2회 이상 측정하였고, 이때 vehicle 처리는 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline, Gibco, USA)를 투여하였다.
실시예 4.2: ob/ob 마우스 모델에서의 체중, 간 무게, 및 간손상 관련 혈액지표에 대한 개선효과
FM9-6+Fc_hole 4주간 반복 투여한 결과, ob/ob 대조군(ob/ob vehicle) 대비 (19.67%), FM9-6+Fc_hole 1 nmol/kg 투여군에서 약 -8.24%****, 세마글루타이드 (Semaglutide) 30 nmol/kg (지속형 GLP-1 유도체) 투여군에서 약 7.66%** (**p<0.01, 및 ****p<0.0001 vs. ob/ob 대조군(ob/ob vehicle); Two-way ANOVA 분석법을 이용) 체중감소 효과를 나타냈다(도 11). 또한, 간 무게(g) 및 절식 체중을 고려한 상대적 간 무게(%)를 평가했을 때, FM9-6+Fc_hole 투여군에서 상대적 간 무게 감소를 확인하였다(도 12).
혈액 내 간손상 지표를 관찰했을 때, ob/ob 마우스(ob/ob vehicle)에서 정상대조군(Lean vehicle) 대비 ALT, AST, ALP, 총 콜레스테롤 (total cholesterol) 및 LDL-c (low density lipoprotein-cholesterol)이 유의적으로 증가하였다. FM9-6+Fc_hole를 투여했을 때, 간손상 지표의 개선을 확인하였으며, FM9-6+Fc_hole 1 nmol/kg 투여군에서 통계학적으로 유의적인 ALT, AST, ALP, 총 콜레스테롤 및 LDL-c의 감소를 확인했다(도 13).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> YUHAN CORPORATION <120> Composition For Preventing or Treating Non-Alcoholic Fatty Liver Disease or Non-Alcoholic Steatohepatitis Comprising Growth Differentiation Factor-15 Variant <130> P22-B042 <160> 109 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 20 25 30 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser 50 55 60 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 85 90 95 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core Domain (R21X, N56X, S64X, D103X) <400> 2 Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Xaa Ala 1 5 10 15 Ser Leu 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210 215 220 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser 245 250 255 Thr Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg 260 265 270 Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg 275 280 285 Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg 290 295 300 Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Arg Leu His Arg Leu Lys 305 310 315 320 Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro 325 330 335 Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr 340 345 350 Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 355 360 <210> 107 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge deleted human IgG1-Fc(L234A, L235A, N297A)(T366W)-GS(EEEA)6-GDF15 variant (delta N3, G4N, D5S, H6T, S64R/ FM11-4) <400> 107 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Glu Glu Glu Ala Glu 210 215 220 Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Glu 225 230 235 240 Glu Glu Ala Asn Ser Thr Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 245 250 255 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 260 265 270 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 275 280 285 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Arg 290 295 300 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 305 310 315 320 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 325 330 335 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 340 345 350 <210> 108 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge deleted human IgG1-Fc(L234A, L235A, N297A)(T366W)-GSGGSS(PT)10-GDF15 variant (delta N3, G4N, D5S, H6T, S64R/ FM11-5) <400> 108 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly Gly Ser Ser Pro 210 215 220 Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro 225 230 235 240 Thr Pro Thr Asn Ser Thr Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 245 250 255 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 260 265 270 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 275 280 285 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Arg 290 295 300 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 305 310 315 320 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 325 330 335 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 340 345 350 <210> 109 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge deleted human IgG1-Fc(L234A, L235A, N297A)(T366W)-GS(EAAAK)5-GDF15 variant (delta N3, G4N, D5S, H6T, S64R/ FM11-6) <400> 109 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys 210 215 220 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 225 230 235 240 Ala Ala Ala Lys Asn Ser Thr Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys 245 250 255 Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp 260 265 270 Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala 275 280 285 Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr 290 295 300 Arg Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val 305 310 315 320 Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly 325 330 335 Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys 340 345 350 Ile

Claims (21)

  1. 하기 식 (I)로 표시되는 GDF15 (Growth differentiation factor-15) 변이체, 지속형 GDF15 융합 단백질 또는 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 (식 I)
    상기 식 (I)에서,
    N-말단 확장 도메인은 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이고;
    코어 도메인은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 20의 아미노산 서열 중 15번째, 50번째, 58번째, 97번째 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드이며;
    상기 15번째 아미노산인 아르기닌(arginine, R)이 알라닌(alanine, A), 아스파르트산(aspartic acid, D), 아스파라긴(asparagine, N), 시스테인(cysteine, C), 글루탐산(glutamic acid, E), 글루타민(glutamine, Q), 글리신(glycine, G), 히스티딘(histidine, H), 이소루신(isoleucine, I), 루신(leucine, L), 리신(lysine, K), 메티오닌(methionine, M), 페닐알라닌(phenylalanine, F), 프롤린(proline, P), 세린(serine, S), 트레오닌(threonine, T), 트립토판(tryptophan, W), 티로신(tyrosine, Y) 또는 발린(valine, V)으로 치환되고,
    상기 50번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine, N)이 알라닌, 아르기닌(arginine, R), 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린으로 치환되며,
    상기 58번째 아미노산인 세린(serine, S)이 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린으로 치환되고, 또는
    상기 97번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린으로 치환됨.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 코어 도메인은 하기 (1) 내지 (6)의 변이들로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 변이를 포함하는 것인, 약학 조성물:
    (1) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 15번째 아미노산인 아르기닌(arginine, R)이 아스파라긴(asparagine, N)으로 치환됨;
    (2) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 50번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine, N)이 루신(leucine, L)으로 치환됨;
    (3) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 58번째 아미노산인 세린(serine, S)이 리신(lysine, K), 아르기닌(arginine, R), 아스파라긴(asparagine, N), 아스파르트산(aspartic acid, D), 글루탐산(glutamic acid, E), 시스테인(cysteine, C) 또는 루신(leucine, L)으로 치환됨;
    (4) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 97번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 루신(leucine, L)으로 치환됨;
    (5) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 50번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine, N) 및 97번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, D)이 시스테인(cysteine, C) 또는 세린(serine, S)으로 치환됨; 및
    (6) 서열번호 20의 아미노산 서열 중 15번째 아미노산인 아르기닌(arginine, R)이 아스파라긴(asparagine, N)으로 치환되고, 58번째 아미노산인 세린(serine, S)이 리신(lysine, K) 또는 아르기닌(arginine, R)으로 치환됨.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 코어 도메인이 서열번호 6 내지 19 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 GDF15 변이체가 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 확장 도메인 및 서열번호 8, 9 또는 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 코어 도메인을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 GDF15 변이체가 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 확장 도메인 및 서열번호 8, 9 또는 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 코어 도메인을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 GDF15 변이체가 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 확장 도메인 및 서열번호 6 내지 19 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 코어 도메인을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 GDF15 변이체가 서열번호 21 내지 39 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 지속형 GDF15 융합 단백질은 상기 GDF15 변이체와 인간 IgG Fc 또는 이의 변이체가 결합되는, 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 지속형 GDF15 융합 단백질 이량체는 지속형 GDF15 융합 단백질 두 개를 포함하는, 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 IgG Fc 또는 이의 변이체는 IgG1 Fc 서열을 포함하는 제1폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 가공된 돌출부(protuberance)를 포함하는 CH3 서열을 포함하는 상기 제1폴리펩타이드; 및
    IgG1 Fc 서열을 포함하는 제2폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 가공된 공동(cavity)을 포함하는 CH3 서열을 포함하는 상기 제2폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 제1폴리펩타이드의 돌출부와 상기 제2폴리펩타이드의 공동의 배치를 통해 제2폴리펩타이드와 이종이량체화되는 것인, 약학 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 GDF15 변이체의 N-말단에 IgG Fc 또는 이의 변이체의 제1폴리펩타이드 중 C-말단 또는 상기 제2폴리펩타이드의 C-말단이 결합되는 것인, 약학 조성물.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 GDF15 변이체와 IgG Fc 또는 이의 변이체의 결합은 링커를 통해 이루어지는 것인, 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 라이신 및 글루탐산 잔기를 포함하고, 10 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드인, 약학 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 48), GSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 92), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 93), GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 94), GSEEEAEEEAEEEAEEEAEEEAEEEA(서열번호: 95), GSGGSSPTPTPTPTPTPTPTPTPTPT(서열번호: 96) 또는 GSEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK(서열번호: 97)인 것인, 약학 조성물.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 제1폴리펩타이드가 서열번호 42, 44 및 46 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 제2폴리펩타이드가 서열번호 43, 45 및 47 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 GDF15 변이체가 적어도 하나의 N-연결된 글리칸(N-linked glycan)을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 지속형 GDF15 융합 단백질이 i) 서열번호 21 내지 39 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 GDF15 변이체, ii) 서열번호 42, 44 및 46 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 제1폴리펩타이드 및 iii) 서열번호 43, 45 및 47 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 제2폴리펩타이드를 포함하는 것인, 약학 조성물.
  19. 비알코올성 지방간질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 예방 또는 치료용 약학 조성물로, GDF15 (Growth differentiation factor-15) 변이체 및 IgG Fc를 포함하는 복합체를 포함하고, 상기 복합체는 하기 식 (II)로 표시되는 약학 조성물:
    IgG Fc - (L)m - N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 (II)
    상기 m은 0 또는 1의 정수이고,
    L은 서열번호 48, 92, 93, 94, 95, 96 및 97로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 링커이고,
    IgG Fc는 서열번호 42, 44 또는 46의 아미노산 서열을 포함하고,
    N-말단 확장 도메인 및 코어 도메인은 제1항에 정의된 바와 같다.
  20. 제19항에 있어서, 상기 N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인은 서열번호 21 내지 39로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 약학 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 복합체는 서열번호 50-91 및 98-109로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 약학 조성물.


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