KR20230092799A - 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 고리매개등온증폭 반응용 프라이머 및 프로브 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브에 대한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 LAMP RT-PCR을 수행하는 경우, SARS-CoV-2의 SARS-CoV-2의 N 유전자 및 RdRp 유전자가 정확하게 증폭되어 SARS-CoV-2를 검출할 수 있음을 확인하였고, 유사 베타코로나바이러스는 검출하지 않음을 확인하였으며, SARS-CoV-2 변이종인 오미크론도 우수하게 검출할 수 있음을 확인한 바, 본 발명은 SARS-CoV-2 또는 변이종의 검출 또는 진단에 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 및 이의 변이종을 특이적으로 검출할 수 있는 고리매개등온증폭 반응용 프라이머 및 프로브 세트에 대한 것이다.
제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)는 2019년 중국 후베이성의 우한시에서 처음 발견된 바이러스로, 코로나바이러스(Coroviridae) 군에 속하며 사스 코로나바이러스(SARS-CoV, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스), 메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV, 중동호흡기증후군 코로나바이러스)와 유사한 바이러스로 알려져 있다. 아직까지 명확한 감염원과 감염경로는 확인되지 않았으나, 우한 지역의 박쥐와의 접촉을 통해 감염되었을 가능성이 높고 사람 간 밀접접촉에 의한 전파가 가능하다고 보고되었다.
SARS-CoV-2는 사람과 다양한 동물에 감염될 수 있는 바이러스로서 유전자 크기 27~32kb의 RNA 바이러스이다. 코로나바이러스는 사람과 동물에 감염될 수 있는 바이러스로 유전자의 크기는 약 30kb의 RNA 바이러스이다. 질병관리본부가 지난 2월 27일에 국내 환자 6명으로부터 얻은 유전자를 분석한 결과 유전자 염기서열은 29,800개로 구성되어 있으며, 국외에서 발생한 환자 유래 바이러스의 유전자 염기서열과 99.7% 이상 동일하고 일부 0.03%(8 - 9개 염기)에서 차이가 나는 것으로 확인되었다. SARS CoV-2 유전자의 기능적 특성은 크게 구조유전자와 비 구조유전자로 구분된다. 구조유전자는 S(spike) 유전자, E(envelop) 유전자, M(Membrane) 유전자 , 그리고 N(nucleocapsid) 유전자로 구분되며, 비 구조유전자는 RdRp(RNA-dependent RNA polymerases) 유전자와 Mpro(Main protease) 유전자로 구분된다. SARS-CoV-2는 잠복기가 2주일 가량이며 무증상일 수도 있으나 발열을 동반한 기침, 호흡곤란, 숨가쁨, 가래 등 호흡기 증상을 주로 보이고, 그 이외에도 두통, 오한, 콧물, 근육통뿐만 아니라 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 복통, 설사 등 소화기 증상도 나타날 수 있다.
특히 SARS-CoV-2에 감염되도 무증상이라면 SARS-CoV-2 감염 여부에 대해서 확인하기 힘들다. 그러므로 SARS-CoV-2에 대하여 신속하면서도 정확한 진단 방법의 개발이 필요하다.
한편, SARS-CoV-2 감염증은 WHO에서 권고하는 ‘코로나바이러스감염증-19(COVID-19, Coronavirus Disease-2019, 코로나19)’라고 명명되었다.
COVID-19가 발생된 이래로 다양한 변종이 발생하였다. 새로운 코로나 바이러스 변이(B.1.1.529)인 오미크론(Omicron)이 2021년 11월 9일 수집된 표본에서 처음 확인됐으며, 아프리카공화국이 2021년 11월 24일 이를 보고하였고 세계보건기구 WHO는 이를 '우려 변이'로 분류하였다. 상기 '우려 변이'는 변이 바이러스의 전파나 치명률이 심각해지고, 현행 치료법이나 백신에 대한 저항력이 높아져 초기 조사가 진행 중일 때 분류되며, 상기 오미크론은 우려 변종(VOC)으로 분류되었다. 현재, COVID-19는 임상양상에 관계없이 검체에서 바이러스를 분리하거나 특이적인 바이러스 유전자를 검출하는 방법으로 진단된다. 빈번히 사용되는 유전자검사방법은 실시간 역전사 중합효소연쇄반응법(Real-time Reverse Transcription PCR, Real-time RT-PCR)으로 현재 다양한 프로토콜이 제시되었으며, 방법마다 검출하는 유전자 부위에 차이가 있다. 이러한 분자진단 검사법은 SARS-CoV-2 바이러스를 특정해 진단할 수 있는 '시약 키트'가 핵심으로, 채취된 검체로부터 바이러스 RNA를 추출 및 검사 이후 보고까지 총 4 - 6시간 이내 결과를 확인할 수 있다. 특히 공항 등 해외에서 인력이 유입되는 경우 적어도 1시간 내에 검사결과를 얻고자 All-in-one system으로 검체부터 유전자 증폭 및 결과확인이 가능하도록 개발되었으나 특정 장비에만 적용할 수 있는 폐쇄형(close type)의 방법인 문제점이 있다.
따라서 SARS-CoV-2 및 이의 변이종 또한 우수하게 검출할 수 있으며, 다양하게 적용가능한 검출 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 SARS-CoV-2 및 이의 변이종을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 개발하고, 상기 프라이머 및 프로브 세트가 SARS-CoV-2 및 이의 변이종만 특이적으로 검출함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 검출용 고리매개등온증폭(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP) 반응용 프라이머 및 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SARS-CoV-2 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SARS-CoV-2 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SARS-CoV-2 감염증의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 N 유전자를 타겟하는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 타겟하는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 고리매개등온증폭(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP) 반응용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SARS-CoV-2의 N 유전자를 타겟하는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 타겟하는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SARS-CoV-2의 N 유전자를 타겟하는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 타겟하는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에서 RNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트, 본 발명에 따른 검출용 조성물 또는 본 발명에 따른 검출용 키트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에서 RNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트, 본 발명에 따른 검출용 조성물 또는 본 발명에 따른 검출용 키트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 LAMP RT-PCR을 수행하는 경우, SARS-CoV-2의 N 유전자 및 RdRp 유전자가 정확하게 증폭되어 SARS-CoV-2를 검출할 수 있음을 확인하였고, 유사 베타코로나바이러스는 검출하지 않음을 확인하였으며, SARS-CoV-2 변이종인 오미크론도 우수하게 검출할 수 있음을 확인한 바, 본 발명은 SARS-CoV-2 또는 변이종의 검출 또는 진단에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브(N 유전자를 타겟하는 프로브는 FAM으로 표지, RdRp 유전자를 타겟하는 프로브는 Cy5로 표지, RPLP0 유전자를 타겟하는 프로브는 ROX로 표지) 세트를 이용하여 실시간 LAMP RT-PCR 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브(N 유전자 또는 RdRp 유전자를 타겟하는 프로브는 FAM으로 표지, RPLP0 유전자를 타겟하는 프로브는 HEX로 표지) 세트를 이용하여 실시간 LAMP RT-PCR 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브(N 유전자 또는 RdRp 유전자에 대한 프로브는 FAM으로 표지, ACTB 유전자에 대한 프로브는 HEX로 표지) 세트를 이용하여 실시간 LAMP RT-PCR 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS-CoV) 바이러스 검출 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 증동호흡기(메르스) 바이러스(Middle East Respiratory Syndrome, MERS-CoV) 검출 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 SARS-CoV-2 변이종 검출 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브(N 유전자 또는 RdRp 유전자를 타겟하는 프로브는 FAM으로 표지, RPLP0 유전자를 타겟하는 프로브는 HEX로 표지) 세트를 이용하여 실시간 LAMP RT-PCR 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브(N 유전자 또는 RdRp 유전자에 대한 프로브는 FAM으로 표지, ACTB 유전자에 대한 프로브는 HEX로 표지) 세트를 이용하여 실시간 LAMP RT-PCR 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS-CoV) 바이러스 검출 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 증동호흡기(메르스) 바이러스(Middle East Respiratory Syndrome, MERS-CoV) 검출 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 SARS-CoV-2 변이종 검출 여부를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 N 유전자를 타겟하는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 타겟하는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 고리매개등온증폭(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP) 반응용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
더불어 본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 LAMP 반응용 프라이머 및 프로브 세트는 RPLP0 유전자를 타겟하는 서열번호 13 내지 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 27로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및 ACTB 유전자를 타겟하는 서열번호 19 내지 서열번호 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 28로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
본 발명은 종래에 PCR, Real-time PCR 검출 기반으로 하는 것과 달리, 고리매개등온증폭(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)에 적용할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 SARS-CoV-2를 우수하게 검출할 수 있는 기술적 특징이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “고리매개등온증폭(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)”는 등온핵산증폭(isothermal nucleic acid amplification; iNAAT) 기술로서, 높은 수준의 특이성, 효율성 및 속도를 갖는 등온 조건에서 Bst DNA 중합 효소를 사용하여 핵산을 증폭시키는 기술이다. 단일 표적 유전자의 증폭을 위해 4개 또는 6개의 프라이머가 사용된다는 점에서 일반 PCR 방법과 차이가 있다.
LAMP는 PCR 대비 단순하고 비용 효율적인 장비의 사용과 높은 수준의 특이성 및 증폭 효율등의 큰 장점을 가진 분석방법이다. 예를 들면, LAMP 기법은 60-65°C 사이에서 수행되며, 일부 표적 분자가 109-1010 카피(copies)로 증폭되므로, 짧은 시간(10-15분) 내에 높은 제품 형성 속도 (>10 μg, >50X PCR 수율)를 보여, 실시간 정량적 PCR보다 높은 민감도를 보인다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 N 유전자를 타겟하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로 N 유전자에 있어서, KN-F3(서열번호 5) 및 KN-B3(서열번호 6)가 198bp의 증폭산물을 생성한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 7 내지 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 RdRp 유전자를 타겟하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로 RdRp 유전자에 있어서, KR-F3(서열번호 11) 및 KR-B3(서열번호 12)가 227bp의 증폭산물을 생성한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 13 내지 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 27로 표시되는 염기서열로 이루어진 염기서열을 갖는 프로브는 내부 대조군(Internal control)인 RPLP0 유전자를 타겟하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로 RPLP0 유전자에 있어서, KH-F3(서열번호 17) 및 KH-B3(서열번호 18)가 293bp의 증폭산물을 생성한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 19 내지 서열번호 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 28로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브는 ACTB 유전자를 타겟하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로 ACTB 유전자에 있어서, KA-F(서열번호 23) 및 KA-B(서열번호 24)가 202bp의 증폭산물을 생성한다.
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트에 포함되는 서열번호 1 내지 28로 표시되는 염기서열은 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 1 내지 28의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기 프라이머의 길이는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하는 온도와 밀접한 관계를 가지는데 일반적으로 길이가 길어질수록 온도는 높아지게 된다. 사용 목적에 따라 달라질 수는 있으나 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 15 내지 25 뉴클레오티드이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
본 발명에서, 용어 “내부 프라이머(inner primer)”는 주형 DNA에 결합하여 새로운 DNA 사슬 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에서, 용어 “외부 프라이머(outer primer)”는 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합한 위치보다 더 바깥쪽에서 주형 DNA에 결합하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합하여 DNA 사슬이 신장된 이후, 외부 프라이머와 주형 DNA의 결합으로 사슬 변위(strand displacement)가 발생하여 먼저 형성된 사슬이 떨어져 나오게 된다.
본 발명에서, 용어 “고리 프라이머(loop primer)”는 상기 내부 프라이머 및 외부 프라이머가 주형 DNA에 결합하여 형성된 초기 줄기 고리(stem loop) 구조 사슬이 고리(loop) 구조 생성 횟수를 증가시켜 결과적으로 전체반응을 가속화시킬 수 있도록 하는, 뉴클레오티드 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 프라이머 세트는 각 표적 서열의 6 개의 상이한 영역을 인식하기 위해 4개의 코어 프라이머, 즉 FIP(Forward Internal Primer, 정방향 내부 프라이머), BIP(Backward Internal Primer, 역방향 내부 프라이머), F3(Forward 3, 정방향 프라이머) 및 B3(Backward 3, 역방향 프라이머)를 포함하며, 또한 반응 속도의 향상을 위하여, LF(Loop Forward, 정방향 프라이머), LB(Loop Backward, 역방향 프라이머)를 포함한다. 상기 LF 및 LB 프라이머는 자동 사이클링 FIP 프라이머 및 BIP 프라이머에 대해 추가의 결합 부위를 생성함으로써 4개의 프라이머 LAMP 반응을 가속시키는 역할을 한다.
본 발명에서 있어서, 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 본 발명에서는 SARS-CoV-2의 N 유전자 또는 RdRp 유전자에 상보적으로 결합하거나, 내부 대조군인 RPLP0 유전자 또는 ACTB 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 프로브는 포스포르아미다이트고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 프로브는 5bp 내지 1000 bp의 길이일 수 있으며, 바람직하게는 10 bp 내지 100 bp일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 10 bp 내지 50 bp의 길이일 수 있으나, 바이러스 유전자의 변이 위치에 따라서 달라질 수 있으며, 그 길이를 제한하지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트는 SARS-CoV-2뿐만 아니라 SARS-CoV-2 변이종인 오미크론(Omicron)을 정확하게 검출함을 확인하였다.
특히, SARS-CoV-2와 같은 베타코로나바이러스(Betacoronaviruses)에 속하는 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS-CoV) 바이러스 및 증동호흡기(메르스) 바이러스(Middle East Respiratory Syndrome, MERS-CoV)에 대해서는 검출 효과를 보이지 않은 바, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 SARS-CoV-2및 SARS-CoV-2 변이종인 오미크론을 특이적으로 정확하게 검출하는 기술적 특징을 갖는다.
상기 LAMP는 이에 제한되는 것은 아니나, LAMP 역전사 중합효소 연쇄반응(LAMP RT-PCR)일 수 있다.
상기 LAMP RT-PCR 방법은 전기영동이 필요없이 Taqman 방식의 형광 프로브를 넣어 신속하고 간편하게 증폭유무를 눈으로 확인할 수 있다. 역전사효소를 통해 SARS-CoV-2 RNA로부터 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)가 합성되고 난 후, SARS-CoV-2에 대한 특이적 프라이머와 LAMP 프라이머가 함께 중합효소연쇄반응을 함으로써 상기 cDNA를 주형으로 PCR 증폭산물(amplicon)이 대량 증폭한다. 이때, PCR 주기의 연장 단계에서 Taq 폴리머레이즈(Taq polymerase)의 5’ 뉴클레아제 활성(nuclease activity)이 프로브를 분해하여 리포터 다이(reporter dye)와 소광자 다이(quencher dye)에서 분리되어 형광신호를 생성한다. 각 주기마다 추가적으로 리포터 다이 분자가 각각의 프로브에서 절단되면 형광 강도가 증가한다. 형광 강도는 각각 isothermal cycler 또는 real-time PCR 장비의 분석 소프트웨어에 의해 모니터링된다. 이와 같이 신속한 검출을 통하여 축적된 진단결과는 COVID-19 바이러스에 대한 역학조사 및 모니터링에 크게 기여할 수 있다.
더불어 본 발명은 SARS-CoV-2의 N 유전자를 타겟하는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 타겟하는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 조성물은 RPLP0 유전자를 타겟하는 서열번호 13 내지 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 27로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및 ACTB 유전자를 타겟하는 서열번호 19 내지 서열번호 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 28로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 검출용 조성물은 LAMP RT-PCR에 사용될 수 있으며, DNA 중합효소, dNTP 및 Mg2+ 이온을 포함하는 LAMP 반응 완충용액을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물에 있어서, 상기 프로브는 이의 5‘ 말단에 리포터가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 한다.
상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(5-hexachloro-fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 한다.
상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와 블랙(Iowa black)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 서열번호 25 내지 서열번호 28로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 프로브의 5' 말단쪽에 FAM, HEX, Cy5 또는 ROX가 결합될 수 있고, 3' 말단쪽에 BHQ가 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가적인 특징의 혼입이 가능하다. 즉, 본 발명에서 목적으로 하는 SARS-CoV-2를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 통상적인 수단을 이용하여 올리고뉴클레오타이드 서열을 변형할 수 있으며, 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩티드, 폴리 L 리신등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 망칼리화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명은 SARS-CoV-2의 N 유전자를 타겟하는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 타겟하는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공한다.
더불어 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 키트는 RPLP0 유전자를 타겟하는 서열번호 13 내지 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 27로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및 ACTB 유전자를 타겟하는 서열번호 19 내지 서열번호 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 28로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 키트는 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조할 수 있다. 더불어 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 증폭 반응에 첨가될 수 있는 시약이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 폴리머라제, dNTPs 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 이에 시약 및 도구로서 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 더불어 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
상기 키트는 SARS-CoV-2 검출을 위하여 하나 이상의 유전자를 타겟할 수 있는 키트인 것이 바람직하다. 바람직하게는 LAMP RT-PCR 키트일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어 본 발명은 시료에서 RNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트, 본 발명에 따른 검출용 조성물 또는 본 발명에 따른 검출용 키트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 가장 광범위한 의미로 사용되며, SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2 변이종에 감염된 것으로 의심되는 시료일 수 있다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 객담, 인두 또는 비인두 도말일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 추출을 위하여 당해 분야의 공지된 어느 방법도 제한없이 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면 실제 SARS-CoV에 감염된 환자 유래 검체로부터 상업적 RNA 추출 키트를 이용하여 RNA를 추출하였다. 또는 타겟 유전자가 포함된 플라스미드 DNA 클론을 이용하여 시험관내 전사(in vitro transcription)를 수행한 후 각각의 ssRNA(Single stranded RNA)를 수득하였다.
본 발명에 있어서, 상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미하며, 바람직하게는 LAMP 분석법일 수 있고, 보다 바람직하게는 LAMP RT-PCR일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 젤 전기영동, 모세관 전기영동, 비색법 및 실시간 형광 검출로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 이를 통해 SARS-CoV-2에 의해 감염된 질환의 진단을 위하여 활용될 수 있다.
따라서 본 발명은 시료에서 RNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트, 본 발명에 따른 검출용 조성물 또는 본 발명에 따른 검출용 키트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 진단을 위한 정보 제공 방법의 세부 내용은 앞선 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 검출용 조성물, 키트 및 SARS-CoV-2 검출 방법에 대해 서술한 바와 동일하다.
상기 SARS-CoV-2 감염증은 COVID-19 또는 오미크론(Omicron)일 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. SARS-CoV-2 검출용 RNA 준비
1-1. 검체 준비 및 RNA 추출
SARS-CoV-2에 감염된 환자로부터 하기도 검체인 비인두 도말을 수득하였다. 멸균된 면봉을 이용하여 환자의 콧구멍에 삽입한 후, 수차례 돌려서 도말을 수득하였다. 이의 50μl과 직접 용해 버퍼(Direct lysis Buffer (1% triton X-100, pH 8.8 Tris-HCl 25 mM) 200 μl를 혼합하고 공지된 RNA 추출키트(QIAamp DSP viral RNA Mini Kit, Qiagen, Germany)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 RNA를 추출하였다.
1-2. SARS-CoV-2 바이러스의 특정 유전자를 포함하는 DNA 절편이 포함된 클론 준비 및 RNA 추출
상기 SARS-CoV-2 바이러스의 특정 유전자로서 표준물질인 N 유전자와 RdRp 유전자를 포함하는 DNA 절편이 포함된 클론(pBluescript II SK(+)에 클로닝함)을 합성하였다. 표준물질인 ssRNA(Single stranded RNA)로 만들기위해 먼저 클론을 제한효소인 EcoRV로 절단하여 선형화 DNA(linearized DNA)를 만들고 전기영동 상에서 단일 밴드만을 잘라서 생체외 전사(in vitro transcription) 키트(mMESSAGE mMACHINE T7 Utra Kit, ThermoFisher Scientific Solution, USA)를 이용하여 ssRNA를 얻었다. 상기 ssRNA는 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 반응조건 수립시 표준 및 검체로 사용하였다.
실시예 2. SARS-CoV-2 검출용 프라이머 설계
본 발명의 발명자는 SARS-CoV-2 바이러스 관련 유전자의 구조유전자와 비구조 유전자를 분석한 후, 가장 변이가 빈번한 Spike 유전자는 배제하고 SARS-CoV-2 바이러스의 N 유전자와 RdRp 유전자를 본 발명의 프라이머 세트가 타겟하는 유전자로 결정하였다.
먼저 SARS-CoV-2 바이러스의 N 유전자와 RdRp 유전자를 NCBI 데이터베이스에서 확인하였다. SARS-CoV-2(NCBI accession no: NC_045512.2.)의 뉴클레오타이드(nucleotide) 유전체 전체를 확인하여 공지된 베타코로나 바이러스 중 SARS-CoV-2 바이러스의 변이(variation)를 모두 비교 분석하였다. 이를 통해 바이러스에 따라 특정 위치에 있을 수 있는 변이에 의해 PCR 증폭이 일어나지 못하는 경우의 수를 최대한 낮출 수 있도록 프라이머를 디자인하였다. 더불어 내부 대조군(Internal control)로서 RPLP0 유전자(NCBI accession no: NC_000012.12)와 ACTB 유전자(NCBI accession no: NC_NM_001101.5)를 검출할 수 있는 프라이머도 제작하였다.
제작된 프라이머 서열에 대해서 하기 표 1에 나타내었다.
| 유전자 명칭 | 프라이머 명칭 | 서열(5'-> 3') | mer | 위치(Position) (5'-3') | 증폭산물(Amplicon) (bp) | Gene Bank | 서열번호 |
| N | KN-FIP | ACTGCTGCCTGGAGTTGAGGCAGTCAAGCCTCTTCTCG | 39 | 28808-28827 | 198 (B3-F3) | NC_045512 | 1 |
| KN-BIP | TCTCCTGCTAGAATGGCTGGCATCTGTCAAGCAGCAGCAAAG | 42 | 28889-28910 | 2 | |||
| KN-LF | TGTTGCGACTACGTGATGAGGA | 22 | 28850-28829 | 3 | |||
| KN-LB | ATGGCGGTGATGCTGCTCT | 19 | 28911-28929 | 4 | |||
| KN-F3 | GCCAAAAGGCTTCTACGCA | 19 | 28774-28792 | 5 | |||
| KN-B3 | TTGCTCTCAAGCTGGTTCAA | 20 | 28971-28952 | 6 | |||
| RdRp | KR-FIP | GACAAGCTACAACACGTTGTATGTTCTAACATGCTTAGAATTATGGCCTC | 50 | 15320-15342 | 227 (B3-F3) | 7 | |
| KR-BIP | TGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATCCTGATGAGGTTCCACC | 44 | 15411-15436 | 8 | |||
| KR-LF | TGCGAGCAAGAACAAGTGA | 19 | 15361-15343 | 9 | |||
| KR-LB | GGCGGTTCACTATATGTTAAACCA | 24 | 15448-15471 | 10 | |||
| KR-F3 | GGGATTATCCTAAATGTGATAGAGC | 25 | 15290-15314 | 11 | |||
| KR-B3 | ACTATTAGCATAAGCAGTTGTGG | 23 | 15516-15494 | 12 | |||
| RPLP0 | KH-FIP | TTGCCCATCAGCACCACAGCCCAAGCAGATGCAGCAGATC | 40 | 1682-1701 | 293 (B3-F3) | NC_000012.12 | 13 |
| KH-BIP | ACACCATGATGCGCAAGGCCCCGGATATGAGGCAGCAGT | 39 | 1745-1764 | 14 | |||
| KH-LF | TTCCCGCGAAGGGACAT | 17 | 1721-1705 | 15 | |||
| KH-LB | AACCCAGCTCTGGAGAA | 17 | 1785-1802 | 16 | |||
| KH-F3 | TTCATTGTGGGAGCAGACAA | 20 | 1654-1674 | 17 | |||
| KH-B3 | GAACACAAAGCCCACATTCC | 20 | 1946-1927 | 18 | |||
| ACTB | KA-FIP | CAG GTC TTT GCG GAT GTC CAC TG GCA TCC ACG AAA CTA CC | 40 | 880-907 | 202 (B3-F3) | NM_001101.5 | 19 |
| KA-BIP | CGC CAA CAC AGT GCT GTC TG CTC CTT CTG CAT CCT GTC G | 39 | 1032-1014 | 20 | |||
| KA-LF | GTC ACA CTT CAT GAT GGA GTT G | 22 | 942-921 | 21 | |||
| KA-LB | CAT GTA CCC TGG CAT TGC | 18 | 996-1013 | 22 | |||
| KA-F | CTT CCA GCC TTC CTT CCT G | 19 | 867-885 | 23 | |||
| KA-B | TCT TCA TTG TGC TGG GTG C | 19 | 1068-1045 | 24 |
상기 표 1에 나타낸 본 발명의 프라이머 세트는 각 유전자를 검출하기 위하여 6개의 프라이머를 모두 사용하는 것을 특징으로 하며, 상기 서열번호 1 내지 24의 프라이머를 모두 사용하는 것을 특징으로 한다. 더불어 본 발명의 프라이머 세트는 각 표적 서열의 6 개의 상이한 영역을 인식하기 위해 4개의 코어 프라이머, 즉 FIP(정방향 내부 프라이머), BIP(역방향 내부 프라이머), F3(정방향 프라이머) 및 B3(역방향 프라이머)를 포함하며, 또한 반응 속도의 향상을 위하여, LF(정방향 프라이머), LB(역방향 프라이머)를 포함한다. 상기 LF 및 LB 프라이머는 자동 사이클링 FIP 프라이머 및 BIP 프라이머에 대해 추가의 결합 부위를 생성함으로써 4개의 프라이머 LAMP 반응을 가속시키는 역할을 한다.
N 유전자에 있어서, KN-F3(서열번호 5) 및 KN-B3(서열번호 6)가 198bp의 증폭산물을 생성하도록 설계하였고, RdRp 유전자에 있어서, KR-F3(서열번호 11) 및 KR-B3(서열번호 12)가 227bp의 증폭산물을 생성하도록 설계하였다. 더불어 RPLP0 유전자에 있어서, KH-F3(서열번호 17) 및 KH-B3(서열번호 18)가 293bp의 증폭산물을 생성하도록 설계하였고, ACTB 유전자에 있어서, KA-F(서열번호 23) 및 KA-B(서열번호 24)가 202bp의 증폭산물을 생성하도록 설계하였다.
실시예 3. SARS-CoV-2 검출용 프로브 설계
SARS-CoV-2 바이러스 관련 N 유전자 및 RdRp 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안하기 위해, 각 유전자에 존재하는 변형(intra variant) 염기서열도 분석하였다. 이를 기반으로 N 유전자형 및 RdRp 유전자형의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계하였다.
N 유전자형 특이적 프로브(N genotype specific probe)와 RdRp 유전자형 특이적 프로브(RdRp genotype specific probe)로서 올리고뉴클레오티드를 설계하였고, 확보한 RNA 서열을 컴퓨터 프로그램 Primer3을 활용하여 유전자형 특이적 프로브를 디자인하였다.
이때, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이는 20±3이고 65% GC가 포함되어 약 60±3℃가 되는 올리고뉴클레오티드로 설정하여 4종의 유형 특이적 프로브를 설계하였다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브의 명칭, 서열 및 유형은 하기 표 2에 나타내었다.
| 유전자 명칭 | 프로브 명칭 | 서열 (5'-> 3') | mer | 위치(5'-3') | Gene Bank | 서열번호 |
| N | KN-P | FAM-CGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGC-BHQ1 | 23 | 28915-28937 | NC_045512 | 25 |
| RdRp | KR-P | FAM-TGGTCATGTGTGGCGGTTCACTA-BHQ1 또는 Cy5-TGGTCATGTGTGGCGGTTCACTA-BHQ1 |
23 | 15437-15459 | 26 | |
| RPLP0 | KH-P | HEX-CCGAGGGCACCTGGAAAACAACC-BHQ1 또는 ROX-CCGAGGGCACCTGGAAAACAACC-BHQ1 |
23 | 1767-1789 | NC_000012.12 | 27 |
| ACTB | KA-P | HEX-CGGCACCACCATGTACCCTG-BHQ1 | 20 | 987-1006 | NM_001101.5 | 28 |
실시예 4. 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 LAMP-PCR 분석 조건
상기 실시예 2 및 실시예 3을 통해 설계한 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브를 이용한 LAMP-PCR 분석에 있어서, 조성 및 조건을 나타내었다.
| 구성요소(Component) | 용량(Volume (μl)) |
| 2x PCR Master mix | 10 |
| 프라이머 (N /RdRp / IC) | 1 / 1 / 1 |
| 프로브 (N /RdRp / IC) | 0.2 / 0.1 / 0.1 |
| Template RNA | |
| Total | 20 |
* N: N 유전자에 대한 프라이머 또는 프로브, RdRp: RdRp에 대한 프라이머 또는 프로브, IC: 내부대조군(RPLP0 또는 ACTB)에 대한 프라이머 또는 프로브.
더불어 cDNA 합성단계 포함 여부 및 사용 PCR 장비에 따른 조건을 하기에 나타내었다.
cDNA 합성단계를 포함하지 않으며, 등온 PCR(isothermal PCR) 장비를 사용하는 경우 조건을 하기 표 4에 나타내었다.
| Program | 사이클(Cycle) |
타겟온도(Target
temperature) |
유지시간(Hold
time) |
| 가열(Heating) | 80 ℃ | 2 분 | |
| LAMP 반응(reaction) | 1 | 62 ℃ | 20 분 |
cDNA 합성단계를 포함하지 않으며, 실시간 PCR(Realtime PCR) 장비를 사용하는 경우 조건을 하기 표 5에 나타내었다.
| Program | 사이클(Cycle) |
타겟온도(Target
temperature) |
유지시간
(Hold time) |
| 가열 | 80 ℃ | 2 분 | |
| LAMP 반응 | 20 | 62 ℃ | 20 분 |
cDNA 합성단계를 포함하며, 등온 PCR 장비를 사용하는 경우 조건을 하기 표 6에 나타내었다.
| Program | 사이클(Cycle) |
타겟온도(Target
temperature) |
유지시간
(Hold time) |
| 가열 | 80 ℃ | 2 분 | |
| 역전사(reverse transcription, RT) 반응 | 1 | 50 ℃ | 5 분 |
| LAMP 반응 | 1 | 62 ℃ | 20 분 |
cDNA 합성단계를 포함하며, 실시간 PCR 장비를 사용하는 경우 조건을 하기 표 7에 나타내었다.
| Program | 사이클(Cycle) |
타겟온도(Target
temperature) |
유지시간
(Hold time) |
| 가열 | 80 ℃ | 2 분 | |
| 역전사(reverse transcription, RT) 반응 | 1 | 50 ℃ | 5 분 |
| LAMP 반응 | 20 | 62 ℃ | 1 분 |
이에 있어, 4 채널(channel) 이상의 형광을 가진 실시간 PCR 장비 또는 등온 PCR 장비를 사용할 경우, SARS-CoV-2 타겟 N 유전자를 타겟하는 프로브의 5' 말단을 FAM으로 표지하였고, RdRp 유전자를 타겟하는 프로브의 5‘ 말단을 Cy5로 표지하였다. 더불어 IC 유전자를 타겟하는 프로브의 5’ 말단을 ROX로 표지하였다. 상기 프로브들의 3' 말단은 BHQ1으로 표지하였다.
또한 2 채널 정도의 형광을 가진 실시간 PCR 장비 또는 등온 PCR 장비를 사용할 경우, SARS-CoV-2 타겟 유전자(N 유전자 및 RdRp 유전자)를 타겟하는 프로브의 5' 말단은 FAM으로 표지하였고, IC 유전자를 타겟하는 프로브의 5’ 말단은 HEX로 표지하였다. 상기 프로브들의 3‘ 말단은 BHQ1으로 표지하였다.
실시예 5. 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 cDNA 합성단계를 제외한 실시간 LAMP RT-PCR 분석
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 LAMP RT-PCR 분석을 수행하였다. 이때 cDNA 합성 단계는 제외하였다. 상기 표 3에 나타낸 조성의 반응액 20μl당 각각 1×102 카피수의 SARS-CoV-2 바이러스 RNA를 넣고 상기 표 7의 조건으로 LAMP RT-PCR을 2회씩 수행하였다. 이에 있어 N 유전자를 타겟하는 프로브는 FAM으로 표지하였고, RdRp 유전자를 타겟하는 프로브는 Cy5로 표지하였으며, RPLP0 유전자를 타겟하는 프로브는 ROX로 표지하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, N 유전자의 경우 Cq 값이 각각 7.39 또는 7.68로 확인되었고, RdRp 유전자의 경우 Cq 값이 각각 7.1 또는 7.23로 확인되었으며, IC인 RPLP0 유전자의 경우 Cq 값이 각각 5.3과 5.41로 확인되었다.
본 발명의 실시간 LAMP RT-PCR 분석을 위해 사용한 CFX96 Dx system(BioRad)는 Quantification cycle로서 Ct(cycle threshold) = Cq (quantification cycle) = Cp (crossing point)로 값과 동일하게 사용된다. 주형(template) RNA를 N 유전자와 RdRp 유전자를 포함하는 표준물질 (1×102)로 이용하였기에 N 유전자와 RdRp 유전자는 증폭되어 Cq값을 나타냄을 확인하였다. 반면, RPLPO 유전자의 경우는 표준물질에 포함되어 있지 않기 때문에 증폭이 되지 않았다. 백그라운드(Background) 값으로 컷 오프(cut off 값)을 Cq 7로 설정시 비증폭됨을 확인하였다.
실시예 6. 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 cDNA 합성단계를 포함한 실시간 LAMP RT-PCR 분석
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 LAMP RT-PCR 분석을 수행하였다. 이때 cDNA 합성 단계를 포함하여 수행하였다. 상기 표 3에 나타낸 반응액 20μl당 각각 1×102 카피수의 SARS-CoV-2 바이러스 RNA를 넣고 상기 표 5의 조건으로 LAMP RT-PCR을 2회씩 수행하였다. 이에 있어 N 유전자 또는 RdRp 유전자를 타겟하는 프로브는 FAM으로 표지하였으며, RPLP0 유전자를 타겟하는 프로브는 HEX로 표지하였다. 더불어 LAMP PCR 분석 장비에 있어서, 한계값(Threshold)를 1,000으로 설정하여 Cq가 Cycle(time)으로 나오게 하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 주형 RNA를 N 유전자와 RdRp 유전자를 포함하는 표준물질(1×102)로 이용하였기에 N 유전자와 RdRp 유전자는 증폭되어 Cycle(time) 값을 나타냄을 확인하였다. 반면, RPLPO 유전자는 상기 표준물질에 포함되어 있지 않았기 때문에 증폭되지 않음을 확인하였다. 더불어 LAMP PCR 반응을 시작한지 5분부터 그래프가 나타나는 것을 확인하였으므로, 15분내로 결과를 확인할 수 있었다.
더불어 N 유전자 또는 RdRp 유전자에 대한 프로브는 FAM으로 표지하고, ACTB 유전자에 대한 프로브는 HEX로 표지하여 상기와 동일한 방법으로 LAMP RT-PCR을 2회씩 수행한 결과를 도 3에 나타내었다. 이때 다른 유전자에 대한 간섭 반응 여부를 확인하기 위하여 인체 세포주(Human cell line)인 A549(Cat No. CCL-185, ATCC, USA)로부터 상기 실험예 1-1과 동일한 방법으로 RNA를 추출하였다. 상기 RNA(100ng/μl)와 N 유전자와 RdRp 유전자를 포함하는 표준물질(1×102)을 혼합한 시료를 이용해 LAMP RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 도 3와 같이, N 유전자와 RdRp 유전자, 그리고 ACTB 유전자의 경우 모두 증폭되어 Cycle(time) 값을 나타냄을 확인하였다. 특히 인체 세포주 유래 RNA를 추가하였음에도 간섭 반응이 없었고, LAMP PCR 반응을 시작한지 5분부터 그래프가 나타나는 것을 확인할 수 있어 15분 안에 결과 확인이 가능함을 확인하였다.
실시예 7. 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 SARS-CoV-2 유사 베타 바이러스 검출 여부 확인
SARS-CoV-2와 같은 베타코로나바이러스(Betacoronaviruses)에 속하는 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS-CoV) 바이러스 및 증동호흡기(메르스) 바이러스(Middle East Respiratory Syndrome, MERS-CoV)에 대하여 본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브가 검출하는지 여부를 확인하였다(각 바이러스 구입처: AMPLIRUNⓡ SARS-CoV-2 coronavirus RNA control, Cat No. MBC137-R, Vircell, Spain) & AMPLIRUNⓡ MERS coronavirus RNA control, Cat No. MBC132, Vircell, Spain).
상기 표 3에 나타낸 반응액 20 μl당 고농도 약 1x104 카피수의 SARS-CoV RNA 농도를 넣고 표 7의 조건으로 실시간 LAMP RT-PCR을 수행하였다.
이때 N 유전자에 대한 프로브는 FAM로 표지하였고, RdRp 유전자에 대한 프로브는 Cy5로 표지하였으며, RPLP0 유전자에 대한 프로브는 ROX로 표지하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 호흡기 바이러스 가운데 하나인 SARS-CoV RNA에 있어서, N 유전자와 RdRp 유전자는 증폭되거나 검출되지 않음을 확인하였다.
상기 표 3에 나타낸 반응액 20 μl당 고농도 약 1x104 카피수의 MARS-CoV RNA 농도를 넣고 표 7의 조건으로 실시간 LAMP RT-PCR을 수행하였다.
이때 N 유전자에 대한 프로브는 FAM로 표지하였고, RdRp 유전자에 대한 프로브는 Cy5로 표지하였으며, RPLP0 유전자에 대한 프로브는 ROX로 표지하였다. 그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 호흡기 바이러스 가운데 하나인 MARS-CoV RNA에 있어서, N 유전자와 RdRp 유전자는 증폭되거나 검출되지 않음을 확인하였다.
그러므로 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트는 SARS-CoV-2만 특이적으로 검출함을 확인하였다.
실시예 8. 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 SARS-CoV-2 변이종 검출 여부 확인
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브를 이용하여 SARS-CoV-2 변이종인 오미크론(omicron)의 검출 여부를 확인하였다(구입처: AMPLIRUNⓡ SARS-CoV-2 OMMICRON RNA Control (Cat. No. MBC413-R, Vircell Microbiologists, Spain)).
상기 표 3에 나타낸 반응액 20 μl당 고농도 약 1x103 카피수의 오미크론 RNA를 넣고 하기 표 8의 조성 및 상기 표 6의 조건으로 실시간 LAMP RT-PCR을 수행하였다.
| 구성요소(Component) | 용량(Volume (μl)) |
| 2x PCR Master mix | 10 |
| 프라이머 (N /RdRp / IC) | 1 / 1 / 1 |
| 프로브 (N /RdRp / IC) mix | 1 |
| Omicron RNA control (1x103 copy/μl㎕ ) | 1 |
| DW | 5 |
| Total | 20 |
이때 N 유전자에 대한 프로브는 FAM로 표지하였고, RdRp 유전자에 대한 프로브는 Cy5로 표지하였으며, RPLP0 유전자에 대한 프로브는 HEX로 표지하였다. 그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브는 SARS-CoV-2 변이종인 오미크론도 우수하게 검출함을 확인하였다. 한편 FAM의 Cq가 당겨질수록 HEX 채널 간섭이 나타났지만, 이는 LAMP PCR 분석장비의 채널 간섭에 의한 것으로 결과 판독에는 영향을 미치지 않았다.
종합적으로 본 발명은 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 프로브에 대한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 LAMP RT-PCR을 수행하는 경우, SARS-CoV-2의 N 유전자 및 RdRp 유전자가 정확하게 증폭되어 SARS-CoV-2를 우수하게 검출할 수 있음을 확인하였고, 유사 베타코로나바이러스는 검출하지 않음을 확인하였으며, SARS-CoV-2 변이종인 오미크론도 우수하게 검출할 수 있음을 확인한 바, 본 발명은 SARS-CoV-2 또는 변이종의 검출 또는 진단에 유용하게 활용할 수 있다.
Claims (23)
- 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 N 유전자를 타겟하는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및
SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 타겟하는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 고리매개등온증폭(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP) 반응용 프라이머 및 프로브 세트.
- 제 1항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 검출용 LAMP 반응용 프라이머 및 프로브 세트는 RPLP0 유전자를 타겟하는 서열번호 13 내지 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 27로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및
ACTB 유전자를 타겟하는 서열번호 19 내지 서열번호 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 28로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 추가적으로 더 포함하는 것인, SARS-CoV-2 검출용 LAMP 반응용 프라이머 및 프로브 세트.
- 제 1항에 있어서,
상기 프라이머 및 프로브 세트는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2 변이종을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출용 LAMP 반응용 프라이머 및 프로브 세트.
- 제 3항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 변이종은 오미크론(Omicron)인 것인, SARS-CoV-2 검출용 LAMP 반응용 프라이머 및 프로브 세트.
- 제 1항에 있어서,
상기 LAMP는 LAMP 역전사 중합효소 연쇄반응(LAMP RT-PCR)인 것인, SARS-CoV-2 검출용 LAMP 반응용 프라이머 및 프로브 세트.
- SARS-CoV-2의 N 유전자를 타겟하는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및
SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 타겟하는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 조성물.
- 제 6항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 검출용 조성물은 RPLP0 유전자를 타겟하는 서열번호 13 내지 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 27로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및
ACTB 유전자를 타겟하는 서열번호 19 내지 서열번호 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 28로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 추가적으로 더 포함하는 것인, SARS-CoV-2 검출용 조성물.
- 제 6항에 있어서,
상기 LAMP는 LAMP 역전사 중합효소 연쇄반응(LAMP RT-PCR)인 것인, SARS-CoV-2 검출용 조성물.
- 제 6항 또는 제 7항에 있어서,
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물.
- 제 9항에 있어서,
상기 검출용 조성물은 LAMP RT-PCR에 사용되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물.
- 제 6항 또는 제 7항에 있어서,
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물.
- 제 11항에 있어서,
상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(5-hexachloro-fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물.
- 제 6항 또는 제 7항에 있어서,
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물.
- 제 13항에 있어서,
상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와 블랙(Iowa black)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물.
- SARS-CoV-2의 N 유전자를 타겟하는 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 25로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및
SARS-CoV-2의 RdRp 유전자를 타겟하는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 26로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트.
- 제 15항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 검출용 키트는 RPLP0 유전자를 타겟하는 서열번호 13 내지 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 27로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브; 및
ACTB 유전자를 타겟하는 서열번호 19 내지 서열번호 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 28로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브;를 추가적으로 더 포함하는 것인, SARS-CoV-2 검출용 키트.
- 제 15항에 있어서,
상기 키트는 LAMP RT-PCR 키트인 것인, 검출용 키트.
- 시료에서 RNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 RNA를 주형으로 하고, 제 1항에 따른 프라이머 및 프로브 세트, 제 6항에 따른 검출용 조성물 또는 제 15항에 따른 검출용 키트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 방법.
- 제 18항에 있어서,
상기 증폭 반응은 LAMP RT-PCR인 것인, SARS-CoV-2 검출 방법.
- 제 18항에 있어서,
상기 시료는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2 변이종에 감염된 것으로 의심되는 시료인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 방법.
- 제 18항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 젤 전기영동, 모세관 전기영동, 비색법 및 실시간 형광 검출로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것인, 검출 방법.
- 시료에서 RNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 RNA를 주형으로 하고, 제 1항에 따른 프라이머 및 프로브 세트, 제 6항에 따른 검출용 조성물 또는 제 15항에 따른 검출용 키트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증의 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제 22항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 감염증은 COVID-19 또는 오미크론(Omicron)인 것인, ARS-CoV-2 감염증의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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| Date | Code | Title | Description |
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| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20221215 |
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| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20241118 Patent event code: PE09021S01D |