KR20230100951A

KR20230100951A - 지황의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커

Info

Publication number: KR20230100951A
Application number: KR1020210190649A
Authority: KR
Inventors: 서지호; 안희준; 이용재
Original assignee: 주식회사 한국인삼공사
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2023-07-06
Anticipated expiration: 2041-12-29
Also published as: KR102750762B1

Abstract

본 발명은 지황의 토강 품종을 판별하는데 유용하게 사용될 수 있는 단일염기다형성(SNP)을 갖는 유전자 마커, 상기 마커를 이용한 지황의 토강 품종의 판별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 PCR 조성물 또는 키트, 및 이를 이용한 지황의 토강 품종의 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 지황의 토강 품종을 이와 매우 유사한 외형과 유전적 특징을 갖는 지황의 다른 품종과 용이하게 구별할 수 있고, 이로써 유사 품종의 혼입 여부를 용이하게 확인함으로써, 수요자에게 지황의 토강 품종을 안정적으로 제공할 수 있다.

Description

지황의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커{Genetic Marker Having Single Nucleotide Polymorphism For Distinguishing Varieties Of Rehmannia}

본 발명은 지황의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)을 갖는 유전자 마커 및 이를 이용하여 지황의 품종, 특히 토강 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 판별 방법에 관한 것이다.

지황은 중국이 원산지이고 약용식물로 재배한다. 현삼과 식물이며 뿌리는 굵고 육질이며 옆으로 뻗고 붉은빛이 도는 갈색이다. 줄기는 곧게 서고 높이가 20∼30 ㎝이며 선모가 있다. 뿌리에서 나온 잎은 뭉쳐나고 긴 타원 모양이며 끝이 둔하고 밑 부분이 뾰족하며 가장자리에 물결 모양의 톱니가 있고, 잎 표면은 주름이 있으며, 뒷면은 맥이 튀어나와 그물처럼 된다. 줄기에 달린 잎은 어긋난다. 개화기는 6∼7월이며 꽃은 붉은빛이 강한 연한 자주색으로 피고, 열매는 삭과이고 10월에 익는다. 한방에서는 뿌리의 생것을 생지황, 건조시킨 것을 건지황, 쪄서 말린 것을 숙지황이라고 한다. 숙지황은 보혈제로 쓰이고 강장, 당뇨병, 혈압강하, 생리불순·허약 체질·어린이의 발육 부진·치매·조루증·발기부전에 사용하며, 생지황은 해열, 해독, 강심, 토혈, 코피, 자궁 출혈·생리불순·변비에 사용하고, 건지황은 열병 후에 생기는 갈증과 장기 내부의 열로 인한 소갈증에 효과가 있으며 토혈과 코피를 그치게 하는 것으로 알려져 있다. 지황의 뿌리에 케타폴(catapol)이라는 이리도이도 글리코시드(iridoid glycoside)가 많이 함유되어 있으므로 지황이 노화관련 질병에 효과가 있을 것으로 생각된다(특허문헌 1).

지황은 약용작물로 육성되어 여러 품종이 등록되어 있으며, 재래종을 포함하여 토강, 다강, 고강, 등의 품종이 대표적으로 사용되고 있다. 현재까지 지황의 품종을 구별할 수 있는 수준의 유전자 데이터베이스는 구축되어 있지 않으며, 전장 유전체에 대한 정보도 없는 상태이다. 또한, ITS(Internal Transcribed Spacer) 유전자를 이용한 분석에서도 일반적으로 재배되고 있는 재래종과 지황의 다른 품종들, 특히 토강 품종과의 구별은 불가능한 것으로 나타나 있다(도 1 참조).

본 발명자는 약용작물로 개발되어 보급되고 있는 다양한 지황 품종을 구별할 수 있는 방법에 대해 연구하였고, 다른 품종으로부터 토강 품종을 구별할 수 있는 단일염기다형성 부위를 찾아내었으며, 이로부터 토강 품종에 특이적인 프라이머 및 프로브를 설계하여 토강 품종을 용이하게 구별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 제10-2009-0072850호

본 발명은 지황의 토강 품종을 판별할 수 있는 유전자 마커, 조성물, 프라이머 세트, 또는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 지황의 토강 품종을 판별할 수 있는 유전자 마커, 조성물, 프라이머 세트, 또는 키트를 사용하여 다양한 품종으로부터 토강 품종을 판별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열의 194번째 단일염기다형성(SNP) 위치를 포함하는 8개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 유전자 마커를 제공한다.

한 구현예에서, 상기 유전자 마커는 지황의 토강 품종을 지황의 고강, 다강, 지황1호, 및 재래종 품종과 구별하기 위한 것이지만 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 구현예에서, 상기 유전자 마커는 서열번호 1의 44번째 내지 343번째 염기서열의 194번째 SNP 위치를 포함하는 8개 내지 300개의 연속적인 뉴클레오티드, 예컨대 서열번호 1의 44번째 내지 343번째 염기서열의 194번째 SNP 위치를 포함하는 8개 내지 200개, 또는 10개 내지 100개, 12개 내지 98개, 또는 18개 내지 30개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태는 서열번호 1 및 그 상보적인 염기서열에 결합하여 본 발명의 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 토강 품종의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

한 구현예에서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 2의 염기서열로 구성된 제1 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 제2 프라이머;를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 PCR 조성물, 또는 본 발명의 프라이머 세트 또는 PCR 조성물을 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 키트를 제공한다.

한 구현예에서, 본 발명의 PCR 조성물 및 키트는 지황의 토강 품종의 판별용 유전자 마커에 특이적으로 결합하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 프로브는 5' 말단에 리포터(Reporter)가 부착되어 있거나, 3' 말단에 퀀쳐(Quencher)가 부착되어 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 염기 서열의 194번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 4의 염기 서열로 구성된 제1 프로브 및 서열번호 5의 염기 서열로 구성된 제2 프로브의 쌍을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

한 구현예에서, 상기 리포터는 Hex, Joe, Fam, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드, 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa Fluor), ROX, 텍사스 레드(texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(cyanine) 계열 염료, 또는 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 구현예에서, 상기 퀀쳐는 블랙홀 퀀쳐-1(Black Hole Quencher-1, BHQ-1), BHQ-2, BH3-3, ROX(carboxy-X-rhodamine), 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀쳐(Blackberry Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, 또는 IRDye QC-1일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태는 1) 식물 시료로부터 유래한 주형 DNA와 전술한 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 상기 혼합물을 PCR 증폭시켜 증폭 산물을 형성하는 단계;를 포함하고, 선택적으로 3) 상기 증폭 산물을 검출 또는 정량하는 단계;를 추가로 포함하는 지황의 토강 품종의 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커, 상기 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 사용한 판별 방법에 따르면 지황의 토강 품종을 이와 매우 유사한 외형과 유전적 특징을 갖는 지황의 다른 품종과 용이하게 구별할 수 있고, 이로써 유사 품종의 혼입 여부를 용이하게 확인함으로써, 수요자에게 지황의 토강 품종을 안정적으로 제공할 수 있다.

도 1은 지황의 토강 품종과 재래종의 ITS 염기 서열을 분석한 결과의 일부를 나타낸 것이다.
도 2는 지황의 토강 품종에 특이적인 5개의 SNP 후보에 대한 NGS 분석 정보를 요약한 것으로서, NGS 분석을 통해 gene_1015 콘티그(contig)에서 나타난 염기서열 다형성 부위 5곳의 각 품종별 빈도율을 나타낸 표이다.
도 3은 상이한 지황 품종을 구별할 수 있는 유전자 마커를 확인하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 유전자 마커의 SNP 위치에서 지황의 토강, 고강, 다강, 및 지황1호 품종의 염기에 대한 NGS 결과를 생어 염기서열 분석법으로 검증한 정보를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 유전자 마커, 프라이머, 및 프로브에 대한 염기 서열 정보를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR을 통해 지황의 토강 품종을 지황의 고강, 다강, 지황1호 품종과 구별할 수 있음을 보여주는 그래프이다.

먼저, 본 발명에서 사용된 용어를 설명한다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 달리 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 비제한적으로 포함하는 의미로 사용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건 하에서 프라이머 또는 프로브가 표적 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로(substantially) 상보적 및 완전히(perfectly) 상보적인 것을 모두 포괄하는 의미를 갖고, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "특이적"은 본 발명의 프라이머 또는 프로브가 다양한 지황 품종들 중에서 어느 하나 또는 일부의 품종에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하는 것을 허용하도록 설계된다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 따라 결정될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "PCR"은 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열의 194번째 단일염기다형성(SNP) 위치를 포함하는 8개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 유전자 마커를 제공한다.

바람직한 구현예에서, 상기 유전자 마커는 다양한 품종의 지황으로부터 토강 품종을 구별할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

한 구현예에서, 본 발명의 유전자 마커는 서열번호 1의 염기서열의 44 내지 343번째 폴리뉴클레오티드의 일부로서 SNP 위치인 194번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 300개, 예컨대, 8개 내지 200개, 10개 내지 100개, 12개 내지 98개, 15개 내지 80개, 18개 내지 50개, 바람직하게는 18개 내지 30개, 보다 바람직하게는 18개 내지 24개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 SNP는 유사한 외형을 갖는 서로 다른 종의 판별에 직접적으로 사용될 수 있는 매우 안정적인 유전자 마커이다. 본 발명의 SNP 마커를 지황의 토강 품종을 판별하는데 사용할 수 있는 것은 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 194번째 염기가 T로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 예를 들어, 서열번호 1의 194번째 염기에 해당하는 SNP는 T 또는 C로 염기다형성을 나타내는데, 이 SNP에서 T를 갖는 종은 지황의 토강 품종으로, C를 갖는 종은 지황의 다른 품종, 예컨대 재래종, 고강, 다강, 지황1호 등의 품종으로 판단할 수 있다.

본 발명은 상기 서열번호 1의 서열에서 해당 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.

또한, 본 발명은 단일염기다형성을 갖는 상기 유전자 마커를 이용하여 지황의 토강 품종을 판별할 수 있는 단일염기다형성 마커 조성물, 프라이머 세트, 프로브, 및 키트를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 지황의 토강 품종의 판별용 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 프라이머 쌍은 각각 서열번호 1 및 그 상보적인 염기서열에 결합하여 상기 지황의 토강 품종의 판별용 유전자 마커를 증폭할 수 있는 임의의 뉴클레오티드 서열을 비제한적으로 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명의 프라이머 쌍은 서열번호 2의 염기서열로 구성된 제1 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 제2 프라이머;를 포함할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 프라이머는 표적 유전자 마커에 인접한 영역의 DNA 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 프라이머는 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 충분한 상보성을 가질 수 있는 것이면 본 발명에 적용할 수 있으므로, 프라이머는 주형인 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없다. 또한 본 발명의 프라이머는 지황의 토강 품종의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열 내의 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오타이드 유사체(analogue), 예를 들면 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 지황의 토강 품종의 판별용 프라이머 세트를 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 지황의 토강 품종의 판별용 프라이머 세트 또는 상기 지황의 토강 품종의 판별용 조성물을 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 지황의 토강 품종의 판별용 조성물 또는 상기 키트는 본 발명의 지황의 토강 품종의 판별용 유전자 마커를 검출하기 위한 프로브를 추가로 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명의 프로브는 서열번호 1 또는 그의 일부인 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 4의 염기 서열로 구성된 제1 프로브 및 서열번호 5의 염기 서열로 구성된 제2 프로브의 쌍을 포함할 수 있다.

상기 프로브의 쌍은 해당 유전자 마커의 SNP 위치에서 지황의 품종에 따른 서로 다른 염기를 특이적으로 검출하기 위한 것이다. 예컨대, 상기 제1 프로브는 그 서열 내에 서열번호 1의 SNP 위치인 194번째 염기에 대응하는 염기로서 토강 품종을 검출하기 위한 "A"를 포함하고, 상기 제2 프로브는 그 서열 내에 서열번호 1의 SNP 위치인 194번째 염기에 대응하는 염기로서 재래종, 고강, 다강, 지황1호 품종을 검출하기 위한 "G"를 포함한다. 따라서, 본 기술분야의 통상의 기술자라면, 서열번호 1의 SNP 위치인 194번째 염기에 대응하는 서로 다른 염기(즉, "A" 및 "G")를 각각 포함하는 한, 서열번호 1의 유전자 마커에 대한 프로브 쌍은 제1 및 제2 프로브의 염기 서열, 즉 서열번호 4 및 서열번호 5와 상이할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이는 서열번호 2 내지 서열번호 3 또는 그의 일부인 유전자 마커의 경우에도 동일하게 적용될 수 있다.

한 구현예에서, 상기 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 적절히 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 또는 퀀쳐가 프로브의 말단에 부착될 수 있다.

상기 프로브의 5' 말단에는 리포터로서 Fam이 부착되어 있을 수 있고, 형광을 나타내는 다른 형광 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 리포터는 플루오레신, 플루오레신 클로로트리아지닐, 로다민 그린, 로다민 레드, 테트라메틸로다민, FITC, 오레곤 그린, 알렉사 플루오로, ROX, Hex, Joe, Fam, 텍사스 레드, TET, TRITC, TAMRA, 시아닌 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌 염료로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 프로브의 3' 말단에는 퀀쳐로서 BHQ-1이 부착되어 있을 수 있고, 퀀쳐로서 사용될 수 있는 다른 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 퀀쳐는 BHQ-2, BH3-3, ROX, 답실, TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀쳐, Qxl, 아이오와 블랙 FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

한 구현예에서, 특정 유전자 마커에 대한 프로브 쌍은 서로 다른 리포터가 각각의 프로브의 말단에 부착될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 유전자 마커에 대한 서열번호 4 및 서열번호 5의 프로브 쌍은 그 5'-말단에 각각 Fam 및 Hex가 부착될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징으로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 식물 시료로부터 유래한 주형 DNA와 상기 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 상기 혼합물을 PCR 증폭시켜 증폭 산물을 형성하는 단계;를 포함하는 지황의 토강 품종의 판별 방법을 제공한다.

상기 PCR은 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미하는 것으로, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법이다. 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있으며, 예를 들면 PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR 등이 있다. 또한, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction, IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 사용될 수 있다.

상기 PCR을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들이 과량으로 제공될 수 있다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공될 수 있다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 제조되어 첨가될 수 있다.

상기 방법은 상기 단계 2) 후에 상기 증폭 산물을 검출 또는 정량하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 상기 증폭 산물의 검출 또는 정량은 HRM 분석, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 특히 HRM 분석을 통해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

HRM 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선(melting curve)에서의 매우 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 실시간 PCR을 통해 증폭된 앰플리콘(amplicon)인 dsDNA가 온도에 따라 해리될 때, dsDNA에 결합된 염료(표지 물질)로부터 방출되는 형광 정도의 차이를 HRM 분석을 위해 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리함으로써 수행된다.

또한, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 수행될 수 있다.

또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광 물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다.

또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4 및 서열번호 5의 프로브를 이용하고, 지황의 토강, 고강, 다강, 지황1호 및 재래종의 5개 지황 품종에서 각각 분리된 DNA를 주형으로 하여 실시간 PCR로 상기 프라이머 및 프로브의 특이성을 확인하였을 때, 상기 프라이머 및 프로브 쌍들은 지황의 토강 품종에 특이적으로 고유한 증폭 및 검출 패턴을 나타냄을 확인하였다(도 6 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 시료로부터 DNA 추출

농촌진흥청에서 분양받은 24종의 지황 품종 시료로부터 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)을 이용해 DNA를 분리하였다. 이를 위하여, 1 ㎝ × 0.5 ㎝ 크기의 시료를 액체 질소에 얼린 후 균질기를 이용하여 분쇄하였다. CTAB 500 ㎕를 넣어 섞은 후 65℃ 항온조에 1시간 동안 인큐베이션하였고, PCI(phenol chloroform alcohol) 500 ㎕를 첨가한 후 상온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮겼고, CI 500 ㎕를 첨가한 후 상온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮겼고, 이소프로판올을 상등액의 70% 부피로 놓고 상온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후 상등액을 버렸고, 70% EtOH 1 ㎖를 첨가한 후 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 10분 동안 공기 건조시킨 후, 20 ㎕의 증류수에 용출하였다.

실시예 2. 상이한 지황 품종을 구별할 수 있는 유전자 마커의 확인

실시예 1에서 추출한 DNA로부터 NGS 라이브러리를 제작하였고, NGS 결과를 취합하였다(표 1).

A. 토강
역치	> 100 bp	> 500 bp	> 1000 bp	> 2000 bp
총 수	7,947,345	1,444,912	348,664	118,754
총 길이(bp)	3,503,649,906	1,452,471,492	741,228,397	429,410,324
평균 길이(bp)	441	1,005	2,126	3,616
N50(L50)	431 (2,092,396)	1,026 (333,860)	2,328 (91,470)	3,657 (37,053)
N80(L80)	295 (5,078,878)	606 (912,953)	1,345 (219,553)	2,499 (80,235)
N90(L90)	247 (6,362,638)	545 (1,166,197)	1,149 (279,313)	2,234 (98,424)
최장 콘티그(bp)	53,419	53,419	53,419	53,419

전체 게놈 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing)과 3kb 메이트 페어(mate paired) 시퀀싱을 병행 분석해 서열을 맵핑하여 콘티그를 제작하였고, 이로부터 지황의 토강 품종에 특이적인 5개의 SNP 후보를 선발하였다(도 2). 구체적으로, 4개 품종의 총 97개 개체에서 DNA를 각 개체별로 추출하였고, 이들 중 1개 개체의 DNA는 전체 게놈 샷건 시퀀싱을 위한 550 bp 쇼트 리드(short read) 확보용 라이브러리 제작에 사용하고, 나머지 96개 개체는 4개 품종별로 DNA를 합쳐서 3 kb 메이트 페어 시퀀싱용 라이브러리 4종을 제작하였다. 각 품종별로 NGS를 수행하여 얻은 리드들을 조립한 후, 전체 게놈 샷건 시퀀싱을 통해 만들어진 참조 서열에 맵핑하여 콘티그를 제작하였다. 4개 품종에서 공통된 콘티그를 찾고(토강에서는 gene_1015 콘티그), 공통 콘티그 내에서 품종별로 서로 다른 서열을 갖는 SNP 후보(토강에서는 5종)를 찾았다(도 2). 생어 염기서열 분석법(Sanger sequencing)으로 5종의 SNP 후보의 염기서열을 개체별로 검증하여 동일한 품종 내에서는 개체별 변이가 없는 SNP를 선택하였다. 상기 과정을 도 3에 나타내었다.

그 결과, 서열번호 1로 기재되는 gene_1015 유전자(콘티그)의 194번째 위치는 지황의 토강 품종과 지황의 고강, 다강, 및 지황1호 품종에서 그 염기가 각각 T 및 C로 나타나고, 해당 위치의 인접한 위치에 또 다른 SNP가 존재하지 않으므로, 해당 SNP를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지황의 토강 품종을 판별하기 위한 적합한 유전자 마커로서 선택하였다(도 4).

실시예 3. 프라이머 및 프로브 제작

실시예 2의 유전자 염기서열 분석을 통해 선정된 SNP 위치, 즉 서열번호 1로 기재되는 gene_1015 콘티그의 194번째 위치를 포함하는 지황의 토강, 고강, 다강, 지황1호, 및 재래종 품종 유래의 유전자 마커를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 설계하였다. 상기 프라이머쌍 및 프로브의 염기서열을 표 2에 나타내었다.

프라이머/프로브	염기서열	서열번호	온도	길이	서열위치	형광표식
전방 프라이머	TCGCCCACCTCAGTTCAATG	2	66.9	21	129-148
후방 프라이머	AGCGAACAGGAGTAACGTCCA	3	67.3	20	206-226
제1 프로브	TGACCCAGTTGGCC	4	63.4	14	187-200	Fam
제2 프로브	CGGTGACCCGGTTGG	5	65.3	15	189-203	Hex

실시예 4. 실시간 PCR에 의한 지황의 토강 품종 판별 방법

농촌진흥청에서 분양받은 토강, 고강, 다강, 및 지황1호 4개 품종의 40개 시료의 DNA를 상기 실시예 1에 기재된 방법을 통해 추출하였고, 추출된 DNA를 실시간 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 상기 실시예 3에서 설계한 표 2의 프라이머 및 프로브의 쌍을 이용해 PCR 산물을 수득 및 검출하였다.

그 결과, 실시예 3에서 설계한 프라이머쌍은 각각 지황의 4개 품종을 모두 증폭하였으며, 제1 프로브는 지황의 토강 품종을 특이적으로 검출하고 제2 프로브는 지황의 고강, 다강, 및 지황1호 품종을 특이적으로 검출하는 것으로 나타나, 상기 프라이머 및 프로브는 지황의 토강 품종을 다른 품종으로부터 쉽게 판별할 수 있음을 확인하였다(도 6).

<110> KOREA GINSENG CORP. <120> Genetic Marker Having Single Nucleotide Polymorphism For Distinguishing Varieties Of Rehmannia <130> 2020-DPA-4028 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2544 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene_1015, PNY01861, retrotransposon-related protein, partial [Trifolium pratense] <220> <221> misc_feature <222> (194) <223> y is t or c <400> 1 atgtctcccg ccgatgaatc gcctatttct caacgccacc tcgatacact ttccgattcc 60 atccactccg ccctacagca atttatgttg gccgtcgatt ccaaactcgc agctatccgc 120 tcggaatttc gcccacctca gttcaatgat ggttcttctt cgtcctgcac acccgctctc 180 gggtctggcc aacygggtca ccgcgtggac gttactcctg ttcgctctat gaagttagat 240 atccctcgtt ttgacggatc ggacccttcg gattggctct ttcgcattga ggcgtttttt 300 gattttcatc acacgccggc ggacactcgt ttacagatta tcgcctttca tttggatggc 360 cgtgccgccg cctggtttca atgggctcga cgtaacggtc ttatttccac atggccggcg 420 ttccgcgctg ccgttgctca tcgttttggg cccgcacctt ttgaagaccc tgagggcgct 480 ctctctaaac tcacccaatc cacaactgtc gccgactttc aggctcaatt tgaagctctt 540 ttgaatcaag tcacgggcat ttctgaacct ctattgatta gtttcttcat cactgggtta 600 cgcaccgaga tccgccgaga gctgcaattc caccgcccca aaactttgat ggaagccttt 660 gccatggctc gggcttatga ggcccgtttt gagggtatct cttcactggg ccgacccacc 720 ttccgcaatt caaatcctat acgtccttct tccttcatgg gccaaccctc agcccacagt 780 tcccctggcc caaatattaa gcccacctac acaccttctt caccccagtc tccttcccca 840 atccctagcc acaccgctgt acctccacct ccaaaattac ctccattatt accttctccc 900 agtcttccga ttcgtcgttt atctccggcg gaacttcgcg ataaacgtga tcgcgggtta 960 tgctacaatt gtgacgaaaa gtacagcccg aatcaccgtt gtaagagcaa atttttgctc 1020 ctcctaggaa atgacgatga cgacgtgccg gtcgaagatt cgccggaacc catctctccg 1080 tcggaggggg atatcgaagg ggacatctcc acccttcact ctttgtctgg ccatcatcaa 1140 caacgctctc tacgcgtttt tgggtctcat gggctgcatc gttttcacgt cctcatcgac 1200 agtgggagca cccacaactt catcaaaccg tctctcgtag aacaaatggg tctcgcggtg 1260 gaatctattc cttcatttcg tgtctccaca ggcagtggtg cctttttggt ttgtcaacac 1320 aaatgttccg ccaccaccat atctattcag ggtatttctt ttacactgga tttgtatgtt 1380 cttgccattg agggtcctga tgttgttctt ggttttccat ggcttcaact tttgggtaaa 1440 gtggcgcatg attattcatc cctcactatg gagttttctt ggaaagggca aacagttgtg 1500 ttacaggggg agacattgcc gtcacctacc ccggtgtcct tccatgcctt gcaggccctt 1560 cttcgtcaac cggatcctcc tcagttattt ctcctttatc attctgccac cgatacatct 1620 actacgcaac ctcccgacat agtgtttccc acggatatcc ctttggaggc taacactttg 1680 ttgcacgaat ttcagggtct cttccagcca cctacaggcc ttccaccaca tcgatcggtg 1740 gaccatcgaa tccacctcgt tcccgattct aagcctgtca atgtccgccc ctatcgctat 1800 cctcattttc aaaaagcaga aatggagaag ttaattcagg agatgctagc tcagggcctc 1860 attaaaccca gcactagccc tttctcgtcc cctgtcctgt tggtccggaa gaaagacggt 1920 tcgtggaggt tttgcgtgga ttatcgagcc ctcaacgctg tcactattcg ggataatttt 1980 cctattccca cgatcgatga gcttctggac gagttgggcg gtgcgacagt tttcagcaaa 2040 ttagacctcc gtgcgggata tcaccaaatc cgaatgcacc cgaaggacat ttataaaaca 2100 gcgttccgca cacatgatgg tcatttcgaa tttctggtca tgccatttgg ccttaccaat 2160 gcgccgtcta cttttcaggc tacaatgaac cgtctttttg ccccgtatct tcgtaagttt 2220 gttatcgttt tttttgatga catcttgatt tacagcccct gtatgaattc ccatttggaa 2280 catttgcatg tggtgttcag ttctatgttg gctaatcagt tctttgtgaa gctttcaaaa 2340 tgtgtatttt gtaaagactc tatcgattac ttgggacaca ttgtctttgc tgggggagtt 2400 aaggctgatc caaaaaaaat agaatctatg cttcagtggc ctgttccaaa agaacgtcaa 2460 ggaattgcgg ggatttcttg gtcttacggg ctattatcgc cgatttatca agggatatgc 2520 gaccatcgcg gcacccttaa ctga 2544 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 tcgcccacct cagttcaatg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 agcgaacagg agtaacgtcc a 21 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> allele 1 probe <400> 4 tgacccagtt ggcc 14 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> allele 2 probe <400> 5 cggtgacccg gttgg 15

Claims

서열번호 1의 염기서열의 194번째 단일염기다형성(SNP) 위치를 포함하는 8개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 유전자 마커.
청구항 1에 있어서,
상기 유전자 마커는 지황의 토강 품종을 지황의 고강, 다강, 지황1호, 및 재래종 품종과 구별하기 위한 것인 유전자 마커.
청구항 1에 있어서,
서열번호 1의 44번째 내지 343번째 염기서열의 194번째 SNP 위치를 포함하는 8개 내지 300개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 유전자 마커.
청구항 1에 있어서,
서열번호 1의 44번째 내지 343번째 염기서열의 194번째 SNP 위치를 포함하는 8개 내지 200개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 유전자 마커.
청구항 1에 있어서,
서열번호 1의 44번째 내지 343번째 염기서열의 194번째 SNP 위치를 포함하는 12개 내지 98개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 유전자 마커.
청구항 1에 있어서,
서열번호 1의 44번째 내지 343번째 염기서열의 194번째 SNP 위치를 포함하는 18개 내지 30개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드인 유전자 마커.
서열번호 1 및 그 상보적인 염기서열에 결합하여 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 프라이머 세트.
청구항 7에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 서열번호 2의 염기서열로 구성된 제1 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 제2 프라이머;를 포함하는 프라이머 세트.
청구항 7의 프라이머 세트를 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 PCR 조성물.
청구항 7의 프라이머 세트 또는 청구항 9의 PCR 조성물을 포함하는 지황의 토강 품종의 판별용 키트.
청구항 10에 있어서,
지황의 토강 품종의 판별용 유전자 마커에 특이적으로 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 키트.
청구항 11에 있어서,
상기 프로브의 5' 말단에 리포터(Reporter)가 부착되어 있거나, 상기 프로브의 3' 말단에 퀀쳐(Quencher)가 부착되어 있는 키트.
청구항 12에 있어서,
서열번호 1의 염기 서열의 194번째 SNP 위치를 포함하는 유전자 마커를 검출하기 위한 서열번호 4의 염기 서열로 구성된 제1 프로브 및 서열번호 5의 염기 서열로 구성된 제2 프로브의 쌍을 포함하는 키트.
청구항 12에 있어서,
상기 리포터는 Hex, Joe, Fam, 플루오레신, 플루오레신 클로로트리아지닐, 로다민 그린, 로다민 레드, 테트라메틸로다민, FITC, 오레곤 그린, 알렉사 플루오로, ROX, 텍사스 레드, TET, TRITC, TAMRA, 시아닌 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌 염료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키트.
청구항 12에 있어서,
상기 퀀쳐는 BHQ-1, BHQ-2, BH3-3, ROX, 답실, TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀쳐, Qxl, 아이오와 블랙 FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키트.
1) 식물 시료로부터 유래한 주형 DNA와 청구항 7의 프라이머 세트를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
2) 상기 혼합물을 PCR 증폭시켜 증폭 산물을 형성하는 단계;를 포함하는 지황의 토강 품종의 판별 방법.
청구항 16에 있어서,
3) 상기 증폭 산물을 검출 또는 정량하는 단계;를 추가로 포함하는 방법.