KR20230128290A - 가변 중쇄 전용 라이브러리, 이의 제조 방법, 및 이의용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 가변 중역 전용 (VHO) 도메인 영역의 설계 및 적용에 관한 것이다. 본 개시는, VHO 도메인이 인간 Vh 패밀리의 Vh 도메인에 기반하여 설계되는, VHO 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드의 VHO 라이브러리 및 VHO 라이브러리의 생성 방법을 제공한다. 본 개시는 pIX 및 pVII와 같은 M13 박테리오파지 마이너 외피 단백질의 이용을 통한 VHO 라이브러리로 인코드되는 VHO 도메인이 디스플레이되는 파지 라이브러리 및 파지 라이브러리의 생성 방법도 제공한다. 본 개시는 관심있는 타겟에 바인딩할 수 있는 VHO 후보를 확인하기 위한 파지 라이브러리의 스크리닝 방법도 제공한다.
Description
관련 출원 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 3일에 출원된 가출원 제 63/120,842호의 우선권 주장을 수반하고, 그 내용이 전체에 참조로써 본원에 결합된다.
서열 목록(SEQUENCE LISTING)
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하고, 전체에 참조로써 본원에 결합된다. 2021년 12월 2일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 15271_0007-00304_SL으로 명명되고, 19,819 바이트의 크기이다.
기술 분야
본 개시는 선택적 결합 모이어티(moiety)로 작용할 수 있고 치료용 분자 및/또는 진단용 시약으로 이용될 수 있는 가변 중역 전용 (Variable Heavy Only, VHO) 도메인 영역의 설계 및 적용에 관한 것이다. 본 개시는 또한 다양한 VHO 변성 라이브러리를 생성하는 방법 및 박테리오파지의 외피 단백질을 이용하는 변성 VHO 라이브러리의 표시 방법에 관한 것이다.
VHH(가변 중역 호모다이머, variable heavy homodimer) 또는 단일 도메인 항체가 한동안 연구되어 왔으며 의학에 사용되고 있다 (Muyldermans 2013); (Belanger, Iqbal et al. 2019). 낙타과 중쇄 항체(HcAb)는 낙타과 (Camelidae family) (라마, 낙타, 알카파, 등)에서 발견되며, 유사 가변 새로운 항원 수용체 (similar Variable New Antigen Receptor, VNAR) 분자는 상어 및 칠성장어를 포함하는 연골어류(Chondrichthyes) 및 원구류(Cyclostomata)에서 발견된다. 현재까지 가장 많이 연구되고 재조합형으로 사용된 VHH는 라마 및 낙타 강(Class)에서 유래한 것들이다 (Arbabi-Ghahroudi 2017). 낙타/라마과에 대해 본원에서의 참조는 낙타과의 구성원을 지칭한다. 150-160kDa 크기의 중쇄 및 경쇄 모두 포함하는 인간 항체 (IgG)에 비해 낙타과 항체는 70-90kDa 크기의 중쇄 전용 분자이다 (도 1a 참조). 낙타 및 라마 항체는 각각 가변 도메인 (variable domain), 불변 도메인(constant domain) 2, 불변 도메인 3의 3 도메인으로 구성된다. 대부분의 항체와 같이 가변 도메인은 3개의 초가변고리(hypervariable loop)와 이 초가변고리 사이에 4개의 프레임워크 영역(framework region)을 가진다. 낙타 또는 라마 항체의 가변 도메인은 체액 반응(humoral response) 동안 외부 단백질과 결합하는 부위이다. 인간 항체와 같이, 항체결합부(paratope)의 다양성은 초가변영역 또는 상보적 결정 영역(complimentary determining regions, CDR)으로 정의된다 (Mitchell and Colwell 2018).
낙타 및 라마 항체의 Vh 도메인은 단일 도메인 및 나노 바디(nanobody) 분자의 엔지니어(engineer)에 사용되어 왔다 (Arbabi-Ghahroudi 2017). 이러한 분자는 ~15 kDa의 크기이며 IgG에 비해 더 높은 열안정성을 갖는다 (McConnell, Spasojevich et al. 2013). 이러한 생물물리학적 특성 때문에, 단일 도메인 분자는 제조와 개발에 이점을 제공한다 (Tonikian and Sidhu 2012) (Ewert, Cambillau et al. 2002) (Harmsen and De Haard 2007). 이러한 특성은 보다 독특한 진단적 및 치료적 적용에 있어 이점도 제공한다. 세포 막을 통과하고 혈액뇌관문(blood brain barrier)을 통과하고, 대체적인 생물학적 전달 시스템으로 역할을 하도록 조작될 수 있다 (Herce, Schumacher et al. 2017) (Bruce, Lopez-Islas et al. 2016). 단일 도메인을 이용하는 대안적인 약물 전달의 예시로는 유도된 전신 전달(systemic delivery) (Yang, Moynihan et al. 2018) (Slastnikova, Ulasov et al. 2018) 및 효율적인 비강 내 전달 (Gomes, Cabrito et al. 2018)에 있어 나노입자로 적응하는 것을 포함한다. 이러한 분자는 또한 이미지 진단으로 역할을 하기 위한 형광 단백질 융합으로 설계될 수 있다(Li, Bourgeois et al. 2012). 일부 질병 타겟(예: 바이러스)은 IgG에 대한 크기 제약을 가지고 있으므로, 단일 도메인과 같은 더 작은 단백질 치료가 요구된다 (Wrapp, De VLieger et al. 2020) (Wilken and McPherson 2018).
낙타 및 라마 항체 가변 영역은 인간 Vh 도메인과 단백질 서열 상동성을 가진다 (Mitchell and Colwell 2018), (Herold, John et al. 2017), (Muyldermans 2013), (Strohl et al., (2012), Woodhead Publishing). 도 1a는 인간 IgG 및 낙타과 항체의 구조를 나타낸다. 인간, 라마 및 낙타에 대한 V 유전자 세그먼트의 공통번역(consensus translations)은 아미노산 서열 유사성(SEQ ID 번호: 1-4)이 나타내는 도 1b에 정렬되어 있다. CDR3은 항체의 다양성이 가장 많은 곳이기 때문에 도 1b에 도시되지 않는다. 도 2은 IMGT(국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템)에서 얻은 낙타 및 라마 Vh 패밀리 모두에 대한 인간 Vh 패밀리의 트리 기반 정렬을 나타낸다 (http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/taballeles/human/IGH/IGHV/Hu_IGHVal l.html). 그룹화는 낙타 및 라마 VH 모두와 서열 상동성에 있어 가장 유사하면서 다른 인간 Vh 패밀리와는 많이 유사하지 않은 인간 패밀리 Vh3를 나타낸다. 도 3은 인간 Vh3 서브 패밀리 내의 추가적인 서열 상동성을 나타낸다.
인간 Vh3 (Vh3 로도 나타냄) 패밀리는 면역화 될 때 인간 체액성 반응 중 발견되는 가장 일반적인 것일 뿐만 아니라, 형성(development) 중 항체의 분포를 반영하기도 한다 (Joyce, Burton et al. 2020) (Longo, Rogosch et al. 2017). 이 패밀리는 인간 레퍼토리(repertoire)에 있어 가장 대표적인 것으로도 밝혀져 있다 (Tiller, Schuster et al. 2013). 낙타/라마 단일 Vh 도메인이 인간 항체 Vh 도메인에 유사하면서도, 이들은 상당히 다르기도 하다. 이 차이들이 낙타/라마 단일 Vh 도메인을 사용하는 진단적 및 치료적 치료의 효율을 제한시키는 면역원성 효과를 발생시킬 수 있다.
일부 연구자들은 낙타, 라마, 또는 알파카 항체 기반 스캐폴드(scaffold)를 그들의 파지 라이브러리의 기반으로 삼아왔다. 최근, Twist Bioscience에는 인간 서열과 다른 종(낙타, 라마, 및 알파카) 서열의 혼합에 기반한 스캐폴드 구조를 이용했다. Rossotti et al. (2021)의 단일 도메인 항체(single domain antibodies, sdAb) 리뷰는 sdAb에 대한 면역원성 및 항-약물 항체 반응(anti-drug antibody responses, ADA)이 응집 특성을 초래한 내재적 비인간 서열로부터 발생했음을 결론지었다.
본 개시에는 단일 도메인-기반 진단적 또는 치료적 화합물을 생성하기 위해, 낙타과-유래 VHH-기반 분자 대신 인간 Vh 영역을 이용하는 것이 기재된다. 예를 들어, 본 개시에는 인간 항체 Vh3 패밀리의 Vh 영역을 이용한 단일 도메인-기반 치료적 화합물의 생성이 기재된다. 이러한 단일 도메인-기반 치료적 화합물은 다른 인간 항체 Vh 패밀리로부터 유래한 단일 도메인-기반 치료적 화합물보다 개선된 안정성 및/또는 개선된 치료적 인덱스를 가질 수 있다.
본 개시는 단일 도메인-기반 치료적 화합물(예: sdAb), 나노바디(Nb) 및 항체의 VHH 유형을 생성하기 위해, VHO(가변 중역 전용, variable heavy only) 플랫폼을 제공한다. 일 실시양태에서는, 본 개시는 유전자 패밀리 Vh3와 같은 인간 Vh 패밀리의 인간 가변 도메인에 기반한 VHO 라이브러리 (본원에 TavoSelect 라이브러리로도 나타냄)를 제공한다. 예를 들어, 인간 항체 Vh3 패밀리의 Vh 영역은 VHO 라이브러리를 생성하기 위한 스캐폴드 구조로 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시는 인간 Vh 패밀리의 Vh 도메인에 아미노산 서열로 상동적이고 및/또는 표준 구조(canonical structure)가 유사한 인간 가변 도메인 생식계열(germline)에 기반한 VHO 라이브러리를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 개시는 다양한 VHO 도메인을 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클리오타이드의 VHO 라이브러리를 제공하고, 여기서 VHO 도메인은 유전자 패밀리 Vh3와 같은 인간 Vh 패밀리의 Vh 도메인과 서열 상동성 및/또는 표준 상동성을 갖는다. 예를 들어, 표준 구조는 IMGT(국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템) 또는 Kabat 데이터베이스 또는 V Base 데이터베이스와 같은 임의의 다른 소스에서 발견되는 인간 항체 서열의 3D 모델링을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시는 다양한 VHO 도메인을 나타낼 수 있거나 다양한 VHO 도메인을 나타내는 파지 라이브러리(본원에 "VHO 파지 라이브러리"로 나타냄)를 제공한다. 일 실시양태에서, VHO 라이브러리는 M13 파지와 같은 박테리아 파지에 외피 단백질 상에 조립된다. 일 실시양태에서, VHO 라이브러리는 M13 파지의 pIX 및/또는 pVII 외피 단백질에 유전적 융합의 방법으로 조립된다.
일 실시양태에서, 본 개시는 다양한 선택 또는 패닝 스크리닝(panning screening)을 수행하기에 충분히 견고한 VHO 파지 라이브러리를 제공한다.
일 실시양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 VHO 도메인들 중 임의의 하나를 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드를 포함한 벡터(vector)를 제공한다.
일 실시양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 VHO 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드 서열을 제공하는 단계 및 파지미드(phagemid) 및/또는 플라스미드(plasmid)와 같은 벡터로 폴리뉴클리오타이드 서열을 삽입하는 단계를 포함하는 VHO 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 VHO 라이브러리로 박테리아 세포 배양물(culture)을 형질전환하는(tranforming) 단계, 박테리아 세포 배양물이 대수기(log phase)로 성장되도록 하고, 박테리아 세포 배양물을 헬퍼 파지(helper phage)로 감염시키는 단계, 및 박테리아 세포 배양물을 증폭시키는 단계를 포함하는, VHO 파지 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 개시는, 관심있는 VHO 후보를 확인하기 위해, 예를 들어 파지 패닝(panning)에 의해, VHO 파지 라이브러리를 스크리닝(screening)하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 개시는 타겟에 바인딩(binding)할 수 있는 관심있는 VHO 도메인을 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 본원에 기재된 바와 같이 VHO 파지 라이브러리와 같은 VHO 라이브러리를 생성하는 단계, 타겟에 대해 바이오패닝(biopanning)을 사용하는 VHO 파지 라이브러리를 스크리닝하여 관심있는 VHO를 확인하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 NGS(차세대 염기서열 분석, next generation sequencing)으로 관심있는 VHO를 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들어 ELISA, BLI, 및/또는 SPR로, 타겟에 대한 관심있는 VHO의 바인딩 친화도(binding affinity)를 평가하는 단계를 더 포함한다.
일 실시양태에서, 관심있는 VHO 후보는 파지상에 제시될 수 있고, 독립형(stand-alone) 단백질로 발현될 수 있고, IgG 또는 다른 수용성 도메인과 융합으로 또는 T 또는 B 세포 수용체 도메인과 같은 세포 표면 단백질에 대한 단백질 융합으로 발현될 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에 기재된 VHO는 융합으로써 인간 IgG Fc 도메인에 연결될 수 있다. 이러한 Fc 도메인으로의 융합은 힌지(hinge) 영역을 가질 수도 가지지 않을 수도 있고, 또는 불변 중쇄 도메인에 융합될 수도 있고 융합되지 않을 수도 있고, 또는 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 패밀리 중 어느 하나의 불변 경쇄에 융합될 수도 있고 융합되지 않을 수도 있다.
일 실시양태에서, 본 개시는 타겟에 바인딩할 수 있는 관심있는 VHO를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 개시는 관심있는 VHO에 대해 50%보다 큰 동일성을 갖는 단백질을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 개시는 관심있는 VHO에 대해 50%보다 큰 동일성을 갖는 단백질을 인코드하는 폴리뉴클리오타이드를 제공한다.
일 실시양태에서, 관심있는 VHO가 태그(tag)에 융합된다. 태그는 임의의 면역글로불린 패밀리의 Fc 도메인, 폴리 히스티딘, 및 FLAG에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 VHO는 면역글로불린, 수용체, 세포 표면 단백질, 및 면역글로불린, 수용체 및 세포 표면 단백질의 단편으로부터 선택되는 단백질에 융합된다. 예를 들어, 관심있는 VHO는 임의의 박테리아 세포(예: 대장균), 임의의 포유류 세포, 효모, 또는 식물세포에서 가용성 단백질로, 다른 단백질(예: 면역글로불린)에 융합된 가용성 단백질로, 또는 임의의 세포 표면 단백질(예: 수용체)에 융합으로 발현될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시는 관심있는 VHO 또는 관심있는 VHO를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예: 다른 단백질과 관심있는 VHO의 융합)을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 세포(예: 박테리아 세포)를 제공한다.
도 1a은 각각 Vh 및 VHH로 나타낸 가변 중역 도메인을 나타내는 3D 리본 구조로 IgG 및 낙타과 HcAb를 도시한 구조 모델을 나타낸다. 도 1b는 IMGT 명명법에 따라 FR1, CDR1(밑줄), FR2, CDR2(밑줄), 및 FR3 영역을 포함하는 인간 (SEQ ID 번호: 2), 낙타(SEQ ID 번호: 3), 및 라마(SEQ ID 번호: 4) 항체의 Vh 도메인과 정렬된 Z 공통 서열 (SEQ ID 번호: 1)를 나타낸다. 도 1a에 도시된 항체 이미지는 https://www.frontiersin.org/files/Articles/288027/fimmu-08-00977- HTML/image_m/fimmu-08-00977-g001.jpg에서 확인할 수 있다. CDR3은 도 1b에 도시되어 있지 않는다.
도 2는 IMGT에서의 인간, 라마, 및 낙타 중역 V-영역 패밀리의 아미노산 서열을 이용한 Geneious Prime 소프트웨어 (https://www.geneious.com/prime/)를 이용하여 생성된 상동성 아미노산 서열 정렬 트리를 나타낸다.
도 3은 Geneious Prime 소프트웨어(https://www.geneious.com/prime/)를 이용하여 생성된 상동성 아미노산 서열 정렬 트리를 나타낸다. 도 3a는 인간 Vh3 서브-패밀리 및 라마 Vh 패밀리의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 도 3b는 인간 Vh3 서브패밀리 및 낙타과 Vh 패밀리의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다.
도 4a는 M13 필라멘트형 박테리오파지(filamentous bacteriophage)의 개략도이고, 도 4b는 M13 파지의 외부를 구성하는 외피 단백질을 도시한다.
도 5는 VHO 파지 라이브러리를 구성하는 구성요소를 도시한다. 도 5a는 pIX (M13 파지의 외피 단백질), HIS (헥사 히스티딘 잔기 (SEQ ID 번호: 12)), 및 HA (헤마글루티닌, hemagglutinin)에 융합한 VHO를 인코딩하는 DNA 세그먼트를 나타내는 유전자 카세트(cassette)의 개략적인 모습이다. 도 5b는 파지미드/플라스미드 (본원에 pTAVO 파지미드/플라스미드로 나타냄)를 도시하고, 여기서 VHO 유전자 카세트는 NcoI 및 NotI 제한 부위 사이에서 pTAVO 파지미드/플라스미드로 스플라이싱될 수 있다. 이 파지미드/플라스미드는 VHO 유전자 발현 및/또는 파지 디스플레이 라이브러리에 사용될 수 있다. 도 5c는 M13 파지의 표면에 융합되거나 디스플레이되는 VHO의 대표적인 형상(rendition)이다.
도 6은 TNF (종양 괴사인자, tumor necrosis factor)인 타겟의 3개의 올소로그(ortholog) (인간, 사이노몰거스 원숭이, 및 마우스)에 대해 팬닝된(panned) VHO 파지 라이브러리에서 55 VHO 후보의 표로 만든 분포를 나타낸다. 도 6은 표의 (각각 "인간 패닝," "사이노 패닝," 및 "마우스 패닝"하의) 각 섹션은 3개의 각각의 올소로그 타겟 (인간, 사이노 사이노몰거스 원숭이, 및 마우스 TNF)에 대해 패닝된 VHO 후보의 그룹을 나타낸다. 각 올소로그 패닝 그룹에 따른 상위 19 VHO 후보가 가장 많은 복제(copy) 서열 수부터 가장 적은 수로 나열된다. 패닝 그룹의 각 섹션내에는 다른 올소로그 패닝 그룹에서 발견된 VHO 서열이 있으며, 따라서 각 올소로그 타겟과의 VHO 교차 반응성을 나타낸다 (예를 들어, VHO 후보 번호 8 및 11은 "인간 패닝" 그룹과 "사이노 패닝" 그룹 모두에 나타나, VHO 번호 8 및 11이 인간 및 사이노 TNF와 교차반응성을 가질 수 있음을 나타낸다). 사이노는 사이노몰거스 원숭이의 줄임말이다.
도 7은 인간 및 쥣과(murine) 가용성 FCRN 단백질에는 반응했지만 베타-2-마이크로글로불린(B2M)에는 반응하지 않았던 VHO-Fc 융합 분자의 세트 (SEQ ID 번호: 7, 8, 및 9를 각각 포함하는 VHO3-Fc, VHO4-Fc, 및 VHO5-Fc)로 수행된 생물층 간섭계 (biolayer interferometry, GatorBio) 바인딩 동역학 실행을 보여준다. 홀수 숫자의 채널 (CH1, Ch3, CH5, 및 CH7로 나타냄)은 pH 7에서 수행되었고, 짝수 숫자의 채널 (CH2, CH4, CH6, 및 CH8로 나타냄)은 pH 6에서 수행되었다. 생물층 간섭계 바인딩 서열 단계는 (1) - 스트렙트아비딘(streptavidin) 코팅된 센서 프로브에 비오틴화된 FCRN (인간 및 마우스) 또는 B2M의 바인딩 단계, (2) - 베이스라인 버퍼 교환을 허용하도록 세척하는 단계, (3) BLI 센서 프로브에 VHO-Fc 피분석물 결합 (association) 단계, (4) - BLI 센서 프로브의 FCRN 또는 B2M으로부터 VHO-Fc 피분석물 분리(dissociation) 단계를 포함한다. 도 7a는 인간 FcRn에 대한 VHO-Fc의 바인딩을 나타내고; 도 7b는 쥣과 FcRn에 대한 VHO-Fc의 바인딩을 나타내고; 도 7c는 베타-2 마크로글로불린에 대해 VHO-Fc가 바인딩하지 않음을 나타낸다. 도 7a, 도 7b 및 도 7c 각각에, VHO3-Fc (SEQ ID 번호: 7을 포함)는 CH1 및 CH2에 해당하고, VHO4-Fc (SEQ ID 번호: 8을 포함)는 CH3 및 CH4에 해당하고, VHO5-Fc (SEQ ID 번호: 9를 포함)는 CH5 및 CH6에 해당하고, IgG1은 CH7에 해당하고, 음성 컨트롤 VHO2-Fc (SEQ ID 번호: 11을 포함)는 CH8에 해당한다.
도 8a는 두 개의 다른 VHO-Fc 분자 (SEQ ID 번호: 10을 포함하는 VHO1-Fc; SEQ ID 번호: 11을 포함하는 VHO2-Fc)를 인간 IgG1 분자에 비교한 크기 배제 크로마토그래피 결과의 예시를 나타낸다. 상기 결과는 단일분산 VHO-Fc 융합 단백질의 존재를 확인한다. 도 8b는 비환원 SDS-PAGE에서 VHO-Fc 단백질 (자기 비드 기반 정제 후 비환원 VHO-Fc 융합 후보)의 순도의 예시를 나타낸다.
도 9는 VHO 생성 프로세스의 주요 단계를 거치는 5개의 타겟 VHO 패닝 실험 결과의 차트를 나타낸다. 표의 제1 열은 핵심 작용(key behavior), 항원결정기 비닝(epitope binning) 또는 그룹핑이 기재된다. VHO 라이브러리 패닝 프로세스는 당업계의 다른 sdAb 패닝 프로세스에 비해 스크린된 후보의 수 당 항원결정기의 수를 두 배로 늘릴 수 있다.
도 10은 생식계열 서브-패밀리 멤버 (IGHV3-23)에 가장 가까운 인간 가변 중역 도메인의 정렬을 나타낸다. IGHV3-23은 본 개시의 일부 실시양태에서 VHO 파지 라이브러리를 구축하기 위한 스캐폴드 구조로 사용되었다. 최근, Wu et al (2020)은 생식계열 패밀리 IGHV3-66을 이용한 sdAb 파지 라이브러리의 생성을 기재하고 있다. 화살표는 IGHV3-66 및 IGHV3-23 사이의 일부 프레임워크 차이를 표시한다. 도 10은 SEQ ID 번호: 23-24, 및 24-27 각각을 외형의 순서대로 개시한다.
도 2는 IMGT에서의 인간, 라마, 및 낙타 중역 V-영역 패밀리의 아미노산 서열을 이용한 Geneious Prime 소프트웨어 (https://www.geneious.com/prime/)를 이용하여 생성된 상동성 아미노산 서열 정렬 트리를 나타낸다.
도 3은 Geneious Prime 소프트웨어(https://www.geneious.com/prime/)를 이용하여 생성된 상동성 아미노산 서열 정렬 트리를 나타낸다. 도 3a는 인간 Vh3 서브-패밀리 및 라마 Vh 패밀리의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 도 3b는 인간 Vh3 서브패밀리 및 낙타과 Vh 패밀리의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다.
도 4a는 M13 필라멘트형 박테리오파지(filamentous bacteriophage)의 개략도이고, 도 4b는 M13 파지의 외부를 구성하는 외피 단백질을 도시한다.
도 5는 VHO 파지 라이브러리를 구성하는 구성요소를 도시한다. 도 5a는 pIX (M13 파지의 외피 단백질), HIS (헥사 히스티딘 잔기 (SEQ ID 번호: 12)), 및 HA (헤마글루티닌, hemagglutinin)에 융합한 VHO를 인코딩하는 DNA 세그먼트를 나타내는 유전자 카세트(cassette)의 개략적인 모습이다. 도 5b는 파지미드/플라스미드 (본원에 pTAVO 파지미드/플라스미드로 나타냄)를 도시하고, 여기서 VHO 유전자 카세트는 NcoI 및 NotI 제한 부위 사이에서 pTAVO 파지미드/플라스미드로 스플라이싱될 수 있다. 이 파지미드/플라스미드는 VHO 유전자 발현 및/또는 파지 디스플레이 라이브러리에 사용될 수 있다. 도 5c는 M13 파지의 표면에 융합되거나 디스플레이되는 VHO의 대표적인 형상(rendition)이다.
도 6은 TNF (종양 괴사인자, tumor necrosis factor)인 타겟의 3개의 올소로그(ortholog) (인간, 사이노몰거스 원숭이, 및 마우스)에 대해 팬닝된(panned) VHO 파지 라이브러리에서 55 VHO 후보의 표로 만든 분포를 나타낸다. 도 6은 표의 (각각 "인간 패닝," "사이노 패닝," 및 "마우스 패닝"하의) 각 섹션은 3개의 각각의 올소로그 타겟 (인간, 사이노 사이노몰거스 원숭이, 및 마우스 TNF)에 대해 패닝된 VHO 후보의 그룹을 나타낸다. 각 올소로그 패닝 그룹에 따른 상위 19 VHO 후보가 가장 많은 복제(copy) 서열 수부터 가장 적은 수로 나열된다. 패닝 그룹의 각 섹션내에는 다른 올소로그 패닝 그룹에서 발견된 VHO 서열이 있으며, 따라서 각 올소로그 타겟과의 VHO 교차 반응성을 나타낸다 (예를 들어, VHO 후보 번호 8 및 11은 "인간 패닝" 그룹과 "사이노 패닝" 그룹 모두에 나타나, VHO 번호 8 및 11이 인간 및 사이노 TNF와 교차반응성을 가질 수 있음을 나타낸다). 사이노는 사이노몰거스 원숭이의 줄임말이다.
도 7은 인간 및 쥣과(murine) 가용성 FCRN 단백질에는 반응했지만 베타-2-마이크로글로불린(B2M)에는 반응하지 않았던 VHO-Fc 융합 분자의 세트 (SEQ ID 번호: 7, 8, 및 9를 각각 포함하는 VHO3-Fc, VHO4-Fc, 및 VHO5-Fc)로 수행된 생물층 간섭계 (biolayer interferometry, GatorBio) 바인딩 동역학 실행을 보여준다. 홀수 숫자의 채널 (CH1, Ch3, CH5, 및 CH7로 나타냄)은 pH 7에서 수행되었고, 짝수 숫자의 채널 (CH2, CH4, CH6, 및 CH8로 나타냄)은 pH 6에서 수행되었다. 생물층 간섭계 바인딩 서열 단계는 (1) - 스트렙트아비딘(streptavidin) 코팅된 센서 프로브에 비오틴화된 FCRN (인간 및 마우스) 또는 B2M의 바인딩 단계, (2) - 베이스라인 버퍼 교환을 허용하도록 세척하는 단계, (3) BLI 센서 프로브에 VHO-Fc 피분석물 결합 (association) 단계, (4) - BLI 센서 프로브의 FCRN 또는 B2M으로부터 VHO-Fc 피분석물 분리(dissociation) 단계를 포함한다. 도 7a는 인간 FcRn에 대한 VHO-Fc의 바인딩을 나타내고; 도 7b는 쥣과 FcRn에 대한 VHO-Fc의 바인딩을 나타내고; 도 7c는 베타-2 마크로글로불린에 대해 VHO-Fc가 바인딩하지 않음을 나타낸다. 도 7a, 도 7b 및 도 7c 각각에, VHO3-Fc (SEQ ID 번호: 7을 포함)는 CH1 및 CH2에 해당하고, VHO4-Fc (SEQ ID 번호: 8을 포함)는 CH3 및 CH4에 해당하고, VHO5-Fc (SEQ ID 번호: 9를 포함)는 CH5 및 CH6에 해당하고, IgG1은 CH7에 해당하고, 음성 컨트롤 VHO2-Fc (SEQ ID 번호: 11을 포함)는 CH8에 해당한다.
도 8a는 두 개의 다른 VHO-Fc 분자 (SEQ ID 번호: 10을 포함하는 VHO1-Fc; SEQ ID 번호: 11을 포함하는 VHO2-Fc)를 인간 IgG1 분자에 비교한 크기 배제 크로마토그래피 결과의 예시를 나타낸다. 상기 결과는 단일분산 VHO-Fc 융합 단백질의 존재를 확인한다. 도 8b는 비환원 SDS-PAGE에서 VHO-Fc 단백질 (자기 비드 기반 정제 후 비환원 VHO-Fc 융합 후보)의 순도의 예시를 나타낸다.
도 9는 VHO 생성 프로세스의 주요 단계를 거치는 5개의 타겟 VHO 패닝 실험 결과의 차트를 나타낸다. 표의 제1 열은 핵심 작용(key behavior), 항원결정기 비닝(epitope binning) 또는 그룹핑이 기재된다. VHO 라이브러리 패닝 프로세스는 당업계의 다른 sdAb 패닝 프로세스에 비해 스크린된 후보의 수 당 항원결정기의 수를 두 배로 늘릴 수 있다.
도 10은 생식계열 서브-패밀리 멤버 (IGHV3-23)에 가장 가까운 인간 가변 중역 도메인의 정렬을 나타낸다. IGHV3-23은 본 개시의 일부 실시양태에서 VHO 파지 라이브러리를 구축하기 위한 스캐폴드 구조로 사용되었다. 최근, Wu et al (2020)은 생식계열 패밀리 IGHV3-66을 이용한 sdAb 파지 라이브러리의 생성을 기재하고 있다. 화살표는 IGHV3-66 및 IGHV3-23 사이의 일부 프레임워크 차이를 표시한다. 도 10은 SEQ ID 번호: 23-24, 및 24-27 각각을 외형의 순서대로 개시한다.
본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원서를 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 출판물은 본 명세서에 상세히 설명되어 있음에도 참조로 본원에 통합된다. 본원에 인용된 참조의 특정 내용이 본 개시와 모순되거나 불일치하는 경우, 본 개시에 따른다.
본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 묘사하기 위한 목적일 뿐이며, 제한하기 위한 것이 아님으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 통상적인 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시의 시험을 위한 실행에 사용될 수 있음에도, 예시적인 재료 및 방법이 본원에 기재된다.
본 명세서 및 부속된 청구항에 사용된 바와 같이, 문맥에서 분명하게 달리 표시하지 않는 한, 단수형은 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 세포"에 대한 표현은 둘 이상의 세포와 같은 조합을 포함한다.
"항체"는 넓은 의미를 뜻하며 쥣과(murine), 인간, 인간화 및 키메라 단일클론 항체를 포함한 단일클론 항체, 항체 단편, 이중특이 또는 다중특이 항체, 이량체, 사량체, 또는 다량체 항체, 단쇄 항체, 도메인 항체 및 다른 요구되는 특이성의 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 변형된 다른 구성을 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다.
완전한 길이 항체 분자는 이황화 결합으로 상호 연결된 2개의 중쇄(heavy chain, HC) 및 2개의 경쇄(light chain, LC) 뿐만 아니라 그의 다량체(예: IgM)로 구성된다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region, VH) 및 중쇄 불변 영역(CH1, 힌지, CH2, 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(light chain variable region, VL) 및 경쇄 불변 영역(light chain constant region, CL)으로 구성된다. Vh 및 VL 영역은 프레임워크 영역(framework regions, FR)으로 배치된 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로 정의되는 초가변의 영역들로 추가로 세분될 수 있다. 각 Vh 및 VL은 아미노부터 카르복실기 말단으로 배열되는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 세 가지 CDR과 네 가지 FR 세그먼트들로 구성된다.
"상보성 결정 영역(CDR)"은 항체에서 "항원 결합 부위"이다. CDR은 다양한 용어로 정의될 수 있으며, (i) Vh에서 세 가지(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 VL에서 세 가지(LCDR1, LCDR2, LCDR3)인 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성(sequence variability)에 기반한다 (Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) Vh에서 세 가지(H1, H2, H3) 및 VL에서 세 가지(L1, L2, L3)인 "초가변 영역," "HVR," 또는 "HV"는 Chothia 및 Lesk에 의해 정의된 바에 따른 구조에서 초가변인 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다 (Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17). 국제 ImMunoGeneTics(IMGT) 데이터베이스 (http://www_imgt_org)는 항원 결합 부위의 표준화된 번호화 및 정의를 제공한다. CDR, HV 및 IMGT 설명 간의 대응 관계는 (Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77.)에 기재되어 있다. 본원에 사용된 대로 용어 "CDR," "HCDR1," "HCDR2," "HCDR3," "LCDR1," "LCDR2" 및 "LCDR3"는 명세서에 달리 분명하게 기재되지 않는 한 supra, Kabat, Chothia 또는 IMGT에 기재된 임의의 방법으로 정의된 CDR을 포함한다.
통상적인 한 글자 및 세 글자 아미노산 코드가 본원에 사용된다. 아미노산 세글자 코드 코드 한글자 코드는:
본원에 제공되는 폴리펩타이드, 핵산, 융합 단백질, 및 다른 조성물은 본원에 제공된 아미노산 서열 또는 DNA 서열에 대해 언급된 퍼센트 동일성(identity)을 갖는 폴리펩타이드, 핵산, 융합 단백질 등을 포함할 수 있다. 용어 "동일성(identity)"은 서열을 배열하고 비교하여 결정되는 둘 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 둘 이상의 핵산 분자의 서열 간의 관계를 의미한다. "퍼센트 동일성," "퍼센트 상동성," "서열 동일성," 또는 "서열 상동성" 등은 비교된 분자에서 아미노산 또는 뉴클리오타이드 간 동일한 잔기의 백분율을 의미하며, 비교되는 가장 작은 분자의 크기를 기준으로 계산된다. 이러한 계산의 경우, (만약 있다면) 배열에서 갭은 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 결정됨이 바람직하다. 배열된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 방법은 Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073에 기재된 방법을 포함한다. 퍼센트 동일성 계산에 있어, 비교되는 서열은 통상적으로 서열 간 가장 큰 일치를 나타내는 방식으로 배열된다.
용어 "펩타이드," "폴리펩타이드," 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 코드화된 및 코드화되지 않은 아미노산을 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산, 화학적 또는 생물화학적으로 변형 또는 유도된 아미노산, 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드의 중합 형태를 의미한다. 용어는 예를 들어 이황화 결합 형태, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 단백질 분해 절단 등 같은 폴리펩타이드의 공-번역(예: 신호 펩타이드 절단) 및 번역 후 변형을 갖는 폴리펩타이드도 포함한다.
나아가, 본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한 자연 서열에 삭제, 부가, 및 치환 (예: 업계의 당업자에게 알려진 바와 같은 자연에서 보존적임)와 같은 변형을 포함하는 단백질을 의미한다. 이러한 변형은 부위-지정 돌연변이유발(mutagenesis)과 같이 의도적일 수 있고, 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이, 또는 PCR 증폭 또는 다른 재조합 DNA 방법으로 인한 에러와 같이 우발적일 수 있다.
용어 "폴리뉴클리오타이드," "올리고뉴클리오타이드," "핵산" 및 "핵산 분자" 는 리보뉴클리오타이드 또는 디옥시리보뉴클리오타이드 중 어느 하나의 뉴클리오타이드의 중합체 형태를 포함하도록 본원에 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 분자의 1차 구조만을 의미한다.
"벡터"는 생물학적 시스템 내에서 복제될 수 있거나 이러한 시스템 간 이동할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 벡터 폴리뉴클리오타이드는 통상적으로 벡터를 복제할 수 있는 생물학적 구성 요소를 이용하는 세포, 바이러스, 동물, 식물, 및 재구성된 생물학적 시스템과 같은 생물학적 시스템에서, 이러한 폴리뉴클리오타이드의 복제 또는 유지를 용이하게 하도록 기능하는 복제 기점(origin), 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커와 같은 요소를 포함한다. 벡터 폴리뉴클리오타이드는 DNA 또는 RNA 분자, cDNA, 또는 이들의 하이브리드, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 벡터는 박테리아 파지미드 및/또는 플라스미드일 수 있다. 벡터는 발현 벡터 또는 파지가 관심 있는 단백질을 디스플레이하도록 하는 벡터일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 pTavo 파지미드/플라스미드는 박테리아 파지의 외피 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드를 포함하는 벡터 또는 이러한 외피 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드를 포함하지 않는 벡터일 수 있다. 예를 들어, 도 5b 참조. 벡터는 예를 들어 정제 및/또는 검출을 위한 예를 들어 ELISA, BLI, 및/또는 SPR에 의한 하나 이상의 태그를 포함할 수 있다. 하나 이상의 태그는 폴리 히스티딘(HIS) 및 헤마글루티닌(HA) 태그 중에서 선택될 수 있다. 태그는 VHO와 및/또는 외피 단백질과 융합할 수 있다. 예를 들어, 도 5a 참조.
"발현 벡터"는 발현 벡터에 있는 폴리뉴클리오타이드 서열로 인코드 되는 폴리펩타이드의 번역을 지시하기 위한 생물학적 시스템 또는 재구성된 생물학적 시스템에서 활용될 수 있는 벡터를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "숙주 세포(host cell)"는 생체 내 또는 생체 외 진핵세포 또는 단세포 개체(entity)로서 배양된 다세포 유기체 (예: 세포주(cell line))에서의 세포를 지칭하고, 진핵세포는 핵산의 수용체(예를 들어, 본 개시의 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클리오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터)로써 사용될 수 있거나 사용되어온 것이며, 핵산에 의해 유전적으로 변형된 본래의 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 의도적인 돌연변이로 인한 본래의 부모와 형태학적으로 또는 게놈적 또는 전체 DNA 상보가 반드시 완전히 동일할 필요는 없다고 이해된다. "재조합 숙주 세포(recombinant host cell)" ("유전적으로 변형된 숙주세포"로도 나타냄)는 발현 벡터와 같은 이종 핵산이 도입된 숙주 세포이다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 진핵 숙주 세포는 적합한 진핵 숙주 세포에, 예를 들어 진핵 숙주 세포에 이질적인 외인성 핵산인 이종 핵산 또는 진핵 숙주 세포에서 정상적으로는 발견되지 않는 재조합 핵산을 도입함으로써 유전적으로 변형된다.
"특이적 바인딩" 또는 "특이적으로 바인딩하다" 또는 "바인딩하다"는 다른 항원 보다 더 강한 친화력으로 특이적 항원에 바인딩을 하는 항체를 의미한다. 통상적으로, 항체는 바인딩에 대한 평형 해리 상수 (equilibrium dissociation constant, KD)가 통상적으로 비특이적 항원(예: BSA, 카세인)으로 바인딩에 대한 그 KD보다 적어도 100배 작은 KD로 약 1X10-8 M 또는 그 이하, 예를 들어 약 1X10-9M 또는 그 이하, 약 1x10-10M 또는 그 이하, 약 1X10-11M 또는 그 이하, 또는 약 1x10-12 M 또는 그 이하인 일 때, “특이하게 바인딩한다". KD는 표준 절차를 이용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "파지 디스플레이 라이브러리"는 단백질 발현 라이브러리를 의미하고, 파지 외피 단백질과 융합하여 클론된(cloned) 단백질 서열의 집합을 발현할 수 있거나 발현하는 예를 들어 M13-유래인, 박테리오파지 벡터에서 구축된다. 항체 파지 디스플레이 라이브러리, 및 이러한 라이브러리를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, Famm et al., J. Mol. Biol. 376:926- 931, 2008; Carmen 및 Jermutus, Brief Funct Genomic Proteomic 1(2):189-203, 2002; 및 U.S. Pat. Nos. 6,828,422 및 7,195,866 참조). 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 VHO 파지 디스플레이 라이브러리는 M13 파지와 같은 파지 상의 VHO 도메인의 라이브러리를 디스플레이할 수 있거나 디스플레이한다.
본원에 사용된 바와 같은 "VHO," "VHO 영역," "VHO 도메인" 또는 "VHO 단백질"은 인간 항체 Vh3 패밀리의 인간 Vh 영역과 같은 인간, 낙타, 및 라마 항체 Vh 패밀리의 Vh 영역과, 예를 들어 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 보존된 서열 (단백질 또는 DNA)를 공유하는 폴리펩타이드를 의미한다. 문맥에 따라, "VHO," "VHO 영역," 또는 "VHO 도메인"은 VHO 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클리오타이드 서열을 의미하도록 사용될 수 있다.
리더 펩타이드(leader peptide)
특정 실시양태에서, 리더 펩타이드 또는 리더 서열은 분비된 단백질로 세포 배양 상청액(supernatant)으로 본 개시에 기재된 VHO 단백질의 분비를 유도하도록 선택된다. 임의의 알려진 분비된 단백질/펩타이드에 대한 임의의 리더 펩타이드가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "리더 펩타이드(leader peptide)" 또는 "신호 펩타이드"는 분비 경로로 향하는 새로 합성된 단백질의 N-말단에 있는 일반적으로 16-30 아미노산 길이의 짧은 펩타이드를 포함한다. 리더 펩타이드는 서열에서 극도로 이질적이고, 많은 원핵 및 진핵 리더 펩타이드가 다른 종들 간에도 기능적으로 상호교환적으로 가능하지만, 단백질 분비의 효율은 리더/신호 펩타이드의 서열에 의해 강하게 결정될 수 있다.
링커 펩타이드(linker peptide)
일부 실시양태에서, VHO, 외피 단백질, 및 하나 이상의 태그 사이에 하나 이상의 링커(linker) 펩타이드가 있을 수 있다. 예를 들어 도 5a 참조. 예를 들어, VHO 및 하나 이상의 태그 (예를 들어, Fc, HIS 태그 및/또는 HA 태그) 사이에 링커 펩타이드가 있을 수 있다. VHO 및 외피 단백질 사이에도 링커 펩타이드가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 펩타이드는 파지 상에 디스플레이되도록 또는 정제 또는 에세이 검출 목적으로 태그의 사용을 위한 활성에 도움이 되는 임의의 다른 펩타이드로 치환될 수 있다.
적합한 링커 펩타이드 ("스페이서(spacer)"로도 나타냄)는 쉽게 선택될 수 있고, 1개의 아미노산 내지 30개의 아미노산 (예를 들어 1 내지 30의 임의의 특정한 정수 또는 1개의 아미노산 (예: Gly) 내지 약 20개의 아미노산 (예: 2-15, 3-12, 4-10, 5-9, 6-8, 또는 7-8 개의 아미노산))과 같은 적합한 길이의 임의의 수일 수 있다.
예시적인 링커 펩타이드는 글리신 폴리머 (G)n, 글리신-세린 폴리머 (예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID 번호: 13) 및 (GGGS)n (SEQ ID 번호: 14), 여기서 n은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20인 적어도 하나의 정수임,을 포함함), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 알라닌-프롤린, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 및 업계에 알려진 다른 유연한 링커 펩타이드를 포함할 수 있는 면역글로불린 동종형 및 아형 힌지를 포함한다. Gly 및 Ser 모두 상대적으로 구조화되지 않으며, 따라서 구성 요소 간 중립 테더(tether)로써 수행할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 링커 펩타이드는 글리신 폴리머이다. 글리신은 알라닌보다도 현저하게 더 많은 파이-싸이(phi-psi) 공간에 접근하고 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다 (Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992) 참조). 예시적인 링커 펩타이드는 이에 제한하지 않으면서 GGS, GGSG (SEQ ID 번호: 15), GGSGG (SEQ ID 번호: 16), GGGGS (SEQ ID번호: 17), GSGSG (SEQ ID번호: 18), GSGGG (SEQ ID 번호: 19), GGGSG (SEQ ID번호: 20), GSSSG (SEQ ID번호: 21) 등을 포함한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 링커 펩타이드는 단단한 링커이다 (Chen, Zaro et al. 2013). 예시적인 단단한 링커 펩타이드는 이에 제한하지 않으면서 프롤린-풍부 서열, (XP)n,를 포함한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, X는 바람직하게는 Ala, Lys, 또는 Glu인 임의의 아미노산을 지칭하고, 여기서 n은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20인 적어도 하나의 정수이다. 예시적인 단단한 링커 펩타이드는 이에 제한하지 않으면서 (EAAAK)n (SEQ ID 번호: 22)의 서열을 갖는 알파 나선-형성 링커를 포함하는 아미노산 서열도 포함할 수 있고, 여기서 n은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20인 적어도 하나의 정수이다.
VHO 라이브러리의 설계, 합성 및 구성(Design, synthesis, and construction of VHO libraries)
본 개시는 단일 도메인 기반 치료적 화합물을 생성하기 위한 VHO 플랫폼을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 개시는 유전자 패밀리 Vh3와 같은 인간 Vh 패밀리의 인간 가변 도메인에 기반한 VHO 라이브러리 (본원에 TavoSelect 라이브러리로도 나타냄)를 제공한다. 인간 항체 Vh3 패밀리의 Vh 영역은 VHO 라이브러리를 생성하기 위한 스캐폴드 구조로써 사용될 수 있다. 예를 들어, IGVh3 패밀리의 한 멤버인 인간 서열 IGHV3.23은 VHO 라이브러리를 형성하기 위한 스캐폴드 구조로써 사용될 수 있다. 인간 생식계열 패밀리보다 안정적인 Vh를 갖기 때문에 IGHV3가 선택된다 (Ewert et al 2003). IGHV3은 낙타, 라마, 및 알파카 IgG에 대한 높은 수준의 서열 동일성도 갖는다 (예를 들어, 도 2 및 도 3 참조)
VHO가 인간 아미노산 서열을 포함한다는 점에서 본원에 기재된 VHO는 다른 단일 도메인 항체 (sdAb) 및/또는 나노바디 (Nb)와 다르다. 따라서, 낙타, 라마, 및 알파카 sdAb 라이브러리에는 필요한 반면, VHO 패닝에 대한 임의의 인간화 방법이 요구되지 않을 수 있다.
일 실시양태에서는, 가능한 가장 높은 정확도를 확보하도록 하는 방법으로VHO 라이브러리가 생성된다. "정확도(accuracy)"는 퇴행성의 CDR 영역에서 설계되는 시스테인, 메티오닌, 및/또는 정지 코돈의 부재 뿐만 아니라 개시 메티오닌 코돈에서부터 설계된 정지 코돈까지 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 유지하는 것으로 정의된다.
일 실시양태에서, 본 개시는 (예를 들어, 랜덤화 코돈으로) 변이를 갖는 VHO 폴리뉴클리오타이드 서열의 라이브러리를 구성하는 VHO 돌연변이 라이브러리를 제공하고, 여기서 VHO 프레임워크 또는 스캐폴드 구조는 인간 Vh3 패밀리의 Vh 영역과 같은 인간 Vh 패밀리의 Vh 영역에 기반하여 설계된다. IMGT 명명법에 기초한, Vh3 패밀리는 서브 패밀리 Vh3 멤버 IGHV3-7, IVGH3-9, IVGH3-11, IVGH3-13, IVGH3-15, IVGH3-16, IVGH3-19, IVGH3-20, IVGH3-21, IVGH3-23, IVGH3-23D, IVGH3-25, IVGH3-30, IVGH3-30-3, IVGH3-30-5, IVGH3-33, IVGH3-35, IVGH3-38, IVGH3-43, IVGH3-47, IVGH3-48, IVGH3-49, IVGH3-52, IVGH3-53, IVGH3-64, IVGH3-66, IVGH3-69-1, IVGH3-72, IVGH3-73, 및 IVGH3-74를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시는 (예를 들어, 랜덤화 코돈으로) 변이를 갖는 VHO 폴리뉴클리오타이드 서열의 라이브러리를 구성하는 VHO 돌연변이 라이브러리를 제공하고, 여기서 VHO 프레임워크 또는 스캐폴드 구조는 IGHV3-23의 Vh 영역에 기반하여 설계된다.
일 실시양태에서, 본 개시는 아미노산 서열로 상동성이고 및/또는 인간 Vh 패밀리의 Vh 도메인과 표준 구조가 유사한 인간 가변 도메인 생식계열에 기반한 VHO 라이브러리를 제공한다. 표준 구조는 CDR 루프의 배열 및 CDR 루프간 서열의 위치 지정을 의미한다. IMGT 및/또는 다른 항체 리소스로 정의되는 모든 VDJ 유전자 조합을 포함하는 인간 생식계열 패밀리 Vh3은 IMGT 및/또는 다른 항체 리소스에 기반한 DNA 및/또는 단백질 서열 BLAST 검색 배열에 따라 그 VDJ 유전자 조합을 포함한 라마 및 낙타 VHH와 가장 유사하다. 도 3은 인간 Vh 도메인에 비해 낙타 또는 라마 VHH 도메인의 서열이 각각 평균 81% 및 79% 상동성의 쌍 동일성(pairwise identity)을 가지는 것을 보여준다. Vh3 생식계열 패밀리는 순수(naive) 및 면역화 인간에서 가장 풍부하다 (Herce, Schumacher et al. 2017). Vh3 생식계열 패밀리는 다른 인간 중역 가변 생식계열 패밀리보다 더 안정적이다 (Ewert, Huber et al. 2003).
일 실시양태에서, VHO 라이브러리는 IMGT 및/또는 다른 항체 리소스로 정의된 바로 모든 VDJ 유전자 조합을 배열하여 예를 들어 Geneious 또는 다른 관련 소프트웨어로 생성되는 완전한 인간 생식계열 Vh3 패밀리의 공통 서열(consensus sequence)에 기반하여 생성된다. Vh3 패밀리 서열의 배열은 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열 (DNA 배열) 또는 아미노산 서열 (단백질 배열)에 기반할 수 있다. DNA 서열은 배열된 아미노산 또는 잔기 종류에 따라서도 생성될 수 있다. 단백질 배열은 IMGT 등과 같은 리소스에 의해 제공되는 표준 구조의 규칙을 적용하여 실행될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시는 다양한 VHO (가변 중역 전용) 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드의 VHO 변성 유전자 라이브러리를 제공하고, 여기서 VHO 도메인은 예를 들어 IGHV3-23인 Vh3 패밀리과 같은 인간 Vh 패밀리의 Vh 도메인으로 IMGT에 의해 정의된 서열 상동성 및/또는 표준 루프 영역 상동성을 가진다. 예를 들어, 서열 상동성 (아미노산 또는 뉴클리오타이드)는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. VHO 도메인은 VHO 도메인의 전체 영역에 걸쳐 잔기 다양성을 가질 수 있다. 예를 들어, VHO 도메인은 예를 들어 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 영역에서인 하나 이상의 CDR 영역에서 잔기 다양성을 가진다. 예를 들어, VHO 도메인은 예를 들어 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 영역에서인 하나 이상의 프레임워크 영역에서 잔기 다양성을 가진다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 프레임워크 영역은 단백질 발현, 단백질 접힘, 단백질 정제, 바인딩 친화도, 다운스트림 타겟 신호 전달, 및/또는 신호 전달의 억제의 수준에서의 개선을 제공하는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 일 실시양태에서, VHO 도메인은 하나 이상의 CDR 영역에서 및 하나 이상의 프레임워크 영역에서 잔기 다양성을 가진다. 일 실시양태에서, VHO 도메인은 모든 CDR 영역에서 및 모든 프레임워크 영역에서 잔기 다양성을 가진다. 일 실시양태에서, VHO는 IMGT 또는 유사한 참조 소스에 따른 가변 중쇄 도메인의 전형적인 예를 들어 CDR 1-3 및 FR1-4인 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, VHO 라이브러리는 CDR1 및 CDR2를 한 섹션으로 CDR3를 다른 섹션으로 갖는 유전자 모듈(module)을 포함하도록 설계된다. CDR은 scFv, Fab 및 IgG 분자에서 발견되는 Vh 및 VL 결합과 관련된 잔기를 파괴(disrupting)하여 응집을 최소화하도록 설계될 수도 있다. 정상적으로 VI 영역과 상호 작용하도록 Vh 영역을 제공하는 프레임워크 뿐만 아니라 CDR의 특정 위치에서 다른 잔기를 이용하면 VHO 분자의 응집을 감소시킬 것이다. 따라서, VHO 라이브러리는 분자 간 sdAb 상호작용으로부터 응집이 발생하는 낙타, 라마, 및 알파카 VHH 항체 라이브러리와 다르다.
일 실시양태에서, 본원에 개시된 VHO 라이브러리로부터 유도된 sdAb의 작은 항체결합부(paratope)는 주어진 타겟 항원의 바이오패닝(biopanning)의 많은 포맷의 스크리닝을 가능하게 할 것이다. VHO의 더 작은 항체결합부와 함께 이러한 다양한 바이오패닝 접근은 타겟 표면에서 발견될 많은 항원결정기(epitope)가 가능하게 한다. 더 많은 항원결정기를 가짐으로써 우월한 치료적 또는 진단적 생물학적 분자를 찾을 가능성을 향상시킬 수 있다.
일 실시양태에서는, IMGT, KABAT, CLOTHIA, 또는 Martin 정의 중 하나 뿐만 아니라 이들의 조합으로 정의되는 CDR3의 길이는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 내지 30개의 아미노산 (해당 폴리뉴클리오타이드 서열의 6 내지 30 코돈)과 같은 1 내지 30개의 아미노산의 범위일 수 있다.
일 실시양태에서는, VHO 라이브러리는 하나 이상의 서브 라이브러리를 포함할 수 있다. 예를 들어, VHO 상의 CDR3의 길이는 다양할 수 있고, 따라서 VHO 라이브러리 내의 복수의 서브 라이브러리가 생성될 수 있다.
일 실시양태에서는, VHO 프레임워크 또는 스캐폴드 구조는 인간 Vh 패밀리의 모든 VJ 영역의, IMGT로부터 아미노산 서열로 업로드된 Geneious 또는 다른 관련 소프트웨어로 생성되는 다음과 같은 공통 서열에 기반하여 설계된다:
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(X)WVRQAPGKGLEWV(X)DSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (SEQ ID 번호: 5)
일 실시양태에서, VHO 프레임워크 또는 스캐폴드 구조는 인간 Vh3 서브 패밀리의 모든 VJ 영역의, IMGT로부터 아미노산 서열로 업로드된 Geneious 또는 다른 관련 소프트웨어로 생성되는 다음과 같은 공통 서열에 기반하여 설계된다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(X)NWVRQAPGKGLEWV(X)DSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (SEQ ID 번호: 6).
인간 가변 중역 도메인의 CDR 영역에서 특정 비보존 위치는 SEQ ID 번호: 5 및 6에서 "X"로 표시된다. "X"는 적절한 아미노산으로 번역되는 코돈에 적용되는 임의의 종류의 변성 돌연변이 유발의 기호이다. "X"의 배치는 IMGT, KABAT, Clothia 또는 Martin 정의 뿐만 아니라 인간 가변 영역에 대한 이러한 정의의 조합에 따른 임의의 정의된 CDR 위치에 설정될 수 있다. "X"는 SEQ ID 번호: 5 및 6과 같은 가변 중역 도메인 내의 임의의 위치에 위치할 수 있고, 아미노산 분포 또는 관련된 코돈 분포의 임의의 조합이 X를 대체하도록 이용될 수 있다.
일 실시양태에서, "X"로 나타낸 위치는 CDR1에 대해 C, CDR2에 대해 C 및 M, CDR3에 대해 C, M 및 N을 제외한 모든 20개의 자연적으로 발생하는 아미노산의 균일한 분포(even distribution)로 대체된다. 예를 들어, CDR1에서 "X"는 C(Cys) 잔기로 대체되지 않고, CDR2에서 "X"는 C 또는 M 잔기로 대체되지 않고, CDR3에서 "X"는 C, M 또는 N 잔기로 대체되지 않는다. 아미노산 및 각 아미노산의 분포의 임의의 다른 조합은 동등하게 여겨진다. 이러한 분포는 NNK 또는 TRIM과 같은 DNA 변성 합성 방법/기술로 생성될 수 있다(Ferreira Amaral, Frigotto et al. 2017) (Li A, Sun Z, Reetz MT. 2018) (Suchsland R, Appel B, Muller S. 2).
가변 영역내의 변성(degeneracy)의 설계는 본원에 개시된 바에 따라 결정될 수 있다. 가변 영역 내의 돌연변이를 설계하기 위한 복수의 표준 방법이 더 다양한 라이브러리를 생성하기 위해서도 사용될 수 있다. VHO 공통 스캐폴드 구조 및/또는 변성의 라이브러리의 설계는 박테리아(예: 대장균), 효모, 또는 포유류 (예: 인간 또는 중국 햄스터 난소 세포)에서의 VHO 스캐폴드 구조의 번역, 및/또는 변성의 라이브러리와 같은 요소들을 고려할 수 있다. 예를 들어, VHO 스캐폴드 구조 및/또는 변성의 라이브러리의 설계는 당업자에 의해 통상적으로 설계되는 코돈 사용 또는 코돈 최적화의 조합이 고려될 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 VHO 라이브러리에서의 폴리뉴클리오타이드 서열이 박테리아 파지미드 및/또는 플라스미드와 같은 벡터 내에 위치한다. 일 실시양태에서, 벡터는 업계의 당업자가 통상적으로 이용하는 항생물질 내성, DNA 복제에 대한 Ori 부위, 파지 복제에 대한 Ori 부위, 단백질 발현을 유도하기 위한 프로모터, 분비 신호 (예: 번역된 단백질의 분비를 유도하기 위한 리더 서열), 단백질 발현의 수준을 제어하는 억제자를 통한 제어된 성장을 위한 기능의 하나 이상의 요소를 포함한다. 사용된 숙주 시스템에 기반하여, 코돈 사용 및 파지미드/플라스미드 요소의 특정 조합이 단백질로의 더 효율적인 유전자의 발현을 얻기 위해 이용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에 개시된 VHO 라이브러리는 도 5b에 나타난 바와 같이 예를 들어 pTAVO와 같은 파지미드/플라스미드 내의 발현 카세트(cassette) 내에 위치한다.
일 실시양태에서, 본 개시는 파지 라이브러리를 제공하고, 여기서 본원에 기재된 바와 같은 VHO 도메인은 원핵 또는 진핵 세포로 생산되는 바이러스성 분자 상, 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 감염시키는 바이러스 상, 또는 원핵 또는 진핵 세포 상에 디스플레이될 수 있거나 디스플레이된다.
일 실시양태에서, 본 개시는 M13 필라멘트형 박테리오파지(filamentous bacteriophage)와 같은 박테리오파지 상에 VHO 라이브러리를 제공한다. 예를 들어 M13인 박테리오파지의 임의의 외피 단백질이 VHO 도메인의 아미노 또는 카르복실기 말단 중 하나로 프레임 내 유전자 융합의 방법으로 연결될 수 있다. 예를 들어, VHO는 M13 필라멘트형 박테리오파지의 예를 들어 PVII, PIX, PIII, 및/또는 PVI (예: pVII 및/또는 pIX)인 임의의 외피 단백질과 융합될 수 있다 (Høydahl, Nilssen et al. 2016 참조). VHO 및 외피 단백질을 포함한 융합은 업계의 당업자가 이해하는 다른 태그 또는 태그 조합과 더 융합될 수 있다. 도 5a는 박테리오파지 외피 단백질과 융합한 VHO(예: HIS 태그 및 HA 태그를 갖는 pIX 외피 단백질과 융합한 VHO)를 보여주는 개략도를 도시한다. 도 5c는 (M13 파지에 디스플레이된) M13 파지에 융합한 VHO의 개략도를 나타낸다.
VHO 돌연변이 라이브러리의 합성 및 구성은 업계의 당업자가 이해할 수 있는 방법으로 수행될 수 있다. 본원에 개시된 VHO 돌연변이 라이브러리는 업계의 당업자가 이해할 수 있는 클로닝(cloning) 방법으로 구성된 파지미드/플라스미드에 배치될 수 있다. 예를 들어, NcoI 및 NotI 제한 부위는 VHO 돌연변이 라이브러리의 DNA가 삽입되어 VHO 파지 라이브러리와 같은 연결된 VHO 라이브러리 구성물(construct)이 얻어지는 pTAVO 상의 영역을 도시한다. 나아가, 재조합 및 제한 효소 클로닝 방법의 조합이 각 카세트 내의 VHO 돌연변이 라이브러리의 구성에 사용될 수 있다.
VHO 파지 라이브러리에 의한 형질전환(Transformation by VHO phage libraries)
연결된 VHO 파지 라이브러리 구성물은 하기 예시적인 실시양태에 도시된 바와 같이 M13 필라멘트형 박테리오파지로 감염될 수 있는 MC1061F' 세포 또는 동등한 균주(strain) (JM105, JM107, JM110, DH1, GM48, SL10, TD1, MC4100, SK1592 등)와 같은 세포로 형질전환될 수 있다. 1x106 내지 1x1011 (연결된 DNA의 양 당 콜로니 수)의 형질전환 효율은 통상적인 실험실 환경에서 얻어질 수 있다. 형질전환 효율은 얼마나 많은 콜로니 형성 단위(형질전환체, transformant)가 DNA의 1 마이크로그램의 반응으로부터 얻어질 수 있는지를 측정하여 계산된다.
박테리아 배양물은 예를 들어 고정된 CDR3 길이를 갖는 VHO 라이브러리인 VHO 파지 라이브러리로 형질전환될 수 있다. VHO 파지 라이브러리가 다른 CDR3 길이를 같은 복수의 서브 라이브러리들을 포함하는 경우, 복수의 박테리아 배양물은 각 CDR3 길이의 VHO 서브-라이브러리로 각각 형질전환될 수 있다.
예를 들어 고정된 CDR3 길이를 갖는 VHO 서브-라이브러리 같은 VHO 파지 라이브러리로 형질전환된 박테리아 배양물은 대수기로 성장된다. 배양물은 예를 들어 VCSM13 헬퍼 파지인 헬퍼 파지로 감염되고, 유도 조건 하에 밤새 성장시킨다. 밤샌 파지 라이브러리 증폭 배양물은 파지 수확 방법을 거친다. 적어도 1x1012의 콜로니 형성 단위 또는 플라크(plaque) 형성 단위의 역가가 얻어진다. 롤링서클(rolling circle) 및 생어(Sanger) 시퀀싱 방법이 단일의 감염된 콜로니에 수행된다. 예를 들어, 단일의 감염된 콜로니의 시퀀싱으로부터 얻어진 서열은 번역을 위해 처리되고, 그 후 또 다른 콜로니 뿐만 아니라 VHO DNA 서열 템플렛 (예를 들어, IMGT로부터 얻어진 상응하는 생식계열 Vh 서열)과도 배열된다. 이러한 서열 분석은 분비 신호에서 예측 최종 정지 코돈까지의 프레임 내 번역을 찾는다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 CDR 내에 위치한 시스테인, 메티오닌, 또는 정지 코돈을 포함한 임의의 서열은 정확한 VHO로 인정되지 않는다. 이러한 VHO 라이브러리의 통상적인 정확도는 30-60%의 범위이다. 도 5c는 어떻게 VHO가 마이너 외피 단백질 pIX 와의 유전자 융합을 통해 M13 파지의 표면에 디스플레이되는지의 예시를 도시한다. 유사한 다양성, 형질전환 효율성 및 기능적 정확도를 가진 Fab 파지 라이브러리는 많은 성공적인 바이오패닝 프로젝트를 가능하게 하였다.
VHO 파지 라이브러리의 스크리닝
본원에 개시된 VHO 파지 라이브러리는 하기 예시적인 실시양태로 도시된 바에 따라 타겟에 대해 패닝 (또는 바이오패닝) 방법을 이용하여 스크린 될 수 있다. 타겟은 단백질, 세포, 조직, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, VHO pIX 파지 디스플레이 라이브러리는 스크리닝을 위해 타겟에 부가된다. 이는 파지 라이브러리의 VHO 부위들 및 타겟 간 바인딩이 이루어지도록 한다. 타겟 특이적 VHO을 확보하기 위해, 비특이적 바운딩된 VHO pIX 파지가 세척되어 제거된다. 세척 이후 타겟에 여전히 바운딩된 VHO 파지는 산을 이용하거나 단지 직접적인 간염에 박테리아 세포를 적용하여 확보될 수 있다. 예를 들어, 감염된 박테리아를 운반하는 VHO 후보는 일반적으로 4시간 내에 배양물에서 팽창(expand)된다. 팽창된 배양물이 최적의 세포 밀도 (예: OD600nm = 0.6-0.8)에 다다르면, 헬퍼 파지가 배양물에 첨가되어 플라크 형성 단위 (pfu)의 양이 적어도 세포의 수의 10X가 되도록 한다. 헬퍼 파지에 감염된 박테리아 세포는 파지에 융합된 선택된 VHO 후보의 발현에 유도되고 배양물은 밤새 배양된다. 이 단계는 업계의 당업자에게 알려진 바이오패닝의 각 라운드 후에 수행될 수 있는 파지 증폭이라 칭한다. 예를 들어, VHO 후보를 운반하는 박테리아 세포 배양물은 8-16시간 동안 배양될 수 있다.
바이오패닝에 대한 단계는 적어도 3번, 4번, 또는 5번과 같이 복수의 횟수로 반복될 수 있다. 바이오패닝이 작동하는지에 대한 효과는 항생 압력(antibiotic pressure) 하에 있기 때문에 바이오패닝의 각 라운드 사이에 배양물이 얼마나 조밀하게 성장하였는지로 결정된다. 바이오패닝의 최종 라운드로부터의 배양물은 예를 들어 바이오패닝 프로세스 이후 타겟에 바인딩할 수 있는 VHO 후보와 같은 바이오패닝 프로세스에서 선택된 VHO 후보를 인코딩하는 파지미드 DNA 서열을 확보하기 위해 이용된다. 확보된 파지미드 DNA 서열은 NGS 라이브러리를 생성하기 위해 이용될 수 있어(Suckling, McFarlane et al. 2019) (Head, Komori et al. 2014), 각 VHO 후보를 서열화할 수 있도록 한다(Dias-Neto, Nunes et al. 2009). 예를 들어, 주어진 타겟을 스크린하는 패닝 그룹과 같은 각 패닝 그룹 (예를 들어 인간 TNF에 집중되는 패닝 그룹, 사이노몰거스 TNF에 집중되는 패닝 그룹, 또는 마우스 TNF에 집중되는 패닝 그룹)이 각각의 NGS 앰플리콘(amplicon) 라이브러리를 구성한다.
예를 들어, 프라이머 기반 인덱스들 Nextera-XT (www.illumina.com)는 후에 각 서열이 선택된 패닝 그룹과 구별되는 방법으로 적용된다. 이 인덱스된 앰플리콘(amplicon) 라이브러리의 생성에 요구되는 PCR 및 비드-기반 정제 단계는 유전자 특이적 서열 프라이밍 부위를 가진 0.1 μM로 희석된 30 ng의 패닝 결과물(output) DNA 및 16S 프라이머의 이용에 기반하여 (16S 메타게놈 시퀀싱 라이브러리 생성, Illumina 부분 # 15044223 Rev B. https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16 s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf) 생성된다. 구체적으로, 정방향 프라이머는 62.6 ℃의 TM을 가지고, 역방향 프라이머는 61.3℃의 TM을 가진다. 두 프라이머 모두 바이오패닝 프로세스로부터 선택된 VHO의 CDR 다양성을 확보하도록 플랭킹 영역(flanking area)에 어닐(anneal)하도록 설계된다. 최종 NGS 앰플리콘 라이브러리 산물(product)은 중쇄 CDR1에서 중쇄 CDR3까지 구성하는 250-300 bp 길이의 대략적인 범위를 포함한다. 이러한 앰플리콘 라이브러리는 2x300 쌍의 MiSeq 실행에 적용된다. 20-25 백만 서열이 이러한 MiSeq 실행에서 얻어진다. 이러한 서열은 품질 점수 (Fastq)로 정리되고, BaseSpace 소프트웨어 (Illumina)를 이용하여 바이오패닝 인덱스로 구분된다. 데이터는 각 바이오패닝 그룹을 정의하는 인덱스에 따라 분리된 페어링되지 않은 Fastq 형식으로 전달된다. 프로세싱 어플리케이션은 본원에 개시된 바와 같이 인덱스/바이오패닝 그룹에 기반하여 추가로 추정될 수 있는 MiSeq 실행 당 최대 25백만 서열을 1000-100,000개의 고유 단백질 서열로 정리한다.
선택된 VHO 후보의 특이성 결정(Determination of specificity of selected VHO candidates)
도시된 실시양태로, NGS로부터의 서열 결과는 바이오패닝에 사용된 타겟 또는 바이오패닝에 사용된 환경에 따라 그룹핑된다. 예를 들어, 사용된 타겟 단백질은 3개의 다른 종: 인간, 사이노몰거스 원숭이(사이노, cyno), 및 마우스로부터의 단백질일 수 있다. 인간 TNF의 ECD(세포 외 도메인)는 각각 사이노 및 마우스 TNF의 ECD와 97% 및 79%의 동일성을 보여준다. 예를 들어, 각각 인간, 사이노, 및 마우스 TNF에 대해 각각의 바이오 패닝 그룹으로부터 분리된 DNA가 각 그룹이 "인덱스되어" (Head, Komori et al. 2014) (Li, Zhao et al. 2019) VHO 후보 서열의 특이적 리커버리(specific recovery)를 돕게 되는 NGS 라이브러리 생성에 이용된다. 초기 수백만개의 서열이 각 인덱스된 바이오패닝 그룹으로 처리된다. 각 바이오패닝 그룹 내에는, 모든 선택된 VHO 후보의 서열 분포가 있다. 선택된 VHO 후보의 DNA 서열이 펩타이드 서열로 프로세스된 후, VHO 후보의 특정 패닝에 대한 별개의 서열이 결정될 수 있다. 예를 들어, 하나의 바이오패닝 그룹 내에서만 발견되는 서열 및 하나 이상의 바이오패닝 그룹에서 발견되는 서열와 같은 특이성이 추가 평가를 위해 선택된다. 추가 평가를 위한 3개의 바이오패닝 그룹, 즉 인간, 사이노, 및 마우스 TNF, 각각으로부터의 후보 서열의 목록이 도 6에 나타나 있다.
NGS 프로세싱에서 결정되는 VHO 후보는 클론성(clonal) 가용성 VHO 발현을 위해 선택되거나 바이오패닝 프로세스에 사용되는 동일한 각각의 타겟에 대한 바인딩 특이성에 대해 평가되기 위해 파지상에 디스플레이된다. 예를 들어, 특정한 발현된 VHO 후보 (예: HIS 또는 Fc와 같은 태그와 함께)는 생물층 간섭계(biolayer interferometry, BLI) 동역학 에세이에서의 피분석물로 적용된다. 도 7은 두개의 서로 다른 종 (인간 및 마우스 FCRN 단백질) 및 두개의 다른 pH 특이성 (pH 6 및 pH 7)에 대한 BLI 실험(GatorBio)에서의 VHO-Fc 융합의 세트(각각 SEQ ID 번호: 7, 8 및, 9로 기재된 VHO 서열을 포함하는 VHO3-Fc, VHO4-Fc, 및 VHO5-Fc)의 바인딩 활성을 나타낸다.
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWKGAGRGPGALGGLDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID 번호: 7).
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVSAIWSDGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTWGHQFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID 번호: 8).
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVSVINYSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMGTPGELPLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID 번호: 9).
바이오패닝, NGS, 및 바인딩 에세이 결과는 완전한 인간 VHO와 같은 VHO가 타겟에 바인딩하는지 여부를 보여준다. VHO는 다양한 라이브러리 세팅 및 클론성 파지 단계 모두에서 pIX 파지상에 디스플레이될 수 있다. 도 7과 연관된 실시예는 VHO 파지 디스플레이를 사용하여 타겟에 대한 교차 반응형 VHO 후보를 생성할 수 있음을 보여준다. 패닝 및 NGS 분석 방법은 많은 VHO 후보 서열을 확인할 수 있다. 1 이상의 VHO 후보는 바이오패닝 및 NGS 분석과 BLI의 특이적 바인딩 결과와의 상관관계를 보여준다. 도 7에서의 데이터는 VHO의 다양한 바인딩 활성을 더 보여준다. 예를 들어, BLI 실행의 제3 및 제4 단계에서의 다른 곡선은 타겟의 2개의 올소로그의 용도 및 사용된 2개의 pH 값과의 다양한 바인딩 활성의 지표이다.
도 8은 IgG와 같은 다른 단백질에 비해 VHO가 얼마나 잘 작용할 수 있는지 (예를 들어, 심각한 응집이 없는) 보여준다. 예를 들어, VHO-Fc 융합 단백질의 일시적으로 발현된 217개의 후보가 완료된 후, VHO-Fc 융합과 함께 응집이 관찰되지 않았다. 217개의 후보 중에, VHO-Fc 다이머로 발현되는 88%가 비환원 SDS-PAGE에 의한 서열에 기반하여 예측된 MW에 해당하는 밴드를 가졌다 (도 8b에 나타난 실시예 참조). 도 8a는 인간 IgG1 분자에 비해 2개의 다른 VHO-Fc 분자 ("VHO1-Fc" 및 "VHO2-Fc"로 나타냄)의 크기 배제 크로마토그래피 결과의 실시예를 보여준다. 도 8a의 크기 배제 크로마토그래피 크로마토그램은 본원에 개시된 전형적인 VHO-Fc 단백질이다. 도 8a의 크로마토그램의 단일 피크 프로파일은 최소한의 응집 또는 크리핑(clipping)으로 정확한 분자량을 가진 VHO 단백질의 존재를 나타낸다.
도 8a에서 특징지워진 "VHO1-Fc" 및 "VHO2-Fc"는 각각 하기 VHO 서열을 포함한다.
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRWAVPGRGHPRFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID 번호: 10).
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID 번호: 11).
실시예
실시예 1. 라이브러리 구성
VHO 유전자 없이 pIX, HIS, 및 HA 태그를 포함하는 초기 카세트는 NcoI 및 NotI 제한 효소 부위를 이용하여 pTAVO로 클로닝되었다. 도 5b는 NcoI 및 NotI 제한 효소 부위를 가진 pTAVO를 도시한다. CRO로 합성된 DNA 단편으로서의 CDR1 및 CDR2 다양성은 적절한 소화(digest) 매개변수에 따른 PstI 및 NcoI와 같은 제한 효소를 이용하여 pIX, HIS, 및 HA 태그를 이미 포함하는 pTAVO로 클로닝되었다. CDR1 및 CDR2 다양성 뿐만 아니라 pIX, HIS, 및 HA 태그를 이미 포함하는 pTAVO가 증폭되었고, 그 후 PstI 및 XhoI와 같은 제한 효소를 이용하여 보다 다양한 CDR3 영역 라이브러리를 삽입하기 위한 벡터를 포함하는 부분적 라이브러리로 사용되었다. T4 리가제가 판매자의 권장 방법에 따라 벡터 및 DNA 단편의 겔 추출 이후 모든 클로닝 단계에서 사용되었다. 소화된 CDR1 및 CDR2 또는 CDR3 단편 및 소화된 pTAVO 또는 부분 라이브러리 pTAVO 벡터의 양은 이 비율에 제한되지 않으면서 각각 적어도 2:1의 몰비율로 설정된 T4 리가제 반응에 배치된다. CDR1, CDR2, 및 CDR3 다양성을 포함하는 pTAVO와 같은 연결된 라이브러리 뿐만 아니라 pIX, HIS, 및 HA 태그가 예를 들어 글리코겐 및 부탄올 침전에 의해 DNA 손실을 방지하는 방법으로 클린업(cleaned up)되었다. 500-1000 ng의 DNA의 연결된 라이브러리가 부분표본(aliquot) 당 108 세포로 각각 설정된 적격의 MC1061 F' E. coli의 5-10 부분표본에 혼합되었다. DNA/세포 혼합물은 가장 높은 형질전환 효율을 위해 최적화된 매개 변수에 따르는 전기천공(electroporation)을 거쳤다. 형질전환된 세포는 항생 내성으로부터 회복되었고, 대수기로 성장되었고, 그 후 M13 헬퍼 파지로 감염되었다. 연결된 라이브러리를 가진 감염된 세포가 16-18 시간동안 최적의 파지 및 VHO 단백질 발현 조건하에 성장되었다. VHO 라이브러리 파지는 침전되었고 10배 농축되었고 그 후 바이오패닝에서 사용하기 위해 -80℃에서 저장되었다. 모든 박테리아/파지 라이브러리 조건에 사용된 배양 배지는 2xYT였다. 포도당이 사용되어 Lac 억제자를 이용하여 파지 증폭 이전 VHO 발현이 억제되었다. VHO 및 파지 발현은 포도당 없이 Lac 프로모터를 가진 1mM IPTG로 유도되었다.
실시예 2. 파지 바이오패닝
파지 라이브러리 및 스트렙트아비딘 (SA) 결합된 자성 비드 (Life Technologies, M280 스트렙트아비딘 철 기반 비드)가 예를 들어 인간, 마우스, 또는 사이노몰거스 TNF 올소로그인 비오틴화된 타겟 항원으로 사전 로딩되었다. 자성 분리기가 사용되어 예를 들어 튜브가 세척 단계 동안 자성 분리기에 위치하여 비드 상의 특이적으로 바인딩한 파지로부터 비특이적으로 바인딩된 파지를 제거할 수 있도록 하는 바이오패닝 실험의 특정 단계 동안 용액으로부터 비드를 효율적으로 분리하였다. 타겟 바인딩된 SA 비드는 우유 또는 화학차단제(Chemiblocker)와 같은 작용제로 차단되어 VHO 파지 라이브러리에 의한 비특이적 바인딩을 감소시켰다. 비특이적 (예를 들어, 타겟-로딩된 비드에 바인딩되지 않음) VHO 파지가 PBS와 같은 버퍼로 세척되어 제거되었다. 대수기 MC1061 F' 대장균 세포가 사용되어 바이오패닝의 최종 라운드 동안 타겟-로딩된 비드에 바인딩 할 수 있는 바람직하게 바이오패닝된 특징을 유지하는 이러한 파지를 확보(감염)하였다. 확보된 VHO 파지의 증폭 및 후속 바이오패닝 라운드 이후에, 감염으로 대수기 MC1061 F'로 확보된 타겟 특이적 VHO 파지의 최종 라운드가 발현의 억제 조건 하에 밤새 성장되었다. 바이오패닝된 결과물의 이러한 최종 배양물에 대한 DNA 제조는 판매자의 프로토콜에 따라 수행되었다.
실시예 3. 바이오패닝된 VHO 후보의 NGS 분석
16S 메타게놈 시퀀싱 라이브러리 제조, Illumina 부분 #15044223 Reb B. 문서 (https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16 s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf)에 기술된 프로토콜에 기반하여, 하기 방법이 사용되어 유전자 특이적 NGS 앰플리콘 라이브러리가 생성되었다. 결과물 DNA 바이오패닝의 최종 라운드가 Illumina 오버행(overhang) 어댑터 서열을 포함하는 유전자 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 증폭되었다. PCR이 이용되어 KAPA HiFi Hot Start 폴리머라제를 이용한 25 주기의 증폭이 수행되었고, AMPure XP 비드-기반 PCR 클린업이 상기 참조된 프로토콜에 따라 PCR 반응에 대해 수행되었다. 정제된 PCR 반응으로부터의 DNA는 KAPA HiFi Hot Start 폴리머라제 및 AMPure XP 비드-기반 PCR 클린업을 이용한 8 주기의 증폭을 가진 제2 PCR (인덱스 PCR)에 사용되었다. 샘플은 그 후에 정규화, 변성, 변성된 PhiX 컨트롤과 혼합, 및 단일 MiSeq 실행에 로딩되어 (Ravi RK, Walton K, Khosroheidari M. 2018) VHO 후보의 서열을 결정했다.
실시예 4. VHO 단백질 생산
바이오패닝 및 NGS로부터 확립된 VHO 서열은 Fc 융합으로 포유류 발현 벡터로 합성되고 클로닝되었다 (Lo et al, 1998). 각 VHO-Fc 구성물은 HEK293 Expi 세포 (Invitrogen)에서 일시적으로 발현되었다. 5일 배양에서 사용된 배지는 단백질 A 또는 단백질 G 방법론을 이용하여 프로세스되어 VHO-Fc 단백질을 정제했다 (Fishman and Berg, 2019).
실시예 5. VHO 단백질 분석
VHO-Fc 단백질은 수율, 순도, 및 생물학적 활성도에 대해 평가되었다. 수율은 분광 광도계를 이용하여 280nm의 흡광도로 결정되었다. 순도는 SDS-PAGE로 평가되었고 단일분산은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 확인되었다. 생물학적 활성도는 타겟 단백질에 또는 그 표면 상에 이러한 타겟을 갖는 세포에 대한 바인딩으로 측정되었다. 단백질 타겟에 대한 바인딩은 ELISA, 생물층 간섭계, 또는 단백질-단백질 상호작용에 대한 임의의 동등한 기법 중 하나로 수행될 수 있다. 바인딩 활성도는 유세포 분석을 통해 세포 상에도 측정되었다.
실시예 6. 항원결정기 스크리닝
가변 중역 영역인 항체의 작은 부분을 이용한 라이브러리가 설계되었다. 이러한 작은 부분이 더 많은 항원결정기가 주어진 타겟에 덮이도록 한다. VHO는 CDR 다양성의 분류된(assorted) 설계를 확보하도록 모듈화되어 더 많은 항체결합부를 확보하는 능력을 증가시킨다. 바이오패닝의 다양한 방법은 많은 항원결정기 및 항체결합부의 생성도 개선시킬 수 있다. NGS 및 서열 분석 방법은 다운스트림 활성 평가에 있어 가용성 단백질로 발현되는 선택된 VHO를 우선시하도록 돕는다.
도 9는 종래의 sdAb, Nb, 및 VHH의 패닝에 비해, 본 개시에 따른 VHO가 스크린되거나 특성화된 후보당 항원결정기의 백분율이 더 높음을 보여준다. Ablynx N.V.의 연구자들은 단일 타겟에 대한 파지 디스플레이를 하려는 노력을 수행했고, 96 후보로부터 3-4 항원결정기를 얻을 수 있었다 (doi: 10.3389/fimmu.2017.00420). 따라서, Ablynx 연구는 0.04 또는 4% (4 항원결정기/ 96 후보)의 성공적인 타겟 효율성의 결과를 보여주었다(doi:10.3389/fimmu.2017.00420). 또 다른 5개 타겟에 대한 면역화된 파지 디스플레이 그룹은 160-182 후보의 범위로부터 3-6의 항원결정기의 범위를 산출하였다. 이들의 성공적인 타겟 효율은 0.03 또는 3% (867 후보로부터 30 항원결정기)였다 (DOI: 10.7554/eLife.48750.009).
VHO (완전한 합성 및 완전한 인간) 파지 디스플레이 라이브러리가 5개의 서로 다른 타겟을 패닝하도록 사용되었다. 190 VHO 후보에 대해 총 31 항원결정기가 얻어졌고, 도 9에 나타난 바와 같이 0.16 또는 16% (190 후보로부터 31 항원결정기)의 성공적인 타겟 효율성의 결과가 나타났다. 따라서, 본 개시에 따른 VHO 라이브러리가 5% 보다 작은 성공적인 타겟 효율성이 얻어지는 업계의 라이브러리보다 더 큰 성공적인 타겟 효율성을 가졌다.
VHO 분자는 VHO-단독 단백질로써 및 Fc 융합 단백질로써 포유류 세포에서 발현되었다. 두 각 형식에서 성공적인 타겟팅 VHO 히트 분자는 도 7에 나타난 바와 같은 바인딩 활성도 뿐만 아니라 도 8에 나타난 단일분산 프로필인 더 좋은 발현 작용도 나타냈다.
추가적인 예시적인 실시양태는 하기에 나타낸다.
1. VHO (가변 중역 전용, variable heavy only) 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드의 VHO 라이브러리로써, 상기 VHO 도메인은 인간 Vh 패밀리의 Vh 도메인과 서열 상동성 및/또는 표준 상동성(canonical homology)을 가지는, VHO 라이브러리.
2. 실시양태 제1항에 있어, 상기 인간 Vh 패밀리는 인간 Vh3 패밀리인, VHO 라이브러리.
3. 실시양태 제1-2항 중 어느 한 항에 있어, 상기 서열 상동성은 적어도 75%인, VHO 라이브러리.
4. 실시양태 제1-3항 중 어느 한 항에 있어, 상기 VHO 도메인은 VHO 도메인의 전체 영역에 걸쳐 잔기 다양성을 가지는, VHO 라이브러리.
5. 실시양태 제1-4항 중 어느 한 항에 있어, 상기 VHO 도메인은 하나 이상의 CDR 영역들에서 잔기 다양성을 가지는, VHO 라이브러리.
6. 실시양태 제1-5항 중 어느 한 항에 있어, 상기 VHO 도메인은 SEQ ID 번호: 5: QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(X)WVRQAPGKGLEWV(X)D SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (SEQ ID 번호: 5)를 포함하고, 여기서 위치 X는 20개의 자연적으로 발생하는 20개 아미노산 잔기 중 임의의 하나를 나타내는, VHO 라이브러리.
7. 실시양태 제1-5항 중 어느 한 항에 있어, 여기서 상기 VHO 도메인은 SEQ ID번호: 6: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(X)NWVRQAPGKGLEWV(X) DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVS S (SEQ ID 번호: 6)를 포함하고, 여기서 위치 X는 20개의 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기 중 임의의 하나를 나타내는, VHO 라이브러리.
8. 실시양태 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어, 여기서 위치 X는 CDR1에 대해 C, CDR2에 대해 C 및 M, CDR3에 대해 C, M, 및 N을 제외한 모든 20개의 자연적으로 발생하는 아미노산의 균일한 분포로 대체되는, VHO 라이브러리.
9. 실시양태 제1-8항 중 어느 한 항에 있어, 상기 VHO 도메인은 하나 이상의 프레임워크 영역(framework region)에서 잔기 다양성을 가지는, VHO 라이브러리.
10. 실시양태 제1-9항 중 어느 한 항에 있어, 하나 이상의 상기 프레임워크 영역이 단백질 발현, 단백질 접힘, 단백질 정제, 바인딩 친화도, 다운스트림 타겟 신호 전달, 및/또는 신호 전달의 억제의 수준에서 개선을 제공하는 하나 이상의 돌연변이를 가지는, VHO 라이브러리.
11. 실시양태 제1-10항 중 어느 한 항에 있어, 상기 VHO 도메인은 하나 이상의 프레임워크 영역에서 및 하나 이상의 CDR 영역에서 잔기 다양성을 가지는, VHO 라이브러리.
12. 실시양태 제1-11항 중 어느 한 항에 있어, 상기 VHO 도메인은 CDR3 영역에서 길이 다양성을 가지는, VHO 라이브러리.
13. 실시양태 제1-11항 중 어느 한 항에 있어, 상기 CDR3 영역의 상기 길이 다양성은 6 내지 30 코돈의 범위인, VHO 라이브러리.
14. 실시양태 제1-13항 중 어느 한 항에 있어, 상기 폴리뉴클리오타이드 인코딩 VHO 도메인이 벡터로 삽입되는, VHO 라이브러리.
15. 실시양태 제14항 중 어느 한 항에 있어, 상기 벡터는 파지미드(phagemid)인, VHO 라이브러리.
16. 실시양태 제14항 중 어느 한 항에 있어, 상기 벡터는 플라스미드(plasmid)인, VHO 라이브러리.
17. 실시양태 제14-15항 중 어느 한 항에 있어, 상기 벡터는 박테리아 파지의 외피 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드를 포함하는, VHO 라이브러리.
18. 실시양태 제17항에 있어, 상기 박테리아 파지는 M13 박테리오파지인, VHO 라이브러리.
19. 실시양태 제17-18항 중 어느 한 항에 있어, 상기 외피 단백질은 pVII 또는 pIX 외피 단백질인, VHO 라이브러리.
20. 실시양태 제14-19항 중 어느 한 항에 있어, 상기 벡터는 하나 이상의 태그(tag)를 포함하는, VHO 라이브러리.
21. 실시양태 제20항에 있어, 상기 하나 이상의 태그는 폴리히스티딘(HIS) 및 헤마글루티닌(HA) 태그 중에서 선택되는, VHO 라이브러리.
22. 실시양태 제21항에 있어, 상기 벡터는 상기 VHO 및 상기 하나 이상의 태그 사이의 링커 펩타이드(linker peptide)를 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드 서열을 포함하는, VHO 라이브러리.
23. 실시양태 제21항에 있어, 상기 벡터는 상기 VHO 및 상기 외피 단백질 사이의 링커 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드 서열을 포함하는, VHO 라이브러리.
24. 실시양태 제22-23항 중 어느 한 항에 있어, 상기 링커 펩타이드는 GGGGS (SEQ ID 번호: 17)인, VHO 라이브러리.
25. 실시양태 제14-15항 및 실시양태 제17-24항 중 어느 한 항에 있어, 상기 벡터는 상기 VHO 도메인이 박테리오파지 상에 디스플레이되도록 하는 방식으로 배열된 요소를 포함하는, VHO 라이브러리.
26. 실시양태 제14-25항 중 어느 한 항에 있어, 상기 벡터는 상기 VHO 도메인이 발현되도록 하는 방식으로 배열된 요소를 포함하는, VHO 라이브러리.
27. 실시양태 제14, 16, 20-22, 24, 및 26항 중 어느 한 항에 있어, 상기 벡터는 VHO 도메인이 박테리아 파지 없이 발현되도록 하는 방식으로 배열된 요소를 포함하는, VHO 라이브러리.
28. 실시양태 제14-27항 중 어느 한 항에 있어, 상기 벡터는 DNA 복제에 대한 Ori 부위, 파지 복제에 대한 Ori 부위, 번역된 단백질의 분비를 유도하기 위한 리더 서열(leader sequence), 단백질 발현을 유도하기 위한 프로모터(promotor), 및 단백질 발현의 수준을 제어하는 억제자(repressor)를 갖는, VHO 라이브러리.
29. 실시양태 제14-28항 중 어느 한 항에 있어, 상기 벡터는 VHO 도메인 중 임의의 하나를 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드를 포함하는, 벡터.
30. 실시양태 제1-28항 중 어느 한 항에 따른 VHO 라이브러리로 인코드되는 VHO 도메인을 디스플레이하는 파지 라이브러리.
31. 실시양태 제30항에 있어, 상기 VHO 도메인이 원핵 또는 진핵 세포로 생산되는 바이러스성 분자 상에 디스플레이되거나, 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 감염시키는 바이러스 상에 디스플레이되거나, 또는 원핵 또는 진핵 세포 상에 디스플레이되는, 파지 라이브러리.
32. 실시양태 제1-28항 중 어느 한 항에 따른 VHO 라이브러리의 제조 방법으로, 상기 방법은, 실시양태 제1-13항 중 어느 한 항에 따른 VHO 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드 서열을 제공하는 단계; 및 실시양태 제14-29항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 폴리뉴클리오타이드 서열을 삽입하는 단계를 포함하는, VHO 라이브러리 제조 방법.
33. 실시양태 제30-31항 중 어느 한 항에 따른 파지 라이브러리 제조 방법으로, 상기 방법은, 실시양태 제1-28항 중 어느 한 항에 따른 VHO 라이브러리로 박테리아 세포 배양물(culture)을 형질전환하는 단계,
박테리아 세포 배양물이 대수기(log phase)로 성장되도록 하고, 박테리아 세포 배양물을 헬퍼 파지(helper phage)로 감염시키는 단계, 및
박테리아 세포 배양물을 증폭시키는 단계를 포함하는, 파지 라이브러리 제조 방법.
34. 타겟에 바인딩할 수 있는 관심있는 VHO 도메인을 확인하는 방법에 있어,상기 방법은, 실시양태 제32항에 따른 VHO 라이브러리를 생성하는 단계, 실시양태 제33항에 따른 파지 라이브러리를 생성하는 단계, 타겟에 대해 바이오패닝(biopanning)을 이용하는 파지 라이브러리를 스크리닝(screening)하여 관심있는 VHO를 확인하는 단계를 포함하는, 관심있는 VHO 도메인 확인 방법.
35. 실시양태 제34항에 있어, 상기 바이오패닝 단계는 복수의 횟수로 실행되는, 방법.
36. 실시양태 제34-35항 중 어느 한 항에 있어, NGS로 관심있는 VHO를 시퀀싱하는 단계를 더 포함하는, 방법.
37. 실시양태 제34-36항 중 어느 한 항에 있어, 타겟에 대한 관심있는 VHO의 바인딩 친화도(binding affinity)를 평가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
38. 실시양태 제37항에 있어, 상기 결합 친화도는 ELISA를 이용하여 평가되는, 방법.
39. 실시양태 제34-38항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 확인된 관심있는 VHO.
40. 실시양태 제39항에 따른 VHO를 포함하는 폴리펩타이드에 있어, 상기 VHO는 면역글로불린, 수용체, 세포 표면 단백질, 및 이들의 단편으로부터 선택되는 단백질에 융합되는, 폴리펩타이드.
41. 실시양태 제39항에 따른 VHO 또는 실시양태 제40항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는, 조성물.
42. 실시양태 제39항에 따른 관심있는 VHO 또는 실시양태 제40항에 따른 폴리펩타이드를 인코딩 하는, 폴리뉴클리오타이드.
43. 실시양태 제39항에 따른 관심있는 VHO에 대해 50%보다 큰 동일성을 가지는, 폴리펩타이드.
44. 실시양태 제39항에 따른 관심있는 VHO에 대해 50%보다 큰 동일성을 갖는 단백질을 인코딩 하는, 폴리뉴클리오타이드.
45. 실시양태 제42항 및 제44항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클리오타이드를 포함하는, 벡터.
46. 실시양태 제29항에 따른 벡터를 포함하는, 세포.
47. 실시양태 제45항에 따른 벡터를 포함하는, 세포.
48. 실시양태 제39항에 따른 VHO를 포함하는 폴리펩타이드에 있어, 상기 VHO는 예를 들어 임의의 종의 면역글로불린 패밀리의 Fc 도메인, 폴리 히스티딘 태그, 및 FLAG 태그와 같은 임의의 태그에 유전적으로 융합되는, 폴리펩타이드.
49. 실시양태 제39항에 따른 VHO를 포함하는 폴리펩타이드에 있어, 상기 폴리펩타이드는 포유류 세포에서 발현되는, 폴리펩타이드.
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<150> US 63/120,842
<151> 2020-12-03
<160> 27
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> A, W, or Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (52)..(52)
<223> I, N, or Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (54)..(54)
<223> S, G, or D
<220>
<221> MOD_RES
<222> (57)..(57)
<223> H, S, or T
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Xaa Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Xaa Ser Xaa Gly Asp Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala
<210> 2
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Val Ile Ser Ser Lys Asp His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
<210> 3
<211> 99
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Camel Vh domain
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Ser
20 25 30
Tyr Trp Met Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp
35 40 45
Val Ser Thr Ile Asn Thr Gly Gly Asp Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala
<210> 4
<211> 97
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Llama Vh domain
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala
<210> 5
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (83)..(83)
<223> Any naturally occurring amino acid
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Trp
20 25 30
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Xaa Asp Ser Val
35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
50 55 60
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
65 70 75 80
Ala Arg Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
85 90
<210> 6
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> Any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (84)..(84)
<223> Any naturally occurring amino acid
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Asn
20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Xaa Asp Ser
35 40 45
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
65 70 75 80
Cys Ala Arg Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
85 90 95
<210> 7
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Lys Gly Ala Gly Arg Gly Pro Gly Ala Leu Gly Gly Leu
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Trp Gly His Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Met Gly Thr Pro Gly Glu Leu Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Arg Trp Ala Val Pro Gly Arg Gly His Pro Arg Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 11
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 12
His His His His His His
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 13
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 14
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 15
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 16
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 18
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 19
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 20
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 21
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 22
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 23
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> A, G, or Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (56)..(56)
<223> G, S, or absent
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Xaa Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Xaa Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 24
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 25
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 26
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 27
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
Claims (45)
- VHO (가변 중역 전용, variable heavy only) 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드의 VHO 라이브러리로써, 상기 VHO 도메인은 인간 Vh 패밀리의 Vh 도메인과 서열 상동성 및/또는 표준 상동성(canonical homology)을 가지는, VHO 라이브러리.
- 제1항에 있어서, 상기 인간 Vh 패밀리는 인간 Vh3 패밀리인, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 상동성은 적어도 75%인, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHO 도메인은 VHO 도메인의 전체 영역에 걸쳐 잔기 다양성을 갖는, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHO 도메인은 하나 이상의 CDR 영역들에서 잔기 다양성을 갖는, VHO라이브러리.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHO 도메인은 SEQ ID 번호: 5: QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(X)WVRQAPGKGLEWV(X)D SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (SEQ ID 번호: 5)를 포함하고, 여기서 위치 X는 20개의 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기 중 임의의 하나를 나타내는, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHO 도메인은 SEQ ID 번호: 6: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(X)NWVRQAPGKGLEWV(X) DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVS S (SEQ ID 번호: 6)를 포함하고, 여기서 위치 X는 20개의 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기 중 임의의 하나를 나타내는, VHO 라이브러리.
- 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 위치 X는 CDR1에 대해 C, CDR2에 대해 C 및 M, CDR3에 대해 C, M, 및 N을 제외한 모든 20개의 자연적으로 발생하는 아미노산의 균일한 분포로 대체되는, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHO 도메인은 하나 이상의 프레임워크 영역(framework region)에서 잔기 다양성을 가지는, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상기 프레임워크 영역이 단백질 발현, 단백질 접힘, 단백질 정제, 바인딩 친화도, 다운스트림 타겟 신호 전달, 및/또는 신호 전달의 억제의 수준에서 개선을 제공하는 하나 이상의 돌연변이를 가지는, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHO 도메인은 하나 이상의 프레임워크 영역에서 및 하나 이상의 CDR 영역에서 잔기 다양성을 가지는, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHO 도메인은 CDR3 영역에서 길이 다양성을 가지는, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR3 영역의 상기 길이 다양성은 6 내지 30 코돈의 범위인, VHO 라이브러리.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클리오타이드 인코딩 VHO 도메인이 벡터로 삽입되는, VHO 라이브러리.
- 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 파지미드(phagemid)인, VHO 라이브러리.
- 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드(plasmid)인, VHO 라이브러리.
- 제14항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 박테리아 파지의 외피 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드를 포함하는, VHO 라이브러리.
- 제17항에 있어서, 상기 박테리아 파지는 M13 박테리오파지인, VHO 라이브러리.
- 제17항 내지 제18항에 있어서, 상기 외피 단백질은 pVII 또는 pIX 외피 단백질인, VHO 라이브러리.
- 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 하나 이상의 태그(tag)를 포함하는, VHO 라이브러리.
- 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 태그는 폴리히스티딘(HIS) 및 헤마글루티닌(HA) 태그 중에서 선택되는, VHO 라이브러리.
- 제21항에 있어서, 상기 벡터는 상기 VHO 및 상기 하나 이상의 태그 사이의 링커 펩타이드(linker peptide)를 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드 서열을 포함하는, VHO 라이브러리.
- 제21항에 있어서, 상기 벡터는 상기 VHO 및 상기 외피 단백질 사이의 링커 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드 서열을 포함하는, VHO 라이브러리.
- 제22항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 GGGGS (SEQ ID 번호: 17)인, VHO 라이브러리.
- 제14항 내지 제15항 및 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 VHO 도메인이 박테리오파지 상에 디스플레이되도록 하는 방식으로 배열된 요소를 포함하는, VHO 라이브러리.
- 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 VHO 도메인이 발현되도록 하는 방식으로 배열된 요소를 포함하는, VHO 라이브러리.
- 제14항, 제16항, 제20항 내지 제22항, 제24항, 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 VHO 도메인이 박테리아 파지 없이 발현되도록 하는 방식으로 배열된 요소를 포함하는, VHO 라이브러리.
- 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 DNA 복제에 대한 Ori 부위, 파지 복제에 대한 Ori 부위, 번역된 단백질의 분비를 유도하기 위한 리더 서열(leader sequence), 단백질 발현을 유도하기 위한 프로모터(promotor), 및 단백질 발현의 수준을 제어하는 억제자(repressor)를 가지는, VHO 라이브러리.
- 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 VHO 도메인 중 임의의 하나를 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드를 포함하는, 벡터.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 VHO 라이브러리로 인코드되는 VHO 도메인을 디스플레이하는, 파지 라이브러리.
- 제30항에 있어서, 상기 VHO 도메인이 원핵 또는 진핵 세포로 생산되는 바이러스성 분자 상에 디스플레이되거나, 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 감염시키는 바이러스 상에 디스플레이되거나, 또는 원핵 또는 진핵 세포 상에 디스플레이되는, 파지 라이브러리.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 VHO 라이브러리의 제조 방법으로, 상기 방법은, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 VHO 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클리오타이드 서열을 제공하는 단계; 및 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 폴리뉴클리오타이드 서열을 삽입하는 단계를 포함하는, VHO 라이브러리 제조 방법.
- 제30항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 파지 라이브러리 제조 방법으로, 상기 방법은, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 VHO 라이브러리로 박테리아 세포 배양물을 형질전환하는 단계,
박테리아 세포 배양물이 대수기(log phase)로 성장되도록 하고, 박테리아 세포 배양물을 헬퍼 파지(helper phage)로 감염시키는 단계, 및
박테리아 세포 배양물을 증폭시키는 단계를 포함하는, 파지 라이브러리 제조 방법. - 타겟에 바인딩할 수 있는 관심있는 VHO 도메인을 확인하는 방법에 있어서, 상기 방법은, 제32항에 따른 VHO 라이브러리를 생성하는 단계, 제33항에 따른 파지 라이브러리를 생성하는 단계, 및 타겟에 대해 바이오패닝(biopanning)을 이용하는 파지 라이브러리를 스크리닝(screening)하여 관심있는 VHO를 확인하는 단계를 포함하는, 관심있는 VHO 도메인 확인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 바이오패닝 단계는 복수의 횟수로 실행되는, 방법.
- 제34항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, NGS로 관심있는 VHO를 시퀀싱하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 타겟에 대한 관심있는 VHO의 바인딩 친화도(binding affinity)를 평가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 결합 친화도는 ELISA를 이용하여 평가되는, 방법.
- 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 확인된, 관심있는 VHO.
- 제39항에 따른 VHO를 포함하는 폴리펩타이드에 있어서, 상기 VHO는 면역글로불린, 수용체, 세포 표면 단백질, 및 이들의 단편으로부터 선택되는 단백질에 융합되는, 폴리펩타이드.
- 제39항에 따른 VHO 또는 제40항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는, 조성물.
- 제39항에 따른 관심있는 VHO 또는 제40항에 따른 폴리펩타이드를 인코딩 하는, 폴리뉴클리오타이드.
- 제29항에 따른 벡터를 포함하는, 세포.
- 제39항에 따른 VHO를 포함하는 폴리펩타이드에 있어, 상기 VHO는 임의의 종의 면역글로불린 패밀리의 Fc 도메인, 폴리 히스티딘 태그, 및 FLAG 태그에서 선택된 태그에 유전적으로 융합된, 폴리펩타이드.
- 제39항에 따른 VHO를 포함하는 폴리펩타이드에 있어, 상기 폴리펩타이드는 포유류 세포에서 발현되는, 폴리펩타이드.
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| PA0105 | International application |
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