KR20240024806A - 면역 작동자 세포의 활성화 및 표적화를 위한 물질 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역 작동자 세포를 활성화하고 활성화된 면역 작동자 세포를 표적 세포로 표적 전달하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에 제공하는 것을 수반한다. 일 구현예에서, 본 발명은 CAR에 대한 결합 모이어티를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 (활성화 화합물)를 암호화하는 RNA를 투여하는 단계와, 표적 세포에 결합하는 결합 모이어티 (제1 표적화 모이어티) 및 CAR (제2 표적)에 대한 추가의 결합 모이어티를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 (도킹 화합물)를 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 수반한다.

Description

면역 작동자 세포의 활성화 및 표적화를 위한 물질 및 방법

본 발명은 면역 작동자 세포를 활성화하고 활성화된 면역 작동자 세포를 표적 세포로 표적 전달하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에 제공하는 것을 수반한다. 일 구현예에서, 본 발명은 CAR에 대한 결합 모이어티를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 (활성화 화합물)를 암호화하는 RNA의 투여와, 표적 세포에 결합하는 결합 모이어티 (제1 표적화 모이어티) 및 CAR (제2 표적)에 대한 추가의 결합 모이어티를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 (도킹 화합물)를 암호화하는 RNA의 투여를 수반한다. 일 구현예에서, 활성화 화합물을 코딩하는 RNA는 세포 표면에서 항원을 제시하는 세포에 의해 발현된다. 활성화 화합물이 발현된 후, CAR에 대한 결합 모이어티는 면역 작동자 세포에 의한 결합에 이용가능해 질 수 있으며, 이러한 결합으로 면역 작동자 세포의 증폭이 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 도킹 화합물을 코딩하는 RNA는 간 세포와 같이 개체의 세포에 의해 발현 및 분비된다. 도킹 화합물이 발현된 후, 제1 표적화 모이어티는 암 세포 상의 암 항원과 같은 표적 항원에 결합할 수 있으며, 그런 다음 면역 작동자 세포가 제2 표적을 표적화함으로써, 면역 작동자 세포는 암 세포와 같은 표적 세포로 정확하게 전달될 수 있다. 활성화 화합물에 포함된 CAR에 대한 결합 모이어티와 도킹 화합물에 포함된 CAR에 대한 결합 모이어티는 펩타이드 태그일 수 있거나, 및/또는 서로 동일하거나 또는 서로 다를 수 있다.

다수의 의학 요법 및 진단 분야에서는 치료학적 물질 (약물) 또는 진단학적 (예, 영상화) 물질과 같은 물질을 환자와 같은 개체의 신체 특정 부위 또는 제한된 영역으로 선택적으로 전달하는 것이 요망되고 있다.

조직 또는 장기에 대한 능동적인 표적화는 대상 표적 부위의 세포 표면에 결합하는 표적화 구조체에 원하는 활성 모이어티 (예, 세포독성 화합물)를 직접 또는 간접적으로 접합함으로써 달성될 수 있다. 이러한 물질을 표적화하기 위해 사용되는 표적화 모이어티는 전형적으로 세포 표면의 표적, 예를 들어 막 단백질에 대해 친화성을 가진 구조체이며, 이는 항체 또는 항체 단편을 망라한다.

본 발명은 예를 들어 제1 표적 (예, 세포 표면 항원)에 결합함으로써 표적 세포를 표지하는 RNA-암호화된 도킹 화합물 (RNA-encoded docketing compound)을 이용하는 방식에 관한 것이다. 도킹 화합물은, 궁극적으로 제2 표적을 표적화하는 항원 수용체가 장착된 면역 작동자 세포에 의해 표적화될, 제2 표적을 포함한다. 이에, 본 발명에 따라 도킹 화합물을 코딩하는 RNA를 투여한다. RNA가 발현된 후, 도킹 화합물은 예를 들어 제1 표적에 결합함으로써 표적 세포에 결합할 수 있다. 면역 작동자 세포는 자신의 항원 수용체를 통해 도킹 화합물 상의 제2 표적에 결합한다. 나아가, 본 발명에 따라 활성화 화합물을 코딩하는 RNA를 투여한다. 이 RNA가 발현되면, 활성화 화합물이 항원 제시 세포의 세포 표면에 존재할 수 있으며, 면역 작동자 세포에 의해 결합될 수 있는 세포 표면 상의 모이어티를 제시할 수 있다. 면역 작동자 세포는 자신의 항원 수용체를 통해 결합 모이어티에 결합하고, 이러한 결합으로 면역 작동자 세포의 증폭이 이루어진다. 본원에 기술된 개념은, 즉, 한가지 유형의 면역 작동자 세포, 및 선택적으로, 한가지 유형의 활성화 화합물을, 다양한 제1 표적을 표적화하고 동일한 제2 표적을 포함하는 다양한 도킹 화합물들과 조합하여 이용함으로써, 한가지 유형의 면역 작동자 세포를 광범위한 표적 세포를 표적화하는데 이용 가능하게 한다.

일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 표적 항원을 발현하는 세포를 특징으로 하는 질환, 장애 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다:

(i) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에 제공하는 단계;

(ii) CAR에 대한 결합 모이어티를 포함하는 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 RNA를 개체에 투여하는 단계;

(iii) 개체에서 항원 제시 세포에 의해 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 발현되어, CAR에 대한 결합 모이어티가 면역 작동자 세포에 의한 결합에 이용 가능해지고, 이러한 결합으로 면역 작동자 세포의 증폭이 이루어지는 단계;

(iv) 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 RNA를 개체에 투여하는 단계로서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티와 CAR에 대한 결합 모이어티를 포함하는, 단계; 및

(v) 개체에서 세포에 의해 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 발현되어, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 표적 항원을 발현하는 세포와 결합하게 되고, CAR에 대한 결합 모이어티는 면역 작동자 세포에 의한 결합에 이용가능해지는 단계.

일부 구현예에서, 항원 제시 세포는 제1 RNA로 형질감염된다.

일부 구현예에서, 제1 RNA는 리포플렉스 입자 제형과 같은 미립자 제형으로 투여된다.

일부 구현예에서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포는 제2 RNA로 형질감염된다.

일부 구현예에서, 제2 RNA는 지질 나노입자로 제형화된 제형과 같이 미립자 제형으로 투여된다.

일부 구현예에서, 항원 제시 세포는 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 항원 제시 세포에 부속된 (associated with) 상태로 발현한다.

일부 구현예에서, 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 막 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.

일부 구현예에서, 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 CAR에 대한 결합 모이어티와 막 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 융합 단백질이다.

일부 구현예에서, 표적 항원을 발현하는 세포와 결합한 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 면역 작동자 세포가 결합하면, 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 살상이 이루어진다.

일부 구현예에서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포는 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 분비한다.

일부 구현예에서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포는 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 혈류로 방출되게 발현한다.

일부 구현예에서, 표적 항원은 세포 표면 항원이다.

일부 구현예에서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티와 CAR에 대한 결합 모이어티로 된 융합 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.

일부 구현예에서, 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티는 항체 또는 항체 유도체를 포함한다.

일부 구현예에서, CAR에 대한 결합 모이어티는 펩타이드 태그를 포함한다.

일부 구현예에서, CAR는 항체 또는 항체 유도체를 포함한다.

일부 구현예에서, 항체 유도체는 항체 단편이다.

일부 구현예에서, 본 방법은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에서 구축하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 암이다.

일부 구현예에서, 표적 항원을 발현하는 세포는 질병에 걸린 세포이다.

일부 구현예에서, 표적 항원을 발현하는 세포는 암 세포이다.

일부 구현예에서, 표적 항원는 종양 항원이다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 표적 항원을 발현하는 세포를 특징으로 하는 질환, 장애 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다:

(i) 펩타이드 태그에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에 제공하는 단계;

(ii) 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 개체의 항원 제시 세포에서 발현되도록 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 RNA를 개체에 투여하는 단계로서, 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 세포외 도메인에 CAR이 결합하는 펩타이드 태그를 포함하는 막 단백질인, 단계; 및

(iii) 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 개체의 세포에서 발현되어 분비되도록 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 RNA를 개체에 투여하는 단계로서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 표적 항원과 결합하는 결합 모이어티 및 CAR이 결합하는 펩타이드 태그를 포함하는, 단계.

일부 구현예에서, 면역 작동자 세포가 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 결합하면, 면역 작동자 세포의 증폭이 이루어진다.

일부 구현예에서, 면역 작동자 세포가 표적 항원에 결합된 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합하면, 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 살상이 이루어진다.

일부 구현예에서, 항원 제시 세포는 제1 RNA로 형질감염된다.

일부 구현예에서, 제1 RNA는 리포플렉스 입자 제형과 같은 미립자 제형으로서 투여된다.

일부 구현예에서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포는 제2 RNA로 형질감염된다.

일부 구현예에서, 제2 RNA는 지질 나노입자로 제형화된 제형과 같이 미립자 제형으로 투여된다.

일부 구현예에서, 항원 제시 세포는 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 항원 제시 세포에 부속된 상태로 발현한다.

일부 구현예에서, 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 CAR이 결합하는 펩타이드 태그와 막 펩타이드 또는 폴리펩타이드로 된 융합 단백질이다.

일부 구현예에서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 혈류로 분비된다.

일부 구현예에서, 표적 항원은 세포 표면 항원이다.

일부 구현예에서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티와 CAR이 결합하는 펩타이드 태그로 된 융합 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.

일부 구현예에서, 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티는 항체 또는 항체 유도체를 포함한다.

일부 구현예에서, CAR는 항체 또는 항체 유도체를 포함한다.

일부 구현예에서, 항체 유도체는 항체 단편이다.

일부 구현예에서, 본 방법은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에서 구축하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 암이다.

일부 구현예에서, 표적 항원을 발현하는 세포는 질병에 걸린 세포이다.

일부 구현예에서, 표적 항원을 발현하는 세포는 암 세포이다.

일부 구현예에서, 표적 항원는 종양 항원이다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 키트에 관한 것이다:

(i) 면역 작동자 세포를 펩타이드 태그에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형하기 위한 핵산, 또는 펩타이드 태그에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포;

(ii) CAR이 결합하는 펩타이드 태그를 세포외 도메인에 포함하는 막 단백질로서, 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 RNA, 또는 제1 RNA를 입수하기 위한 핵산; 및 선택적으로

(iii) 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티와 CAR이 결합하는 펩타이드 태그를 포함하는 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 RNA, 또는 제2 RNA를 입수하기 위한 핵산.

면역 작동자 세포를 펩타이드 태그에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형하기 위한 핵산, 펩타이드 태그에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포, 제1 RNA, 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 제2 RNA 및/또는 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 구현예들은 본 발명에서, 예를 들어 본 발명의 방법의 맥락에서 기술된다.

일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 이용하기 위한 본원에 기술된 물질 또는 조성물 (예를 들어, 면역 작동자 세포를 유전자 변형하기 위한 핵산, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포, 제1 RNA, 제2 RNA 및/또는 키트)에 관한 것이다.

도 1: 모듈형 CAR-T 세포 방식
도면은 ALFA-tag/NbALFA를 예를 들어, 모듈형 상호작용 쌍에 기반한 범용 CAR-T 방식을 개략적인 도표로 도시한다. 여기서, 표면에 태그-결합 모이어티 (예, NbALFA VHH)를 가진 일반적인 기성품으로 생산가능한 CART 세포를 제작한다 (1). 이 CAR-T 세포를 환자에 투여하고, 막-고정된 단백질 도메인 (예, 말단 절단형 (truncated) CLDN6)에 융합된 태그를 암호화하는 RNA 리포플렉스에 의해, 이를 생체내에서 특이적으로 증폭시킬 수 있다 (2). 제2 결합 모이어티, 종양-항원 특이 리간드 (예, scFv, VHH 또는 Fab 단편)에 융합된 ALFA-tag로 이루어진 소위 표적화 리간드 (TL)를 RNA의 지질 나노입자 제형으로 환자에게 투여한다 (3). RNA는 생체내에서 이중 특이성 단백질로 번역되어, 혈류로 분비된다. 표적화 리간드가 특정 종양 항원에 대한 특이적인 결합에 기반하여 종양에 축적된 후, NbALFA-CAR T 세포가 이에 결합하여 활성화됨으로써 종양 세포의 특이적인 세포용해가 유발될 것이다 (4). 여러가지 표적화 리간드를 이용함으로써, 여러가지 종양 항원을 환자의 동일한 CART 세포 생산물을 이용해 순차적으로 또는 동시에 해결할 수 있다.
도 2: 어댑터는 CAR+ 작동자 세포에 결합한다
Jurkat T 세포를 모듈형 CAR을 암호화하는 mRNA로 형질감염하였다. 모듈형 CAR을 발현하는 세포를 용해성 어댑터로 무장한 다음 어댑터-특이 항체로 염색하였다. 도면은 모듈형 CAR 발현 세포의 표면에서의 어댑터 검출 빈도와 강도를 보여준다.
도 3: 일차 인간 T 세포는 모듈형 CAR을 발현할 수 있다.
일차 인간 T 세포를 활성화한 다음 mRNA를 이용해 모듈형 CAR을 발현하도록 조작하였다. CAR 분자를 염색하고, 유세포 측정 방법으로 발현을 검출하였다.
도 4: 모듈형 CAR을 발현하는 일차 인간 T 세포는 용해성 어댑터로 무장할 수 있다.
모듈형 CAR T 세포에 핵산 형질감염된 세포에 의해 생성된 용해성 어댑터 (100 nM)로 무장하였다. 어댑터를 특이 항체로 염색하고, 유세포 측정 방법으로 발현을 검출하였다. 도면은 모듈형 CAR을 발현하는 T 세포 표면에서의 어댑터 검출의 빈도 및 강도를 보여준다.
도 5: 모듈형 CAR-T 플랫폼은 종양 세포의 세포용해를 매개한다.
어댑터로 무장된 모듈형 CAR T 세포를 항원 양성 (Ag+) 종양 세포와 공-배양하였다. CAR-T 세포 반응을 임피던스에 기반한 세포독성 방법을 이용해 분석하였다. 세포독성은 non-mRNA 형질감염 T 세포와 함께 배양한 종양 세포에 대해 표준화하였다.
도 6: iDC에 형질감염된 범용 항원에 의해 자극한 모듈형 CAR 매개 증폭.
인간 미성숙 수지상 세포를 막에 고정되는 결합 모이어티를 암호화하는 mRNA로 형질감염하였다. 동시에, T 세포를 mRNA를 암호화하는 모듈형 CAR로 형질감염하고, 증식 염료로 염색하였다. 모듈형 CAR-T 세포 및 CARVac를 발현하는 iDC를 공배양하였다. 도 6 A 및 B에서, 막에 고정되는 결합 모이어티는 ALFA 펩타이드를 포함하고, CAR은 VHH(aALFA)를 포함한다. 도 6A는 iDC 상에서 표적을 탐지한 반응으로, 어댑터로 무장된 조작된 CAR-T 세포의 증식을 도시한다. 도 6A와 마찬가지로, 모듈형 CAR을 발현하는 인간 T 세포의 증식을 측정한다. 여기서, 모듈형 CAR은 도 6A에서 이용한 VHH(aALFA)PE CAR에 비해 iDC 표면에 발현된 자신의 표적 항원에 대해 친화성이 더 높은 VHH(aALFA) 서열번호 30을 이용하였다. 도 6C 및 D에서, 막에 고정된 결합 모이어티는 VHH(aALFA)를 포함하고, CAR은 ALFA 펩타이드를 포함한다.
도 7: CD19 특이적인 어댑터로 무장된 모듈형 ALFA CAR-T는 CD19로 형질감염된 iDC 또는 일차 인간 B 세포에 대항하여 증식을 매개한다.
일차 인간 T 세포에 mRNA를 암호하는 모듈형 CAR을 형질감염시키고, 증식 염료로 염색하였다. 모듈형 CAR T 세포를 B 세포 (CD19+) 또는 CD19 mRNA로 형질감염한 iDC와 공배양하였다. 증식을 유세포 측정에 의해 분석하였다.

서열 설명

하기 표는 본 발명에서 참조한 특정 서열들의 목록을 제공한다.

서열 설명
서열번호	설명	서열
5'-UTR (hAg-Kozak)
1	5'-UTR	AACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC
3'-UTR (2hBg)
2	3'-UTR	CUCGAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCGAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGC
3'-UTR (FI 요소)
3	3'-UTR	CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
A30L70
4	A30L70	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

상세한 설명

본 발명은 아래에서 상세히 설명되지만, 본 발명의 내용은 변경될 수 있으므로, 본 발명에 기술된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에 사용된 용어들은 구체적인 구현예를 기술하기 위한 목적일 뿐이며, 첨부된 청구항에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않은 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 당해 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다.

바람직하게는, 본 발명에 사용된 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 언급된 바와 같이 정의된다.

본 발명의 실시에는, 달리 언급되지 않은 한, 본 기술 분야의 문헌에 언급된 통상적인 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기법 방법들이 채택될 것이다 (예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989 참조).

이하, 본 발명의 요소들을 설명한다. 이들 요소는 구체적인 구현예를 들어 열거되지만, 임의의 방식 및 임의의 수로 조합하여 부가적인 구현예를 구성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 구현예들은 본 발명을 명시적으로 기술된 구현예로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 설명은 명시적으로 기술된 구현예들이 임의의 복수의 기술된 요소들과 조합된 구현예들을 기술하고 이를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 아울러, 언급된 모든 요소들에 대한 임의 순열 및 조합도 문맥상 달리 지시되지 않은 한 이러한 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.

용어 "약"은 대략적으로 또는 거의를 의미하며, 본 발명에 언급된 수치 값 또는 범위의 맥락에서, 일 구현예에서, 언급되거나 또는 청구된 수치 값 또는 범위에 대한 ±20%, ±10%, ±5% 또는 ±3%를 의미한다.

개시 내용을 설명하는 문맥에 (특히 청구항의 맥락에서) 사용되는 용어 관사 ("a" 및 "an" 및 "the") 및 비슷한 표현은, 본원에서 달리 명시되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충하지 않은 한, 단수 및 복수를 모두 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명에서 수치 값들에 대한 범위 언급은 주로 범위에 속하는 각각의 개별 값들을 각각 기술하는 약칭 방식을 적용한 것으로 의도된다. 본원에서 달리 언급되지 않은 한, 각각의 개별 값은 본원에 각각 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본 발명에 기술된 모든 방법들은, 본원에서 달리 언급되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충하지 않은 한, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예, 또는 예시적인 표현 (예, "와 같은")은 주로 개시 내용을 잘 설명하기 위한 것일 뿐, 청구항의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 명세서에서 어떤 표현도 개시 내용을 실시하는데 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소들을 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.

명확하게 달리 명시되지 않은 한, 용어 "포함하는"은 본 발명의 맥락에서 "포함하는"에 의해 열거된 목록의 구성 요소와 더불어, 추가적인 구성 요소들이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 그러나, 본 발명의 구체적인 구현예로서, 용어 "포함하는"은 추가적인 구성 요소들이 존재하지 않을 경우도 포괄하는 것으로 고려되며, 즉 이러한 구현예의 경우 "포함하는"은 "로 이루어진" 또는 "로 본질적으로 이루어진"의 의미인 것으로 이해되어야 한다.

몇몇 문헌들이 본 명세서의 전체 내용에서 인용된다. 본원에 인용된 전술한 또는 후술한 각각의 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 명세서, 설명서 등)은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 이러한 기술 내용을 선행할 자격이 없다는 인정으로서 해석되어서는 안된다.

정의

이하, 본 발명의 모든 측면들에 적용되는 정의들을 제시한다. 아래 용어들은 달리 언급되지 않은 한 후술한 의미를 가진다. 정의되지 않은 임의의 용어는 당해 기술 분야에서 이해되는 의미를 가진다.

본원에 사용된 바와 같이, "감소한다", "낮춘다", "저해한다" 또는 "손상시킨다"와 같은 용어들은, 수준 측면에서, 바람직하게는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 75% 또는 그 이상의 전체적인 감소 또는 전체적인 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 이들 용어는 완전한 또는 본질적으로 완전한 저해, 즉 0으로의 감소 또는 본질적으로 0까지의 감소를 망라한다.

"증가시킨다", "강화한다" 또는 "초과한다"와 같은 용어들은 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500% 또는 그 이상의 증가 또는 강화에 대한 것이다.

본 발명에 따라, 용어 "펩타이드"는 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드를 망라하며, 펩타이드 결합으로 서로 연결된 연속적인 아미노산을 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 6개 이상, 약 8개 이상, 약 10개 이상, 약 13개 이상, 약 16개 이상, 약 20개 이상에서 최대 약 50개, 약 100개 또는 약 150개 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 거대 펩타이드, 특히 아미노산 약 150개 이상을 가진 펩타이드를 지칭하지만, 용어 "펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 본원에서 통상적으로 동의어로 사용된다.

아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)과 관련하여 "단편"은 아미노산 서열의 일부를 의미하며, 즉, N-말단 및/또는 C-말단에서 짧아진 아미노산 서열을 나타내는 서열을 의미한다. C-말단에서 짧아진 단편 (N-말단 단편)은, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 3'-말단이 결핍된 말단 절단된 (truncated) 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. N-말단에서 짧아진 단편 (C-말단 단편)은, 말단 절단된 오픈 리딩 프래임이 번역 개시에 이용되는 개시 코돈을 포함하는 한, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 5'-말단이 결핍된 말단 절단된 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. 아미노산 서열의 단편은, 예를 들어, 아미노산 서열로부터 유래한 아미노산 잔기들의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%를 포함한다. 아미노산 서열의 단편은, 바람직하게는, 아미노산 서열로부터 유래한 연속적인 아미노산을 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개 포함한다.

본원에서, "변이체"는 하나 이상의 아미노산 변형으로 인해 부모 (parent) 아미노산 서열과는 차이가 있는 아미노산 서열을 의미한다. 부모 아미노산 서열은 자연 생성 또는 야생형 (WT) 아미노산 서열일 수 있거나, 또는 야생형 아미노산 서열의 변형된 버전일 수 있다. 바람직하게는, 변이체 아미노산 서열은 부모 아미노산 서열과 비교해 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어 부모 아미노산 서열과 비교해 1개 내지 약 20개, 바람직하게는 1개 내지 약 10개 또는 1개 내지 약 5개의 아미노산 변형을 가진다.

본원에서 "야생형" 또는 "WT" 또는 "천연 (native)"은 대립유전자 변이를 비롯해 자연계에서 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 아미노산 서열, 펩타이드 또는 단백질은 의도적으로 변형하지 않은 아미노산 서열을 가진다.

본 발명의 목적에서, 아미노산 서열 (펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결손 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 돌연변이, 스플라이싱 변이체, 번역 후 수정된 버전, 입체구조 (conformation), 이소형, 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 종 상동체 (species homolog), 특히 자연적으로 생성되는 것을 모두 포괄한다. 용어 "변이체"는 특히 아미노산 서열의 단편을 포괄한다.

아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에 하나 또는 2 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입이 존재하는 아미노산 서열의 경우, 수득되는 산물에 대한 적절한 스크리닝을 이용한 무작위 삽입도 가능하지만, 아미노산 서열 내 특정 부위에 하나 이상의 아미노산 잔기를 삽입한다. 아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그보다 많은 수의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합을 포함한다. 아미노산 결손 변이체는 서열에서 하나 이상의 아미노산의 제거, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 제거를 특징으로 한다. 결손은 단백질의 임의 위치에 존재할 수 있다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 결손을 포함하는 아미노산 결손 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단형 변이체 (truncation variant)로도 지칭된다. 아미노산 치환 변이체는 서열에서 하나 이상의 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입하는 것을 특징으로 한다. 상동적인 단백질들 또는 펩타이드들 간에 비-보존된 아미노산 서열 내 위치에 변형이 존재하거나, 및/또는 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 펩타이드 및 단백질 변이체에서 아미노산 변경은 보존적인 아미노산 변경, 즉 유사하게 하전 또는 비-하전된 아미노산으로 치환하는 것이다. 보존적인 아미노산 변경은 측쇄가 비슷한 아미노산들로 구성된 동일 계열의 다른 아미노산으로의 치환을 수반한다. 자연 생성 아미노산은 일반적으로 4가지 계열로 나뉜다: 산성 아미노산 (아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성 아미노산 (라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성 아미노산 (알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비-하전된 극성 아미노산 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다. 일 구현예에서, 보존적인 아미노산 치환은 다음과 같은 군 내 치환을 포함한다:

글리신, 알라닌;

발린, 이소루신, 루신;

아스파르트산, 글루탐산;

아스파라긴, 글루타민;

세린, 트레오닌;

라이신, 아르기닌; 및

페닐알라닌, 티로신.

바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과 주어진 아미노산 서열에 대한 변이체 아미노산 서열 간의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는 적어도 약 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%에 해당하는 아미노산 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 아미노산 200개로 구성된다면, 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 아미노산, 일부 구현예에서 연속적인 아미노산 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 60개, 적어도 약 80개, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개 또는 약 200개에 대해 제시된다. 일부 구현예에서, 유사성 또는 동일성 정도는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 제시된다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 기술 분야에 공지된 도구를 사용해, 바람직하게는 최상의 서열 정렬, 예를 들어, Align을 사용해, 표준 설정 조건으로, 바람직하게는 EMBOSS::needle, 매트릭스: Blosum62, 갭 오픈 (Gap Open) 10.0, 갭 연장 (Gap Extend) 0.5 하에 수행할 수 있다.

"서열 유사성"은 보존적인 아미노산 치환이거나 또는 동일한 아미노산의 %를 나타낸다. 아미노산 서열 2종 간의 "서열 동일성"은 서열들 간에 동일한 아미노산의 %를 나타낸다. 핵산 서열 2종 간의 "서열 동일성"은 서열들 간에 동일한 뉴클레오티드의 %를 나타낸다.

용어 "% 동일한", "동일성 %" 또는 유사 용어는 특히 비교할 서열을 최적으로 정렬하였을 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 %를 나타내는 것으로 의도된다. 이러한 %는 순전히 통계이며, 서열 2종 간의 차이는 비교할 서열의 전체 길이에 무작위로 분포할 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 서열 2종 간의 비교는 통상적으로, 대응하는 서열들의 국소 영역을 식별하기 위해, "분절" 또는 "비교 창"과 관련하여, 최적으로 정렬한 후, 서열을 비교함으로써 이루어진다. 비교하기 위한 최적의 정렬은 수동으로 또는 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482에 따른 국소 상동성 알고리즘, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443에 따른 국소 상동성 알고리즘, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444에 따른 유사성 검색 알고리즘, 또는 이러한 알고리즘을 활용한 컴퓨터 프로그램 (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 보조적으로 이용해, 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 2종 간의 동일성 %는 미국 국립 생물공학 정보 센터 (NCBI) 웹사이트에서 이용가능한 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 이용해 결정한다 (예를 들어, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq). 일부 구현예에서, NCBI 웹사이트에서 BLASTN 알고리즘에 적용되는 알고리즘 매개변수로는 (i) 예상 역치 10; (ii) 문자 크기 28; (iii) 질의 범위에서 최대 매칭 0; (iv) 매치/미스매치 스코어 1, -2; (v) 갭 코스트 선형 (Gap Costs set to Linear); 및 (vi) 저 복잡성 영역에 대한 필터 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, NCBI 웹사이트에서 BLASTP 알고리즘에 적용되는 알고리즘 매개변수로는 (i) 예상 역치 10; (ii) 문자 크기 3; (iii) 질의 범위에서 최대 매칭 0; (iv) 매트릭스 BLOSUM62; (v) 갭 코스트 존재: 11 연장: 1; 및 (vi) 조건부 조합 점수 매트릭스 조정 (conditional compositional score matrix adjustment)을 포함한다.

동일성 %는 비교 서열에 대응하는 동일 위치의 개수를 결정하고, 이를 비교한 위치의 총수 (예를 들어 참조 서열에서의 위치 총수)로 나눈 후 여기에 100을 곱하여 구한다.

일부 구현예에서, 유사성 또는 동일성 정도는 참조 서열의 전장의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 영역에 대해 제시된다. 예를 들어, 만일 참조 핵산 서열이 뉴클레오티드 200개로 이루어진다면, 동일성 정도는 뉴클레오티드, 일부 구현예에서, 연속적인 뉴클레오티드 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개 또는 약 200개에 대해 제시된다. 일부 구현예에서, 동일성 또는 유사성의 정도는 참조 서열의 전장에 대해 제시된다.

상동적인 아미노산 서열은 본원에 따르면 아미노산 잔기들에 대해 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 나타낸다.

본 발명에 기술된 아미노산 서열 변이체는 당해 기술 분야의 당업자에 의해, 예를 들어, 재조합 DNA 조작을 통해 쉽게 제조할 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결손을 가진 펩타이드 또는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작 방법은, 예를 들어, Sambrook et al. (1989)에 상세히 기술되어 있다. 또한, 본원에 기술된 펩타이드 및 아미노산 변이체는, 예를 들어 고상 합성 및 유사 방법과 같이 공지된 펩타이드 합성 기법을 보조적으로 이용해 쉽게 제조할 수 있다.

일 구현예에서, 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)의 단편 또는 변이체는 바람직하게는 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"이다. 아미노산 서열의 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"라는 용어는 이것이 기원한 아미노산 서열과 동일한 또는 비슷한 한가지 이상의 기능적 특성을 발휘하는 임의의 단편 또는 변이체를 의미하며, 즉 기능적 균등물이다. 항체와 같은 결합제의 서열과 관련하여, 구체적인 한가지 기능은 단편 또는 변이체의 기원이 되는 아미노산 서열에 의해 구현되는 한가지 이상의 결합 활성이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"는, 특히, 부모 분자 또는 서열의 아미노산 서열과 비교해 하나 이상의 아미노산이 변형된 아미노산 서열을 포함하지만, 부모 분자 또는 서열의 한가지 이상의 기능을 여전히 충족할 수 있는, 예를 들어 표적 분자에 대한 결합성을 여전히 발휘하는, 변이체 분자 또는 서열을 의미한다. 일 구현예에서, 부모 분자 또는 서열의 아미노산 서열 내 변형은 분자 또는 서열의 특징을 현저하게 바꾸지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다. 다른 구현예에서, 기능성 단편 또는 기능성 변이체의 기능이 저하될 순 있지만 여전히 현저한 수준으로 존재하며, 예를 들어, 기능성 변이체의 결합성이 부모 분자 또는 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%일 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 기능성 단편 또는 기능성 변이체의 결합성이 부모 분자 또는 서열과 비교해 강화될 수도 있다.

명시된 아미노산 서열 (펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)"로부터 유래한" 아미노산 서열 (펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)은 제1 아미노산 서열의 기원을 참조한다. 바람직하게는, 특정 아미노산 서열로부터 유래한 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편과 동일한, 본질적으로 동일한 또는 상동적인 아미노산 서열을 가진다. 특정 아미노산 서열로부터 유래한 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에서 이용하기 적합한 서열이, 이의 기원이 되는 자연 생성 또는 본래의 서열과 서열상 차이는 있지만 본래의 서열의 바람직한 활성을 유지하도록 변형될 수 있는 것임을, 이해할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 공지하기 위해 이용할 수 있는 "설명 자료" 또는 "설명서"는 출판물, 기록, 도표 또는 임의의 다른 표현 매체를 포괄한다. 본 발명의 키트의 설명 자료는, 예를 들어, 본 발명의 조성물이 수용된 용기에 고정되거나 또는 조성물이 수용된 용기와 함께 운반될 수 있다. 대안적으로, 설명 자료는 용기와는 별도로, 설명 자료와 조성물을 사용자가 함께 이용하고자 하는 의도로 이송될 수 있다.

"단리된"은 자연적인 상태로부터 달라지거나 또는 취해지는 것을 의미한다.예를 들어, 살아있는 동물에 본래 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이 아니며, 자연적인 상태에서 함께 존재하는 물질로부터 일부 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 비-천연 환경, 예를 들어 숙주 세포에 존재할 수 있거나, 또는 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있다.

용어 "재조합"은 본 발명의 맥락에서 "유전자 조작을 통해 만들어지는" 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서, 재조합 세포와 같은 "재조합 대상체"는 자연적으로 생성되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "자연 생성"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, (바이러스를 비롯한) 유기체에 존재하고 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있으며 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩타이드 또는 핵산은 자연 생성이다.

용어 "결합한다" 또는 "결합하는"은 표적과의 비-공유적인 상호작용에 대한 것이다. 일 구현예에서, 용어 "결합한다" 또는 "결합하는"은 특이적인 결합에 대한 것이다. 용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합한다"는, 본원에 사용된 바와 같이, 특이적인 표적 분자를 인지하지만 샘플 또는 개체에서 다른 분자는 실질적으로 인지 또는 결합하지 않는, 항체 또는 항원 수용체와 같은 분자를 의미한다. 예를 들어, 한가지 종으로부터 유래한 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 다른 종으로부터 유래한 항원에도 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차-종 반응성은 그 자체로는 항체를 특이적인 것으로 분류하는 것을 바꾸진 않는다. 다른 예로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 다른 대립유전자 형태에도 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 항체를 특이적인 것으로 분류하는 것을 바꾸진 않는다.

일부 경우에, 용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합한다"는, 상호작용이 화학 종 상의 특정 구조체 (예, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존하는 것을 의미하기 위해, 항체, 단백질 또는 펩타이드와 제2 화학적 종 간의 상호작용에 대해 사용될 수 있으며; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특이적인 단백질 구조를 인지하여 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 표지된 "A"와 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A를 함유한 분자 (또는 유리형의 비-표지된 A)의 존재시 항체에 결합한 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "생리학적 pH"는 pH 약 7.5를 지칭한다.

용어 "유전자 변형" 또는 간단히 "변형"은 세포를 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함한다. 용어 "형질감염"은 핵산, 특히 RNA를 세포에 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적에서, 용어 "형질감염"은 또한 세포에 핵산의 도입 또는 세포에 의한 핵산의 흡수를 포함하며, 여기서 세포는 개체, 예를 들어 환자에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 본원에 기술된 핵산을 형질감염시키기 위한 세포는 시험관내 또는 생체내에 존재할 수 있으며, 예를 들어 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 유기체의 일부를 구성할 수 있다. 본 발명에 따라, 형질감염은 일시적이거나 또는 안정적일 수 있다. 형질감염의 일부 이용에서는, 형질감염된 유전 물질이 일시적으로 발현되는 것만으로도 충분하다. RNA는 이것이 암호화하는 단백질을 일시적으로 발현하도록 세포에 형질감염시킬 수 있다. 형질감염 공정으로 도입된 핵산은 통상적으로 핵 게놈에 통합되지 않으므로, 외래 핵산은 유사분열을 통해 희석되거나 또는 분해될 것이다. 핵산의 에피좀 증폭을 허용하는 세포는 희석 속도를 크게 늦춘다. 형질감염된 핵산이 실제 그 세포와 이의 딸 세포의 게놈에 잔류하는 것이 바람직하다면, 안정적인 형질감염이 이루어져야 한다. 이러한 안정적인 형질감염은 바이러스-매개 시스템 또는 트랜스포존-매개 시스템을 형질감염에 이용함으로써 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 수용체를 발현하도록 유전자 변형된 세포는 항원 수용체를 암호화하는 핵산으로 안정적으로 형질감염된다. 일반적으로, 도킹 화합물을 암호화하는 핵산 및/또는 활성화 화합물을 암호화하는 핵산은 세포에 일시적으로 형질감염된다. RNA는 이것이 암호화하는 단백질을 일시적으로 발현하도록 세포에 형질감염될 수 있다.

제1 표적

본원에서 사용되는 바와 같이, "제1 표적"은, 예를 들어, 치료학적 방법에서, 결합 또는 달리 다루고자 하는 표적에 대한 것이다.

제1 표적은 인간 또는 동물 체내 임의의 적절한 표적들로부터 선택할 수 있으며, 이는 세포, 병원체 또는 기생 동물일 수 있거나, 또는 세포, 병원체 또는 기생 동물 상에 존재할 수 있다.

특정 구현예에서, 제1 표적은 세포 표면 항원 또는 세포 표면 수용체와 같이 표적 세포의 표면에 존재하는 단백질과 같은 구조체이다. 제1 표적은 질환, 예를 들어, 감염 또는 암 상태에서 상향 조절될 수 있다. 병에 걸린 조직의 경우, 마커가 건강한 조직에서와는 다를 수 있어, 요법, 특히 표적 요법에 대해 고유한 잠재성을 제공할 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 표적 또는 간단히 "표적"은 질환-관련 항원, 예를 들어 종양 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원이다.

용어 "질환-관련 항원"은 가장 광의적인 의미로, 질환과 연관된 임의의 항원을 지칭하기 위해 사용된다. 질환-관련 항원은 미생물 감염과 관련 있을 수 있으며, 전형적으로 미생물 항원이거나 또는 암, 전형적으로 종양과 관련 있을 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 표적 또는 간단히 "표적"은 종양 항원이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "종양 항원" 또는 "종양-관련 항원"은 정상 환경에서 제한된 수의 조직 및/또는 장기에서 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되는 단백질을 지칭하며, 예를 들어, 종양 항원은 정상 환경에서 위 조직, 바람직하게는 위 점막, 생식 기관, 예를 들어, 고환, 영양배엽조직, 예를 들어, 태반, 또는 생식계열 세포에서 특이적으로 발현될 수 있으며, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 또는 비-정상적으로 발현된다. 이러한 맥락에서, "제한된 수"는 바람직하게는 3 이하, 더 바람직하게는 2 이하를 의미한다. 본 발명의 맥락에서 종양 항원은, 예를 들어, 분화 항원, 바람직하게는 세포 타입 특이적인 분화 항원, 즉 정상 환경에서 특정 분화 단계에서 특수한 세포 타입에서 특이적으로 발현되는 단백질, 암/고환 항원, 즉 정상 환경에서 고환, 때로는 태반에서 특이적으로 발현되는 단백질, 및 생식계열 특이 항원을 망라한다. 본 발명의 맥락에서, 종양 항원은 바람직하게는 암 세포의 세포 표면에 부속되어 있으며, 바람직하게는 정상 조직에서는 발현되지 않거나, 단지 드물게 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원 또는 종양 항원의 비-정상적인 발현이 암 세포를 식별한다. 본 발명의 맥락에서, 개체, 예를 들어, 암 질환을 앓고 있는 환자에서 암 세포에 의해 발현되는 종양 항원은, 바람직하게는 개체의 자기-단백질이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 종양 항원은 정상 환경 하에 비-필수 조직 또는 장기, 즉, 면역 시스템에 의해 손상되었을 경우 개체의 사망을 유발하지 않는 조직 또는 장기, 또는 면역 시스템이 접근하지 못하거나 또는 거의 접근하지 못하는 장기 또는 신체 구조에서 특이적으로 발현된다. 바람직하게는, 종양 항원의 아미노산 서열은 암 조직에서 발현되는 종양 조직과 정상 조직에서 발현되는 종양 항원 간에 동일하다.

종양 항원에 대한 예로는 p53, ART-4, BAGE, β-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, claudin 계열의 세포 표면 단백질, 예를 들어 CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE 및 WT를 포함한다. 특히 바람직한 종양 항원으로는 CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) 및 CLAUDIN-6 (CLDN6)를 포함한다.

본 발명에서, 표적, 예를 들어 표적 세포 상의 항원에 결합하는 모이어티를 가진 도킹 화합물을 제공함으로써, 표적 세포와 같은 표적으로 면역 작동자 세포를 특이적으로 전달할 수 있다. 도킹 화합물은 표적과 면역 작동자 세포를 함께 끌어당기기 위해 면역 작동자 세포에 대한 결합 모이어티를 추가로 포함한다.

도킹 화합물

본 발명에서, RNA-암호화된 "도킹 화합물"은 제1 표적, 예를 들어 표적 세포 또는 표적 세포 상의 항원과 도킹 화합물 간에 비-공유 연결과 같은 연결을 형성하기 위해 이용된다. 도킹 화합물은 면역 작동자 세포에 대해 연결, 예를 들어 비-공유 연결을 형성할 수 있다. RNA-암호화된 도킹 화합물은 본원에서 "RiboDocker"로도 지칭된다.

일 구현예에서, 도킹 화합물은 "표적에 결합하는 결합 모이어티", 특히 "표적 세포 상의 표적에 결합하는 결합 모이어티" 또는 대상 제1 표적에 결합할 수 있는 "표적 항원에 결합하는 결합 모이어티"로도 지칭되는, "제1 표적화 모이어티"를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "제1 표적화 모이어티"는 제1 표적에 결합하는 도킹 화합물의 일부를 지칭한다. 이러한 표적화 모이어티는 전형적으로 세포 표면 표적 (예, 막 수용체) 또는 구조 단백질 (예를 들어, 아밀로이드 플라크)에 대해 친화성을 가진 모이어티이다. 이들 모이어티는 제1 표적에 결합하는 임의의 펩타이드 또는 단백질 (예, 항체 또는 항체 단편)일 수 있다. 본 발명에 이용하기 적합한 제1 표적화 모이어티에 대한 구체적인 예로는 세포 표면 항원에 결합하는 펩타이드 및 항체를 포함한다. 제1 표적화 모이어티에 대한 다른 예는 수용체가 결합하는 펩타이드 또는 단백질이다.

제1 표적화 모이어티는 바람직하게는 고 특이성 및/또는 고 친화성으로 결합하며, 제1 표적과의 결합은 바람직하게는 체내에서 안정적이다.

상기에 열거된 제1 표적에 대한 특이적인 표적화를 허용하기 위해, 도킹 화합물의 제1 표적화 모이어티는, 비-제한적으로, 항체, 항체 단편, 예를 들어 Fab2, Fab, scFV, VHH 도메인 및 기타 단백질 또는 펩타이드 등의 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명에 대한 특정 구현예에서, 제1 표적은 수용체이며, 적절한 제1 표적화 모이어티는 이러한 수용체의 리간드 또는 수용체에 여전히 결합하는 이의 일부분, 예를 들어 수용체 결합 단백질 리간드의 경우에는 수용체 결합 펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

단백질 특성을 가진 제1 표적화 모이어티에 대한 다른 예로는 인터페론, 예를 들어 α, β 및 γ 인터페론, 인터루킨 및 단백질 성장인자, 예를 들어 전환 성장인자 (transforming growth factor, TGF) 또는 혈소판-유래 성장인자 (PDGF) 등이 있다.

본 발명에 대한 추가적인 특정 구현예에서, 제1 표적 및 제1 표적화 모이어티는, 암 또는 감염과 같은 질환 또는 조직의 특이적인 표적화 또는 표적화 증가를 달성하도록, 선택된다. 이는, 조직-특이적인 발현, 세포-특이적인 발현 또는 질환-특이적인 발현을 가진 제1 표적을 선택함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 종양 항원은 정상 세포에서 더 낮은 수준으로 발현되거나 또는 발현되지 않으면서 다양한 종양 세포에서 과다 발현될 수 있다.

도킹 화합물은 "제2 표적"으로서, 즉 면역 작동자 세포에 대한 결합 파트너를 제공하는 도킹 화합물의 일부로서 작용하는 기를 추가로 포함한다. 면역 작동자 세포 ("제2 표적")에 결합하는 도킹 화합물에 포함된 결합 모이어티와 도킹 화합물 ("제2 표적화 모이어티")에 결합하는 면역 작동자 세포에 포함된 결합 모이어티 (즉, 항원 수용체)가 서로 결합한다.

일 구현예에서, 도킹 화합물은 제1 표적에 결합하는 결합 도메인과 면역 작동자 세포 상의 제2 표적화 모이어티에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 서브유닛 2 이상을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 융합 단백질은 서브유닛 2 이상 간의 번역 융합체이다. 번역 융합체는 하나의 서브유닛에 대한 암호화 뉴클레오티드 서열을 다른 서브유닛에 대한 암호화 뉴클레오티드 서열과 리딩 프래임으로 유전자 조작함으로써 구축할 수 있다. 서브유닛들은 링커에 의해 배치된다.

일 구현예에서, 도킹 화합물은 펩타이드 단쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 펩타이드 단쇄는 제1 표적에 결합하는 항체 단편과 면역 작동자 세포 상의 제2 표적화 모이어티 (즉, 항원 수용체)에 결합하는 펩타이드 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 항체 단편은 VHH, scFv 또는 이들의 혼합이다.

일 구현예에서, 도킹 화합물에 포함된 제2 표적은 펩타이드 또는 단백질, 예를 들어, 펩타이드 태그를 포함하고, 면역 작동자 세포에 포함된 제2 표적화 모이어티, 즉 항원 수용체는 펩타이드 또는 단백질에 결합하는, 결합제, 예를 들어 항체 단편을 포함한다.

일 구현예에서, 본원에서 사용되는 제2 표적/제2 표적화 모이어티 시스템은 에피토프 태그/결합제 시스템을 포함한다.

일 구현예에서, 에피토프 태그/결합제 시스템은 서열 SRLEEELRRRLTE를 포함하는 에피토프 태그를 포함하고, 결합제는 CDR1 서열 GVTISALNAMAMG, CDR2 서열 AVSERGNAM 및 CDR3 서열 LEDRVDSFHDY를 포함하는 camelid VHH 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 에피토프 태그/결합제 시스템은 서열 SRLEEELRRRLTE를 포함하는 에피토프 태그를 포함하고, 결합제는 아미노산 서열 EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS, 상기한 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일한 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열의 단편 또는 상기 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, camelid VHH 도메인을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "에피토프 태그"는 항체 또는 항체-유사 기능을 가진 단백질성 분자 (proteinaceous molecule)가 결합할 수 있는 아미노산 가닥을 지칭한다.

일 구현예에서, 도킹 화합물은, RNA를 발현하는 세포로부터 도킹 화합물의 분비를 허용하는, 신호 펩타이드, 예를 들어 N-말단 신호 펩타이드를 포함한다.

활성화 화합물

본 발명은 T 세포와 같은 면역 작동자 세포의 효능을 강화하기 위한 활성화 화합물을 추가로 수반한다.

본원에 기술된 바와 같이, 항원 수용체-조작된 면역 작동자 세포는 항원 수용체-조작된 면역 작동자 세포를 투여함으로써 또는 개체에서 항원 수용체-조작된 면역 작동자 세포를 구축함으로써 개체에 제공할 수 있다. 일 구현예에서, 항원 수용체-조작된 면역 작동자 세포는 처치받은 개체에서 구축된다. 이러한 생체내 구축은 일반적으로 개체에서 항원 수용체-조작된 면역 작동자 세포를 소량으로만 공급할 것이다. 그러나, 이러한 소량의 항원 수용체-조작된 면역 작동자 세포는 항원 수용체에 대한 활성화 화합물을 제공함으로써 달성되는 강한 자극 효과로 인해, 치료학적으로 유효할 것으로 예상된다. 일반적으로, 본원에 기술된 방법이 본원에 기술된 면역 작동자 세포가 결합하는 모이어티를 포함하는 활성화 화합물의 투여를 추가로 제공하므로, 항원 수용체-조작된 면역 작동자 세포는 준-치료학적 양 (sub-therapeutic amount)으로 개체에 제공할 수 있으며, 이러한 결합으로 면역 작동자 세포의 활성화 및/또는 증폭이 이루어진다. 일 구현예에서, 면역 작동자 세포는, 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포와 같은 2차 림프 기관의 세포 상에 존재할 경우에, 항원 수용체를 이용해 활성화 화합물에 결합한다.

본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, 활성화 화합물을 암호화하는 RNA는 개체의 세포에서 발현되어, 면역 작동자 세포에 의해 발현된 항원 수용체가 결합하기 위한 모이어티를 제공하며, 결합이 이루어지면 면역 작동자 세포의 자극, 감작 및/또는 증폭이 이루어진다.

활성화 화합물은 면역 작동자 세포가 결합할 수 있는 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 활성화 화합물은 면역 작동자 세포가 결합할 수 있는 도킹 화합물의 제2 표적 또는 이의 단편 또는 변이체에 해당하는 모이어티, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 펩타이드 태그를 포함한다.

활성화 화합물은 세포 표면, 예를 들어 항원 제시 세포의 세포 표면 상에 면역 작동자 세포가 결합할 수 있는 모이어티를 제시하는 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 모이어티는 막 단백질, 예를 들어 막관통 단백질 또는 수용체를 포함한다. 이에, 활성화 화합물은 면역 작동자 세포가 결합할 수 있는 모이어티 (예, 펩타이드 태드)와 세포 표면 상에서 면역 작동자 세포가 결합할 수 있는 모이어티 (예, 막 단백질)를 제시하는 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역 작동자 세포가 결합할 수 있는 모이어티는 일반적으로 세포 표면 상에, 즉 세포 외측에 존재한다.

일 구현예에서, 활성화 화합물을 암호화하는 RNA를 투여하여, (적절한 표적 세포에 의해 RNA 발현 후) 면역 작동자 세포를 자극, 감작 및/또는 증폭시키기 위한 활성화 화합물을 제공한다. 환자에서 자극, 감작 및/또는 증폭된 T 세포와 같은 면역 작동자 세포는 도킹 화합물을 경유하여 표적 세포 집단 또는 항원을 발현하는 표적 조직을 인지하며, 이로서 병에 걸린 세포의 제거가 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 활성화 화합물을 암호화하는 RNA는 2차 림프 장기를 표적으로 한다.

본원에 사용된 바와 같이, "활성화" 또는 "자극"은 검출가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포와 같은 면역 작동자 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 신호전달 경로의 개시, 유도된 사이토카인 생산, 및 검출가능한 작동자 기능과 관련있을 수 있다. 용어 "활성화된 면역 작동자 세포"는 그 중에서도 세포 분열 중인 면역 작동자 세포를 지칭한다.

용어 "감작"은 T 세포와 같은 면역 작동자 세포가 이의 특이적인 항원과 최초로 접촉하여 작동자 T 세포와 같은 작동자 세포로의 분화를 유발하는 과정을 지칭한다.

용어 "클론 증폭" 또는 "증폭"은 특정 실체가 증폭되는 과정을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 이 용어는 바람직하게는 림프구가 항원에 의해 자극받아, 많아 지고, 그 항원을 인지하는 특정 림프구가 증폭되는 면역학적 반응 맥락에서 사용된다. 바람직하게는, 클론 증폭은 림프구의 분화로 이어진다.

일반적으로, 활성화 화합물은 이의 항원 수용체 결합 모이어티가 면역 작동자 세포에 의해 발현된 항원 수용체에 의해 결합하는데 이용가능하도록 세포 표면 상에 발현된다.

용어 "세포 표면 상에 발현된" 또는 "세포 표면에 부속된"은 수용체 또는 항원과 같은 분자가 세포의 원형질막에 붙어 위치하는 것을 의미하며, 여기서 분자의 적어도 일부는 이러한 세포의 세포외 공간으로 향하고, 세포 외측으로부터, 예를 들어 세포 외측에 위치한 항원 수용체에 의해, 접근가능하다. 이러한 맥락에서, 일부는 바람직하게는 아미노산 4개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 12개 이상, 더 바람직하게는 20개 이상이다. 부속은 직접 또는 간접일 수 있다. 예를 들어, 부속은 하나 이상의 막관통 도메인에 의해, 하나 이상의 지질 앵커에 의해 또는 임의의 다른 단백질, 지질, 사카라이드 또는 세포 원형질막의 외측 첨판 (outer leaflet)에서 발견할 수 있는 기타 구조와의 상호작용에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 세포 표면에 부속된 분자는 세포외 부분을 가진 막관통 단백질일 수 있거나 또는 막관통 단백질인 다른 단백질과의 상호작용에 의해 세포의 표면에 부속된 단백질일 수 있다.

"세포 표면" 또는 "세포의 표면"은 당해 기술 분야에서 일반적인 의미에 따라 사용되며, 즉 단백질 및 기타 분자에 의한 결합에 접근가능한 세포의 외측을 포함한다. 항원은, 세포 표면에 위치하고 예를 들어 세포에 첨가된 항원-특이 항체에 의한 결합에 접근 가능하다면, 세포 표면 상에 발현되는 것이다. 일 구현예에서, 세포 표면 상에 발현된 항원은 항원 수용체에 의해 인지된 세포외 부분을 가진 내장된 (integral) 막 단백질이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "세포외 부분" 또는 "엑소도메인"은 세포의 세포외 공간으로 향하고, 바람직하게는 예를 들어, 세포 외측에 위치한 항체와 같은 분자에 결합함으로써, 세포의 외측으로부터 접근가능한, 단백질과 같은 분자의 부분을 지칭한다.

면역 작동자 세포

본원에 사용되는 면역 작동자 세포는 제2 표적화 모이어티를 포함한다. 이 제2 표적화 모이어티는 또한 본원에서 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 간단하게 항원 수용체를 지칭한다. 제2 표적화 모이어티는 활성화 화합물에 포함된 면역 작동자 세포 및/또는 도킹 화합물에 포함된 제2 표적에 대한 결합 모이어티에 대해 결합 파트너를 형성하는 면역 작동자 세포의 부분에 관한 것이다. 면역 작동자 세포는 바람직하게는 요망되는 효과, 예를 들어 치료학적 효과를 제공하거나 또는 달성할 수 있다.

본 발명과 연계하여 사용되며 항원 수용체를 암호화하는 핵산 (DNA 또는 RNA)이 도입될 수 있는 면역 작동자 세포는 특히 세포용해 잠재성을 가진 세포, 특히 림프계 세포와 같은 면역 작동자 세포를 포함하며, 바람직하게는 T 세포, 특히 세포독성 림프구, 바람직하게는 세포독성 T 세포, 자연 살상 (NK) 세포 및 림포카인-활성화된 살상 (LAK) 세포로부터 선택되는 세포독성 림프구이다. 이들 세포독성 림프구들 각각은, 활성화되면, 표적 세포의 파괴를 촉발한다. 예를 들어, 세포독성 T 세포는 다음과 같은 수단 중 어느 하나 또는 이들에 의해 표적 세포의 파괴를 촉발한다. 첫째, T 세포는 활성화되면 퍼포린, 그랜자임 및 그래뉼라이신과 같은 세포독소를 방출한다. 퍼포린 및 그래뉼라이신은 표적 세포에 구멍을 만들고, 그랜자임이 세포에 들어가 세포질에서 세포의 세포자살 (프로그래밍된 세포 사멸)을 유도하는 카스파제 캐스케이드를 촉발한다. 둘째, 세포자살은 T 세포와 표적 세포 간의 Fas-Fas 리간드 상호작용을 통해 유발될 수 있다. 본 발명과 관련하여 이용되는 세포는 바람직하게는 자가 세포일 것이나, 이종의 세포 또는 동종이계 세포도 이용할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 용어 "작동자 기능"은, 예를 들어 종양 세포와 같이 질병에 걸린 세포의 사멸 또는 종양 확산 및 전이의 저해 등의 종양 증식의 저해 및/또는 종양 진행의 저해를 달성하는, 면역 시스템의 구성성분에 의해 매개되는 임의의 기능을 망라한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 작동자 기능은 T 세포 매개 작동자 기능이다. 이러한 기능은 헬퍼 T 세포 (CD4⁺ T 세포)의 경우 사이토카인 방출 및/또는 CD8⁺ 림프구 (CTL) 및/또는 B 세포의 활성화를 포함하고, CTL의 경우 세포, 즉 항원 발현을 특징으로 하는 세포의, 예를 들어 세포자살 또는 퍼포린-매개 세포 용해를 통한 소거, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생산, 및 항원을 발현하는 표적 세포의 특이적인 세포용해성 살상 (cytolytic killing)을 포함한다.

본 발명의 맥락에서 용어 "면역 작동자 세포" 또는 "면역반응성 세포"는 면역 반응 중에 작동자 기능을 발휘하는 세포를 지칭한다. "면역 작동자 세포"는 일 구현예에서 활성화 화합물에 의해 제시된 항원과 같은 항원 (예를 들어, 펩타이드 항원) 및 제2 표적으로서 도킹 화합물에 결합할 수 있다. 예를 들어, 면역 작동자 세포는 T 세포 (세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤성 T 세포), B 세포, 자연 살상 세포, 호중구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서, "면역 작동자 세포"는 T 세포이며, 바람직하게는 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포이고, 가장 바람직하게는 CD8⁺ T 세포이다. 본 발명에서, 용어 "면역 작동자 세포"는 또한 적절한 자극으로 면역 세포 (예, T 세포, 특히 T 헬퍼 세포 또는 세포용해성 T 세포)로 성숙할 수 있는 세포를 포함한다. 면역 작동자 세포는 CD34⁺ 조혈 줄기 세포, 미성숙 및 성숙 T 세포, 미성숙 및 성숙 B 세포를 포함한다. 항원에 노출시 T 세포 전구체에서 세포용해성 T 세포로의 분화는 면역 시스템의 클론 선택과 유사하다.

본 발명에 따라 이용할 면역 작동자 세포는 T 세포 수용체 또는 B 세포 수용체와 같은 내인성 항원 수용체를 발현할 수 있거나, 또는 내인성 항원 수용체의 발현이 결핍될 수 있다.

"림프계 세포"는, 선택적으로 적절한 변형 후, 예를 들어 TCR 또는 CAR과 같은 항원 수용체의 전달 후, 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응 또는 이러한 세포의 전구 세포를 생산할 수 있는 세포이며, 림프구를 포함하며, 바람직하게는 T 림프구, 림프모구 및 형질세포를 포함한다. 림프계 세포는 본원에 기술된 바와 같은 면역 작동자 세포일 수 있다. 바람직한 림프계 세포는 세포 표면 상에 항원 수용체를 발현하도록 변형될 수 있는 T 세포이다. 일 구현예에서, 림프계 세포는 T 세포 수용체의 내인성 발현이 결핍된다.

용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, T 헬퍼 세포 (CD4⁺ T 세포) 및 세포용해성 T 세포를 포함한 세포독성 T 세포 (CTL, CD8⁺ T 세포)를 망라한다.

T 세포는 림프구로 알려진 백혈구 세포 군에 속하며, 세포-매개 면역에 중추적인 역할을 담당한다. T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)로 지칭되는 세포 표면 상의 특수한 수용체의 존재에 의해 B 세포 및 자연 살상 세포와 같은 다른 림프구 유형과 구분할 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙을 담당하는 기본 장기이다. 각각 구별되는 기능을 가진 T 세포의 몇가지 다양한 아종들이 발견되어 있다.

T 헬퍼 세포는, 다른 기능들 중에서도, B 세포에서 형질세포로의 성숙화 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 비롯해, 면역학적 과정에서 다른 백혈구 세포를 돕는다. 이들 세포는 또한 표면에 CD4 당단백질을 발현하므로, CD4+ T 세포로도 알려져 있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포 (APC)의 표면에 발현된 MHC 클래스 II 분자를 통해 펩타이드 항원을 제시하였을 때 활성화되게 된다. 일단 활성화되면, 빠르게 분열하여, 능동 면역 반응에서 조절 또는 보조하는 사이토카인으로 지칭되는 소형 단백질을 분비하게 된다.

세포독성 T 세포는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하며, 이식 거부 반응에도 관여한다. 이들 세포는 표면에 CD8 당단백질을 발현하므로, CD8⁺ T 세포로도 알려져 있다. 이들 세포는 신체 거의 모든 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I과 조합된 항원에 결합함으로써 그 표적을 인지한다.

"조절성 T 세포" 또는 "Treg"는 면역 시스템을 조절하고, 자기-항원에 대한 관용성을 유지하며, 자가면역 질환을 방지하는, T 세포의 아집단이다. Treg는 면역억제성이며, 일반적으로 작동자 T 세포의 유도 및 증식을 억제 또는 하향 조절한다. Treg는 바이오마커 CD4, FoxP3 및 CD25를 발현한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "나이브 T 세포"는, 활성화된 또는 기억 T 세포와는 달리, 말초에서 이의 동족 항원과 접촉한 적 없는 성숙한 T 세포를 지칭한다. 나이브 T 세포는 일반적으로 L-셀렉틴 (CD62L)의 표면 발현, 활성화 마커 CD25, CD44 또는 CD69의 부재, 및 기억 CD45RO 이소형의 부재가 특징적이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기억 T 세포"는 이의 동족 항원과 이전에 접촉하여 반응한 적 있는 T 세포의 아군 또는 아집단을 지칭한다. 기억 T 세포는 그 항원과 2차 접촉하게 되면, 그 항원에 최초 반응한 면역 시스템에 비해 더 빠르고 더 강하게 면역 반응을 구축할 수 있다. 기억 T 세포는 CD4⁺ 또는 CD8⁺일 수 있으며, 통상적으로 CD45RO를 발현한다.

본 발명에서, 용어 "T 세포"는 또한 적절한 자극시 T 세포로 성숙할 수 있는 세포를 망라한다.

T 세포 대다수는 수종의 단백질들의 복합체로 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 가지고 있다. 실제 T 세포 수용체는 독립적인 T 세포 수용체 α 및 β (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 만들어지는 구분되는 펩타이드 쇄 2개로 구성되는데, 이는 α-TCR 쇄 및 β-TCR 쇄로 지칭된다. γδ T 세포 (감마 델타 T 세포)는 그 표면에 구분되는 T 세포 수용체 (TCR)를 가진 T 세포의 소규모 하위군이다. 그러나, γδ T 세포에서, TCR은 γ 쇄 하나와 δ 쇄 하나로 구성된다. 이러한 T 세포 군은 αβ T 세포보다 훨씬 적다 (전체 T 세포의 2%).

모든 T 세포는 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 기원한다. 조혈 줄기 세포로부터 유래하는 조혈 전구 세포는 흉선에 머무르며, 세포 분열을 통해 증폭함으로써 미성숙 흉선세포 집단을 대량으로 만들다. 최초기 흉선세포는 CD4도 CD8도 발현하지 않으며, 그래서 이중-음성 (CD4^-CD8^-) 세포로 분류된다. 이것이 발달함에 따라, 이중-양성 흉선세포 (CD4⁺CD8⁺)를 거쳐, 최종적으로는 단일-양성 (CD4⁺CD8^- 또는 CD4^-CD8⁺) 흉선세포로 성숙된 다음 흉선에서 말초 조직으로 방출된다.

T 세포는 일반적으로 표준 공정을 이용해 시험관내 또는 생체외에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, T 세포는 환자와 같은 포유류의 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 분획으로부터 상업적으로 이용가능한 세포 분리 시스템을 이용해 단리할 수 있다. 대안적으로, T 세포는 관련 또는 비-관련 인간, 인간이 아닌 동물, 세포주 또는 배양물로부터 유래할 수 있다. T 세포를 포함하는 샘플은 예를 들어 말초혈 단핵 세포 (PBMC)일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "NK 세포" 또는 "자연 살상 세포"는 T 세포 수용체가 없고 CD56 또는 CD16을 발현하는 것으로 정의되는 말초혈 림프구의 하위군을 지칭한다. 본원에 제시된 바와 같이, NK 세포는 또한 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 분화될 수 있다.

항원 수용체

본원에 기술된 면역 작동자 세포는 활성화 화합물 및 도킹 화합물 각각 상의 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 항원 수용체를 발현하도록 처치 중인 개체에서 생체외/시험관내 또는 생체내에서 유전자 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 항원 수용체를 발현하기 위한 변형은 생체외/시험관내에서 이루어진다. 후속적으로, 변형된 세포를 환자에 투여할 수 있다.

키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR-조작된 T 세포를 이용한 입양 세포 전이 요법은, CAR-변형된 T 세포가 바람직하게는 MHC-독립적인 방식으로 실제 임의의 종양 항원을 표적화하도록 조작될 수 있으므로, 기대되는 항암 치료제이다. 예를 들어, 환자의 T 세포는 환자의 종양 세포 상의 항원을 특이적으로 겨냥하는 CAR을 발현하도록 유전자 조작 (유전자 변형)할 수 있다.

본원에 기술된 내용은 자가 면역 작동자 세포를 사용하는 것으로만 제한되는 것은 아니다.

본원의 기술 내용에 따라, 면역 작동자 세포는 항원 수용체를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 면역 작동자 세포는 항원 수용체를 발현하도록 생체외 또는 생체내 유전자 변형될 수 있다. 이러한 유전자 변형은 생체외 또는 시험관내에서 달성될 수 있으며, 후속적으로 면역 작동자 세포를 치료가 필요한 개체에 투여할 수 있거나 또는 치료가 필요한 개체에서 생체내에서 수행될 수 있다.

다양한 구현예에서, 치료할 개체나 또는 다른 개체로부터 유래한 면역 작동자 세포를 치료할 개체에 투여한다. 투여되는 면역 작동자 세포는 투여하기 전에 생체외에서 유전자 변형될 수 있거나 또는 투여한 후 개체에서 생체내 유전자 변형되어 본원에 기술된 항원 수용체를 발현할 수 있다. 일 구현예에서, 면역 작동자 세포는 치료할 개체에 내인성이며 (즉, 치료할 개체에 투여되지 않음), 개체에서 생체내 유전자 변형되어 본원에 기술된 항원 수용체를 발현한다.

본 발명에서, 용어 "CAR" (또는 "키메라 항원 수용체")은 용어 "키메라 T 세포 수용체" 및 "인공 T 세포 수용체"와 동의어이며, 표적 구조 (예, 항원)를 (예를 들어, 항원 결합 도메인이 항원에 결합함으로써) 인지하는, 즉 결합하고, 세포 표면 상에 CAR을 발현하는 T 세포와 같은 면역 작동자 세포에 특이성을 부여할 수 있는, 단일 분자 또는 분자 복합체를 포함하는, 인공적인 수용체를 의미한다. 이러한 세포는 인지하는데 항원의 가공 및 제시가 반드시 필요한 것은 아니지만, 바람직하게는 임의의 항원을 특이적으로 인지할 수 있다. 바람직하게는, CAR에 의해 표적 구조가 인지되면, 그 CAR을 발현하는 면역 작동자 세포의 활성화가 이루어진다. CAR은 하나 이상의 단백질 단위를 포함할 수 있으며, 이러한 단백질 단위는 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 도메인을 포함한다. 용어 "CAR"은 T 세포 수용체를 포괄하진 않는다.

CAR은 다르게는 일반적으로 CAR의 세포외 도메인의 일부로서 항원 결합 모이어티 또는 항원 결합 도메인으로서 지칭되는 표적-특이적인 결합성 요소들을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 CAR은 도킹 화합물 또는 활성화 화합물 상의 항원을 표적으로 한다.

본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합성 도메인은 항원 특이성을 가진 면역글로불린 (VH) 중쇄의 가변 영역과, 항원 특이성을 가진 면역글로불린 (VL) 경쇄의 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 면역글로불린은 항체이다. 일 구현예에서, 이러한 중쇄 가변 영역 (VH)과 대응되는 경쇄 가변 영역 (VL)은 펩타이드 링커를 통해 연결된다. 바람직하게는, CAR에서 항원 결합성 영역은 scFv이다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VHH 도메인을 포함한다.

CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 본래 CAR의 도메인들 중 하나와 조합되지 않는다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 본래 CAR의 도메인들 중 하나와 조합된다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 이들 도메인이 동일한 또는 다른 표면 막 단백질의 막관통 도메인과 결합하지 않도록 아미노산 치환에 의해 변형된다. 막관통 도메인은 천연 기원 또는 합성 기원으로부터 유래할 수 있다. 기원이 천연 기원일 경우, 도메인은 임의의 막-결합형 또는 막관통 단백질로부터 유래할 수 있다. 본 발명에서 특별한 용도를 가진 막관통 영역은 T 세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄, CD28, CD3 ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래할 수 있다 (즉, 이의 막관통 영역(들)을 적어도 포함한다). 대안적으로, 막관통 도메인은 합성 산물일 것이며, 이 경우 주로 루신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 바람직하게는, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린으로 이루어진 삼중체 (triplet)가 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다.

일부 경우에, 본 발명의 CAR은 막관통 도메인과 세포외 도메인 간에 연결을 형성하는 힌지 도메인을 포함한다.

CAR의 세포질 도메인 또는 달리 세포내 신호전달 도메인은, CAR이 배치된 면역 세포의 정상적인 작동자 기능들 중 한가지 이상의 활성화를 담당한다. 용어 "작동자 기능"은 세포의 전문화된 기능을 의미한다. T 세포의 작동자 기능은, 예를 들어, 사이토카인 분비를 비롯한 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 즉, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은, 작동자 기능의 신호를 변환하고 세포가 전문적인 기능을 수행하게 하는, 단백질의 일부분을 의미한다. 일반적으로, 세포내 신호전달 도메인 전체를 이용할 수도 있지만, 다수의 경우에, 반드시 쇄 전체를 사용해야 하는 것은 아니다. 세포내 신호전달 도메인의 말단 절단된 부분 (truncated portion)을 이용하는 경우, 이러한 말단 절단된 부분은 이것이 작동자 기능 신호를 변환하는 한, 온전한 쇄 대신 사용할 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은, 작동자 기능 신호를 변환하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단 절단된 부분을 포함하는 것을, 의미한다.

TCR 단독을 통해 생성되는 신호는 T 세포를 완전히 활성화하기에 충분하지 않으며, 2차 또는 공동-자극 신호가 또한 필요하다는 것 역시 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 2가지 구분되는 유형의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개되는 것으로 볼 수 있다: TCR을 통해 항원-의존적인 1차 활성화를 개시하는 유형 (1차 세포질 신호전달 서열) 및 2차 또는 공동-자극성 신호를 제공하기 위해 항원-독립적인 방식으로 작동하는 유형 (2차 세포질 신호전달 서열).

일 구현예에서, CAR은 CD3-ζ로부터 유래한 1차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 나아가, CAR의 세포질 도메인은 CD3-ζ 신호전달 도메인을 공동-자극성 신호전달 영역과 조합하여 포함할 수 있다.

공동-자극 도메인의 실체 (identity)는 CAR에 의해 표적화된 모이어티의 결합하면 세포 증식 및 생존을 강화하는 능력을 가진 것으로만 제한된다. 적합한 공동-자극 도메인으로는 CD28, CD137 (4-1BB), 즉 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 슈퍼패밀리의 구성원, CD134 (OX40), 즉 수용체의 TNFR-슈퍼패밀리의 구성원, 및 CD278 (ICOS), 즉 활성화된 T 세포 상에 발현된 CD28-슈퍼패밀리 공동-자극 분자를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이들 언급된 공동-자극 도메인의 서열 변이체들이, 변이체를 모델링한 도메인과 동일한 또는 유사한 활성을 가지는 경우에 본 발명에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 이용할 수 있음을 알 것이다. 이러한 변이체는 이의 기원이 되는 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 가질 것이다. 본 발명의 일부 구현예에서, CAR 구조체는 공동-자극 도메인 2개를 포함한다. 구체적인 조합은 언급된 도메인 4종에 대한 모든 가능한 변이체들을 포함하며, 구체적인 예로는 CD28+CD137 (4-1BB) 및 CD28+CD134 (OX40)를 포함한다.

CAR의 세포질 신호전달 영역 내 세포질 신호전달 서열들은 무작위로 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 선택적으로, 더 짧은, 바람직하게는 아미노산 2-10개 길이의, 올리고-펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커가 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체가 특히 적합한 링커이다.

일 구현예에서, CAR은 발생 초기 단백질 (nascent protein)을 소포체로 향하게 하는 신호 펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 신호 펩타이드는 항원 결합성 도메인 앞에 위치한다. 일 구현예에서, 신호 펩타이드는 IgG와 같은 면역글로불린으로부터 유래한다.

CAR은 상기한 도메인들을 융합 단백질 형태로 함께 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 일반적으로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된 항원 결합 도메인, 하나 이상의 공동-자극 도메인 및 신호 서열을 포함할 것이다. 그러나, 본 발명의 CAR은 이러한 정렬로 제한되지 않으며, 다른 정렬도 허용되며, 결합 도메인, 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 항원에 결합하기 위해 자유로워야 하므로, 융합 단백질 내 결합 도메인의 배치는 일반적으로 세포의 외측에 이러한 영역을 나열하도록 이루어지는 것으로, 이해될 것이다. 동일한 방식으로, 공동-자극 도메인 및 신호전달 도메인은 세포독성 림프구의 활성 및 증식을 유도하는 역할을 하므로, 융합 단백질은 일반적으로 세포 내부에 이들 도메인 2종을 나열할 것이다.

일 구현예에서, CAR 분자는 하기를 포함한다:

i) 표적 항원 (예를 들어, 에피토프 태그) 결합 도메인;

ii) 막관통 도메인; 및

iii) 4-1BB 공동-자극 도메인 및 CD3-zeta 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인.

일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄, CD28, CD3 ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDllc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAMl (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGLl, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및 NKG2C로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 힌지 도메인을 경유하여 막관통 도메인과 연결된다. 일 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인이다.

일 구현예에서, 본 발명의 CAR 분자는 하기를 포함한다:

i) 표적 항원 결합 도메인;

ii) CD8α 힌지 도메인;

iii) CD8α 막관통 도메인; 및

iv) 4-1BB 공동-자극 도메인과 CD3-zeta 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인.

다양한 방법들을 이용해, CAR 구조체와 같은 항원 수용체를 T 세포와 같은 세포에 도입함으로써, 항원 수용체를 발현하도록 유전자 변형된 세포를 구축할 수 있다. 이러한 방법으로는 비-바이러스 기반의 DNA 형질감염, 비-바이러스 기반의 RNA 형질감염, 예를 들어, mRNA 형질감염, 트랜스포존-기반의 시스템 및 바이러스-기반의 시스템 등이 있다. 비-바이러스 기반의 DNA 형질감염은 삽입 돌연변이가 발생할 위험성이 낮다. 트랜스포존-기반의 시스템은 통합 인자를 함유하지 않은 플라스미드보다 더 효율적으로 전이유전자를 통합시킬 수 있다. 바이러스 기반의 시스템은 감마-레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터의 사용을 포함한다. 감마-레트로바이러스는 상대적으로 제조하기 용이하고, T 세포를 효율적이고 영구적으로 형질도입시키고, 일차 인간 T 세포에서 통합 관점에서 안전성이 사전에 입증되어 있다. 또한, 렌티바이러스 벡터는 효율적이고 영구적으로 T 세포에 형질도입되지만, 생산 단가가 더 높다. 이는 또한 레트로바이러스 기반의 시스템보다 잠재적으로 더 안전하다.

본원에 사용된 바와 같이, "렌티바이러스"는 레트로비리대 (Retroviridae) 과에 속하는 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포에 감염할 수 있다는 점에서 레트로바이러스들 중에서도 독특하며; 이는 상당량의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있으며, 그래서 가장 효율적인 유전자 전달 벡터 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 유래한 벡터는 생체내에서 상당 수준의 유전자 전달을 달성하기 위한 수단을 제공한다.

일 구현예에서, T 세포 또는 T 세포 전구체 (progenitor)는 항원 수용체를 암호화하는 핵산으로 생체외 또는 생체내에서 형질감염된다. 일 구현예에서, 생체외 및 생체내 형질감염을 조합하여 사용할 수 있다. 일 구현예에서, T 세포 또는 T 세포 전구체는 치료할 개체로부터 유래한다. 본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, T 세포 또는 T 세포 전구체는 치료할 개체가 아닌 다른 개체로부터 유래한다.

CAR T 세포는 생체내에서 생산할 수 있으며, 따라서 거의 동시에 T 세포를 표적화하는 나노입자를 이용할 수 있다. 예를 들어, 폴리(β-아미노 에스테르)-기반의 나노입자는 T 세포 상의 CD3에 결합하기 위해 항-CD3e F(ab) 단편과 커플링될 수 있다. 이러한 나노입자는, T 세포에 결합하면, 세포내 이입된다. 이의 내용물, 예를 들어 항-종양 항원 CAR을 암호화하는 플라스미드 DNA는 미세소관-관련 서열 (MTAS) 및 핵 위치화 신호 (NLS)를 함유한 펩타이드를 함유하고 있어, T 세포의 핵으로 향할 수 있다. CAR 유전자 발현 카세트 측면에 트랜스포존의 함유 및 과반응성 트랜스포자제를 암호화하는 개별 플라스미드는 CAR 벡터가 염색체에 효율적으로 통합될 수 있게 해준다. 나노입자 주입 후 CAR T 세포를 생체내에서 생산할 수 있게 해주는 이러한 시스템은 Smith et al. (2017) Nat. Nanotechnol. 12:813-820에 기술되어 있다.

아울러, CD19-CAR T 세포는 인간 CD8⁺ 세포를 특이적으로 표적화하는 렌티바이러스 벡터 CD8-LV를 이용함으로써, 생체내에서 직접 구축할 수 있다 (Pfeiffer A. et al., EMBO Mol. Med. Nov; 10(11), 2018, 9158).

다른 가능한 방법은 CRISPR/Cas9 방법을 이용해 CAR 암호화 서열을 특정 유전자 좌에 의도적으로 배치하는 것이다. 예를 들어, 기존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 넉아웃하고, 동시에 CAR을 넉킹 인 (knocking in)하고 TCR 발현을 조정하게 될 내인성 프로모터의 동역학적 조절성 통제 하에 이를 배치할 수 있으며; 예를 들어, Eyquem et al. (2017) Nature 543:113-117을 참조한다.

일 구현예에서, 항원 수용체를 발현하도록 유전자 변형된 세포는 항원 수용체를 암호화하는 핵산으로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염된다. 따라서, 항원 수용체를 암호화하는 핵산은 세포의 게놈에 통합되거나 또는 통합되지 않는다.

일 구현예에서, 항원 수용체를 발현하도록 유전자 변형된 세포는 내인성 T 세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현이 불활성화된다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 세포는 치료할 개체에 대해 자가의 것이거나, 동종이계이거나 또는 동계의 것일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 환자로부터 세포를 수집한 다음 세포를 다시 환자로 전달하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 환자로부터 세포를 수집하는 것을 고려하지 않는다. 후자의 경우, 세포를 유전자 변형하는 모든 단계가 생체내에서 이루어진다.

용어 "자가"는 어떤 것이 동일한 개체로부터 유래함을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, "자가 이식"은 동일한 개체로부터 유래한 조직 또는 장기의 이식을 의미한다. 이러한 시술은, 그렇지 않을 경우 거부 반응을 야기하는 면역학적 장벽을 극복하므로, 유리하다.

용어 "동종이계"는 어떤 것이 동일 종의 다른 개체로부터 유래하는 것을 나타내기 위해 사용된다. 2 이상의 개체는, 하나 이상의 유전자 좌에 위치한 유전자들이 동일하지 않을 경우, 서로에 대해 동종이계이라고 한다.

용어 "동계"는 어떤 것이 동일한 유전자형을 가진 개체 또는 조직, 즉 동일한 일란성 쌍둥이 또는 근친계 (inbred strain)의 동물 또는 이들의 조직으로부터 유래함을 나타내기 위해 사용된다.

용어 "이종"은 어떤 것이 복수의 서로 다른 인자들로 구성됨을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, 한 개체의 골수를 다른 개체로 이식하는 것이 이종 이식이다. 이종의 유전자는 개체와는 다른 기원으로부터 유래하는 유전자이다.

결합 모이어티 및 물질

본 발명은 항체 또는 항체 유도체와 같은 결합 모이어티 또는 물질을 기술한다.

용어 "에피토프"는 결합제에 의해 인지되는 분자 또는 항원의 일부분 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 항체 또는 임의의 다른 결합 단백질에 의해 인지될 수 있다. 에피토프는 항원의 연속적인 부분 또는 비-연속적인 부분을 포함할 수 있으며, 아미노산 약 5개 내지 약 100개, 예를 들어 약 5개 내지 약 50개, 더 바람직하게 약 8개 내지 약 30개, 가장 바람직하게는 약 10개 내지 약 25개 길이일 수 있으며, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게는 아미노산 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 에피토프는 아미노산 약 10개 내지 약 25개 길이이다. 용어 "에피토프"는 구조 에피토프를 포함한다.

용어 "면역글로불린"은 폴리펩타이드 쇄 2 쌍, 즉 저 분자량 경(L) 쇄 한 쌍과 중(H) 쇄 한 쌍으로 구성되며 이황화 결합에 의해 4개 모두 상호 연결된, 구조적으로 비슷한 당단백질 일 군이다. 면역글로불린의 구조는 잘 규명되어 있다. 예를 들어, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))을 참조한다. 간략하게는, 각 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 V_H 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역 (본원에서 C_H 또는 CH로 약칭함)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 도메인 3종, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 힌지부는 중쇄의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 영역으로, 매우 유연하다. 힌지부에서 이황화 결합은 IgG 분자에서 중쇄 2개 간에 상호작용하는 부분이다. 각 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역 (본원에서 V_L 또는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역 (본원에서 C_L 또는 CL로 약칭함)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 도메인 하나, 즉 CL로 구성된다. VH 영역 및 VL 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 더욱 보존적인 영역이 사이에 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 지칭되는 과변이 영역 (또는 구조적으로 정의된 루프 형태 및/또는 서열에서 초가변성일 수 있는 초가변성 영역)들로 추가적으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한 Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987) 참조). 달리 언급되지 않은 한 또는 문맥상 상충하지 않은 한, 본 발명에서 불변 영역에서 아미노산 위치에 대한 언급은 EU-넘버링에 따른다 (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH 공개번호 91-3242). 일반적으로, 본원에 기술된 CDR은 Kabat 정의에 따른다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "위치...에 대응하는 아미노산"은 인간 IgG1 중쇄에서 아미노산 위치 번호를 지칭한다. 다른 면역글로불린에서 대응하는 아미노산 위치들은 인간 IgG1과의 정렬을 통해 확인할 수 있다. 즉, 다른 서열의 아미노산 또는 분절"과 대응하는" 한 서열의 아미노산 또는 분절은, ALIGN, ClustalW 또는 비슷한 프로그램 등의 표준 서열 정렬 프로그램을 이용하여, 전형적으로 디폴트 설정을 적용해, 다른 아미노산 또는 분절과 정렬한 것이며, 이는 인간 IgG1 중쇄에 대해 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 가진다. 서열 또는 서열의 분절을 정렬하여, 본 발명에 따른 아미노산 위치에 대해 대응하는 서열 내 위치를 결정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "항체" (Ab)는, 항원에 대한 결합력, 바람직하게는 항원에 특이적으로 결합하는 결합력을 가진, 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 단편 또는 이의 유도체를 지칭한다. 일 구현예에서, 결합은 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 약 24시간 이상, 약 48시간 이상, 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 그보다 긴 기간 등과 같이 상당한 시간, 또는 임의의 기타 적절한 기능적으로 정의되는 기간 (예, 항체의 항원에의 결합과 관련한 생리학적 반응을 유도, 촉진, 강화 및/또는 조절하는데 충분한 시간)의 반감기로, 전형적인 생리학적 조건에서 이루어진다. 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 용어 "항원-결합 영역", "결합 영역" 또는 "결합 도메인"은, 본원에 사용된 바와 같이, 항원과 상호작용하는 영역 또는 도메인을 지칭하며, 전형적으로 VH 영역과 VL 영역 둘다 포함한다. 용어 항체는 본원에서 사용되는 경우 단일 특이성 항체뿐 아니라 서로 다른 항원-결합 영역을 여러개, 예를 들어 2종 이상, 예컨대 3종 이상 포함하는 다중 특이성 항체를 포괄한다. 항체 (Ab)의 불변 영역은 다양한 면역계 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 활성화 경로의 제1 성분인 C1q와 같은 보체 시스템의 성분 등의, 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다. 전술한 바와 같이, 용어 항체는 본원에 사용된 바와 같이, 달리 언급되지 않은 한 또는 문맥상 명확하게 상충하지 않은 한, 항원 결합 단편인, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지한 항체의 단편, 및 항체 유도체, 즉 항체로부터 유래한 구조체를 포괄한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 알려져 있다. 용어 "항체"에 망라되는 항원 결합 단편에 대한 예로는, (i) Fab' 또는 Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH 도메인들로 구성되는 일가 단편 또는 WO2007059782　(Genmab)에 기술된 바와 같은 일가 항체; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 연결된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편, 즉 F(ab')₂ 단편; (iii) VH 도메인과 CH 도메인으로 본질적으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 한쪽 팔의 VL 도메인과 VH 도메인으로 본질적으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 본질적으로 구성되며, 또한 도메인 항체 (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov; 21(11): 484-90)로도 지칭되는, dAb 단편 (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) 낙타과 또는 나노바디 분자 (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5(1): 111-24), 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 등이 있다. 아울러, Fv 단편의 도메인 2개, 즉 VL 및 VH는 개별 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 형성하여 일가 분자 (단쇄 항체 또는 단쇄 Fv (scFv)로 공지됨, 예를 들어, Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) and Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) 참조)를 형성하는 단백질 단쇄로 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용해 서로 연결될 수 있다. 이러한 단쇄 항체는 달리 언급되거나 또는 문맥상 명확하게 상충하지 않은 한 용어 항체에 망라된다. 이러한 단편은 일반적으로 항체의 의미에 포함되지만, 이는 총괄적으로, 각각 독립적으로, 여러가지 생물학적 특성 및 유용성을 나타내는 본 발명의 고유한 특징이다. 본 발명의 맥락에서 이들 및 기타 유용한 항체 단편뿐 아니라 이러한 단편의 이중 특이성 형태가 본원에서 추가로 논의된다. 또한, 용어 항체는, 달리 명시되지 않은 한, 다클론 항체, 단일클론 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩타이드, 예를 들어 키메라 항체 및 인간화된 항체, 및 효소학적 절단, 펩타이드 합성 및 재조합 기법과 같은 임의의 공지된 기법에 의해 제공되는 항원에 대한 특이적인 결합력을 유지한 항체 단편 (항원 결합 단편)을 포괄하는 것으로, 이해하여야 한다.

표현 "단쇄 Fv" 또는 "scFv"는 전통적인 2쇄 항체의 중쇄 및 경쇄 (VH 및 VL)의 가변성 도메인들이 하나의 쇄로 연결된 항체를 지칭한다. 적절하게 접혀 활성 결합 부위를 형성할 수 있도록 쇄 2개 사이에 선택적으로 링커 (통상 펩타이드)가 삽입된다.

단일-도메인 항체는 나노바디로도 알려져 있으며, 단일 단량체성 가변성 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 일 구현예에서, 단일-도메인 항체는 중쇄 항체의 가변성 도메인 (V_H)이다. 이는 VHH 단편으로 지칭된다. 전장 항체와 마찬가지로, 단일-도메인 항체는 특이적인 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 최초 단일-도메인 항체는 낙타과에서 발견된 중쇄 항체로부터 조작되었다. 연골 어류 역시 중쇄 항체 (IgNAR, '면역글로불린 신생 항원 수용체')를 가지며, 이로부터 VNAR 단편으로 지칭되는 단일-도메인 항체를 수득할 수 있다. 대안적인 방식은 인간 또는 마우스 유래 공통 면역글로불린 G (IgG)으로부터 이량체 가변성 도메인을 단량체로 분할하는 것이다. 단일-도메인 항체에 대한 대부분의 연구는 현재 중쇄 가변성 도메인을 기반으로 하지만, 경쇄로부터 유래한 나노바디 역시 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 입증된 바 있다.

항체는 임의의 이소형을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화된 면역글로불린 유형 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM)을 지칭한다. 특정 이소형, 예를 들어 IgG1이 본원에 언급된 경우, 이 용어는 특정한 이소형 서열, 예를 들어, 특별한 IgG1 서열로 한정되지 않으며, 항체가 서열상 그 이소형에 더 가까운, 예를 들어 다른 이소형에 비해 IgG1에 더 가까운 것을 표현하기 위해 사용된다. 이에, 예를 들어, 본 발명의 IgG1 항체는 불변 영역 내 변형을 비롯하여 자연 생성 IgG1 항체의 서열 변이체일 수 있다.

다양한 구현예들에서, 항체는 IgG1 항체이며, 보다 구체적으로는 IgG1, κ 또는 IgG1, λ 이소형 (즉, IgG1, κ, λ), IgG2a 항체 (예, IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체 (예, IgG2b, κ, λ), IgG3 항체 (예, IgG3, κ, λ) 또는 IgG4 항체 (예, IgG4, κ, λ)이다.

용어 "단일클론 항체"는, 본원에 사용된 바와 같이, 단일한 분자 조성의 항체 분자의 조제물을 지칭한다. 단일클론 항체 조성은 특정 에피토프에 대해 단일한 결합 특이성과 친화성을 나타낸다. 이에, 용어 "인간 단일클론 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변성 영역과 불변 영역을 가진, 단일한 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 인간 단일클론 항체는, 불멸화 세포와 융합된, 인간 중쇄 전이유전자와 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 가진, 유전자이식 (transgenic) 또는 염색체이식 (transchromosomal) 비-인간 동물, 예를 들어 유전자이식 마우스로부터 수득한 B 세포를 함유한 하이브리도마에 의해 생산할 수 있다.

용어 "키메라 항체"는 본원에 사용된 바와 같이 가변 영역은 비-인간 종으로부터 유래하고 (예를 들어 설치류로부터 유래하고); 불변 영역은 인간과 같은 다른 종으로부터 유래하는, 항체를 지칭한다. 치료학적 용도를 위한 키메라 단일클론 항체는 항체 면역원성을 낮추기 위해 개발된다. 용어 "가변 영역" 또는 "가변성 도메인"은 키메라 항체 맥락에서 사용된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 둘다의 CDR과 프래임워크 영역을 포함하는, 영역을 지칭한다. 키메라 항체는 Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15에 기술된 바와 같이 표준적인 DNA 기법을 이용해 제작할 수 있다. 키메라 항체는 유전학적으로 또는 효소학적으로 조작된 재조합 항체일 수 있다. 키메라 항체를 제작하는 것은 당업자의 지식 내이며, 따라서 본 발명에 따른 키메라 항체의 제작은 본원에 언급된 방법 외의 다른 방법에 의해 수행할 수도 있다.

용어 "인간화 항체"는 본원에 사용된 바와 같이 인간 가변성 도메인에 대해 높은 수준의 서열 상동성을 가지도록 변형된 비-인간 가변성 도메인과 인간 항체 불변 도메인을 가진, 유전학적으로 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 이는, 함께 항원 결합부를 형성하는 비-인간 항체 상보성-결정 영역 (CDR) 6종을 상동적인 인간 어셉터 프래임워크 영역 (FR)에 이식함으로써 달성할 수 있다 (WO92/22653 및 EP0629240 참조). 모 항체의 결합 친화성과 특이성을 완전히 재구성하기 위해, 부모 항체 (즉, 비-인간 항체)의 프래임워크 잔기를 인간 프래임워크 영역으로 치환 (역-돌연변이)하여야 할 수 있다. 구조적 상보성 모델링은 프래임워크 영역에서 항체의 결합 특성에 중요한 아미노산 잔기들을 동정하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 비-인간 CDR 서열, 주로 비-인간 아미노산 서열로의 아미노산 역-돌연변이 하나 이상을 포함하는 인간 프래임워크 영역, 및 완전한 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 선택적으로, 반드시 역-돌연변이인 것은 아닌 추가적인 아미노산 변형도 적용하여, 친화성 및 생화학적 특성과 같은 바람직한 특징을 가진 인간화 항체를 수득할 수 있다.

용어 "인간 항체"는 본원에 사용된 바와 같이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 영역과 불변 영역을 가진 항체를 지칭한다. 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 함유할 수 있다. 그러나, 용어 "인간 항체"가 본원에 사용된 바와 같이 마우스 또는 랫과 같은 다른 포유류 종의 생식계열로부터 유래한 CDR 서열이 인간 프래임워크 서열에 이식된, 항체를 포괄하는 것으로 의도하는 것은 아니다. 인간 단일클론 항체는 통례적인 단일클론 항체 방법, 예를 들어 Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)의 표준적인 체세포 혼성화 기법 등의 다양한 기법을 통해 생산할 수 있다. 체세포 혼성화 공정이 바람직하지만, 기본적으로 단일클론 항체를 생산하는 다른 기법, 예를 들어 B-림프구의 바이러스 또는 종양유발성 형질전환 또는 인간 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 기법을 채택할 수도 있다. 인간 단일클론 항체를 분비하는 적절한 하이브리도마 생산 동물 시스템은 뮤라인 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마의 구축은 매우 잘 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜 및 면역화된 비장세포를 융합하기 위해 단리하는 기법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 또한, 융합 파트너 (예를 들어, 뮤라인 골수종 세포) 및 융합 공정 역시 공지되어 있다. 따라서, 인간 단일클론 항체는 예를 들어 마우스 또는 랫 시스템보다는 인간 면역 시스템의 일부를 보유한 유전자이식 또는 염색체이식 마우스 또는 랫을 이용해 구축할 수 있다. 이에, 일 구현예에서, 인간 항체는 동물 면역글로불린 서열 대신 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 보유한, 마우스 또는 랫과 같은 유전자이식 동물로부터 수득된다. 이러한 구현예에서, 항체는 동물에 도입된 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 기원하지만, 최종 항체 서열은 이러한 인간 생식계열 면역글로불린 서열이 체세포 과돌연변이에 의한 추가적인 변형 및 내인성 동물 항체 기구에 의한 친화성 성숙화를 거친 결과이며, 예를 들어 Mendez et al. 1997 Nat Genet. 15(2):146-56을 참조한다.

본원에 사용된 경우, 문맥상 상충하지 않은 한, 용어 "Fab-팔", "결합 팔" 또는 "팔"은 중쇄-경쇄 한 쌍을 포함하며, 본원에서 "분자 절반 (half-molecule)"과 상호 호환적으로 사용된다.

용어 "전장"은 항체 맥락에서 사용된 경우, 항체가 단편이 아니고, 천연적으로 그 이소형에서 보통 발견되는 특정 이소형의 도메인들을 모두, 예를 들어 IgG1 항체의 경우 VH, CH1, CH2, CH3, 힌지, VL 및 CL 도메인을 모두 가진 것을 의미한다.

본원에 사용된 경우, 문맥상 상충하지 않은 한, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 Fc 서열 2개로 구성된 항체 영역을 지칭하며, 여기서 Fc 서열은 적어도 힌지부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합하는" 또는 "결합할 수 있는"은, 항체가 기결정된 항원 또는 에피토에 결합하는 맥락에서, 전형적으로, 생물층 간섭측정 (BLI)을 이용해 결정하거나 또는 예를 들어 BIAcore 3000 장치에서 리간드로서 항원과 분석물로서 항체를 이용한 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기법을 이용해 결정하였을 경우, K_D 약 10^-7 M 이하, 예를 들어 약 10^-8 M 이하, 예컨대 약 10^-9 M 이하, 약 10^-10 M 이하 또는 약 10^-11 M 또는 심지어 그 미만에 해당하는 친화성으로 결합하는 것이다. 항체는, 기결정된 항원 또는 밀접하게 연관된 항원 이외의 다른 비-특이적인 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합 친화성보다 적어도 10배 낮은, 예를 들어 적어도 100배 낮은, 예컨대 적어도 1,000배 낮은, 예로, 적어도 10,000배 낮은, 예를 들어, 적어도 100,000배 낮은 K_D에 해당하는 친화성으로, 기결정된 항원에 결합한다. 친화성의 낮은 정도는 항체의 K_D에 따라 결정되므로, 항체의 K_D가 매우 낮으면 (즉, 항체가 고 특이성인 경우) 비-특이적인 항원에 대한 친화성 대비 항체에 대한 친화성의 감소 정도는 적어도 10,000배일 수 있다.

용어 "k_d" (sec^{- 1})는, 본원에 사용된 바와 같이, 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 나타낸다. 이 수치는 k_off 값으로도 언급된다.

용어 "K_D" (M)는, 본원에 사용된 바와 같이, 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 나타낸다.

또한, 본 발명은 본원에 기술된 항체의 VL 영역, VH 영역 또는 하나 이상의 CDR의 기능적인 변이체를 포함하는 항체를 구상한다. 항체 맥락에서 사용되는 VL, VH 및 CDR의 기능적인 변이체는 항체가 여전히 "참조" 또는 "부모" 항체의 친화성 및/또는 특이성/선택성을 적어도 상당한 비율 (적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상)로 유지하며, 일부 경우에는 이러한 항체는 부모 항체와 비교해 더 높은 친화성, 선택성 및/또는 특이성을 수반할 수도 있다.

이러한 기능적인 변이체는 전형적으로 부모 항체에 대해 상당한 서열 동일성을 유지한다.

변이체의 예는 부모 항체 서열의 VH 및/또는 VL 및/또는 CDR 영역과 주로 보존적인 치환에 따른 차이가 있는 것을 포함하며; 예를 들어, 변이체에서 치환 중 최대 10개, 예를 들어 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개는 아미노산 잔기의 보존적인 치환이다.

VL 영역 또는 VH 영역과 같이 본원에 기술된 항체 서열의 기능적인 변이체, 또는 VL 영역 또는 VH 영역과 같이 본원에 기술된 항체 서열에 대해 특정 수준의 상동성 또는 동일성을 가진 항체 서열의 기능적인 변이체는, 바람직하게는, 비-CDR 서열에 변형 또는 변이를 포함하고, CDR 서열은 바람직하게는 변화 없이 유지된다.

용어 "특이성"은 본원에 사용된 바와 같이 문맥상 상충하지 않은 한 다음과 같은 의미를 가진 것으로 의도된다. 항체 2종이 동일한 항원 및 동일한 에피토프에 결합한다면, 이들은 "동일한 특이성"을 가진 것이다.

용어 "경쟁한다" 및 "경쟁"은 제1 항체 및 제2 항체가 동일한 항원에 대해 경쟁하는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, "경쟁한다" 및 "경쟁"은 항체와 내인성 리간드가 내인성 리간드의 해당 수용체에 결합하는 것에 대해 경쟁하는 것을 의미할 수 있다. 만일 항체가 내인성 리간드가 그 수용체에 결합하는 것을 방지한다면, 그 항체는 리간드와 이의 수용체 간의 내인성 상호작용을 차단하는, 즉 내인성 리간드와 경쟁하는 것으로 지칭된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 항체가 표적 항원에의 결합에 대해 경쟁하는지를 검사하는 방법을 잘 알고 있다. 이러한 방법의 일 예는 소위 교차-경쟁 분석이며, 이는 예를 들어 ELISA로서 수행하거나 또는 유세포 측정에 의해 수행할 수 있다. 대안적으로, 경쟁은 생물층 간섭측정으로 결정할 수 있다.

표적 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체는 항원 상의 여러 에피토프들에 결합할 수 있으며, 여기서 에피토프들은 하나의 에피토프에의 제1 항체의 결합이 다른 에피토프에의 제2 항체의 결합을 막을 만큼 서로 인접하게 위치하는 것이다. 그러나, 다른 경우에는, 서로 다른 항체 2종이 항원 상의 동일 에피토프에 결합할 수 있으며, 경쟁적인 결합 분석에서 결합에 대해 경쟁할 것이다. 동일한 에피토프에 결합하는 이러한 항체는 본원에서 동일한 특이성을 가진 것으로 간주된다. 이에, 일 구현예에서, 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 표적 분자 상의 동일한 아미노산에 결합하는 것으로 간주된다. 항체가 표적 항원 상의 동일 에피토프에 결합하는지는 표준적인 알라닌 스캐닝 실험 또는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 항체-항원 결정화 실험에 의해 결정할 수 있다. 바람직하게는, 서로 다른 에피토프에 결합하는 항체 또는 결합 도메인은 각각의 해당 에피토프에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하지 않는다.

전술한 바와 같이, 다양한 항체 형태들이 당해 기술 분야에 언급되어 있다. 본 발명의 결합제는 기본적으로 임의의 이소형 항체를 포함한다. 이소형의 선택은 전형적으로 ADCC 유도와 같이 요망되는 Fc-매개 작동자 기능, 또는 Fc-매개 작동자 기능이 결여된 항체 ("불활성" 항체)에 대한 요건에 의해 안내될 것이다. 이소형의 예는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 영역, 카파 또는 람다 중 어느 하나를 이용할 수 있다. 본 발명의 항체의 작동자 기능은, 이소형 전환에 의해, 예를 들어 다양한 치료학적 용도에서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM 항체로의 이소형 전환에 의해 바꿀 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄 양쪽은 IgG1 이소형, 예를 들어, IgG1 카파의 것이다. 선택적으로, 중쇄는 본원의 도처에 기술된 바와 같이 힌지 및/또는 CH3 영역에서 변형될 수 있다.

바람직하게는, 항원-결합 영역 또는 도메인 각각이 중쇄 가변 영역 (VH)과 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 가변 영역은 각각 CDR 서열 3종, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3와, 프래임워크 서열 4종, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다. 아울러, 바람직하게는, 항체는 중쇄 불변 영역 (CH) 2개와 경쇄 불변 영역 (CL) 2개를 포함한다.

일 구현예에서, 결합제는 전장 IgG1 항체와 같은 전장 항체를 포함한다.

다른 구현예에서, 결합제는 항체 단편, 예를 들어 Fab' 또는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, WO2007059782　(Genmab)에 기술된 1가 항체, F(ab')₂ 단편, Fd 단편, Fv 단편, dAb 단편, 낙타과 항체 (camelid) 또는 나노바디, 또는 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.

용어 "결합제"는 본 발명의 맥락에서 원하는 항원에 결합할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 결합제는 항체, 항체 단편 또는 임의의 다른 결합 단백질, 또는 이들의 임의 조합이거나, 또는 이를 포함한다.

용어 "결합 모이어티"는 본 발명의 맥락에서 원하는 항원에 결합할 수 있는 임의의 모이어티, 기 또는 도메인을 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 결합 모이어티는 항체, 항체 단편 또는 임의의 다른 결합 단백질, 또는 이들의 임의 조합이거나, 또는 이를 포함한다.

핵산

용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에 사용된 바와 같이 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합에 의해 만들어진 분자 및 화학 합성된 분자와 같은 DNA 및 RNA를 포괄하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥이거나 또는 이중 가닥일 수 있다. RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA를 포괄한다. 본 발명에서, 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단리된다.

핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 베큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC) 또는 P1 인공 염색체 (PAC)와 같은 인공 염색체 벡터를 비롯하여, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의 벡터를 포괄한다. 이러한 벡터는 발현 벡터뿐 아니라 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드뿐 아니라 바이러스 벡터를 포함하며, 일반적으로 바람직한 암호화 서열과, 특정 숙주 유기체 (예, 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류)에서 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현시키는데 필요한 적절한 DNA 서열을 가진다. 클로닝 벡터는 일반적으로 원하는 특정 DNA 단편을 조작 및 증폭시키기 위해 이용되며, 원하는 DNA 단편을 발현시키기 위해 필요한 기능적인 서열들은 결핍되어 있을 수도 있다.

본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 본원에 기술된 활성화 화합물을 암호화하는 RNA는 활성화 화합물을 제공하기 위해 처치된 개체의 세포에서 발현된다. 만일 활성화 화합물이 폴리펩타이드 쇄를 2 이상 포함한다면, 서로 다른 폴리펩타이드 쇄는 동일한 또는 서로 다른 RNA 분자에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 본원에 기술된 도킹 화합물을 암호화하는 RNA는 도킹 화합물을 제공하기 위해 처치된 개체의 세포에서 발현된다. 만일 도킹 화합물이 폴리펩타이드 쇄를 2 이상 포함한다면, 서로 다른 폴리펩타이드 쇄는 동일한 또는 서로 다른 RNA 분자에 의해 암호화될 수 있다.

본원에 기술된 핵산은 재조합 분자이거나 및/또는 단리된 분자일 수 있다.

본원에서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 함유한 핵산 분자를 의미한다. 바람직한 구현예에서, RNA는 그 전체가 또는 대부분이 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된다. 본원에 사용된 바와 같이, "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 기의 2' 위치에 하이드록시 기를 가진 뉴클레오티드이다. RNA는, 비-제한적으로, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예를 들어 일부 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합에 의해 제조된 RNA 뿐 아니라 자연 생성 RNA와 비교해 뉴클레오티드 하나 이상의 부가, 결손, 치환 및/또는 변이 차이를 가진 변형된 RNA를 망라한다. 이러한 변이는 내부 RNA 뉴클레오티드 또는 RNA의 말단(들)에 비-뉴클레오티드 물질이 부가되는 것을 의미할 수도 있다. 이는 또한, 본원에서, RNA에서 뉴클레오티드가 화학 합성 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비-표준 뉴클레오티드일 수 있는 것 역시 고려된다. 본 발명에서, 이들 변이된 RNA는 자연 생성 RNA의 유사체로 간주된다.

본 발명의 특정 구현예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 RNA 전사체와 관련한 메신저 RNA (mRNA)이다. 당해 기술 분야에서 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 비-번역 영역 (5'-UTR), 펩타이드 암호화 영역 및 3' 비-번역 영역 (3'-UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 제조된다. 일 구현예에서, mRNA는 DNA 주형을 이용한 시험관내 전사를 통해 제조하며, 여기서 DNA는 데옥시리보뉴클레오티드를 함유한 핵산을 지칭한다.

일 구현예에서, RNA는 시험관내에서 전사된 RNA (IVT-RNA)이며, 적절한 DNA 주형으로부터 시험관내 전사를 통해 수득할 수 있다. 전사 조절 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고, 이를 시험관내 전사를 위해 적절한 벡터에 도입하여 수득할 수 있다. cDNA는 RNA를 역전사하여 수득할 수도 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, RNA는 "레플리콘 RNA" 또는 간단히 "레플리콘", 특히 "자기-복제성 RNA" 또는 "자기-증폭성 RNA"이다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 레플리콘 또는 자기-복제성 RNA는 ssRNA 바이러스, 특히 알파바이러스와 같은 (+) 가닥 ssRNA 바이러스로부터 유래하는 인자들로부터 유래하거나 또는 이를 포함한다. 알파바이러스는 (+) 가닥 RNA 바이러스의 전형적인 예이다. 알파바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 복제된다 (알파바이러스의 생활 주기에 대한 검토로, Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856을 참조함). 다수의 알파바이러스의 전체 게놈 길이는 전형적으로 뉴클레오티드 11,000 내지 12,000개 범위이며, 게놈 RNA는 전형적으로 5'-캡과 3'-폴리(A) 꼬리를 가진다. 알파바이러스의 게놈은 (바이러스 RNA의 전사, 수정 및 복제 및 단백질 변형에 참여하는) 비-구조 단백질과 (바이러스 입자를 형성하는) 구조 단백질을 암호화한다. 전형적으로, 게놈에는 오픈 리딩 프래임 (ORF) 2개가 존재한다. 4개의 비-구조 단백질 (nsP1-nsP4)은 전형적으로 게놈의 5' 말단 근처에서 시작되는 제1 ORF에 함께 암호화되어 있으며, 알파바이러스 구조 단백질은 제1 ORF의 하류에서 발견되고 게놈의 3' 말단 근처까지 연장되는 제2 ORF에 함께 암호화되어 있다. 전형적으로, 제1 ORF가 제2 ORF보다 크고, 그 비율은 대략적으로 2:1이다. 알파바이러스에 감염된 세포의 경우, 비-구조 단백질을 암호화하는 핵산 서열만 게놈 RNA로부터 번역되고, 구조 단백질을 암호화하는 유전자 정보는 진핵생물 메신저 RNA와 비슷한 RNA 분자인 서브게놈 전사체로부터 번역가능하다 (mRNA; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124). 감염 후, 즉, 바이러스 생활 주기의 초기 단계에, (+) 가닥 게놈 RNA는 비-구조 폴리-단백질 (nsP1234)을 암호화하는 오픈 리딩 프래임을 번역하기 위해 메신저 RNA처럼 직접 작용한다. 알파바이러스-유래 벡터는 외래 유전자 정보를 표적 세포 또는 표적 유기체에 전달하기 위해 제안되었다. 간단한 방법으로, 알파바이러스 구조 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프래임을 대상 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프래임으로 치환한다. 알파바이러스-기반의 트랜스-복제 시스템은 2개의 개별 핵산 분자 상의 알파바이러스 뉴클레오티드 서열 인자에 의존한다: 핵산 분자 하나는 바이러스 레플리카제를 암호화하고, 다른 핵산 분자는 이 레플리카제에 의해 트랜스로 복제될 수 있다 (그래서, 트랜스-복제 시스템으로 지칭됨). 트랜스-복제를 위해서는 주어진 숙주 세포에 이들 핵산 분자가 모두 존재하여야 한다. 레플리카제에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 핵산 분자는 알파바이러스 레플리카제에 의한 인지 및 RNA 합성을 허용하기 위해 특정 알파바이러스 서열 인자를 포함하여야 한다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 RNA는 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수도 있다. 일부 구현예에서, RNA는 하나 이상의 (예를 들어, 모든) 우리딘 대신 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "우라실"은 RNA 핵산에서 생길 수 있는 뉴클레오베이스들 중 하나를 지칭한다. 우라실의 구조는 다음과 같다:

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "우리딘"은 RNA에서 생길 수 있는 뉴클레오디스들 중 하나를 지칭한다. 우리딘 구조는 다음과 같다:

UTP (우리딘 5'-트리포스페이트)는 하기 구조를 가진다:

슈도-UTP (슈도우리딘 5'-트리포스페이트)는 하기 구조를 가진다:

"슈도우리딘"은 우라실이 질소-탄소 글리코시드 결합 대신 탄소-탄소 결합을 통해 펜토스 고리에 결합된, 변형된 뉴클레오시드, 즉 우리딘 이성질체의 일 예이다.

변형된 뉴클레오시드에 대한 다른 예는 하기 구조를 가진 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)이다:

N1-메틸-슈도-UTP는 하기 구조를 가진다:

변형된 뉴클레오시드에 대한 또 다른 예는 하기 구조를 가지는 5-메틸-우리딘 (m5U)이다:

일부 구현예에서, 본원에 언급된 RNA에서 하나 이상의 우리딘이 변형된 뉴클레오시드로 치환된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 우리딘이다.

일부 구현예에서, RNA는 하나 이상의 우리딘 대신 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 각각의 우리딘 대신 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.

일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 독립적으로 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ) 및 5-메틸-우리딘 (m5U)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (Ψ)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 변형된 뉴클레오시드를 2가지 타입 이상 포함할 수 있으며, 변형된 뉴클레오시드는 독립적으로 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ) 및 5-메틸-우리딘 (m5U)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (Ψ)과 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (Ψ)과 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)과 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ) 및 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다.

일부 구현예에서, RNA에서 우리딘 하나 이상, 예를 들어 모든 우리딘을 치환하는 변형된 뉴클레오시드는 3-메틸-우리딘 (m³U), 5-메톡시-우리딘 (mo⁵U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s²U), 4-티오-우리딘 (s⁴U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho⁵U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예를 들어, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo⁵U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르 (mcmo⁵U), 5-카르복시메틸-우리딘 (cm⁵U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 (chm⁵U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르 (mchm⁵U), 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘 (mcm⁵U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm⁵s²U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm⁵s²U), 5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm⁵U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm⁵s²U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm⁵se²U), 5-카바모일메틸-우리딘 (ncm⁵U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm⁵U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm⁵s²U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘 (τm⁵U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘), 5-메틸-2-티오-우리딘 (m⁵s²U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m¹s⁴Ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m³Ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 다이하이드로우리딘 (D), 다이하이드로슈도우리딘, 5,6-다이하이드로우리딘, 5-메틸-다이하이드로우리딘 (m⁵D), 2-티오-다이하이드로우리딘, 2-티오-다이하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘 (acp³U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘 (acp³ Ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm⁵U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm⁵s²U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-다이메틸-우리딘 (m⁵Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘 (ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s²Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm⁵Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm⁵Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm⁵Um), 3,2'-O-다이메틸-우리딘 (m³Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm⁵Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-ara-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-ara-우리딘, 5-(2-카르보메톡시비닐)우리딘, 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘, 또는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기타 변형된 우리딘 중 어느 하나 이상일 수 있다.

일 구현예에서, RNA는 다른 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나, 또는 추가의 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어 변형된 시티딘을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, RNA에서 시티딘이 5-메틸시티딘으로 일부 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 치환된다. 일 구현예에서, RNA는 5-메틸시티딘, 및 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ) 및 5-메틸-우리딘 (m5U)으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 일 구현예에서, RNA는 5-메틸시티딘 및 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 각각의 시티딘 대신 5-메틸시티딘을 포함하고, 각 우리딘 대신 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 5'-캡 (cap)을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 RNA는 캡이 달리지 않은 5'-트리포스페이트를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, RNA는 5'-캡 유사체에 의해 변형될 수 있다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 구조를 지칭하는데, 이는 일반적으로 5' -> 5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일 구현예에서, 이 구아노신은 7번 위치에서 메틸화된다. RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 부가는, 5'-캡을 RNA 가닥으로 공동-전사를 통해 발현하는 시험관내 전사에 의해 달성되거나, 또는 캡핑 효소를 이용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다.

일부 구현예에서, RNA에 대한 빌딩 블록 캡은 하기 구조를 가진 m₂ ^7,3'-OGppp(m₁ ^2'-O)ApG (때때로 m₂ ^7,3`OG(5')ppp(5')m^2'-OApG로 지칭됨)이다:

RNA 및 m₂ ^{7, 3`O}G(5')ppp(5')m^{2 '- O}ApG를 포함하는 Cap1 RNA에 대한 예는 다음과 같다:

(캡 유사체가 아닌) Cap1 RNA에 대한 다른 예는 다음과 같다:

일부 구현예에서, RNA는, 일 구현예에서, 하기 구조를 가진 캡 유사체 안티-리버스 캡 (ARCA Cap (m₂ ^7,3`OG(5')ppp(5')G))을 이용해 "Cap0" 구조로 변형된다:

RNA 및 m₂ ^{7, 3`O}G(5')ppp(5')G를 포함하는 Cap0 RNA에 대한 예는 다음과 같다:

일부 구현예에서, "Cap0" 구조는 하기 구조를 가진 캡 유사체 β-S-ARCA (m₂ ^7,2`OG(5')ppSp(5')G)를 이용해 만들어진다:

β-S-ARCA (m₂ ^{7, 2`O}G(5')ppSp(5')G) 및 RNA를 포함하는 Cap0 RNA에 대한 예는 다음과 같다:

β-S-ARCA 또는 "β-S-ARCA(D1)"의 "D1" 부분입체이성질체는 β-S-ARCA (β-S-ARCA(D2))의 D2 부분입체이성질체와 비교해 HPLC 컬럼에서 처음에 용출되는 β-S-ARCA의 부분입체이성질체이며, 따라서 짧은 체류 시간을 보인다 (WO 2011/015347 참조, 원용에 의해 본원에 포함됨).

β-S-ARCA(D1)(m₂ ^{7,2'- O}GppSpG) 또는 m₂ ^{7,3'- O}Gppp(m₁ ^2'-O)ApG가 특히 바람직한 캡이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 용어 "비-번역 영역" 또는 "UTR"은 DNA 분자에서 전사되지만 아미노산 서열로 번역되진 않는 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자에서의 대응되는 영역을 의미한다. 비-번역 영역 (UTR)은 오픈 리딩 프래임의 5' (상류)(5'-UTR) 및/또는 오픈 리딩 프래임의 3' (하류)(3'-UTR)에 존재할 수 있다. 5'-UTR은, 존재한다면, 단백질-암호화 영역의 개시 코돈의 상류, 5'-말단에 위치한다. 5'-UTR은, (존재한다면) 5'-캡의 하류이며, 예를 들어 5'-캡에 바로 인접하여 위치한다. 3'-UTR은, 존재한다면, 단백질-암호화 영역의 종결 코돈의 하류, 3' 말단에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 서열을 포함하지 않는다. 따라서, 3'-UTR은 (존재한다면) 폴리(A) 서열의 상류이며, 예를 들어 폴리(A) 서열에 바로 인접하게 위치한다.

일부 구현예에서, RNA는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5'-UTR을 포함한다.

일부 구현예에서, RNA는 서열번호 2 또는 3의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2 또는 3의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3'-UTR을 포함한다.

특히 바람직한 5'-UTR은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히 바람직한 3'-UTR은 서열번호 2 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 3'-폴리(A) 서열을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리(A) 서열" 또는 "폴리-A 꼬리"는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치한 아데닐레이트 잔기들로 구성된 불연속적인 또는 연속적인 서열을 지칭한다. 폴리(A) 서열은 당해 기술 분야의 당업자들에게 알려져 있으며, 본원에 기술된 RNA에서 3' UTR 다음에 올 수 있다. 연속적인 폴리(A) 서열은 연이은 아데닐레이트 잔기들로 특정된다. 사실상 연속적인 폴리(A) 서열이 전형적이다. 본원에 기술된 RNA는 전사 후 주형-독립적인 RNA 중합효소에 의해 RNA의 유리 3'-말단에 부착된 폴리(A) 서열을 가지거나, 또는 DNA에 의해 암호화되고 주형-의존적인 RNA 중합효소에 전사되는 폴리(A) 서열을 가질 수 있다.

뉴클레오티드 A가 약 120개인 폴리(A) 서열이 형질감염된 진핵생물 세포에서 RNA 수준에서뿐 아니라 폴리(A) 서열의 상류 (5')에 존재하는 오픈 리딩 프래임으로부터 번역되는 단백질 수준에서 유익한 효과를 가지는 것으로 입증되어 있다 (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017).

폴리(A) 서열은 임의 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 A 뉴클레오티드를 적어도 약 20개, 적어도 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 80개 또는 적어도 약 100개, 그리고 최대 약 500개, 최대 약 400개, 최대 약 300개, 최대 약 200개 또는 최대 약 150개 포함하며, 특히 A 뉴클레오티드를 약 120개 포함한다. 이러한 맥락에서, "로 본질적으로 구성된다"는 폴리(A) 서열에서 대부분의 뉴클레오티드, 전형적으로 폴리(A) 서열에서 뉴클레오티드 개수의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%가 A 뉴클레오티드인 것을 의미하지만, 나머지 뉴클레오티드가 U 뉴클레오티드 (우리딜레이트), G 뉴클레오티드 (구아닐레이트) 또는 C 뉴클레오티드 (시티딜레이트) 등의 A 뉴클레오티드 이외의 다른 뉴클레오티드인 경우도 허용한다. 이러한 맥락에서, "로 구성된다"는 폴리(A) 서열의 모든 뉴클레오티드, 즉 폴리(A) 서열에서 뉴클레오티드 수 100%가 A 뉴클레오티드인 것을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오티드" 또는 "A"는 아데닐레이트를 지칭한다.

일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 암호화 가닥에 상보적인 가닥에서 반복적인 dT 뉴클레오티드 (데옥시티미딜레이트)를 포함하는 DNA 주형을 토대로, RNA 전사 중에, 예를 들어 시험관내 전사되는 RNA의 제조 중에 부착된다. 폴리(A) 서열을 암호화하는 DNA 서열 (암호화 가닥)은 폴리(A) 카세트로 지칭된다.

일부 구현예에서, 폴리(A) 카세트는 dA 뉴클레오티드로 본질적으로 구성된 DNA의 암호화 가닥에 존재하지만, 뉴클레오티드 4종 (dA, dC, dG 및 dT)의 무작위 서열이 사이에 산재한다. 이러한 무작위 서열은 뉴클레오티드 5-50개, 10-30개 또는 10-20개 길이일 수 있다. 이러한 카세트는 WO 2016/005324 A1에 개시되어 있으며, 이는 원용에 의해 본원에 포함된다. WO 2016/005324 A1에 개시된 임의의 폴리(A) 카세트를 본 발명에 이용할 수 있다. 본질적으로 dA 뉴클레오티로 구성되지만 뉴클레오티드 4종 (dA, dC, dG, dT)이 균등하게 분포하며 예를 들어 뉴클레오티드 5-50개 길이의 무작위 서열이 사이에 산재된, 폴리(A) 카세트는, DNA 수준에서, E. coli에서 플라스미드 DNA의 일정한 증폭성을 나타내며, RNA 수준에서, RNA 안정성 및 번역 효율을 뒷받침하는 측면에서 유익한 특성과 여전히 연관되어 있다. 이에, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 RNA 분자에 함유된 폴리(A) 서열은 본질적으로 A 뉴클레오티드로 구성되지만, 뉴클레오티드 4종 (A, C, G, U)으로 된 무작위 서열이 사이에 산재되어 있다. 이러한 무작위 서열은 뉴클레오티드 5-50개, 10-30개 또는 10-20개 길이일 수 있다.

일부 구현예에서, 3' 말단에서 A 뉴클레오티드 이외의 다른 뉴클레오티드가폴리(A) 서열 측면에 위치하지 않으며, 즉, 폴리(A) 서열은 3' 말단에서 A 이외의 다른 뉴클레오티드에 의해 가려지거나 또는 이것으로 이어지지 않는다.

일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 뉴클레오티드 A를 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 80개 또는 적어도 100개에서 최대 500개, 최대 400개, 최대 300개, 최대 200개 또는 최대 150개 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 뉴클레오티드 A 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 80개 또는 적어도 100개에서 최대 500개, 최대 400개, 최대 300개, 최대 200개 또는 최대 150개로 본질적으로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 뉴클레오티드 A 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 80개 또는 적어도 100개에서 최대 500개, 최대 400개, 최대 300개, 최대 200개 또는 최대 150개로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 뉴클레오티드 A를 적어도 100개 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 뉴클레오티드 A를 약 150개 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 뉴클레오티드 A를 약 120개 포함한다.

일부 구현예에서, RNA는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리(A) 서열을 포함한다.

특히 바람직한 폴리(A) 서열은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에서, 활성화 화합물은 바람직하게는 RNA 투여 중인 개체의 세포로의 도입시 해당 단백질로 번역되는 단일 가닥의 5'-캡이 달린 mRNA로서 투여된다. 바람직하게는, RNA는 안정성 및 번역 효율과 관련하여 RNA의 최대 효능을 위해 최적화된 구조 요소를 포함한다 (5'-캡, 5'-UTR, 3'-UTR, 폴리(A) 서열).

본 발명의 기술 내용에 따라, 도킹 화합물은 바람직하게는 RNA 투여 중인 개체의 세포로의 도입시 해당 단백질로 번역되는 단일 가닥의 5'-캡이 달린 mRNA로서 투여된다. 바람직하게는, RNA는 안정성 및 번역 효율과 관련하여 RNA의 최대 효능을 위해 최적화된 구조 요소를 포함한다 (5'-캡, 5'-UTR, 3'-UTR, 폴리(A) 서열).

일 구현예에서, β-S-ARCA(D1)는 RNA의 5'-말단에서 특이적인 캡핑 구조로서 사용된다. 일 구현예에서, m₂ ^{7,3'- O}Gppp(m₁ ^2'-O)ApG는 RNA의 5'-말단에서 특이적인 캡핑 구조로서 사용된다. 일 구현예에서, 5'-UTR 서열은 인간 α-글로빈 mRNA로부터 유래하며, 선택적으로 번역 효율을 높이기 위해 최적화된 Kozak 서열을 가진다. 일 구현예에서, 더 높은 최대 단백질 수준 및 mRNA의 연장된 잔류를 보장하기 위해, 암호화 서열과 폴리(A) 서열 사이에, "스플리트의 아미노 말단 인핸서" (amino terminal enhancer of split, AES) mRNA (F로 지칭됨) 및 미토콘드리아에서 암호화된 12S 리보솜 RNA (I로 지칭됨)로부터 유래한 서열 요소 2종의 조합 (FI 요소)이 배치된다. 이는 생체외 선택 공정에 의해 RNA 안정성을 부여하며 전체 단백질 발현을 높이는 서열로 동정되어 있다 (WO 2017/060314를 참조하며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 일 구현예에서, 더 높은 최대 단백질 수준 및 mRNA의 연장된 잔류를 보장하기 위해, 암호화 서열과 폴리(A) 서열 사이에, 인간 β-글로빈 mRNA로부터 유래한 반복되는 3'-UTR 2개가 배치된다. 일 구현예에서, 뉴클레오티드 110개 길이이고 순차적으로 아데노신 잔기 30개, 뉴클레오티드 10개 길이의 링커 서열 및 아데노신 잔기 70개로 이루어진 가닥으로 구성되는 폴리(A) 서열이 사용된다. 이러한 폴리(A) 서열은 RNA 안정성과 번역 효율을 강화하기 위해 설계된다.

본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, 활성화 화합물을 암호화하는 RNA는 활성화 화합물을 제공하기 위해 처치된 개체의 세포에서 발현된다. 본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, RNA는 개체의 세포에서 일시적으로 발현된다. 본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA이다. 본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, 활성화 화합물의 발현은 세포 표면에서 이루어지며, 즉, 활성화 화합물은 세포내 부속되어 잔류한다.

본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, 도킹 화합물을 암호화하는 RNA는 도킹 화합물을 제공하기 위해 처치된 개체의 세포에서 발현된다. 본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, RNA는 개체의 세포에서 일시적으로 발현된다. 본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA이다. 본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, 도킹 화합물의 발현은 세포외 공간으로 이루어지며, 즉, 도킹 화합물은 분비된다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "전사"는 DNA 서열에서 유전자 코드가 RNA로 전사되는 공정을 지칭한다. 이후, RNA는 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하며, 여기서 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포성 시스템에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 이용해 시험관내에서 합성되는 공정을 지칭한다. 바람직하게는, 클로닝 벡터가 전사체 제조에 활용된다. 이들 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로서 지칭되며, 본 발명에 따라 용어 "벡터"에 망라된다. 본 발명에서, 본 발명에서 사용되는 RNA는 바람직하게는 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)이고, 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득할 수 있다. 전사를 통제하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. RNA 중합효소에 대한 구체적인 예는 T7, T3 및 SP6 RNA 중합효소이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 시험관내 전사는 T7 또는 SP6 프로모터에 의해 통제된다. 시험관내 전사용 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝한 다음 시험관내 전사용 적정 벡터에 도입함으로써 수득할 수 있다. cDNA는 RNA의 역 전사에 의해 수득할 수 있다.

RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 mRNA 가닥이 아미노산 서열의 조립을 지시하여 펩타이드 또는 단백질을 만드는, 세포의 리보솜에서의 공정을 지칭한다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 RNA 투여 후, 예를 들어 RNA 지질 입자로서 제형화하여 투여한 후, RNA의 적어도 일부는 발현하기 위해 세포로 전달된다. 일 구현예에서, RNA의 적어도 일부가 표적 세포의 세포질로 전달된다. 일 구현예에서, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어 이것이 암호화하는 펩타이드 또는 단백질이 만들어진다.

"암호화"는 정의된 뉴클레오티드 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열과 이로부터 기인한 생물학적 특성을 가진, 생물학적 과정에서 다른 폴리머 및 거대분자를 합성하기 위한 주형으로서 역할을 하는, 유전자, cDNA 또는 mRNA 등의, 폴리뉴클레오티드로서 특정한 뉴클레오티드 서열의 고유한 특성을 의미한다. 따라서, 세포 또는 다른 생물 시스템에서 유전자에 대응하는 mRNA의 전사 및 번역으로 단백질이 만들어진다면, 그 유전자가 단백질을 암호화하는 것이다.암호화 가닥, 즉 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공된 암호화 가닥과, 유전자 또는 cDNA를 전사하기 위한 주형으로서 사용되는 비-암호화 가닥 둘다, 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 산물을 암호화하는 것으로서 언급될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따라 투여할 활성화 화합물을 암호화하는 RNA는 비-면역원성이다.

일 구현예에서, 본 발명에 따라 투여할 도킹 화합물을 암호화하는 RNA는 비-면역원성이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비-면역원성 RNA"는, 예를 들어 포유류에 투여시 면역 시스템에 의한 반응을 유도하지 않거나, 또는 비-면역원성 RNA를 비-면역원성으로 만드는 변형 또는 처리를 거치지 않은 점에서만 차이가 있는 동일한 RNA에 의해 유도되는 것보다, 즉, 표준 RNA (stdRNA)에 의해 유발되는 것보다 약하게 반응을 유도하는, RNA를 지칭한다. 바람직한 일 구현예에서, 본원에서 변형된 RNA (modRNA)로도 지칭되는 비-면역원성 RNA는 선천적인 면역 수용체를 RNA로 RNA-매개 활성화되는 것을 억제하는 변형된 뉴클레오시드를 병합하고 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 제거함으로써, 비-면역원성으로 된다.

변형된 뉴클레오시드의 병합에 의해 비-면역원성 RNA를 비-면역원성으로 만들기 위해, RNA의 면역원성을 낮추거나 또는 억제하는 한 임의의 변형된 뉴클레오시드를 이용할 수 있다. 선천적인 면역 수용체의 RNA-매개 활성화를 억제하는 변형된 뉴클레오시드가 특히 바람직하다. 일 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 우리딘 하나 이상을 변형된 핵염기 (modified nucleobase)를 포함하는 뉴클레오시드로 치환하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실이다. 일 구현예에서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 3-메틸-우리딘 (m³U), 5-메톡시-우리딘 (mo⁵U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s²U), 4-티오-우리딘 (s⁴U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho⁵U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예를 들어, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo⁵U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르 (mcmo⁵U), 5-카르복시메틸-우리딘 (cm⁵U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 (chm⁵U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르 (mchm⁵U), 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘 (mcm⁵U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm⁵s²U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm⁵s²U), 5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm⁵U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm⁵s²U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm⁵se²U), 5-카바모일메틸-우리딘 (ncm⁵U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm⁵U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm⁵s²U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘 (τm⁵U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘), 5-메틸-2-티오-우리딘 (m⁵s²U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m¹s⁴Ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m³Ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 다이하이드로우리딘 (D), 다이하이드로슈도우리딘, 5,6-다이하이드로우리딘, 5-메틸-다이하이드로우리딘 (m⁵D), 2-티오-다이하이드로우리딘, 2-티오-다이하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘 (acp³U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘 (acp³ Ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm⁵U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm⁵s²U), 알파-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-다이메틸-우리딘 (m⁵Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘 (Ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s²Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm⁵Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm⁵Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm⁵Um), 3,2'-O-다이메틸-우리딘 (m³Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm⁵Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-ara-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-ara-우리딘, 5-(2-카르보메톡시비닐) 우리딘 및 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ) 또는 5-메틸-우리딘 (m5U)이며, 특히 N1-메틸-슈도우리딘이다.

일 구현예에서, 하나 이상의 우리딘을 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드로 바꾸는 치환은 우리딘의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 치환을 포함한다.

T7 RNA 중합효소를 이용한 시험관내 전사 (IVT)에 의해 mRNA를 합성하는 동안, 효소의 독특한 활성으로 인해, 이중 가닥 RNA (dsRNA) 등의 부적절한 산물이 상당량 만들어진다. dsRNA는 염증성 사이토카인을 유도하고 작동자 효소를 활성화하여, 단백질 합성 저해로 이어진다. dsRNA는 IVT RNA와 같은 RNA로부터, 예를 들어, 무공성 또는 다공성 C-18 폴리스티렌-다이비닐벤젠 (PS-DVB) 매트릭스를 이용한 이온-쌍 역상 HPLC에 의해 제거할 수 있다. 대안적으로, dsRNA를 특이적으로 가수분해하지만 ssRNA는 가수분해하지 않으므로 IVT RNA 조제물로부터 dsRNA 오염물질을 제거하는, E. coli RNaseIII를 이용한 효소 기반의 방법을 이용할 수도 있다. 아울러, 셀룰로스 물질을 이용해 ssRNA로부터 dsRNA를 분리할 수 있다. 일 구현예에서, RNA 조제물은 셀룰로스 물질과 접촉시키고, dsRNA가 셀룰로스 물질에 결합되도록 허용하지만 ssRNA가 셀룰로스 물질에 결합하지 않도록 하는 조건 하에 셀룰로스 물질로부터 ssRNA를 분리한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제거한다" 또는 "제거"는 비-면역원성 RNA와 같은 제1 물질 집단이 dsRNA와 같은 제2 물질 집단의 근접성으로부터 분리되는 특성을 지칭하며, 여기서 제1 물질 집단에 반드시 제2 물질이 결여되는 것은 아니고, 제2 물질 집단에 반드시 제1 물질이 결여되는 것은 아니다. 그러나, 제2 물질 집단의 제거를 특징으로 하는 제1 물질 집단은 제1 물질 및 제2 물질의 비-분리 혼합물과 비교해 제2 물질의 함량이 측정가능하게 더 적다.

일 구현예에서, 비-면역원성 RNA로부터 dsRNA의 제거는, 비-면역원성 RNA 조성물에서 RNA의 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.3% 미만 또는 0.1% 미만이 되도록, dsRNA를 제거하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 비-면역원성 RNA에는 dsRNA가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 구현예에서, 비-면역원성 RNA 조성물은 단일 가닥의 뉴클레오시드 변형된 RNA의 정제된 조제물을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 가닥의 뉴클레오시드 변형된 RNA의 정제된 조제물에는 이중 가닥 RNA (dsRNA)이 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 정제된 조제물은 다른 모든 핵산 분자 (DNA, dsRNA, 등)와 비교해 단일 가닥의 뉴클레오시드 변형된 RNA가 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9%이다.

일 구현예에서, 비-면역원성 RNA는 서열이 동일한 표준 RNA보다 더 효율적으로 세포에서 번역된다. 일 구현예에서, 번역이 비-변형된 카운터파트와 비교해 2배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 3배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 비-변형된 카운터파트와 비교해 4배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 5배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 6배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 7배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 8배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 9배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 10배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 15배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 20배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 50배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 100배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 200배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 500배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 1000배 강화된다. 일 구현예에서, 번역이 2000배 비율로 강화된다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 10-1000배이다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 10-100배이다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 10-200배이다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 10-300배이다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 10-500배이다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 20-1000배이다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 30-1000배이다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 50-1000배이다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 100-1000배이다. 일 구현예에서, 이러한 비율은 200-1000배이다. 일 구현예에서, 번역이 임의의 다른 유의한 수준 또는 수준 범위로 강화된다.

일 구현예에서, 비-면역원성 RNA는 서열이 동일한 표준 RNA와 비교해 선천적인 면역원성을 현저하게 낮게 나타낸다. 일 구현예에서, 비-면역원성 RNA는 비-변형 카운터파트와 비교해 2배 낮은 선천적인 면역 반응을 나타낸다. 일 구현예에서, 선천적인 면역 반응이 3배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 4배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 5배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 6배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 7배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 8배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 9배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 10배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 15배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 20배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 50배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 100배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 200배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 500배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 1000배 감소한다. 일 구현예에서 선천적인 면역원성이 2000배 감소한다.

용어 "선천적인 면역원성을 현저하게 낮게 나타낸다"는 선천적인 면역원성의 검출가능한 수준의 감소를 의미한다. 일 구현예에서, 이 용어는 비-면역원성 RNA의 유효량이 검출가능한 선천적인 면역 반응을 촉발하지 않으면서 투여할 수 있을 정도의, 감소를 의미한다. 일 구현예에서, 이 용어는 비-면역원성 RNA에 의해 암호화된 단백질의 생산을 검출가능하게 낮추기에 충분한 선천적인 면역 반응을 유발하지 않으면서 비-면역원성 RNA를 반복 투여할 수 있도록, 감소를 의미한다. 일 구현예에서, 감소는, 비-면역원성 RNA에 의해 암호화된 단백질의 생산을 검출가능하게 소거하기에 충분한 선천적인 면역 반응을 유발하지 않으면서 비-면역원성 RNA를 반복 투여할 수 있는 수준이다.

"면역원성"은 RNA와 같은 외래 물질이 인간 또는 기타 동물의 신체에서 면역 반응을 일으키는 유발 능력이다. 선천적인 면역 시스템은 비교적 비-특이적이고 즉발적인 면역 시스템의 구성 요소이다. 이는 적응 면역 시스템과 더불어 척추동물 면역 시스템의 주요 구성 요소 2종 중 하나이다.

본원에 사용된 바와 같이 "내인성"은 임의 물질이 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 파생되거나 또는 내부에서 생성되는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외인성"은 임의 물질이 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로 도입되거나 또는 그 외부로부터 생성되는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 2 이상의 요소 또는 구성성분 또는 도메인이 서로 연결되는 것을 의미한다.

코돈-최적화 / G/C 함량 증가

일부 구현예에서, 본원에 기술된 활성화 화합물의 아미노산 서열 및/또는 본원에 기술된 도킹 화합물의 아미노산 서열은 코돈-최적화되고 및/또는 야생형 코딩 서열과 비교해 G/C 함량이 증가된 코딩 서열에 의해 암호화된다. 이는 또한 코딩 서열의 하나 이상의 서열 영역이 코돈-최적화되고 및/또는 야생형 코딩 서열의 대응되는 서열 영역과 비교해 G/C 함량이 증가된, 구현예를 포함한다. 일 구현예에서, 코돈-최적화 및/또는 G/C 함량 증가가 바람직하게는 암호화된 아미노산 서열을 변경하는 것은 아니다.

용어 "코돈-최적화된"은 바람직하게는 핵산 분자에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 바꾸지 않으면서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 용법을 반영하기 위한 핵산 분자의 코딩 영역내 코돈의 변형을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 암호화 영역은 바람직하게는 본원에 기술된 RNA 분자를 이용해 치료할 개체에서 최적 발현을 위해 코돈-최적화된다. 코돈-최적화는, 번역 효율이 세포에서 tRNA의 차별적인 발생 빈도에 의해 결정된다는 사실에 기반한다. 즉, RNA 서열은, "드문 코돈" 대신 빈도가 높은 tRNA를 이용가능한 코돈으로 삽입하여 변형할 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본원에 기술된 RNA의 암호화 영역의 구아노신/시토신 (G/C) 함량은 야생형 RNA의 대응되는 암호화 서열의 G/C 함량과 비교해 증가되며, RNA에 의해 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게는 야생형 RNA에 의해 암호화된 아미노산 서열과 비교해 변경되진 않는다. RNA 서열의 변형은, 번역할 임의의 RNA 서열이 mRNA의 효율적인 번역에 중요하다는 사실에, 기반한다. G (구아노신)/C (시토신) 함량이 증가된 서열은 A (아데노신)/U (우라실) 함량이 증가된 서열보다 더 안정적이다. 코돈 여러 개가 하나의 동일한 아미노산을 암호한다는 (소위 유전자 코드의 중복) 사실에 비추어, 안정성 측면에서 가장 유익한 코돈을 결정할 수 있다 (소위 대안적인 코돈 용법). RNA에 의해 암호화할 아미노산에 따라, RNA 서열은 이의 야생형 서열과 비교해 변형 가능성이 여러가지 존재한다. 특히, A 및/또는 U 뉴클레오티드를 가진 코돈은 이 코돈을 동일한 아미노산을 암호화하지만 A 및/또는 U를 함유하지 않거나 또는 A 및/또는 U 뉴클레오티드 함유율이 낮은 다른 코돈으로 치환함으로써 변형할 수 있다.

다양한 구현예들에서, 본원에 기술된 RNA의 암호화 영역의 G/C 함량은 야생형 RNA의 암호화 영역의 G/C 함량과 비교해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 55% 또는 심지어 그 보다 높다.

핵산을 함유한 입자

활성화 화합물을 암호화하는 RNA 및/또는 도킹 화합물을 암호화하는 RNA와 같은 본원에 기술된 핵산은 입자로 제형화하여 투여할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "입자"는 분자 또는 분자 복합체에 의해 형성된 구조화된 물질을 지칭한다. 일 구현예에서, 용어 "입자"는 매질 중에 분산된 미세 크기 또는 나노 크기의 구조, 예를 들어 미세 크기 또는 나노 크기의 조밀한 구조를 지칭한다. 일 구현예에서, 입자는 DNA, RNA 또는 이의 혼합물을 포함하는 입자와 같은 핵산을 함유한 입자이다.

폴리머 및 지질과 같이 양으로 하전된 분자와 음으로 하전된 핵산 간의 정전기적 상호작용이 입자 형성에 참여한다. 그 결과 복합체가 형성되고, 핵산 입자가 자발적으로 형성된다. 일 구현예에서, 핵산 입자는 나노입자이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, "나노입자"는 비경구 투여하기에 적합한 평균 직경을 가진 입자를 지칭한다.

"핵산 입자"는 핵산을 대상 표적 부위 (예를 들어, 세포, 조직, 장기 등)로 전달하기 위해 이용할 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상의 양이온성 또는 양이온으로 이온화가능한 지질 또는 지질-유사 물질, 하나 이상의 양이온성 폴리머, 예를 들어 프로타민, 또는 이들의 혼합물과 핵산으로부터 만들어질 수 있다. 핵산 입자는 지질 나노입자 (LNP)-기반의 제형 및 리포플렉스 (LPX)-기반의 제형을 포함한다.

임의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 양이온성 또는 양이온으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 및/또는 양이온성 폴리머가 핵산과 함께 조합되어 응집체를 형성하고, 이러한 응집으로 안정적인 콜로이드 입자가 만들어지는 것으로 보인다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 양이온성 또는 양이온으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 이외의 다른 하나 이상의 지질 또는 지질-유사 물질, 양이온성 폴리머 이외의 다른 하나 이상의 폴리머 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 입자는, 핵산 분자의 분자 매개변수들이 몰 질량 또는 분자 구조, 캡핑, 암호화 영역 또는 기타 특징 등의 기본적인 구조 요소들 측면에서 서로 비슷하거나 또는 다를 수 있는, 2가지 유형 이상의 핵산 분자를 포함한다.

본원에 기술된 핵산 입자는, 일 구현예에서, 약 30 nm 내지 약 1000 nm, 약 50 nm 내지 약 800 nm, 약 70 nm 내지 약 600 nm, 약 90 nm 내지 약 400 nm, 또는 약 100 nm 내지 약 300 nm 범위의 평균 직경을 가질 수 있다.

본원에 기술된 핵산 입자는 약 0.5 미만, 약 0.4 미만, 약 0.3 미만 또는 약 0.2 미만의 다분산 지수를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 핵산 입자는 약 0.1 내지 약 0.3 또는 약 0.2 내지 약 0.3 범위의 다분산 지수를 나타낼 수 있다.

RNA 지질 입자와 관련하여, N/P 비율은 RNA에서 포스페이트 기의 개수에 대한 지질의 질소 기의 비율을 나타낸다. 이는 (pH에 따라) 질소 원소는 통상 양으로 하전되고 포스페이트 기는 음으로 하전되므로, 전하 비율과 연관성이 있다. N/P 비율은, 전하 평형이 존재하는 경우, pH에 의존한다. 지질 제형은, 양으로 하전된 나노입자가 형질감염에 우호적인 것으로 간주되므로, 흔히 N/P 비율이 4 초과 최대 12가 되도록, 제조된다. 이 경우, RNA가 나노입자에 완전히 결합되는 것으로 간주된다.

본원에 기술된 핵산 입자는 하나 이상의 양이온성 또는 양이온으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 및/또는 하나 이상의 양이온성 폴리머로부터 콜로이드를 수득하고, 콜로이드를 핵산과 혼합하여 핵산 입자를 수득하는 것을 수반할 수 있는 매우 다양한 방법을 이용해 제조할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "콜로이드"는 분산된 입자가 침강되지 않은 균질한 혼합물 유형을 지칭한다. 혼합물에서 불용성 입자는 입자 크기 10-1000 nm로 미세하다. 이 혼합물은 콜로이드 또는 콜로이드 현탁물로 지칭될 수 있다. 때로는, 용어 "콜로이드"는 혼합물 중의 입자만을 지칭하는 것이고 현탁액 전체를 지칭하는 것은 아니다.

하나 이상의 양이온성 또는 양이온으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 및/또는 하나 이상의 양이온성 폴리머를 포함하는 콜로이드를 제조하는 경우, 리포좀 소낭을 제조하기 위해 통례적으로 이용되는 방법들을 본원에 적용가능하며, 적절하게 조정된다. 가장 일반적으로 사용되는 리포좀 소낭 제조 방법은 다음과 같은 기본 단계를 공유한다: (i) 유기 용매에 지질 용해, (ii) 수득한 용액의 건조, 및 (iii) 건조한 지질의 (다양한 수성 매질을 이용한) 수화.

막 수화법 (film hydration method)의 경우, 지질을 먼저 적절한 유기 용매에 용해한 다음 건조하여 플라스크 바닥부에서 얇은 막을 제조한다. 수득한 지질 막을 적절한 수성 매질로 수화하여 리포좀 분산물을 제조한다. 또한, 추가적인 크기 축소 단계도 포함될 수 있다.

역상 증발은 수상과 지질 함유 유기상 간에 유중수 에멀젼의 형성을 수반하는 리포좀 소낭을 제조하기 위한 막 수화법의 대안적인 방법이다. 시스템 균질화를 위해 혼합물을 간단히 초음파 처리하여야 한다. 감압 하에 유기상을 제거하여, 우유같은 겔을 수득하고, 이는 이후에 리포좀 현탁물로 전환한다.

용어 "에탄올 주입술"은 지질을 포함하는 에탄올 용액을 수성 용액에 바늘을 사용해 빠르게 주입하는 공정을 지칭한다. 이러한 행위는 지질을 용액 전체로 분산시키고, 지질 구조체의 형성, 예를 들어 리포좀 형성과 같은 지질 소낭 형성을 촉진한다. 일반적으로, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 RNA를 콜로이드 리포좀 분산물에 투입함으로써 수득가능하다. 에탄올 주입술을 이용해 이러한 콜로이드 리포좀 분산물은, 일 구현예에서 다음과 같이 형성된다: 양이온성 지질 및 부가적인 지질과 같은 지질을 포함하는 에탄올 용액을 수성 용액에 교반하면서 주입한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 압출 단계 없이 수득가능하다.

용어 "압출" 또는 "압착"은 고정된 횡단면 프로파일을 가진 입자를 제조하는 것을 지칭한다. 특히, 이 용어는 입자를 규정된 구멍이 구비된 필터를 통해 강제로 통과시킴으로써 입자를 소형화하는 것을 의미한다.

유기 용매를 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 기타 방법들 역시 콜로이드를 제조하기 위해 본 발명에 따라 이용할 수 있다.

LNP는 전형적으로 구성성분 4종: 이온화가능한 양이온성 지질, 인지질과 같은 중성 지질, 콜레스테롤과 같은 스테로이드, 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-지질과 같은 폴리머 접합 지질을 포함한다. 각 구성성분은 페이로드를 보호하는 역할을 하며, 효과적인 세포내 전달을 달성할 수 있다. LNP는 에탄올 중에 용해한 지질을 핵산과 수성 완충제에서 신속하게 혼합함으로써 제조할 수 있다.

용어 "평균 직경"은 동적 광 산란 (DLS)과 소위 누적 알고리즘에 의한 데이터 분석으로 측정되는, 입자의 평균 유체역학적 직경을 의미하며, 이는 결과로서 길이 치수를 가진 Z_평균과 치수가 없는 다분산 지수 (PI)가 제공된다 (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321). 여기서, 입자의 "평균 직경", "직경" 또는 "크기"는 Z_평균 값과 동의어로 사용된다.

용어 "다분산 지수"는 "평균 직경"의 정의에 언급된 바와 같이 소위 누적 분석에 따른 동적 광 산란 측정값을 기반으로 계산한다. 특정 전제 조건에서는, 이는 나노입자 전체의 크기 분포의 측정값으로서 획득할 수 있다.

핵산을 함유한 입자의 여러가지 유형들이 핵산을 미립자 형태로 전달하기에 적합한 것으로 이전에 개시된 바 있다 (예, Kaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60). 비-바이러성 핵산 전달 비히클의 경우, 핵산의 나노입자 캡슐화는 핵산을 분해로부터 물리적으로 보호하고, 특이적인 화학 특성에 따라 세포 흡수 및 엔도좀 탈출을 도울 수 있다.

본 발명은 핵산, 하나 이상의 양이온성 또는 양이온으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질, 및/또는 하나 이상의 양이온성 폴리머를 포함하는 입자를 기술하며, 이는 핵산과 조합하여 핵산 입자와 이러한 입자를 포함하는 조성물을 형성한다. 핵산 입자는 입자에 대한 비-공유적 상호작용에 의해 여러가지 형태로 복합체를 형성한 핵산을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 입자는 바이러스 입자, 특히 감염성 바이러스 입자가 아니며, 즉 이는 세포를 바이러스로 감염시키지 못한다.

적합한 양이온성 또는 양이온으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 및 양이온성 폴리머는 핵산 입자를 형성하는 것이며, 용어 "입자를 형성하는 구성성분" 또는 "입자를 형성하는 물질"에 포함된다. 용어 "입자를 형성하는 구성성분" 또는 "입자를 형성하는 물질"은 핵산과 결합하여 핵산 입자를 형성하는 임의의 구성성분을 지칭한다. 이러한 구성성분은 핵산 입자의 일부일 수 있는 임의의 구성성분을 포함한다.

양이온성 폴리머

더 높은 수준의 화학적 유연성을 감안해, 나노입자-기반의 전달에 통상적으로 사용되는 물질은 폴리머이다. 전형적으로, 양이온성 폴리머를 이용해, 음으로 하전된 핵산을 나노입자로 정전기적으로 압축한다. 이러한 양으로 하전된 기들은 흔히 엔도좀을 파괴하는 이온 불균형을 일으키는 것으로 간주되는, pH 5.5-7.5 범위에서 양성자화 상태가 달라지는 아민으로 구성된다. 폴리-L-라이신, 폴리아미도아민, 프로타민 및 폴리에틸렌이민과 같은 폴리머뿐 아니라 키토산과 같은 자연 생성 폴리머 모두 핵산 전달에 이용된 바 있으며, 본원에서 양이온성 폴리머로서 적합하다. 아울러, 일부 연구자들은 핵산 전달용으로 폴리머를 특수 합성한 바 있다. 특히, 폴리(β-아미노 에스테르)가 이의 용이한 합성 및 생분해성으로 인해 핵산 전달용으로 널리 사용되고 있다. 이러한 합성 폴리머는 또한 본원에서 양이온성 폴리머로서 적합하다.

본원에 사용된 바와 같이, "폴리머"는 일반적인 의미로 제공되며, 즉 공유 결합에 의해 연결된 하나 이상의 반복 단위 (단량체)를 포함하는 분자 구조를 의미한다. 이러한 반복 단위들은 모두 동일할 수 있거나, 또는 일부 경우에는 2가지 타입 이상의 반복 단위가 폴리머에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 폴리머는 생물학적으로 유래한 것이며, 즉 단백질과 같은 바이오폴리머이다. 일부 경우에, 폴리머에 부가적인 모이어티도 존재할 수 있으며, 예를 들어 본원에 언급된 것과 같은 표적화 모이어티가 존재할 수 있다.

폴리머에 2가지 타입 이상의 반복 단위가 존재한다면, 이러한 폴리머는 "코폴리머"라 지칭한다. 본원에서 채택되는 폴리머는 코폴리머일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 코폴리머를 형성하는 반복 단위는 임의 방식으로 정렬될 수 있다. 예를 들어, 반복 단위는 무작위 순서로, 교대로 배치되는 순서로 또는 "블록" 코폴리머로서, 즉 각각 제1 반복 단위 (예, 제1 블록)를 포함하는 하나 이상의 영역과 각각 제2 반복 단위 (예, 제2 블록)를 포함하는 하나 이상의 영역 등을 포함하는 블록 코폴리머로서 정렬될 수 있다. 블록 코폴리머는 별개의 블록을 2개 (다이블록 코폴리머), 3개 (트리블록 코폴리머) 또는 그 이상의 개수로 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 폴리머는 생체적합한 것이다. 생체적합한 폴리머는 전형적으로 적당한 농도에서 현저한 세포 사멸을 유발하지 않는 폴리머이다. 특정 구현예에서, 생체적합한 폴리머는 생분해성이며, 즉 폴리머는 체내와 같은 생리학적 환경에서 화학적으로 및/또는 생물학적으로 분해될 수 있다.

특정 구현예에서, 폴리머는 프로타민 또는 폴리알킬렌이민일 수 있으며, 특히 프로타민일 수 있다.

용어 "프로타민"은, 아르기닌이 풍부한 비교적 저 분자량의 다양한 임의의 강 염기성 단백질을 지칭하며, 이는 다양한 동물 (어류)의 정자 세포에서 체세포 히스톤 대신 DNA에 특히 결합된 상태로 발견된다. 구체적으로, 용어 "프로타민"은 강 염기성이며, 수 용해성이고, 열에 의해 응집되지 않고, 가수분해시 주로 아르기닌이 수득되는, 어류 정자에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 이는, 정제된 형태로는 인슐린의 장기 작용 제형에 이용되며, 헤파린의 항-응집 효과를 중화한다.

본 발명에 따르면, 용어 "프로타민"은, 본원에 사용된 바와 같이, 자연 또는 생물학적 원료로부터 수득 또는 유래하는 임의의 프로타민 아미노산 서열을, 이의 단편 및 상기한 아미노산 서열 또는 이의 단편의 다량체 형태뿐 아니라 특수 목적으로 특별히 인공적으로 설계된, 천연적인 또는 생물학적 원료로부터 분리할 수 없는 (합성) 폴리펩타이드를 비롯하여, 망라하는 것을 의미한다.

일 구현예에서, 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리프로필렌이민을 포함하고, 바람직하게는 폴리에틸렌이민을 포함한다. 바람직한 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 (PEI)이다. PEI의 평균 분자량은 바람직하게는 0.75·10² 내지 10⁷ Da, 바람직하게는 1000 내지 10⁵ Da, 더 바람직하게는 10000 내지 40000 Da, 더 바람직하게는 15000 내지 30000 Da, 더욱 더 바람직하게는 20000 내지 25000 Da이다.

본 발명에 따르면 선형 폴리에틸렌이민 (PEI)과 같은 선형 폴리알킬렌이민이 바람직하다.

본 발명에서 사용이 고려되는 (다가양이온 폴리머를 비롯한) 양이온성 폴리머는 핵산에 정전기적으로 결합할 수 있는 임의의 양이온성 폴리머를 망라한다. 일 구현예에서, 본 발명에서 사용이 고려되는 양이온성 폴리머는, 예를 들어 핵산과 복합체를 형성함으로써 또는 핵산이 봉입 또는 캡슐화된 소낭을 형성함으로써, 핵산과 조합될 수 있는, 임의의 양이온성 폴리머를 망라한다.

본원에 기술된 입자는 또한 양이온성 폴리머 이외의 다른 폴리머, 즉 비-양이온성 폴리머 및/또는 음이온성 폴리머를 포함할 수 있다. 통틀어 음이온성 폴리머 및 중성 폴리머는 본원에서 비-양이온성 폴리머로 지칭된다.

지질 및 지질 -유사 물질

용어 "지질" 및 "지질-유사 물질"은 하나 이상의 소수성 모이어티 또는 기를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 친수성 모이어티 또는 기를 포함하는 분자로서, 광의적인 의미로 본원에서 정의된다. 소수성 모이어티와 친수성 모이어티를 포함하는 분자는 또한 양친매성으로 종종 언급된다. 지질은 통상 수 난용성이다. 양친매성 특성은 수성 환경에서 분자가 조직화된 구조로 자기-조립하여 여러가지 상을 형성할 수 있게 해준다. 이는 수성 환경에서 소낭, 다층/단일층 리포좀 또는 막으로 존재하므로, 이들 상 중 하나는 지질 이중층으로 구성된다. 소수성은, 비-제한적으로, 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기, 그리고 방향족, 지환족 또는 헤테로사이클릭 기(들) 중 하나 이상으로 치환된 상기한 기를 포함하여, 무극성 기를 함유함으로써 부여될 수 있다. 친수성 기는 극성 및/또는 하전된 기를 포함할 수 있으며, 탄수화물, 포스페이트 기, 카르복시 기, 설페이트 기, 아미노 기, 설프하이드릴 기, 니트로 기, 하이드록시 기 및 기타 유사 기를 함유할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "양친매성"은 극성 부분 및 비-극성 부분을 모두 가진 분자를 지칭한다. 종종, 양친매성 화합물은 긴 소수성 꼬리가 달린 극성 헤드를 가진다. 일부 구현예에서, 극성 부분은 수 용해성인 반면, 비-극성 부분은 수 불용성이다. 또한, 극성 부분은 형식 양 전하 (formal positive charge) 또는 형식 음 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 극성 부분은 형식 양 전하 및 음전하 둘다를 가질 수 있으며, 양쪽성 이온 또는 내부 염 (inner salt)일 수 있다. 본 발명의 목적에서, 양친매성 화합물은 천연성 또는 비-천연성 지질 및 지질-유사 화합물 하나 또는 복수개일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

용어 "지질-유사 물질", "지질-유사 화합물" 또는 "지질-유사 분자"는 지질과 구조적으로 및/또는 기능적으로 관련성이 있지만 엄밀한 의미에서는 지질로 간주할 수 없는 물질을 의미한다. 예를 들어, 이 용어는 수성 환경에서 소낭, 다층/단일층 리포좀 또는 막에 존재하므로, 양친매성 층을 형성할 수 있는 화합물을 망라하며, 계면활성제 또는 친수성 및 소수성 모이어티를 모두 가진 합성 화합물을 망라한다. 일반적으로 말해, 이 용어는 지질과 비슷하거나 또는 비슷하지 않을 수 있는, 소수성 및 친수성 모이어티를 여러가지 구조적 구성으로 포함하는, 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지질"은 본원에서 달리 지시되지 않은 한 또는 문맥상 명확하게 상충하지 않은 한 지질 및 지질-유사 물질 둘다를 망라하는 것으로 해석되어야 한다.

양친매성 층에 함유될 수 있는 양친매성 화합물에 대한 구체적인 예로는 포스포리피드, 아미노리피드 및 스핑고리피드 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

특정 구현예에서, 양친매성 화합물은 지질이다. 용어 "지질"은 물에 불용성이나 다수의 유기 용매에는 용해성인 것을 특징으로 하는 일군의 유기 화합물을 지칭한다. 일반적으로, 지질은 8개의 범주로 나눌 수 있다: 지방산, 글리세로리피드, 글리세로포스포리피드, 스핑고리피드, 사카로리피드, (케토아실 서브유닛의 축합으로 유래하는) 폴리케티드, 스테롤 리피드 및 (이소프렌 서브유닛들의 축합으로 유래하는) 프레놀 리피드. 용어 "지질"은 종종 지방과 동의어로 사용되지만, 지방은 트리글리세라이드로 지칭되는 지질의 하위군이다. 또한, 지질은 지방산 및 이의 유도체 (트리-글리세라이드, 다이-글리세라이드, 모노-글리세라이드 및 포스포리피드)와 같은 분자뿐 아니라 콜레스테롤과 같은 스테롤-함유 대사산물을 망라한다.

지방산 또는 지방산 잔기는 카르복시산 기로 끝나는 탄화수소 쇄로 만들어진 다양한 분자 군으로서; 이러한 배열은 수 불용성인 비-극성 소수성 말단과 극성 친수성 말단을 가진 분자를 제공한다. 이 탄소 쇄, 전형적으로 탄소수 4-24 길이의 탄소 쇄는 포화되거나 또는 불포화될 수 있으며, 산소, 할로겐, 질소 및 황을 함유한 관능기가 부착될 수 있다. 지방산이 이중 결합을 가진다면, 분자의 배위에 현저한 영향을 미치는 시스 또는 트랜스 기하 이성질 현상 (isomerism)이 존재할 수 있다. 시스-이중 결합은 쇄에서 이중 결합들이 더 많이 형성된 효과로서, 지방산 쇄가 만곡되게 한다. 지방산 범주에서 다른 주요 지질 계열은 지방 에스테르와 지방 아미드이다.

글리세로리피드는 가장 잘 알려진 글리세롤의 지방산 트리에스테르로서 단일-치환된 글리세롤, 이중-치환된 글리세롤 및 삼중-치환된 글리세롤로 구성된다. 용어 "트리아실글리세롤"은 때때로 "트리글리세라이드"와 동의어로 사용된다. 이들 화합물에서, 글리세롤의 하이드록시 기 3개가 각각 에스테르화 되며, 전형적으로 서로 다른 지방산에 의해 에스테르화 된다. 글리세로리피드의 부가적인 하위군은 글리코시드 결합을 통해 글리세롤이 부착된 하나 이상의 당 잔기의 존재를 특징으로 하는 글리코실글리세롤이다.

글리세로포스포리피드는, 글리세롤 코어가 지방산-유래 "꼬리" 2개와 에스테르 결합으로, 그리고 "머리" 기 하나와 포스페이트 에스테르 결합으로 결합된, (소수성 부분과 친수성 부분을 모두 가진) 양친매성 분자이다. 통상 (스핑고마이엘린 역시 포스포리피드로 분류되지만) 포스포리피드로 언급되는, 글리세로포스포리피드에 대한 예로는 포스파티딜콜린 (PC, GPCho 또는 레시틴으로도 알려짐), 포스파티딜에탄올아민 (PE 또는 GPEtn) 및 포스파티딜세린 (PS 또는 GPSer)이 있다.

스핑고리피드는 공통적인 구조 특징으로서 스핑고이드 염기 백본을 공유한 화합물들로 구성된 복합체 계열이다. 포유류에서 주요 스핑고이드 염기는 일반적으로 스핑고신으로 지칭된다. 세라마이드 (N-아실-스핑고이드 염기)는 아미드-연결된 지방산을 가진 스핑고이드 염기 유도체의 주요 하위군이다. 지방산은 전형적으로 탄소수 16-26의 쇄를 가진 포화 또는 단일-불포화된 형태이다. 포유류의 주요 포스포스핑고리피드는 스핑고마이엘린 (세라마이드 포스포콜린)이지만, 곤충은 주로 세라마이드 포스포에탄올아민을 함유하고 있으며, 진균은 피토세라마이드 포스포이노시톨 및 만노스-함유성 헤드 기를 가지고 있다. 글리코스핑고리피드는 스핑고이드 염기에 글리코시드 결합을 통해 연결된 하나 이상의 당 잔기로 구성되는 다양한 분자 계열이다. 이에 대한 예로는 세레브로시드 및 강글리오시드와 같은 단순한 글리코스핑고리피드와 복잡한 글리코스핑고리피드가 있다.

콜레스테롤 및 이의 유도체, 또는 토코페롤 및 이의 유도체와 같은 스테롤 리피드는, 글리세로포스포리피드 및 스핑고마이엘린과 더불어, 막 지질의 중요 성분이다.

사카로리피드는, 지방산이 당 백본에 직접 결합하여 막 이중층에 적합한 구조를 형성하는, 화합물이다. 사카로리피드에서, 단당류가 글리세로리피드 및 글리세로포스포리피드에 존재하는 글리세롤 백본을 대신한다. 가장 익숙한 사카로리피드는 그람 음성 박테리아에서 지질다당류의 지질 A 성분의 아실화된 글루코사민 전구체이다. 전형적인 지질 A 분자는 많게는 7개의 지방-아실 쇄로 유도체화된 글루코사민 이당류이다. E. coli에서 증식하는데 필요한 최소 지질다당류는 Kdo2-지질 A, 즉 3-데옥시-D-만노-옥툴로소닉 산 (Kdo) 잔기 2개로 당화된 글루코사민의 헥사-아실화된 이당류이다.

폴리케티드는 고전적인 효소뿐 아니라 지방산 신타제와 기전 특징을 공유한 반복적인 다중 모듈형 효소에 의한, 아세틸과 프로피오닐 서브유닛의 중합을 통해 합성된다. 이는 동물, 식물, 세균, 진균 및 해양 원료로부터 유래하는 2차 대사산물과 천연 산물을 다수 포함하며, 상당한 구조 다양성을 가진다. 다수의 폴리케티드들이, 당화, 메틸화, 하이드록시화, 산화 또는 기타 공정에 의해 종종 추가로 변형된 백본을 가진 고리형 분자이다.

본 발명에서, 지질 및 지질-유사 물질은 양이온성, 음이온성 또는 중성일 수 있다. 중성 지질 또는 지질-유사 물질은 선택 pH에서 하전되지 않거나 또는 중성의 양쪽성 형태로 존재한다.

양이온성 또는 양이온으로 이온화가능한 지질 또는 지질-유사 물질

본원에 기술된 핵산 입자는 하나 이상의 양이온성 또는 양이온으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질을 입자 형성제로서 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용이 고려되는 양이온성 또는 양이온으로 이온화가능한 지질 또는 지질-유사 물질로는 핵산에 정전기적으로 결합할 수 있는, 임의의 양이온성 또는 양이온으로 이온화가능한 지질 또는 지질-유사 물질 등이 있다. 일 구현예에서, 본 발명에서 사용이 고려되는 양이온성 또는 양이온으로 이온화가능한 지질 또는 지질-유사 물질은, 예를 들어, 핵산이 봉입 또는 캡슐화된 소낭을 형성하거나 또는 핵산과 복합체를 형성함으로써, 핵산과 조합될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "양이온성 지질" 또는 "양이온성 지질-유사 물질"은 순 양의 전하 (net positive charge)를 가진 지질 또는 지질-유사 물질을 의미한다. 양이온성 지질 또는 지질-유사 물질은 정전기적 상호작용을 통해 음으로 하전된 핵산에 결합한다. 일반적으로, 양이온성 지질은 스테롤, 아실 쇄, 다이아실 또는 그 이상의 아실 쇄 등의 친지성 모이어티를 가지고 있으며, 지질의 헤드 기는 전형적으로 양 전하를 띤다.

특정 구현예에서, 양이온성 지질 또는 지질-유사 물질은 특정 pH에서만, 구체적으로 산성 pH에서만 순 양의 전하를 띠며, 다른, 바람직하게는 더 높은 pH, 예를 들어 생리학적 pH에서 바람직하게는 순 양의 전하를 띠지 않으며, 바람직하게는 전하를 띠지 않으며, 즉 중성이다. 이러한 이온화 가능한 거동은 생리학적 pH에서 양이온성으로 유지되는 입자와 비교해 엔도좀 탈출 및 독성 저하를 보조함으로써 효능을 강화하는 것으로 보인다.

본 발명의 목적에서, 이러한 "양이온으로 이온화 가능한" 지질 또는 지질-유사 물질은, 상황에 따라 상충하지 않은 한, 용어 "양이온성 지질 또는 지질-유사 물질"에 포함된다.

일 구현예에서, 양이온성 또는 양이온으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질은 양으로 하전되거나 또는 양성자화될 수 있는 하나 이상의 질소 원자 (N)를 가진 헤드 기를 포함한다.

양이온성 지질에 대한 예로는 1,2-다이올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); N,N-다이메틸-2,3-다이올레일옥시프로필아민 (DODMA), 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 3-(N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤 (DC-Chol), 다이메틸다이옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-다이아실옥시-3-다이메틸암모늄 프로판; 1,2-다이알킬옥시-3-다이메틸암모늄 프로판; 다이옥타데실다이메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-다이스테아릴옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판 (DSDMA), 2,3-다이(테트라데콕시)프로필-(2-하이드록시에틸)-다이메틸아자늄 (DMRIE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC), l,2-다이미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE), 및 2,3-다이올레오일옥시-N-[2(스페르민 카르복사미드)에틸]-N,N-다이메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-다이리놀레닐옥시-N,N-다이메틸아미노프로판 (DLenDMA), 다이옥타데실아미도글리실 스페르민 (DOGS), 3-다이메틸아미노-2-(콜레스트-5-en-3-β-옥시부탄-4-옥시)-1-(cis,cis-9,12-옥타데카다이엔옥시)프로판 (CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-en-3-β-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-다이메틸-1-(cis,cis-9',12'-옥타데카다이엔옥시)프로판 (CpLinDMA), N,N-다이메틸-3,4-다이올레일옥시벤질아민 (DMOBA), 1,2-N,N'-다이올레일카르브아밀-3-다이메틸아미노프로판 (DOcarbDAP), 2,3-다이리놀레오일옥시-N,N-다이메틸프로필아민 (DLinDAP), 1,2-N,N'-다이리놀레일카르브아밀-3-다이메틸아미노프로판 (DLincarbDAP), 1,2-다이리놀레오일카르브아밀-3-다이메틸아미노프로판 (DLinCDAP), 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란 (DLin-K-DMA), 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노에틸-[1,3]-다이옥솔란 (DLin-K-XTC2-DMA), 2,2-다이리놀레일-4-(2-다이메틸아미노에틸)-[1,3]-다이옥솔란 (DLin-KC2-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(다이메틸아미노)부타노에이트 (DLin-MC3-DMA), N-(2-하이드록시에틸)-N,N-다이메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판아미늄 브로마이드 (DMRIE), (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-다이메틸-2,3-비스(cis-9-테트라데세닐옥시)-1-프로판아미늄 브로마이드 (GAP-DMORIE), (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-다이메틸-2,3-비스(도데실옥시)-1-프로판아미늄 브로마이드 (GAP-DLRIE), (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-다이메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판아미늄 브로마이드 (GAP-DMRIE), N-(2-아미노에틸)-N,N-다이메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판아미늄 브로마이드 (βAE-DMRIE), N-(4-카르복시벤질)-N,N-다이메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄 (DOBAQ), 2-({8-[(3β)-콜레스트-5-en-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-다이메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일옥시]프로판-1-아민 (옥틸-CLinDMA), 1,2-다이미리스토일-3-다이메틸암모늄-프로판 (DMDAP), 1,2-다이팔미토일-3-다이메틸암모늄-프로판 (DPDAP), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[다이(3-아미노-프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-다이[올레일옥시]-벤즈아미드 (MVL5), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC), 2,3-비스(도데실옥시)-N-(2-하이드록시에틸)-N,N-다이메틸프로판-1-암모늄 브로마이드 (DLRIE), N-(2-아미노에틸)-N,N-다이메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)프로판-1-아미늄 브로마이드 (DMORIE), 다이((Z)-non-2-en-1-일) 8,8'-((((2(다이메틸아미노)에틸)티오)카르보닐)아잔다이일)다이옥타노에이트 (ATX), N,N-다이메틸-2,3-비스(도데실옥시)프로판-1-아민 (DLDMA), N,N-다이메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)프로판-1-아민 (DMDMA), 다이((Z)-non-2-en-1-일)-9-((4-(다이메틸아미노부타노일)옥시)헵타데칸다이오에이트 (L319), N-도데실-3-((2-도데실카바모일-에틸)-{2-[(2-도데실카바모일-에틸)-2-{(2-도데실카바모일-에틸)-[2-(2-도데실카바모일-에틸아미노)-에틸]-아미노}-에틸아미노)프로피온아미드 (리피도이드 98N₁₂-5), 1-[2-[비스(2-하이드록시도데실)아미노]에틸-[2-[4-[2-[비스(2 하이드록시도데실)아미노]에틸]피페라진-1-일]에틸]아미노]도데칸-2-올 (리피도이드 C12-200)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

일부 구현예에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 전체 지질 중 약 10 mol% 내지 약 100 mol%, 약 20 mol% 내지 약 100 mol%, 약 30 mol% 내지 약 100 mol%, 약 40 mol% 내지 약 100 mol%, 또는 약 50 mol% 내지 약 100 mol%를 차지할 수 있다.

부가적인 지질 또는 지질-유사 물질

본원에 기술된 입자는, 양이온성 또는 양이온으로 이온화가능한 지질 또는 지질-유사 물질 이외에, 다른 지질 또는 지질-유사 물질, 즉 비-양이온성 지질 또는 지질-유사 물질 (비-양이온으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 포함)을 또한 포함할 수 있다. 본원에서는 음이온성 및 중성 지질 또는 지질-유사 물질을 총괄적으로 비-양이온성 지질 또는 지질-유사 물질이라 지칭한다. 이온화 가능한/양이온성 지질 또는 지질-유사 물질과 더불어, 콜레스테롤 및 지질과 같은 기타 소수성 모이어티의 부가에 의한 핵산 입자의 제형 최적화는 입자 안정성 및 핵산 전달 효율을 강화할 수 있다.

핵산 입자의 총 전하에 영향을 미치거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있는 부가적인 지질 또는 지질-유사 물질이 병합될 수도 있다. 특정 구현예에서, 부가적인 지질 또는 지질-유사 물질은 비-양이온성 지질 또는 지질-유사 물질이다. 비-양이온성 지질은 예를 들어, 하나 이상의 음이온성 지질 및/또는 중성 지질을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "음이온성 지질"은 선택 pH에서 음으로 하전되는 임의의 지질을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "중성 지질"은 선택한 pH에서 비-하전된 또는 중성의 양쪽성 형태로 존재하는 다수의 임의 지질 종을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 부가적인 지질은 다음과 같은 중성 지질 성분들 중 하나를 포함한다: (1) 인지질, (2) 콜레스테롤 또는 그 유도체; 또는 (3) 인지질 및 콜레스테롤 또는 그 유도체의 혼합물. 콜레스테롤 유도체에 대한 예로는 콜레스타놀, 콜레스타논, 콜레스테논, 코프로스타놀, 콜레스테릴-2'-하이드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4'-하이드록시부틸 에테르, 토코페롤 및 그 유도체 및 이들의 혼합물 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

사용가능한 구체적인 인지질로는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜세린 또는 스핑고마이엘린 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이들 인지질은 특히 다이아실포스파티딜콜린, 예를 들어 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 다이펜타데카노일포스파티딜콜린, 다이라우로일포스파티딜콜린, 다이팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 다이아라키도닐포스파티딜콜린 (DAPC), 다이베헤노일포스파티딜콜린 (DBPC), 다이트리코사노일포스파티딜콜린 (DTPC), 다이리그노세로일파티딜콜린 (DLPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린 (POPC), 1,2-다이-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0 다이에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C16 Lyso PC) 및 포스파티딜에탄올아민, 특히 다이아실포스파티딜에탄올아민, 예를 들어 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 다이팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 다이미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 다이라우로일-포스파티딜에탄올아민 (DLPE), 다이피타노일-포스파티딜에탄올아민 (DPyPE), 및 여러가지 소수성 쇄를 가진 추가의 포스파티딜에탄올아민 지질을 포함한다.

바람직한 특정 구현예에서, 부가적인 지질은 DSPC이거나 또는 DSPC 및 콜레스테롤이다.

특정 구현예에서, 핵산 입자는 양이온성 지질과 부가적인 지질 둘다 포함한다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 페길화 지질 (pegylated lipid)과 같이 폴리머 접합된 지질 (polymer conjugated lipid)을 포함한다. 용어 "페길화 지질"은 지질 부분과 폴리에틸렌 글리콜 부분을 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 페길화 지질은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 하나 이상의 부가적인 지질의 함량 대비 하나 이상의 양이온성 지질의 함량은 핵산의 전하, 입자 크기, 안정성, 조직 선택성 및 생활성과 같은 핵산 입자의 중요한 특징에 영향을 미칠 수 있다. 이에, 일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 : 하나 이상의 부가적인 지질의 몰 비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다.

일부 구현예에서, 비-양이온성 지질, 특히 중성 지질 (예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자에 존재하는 전체 지질에 대해 약 0 mol% 내지 약 90 mol%, 약 0 mol% 내지 약 80 mol%, 약 0 mol% 내지 약 70 mol%, 약 0 mol% 내지 약 60 mol% 또는 약 0 mol% 내지 약 50 mol%를 차지할 수 있다.

리포플렉스 입자

본 발명의 특정 구현예에서, 본원에 기술된 RNA는 RNA 리포플렉스 입자로 존재할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "RNA 리포플렉스 입자"는 지질, 특히 양이온성 지질과 RNA를 함유한 입자를 지칭한다. 양으로 하전된 리포좀과 음으로 하전된 RNA 간의 정전기적 상호작용으로 복합체가 형성되어, RNA 리포플렉스 입자가 자발적으로 만들어진다. 양으로 하전된 리포좀은 일반적으로 DOTMA와 같은 양이온성 지질 및 DOPE와 같은 부가적인 지질을 사용해 합성할 수도 있다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 나노입자이다.

특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 양이온성 지질과 부가적인 지질을 둘다 포함한다. 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 DOTMA이고, 부가적인 지질은 DOPE이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 : 하나 이상의 부가적인 지질의 몰 비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다. 특정 구현예에서, 상기한 몰 비는 약 3:1, 약 2.75:1, 약 2.5:1, 약 2.25:1, 약 2:1, 약 1.75:1, 약 1.5:1, 약 1.25:1 또는 약 1:1일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 : 하나 이상의 부가적인 지질의 몰 비는 약 2:1이다.

본 발명에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는, 일 구현예에서, 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위의 평균 직경을 가진다. 특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 평균 직경이 약 200 nm, 약 225 nm, 약 250 nm, 약 275 nm, 약 300 nm, 약 325 nm, 약 350 nm, 약 375 nm, 약 400 nm, 약 425 nm, 약 450 nm, 약 475 nm, 약 500 nm, 약 525 nm, 약 550 nm, 약 575 nm, 약 600 nm, 약 625 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 725 nm, 약 750 nm, 약 775 nm, 약 800 nm, 약 825 nm, 약 850 nm, 약 875 nm, 약 900 nm, 약 925 nm, 약 950 nm, 약 975 nm 또는 약 1000 nm이다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 평균 직경이 약 250 nm 내지 약 700 nm 범위이다. 다른 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 평균 직경이 약 300 nm 내지 약 500 nm 범위이다. 예시적인 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 평균 직경이 약 400 nm이다.

본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자 및 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물은 비경구 투여 후, 특히 정맥내 투여 후, RNA를 표적 조직으로 전달하기에 유용하다. RNA 리포플렉스 입자는 에탄올 중의 지질 용액을 물 또는 적절한 수성 상에 주입함으로써 수득할 수 있는 리포좀을 이용해 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 수성 상은 산성 pH를 가진다. 일 구현예에서, 수성 상은 아세트산을, 예를 들어, 약 5 mM 함량으로 포함한다. 리포좀은, 리포좀을 RNA와 혼합함으로써 RNA 리포플렉스 입자 제조에 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 리포좀 및 RNA 리포플렉스 입자는 하나 이상의 양이온성 지질과 하나 이상의 부가적인 지질을 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA) 및/또는 1,2-다이올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 부가적인 지질은 1,2-다이-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤 (Chol) 및/또는 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA)을 포함하고, 하나 이상의 부가적인 지질은 1,2-다이-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함한다. 일 구현예에서, 리포좀 및 RNA 리포플렉스 입자는 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA)과 1,2-다이-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함한다.

지질 나노입자 ( LNP )

일 구현예에서, 본원에 기술된 RNA와 같은 핵산은 지질 나노입자 (LNP)의 형태로 투여된다. LNP는 하나 이상의 핵산 분자가 부착되거나 또는 하나 이상의 핵산 분자가 안에 캡슐화된, 입자를 형성할 수 있는 임의 지질을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질과 하나 이상의 안정화 지질을 포함한다. 안정화 지질로는 중성 지질 및 페길화된 지질 등이 있다.

일 구현예에서, LNP는 양이온성 지질, 중성 지질, 스테로이드, 폴리머 접합된 지질; 및 지질 나노입자 안에 캡슐화되거나 또는 이와 조합된 RNA를 포함한다.

일 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 40 내지 55 mol%, 40 내지 50 mol%, 41 내지 49 mol%, 41 내지 48 mol%, 42 내지 48 mol%, 43 내지 48 mol%, 44 내지 48 mol%, 45 내지 48 mol%, 46 내지 48 mol%, 47 내지 48 mol% 또는 47.2 내지 47.8 mol%로 포함한다. 일 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 약 47.0, 47.1, 47.2, 47.3, 47.4, 47.5, 47.6, 47.7, 47.8, 47.9 또는 48.0 mol%로 포함한다.

일 구현예에서, 중성 지질이 5 내지 15 mol%, 7 내지 13 mol% 또는 9 내지 11 mol% 범위의 농도로 존재한다. 일 구현예에서, 중성 지질이 약 9.5, 10 또는 10.5 mol% 농도로 존재한다.

일 구현예에서, 스테로이드가 30 내지 50 mol%, 35 내지 45 mol% 또는 38 내지 43 mol% 범위의 농도로 존재한다. 일 구현예에서, 스테로이드가 약 40, 41, 42, 43, 44, 45 또는 46 mol% 농도로 존재한다.

일 구현예에서, LNP는 폴리머 접합된 지질을 1 내지 10 mol%, 1 내지 5 mol%, 또는 1 내지 2.5 mol%로 포함한다.

일 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 40 내지 50 mol%로; 중성 지질을 5 내지 15 mol%로; 스테로이드를 35 내지 45 mol%로; 폴리머 접합된 지질을 1 내지 10 mol%로; 그리고, 지질 나노입자 안에 캡슐화되거나 또는 이와 조합된 RNA를 포함한다.

일 구현예에서, mol%는 지질 나노입자에 존재하는 지질의 총 mol을 기준으로 하여 정해진다.

일 구현예에서, 중성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE, DOPG, DPPG, POPE, DPPE, DMPE, DSPE 및 SM으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 중성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 중성 지질은 DSPC이다.

일 구현예에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다.

일 구현예에서, 폴리머 접합된 지질은 페길화된 지질이다. 일 구현예에서, 페길화된 지질은 하기 구조를 가지거나, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 호변이성질체 또는 입체이성질체이다:

상기 식에서,

R¹² 및 R¹³은 각각 독립적으로 탄소수 10-30의 포화 또는 불포화된 알킬 직쇄 또는 분지쇄이고, 여기서 알킬 쇄는 선택적으로 하나 이상의 에스테르 결합이 사이에 존재하고; w는 30-60 범위의 평균 값을 가진다. 일 구현예에서, R¹² 및 R¹³은 각각 독립적으로 탄소수 12-16의 포화된 알킬 직쇄이다. 일 구현예에서, w는 40-55 범위의 평균 값을 가진다. 일 구현예에서, w 평균은 약 45이다. 일 구현예에서, R¹² 및 R¹³은 각각 독립적으로 탄소수 약 14의 포화된 알킬 직쇄이고, w는 약 45의 평균 값을 가진다.

일부 구현예에서, LNP의 양이온성 지질 성분은 식 (III)의 구조를 가지거나, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 호변이성질체, 프로드럭 또는 입체이성질체이다:

상기 식에서,

L¹ 또는 L² 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)_x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NR^aC(=O)-, -C(=O)NR^a-, NR^aC(=O)NR^a-, -OC(=O)NR^a- 또는 -NR^aC(=O)O-이고, L¹ 또는 L² 중 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)_x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NR^aC(=O)-, -C(=O)NR^a-, NR^aC(=O)NR^a-, -OC(=O)NR^a- 또는 -NR^aC(=O)O-이거나 또는 직접 결합이고;

G¹ 및 G²는 각각 독립적으로 비-치환된 C₁-C₁₂ 알킬렌 또는 C₁-C₁₂ 알케닐렌이고;

G³는 C₁-C₂₄ 알킬렌, C₁-C₂₄ 알케닐렌, C₃-C₈ 사이클로알킬렌, C₃-C₈ 사이클로알케닐렌이고;

R^a는 H 또는 C₁-C₁₂ 알킬이고;

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 C₆-C₂₄ 알킬 또는 C₆-C₂₄ 알케닐이고;

R³는 H, OR⁵, CN, -C(=O)OR⁴, -OC(=O)R⁴ 또는 -NR⁵C(=O)R⁴이고;

R⁴는 C₁-C₁₂ 알킬이고;

R⁵는 H 또는 C₁-C₆ 알킬이고; 및

x는 0, 1 또는 2이다.

식 (III)의 전술한 구현예들 중 일부에서, 지질은 하기 구조 (IIIA) 또는 (IIIB) 중 하나를 가진다:

또는

상기 식에서,

A는 3-8원성 사이클로알킬 또는 사이클로알킬렌 고리이고;

R⁶는, 각각의 경우에, 독립적으로 H, OH 또는 C₁-C₂₄ 알킬이고;

n은 1-15 범위의 정수이다.

상기 식 (III)에 대한 일부 구현예에서, 지질은 구조 (IIIA)를 가지고, 다른 구현예에서 지질은 구조 (IIIB)를 가진다.

식 (III)에 대한 다른 구현예에서, 지질은 하기 구조 (IIIC) 또는 (IIID) 중 하나를 가진다:

또는

상기 식에서, y 및 z는 각각 독립적으로 1-12 범위의 정수이다.

상기 (III)에 대한 전술한 구현예들 중 임의의 구현예에서, L¹ 또는 L² 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, L¹ 및 L²는 각각 -O(C=O)-이다. 전술한 임의 구현예에 대한 일부 다른 구현예에서, L¹ 및 L²는 각각 독립적으로 -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, L¹ 및 L²는 각각 -(C=O)O-이다.

식 (III)에 대한 일부 다른 구현예에서, 지질은 하기 구조 (IIIE) 또는 (IIIF) 중 하나를 가진다:

또는

식 (III)에 대한 전술한 구현예들 중 일부에서, 지질은 하기 구조 (IIIG), (IIIH), (IIII) 또는 (IIIJ) 중 하나를 가진다:

; ; ; .

상기 식 (III)에 대한 전술한 구현예들 중 일부 구현예에서, n은 2-12, 예를 들어, 2-8 또는 2-4 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, n은 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, n은 3이다. 일부 구현예에서, n은 4이다. 일부 구현예에서, n은 5이다. 일부 구현예에서, n은 6이다.

상기 식 (III) 에 대한 전술한 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 2-10 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 4-9 또는 4-6 범위의 정수이다.

상기 식 (III)에 대한 전술한 구현예들 중 일부 구현예에서, R⁶는 H이다. 전술한 구현예들 중 다른 구현예에서, R⁶는 C₁-C₂₄ 알킬이다. 다른 구현예에서, R⁶는 OH이다.

식 (III)에 대한 일부 구현예에서, G³는 비-치환된다. 다른 구현예에서, G3는 치환된다. 다양한 다른 구현예들에서, G³는 선형의 C₁-C₂₄ 알킬렌 또는 선형의 C₁-C₂₄ 알케닐렌이다.

상기 식 (III)에 대한 전술한 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, R¹ 또는 R², 또는 이 둘다는 C₆-C₂₄ 알케닐이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 하기 구조를 가진다:

상기 식에서,

R^7a 및 R^7b는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C₁-C₁₂ 알킬이고; 및

a는 2-12의 정수이고,

R^7a, R^7b 및 a는 각각, R¹ 및 R²가 각각 독립적으로 탄소 원자 6-20개를 포함하도록 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, a는 5-9 또는 8-12 범위의 정수이다.

상기 식 (III)에 대한 전술한 구현예들 중 일부 구현예에서, R^7a 하나 이상은 H이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R^7a는 각 경우에 H이다. 전술한 내용에 대한 다른 여러가지 구현예들에서, R^7b 하나 이상은 C₁-C₈ 알킬이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, C₁-C₈ 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, iso-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.

식 (III)에 대한 여러가지 구현예들에서, R¹ 또는 R², 또는 이 둘다는 하기 구조들 중 하나를 가진다:

; ; ; ; ; ; ; ; ;

상기 식 (III)에 대한 전술한 구현예들 중 일부 구현예에서, R³는 OH, CN, -C(=O)OR⁴, -OC(=O)R⁴ 또는 -NHC(=O)R⁴이다. 일부 구현예에서, R⁴는 메틸 또는 에틸이다.

다양한 여러가지 구현예들에서, 식 (III)의 양이온성 지질은 하기 표에 나타낸 구조들 중 어느 하나를 가진다.

대표적인 식 (III) 화합물.

일부 구현예에서, LNP는 식 (III)의 지질, RNA, 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 식 (III)의 지질은 화합물 III-3이다. 일부 구현예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 일부 구현예에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 페길화된 지질은 ALC-0159이다.

ALC-0159:

일부 구현예에서, 양이온성 지질은 LNP에 약 40 내지 약 50 mole% 함량으로 존재한다. 일 구현예에서, 중성 지질은 LNP에 약 5 내지 약 15 mole% 함량으로 존재한다. 일 구현예에서, 스테로이드는 LNP에 약 35 내지 약 45 mole% 함량으로 존재한다. 일 구현예에서, 페길화된 지질은 LNP에 약 1 내지 약 10 mole% 함량으로 존재한다.

일부 구현예에서, LNP는 화합물 III-3를 약 40 내지 약 50 mole% 함량으로, DSPC를 약 5 내지 약 15 mole% 함량으로, 콜레스테롤을 약 35 내지 약 45 mole% 함량으로, 그리고 ALC-0159를 약 1 내지 약 10 mole% 함량으로 포함한다.

일부 구현예에서, LNP는 화합물 III-3를 약 47.5 mole% 함량으로, DSPC를 약 10 mole% 함량으로, 콜레스테롤을 약 40.7 mole% 함량으로, 그리고 ALC-0159를 약 1.8 mole% 함량으로 포함한다.

N/P 값은 바람직하게는 적어도 약 4이다. 일부 구현예에서, N/P 값은 4 내지 20, 4 내지 12, 4 내지 10, 4 내지 8 또는 5 내지 7의 범위이다. 일 구현예에서, N/P 값은 약 6이다.

본원에 기술된 LNP는, 일 구현예에서 약 30 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 120 nm 범위의 평균 직경을 가질 수 있다.

RNA 표적화

본 발명의 일부 측면은 본 발명에 기술된 RNA (예를 들어, 활성화 화합물을 암호화하는 RNA 및/또는 도킹 화합물을 암호화하는 RNA)의 표적 전달을 수반한다.

일 구현예에서, 본 발명은 림프 시스템, 구체적으로 2차 림프 기관, 보다 구체적으로 비장으로의 표적화를 포함한다. 림프 시스템, 구체적으로 2차 림프 기관, 보다 구체적으로 비장으로의 표적화는, 투여된 RNA가 활성화 화합물을 암호화하는 RNA일 경우에, 특히 바람직하다.

일 구현예에서, 표적 세포는 비장 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 비장내 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 비장내 수지상 세포이다.

"림프 시스템"은 순환계의 일부이자, 림프액을 운반하는 림프관 네트워크를 포함하는 면역 시스템의 중요한 부분이다. 림프 시스템은 림프 장기, 림프관으로 된 이동 네트워크 및 순환성 림프액으로 구성된다. 일차 또는 중추 림프 장기는 미성숙 전구 세포로부터 림프구를 생성한다. 흉선 및 골수는 일차 림프 장기를 구성한다. 이차 또는 말초 림프 장기는 림프절과 비장을 포함하며, 성숙한 나이브 림프구를 유지시키고, 적응 면역 반응을 개시한다.

RNA는, RNA가 양이온성 지질 및 선택적으로 부가적인 또는 보조 지질을 포함하는 리포좀에 결합되어 주사가능한 나노입자 제형을 형성하는, 소위 리포플렉스 제형에 의해 비장으로 전달할 수 있다. 리포좀은 에탄올 중의 지질 용액을 물 또는 적절한 수상에 주입함으로써 수득할 수 있다. RNA 리포플렉스 입자는 리포좀을 RNA와 혼합하여 제조할 수 있다. 비장을 표적화하는 RNA 리포플렉스 입자는 WO 2013/143683에 언급되어 있으며, 본원에 원용에 의해 포함된다. 음의 순 전하를 가진 RNA 리포플렉스 입자를 이용하여, 항원-제시 세포와 같은 비장 조직 또는 비장 세포, 구체적으로 수지상 세포를 선호적으로 표적화할 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 이에, RNA 리포플렉스 입자를 투여한 후, 비장에서 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 이루어진다. 따라서, 본 발명의 RNA 리포플렉스 입자는 비장에서 RNA를 발현시키기 위해 활용할 수 있다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자를 투여한 후, 폐 및/또는 간에서의 RNA 축적 및/또는 RNA 발현은 발생하지 않거나, 또는 본질적으로 발생하지 않는다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자를 투여한 후, 비장내 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포에서 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 발생한다. 따라서, 본 발명의 RNA 리포플렉스 입자는 이러한 항원 제시 세포에서 RNA를 발현시키기 위해 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포 및/또는 대식 세포이다.

본 발명의 RNA 리포플렉스 입자의 전하는 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 전하와 RNA에 존재하는 전하의 총합이다. 전하 비율은 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 : RNA에 존재하는 음 전하의 비율이다. 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 : RNA에 존재하는 음 전하의 전하 비율은 다음의 식으로 계산한다: 전하 비율 = [(양이온성 지질 농도 (mol)) * (양이온성 지질에 존재하는 양 전하의 총 수)] / [(RNA 농도 (mol)) * (RNA에 존재하는 음 전하의 총 수)].

생리학적 pH에서 비장을 표적화하는 본 발명에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 바람직하게는 양 전하 : 음 전하의 전하 비율 약 1.9:2 내지 약 1:2, 또는 약 1.6:2 내지 약 1:2, 또는 약 1.6:2 내지 약 1.1:2와 같이 음의 순 전하를 가진다. 특정 구현예에서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자에서 양 전하 : 음 전하의 전하 비율은 약 1.9:2.0, 약 1.8:2.0, 약 1.7:2.0, 약 1.6:2.0, 약 1.5:2.0, 약 1.4:2.0, 약 1.3:2.0, 약 1.2:2.0, 약 1.1:2.0, 또는 약 1:2.0이다.

도킹 화합물은 도킹 화합물을 암호화하는 RNA를 간 또는 간 조직으로 선호적으로 전달하기 위한 제형으로 개체에 투여함으로써 개체에 투여할 수 있다. 이러한 표적 기관 또는 조직으로의 RNA 전달은, 특히 암호화된 펩타이드/폴리펩타이드를 다량 발현하는 것이 요망되거나 및/또는 암호화된 펩타이드/폴리펩타이드의, 특히 상당량으로 전신 존재가 요망되거나 또는 필요하다면, 바람직하다.

RNA 전달 시스템은 고유한 간 선호성을 가진다. 이는 지질-기반의 입자, 양이온성 및 중성 나노입자, 특히 지질 나노입자, 예를 들어 리포좀, 나노마이셀 및 바이오접합체 형태의 친지성 리간드와 관련있다. 간 축적은 간 혈관 구조 또는 지질 대사 (리포좀 및 지질 또는 콜레스테롤 접합체)의 불연속적인 특성에 의해 유발된다.

RNA를 간으로 생체내 전달하는 경우, 분해를 방지함으로써 RNA를 간으로 수송하기 위한 약물 전달 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)-코팅된 표면과 mRNA-함유성 코어로 구성되는 폴리플렉스 나노마이셀은, 나노마이셀이 생리학적 조건에서 우수한 생체내 RNA 안정성을 제공하므로, 유용한 시스템이다. 아울러, 조밀한 PEG 울타리로 구성된, 폴리플렉스 나노마이셀 표면에 의해 제공되는 잠행성 (stealth property)은 숙주 면역 방어를 효과적으로 회피한다.

간을 표적화하기에 적합한 면역자극제에 대한 예는 T 세포 증식 및/또는 유지에 참여하는 사이토카인이다. 적합한 사이토카인의 예로는 IL2 또는 IL7, 또는 이들의 단편 및 변이체, 그리고 이들 사이토카인, 단편 및 변이체의 융합 단백질이 있다.

다른 구현예로, 면역자극제를 암호화하는 RNA는 RNA를 림프계, 특히 2차 림프 기관, 보다 구체적으로는 비장으로 선호적으로 전달하기 위한 제형으로 투여할 수 있다. 면역자극제를 이러한 표적 조직으로 전달하는 것은, 특히 이러한 기관 또는 조직 내에 면역자극제의 존재가 요망되지만 (예를 들어, 면역 반응을 유발하기 위해, 특히 T 세포 감작 중에 사이토카인과 같은 면역자극제가 필요한 경우 또는 상주하는 면역 세포를 활성화하기 위해), (예를 들어 면역자극제가 전신 독성이 있어) 면역자극제가 전신에, 특히 상당량으로 존재하는 것은 요망되지 않는다면, 바람직하다.

적절한 면역자극제에 대한 예는 T 세포 감작에 참여하는 사이토카인이다. 적절한 사이토카인의 예로는 IL12, IL15, IFN-α 또는 IFN-β, 이들의 단편 및 변이체, 및 이들 사이토카인, 단편 및 변이체의 융합 단백질 등이 있다.

약학적 조성물

활성화 화합물을 암호화하는 RNA, 도킹 화합물을 암호화하는 RNA 및/또는 면역 작동자 세포 등의 본원에 기술된 물질은 약학적 조성물 또는 의약제로 투여할 수 있으며, 임의의 적합한 약학적 조성물의 형태로 투여할 수 있다.

본 발명의 모든 측면들에 대한 일 구현예에서, 본원에 기술된 구성성분은, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고 선택적으로 하나 이상의 보강제, 안정화제 등을 포함할 수 있는, 약학적 조성물 형태로 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 치료학적 또는 예방학적 치료를 위한 것이며, 예를 들어 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다.

용어 "약학적 조성물"은 치료학적으로 유효한 물질을, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함하는 제형에 관한 것이다. 이러한 약학적 조성물은, 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 질환 또는 장애를 치료하거나, 방지하거나 또는 중증도를 낮추기 위해 이용 가능하다. 약학적 조성물은 또한 약학적 제형으로서 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 "약제학적 유효량"으로, "약제학적으로 허용가능한 조제물 (pharmaceutically acceptable preparation)"로 적용된다.

용어 "약제학적으로 허용가능한"은 물질이 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 무독성인 것을 의미한다.

용어 "약제학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 단독으로 또는 추가적인 투여 및/또는 물질과 더불어 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 특정 질환을 치료하는 경우, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 진행 저해를 의미하다. 이는 질환의 진행 속도를 늦추는 것을 포함하며, 구체적으로 질환의 진행을 중단시키거나 또는 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 원하는 반응은 또한 이러한 질환 또는 병태의 개시 지연 또는 개시 방지일 수 있다. 본 발명에 기술된 조성물의 유효량은 치료할 병태, 질환의 중증도, 나이, 생리학적 상태, 신체 크기와 체중 등의 환자의 개별 매개변수, 치료 기간, (존재하는 경우) 동반되는 요법의 유형, 구체적인 투여 경로 및 유사 인자에 따라 결정될 것이다. 따라서, 본 발명에 기술된 조성물의 투여 용량은 이러한 다양한 매개변수에 따라 결정될 수 있다. 환자에서 반응이 1차 투여로 충분하지 않을 경우, 이보다 고 용량 (또는 효과적으로는 다른, 보다 국지적인 투여 경로에 의해 달성되는 더 높은 용량)을 사용할 수 있다.

용어 "준-치료학적 용량 (sub-therapeutic dose)"은 전형적으로 치료학적 물질의 표준 치료학적 양 미만을 지칭하며, 원하는 효과를 위해 필요한 양이 약제학적 물질을 단독으로 사용하였을 경우보다 더 낮은 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "준-치료학적 용량"은 특정 약제학적 물질의 투여량 또는 양이 다른 화합물, 약물 또는 약제학적 물질이 없는 상태에서, 예를 들어 활성화 화합물이 없는 상태에서 원하는 약리학적 작용을 달성하기에 충분하지 않은 것을 의미한다. 이러한 원하는 약리학적 작용은 고형 종양의 완전한 또는 본질적으로 완전한 거부를 포괄할 수 있다. 준-치료학적 양 및 용량은 통상적으로 치료학적 투여량 또는 양의 약 10% 이상, 전형적으로 약 10% 이상, 및 전형적으로 약 75% 이하, 보다 전형적으로 약 60% 이하일 것이다. 통상적으로, 인간의 CAR T 세포 요법을 위해 (개체에서 생체내 구축 등의) 투여되는 면역 작동자 세포의 개수는 용량 당 약 10⁹ (1,33 x 10⁷/kg에 해당함) 또는 그 이상 (1.3 x 10⁷/kg에 해당함)이다. 아울러, 일부 치료학적 접근법은 CAR T 세포를 단기간 (예, 4주 미만) 반복 투여하여, 용량 증량에 의해 안전성을 개선하거나 및/또는 환자에서 유효한 T 세포의 개수를 유지하는 것을 포함한다. 이는 이 기간 내에 심지어 더 높은 "누적 용량"으로 이어진다. 따라서, 면역 작동자 세포의 "준-치료학적 용량"은 첫 용량 당 및/또는 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 21일, 적어도 28일 또는 심지어 더 긴 기간 동안, 10⁸ 또는 그 미만, 10⁷ 또는 그 미만, 10⁶ 또는 그 미만, 10⁵ 또는 그 미만, 10⁴ 또는 그 미만, 10³ 또는 그 미만 또는 심지어 더 낮은 수치의 이러한 세포의 양이다. 일 구현예에서, 항원 수용체를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포의 "준-치료학적 양"은 10⁸ 또는 그 미만, 10⁷ 또는 그 미만, 10⁶ 또는 그 미만, 10⁵ 또는 그 미만, 10⁴ 또는 그 미만, 10³ 또는 그 미만 또는 심지어 더 낮은 수치에 해당하는 양으로서 이러한 세포의 단일 용량을 언급한다. 용어 "연장된 시간"은 적어도 14일, 적어도 21일, 적어도 28일, 적어도 3개월, 적어도 6개월 또는 심지어 이보다 더 긴 기간을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 염, 완충제, 보존제, 그리고 선택적으로 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물에 사용하기 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 본 발명의 약학적 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분이 아닌 물질을 지칭한다. 부형제에 대한 예로는 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 계면활성제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 착향제 또는 착색제 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

용어 "희석제"는 희석하는 물질 및/또는 묽게 하는 물질을 의미한다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁물 및/또는 혼합 매질 중 어느 하나를 포함한다. 적합한 희석제에 대한 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물 등이 있다.

용어 "담체"는 약학적 조성물의 투여를 용이하게 하거나, 강화하거나 또는 투여를 수행할 수 있게 하기 위해 활성 성분과 조합되는 천연, 합성, 유기, 무기성일 수 있는 성분을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 담체는, 개체에 투여하기 적합한, 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 적합한 담체로는 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 등장성 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌, 특히, 생체적합한 락티드 폴리머, 락티드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 코폴리머 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 등장성 식염수를 포함한다.

치료학적 용도에서 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다.

약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도한 투여 경로 및 표준 약제학 실무에 따라 선택할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 기술된 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 진피내 또는 근육내로 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 국소 또는 전신 투여용으로 제형화된다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수를 수반하는 장 투여 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "비경구 투여"는 정맥내 주사 등의 위장관을 통해 이루어지는 것 이외의 다른 임의의 방식으로 투여하는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 근육내 투여용으로 제형화된다. 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 전신 투여용, 예를 들어 정맥내 투여용으로 제형화된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공동-투여"는 활성화 화합물을 암호화하는 RNA, 도킹 화합물을 암호화하는 RNA 및 선택적으로 면역 작동자 세포와 같은 여러가지 화합물 또는 조성물을 같은 환자에게 투여하는 방식을 의미한다. 여러가지 화합물 또는 조성물은 동시에, 본질적으로 동일 시기에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

치료

본원에 기술된 물질, 조성물 및 방법은 질환, 예를 들어 (제1 표적으로 작용할 수 있는) 항원을 발현하는 질병에 걸린 세포의 존재를 특징으로 하는 질환을 가진 개체를 치료하기 위해 이용할 수 있다. 특히 바람직한 질환은 암 질환이다. 예를 들어, 만일 항원이 바이러스로부터 유래한다면, 물질, 조성물 및 방법은 이러한 바이러스에 의해 유발된 바이러스 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 만일 항원이 종양 항원이라면, 물질, 조성물 및 방법은 암 세포가 이러한 종양 항원을 발현하는 암 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.

본원에 기술된 물질, 조성물 및 방법은 다양한 질환들을 치료학적으로 또는 예방학적으로 치료하는데 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 물질, 조성물 및 방법은 항원을 수반하는 질환을 치료학적으로 또는 예방학적으로 치료하는데 유용할 수 있다.

본원에 기술된 방법 및 물질은 구체적으로 도킹 화합물이 겨냥하는 항원, 예를 들어 종양 항원을 발현하는 질병에 걸린 세포를 특징으로 하는 질환을 치료하는데 유용하다. 세포는 도킹 화합물에 인지되기 위해 세포 표면 상에 항원을 발현한다. 방법은 항원을 발현하는 이러한 세포를 선택적으로 소거하기 위해 제공할 수 있으며, 따라서 항원을 발현하지 않는 정상 세포에 대한 유해 효과는 최소화한다. 도킹 화합물에의 결합을 통해 세포를 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포는 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에 투여함으로써 또는 개체에서 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 구축함으로써 등에 의해 개체에 제공된다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 면역 작동자 세포는 T 세포이다. 일 구현예에서, 면역 작동자 세포는 종양 또는 암을 겨냥한다. 일 구현예에서, 표적 세포 집단 또는 표적 조직은 종양 세포 또는 종양 조직, 특히 고형 종양이다. 일 구현예에서, 표적 항원 (제1 표적)은 종양 항원이다.

일 측면에서, 본 발명은 질환에 걸린 세포, 특히 종양 항원을 발현하는 암 세포와 같이 항원을 발현하는 세포를 표적화함으로써 질환을 치료하는 것을 망라한다. 일 구현예에서, 암 세포 또는 암 조직은 고형 암이다. 표적 세포는 세포 표면에 항원을 발현할 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 종양-관련 항원이고, 질환은 암이다. 이러한 치료는 항원을 발현하는 세포의 선택적인 소거를 제공하며, 따라서 항원을 발현하지 않는 정상적인 세포에 대한 유해 효과를 최소화한다.

일 구현예에서, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포는 준-치료학적 양으로 개체에 제공된다.

용어 "질환"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비-정상적인 상황을 지칭한다. 질환은 종종 특정 증상 및 징후와 관련있는 의학적인 상태로서 해석된다. 질환은 감염성 질환과 같은 외부 원인으로부터 기원한 인자에 의해 유발될 수 있거나, 또는 자가면역 질환과 같은 내부 기능부전에 의해 유발될 수도 있다. 인간에서, "질환"은 더 넒은 의미에서 개체와 접촉시 질병에 걸린 개체에서 통증, 기능부전, 괴로움, 사회적 문제 또는 사망 또는 비슷한 문제를 유발하는 임의의 상황을 지칭하기 위해 사용된다. 더 넓은 의미에서, 이는 때때로 상해, 불능, 장애, 증후군, 감염, 고립된 증상, 일탈 행위 및 구조적 및 기능적인 비정형성 변형을 포함하며, 다른 맥락 및 다른 목적에서, 이는 구분가능한 범주로 간주될 수 있다. 다수의 질환과 접촉 및 생활하는 것이 삶에 대한 관점과 개인의 성격을 바꿀 수 있으므로, 질병은 일반적으로 개체에 신체적으로뿐만 아니라 감정적으로도 영향을 미친다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료학적 개입"은 질환 또는 장애와 같은 병태를 퇴치할 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것을 의미한다. 이 용어는 증상 또는 합병증을 완화하거나, 질환, 장애 또는 병태의 진행을 지연시키거나, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감하거나, 및/또는 질환, 장애 또는 병태를 치유 또는 해소하거나, 아울러 병태를 방지하기 위해, 치료학적으로 유효한 화합물의 투여 등의, 병을 앓고 있는 개체로부터 소정의 병태에 대한 전 범위 치료를 포괄하는 것으로 의도되며, 이때 방지는 질환, 병태 또는 장애와 싸우기 위한 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것으로서 이해되어야 하며, 증상 또는 합병증의 개시를 방지하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.

용어 "치료학적 치료"는 개체의 건강 상태를 개선하거나 및/또는 개체의 수명을 연장하는(늘리는) 임의의 치료를 의미한다. 이러한 치료는 개체에서 질환의 소거, 개체에서 질환 진행의 정지 또는 서행, 개체에서 질환 진행의 저해 또는 서행, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도 감소, 및/또는 질환을 현재 앓고 있거나 이전에 걸린 적 있는 개체에서 재발 감소일 수 있다.

용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 개체에서 질환 발생을 방지하고자 의도하는 모든 처치를 의미한다. 용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.

용어 "대상" 및 "개체"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는, 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)에 걸릴 수 있거나 또는 취약할 수 있으나, 질환 또는 장애에 걸렸거나 또는 걸리지 않았을 수 있는, 인간 또는 기타 포유류 (예, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 의미한다. 다수의 구현예들에서, 개체는 인간이다. 달리 명시되지 않은 한, 용어 "개인" 및 "개체"는 특정 연령을 지정하지 않으며, 따라서 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 망라한다. 본 발명의 구현예에서, "개인" 또는 "개체"는 "환자"이다.

용어 "환자"는 치료하고자 하는 개인 또는 개체, 구체적으로 질환에 걸린 개인 또는 개체를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에서, 목표는 종양 항원을 발현하는 암 세포 등의 항원을 발현하는 질환에 걸린 세포에 (화합물 및 세포 등의) 약제학적으로 활성인 물질을 전달하여, 종양 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 수반하는 암 질환과 같은 질환을 치료하고자 하는 것이다.

용어 "항원을 수반하는 질환", "항원을 발현하는 세포를 수반하는 질환" 또는 이와 비슷한 표현은 항원이 연루된 임의 질환, 예를 들어 항원의 존재를 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 항원을 수반하는 질환은 감염성 질환 또는 암 질환 또는 간단히 암일 수 있다. 전술한 바와 같이, 항원은 질환-관련 항원, 예를 들어, 종양-관련 항원, 바이러스 항원 또는 세균성 항원일 수 있다. 일 구현예에서, 항원을 수반하는 질환은 항원을, 바람직하게는 세포 표면 상에 발현하는 세포를 수반하는 질환이다.

용어 "감염성 질환"은 개체에서 개체로 또는 유기체에서 유기체로 전파될 수 있으며, 미생물 물질에 의해 유발되는 (예, 감기) 임의 질환을 지칭한다. 감염성 질환은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 바이러스, 박테리아 및 기생충에 의해 각각 유발되는 바이러스성 질환, 박테리아성 질환 또는 기생충 질환을 포함한다. 이런 점에서, 감염성 질환은, 예를 들어, 간염, 성 접촉에 의해 전파되는 질환 (예, 클라미디아 또는 임질), 결핵, HIV/후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 디프테리아, B형 간염, C형 간염, 콜레라, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS), 조류 독감 및 인플루엔자일 수 있다.

용어 "암 질환" 또는 "암"은 개체에서 전형적으로 통제를 벗어난 세포 증식을 특징으로 하는 병리학적 병태를 지칭하거나 또는 이를 의미한다. 암에 대한 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 이러한 암에 대한 예로는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성 및 생식 기관의 암종, 호지킨 질환, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 신경외배엽 암, 척추 종양, 신경교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 용어 "암"은 암 전이를 또한 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "고형 종양" 또는 "고형 암"은 당해 기술 분야에, 예를 들어 Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition에서 잘 알려져 있는 바와 같이 암 덩어리의 출현을 의미한다. 바람직하게는, 이 용어는 혈액 이외의 다른 신체 조직, 바람직하게는 혈액, 골수 및 림프계 이외의 다른 조직의 암 또는 암종을 의미한다. 예를 들어, 비-제한적으로, 고형 종양은 전립선, 폐암, 결장직장 조직, 방광, 구인두/후두 조직, 신장, 유방, 자궁내막, 난소, 경부, 위, 췌장, 뇌 및 중추 신경계의 암을 포함한다.

본원에 기술된 방법 및 물질은 특히 도킹 화합물이 겨냥하는 항원을 발현하는 질환에 걸린 세포를 특징으로 하는, 암, 예를 들어 고형 암을 치료하는데 유용하다.

본 발명의 일 구현예에서, 목표는 종양 항원을 발현하는 암 세포와 같이 항원을 발현하는 질환에 걸린 세포에 대항하여 면역 반응을 제공하고, 종양 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 수반한 암 질환과 같은 질환을 치료하고자 하는 것이다.

치료학적일 수 있거나 또는 부분적으로 또는 완전히 예방적일 수 있는 항원에 대항하여 면역 반응이 도출될 수 있다. 본원에 기술된 약학적 조성물은 면역 반응을 유도 또는 강화하기 위해 적용가능하다. 본원에 기술된 약학적 조성물은 따라서 항원을 수반한 질환에 대한 예방학적 및/또는 치료학적 치료에 유용하다.

본원에 사용된 바와 같이, "면역 반응"은 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대해 일체화된 신체 반응을 지칭하며, 이는 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 지칭한다.

"세포-매개 면역", "세포성 면역", "세포성 역 반응" 또는 유사 표현은 항원의 발현을 특징으로 하는, 클래스 I 또는 클래스 II MHC를 이용해 항원을 제시하는 것을 특징으로 하는, 세포에 대한 세포성 반응을 포함하는 것을 의미한다. 세포성 반응은 "헬퍼" 또는 "살상 세포"로서 작용하는 T 세포 또는 T 림프구를 지칭하는 세포에 관한 것이다. 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포로도 지칭됨)는 면역 반응을 조절함으로써 중추적인 역할을 수행하고, 살상 세포 (세포독성 T 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL로도 지칭됨)는 암 세포와 같이 질환에 걸린 세포를 살상하여, 질환에 걸린 세포가 더 많이 생기는 것을 방지한다.

본 발명은 보호적, 예방적, 예방학적 및/또는 치료학적일 수 있는 면역 반응을 고려한다. 본원에 사용된 바와 같이, "면역 반응을 유도한다 [또는 유도하는]"는 유도하기 전 특정 항원에 대한 면역 반응이 없다는 것을 의미할 수 있거나, 또는 유도하기 전 특정 항원에 대한 면역 반응이 기저 수준으로 존재하고 유도 후 강화되는 것을 의미할 수 있다. 따라서, "면역 반응을 유도한다 [또는 유도하는]"는 "면역 반응을 강화한다 [또는 강화하는]"를 포함한다.

용어 "대식 세포"는 단핵구 분화를 통해 생기는 식세포의 하위군을 지칭한다. 염증, 면역 사이토카인 또는 미생물 산물에 의해 활성화된 대식 세포는 비-특이적으로 탐식 작용을 수행하여, 수소분해성 및 산화성 공격에 의해 대식 세포 안의 외인성 병원체를 사멸시켜 병원체를 분해한다. 분해된 단백질로부터 유래한 펩타이드는 대식 세포의 세포 표면 상에 제시되고, 여기서 T 세포에 의해 인지될 수 있으며, B 세포 표면 상의 항체와 직접 상호작용하여, T 세포 및 B 세포를 활성화하고 면역 반응을 추가적으로 자극할 수 있다. 대식 세포는 항원-제시 세포 유형에 속한다. 일 구현예에서, 대식 세포는 비장 대식 세포이다.

용어 "수지상 세포" (DC)는 항원 제시 세포 유형에 속하는 식세포의 다른 하위종을 지칭한다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 조혈 골수 전구 세포로부터 유래한다. 이들 전구 세포는 먼저 미성숙 수지상 세포로 변환한다. 이들 미성숙 세포는 높은 탐식 활성과 낮은 T 세포 활성화 잠재성을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 바이러스 및 박테리아 등의 병원체에 대해 주변 환경을 계속적으로 샘플링한다. 미성숙 수지상 세포가 제시가능한 항원과 접촉하게 되면, 그 세포는 성숙한 수지상 세포로 활성화되어, 비장 또는 림프절로의 이동하게 된다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하여, 이의 단백질을 작은 조각으로 분해하고, 성숙화되면 이들 조각들을 MHC 분자를 이용해 세포 표면에 제시한다. 동시에, 이들 세포는 CH80, CH86 및 CH40과 같은 T 세포 활성화에서 공동-수용체로서 작용하는 세포-표면 수용체를 상향 조절하여, 이의 T 세포 활성화 능력을 크게 강화한다. 이들 세포는 또한 수지상 세포가 혈류를 통해 비장으로 이동하거나 또는 림프 시스템을 통해 림프절로 이동하게 유도하는 주화성 수용체인 CCR7을 상향 조절한다. 여기서, 이들 세포는 항원-제시 세포로 작용하며, 비-항원 특이적인 공동-자극 신호와 동시에, 헬퍼 T 세포 및 살상 T 세포뿐 아니라 항원 제시에 의해 B 세포를 활성화한다. 따라서, 수지상 세포는 T 세포-관련 면역 반응 또는 B 세포-관련 면역 반응을 활성적으로 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 비장의 수지상 세포이다.

용어 "항원 제시 세포" (APC)는 세포의 표면 상에 (또는 표면에) 하나 이상의 항원 또는 항원 단편을 나열, 획득 및/또는 제시할 수 있는 다양한 세포들 중 하나의 세포이다. 항원-제시 세포는 전문적 항원 제시 세포 및 비-전문적 항원 제시 세포로 구분될 수 있다.

용어 "전문적 항원 제시 세포"는 나이브 T 세포와의 상호작용에 필요한 주 조직적합성 복합체 클래스 II (MHC 클래스 II) 분자를 구성적으로 발현하는 항원 제시 세포이다. T 세포가 항원 제시 세포의 막 상에 MHC 클래스 II 분자 복합체와 상호작용하면, 항원 제시 세포는 T 세포의 활성화를 유도하는 공동-자극성 분자를 생산하게 된다. 전문적 항원 제시 세포는 수지상 세포 및 대식 세포를 포함한다.

용어 "비-전문적 항원 제시 세포"는 MHC 클래스 II 분자를 구성적으로 발현하진 않지만 인터페론-γ와 같은 특정 사이토카인에 의한 자극시 발현하는 항원 제시 세포를 지칭한다. 예를 들어, 비-전문적 항원 제시 세포는 섬유모세포, 흉선 상피 세포, 갑상선 상피 세포, 신경교 세포, 췌장 베타 세포 또는 혈관 내피 세포를 포함한다.

"항원 가공 처리"는 항원을 가공 처리 산물로 분해하는 것을 의미하며, 처리 산물은 항원의 단편 (예, 단백질의 펩타이드로의 분해) 및 특정 T 세포에 대한 항원 제시 세포와 같이 세포에 의해 제시하기 위한 MHC 분자와 이들 하나 이상의 단편의 (예, 결합을 통한) 조합물이다.

본원에 참조된 문헌 및 실험에 대한 인용은 임의의 전술한 내용이 선행 기술 분야와 관련 있다는 인정으로서 의도되는 것은 아니다. 이들 문헌의 내용에 대한 모든 언급은 출원인이 이용가능한 정보를 기반으로 하며, 이들 문헌의 내용에 대한 정확성에 관한 어떠한 인정으로도 간주되지 않는다.

후술한 내용은 당해 기술 분야의 당업자가 다양한 구현예들을 구성 및 이용할 수 있게 하기 위해 제공된다. 구체적인 장치, 기법 및 이용에 관한 설명은 단지 예로서 제공된다. 본 발명에 기술된 예에 대한 다양한 변형들이 당해 기술 분야의 당업자들에게 용이하게 자명할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 다양한 구현예들의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 다른 예 및 활용으로 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예들은 본 발명에 기술된 예들로 한정하고자 하는 것은 아니며, 청구항과 일치하는 범위에 부합하는 것으로 의도된다.

실시예

mRNA 구조체

모든 구조체는 아래 기술한 서열 인자들을 포함하거나 또는 암호화하는 유전자 합성에 의해 제작하였다:

서열 인자들

영역	nt-서열	서열번호	aa-서열	서열번호
IgG-리더	ATGGACTGGATCTGGCGAATACTGTTTCTGGTGGGAGCCGCCACTGGGGCCCATTCT	35	MDWIWRILFLVGAATGAHS	10
ALFA	CCTAGCAGGCTGGAGGAGGAACTCCGCAGACGGCTGACCGAACCC	36	PSRLEEELRRRLTEP	11
인간 CD8 힌지	ACTACTACCCCAGCACCTAGACCGCCTACACCCGCACCCACTATCGCGTCTCAGCCCTTGAGTCTGCGGCCCGAGGCTTGTCGGCCCGCAGCTGGCGGGGCTGTGCATACCCGAGGACTCGACTTTGCATGCGACATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCCGGCACTTGCGGCGTCCTTCTTCTGAGTCTGGTCATAACGTTGTATTGC	37	TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC	12
인간 4-1BB 도메인	AAACGGGGCAGGAAGAAACTGCTGTATATCTTCAAGCAGCCTTTCATGCGCCCAGTTCAGACCACTCAGGAGGAGGATGGGTGTTCCTGTCGTTTCCCTGAGGAAGAAGAAGGCGGGTGCGAATTG	38	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL	13
인간 CD3 zeta 도메인	AGGGTCAAGTTTAGCCGATCAGCTGACGCCCCTGCTTACAAACAGGGGCAAAATCAGCTTTACAATGAGCTGAACCTCGGGCGTAGAGAGGAGTACGACGTGTTGGACAAGCGCAGAGGGAGAGATCCCGAGATGGGCGGCAAACCAAGACGCAAGAATCCCCAAGAAGGCCTCTACAACGAGCTGCAGAAGGATAAAATGGCCGAAGCCTATAGCGAGATTGGCATGAAAGGAGAACGGAGGAGAGGGAAAGGTCACGATGGACTCTACCAAGGCCTGAGCACAGCTACCAAAGACACGTATGATGCCTTGCACATGCAAGCACTGCCACCCAGGTAG	39	RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*	14
G4S-링커	GGAGGAGGCGGGAGC	40	GGGGS	15
TNFL9 (전체 서열)	ATGGAGTATGCTAGCGATGCCTCTCTGGACCCGGAAGCTCCATGGCCACCAGCTCCTAGGGCTCGCGCTTGCCGTGTGCTTCCTTGGGCCCTGGTGGCTGGCCTCCTGTTGCTGCTGCTGCTGGCTGCCGCATGCGCTGTGTTCCTCGCCTGTCCATGGGCGGTAAGTGGCGCGAGAGCCTCTCCTGGTTCAGCCGCATCACCGAGGCTGAGGGAAGGGCCAGAGCTTAGCCCCGATGACCCTGCTGGGTTGCTCGACCTGAGACAGGGGATGTTTGCCCAGTTGGTAGCGCAGAACGTGCTGCTGATCGACGGTCCCTTGAGCTGGTATTCCGATCCCGGTCTTGCCGGAGTCAGCCTCACTGGCGGCCTGAGTTACAAGGAGGACACCAAGGAACTGGTGGTTGCCAAAGCCGGTGTCTACTACGTGTTCTTCCAGCTCGAACTCAGGCGCGTGGTTGCAGGAGAGGGGTCAGGCTCTGTGAGTCTTGCCCTTCATCTCCAGCCCCTGAGAAGCGCAGCCGGAGCCGCTGCACTGGCGCTGACCGTGGATCTCCCACCCGCCTCCTCCGAAGCCCGCAATAGCGCTTTTGGCTTCCAAGGGCGACTGTTGCACCTGTCTGCAGGCCAACGGCTGGGAGTCCATCTGCACACGGAGGCCAGAGCACGACACGCATGGCAGCTGACACAGGGAGCCACTGTCCTGGGACTGTTTCGGGTTACACCCGAGATTCCTGCAGGCCTTCCCTCCCCTCGGTCCGAG	41	MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE	16
인간 sec 신호	ATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC	42	MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS	17
(EA3K)3 링커	GAGGCGGCAGCTAAGGAAGCTGCTGCTAAAGAGGCTGCGGCTAAG	43	EAAAKEAAAKEAAAK	18
GPI 앵커 (인간 CD55)	CCAAATAAAGGAAGTGGAACCACTTCAGGTACTACCCGTCTTCTATCTGGGCACACGTGTTTCACGTTGACAGGTTTGCTTGGGACGCTAGTAACCATGGGCTTGCTGACTTGA	44	PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT	19
IgG-리더2	ATGGATTGGACTTGGCGGGTCTTTTGCCTGTTAGCAGTGGCCCCCGGCGCTCATAGC	45	MDWTWRVFCLLAVAPGAHS	20
GS-링커2	GGAGGAGGCGGGAGCGGCGGGGGTAGT	46	GGGGSGGGGS	21
aCLDN6 VH	GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCAGGGCCGGAACTGGTGAAACCCGGCGCTAGCATGAAGATCTCCTGTAAGGCGAGCGGGTATTCCTTTACCGGCTACACCATGAACTGGGTTAAGCAATCTCACGGCAAGAACCTTGAGTGGATAGGACTCATTAATCCTTACAATGGCGGCACAATCTACAACCAGAAGTTCAAAGGCAAAGCAACCCTTACCGTGGACAAGAGCAGCTCTACAGCCTATATGGAGCTGCTCTCACTGACGTCCGAGGATAGCGCAGTGTACTATTGTGCGCGGGATTACGGGTTTGTGCTGGATTATTGGGGACAGGGCACCACACTGACCGTAAGCAGT	47	EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGFVLDYWGQGTTLTVSS	22
aCLDN6 VL	GACATTGTCCTGACACAGAGTCCATCCATTATGAGCGTGAGTCCTGGTGAAAAGGTTACAATCACCTGCAGTGCAAGCTCATCAGTGTCTTACATGCATTGGTTTCAGCAGAAGCCGGGAACTTCTCCTAAGCTGAGCATCTACTCTACGAGCAATCTCGCCTCTGGTGTCCCAGCGAGGTTCTCAGGACGCGGGTCCGGGACTTCCTATTCCCTCACAATTTCCAGGGTAGCCGCTGAAGATGCTGCCACCTATTATTGCCAACAGCGCAGCAACTACCCACCCTGGACATTCGGTGGTGGAACAAAACTGGAGATTAAGCGGTCCGACCCAGCC	48	DIVLTQSPSIMSVSPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLSIYSTSNLASGVPARFSGRGSGTSYSLTISRVAAEDAATYYCQQRSNYPPWTFGGGTKLEIKRSDPA	23
GS-링커3	GGAGGCGGTGGAAGTGGCGGTGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGATCT	49	GGGGSGGGGSGGGGS	24
GS-링커4	GGCGGCTCT	50	GGS	25
His-Tag	CACCACCACCACCATCAT	51	HHHHHH	26

하기 실시예에 사용할 구축물에 의해 암호화된 단백질은 다음과 같다:

명칭	서열	서열번호 구성	서열번호
리더-ALFA-CD8h-BBz-CAR	MDWIWRILFLVGAATGAHSPSRLEEELRRRLTEP TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	10, 11, 12, 13, 14	27
리더-ALFA-G4S-CD8h-BBz-CAR	MDWIWRILFLVGAATGAHSPSRLEEELRRRLTEP GGGGS TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	10, 11, 15, 12, 13, 14	28
리더-VHH(aALFA)-CD8h-BBz-CAR	MDWIWRILFLVGAATGAHSEVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	10, 9, 12, 13, 14	29
리더-VHH(aALFA)-G4S-CD8h-BBz-CAR	MDWIWRILFLVGAATGAHSEVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS GGGGS TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	10, 9, 15, 12, 13, 14	30
TNFL9-ALFA	MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEPSRLEEELRRRLTE	16, 11	31
hu-sec-ALFA-(EA3K)3-GPI	MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGSSRLEEELRRRLTEP EAAAKEAAAKEAAAK PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT	17, 5, Pro, 18, 19	32
hu-sec-VHH(aALFA)-(EA3K)3-GPI	MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSSEAAAKEAAAKEAAAK PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT	17, 9, 18, 19	33
리더2-ALFA-VH/VL(aCLDN6)-His	MDWTWRVFCLLAVAPGAHS PSRLEEELRRRLTEP GGGSGGGS EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGFVLDYWGQGTTLTVSS GGGSGGGSGGGS DIVLTQSPSIMSVSPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLSIYSTSNLASGVPARFSGRGSGTSYSLTISRVAAEDAATYYCQQRSNYPPWTFGGGTKLEIKRSDPA GGS HHHHHH	20, 11, 21, 22, 24, 23, 25, 26	34

실시예 1: 범용 CART 방식.

도 1에 예시된 본 실시예에서, CAR-T 세포는 캐처 (catcher)를 키메라 항원 수용체의 힌지, 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 인지 도메인으로서 융합하여, 구축된다. 단가를 낮추고 신속한 환자 공급을 가능하게 하기 위해, 동종이계 CART 세포가 이런 목적에 바람직하며, 이는 αβ T-세포 고갈의 유전자 조작과 같은 확립된 방법을 통해 구축할 수 있다. 제너릭 CAR-T 세포는, 본 출원인에 의해 최근 발표된 CARVAC 방식 (Reinhard et al., 2020)을 토대로 막-고정된 단백질 도메인에 융합된 CAR-특이적인 태그를 암호화하는 mRNA의 리포솜 제형을 통해, 증폭될 수 있는 환자에게 투여된다. 제2 성분으로서, 종양-특이적인 표적화 리간드, 예를 들어 항-CLDN6 scFv가 태그 서열과 융합되어, 지질 나노입자로 캡슐화된 RNA로서 환자에 투여된다. 지질 나노입자는 간 세포에 의해 흡수된 다음 이중 특이성 융합 단백질이 발현되어 혈류로 분비된다. 표적화 리간드가 종양 부위에서 축적되고, 최종적으로 제너릭 CAR-T 세포가 결합하여 종양-세포 사멸을 매개할 수 있다. 기술된 공정은 이론적으로는 여러가지 종양 항원들에 보편적으로 적용가능하며, 원칙적으로는 효능을 강화할 것이며, 또한 여러가지 표적화 리간드를 암호화하는 RNA 혼합물을 제공함으로써 수종의 항원을 동시에 표적화할 수 있을 것이다. 이러한 방식의 또 다른 주요 이점은 CAR-T 세포가 표적화 리간드 부재시 안전하게 잔류한다는 것이다. 이로써, 모든 종양 세포가 제거된 경우에도 CAR-T 세포의 고갈 없이 요법을 멈출 수 있으며, 동시에 종양이 재발된 경우 동일한 또는 다른 표적화 리간드를 이용하여 요법을 계속할 수 있는 옵션을 제공해준다.

실시예 2: Jurkat 세포에서 모듈형 CAR-T

Jurkat T 세포를 모듈형 CAR을 암호화하는 mRNA를 가지도록 조작하고, 24시간 후 유세포 측정에 의해 분석하였다. 핵산으로 형질감염된 세포에 의해 용해성 모듈형 CAR 어댑터를 생산하였다. 모듈형 CAR Jurkat 세포를 1 또는 10 nM 용해성 어댑터로 무장시키고, 모듈형 CAR 상의 어댑터의 결합을 검출하기 위해 어댑터-특이 항체 (aCLDN6 항체에 대한 항-이디오타입 항체)를 사용해 대조 염색하였다. 어댑터-결합된 CAR을 유세포 측정 방법을 이용해 검출하였다. 모의 Jurkat 세포 (mRNA 비-형질감염)는 세포 표면에서 어댑터 모이어티가 검출되지 않는 대조군으로 이용하였다. 어댑터는 모듈형 CAR (VHH(aALFA)-G4S-CAR, 서열번호 30)을 발현하도록 변형된 T 세포 계열의 표면에서 검출되었다. 사용한 용량 범위는, 모듈형 CAR-T 세포가 어댑터에 저 용량 (1nM, 어댑터 결합성 세포에 대한 %)에서도 효율적으로 결합할 수 있으며, 결합 강도 (MFI)가 어댑터의 용량 증가에 따라 증가할 수 있음을 보여준다. 본 실험에서는 ALFA-VH-VL 어댑터 형태 (서열번호 34)를 이용하였다. 도 2는 CAR과 어댑터의 조립을 보여준다.

실시예 3: 일차 세포에서 모듈형 CAR-T

일차 인간 T 세포를 CD3 작용제 항체를 이용해 5일에 걸쳐 활성화한 다음 모듈형 CAR을 암호화하는 mRNA (VHH(aALFA)-G4S-CAR, 서열번호 30)로 형질감염하였다. 24시간 후 표지된 ALFA 펩타이드를 사용해 CAR 분자를 염색하였다. 유세포 측정 방법으로 발현을 검출하였다. 도 3은 CAR이 일차 인간 T 세포에서 잘 발현됨 (39.5%)을 보여준다.

병행하여, 전술한 바와 같이 활성화하여 형질감염한 일차 세포를 핵산으로 형질감염된 세포에 의해 생성된 100 nM 용해성 어댑터로 무장한 다음 24시간 후 어댑터-특이적인 항체로 염색하였다. CAR-결합된 어댑터의 %를 유세포 측정 방법으로 평가하였다. 어댑터는 조작된 일차 인간 T 세포의 표면에 발현된 모듈형 CAR에 결합하였다 (어댑터 100 nM의 경우 12.4%). 본 실험에서는 ALFA-VH-VL-His-태그 어댑터 형태 (서열번호 34)를 사용하였다. 도 4는 모듈형 CAR이 조립되었음을 보여준다. 도 2와 비교해 어댑터의 더 낮은 검출 결과는 태그 2종에 의해 둘러싸인 VH-VL 도메인의 접근성으로 인한 것이다.

실시예 4: 모듈형 CAR-T 세포는 종양 세포의 세포용해를 매개한다.

항원 양성의 종양 세포를 E-플레이트 (ACEA)에 접종하여, 공-배양하기 전 24시간 동안 인큐베이션하였다. 모듈형 CAR을 발현하도록 조작된 (도 3 참조), 활성화된 일차 인간 T 세포를, 형질감염 후 24시간 동안 핵산으로 형질감염 세포에 의해 생성된 10 nM 또는 100 nM 용해성 어댑터로 무장하였다. 무장한 모듈형 CAR-T 세포를 종양 세포와 작동자:표적 10:1 비율로 공-배양하였다. 비-무장한 모듈형 CAR-T 세포를 음성 대조군으로 이용하였다. 24시간 후 xCELLigence 시스템에서 임피던스-기반의 방법을 이용해 27시간 동안 종양 세포의 세포용해를 평가하였다. 세포독성은 mRNA 비-형질감염 T 세포에 대해 표준화하고, 트리톤-X로 달성된 최대 세포용해에 대하여 계산하였다.

비-무장한 모듈형 CAR-T 세포는 항원을 발현하는 종양 세포의 세포독성 세포용해를 유도하지 못하였다. 어댑터로 무장된 모듈형 CAR-T 세포는 강한 세포용해 활성을 촉진하였다. 도 5는 어댑터 용량 의존적인 방식의 종양 세포의 살상을 도시한다.

실시예 5: 범용 ALFA- 펩타이드를 함유한 mRNA 형질감염됨 iDC에 의해 유발된 모듈형 CAR-T 세포의 증식

GM-CSF 및 IL-4에 의해 CD14 양성 세포로부터 인간 미성숙 수지상 세포 (iDC)를 분화시켰다. iDC를 막 고정된 결합 모이어티 (CARVac)를 암호화하는 mRNA로 형질감염하였다. 자가 T 세포를 모듈형 CAR을 암호화하는 mRNA로 형질감염한 다음 증식 염료 브릴리언트 바이올렛으로 염색하였다. 모듈형 CAR-T 세포와 CARVac를 발현하는 iDC를 작동자:표적 10:1의 비율로 4일간 공-배양하였다. 모듈형 CAR-T 세포 증식을 유세포 측정 방법을 이용한 딸 세대 대비 증식 염료의 감소에 의해 분석하였다. 모의 mRNA 형질감염한 iDC를 음성 대조군 (대조군)으로 이용하였다. 도 6 A 및 B에서, iDC 상에 발현된 막에 고정된 결합 모이어티는 ALFA 펩타이드를 포함하고, CAR은 항-ALFA VHH를 포함한다. 도 6C 및 D에서, iDC 상에 발현된 막에 고정된 결합 모이어티는 항-ALFA VHH를 포함하고, CAR은 ALFA 펩타이드를 포함한다.

모듈형 CAR-T 세포는 대조군 iDC에 대해서는 증식하지 않았지만, VHH(aALFA) CAR (서열번호 30) T 세포뿐 아니라 시밀러 VHH(aALFA)PE-CAR은 ALFA-펩타이드를 함유한 CARVac 구조체에 대해 현저한 증식을 나타내었다 (도 6 A & B). 여기서, 모듈형 CAR의 표적은, 항원 제시 세포의 표면에서 막관통 고정을 위한 2종의 서로 다른 스캐폴드, 즉 TNFL9 앵커 (서열번호 31) 또는 (EA3K)GPI 앵커 (서열번호 32)를 이용해 발현시켰다. 도 6 C & D에서, 모듈형 CAR (서열번호 27 및 28)은 VHH를 함유한 iDC 제시 구조체 (서열번호 33)에 대항하여 현저한 증식을 촉진하였다.

실시예 6: CD19 특이적인 어댑터가 탑재된 모듈형 ALFA CAR-T는 CD19 형질감염된 iDC 또는 일차 인간 B 세포에 대항하여 증식을 매개한다.

ALFA CAR을 발현하도록 인간 일차 T 세포를 조작한 다음 증식 염료 브릴리언트 바이올렛으로 표지하였다. 그 후, 이를 일차 인간 B 세포 (좌측) 또는 CD19를 암호화하는 mRNA로 형질감염된 자가 iDC와 4일간 핵산으로 조작된 생산 세포로부터 생성된 0, 1 또는 10 nM 어댑터 (nbALFA/VHH(aALFA)-antiCD19(FMC63))의 존재 하에, 공-배양하였다. B 세포의 경우, 작동자:표적 비율은 10:1, 1:1 내지 1:10로 다양하게 하였다. 표적 세포로서 iDC의 경우, 적용한 E:T 비율은 10:1이었다. 증식성 CAR-T 세포의 빈도를 유세포 측정에 의해 획득 및 분석하여 나타낸다.

도 7에서 관찰된 바와 같이, 조작된 ALFA-CAR T 세포의 증식에는 CD19를 발현하는 표적 세포뿐 아니라 어댑터의 존재도 필요하였다.

본 실시예에서 어댑터는 scFv 항원 결합 도메인에 연결된 VHH(aALFA) 항원 결합 도메인으로 구성하였다.

SEQUENCE LISTING <110> BioNTech Cell & Gene Therapies GmbH <120> AGENTS AND METHODS FOR ACTIVATION AND TARGETING OF IMMUNE EFFECTOR CELLS <130> 674-381 PCT3 <150> PCT/EP2021/065290 <151> 2021-06-08 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR <400> 1 aacuaguauu cuucuggucc ccacagacuc agagagaacc cgccacc 47 <210> 2 <211> 311 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR <400> 2 cucgagagcu cgcuuucuug cuguccaauu ucuauuaaag guuccuuugu ucccuaaguc 60 caacuacuaa acugggggau auuaugaagg gccuugagca ucuggauucu gccuaauaaa 120 aaacauuuau uuucauugcu gcgucgagag cucgcuuucu ugcuguccaa uuucuauuaa 180 agguuccuuu guucccuaag uccaacuacu aaacuggggg auauuaugaa gggccuugag 240 caucuggauu cugccuaaua aaaaacauuu auuuucauug cugcgucgag accuggucca 300 gagucgcuag c 311 <210> 3 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR <400> 3 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uccuggguac cccgagucuc 60 ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 4 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A30L70 <400> 4 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcauaugacu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 110 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope tag <400> 5 Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 6 Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 7 Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 8 Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> 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Human CD8 hinge <400> 12 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr Leu Tyr Cys 65 <210> 13 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 41-BB domain <400> 13 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD3 zeta domain <400> 14 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 16 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFL9 (full sequence) <400> 16 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 17 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human sec signal <400> 17 Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser 20 25 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 18 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala 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Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aCLDN6 VL <400> 23 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala 100 105 110 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 25 Gly Gly Ser 1 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-Tag <400> 26 His His His His His His 1 5 <210> 27 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR construct <400> 27 Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr 20 25 30 Glu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 35 40 45 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 50 55 60 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 65 70 75 80 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 85 90 95 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 100 105 110 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 115 120 125 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 130 135 140 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln 145 150 155 160 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 165 170 175 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 180 185 190 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 195 200 205 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 210 215 220 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 225 230 235 240 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 245 250 255 Arg <210> 28 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR construct <400> 28 Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr 20 25 30 Glu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 35 40 45 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 50 55 60 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 65 70 75 80 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 85 90 95 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 100 105 110 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 115 120 125 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 130 135 140 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 145 150 155 160 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 165 170 175 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 180 185 190 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 195 200 205 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 210 215 220 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 245 250 255 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 260 <210> 29 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR construct <400> 29 Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Glu Val Gln 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15 Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser Ser Arg Leu Glu Glu Glu 20 25 30 Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala 35 40 45 Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser 50 55 60 Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly 65 70 75 80 Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr 85 90 <210> 33 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Activation compound <400> 33 Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 35 40 45 Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly 50 55 60 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg Val Met Val Ala Ala Val 65 70 75 80 Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu Ser Val Gln Gly Arg Phe 85 90 95 Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met Val Ser Leu Gln Met Asp 100 105 110 Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Val Leu Glu 115 120 125 Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 130 135 140 Thr Val Ser Ser Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 145 150 155 160 Ala Ala Lys Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg 165 170 175 Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr 180 185 190 Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr 195 200 <210> 34 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Docketing compound <400> 34 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr 20 25 30 Glu Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln 35 40 45 Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys 50 55 60 Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys 65 70 75 80 Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr 85 90 95 Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu 100 105 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ccactggggc ccattct 57 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALFA <400> 36 cctagcaggc tggaggagga actccgcaga cggctgaccg aaccc 45 <210> 37 <211> 207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD8 hinge <400> 37 actactaccc cagcacctag accgcctaca cccgcaccca ctatcgcgtc tcagcccttg 60 agtctgcggc ccgaggcttg tcggcccgca gctggcgggg ctgtgcatac ccgaggactc 120 gactttgcat gcgacatcta catttgggcc cctctggccg gcacttgcgg cgtccttctt 180 ctgagtctgg tcataacgtt gtattgc 207 <210> 38 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 41-BB domain <400> 38 aaacggggca ggaagaaact gctgtatatc ttcaagcagc ctttcatgcg cccagttcag 60 accactcagg aggaggatgg gtgttcctgt cgtttccctg aggaagaaga aggcgggtgc 120 gaattg 126 <210> 39 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD3 zeta domain <400> 39 agggtcaagt ttagccgatc agctgacgcc cctgcttaca aacaggggca aaatcagctt 60 tacaatgagc tgaacctcgg gcgtagagag gagtacgacg tgttggacaa gcgcagaggg 120 agagatcccg agatgggcgg caaaccaaga cgcaagaatc cccaagaagg cctctacaac 180 gagctgcaga aggataaaat ggccgaagcc tatagcgaga ttggcatgaa aggagaacgg 240 aggagaggga aaggtcacga tggactctac caaggcctga gcacagctac caaagacacg 300 tatgatgcct tgcacatgca agcactgcca cccaggtag 339 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 40 ggaggaggcg ggagc 15 <210> 41 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFL9 (full sequence) <400> 41 atggagtatg ctagcgatgc ctctctggac ccggaagctc catggccacc agctcctagg 60 gctcgcgctt gccgtgtgct tccttgggcc ctggtggctg gcctcctgtt gctgctgctg 120 ctggctgccg catgcgctgt gttcctcgcc tgtccatggg cggtaagtgg cgcgagagcc 180 tctcctggtt cagccgcatc accgaggctg agggaagggc cagagcttag ccccgatgac 240 cctgctgggt tgctcgacct gagacagggg atgtttgccc agttggtagc gcagaacgtg 300 ctgctgatcg acggtccctt gagctggtat tccgatcccg gtcttgccgg agtcagcctc 360 actggcggcc tgagttacaa ggaggacacc aaggaactgg tggttgccaa agccggtgtc 420 tactacgtgt tcttccagct cgaactcagg cgcgtggttg caggagaggg gtcaggctct 480 gtgagtcttg cccttcatct ccagcccctg agaagcgcag ccggagccgc tgcactggcg 540 ctgaccgtgg atctcccacc cgcctcctcc gaagcccgca atagcgcttt tggcttccaa 600 gggcgactgt tgcacctgtc tgcaggccaa cggctgggag tccatctgca cacggaggcc 660 agagcacgac acgcatggca gctgacacag ggagccactg tcctgggact gtttcgggtt 720 acacccgaga ttcctgcagg ccttccctcc cctcggtccg ag 762 <210> 42 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human sec signal <400> 42 atgagagtga tggcccccag aaccctgatc ctgctgctgt ctggcgccct ggccctgaca 60 gagacatggg ccggaagc 78 <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 43 gaggcggcag ctaaggaagc tgctgctaaa gaggctgcgg ctaag 45 <210> 44 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPI Anchor (human CD55) <400> 44 ccaaataaag gaagtggaac cacttcaggt actacccgtc ttctatctgg gcacacgtgt 60 ttcacgttga caggtttgct tgggacgcta gtaaccatgg gcttgctgac ttga 114 <210> 45 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-Leader <400> 45 atggattgga cttggcgggt 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tttccagggt agccgctgaa 240 gatgctgcca cctattattg ccaacagcgc agcaactacc caccctggac attcggtggt 300 ggaacaaaac tggagattaa gcggtccgac ccagcc 336 <210> 49 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 49 ggaggcggtg gaagtggcgg tggagggtca ggaggtggtg gatct 45 <210> 50 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 50 ggcggctct 9 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His-Tag <400> 51 caccaccacc accatcat 18

Claims (45)

1. 하기 단계를 포함하는, 표적 항원을 발현하는 세포를 특징으로 하는 질환, 장애 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법:
   (i) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에 제공하는 단계;
   (ii) CAR에 대한 결합 모이어티를 포함하는 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 RNA를 개체에 투여하는 단계;
   (iii) 개체에서 항원 제시 세포에 의해 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 발현되어, CAR에 대한 결합 모이어티가 면역 작동자 세포에 의한 결합에 이용 가능해지고, 이러한 결합으로 면역 작동자 세포의 증폭이 이루어지는 단계;
   (iv) 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 RNA를 개체에 투여하는 단계로서, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티와 CAR에 대한 결합 모이어티를 포함하는, 단계; 및
   (v) 개체에서 세포에 의해 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 발현되어, 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 표적 항원을 발현하는 세포와 결합하게 되고, CAR에 대한 결합 모이어티는 면역 작동자 세포에 의한 결합에 이용가능해지는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 제1 RNA로 형질감염되는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 RNA가 리포플렉스 입자 제형과 같은 미립자 제형으로 투여되는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포가 제2 RNA로 형질감염된, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 RNA는 지질 나노입자 제형과 같은 미립자 제형으로 투여되는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 상기 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 상기 항원 제시 세포에 부속된 형태로 발현하는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 막 펩타이드 또는 폴리펩타이드인, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 CAR에 대한 결합 모이어티 및 막 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 융합 단백질인, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 작동자 세포가 표적 항원을 발현하는 세포에 결합된 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합하면 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 살상이 이루어지는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포가 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 분비하는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포가 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 혈류로 분비되게 발현하는, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원이 세포 표면 항원인, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티 및 CAR에 대한 결합 모이어티의 융합 펩타이드 또는 폴리펩타이드인, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티가 항체 또는 항체 유도체를 포함하는, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR에 대한 결합 모이어티가 펩타이드 태그를 포함하는, 방법.
16. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 항체 또는 항체 유도체를 포함하는, 방법.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 유도체가 항체 단편인, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 개체에 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 개체에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 구축하는 것을 포함하는, 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 암인, 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원을 발현하는 세포가 질병에 걸린 세포인, 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원을 발현하는 세포가 암 세포인, 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원이 종양 항원인, 방법.
24. 하기 단계를 포함하는, 표적 항원을 발현하는 세포를 특징으로 하는 질환, 장애 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법:
    (i) 펩타이드 태그에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 개체에 제공하는 단계;
    (ii) 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 개체의 항원 제시 세포에서 발현되도록 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 RNA를 개체에 투여하는 단계로서, 상기 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 CAR이 결합하는 펩타이드 태그를 세포외 도메인에 포함하는 막 단백질인, 단계; 및
    (iii) 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 개체의 세포에서 발현 및 분비되도록 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 RNA를 개체에 투여하는 단계로서, 상기 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티와 CAR이 결합하는 펩타이드 태그를 포함하는, 단계.
25. 제24항에 있어서, 상기 면역 작동자 세포가 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합하면 면역 작동자 세포의 증폭이 이루어지는, 방법.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 면역 작동자 세포가 표적 항원에 결합된 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합하면 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 살상이 이루어지는, 방법.
27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 제1 RNA로 형질감염되는, 방법.
28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA가 리포플렉스 입자 제형과 같은 미립자 제형으로 투여되는, 방법.
29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포가 제2 RNA로 형질감염되는, 방법.
30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 RNA는 지질 나노입자 제형과 같은 미립자 제형으로 투여되는, 방법.
31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 항원 제시 세포에 부속된 형태로 발현하는, 방법.
32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 CAR이 결합하는 펩타이드 태그 및 막 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 융합 단백질인, 방법.
33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 혈류로 분비되는, 방법.
34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원이 세포 표면 항원인, 방법.
35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티 및 CAR이 결합하는 펩타이드 태그의 융합 펩타이드 또는 폴리펩타이드인, 방법.
36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티가 항체 또는 항체 유도체를 포함하는, 방법.
37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 항체 또는 항체 유도체를 포함하는, 방법.
38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 항체 유도체가 항체 단편인, 방법.
39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 개체에 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
40. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 개체에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포를 구축하는 것을 포함하는, 방법.
41. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 암인, 방법.
42. 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원을 발현하는 세포가 질병에 걸린 세포인, 방법.
43. 제24항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원을 발현하는 세포가 암 세포인, 방법.
44. 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원이 종양 항원인, 방법.
45. 하기를 포함하는, 키트:
    (i) 면역 작동자 세포를 펩타이드 태그에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형하기 위한 핵산, 또는 펩타이드 태그에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 면역 작동자 세포;
    (ii) CAR이 결합하는 펩타이드 태그를 세포외 도메인에 포함하는 막 단백질로서 제1 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 RNA, 또는 제1 RNA를 입수하기 위한 핵산; 및 선택적으로
    (iii) 표적 항원에 결합하는 결합 모이어티와 CAR이 결합하는 펩타이드 태그를 포함하는 제2 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 RNA, 또는 제2 RNA를 입수하기 위한 핵산.