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KR20240055073A - 클래스 ii, v형 crispr 시스템 - Google Patents

클래스 ii, v형 crispr 시스템 Download PDF

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Publication number
KR20240055073A
KR20240055073A KR1020247011373A KR20247011373A KR20240055073A KR 20240055073 A KR20240055073 A KR 20240055073A KR 1020247011373 A KR1020247011373 A KR 1020247011373A KR 20247011373 A KR20247011373 A KR 20247011373A KR 20240055073 A KR20240055073 A KR 20240055073A
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KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
endonuclease
engineered
nucleic acid
effector
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020247011373A
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Inventor
브라이언 씨 토마스
크리스토퍼 브라운
신디 카스텔
리사 알렉산더
릴리아나 곤잘레스-오소리오
카르네발리 폴라 마테우스
돔 카스탄조
Original Assignee
메타지노미, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메타지노미, 인크. filed Critical 메타지노미, 인크.
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Pending legal-status Critical Current

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Abstract

신규한 클래스 2, V형 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전자 편집에 유용한 미배양 미생물로부터 유래된 방법, 조성물, 및 시스템이 본원에 기술된다.

Description

클래스 II, V형 CRISPR 시스템
관련 출원
본 출원은, 각각 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는 PCT 출원 번호 PCT/US2021/021259 및 PCT 출원 번호 PCT/US2022/031849에 관한 것이다.
상호 참조
본 출원은 2021년 9월 8일자로 출원된, "클래스 II, V형 CRISPR 시스템(CLASS II, TYPE V CRISPR SYSTEMS)"으로 명명된 미국 가출원 제63/241,928호의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
Cas 효소는 이와 연관된 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)　가이드 리보 핵산(RNA)과 함께 원핵 면역 체계의 만연한(약 45%의 박테리아, 약 84%의 고세균) 구성요소인 것으로 보이는데, 이들은 CRISPR-RNA 가이드된 핵산 절단에 의해 비자기 핵산, 예컨대 감염성 바이러스 및 플라스미드에 대해 이러한 미생물을 보호하는 역할을 한다. CRISPR RNA 요소를 암호화하는 데옥시리보핵산(DNA) 요소는 구조 및 길이가 비교적 보존될 수 있지만, 이들의 CRISPR-연관(Cas) 단백질은 매우 다양하며, 매우 다양한 핵산-상호 작용 도메인을 함유한다. CRISPR DNA 요소는 1987년 초에 관찰되었지만, CRISPR/Cas 복합체의 프로그램 가능한 엔도뉴클레아제 절단 능력은 비교적 최근에 인식되었고, 이는 다양한 DNA 조작 및 유전자 편집 응용에서 재조합 CRISPR/Cas 시스템의 사용으로 이어지고 있다.
서열 목록
본 출원은 XML 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 동 서열 목록은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 2022년 9월 6일에 생성된 상기 XML 사본의 명칭은 55921-732601_revised_2.xml이고 크기는 1,114,268 바이트이다.
발명의 내용
일부 측면에서, 본 개시내용은 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하며, 조작된 뉴클레아제 시스템은 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 또는 이의 변이체 중 어느 하나와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고 상기 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 410-419, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 414-419, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하며, 조작된 뉴클레아제 시스템은 서열번호 410-419, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 조작된 가이드 RNA, 및 상기 조작된 가이드 RNA에 결합하도록 구성된 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 1개 또는 2개의 단일-가닥 DNA 분절이 측면에 위치한 이중-가닥 DNA 분절을 포함하는 DNA 복구 템플릿을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 단일-가닥 DNA 분절은 상기 이중-가닥 DNA 분절의 5' 말단에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 단일-가닥 DNA 분절은 상기 이중-가닥 DNA 분절의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 단일-가닥 DNA 분절은 4 내지 10개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다.
일부 실시예에서, 상기 단일-가닥 DNA 분절은 상기 스페이서 서열 내의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 이중-가닥 DNA 서열은 바코드, 개방 해독 프레임, 인핸서, 프로모터, 단백질-코딩 서열, miRNA 코딩 서열, RNA 코딩 서열, 또는 이식유전자를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 이중-가닥 DNA 서열은 뉴클레아제 절단 부위의 측면에 위치한다. 일부 실시예에서, 상기 뉴클레아제 절단 부위는 스페이서 및 PAM 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 PAM은 서열번호 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 및 475 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 시스템은 Mg2+의 공급원을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 가이드 RNA는 적어도 8개, 적어도 10개, 또는 적어도 12개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 헤어핀은 10개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75%, 80%, 또는 90% 동일한 서열을 포함하고; 상기 가이드 RNA 구조는 서열번호 410-419 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80%, 또는 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 상기 가이드 RNA 구조는 서열번호 414-419, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 서열 동일성은 BLASTP, CLUSTALW, MUSCLE, MAFFT 알고리즘, 또는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘 파라미터를 사용하는 CLUSTALW 알고리즘에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, 상기 서열 동일성은, 단어 길이(W) 3, 기대치(E) 10의 파라미터, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(존재 11, 연장 1의 갭 비용 설정)를 사용하고, 조건부 조성 스코어 매트릭스 조정을 사용하는, BLASTP 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 표적 DNA 분자 내의 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA-표적화 분절; 및 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체를 형성하기 위해 혼성화되는 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장을 포함하는 단백질-결합 분절을 포함하는 조작된 가이드 RNA 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 뉴클레오티드의 상기 2개의 상보적 신장은 개재 뉴클레오티드와 서로 공유 결합되고, 상기 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드는 2형, 클래스 V Cas 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 2형, 클래스 V Cas 엔도뉴클레아제는 미배양 유기체로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 75% 서열 동일성을 가지며, 상기 표적 DNA 분자의 상기 표적 서열에 상기 복합체를 표적화한다. 일부 실시예에서, 상기 DNA-표적화 분절은 뉴클레오티드의 상기 2개의 상보적 신장 둘 모두의 3'에 위치한다. 일부 실시예에서, 상기 단백질 결합 분절은 서열번호 410-419의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체는 적어도 5개, 적어도 8개, 적어도 10개, 또는 적어도 12개의 리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 조작된 가이드 RNA 중 어느 하나를 암호화하는 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 상기 핵산은 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하고, 상기 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래되고, 여기서 유기체는 상기 미배양 유기체가 아니다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 70% 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 엔도뉴클레아제의 N-말단 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 NLS는 서열번호 630-645로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 NLS는 서열번호 631을 포함한다. 일부 실시예에서, NLS는 상기 엔도뉴클레아제의 상기 N-말단에 근접한다. 일부 실시예에서, 상기 NLS는 서열번호 630을 포함한다. 일부 실시예에서, NLS는 상기 엔도뉴클레아제의 상기 C-말단에 근접한다. 일부 실시예에서, 상기 유기체는 원핵생물, 박테리아, 진핵생물, 진균류, 식물, 포유류, 설치류, 또는 인간이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 벡터를 제공하며, 여기서 상기 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 조작된 벡터를 제공한다. 일부 실시예에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노-연관 바이러스(AAV) 유래 비리온, 렌티바이러스, 또는 아데노바이러스이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 벡터 중 어느 하나를 포함하는 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 세포 중 어느 하나를 배양하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 결합, 절단, 마킹, 또는 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은: 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를, 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 RNA로 복합체 중 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함하며; 여기서 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM, protospacer adjacent motif)를 포함하고; 여기서 상기 가이드 RNA 구조는 서열번호 410-419 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80%, 또는 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 상기 조작된 가이드 RNA의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 가닥 및 상기 PAM을 포함하는 제2 가닥을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 PAM은 상기 조작된 가이드 RNA의 상기 서열에 상보적인 상기 서열의 5' 말단에 바로 인접한다. 일부 실시예에서, 상기 PAM은 서열번호 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 및 475 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제는 PAM 상호작용 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 진핵생물, 식물, 진균류, 포유류, 설치류, 또는 인간 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조와 복합체를 형성하도록 구성되고, 여기서 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합할 때 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 단계는 상기 표적 핵산 유전자좌에 대한 결합, 니킹, 절단, 또는 마킹하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 표적 핵산은 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 또는 박테리아 DNA를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 시험관 내에 있다. 일부 실시예에서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 세포 내에 있다. 일부 실시예에서, 상기 세포는 원핵생물 세포, 박테리아 세포, 진핵생물 세포, 진균류 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 영장류 세포, 인간 세포, 또는 일차 세포이다. 일부 실시예에서, 상기 세포는 일차 세포이다. 일부 실시예에서, 상기 일차 세포는 T 세포이다. 일부 실시예에서, 상기 일차 세포는 조혈 줄기 세포(HSC, hematopoietic stem cell)이다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나 또는 본원에 개시된 벡터 중 어느 하나를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 핵산은 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 상기 개방 해독 프레임이 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 상기 개방 해독 프레임을 함유하는 캡핑된 mRNA를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 번역된 폴리펩티드를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 리보핵산(RNA) pol III 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 조작된 가이드 RNA를 암호화하는 데옥시리보핵산(DNA)을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 표적 유전자좌에서 또는 이에 근접하여 단일-가닥 파단 또는 이중-가닥 파단을 유도한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 표적 유전자좌 내에서 또는 이의 3'에서 엇갈린 단일-가닥 파단을 유도한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 이종 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli) 세포이다. 일부 실시예에서, 상기 대장균 세포는 λDE3 리소겐이거나 상기 대장균 세포는 BL21(DE3) 균주이다. 일부 실시예에서, 상기 대장균 세포는 ompT lon 유전자형을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 개방 해독 프레임은 T7 프로모터 서열, T7-lac 프로모터 서열, lac 프로모터 서열, tac 프로모터 서열, trc 프로모터 서열, ParaBAD 프로모터 서열, PrhaBAD 프로모터 서열, T5 프로모터 서열, csp프로모터 서열, araPBAD 프로모터, 파지 람다로부터의 강한 좌측 프로모터(pL 프로모터), 또는 이들의 임의의 조합에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 상기 개방 해독 프레임은 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열에 프레임-내에서 연결된 친화도 태그를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 친화도 태그는 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC, immobilized metal affinity chromatography) 태그이다. 일부 실시예에서, 상기 IMAC 태그는 폴리히스티딘 태그이다. 일부 실시예에서, 상기 친화도 태그는 myc 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 말토오스 결합 단백질(MBP) 태그, 글루타티온 S-전이효소(GST) 태그, 스트렙타비딘 태그, FLAG 태그, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시예에서, 상기 친화도 태그는 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 링커 서열을 통해 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열에 프레임-내에서 연결된다. 일부 실시예에서, 상기 프로테아제 절단 부위는 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, PreScission® 프로테아제(PSP) 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시예에서, 상기 개방 해독 프레임은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시예에서, 상기 개방 해독 프레임은 벡터 상에 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 개방 해독 프레임은 상기 숙주 세포의 게놈에 통합된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적합한 액체 배지에 본원에 개시된 숙주 세포 중 어느 하나를 포함하는 배양물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적합한 성장 배지에 본원에 개시된 숙주 세포 중 어느 하나를 배양하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 방법은 추가 화학 제제 또는 증가된 양의 영양소의 첨가에 의해 상기 엔도뉴클레아제의 발현을 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 배양 후 상기 숙주 세포를 단리하는 단계 및 상기 숙주 세포를 용해시켜 단백질 추출물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 상기 단백질 추출물을 IMAC, 또는 이온 친화도 크로마토그래피에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 상기 프로테아제 절단 부위에 상응하는 프로테아제를 상기 엔도뉴클레아제에 접촉시킴으로써 상기 IMAC 친화도 태그를 절단하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 감산 IMAC 친화도 크로마토그래피를 수행하여 상기 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물로부터 상기 친화도 태그를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포에서 유전자좌를 파괴하는 방법을 제공하며, 방법은 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75% 동일성을 갖는 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 상기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고 상기 조작된 가이드 RNA는 유전자좌의 영역에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 세포에서 spCas9와 적어도 동등한 절단 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 절단 활성은 상기 표적 핵산을 포함하는 세포에 적합한 가이드 RNA와 함께 상기 엔도뉴클레아제를 도입하고 상기 세포에서 상기 표적 핵산 서열의 절단을 검출함으로써 시험관 내에서 측정된다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 20 피코몰(pmol) 이하의 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 1 pmol 이하의 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포에서 알부민 유전자좌를 파괴하는 방법을 제공하며, 방법은 상기 세포를 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 조성물은 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75% 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 유전자좌의 영역에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 표 6의 표적 서열 중 어느 하나와 혼성화되도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 가이드 RNA는 서열번호 414-419432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 적어도 18개의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 가이드 RNA는 표 6의 단일 가이드 RNA(sgRNA) 서열 중 어느 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 57과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 영역은 서열번호 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 및 475 중 어느 하나를 포함하는 PAM 서열의 5'에 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 표 6의 서열 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 RNA 분자를 제공한다. 일부 실시예에서, 단리된 RNA 분자는 표 6에 인용된 가이드 RNA 중 어느 하나에 인용된 화학적 변형의 패턴을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포의 알부민 유전자좌를 변형시키기 위한 본원에 개시된 RNA 분자 중 어느 하나의 용도를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하며, 조작된 뉴클레아제 시스템은, 서열번호 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 및 475 중 어느 하나를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 선택적이도록 구성되는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하며, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성되는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas12a 뉴클레아제가 아니다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 미배양 유기체로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 PAM과 상호작용하도록 구성되는 PAM 상호작용 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제; 및 DNA 메틸트랜스퍼라아제를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템를 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제는 상기 엔도뉴클레아제에 비-공유적으로 결합한다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제는 단일 폴리펩티드에서 상기 엔도뉴클레아제에 융합된다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제는 Dmnt3A 또는 Dnmt3L을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 KRAB 도메인은 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제에 비-공유적으로 결합한다.
일부 실시예에서, 상기 KRAB 도메인은 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제에 공유적으로 결합된다. 일부 실시예에서, 상기 KRAB 도메인은 단일 폴리펩티드에서 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제에 융합된다. 일부 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 니카아제이거나 촉매적으로 사멸된다. 일부 실시예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 RNA 구조를 추가로 포함하고, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 표적 핵산 서열은 표적 게놈의 프로모터에 포함되거나 이에 근접한다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 가이드 RNA 구조는 (a) 2'-O-메틸뉴클레오티드; (b) 2'-플루오로뉴클레오티드; 또는 (c) 포스포로티오에이트 결합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 가이드 RNA 구조는 표 6의 단일 가이드 RNA 중 어느 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 패턴을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 상기 조작된 뉴클레아제 시스템 중 어느 하나를 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 엔도뉴클레아제는 상기 조작된 가이드 RNA 구조와 복합체를 형성하도록 구성되고, 여기서 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합할 때 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제가 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키도록 구성된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 핵산 유전자좌를 변형시키기 위한 본원에 개시된 조작된 뉴클레아제 시스템 중 어느 하나의 용도를 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 핵산 유전자좌를 변형시키는 단계는 상기 핵산 유전자좌의 뉴클레오티드를 메틸화하거나 탈메틸화하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하며, 조작된 뉴클레아제 시스템은 (a) RuvC 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 여기서 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래되고, 엔도뉴클레아제는 Cas12a 엔도뉴클레아제가 아닌, 엔도뉴클레아제; 및 (b) 조작된 가이드 RNA로서, 여기서 조작된 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는, 조작된 가이드 RNA를 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하며, 조작된 뉴클레아제 시스템은: (a) 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제; 및 (b) 조작된 가이드 RNA로서, 여기서, 조작된 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는 조작된 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시예에서, 엔도뉴클레아제는 RuvCI, II, 또는 III 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 RuvCI, II, 또는 III 도메인과 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, RuvCI 도메인은 D 촉매 잔기를 포함한다. 일부 실시예에서, RuvCII 도메인은 E 촉매 잔기를 포함한다. 일부 실시예에서, RuvCIII 도메인은 D 촉매 잔기를 포함한다. 일부 실시예에서, RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다. 일부 실시예에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 WED II 도메인과 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 동일성을 갖는 WED II 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 가이드 RNA는 서열번호 410-419 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하며, 조작된 뉴클레아제 시스템은 (a) 서열번호 410-419 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 조작된 가이드 RNA, 및 (b) 조작된 가이드 RNA에 결합하도록 구성된 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시예에서, 가이드 RNA는 진핵생물, 진균류, 식물, 포유류, 또는 인간 게놈 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 가이드 RNA는 30-250개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시예에서, 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제의 N-말단 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함한다. 일부 실시예에서, NLS는 서열번호 630-645로 이루어진 군으로부터의 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은, 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 복구 템플릿을 추가로 포함하며, 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 복구 템플릿은 5'에서 3'으로 다음을 포함한다: 표적 데옥시리보핵산 서열의 5'에 있는 적어도 20개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 제1 상동 아암, 적어도 10개 뉴클레오티드의 합성 DNA 서열, 및 표적 서열의 3'에 있는 적어도 20개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 제2 상동 아암. 일부 실시예에서, 제1 또는 제2 상동 아암은 적어도 40, 80, 120, 150, 200, 300, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 상동 아암은 원핵생물, 박테리아, 진균류, 또는 진핵생물의 게놈 서열과 상동이다. 일부 실시예에서, 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 복구 템플릿은 이식유전자 공여자를 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 1개 또는 2개의 단일-가닥 DNA 분절이 측면에 위치한 이중-가닥 DNA 분절을 포함하는 DNA 복구 템플릿을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 단일-가닥 DNA 분절은 이중-가닥 DNA 분절의 5' 말단에 접합된다. 일부 실시예에서, 단일-가닥 DNA 분절은 이중-가닥 DNA 분절의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시예에서, 단일-가닥 DNA 분절은 4 내지 10개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다. 일부 실시예에서, 단일-가닥 DNA 분절은 스페이서 서열 내의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시예에서, 이중-가닥 DNA 서열은 바코드, 개방 해독 프레임, 인핸서, 프로모터, 단백질-코딩 서열, miRNA 코딩 서열, RNA 코딩 서열, 또는 이식유전자를 포함한다. 일부 실시예에서, 이중-가닥 DNA 서열은 뉴클레아제 절단 부위의 측면에 위치한다. 일부 실시예에서, 뉴클레아제 절단 부위는 스페이서 및 PAM 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 시스템은 Mg2+의 공급원을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 가이드 RNA는 적어도 8개, 적어도 10개, 또는 적어도 12개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀을 포함한다. 일부 실시예에서, 헤어핀은 10개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, (a) 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75%, 80%, 또는 90% 동일한 서열을 포함하고; (b) 가이드 RNA 구조는 서열번호 410-419 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80%, 또는 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 서열 동일성은 BLASTP, CLUSTALW, MUSCLE, MAFFT 알고리즘, 또는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘 파라미터를 사용하는 CLUSTALW 알고리즘에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, 서열 동일성은, 단어 길이(W) 3, 기대치(E) 10의 파라미터, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(존재 11, 연장 1의 갭 비용 설정)를 사용하고, 조건부 조성 스코어 매트릭스 조정을 사용하는, BLASTP 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 조작된 가이드 RNA를 제공하며, 조작된 가이드 RNA는 (a) 표적 DNA 분자 내의 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA-표적화 분절; 및 (b) 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체를 형성하기 위해 혼성화되는 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장을 포함하는 단백질-결합 분절을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장은 개재 뉴클레오티드와 서로 공유적으로 결합되고, 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하여 복합체를 표적 DNA 분자의 표적 서열에 대해 표적화할 수 있다. 일부 실시예에서, DNA-표적화 분절은 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장 둘 모두의 3'에 위치한다. 일부 실시예에서, 단백질 결합 분절은 서열번호 410-419의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체는 적어도 5개, 적어도 8개, 적어도 10개, 또는 적어도 12개의 리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 핵산은 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하고, 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래되고, 여기서 유기체는 미배양 유기체가 아니다. 일부 실시예에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 70% 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제의 N-말단 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, NLS는 서열번호 630-645로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, NLS는 서열번호 631을 포함한다. 일부 실시예에서, NLS는 엔도뉴클레아제의 N-말단에 근접한다. 일부 실시예에서, NLS는 서열번호 630을 포함한다. 일부 실시예에서, NLS는 엔도뉴클레아제의 C-말단에 근접한다. 일부 실시예에서, 유기체는 원핵생물, 박테리아, 진핵생물, 진균류, 식물, 포유류, 설치류, 또는 인간이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 벡터를 제공하며, 여기서 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 핵산을 포함하는 조작된 벡터를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 벡터를 제공한다. 일부 실시예에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노-연관 바이러스(AAV) 유래 비리온, 렌티바이러스, 또는 아데노바이러스이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 숙주 세포 중 어느 하나를 배양하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 결합, 절단, 마킹, 또는 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를, 엔도뉴클레아제 및 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 핵산 구조로 복합체 중 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함하며; 여기서 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하고; 가이드 RNA 구조는 서열번호 410-419 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80%, 또는 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 조작된 가이드 RNA의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 가닥 및 PAM을 포함하는 제2 가닥을 포함한다. 일부 실시예에서, PAM은 조작된 가이드 RNA의 서열에 상보적인 서열의 5' 말단에 바로 인접한다. 일부 실시예에서, 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 진핵생물, 식물, 진균류, 포유류, 설치류, 또는 인간 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드이다.
일부 실시예에서, 본 개시내용은 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기술된 조작된 뉴클레아제 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계를 포함하고, 여기서, 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 리보핵산 구조와 복합체를 형성하도록 구성되고, 복합체는, 복합체가 표적 핵산 유전자좌에 결합할 때 복합체가 표적 핵산 유전자좌를 변형시키도록 구성된다. 일부 실시예에서, 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 단계는 표적 핵산 유전자좌를 결합, 니킹, 절단, 또는 마킹하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 표적 핵산 유전자좌는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함한다. 일부 실시예에서, 표적 핵산은 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 또는 박테리아 DNA를 포함한다. 일부 실시예에서, 표적 핵산 유전자좌는 시험관 내에 있다. 일부 실시예에서, 표적 핵산 유전자좌는 세포 내에 있다. 일부 실시예에서, 세포는 원핵생물 세포, 박테리아 세포, 진핵생물 세포, 진균류 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 영장류 세포, 인간 세포, 또는 일차 세포이다. 일부 실시예에서, 세포는 일차 세포이다. 일부 실시예에서, 일차 세포는 T 세포이다. 일부 실시예에서, 일차 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 일부 실시예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 본원에 기술된 핵산 또는 본원에 기술된 벡터를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 핵산은 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임이 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임을 함유하는 캡핑된 mRNA를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 번역된 폴리펩티드를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 리보핵산(RNA) pol III 프로모터에 작동 가능하게 연결된 조작된 가이드 RNA를 암호화하는 데옥시리보핵산(DNA)을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 엔도뉴클레아제는 표적 유전자좌에서 또는 이에 근접하여 단일-가닥 파단 또는 이중-가닥 파단을 유도한다. 일부 실시예에서, 엔도뉴클레아제는 표적 유전자좌 내에서 또는 이의 3'에서 엇갈린 단일-가닥 파단을 유도한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 이종 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시예에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 대장균 세포 또는 포유류 세포이다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 대장균 세포이다. 일부 실시예에서, E. coli 세포는 λDE3 리소겐이거나 E. coli 세포는 BL21(DE3) 균주이다. 일부 실시예에서, E. coli 세포는 ompT lon 유전자형을 갖는다. 일부 실시예에서, 개방 해독 프레임은 T7 프로모터 서열, T7-lac 프로모터 서열, lac 프로모터 서열, tac 프로모터 서열, trc 프로모터 서열, ParaBAD 프로모터 서열, PrhaBAD 프로모터 서열, T5 프로모터 서열, cspA 프로모터 서열, araP BAD 프로모터, 파지 람다로부터의 강한 좌측 프로모터(pL 프로모터), 또는 이들의 임의의 조합에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 개방 해독 프레임은 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열에 프레임-내에서 연결된 친화도 태그를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 친화도 태그는 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 태그이다. 일부 실시예에서, IMAC 태그는 폴리히스티딘 태그이다. 일부 실시예에서, 친화도 태그는 myc 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 말토오스 결합 단백질(MBP) 태그, 글루타티온 S-전이효소(GST) 태그, 스트렙타비딘 태그, FLAG 태그, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시예에서, 친화도 태그는 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 링커 서열을 통해 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열에 프레임-내에서 연결된다. 일부 실시예에서, 프로테아제 절단 부위는 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, PreScission® 프로테아제 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시예에서, 개방 해독 프레임은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시예에서, 개방 해독 프레임은 벡터 상에 제공된다. 일부 실시예에서, 개방 해독 프레임은 숙주 세포의 게놈에 통합된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적합한 액체 배지에 본원에 기술된 숙주 세포 중 어느 하나를 포함하는 배양물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적합한 성장 배지에 본원에 기술된 숙주 세포 중 어느 하나를 배양하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 방법은 추가 화학 제제 또는 증가된 양의 영양소의 첨가에 의해 엔도뉴클레아제의 발현을 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 추가 화학 제제 또는 증가된 양의 영양소는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 또는 추가 양의 락토오스를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 배양 후 숙주 세포를 단리하는 단계 및 숙주 세포를 용해시켜 단백질 추출물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 단백질 추출물을 IMAC, 또는 이온 친화도 크로마토그래피에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 개방 해독 프레임은 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열에 프레임-내에서 연결된 IMAC 친화도 태그를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, IMAC 친화도 태그는 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 링커 서열을 통해 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열에 프레임-내에서 연결된다. 일부 실시예에서, 프로테아제 절단 부위는 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, PreScission® 프로테아제 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 프로테아제 절단 부위에 상응하는 프로테아제를 엔도뉴클레아제에 접촉시킴으로써 IMAC 친화도 태그를 절단하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 감산 IMAC 친화도 크로마토그래피를 수행하여 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물로부터 친화도 태그를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포에서 유전자좌를 파괴하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75% 동일성을 갖는 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 상기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 조작된 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고 조작된 가이드 RNA는 유전자좌의 영역에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제는 세포에서 spCas9와 적어도 동등한 절단 활성을 갖는다. 일부 실시예에서, 절단 활성은 표적 핵산을 포함하는 세포에 적합한 가이드 RNA와 함께 엔도뉴클레아제를 도입하고 세포에서 표적 핵산 서열의 절단을 검출함으로써 시험관 내에서 측정된다. 일부 실시예에서, 조성물은 20 pmol 이하의 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시예에서, 조성물은 1 pmol 이하의 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본 개시내용의 추가 측면 및 이점은, 본 개시내용의 예시적인 실시예만이 도시되고 설명되는, 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 인지하게 되겠지만, 본 개시내용은 다른 실시예 및 상이한 실시예가 가능하고, 본 개시내용의 몇몇 세부 사항은 다양한 명백한 측면에서 본 개시를 벗어나지 않고도 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본질적으로 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 제한적인 것으로 간주되지 않아야 한다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참조에 의해 구체적으로 및 개별적으로 통합된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 본원에 통합된다.
본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 청구범위에 명시되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점은 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시예가 제시되는 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 첨부 도면을 참조함으로써 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은 본 개시내용 전 이전에 문서화된 상이한 클래스 및 유형의 CRISPR/Cas 유전자좌의 전형적인 조직을 도시한다.
도 2a 내지 2d는 MG119 계열의 개요를 도시한다. 도 2a는 MG119 효과기 대표의 다중 정렬을 도시하는 것으로서 이중-가닥 DNA 절단 활성에 대한 기능에 중요한 RuvC 촉매 잔기의 도메인 구성 및 보존을 보여준다. 도 2b는 CRISPR 어레이 및 Cas 효과기(MG119-1의 예)를 둘러싸는 게놈 컨텍스트를 갖는 CRISPR-함유 콘티그의 대표를 도시한다. 도 2c는 MG119-1의 직접 반복의 접힘을 도시한다. 도 2d는 MG119-1을 위해 설계된 단일 가이드 RNA를 도시한다.
도 3a 내지 3c는 MG90 계열의 개요를 도시한다. 도 3a는 MG90 효과기 대표의 다중 정렬을 도시하는 것으로서 이중-가닥 DNA 절단 활성에 대한 기능에 중요한 RuvC 촉매 잔기의 도메인 구성 및 보존을 보여준다. 도 3b는 CRISPR 어레이 및 Cas 효과기(MG90-5의 예)를 둘러싸는 게놈 컨텍스트를 갖는 CRISPR-함유 콘티그의 대표를 도시한다. 도 3c는 MG90-5의 직접 반복의 접힘을 도시한다.
도 4a 내지 4c는 MG126 계열의 개요를 도시한다. 도 4a는 MG126 효과기 대표의 다중 정렬을 도시하는 것으로서 이중-가닥 DNA 절단 활성에 대한 기능에 중요한 RuvC 촉매 잔기의 도메인 구성 및 보존을 보여준다. 도 4b는 CRISPR 어레이 및 Cas 효과기(MG126-4의 예)를 둘러싸는 게놈 컨텍스트를 갖는 CRISPR 함유 콘티그의 대표를 도시한다. 도 4c는 MG126-4의 직접 반복의 접힘을 도시한다.
도 5a 내지 5c는 MG118 계열의 개요를 도시한다. 도 5a는 MG118 효과기 대표의 다중 정렬을 도시하는 것으로서 이중-가닥 DNA 절단 활성에 대한 기능에 중요한 RuvC 촉매 잔기의 도메인 구성 및 보존을 보여준다. 도 5b는 CRISPR 어레이 및 Cas 효과기(MG118-1의 예)를 둘러싸는 게놈 컨텍스트를 갖는 CRISPR 함유 콘티그의 대표를 도시한다. 도 5c는 MG118-1의 직접 반복의 접힘을 도시한다.
도 6a 내지 6c는 MG122 계열의 개요를 도시한다. 도 6a는 MG122 효과기 대표의 다중 정렬을 도시하는 것으로서 이중-가닥 DNA 절단 활성에 대한 기능에 중요한 RuvC 촉매 잔기의 도메인 구성 및 보존을 보여준다. 도 6b는 CRISPR 어레이 및 Cas 효과기(MG122-4의 예)를 둘러싸는 게놈 컨텍스트를 갖는 CRISPR 함유 콘티그의 대표를 도시한다. 도 6c는 MG122-4의 직접 반복의 접힘을 도시한다.
도 7a 내지 7c는 MG120 계열의 개요를 도시한다. 도 7a는 MG120 효과기 대표의 다중 정렬을 도시하는 것으로서 이중-가닥 DNA 절단 활성에 대한 기능에 중요한 RuvC 촉매 잔기의 도메인 구성 및 보존을 보여준다. 도 7b는 CRISPR 어레이 및 Cas 효과기(MG120-1의 예)를 둘러싸는 게놈 컨텍스트를 갖는 CRISPR 함유 콘티그의 대표를 도시한다. 도 7c는 MG120-1의 직접 반복의 접힘을 도시한다.
도 8a 내지 8d는 MG91 계열의 개요를 도시한다. 도 8a는 CRISPR 어레이 및 Cas 효과기(MG91B-24의 예)를 둘러싸는 게놈 컨텍스트를 갖는 CRISPR 함유 콘티그의 대표를 도시한다. 도 8b는 MG91B-24의 직접 반복의 접힘을 도시한다. 도 8c는 CRISPR 어레이 및 Cas 효과기(MG91C-10의 예)를 둘러싸는 게놈 컨텍스트를 갖는 CRISPR 함유 콘티그의 대표를 도시한다. 도 8d는 MG91C-10의 직접 반복의 접힘을 도시한다.
도 9는 TXTL 검정을 사용한 MG119-2의 시험관 내 활성을 도시한다. MG119-2를 MG119-2 콘티그로부터의 2개의 유전자간 서열, 정방향 또는 역방향 배향으로 반복을 함유하는 최소 어레이(MA, 최소 어레이) 서열, 및 PAM 라이브러리 표적 플라스미드를 갖는 dsDNA 절단에 대해 시험하였다. 유전자간(IG, intergenic) 서열 1을 갖는 증폭된 절단 산물로서 레인 1에서 양성 유전자간 농축이 관찰되었으며, 정방향 배향에서 반복을 갖는 최소 어레이가 관찰되었다. 레인 3 및 7은 IG가 생략된 음성 대조군이고, 레인 4는 어레이 및 IG 둘 모두가 생략된 세 번째 음성 대조군이다.
도 10a는 시험관 내 절단 검정으로부터 수득된 절단 산물의 차세대 시퀀싱(NGS)을 통해 결정된 MG119-2 PAM(5'-nTnn-3')의 SeqLogo를 도시한다. 도 10b는 절단 부위의 히스토그램(PAM으로부터 23 bd 떨어져 있음)을 도시한다.
도 11a 및 도 11b는 활성 MG119 뉴클레아제 및 이들의 sgRNA 설계의 예를 도시한다. 도 11a는 스페이서가 없는 단일 가이드 RNA 서열에 대한 예측된 접힘을 도시한다. 청색 원은 tracrRNA의 처음 5' 뉴클레오티드를 나타내고, 적색 원은 반복의 3' 뉴클레오티드를 나타낸다. TracrRNA 및 반복 서열은 GAAA 테트라루프로 루프화된다. 반복 항-반복 접힘부는 각 구조의 3' 말단에 있다. 동일한 계열 내의 활성 가이드의 3개의 상이한 RNA 구조가 도시되어 있다. 왼쪽에서 오른쪽으로: MG119-28 가이드는 4개의 헤어핀, 5' 말단에 3개의 더 작은 헤어핀, 및 반복, 항-반복 접힘부 옆에 2개의 벌지가 있는 매우 긴 헤어핀을 갖는다. MG119-83 sgRNA는 3개의 작은 헤어핀을 갖고, 반복 항-반복은 2개의 벌지를 갖는다. MG119-118은 4개의 헤어핀이 있으며, 5' 말단의 두 번째 헤어핀은 3개의 헤어핀으로 갈라지고, 세 번째 헤어핀과 반복 항-반복은 1개의 벌지를 갖는다. 이 가이드는 또한 tracr의 5' 말단과 반복의 3' 말단 사이에 일부 페어링 뉴클레오티드를 갖는다. 도 11b는 2% 아가로오스 겔 상의 시험관 내 절단 분석 증폭 산물을 도시한다. 저 분자량 DNA 래더(NEB)는 레인 1, 7, 및 11에 있다. 왼쪽에서 오른쪽으로 다른 레인 내용물: (2) MG119-28 뉴클레아제 단독, MG119-28 뉴클레아제 + (3) U67 스페이서를 갖는 sgRNA1, (4) U40 스페이서를 갖는 sgRNA1, (5) U67 스페이서를 갖는 sgRNA2, 및 (6) U40 스페이서를 갖는 sgRNA2; (8) MG119-83 뉴클레아제 단독, MG119-83 뉴클레아제 + (9) U67 스페이서를 갖는 sgRNA1 및 (10) U40 스페이서를 갖는 sgRNA1; (12) MG119-118 뉴클레아제 단독, MG119-118 뉴클레아제 + (13) U67스페이서를 갖는 sgRNA1 및 (14) U40 스페이서를 갖는 sgRNA1. 생성된 앰플리콘 생성물은 U67 스페이서 운반 가이드가 있는 188 bp 또는 U40 스페이서 운반 가이드가 있는 205 bp이다.
도 12는 활성 MG119 뉴클레아제에 대한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 서열 로고를 도시한다.
도 13a 내지 13f는 단백질 정제 단계의 예시적인 SDS-PAGE 겔 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) A280 트레이스를 도시한다. 도 13a는 (1) 초음파 처리 후 용해, (2) 정화 후 원심분리, (3) Ni-NTA 중력 컬럼 관류, (4) Ni-NTA 수지로부터 용리, (5) 농축된 샘플에서 회수된 샘플을 이용한 MG119-28Δ 정제 도시한다. 도 13b는 S200i 10 / 300 GL 컬럼 SEC A280 트레이스를 도시한다. 피크 분획을 모으고 농축시켰다. 도 13c 및 도 13d는 (1) 초음파 처리 후 용해, (2) 정화 후 원심분리, (3) Ni-NTA 중력 컬럼 관류, (4) Ni-NTA 수지로부터 용리, (5) 농축된 단백질, (6) TEV 프로테아제로 밤새 절단된 농축 단백질, (7) 및 원심분리(21,000 x g, 4℃, 10분)하여 응집체를 펠릿화, (8) 아밀로오스 컬럼 관류, (9) 원심분리된 관류(21,000 x g, 4℃, 10분)로 응집체를 펠릿화, 및 (10) 농축된 관류물에서 회수된 샘플을 이용한 MBP-태그된/절단된 MG119-28Δ 정제를 도시한다. 도 13e는 S200i 10 / 300 GL 컬럼 SEC A280 트레이스를 도시한다. 도 13f는 pMGB 및 pMGBΔ 발현 벡터 둘 다에서 발현된 5개의 MG119 후보 중 pMGBΔ 벡터에서 더 높은 수율을 나타냈음을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 14a 및 도 14b는 정제된 단백질을 이용한 시험관 내 절단 효율의 예를 도시한다. 도 14a는 RNP:기질 비율 적정 및 더 높은 비율에서의 기질 절단 증가를 보여주는 아가로오스 겔을 도시한다. 도 14b는 밀도계를 사용하여 각 레인에 대해 결정된 절단된 기질의 백분율을 도시한다. 절단 분율을 Prism8에 도표화하고, 선형 절단 범위의 기울기를 사용하여 단백질 활성 분율을 계산하였다. 이 검정에서 pMGBΔ 백본에서 발현된 MG119-28을 사용하였다.
도 15a 및 도 15b는 마우스 Hepa1-6 세포 DNA의 시험관 내 절단 및 편집 효율의예를 도시한다. 도 15a는 인트론 1에서 마우스 알부민 유전자를 표적화하는 4개의 화학적으로 변형된 가이드를 갖는 MG119-28의 절단백분율을 도시한다(표 6). 15.6 nM(검은 막대) 및 7.8 nM(흰 막대)의 2가지 농도의 뉴클레아제를 시험하였다. 절단을 비-표적화 대조군으로 정규화하였다. MG119-28은 15.6 nM RNP의 sgRNA4 및 7.8 nM RNP의 최대 33%로 Hepa 1-6 gDNA를 최대 평균 60%까지 절단할 수 있다. 도 15b는 아포 반응에 대해 정규화된 Hepa 1-6 세포에서 MG119-28에 의해 생성된 INDEL백분율을 도시한다. 각각의 조건을 3회 수행하였다. 시퀀싱된 판독물의 평균 25.12%를 sgRNA3으로 편집하였다. sgRNA3은 시험관 내에서 및 본원에 도시된 바와 같은 세포에서 일관되게 활성이다. 세포에서의 다음 최상의 가이드는 평균 4.11% 편집을 갖는 sgRNA4이다. 관찰된 편집물은 대부분 4 내지 24 bp의 결실이다.
서열 목록에 대한 간단한 설명
본원과 함께 출원된 서열 목록은 본 개시내용에 따른 방법, 조성물, 및 시스템에 사용하기 위한 예시적인 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 제공한다. 서열 목록 내 서열에 대한 예시적인 설명이 아래에 제시되어 있다.
MG122
서열번호 1-5는 MG122 뉴클레아제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
MG120
서열번호 6-14는 MG120 뉴클레아제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 333-335 및 355-357은 MG120 Cas 효과기와 동일한 유전자좌로부터 유래된 MG120 tracrRNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 374-375 및 389-390은 MG120 최소 어레이의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
MG118
서열번호 15는 MG118 뉴클레아제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 376은 MG118 최소 어레이의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 391은 MG118 최소 어레이의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 400-401은 MG118 표적 CRISPR 반복의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 410-411은 MG118 crRNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
MG90
서열번호 16-29는 MG90 뉴클레아제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 346-347 및 368-369는 MG90 Cas 효과기와 동일한 유전자좌로부터 유래된 MG90 tracrRNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 383-384 및 398-399는 MG90 최소 어레이의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 402-403은 MG90 표적 CRISPR 반복의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 412-413은 MG90 sgRNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
MG119
서열번호 30-150, 420-431, 476-624, 및 629는 MG119 뉴클레아제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 326-332, 336-345, 348-354, 및 358-367은 MG119 Cas 효과기와 동일한 유전자좌로부터 유래된 MG119 tracrRNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 370-373, 377-382, 385-388, 및 392-397은 MG119 최소 어레이의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 404-409는 MG119 표적 CRISPR 반복의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 414-419, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474는 MG119 sgRNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 및 475는 MG119 PAM의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
MG91B
서열번호 151-291은 MG91B 뉴클레아제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
MG91C
서열번호 292-318은 MG91C 뉴클레아제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
MG91A
서열번호 319는 MG91A 뉴클레아제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
MG126
서열번호 320-325는 MG126 뉴클레아제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
본 발명의 다양한 실시예가 본원에 도시되고 기술되었지만, 이러한 실시예는 단지 예시로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않고도 많은 변이, 변화, 및 치환이 당업자에게 일어날 수 있다. 본원에 기술된 본 발명의 실시예에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 일부 방법을 실시하는 데에는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 게놈, 및 재조합 DNA의 기술이 사용된다. 예를 들어 Sambrook 및 Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012); the series Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 등(편); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames 및 G.R. Taylor(편) (1995)), Harlow and Lane(편) (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney(편) (2010))을 참조한다(이들은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 복수 형태도 포함하도록 의도된다. 또한, 용어 "포함하는(including, includes, having, has, with)" 또는 이의 변형된 표현이 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및/또는 청구범위에 사용되는 정도까지, 이러한 용어는 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내의 것을 의미하며, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당 기술분야의 관행에 따라 하나 또는 둘 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 15%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "세포"는 일반적으로 생물학적 세포를 지칭한다. 세포는 살아있는 유기체의 기본 구조, 기능, 및/또는 생물학적 단위일 수 있다. 세포는 하나 이상의 세포를 갖는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 원핵 세포, 진핵 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단세포 진핵생물의 세포, 원생동물 세포, 식물 유래의 세포(예를 들어, 식물 작물, 과일, 야채, 곡물, 대두, 옥수수(corn), 옥수수(maize), 밀, 씨앗, 토마토, 쌀, 카사바, 사탕수수, 호박, 건초, 감자, 면, 대마, 담배, 개화 식물, 침엽수, 겉씨식물, 양치류, 석송, 뿔이끼류, 우산이끼, 이끼 유래의 세포), 해조류 세포(예를 들어, 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii), 클라미도모나스 라인하르트티(Chlamydomonas reinhardtii), 나노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 쌍발이모자반(Sargassum patens C. Agardh, 등), 해초(예를 들어, 켈프), 진균 세포(예를 들어, 효모 세포, 버섯 유래의 세포), 동물 세포, 무척추 동물(예를 들어, 초파리, 자포류, 극피동물, 선충 등) 유래의 세포. 척추동물(예를 들어, 생선, 양서류, 파충류, 새, 포유동물) 유래의 세포, 포유동물(예를 들어, 돼지, 젖소, 염소, 양, 설치류, 랫트, 마우스, 비인간 영장류, 인간 등) 유래의 세포, 등. 때로는, 세포는 천연 유기체로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 세포는 합성으로 만들어질 수 있고, 이는 가끔 인공 세포라 불린다).
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 일반적으로 염기-당-인산염의 조합을 지칭한다. 뉴클레오티드는 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 합성 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 핵산 서열(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA))의 단량체 단위일 수 있다. 뉴클레오티드라는 용어는 리보뉴클레오시드 삼인산, 아데노신 삼인산(ATP), 우리딘 삼인산(UTP), 시토신 삼인산(CTP), 구아노신 삼인산(GTP), 및 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산, 예컨대 dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 유도체는, 예를 들어, [αS]dATP, 7-데아자-dGTP 및 7-데아자-dATP, 및 이를 함유하는 핵산 분자에 뉴클레아제 저항성을 부여하는 뉴클레오티드 유도체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 뉴클레오티드는 디데옥시리보뉴클레오시드 삼인산(ddNTP) 및 이들의 유도체를 지칭할 수 있다. 디데옥시리보뉴클레오시드 삼인산의 예시적인 예는 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, 및 ddTTP를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 뉴클레오티드는 표지되지 않거나, 예컨대 광학적으로 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 형광단)를 포함하는 모이어티를 사용하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 표지화는 양자점(quantum dots)으로 수행될 수도 있다. 검출 가능한 표지는, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 생물발광 표지, 및 효소 표지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 형광 표지는 플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인(FAM), 2',7'-디메톡시-4'5-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 로다민, 6-카르복시로다민(R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 6-카르복시-X-로다민(ROX), 4-(4'디메틸아미노페닐아조) 벤조산(DABCYL), 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 오레곤 그린(Oregon Green), 텍사스 레드(Texas Red), 사아닌, 및 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS)을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 형광 표지된 뉴클레오티드의 특정 예는 다음을 포함할 수 있다: Perkin Elmer(Foster City, Calif)로부터 입수할 수 있는 [R6G]dUTP, [TAMRA]dUTP, [R110]dCTP, [R6G]dCTP, [TAMRA]dCTP, [JOE]ddATP, [R6G]ddATP, [FAM]ddCTP, [R110]ddCTP, [TAMRA]ddGTP, [ROX]ddTTP, [dR6G]ddATP, [dR110]ddCTP, [dTAMRA]ddGTP, 및 [dROX]ddTTP; Amersham(Arlington Heights, Il.)으로부터 입수할 수 있는 FluoroLink 데옥시뉴클레오티드, FluoroLink Cy3-dCTP, FluoroLink Cy5-dCTP, FluoroLink 플루오르 X-dCTP, FluoroLink Cy3-dUTP, 및 FluoroLink Cy5-dUTP; Boehringer Mannheim(Indianapolis, Ind.)으로부터 입수할 수 있는 플루오레세인-15-dATP, 플루오레세인-12-dUTP, 테트라메틸-로다민-6-dUTP, IR770-9-dATP, 플루오레세인-12-ddUTP, 플루오레세인-12-UTP, 및 플루오레세인-15-2'-dATP; 및 Molecular Probes(Eugene, Oreg.)로부터 입수할 수 있는 염색체 표지된 뉴클레오티드, BODIPY-FL-14-UTP, BODIPY-FL-4-UTP, BODIPY-TMR-14-UTP, BODIPY-TMR-14-dUTP, BODIPY-TR-14-UTP, BODIPY-TR-14-dUTP, 캐스케이드 블루-7-UTP, 캐스케이드 블루-7-dUTP, 플루오레세인-12-UTP, 플루오레세인-12-dUTP, 오레곤 그린 488-5-dUTP, 로다민 그린-5-UTP, 로다민 그린-5-dUTP, 테트라메틸로다민-6-UTP, 테트라메틸로다민-6-dUTP, 텍사스 레드-5-UTP, 텍사스 레드-5-dUTP, 및 텍사스 레드-12-dUTP. 뉴클레오티드는 화학적 변형에 의해 표지되거나 표시될 수도 있다. 화학적으로 변형된 단일 뉴클레오티드는 비오틴-dNTP일 수 있다. 비오틴화된 dNTP의 일부 비제한적인 예는 다음을 포함할 수 있다: 비오틴-dATP(예를 들어, 비오-N6-ddATP, 비오틴-14-dATP), 비오틴-dCTP(예를 들어, 비오틴-11-dCTP, 비오틴-14-dCTP), 및 비오틴-dUTP(예를 들어, 비오틴-11-dUTP, 비오틴-16-dUTP, 비오틴-20-dUTP).
용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", 및 "핵산"은 일반적으로 임의의 길이를 가진 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하도록 교환적으로 사용되며, 상기 뉴클레오티드는 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 다중 가닥의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이거나, 이의 유사체일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 세포에 대해 외인성이거나 내인성일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 무세포 환경에서 존재할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 유전자이거나 이의 단편일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 유사체(예를 들어, 백본, 당, 또는 핵염기가 변경된 유사체)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 유사체의 일부 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 5-브로모우라실, 펩티드 핵산, 제노 핵산(xeno 핵산), 모르폴리노, 잠금 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 디데옥시뉴클레오티드, 코르디세핀, 7-데아자-GTP, 형광단 (예를 들어, 당류에 연결된 로다민 또는 플루오레세인), 티올 함유 뉴클레오티드, 비오틴 연결된 뉴클레오티드, 형광 염기 유사체, CpG 섬, 메틸-7-구아노신, 메틸화된 뉴클레오티드, 이노신, 티오우리딘, 슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 큐오신, 및 와이오신. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌/유전자좌들, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 무세포 DNA(cfDNA) 및 무세포 RNA(cfRNA)를 포함하는 무세포 폴리뉴클레오티드, 핵산 프로브, 및 프라이머. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다.
용어 "형질감염(transfection 또는 transfected)"은 일반적으로 비-바이러스적인 방법 또는 바이러스-기반 방법에 의해 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 핵산 분자는 완전한 단백질 또는 이의 기능적 부분을 암호화하는 유전자 서열일 수 있다. 예를 들어, Sambrook 등의 문헌[1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88(이는 본원에 참조로서 전체적으로 통합됨)]을 참조한다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 일반적으로 펩티드 결합에 의해 결합된 적어도 2개의 아미노산 잔기로 이루어진 중합체를 지칭하도록 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이 용어는 중합체의 특정 길이를 의미하지 않으며, 펩티드가 재조합 기술, 화학적 또는 효소적 합성을 사용해 생산되는지 또는 자연적으로 발생하는지를 암시하거나 구별하도록 의도되지도 않는다. 상기 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체뿐만 아니라 적어도 하나의 변형된 아미노산을 포함하는 아미노산 중합체에도 적용된다. 일부 경우에, 중합체는 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 전장 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬, 및 2차 및/또는 3차 구조(예를 들어, 도메인)가 있거나 없는 단백질을 포함한다. 상기 용어는 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당질화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 산화, 및 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작에 의해 변형된 아미노산 중합체도 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은, 변형된 아미노산 및 아미노산 유사체를 포함하되 이에 한정되지 않는, 천연 및 비-천연 아미노산을 일반적으로 지칭한다. 변형된 아미노산은, 아미노산 상에는 자연적으로 존재하지 않는 기 또는 화학적 모이어티를 포함하도록 화학적으로 변형된 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산 유사체는 아미노산 유도체를 지칭할 수 있다. 용어 "아미노산"은 D-아미노산 및 L-아미노산 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비-고유(non-native)"는 고유 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 일반적으로 지칭할 수 있다. 비-고유는 친화도 태그를 지칭할 수 있다. 비-고유는 융합을 지칭할 수 있다. 비-고유는 돌연변이, 삽입, 및/또는 결실을 포함하는 자연 발생 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 비-고유 서열은 비-고유 서열이 융합되는 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열에 의해서도 나타날 수 있는 활성(예를 들어, 효소 활성, 금속전이효소 활성, 아세틸전이효소 활성, 키나아제 활성, 유비퀴틴화 활성 등)을 나타내고/나타내거나 이를 암호화할 수 있다. 비-고유 핵산 또는 폴리펩티드 서열은 유전자 조작에 의해 자연 발생 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열(또는 이의 변이체)에 연결되어 키메라 핵산 또는 폴리펩티드를 암호화하는 키메라 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열을 생성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는, 유전자의 전사 또는 발현을 조절하고 RNA 전사가 개시되는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 영역에 인접하게 위치하거나 이와 중첩될 수 있는 조절 DNA 영역을 일반적으로 지칭한다. 프로모터는 종종 전사 인자로서 지칭되는 단백질 인자에 결합하는 특이적 DNA 서열을 함유할 수 있는데, 상기 인자는 RNA 중합효소가 DNA에 결합하는 것을 용이하게 하여 유전자 전사를 유도한다. '코어 프로모터'로도 지칭되는 '기저 프로모터(basal 프로모터)'는 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 전사 발현을 촉진하는 모든 필수 기본 요소를 함유하는 프로모터를 일반적으로 지칭할 수 있다. 진핵생물 기저 프로모터는, 반드시 그런 것은 아니지만, 통상적으로, TATA-박스 및/또는 CAAT 박스를 함유한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드가 DNA 템플릿으로부터 (예컨대 mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 공정 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 공정을 일반적으로 지칭한다. 전사체 및 암호화된 폴리펩티드는 "유전자 산물"로서 통칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 연결된(operably linked, operable linkage, operatively linked)" 또는 이와 문법적으로 동등한 표현은 유전자 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 서열 등의 병치를 일반적으로 지칭하는데, 여기서 요소들은 이들이 예상된 방식으로 작동하도록 허용하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서 서열을 포함할 수 있는 조절 요소가 코딩 서열의 전사 개시에 도움을 주는 경우, 조절 요소는 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한, 조절 요소와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 일반적으로 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 폴리뉴클레오티드와 결합하고 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달하는 것을 매개하는데 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자의 연관을 지칭한다. 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 및 기타 유전자 전달 비히클을 포함한다. 벡터는 유전자에 작동 가능하게 연결되어 표적에서 유전자의 발현을 용이하게 하는 유전자 요소, 예를 들어 조절 요소를 일반적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "발현 카세트" 및 "핵산 카세트"는 함께 발현되거나 발현을 위해 작동 가능하게 연결된 핵산 서열 또는 요소의 조합을 지칭하기 위해 일반적으로 상호 교환적으로 사용된다. 일부 경우에, 발현 카세트는 조절 요소와 발현을 위해 조절 요소가 작동 가능하게 연결되는 유전자의 조합을 지칭한다.
DNA 또는 단백질 서열의 "기능적 단편"은 전장 DNA 또는 단백질 서열의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능적 또는 구조적 활성)을 보유하는 단편을 일반적으로 지칭한다. DNA 서열의 생물학적 활성은 전장 서열에 기인하는 것으로 알려진 방식으로 발현에 영향을 미치는 이의 능력일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조작된" 객체란 객체가 인간 개입에 의해 변형되었음을 일반적으로 나타낸다. 비제한적인 예에 따르면: 핵산은 이의 서열을 자연에서 발생하지 않는 서열로 변경함으로써 변형될 수 있고; 핵산은 이 핵산을 자연에서 연관되지 않는 핵산과 결합시키되, 결합 산물이 원래 핵산에 존재하지 않는 기능을 갖도록 결합시킴으로써 변형될 수 있고; 조작된 핵산은 자연에서 존재하지 않는 서열을 이용해 시험관 내에서 합성될 수 있고; 단백질은 이의 아미노산 서열을 자연에서 존재하지 않는 서열과 치환함으로써 변형될 수 있고; 조작된 단백질은 새로운 기능 또는 특성을 획득할 수 있다. "조작된" 시스템은 적어도 하나의 조작된 구성요소를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "합성" 및 "인공"은, 대체적으로 자연 발생 인간 단백질과 낮은 서열 동일성(예를 들어, 50% 미만의 서열 동일성, 25% 미만의 서열 동일성, 10% 미만의 서열 동일성, 5% 미만의 서열 동일성, 1% 미만의 서열 동일성)을 갖는 단백질 또는 이의 도메인을 지칭하도록 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, VPR 및 VP64 도메인은 합성 전사 활성화 도메인이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Cas12a"는 대체적으로 클래스 2, V-A형 Cas 엔도뉴클레아제이고, (a) CRISPR 어레이로부터의 전사 후 뉴클레아제 자체에 의해 가공되는 비교적 작은 가이드 RNA(약 42 내지 44개 뉴클레오티드)를 사용하고, (b) 엇갈린 절단 부위를 남기도록 DNA를 절단하는 Cas 엔도뉴클레아제의 계통을 지칭한다. 이러한 효소 계통의 추가 특징은, 예를 들어, Zetsche B, Heidenreich M, Mohanraju P 등의 문헌 [Nat Biotechnol 2017;35:31-34], 및 Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO 등의 문헌 Cell 2015;163:759-771]에서 확인할 수 있으며, 이는 본원에 참조로서 통합된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "가이드 핵산"은 다른 핵산에 혼성화될 수 있는 핵산을 일반적으로 지칭할 수 있다. 가이드 핵산은 RNA일 수 있다. 가이드 핵산은 DNA일 수 있다. 가이드 핵산은 핵산의 서열에 부위 특이적으로 결합하도록 프로그래밍될 수 있다. 표적화될 핵산 또는 표적 핵산은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가이드 핵산은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 핵산의 일부는 가이드 핵산의 일부에 상보적일 수 있다. 가이드 핵산에 상보적이고 가이드 핵산과 혼성화되는 이중-가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 가닥은 상보적 가닥으로 지칭될 수 있다. 상보적 가닥에 상보적이고, 따라서 가이드 핵산에 상보적이 아닐 수 있는 이중-가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 가닥은 비상보적 가닥으로 지칭될 수 있다. 가이드 핵산은 하나의 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함할 수 있고 "단일 가이드 핵산"으로 지칭될 수 있다. 가이드 핵산은 2개의 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함할 수 있고 "이중 가이드 핵산"으로 지칭될 수 있다. 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "가이드 핵산"은 단일 가이드 핵산 및 이중 가이드 핵산 둘 다를 포함할 수 있고, 둘 다를 지칭할 수 있다. 가이드 핵산은 "핵산-표적화 분절" 또는 "핵산-표적화 서열" 또는 "스페이서 서열"로서 지칭될 수 있는 분절을 포함할 수 있다. 핵산-표적화 분절은 "단백질 결합 분절" 또는 "단백질 결합 서열" 또는 "Cas 단백질 결합 분절"로서 지칭될 수 있는 하위 분절을 포함할 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서의 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성 백분율"은, 서열 비교 알고리즘을 사용해 측정했을 때, 부분적 또는 전체 비교 윈도우에 걸쳐 비교하고 최대 상응에 정렬했을 때 동일한 2개(예를 들어, 쌍으로 정렬했을 때) 또는 그 이상(예를 들어, 다수의 서열을 정렬했을 때)의 서열; 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율을 갖는 2개(예를 들어, 쌍으로 정렬했을 때) 또는 그 이상(예를 들어, 다수의 서열을 정렬했을 때)의 서열을 일반적으로 지칭한다. 폴리펩티드 서열에 대한 적절한 서열 비교 알고리즘은 예를 들어 다음을 포함한다: 단어 길이(W) 3, 기대치(E) 10의 파라미터, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(존재 11, 연장 1의 갭 비용 설정)를 사용하고, 30개 잔기를 초과하는 길이의 폴리펩티드 서열에 대해서는 조건부 조성 스코어 매트릭스 조정(conditional compositional score matrix)을 사용하는 BLASTP; 단어 길이(W) 2, 기대치(E) 1000000의 파라미터, 및 30개 잔기 미만의 서열에 대해서는 PAM30 스코어링 매트릭스(개방 갭 9, 연장 갭 1의 갭 비용 설정 - 이들은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 이용할 수 있는 BLAST 세트 중 BLASTP에 대한 디폴트 파라미터임)를 사용하는 BLASTP; 일치 2, 불일치 -1, 및 갭 -1의 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘 파라미터를 사용하는 CLUSTALW; 디폴트 파라미터를 사용하는 MUSCLE; retree 2 및 최대 반복 1000의 파라미터를 사용하는 MAFFT; 디폴트 파라미터를 사용하는 Novafold; 디폴트 파라미터를 사용하는 HMMER hmmalign.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "최적으로 정렬된"은 일반적으로, 예를 들어, 최고 또는 "최적화된" 동일성 백분율 점수를 생성하는 정렬에 의해 결정했을 때, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 최대 상응성에 정렬된 2개 이상의 (예를 들어, 쌍 정렬의) (예를 들어, 다중 서열 정렬의) 서열을 지칭한다.
하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 본원에 기술된 효소 중 어느 하나의 변이체가 본 개시에 포함된다. 이러한 보존적 치환은 폴리펩티드의 3차원 구조 또는 기능을 파괴하지 않고도 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 이루어질 수 있다. 보존적 치환은 소수성, 극성, 및 R 사슬 길이가 서로 유사한 아미노산들을 치환함으로써 달성될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상이한 종의 상동성 단백질의 정렬된 서열을 비교함으로써, 종들 간에 돌연변이된 아미노산 잔기(예를 들어, 암호화된 단백질의 기본 기능을 변경시키지 않은 비보존적 잔기)를 위치시킴으로써 보존적 치환을 식별할 수 있다. 이러한 보존적으로 치환된 변이체는 본원에 기술된 엔도뉴클레아제 단백질 서열 중 어느 하나(예를 들어, 본원에 기술된 MG90, MG91A, MG91B, MG91C, MG118, MG119, MG120, MG122, 또는 MG126 계열 엔도뉴클레아제, 또는 본원에 기술된 임의의 다른 계열의 뉴클레아제)와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 보존적으로 치환된 변이체는 기능적 변이체이다. 이러한 기능적 변이체는 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 중요한 활성 부위 잔기 또는 가이드 RNA 결합 잔기의 활성이 파괴되지 않도록 치환된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 단백질 중 어느 하나의 기능적 변이체에는 도 2a, 3a, 4a, 5a, 또는 6a에 언급된 보존 또는 기능적 잔기 적어도 하나의 치환이 결여되어 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 단백질 중 어느 하나의 기능적 변이체에는 도 2a, 3a, 4a, 5a, 또는 6a에 언급된 보존 또는 기능적 잔기 모두의 치환이 결여되어 있다.
또한, 본 개시에는 효소의 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 하나 이상의 촉매 잔기의 치환을 갖는, 본원에 기술된 효소 중 어느 하나의 변이체(예를 들어, 감소된-활성 변이체)가 포함된다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 단백질로서의 감소된 활성 변이체는 도 2a, 3a, 4a, 5a, 또는 6a에 언급된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개의 촉매 잔기 모두의 파괴 치환을 포함한다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 다양한 참조 문헌을 통해 이용할 수 있다(예를 들어, Creighton의 문헌[단백질s: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (1993년 12월)] 참조). 다음의 8개의 기는 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 각각 함유한다:
1) 알라닌 (A), 글리신 (G);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);
7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및
8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)
개요
독특한 기능 및 구조를 갖는 새로운 Cas 효소의 발견은 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 파괴할 수 있는 편집 기술을 제공함으로써, 속도, 특이성, 기능, 및 사용 편이성을 개선할 수 있다. 미생물에서 CRISPR 시스템의 예측 유병률 및 미생물 종의 순수한 다양성과 관련하여, 기능적으로 특성화된 CRISPR/Cas 효소는 문헌에 상대적으로 거의 존재하지 않는다. 이는 부분적으로는 많은 수의 미생물 종이 실험실 조건에서 쉽게 배양되지 않을 수 있기 때문이다. 많은 수의 미생물 종을 포함하는 자연 환경 적소로부터의 메타게놈 시퀀싱은 알려진 신규 CRISPR/Cas 시스템의 수를 극적으로 증가시키고 새로운 올리고뉴클레오티드 편집 기능의 발견을 가속화할 수 있는 가능성을 제공할 수 있다. 이러한 접근법의 결실에 대한 최근의 예는 2016년에 천연 미생물 군집의 메타게놈 분석에서 CasX/CasY CRISPR 시스템을 발견한 것에 의해 입증된다.
CRISPR/Cas 시스템은 미생물에서 적응성 면역 체계로서 기능하는 것으로 기술된 RNA-지향성 뉴클레아제 복합체이다. 이들의 자연적인 맥락에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR(일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열) 오페론 또는 유전자좌에서 발생하며, 이는 일반적으로 2개의 부분을 포함한다: (i) RNA-기반 표적화 요소를 암호화하는, 동일하게 짧은 스페이서 서열에 의해 분리된 짧은 반복 서열(30 내지 40 bp)의 어레이; 및 (ii) 부속 단백질/효소와 함께 RNA-기반 표적화 요소가 지향하는 뉴클레아제 폴리펩티드를 암호화하는 Cas를 암호화하는 ORF. 특정 표적 핵산 서열의 효율적인 뉴클레아제 표적화는 일반적으로 다음 두 가지 모두를 필요로 한다: (i) 표적의 첫 6 내지 8개의 핵산(표적 시드)과 crRNA 가이드 사이의 상보적 혼성화; 및 (ii) 표적 시드의 정의된 근위 이내에 프로토스페이서-인접 모티프(PAM) 서열의 존재(PAM은 일반적으로 숙주 게놈 내에서 흔히 나타나지 않는 서열임). 시스템의 정확한 기능 및 구성에 따라, CRISPR-Cas 시스템은 공통의 기능적 특성 및 진화적 유사성을 기반으로 일반적으로 2개의 클래스, 5개의 유형, 및 16개의 하위 유형으로 구성된다(도 1 참조).
클래스 I CRISPR-Cas 시스템은 큰 다중 서브유닛 효과기 복합체를 가지며, I형, III형, 및 IV형을 포함한다. 클래스 II CRISPR-Cas 시스템은 단일-폴리펩티드 다중도메인 뉴클레아제 효과기를 일반적으로 가지며, II형, V형, 및 VI형을 포함한다.
II형 CRISPR-Cas 시스템은 구성요소 측면에서 가장 단순한 것으로 간주된다. II형 CRISPR-Cas 시스템에서, CRISPR 어레이를 성숙한 crRNA로 가공하는 데에는 특별한 엔도뉴클레아제 서브유닛의 존재가 필요하지 않고, 오히려 어레이 반복 서열에 상보적인 영역을 갖는 작은 트랜스-암호화된 crRNA(tracrRNA)가 필요하며; 여기서 tracrRNA는 이의 상응하는 효과기 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 및 반복 서열 둘 다와 상호작용하여 전구체 dsRNA 구조를 형성하는데, 이는 내인성 RNAse III에 의해 절단되어 tracrRNA 및 crRNA 둘 다와 함께 로딩되는 성숙한 효과기 효소를 생성한다. Cas II 뉴클레아제는 DNA 뉴클레아제로서 알려져 있다. 2형 효가기는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인의 접힘부 내에 삽입된 무관한 HNH 뉴클레아제 도메인과 함께 RNase H 접힘부를 입양하는 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인으로 이루어진 구조를 일반적으로 나타낸다. RuvC-유사 도메인은 표적 (예를 들어, crRNA 상보적인) DNA 가닥의 절단을 담당하는 반면, HNH 도메인은 변위된 DNA 가닥의 절단을 담당한다.
V형 CRISPR-Cas 시스템은 II형 효과기의 구조와 유사하고, RuvC-유사 도메인을 포함하는 뉴클레아제 효과기(예를 들어, Cas 12) 구조를 특징으로 한다. II형과 유사하게, (전부는 아니지만) 대부분의 V형 CRISPR 시스템은 tracrRNA를 사용해 pre-crRNA를 성숙한 crRNA로 처리하지만; pre-crRNA를 다수의 crRNA로 절단하기 위해 RNAse III을 필요로 하는 II형 시스템과 달리, V형 시스템은 효과기 뉴클레아제 자체를 사용해 pre-crRNA를 절단할 수 있다. II형 CRISPR-Cas 시스템과 마찬가지로, V형 CRISPR-Cas 시스템도 DNA 뉴클레아제로서 알려져 있다. II형 CRISPR-Cas 시스템과 달리, 일부 V형 효소(예를 들어, Cas12a)는 이중-가닥 표적 서열의 제1 crRNA 가이드 절단에 의해 활성화되는 강력한 단일-가닥 비특이적 데옥시리보뉴클레아제 활성을 갖는 것으로 보인다.
CRISPR-Cas 시스템은 표적화 가능성과 사용 용이성으로 인해 최근 몇 년 동안 유전자 편집 기술의 선택지로서 각광받고 있다. 가장 흔히 사용되는 시스템은 클래스 2 II형 SpCas9 및 클래스 2 V-A형 Cas12a(종래 Cpf1)이다. 특히, V-A형 시스템은 세포에서 기록되는 특이성이 다른 뉴클레아제보다 높고, 오프-타겟 효과가 적거나 없기 때문에 점차적으로 널리 사용되고 있다. V-A 시스템은 또한 가이드 RNA가 작고(SpCas9 경우의 대략 100 nt와 비교하여 42 내지 44개의 뉴클레오티드) CRISPR 어레이로부터의 전사 후 뉴클레아제 자체에 의해 처리되기 때문에, 다중 유전자 편집으로 다중화된 응용을 단순화시킨다는 점에서 유리하다. 또한, V-A 시스템은 엇갈린 절단 부위를 가지며, 이는 미세상동성-의존성 표적 통합(MITI)과 같은 유도 복구 경로를 촉진시킬 수 있다.
가장 통상적으로 사용되는 V-A형 효소는 선택된 표적 부위 옆에 다음과 같은 5' 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 필요로 한다:
라흐노스피라세아(Lachnospiraceae) 박테리움 ND2006 LbCas12a 및 애시드아미노코커스 속(Acidaminococcus sp.) AsCas12a의 경우 5'-TTTV-3'; 및 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) FnCas12a의 경우 5'-TTV-3'. 최근의 병렬상동체(ortholog)에 대한 연구는, 포유류 세포 배양물, 예를 들어, YTV, YYN 또는 TTN에서도 활성인, 보다 덜 제한적인 PAM 서열을 갖는 단백질을 발견하였다. 그러나, 이들 효소는 V형 생물다양성 및 표적화 능력을 완전히 포함하지 않으며, 모든 가능한 활성 및 PAM 서열 요건을 나타내지 않을 수 있다. 여기서, 수천 개의 게놈 단편을 V형 뉴클레아제에 대한 다수의 메타게놈으로부터 채굴하였다. 알려진 V 효소의 다양성이 확장되었을 수 있고, 신규 시스템이 고도로 표적화되고, 콤팩트하고, 정확한 유전자 편집제로 개발되었을 수 있다.
MG 효소
V형 CRISPR 시스템은 다양한 게놈 편집 응용에 사용하기 위해 신속하게 채택되고 있다. 이러한 프로그램 가능한 뉴클레아제는 적응성 미생물 면역계의 일부이며, 이의 자연 다양성은 대부분 밝혀지지 않았다. V형 CRISPR 효소의 신규 계통을 다양한 복잡한 환경으로부터 수집된 메타게놈의 대규모 분석을 통해 식별하고, 이들 시스템의 대표를 유전자 편집 플랫폼으로 개발하였다. 이들 시스템의 대부분은 미배양 유기체로부터 유래하며, 이들 중 일부는 동일한 CRISPR 작동부 내에 발산 V형 효과기를 암호화한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 신규 V형 후보를 제공한다. 이들 후보는 하나 이상의 신규한 하위유형을 나타낼 수 있고, 일부 하위 계열이 식별되었을 수 있다. 이들 뉴클레아제는 약 900개 아미노산의 길이이다. 이들 신규한 하위 유형은 알려진 V형 효과기와 동일한 CRISPR 유전자좌에서 발견될 수 있다. RuvC 촉매 잔기는 신규한 V형 후보에 대해 식별되었을 수 있으며, 이들 신규한 V형 후보는 tracrRNA를 필요로 하지 않을 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 더 작은 V형 효과기를 제공한다. 이러한 효과기는 작은 추정 효과기일 수 있다. 이들 효과기는 전달을 단순화할 수 있고 치료 적용을 연장할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 신규한 V형 효과기를 제공한다. 이러한 효과기는 본원에 기술된 바와 같은 MG90일 수 있다(도 3a 내지 3c 참조). 이러한 효과기는 본원에 기술된 바와 같은 MG91일 수 있다(도 8a 내지 8b 참조). 이러한 효과기는 본원에 기술된 바와 같은 MG118일 수 있다(도 5a 내지 5c 참조). 이러한 효과기는 본원에 기술된 바와 같은 MG119일 수 있다(도 2a 내지 2d 참조). 이러한 효과기는 본원에 기술된 바와 같은 MG120일 수 있다(도 7a 내지 7c 참조). 이러한 효과기는 본원에 기술된 바와 같은 MG122일 수 있다(도 6a 내지 6c 참조). 이러한 효과기는 본원에 기술된 바와 같은 MG126일 수 있다(도 4a 내지 4c 참조).
일 측면에서, 본 개시내용은 메타게놈 시퀀싱을 통해 발견된 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공한다. 일부 경우, 메타게놈 시퀀싱은 샘플에 대해 수행된다. 일부 경우, 샘플은 다양한 환경으로부터 수집될 수 있다. 이러한 환경은 인간 마이크로바이옴, 동물 마이크로바이옴, 고온을 갖는 환경, 저온을 갖는 환경일 수 있다. 이러한 환경은 침전물을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 개시내용은 엔도뉴클레아제를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 신규한 하위 유형의 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래된다. 엔도뉴클레아제는 RuvC 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템은 조작된 가이드 RNA를 포함한다. 일부 경우, 조작된 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된다. 일부 경우, 조작된 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 경우, 스페이서 서열은 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성된다.
일 측면에서, 본 개시내용은 엔도뉴클레아제를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 70% 서열 동일성을 갖는다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는다.
일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 실질적으로 동일할 수 있다.
일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템은 조작된 가이드 RNA를 포함한다. 일부 경우, 조작된 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된다. 일부 경우, 조작된 가이드 RNA는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 경우, 스페이서 서열은 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성된다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된다.
일부 경우, 엔도뉴클레아제는 Cpf1 또는 Cms1 엔도뉴클레아제가 아니다.
일부 경우, 가이드 RNA는 서열번호 410-419의 처음 19개 뉴클레오티드 또는 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 서열번호 410-419의 처음 19개 뉴클레오티드 또는 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 서열번호 410-419의 처음 19개 뉴클레오티드 또는 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 서열번호 410-419의 처음 19개 뉴클레오티드 또는 비-축퇴성 뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, 가이드 RNA는 서열번호 410-419의 처음 19개 뉴클레오티드 또는 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 RNA에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, Cas 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 RNA에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 클래스 2 Cas 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 RNA에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 RNA에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 클래스 2, V형, 신규한 아형 Cas 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 RNA에 결합하도록 구성된다.
일부 경우, 가이드 RNA는 진핵생물, 진균류, 식물, 포유류, 또는 인간 게놈 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 진핵생물 게놈 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 진균류 게놈 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 식물 게놈 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 포유류 게놈 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 인간 게놈 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
일부 경우, 가이드 RNA는 30-250개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우, 가이드 RNA는 42-44개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우, 가이드 RNA는 42개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우, 가이드 RNA는 43개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우, 가이드 RNA는 44개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우, 가이드 RNA는 85-245개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우, 가이드 RNA는 90개 초과 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우, 가이드 RNA는 245개 미만 뉴클레오티드 길이이다.
일부 경우, 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. NLS는 엔도뉴클레아제의 N-말단 또는 C-말단에 근접할 수 있다. NLS는 서열번호 630-645 중 어느 하나, 또는 서열번호 630-645 중 어느 하나와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 변이체에 대해 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 일부 경우, NLS는 서열번호 630-645 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따라 Cas 효과기와 함께 사용될 수 있는 NLS 서열의 예.
공급원 NLS 아미노산 서열 서열번호
SV40 PKKKRKV 630
뉴클레오플라스민 이분 NLS KRPAATKKAGQAKKKK 631
c-myc NLS PAAKRVKLD 632
c-myc NLS RQRRNELKRSP 633
hRNPA1 M9 NLS NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY 634
임포르틴-알파 IBB 도메인 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV 635
Myoma T 단백질 VSRKRPRP 636
Myoma T 단백질 PPKKARED 637
p53 PQPKKKPL 638
마우스 c-abl IV SALIKKKKKMAP 639
인플루엔자 바이러스 NS1 DRLRR 640
인플루엔자 바이러스 NS1 PKQKKRK 641
간염 바이러스 델타 항원 RKLKKKIKKL 642
마우스 Mx1 단백질 REKKKFLKRR 643
인간 폴리(ADP-리보오스) 중합효소 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK 644
스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드 RKCLQAGMNLEARKTKK 645
일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템은 단일 또는 이중-가닥 DNA 복구 템플릿을 추가로 포함한다. 일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템은 단일-가닥 DNA 복구 템플릿을 추가로 포함한다. 일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템은 이중-가닥 DNA 복구 템플릿을 추가로 포함한다. 일부 경우, 단일 또는 이중-가닥 DNA 복구 템플릿은 5'에서 3'으로 다음을 포함할 수 있다: 상기 표적 데옥시리보핵산 서열의 5'에 있는 적어도 20개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 제1 상동 아암, 적어도 10개 뉴클레오티드의 합성 DNA 서열, 및 전술한 표적 서열의 3'에 있는 적어도 20개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 제2 상동 아암.
일부 경우, 제1 상동 아암은 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 175개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 750개, 또는 적어도 1000개 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 경우, 제2 상동 아암은 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 175개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 750개, 또는 적어도 1000개 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 경우, 제1 및 제2 상동 아암은 원핵생물의 게놈 서열과 상동이다. 일부 경우, 제1 및 제2 상동 아암은 박테리아의 게놈 서열과 상동이다. 일부 경우, 제1 및 제2 상동 아암은 진균의 게놈 서열과 상동이다. 일부 경우, 제1 및 제2 상동 아암은 진핵생물의 게놈 서열과 상동이다.
일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템은 DNA 복구 템플릿을 추가로 포함한다. DNA 복구 템플릿은 이중-가닥 DNA 분절을 포함할 수 있다. 이중-가닥 DNA 분절에는 하나의 단일-가닥 DNA 분절이 측면에 위치할 수 있다. 이중-가닥 DNA 분절에는 2개의 단일-가닥 DNA 분절이 측면에 위치할 수 있다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 이중-가닥 DNA 분절의 5' 말단에 접합된다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 이중-가닥 DNA 분절의 3' 말단에 접합된다.
일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 1 내지 15개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 4 내지 10개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 4개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 5개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 6개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 7개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 8개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 9개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다. 일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 10개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는다.
일부 경우, 단일-가닥 DNA 분절은 스페이서 서열 내의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 경우, 이중-가닥 DNA 서열은 바코드, 개방 해독 프레임, 인핸서, 프로모터, 단백질 코딩 서열, miRNA 코딩 서열, RNA 코딩 서열, 또는 이식유전자를 포함한다.
일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템은 Mg2+의 공급원을 추가로 포함한다.
일부 경우, 가이드 RNA는 적어도 8개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 적어도 9개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 적어도 10개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 적어도 11개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀을 포함한다. 일부 경우, 가이드 RNA는 적어도 12개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀을 포함한다.
일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 70% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 엔도뉴클레아제는 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, BLASTP, CLUSTALW, MUSCLE, 또는 MAFFT 알고리즘, 또는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘 파라미터를 사용하는 CLUSTALW 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 서열 동일성은, 단어 길이(W) 3, 기대치(E) 10의 파라미터, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(존재 11, 연장 1의 갭 비용 설정)를 사용하고, 조건부 조성 스코어 매트릭스 조정을 사용하는, 전술한 BLASTP 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정될 수 있다.
일 측면에서, 본 개시내용은 (a) DNA-표적화 분절을 포함하는 조작된 가이드 RNA를 제공한다. 일부 경우, DNA-표적화 분절은 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우, 표적 서열은 표적 DNA 분자 내에 있다. 일부 경우, 조작된 가이드 RNA는 단백질-결합 분절을 포함한다. 일부 경우, 단백질-결합 분절은 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장을 포함한다. 일부 경우, 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장은 혼성화되어 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체를 형성한다. 일부 경우, 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장은 개재 뉴클레오티드와 서로 공유 결합된다. 일부 경우, 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 경우, 복합체는 표적 DNA 분자의 표적 서열을 표적화한다. 일부 경우, DNA-표적화 분절은 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장 둘 모두의 3'에 위치한다.
일부 경우, 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체는 적어도 8개의 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우, 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체는 적어도 9개의 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우, 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체는 적어도 10개의 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우, 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체는 적어도 11개의 리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우, 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체는 적어도 12개의 리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 경우, 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 암호화한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 경우, 조작된 핵산 서열은 유기체에서의 발현에 최적화된다. 일부 경우, 핵산은 엔도뉴클레아제를 암호화한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2, V형, 신규한 하위 유형의 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래된다. 일부 경우, 유기체는 미배양 유기체가 아니다.
일부 경우, 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 경우, 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. NLS는 엔도뉴클레아제의 N-말단 또는 C-말단에 근접할 수 있다. NLS는 서열번호 630-645 중 어느 하나, 또는 서열번호 630-645 중 어느 하나와 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 변이체에 대해 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다.
일부 경우, 유기체는 원핵생물이다. 일부 경우, 유기체는 박테리아이다. 일부 경우, 유기체는 진핵생물이다. 일부 경우, 유기체는 진균류이다. 일부 경우, 유기체는 식물이다. 일부 경우, 유기체는 포유류이다. 일부 경우, 유기체는 설치류이다. 일부 경우, 유기체는 인간이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 조작된 벡터를 제공한다. 일부 경우, 조작된 벡터는 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2, V형, 신규한 하위 유형의 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래된다.
일부 경우, 조작된 벡터는 본원에 기술된 핵산을 포함한다. 일부 경우, 본원에 기술된 핵산은 본원에 기술된 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드이다. 일부 경우, 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노-연관 바이러스(AAV) 유래 비리온, 렌티바이러스이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 엔도뉴클레아제를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 경우, 방법은 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 결합, 절단, 마킹, 또는 변형시키는 방법을 제공한다. 방법은 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 클래스 2, V형, 신규한 하위 유형의 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 RNA와 복합체를 이룬다. 일부 경우, 조작된 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 조작된 가이드 RNA는 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 조작된 가이드 RNA는 엔도뉴클레아제 및 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함한다.
일부 경우, 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 조작된 가이드 RNA의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 가닥 및 PAM을 포함하는 제2 가닥을 포함한다. 일부 경우, PAM은 조작된 가이드 RNA의 서열에 상보적인 서열의 5' 말단에 바로 인접한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 Cpf1 엔도뉴클레아제 또는 Cms1 엔도뉴클레아제가 아니다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래된다. 일부 경우, 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 진핵생물, 식물, 진균류, 포유류, 설치류, 또는 인간 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드이다.
일 측면에서, 본 개시내용은 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기술된 조작된 뉴클레아제 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 리보핵산 구조와 복합체를 형성하도록 구성된다. 일부 경우, 복합체는 해당 복합체가 표적 핵산 유전자좌에 결합할 때, 해당 복합체가 표적 핵산 유전자좌를 변형시키도록 구성된다.
일부 경우, 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 단계는 표적 핵산 유전자좌에 대한 결합, 니킹, 절단, 또는 마킹하는 단계를 포함한다. 일부 경우, 표적 핵산 유전자좌는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함한다. 일부 경우, 표적 핵산은 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 또는 박테리아 DNA를 포함한다. 일부 경우, 표적 핵산 유전자좌는 시험관 내에 있다. 일부 경우, 표적 핵산 유전자좌는 세포 내에 있다. 일부 경우, 세포는 원핵생물 세포, 박테리아 세포, 진핵생물 세포, 진균류 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 영장류 세포, 또는 인간 세포이다.
일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템의 표적 핵산 유전자좌에 대한 전달은 본원에 기술된 핵산 또는 본원에 기술된 벡터를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템의 표적 핵산 유전자좌에 대한 전달은 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 경우, 핵산은 프로모터를 포함한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템의 표적 핵산 유전자좌에 대한 전달은 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임을 함유하는 캡핑된 mRNA를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템의 표적 핵산 유전자좌에 대한 전달은 번역된 폴리펩티드를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 경우, 조작된 뉴클레아제 시스템의 표적 핵산 유전자좌에 대한 전달은 리보핵산(RNA) pol III 프로모터에 작동 가능하게 연결된 조작된 가이드 RNA를 암호화하는 데옥시리보핵산(DNA)을 전달하는 단계를 포함한다.
일부 경우, 엔도뉴클레아제는 표적 유전자좌에서 또는 이에 근접하여 단일-가닥 파단 또는 이중-가닥 파단을 유도한다. 일부 경우, 엔도뉴클레아제는 전술한 표적 유전자좌 내에서 또는 이의 3'에서 엇갈린 단일-가닥 파단을 유도한다.
일부 경우, 효과기 반복 모티프는 MG 뉴클레아제의 가이드 설계에 정보를 제공하는 데 사용된다. 예를 들어, V형 시스템의 처리된 gRNA는 CRISPR 반복의 마지막 20-22개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 이러한 서열은 (스페이서와 함께) crRNA로 합성될 수 있고, 가능한 표적의 라이브러리 상에서 절단을 위해 합성된 뉴클레아제와 함께 시험관 내에서 시험될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, PAM이 결정될 수 있다. 일부 경우, V형 효소는 "범용" gRNA를 사용할 수 있다. 일부 경우, V형 효소는 고유 gRNA를 필요로할 수 있다.
본 개시내용의 시스템은, 예를 들어 핵산 편집(예를 들어, 유전자 편집), 핵산 분자에 대한 결합(예를 들어, 서열-특이적 결합)과 같은 다양한 응용에 사용될 수 있다. 이러한 시스템은, 예를 들어 대상체에서 질환을 유발할 수 있는 유전적으로 물려받은 돌연변이를 처리(예를 들어 제거 또는 치환)하는 데 사용될 수 있고, 세포에서 유전자의 기능을 확실하게 하기 위해 유전자를 불활성화시키는 데 사용될 수 있고, (예를 들어, 역-전사된 바이러스 RNA를 절단하거나 질환-유발 돌연변이를 암호화하는 증폭된 DNA 서열을 절단함으로써) 질환을 유발하는 유전적 요소를 검출하기 위한 진단 도구로서 사용될 수 있고, 특정 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 박테리아에서 항생제 내 박테리아를 암호화하는 서열)을 표적화하고 검출하기 위한 프로브와 조합된 비활성화된 효소로서 사용될 수 있고, 바이러스 게놈을 표적화함으로써 바이러스를 불활성화시키거나 바이러스가 숙주 세포를 감염시킬 수 없게 하는 데 사용될 수 있고, 유전자를 추가하거나 대사 경로를 변경하여 유기체가 귀중한 소분자, 거대분자, 또는 이차 대사물을 생산하도록 이를 조작하는 데 사용될 수 있고, 진화적 선택을 위한 유전자 구동 요소를 확립하는 데 사용될 수 있고, 바이오센서로서 외래 소분자 및 뉴클레오티드에 의한 세포 섭동을 검출하는 데 사용될 수 있다.
예
IUPAC 규칙에 따라, 다음의 약어가 예 전체에 걸쳐 사용된다:
A = 아데닌
C = 시토신
G = 구아닌
T = 티민
R = 아데닌 또는 구아닌
Y = 시토신 또는 티민
S = 구아닌 또는 시토신
W = 아데닌 또는 티민
K = 구아닌 또는 티민
M = 아데닌 또는 시토신
B = C, G, 또는 T
D = A, G, 또는 T
H = A, C, 또는 T
V = A, C, 또는 G
예 1 - 신규 단백질에 대한 메타게놈 분석 방법
퇴적물, 토양 및 동물로부터 메타게놈 샘플을 수집하였다. 데옥시리보핵산(DNA)을 Zymobiomics DNA 미니-분취 키트로 추출하고 Illumina HiSeq® 2500 상에서 시퀀싱하였다. 재산 소유자의 동의 하에 샘플을 수집하였다. 공개 소스로부터의 추가 원시 서열 데이터는 동물 미생물, 퇴전물, 토양, 온천, 열 벤트, 해양, 피트 보그, 퍼마프로스트, 및 하수 서열을 포함하였다. 신규한 Cas 효과기를 식별하기 위하여 클래스 II V형 Cas 효과기 단백질을 포함하는 알려진 Cas 단백질 서열에 기초하여 생성된 Hidden Markov 모델을 사용하여 메타게놈 서열 데이터를 검색하였다. 검색에 의해 식별된 신규한 효과기 단백질을 알려진 단백질과 정렬시켜 잠재적 활성 부위를 식별하였다. 이러한 메타게놈 워크플로우를 실행하여 본원에 기술된 MG90, MG91A, MG91B, MG91C, MG118, MG119, MG120, MG122, 및 MG126 계열을 기술하였다.
예 2 - CRISPR 시스템의 MG90, MG91A, MG91B, MG91C, MG118, MG119, MG120, MG122, 및 MG126 계열의 발견
예 1의 메타게놈 분석의 데이터 분석은 9개의 계열(MG90, MG91A, MG91B, MG91C, MG118, MG119, MG120, MG122, 및 MG126)을 포함하는 이전에 기술되지 않은 추정 CRISPR 시스템의 신규 클러스터를 나타냈다. 이들 신규 효소 및 이들의 예시적인 서브도메인에 대한 상응하는 단백질 및 핵산 서열은 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629로 제시된다.
예 3 -전사 및 번역을 위한 템플릿 DNA
모든 MG VU 및 CasPhi 뉴클레아제의 E. coli 코돈 최적화된 서열을 T7 프로모터를 갖는 플라스미드에서 정렬하였다(Twist Biosciences). 선형 템플릿을 PCR에 의해 플라스미드로부터 증폭시켜 T7 및 뉴클레아제 서열을 포함시켰다. 최소 어레이 선형 템플릿은 T7 프로모터, 고유 반복, 범용 스페이서, 및 고유 반복으로 이루어진 서열로부터 증폭되었으며, 증폭을 위한 어댑터 서열이 측면에 위치하였다. 범용 스페이서는 PAM 결정을 위해 스페이서에 인접한 8N 혼합 염기가 있는 8N 표적 라이브러리에서 스페이서와 매칭한다. ORF 또는 CRISPR 어레이 근처의 3개의 유전자간 서열을 메타게놈 콘티그로부터 식별하고, 증폭을 위한 측부 어댑터 서열을 갖는 gBlock으로서 정렬하였다(통합 DNA 기술).
예 4 -crRNA, 최소 어레이, 및 sgRNA의 시험관 내 전사
RNA를, HiScribe?? T7 고수율 RNA 합성 키트를 사용하여 시험관 내 전사에 의해 생산하였고 Monarch® RNA 세정 키트(New England Biolabs Inc.)를 사용하여 정제하였다. T7 전사를 위한 템플릿을 다양화하였다. crRNA의 경우, DNA 올리고를 T7 프로모터, 트리밍된 고유 반복, 및 범용 스페이서를 사용하여 설계하였다. 최소 어레이의 경우, 전술한 것과 동일한 템플릿을 사용하였다. sgRNA의 경우, DNA 초량체를 T7 프로모터, 트리밍된 tracrRNA, GAAA 테트라루프, 트리밍된 고유 반복, 및 범용 스페이서를 사용하여 설계하였다. 어댑터 프라이머로 최소 어레이 템플릿을 증폭시켰다. crRNA 및 sgRNA 템플릿을 역상보체로서 정렬하고, 95℃에서 2분 동안 1X IDT 이중체 완충액 중 T7 프로모터 서열을 갖는 프라이머로 어닐링한 다음, 0.1℃/초에서 22℃로 냉각시켜 전사에 적합한 하이브리드 ds/ssDNA 기질을 생성하였다. 전사 후, 그러나 세정 전에, 각각의 반응물을 DNAse I로 처리하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 모든 전사 산물을 RNA TapeStation을 통해 또는 변성 우레아 PAGE 겔을 통해 수율 및 순도에 대해 확인하였다.
예 5 -TXTL 발현
뉴클레아제, 유전자간 서열, 및 최소 어레이를 myTXTL®Sigma 70 Master Mix Kit(Arbor Biosciences)를 사용하여 전사-번역 반응 혼합물에서 발현시켰다. 최종 반응 혼합물은 5 nM 뉴클레아제 DNA 템플릿, 12 nM 유전자간 DNA 템플릿, 15 nM 최소 어레이 DNA 템플릿, 0.1 nM pTXTL-P70a-T7rnap, 및 1X의 myTXTL®Sigma 70 Master Mix를 함유하였다. 반응물을 29℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 다음, 4℃에서 보관하였다.
예 6 - PURExpress 발현
10 nM의 뉴클레아제 PCR 템플릿을 PURExpress® 시험관 내 단백질 합성 키트(New England Biolabs Inc.)를 사용하여 37℃에서 3시간 동안 발현시켜 시험관 내 전사된 RNA로 절단하였다. 이들 반응을 사용하여 절단 반응 섹션에 기술된 것과 동일한 절차에 따라 50 nM sgRNA 또는 최소 어레이 RNA로 시험관 내 절단을 시험하였다.
예 7 - E. coli 발현
효과기, 게놈 콘티그로부터의 유전자간 서열, 고유 반복, T7 프로모터를 갖는 범용 스페이서 서열을 암호화하는 플라스미드를 BL21 DE3 또는 T7 Express lysY/Iq 내로 형질전환시키고, 100 μg/mL의 암피실린이 보충된 60 mL의 강력 브로스 배지에서 37℃에서 배양하였다. 배양물이 0.5의 OD600nm에 도달한 후 0.4 mM IPTG로 발현을 유도하고, 세포를 16℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 25 mL의 세포를 원심분리로 펠릿화하고, 1.5 mL의 용해 완충액(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 1 mM TCEP, 5% 글리세롤, Pierce Protease Inhibitor를 포함한 10 mM MgCl2 pH 7.5, (Thermo Scientific™))에 재현탁하였다. 그런 다음, 초음파처리로 세포를 용해시켰다. 상청액과 세포 파편을 원심분리로 분리하였다.
예 8 -절단 반응
플라스미드 라이브러리 DNA 절단 반응을, 5 nM의 표적 라이브러리, TXTL 또는 PURExpress 발현의 5배 희석물, 10 nM Tris-HCl, 10 nM MgCl2, 및 100 mM NaCl을 37℃에서 2시간 동안 혼합함으로써 수행하였다. 대장균 발현과의 반응의 경우, 10 μL의 정화된 용해물을 첨가하였다. 반응을 정지시키고 HighPrep™ PCR 세정 비드(MAGBIO Genomics, Inc.)로 세정하고, Tris EDTA pH 8.0 완충액에서 용리하였다. 3 nM의 절단 생성물 말단을 3.33 μM dNTP, 1X T4 DNA 리가아제 완충액, 및 0.167 U/μL의 Klenow Fragment(New England Biolabs Inc.)로 25℃에서 15분 동안 평활말단화(blunting)시켰다. 1.5 nM의 절단 생성물을 150 nM 어댑터, 1 X T4 DNA 리가아제 완충액(New England Biolabs Inc.), 및 20 U/μL T4 DNA 리가아제(New England Biolabs Inc.)와 실온에서 20분 동안 결찰시켰다. 결찰 생성물을 NGS 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시키고, NGS로 시퀀싱하여 PAM을 수득하였다. MG119-2의 시험관 내 활성이 도 9에 도시되어 있는 한편, MG119-2에 대한 PAM 결정은 도 10에 도시되어 있다.
예 9 -TXTL 및 E. coli 용해물로부터 유전자간 농축물의 RNAseq 라이브러리 제조
Quick-RNA™ Miniprep Kit(Zymo Research)에 따라 RNA를 TXTL 및 세포 용해물 발현으로부터 추출하고 30-50 μL의 물에 용리시켰다. 전사물의 총 농도를 Nanodrop, Tapestation, 및 Qubit 상에서 측정하였다.
Illumina(New England Biolabs Inc.)를 위한 NEBNext Small RNA Library Prep Set를 사용하여 각 샘플로부터의 100 ng 내지 1 ug의 총 RNA를 RNA 시퀀싱을 위해 준비하였다. 150-300 bp의 앰플리콘을 Tapestation 및 Qubit로 정량화하고 4 nM의 최종 농도로 풀링하였다. 12.5 pM의 최종 농도를 MiSeq V3 키트에 로딩하고, 총 176회 사이클 동안 Miseq 시스템(Illumina)에서 시퀀싱하였다. RNAseq 판독물을 사용하여 유전자의 tracr 서열을 식별하였다.
예 10 -예측된 RNA 접힘
활성 단일 RNA 서열의 예측된 RNA 접힘을 Andronescu 2007의 방법을 사용하여 37℃에서 연산하였다. 염기의 음영은 해당 염기의 염기쌍 확률에 해당한다.
예 11 -시험관 내 절단 효율 (예시)
T7 유도성 프로모터 하에 E. coli 프로테아제 결핍 B 균주에서 단백질을 발현시키고, 세포를 초음파처리를 사용하여 용해시키고, His-태그된 관심 단백질을 AKTA Avant FPLC(GE Lifescience) 상의 HisTrap FF(GE Lifescience) Ni-NTA 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제한다. 순도를 SDS-PAGE 및 InstantBlue Ultrafast(Sigma-Aldrich) 쿠마시 염색 아크릴아미드 겔(Bio-Rad) 상에서 분해된 단백질 밴드의 ImageLab 소프트웨어(Bio-Rad)에서의 밀도계를 사용하여 결정한다. 단백질을 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 5% 글리세롤; pH 7.5로 구성된 보관 완충액에서 탈염시키고 -80℃에서 보관한다.
NGS를 통해 결정된 스페이서 서열 및 PAM을 함유하는 표적 DNA를 작제한다. PAM 중 퇴행성 염기가 존재할 경우, 단일 대표 PAM을 시험을 위해 선택한다. 표적 DNA는 PCR 증폭을 통해 플라스미드로부터 유래된 2200 bp의 선형 DNA이다. PAM 및 스페이서는 일 말단으로부터 700 bp에 위치한다. 성공적인 절단은 700 및 1500 bp의 단편을 생성한다.
표적 DNA, 시험관 내 전사된 단일 RNA, 및 정제된 재조합 단백질을 과량의 단백질 및 RNA와 함께 절단 완충액(10 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) 중에 합치고 5분 내지 3시간, 통상적으로 1시간 동안 인큐베이션한다. RNAse A를 첨가하여 반응을 중단시키고 60℃에서 인큐베이션한다. 반응물을 1.2% TAE 아가로오스 겔 상에서 분리하고, 절단된 표적 DNA의 분율을 ImageLab 소프트웨어에서 정량화한다.
예 12 - E. coli 에서의 활성(예시)
박테리아 세포에서 뉴클레아제 활성을 시험하기 위해, 관심 효소에 특이적인 상응하는 PAM 서열을 갖는 표적 스페이서를 함유하는 게놈 서열로 균주를 작제한다. 그런 다음, 조작된 균주를 관심 뉴클레아제를 사용하여 형질전환시키고, 이어서 형질전환체를 화학적 만능성(chemocompetent)으로 만들고, 50 ng의 단일 가이드로 표적 서열에 특이적인 것(표적 내) 또는 표적에 비특이적인 것(표적 외) 중 하나로 형질전환시킨다. 열충격 후, 37℃에서 2시간 동안 SOC에서 형질전환체를 회수하고, 뉴클레아제 효율을 유도 배지 상에서 성장시킨 5배 희석 시리즈로 측정한다. 콜로니를 희석 시리즈로부터 3회 정량화한다.
예 13 -포유류 세포에서의 활성(예시)
포유류 세포에서의 표적화 및 절단 활성을 규명하기 위해, 단백질 서열을 다음 2개의 포유류 발현 벡터 내로 클로닝한다: C-말단 SV40 NLS 및 2A-GFP 태그를 갖는 하나의 벡터, 및 GFP 태그가 없고 2개의 NLS 서열을 갖는 하나의 벡터(N-말단 상의 하나의 벡터 및 C-말단 상의 하나의 벡터). 또한 사용될 수 있는 대안적인 NLS 서열. 단백질에 대한 DNA 서열은 천연 서열, E. coli 코돈 최적화된 서열, 또는 포유류 코돈 최적화된 서열일 수 있다. 관심 유전자 표적을 갖는 단일 가이드 RNA 서열을 포유류 발현 벡터 내로 클로닝한다. 2개의 플라스미드를 HEK293T 세포 내로 공동 형질감염시킨다. 발현 플라스미드 및 sgRNA 표적화 플라스미드를 HEK293T 세포 내로 공동 형질감염시킨 후 72시간차에, DNA를 추출하고 이를 NGS-라이브러리의 제조에 사용한다. NHEJ 백분율은 포유류 세포에서의 효소의 표적화 효율을 입증하기 위해 표적 부위의 시퀀싱에서의 인델을 통해 측정된다. 각각의 단백질 활성을 시험하기 위해 적어도 10개의 상이한 표적 부위를 선택한다.
예 14 - MG119 계열에서 콤팩트한 V형 뉴클레아제의 특성분석
MG119 계열에서 신규한 콤팩트한 V형 뉴클레아제의 인실리코 식별
콤팩트한 V형 뉴클레아제의 MG119 계열에서 뉴클레아제 서열과 관련된 예측된 단백질의 발견은 상동성 검색에 기초하였다. HMMER 소프트웨어(http://hmmer.org/)를 사용하여 검색을 수행하였다. V형 뉴클레아제 서열 히트는 다음 기준을 충족하는 경우 유지하였다: (i) hmmsearch e-값 ≤ 10-5이었음, (ii) 뉴클레아제를 암호화하는 유전자는 CRISPR 어레이로부터 1 kb 이내에 있었음, 및 (iii) 아미노산 서열 길이는 350 내지 700 aa 범위에 있었음. MMSeqs2(https://github.com/soedinglab/MMseqs2)를 사용하여 100% 아미노산 동일성에서 서열을 클러스터링하였고, 커버리지 모드 1 및 표적 서열의 80% 커버리지를 가졌다(파라미터 --cov-mode 1 -c 0.8 --min-seq-id 1.0). 전체적인 정렬을 위한 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 MAFFT(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)를 사용하여 다중 서열 정렬을 구축하기 위해 서열 대표를 선택하고, FastTree(https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009490)를 사용하여 계통발생 트리를 구축하였다. 뉴클레아제 유전자의 게놈 맥락을 포함하여, 계통발생 트리 상의 개별 계통군을 신중하게 검사한 결과 MG119 계열(서열번호 476-624 및 629)에서 여러 신규한 콤팩트한 V형 뉴클레아제 서열을 식별하였다.
추정 tracrRNA를 식별하기 위한 시험관 내 특성분석
예를 들어 뉴클레아제 MG119-2에 대한 추정 tracrRNA 서열을 식별하기 위해, myTXTL®Sigma 70 Master Mix Kit(Arbor Biosciences)를 사용하여, 인접 유전자간 서열 및 최소 어레이를 전사-번역 반응 혼합물에서 발현시켰다. 최종 반응 혼합물은 5 nM 뉴클레아제 DNA 템플릿, 12 nM 유전자간 DNA 템플릿, 15 nM 최소 어레이 DNA 템플릿, 0.1 nM pTXTL-P70a-T7rnap, 및 1X의 myTXTL®Sigma 70 Master Mix를 함유하였다. 반응물을 29℃에서 16시간 동안 인큐베이션한 다음, 4℃에서 보관하였다.
시험관 내 절단 반응을 통해 리보뉴클레오단백질 복합체를 시험하였다. 플라스미드 DNA 라이브러리 절단 반응을, 가능한 모든 8N PAM을 나타내는 5 nM의 표적 플라스미드 DNA 라이브러리, TXTL 발현의 5배 희석물, 10 nM Tris-HCl, 10 nM MgCl2, 및 100 mM NaCl을 37℃에서 2시간 동안 혼합함으로써 수행하였다. 반응을 정지시키고 HighPrep™ PCR 세정 비드(MAGBIO Genomics, Inc.)로 세정하고, Tris EDTA pH 8.0 완충액에서 용리하였다.
PAM 서열을 수득하기 위해, 3 nM의 절단 생성물 말단을 3.33 μM dNTP, 1X T4 DNA 리가아제 완충액, 및 0.167 U/μL의 Klenow Fragment(New England Biolabs Inc.)로 25℃에서 15분 동안 평활말단화 하였다. 1.5 nM의 절단 생성물을 150 nM 어댑터, 1 X T4 DNA 리가아제 완충액(New England Biolabs Inc.), 및 20 U/μL T4 DNA 리가아제(New England Biolabs Inc.)를 사용하여 실온에서 20분 동안 결찰시켰다. 결찰 생성물을 NGS 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시키고, NGS로 시퀀싱하였다.
tracrRNA 및 crRNA의 서열을 수득하기 위해, Quick-RNA™ Miniprep Kit(Zymo Research)에 이어서 TXTL 용해물로부터 RNA를 추출하고 30-50 μL의 물에서 용리하였다. 각 샘플로부터의 100 ng-1 μg의 총 RNA를 Illumina용 NEBNext Small RNA Library Prep Set(New England Biolabs Inc.)를 사용하여 RNA 시퀀싱을 위해 준비하였다. 150-300 bp의 앰플리콘을 Tapestation 및 Qubit로 정량화하고 4 nM의 최종 농도로 풀링하였다. 12.5 pM의 최종 농도를 MiSeq V3 키트에 로딩하고, 총 176회 사이클 동안 Miseq 시스템(Illumina)에서 시퀀싱하였다. RNAseq 판독물을 사용하여 원래 서열에 다시 맵핑함으로써 유전자의 tracr 서열을 식별하였다.
신규한 tracrRNA 서열에 대한 인-실리코 검색
잠재적 tracrRNA를 함유하는 추가적인 비암호화 영역을 식별하기 위해, 활성 tracrRNA의 서열을 동일한 뉴클레아제 계열(예를 들어 MG119-1 및 MG119-3)의 뉴클레아제를 함유하는 다른 콘티그에 맵핑하였다. 새롭게 식별된 서열을 사용하여 공분산 모델을 생성하여 추가 tracrRNA를 예측하였다. 공분산 모델은 활성 및 예측된 tracrRNA 서열의 다중 서열 정렬(MSA)로부터 구축되었다. MSA의 이차 구조는 RNAalifold(Vienna Package)로 수득하였고, 공분산 모델은 Infernal package(http://eddylab.org/infernal/)로 구축하였다. 후보 뉴클레아제를 함유하는 다른 콘티그를 Infernal 명령 'cmsearch'로 공분산 모델을 사용하여 검색하였다. TracrRNA 후보를 시험관 내에서 시험하고(아래 참조), 반복 과정에서, 활성 후보로부터의 서열을 사용하여 공분산 모델을 개선하고 다른 뉴클레아제 후보와 연관된 유전자간 영역에서 추가 tracrRNA를 검색하였다.
sgRNA 설계
공분산 모델 및 관련 CRISPR 반복 서열로부터 수득된 예측된 tracrRNA를 변형시켜 sgRNA(도 11a)를 다음과 같이 생성하였다: 예측된 tracrRNA 서열의 3' 말단뿐만 아니라 반복 서열의 5' 말단을 트리밍한 다음, GAAA 테트라루프와 연결하였다.
시험관 내 절단 반응은 뉴클레아제 활성을 입증하고 PAM 결정을 가능하게 함
PURExpress® In Vitro 단백질 Synthesis Kit(New England Biolabs Inc.)를 사용하여 5 nM의 뉴클레아제 증폭 DNA 템플릿 및 25 nM sgRNA 증폭 DNA 템플릿(표 2에 열거된 스페이서 서열 중 하나 포함)을 37℃에서 3시간 동안 발현시켰다. 가능한 모든 8N PAM을 나타내는 5 nM의 표적 라이브러리, PURExpress 발현의 5배 희석물, 10 nM Tris-HCl pH 7.9, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL BSA, 및 50 mM NaCl(NEB 2.1 완충액, NEB Inc.)을 37℃에서 2시간 동안 혼합함으로써 플라스미드 라이브러리 DNA 절단 반응을 수행하였다. 반응을 정지시키고 HighPrep™ PCR 세정 비드(MAGBIO Genomics, Inc.)로 세정하고, Tris EDTA pH 8.0 완충액에서 용리하였다. 3 nM의 절단 생성물 말단을 3.33 μM dNTP, 1X T4 DNA 리가아제 완충액, 및 0.167 U/μL의 Klenow Fragment(New England Biolabs Inc.)로 25℃에서 15분 동안 평활말단화시켰다. 1.5 nM의 절단 생성물을 150 nM 어댑터, 1 X T4 DNA 리가아제 완충액(New England Biolabs Inc.), 및 20 U/μL T4 DNA 리가아제(New England Biolabs Inc.)와 실온에서 20분 동안 결찰시켰다. 결찰 생성물을 NGS 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시키고, NGS로 시퀀싱하여 PAM을 수득하였다. sgRNA에서 어떤 표적 부위가 암호화되었는지에 따라, PAM 라이브러리를 성공적으로 절단한 활성 단백질은 아가로오스 겔에서 약 188 또는 205 bp의 밴드를 생성하였다(도 11b).
코드 서열
U67 스페이서 GTCGAGGCTTGCGACGTGGT
U40 스페이서 TGGAGATATCTTGAACCTTG
MG119 뉴클레아제에 의해 인식되는 PAM은 Seqlog 제조기로 제조된 서열 로고로서 도시되어 있다(도 12). U40 스페이서에 상보적인 프로토스페이서 서열의 표적 가닥 상의 바람직한 절단 위치는 표 3에 열거되어 있다.
MG119 뉴클레아제는 프로토스페이서 서열의 절단 부위를 선호함
뉴클레아제 sgRNA 절단부위
119-1 MG119-1_sgRNA1 20 & 23
119-2 MG119-2_sgRNA1_돌연변이1 22
119-3 MG119-3_sgRNA1_돌연변이1 22-23
119-4 MG119-4_sgRNA1 22-23
119-10 MG119-10_sgRNA1 22-23
119-19 MG119-19_sgRNA1 23
119-27 MG119-27_sgRNA2_돌연변이2 22-23
119-28 MG119-28_sgRNA2 22-23
119-32 MG119-32_sgRNA1 23
119-54 MG119-54_sgRNA1 22
119-64 MG119-64_sgRNA2 20
119-72 MG119-72_sgRNA1 23
119-83 MG119-83_sgRNA1 23
119-97 MG119-97_sgRNA1_돌연변이1 22
119-109 MG119-109_sgRNA1 24-25
119-118 MG119-118_sgRNA1_돌연변이2 23
119-121 MG119-121_sgRNA1_돌연변이1 20 & 22
119-125 MG119-125_sgRNA1 22-23
119-128 MG119-128_sgRNA2_돌연변이1 22
119-129 MG119-129_sgRNA1_돌연변이1 22-23
119-133 MG119-133_sgRNA1_돌연변이1 22
119-136 MG119-136_sgRNA1_돌연변이2 23
119-137 MG119-137_sgRNA1 22-23
단백질 발현 및 정제
순수하고 기능적인 단백질을 단리하는 것은 생화학적 특성 및 기계적 연구의 광범위한 시험관 내 분석에 필수적이다. MG119 후보의 발현 및 정제를 이러한 특성분석을 위해 충분한 양 및 품질의 단백질을 수득하도록 최적화하였다. 모든 작제물을 E. coli(NEBExpress Iq 유능 E. coli, NEB C3037I)에서 발현시켰다. 작제물을 pMGB 발현 벡터(MBP-융합), pMGBΔ 발현 벡터(융합 단백질 없음), 또는 둘 다에서 발현시켰다.
단백질 발현
pMGB 및 pMGBΔ 작제물에 대한 단백질 발현 프로토콜은 동일하다. 배양물을 2xYT 배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 추출물, 0.5% NaCl) 또는 100 μg/L 카르베니실린이 포함된 TB 배지(Teknova T0690)에서 37℃에서 성장시켰다. OD600 약 0.8-1.2에서, 0.5 mM IPTG(GoldBio I2481)로 배양물을 유도하고, 작제물에 따라 18℃에서 밤새 또는 24℃에서 4-6시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 6,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 배양물을 수확하고, 펠릿을 니켈_A 완충액(50 mM Tris pH 7.5, 750 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 20 mM 이미다졸, 0.5 mM EDTA, 5 % 글리세롤, 0.5 mM TCEP) + 프로테아제 억제제(Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-없음, ThermoFisher A32965)에 재현탁하고 -80℃에서 보관하였다.
단백질 정제 - pMGBΔ 발현 벡터
본 벡터에서 발현된 단백질은 다음의 서열 구조를 갖는다: 6xHis-(GS)2-PSP-뉴클레오플라스민 이분 NLS-(GGS)1-(GS)1-MG119-X-(GGS)3-SV40 NLS (표 5). 본 벡터에서 발현된 단백질은 MG119-X Δ로 표시하였다. 세포 펠릿을 해동하고 Cf = 0.5% n-옥틸-ß-D-글루코시드 세제(P212121, CI-00234)를 사용하여 120 mL로 부피를 보충하였다. 샘플을 15초 온/45초 오프 사이클을 사용하여 3분의 총 처리 시간 동안 75% 진폭에서 얼음수조에서 초음파 처리하였다. 용해물을 30,000 x g에서 25분 동안 원심분리하여 정화하고, 상청액 배치를 5 mL Ni-NTA 수지(HisPur Ni-NTA 수지, ThermoFisher 88223)에 ≥ 20분 동안 결합시켰다. 샘플을 중력 컬럼 상에 로딩하고 30 CV 니켈_A 완충액으로 세척한 다음, 50 kDa MWCO 농축기(Amicon Ultra-15, MilliporeSigma UFC9050)에 농축시키기 전에 4 CV 니켈_B 완충액(니켈_A 완충액 + 250 mM 이미다졸)에서 용리하였다. 샘플을 정제 공정 전반에 걸쳐 채취하고 SDS-PAGE 단백질 겔(BioRad #4568126) 상에서 러닝시켰고, 이를 5분 UV 활성화 후 무염색 채널에서 ChemiDoc 상에서 이미지화 하였다(도 13a). 그런 다음, ΔMBP 작제물을 S200i 10/300 GL 컬럼(Cytiva 28-9909-44) 상에 로딩하고 니켈_A 완충액 내로 러닝시켰다(도 13b). 피크 분획을 풀링하고 50 kDa MWCO 농축기에서 농축시켰다. pMGBΔ 벡터에서 발현된 단백질의 정제는 일반적으로 L 발현 배양 당 25-125 nmol 단백질을 생산하였다(도 13f).
단백질 정제 - pMGB 발현 벡터
본 벡터에서 발현된 단백질은 다음의 서열 구조를 갖는다: 6xHis-(GS)1-MBP-(GS)1-TEV- 뉴클레오플라스민 이분 NLS-(GGGGS)3-(GS)1-MG119-X-(GGS)3-SV40 NLS(표 5). MBP-융합 작제물을 니켈_B에서 용해, 정화, 친화도 정제, 및 용리를 통해 pMGBΔ 단백질과 동일하게 정제하였다(도 13c). 50 kDa MWCO 농축기에서 단백질 농축 후, TEV 프로테아제(GenScript Z03030)를 각 샘플(Cf = 1 UI/μL)에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 끝에서 끝으로 부드럽게 회전시켰다. 샘플을 원심분리(21,000 x g, 4℃, 10분)하여 펠릿 응집물을 수득한 다음, 상청액을 4℃에서 30분 동안 3 mL 아밀로오스 수지(NEB E8021L)에 배치 결합시킨 다음, 중력 컬럼 상에 로딩하였다. 관류액을 수집하고 50 kDa MWCO 농축기에서 농축시켰다(도 13d). 다시, S200i 10/300 GL 컬럼 상에 로딩하기 전에 샘플을 원심분리하여(21,000 x g, 4℃, 10분) 응집물을 펠릿화하고 니켈_A 완충액 내로 러닝시켰다(도 13e). 피크 분획을 풀링하고 50 kDa MWCO 농축기에서 농축시켰다. 샘플을 정제 공정 전반에 걸쳐 채취하고 SDS-PAGE 단백질 겔(BioRad #4568126) 상에서 러닝시켰고, 이를 5분 UV 활성화 후 무염색 채널에서 ChemiDoc 상에서 이미지화 하였다(도 13d).
선택된 몇 개의 MG119 후보를 pMGB 및 pMGBΔ 발현 벡터 둘 모두로부터 정제하였다. 초기 발현 배양 부피에 대해 정규화된 최종 단백질 수율의 비교는 pMGBΔ 벡터로부터의 더 높은 발현 수율의 경향을 보여준다(도 13e). pMGBΔ 벡터에서 발현된 단백질의 정제는 일반적으로 L 발현 배양 당 2-15 nmol 단백질을 생산하였다(도 13e). 단백질 정제 수율은 표 4에 나타나 있다.
단백질 정제 수율
뉴클레아제 발현 벡터 발현 배지 수율(nmol)
MG119-1 pMGB TB 8.8
MG119-1 pMGBΔ TB 105.2
MG119-2 pMGB 2xYT 5.0
MG119-2 pMGBΔ 2xYT 95.0
MG119-3 pMGB 2xYT 7.6
MG119-3 pMGBΔ 2xYT 78.1
MG119-27 pMGB 2xYT 11.9
MG119-28 pMGB 2xYT 11.6
MG119-28 pMGBΔ 2xYT 102.2
MG119-32 pMGB 2xYT 4.3
MG119-54 pMGB 2xYT 5.6
MG119-64 pMGB 2xYT 2.1
MG119-97 pMGB 2xYT 4.3
MG119-109 pMGB 2xYT 4.1
MG119-121 pMGB 2xYT 8.2
MG119-128 pMGB 2xYT 9.9
MG119-128 pMGBΔ 2xYT 37.0
MG119-129 pMGB 2xYT 2.8
MG119-136 pMGB 2xYT 14.3
MG119-137 pMGB 2xYT 10.4
서열 요소 용어집
요소 명칭 요소 아미노산 서열
6xHis HHHHHH
(GS)n GS
(GGS)n GGS
(GGGGS)n GGGGS
PSP LEVQFQGP
TEV ENLYFQG
뉴클레오플라스민 이분 NLS KRPAATKKAGQAKKKK
SV40 NLS PKKKRKV
정제된 단백질을 이용한 시험관 내 절단 효율
단백질 분취물의 활성 분율을 선형 DNA 기질 절단 검정에서 결정하였다. 효과기 단백질을 실온에서 20분 동안 2배 몰 과량의 sgRNA와 함께 사전 인큐베이션하여 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)를 형성하였다. 25 nM DNA 기질 및 기질에 대해 0.25X 내지 10X 몰 과량의 RNP의 적정을 사용하여 반응을 설정하였다. 반응 완충액 조성은 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 및 100 mM NaCl이었다. DNA 기질은 522 bp 길이이다. 성공적인 절단은 172 및 350 bp의 단편을 생성한다. 반응물을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 75℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. RNase(NEB T3018)를 각 반응(Cf = 0.33 μg/μL)에 첨가하고, 샘플을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 단백질분해효소 K(NEB P8107)를 각 반응(Cf = 60 단위/mL)에 첨가하고, 샘플을 55℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 각각의 반응의 전체를 GelGreen 염료가 포함된 1.5% 아가로오스 겔(Biotium, #41005) 상에서 러닝시키고(도 14a), GelGreen 채널 내의 ChemiDoc 상에서 이미지화하였다. BioRad의 Image Lab 소프트웨어(버전 6.1.0 빌드 7)를 사용하여 밀도계 분석을 통해 각 레인에 대해 절단된 기질 백분율을 계산하였다. 활성 분율을 선형 절단 범위의 기울기에 의해 결정하였다(도 14b).
정제된 단백질로 정제된 Hepa1-6 게놈 DNA의 시험관 내 절단
정제된 마우스 Hepa1-6 게놈 DNA(gDNA)의 절단을 평가하기 위해, 마우스 알부민 유전자를 인트론 1에 표적화하였다(표 6). gDNA를 PurelinkTM 게놈 DNA Mini 키트(Invitrogen)에 따라 8백만 개의 세포로 Hepa1-6 세포 펠릿으로부터 추출하고, pH 8의 10 mM TrisHCl에서 용리하였다. sgRNA를 2 nmol의 Integrated DNA technologies(IDT)로부터 주문한 다음, 20 μM의 10 mM Tris EDTA 완충액에 재현탁하였다(표 6). 1X 효과기 완충액(100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM Tris HCl, pH 7.5) 중에서 실온에서 30분 동안 1:2 몰비로 표적화 또는 비표적화 가이드와 함께 뉴클레아제를 사전 인큐베이션함으로써 리보뉴클레오단백질(RNP)을 제조하였다. 모든 반응은 sgRNA가 없는 음성 대조군을 포함하여 3회 반복으로 수행하였다. RNP 형성 후, RNP를 1X 효과기 완충액 중 20 ng/μL의 정제된 gDNA를 함유하는 분해 반응에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 뉴클레아제를 2개의 최종 농도인 7.8 및 15.6 nM에서 시험하였다. 표적화된 농도를 각 뉴클레아제에 대한 활성 분율로 나눔으로써 이들 농도를 정규화하였다. 인큐베이션 후, 이들 반응물을 즉시 4℃로 옮기고, 물에서 30X로 희석한 다음, 1X PrimeTime® Gene Expression Master Mix, 10 μM 순방향 프라이머, 10 μM 역방향 프라이머, 및 5 μM 5'-FAM 및 ZEN/Iowa Black 형광 소광 Taqman 프로브(IDT)를 함유하는 마스터 혼합물에서 qPCR을 위해 제조하였다(표 7). AriaMx Real-Time PCR System(Agilent)을 다음 사이클로 사용하였다: 1) 95℃에서 15분 동안, 2) 95℃에서 5초 동안, 및 3) 60℃에서 1분 동안, 여기서 단계 2-3을 40X 반복하였다. Cq 값을 사용하여 절단식 백분율(아래)에 따라 각 반응의 gDNA 절단 백분율을 계산하였다. 모두 비표적화 대조군 반응으로 정규화하였다. 도 15a는 MG119-28 및 sgRNA3에 의한 평균 60% gDNA 절단 및 사용된 단백질의 더 높은 농도에서 sgRNA2에 의한 21% 절단의 일례를 도시한다.
절단 백분율 방정식
절단 % = 100 - (2 -(Cq(실험) - Cq(비표적 대조군)) x 100)
마우스 알부민 인트론 1 및 화학적으로 변형된 sgRNA(IDT)에서의 표적화 서열
sgRNA 명칭 서열 (5'-3') 마우스 알부민 표적 (5'-3')
119-28 sgRNA1_마우스_Alb mU*mU*mG*rArArArUrArArArArUrGrArArUrUrUrCrArArArCrCrCrCrUrUrCrGrGrGrGrGrArGrGrGrCrGrCrGrUrUrGrGrArGrCrGrCrCrUrUrArGrUrUrUrGrArGrGrUrGrCrArGrArArUrCrArArArArArArArCrUrGrCrGrArCrGrArUrGrGrArGrGrUrCrGrUrUrUrCrArGrUrCrUrCrUrGrUrArCrArCrUrCrArArArArArArUrUrCrArCrUrUrGrArGrArArArUrCrArArGrUrGrArArUrArUrCrCrArArCrArArGrArUrUrGrArUrGrArArGrArCrArA*mC*mU*mA AAGATTGATGAAGACAACTA
119-28 sgRNA2_마우스_Alb mU*mU*mG*rArArArUrArArArArUrGrArArUrUrUrCrArArArCrCrCrCrUrUrCrGrGrGrGrGrArGrGrGrCrGrCrGrUrUrGrGrArGrCrGrCrCrUrUrArGrUrUrUrGrArGrGrUrGrCrArGrArArUrCrArArArArArArArCrUrGrCrGrArCrGrArUrGrGrArGrGrUrCrGrUrUrUrCrArGrUrCrUrCrUrGrUrArCrArCrUrCrArArArArArArUrUrCrArCrUrUrGrArGrArArArUrCrArArGrUrGrArArUrArUrCrCrArArCrGrGrUrCrArGrUrGrArArGrArGrArArGrA*mA*mC*mA GGTCAGTGAAGAGAAGAACA
119-28 sgRNA3_마우스_Alb mU*mU*mG*rArArArUrArArArArUrGrArArUrUrUrCrArArArCrCrCrCrUrUrCrGrGrGrGrGrArGrGrGrCrGrCrGrUrUrGrGrArGrCrGrCrCrUrUrArGrUrUrUrGrArGrGrUrGrCrArGrArArUrCrArArArArArArArCrUrGrCrGrArCrGrArUrGrGrArGrGrUrCrGrUrUrUrCrArGrUrCrUrCrUrGrUrArCrArCrUrCrArArArArArArUrUrCrArCrUrUrGrArGrArArArUrCrArArGrUrGrArArUrArUrCrCrArArCrArGrUrGrUrArGrCrArGrArGrArGrGrArA*mC*mC*mA AGTGTAGCAGAGAGGAACCA
119-28 sgRNA4_마우스_Alb mU*mU*mG*rArArArUrArArArArUrGrArArUrUrUrCrArArArCrCrCrCrUrUrCrGrGrGrGrGrArGrGrGrCrGrCrGrUrUrGrGrArGrCrGrCrCrUrUrArGrUrUrUrGrArGrGrUrGrCrArGrArArUrCrArArArArArArArCrUrGrCrGrArCrGrArUrGrGrArGrGrUrCrGrUrUrUrCrArGrUrCrUrCrUrGrUrArCrArCrUrCrArArArArArArUrUrCrArCrUrUrGrArGrArArArUrCrArArGrUrGrArArUrArUrCrCrArArCrUrCrUrGrUrGrGrArArArCrArGrGrGrArG*mA*mG*mA TCTGTGGAAACAGGGAGAGA
qPCR에 사용된 DNA 올리고
올리고 명칭 올리고 서열
611F_HE TGCACAGATATAAACACTTAACGGG
869R_HE GGGCGATCTCACTCTTGTCT
680_HE Taqman 프로브 5'-FAM-AGCAGAGAGGAACCATTGCCACCTTCAG
Hepa 1-6 세포에서 게놈 DNA를 정제된 단백질로 생체 내에서 절단
세포 편집에서, 인트론 1에서 마우스 알부민 유전자를 표적화하는 뉴클레아제 및 가이드의 RNP 복합체로 입증하였다(표 6). Hepa1-6 세포를 해동하고, 세척하고, Dulbecco의 변형된 이글 배지(DMEM, 10% FBS, 및 1% Pen-strep)에 재현탁하였다. 세포를 37℃에서 30 mL의 배지에 15 cm 접시 당 4 x 106개의 세포 밀도로 시딩하였다. 세포가 70-80% 컨플루언시에 도달한 2일 후, 세포를 분할하였다. 세포를 0.25% 트립신으로 트립신화한 다음, 37℃에서 30초 동안 인큐베이션하였다. DMEM을 첨가한 다음, 3 mL로 나누고, 27 mL의 배지로 추가로 희석하였다. 분할 세포를 2일 동안 추가로 인큐베이션하였다. 뉴클레오펙션 전에, 배지를 플레이트로부터 흡인하고, 트립신화 전에 세포를 1X 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco™) pH 7.2로 세척하였다. 트립신을 중화시키고 세포를 DMEM으로 재현탁하였다. 세포 현탁액 중의 세포를 Countess 3 FL(Invitrogen)로 계수하여 펠릿화할 세포의 부피를 계산하였다. 하류의 각 처리는 총 100,000개의 세포를 필요로 하였다. 세포를 소르발 X Pro 시리즈 원심분리(Thermo Fisher)에서 300 x g에서 7분 동안 원심분리한 다음, PBS pH 7.2에서 세척한 후, Amaxa™ 4D-Nucleofector ™ 키트(Lonza)의 Nucleofector™ 용액에 재현탁하였다.
120 pmol의 뉴클레아제를 120 pmol의 가이드와 함께 실온에서 90분 동안 인큐베이션함으로써 RNP 복합체를 개별적으로 제조하였다. 20 μL의 제조된 세포를 RNP에 첨가하였다. 4D-Nucleofector ™ 시스템(Lonza)에서 Amaxa™ 4D-Nucleofector™ 프로토콜로 뉴클레오펙션을 수행하였다. 뉴클레오펙션된 세포를 뉴클레오펙션 카세트로부터 24 웰 플레이트로 옮겼으며, 각각의 웰은 500 μL의 배지를 함유하였다. 2일 동안 인큐베이션한 후, 모든 처리의 gDNA를 QuickExtract(Lucigen)로 1) 65℃에서 15분 동안, 2) 68℃에서 15분 동안, 및 3) 98℃에서 10분 동안의 사이클을 사용하여 추출한 다음, 사용할 때까지 4℃에서 유지하였다. 다음 사이클을 사용하여 Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix(Thermo Fisher)로 추출한 gDNA로부터 317 bp의 표적화 윈도우를 증폭시켰다: 1) 98℃에서 10초 동안, 2) 98℃에서 1초 동안, 3) 63℃에서 5초 동안, 4) 72℃에서 15초 동안, 및 5) 72℃에서 1분 동안, 30사이클 동안 단계 2-5를 반복한 다음 4℃에서 유지하였다. 앰플리콘을 2% 아가로오스 겔 상에서 시각화한 후, HighPrep Magnetic Beads(MagBio Genomics Inc.)로 1.8X 비드 부피로 세척 및 농축시켜 샘플을 수득하였다. 샘플을 물에서 용리하였다. INDEL은 샘플 당 최소 20,000개의 판독물을 갖는 2 x 301 bp 쌍-말단 판독물에 대해 v3 시약 키트(600-사이클; 표 8) 및 5% phiX를 갖는 MiSeq 상에서 NGS에 의해 시퀀싱하였다. INDEL 분석은 변형된 CRISPResso2 프로그램(Clement 등의 2019년 문헌; https://doi.org/10.1038/s41587-019-0032-3)으로 수행하였고, 결과는 표 9 및 도 15b에 도시되어 있다.
NGS PCR1에 사용된 올리고
올리고 명칭 올리고 서열(5'-3')
611F_NGS GCTCTTCCGATCTNNNNNTGCACAGATATAAACACTTAACGGG
927R_NGS GCTCTTCCGATCTNNNNNTTCAGCATTATAACTTACAGGCCT
Apo 조건에 대해 정규화된 INDEL 백분율
RNP 복제물1 복제물2 복제물3 평균
INDEL % INDEL % INDEL % INDEL %
119-28 sgRNA1_마우스_Alb 0.70 0.23 0.87 0.60
119-28 sgRNA2_마우스_Alb 0.32 0.48 0.38 0.39
119-28 sgRNA3_마우스_Alb 50.57 13.12 11.68 25.12
119-28 sgRNA4_마우스_Alb 9.23 2.52 0.60 4.12
예 15 - MG119 단백질 정제를 위한 완충액 최적화(예시)
지금까지, MG119 단백질을 니켈_A 완충액에서 정제하였다. 니켈_A 완충액은 높은 염도로 인해 하류 생체 내 검정과 호환되지 않으며, 저염 용액으로의 신속한 희석은 단백질 침전을 유도한다. 단백질 안정성 및 하류 검정 호환성을 위한 완충액을 최적화하기 위해, MG119 뉴클레아제를 고염 완충액(750 mM NaCl)에서 초기에 정제하고, 200 mM NaCl 및 쌍성이온성 아미노산 L-아르기닌(50 mM) 및 L-글루타메이트(50 mM)가 포함된 니켈_A 완충액 변이체로 점진적으로 세척한다. 경험적으로, 다양한 안정화 당(리보오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨)을 완충액에 첨가하여 저염 완충액에서 단백질 안정성을 향상시킨다.
예 16 -뉴클레아제 활성의 형광-기반 측정(예시)
신규 세포주 조작
생체 내(즉, 포유류 세포주에서) 뉴클레아제 활성을 측정하는 데 사용되는 현재의 검정은 광범위한 데이터 분석 및 최대 1주의 소요 시간을 필요로 한다. 생체 내 뉴클레아제 활성의 평가를 신속하게 하기 위해, 불멸화된 포유류 세포주를 조작하여 게놈 DNA의 편집에 대한 즉각적인 데이터를 제공한다. IMDM(Gibco #12440053) + 10% FBS(Corning™ Regular Fetal Bovine Serum, MT35011CV )에서 성장시킨 K562 포유류 세포를 본 검정에 사용한다. K562 포유류 세포를 12 pmol Cas9 단백질(IDT #1081058), 60 pmol sgRNA(Mali 등의 문헌[Science, 2013 Feb 15;339(6121):823-6.]), 및 mMBP-(GGS)3-eGFP 단백질에 대한 발현 서열을 함유하는 1200 ng 플라스미드(pUC 백본)를 사용하여 형질감염한다. 이러한 작제물의 게놈 통합은 합성 MND 프로모터 하에서 구성적 발현을 초래한다. 세포를 6일 동안 성장시키고, 3일마다 계대배양한다. Sony MA900 세포 분류기를 사용하여 개별 GFP-발현 세포를 96-웰 플레이트로 분류함으로써 단일 세포로부터 단일유전성(monogenic) 세포주를 단리한다.
형광-기반 생체 내 뉴클레아제 활성 스크리닝
적절한 sgRNA는 mMBP 및 eGFP 유전자를 따라 뉴클레아제 절단을 유도하도록 설계되므로, 인델 형성은 프레임시프트 돌연변이를 생성하여 형광의 손실을 초래한다. 100 pmol 단백질과 200 pmol sgRNA를 합하고 실온에서 ≥ 20분 동안 5 μL의 최종 부피로 인큐베이션함으로써 MG119 RNP 복합체를 형성한다. K562 세포를 1x PBS로 세척하고, 웰 당 약 200,000개의 세포가 포함된 Nucleofector Solution(SF 세포주 96-웰 Nucleofector™ Solution)에 재현탁한다. 세포와 RNP를 Lonza 96-웰 뉴클레오펙션 플레이트(SF 세포주 96-웰 Nucleofector™ 키트, V4SC-2096)에서 25 μL의 최종 부피로 합치고, 뉴클레오펙션하고(K562 세포, FF-120), IMDM + 10% FBS 배지에서 회수한다. 세포를 37℃에서 2 내지 3일 동안 회수하도록 방치한다. 분석하기 위해, 세포를 1x PBS로 2회 세척한 다음, 실온에서 20분 동안 1x PBS + LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit 염료(ThermoFisher L10119)로 염색한다. 1x PBS에 재현탁하기 전에 세포를 1x PBS로 한 번 더 세척하고, 형광 분석을 위해 Attune NxT, 음향 집중 유세포 계측기(모델 AFC2)에 로딩한다. 양성 및 음성 형광 게이트를 확립하기 위해 양성 미편집 대조군(RNP 없이 뉴클레오펙션됨) 및 음성 대조군(비형광 K562 세포)을 사용하고, 생체 내 뉴클레아제 활성을 평가하기 위해 GFP 채널에서 세포 집단을 형광 상실에 대해 분석한다.
예 17 -후성유전체 편집 용도(예시)
후성유전체 편집은 구성적으로 또는 일시적으로 유전자를 켜거나 끄는 것을 포함하는 유전자 조절 기술이다. 이러한 기술은 3개의 단백질에 융합된 촉매적으로 사멸된 Cas9(dCas9)를 사용할 수 있다: Dnmt3A, Dnmt3L, 및 KRAB(예를 들어, Nuρez 등의 Cell 2021, 184(9), 2503-2519에 기술된 바와 같음, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). Dnmt3A 및 Dnmt3L은 DNA 메틸트랜스퍼라아제이다. KRAB 도메인은 히스톤 메틸화를 매개한다. 프로모터 영역에서 DNA 및 히스톤의 메틸화는 구성적 유전자 억제를 매개한다. dCas9 및 가이드 RNA는 DNA 및 히스톤 메틸화 복합체를 프로모터 영역에 동원할 수 있으며, 뉴클레아제 활성을 필요로 하지 않는다. 함께, Dnmt3A, Dnmt3L, 및 KRAB는 579 aa이고, dCas9는 1,368 aa이다. 융합 단백질은 아데노-연관 바이러스 벡터(AAV) 패키징 한계(4.7 Kb)를 초과하는 1,947 aa 또는 5,841개의 뉴클레오티드로 구성된다. 따라서, 보다 콤팩트한 후성유전체 편집자를 생성할 필요가 있다. MG119 계열의 콤팩트한 V형 뉴클레아제는 후성유전체 편집 기술에서 사멸된 뉴클레아제 파트너로서 사용하기에 좋은 후보를 나타낸다. DNA 및 히스톤 메틸화 복합체에 융합될 때, 350 내지 700 aa 범위의 작은 크기로 인해, 융합 단백질의 크기는, 예를 들어, 약 929 내지 약 1,279 aa, 또는 약 2787 내지 약 3837 뉴클레오티드의 범위일 수 있어서, AAV에 쉽게 패키징될 수 있다.
MG119 융합 단백질을 후성유전체 편집자로서 시험하기 위해, 키메라 프로모터(GAPDH-Srnpn) 하에 GFP를 발현하는 HEK293T 세포를 렌티바이러스 형질도입에 의해 생성한다. 키메라 프로모터를 표적화하는 MG119 계열 가이드 RNA를 설계한다. 안정성을 위해 3개의 2'-O-메틸 치환기 및 3개의 포스포로티오에이트 결합으로 5' 및 3' 뉴클레오티드를 변형시키는 IDT로부터 가이드를 정렬한다. MG119 뉴클레아제의 사멸 버전을 DNA 및 히스톤 메틸화 복합체(MG119 후성유전체 편집자)에 융합시킨다. 융합 단백질을 CMV 프로모터 하의 포유류 발현 플라스미드에 클로닝한다. HEK293T 세포를 발현하는 GFP를 MG119 후성유전체 편집자를 발현하는 플라스미드 및 화학적으로 합성된 가이드로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 유세포 계측법으로 분석한다. 성공적인 MG119 후성유전체 편집자를 형질감염된 세포에서 GFP 형광의 손실에 의해 결정한다. 그런 다음, MG119 후성유전체 편집자를 사용하여 치료 관심 유전자를 표적화한다.
본원에서 언급되는 단백질 및 핵산 서열
카탈로그 서열번호 설명 유형
MG122 효과기 1 MG122-1 효과기 단백질
MG122 효과기 2 MG122-2 효과기 단백질
MG122 효과기 3 MG122-3 효과기 단백질
MG122 효과기 4 MG122-4 효과기 단백질
MG122 효과기 5 MG122-5 효과기 단백질
MG120 효과기 6 MG120-1 효과기 단백질
MG120 효과기 7 MG120-2 효과기 단백질
MG120 효과기 8 MG120-3 효과기 단백질
MG120 효과기 9 MG120-4 효과기 단백질
MG120 효과기 10 MG120-5 효과기 단백질
MG120 효과기 11 MG120-6 효과기 단백질
MG120 효과기 12 MG120-7 효과기 단백질
MG120 효과기 13 MG120-8 효과기 단백질
MG120 효과기 14 MG120-9 효과기 단백질
MG118 효과기 15 MG118-1 효과기 단백질
MG90 효과기 16 MG90-3 효과기 단백질
MG90 효과기 17 MG90-5 효과기 단백질
MG90 효과기 18 MG90-6 효과기 단백질
MG90 효과기 19 MG90-7 효과기 단백질
MG90 효과기 20 MG90-8 효과기 단백질
MG90 효과기 21 MG90-16 효과기 단백질
MG90 효과기 22 MG90-17 효과기 단백질
MG90 효과기 23 MG90-18 효과기 단백질
MG90 효과기 24 MG90-19 효과기 단백질
MG90 효과기 25 MG90-20 효과기 단백질
MG90 효과기 26 MG90-21 효과기 단백질
MG90 효과기 27 MG90-22 효과기 단백질
MG90 효과기 28 MG90-23 효과기 단백질
MG90 효과기 29 MG90-24 효과기 단백질
MG119 효과기 30 MG119-1 효과기 단백질
MG119 효과기 31 MG119-2 효과기 단백질
MG119 효과기 32 MG119-3 효과기 단백질
MG119 효과기 33 MG119-4 효과기 단백질
MG119 효과기 34 MG119-5 효과기 단백질
MG119 효과기 35 MG119-6 효과기 단백질
MG119 효과기 36 MG119-7 효과기 단백질
MG119 효과기 37 MG119-8 효과기 단백질
MG119 효과기 38 MG119-9 효과기 단백질
MG119 효과기 39 MG119-10 효과기 단백질
MG119 효과기 40 MG119-11 효과기 단백질
MG119 효과기 41 MG119-12 효과기 단백질
MG119 효과기 42 MG119-13 효과기 단백질
MG119 효과기 43 MG119-14 효과기 단백질
MG119 효과기 44 MG119-15 효과기 단백질
MG119 효과기 45 MG119-16 효과기 단백질
MG119 효과기 46 MG119-17 효과기 단백질
MG119 효과기 47 MG119-18 효과기 단백질
MG119 효과기 48 MG119-19 효과기 단백질
MG119 효과기 49 MG119-20 효과기 단백질
MG119 효과기 50 MG119-21 효과기 단백질
MG119 효과기 51 MG119-22 효과기 단백질
MG119 효과기 52 MG119-23 효과기 단백질
MG119 효과기 53 MG119-24 효과기 단백질
MG119 효과기 54 MG119-25 효과기 단백질
MG119 효과기 55 MG119-26 효과기 단백질
MG119 효과기 56 MG119-27 효과기 단백질
MG119 효과기 57 MG119-28 효과기 단백질
MG119 효과기 58 MG119-29 효과기 단백질
MG119 효과기 59 MG119-30 효과기 단백질
MG119 효과기 60 MG119-31 효과기 단백질
MG119 효과기 61 MG119-32 효과기 단백질
MG119 효과기 62 MG119-33 효과기 단백질
MG119 효과기 63 MG119-34 효과기 단백질
MG119 효과기 64 MG119-35 효과기 단백질
MG119 효과기 65 MG119-36 효과기 단백질
MG119 효과기 66 MG119-37 효과기 단백질
MG119 효과기 67 MG119-38 효과기 단백질
MG119 효과기 68 MG119-39 효과기 단백질
MG119 효과기 69 MG119-40 효과기 단백질
MG119 효과기 70 MG119-41 효과기 단백질
MG119 효과기 71 MG119-42 효과기 단백질
MG119 효과기 72 MG119-43 효과기 단백질
MG119 효과기 73 MG119-44 효과기 단백질
MG119 효과기 74 MG119-45 효과기 단백질
MG119 효과기 75 MG119-46 효과기 단백질
MG119 효과기 76 MG119-47 효과기 단백질
MG119 효과기 77 MG119-48 효과기 단백질
MG119 효과기 78 MG119-49 효과기 단백질
MG119 효과기 79 MG119-50 효과기 단백질
MG119 효과기 80 MG119-51 효과기 단백질
MG119 효과기 81 MG119-52 효과기 단백질
MG119 효과기 82 MG119-53 효과기 단백질
MG119 효과기 83 MG119-54 효과기 단백질
MG119 효과기 84 MG119-55 효과기 단백질
MG119 효과기 85 MG119-56 효과기 단백질
MG119 효과기 86 MG119-57 효과기 단백질
MG119 효과기 87 MG119-58 효과기 단백질
MG119 효과기 88 MG119-59 효과기 단백질
MG119 효과기 89 MG119-61 효과기 단백질
MG119 효과기 90 MG119-62 효과기 단백질
MG119 효과기 91 MG119-63 효과기 단백질
MG119 효과기 92 MG119-64 효과기 단백질
MG119 효과기 93 MG119-65 효과기 단백질
MG119 효과기 94 MG119-66 효과기 단백질
MG119 효과기 95 MG119-67 효과기 단백질
MG119 효과기 96 MG119-68 효과기 단백질
MG119 효과기 97 MG119-69 효과기 단백질
MG119 효과기 98 MG119-70 효과기 단백질
MG119 효과기 99 MG119-71 효과기 단백질
MG119 효과기 100 MG119-72 효과기 단백질
MG119 효과기 101 MG119-73 효과기 단백질
MG119 효과기 102 MG119-74 효과기 단백질
MG119 효과기 103 MG119-75 효과기 단백질
MG119 효과기 104 MG119-76 효과기 단백질
MG119 효과기 105 MG119-77 효과기 단백질
MG119 효과기 106 MG119-78 효과기 단백질
MG119 효과기 107 MG119-79 효과기 단백질
MG119 효과기 108 MG119-80 효과기 단백질
MG119 효과기 109 MG119-81 효과기 단백질
MG119 효과기 110 MG119-83 효과기 단백질
MG119 효과기 111 MG119-84 효과기 단백질
MG119 효과기 112 MG119-85 효과기 단백질
MG119 효과기 113 MG119-86 효과기 단백질
MG119 효과기 114 MG119-87 효과기 단백질
MG119 효과기 115 MG119-88 효과기 단백질
MG119 효과기 116 MG119-89 효과기 단백질
MG119 효과기 117 MG119-90 효과기 단백질
MG119 효과기 118 MG119-91 효과기 단백질
MG119 효과기 119 MG119-92 효과기 단백질
MG119 효과기 120 MG119-93 효과기 단백질
MG119 효과기 121 MG119-94 효과기 단백질
MG119 효과기 122 MG119-95 효과기 단백질
MG119 효과기 123 MG119-96 효과기 단백질
MG119 효과기 124 MG119-97 효과기 단백질
MG119 효과기 125 MG119-98 효과기 단백질
MG119 효과기 126 MG119-99 효과기 단백질
MG119 효과기 127 MG119-100 효과기 단백질
MG119 효과기 128 MG119-101 효과기 단백질
MG119 효과기 129 MG119-102 효과기 단백질
MG119 효과기 130 MG119-103 효과기 단백질
MG119 효과기 131 MG119-104 효과기 단백질
MG119 효과기 132 MG119-105 효과기 단백질
MG119 효과기 133 MG119-106 효과기 단백질
MG119 효과기 134 MG119-107 효과기 단백질
MG119 효과기 135 MG119-108 효과기 단백질
MG119 효과기 136 MG119-109 효과기 단백질
MG119 효과기 137 MG119-110 효과기 단백질
MG119 효과기 138 MG119-111 효과기 단백질
MG119 효과기 139 MG119-112 효과기 단백질
MG119 효과기 140 MG119-113 효과기 단백질
MG119 효과기 141 MG119-114 효과기 단백질
MG119 효과기 142 MG119-115 효과기 단백질
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T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-5 최소 어레이 382 119-5_5U40_31_R 뉴클레오티드
T7 프로모터, 정방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG90-3 최소 어레이 383 90-3_5U67_37_F 뉴클레오티드
T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG90-3 최소 어레이 384 90-3_5U67_37_R 뉴클레오티드
T7 프로모터, 정방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-3 최소 어레이 + 어댑터 385 119-3_5U40_31_F_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-3 최소 어레이 + 어댑터 386 119-3_5U40_31_R_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 정방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-4 최소 어레이 + 어댑터 387 119-4_5U40_31_F_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-4 최소 어레이 + 어댑터 388 119-4_5U40_31_R_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 정방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG120-1 최소 어레이 + 어댑터 389 120-1_5U40_37_F_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG120-1 최소 어레이 + 어댑터 390 120-1_5U40_37_R_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG118-1 최소 어레이 + 어댑터 391 118-1_5U40_38_R_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 정방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-1 최소 어레이 + 어댑터 392 119-1_5U67_32_F_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-1 최소 어레이 + 어댑터 393 119-1_5U67_32_R_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 정방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-2 최소 어레이 + 어댑터 394 119-2_5U40_28_F_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-2 최소 어레이 + 어댑터 395 119-2_5U40_28_R_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 정방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-5 최소 어레이 + 어댑터 396 119-5_5U40_31_F_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG119-5 최소 어레이 + 어댑터 397 119-5_5U40_31_R_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 정방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG90-3 최소 어레이 + 어댑터 398 90-3_5U67_37_F_어댑터 뉴클레오티드
T7 프로모터, 역방향 배향인 2개의 반복, 및 1개의 스페이서를 갖는 MG90-3 최소 어레이 + 어댑터 399 90-3_5U67_37_R_어댑터 뉴클레오티드
트리밍된 반복 및 18 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG118-1 crRNA 400 MG118-1_U40_18nt_target 뉴클레오티드
트리밍된 반복 및 18 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG118-1 crRNA 401 MG118-1_U67_18nt_target 뉴클레오티드
10 RAR 및 24 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG90-3 sgRNA 402 90-3_sgRNA_10bp_RAR_U40_24_target 뉴클레오티드
16 RAR 및 24 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG90-3 sgRNA 403 90-3_sgRNA_16bp_RAR_U40_24_target 뉴클레오티드
10 RAR 및 24 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG119-1 sgRNA 404 119-1_sgRNA_10bp_RAR_U40_24_target 뉴클레오티드
15 RAR 및 24 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG119-1 sgRNA 405 119-1_sgRNA_15bp_RAR_U40_24_target 뉴클레오티드
10 RAR 및 24 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG119-2 sgRNA 406 119-2_sgRNA_10bp_RAR_U40_24_target 뉴클레오티드
16 RAR 및 24 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG119-2 sgRNA 407 119-2_sgRNA_16bp_RAR_U40_24_target 뉴클레오티드
9 RAR 및 24 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG119-5 sgRNA 408 119-5_sgRNA_9bp_RAR_U40_24_target 뉴클레오티드
16 RAR 및 24 nt 범용 스페이서, 표적 서열을 갖는 MG119-5 sgRNA 409 119-5_sgRNA_16bp_RAR_U40_24_target 뉴클레오티드
트리밍된 반복 및 18 nt 범용 스페이서를 갖는 MG118-1 crRNA 410 MG118-1_U40_18nt 뉴클레오티드
트리밍된 반복 및 18 nt 범용 스페이서를 갖는 MG118-1 crRNA 411 MG118-1_U67_18nt 뉴클레오티드
10 RAR 및 24 nt 범용 스페이서를 갖는 MG90-3 sgRNA 412 90-3_sgRNA_10bp_RAR_U40_24 뉴클레오티드
16 RAR 및 24 nt 범용 스페이서를 갖는 MG90-3 sgRNA 413 90-3_sgRNA_16bp_RAR_U40_24 뉴클레오티드
10 RAR 및 24 nt 범용 스페이서를 갖는 MG119-1 sgRNA 414 119-1_sgRNA_10bp_RAR_U40_24 뉴클레오티드
15 RAR 및 24 nt 범용 스페이서를 갖는 MG119-1 sgRNA 415 119-1_sgRNA_15bp_RAR_U40_24 뉴클레오티드
10 RAR 및 24 nt 범용 스페이서를 갖는 MG119-2 sgRNA 416 119-2_sgRNA_10bp_RAR_U40_24 뉴클레오티드
16 RAR 및 24 nt 범용 스페이서를 갖는 MG119-2 sgRNA 417 119-2_sgRNA_16bp_RAR_U40_24 뉴클레오티드
9 RAR 및 24 nt 범용 스페이서를 갖는 MG119-5 sgRNA 418 119-5_sgRNA_9bp_RAR_U40_24 뉴클레오티드
16 RAR 및 24 nt 범용 스페이서를 갖는 MG119-5 sgRNA 419 119-5_sgRNA_16bp_RAR_U40_24 뉴클레오티드
MG119 효과기 420 MG119-124 효과기 단백질
MG119 효과기 421 MG119-125 효과기 단백질
MG119 효과기 422 MG119-126 효과기 단백질
MG119 효과기 423 MG119-127 효과기 단백질
MG119 효과기 424 MG119-128 효과기 단백질
MG119 효과기 425 MG119-129 효과기 단백질
MG119 효과기 426 MG119-130 효과기 단백질
MG119 효과기 427 MG119-131 효과기 단백질
MG119 효과기 428 MG119-132 효과기 단백질
MG119 효과기 429 MG119-133 효과기 단백질
MG119 효과기 430 MG119-134 효과기 단백질
MG119 효과기 431 MG119-135 효과기 단백질
MG119-1 효과기 sgRNA1 432 MG119-1_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-1 효과기 PAM (5') 433 MG119-1 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-2 효과기 sgRNA1 434 MG119-2_sgRNA1_돌연변이1 뉴클레오티드
MG119-2 효과기 PAM (5') 435 MG119-2 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-3 효과기 sgRNA1 436 MG119-3_sgRNA1_돌연변이1 뉴클레오티드
MG119-3 효과기 PAM (5') 437 MG119-3 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-4 효과기 sgRNA1 438 MG119-4_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-4 효과기 PAM (5') 439 MG119-4 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-10 효과기 sgRNA1 440 MG119-10_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-10 효과기 PAM (5') 441 MG119-10 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-19 효과기 sgRNA1 442 MG119-19_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-19 효과기 PAM (5') 443 MG119-19 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-27 효과기 sgRNA2 444 MG119-27_sgRNA2_돌연변이2 뉴클레오티드
MG119-27 효과기 PAM (5') 445 MG119-27 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-28 효과기 sgRNA2 446 MG119-28_sgRNA2 뉴클레오티드
MG119-28 효과기 PAM (5') 447 MG119-28 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-32 효과기 sgRNA1 448 MG119-32_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-32 효과기 PAM (5') 449 MG119-32 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-54 효과기 sgRNA1 450 MG119-54_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-54 효과기 PAM (5') 451 MG119-54 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-64 효과기 sgRNA2 452 MG119-64_sgRNA2 뉴클레오티드
MG119-64 효과기 PAM (5') 453 MG119-64 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-72 효과기 sgRNA1 454 MG119-72_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-72 효과기 PAM (5') 455 MG119-72 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-83 효과기 sgRNA1 456 MG119-83_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-83 효과기 PAM (5') 457 MG119-83 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-97 효과기 sgRNA1 458 MG119-97_sgRNA1_돌연변이1 뉴클레오티드
MG119-97 효과기 PAM (5') 459 MG119-97 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-109 효과기 sgRNA1 460 MG119-109_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-109 효과기 PAM (5') 461 MG119-109 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-118 효과기 sgRNA1 462 MG119-118_sgRNA1_돌연변이2 뉴클레오티드
MG119-118 효과기 PAM (5') 463 MG119-118 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-121 효과기 sgRNA1 464 MG119-121_sgRNA1_돌연변이1 뉴클레오티드
MG119-121 효과기 PAM (5') 465 MG119-121 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-125 효과기 sgRNA1 466 MG119-125_sgRNA1 뉴클레오티드
MG119-125 효과기 PAM (5') 467 MG119-125 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-128 효과기 sgRNA1 468 MG119-128_sgRNA2_돌연변이1 뉴클레오티드
MG119-128 효과기 PAM (5') 469 MG119-128 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-129 효과기 sgRNA1 470 MG119-129_sgRNA1_돌연변이1 뉴클레오티드
MG119-129 효과기 PAM (5') 471 MG119-129 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-133 효과기 sgRNA1 472 MG119-133_sgRNA1_돌연변이1 뉴클레오티드
MG119-133 효과기 PAM (5') 473 MG119-133 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-136 효과기 sgRNA1 474 MG119-136_sgRNA1_돌연변이2 뉴클레오티드
MG119-136 효과기 PAM (5') 475 MG119-136 PAM (5') 뉴클레오티드
MG119-136 활성 효과기 476 MG119-136 효과기 단백질
MG119-139 효과기 477 MG119-139 효과기 단백질
MG119-140 효과기 478 MG119-140 효과기 단백질
MG119-141 효과기 479 MG119-141 효과기 단백질
MG119-142 효과기 480 MG119-142 효과기 단백질
MG119-143 효과기 481 MG119-143 효과기 단백질
MG119-144 효과기 482 MG119-144 효과기 단백질
MG119-145 효과기 483 MG119-145 효과기 단백질
MG119-146 효과기 484 MG119-146 효과기 단백질
MG119-147 효과기 485 MG119-147 효과기 단백질
MG119-148 효과기 486 MG119-148 효과기 단백질
MG119-149 효과기 487 MG119-149 효과기 단백질
MG119-150 효과기 488 MG119-150 효과기 단백질
MG119-151 효과기 489 MG119-151 효과기 단백질
MG119-152 효과기 490 MG119-152 효과기 단백질
MG119-153 효과기 491 MG119-153 효과기 단백질
MG119-154 효과기 492 MG119-154 효과기 단백질
MG119-155 효과기 493 MG119-155 효과기 단백질
MG119-156 효과기 494 MG119-156 효과기 단백질
MG119-157 효과기 495 MG119-157 효과기 단백질
MG119-158 효과기 496 MG119-158 효과기 단백질
MG119-159 효과기 497 MG119-159 효과기 단백질
MG119-160 효과기 498 MG119-160 효과기 단백질
MG119-161 효과기 499 MG119-161 효과기 단백질
MG119-162 효과기 500 MG119-162 효과기 단백질
MG119-163 효과기 501 MG119-163 효과기 단백질
MG119-164 효과기 502 MG119-164 효과기 단백질
MG119-165 효과기 503 MG119-165 효과기 단백질
MG119-166 효과기 504 MG119-166 효과기 단백질
MG119-167 효과기 505 MG119-167 효과기 단백질
MG119-168 효과기 506 MG119-168 효과기 단백질
MG119-169 효과기 507 MG119-169 효과기 단백질
MG119-170 효과기 508 MG119-170 효과기 단백질
MG119-171 효과기 509 MG119-171 효과기 단백질
MG119-172 효과기 510 MG119-172 효과기 단백질
MG119-173 효과기 511 MG119-173 효과기 단백질
MG119-174 효과기 512 MG119-174 효과기 단백질
MG119-175 효과기 513 MG119-175 효과기 단백질
MG119-176 효과기 514 MG119-176 효과기 단백질
MG119-177 효과기 515 MG119-177 효과기 단백질
MG119-178 효과기 516 MG119-178 효과기 단백질
MG119-179 효과기 517 MG119-179 효과기 단백질
MG119-180 효과기 518 MG119-180 효과기 단백질
MG119-181 효과기 519 MG119-181 효과기 단백질
MG119-182 효과기 520 MG119-182 효과기 단백질
MG119-183 효과기 521 MG119-183 효과기 단백질
MG119-184 효과기 522 MG119-184 효과기 단백질
MG119-185 효과기 523 MG119-185 효과기 단백질
MG119-186 효과기 524 MG119-186 효과기 단백질
MG119-187 효과기 525 MG119-187 효과기 단백질
MG119-188 효과기 526 MG119-188 효과기 단백질
MG119-189 효과기 527 MG119-189 효과기 단백질
MG119-190 효과기 528 MG119-190 효과기 단백질
MG119-191 효과기 529 MG119-191 효과기 단백질
MG119-192 효과기 530 MG119-192 효과기 단백질
MG119-193 효과기 531 MG119-193 효과기 단백질
MG119-194 효과기 532 MG119-194 효과기 단백질
MG119-195 효과기 533 MG119-195 효과기 단백질
MG119-196 효과기 534 MG119-196 효과기 단백질
MG119-197 효과기 535 MG119-197 효과기 단백질
MG119-198 효과기 536 MG119-198 효과기 단백질
MG119-199 효과기 537 MG119-199 효과기 단백질
MG119-200 효과기 538 MG119-200 효과기 단백질
MG119-201 효과기 539 MG119-201 효과기 단백질
MG119-202 효과기 540 MG119-202 효과기 단백질
MG119-203 효과기 541 MG119-203 효과기 단백질
MG119-204 효과기 542 MG119-204 효과기 단백질
MG119-205 효과기 543 MG119-205 효과기 단백질
MG119-206 효과기 544 MG119-206 효과기 단백질
MG119-207 효과기 545 MG119-207 효과기 단백질
MG119-208 효과기 546 MG119-208 효과기 단백질
MG119-209 효과기 547 MG119-209 효과기 단백질
MG119-210 효과기 548 MG119-210 효과기 단백질
MG119-211 효과기 549 MG119-211 효과기 단백질
MG119-212 효과기 550 MG119-212 효과기 단백질
MG119-213 효과기 551 MG119-213 효과기 단백질
MG119-214 효과기 552 MG119-214 효과기 단백질
MG119-215 효과기 553 MG119-215 효과기 단백질
MG119-216 효과기 554 MG119-216 효과기 단백질
MG119-217 효과기 555 MG119-217 효과기 단백질
MG119-218 효과기 556 MG119-218 효과기 단백질
MG119-219 효과기 557 MG119-219 효과기 단백질
MG119-220 효과기 558 MG119-220 효과기 단백질
MG119-221 효과기 559 MG119-221 효과기 단백질
MG119-222 효과기 560 MG119-222 효과기 단백질
MG119-223 효과기 561 MG119-223 효과기 단백질
MG119-224 효과기 562 MG119-224 효과기 단백질
MG119-225 효과기 563 MG119-225 효과기 단백질
MG119-226 효과기 564 MG119-226 효과기 단백질
MG119-227 효과기 565 MG119-227 효과기 단백질
MG119-228 효과기 566 MG119-228 효과기 단백질
MG119-229 효과기 567 MG119-229 효과기 단백질
MG119-230 효과기 568 MG119-230 효과기 단백질
MG119-231 효과기 569 MG119-231 효과기 단백질
MG119-232 효과기 570 MG119-232 효과기 단백질
MG119-233 효과기 571 MG119-233 효과기 단백질
MG119-234 효과기 572 MG119-234 효과기 단백질
MG119-235 효과기 573 MG119-235 효과기 단백질
MG119-236 효과기 574 MG119-236 효과기 단백질
MG119-237 효과기 575 MG119-237 효과기 단백질
MG119-238 효과기 576 MG119-238 효과기 단백질
MG119-239 효과기 577 MG119-239 효과기 단백질
MG119-240 효과기 578 MG119-240 효과기 단백질
MG119-241 효과기 579 MG119-241 효과기 단백질
MG119-242 효과기 580 MG119-242 효과기 단백질
MG119-243 효과기 581 MG119-243 효과기 단백질
MG119-244 효과기 582 MG119-244 효과기 단백질
MG119-245 효과기 583 MG119-245 효과기 단백질
MG119-246 효과기 584 MG119-246 효과기 단백질
MG119-247 효과기 585 MG119-247 효과기 단백질
MG119-248 효과기 586 MG119-248 효과기 단백질
MG119-249 효과기 587 MG119-249 효과기 단백질
MG119-250 효과기 588 MG119-250 효과기 단백질
MG119-251 효과기 589 MG119-251 효과기 단백질
MG119-252 효과기 590 MG119-252 효과기 단백질
MG119-253 효과기 591 MG119-253 효과기 단백질
MG119-254 효과기 592 MG119-254 효과기 단백질
MG119-255 효과기 593 MG119-255 효과기 단백질
MG119-256 효과기 594 MG119-256 효과기 단백질
MG119-257 효과기 595 MG119-257 효과기 단백질
MG119-258 효과기 596 MG119-258 효과기 단백질
MG119-259 효과기 597 MG119-259 효과기 단백질
MG119-260 효과기 598 MG119-260 효과기 단백질
MG119-261 효과기 599 MG119-261 효과기 단백질
MG119-262 효과기 600 MG119-262 효과기 단백질
MG119-263 효과기 601 MG119-263 효과기 단백질
MG119-264 효과기 602 MG119-264 효과기 단백질
MG119-265 효과기 603 MG119-265 효과기 단백질
MG119-266 효과기 604 MG119-266 효과기 단백질
MG119-267 효과기 605 MG119-267 효과기 단백질
MG119-268 효과기 606 MG119-268 효과기 단백질
MG119-269 효과기 607 MG119-269 효과기 단백질
MG119-270 효과기 608 MG119-270 효과기 단백질
MG119-271 효과기 609 MG119-271 효과기 단백질
MG119-272 효과기 610 MG119-272 효과기 단백질
MG119-273 효과기 611 MG119-273 효과기 단백질
MG119-274 효과기 612 MG119-274 효과기 단백질
MG119-275 효과기 613 MG119-275 효과기 단백질
MG119-276 효과기 614 MG119-276 효과기 단백질
MG119-277 효과기 615 MG119-277 효과기 단백질
MG119-278 효과기 616 MG119-278 효과기 단백질
MG119-279 효과기 617 MG119-279 효과기 단백질
MG119-280 효과기 618 MG119-280 효과기 단백질
MG119-281 효과기 619 MG119-281 효과기 단백질
MG119-282 효과기 620 MG119-282 효과기 단백질
MG119-283 효과기 621 MG119-283 효과기 단백질
MG119-284 효과기 622 MG119-284 효과기 단백질
MG119-285 효과기 623 MG119-285 효과기 단백질
MG119-286 효과기 624 MG119-286 효과기 단백질
sgRNA 625 119-28 sgRNA1_마우스_Alb 뉴클레오티드 (RNA)
sgRNA 626 119-28 sgRNA2_마우스_Alb 뉴클레오티드 (RNA)
sgRNA 627 119-28 sgRNA3_마우스_Alb 뉴클레오티드 (RNA)
sgRNA 628 119-28 sgRNA4_마우스_Alb 뉴클레오티드 (RNA)
MG119 효과기 629 MG119-137 효과기 단백질
본원에서 참조되는 단백질 및 핵산 서열
카탈로그 서열번호 설명 유형 유기체 기타 정보 서열
MG119
효과기		 629 MG119-137 효과기 단백질 알려지지 않음 미배양
유기체		 MSKDKYVITRKIKLLPVGGENEVDRVYDFIRNGQYSQYQALNLLMGQLASKYYDCKKDLSSAEFKDAQKSILSNSNPNLCDIEFVKGCDTKSAVVQKVRQDFSTAIKNGLPRGERNITNYKRTVPLITRGRDLVFVHGYENYTEFLDNLYTDRNLKVFIKWVNKIQFKIVFGNPYKSAELRSVVQNIFEERYKINGSSICIDDDDIILNLSLTMPKEIKELDESKVVGVDLGIAIPAVCALNTNSYSRKSIGSADDFLRVRTKIRAQRRRLQKSLSQTSGGHGRKKKLRALDKFSEYEKHWVQNYNHYVSKQVVDFAIKNNAKYINLEDLEGYGEEEKNKFILSNWSYYQLQQYIAYKAEKYGIEVRKINPYHTSQVCSCCGHWESGQRVNQKTFICKNPECENFGEEVNADFNAARNIALSTNWSDIDEKKNKKNKKK
본 발명의 바람직한 실시예가 본원에 도시되고 기술되었지만, 이러한 실시예는 단지 예시로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 본 명세서 내에 제공된 특정 예에 의해 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 전술한 명세서를 참조하여 기술되었지만, 본원의 실시예의 설명 및 예시는 한정적인 의미로 해석되는 것을 의미하지는 않는다. 이제 본 발명을 벗어나지 않고도 많은 변이, 변화, 및 치환이 당업자에게 일어날 것이다. 또한, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 따라 달라지는 본원에 제시된 특정 도시, 구성, 또는 상대 비율로 한정되지 않음을 이해할 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 임의의 이러한 대안, 변형, 변이, 또는 균등물도 포괄하는 것으로 고려된다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이들 청구범위의 범위에 속하는 방법 및 구조와 이들의 등가물이 이에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (140)

  1. 조작된 뉴클레아제 시스템으로서
    (a) 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제; 및
    (b) 조작된 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 410-419, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 서열번호 414-419, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  5. 조작된 뉴클레아제 시스템으로서
    (a) 서열번호 410-419, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 조작된 가이드 RNA, 및
    (b) 상기 조작된 가이드 RNA에 결합하도록 구성된, 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 진핵생물, 진균류, 식물, 포유류, 또는 인간 게놈 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 30개 내지 250개 뉴클레오티드 길이인, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 상기 엔도뉴클레아제의 N-말단 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLS가 서열번호 630-645로 이루어진 군으로부터의 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 5'에서 3'으로, 상기 표적 데옥시리보핵산 서열의 5'에 있는 적어도 20개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 제1 상동 아암, 적어도 10개 뉴클레오티드의 합성 DNA 서열, 및 상기 표적 서열의 3'에 있는 적어도 20개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 제2 상동 아암을 포함하는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 복구 템플릿을 추가로 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 상동 아암은 적어도 40, 80, 120, 150, 200, 300, 500, 또는 1,000개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제1 및 제2 상동 아암이 원핵생물, 박테리아, 진균류, 또는 진핵생물의 게놈 서열과 상동인, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 복구 템플릿이 이식유전자 공여자를 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 또는 2개의 단일-가닥 DNA 분절이 측면에 위치한 이중-가닥 DNA 분절을 포함하는 DNA 복구 템플릿을 추가로 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단일-가닥 DNA 분절이 상기 이중-가닥 DNA 분절의 5' 말단에 접합되는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  16. 제14항에 있어서, 상기 단일-가닥 DNA 분절이 상기 이중-가닥 DNA 분절의 3' 말단에 접합되는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일-가닥 DNA 분절이 4개 내지 10개 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일-가닥 DNA 분절이 상기 스페이서 서열 내의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 DNA 서열이 바코드, 개방 해독 프레임, 인핸서, 프로모터, 단백질-코딩 서열, miRNA 코딩 서열, RNA 코딩 서열, 또는 이식유전자를 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  20. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 DNA 서열이 뉴클레아제 절단 부위가 측면에 위치하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 상기 뉴클레아제 절단 부위가 스페이서 및 PAM 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 상기 PAM이 서열번호 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 및 475 중 어느 하나의 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 Mg2+의 공급원을 추가로 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 적어도 8개, 적어도 10개, 또는 적어도 12개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  25. 제24항에 있어서, 상기 헤어핀은 10개의 염기쌍 리보뉴클레오티드를 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75%, 80%, 또는 90% 동일한 서열을 포함하고;
    b) 상기 가이드 RNA 구조가 서열번호 410-419 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80%, 또는 90% 동일한 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
    b) 상기 가이드 RNA 구조가 서열번호 414-419, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 동일성은 BLASTP, CLUSTALW, MUSCLE, MAFFT 알고리즘, 또는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘 파라미터를 사용하는 CLUSTALW 알고리즘에 의해 결정되는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  29. 제28항에 있어서, 상기 서열 동일성은, 단어 길이(W) 3, 기대치(E) 10의 파라미터, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(존재 11, 연장 1의 갭 비용 설정)를 사용하고, 조건부 조성 스코어 매트릭스 조정을 사용하는, 상기 BLASTP 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정되는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  30. 조작된 가이드 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오티드로서,
    a) 표적 DNA 분자 내의 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA-표적화 분절; 및
    b) 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체를 형성하도록 혼성화되는 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장을 포함하는, 단백질-결합 분절을 포함하며,
    여기서 상기 뉴클레오티드의 2개의 상보적 신장은 개재 뉴클레오티드와 서로 공유적으로 연결되고,
    여기서 상기 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드는 2형, 클래스 V Cas 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는, 조작된 가이드 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오티드.
  31. 제30항에 있어서, 상기 2형, 클래스 V Cas 엔도뉴클레아제가 미배양 유기체로부터 유래되는, 조작된 가이드 RNA.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제가 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 75% 서열 동일성을 갖고, 상기 복합체를 상기 표적 DNA 분자의 상기 표적 서열에 표적화하는, 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA-표적화 분절은 뉴클레오티드의 상기 2개의 상보적 신장 둘 모두의 3'에 위치하는, 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 결합 분절이 서열번호 410-419의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA(dsRNA) 이중체가 적어도 5개, 적어도 8개, 적어도 10개, 또는 적어도 12개의 리보뉴클레오티드를 포함하는, 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항의 조작된 가이드 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 암호화하는, 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드.
  37. 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 여기서 상기 핵산은 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하고, 여기서 상기 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래되고, 여기서 상기 유기체는 상기 미배양 유기체가 아닌, 핵산.
  38. 제37항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 70% 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 핵산.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 엔도뉴클레아제의 N-말단 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  40. 제39항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 630-645로부터 선택된 서열을 포함하는, 핵산.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 631을 포함하는, 핵산.
  42. 제41항에 있어서, 상기 NLS는 상기 엔도뉴클레아제의 상기 N-말단에 근접한, 핵산.
  43. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 630을 포함하는, 핵산.
  44. 제43항에 있어서, 상기 NLS는 상기 엔도뉴클레아제의 상기 C-말단에 근접한, 핵산.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기체는 원핵생물, 박테리아, 진핵생물, 진균류, 식물, 포유류, 설치류, 또는 인간인, 핵산.
  46. 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조작된 벡터로서, 여기서 상기 엔도뉴클레아제는 미배양 미생물로부터 유래되는, 조작된 벡터.
  47. 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는, 조작된 벡터.
  48. 제36항의 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조작된 벡터.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노-연관 바이러스(AAV) 유래 비리온, 렌티바이러스, 또는 아데노바이러스인, 조작된 벡터.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항의 조작된 벡터를 포함하는, 세포.
  51. 엔도뉴클레아제를 제조하는 방법으로서, 제50항의 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 결합, 절단, 마킹, 또는 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를, 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 RNA로 복합체 중 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함하고;
    여기서 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하고;
    여기서 상기 가이드 RNA 구조는 서열번호 410-419 중 어느 하나의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 상기 조작된 가이드 RNA의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 가닥 및 상기 PAM을 포함하는 제2 가닥을 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 PAM은 상기 조작된 가이드 RNA의 상기 서열에 상보적인 상기 서열의 5' 말단에 바로 인접하는, 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PAM은 서열번호 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 및 475 중 어느 하나의 서열을 포함하는, 방법.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제가 미배양 미생물로부터 유래되는, 방법.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제가 PAM 상호작용 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드가 진핵생물, 식물, 진균류, 포유류, 설치류, 또는 인간 이중-가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드인, 방법.
  59. 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조와 복합체를 형성하도록 구성되고, 여기서 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합할 때 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키도록 구성되는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 단계는 상기 표적 핵산 유전자좌를 결합, 니킹, 절단, 또는 마킹하는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함하는, 방법.
  62. 제59항에 있어서, 상기 표적 핵산은 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 또는 박테리아 DNA를 포함하는, 방법.
  63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 시험관 내에 있는, 방법.
  64. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 세포 내에 있는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포, 진균 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 영장류 세포, 인간 세포, 또는 일차 세포인, 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 세포는 일차 세포인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 일차 세포는 T 세포인, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 일차 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)인, 방법.
  69. 제59항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항의 조작된 벡터를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  70. 제59항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산을 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 핵산은 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 상기 개방 해독 프레임이 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함하는, 방법.
  72. 제59항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 상기 개방 해독 프레임을 함유하는 캡핑된 mRNA를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  73. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 번역된 폴리펩티드를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  74. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계는 리보핵산(RNA) pol III 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 조작된 가이드 RNA를 암호화하는 데옥시리보핵산(DNA)을 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제59항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 표적 유전자좌에서, 또는 이에 근접하여 단일-가닥 파단 또는 이중-가닥 파단을 유도하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 표적 유전자좌 내에서, 또는 상기 표적 유전자좌의 3'에서 엇갈린 단일-가닥 파단을 유도하는, 방법.
  77. 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 이종 엔도뉴클레아제를 암호화하는 개방 해독 프레임을 포함하는, 숙주 세포.
  78. 제77항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 1, 6, 15, 30, 151, 292, 또는 319 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는, 숙주 세포.
  79. 제77항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 숙주 세포.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli 세포인, 숙주 세포.
  81. 제80항에 있어서, 상기 E. coli 세포는 λDE3 리소겐이거나 상기 E. coli 세포는 BL21(DE3) 균주인, 숙주 세포.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 E. coli 세포는 ompT lon 유전자형을 갖는, 숙주 세포.
  83. 제77항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개방 해독 프레임은 T7 프로모터 서열, T7-lac 프로모터 서열, lac 프로모터 서열, tac 프로모터 서열, trc 프로모터 서열, ParaBAD 프로모터 서열, PrhaBAD 프로모터 서열, T5 프로모터 서열, cspA 프로모터 서열, araP BAD 프로모터, 파지 람다로부터의 강한 좌측 프로모터(pL 프로모터), 또는 이들의 임의의 조합에 작동 가능하게 연결되는, 숙주 세포.
  84. 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개방 해독 프레임은 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열에 프레임-내 연결된 친화도 태그를 암호화하는 서열을 포함하는, 숙주 세포.
  85. 제84항에 있어서, 상기 친화도 태그는 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 태그인, 숙주 세포.
  86. 제85항에 있어서, 상기 IMAC 태그는 폴리히스티딘 태그인, 숙주 세포.
  87. 제84항에 있어서, 상기 친화도 태그는 myc 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, 말토오스 결합 단백질(MBP) 태그, 글루타티온 S-전이효소(GST) 태그, 스트렙타비딘 태그, FLAG 태그, 또는 이들의 임의의 조합인, 숙주 세포.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화도 태그는 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 링커 서열을 통해 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 상기 서열에 프레임-내에서 연결되는, 숙주 세포.
  89. 제88항에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위는 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, PreScission® 프로테아제(PSP) 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 또는 이들의 임의의 조합인, 숙주 세포.
  90. 제77항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개방 해독 프레임은 상기 숙주 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화되는, 숙주 세포.
  91. 제77항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개방 해독 프레임은 벡터 상에 제공되는, 숙주 세포.
  92. 제77항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개방 해독 프레임은 상기 숙주 세포의 게놈에 통합되는, 숙주 세포.
  93. 제77항 내지 제92항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 적합한 액체 배지 중에 포함하는, 배양물.
  94. 엔도뉴클레아제를 생산하는 방법으로서, 적합한 성장 배지 중에 제77항 내지 제92항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 추가 화학 제제 또는 증가된 양의 영양소의 첨가에 의해 상기 엔도뉴클레아제의 발현을 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 추가 화학 제제 또는 증가된 양의 영양소는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 또는 추가 양의 락토오스를 포함하는, 방법.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항 있어서, 상기 배양 후 상기 숙주 세포를 단리하는 단계 및 상기 숙주 세포를 용해시켜 단백질 추출물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 단백질 추출물을 IMAC, 또는 이온 친화도 크로마토그래피에 적용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 개방 해독 프레임은 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열에 프레임-내 연결된 IMAC 친화도 태그를 암호화하는 서열을 포함하는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 IMAC 친화도 태그는 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 링커 서열을 통해 상기 엔도뉴클레아제를 암호화하는 상기 서열에 프레임-내 연결되는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위는 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, PreScission® 프로테아제 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위에 상응하는 프로테아제를 상기 엔도뉴클레아제에 접촉시킴으로써 상기 IMAC 친화도 태그를 절단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 감산 IMAC 친화도 크로마토그래피를 수행하여 상기 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물로부터 상기 친화도 태그를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  104. 세포에서 유전자좌를 파괴하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제; 및
    (b) 조작된 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 상기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 유전자좌의 영역에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하고,
    여기서 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 세포에서 spCas9와 적어도 동등한 절단 활성을 갖는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 절단 활성은 상기 표적 핵산을 포함하는 세포에 적합한 가이드 RNA와 함께 상기 엔도뉴클레아제를 도입하고 상기 세포에서 상기 표적 핵산 서열의 절단을 검출함으로써 시험관 내에서 측정되는, 방법.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 상기 조성물은 20 피코몰(pmol) 이하의 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 조성물은 1 pmol 이하의 상기 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는, 방법.
  108. 세포에서 알부민 유전자좌를 파괴하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제; 및
    (b) 조작된 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 상기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 유전자좌의 영역에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하고,
    여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 표 6의 표적 서열 중 어느 하나에 혼성화되도록 구성되는, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 조작된 가이드 RNA가 서열번호 414-419432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 및 474 중 어느 하나의 적어도 18개의 비-축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, 상기 조작된 가이드 RNA가 표 6의 단일 가이드 RNA(sgRNA) 서열 중 어느 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  111. 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 57과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  113. 제108항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영역은 서열번호 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 및 475 중 어느 하나를 포함하는 PAM 서열의 5'에 있는, 방법.
  114. 단리된 RNA 분자로서, 표 6의 서열 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 단리된 RNA 분자.
  115. 제114항에 있어서, 표 6에 인용된 가이드 RNA 중 어느 하나에 인용된 화학적 변형의 패턴을 추가로 포함하는, 단리된 RNA 분자.
  116. 세포의 알부민 유전자좌를 변형시키기 위한 제114항 또는 제115항의 RNA 분자의, 용도.
  117. 조작된 뉴클레아제 시스템으로서,
    (a) 서열번호 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 및 475 중 어느 하나를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 대해 선택적이도록 구성되는 엔도뉴클레아제; 및
    (b) 조작된 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  118. 제117항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 클래스 2, V형 Cas 엔도뉴클레아제인, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  119. 제117항 또는 제118항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 Cas12a 뉴클레아제가 아닌, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  120. 제117항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 미배양 유기체로부터 유래되는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  121. 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 상기 PAM과 상호작용하도록 구성된 PAM 상호작용 도메인을 추가로 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  122. 제117항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  123. 제122항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  124. 조작된 뉴클레아제 시스템으로서
    (a) 서열번호 1-325, 420-431, 476-624, 또는 629 중 어느 하나, 또는 이의 변이체와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제; 및
    (b) DNA 메틸트랜스퍼라아제를 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  125. 제124항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 30-33, 39, 48, 56, 57, 61, 83, 92, 100, 110, 124, 136, 145, 148, 424, 425, 429, 476, 또는 629 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  126. 제124항 또는 제125항에 있어서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제는 상기 엔도뉴클레아제에 비-공유적으로 결합하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  127. 제124항 또는 제125항에 있어서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제는 단일 폴리펩티드에서 상기 엔도뉴클레아제에 융합되는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  128. 제124항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제는 Dmnt3A 또는 Dnmt3L을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  129. 제124항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, KRAB 도메인을 추가로 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  130. 제129항에 있어서, 상기 KRAB 도메인은 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제에 비-공유적으로 결합하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  131. 제129항에 있어서, 상기 KRAB 도메인은 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제에 공유적으로 연결되는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  132. 제131항에 있어서, 상기 KRAB 도메인은 단일 폴리펩티드에서 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제에 융합되는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  133. 제124항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 니카아제이거나 촉매적으로 사멸되는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  134. 제124항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되는 조작된 가이드 RNA 구조를 추가로 포함하고, 여기서 상기 조작된 가이드 RNA 구조는 표적 핵산 서열에 혼성화되도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  135. 제134항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열은 표적 게놈의 프로모터에 포함되거나 이에 근접하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  136. 제134항 또는 제135항에 있어서, 상기 조작된 가이드 RNA 구조는 (a) 2'-O-메틸뉴클레오티드; (b) 2'-플루오로뉴클레오티드; 또는 (c) 포스포로티오에이트 결합 중 하나 이상을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  137. 제134항 또는 제135항에 있어서, 상기 조작된 가이드 RNA 구조는 표 6의 단일 가이드 RNA 중 어느 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 패턴을 포함하는, 조작된 뉴클레아제 시스템.
  138. 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 제124항 내지 제137항 중 어느 한 항의 상기 조작된 뉴클레아제 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 조작된 가이드 RNA 구조와 복합체를 형성하도록 구성되고, 여기서 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합할 때 상기 DNA 메틸트랜스퍼라아제가 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키도록 구성되는, 방법.
  139. 핵산 유전자좌를 변형시키기 위한 제124항 내지 제137항 중 어느 한 항의 조작된 뉴클레아제 시스템의, 사용.
  140. 제139항에 있어서, 상기 핵산 유전자좌를 변형시키는 단계는 상기 핵산 유전자좌의 뉴클레오티드를 메틸화하거나 탈메틸화하는 단계를 포함하는, 사용.
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