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KR20240095537A - 트랜스포존 조성물 및 이의 이용 방법 - Google Patents

트랜스포존 조성물 및 이의 이용 방법 Download PDF

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KR20240095537A
KR20240095537A KR1020247014572A KR20247014572A KR20240095537A KR 20240095537 A KR20240095537 A KR 20240095537A KR 1020247014572 A KR1020247014572 A KR 1020247014572A KR 20247014572 A KR20247014572 A KR 20247014572A KR 20240095537 A KR20240095537 A KR 20240095537A
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KR
South Korea
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nucleic acid
seq
acid sequence
itr comprises
sequence
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020247014572A
Other languages
English (en)
Inventor
조셉 에스 루카스
블레어 비 매디슨
Original Assignee
포세이다 테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 포세이다 테라퓨틱스, 인크. filed Critical 포세이다 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

발명의 요약
본 명세서는 유전자 치료법에 사용하기 위한 조성물 및 전위를 개선시키는 방법을 제공한다. 전위의 효능을 개선시키기 위해, 역전된 말단 반복부 (ITR) 영역의 비-자연 발생적 구조적 개선을 포함하는 트랜스포존 조성물들이 개시된다. 제1 역전된 말단 반복부 (ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 개시되며, 이때 상기 제1 ITR 및/또는 상기 제2 ITR은 전위 활성의 증가를 부여하는 적어도 하나의 핵산 치환을 포함한다. 이들 트랜스포존 조성물과 폴리뉴클레오티드를 만드는 방법 및 이용 방법들이 또한 개시된다.

Description

트랜스포존 조성물 및 이의 이용 방법
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2021년 10월 4일자로 제출된 U.S. 가출원 번호 63/252,030에 대해 우선권을 주장하고, 이의 이점을 청구한다. 본 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 편입된다.
서열 목록은 참고자료로 편입
본 출원과 연합된 서열 목록 XML은 XML 파일 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참고자료에 편입된다. 상기 서열 목록 XML을 갖고 있는 XML 파일명은 "POTH-071_001WO_SeqList_ST26"이다. 2022년 10월 2일자로 만들어진 상기 XML 파일의 크기는 779,850 바이트이며, USPTO Patent Center를 통해 전자적으로 제출된다.
명세서의 분야
본 명세서는 분자 생물학, 보다 구체적으로 트랜스포존, 트랜스포존을 포함하는 세포 조성물, 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경
유전자 치료에 사용하기 위한 개선된 전위(transposition)를 위한 조성물 및 방법에 대햐 업계에서는 오랫동안 갈구된, 충족되지 않은 요구가 있어 왔다. 본 명세서는 특히 유전자 치료를 위해 세포를 변형하는 방법으로 인간 세포에서 사용하기 위해 전위의 효능과 빈도를 향상시기 위한, 트랜스포존의 역전된 말단 반복 서열(ITR)에 대한 비-자연 발생적 구조적 개선점을 포함하는 조성물, 이를 만드는 방법 및 이들을 이용하는 방법들을 제공한다.
본 발명의 요약
본 명세서는 다음을 포함하는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다: a) 서열 식별 번호: 4에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 제1 역전된 말단 반복부 (ITR); 그리고 b) 서열 식별 번호: 5에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 제2 ITR; 그리고 이때 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 4의 핵산 위치 31 및 위치 33중 적어도 하나의 위치에 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 트랜스포존의 좌측 단부 ITR (LE ITR)이다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 트랜스포존의 우측 단부 ITR (RE ITR)이다.
본 명세서는 다음을 포함하는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다: a) 서열 식별 번호: 4에 대해 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 제1 역전된 말단 반복부 (ITR); 그리고 b) 서열 식별 번호: 5에 대해 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 제2 ITR; 그리고 이때 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 4의 핵산 위치 31 및 위치 33중 적어도 하나의 위치에 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 트랜스포존의 좌측 단부 ITR (LE ITR)이다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 트랜스포존의 우측 단부 ITR (RE ITR)이다.
일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 31G>T의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 33A>C의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 31G>T 및 33A>C의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존 또는 piggyBac-유사 트랜스포존이다. 일부 측면들에서, 상기 piggyBac 트랜스포존은 서열 식별 번호: 144-156 및 158에서 제시된 핵산 서열들 중 임의의 서열을 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 트랜스포존은 전위 활성에서 서열 식별 번호: 4의 제1 ITR 및 서열 식별 번호: 5의 제2 ITR을 갖는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하였을 때, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 증가된 활성을 보유한다. 일부 측면들에서, 상기 전위 활성은 절제다. 일부 측면들에서, 상기 전위 활성은 통합이다. 일부 측면들에서, 상기 전위 활성은 절제 및 통합이다.
일부 측면들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 선택가능한 마커를 인코딩하는 유전자를 더 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터를 더 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 절연체(insulator)를 인코딩하는 서열을 더 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 외생성 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 하나 외생성 핵산 서열은 비-자연 발생적 항원 수용체, 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 또는 이의 조합를 인코드한다. 일부 측면들에서, 적어도 하나의 외생성 핵산 서열은 키메라 항원 수용체를 포함하는 비-자연 발생적 항원 수용체를 인코드한다. 일부 측면들에서, 상기 하나의 외생성 핵산 서열은 치료요법적 폴리펩티드를 인코드한다.
본 명세서는 본원에서 개시된 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 하나를 포함하는 벡터를 또한 제공한다. 본 명세서는 본원에서 개시된 벡터들중 임의의 하나를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 본 명세서는 본원에서 개시된 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 하나를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 본 명세서는 본원에서 개시된 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 하나 또는 벡터들중 임의의 하나를 포함하는 세포를 또한 제공한다. 본 명세서는 본원에 개시된 세포들중 임의의 하나 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 또한 제공한다.
본 명세서는 변형된 세포들의 집단을 만드는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포들의 집단으로 a) 본원에서 개시된 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 하나, 그리고 b) 트란스포사제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 전달하고, 이로 인하여 전위 활성이 유도되고, 변형된 세포들의 집단이 생성되는 단계를 포함하며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드의 전위 활성은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하는 제1 ITR 및 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함하는 제2 ITR을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 증가된다.
본 명세서는 변형된 세포들의 집단을 만드는 방법을 제공하며, 이 방법은 세포들의 집단으로 a) 본원에서 개시된 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 하나, 그리고 b) 트란스포사제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 전달하고, 이로 인하여 전위 활성이 유도되며, 변형된 세포들의 집단이 생성되는 단계를 포함하고, 이때 상기 폴리뉴클레오티드의 전위 활성은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하는 제1 ITR 및 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함하는 제2 ITR을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 적어도 1.0 배, 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 또는 적어도 3.0 배 증가된다. 일부 측면들에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 전위 활성은 적어도 2.0 배 증가된다. 일부 측면들에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 전위 활성은 적어도 2.5 배 증가된다.
일부 측면들에서, 상기 트란스포사제 효소는 piggyBac 트란스포사제 또는 piggy-Bac 유사 트란스포사제이다. 일부 측면들에서, 상기 트란스포사제 효소는 Super piggyBac™ (SPB) 트란스포사제 효소이다. 일부 측면들에서, 상기 트란스포사제 효소는 서열 식별 번호: 107을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 트란스포사제 효소는 서열 식별 번호: 109를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서는 본원에 개시된 변형된 세포들의 집단을 만드는 방법들 중 임의의 하나의 방법에 따라 생산된 변형된 세포들의 집단을 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
본 명세서는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법을 또한 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 전술한 청구항들 중 임의의 한 항의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 및/또는 조성물의 적어도 하나의 치료요법적으로 효과적인 용량을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 질환 또는 장애는 암이다. 일부 측면들에서, 상기 암은 BCMA-양성 암, MUC-1-C 양성 암 또는 PSMA-양성 암이다. 일부 측면들에서, 상기 암은 폐암, 뇌암, 두경부암, 유방암, 피부암, 간암, 췌장암, 위암, 대장암, 직장암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 피부암, 식도암, 림프종, 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 털상세포백혈병, 골수이형성증후군(MDS), 호지킨병, 비호지킨 림프종 또는 다발성 골수종이다.
일부 측면들에서, 상기 질환 또는 장애는 간 질환 또는 장애다. 일부 측면들에서, 상기 간 질환 또는 장애는 요소 주기 장애다. 일부 측면들에서, 상기 간 질환 또는 장애는 대사성 간 장애다. 일부 측면들에서, 상기 대사성 간 장애 MLD는 N-아세틸글루타메이트 합성효소(NAGS) 결핍, 카르바모일포스페이트 합성효소 I 결핍(CPSI 결핍), 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC) 결핍, 아르기니노숙신산염 합성효소 결핍(ASSD)(시트룰린혈증 I), 시트린 결핍(시트룰린혈증 II), 아르기니노숙신산염 리아제 결핍(아르기닌숙신산뇨증), 아르기나아제 결핍(고아르기닌혈증), 오르니틴 트랜스로카제 결핍(HHH 증후군), 진행성 가족성 간내 담즙정체 1형(PFIC1), 진행성 가족성 간내 담즙정체 1형(PFIC2), 진행성 가족성 간내 담즙정체 1형(PFIC3), 메틸말론산혈증 (MMA) 또는 이의 임의의 조합이다.
일부 측면들에서, 상기 질환 또는 장애는 혈우병 질환이다. 일부 측면들에서, 상기 혈우병 질환은 혈우병 A, 혈우병 B, 혈우병 C 또는 이의 임의의 조합이다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 도면이 적어도 하나가 포함되어 있다. 컬러 도면이 있는 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 요금 지불시, 특허청(Office)에서 제공한다.
도 1은 돌연변이된 LE ITR 및/또는 돌연변이된 RE ITR을 포함하는 트랜스포존 라이브러리의 스크리닝 전략을 보여주는 개략도다.
도 2A는 상기 LE ITR의 이량체화 및 DNA 결합 도메인 (DDBD) 결합 부위 주변의 13bp 창의 돌연변이 전략을 보여주는 개략도다.
도 2B는 LE ITR의 DDBD 결합 부위 주변의 13개 염기쌍 각각의 풍부화도(enrichment) 점수를 보여주는 그래프다. 상기 야생형 LE ITR 서열은 상기 그래프의 맨 위 행에서 보여진다. 상기 야생형 뉴클레오티드가 항상 가장 풍부화된 서열은 아니다.
도 3은 트랜스포존 서열의 상기 5' 좌측 단부 반복된 영역, 상기 5' 내부 반복된 영역 및 상기 3' 우측 단부 반복된 영역에 대한 돌연변이적 서열을 보여주는 그래프다. 치환, 삽입 및 결손을 이용하여 이들 세 영역 각각에 대한 돌연변이 라이브러리를 생성하였다.
도 4는 상기 LE ITR에 대한 돌연변이성 라이브러 디자인의 개략도이다. 1bp, 2bp 또는 3bp 크기의 치환, 결손 및 삽입은 상기 LE ITR의 각 위치에서 생성되었다. 치환 - 1bp (서열 식별 번호: 561-583); 치환 - 2bp (서열 식별 번호: 584-607); 치환 - 3bp (서열 식별 번호: 454-477, 584 및 585); 결손 - 1bp (서열 식별 번호: 610-632); 결손 - 2bp (서열 식별 번호: 633-656); 결손 - 3bp (서열 식별 번호: 657-681).
도 5는 상기 5' 좌측 단부 반복된 영역, 상기 5' 내부 반복된 영역 및 상기 3' 우측 단부 반복된 영역의 각 결손 돌연변이 라이브러리에 대한 풍부화도 점수를 보여주는 일련의 그래프들이다.
도 6은 상기 5' 좌측 단부 반복된 영역, 상기 5' 내부 반복된 영역 및 상기 3' 우측 단부 반복된 영역의 각 삽입 돌연변이 라이브러리에 대한 풍부화도 점수를 보여주는 일련의 그래프들이다.
도 7은 상기 5' 좌측 단부 반복된 영역, 상기 5' 내부 반복된 영역 및 상기 3' 우측 단부 반복된 영역의 각 치환 돌연변이 라이브러리에 대한 풍부화도 점수를 보여주는 일련의 그래프들이다.
도 8은 트랜스포존의 LE ITR 및 RE ITR에 대한 돌연변이성 라이브러리 디자인의 개략적 다이아그램이다. 개별 삼량체 치환의 두 라이브러리가 생성되었다. 상기 LE ITR 돌연변이 라이브러리 (라이브러리 5)는 1888개 돌연변이를 보유한다 (예시적인 서열들, 서열 식별 번호: 454-486를 제시한다). 상기 RE ITR 돌연변이 라이브러리 (라이브러리 6)는 3232개 돌연변이를 보유한다 (예시적인 서열들, 서열 식별 번호: 487-547을 제시한다). N은 4개의 뉴클레오티드 중 하나를 나타낸다. NNN은 삼량체 치환의 64가지 상이한 조합을 나타낸다.
도 9A는 돌연변이 분석 후, Piggybac 트랜스포존의 LE ITR의 각 위치에서 전위에 대한 누적된 풍부화도 점수를 보여주는 그래프다. 상기 트랜스포존 위치는 piggyBac 트란스포사제의 이량체화 및 DNA 결합 도메인 (DDBD1 및 DDBD2), 그리고 시스테인 풍부화된 도메인 (CRD1 및 CRD2)의 예상된 결합 부위와 중첩되어 있다. 상기 LE ITR의 특정 영역만 돌연변이를 허용하며, 이러한 돌연변이의 하위 집합은 전위를 향상시킨다.
도 9B는 돌연변이 분석 후, Piggybac 트랜스포존의 RE ITR의 각 위치에서 전위에 대한 누적된 풍부화도 점수를 보여주는 그래프다. 상기 트랜스포존 위치들은 piggyBac 트란스포사제의 DDBD1, DDBD2, CRD1 및 CRD2의 예상된 결합 부위와 중첩되어 있다. 상기 RE ITR의 특정 영역만 돌연변이를 허용하며, 이러한 돌연변이들 중 많은 것들이 전위를 향상시킨다. RE ITR의 풍부한 돌연변이들은 LE ITR의 풍부화된 돌연변이들과 함께 테스트되었으며, 전위에서 추가 개선을 나타내지 않았다.
도 10은 야생형 LE ITR을 갖는 트랜스포존에 비해 전위를 증가시킨 LE ITR 트랜스포존 돌연변이체의 하위세트를 보여주는 그래프다. 돌연변이 LE ITRs을 갖는 각 트랜스포존을 Super Piggybac 트랜스포사제와 함께 HEK 293T 세포에 개별적으로 형질감염시켰다. 7일 후에, 유세포 분석법으로 GFP 양성 세포 비율을 측정했다. y-축은 형질감염 효율로 정규화된 7일차 통합을 나타낸다. 특정 돌연변이 LE ITR 트랜스포손들은 전위된 세포들의 비율을 적어도 5% 증가시켰다. 예시적인 돌연변이 LE ITR 서열은 서열 식별 번호: 1, 4, 16, 160-163, 165-166, 169, 171, 174-175, 177, 178-181, 183-185, 187, 189, 191, 193, 196, 199-200, 203-204, 206, 208, 210, 212-215, 219-220, 224, 226-232, 236-237, 239, 241, 245-247, 249, 250-251, 253, 256, 260-261, 263, 265, 및 517로 나타낸다.
도 11은 각 돌연변이 트랜스포존을 사용하여, 절제 및 통합 비율 확인에 사용되는 이중 리포터 플라스미드 디자인의 개략도이다. H-2kk GFP 트랜스포존 리포터 (리포터 1)를 사용하여, 상기 트랜스포존의 절제에서 증가가 있는 경우, H2kk 발현 증가가 관찰된다. 리포터 2를 사용하면, 트랜스포존의 통합에서 증가가 있는 경우, GFP 발현 증가가 관찰된다. 리포터 2의 대체 디자인에서, 상기 트랜스포존의 절제에서 증가가 있는 경우 초파리 루시퍼라제 발현 증가가 관찰되며, 트랜스포존의 통합에서 증가가 있는 경우 NanoLuc의 증가가 관찰된다.
도 12는 H-2kk GFP 트랜스포존 리포터 (리포터 1) (서열 식별 번호: 452)의 개략도이다. 트랜스포존의 구조적 특징들은 원형 지도와 선형 지도로 표시된다. 상기 트랜스포존의 절제에서 증가가 있는 경우 H2kk 발현에서 증가가 관찰되며, 상기 트랜스포존의 통합에서 증가가 있는 경우 GFP에서 증가가 관찰된다.
도 13은 초파리 루시퍼라제 Nano Luc 트랜스포존 리포터 (서열 식별 번호: 453)의 개략도이다. 트랜스포존의 구조적 특징들은 원형 지도와 선형 지도로 표시된다. 상기 트랜스포존의 절제에서 증가가 있는 경우 초파리 루시퍼라제 발현이 관찰되며, 트랜스포존의 통합에서 증가가 있는 경우 NanoLuc에서 증가가 관찰된다.
도 14는 각 돌연변이된 트랜스포존의 절제 및 통합 비율을 보여주는 일련의 그래프들이다. 많은 돌연변이들이 야생형 절제 및 통합에 비해 개선을 보여주었고, 상기 LE LTR 상에 31TCC 돌연변이를 갖는 돌연변이 트랜스포존들 (즉, 치환 31G>T 및 33A>C)은 절제 및/또는 통합을 통해 세포의 최대 증가를 보여주었다. 예시적인 돌연변이 LE ITRs, 서열 식별 번호: 166, 16, 548-550, 16, 551, 4 및 552를 위에서 아래로 나타낸다. 예시적인 돌연변이 RE ITRs, 서열 식별 번호: 5 및 553-556을 위에서 아래로 나타낸다.
도 15는 K562 세포들, HEK293T 세포들 및 일차 T 세포들에서 돌연변이 트랜스포존 및 Super Piggybac 트란스포사제를 이용하여 개선된 전위를 보여주는 일련의 그래프들이다.
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발명의 상세한 설명
본 명세서는 트랜스포존, 트랜스포존을 포함하는 조성물들 및 세포들, 본원에 기재된ㄷ 트랜스포존을 만드는 방법들, 그리고 본원에서 기재된 트랜스포존들, 조성물들 및 세포들을 이용하는 방법들을 제공한다.
본 명세서의 상기 트랜스포존들은 좌측 단부 역전된 말단 반복부 (LE ITR) 및 우측 단부 역전된 반복 (RE ITR)을 최적화시키고, 이로 인하여 전위 효능 및 효율을 증가시키도록 기획된다. 본 명세서의 트랜스포존들, 이들 트랜스포존들을 포함하는 조성물들은 모든 세포 유형에서 효과적이며; 그러나 이들은 인간 세포들에서 사용하기에 특히 효과적이다.
본원에서 기재된 바와 같이, 본 명세서의 트랜스포존을 이용하여, 전위 빈도를 증가시키고, 이로 인하여 결과적으로 유전적으로 편집된 세포들의 집단에서 원하는 유전자 전달 또는 원하는 부위 특이적 돌연변이들을 갖는 유전적으로 조작된 세포들의 비율이 더 높아지게 된다. 본 명세서의 트랜스포존은 유전자 편집에 필요한 공여자 플라스미드의 용량을 감소시키고, 이로 인하여 세포 생존력 증가에 또한 사용될 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 상기 ITR 영역과 대응하는 트란스포사제 간의 결합 친화력에서 변화는 야생형 ITR과 비교하여 이들 두 ITR 서열들을 함께 가져오는 상기 트란스포사제의 능력을 변경시키고, 이로 인하여 상기 트랜스포존으로부터 상기 내부-ITR 서열의 절제 증가 및/또는 상기 내부-ITR 서열을 표적 부위로의 통합이 증가하게 된다.
본 명세서의 조성물들
본 명세서는 a) 제1 역전된 말단 반복부 (ITR), 및 b) 제2 ITR을 포함하는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이때 상기 제1 ITR 및/또는 상기 제2 ITR은 트랜스포존의 야생형 ITR과 비교하여 적어도 하나의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 트랜스포존은 나노트랜스포존이다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 상기 좌측 단부 ITR이다. 일부 측면들에서, 상기 트랜스포존의 야생형 ITR과 비교하여 상기 하나의 핵산 치환은 전위 활성의 증가를 제공한다. 일부 측면들에서, 상기 전위 활성의 증가는 세포에서 트랜스포존의 절제의 증가다. 일부 측면들에서, 상기 전위 활성의 증가는 세포에서 트랜스포존의 통합의 증가다. 일부 측면들에서, 상기 전위 활성의 증가는 세포에서 트랜스포존의 절제의 증가 및 통합의 증가다.
일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열, 또는 이의 역 보체를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 원형 단일-가닥의 DNA 폴리뉴클레오티드는 두 개의 ITR 서열, 또는 이의 보체들을 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, ITR 서열은 당분야에 공지된 임의의 ITR 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, ITR 서열은 당분야에 공지된 임의의 piggyBac 트랜스포존 ITR 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 측면들에서, ITR 서열은 piggyBac 트랜스포존 ITR 서열, Sleeping Beauty 트랜스포존 ITR, Helraiser 트랜스포존 ITR, Tol2 트랜스포존 ITR, TcBuster 트랜스포존 ITR 또는 이의 임의의 조합을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 TTAA, TTAT, 또는 TTAX 인지 서열을 포함할 수 있다. 상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개의 뉴클레오티드 (또는 이들 사이의 임의의 갯수의 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, 본 명세서의 piggyBac ITR 서열은 다음 서열들 중 적어도 하나의 한쪽 단부 또는 양 단부에 측면에 위치할 수 있다: 5'-CTAA-3', 5'-TTAG-3', 5'-ATAA-3', 5'-TCAA-3', 5'AGTT-3', 5'-ATTA-3', 5'-GTTA-3', 5'-TTGA-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTAC-3', 5'-ACTA-3', 5'-AGGG-3', 5'-CTAG-3', 5'-TGAA-3', 5'-AGGT-3', 5'-ATCA-3', 5'-CTCC-3', 5'-TAAA-3', 5'-TCTC-3', 5'TGAA-3', 5'-AAAT-3', 5'-AATC-3', 5'-ACAA-3', 5'-ACAT-3', 5'-ACTC-3', 5'-AGTG-3', 5'-ATAG-3', 5'-CAAA-3', 5'-CACA-3', 5'-CATA-3', 5'-CCAG-3', 5'-CCCA-3', 5'-CGTA-3', 5'-GTCC-3', 5'-TAAG-3', 5'-TCTA-3', 5'-TGAG-3', 5'-TGTT-3', 5'-TTCA-3'5'-TTCT-3' 및 5'-TTTT-3'. 일부 측면들에서, piggyBac ITR 서열은 5'-TTAA-3'의 측면에 위치할 수 있다. 따라서, 본 명세서의 임의의 부분적으로 이중-가닥으로된 DNA 분자는 다음 중 임의의 하나를 더 포함할 수 있다: 5'-CTAA-3', 5'-TTAG-3', 5'-ATAA-3', 5'-TCAA-3', 5'AGTT-3', 5'-ATTA-3', 5'-GTTA-3', 5'-TTGA-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTAC-3', 5'-ACTA-3', 5'-AGGG-3', 5'-CTAG-3', 5'-TGAA-3', 5'-AGGT-3', 5'-ATCA-3', 5'-CTCC-3', 5'-TAAA-3', 5'-TCTC-3', 5'TGAA-3', 5'-AAAT-3', 5'-AATC-3', 5'-ACAA-3', 5'-ACAT-3', 5'-ACTC-3', 5'-AGTG-3', 5'-ATAG-3', 5'-CAAA-3', 5'-CACA-3', 5'-CATA-3', 5'-CCAG-3', 5'-CCCA-3', 5'-CGTA-3', 5'-GTCC-3', 5'-TAAG-3', 5'-TCTA-3', 5'-TGAG-3', 5'-TGTT-3', 5'-TTCA-3'5'-TTCT-3' 및 5'-TTTT-3' 측면 piggyBac ITR 서열.
일부 측면들에서, 본 명세서의 piggyBac ITR 서열은 다음 서열들 또는 이의 역 보체들 중 적어도 하나의 한쪽 단부 또는 양 단부에 측면에 위치할 수 있다: 5'-NTAA-3', 5'-TNAA-3', 5'-TTNA-3' 및 5'-TTAN-3', 이때 N은 A, T, C 또는 G 중 임의의 하나이다. 따라서, 본 명세서의 임의의 부분적으로 이중-가닥으로된 DNA 분자는 5'-NTAA-3', 5'-TNAA-3', 5'-TTNA-3' 및 5'-TTAN-3' 또는 이의 역 보체들 중 임의의 하나를 더 포함할 수 있고, 이때 N은 A, T, C 또는 G 중 임의의 하나이다.
일부 측면들에서, piggyBac ITR 서열은 당분야에 공지된 임의의 piggyBac ITR 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, piggyBac ITR 서열은 서열 식별 번호: 1-5에서 제시된 서열들 중 임의의 것, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 4에서 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 11에서 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다. 상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 1에서 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다. 상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 2에서 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다. 상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 3에서 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
본 명세서의 예시적인 돌연변이 좌측 단부 (LE) ITR 서열은 표 1에서 제시된다. 상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 14-16 또는 160-163, 165-265 중 임의의 하나의 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
표 1. 돌연변이 LE ITR 서열들
상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 14에서 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 15에서 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 16에서 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 위치 31 및 위치 33 중 적어도 하나에 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 31 G>T의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 33A>C의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 31G>T의 핵산 치환 및 33A>C의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서 "31TCC" 돌연변이 LE ITR은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 190의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 191의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 192의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 193의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 194의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 195의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 196의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 197의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 198의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 199의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 200의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 201의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 202의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 203의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 204의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 205의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 206의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 207의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 208의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 209의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 210의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 211의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 212의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 213의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 214의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 215의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 216의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 217의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 218의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 219의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 220의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 221의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 222의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 223의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 224의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 225의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 226의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 227의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 228의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 229의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 230의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 231의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 232의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 233의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 234의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 235의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 236의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 237의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 238의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 239의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 240의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 241의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 242의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 243의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 244의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 245의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 246의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 247의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 248의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 249의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 250의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 251의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 252의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 253의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 254의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 255의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 256의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 257의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 258의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 259의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 260의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 261의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 262의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 263의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 264의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 265의 핵산 서열을 포함한다.
상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 5에서 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
본 명세서의 예시적인 돌연변이 우측 단부 (RE) ITR 서열은 표 2에서 제시된다. 상기 제1 ITR을 인코딩하는 서열 또는 상기 제2 ITR을 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 267-277, 279-329 또는 331-451 중 임의의 하나의 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
표 2. 돌연변이 RE ITR 서열들
일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 277의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 279의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 280의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 281의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 282의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 283의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 284의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 285의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 286의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 287의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 288의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 289의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 290의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 291의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 292의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 293의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 294의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 295의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 296의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 297의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 298의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 299의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 300의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 301의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 302의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 303의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 304의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 305의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 306의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 307의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 308의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 309의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 310의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 311의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 312의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 313의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 314의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 315의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 316의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 317의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 318의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 319의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 320의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 321의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 322의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 323의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 324의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 325의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 326의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 327의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 328의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 329의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 330의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 331의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 332의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 333의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 334의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 335의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 336의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 337의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 338의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 339의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 340의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 341의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 342의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 343의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 344의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 345의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 346의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 347의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 348의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 349의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 350의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 351의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 352의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 353의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 354의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은서열 식별 번호: 355의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 356의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 357의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 358의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 359의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 360의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 361의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 362의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 363의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 364의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 365의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 366의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 367의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 368의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 369의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 370의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 371의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 372의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 373의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 374의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 375의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 376의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 377의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 378의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 379의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 380의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 381의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 382의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 383의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 384의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 385의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 386의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 387의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 388의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 389의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 390의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 391의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 392의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 393의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 394의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 395의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 396의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 397의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 398의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 399의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 400의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 401의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 402의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 403의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 404의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 405의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 406의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 407의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 408의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 409의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 410의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 411의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 412의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 413의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 414의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 415의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 416의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 417의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 418의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 419의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 420의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 421의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 422의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 423의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 424의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 425의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 426의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 427의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 428의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 429의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 430의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 431의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 432의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 433의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 434의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 435의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 436의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 437의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 438의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 439의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 440의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 441의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 442의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 443의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 444의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 445의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 446의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 447의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 448의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 449의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 450의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 서열 식별 번호: 451의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4, 14-16, 160-163 또는 165-265의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5, 11, 267-277, 279-329 또는 331-451의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 11의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 267의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 268의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 269의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 270의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 271의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 272의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 273의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 274의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 275의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 160의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 161의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 162의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 163의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 165의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 166의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 167의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 168의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 169의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 170의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 171의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 172의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 173의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 174의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 175의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 176의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 177의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 178의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 179의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 180의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 181의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 182의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 183의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 184의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 185의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 186의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 187의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 188의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 제1 ITR을 인코딩하는 제1 서열은 서열 식별 번호: 189의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 ITR을 인코딩하는 제2 서열은 서열 식별 번호: 276의 핵산 서열을 포함한다.
상기 조성물은 복제 원점 서열 또는 복제 서열을 인코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 제1 핵산 서열 또는 상기 제2 핵산 서열은 복제 원점 서열 또는 복제 서열을 인코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 핵산 서열은 복제 원점 서열 또는 복제 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
상기 복제 원점 서열은 R6K 복제 원점을 포함할 수 있다. 상기 R6K 복제 원점은 R6K 감마 복제 원점을 포함할 수 있다. 상기 복제 원점 서열은 미니 복제 원점을 포함할 수 있다. 상기 미니 복제 원점은 R6K 미니 복제 원점을 포함할 수 있다. 상기 R6K 미니 복제 원점은 R6K 감마 미니 복제 원점을 포함할 수 있다. 상기 R6K 감마 미니 복제 원점의 길이는 281개 뉴클레오티드 (281개 염기쌍)이며, 서열 식별 번호: 17의 핵산 서열을 포함하거나, 이 서열로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
상기 조성물은 선택가능한 마커 또는 선택가능한 마커를 인코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열 또는 상기 제2 핵산 서열은 선택가능한 마커 또는 선택가능한 마커를 인코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산 서열은 선택가능한 마커 또는 선택가능한 마커를 인코딩하는 서열을 포함한다.
상기 핵산 서열은 적어도 하나의 외생성 서열 및 포유류 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 적어도 하나의 프로모터를 더 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 프로모터는 인간 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있다. 한 측면에서, 상기 조성물의 트랜스포존 서열은 상기 적어도 하나의 외생성 서열 및 포유류 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 적어도 하나의 프로모터를 포함한다.
일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 프로모터 서열은 당분야에 공지된 임의의 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 세포-유형 또는 조직-유형 특이적 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 EF1a 프로모터 (서열 식별 번호: 18), CMV 프로모터, MND 프로모터, SV40 프로모터, PGK1 프로모터, Ubc 프로모터, CAG 프로모터, H1 프로모터, 또는 U6 프로모터일 수 있다. 한 측면에서, 상기 프로모터는 EF1a 프로모터이다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 하이브리드 간 프로모터 (HLP)를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 프로모터 서열은 LP1 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 프로모터 서열은 백혈구-특이적 발현을 하는 pp52 (LSP1) 긴 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 프로모터 서열은 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 wTBG 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 프로모터 서열은 간의 조합적 번들 (HCB) 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 프로모터 서열은 ApoE-hAAT 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 프로모터 서열은 2xApoE-hAAT 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 프로모터 서열은 백혈구-특이적 발현의 pp52 (LSP1) + 키메라 인트론 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 프로모터 서열은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 서열 식별 번호: 19-28에서 제시된 서열들 중 임의의 것, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 하이브리드 간 프로모터 (HLP)를 포함할 수 있다. HLP는 서열 식별 번호: 19 또는 27, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 LP1 프로모터를 포함할 수 있다. LP1 프로모터는 서열 식별 번호: 20, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 백혈구-특이적 발현을 하는 pp52 (LSP1) 긴 프로모터를 포함할 수 있다. LSP1 긴 프로모터는 서열 식별 번호: 21, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터를 포함할 수 있다. TBG 프로모터는 서열 식별 번호: 22, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 wTBG 프로모터를 포함할 수 있다. wTBG 프로모터는 서열 식별 번호: 23, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 간의 조합적 번들 (HCB) 프로모터를 포함할 수 있다. HCB 프로모터는 서열 식별 번호: 24, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 2xApoE-hAAT 프로모터를 포함할 수 있다. 2xApoE-hAAT 프로모터는 서열 식별 번호: 25, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 백혈구-특이적 발현의 pp52 (LSP1) + 키메라 인트론 프로모터를 포함할 수 있다. LSP1 + 키메라 인트론 프로모터는 서열 식별 번호: 26, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 프로모터 서열은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함할 수 있다. CMV 프로모터는 서열 식별 번호: 28, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
상기 적어도 하나의 외생성 서열은 비-자연 발생적 항원 수용체, 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 서열로 구성될 수 있다. 상기 비-자연 발생적 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR), 키메라 자극 수용체 (CSR), HLA 클라스 I 조직적합성 항원, 알파 쇄 E 재조합 폴리펩티드 (HLA-E), 베타-2-마이크로글로불린 (B2M) 재조합 폴리펩티드, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. TCRs, CSRs, HLA-Es 및 B2Ms는 본원에서 상세하게 기술된다. 한 측면에서, 상기 비-자연 발생적 항원 수용체는 CAR를 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 적어도 하나의 외생성 서열은 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 포함하거나, 이 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 서열로 구성된다.
일부 측면들에서, 치료요법적 폴리펩티드는 메틸말로닐-CoA 무타제 (MUT1) 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 구성되거나, 이것으로 구성된다. 일부 측면들에서, 단백질 및/또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 메틸말로닐-CoA 무타제 (MUT1) 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 단백질 및/또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 MUT1 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 이때 상기 MUT1 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 29-32에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면들에서, MUT1 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열은 서열 식별 번호: 33-44에서 제시된 임의의 서열, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 치료요법적 폴리펩티드는 오르니틴 트란스카르바밀라제 (OTC) 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일부 측면들에서, 단백질 및/또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 오르니틴 트란스카르바밀라제 (OTC) 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 단백질 및/또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 OTC 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 이때 상기 OTC 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 45 또는 46에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면들에서, OTC 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열은 서열 식별 번호: 47-50에서 제시된 임의의 서열, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 치료요법적 폴리펩티드는 인자 VIII (FVIII) 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 구성되거나, 이것으로 구성될 수 있다. 일부 측면들에서, FVIII 폴리펩티드는 B-도메인이 결여된 FVIII 폴리펩티드 (이하에서 FVIII-BDD 폴리펩티드로 지칭됨)일 수 있다. 당업자가 인지할 수 있는 것과 같이, 인자 VIII-BDD 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내 생물학적 전위 활성을 유지한다 (Kessler et al. Haemophilia, 2005, 11(2): 84-91 참고). FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 51에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 일부 측면들에서, FVIII-BDD 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열은 서열 식별 번호: 52, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 치료요법적 폴리펩티드는 인자 IX (FIX) 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 구성되거나, 이것으로 구성될 수 있다. 일부 측면들에서, FIX 폴리펩티드는 R338L 돌연변이를 포함할 수 있다. 당업자가 인지할 수 있는 것과 같이, 상기 R338L 돌연변이는 Padua 돌연변이로 지칭될 수 있다 (VandenDriessche and Chuah, Molecular Therapy, 2018, Vol. 26, Issue 1, P14-16, 그 내용은 그 전문이 참조로 본원에 편입된다).
일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 polyA 서열, 또는 이의 역 보체를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, polyA 서열은 당분야에 공지된 polyA 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, poly-A 서열은 서열 식별 번호: 53-57, 또는 이의 역 보체에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다.
일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 5' UTR 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 명세서의 트랜스포존은 다음의 것들중 임의의 조합을 포함할 수 있다: i) 적어도 하나의 절연체 서열, 또는 이의 역 보체; ii) 적어도 하나의 프로모터 서열, 또는 이의 역 보체; iii) 적어도 하나의 단백질 및/또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 역 보체; iv) 적어도 하나의 polyA 서열, 또는 이의 역 보체; 적어도 하나의 5' UTR 서열, 또는 이의 역 보체, 및/또는 vi) 적어도 하나의 3' UTR 서열, 또는 이의 역 보체.
따라서, 본 명세서의 트랜스포존은 다음의 것들 중 임의의 조합을 포함할 수 있다: i) 적어도 하나의 절연체 서열, 또는 이의 역 보체; ii) 적어도 하나의 프로모터 서열, 또는 이의 역 보체; iii) 적어도 하나의 단백질 및/또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 역 보체; 및/또는 iv) 적어도 하나의 polyA 서열, 또는 이의 역 보체.
비-제한적인 예로써, 본 명세서의 트랜스포존은 다음을 포함할 수 있다: i) 제1 절연체 서열, 또는 이의 역 보체, 이어서 적어도 하나의 프로모터 서열, 또는 이의 역 보체, 이어서 적어도 하나의 단백질 및/또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 역 보체, 이어서 적어도 하나의 polyA 서열, 또는 이의 역 보체, 이어서 제2 절연체 서열, 또는 이의 역 보체.
일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 및 3' UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 5'에서 3' 방향으로, 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 및 3' UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열에 이어서, 3' UTR 서열을 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 제1 절연체 서열, 적어도 하나의 프로모터 서열, 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 서열, 3' UTR 서열, polyA 서열 및 제2 절연체 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서 본 명세서의 트랜스포존은 상기 5'에서 3' 방향으로, 제1 절연체 서열, 적어도 하나의 프로모터 서열, 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 서열, 3' UTR 서열, polyA 서열, 및 제2 절연체 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 제1 절연체 서열, 이어서 적어도 하나의 프로모터 서열, 이어서 적어도 하나의 프로모터 서열, 이어서 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 서열, 이어서 3' UTR 서열, 이어서 polyA 서열, 이어서 제2 절연체 서열을 포함할 수 있다.
전술한 트랜스포존들의 일부 측면들에서, 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 서열은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 인코딩하는 서열일 수 있고, 이때 상기 FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, FVIII-BDD 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 52의 핵산 서열, 또는 이의 역 보체를 포함할 수 있다.
전술한 트랜스포존의 일부 측면들에서, 3' UTR 서열은 서열 식별 번호: 58의 핵산 서열, 또는 이의 역 보체를 포함할 수 있다.
따라서, 비-제한적인 예로써, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 및 3' UTR 서열을 포함할 수 있고, 이때 상기 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 인코드하는 서열이며, 이때 상기 FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 상기 3' UTR 서열은 서열 식별 번호: 58의 핵산 서열, 또는 이의 역 보체를 포함한다.
일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 제1의 3' UTR 서열 및 제2의 3' UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 5'에서 3' 서열 방향으로, 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 제1의 3' UTR 서열 및 제2의 3' UTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 이어서 제1의 3' UTR, 이어서 제2의 3' UTR 서열을 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 제1 절연체 서열, 적어도 하나의 프로모터 서열, 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 서열, 제1의 3' UTR 서열, 제2의 3' UTR 서열, polyA 서열 및 제2 절연체 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 5'에서 3' 방향으로, 제1 절연체 서열, 적어도 하나의 프로모터 서열, 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 서열, 제1의 3' UTR 서열, 제2의 3' UTR 서열, polyA 서열, 및 제2 절연체 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 본 명세서의 트랜스포존은 제1 절연체 서열, 이어서 적어도 하나의 프로모터 서열, 이어서 적어도 하나의 프로모터 서열, 이어서 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 서열, 이어서 제1의 3' UTR 서열, 이어서 제2의 3' UTR 서열, 이어서 polyA 서열, 이어서 제2 절연체 서열을 포함할 수 있다.
전술한 트랜스포존들의 일부 측면들에서, 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 서열은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 인코딩하는 서열일 수 있고, 이때 상기 FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, FVIII-BDD 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 52의 핵산 서열, 또는 이의 역 보체를 포함할 수 있다.
전술한 트랜스포존의 일부 측면들에서, 제1의 3' UTR 서열은 AES 3' UTR 서열일 수 있고, 이때 상기 AES 3' UTR 서열은 서열 식별 번호: 59의 핵산 서열을 포함한다.
전술한 트랜스포존의 일부 측면들에서, 제2의 3' UTR 서열은 mtRNR1 3' UTR 서열일 수 있고, 이때 상기 mtRNR1 3' UTR 서열은 서열 식별 번호: 60의 핵산 서열, 또는 이의 역 보체를 포함한다.
따라서, 비-제한적인 예로써, 본 명세서의 트랜스포존은 적어도 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 제1의 3' UTR 서열 및 제2의 3' UTR 서열을 포함할 수 있고, 이때 상기 하나의 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 은 FVIII-BDD 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이며, 이때 상기 FVIII-BDD 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하고, 이때 상기 제1의 3' UTR 서열은 서열 식별 번호: 59의 핵산 서열, 또는 이의 역 보체를 포함하며, 상기 제2의 3' UTR 서열은 서열 식별 번호: 60의 핵산 서열, 또는 이의 역 보체를 포함한다.
상기 적어도 하나의 외생성 서열은 유도성 사전-세포자멸성 촉진 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하거나, 이 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 서열로 구성될 수 있다. 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드들은 본원에 상세하게 기술되어있다.
상기 적어도 하나의 외생성 서열은 제2 선택가능한 마커를 추가로 포함하거나, 이 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 서열로 구성될 수 있다. 상기 제2 선택가능한 마커는 세포 생존과 생존에 필수적인 유전자 산물을 인코드할 수 있다. 상기 제2 선택가능한 마커는 선택적 세포 배양 조건에 의해 시험공격을 받을 때, 세포 생존력과 생존에 필수적인 유전자 산물을 인코드할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존력 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있으며, 이때 유전자 산물은 화합물에 대한 저항성을 부여한다. 선택 유전자의 비제한적인 예시에는 neo (네오마이신에 대한 내성 부여함), DHFR (디히드로엽산 환원효소를 인코드하고, 메토트렉세이트에 대한 저항성 부여), TYMS (티미딜레이트 합성효소를 인코딩), MGMT (O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 인코딩), 다중-약물 내성 유전자 (MDR1), ALDH1 (알데히드 탈수소효소 1 계열, A1 구성원을 인코딩), FRANCF, RAD51C (RAD51 Paralog C를 인코딩), GCS (글루코실세라미드 합성효소를 인코딩), NKX2.2 (NK2 Homeobox 2를 인코딩), 또는 이의 임의의 조합이 내포된다.
상기 제2 선택가능한 마커는 탐지가능한 마커일 수 있다. 상기 탐지가능한 마커는 형광 마커, 세포-표면 마커 또는 대사성 마커일 수 있다. 선호되는 측면에서, 상기 제2 선택가능한 마커는 디히드로엽산 환원효소 (DHFR) 뮤테인 효소를 인코딩하는 서열을 포함한다. 상기 DHFR 뮤테인 효소는 서열 식별 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 상기 DHFR 뮤테인 효소는 서열 식별 번호: 62의 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다. 상기 DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80, 113, 또는 153 중 하나 또는 그 이상의 위치에서 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 상기 DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80에서 페닐알라닌 (F) 또는 류신 (L)의 치환, 위치 113에서 류신 (L) 또는 발린 (V)의 치환, 그리고 위치 153에서 발린 (V) 또는 아스파르트산 (D)의 치환 중 하나 또는 그 이상의 치환을 포함할 수 있다.
상기 적어도 하나의 외생성 서열은 적어도 하나의 자가-절단 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하거나, 이 서열로 필수적으로 더 구성되거나, 이 서열로 더 구성될 수 있다. 예를 들면, 자가-절단 펩티드는 CAR과 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드 사이에 위치할 수 있고; 또는, 자가-절단 펩티드는 CAR과 제2 선택가능한 마커 사이에 위치할 수 있다.
상기 적어도 하나의 외생성 서열은 적어도 두 개의 자가-절단 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하거나, 이 서열로 필수적으로 더 구성되거나, 이 서열로 더 구성될 수 있다. 예를 들면, 제1 자가-절단 펩티드는 CAR의 상류 또는 직전 상류에 위치하며, 제2 자가-절단 펩티드는 CAR의 하류 또는 직전 하류에 위치하며; 또는 상기 제1 자가-절단 펩티드와 상기 제2 자가-절단 펩티드는 CAR의 측면에 있다. 예를 들면, 제1 자가-절단 펩티드는 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드의 상류 또는 직전 상류에 위치하며, 제2 자가-절단 펩티드는 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드의 하류 또는 직전 하류에 위치하며; 또는 상기 제1 자가-절단 펩티드와 상기 제2 자가-절단 펩티드는 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드의 측면에 있다. 예를 들면, 제1 자가-절단 펩티드는 제2 선택가능한 마커의 상류 또는 직전 상류에 위치하며, 제2 자가-절단 펩티드는 제2 선택가능한 마커의 하류 또는 직전 하류에 위치하며; 또는 상기 제1 자가-절단 펩티드와 상기 제2 자가-절단 펩티드는 제2 선택가능한 마커의 측면에 있다.
자가-절단 펩티드의 비-제한적인 예시에는 T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드가 내포된다. 자가 절단 펩티드들의 비-제한적 예시들은 PCT 공개 번호 WO 2020/132396에 기재되어 있다.
적어도 하나의 외생성 서열을 포함하는 트랜스포존 및 포유류 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 적어도 하나의 프로모터를 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 절연체를 인코딩하는 적어도 하나의 서열을 더 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 제1 절연체를 인코딩하는 제1 서열과 제2 절연체를 인코딩하는 제2 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 제1 절연체 또는 제2 절연체를 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 64 또는 서열 식별 번호: 65에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다.
적어도 하나의 외생성 서열을 포함하는 트랜스포존 및 포유류 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 적어도 하나의 프로모터를 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 폴리아데노신 (polyA) 서열을 더 포함할 수 있다. 적어도 하나의 외생성 서열, 포유류 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 적어도 하나의 프로모터 및 절연체를 인코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 폴리아데노신 (polyA) 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 polyA 서열은 바이러스 polyA 서열로부터 단리될 수 있거나, 이로부터 파생될 수 있다. 상기 polyA 서열은 (SV40) polyA 서열로부터 단리될 수 있거나, 이로부터 파생될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제1 절연체 또는 제2 절연체를 인코딩하는 서열은 서열 식별 번호: 68에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다.
한 측면에서, 상기 조성물은 외래 DNA를 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 한 측면에서, 상기 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 외래 DNA를 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 한 측면에서, 상기 조성물은 외래 DNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 외래 DNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 외래 DNA는 외생성 서열이 발현되는 포유류 세포와 동일한 유기체로부터 유래되거나 획득되지 않은 DNA 서열이다. 예를 들면, 외래 DNA는 포유류가 아닌 바이러스의 DNA일 수 있고; 또는 상기 외래 DNA가 포유류가 아닌 파충류의 DNA일 수도 있다. 또다른 측면에서, 상기 외래 DNA는 하나의 포유동물로부터 유래될 수 있지만, 그 포유동물은 외생성 서열이 발현될 포유동물과 상이하다. 예를 들면, 상기 외래 DNA는 인간이 아닌 랫으로부터 기인된다.
한 측면에서, 상기 조성물은 재조합 부위, 절제 부위, 결찰 부위 또는 이들의 조합을 포함하지 않는다. 한 측면에서, 상기 조성물은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이들의 조합의 산물을 포함하지 않는다. 한 측면에서, 상기 조성물은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이들의 조합으로부터 유래되지 않는다.
한 측면에서, 상기 제1 핵산 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 결찰 부위, 또는 이들의 조합을 포함하지 않는다. 한 측면에서, 상기 제1 핵산 서열은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이들의 조합의 생성물을 포함하지 않는다. 한 측면에서, 상기 제1 핵산 서열은 재조합 사건, 절제 사건, 결찰 사건, 또는 이들의 조합으로부터 유래되지 않는다.
재조합 부위는 재조합 사건으로부터 생성된 서열을 포함할 수 있거나, 재조합 사건의 산물인 서열을 포함할 수 있거나, 재조합효소의 활성(가령, 재조합효소 부위)을 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본 명세서는 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 제공하며, 이때 상기 CAR은 항원 인지 영역을 포함하는 엑토-도메인; 막횡단 도메인, 및 적어도 하나의 공동-자극 도메인을 포함하는 엔도-도메인을 포함한다. 상기 CAR은 상기 항원 인지 도메인과 상이 막횡단 도메인 사이에 힌지 영역을 더 포함할 수 있다.
상기 항원 인지 영역은 적어도 하나의 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 센티린, 단일 도메인 항체, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 적어도 하나의 단일 도메인 항체는 VHH이다. 한 측면에서, 상기 적어도 하나의 단일 도메인 항체는 VH이다.
scFv
본 명세서의 상기 조성물들 (가령, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)은 CAR을 포함할 수 있고; 그리고 일부 측면들에서, 상기 CAR의 항원 인지 영역은 특이적 표적 단백질/항원을 인지하고, 이에 결합하도록 하나 또는 그 이상의 scFv 조성물들을 포함할 수 있다. 상기 항원 인지 영역은 적어도 두 개의 scFvs를 포함할 수 있다. 상기 항원 인지 영역은 적어도 세 개의 scFvs를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 명세서의 CAR은 두 개의 별개 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 두 개의 scFvs를 포함하는 이중-특이적 CAR이다.
상기 scFv 조성물들은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. scFv는 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질이며, 상기 VH 도메인과 VL 도메인은 짧은 펩티드 링커로 연결되어 있다. scFv는 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 원래 면역글로불린의 특이성을 유지할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 링커 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 상기 링커 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 70의 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다.
센티린(Centyrin)
본 명세서의 상기 조성물들 (가령, 트랜스포존 또는 나노트랜스포존)은 CAR을 포함할 수 있고; 그리고 일부 측면들에서, 상기 CAR의 항원 인지 영역은 특이적 표적 단백질/항원을 인지하고, 이에 결합하도록 하나 또는 그 이상의 센티린 조성물들을 포함할 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 센티린은 특이적 항원을 향한 세포 (가령, 세포독성 면역 세포)의 특이성을 지시하는 데 사용될 수 있다. 센티린을 포함하는 CAR은 본원에서 CARTyrin로 지칭된다.
본 명세서의 센티린은 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있고, 이때 상기 스캐폴드는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 명세서의 센티린은 적어도 하나의 피브로넥틴 유형 III (FN3) 도메인의 콘센수스 서열을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있고, 이때 상기 스캐폴드는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 적어도 하나의 피브로넥틴 유형 III (FN3) 도메인은 인간 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기 인간 단백질은 테나신-C일 수 있다. 센티린의 비-제한적인 예시들은 PCT 공개 번호 WO 2020/132396에서 기술된다.
"항체 모방체(antibody mimetic)"라는 용어는 표적 서열에 특이적으로 결합하고, 자연-발생적 항체와는 구별되는 구조를 갖는 유기 화합물을 설명하려는 의도이다. 항체 모방체는 단백질, 핵산, 또는 소 분자를 포함할 수 있다. 본 명세서의 항체 모방체가 특이적으로 결합하는 표적 서열은 항원일 수 있다. 항체 모방체는 우수한 용해도, 조직 침투, 열 및 효소에 대한 안정성(가령, 효소 분해에 대한 저항성) 및 낮은 생산 비용을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는, 항체에 비해 우수한 특성을 제공할 수 있다. 예시적인 항체 모방체에는 아피바디(affibody), 아필린(afflilin), 아피머(affimer), 아피틴(affitin), 알파바디(alphabody), 안티칼린(anticalin) 및 아비머 (결합력 멀티머라고도 알려짐), DARPin (기획된 안키린 반복 단백질), 피노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드 및 모노바디가 내포되지만, 이에 국한되지는 않는다. 아피바디, 아플린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린 및 아비머(결합력 멀티머라고도 알려짐), DARPin(설계된 안키린 반복 단백질), 피노머, 쿠니츠 도메인 펩티드 및 모노바디는 PCT 공개 번호 WO 2020/132396에 기재되어 있다.
VHH
본 명세서의 상기 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 CAR의 항원 인지 영역은 특이적 표적 단백질/항원을 인지하고, 이에 결합하는 적어도 하나의 단일 도메인 항체들 (SdAb)을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 단일 도메인 항체는 VHH이다. VHH는 낙타에서 발견된 중쇄 항체다. 항원에 특이적으로 결합하는 VHH는 특이적 항원을 향한 세포 (가령, 세포독성 면역 세포)의 특이성을 지시하는 데 사용될 수 있다. 상기 항원 인지 영역은 적어도 두 개의 VHHs를 포함할 수 있다. 상기 항원 인지 영역은 적어도 세 개의 VHHs를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 명세서의 CAR은 두 개의 별개 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 두 개의 VHHs를 포함하는 이중-특이적 CAR이다. VHH를 포함하는 CAR을 본원에서 VCAR이라고 지칭한다.
본 명세서의 적어도 하나의 VHH 단백질 또는 VCAR은 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 선택적으로 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포 또는 불멸화 세포의 클론 집단에 의해 생산될 수 있다. 가령, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001) 참고.
VHH 단백질의 아미노산은 당업계에 공지된 바와 같이, 면역 원성을 감소시키거나, 또는 결합, 친화력, 결합-속도 (on-rate), 해리-속도 (off-rate), 항원항체결합력, 특이성, 반감기, 안정성, 용해도 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소, 강화 또는 변형하는데 사용될 수 있다.
VH
본 명세서의 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있고; 그리고 일부 측면들에서, 상기 CAR의 항원 인지 영역은 특이적 표적 단백질/항원을 인지하고, 이에 결합하는 적어도 하나의 단일 도메인 항체들 (SdAb)을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 단일 도메인 항체는 VH이다. VH는 공통적인 IgG로부터 유래된 단일 도메인 결합자이다. 항원에 특이적으로 결합하는 VH는 특이적 항원을 향한 세포 (가령, 세포독성 면역 세포)의 특이성을 지시하는 데 사용될 수 있다. 상기 항원 인지 영역은 적어도 두 개의 VHs를 포함할 수 있다. 상기 항원 인지 영역은 적어도 세 개의 VHs를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 명세서의 CAR은 두 개의 별개 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 두 개의 VHs를 포함하는 이중-특이적 CAR이다. VH 단리 및 VH 조작 방법들은 PCT 공개 번호 WO 2020/132396에 기술되어 있다.
본 명세서의 CAR은 10-9M이거나 또는 이보다 적은, 10-10M이거나 또는 이보다 적은, 10-11M이거나 또는 이보다 적은, 10-12M이거나 또는 이보다 적은, 10-13M이거나 또는 이보다 적은, 10-14M이거나 또는 이보다 적은, 그리고 10-15M이거나 또는 이보다 적은 KD로부터 선택된 적어도 하나의 친화력으로 인간 항원에 결합할 수 있다. 상기 KD는 표면 플라즈몬 공명을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.
한 측면에서, 상기 공개된 CAR의 항원 인지 영역은 적어도 하나의 항-BCMA 센티린을 포함한다. 상기 항-BCMA 센티린은 서열 식별 번호: 71에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 상기 항-BCMA 센티린은 서열 식별 번호: 72에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
상기 항-BCMA 센티린을 포함하는 CAR은 본원에서 BCMA CARTyrin로 지칭된다. 선호되는 측면에서, 상기 BCMA CARTyrin은 서열 식별 번호: 73에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 상기 BCMA CARTyrin은 서열 식별 번호: 74에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
BCMA CARTyrin을 포함하는 본 명세서의 조성물 (가령, 트랜스포존)은 서열 식별 번호: 75에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. BCMA CARTyrin을 포함하는 본 명세서의 조성물 (가령, 트랜스포존)은 서열 식별 번호: 76에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다.
한 측면에서, 상기 공개된 CAR의 항원 인지 영역은 적어도 하나의 항-PSMA 센티린을 포함한다. 상기 항-PSMA 센티린은 서열 식별 번호: 77에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 상기 항-PSMA 센티린은 서열 식별 번호: 78에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
상기 항-PSMA 센티린을 포함하는 CAR은 본원에서 PSMA CARTyrin로 지칭된다. 선호되는 측면에서, 상기 PSMA CARTyrin은 서열 식별 번호: 79에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 상기 PSMA CARTyrin은 서열 식별 번호: 80에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
PSMA CARTyrin을 포함하는 본 명세서의 조성물 (가령, 트랜스포존)은 서열 식별 번호: 81에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. PSMA CARTyrin을 포함하는 본 명세서의 조성물 (가령, 트랜스포존)은 서열 식별 번호: 82에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다.
한 측면에서, 상기 공개된 CAR의 항원 인지 영역은 적어도 하나의 항-BCMA VH를 포함한다. 상기 항-BCMA VH는 서열 식별 번호: 83에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 상기 항-BCMA VH는 서열 식별 번호: 84에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
상기 항-BCMA VH를 포함하는 CAR은 본원에서 BCMA VCAR로 지칭된다. 선호되는 측면에서, 상기 BCMA VCAR은 서열 식별 번호: 85에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 상기 BCMA VCAR은 서열 식별 번호: 86에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
BCMA VCAR을 포함하는 본 명세서의 조성물 (가령, 트랜스포존)은 서열 식별 번호: 87에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. BCMA VCAR을 포함하는 본 명세서의 조성물 (가령, 트랜스포존)은 서열 식별 번호: 88에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다.
한 측면에서, 상기 공개된 CAR의 항원 인지 영역은 적어도 하나의 항-MUC1-C ScFv를 포함한다. 상기 항-MUC1-C ScFv는 서열 식별 번호: 89에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 상기 항-MUC1-C ScFv는 서열 식별 번호: 90에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
상기 항-MUC1-C ScFv를 포함하는 CAR은 본원에서 MUC1-C CAR로 지칭된다. 선호되는 측면에서, 상기 MUC1-C CAR은 서열 식별 번호: 91에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 상기 MUC1-C CAR은 서열 식별 번호: 92에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
MUC1-C CAR을 포함하는 본 명세서의 조성물 (가령, 트랜스포존)은 서열 식별 번호: 93에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. MUC1-C CAR을 포함하는 본 명세서의 조성물 (가령, 트랜스포존)은 서열 식별 번호: 94에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다.
상기 엑토-도메인은 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 신호 펩티드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 선호되는 측면에서, 상기 신호 펩티드는 인간 CD8 알파 (CD8α) 신호 펩티드 (SP) 또는 이의 일부분을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 상기 인간 CD8α SP는 서열 식별 번호: 95에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, 상기 인간 CD8α SP는 서열 식별 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
상기 인간 CD8α SP는 서열 식별 번호: 96에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다. 바람직하게는, 상기 인간 CD8α SP는 서열 식별 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
상기 힌지 도메인 또는 힌지 영역은 인간 CD8α, IgG4, CD4 서열, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 선호되는 측면에서, 상기 힌지는 인간 CD8 알파 (CD8α) 힌지 또는 이의 일부분을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 상기 인간 CD8a 힌지는 서열 식별 번호: 97에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, 상기 인간 CD8α 힌지 도메인은 서열 식별 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
상기 인간 CD8α 힌지는 서열 식별 번호: 98에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다. 바람직하게는, 상기 인간 CD8α 힌지 도메인은 서열 식별 번호: 98의 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
상기 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이 서열로 기본적으로 구성되거나, 이 서열로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 상기 막횡단 도메인은 인간 CD8 알파 (CD8α) 막횡단 도메인, 또는 이의 일부분을 포함하거나, 이로 기본적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 상기 CD8a 막횡단 도메인은 서열 식별 번호: 99에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, 상기 인간 CD8α 막횡단 도메인은 서열 식별 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
상기 CD8α 막횡단 도메인은 서열 식별 번호: 100에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다. 바람직하게는, 상기 CD8α 막횡단 도메인은 서열 식별 번호: 100의 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
상기 적어도 하나의 공동-자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD3 제타 (CD3ζ), CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 도메인, 또는 이의 임의의 조합을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 공동-자극 도메인은 CD3ζ, 4-1BB 공동-자극 도메인, 또는 이의 조합을 포함한다.
상기 4-1BB 세포내 도메인은 서열 식별 번호: 101에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, 상기 4-1BB 세포내 도메인은 서열 식별 번호: 101의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
상기 4-1BB 세포내 도메인은 서열 식별 번호: 102에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다. 바람직하게는, 상기 4-1BB 세포내 도메인은 서열 식별 번호: 102의 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
상기 CD3ζ 세포내 도메인은 서열 식별 번호: 103에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, 상기 CD3ζ 세포내 도메인은 서열 식별 번호: 103의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
상기 CD3ζ 세포내 도메인은 서열 식별 번호: 104에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다. 바람직하게는, 상기 CD3ζ 세포내 도메인은 서열 식별 번호: 104의 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
트랜스포존 및 벡터 조성물들
전위 시스템
본 명세서는 a) 제1 역전된 말단 반복부 (ITR) 및 b) 제2 ITR을 포함하는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이때 상기 제1 ITR 및/또는 상기 제2 ITR은 트랜스포존의 야생형 ITR과 비교하여 적어도 하나의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 트랜스포존은 나노트랜스포존이다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 상기 좌측 단부 ITR이다. 일부 측면들에서, 상기 트랜스포존의 야생형 ITR과 비교하여 상기 하나의 핵산 치환은 전위 활성의 증가를 제공한다. 일부 측면들에서, 상기 전위 활성의 증가는 세포에서 트랜스포존의 절제의 증가다. 일부 측면들에서, 상기 전위 활성의 증가는 세포에서 트랜스포존의 통합의 증가다. 일부 측면들에서, 상기 전위 활성의 증가는 세포에서 트랜스포존의 절제의 증가 및 통합의 증가다.
본 명세서의 상기 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 단백질 스캐폴드 (가령, 적어도 하나의 scFv, 단일 도메인 항체 또는 센티린을 포함하는 CAR)를 포함한다. 상기 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 단백질 스캐폴드 (가령, 적어도 하나의 scFv, 단일 도메인 항체 또는 센티린을 포함하는 CAR)를 인코드하는 서열과 이의 측면에 두 개의 시스-조절성 절연체 요소들을 포함하는 플라스미드 DNA 트랜스포존일 수 있다. 상기 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 트란스포사제를 인코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함할 수 있다. 상기 트란스포사제를 인코드하는 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다. 바람직하게는, 상기 트란스포사제를 인코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 명세서의 상기 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 piggyBac™ (PB) 트랜스포존일 수 있다. 상기 트랜스포존이 PB 트랜스포존인 일부 측면들에서, 상기 트란스포사제는 piggyBac™ (PB) 트란스포사제 piggyBac-유사 (PBL) 트란스포사제 또는 Super piggyBac™ (SPB) 트란스포사제이다. 바람직하게는, 상기 SPB 트란스포사제를 인코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
PB 트랜스포존 및 PB, PBL 및 SPB 트란스포사제의 비-제한적 예시들은 U.S. 특허 번호 6,218,182; U.S. 특허 번호 6,962,810; U.S. 특허 번호 8,399,643 및 PCT 공개 번호 WO 2010/099296에서 상세하게 기술된다.
상기 PB, PBL 및 SPB 트란스포사제는 상기 트랜스포돈 상의 단부들에서 트랜스포존-특이적 역전된 말단 반복부 서열들 (ITRs)을 인지하고, 염색체 부위 내 서열 5'-TTAT-3' (TTAT 표적 서열)에서 염색체 부위 내 서열 5'-TTAA-3' (TTAA 표적 서열)에서 ITRs 사이에 내용물을 삽입시킨다. 상기 PB 또는 PBL 트랜스포존의 표적 서열은 5'-CTAA-3', 5'-TTAG-3', 5'-ATAA-3', 5'-TCAA-3', 5'AGTT-3', 5'-ATTA-3', 5'-GTTA-3', 5'-TTGA-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTAC-3', 5'-ACTA-3', 5'-AGGG-3', 5'-CTAG-3', 5'-TGAA-3', 5'-AGGT-3', 5'-ATCA-3', 5'-CTCC-3', 5'-TAAA-3', 5'-TCTC-3', 5'TGAA-3', 5'-AAAT-3', 5'-AATC-3', 5'-ACAA-3', 5'-ACAT-3', 5'-ACTC-3', 5'-AGTG-3', 5'-ATAG-3', 5'-CAAA-3', 5'-CACA-3', 5'-CATA-3', 5'-CCAG-3', 5'-CCCA-3', 5'-CGTA-3', 5'-GTCC-3', 5'-TAAG-3', 5'-TCTA-3', 5'-TGAG-3', 5'-TGTT-3', 5'-TTCA-3'5'-TTCT-3' 및 5'-TTTT-3'을 포함하거나, 이로 구성될 수 있다. 상기 PB 또는 PBL 트랜스포존 시스템에는 ITRs 사이에 내포될 수 있는 관심대상의 유전자에 대한 페이로드 제한이 없다.
하나 또는 그 이상의 PB, PBL 및 SPB 트란스포사제에 대한 예시적인 아미노산 서열은 U.S. 특허 번호 6,218,185; U.S. 특허 번호 6,962,810 및 U.S. 특허 번호 8,399,643에 기재되어 있다. 한 측면에서, 상기 PB 트란스포사제는 서열 식별 번호: 105에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
한 측면에서, 상기 SPB 트란스포사제 ("야생형 SPB")는 서열 식별 번호: 107에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다.
MAPKKKRKVGGGGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEVSDHVSEDDVQSDTEEAFIDEVHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWSTSKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKWTNAEISLKRRESMTSATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLFDRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIWDLFIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRVYIPNKPSKYGIKILMMCDSGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFTSIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGPLTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGVDTLDQMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQSRKKFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPKEVPGTSDDSTEEPVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF (서열 식별 번호: 107)
한 측면에서, 상기 SPB 트란스포사제 ("야생형 SPB")는 서열 식별 번호: 108에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
ATGGCTCCCAAGAAGAAGCGGAAAGTTGGCGGCGGAGGCAGCAGCCTGGATGATGAGCATATTCTGAGCGCCCTGCTGCAGAGCGACGATGAACTCGTGGGCGAAGATAGCGACAGCGAGGTGTCCGATCACGTGTCCGAGGATGACGTGCAGTCCGATACCGAGGAAGCCTTCATCGACGAGGTGCACGAAGTGCAGCCTACAAGCAGCGGCAGCGAGATCCTGGACGAGCAGAATGTGATCGAGCAGCCAGGATCTAGCCTGGCCAGCAACAGAATCCTGACACTGCCCCAGAGAACCATCCGGGGCAAGAACAAGCACTGCTGGTCCACCAGCAAGAGCACCAGACGGTCTAGAGTGTCTGCCCTGAACATCGTGCGAAGCCAGAGGGGCCCTACCAGAATGTGCCGGAACATCTACGACCCTCTGCTGTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCTCCGAGATCGTGAAGTGGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGCGGAGAGAATCCATGACCAGCGCCACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCATCCTGGTCATGACAGCCGTGCGGAAGGACAACCACATGAGCACCGACGACCTGTTCGACCGCAGCCTGTCTATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCCGGGACAGATTCGACTTCCTGATCCGGTGCCTGCGGATGGACGACAAGTCCATCAGACCCACACTGCGCGAGAACGACGTGTTCACACCTGTGCGGAAGATCTGGGACCTGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCTCACCTGACCATCGACGAACAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAGTGTACATCCCCAACAAGCCCTCTAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCGACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTCGGCAGAGGCACCCAAACAAATGGCGTGCCACTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAACTGAGCAAGCCTGTGCACGGCAGCTGCAGAAACATCACCTGTGACAACTGGTTTACCAGCATTCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAAGAACCCTACAAGCTGACAATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGAGGGAAATTCCCGAGGTGCTGAAGAACTCTCGGAGCAGACCTGTGGGCACCAGCATGTTCTGCTTCGACGGACCTCTGACACTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCTGCCAAGATGGTGTACCTGCTGAGCAGCTGTGACGAGGACGCCAGCATCAATGAGAGCACCGGCAAGCCCCAGATGGTCATGTACTACAACCAGACCAAAGGCGGCGTGGACACCCTGGATCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCCATGGCTCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCTTCATCATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGAAGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCAGCAGCTTCATGAGAAAGCGGCTGGAAGCCCCTACACTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAGCAACATCCTGCCTAAAGAGGTGCCCGGCACCAGCGACGATAGCACAGAGGAACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATCCGGCGGAAGGCCAACGCCAGCTGCAAAAAGTGCAAGAAAGTGATCTGCCGCGAGCACAACATCGATATGTGCCAGAGCTGCTTCTGA (서열 식별 번호: 108)
상기 PB 또는 PBL 트란스포사제는 서열 식별 번호: 105의 서열에서 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 두 개 또는 그 이상의 위치, 세 개 또는 그 이상의 위치 또는 각각 위치에서 아미노산 치환을 보유하는 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 트란스포사제는 서열 식별 번호: 105의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 이 아미노산 서열로 구성된 SPB 트란스포사제일 수 있으며, 이때 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신 (I)을 발린(V)으로의 치환, 위치 165에서 아미노산 치환은 글리신(G)을 세린 (S)으로의 치환, 위치 282에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)을 발린 (V)으로의 치환, 그리고 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)을 리신(K)으로의 치환일 수 있다. 선호되는 측면에서, 상기 SPB 트란스포사제는 서열 식별 번호: 106에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
상기 트란스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기-기술된 돌연변이를 포함하는 특정 측면들에서, 상기 PB, PBL 및 SPB 트란스포사제는 서열 식별 번호: 105 또는 서열 식별 번호: 106의 서열에서 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 또는 그 이상의 위치에서 아미노산 치환을 더 포함할 수 있고, 이들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에서 상세하게 기술되어 있다.
한 측면에서, 상기 SPB 트란스포사제 ("M226F SPB" 또는 "돌연변이 M226F SPB")는 서열 식별 번호: 109에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 상기 M226F 돌연변이는 굵게, 밑줄친 것으로 표현된다.
MAPKKKRKVGGGGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEVSDHVSEDDVQSDTEEAFIDEVHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWSTSKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKWTNAEISLKRRESMTSATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLFDRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLR F DDKSIRPTLRENDVFTPVRKIWDLFIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRVYIPNKPSKYGIKILMMCDSGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFTSIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGPLTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGVDTLDQMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQSRKKFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPKEVPGTSDDSTEEPVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF
(서열 식별 번호: 109)
한 측면에서, 상기 SPB 트란스포사제 ("M226F SPB" 또는 "돌연변이 M226F SPB")는 서열 식별 번호: 110에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 필수적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다. 상기 M226F 돌연변이를 포함하는 핵산은 굵게, 밑줄친 것으로 표현된다.
ATGGCTCCCAAGAAGAAGCGGAAAGTTGGCGGCGGAGGCAGCAGCCTGGATGATGAGCATATTCTGAGCGCCCTGCTGCAGAGCGACGATGAACTCGTGGGCGAAGATAGCGACAGCGAGGTGTCCGATCACGTGTCCGAGGATGACGTGCAGTCCGATACCGAGGAAGCCTTCATCGACGAGGTGCACGAAGTGCAGCCTACAAGCAGCGGCAGCGAGATCCTGGACGAGCAGAATGTGATCGAGCAGCCAGGATCTAGCCTGGCCAGCAACAGAATCCTGACACTGCCCCAGAGAACCATCCGGGGCAAGAACAAGCACTGCTGGTCCACCAGCAAGAGCACCAGACGGTCTAGAGTGTCTGCCCTGAACATCGTGCGAAGCCAGAGGGGCCCTACCAGAATGTGCCGGAACATCTACGACCCTCTGCTGTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCTCCGAGATCGTGAAGTGGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGCGGAGAGAATCCATGACCAGCGCCACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCATCCTGGTCATGACAGCCGTGCGGAAGGACAACCACATGAGCACCGACGACCTGTTCGACCGCAGCCTGTCTATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCCGGGACAGATTCGACTTCCTGATCCGGTGCCTGCGG TTC GACGACAAGTCCATCAGACCCACACTGCGCGAGAACGACGTGTTCACACCTGTGCGGAAGATCTGGGACCTGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCTCACCTGACCATCGACGAACAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAGTGTACATCCCCAACAAGCCCTCTAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCGACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTCGGCAGAGGCACCCAAACAAATGGCGTGCCACTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAACTGAGCAAGCCTGTGCACGGCAGCTGCAGAAACATCACCTGTGACAACTGGTTTACCAGCATTCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAAGAACCCTACAAGCTGACAATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGAGGGAAATTCCCGAGGTGCTGAAGAACTCTCGGAGCAGACCTGTGGGCACCAGCATGTTCTGCTTCGACGGACCTCTGACACTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCTGCCAAGATGGTGTACCTGCTGAGCAGCTGTGACGAGGACGCCAGCATCAATGAGAGCACCGGCAAGCCCCAGATGGTCATGTACTACAACCAGACCAAAGGCGGCGTGGACACCCTGGATCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCCATGGCTCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCTTCATCATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGAAGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCAGCAGCTTCATGAGAAAGCGGCTGGAAGCCCCTACACTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAGCAACATCCTGCCTAAAGAGGTGCCCGGCACCAGCGACGATAGCACAGAGGAACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATCCGGCGGAAGGCCAACGCCAGCTGCAAAAAGTGCAAGAAAGTGATCTGCCGCGAGCACAACATCGATATGTGCCAGAGCTGCTTCTGA (서열 식별 번호: 110)
상기 PB, PBL 또는 SPB 트란스포사제들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에서 상세하게 기술된 바와 같이, 곤충, 척추동물, 갑각류 또는 미색류(urochordate)에서 단리되거나 유래될 수 있다. 선호적은 측면에서, 상기 PB, PBL 또는 SPB 트란스포사제는 곤충 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) (GenBank 수탁 번호 AAA87375) 또는 봄빅스 모리(Bombyx mori)(GenBank 수탁 번호 BAD11135)로부터 단리되거나, 유래된다.
과잉활동성 PB 또는 PBL 트랜스포사제는 파생된 자연 발생 변이체보다 더 활성인 트랜스포사제이다. 선호되는 측면에서, 과잉활동성 PB 또는 PBL 트란스포사제는 봄빅스 모리(Bombyx mori) 또는 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis)로부터 단리되거나, 파생된다. 과잉활동성 PB 또는 PBL 트란스포사제의 예시들은 U.S. 특허 번호 6,218,185; U.S. 특허 번호 6,962,810, U.S. 특허 번호 8,399,643 및 WO 2019/173636에서 기술된다. 과잉활동성 아미노산 치환의 목록은 U.S. 특허 번호 10,041,077에 기술되어 있다.
일부 측면들에서, 상기 PB 또는 PBL 트란스포사제는 통합 결핍(integration deficient)이다. 통합 결핍 PB 또는 PBL 트란스포사제는 이의 대응하는 트랜스포존을 절제할 수 있지만, 대응하는 야생형 트랜스포사제보다 더 낮은 빈도로 절제된 트랜스포존을 통합하는 트랜스포사제다. 통합 결핍 PB 또는 PBL 트란스포사제들의 예시들은 U.S. 특허 번호 6,218,185; U.S. 특허 번호 6,962,810, U.S. 특허 번호 8,399,643 및 WO 2019/173636에 기술된다. 통합 결핍 아미노산 치환의 목록은 US 특허 번호 10,041,077에 기술되어 있다.
일부 측면들에서, 상기 PB 또는 PBL 트란스포사제는 핵 국소화 신호에 융합된다. 핵 국소화 신호에 융합된 PB 또는 PBL 트란스포사제는 U.S. 특허 번호 6,218,185; U.S. 특허 번호 6,962,810, U.S. 특허 번호 8,399,643 및 WO 2019/173636에 기술된다.
본 명세서의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존는 Sleeping Beauty 트랜스포존일 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 트랜스포존은 Sleeping Beauty 트랜스포존일 때, 상기 트란스포사제는 Sleeping Beauty 트란스포사제 (예를 들면, U.S. 특허 번호 9,228,180에 기재되어 있는 것과 같은) 또는 과잉활동성 Sleeping Beauty (SB100X) 트란스포사제이다. 선호되는 측면에서, 상기 Sleeping Beauty 트란스포사제는 서열 식별 번호: 111에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 선호되는 측면에서, 과잉활동성 Sleeping Beauty (SB100X) 트란스포사제는 서열 식별 번호: 112에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
본 명세서의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 서열 식별 번호: 144-156 및 158에서 제시된 임의의 핵산들에 대해 어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 piggyBac 트랜스포존일 수 있다. 본 명세서의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 서열 식별 번호: 114에서 제시된 임의의 핵산들에 대해 핵산 서열 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 것을 포함하거나, 이로 구성된 piggyBac 트랜스포존일 수 있다. 본 명세서의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 서열 식별 번호: 115에서 제시된 임의의 핵산들에 대해 핵산 서열 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 것을 포함하거나, 이로 구성된 piggyBac 트랜스포존일 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존일 때, 상기 트란스포사제는 piggyBac 트란스포사제 (예를 들면, U.S. 특허 번호 6,218,182; U.S. 특허 번호 6,962,810; U.S. 특허 번호 8,399,643 및 PCT 공개 번호 WO 2010/099296에서 기술된 것과 같은), piggyBac-유사 트란스포사제, Super piggyBac 트란스포사제 또는 돌연변이 Super piggyBac 트란스포사제이다. 한 측면에서, 상기 piggyBac 트란스포사제는 서열 식별 번호: 105에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 한 측면에서, Super piggyBac 트란스포사제는 서열 식별 번호: 107에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 한 측면에서, Super piggyBac 트란스포사제는 서열 식별 번호: 109에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
본 명세서의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 Helraiser 트랜스포존일 수 있다. 예시적인 Helraiser 트랜스포존에는 Helibat1이 내포되며, 이것은 서열 식별 번호: 116에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 일부 측면들에서, 상기 트랜스포존이 Helraiser 트랜스포존일 때, 상기 트란스포사제는 Helitron 트란스포사제 (예를 들면, WO 2019/173636에서 기술된 것과 같은)이다. 선호되는 측면에서, Helitron 트란스포사제는 서열 식별 번호: 117에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
본 명세서의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 Tol2 트랜스포존일 수 있다. 역전된 반복, 준-말단 서열들 및 Tol2 트란스포사제가 내포된 예시적인 Tol2 트랜스포존은 서열 식별 번호: 118에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 구성된다. 일부 측면들에서, 상기 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 경우, 상기 트란스포사제는 Tol2 트란스포사제 (예를 들면, WO 2019/173636에 기술된 것과 같은)이다. 선호되는 측면에서, Tol2 트란스포사제는 서열 식별 번호: 119에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
본 명세서의 트랜스포존 또는 나노트랜스포존은 TcBuster 트랜스포존일 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 트랜스포존이 TcBuster 트랜스포존인 경우, 상기 트란스포사제는 TcBuster 트란스포사제 또는 과잉활동성 TcBuster 트란스포사제 (예를 들면, WO 2019/173636에 기재된 바와 같은)이다. 상기 TcBuster 트란스포사제는 자연 발생적 아미노산 서열 또는 비-자연 발생적 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 선호되는 측면에서, TcBuster 트란스포사제는 서열 식별 번호: 120에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. TcBuster 트란스포사제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자연 발생적 핵산 서열 또는 비-자연 발생적 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 구성될 수 있다. 선호되는 측면에서, TcBuster 트란스포사제는 서열 식별 번호: 121에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
일부 측면들에서, 돌연변이 TcBuster 트란스포사제는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에서 상세하게 기재된 바와 같이, 야생형 TcBuster 트란스포사제와 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 서열 변이를 포함한다.
본원에 기재된 상기 세포 전달 조성물들 (가령, 트랜스포존)은 치료요법적 단백질 또는 치료요법적 작용제를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 치료요법적 단백질의 예시들에는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에 기재된 것들이 내포되어 있다.
벡터 시스템
일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 (가령, 트랜스포존)는 또다른 트랜스포존 또는 나노트랜스포존와 조합되어, 또는 벡터와 함께 이용될 수 있다. 본 명세서의 벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리되거나 이로부터 파생된 서열을 포함할 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 아데노-연합된 바이러스 (AAV)로부터 단리된 또는 파생된 서열을 포함할 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 재조합 AAV (rAAV)를 포함할 수 있다. 예시적인 아데노-연합된 바이러스들 및 재조합 아데노-연합된 바이러스들은 본 명세서의 scFv 또는 CAR을 인코드하는 서열 옆에 cis로 위치한 두 개 또는 그 이상의 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열들을 포함한다 예시적인 아데노-연합된 바이러스들 및 재조합 아데노-연합된 바이러스들에는 모든 혈청형 (가령, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9)이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 아데노-연합된 바이러스들 및 재조합 아데노-연합된 바이러스들에는 하나의 혈청형의 게놈과 또다른 혈청형의 캡시드를 함유하는 자가-상보적 AAV (scAAV) 및 AAV 하이브리드 (가령, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 아데노-연합된 바이러스들 및 재조합 아데노-연합된 바이러스들에는 rAAV-LK03이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
본 명세서의 벡터는 나노입자일 수 있다. 나노입자 벡터들의 비-제한적 예시에는 핵산 (가령, RNA, DNA, 합성 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 이의 임의의 조합), 아미노산 (L-아미노산, D-아미노산, 합성 아미노산, 변형된 아미노산, 또는 이의 임의의 조합), 중합체 (가령, 폴리머좀), 미셀, 지질 (가령, 리포좀), 유기 분자들 (가령, 탄소원자, 쉬트, 섬유, 튜브), 무기 분자들 (가령, 인산칼슘 또는 금) 또는 이의 임의의 조합이 내포된다. 나노입자 벡터는 세포 막을 통해 수동적으로 또는 능동적으로 운반될 수 있다.
본원에 기재된 상기 세포 전달 조성물들 (가령, 트랜스포존, 벡터)은 치료요법적 단백질 또는 치료요법적 작용제를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 치료요법적 단백질의 예시들에는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에 기재된 것들이 내포되어 있다.
본 명세서의 세포들 및 변형된 세포들
본 명세서의 세포들 및 변형된 세포들은 포유류 세포들일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포들 및 변형된 세포들은 인간 세포들이다. 본 명세서의 세포들 및 변형된 세포들은 면역 세포들일 수 있다. 본 명세서의 상기 면역 세포들은 림프 전구세포 세포들, 천연 킬러 (NK) 세포들, T 림프구 (T-세포), 줄기 기억 T 세포들 (TSCM 세포들), 중앙 기억 T 세포들 (TCM), 줄기 세포-유사 T 세포들, B 림프구 (B-세포들), 항원 제시 세포들 (APCs), 사이토킨 유도된 킬러 (CIK) 세포들, 골수 전구세포 세포들, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식세포, 혈소판, 적혈구, 적혈구 세포들 (RBCs), 거핵세포 또는 파골세포를 포함할 수 있다.
상기 면역 전구체 세포들은 하나 또는 그 이상의 유형의 면역 세포들로 분화될 수 있는 임의의 세포들을 포함할 수 있다. 상기 면역 전구체 세포들은 자가-재생하여, 면역 세포로 발달할 수 있는 다능성 줄기 세포를 포함할 수 있다. 상기 면역 전구체 세포들은 조혈 줄기 세포(HSCs) 또는 이의 자손을 포함할 수 있다. 상기 면역 전구체 세포들은 면역 세포로 발달할 수 있는 전구체 세포들을 포함할 수 있다. 상기 면역 전구체 세포들은 조혈성 전구 세포들 (HPCs)을 포함할 수 있다.
조혈성 줄기 세포들 (HSCs)은 다능성, 자가-재생 세포들이다. 림프계 및 골수계 계통의 모든 분화된 혈액 세포는 HSCs에서 발생된다. HSCs는 성인 골수, 말초 혈액, 동원된 말초 혈액, 복막 투석액 및 제대혈에서 발견될 수 있다.
HSCs는 일차 줄기 세포 또는 배양된 줄기 세포로부터 단리되거나 유래될 수 있니다. HSCs는 배아 줄기 세포, 다능성(multipotent) 줄기 세포, 만능(pluripotent) 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 단리되거나 유래될 수 있다.
면역 전구체 세포들은 HSC 또는 HSC 후손 세포를 포함할 수 있다. HSC 후손 세포들에는 다능성 줄기 세포들, 림프 전구세포 세포들, 천연 킬러 (NK) 세포들, T 림프구 세포들 (T-세포들), B 림프구 세포들 (B-세포들), 골수 전구세포 세포들, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구 및 대식세포가 내포된다.
개시된 방법에 의해 생산된 HSCs는 성체 줄기 세포로부터 단리 또는 유래되고 단일 계통에 속하면서, 배아 줄기 세포의 특징을 공유하는 "원시(primitive)" 줄기 세포의 특징을 보유할 수 있다. 예를 들면, 개시된 방법에 의해 생성된 "원시" HSCs는 분할 후에도 이들의 "줄기성(stemness)"을 유지하고, 분별화되지 않는다. 결과적으로, 입양 세포 치료법으로서 개시된 방법에 의해 생산된 "원시" HSCs는 그 수를 보충하고, 뿐만 아니라 생체내에서 확장된다. 개시된 방법에 의해 생산된 "원시" HSCs는 단일 용량으로 투여될 때 치료적으로 효과적일 수 있다.
원시 HSCs는 CD34+일 수 있다. 원시 HSCs는 CD34+ 및 CD38-일 수 있다. 원시 HSCs는 CD34+, CD38- 및 CD90+일 수 있다. 원시 HSCs는 CD34+, CD38-, CD90+ 및 CD45RA-일 수 있다. 원시 HSCs는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, 및 CD49f+일 수 있다. 원시 HSCs는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, 및 CD49f+일 수 있다.
원시 HSCs, HSCs, 및/또는 HSC 후손 세포들은 외생성 서열 (가령, 키메라 항원 수용체 또는 치료요법적 단백질)을 발현시키도록, 본원에 개시된 방법들에 따라 변형될 수 있다. 변형된 원시 HSCs, 변형된 HSCs, 및/또는 변형된 HSC 후손 세포들은 변형된 T 세포, 변형된 천연 킬러 세포 및/또는 변형된 B-세포를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않은 변형된 면역 세포를 생산하기 위해 앞으로 분화될 수 있다.
상기 변형된 면역 세포들 또는 면역 전구체 세포들은 NK 세포들일 수 있다. 상기 NK 세포들은 림프 전구세포 세포들로부터 분화되는 세포독성 림프구일 수 있다. 변형된 NK 세포들은 변형된 조혈성 줄기 세포 및 전구 세포들 (HSPCs) 또는 변형된 HSCs로부터 유래될 수 있다. 일부 측면들에서, 비-활성화된 NK 세포들은 CD3-고갈된 백혈구분리술 (CD14/CD19/CD56+ 세포들을 함유하는)로부터 유래될 수 있다.
상기 변형된 면역 세포들 또는 면역 전구체 세포들은 B 세포들일 수 있다. B 세포들은 상기 세포 표면 상에 B 세포 수용체들을 발현시키는 림프구 유형이다. B 세포 수용체들은 특이적 항원들에 결합한다. 변형된 B 세포들은 변형된 조혈성 줄기 세포들 및 전구 세포들 (HSPCs) 또는 변형된 HSCs로부터 유래될 수 있다.
본 명세서의 변형된 T 세포들은 변형된 조혈성 줄기 세포들 및 전구 세포들 (HSPCs) 또는 변형된 HSCs로부터 유래될 수 있다. 전통적인 생물학적 제제 및 화학요법제와 달리, 공개된 변형된 T-세포들은 항원 인지 시, 신속하게 재생산할 수 있는 능력을 갖고 있고, 이로 인하여 반복 치료의 필요성을 잠재적으로 제거한다. 이를 달성하기 위해, 일부 측면들에서 변형된 T 세포들은 초기 반응을 유도하고, 뿐만 아니라 잠재적인 재발을 방지하기 위해, 생존가능한 기억 T 세포의 안정적인 집단으로 이들 환자들에게 지속된다. 대안으로, 일부 측면들에서, 원하지 않는 경우, 상기 변형된 T 세포는 해당 환자에게 지속되지 않는다.
항원-독립적(토닉) 신호 전달을 통해 T 세포 고갈을 일으키지 않는 항원 수용체 분자 개발, 뿐만 아니라 초기 기억 T 세포, 특히, 줄기 세포 기억 (TSCM) 또는 줄기 세포-유사 T 세포를 함유한 변형된-T 세포 생성물의 개발에 많은 노력이 집중되어 왔다. 본 명세서의 줄기 세포-유사 변형된-T 세포들은 중앙 기억 (TCM) T 세포들 또는 TCM 유사 세포들, 작동체 기억 세포들 (TEM) 및 작동체 T 세포들 (TE)을 유도하기 위한 자가-재생 및 다능성 능력을 유도하는 최대 능력을 나타내고, 이로 인하여 종양 근절이 더 우수하고, 장기적으로 변형된-T 세포 생착을 만든다. 선형 분화 경로가 이러한 세포를 생성하는 역할을 할 수 있다: 나이브() T 세포들 (TN) > TSCM > TCM > TEM > TE > TTE, 이로써 TN은 TSCM를 직접적으로 일으키고, 이어서 TCM, 등등을 직접적으로 일으키는 부모계 전구체이다. 본 명세서의 T 세포들의 조성물들은 하나 또는 그 이상의 각 부모계 T 세포 하위집단을 포함할 수 있는데, TSCM 세포들이 가장 풍부하다 (가령, TSCM > TCM > TEM > TE > TTE).
상기 면역 세포 전구체는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T-세포, 나이브 T 세포들 (TN), TSCM, TCM, TEM, TE, 또는 TTE로 분화되거나, 분화될 수 있다. 상기 면역 세포 전구체는 본 명세서의 원시 HSC, HSC, 또는 HSC 후손 세포일 수 있다. 상기 면역 세포는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T-세포, 나이브 T 세포들 (TN), TSCM, TCM, TEM, TE, 또는 TTE일 수 있다.
본 명세서의 방법들은 변형된 T 세포들 집단을 변형시키거나 및/또는 생산할 수 있고, 이때 상기 집단에서 다수 변형된 T 세포들의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 백분율의 세포들은 초기 기억 T 세포의 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시킨다. 변형된 초기 기억 T 세포들의 상기 집단은 다수의 변형된 줄기 세포-유사 T 세포들을 포함한다. 변형된 초기 기억 T 세포들의 상기 집단은 다수의 변형된 TSCM 세포들을 포함한다. 변형된 초기 기억 T 세포들의 상기 집단은 다수의 변형된 TCM 세포들을 포함한다.
본 명세서의 방법들은 변형된 T 세포들 집단을 변형시키거나 및/또는 생산할 수 있고, 이때 상기 집단에서 다수 변형된 T 세포들의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 백분율의 세포들은 줄기 세포-유사 T 세포의 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시킨다. 변형된 줄기 세포-유사 T 세포들의 상기 집단은 다수의 변형된 TSCM 세포들을 포함한다. 변형된 줄기 세포-유사 T 세포들의 상기 집단은 다수의 변형된 TCM 세포들을 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 집단에서 다수의 변형된 T 세포들의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 또는 이들 사이의 임의의 백분율의 세포들은 줄기 기억 T 세포 (TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고; 그리고 이때 상기 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)은 CD45RA 및 CD62L을 포함한다. 상기 세포-표면 마커들은 하나 또는 그 이상의 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ을 포함할 수 있다. 상기 세포-표면 마커들은 하나 또는 그 이상의 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L을 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, 상기 집단에서 다수의 변형된 T 세포들의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 세포들은 중앙 기억 T 세포 (TCM) 또는 TCM-유사 세포들의 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고; 그리고 이때 상기 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)은 CD45RO 및 CD62L을 포함한다. 상기 세포-표면 마커들은 하나 또는 그 이상의 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L을 포함할 수 있다.
본 명세서의 방법들은 변형된 T 세포들 집단을 변형시키거나 및/또는 생산할 수 있고, 이때 상기 집단에서 다수 변형된 T 세포들의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 백분율의 세포들은 나이브 T 세포 (TN)의 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시킨다. 상기 세포-표면 마커들은 하나 또는 그 이상의 CD45RA, CCR7 및 CD62L을 포함할 수 있다.
본 명세서의 방법들은 변형된 T 세포들 집단을 변형시키거나 및/또는 생산할 수 있고, 이때 상기 집단에서 다수 변형된 T 세포들의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 백분율의 세포들은 작동체 T-세포 (변형된 TEFF)의 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시킨다. 상기 세포-표면 마커들은 하나 또는 그 이상의 CD45RA, CD95, 및 IL-2Rβ를 포함할 수 있다.
본 명세서의 방법들은 변형된 T 세포들 집단을 변형시키거나 및/또는 생산할 수 있고, 이때 상기 집단에서 다수 변형된 T 세포들의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 백분율의 세포들은 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포 (TSCM) 또는 중앙 기억 T 세포 (TCM)의 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시킨다.
상기 집단의 다수의 변형된 세포들은 이식유전자 (가령, CAR) 또는 상기 이식유전자를 인코드하는 서열을 포함하며, 이때 상기 집단의 다수 세포들의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 상기 이식유전자 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하며, 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키거나, 또는 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 약 70% 내지 약 99%, 약 75% 내지 약 95% 또는 약 85% 내지 약 95%는 CD34를 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시킨다 (가령, 세포-표면 마커 표현형 CD34+를 포함한다).
상기 집단의 다수의 변형된 세포들은 이식유전자 (가령, CAR) 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하며, 이때 상기 집단의 다수의 세포들의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 상기 이식유전자 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하고, 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD38을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않으며, 또는 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 약 45% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80% 또는 약 65% 내지 약 75%는 CD34를 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD38을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않는다 (가령, 세포-표면 마커 표현형 CD34+ 및 CD38-를 포함한다).
상기 집단의 다수의 변형된 세포들은 이식유전자 (가령, CAR) 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하며, 이때 상기 집단의 다수의 세포들의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 상기 이식유전자 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하며, 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD38을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않고, 또는 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 약 0.2% 내지 약 40%, 약 0.2% 내지 약 30%, 약 0.2% 내지 약 2% 또는 0.5% 내지 약 1.5%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD38을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않는다 (가령, 세포-표면 마커 표현형 CD34+, CD38- 및 CD90+을 포함한다).
상기 집단의 다수의 변형된 세포들은 이식유전자 (가령, CAR) 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하며, 이때 상기 집단의 다수의 세포들의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 상기 이식유전자 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하며, 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD38 및 CD45RA을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않고, 또는 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 약 0.2% 내지 약 40%, 약 0.2% 내지 약 30%, 약 0.2% 내지 약 2% 또는 0.5% 내지 약 1.5%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD38 및 CD45RA을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않는다 (가령, 세포-표면 마커 표현형 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-을 포함한다).
상기 집단의 다수의 변형된 세포들은 이식유전자 (가령, CAR) 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하고, 이때 상기 집단의 다수의 세포들의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 상기 이식유전자 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하고, 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 0.01%, 적어도 0.02%, 적어도 0.03%, 적어도 0.04%, 적어도 0.05%, 적어도 0.06%, 적어도 0.07%, 적어도 0.08%, 적어도 0.09%, 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34, CD90 및 CD49f을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD38 및 CD45RA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않고, 또는 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 약 0.02% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 2%, 약 0.04% 내지 약 2% 또는 약 0.04% 내지 약 1%는 CD34, CD90 및 CD49f를 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD38 및 CD45RA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않는다 (가령, 세포-표면 마커 표현형 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA- 및 CD49f+를 포함한다).
상기 집단의 다수의 변형된 세포들은 이식유전자 (가령, CAR) 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하고, 이때 상기 집단의 다수의 세포들의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 상기 이식유전자 또는 상기 이식유전자를 인코딩하는 서열을 포함하고, 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 0.01%, 적어도 0.02%, 적어도 0.03%, 적어도 0.04%, 적어도 0.05%, 적어도 0.06%, 적어도 0.07%, 적어도 0.08%, 적어도 0.09%, 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD45RA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않고, 또는 이때 상기 변형된 세포들의 집단의 적어도 약 0.2% 내지 약 5%, 약 0.2% 내지 약 3% 또는 약 0.4% 내지 약 3%는 CD34 및 CD90을 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키고, CD45RA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 세포-표면 마커(들)을 발현시키지 않는다 (가령, 세포-표면 마커 표현형 CD34+, CD90+ 및 CD45RA-을 포함한다).
면역 세포들 또는 면역 전구체 세포들 (가령, 개시된 변형된 T-세포들)을 생산하고, 및/또는 확장시키는 조성물들과 방법들, 그리고 상기 면역 세포들 또는 면역 전구체 세포들 (가령, 개시된 변형된 T-세포들)의 세포 생존력 및/또는 줄기-유사 표현형의 수준을 유지 또는 강화시키기 위한 완충액들은 U.S. 특허 번호 10,329,543 및 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에서 상세하게 기술하고 있다.
본 명세서의 세포들 및 변형된 세포들은 체세포 세포들일 수 있다. 본 명세서의 세포들 및 변형된 세포들은 분화된 세포들일 수 있다. 본 명세서의 세포들 및 변형된 세포들은 자가조직의 세포들 또는 동종이계의 세포들일 수 있다. 동종이계의 세포들은 대상체에게 투여-후, 생착(engraftment)에 대한 부작용을 방지하도록 조작된다. 동종이계의 세포들은 임의의 유형의 세포일 수 있다. 동종이계의 세포들은 줄기 세포들일 수도 있거나, 줄기 세포들로부터 유래될 수 있다. 동종이계의 세포들은 분화된 체세포 세포들일 수 있다.
키메라 항원 수용체 또는 치료요법적 폴리펩티드를 발현시키는 방법들
본 명세서는 변형된 세포들의 집단을 생산하는 방법들을 제공한다. 한 측면에서, 본 명세서는 세포의 표면 상에서 CAR을 발현시키는 방법들을 제공한다. 한 측면에서, 본 명세서는 세포에서 치료요법적 폴리펩티드를 발현시키는 방법들을 제공한다. 상기 방법은 세포들의 집단으로 a) 본 명세서의 트랜스포존 (가령, CAR 또는 치료요법적 폴리펩티드에 대한 서열을 인코드하는 트랜스포존)을 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 b) 트란스포사제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 전달하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 (c) 상기 CAR 또는 상기 치료요법적 폴리펩티드를 인코드하는 서열의 통합에 적합한 조건 하에서 상기 변형된 세포 집단을 배양하는 단계; 그리고 (d) 상기 변형된 세포 집단으로부터 상기 세포 표면 상에서 상기 CAR을 발현시키는 적어도 하나의 세포, 또는 상기 변형된 세포 집단으로부터 상기 세포에서 상기 치료요법적 단백질을 발현시키는 적어도 하나의 세포를 확장시키고 및/또는 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, 상기 세포 집단은 백혈구 및/또는 CD4+ 및 CD8+ 백혈구를 포함할 수 있다. 상기 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ 백혈구를 최적화된 비율로 포함할 수 있다. CD4+ 대 CD8+ 백혈구의 상기 최적화된 비율은 생체내에서 자연적으로 생성되는 비율은 아니다. 상기 세포 집단은 종양 세포를 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, 상기 CAR 또는 상기 CAR, 트랜스포존, 또는 벡터를 인코딩하는 서열을 상기 세포 집단에서 적어도 하나의 세포의 세포 막을 통하여 운반하는데 충분한 조건은 지정된 전압의 펄스, 완충액, 하나 또는 그 이상의 보충 인자(들) 중에서 하나 또는 그 이상을 적용시키는 단계를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 CAR을 인코딩하는 서열의 통합에 적합한 조건들은 완충액 및 하나 또는 그 이상의 보충 인자(들) 중 적어도 하나를 포함한다.
상기 완충액은 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, Amaxa Nucleofector, 인간 T 세포 핵감염(nucleofection) 완충액 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 하나 또는 그 이상의 보충 인자(들)은 (a) 재조합 인간 사이토킨, 케모킨, 인터루킨 또는 이의 임의의 조합; (b) 염, 미네랄, 대사물질 또는 이의 임의의 조합; (c) 세포 배지; (d) 세포성 DNA 센싱, 대사, 분화, 신호 형질도입, 하나 또는 그 이상의 자가사멸 경로(들) 또는 이의 조합의 억제제; 그리고 (e) 하나 또는 그 이상의 핵산들을 변형 또는 안정화시키는 시약을 포함할 수 있다. 상기 재조합 인간 사이토킨, 케모킨, 인터루킨 또는 이의 임의의 조합은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP (TGF-베타 1), 림포톡신-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 염, 미네랄, 대사물질 또는 이의 임의의 조합은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오시드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대체제, 항생제, pH 조절제, Earle의 염, 2-머캅토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, Nucleofector PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 숙신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 포도당, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌글리콜, Poloxamer 188, Poloxamer 181, Poloxamer 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, Crown-5, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC 배지, CTS OpTimizer T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, ImmunoCult-XF T 세포 확장 배지 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포성 DNA 센싱, 대사, 분화, 신호 형질도입, 하나 또는 그 이상의 자가사멸 경로(들) 또는 이의 조합의 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 유형 1 인터페론, 전-염증성 사이토킨, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 카스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A, 글리코겐 합성효소 키나아제-3β (GSK-3 β)의 억제제 (가령, TWS119), 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 억제제의 예로는 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이의 임의의 조합이 내포되어 있을 수 있다. 하나 또는 그 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 상기 시약은 pH 변형제, DNA-결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖는 또는 이 사열 없이 순-중화 전위 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
확장 단계 및 선택 단계는 동시에, 또는 순차적으로 발생할 수 있다. 상기 선택 단계 전, 확장이 발생될 수 있다. 상기 장은 선택 후에 발생할 수 있으며, 선택적으로 추가(즉, 두 번째) 선택이 확장 후에 발생할 수 있다. 확장 단계와 선택 단계의 공존의 연립도 가능하다. 상기 확장 단계 및/또는 선택 단계는 종점을 포함하여 10~14일 동안 진행될 수 있다.
상기 확장은 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 항원과 접촉시켜 상기 CAR을 통해 적어도 하나의 세포를 자극하고, 이로서 확장된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 항원 기질 표면에 제시될 수 있다. 상기 기질은 표면, 웰, 비드 또는 이들 복수, 및 매트릭스를 포함하지만 이에 국한되지 않는 임의의 형태를 가질 수 있다. 상기 기질은 상자성 또는 자성 구성요소를 더 포함할 수 있다. 상기 항원은 기질의 표면에 제시될 수 있으며, 이때 상기 기질은 자기 비드이며, 이때 자석은 변형되고, 확장된 세포 집단으로부터 자기 비드들을 제거하거나 분리하기 위해 사용될 수 있다. 상기 항원은 세포 표면 또는 인공 항원 제시 세포의 표면에 제시될 수 있다. 인공 항원 제시 세포에는 종양 세포 및 줄기 세포가 내포될 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다.
상기 트랜스포존 또는 벡터는 선택 유전자를 포함하는 일부 측면들에서, 상기 선택 단계는 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 선택 유전자에게 저항성을 부여하는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로 인하여 상기 선택 유전자를 발현시키는 세포는 선택에서 살아남은 세포로 확인되며, 상기 선택 유전자를 발현시키지 못하는 세포들은 선택 단계에서 생존하지 못하는 것으로 식별한다.
본 명세서는 본원에 기술된 방법의 변형, 확장 및 선택된 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
세포 표면에서 CAR을 발현시키는 방법에 대한 더 자세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816 및 PCT/US2019/049816에 개시되어 있다.
본 명세서는 세포 또는 세포들의 집단을 제공하며, 이때 상기 세포는 다음을 포함하는 본 명세서의 트랜스포존을 포함하고: (a) 유도성 이식유전자 구조체, 이 구조체는 유도성 프로모터를 인코드하는 서열, 그리고 이식유전자, 이를 테면, 치료요법적 폴리펩티드를 인코드하는 서열을 포함하고, (b) 수용체 구조체, 이 구조체는 구성적 프로모터를 인코드하는 서열, 그리고 외생성 수용체, 이를 테면 CAR을 인코드하는 서열을 포함하고, 이때, 상기 (a)의 구조체와 상기 (b)의 구조체가 세포의 게놈 서열로 통합될 때, 상기 외생성 수용체가 발현되며, 이때 상기 외생성 수용체는 리간드 또는 항원의 결합-시, 상기 유도성 이식유전자 (a)의 발현을 조절하는 유도성 프로모터를 직접 또는 간접적으로 표적으로 삼는 세포내 신호를 변환시켜 유전자 발현을 변형시킨다.
상기 조성물은 유전자 발현을 감소시킴으로써 유전자 발현을 변형시킬 수 있다. 상기 조성물은 유전자 발현을 일시적으로 (가령, 리간드가 외생성 수용체에 결합하는 동안) 변형함으로써 유전자 발현을 변형시킬 수 있다. 상기 조성물은 유전자 발현을 급격하게 변형시킬 수 있다(가령, 리간드는 외생성 수용체에 가역적으로 결합한다). 상기 조성물은 유전자 발현을 만성적으로 변형시킬 수 있다(가령, 리간드는 외생성 수용체에 비가역적으로 결합한다).
상기 외생성 수용체는 세포의 게놈 서열에 대해 내생성 수용체를 포함할 수 있다. 예시적인 수용체들에는 세포내 수용체들, 세포-표면 수용체들, 막횡단 수용체들, 리간드-개폐 이온 채널, 및 G-단백질 커플링된 수용체들이 내포되지만, 이에 국한되지 않는다.
상기 외생성 수용체는 비-자연 발생적 수용체를 포함할 수 있다. 상기 비-자연 발생적 수용체는 합성, 변형된, 재조합, 돌연변이 또는 키메라 수용체일 수 있다. 상기 비-자연 발생적 수용체는 T-세포 수용체 (TCR)로부터 단리된 또는 유래된 하나 또는 그 이상의 서열들을 포함할 수 있다. 상기 비-자연 발생적 수용체는 스캐폴드 단백질로부터 단리된 또는 유래된 하나 또는 그 이상의 서열들을 포함할 수 있다. 상기 비-자연 발생적 수용체가 막횡단 도메인을 포함하지 않는 경우들을 비롯한 일부 측면들에서, 상기 비-자연 발생적 수용체는 제2 막횡단, 막-결합된 및/또는 세포내 수용체와 상호작용하고, 이것은 상기 비-자연 발생적 수용체와 접촉한 후, 세포내 신호를 변환시킨다. 상기 비-자연 발생적 수용체는 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 상기 비-자연 발생적 수용체는 세포내 신호를 변환시키는 세포내 수용체와 상호작용할 수 있다. 상기 비-자연 발생적 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 상기 비-자연 발생적 수용체는 키메라 리간드 수용체 (CLR)일 수 있다. 상기 CLR은 키메라 항원 수용체 (CAR)일 수 있다.
상기 유도성 프로모터를 인코딩하는 서열은 NFĸB 프로모터를 인코딩하는 서열, 인터페론 (IFN) 프로모터을 인코딩하는 서열 또는 인터루킨-2 프로모터를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 IFN 프로모터는 IFNγ 프로모터이다. 상기 유도성 프로모터는 사이토킨 또는 케모킨의 프로모터로부터 단리되거나, 이로부터 파생될 수 있다. 상기 사이토킨 또는 케모킨은 IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12, IL13, IL17A/F, IL21, IL22, IL23, 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ), 콜로니 자극 인자 2 (GM-CSF), 인터페론 감마 (IFNγ), 종양 괴사 인자 알파 (TNFα), LTα, 퍼포린, Granzyme C (Gzmc), Granzyme B (Gzmb), C-C 모티프 케모킨 리간드 5 (CCL5), C-C 모티프 케모킨 리간드 4 (Ccl4), C-C 모티프 케모킨 리간드 3 (Ccl3), X-C 모티프 케모킨 리간드 1 (Xcl1) 또는 LIF 인터루킨 6 패밀리 사이토킨 (Lif)을 포함할 수 있다.
상기 유도성 프로모터는 세포 분화, 활성화, 탈진 및 기능에 관여하는 표면 단백질로 구성된 유전자의 프로모터로부터 단리되거나, 이로부터 파생될 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 유전자는 CD69, CD71, CTLA4, PD-1, TIGIT, LAG3, TIM-3, GITR, MHCII, COX-2, FASL 또는 4-1BB를 포함한다.
상기 유도성 프로모터는 CD 대사 및 분화에 관여하는 유전자의 프로모터로부터 단리되거나, 이로부터 파생될 수 있다. 상기 유도성 프로모터는 Nr4a1, Nr4a3, Tnfrsf9 (4-1BB), Sema7a, Zfp36l2, Gadd45b, Dusp5, Dusp6 및 Neto2의 프로모터로부터 단리되거나, 이로부터 파생될 수 있다.
일부 측면들에서, 상기 유도성 이식유전자 구조체는 억제성 체크포인트 신호의 하류에 있는 신호전달 성분, 전사 인자, 사이토킨 또는 사이토킨 수용체, 케모킨 또는 케모킨 수용체, 세포자멸 또는 세포자멸 수용체/리간드, 대사 감지 분자, 암 치료법에 대한 민감성을 부여하는 단백질 및 종양유전자 또는 종양 억제 유전자를 포함하거나, 이의 발현을 구동시킨다. 이의 비-제한적인 예들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT 출원 번호 PCT/US2019/049816에 개시되어 있다.
기갑화된 (armored) 세포들
상기 본 명세서의 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 이들의 치료 잠재력을 강화시키도록 더 변형될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 상기 변형된 세포들은 면역학적 및/또는 대사성 체크포인트에 덜 민감하도록 더 변형될 수 있다. 이러한 유형의 변형은 본 명세서에서 세포를 "기갑화(armored)"시키는 것으로, 이는 변형-후 "기갑(armor)" 세포 (가령, 기갑화된 T-세포들)로 지칭될 수 있다. 기갑 세포는 예를 들어, 종양 면역억제 미세환경 내에서 자연적으로 세포에 전달되는 특정 체크포인트 신호 (가령, 체크포인트 억제)를 차단 및/또는 희석함으로써 생산될 수 있다.
본 명세서의 기갑 세포는 임의의 세포, 예를 들면, T 세포, NK 세포, 조혈성 전구 세포, 말초 혈액 (PB) 유래된 T 세포(G-CSF 동원 말초 혈액으로부터 분리되거나 유래된 T 세포 포함), 또는 제대혈(UCB) 유래된 T 세포로부터 유래될 수 있다. 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 T-세포)는 키메라 리간드 수용체 (단백질 스캐폴드, 항체, ScFv, 또는 항체 모방체를 포함하는 CLR)/키메라 항원 수용체 (단백질 스캐폴드, 항체, ScFv, 또는 항체 모방체를 포함하는 CAR), CARTyrin (센티린을 포함하는 CAR), 및/또는 VCAR (낙타 VHH 또는 단일 도메인 VH를 포함하는 CAR) 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 T-세포)는 본원에서 기재된 바와 같은 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 T-세포)는 외생성 서열을 포함할 수 있다. 상기 외생성 서열은 치료요법적 단백질을 인코드하는 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 치료요법적 단백질은 핵 단백질, 세포질 단백질, 세포내 단백질, 막횡단 단백질, 세포-표면 결합된 단백질, 또는 분비된 단백질일 수 있다. 상기 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 T-세포)에 의해 발현되는 예시적인 치료요법적 단백질은 상기 기갑화된 세포의 활성을 변형시킬 수 있거나, 제2 세포의 활성을 변형시킬 수 있다. 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 T-세포)는 선별 유전자 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 T-세포)는 합성 유전자 발현 카세트 (본원에서 유도성 이식유전자 구조체로도 지칭됨)를 포함할 수 있다.
본 명세서의 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 CAR T-세포)를 만들기 위해, 억제성 체크포인트 신호의 수용체(들)을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자(들) 발현을 침묵시키거나, 감소되도록 더 변형될 수 있다. 억제성 체크포인트 신호의 수용체들은 상기 세포 표면 상에 발현되거나, 세포의 세포질 내에서 발현된다. 상기 억제성 체크포인트 신호의 수용체를 인코딩하는 유전자 발현의 침묵 또는 감소로 기갑화된 세포 표면 상에서 또는 이들의 세포질 내에서 상기 억제성 체크포인트 수용체들의 단백질 발현이 상실된다. 따라서, 억제성 체크포인트 수용체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자들의 발현이 침묵되거나 또는 감소된 기갑화된 세포들은 체크포인트 신호에 대해 저항성이거나, 비-수용성이거나, 둔감하다. 억제성 체크포인트 신호에 대해 상기 기갑화된 세포의 저항성, 또는 감소된 민감성은 이들 억제성 체크포인트 신호 존재 하에서 상기 기갑화된 세포의 치료요법적 잠재력을 강화시킨다. 억제성 체크포인트 신호 (및 면역억제를 유도하는 단백질들)의 비-제한적인 예시들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다. 침묵화될 수 있는 억제성 체크포인트 신호의 선호되는 예시에는 PD-1 및 TGFβRII이 내포되지만, 이에 국한되지 않는다.
본 명세서의 상기 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 체크포인트 신호전달에 연루된 세포된 단백질을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나, 감소되도록 더 변형될 수 있다. 상기 변형된 세포들의 상기 활성은 체크포인트 신호전달 경로에 연루된 임의의 세포내 신호전달 단백질을 표적으로 하고, 이로 인하여 하나 또는 그 이상의 체크포인트 경로에 대해 체크포인트 억제 또는 간섭을 취득함으로써 강화될 수 있다. 체크포인트 신호전달에 연루된 세포내 신호전달 단백질들의 비-제한적 예시들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다.
본 명세서의 상기 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 치료법의 효능을 방해하는 전사 인자를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나, 감소되도록 더 변형될 수 있다. 변형된 세포들의 활성은 치료법의 효능을 방해하는 전사 인자의 발현을 침묵 또는 감소(또는 기능을 억제)시킴으로써 강화되거나, 조절될 수 있다. 발현을 침묵 또는 감소시키거나, 이의 기능을 억제하기 위해 변형될 수 있는 전사 인자의 비-제한적인 예시들에는 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에서 기술된 예시적인 전사 인자들이 내포되지만, 이에 국한되지 않는다.
본 명세서의 상기 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 세포 사멸 또는 세포자멸 수용체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나, 감소되도록 더 변형될 수 있다. 사멸 수용체 및 이의 내생성 리간드의 상호작용 결과로 세포자멸이 개시된다. 세포 사멸 및/또는 세포자멸 수용체 및/또는 리간드의 발현, 활성 또는 상호작용의 파괴는 변형된 세포가 사멸 신호에 덜 반응하게 하고, 결과적으로 상기 기갑화된 세포들을 종양 환경에서 더욱 효과적이게 만든다. 세포 사멸 및/또는 세포자멸 수용체들 및 리간드들의 비-제한적인 예시들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다. 변형될 수 있는 세포 사멸 수용체의 바람직안 예는 Fas (CD95)이다.
본 명세서의 상기 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 대사성 감지 단백질을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나, 감소되도록 더 변형될 수 있다. 변형된 세포에 의해 면역억제성 종양 미세환경(산소, pH, 포도당 및 기타 분자의 수준이 낮은 것을 특징으로 함)의 대사성 감지가 중단되면 T-세포 기능의 유지가 연장되고, 결과적으로 세포당 더 많은 종양 세포가 죽게 된다. 대사성 감지 유전자 및 단백질의 비-제한적인 예시들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다. 바람직한 예시인, HIF1a 및 VHL은 저산소 환경에서 T-세포 기능에 역할을 한다. 기갑화된 T-세포에서는 HIF1a 또는 VHL를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자 발현이 침묵되거나, 감소될 수 있다.
본 명세서의 상기 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 단클론 항체를 포함하는 암 요법에 감도를 부여하는 단백질을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나, 감소되도록 더 변형될 수 있다. 따라서, 기갑화된 세포는 암 치료법 (가령, 화학요법, 단클론 항체 요법, 또는 또다른 항-종양 치료)이 있는 동안 기능할 수 있고, 우수한 기능이나 효능을 나타낼 수 있다. 암 치료법에 감도를 부여하는데 연루된 단백질들의 비-제한적 예시들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다.
본 명세서의 상기 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 기갑화된 세포 (가령, 기갑화된 CAR T-세포)를 생산하기 위해 성장 이점 인자를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나, 감소되도록 더 변형될 수 있다. 종양유전자 발현의 침묵 또는 감성은 이 세포에 성장 이점을 부여할 수 있다. 예를 들면, CAR T-세포 제조 공정 동안, TET2 유전자 발현을 침묵 또는 감소(가령, 발현을 방해)하면, 확장 능력이 부족한 기갑화안된 CAR T-세포와 비교할 때, 종양의 확장 및 후속 박멸을 위한 상당한 능력을 갖춘 강화된 CAR T-세포들이 만들어진다. 이 전략은 안전 스위치 (가령, 본 문서에 설명된 iC9 안전 스위치)와 결합될 수 있는데, 이는 대상체으로부터의 부작용 또는 상기 기갑화된 CAR-T 세포의 통제되지 않은 성장이 발생하는 경우, 이들 기갑화된 CAR T-세포의 표적화된 파괴가 허용된다. 성장 이점 인자들의 비-제한적인 예시들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다.
상기 본 명세서의 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 본 명세서의 기갑화된 T-세포를 생산하기 위해, 변형된/키메라 체크포인트 수용체를 발현시키도록 더 변형될 수 있다.
상기 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 무효(null) 수용체, 데코이(decoy) 수용체 또는 지배적 음성 수용체를 포함할 수 있다. 무효 수용체, 데코이 수용체 또는 지배적 음성 수용체는 변형된/키메라 수용체/단백질일 수 있다. 무효 수용체, 데코이 수용체 또는 지배적 음성 수용체는 상기 세포내 신호전달 도메인의 발현을 위해 절두될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 무효 수용체, 데코이 수용체 또는 지배적 음성 수용체는 세포내 신호전달 도메인 내 효과적인 신호전달에 결정적이거나 필요한 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 돌연변이될 수 있다. 무효 수용체, 데코이 수용체 또는 지배적 음성 수용체의 절두 또는 돌연변이 결과로 상기 세포 또는 이들 세포내 체크포인트 신호를 운반 또는 변환시키는 이들 수용체의 능력이 상실될 수 있다.
예를 들면, 종양 세포 표면에 발현된 PD-L1 수용체의 면역억제 체크포인트 신호를 희석하거나 차단하는 것은 기갑 세포 (가령, 기갑화된 CAR T-세포) 표면에 변형/키메라 PD-1 무효 수용체를 발현함으로써 달성될 수 있고, 이는 상기 기갑화된 세포의 내생성 PD-1 수용체를 통한 면역억제 체크포인트 신호의 전달을 감소시키거나 억제하기 위해, 상기 기갑화된의 표면에서도 또한 발현되는 내생성 (비-변형된) PD-1 수용체와 효과적으로 경쟁한다. 이 비-제한적인 예에서는, 종양 세포에서 발현되는 PD-L1에 결합하기 위한 두 가지 상이한 수용체들 간의 경쟁은 효과적인 체크포인트 신호 전달 수준을 감소시키거나 줄이며, 이로 인하여 PD-1 무효 수용체를 발현하는 상기 기갑화된 세포의 치료 잠재력이 향상된다.
상기 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 무효 수용체, 데코이 수용체 또는 막횡단 수용체인 지배적 음성 수용체, 막-연합된 또는 막-연계된 수용체/단백질 또는 세포내 수용체/단백질을 포함할 수 있다. 예시적인 무효, 데코이, 또는 지배적 음성 세포내 수용체들/단백질에는 억제성 체크포인트 신호의 하류에 있는 신호전달 성분, 전사 인자, 사이토킨 또는 사이토킨 수용체, 케모킨 또는 케모킨 수용체, 세포자멸 또는 세포자멸 수용체/리간드, 대사 감지 분자, 암 치료법에 대한 민감성을 부여하는 단백질 및 종양유전자 또는 종양 억제 유전자가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 사이토킨, 사이토킨 수용체들, 케모킨 및 케모킨 수용체들의 비-제한적인 예시들은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636에 개시되어 있다.
상기 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 스위치 수용체를 포함할 수 있다. 예시적인 스위치 수용체들은 변형된/키메라 수용체/단백질을 포함하며, 이때 고유의 또는은 야생형 세포내 신호전달 도메인은 상기 단백질에 고유하지 않거나 및/또는 야생형 도메인이 아닌 상이한 세포내 신호전달 모데인으로 스위치되거나, 대체된다. 예를 들면, 억제성 신호전달 도메인을 자극 신호전달 도메인으로 대체시키면 면역억제성 신호가 면역자극 신호로 스위치될 것이다. 대안으로, 억제성 신호전달 도메인을 상이한 억제성 도메인으로 대체시키면 억제성 신호전달 수준이 감소 또는 강화될 수 있다. 스위치 수용체의 발현 또는 과발현 결과로 면역억제성 종양 미세환경 내 발현되는 동족 체크포인트 수용체에 결합하기 위한 내생성 야생형 체크포인트 수용체 (스위치 수용체가 아님)와의 경쟁을 통해, 동족 체크포인트 신호의 희석 및/또는 차단을 초래할 수 있다. 기갑화된 세포들 (가령, 기갑화된 CAR T-세포들)은 스위치 수용체를 인코딩하는 서열을 포함하며, 이는 하나 또는 그 이상의 스위치 수용체들의 발현으로 이어지고, 결과적으로, 기갑화된 세포의 활성이 변경된다. 기갑화된 세포들 (가령, 기갑화된 CAR T-세포들)은 체크포인트 수용체, 전사 인자, 사이토킨 수용체, 사멸 수용체, 대사성 감지 분자, 암 치료법, 종양유전자 및/또는 종양 억제 단백질 또는 유전자의 세포 내 발현되는 단백질 하류를 표적으로 하는 스위치 수용체를 발현할 수 있다.
예시적인 스위치 수용체들은 억제성 체크포인트 신호의 하류에 있는 신호전달 성분, 전사 인자, 사이토킨 또는 사이토킨 수용체, 케모킨 또는 케모킨 수용체, 세포자멸 또는 세포자멸 수용체/리간드, 대사 감지 분자, 암 치료법에 대한 민감성을 부여하는 단백질 및 종양유전자 또는 종양 억제 유전자를 포함하나, 이에 국한되지 않는 단백질을 포함할 수 있거나, 이로부터 파생될 수 있다.
본 명세서의 상기 변형된 세포들 (가령, CAR T-세포들)은 기갑화된 T-세포를 생산하기 위한 조건적 유전자 발현을 중재하는 CLR/CAR을 발현시키기 위해 더 변형될 수 있다. 상기 기갑화된 T-세포 핵에서 CLR/CAR과 조건 유전자 발현 시스템의 조합은 합성 유전자 발현 시스템은 동족 리간드(들)이 CLR과 결합, 또는 동족 항원(들)이 CAR과 결합하면 조건부로 활성화되는 시스템이다. 이 시스템은 예를 들어, 종양 환경이나 종양 환경 내 리간드 또는 항원 결합 부위에서 합성 유전자 발현을 줄이거나 제한함으로써, 변형된 T-세포들의 치료요법적 잠재력을 '무장'시키거나 향상시키는 데 도움이 될 수 있다.
유전자 편집 조성물들 및 방법들
이식유전자를 세포에 도입함으로써, 변형된 세포들이 만들어진다. 상기 도입 단계는 비-전위 전달 시스템을 통한 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 구조체의 전달을 포함할 수 있다.
핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장에서 세포로의 도입은 국소 전달, 흡착, 흡수, 전기천공, 스핀감염, 공동배양, 형질감염, 기계적 전달, 음파 전달, 진동 전달, 자기감염 또는 나노입자-매개된 전달 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장에서 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 세포로 도입은 리포솜 형질감염, 인산칼슘 형질감염, 푸진(fugene) 형질감염 및 덴드리머-매개된 형질감염을 포함할 수 있다. 생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장에서 핵산 서열, 이식유전자, 및/또는 게놈 편집 구조체를 기계적인 형질감염에 의한 세포로의 도입은 세포 압착, 세포 투하 또는 유전자 총 기술을 포함할 수 있다. 생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장에서 핵산 서열, 이식유전자, 및/또는 게놈 편집 구조체를 나노입자-매개된 형질감염에 의한 세포로의 도입은 리포솜 전달, 미셀에 의한 전달 및 폴리머로솜에 의한 전달을 포함할 수 있다.
생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장에서 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 세포로 도입은 비-바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 상기 비-바이러스 벡터는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 비-바이러스 벡터는 플라스미드 DNA, 선형 이중-가닥의 DNA (dsDNA), 선형 단일-가닥의 DNA (ssDNA), DoggyBone™ DNA, 나노플라스미드, 미니서클 DNA, 단일-가닥의 올리고데옥시뉴클레오티드 (ssODN), DDNA 올리고뉴클레오티드, 단일-가닥의 mRNA (ssRNA), 및 이중-가닥의 mRNA (dsRNA)를 포함할 수 있다. 상기 비-바이러스 벡터는 본원에서 기재된 바와 같이, 트랜스포존을 포함할 수 있다.
생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장에서 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 세포로 도입은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 비-통합성 비-염색체성 벡터일 수 있다 비-통합성 비-염색체성 벡터들의 비-제한적인 예시에는 아데노-연합된 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 및 헤르페스 바이러스가 내포된다. 상기 바이러스 벡터는 합성 염색체성 벡터일 수 있다. 통합성 염색체성 벡터들의 비-제한적인 예시에는 아데노-연합된 벡터들 (AAV), 렌티바이러스들, 및 감마-레트로바이러스들이 내포된다.
생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장에서 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 세포로 도입은 벡터들의 조합을 포함할 수 있다. 벡터 조합의 비-제한적인 예시에는 바이러스 벡터와 비-바이러스 벡터, 다수의 비-바이러스 벡터들, 또는 다수의 바이러스 벡터들이 내포된다. 벡터 조합에는 DNA-유래된 벡터와 RNA-유래된 벡터의 조합, RNA와 역-전사효소의 조합, 트랜스포존과 트란스포사제의 조합, 비-바이러스 벡터와 엔도뉴클레아제의 조합, 그리고 바이러스 벡터와 엔도뉴클레아제의 조합이 내포된다.
게놈 변형은 핵산 서열을 안정적으로 통합하거나, 핵산 서열을 일시적으로 통합하거나, 핵산 서열의 부위-특이적 통합을 생성하거나, 핵산 서열의 편향된 통합을 생성하기 위해, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장에서 세포로 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 도입시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열은 이식유전자일 수 있다.
게놈 변형은 생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장에서 핵산 서열을 안정적으로 통합시키기 위해, 세포로 핵산 서열, 이식유전자 및/또는 게놈 편집 구조체를 도입시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 안정적 염색체성 통합은 무작위 통합, 부위-특이적 통합, 또는 편향된 통합일 수 있다. 상기 부위-특이적 통합은 비-지원된 통합이거나 지원된 통합일 수 있다. 상기 지원된 부위-특이적 통합은 부위-지향된 뉴클레아제와 함께 공동-운반된다. 상기 부위-지향된 뉴클레아제는 상기 게놈 통합 부위의 상류 및 하류 영역과 일정 비율의 상동성을 함유하는 5' 및 3' 뉴클레오티드 서열 연장을 갖는 이식유전자를 포함한다. 상동성 뉴클레오티드 연장을 갖는 이식유전자는 상동성 재조합, 미세상동성-매개된 단부 연결 또는 비상동성 단부-연결에 의한 게놈 통합을 가능하게 한다. 상기 부위-특이적 통합은 안전한 정막 부위에서 발생할 수 있다. 안전한 게놈 잠복 부위는 새로 삽입된 유전 요소들이 안정적으로 기능하도록 (예를 들어, 치료적으로 효과적인 발현 수준으로 발현되고) 보장하는 방식, 그리고 숙주 유기체에 위험을 야기하는 숙주 게놈에게 해로운 변화를 일으키지 않는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 있다. 잠재적으로 게놈 안정 잠복의 비-제한적인 예시에는 상기 인간 알부민 유전자의 인트론 서열들, 아데노-연합된 바이러스 부위 1 (AAVS1), 염색체 19 상의 AAV 바이러스의 자연 발생적 통합 부위, 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 5 (CCR5) 유전자의 부위 및 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 오르소로그(ortholog) 부위가 내포된다.
상기 부위-특이적 이식유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 파괴하는 부위에서 일어날 수 있다. 표적 유전자 발현의 중단은 인트론, 엑손, 프로모터, 유전적 요소, 인핸서, 억제자, 시작 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서의 부위 특이적 통합에 의해 발생할 수 있다. 부위-특이적 통합의 표적이 되는 표적 유전자들의 비-제한적인 예시에는 TRAC, TRAB, PDI, 임의의 면역억제성 유전자, 및 동종-거부(allo-rejection)에 연루된 유전자들이 내포된다.
상기 부위-특이적 이식유전자 통합은 표적 유전자의 발현이 강화되는 결과를 초래하는 부위에서 일어날 수 있다. 표적 유전자 발현의 풍부화는 인트론, 엑손, 프로모터, 유전적 요소, 인핸서, 억제자, 시작 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서의 부위 특이적 통합에 의해 발생할 수 있다.
효소는 상기 이식유전자의 전달 또는 통합을 촉진하기 위해 숙주 게놈에서 가닥의 갈라진틈(breaks)을 생성하는 데 사용될 수 있다. 효소는 단일-가닥 갈라진틈 또는 이중-가닥 갈라진틈을 생성할 수 있다. 갈라진틈-유도 효소들의 비-제한적인 예시에는 트란스포사제, 통합효소, 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas9, 전사 활성자-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), Cas-CLOVER™, 및 CPF1이 내포된다. 갈라진틈-유도 효소는 DNA, mRNA에 인코딩된 단백질 또는 가이드 RNA(gRNA)와 핵단백질 복합체로 인코딩된 세포에 전달될 수 있다.
상기 부위-특이적 이식유전자 통합은 벡터-매개된 통합 부위 편향에 의해 조절될 수 있다. 벡터-매개된 통합 부위 편향은 선택된 렌티바이러스 벡터 또는 선택된 감마-레트로바이러스 벡터에 의해 제어될 수 있다.
상기 부위-특이적 이식유전자 통합 부위는 비-안정적 염색체성 삽입일 수 있다. 상기 통합된 이식유전자는 침묵될 수 있고, 제거될 수 있고, 절제될 수 있거나, 더 변형될 수 있다. 상기 게놈 변형은 이식유전자의 비-안정적 통합일 수 있다. 상기 비-안정적 통합은 일과적인 비-염색체성 통합, 절반(semi)-안정적 비-염색체성 통합, 절반-지속적 비-염색체성 삽입, 또는 비-안정적 염색체성 삽입일 수 있다. 상기 일과적인 비-염색체성 삽입은 에피-염색체성 또는 세포질성 삽입일 수 있다. 한 측면에서, 상기 이식유전자의 일과적인 비-염색체성 삽입은 염색체로의 통합이 아니며, 상기 변형된 유전 물질은 세포 분열 중에 복제되지 않는다.
상기 게놈 변형은 이식유전자의 절반-안정적 또는 지속적 비-염색체성 통합일 수 있다. DNA 벡터는 분열하는 세포의 핵에서 자율 복제를 허용하는 비-바이러스 벡터의 에피솜 유지를 위해, 핵 기질 단백질에 결합하는 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S-MAR) 모듈을 인코딩한다.
상기 게놈 변형은 이식유전자의 비-안정적 염색체성 통합일 수 있다. 상기 통합된 이식유전자는 침묵될 수 있고, 제거될 수 있고, 절제될 수 있고, 또는 더 변형될 수 있다.
이식유전자 삽입에 의한 상기 게놈 변형은 숙주 세포-지향된 이중-가닥 파손 복구(상동성-지향된 복구)를 통해 상동성 재조합(HR), 미세상동성 매개 말단 결합(MMEJ), 비-상동성 말단 결합(NHEJ), 트랜스포사제 효소-매개된 변형, 인테그라제 효소-매개된 변형, 엔도뉴클레아제 효소-매개된 변형 또는 재조합 효소-매개된 변형에 의해 발생할 수 있다. 이식유전자 삽입에 의한 게놈에서의 변형은 CRISPR-Cas9, TALEN, ZFNs, Cas-CLOVER™, 및 cpf1을 통하여 일어날 수 있다.
새로운 또는 기존의 뉴클레오티드/핵산 삽입이 연루된 유전자 편집 시스템에서, 절단 효소 (가령, 뉴클레아제, 재조합효소, 인테그라아제 또는 트랜스포사아제)에 추가적으로, 삽입 도구 (가령, DNA 주형 벡터들, 이식 가능한 요소들 (트랜스포존 또는 레트로트랜스포존)이 세포에 전달되어야 한다. 이러한 재조합을 위한 효소 삽입 도구의 예시로는 DNA 벡터가 내포될 수 있다. 다른 유전자 편집 시스템에는 삽입 벡터와 함께, 인테그라제, 트랜스포존/레트로트랜스포존과 함께 트랜스포사제, 등의 전달이 필요하다. 절단 효소로 사용될 수 있는 예시적인 재조합효소는 CRE 재조합효소다. 삽입 도구에 사용될 수 있는 인테그라제의 비-제한적인 예시에는 AAV, 감마 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 비롯한, 임의의 다수의 바이러스들에서 취한 바이러스 기반 효소들이 내포된다. 삽입 도구에 사용될 수 있는 트랜스포존/레트로트랜스포존의 예시들은 본 명세서에 더 자세히 설명되어 있다.
생체외, 생체내, 시험관내 또는 현장 게놈 변형을 갖는 세포는 생식계 세포 또는 체세포일 수 있다. 상기 변형된 세포는 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 또는 개의 세포일 수 있다. 상기 변형된 세포는 분화된 세포, 분화안된 세포, 또는 불사화된 세포일 수 있다. 상기 변형된, 분화안된 세포는 줄기 세포일 수 있다. 상기 변형된, 분화안된 세포는 유도된 만능성 줄기 세포일 수 있다. 상기 변형된 세포는 면역 세포일 수 있다. 상기 변형된 세포는 T 세포, 조혈성 줄기 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구, 거핵구 또는 파골세포일 수 있다. 상기 변형된 세포는 세포가 정지 상태, 활성화된 상태, 휴지기, 간기(interphase), 전기(prophase), 중기(metaphase), 후기(anaphase) 또는 말기(telophase)에 있는 동안 변형될 수 있다. 상기 변형된 세포는 신선한 세포, 냉동보존된 세포, 벌크의 세포일 수 있으며, 전혈, 백혈구 성분채집술 또는 불멸화 세포주에서 하위 집단으로 분류될 수 있다. 백혈구분리술 산물 또는 혈액으로부터 세포를 분리하는 방법에 대한 자세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/173636 및 PCT/US2019/049816에 개시되어 있다.
본 명세서는 상기 유전자 편집 조성물을 포함하는 세포를 제공한다. 상기 유전자 편집 조성물은 DNA 결합 도메인을 인코딩하는 서열과 뉴클레아제 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 뉴클레아제 단백질을 인코딩하는 서열과 이의 뉴클레아제 도메인을 인코딩하는 서열은 DNA 서열, RNA 서열, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 상기 뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인은 하나 또는 그 이상의 CRISPR/Cas 단백질, 전사 활성자-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 및 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다.
상기 뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인은 뉴클레아제-비활성화된 Cas (dCas) 단백질 및 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 Clo051 뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 상기 유전자 편집 조성물은 융합 단백질을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 뉴클레아제-비활성화된 Cas9 (dCas9) 단백질 및 Clo051 뉴클레아제 또는 Clo051 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 상기 유전자 편집 조성물은 가이드 서열을 더 포함할 수 있다. 상기가이드 서열은 RNA 서열을 포함한다.
본 명세서는 작동체에 작동가능하게-연계된, 작은 Cas9 (Cas9)를 포함하는 조성물들을 제공한다. 본 명세서는 DNA 국소화 성분 및 작동체 분자를 포함하는, 이로 필수적으로 구성되거나 이로 구성된 융합 단백질을 제공하며, 이때 상기 작동체는 작은 Cas9 (Cas9)를 포함한다. 본 명세서의 작은 Cas9 구조체는 유형 IIS 엔도뉴클레아제를 포함하는 작동체를 포함할 수 있다. 활성 촉매 부위를 갖는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) Cas9는 서열 식별 번호: 122의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서는 작동체에 작동가능하게-연계된 비활성화된, 작은 Cas9 (dSaCas9)를 포함하는 조성물들을 제공한다. 본 명세서는 DNA 국소화 성분 및 작동체 분자를 포함하는, 이로 필수적으로 구성되거나 이로 구성된 융합 단백질을 제공하며, 이때 상기 작동체는 비활성화된, 작은 Cas9 (dSaCas9)를 포함한다. 본 명세서의 작은, 비활성화된 Cas9 (dSaCas9) 구조체는 유형 IIS 엔도뉴클레아제를 포함하는 작동체를 포함할 수 있다. dSaCas9는 서열 식별 번호: 123의 아미노산 서열을 포함하는데, 여기에는 촉매 부위를 비활성화하는 D10A 및 N580A 돌연변이가 내포되어 있다.
본 명세서는 작동체에 작동가능하게-연계된 비활성화된 Cas9 (dCas9)를 포함하는 조성물들을 제공한다. 본 명세서는 DNA 국소화 성분 및 작동체 분자를 포함하는, 이로 필수적으로 구성되거나 이로 구성된 융합 단백질을 제공하며, 이때 상기 작동체는 비활성화된 Cas9 (dCas9)를 포함한다. 본 명세서의 비활성화된 Cas9 (dCas9) 구조체는 유형 IIS 엔도뉴클레아제를 포함하는 작동체를 포함할 수 있다.
상기 dCas9는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptoccocus pyogenes)로부터 단리되거나 이로부터 유래될 수 있다. 상기 dCas9는 아미노산 위치 10과 위치 840에서 치환을 갖는 dCas9를 포함할 수 있고, 이 치환으로 촉매 부위가 비활성화된다. 일부 측면들에서, 이들 치환은 D10A 및 H840A이다. 상기 dCas9는 서열 식별 번호: 124 또는 서열 식별 번호: 125의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 Clo051 뉴클레아제 도메인은 서열 식별 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다.
예시적인 dCas9-Clo051 (Cas-CLOVER) 융합 단백질은 서열 식별 번호: 127의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 예시적인 dCas9-Clo051 융합 단백질은 서열 식별 번호: 128의 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다. 상기 dCas9-Clo051 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
예시적인 dCas9-Clo051 (Cas-CLOVER) 융합 단백질은 서열 식별 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성된다. 예시적인 dCas9-Clo051 융합 단백질은 서열 식별 번호: 130의 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다. 상기 dCas9-Clo051 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
상기 유전자 편집 조성물을 포함하는 세포는 안정적으로 또는 일과적으로 상기 유전자 편집 조성물을 발현시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자 편집 조성물은 일과적으로 발현된다. 상기 가이드 RNA는 게놈 DNA 서열 내 표적 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 게놈 DNA 서열 내의 표적 서열은 게놈 DNA 서열의 안전한 정박 부위 내의 표적 서열일 수 있다.
Cas-CLOVER을 포함하는 유전자 편집 조성물 및 유전자 편집을 위한 이들 조성물을 사용하는 방법들이 U.S. 특허 공개 번호 2017/0107541, 2017/0114149, 2018/0187185 및 U.S. 특허 번호 10,415,024에 상세하게 기술되어 있다.
유전자 편집 도구는 하나 또는 그 이상의 폴리(히스티딘)- 기반 미셀을 사용하여 세포에 전달될 수도 있다. 폴리(히스티딘) (가령, 폴리(L-히스티딘))은 불포화 질소에 고립 전자쌍을 제공하는 이미다졸 고리로 인해, pH에 민감한 중합체다. 즉, 폴리(히스티딘)은 양성자화-탈양성자화를 통해 양쪽성 성질을 갖게 된다. 특히, 특정 pH에서 폴리(히스티딘)-함유하는 삼블록 공-중합체는 상기 표면에 양전하를 띤 폴리(히스티딘) 단위가 있는 미셀로 조립될 수 있으며, 이에 따라 음전하를 띤 유전자 편집 분자(들)와 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 나노입자를 사용하여 pH-의존적 방식으로 단백질 및/또는 핵산을 결합 및 방출하면, 원하는 유전자 변형을 수행하는 효율적이고, 선택적인 메커니즘을 제공할 수 있다. 특히, 이러한 미셀-기반 전달 시스템은 충전된 물질과 관련하여 실질적인 유연성을 제공하고, 뿐만 아니라 큰 페이로드 용량 및 나노입자 페이로드의 표적 방출을 제공한다. 하나의 예시에서, 이중 가닥 DNA의 부위-이적 절단은 폴리(히스티딘)-기반 미셀을 사용하는 뉴클레아제 전달에 의해 가능해진다. 특정 이론에 결부되기를 원하지 않지만, 다양한 삼중 블록 공중합체에 의해 형성된 미셀에서 소수성 블록은 양단에 친수성 블록과 폴리(히스티딘) 블록이 남겨두고 응집되어 코어를 형성하여, 하나 또는 그 의 주변 층을 형성한다.
한 측면에서, 본 명세서는 친수성 블록, 소수성 블록 및 하전된 블록으로 이루어진 삼중블록 공중합체를 제공한다. 일부 측면들에서, 상기 수성 블록은 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)일 수 있고, 상기 전된 블록은 폴리(L-히스티딘)일 수 있다. 사용할 수 있는 삼중 블록 공중합체의 예로는 PEO-b-PLA-b-PHIS가 있으며, 각 블록의 반복 단위 수는 설계에 따라 가변적이다.
트리블록 공중합체를 만들기 위한 중간체로 사용할 수 있는 디블록 공중합체는 다양한 소수성 지방족 폴리(무수물), 폴리(핵산), 폴리(에스테르), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(펩티드), 폴리(포스파젠) 및 폴리(당류)(폴리(락타이드에 국한되지는 않음))에 결합됨)(PLA), 폴리(글리콜리드)(PLGA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL) 및 폴리(트리메틸렌 카보네이트)(PTMC)에 커플링된, PEG와 화학적으로 동의어인 친수성 생체 적합성 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)를 가질 수 있다. 100% PEG화된 표면으로 구성된 중합체 미셀은 시험관내 화학적 안정성이 향상되고, 생체내 생체 이용률이 증가하며 혈액 순환 반감기가 연장된다.
삼중 블록 공중합체를 포함하는 것들을 비롯하여, 중합체 소포, 폴리머좀 및 폴리(히스티딘)-기반 미셀, 및 이를 제조하는 방법들이 U.S. 특허 번호 7,217,427; 7,868,512; 6,835,394; 8,808,748; 10,456,452; U.S. 공개 번호 2014/0363496; 2017/0000743; 및 2019/0255191; 그리고 PCT 공개 번호 WO 2019/126589에 상세하게 기술되어 있다.
유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드
본원에 기술된 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드들은 기존 유도성 폴리펩티드들보다 우수한데, 그 이유는 본 명세서의 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드들의 면역원성이 덜하기 때문이다. 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드들은 재조합 폴리펩티드들이며, 따라서 비-자연 발생적이다. 더욱이, 숙주 인간 면역 시스템이 비-인간 서열들을 포함하지 않는 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드를 생산하기 위해 재조합된 서열들을 "비-자가(non-self)"로 인지할 수 있고, 결과적으로 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드, 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드를 포함하는 세포, 또는 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드 또는 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 제공받은 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 명세서는 리간드 결합 영역, 링커, 및 사전-세포자멸성 펩티드를 포함하는 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드를 제공하며, 이때 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 측면들에서, 상기 비-인간 서열은 제한 부위(restriction site)를 포함한다. 특정 측면들에서, 상기 리간드 결합 영역은 다량체성 리간드 결합 영역일 수 있다. 특정 측면들에서, 상기 사전-세포자멸성 펩티드는 카스파제 폴리펩티드이다. 카스파제 폴리펩티드의 비-제한적인 예시에는 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 11, 카스파제 12, 및 카스파제 14가 내포되어 있다. 바람직하게는, 상기 카스파제 폴리펩티드는 카스파제 9 폴리펩티드이다. 상기 카스파제 9 폴리펩티드는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드일 수 있다. 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드들은 비-자연 발생적일 수 있다. 상기 카스파제가 카스파제 9 또는 절두된 카스파제 9인 경우, 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드들 또한 "iC9 안전성 스위치"로 지칭될 수 있다.
유도성 카스파제 폴리펩티드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이때 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 측면들에서, 유도성 카스파제 폴리펩티드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드, 이때 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다.
상기 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12 (FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. FK506 결합 단백질 12 (FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 기 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 이 서열의 위치 36에 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 위치 36에서 페닐알라닌 (F)이 발린(V)으로의 치환 (F36V)일 수 있다. 상기 FKBP12 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 131에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 FKBP12 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 132에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다.
상기 링커 영역은 서열 식별 번호: 133에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 또는 상기 링커 영역은 서열 식별 번호: 134에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 링커를 인코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하고 있지 않다.
상기 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 이 서열의 위치 87에 아르기닌 (R)을 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 상기 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 이 서열의 위치 282에 알라닌 (A)을 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 135에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 136에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다.
폴리펩티드가 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 특정 측면들에서, 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 137에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 이 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 또는 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 138, 서열 식별 번호: 139, 또는 서열 식별 번호: 140에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다.
유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드는 세포에서 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드의 발현을 개시할 수 있고 및/또는 조절할 수 있는 당분야에 공지된 임의의 프로모터의 전사 조절 하에서 이 세포에서 발현될 수 있다.
유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드의 활성화는 예를 들어, 조건부로 조절되는 단백질 또는 폴리펩티드를 생성하기 위한 유도 작용제에 의해 매개되는 화학적으로 유도된 이량체화(CID)를 통해 달성될 수 있다. 사전-세포자멸성 폴리펩티드는 유도될 수 있고, 뿐만 아니라 불안정한 이량체화 작용제의 분해 또는 단량체 경쟁 억제제의 투여로 인해, 이들 폴리펩티드의 유도 또한 가역적이다.
상기 리간드 결합 영역이 위치 36에서 펜닐알라닌(F)을 발린(V)으로의 치환 (F36V)을 갖는 FKBP12 폴리펩티드를 포함하는 특정 측면들에서, 상기 유도 작용제는 AP1903, 합성 약물 (CAS 색인명: 2-피페리딘카르복실산, 1-[(2S)-1-옥소-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부틸]-, 1,2-에탄디일비스[이미노(2-옥소-2,1-에탄디일)옥시 -3,1-페닐렌[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로필리덴]]에스테르, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS 등록 번호: 195514-63-7; 분자식: C78H98N4O20; 분자량: 1411.65)); AP20187 (CAS 등록 번호: 195514-80-8 및 분자식: C82H107N5O20) 또는 AP20187 유사체, 이를 테면, 예를 들면, AP1510을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 유도 작용제 AP20187, AP1903 및 AP1510은 호환 이용될 수 있다.
유도성 사전-세포자멸성 펩티드들 및 이들 펩티드를 유도하는 방법들은 U.S. 특허 공개 번호 WO 2019/0225667 및 PCT 공개 번호 WO 2018/068022에서 상세하게 기술되어 있다.
키메라 자극제 수용체들 및 재조합 HLA-E 폴리펩티드들
임의의 환자들에게 투여하기에 "보편적으로" 안전한 입양 세포 조성물들은 동종반응성의 상당한 감소 또는 제거를 필요로 한다. 이를 위해, 본 명세서의 세포 (가령, 동종이계의 세포들)는 T-세포 수용체(TCR) 및/또는 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 클래스의 발현 또는 기능을 방해하도록 변형될 수 있다. 상기 TCR은 이식편 대 숙주(GvH) 반응을 중재하는 반면, 상기 MHC는 숙주 대 이식편(HvG) 반응을 중재한다. 바람직한 측면들에서, 상기 TCR의 임의의 발현 및/또는 기능은 대상체에게 사멸을 유발할 수 있는 T 세포 매개 GvH를 방지하기 위해 제거된다. 따라서, 선호되는 측면에서, 본 명세서는 순수 TCR-음성 동종이계의 T-세포 조성물을 제공한다 (가령, 상기 조성물의 각 세포는 탐지불가능하거나 비-존재하지 않는 수준까지의 낮은 수준으로 발현된다).
MHC 클라스 I (MHC-I, 특히, HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C)의 발현 및/또는 기능이 축소 또는 제거되어 HvG를 방지하고, 결과적으로 대상체의 세포들 생착이 개선된다. 개선된 생착으로 인해 세포의 지속성이 연장되고, 이에 따라 이 대상체에 대한 치료요법적 창은 더 커진다. 특히, MHC-I의 구조 요소인 베타-2-마이크로글로불린(B2M)의 발현 및/또는 기능이 축소되거나 제거된다.
상기 전략은 더 많은 문제를 야기한다. T 세포들에서 T 세포 수용체(TCR) 녹아웃(KO)은 TCR 복합체의 일부인 CD3-제타 (CD3z 또는 CD3ζ)의 발현 손실을 초래한다. TCR-KO T-세포들에서 CD3ζ의 손실은 효현제 항-CD3 mAb를 포함하지만, 이에 국한되지 않는 표준 자극/활성화 시약들을 사용하여 이들 세포를 최적으로 활성화시키고, 확장시키는 능력을 극적으로 감소시킨다. TCR 복합체의 임의의 한 구성 요소의 발현이나 기능이 중단된 경우, 상기 복합체의 TCR-알파 (TCRα), TCR-베타 (TCRβ), CD3-감마 (CD3γ), CD3-엡실론 (CD3ε), CD3-델타 (CD3δ), 및 CD3-제타 (CD3ζ)를 비롯한 모든 성분들이 상실된다. CD3ε 및 CD3ζ는 모두 T 세포 활성화 및 확장에 필요하다. 효현제 항-CD3 mAbs는 이들 복합체 내 주로 CD3ε를 인지하고, 가능한 또다른 단백질을 인지하고, 이어서 CD3ζ에게 신호를 보낸다. CD3ζ는 최적의 활성화 및 확장을 위해, T 세포 활성화 (2차 공동-자극 신호와 함께)에 대한 1차 자극을 제공한다. 정상적인 조건에서, 완전한 T-세포 활성화는 면역 반응을 부스팅시키는 하나 또는 그 이상의 공동-자극 수용체 (가령, CD28, CD2, 4-1BBL)에 의해 매개되는 두 번째 신호와 TCR의 결합에 따라 달라진다. 그러나, 상기 TCR이 존재하지 않는 경우, 효현제 항CD3 mAb를 포함한 표준 활성화/자극 시약들을 사용하여 자극하면, T 세포 확장이 심각하게 축소된다. 실제로, T 세포 확장은 작용제 항-CD3 mAb를 포함한 표준 활성화/자극 시약들을 사용하여 자극할 때, 정상적인 확장 수준에 비해 겨우 20-40%로 축소된다.
따라서, 본 명세서는 다음을 포함하는 비-자연 발생적 키메라 자극 수용체 (CSR)를 제공한다: (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토-도메인, 이때 상기 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 파생되며; (b) 막횡단 도메인; 그리고 (c) 적어도 하나의 신호 변환 도메인을 포함하는 엔도-도메인, 이때 상기 하나의 신호 변환 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 파생되며; 이때 상기 제1 단백질 및 상기 제2 단백질은 동일하지 않다.
상기 활성화 성분은 T-세포 수용체 (TCR)의 성분, TCR 복합체의 성분, TCR 공동-수용체의 성분, TCR 공동-자극 단백질의 성분, TCR 억제성 단백질의 성분, 사이토킨 수용체, 그리고 상기 활성화 성분의 효현제가 결합하는 케모킨 수용체 중 하나 또는 그 이상의 성분의 일부분을 포함할 수 있다. 상기 활성화 성분은 CD2 세포외 도메인 또는 효현제가 결합하는 그의 부분을 포함할 수 있다.
상기 신호 변환 도메인은 인간 신호 변환 도메인의 성분, T-세포 수용체 (TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 공동-수용체의 성분, TCR 공동-자극 단백질의 성분, TCR 억제성 단백질의 성분, 사이토킨 수용체, 및 케모킨 수용체 중 하나 또는 그 이상의 성분의 일부분을 포함할 수 있다. 상기 신호 변환 도메인은 CD3 단백질 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 상기 CD3 단백질은 CD3ζ 단백질 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다.
상기 엔도-도메인은 세포질 도메인을 더 포함할 수 있다. 상기 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 단리되거나 이로부터 유래될 수 있다. 상기 제1 단백질과 상기 제3 단백질은 동일한 것일 수 있다. 상기 엑토-도메인은 신호 펩티드를 더 포함할 수 있다. 상기 신호 펩티드는 제4 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기 제1 단백질과 상기 제4 단백질은 동일한 것일 수 있다. 상기 막횡단 도메인은 제5 단백질로부터 단리되거나 이로부터 유래될 수 있다. 상기 신호 펩티드는 제5 단백질로부터 유래될 수 있다.
일부 측면들에서, 상기 활성화 성분은 자연-발생적 분자에 결합하지 않는다. 일부 측면들에서, 상기 활성화 성분은 자연-발생적 분자에 결합하지만, 상기 CSR은 상기 활성화 성분이 자연-발생적 분자에 결합할 때, 신호를 변환시키지 않는다. 일부 측면들에서, 상기 활성화 성분은 비-자연 발생적 분자에 결합한다. 일부 측면들에서, 상기 활성화 성분은 자연-발생적 분자에 결합하지 않지만, 비-자연 발생적 분자에 결합한다. 상기 CSR은 상기 활성화 성분이 비-자연 발생적 분자에 결합할 때, 신호를 선택적으로 변환시킬 수 있다.
선호되는 측면에서, 본 명세서는 다음을 포함하는 비-자연 발생적 키메라 자극 수용체 (CSR)를 제공한다: (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토-도메인, 이때 상기 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 이의 일부분을 포함하고, 이때 상기 활성화 성분은 CD2 세포외 도메인 또는 효현제가 결합하는 이의 일부분을 포함하며; (b) 막횡단 도메인, 이때 상기 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인 또는 이의 일부분을 포함하고; 그리고 (c) 세포질 도메인과 적어도 하나의 신호 변환 도메인을 포함하는 엔도-도메인, 이때 상기 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 이의 일부분을 포함하고, 이때 상기 적어도 하나의 신호 변환 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 이의 일부분을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 비-자연적 CSR은 서열 식별 번호: 141에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 선호되는 측면에서, 상기 비-자연 발생적 CSR은 서열 식별 번호: 141의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서는 또한 비-자연 발생적 키메라 자극 수용체 (CSR)를 제공하며, 이때 상기 엑토-도메인은 변형을 포함한다. 상기 변형은 상기 활성화 성분 또는 상기 제1 단백질의 야생형 서열과 비교하였을 때, 상기 활성화 성분 또는 상기 제1 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 절두를 포함할 수 있다. 상기 활성화 성분의 아미노산 서열의 돌연변이 또는 이 서열의 절두는 CD2 세포외 도메인 또는 효현제가 결합하는 이의 일부분의 돌연변이 또는 절두를 포함할 수 있다. 상기 CD2 세포외 도메인의 돌연변이 또는 절두로 인한 결과로 자연 발생적 CD58과의 결합을 축소시키거나 없앨 수 있다. 일부 측면들에서, 돌연변이 또는 절두를 포함하는 상기 CD2 세포외 도메인은 서열 식별 번호: 142에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 선호되는 측면에서, 돌연변이 또는 절두를 포함하는 상기 CD2 세포외 도메인은 서열 식별 번호: 142의 아미노산 서열을 포함한다.
선호되는 측면에서, 본 명세서는 다음을 포함하는 비-자연 발생적 키메라 자극 수용체 (CSR)를 제공한다: (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토-도메인, 이때 상기 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 이의 일부분을 포함하고, 이때 상기 활성화 성분은 CD2 세포외 도메인 또는 효현제가 결합하는 이의 일부분을 포함하고, 이때 상기 CD2 세포외 도메인 또는 효현제가 결합하는 이의 일부분은 돌연변이 또는 절두를 포함하며; (b) 막횡단 도메인, 이때 상기 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인 또는 이의 일부분을 포함하고; 그리고 (c) 세포질 도메인 및 적어도 하나의 신호 변환 도메인을 포함하는 엔도-도메인, 이때 상기 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 이의 일부분을 포함하고, 이때 상기 적어도 하나의 신호 변환 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 이의 일부분을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 비-자연적 CSR은 서열 식별 번호: 143에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 사이의 임의의 백분율) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 선호되는 측면에서, 상기 비-자연 발생적 CSR은 서열 식별 번호: 143의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서는 본원에서 기재된 임의의 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 명세서는 본원에서 기재된 임의의 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존 또는 벡터를 제공한다.
본 명세서는 본원에서 기재된 임의의 CSR을 포함하는 세포를 제공한다. 본 명세서는 본원에서 기재된 임의의 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 본 명세서는 본원에서 기재된 임의의 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 본 명세서는 본원에서 기재된 임의의 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다.
본원에서 기재된 변형된 세포는 동종이계의 세포 또는 자가조직의 세포일 수 있다. 일부 선호되는 측면들에서, 상기 변형된 세포는 동종이계의 세포다. 일부 측면들에서, 상기 변형된 세포는 자가조직의 T-세포 또는 변형된 자가조직의 CAR T-세포다. 일부 선호되는 측면들에서, 상기 변형된 세포는 동종이계의 T-세포 또는 변형된 동종이계의 CAR T-세포다.
본 명세서는 본원에서 기재된 임의의 CSR을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 명세서는 본원에서 기재된 임의의 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 명세서의 조성물은 본원에서 기재된 임의의 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 명세서는 본원에서 기재된 임의의 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 명세서는 본원에서 기재된 변형된 세포를 포함하는 조성물 또는 본원에서 기재된 다수의 변형된 세포들을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 명세서는 다음을 포함하는 변형된 T 림프구 (T-세포)를 제공한다: (a) T-세포 수용체 (TCR)를 인코딩하는 내생성 서열의 변형, 이때 상기 변형으로 상기 TCR의 발현 또는 활성 수준은 축소 또는 사라지게 되며; 그리고 (b) 다음을 포함하는 키메라 자극 수용체 (CSR): (i) 엑토-활성화 성분을 포함하는 엑토-도메인, 이때 상기 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 유래되며; (ii) 막횡단 도메인; 그리고 (iii) 적어도 하나의 신호 변환 도메인을 포함하는 엔도-도메인, 이때 상기 적어도 하나의 신호 변환 도메인은 제2 단백질으로부터 단리되거나 유래되며; 이때 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질은 동일하지 않다.
상기 변형된 T-세포는 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 상기 변형된 T-세포는 베타-2-마이크로글로불린 (B2M)을 인코딩하는 내생성 서열의 변형을 더 포함할 수 있고, 이때 상기 변형으로 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클라스 I (MHC-I)의 발현 또는 활성 수준이 축소 또는 제거된다.
상기 변형된 T-세포는 HLA 클라스 I 조직적합성 항원, 알파 쇄 E (HLA-E) 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생적 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 상기 비-자연 발생적 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드를 더 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 상기 비-자연 발생적 폴리펩티드는 B2M 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 상기 비-자연 발생적 폴리펩티드는 링커를 더 포함할 수 있고, 이때 상기 링커는 상기 B2M 폴리펩티드와 상기 HLA-E 폴리펩티드 사이에 위치한다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 상기 비-자연 발생적 폴리펩티드는 펩티드 및 B2M 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 상기 비-자연 발생적 폴리펩티드는 상기 B2M 신호 펩티드와 상기 펩티드 사이에 제1 링커, 그리고 상기 B2M 폴리펩티드와 상기 HLA-E를 인코딩하는 펩티드 사이에 위치한 제2 링커를 더 포함할 수 있다.
상기 변형된 T-세포는 비-자연 발생적 항원 수용체, 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 더 포함할 수 있다. 상기 비-자연 발생적 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함할 수 있다.
상기 CSR은 상기 변형된 T-세포 내에서 일과적으로 발현될 수 있다. 상기 CSR은 상기 변형된 T-세포 내에서 안정적으로 발현될 수 있다. 상기 HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 상기 변형된 T-세포 내에서 일과적으로 발현될 수 있다. 상기 HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 상기 변형된 T-세포 내에서 인정적으로 발현될 수 있다. 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드는 상기 변형된 T-세포 내에서 일과적으로 발현될 수 있다. 상기 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드는 상기 변형된 T-세포 내에서 인정적으로 발현될 수 있다. 상기 비-자연 발생적 항원 수용체 또는 치료요법적 단백질을 인코딩하는 서열은 상기 변형된 T-세포 내에서 일과적으로 발현될 수 있다. 상기 비-자연 발생적 항원 수용체 또는 치료요법적 단백질을 인코딩하는 서열은 상기 변형된 T-세포 내에서 인정적으로 발현될 수 있다.
본원에서 상술된 바와 같이 dCas9-Clo051을 포함하는 RNA-유도된 융합 단백질들을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 유전자 편집 조성물들을 이용하여 내생성 T-세포 수용체를 표적으로 하고, 이의 발현을 감소시키거나, 없앨 수 있다. 바람직한 측면들에서, 상기 유전자 편집 조성물들은 내생성 T-세포 수용체를 인코딩하는 유전자, 유전자의 일부분, 또는 유전자의 조절 요소 (이를 테면, 프로모터)를 표적으로 하고, 이를 제거한다. TCR-알파 (TCR-α)를 표적으로 하고 이의 제거용으로, TCR-베타 (TCR-β)를 표적으로 하고 이의 제거용으로, 그리고 베타-2-마이크로글로불린 (β2M)을 표적으로 하고 이의 제거용으로 가이드 RNA (gRNA) 주형들을 만들기 위한 프라이머들 (T7 프로모터, 게놈 표적 서열, 및 gRNA 스캐폴드를 내포하는)은 PCT 출원 번호 PCT/US2019/049816에서 기재되어 있다.
dCas9-Clo051을 포함하는 RNA-유도된 융합 단백질들을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 유전자 편집 조성물들을 이용하여 내생성 MHCI, MHCII, 또는 MHC 활성자를 표적으로 하고, 이의 발현을 감소시키거나, 없앨 수 있다. 바람직한 측면들에서, 상기 유전자 편집 조성물들은 내생성 MHCI, MHCII, 또는 MHC 활성자의 하나 또는 그 이상의 성분들을 인코딩하는 유전자, 유전자의 일부분, 또는 유전자의 조절 요소 (이를 테면, 프로모터)를 표적으로 하고, 이를 제거한다. MHC 활성자들을 표적으로 하고 이를 제거하기 위한 가이드 RNAs (gRNAs)의 비-제한적인 예시들이 PCT 출원 번호 PCT/US2019/049816에서 기재되어 있다.
비-자연 발생적 키메라 자극 수용체들, TCR-알파 (TCR-α), TCR-베타 (TCR-β), 및/또는 베타-2-마이크로글로불린 (β2M)을 인코딩하는 내생성 서열들의 유전적 변형, 및 HLA 클라스 I 조직적합성 항원, 알파 쇄 E (HLA-E) 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생적 폴리펩티드의 상세한 설명은 PCT 출원 번호 PCT/US2019/049816에서 기재되어 있다.
제형, 투여량 및 투여 방식
본 명세서는 본원에 기재된 조성물들의 제형, 투여량 및 투여 방법들을 제공한다.
개시된 조성물들 및 약제학적 조성물들은 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 방부제, 보조제 및 이와 유사한 것들과 같은, 그러나 이에 국한되지 않는 임의의 적합한 보조제 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 수용가능한 보조제들이 선호된다. 이러한 멸균 용액의 비제한적인 예시 및 제조 방법은 이를 테면, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990 및 "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics (Montvale, N.J.) 1998에서 당업계에 잘 알려져 있다. 약제학적으로 수용가능한 담체들은 당업계에 잘 알려져 있거나, 본원에 기술된 바와 같이 단백질 스캐폴드, 단편 또는 변이체 조성물의 투여 방식, 용해도 및/또는 안정성에 적합한 관례적으로 선택될 수 있다.
사용하기에 적합한 약제학적 부형제 및 첨가제의 비제한적인 예에는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류 및 올리고당을 포함하는 당; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당류 및 이와 유사한 것들과 같은 유도체화된 당; 그리고 다당류 또는 당 중합체)이 내포되며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 존재할 수 있으며, 중량 또는 부피 기준으로 1-99.99%를 구성한다. 단백질 부형제의 비-제한적인 예시들에는 혈청 알부민, 이를 테면, 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 알부민 (rHA), 젤라틴, 카제인, 및 이와 유사한 것들이 내포된다. 완충액 효능에서 또한 기능을 할 수 있는 대표적인 아미노산/단백질 성분들에는 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐, 및 이와 유사한 것들이 내포된다. 한 가지 바람직한 아미노산은 글리신이다.
사용하기에 적합한 탄수화물 부형제의 비-제한적인 예시에는 단당류, 이를 테면, 과당, 맥아당, 갈락토스, 포도당, D-만노스, 소르보스, 및 이와 유사한 것들; 이당류, 이를 테면, 유당, 자당, 트레할로스, 셀로비오스, 및 이와 유사한 것들; 다당류, 이를 테면, 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분, 및 이와 유사한 것들; 그리고 알디톨, 이를 테면, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨(글루시톨), 미오이노시톨 및 이와 유사한 것들이 내포되어 있다. 바람직하게는, 상기 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스, 및/또는 라피노스이다.
상기 조성물들에는 완충액 또는 pH-조정 작용제가 또한 내포될 수 있고; 전형적으로, 상기 완충액은 유기산 또는 염기로부터 준비된 염이다. 대표적인 완충액에는 유기산 염, 이를 테면, 구연산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염; Tris, 트로메타민 염산염 또는 인산염 완충제들이 내포되어 있다. 바람직한 완충액은 유기산 염, 이를 테면, 구연산이다.
추가적으로, 개시된 조성물들에는 고분자 부형제/첨가제, 이를 테면, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(고분자 당), 덱스트레이트 (가령, 사이클로덱스트린, 이를 테면, 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향료, 항균제, 감미료, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제 (가령, 폴리소르베이트, 이를 테면 "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80"), 지질 (가령, 인지질, 지방산), 스테로이드 (가령, 콜레스테롤), 및 킬레이팅 작용제 (가령, EDTA)가 내포된다.
본원에 개시된 조성물 또는 약제학적 조성물의 치료요법적 유효량을 투여하기 위해 많은 공지되고 개발된 방식이 사용될 수 있다. 투여 방식의 비-제한적인 예시에는 볼루스, 협측, 주입, 관절내, 기관지내, 복강내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 소뇌내, 뇌실내, 복강내, 경추내, 위내, 간내, 병변내, 근육내, 심근내, 비강내, 안구내, 골내, 골내, 골반내, 심낭내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉부내, 자궁내, 종양내, 정맥내, 방광내, 경구, 비경구, 직장, 설하, 피하, 경피 또는 질 수단이 내포된다.
본 명세서의 조성물은 비경구 (피하, 근육내 또는 정맥내) 또는 특히 액체 용액이나 현탁액 형태의 임의의 기타 투여용; 특히 반고체 형태, 이를 테면, 크림과 좌약을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 형태로 질 또는 직장 투여용; 이를 테면, 정제 또는 캡슐을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 형태로 협측 또는 설하 투여용; 또는 이를 테면, 분말, 점비약, 에어로졸 또는 특정 작용제를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않은 형태로 비강내로; 또는 경피로, 이를 테면 피부 구조를 변형시키는 디메틸 설폭사이드, 또는 경피 패치의 약물 농도를 증가시키기 위한 현탁액 또는 화학적 강화제가 포함된(Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement;" Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994), 또는 단백질, 펩티드-함유 제제를 피부에 도포할 수 있는 산화제(WO 98/53847)가 포함된, 또는 일시적인 수송 경로를 생성하기 위한 전기장 적용, 이를 테면, 전기천공을 적용시키거나, 또는 피부를 통한 하전된 약물의 이동성을 증가시키기 위한, 이를 테면, 이온 영동 또는 초음파 적용, 이를 테면, 초음파영동 (U.S. 특허 번호 4,309,989 및 4,767,402)이 적용되나, 이에 국한되지 않는 젤, 연고, 로션, 패치 전달 시스템에 의한 경피 전달용으로 이용될 수 있다 (위의 간행물 및 특허는 참조로 전체 내용이 본 문서에 편입되어 있다).
비경구 투여를 위해, 본원에 개시된 임의의 조성물은 약학적으로 허용되는 비경구 비히클과 함께 용액, 현탁액, 에멀젼, 입자, 분말 또는 동결건조 분말로 제형화되거나 비경구 비히클과는 별도로 제공될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 일반적인 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성 오일, 수소화된 나프탈렌 및 이와 유사한 것들을 함유할 수 있다. 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 방법에 따라, 적절한 유화제 또는 가습제 및 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 주사용 작용제는 수용액, 멸균 주사용 용액 또는 용매 중 현탁액과 같은 무독성, 비경구 투여 가능한 희석제일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로는 물, 링거액, 등장성 식염수 등등이 허용되며; 일반용제나 현탁용제로는 멸균된 불휘발성 오일을 사용할 수 있다. 이러한 목적을 위해 천연, 합성 또는 반-합성 지방유 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드를 비롯한, 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산을 사용할 수 있다. 비경구 투여는 당업계에 공지되어 있으며, U.S. 특허 번호 5,851,198에 기술된 바와 같은 통상적인 주사 수단, 가스 압력-바늘없는 주사 장치, 및 U.S. 특허 5,839,446에 설명된 레이저 천공 장치를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
경구 투여용 제형은 장벽의 투과성을 인위적으로 증가시키기 위해 보조제(가령, 레조르시놀 및 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르와 같은 비이온성 계면활성제)의 병용-투여, 뿐만 아니라 효소 분해를 억제하기 위해 효소 억제제(가령, 췌장 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트(DFF) 및 트라실롤)를 병용 투여에 의존한다. 경구, 협측, 점막, 비강, 폐, 질 막횡단 또는 직장 투여용으로 의도된 단백질과 단백질 스캐폴드, 그리고 적어도 2종의 계면활성제의 조합이 내포된, 친수성 작용제의 전달을 위한 제형이 U.S. 특허 6,309,663에 기재되어 있다. 경구 투여용 고체-유형 투약형의 활성 구성 화합물에는 수크로스, 락토스, 셀룰로오스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 아르기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸스 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카세인, 알부민, 합성 또는 반-합성 중합체 및 글리세리드 중 적어도 하나와 혼합될 수 있다. 이들 투약형에는 또한 다른 유형의 첨가제(들), 윤활제, 가령, 불활성 희석제, 윤활제, 이를 테면, 스테아르산 마그네슘, 파라벤, 보존제, 이를 테면, 소르브산, 아스코르브산, .알파.-토코페롤, 항산화제 이를 테면, 시스테인, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 풍미제, 향료, 등등을 또한 함유할 수 있다.
정제와 알약은 장용-코팅 조제물로 추가 가공될 수 있다. 경구 투여용 액체 조제물에는 의료용으로 허용되는 유제, 시럽제, 엘릭서제, 현탁제, 및 액체 조제물이 내포되어 있다. 이들 조제물에는 전술한 분야에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 가령, 물을 함유할 수 있다. 리포좀은 인슐린과 헤파린의 약물 전달 시스템으로도 설명되었다 (U.S. 특허 번호 4,239,754). 최근에는, 혼합 아미노산(프로테노이드)의 인위적 중합체들의 미세구가 의약품 전달에 사용되었다 (U.S. 특허 번호 4,925,673). 또한, U.S. 특허 번호 5,879,681 및 U.S.특허 번호 5,871,753에서 기술된, 생물학적 활성 작용제들을 경구로 전달하는 데 사용되는 담체 화합물들이 해당 분야에 알려져 있다.
폐 투여의 경우, 바람직하게는 본원에 기술된 조성물 또는 약제학적 조성물은 폐 또는 부비강의 하부 기도에 도달하는 데 효과적인 입자 크기로 전달된다. 상기 조성물 또는 약제학적 조성물은 흡입에 의한 치료요법적 작용제의 투여를 위해, 당업계에 공지된 임의의 다양한 흡입 또는 비강 장치에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비강 또는 폐포에 에어로졸화된 제제를 침착시킬 수 있는 이러한 장치들에는 정량 흡입기, 분무기(가령, 제트 분무기, 초음파 분무기), 건조 분말 발생기, 분무기 및 이와 유사한 것들이 내포되어 있다. 이러한 모든 장치들에서 본원에 기술된 조성물 또는 약제학적 조성물을 에어로졸로 분배하기 위한 투여에 적합한 제형들이 이용될 수 있다. 이러한 에어로졸은 용액 (수성 용액 및 비-수성 용액 모두) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. 추가적으로, 본원에 기술된 조성물 또는 약제학적 조성물을 포함하는 스프레이는 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 현탁액 또는 용액을 압력 하에서 노즐을 통해 강제로 밀어냄으로써 만들어질 수 있다. 정량 흡입기(MDI)에서는 본원에 기술된 추진제, 조성물 또는 약제학적 조성물, 및 임의의 부형제 또는 기타 첨가제가 액화 압축 가스를 포함하는 혼합물로서 캐니스터(canister)에 함유되어 있다. 계량 밸브를 작동시키면 혼합물이 바람직하게는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm 크기 범위의 입자를 함유하는 에어로졸로서 방출된다. 폐 투여, 제제 및 관련 장치에 대한 더 자세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816에 개시되어 있다.
점막 표면을 통한 흡수를 위해, 조성물에는 다수의 미크론 미만 입자, 점막접착성 거대분자, 생활성 펩티드, 및 에멀젼 입자의 점막접착을 달성함으로써 점막 표면을 통한 흡수를 촉진하는 수성 연속상을 포함하는 에멀젼이 내포되어 있다 (U.S. 특허 번호 5,514,670). 본 명세서의 에멀젼의 적용에 적합한 점액 표면은 각막, 결막, 협측, 설하, 비강, 질, 폐, 위, 장 및 직장 투여 경로가 내포될 수 있다. 질 또는 직장 투여용 제제, 가령, 좌제는 부형제로서 예를 들어, 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 및 이와 유사한 것들을 함유할 수 있다. 비강내 투여를 위한 제형는 고체일 수 있고, 부형제로서 예를 들어, 락토스를 함유할 수 있거나 점비액의 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 구강 투여를 위한 부형제에는 설탕, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 전젤라틴화 전분 및 이와 유사한 것들이 내포되어 있다 (U.S. 특허 번호 5,849,695). 점막 투여 및 제형에 대한 더 자세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816에 개시되어 있다.
경피 투여를 위해, 본 명세서에 개시된 조성물 또는 약학 조성물은 리포솜 또는 중합체성 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐 또는 마이크로구체와 같은 전달 장치에 캡슐화된다(달리 명시하지 않는 한, 집합적으로 마이크로입자라고 함). 합성 중합체, 이를 테면, 폴리히드록시산, 이를 테면 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 이들의 공중합체, 폴리오르소에스테르, 폴리무수물 및 폴리포스파젠, 및 천연 중합체, 이를 테면 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 기타 단백질, 알기네이트 및 기타 다당류, 및 이들의 조합을 비롯한 중합체로 만들어진 마이크로입자를 포함한 다수의 적합한 장치들이 공지되어 있다 (U.S. 특허 번호 5,814,599). 경피 투여, 제제 및 적합한 장치에 대한 더 자세한 설명은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816에 개시되어 있다.
개시된 화합물을 장기간에 걸쳐, 예를 들어, 단일 투여로부터 1주 ~ 1년의 기간 동안 대상체에게 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 서방형, 데포형 또는 이식형 투여 형태를 활용할 수 있다. 예를 들면, 투여형은 예를 들어, 체액에 대한 용해도가 낮은 화합물의 약학적으로 허용되는 무독성 염을 함유할 수 있는데, 예를 들면, (a) 다염기산, 이를 테면, 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디-술폰산, 폴리갈락투론산 및 이와 유사한 것들을 갖는 산 부가 염; (b) 다가 금속 양이온, 이를 테면, 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 및 이와 유사한 것들을 갖는 염, 또는 가령, N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 영이온을 갖는 염; 또는 (c) (a)와 (b)의 조합, 가령, 탄산아연염을 함유할 수 있다. 추가로, 개시된 화합물 또는 바람직하게는 방금 기재된 것과 같은 상대적으로 불용성인 염은 주사에 적합한 겔, 예를 들어, 참깨유과 함께 모노스테아르산알루미늄 겔로 제형화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연염, 아연 탄네이트염, 파모에이트염 및 이와 유사한 것들이다. 주사용 서방성 데포(depot) 제형의 또 다른 유형은 느리게 분해되는 비-독성, 비-항원성 중합체, 이를 테면, U.S. 특허 번호 3,773,919에서 기술된 바와 같이, 예를 들어, 폴리락트산/폴리글리콜산 중합체에 캡슐화하기 위해 분산된 화합물 또는 염을 함유할 것이다. 상기 기재된 것과 같은 화합물 또는 바람직하게는 상대적으로 불용성인 염은 특히, 동물에 사용하기 위해 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛으로 제형화될 수도 있다. 추가의 서방형, 데포 또는 임플란트 제형, 가령, 기체 또는 액체 리포솜이 문헌에 공지되어 있다 (U.S. 특허 번호 5,770,222, 그리고 "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).
적합한 투여용량은 당업계에 잘 알려져 있다. 가령, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J. 참고. 바람직한 용량(doses)은 임의선택적으로, 투여당 약 0.1-99 및/또는 100-500mg/kg, 또는 이의 범위내 임의의 범위, 값 또는 분획이 내포되거나, 단일 또는 다중 투여당 혈청 ml 당 약 0.1-5000μg의 농도, 또는 이의 범위내 임의의 범위, 값 또는 분획의 혈청 농도를 달성하기 위한 용량이 내포될 수 있다. 본원에 개시된 조성물 또는 약제학적 조성물에 대한 바람직한 투여용량(dosage) 범위는 대상체 체중 당 약 1mg/kg, 최대 약 3, 약 6 또는 약 12mg/kg이다.
대안으로, 투여되는 투여용량은 알려진 인자들, 이를 테면, 특정 제제의 약력학적 특성, 투여 방식 및 경로; 수령인의 나이, 건강 및 체중; 증상의 성격과 정도, 병용치료의 종류, 치료횟수, 및 원하는 효과에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 활성 성분의 투여용량은 체중 kg당 약 0.1~100mg일 수 있다. 일반적으로, 투여당, 킬로그램당 0.1~50, 바람직하게는 0.1~10mg 또는 서방형이 원하는 결과를 얻는 데 효과적이다.
비-제한적인 예시로써, 단일, 주입 또는 반복 용량 투여를 이용하여, 일일 약 0.1 ~ 100mg/kg 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 이의 분획을 1-40일차 중 적어도 하루에, 또는, 대안으로 또는 추가적으로, 1-52주차 중 적어도 하나, 또는, 대안으로 또는 추가적으로, 1-20년 중 적어도 하나, 또는 이의 임의의 조합 중 하나의 기간 당, 본원에 기술된 상기 조성물들 또는 약제학적 조성물들의 일회 또는 주기적 투여용량으로써 인간 또는 동물 치료용으로 제공될 수 있다.
내부 투여에 적합한 제형은 일반적으로 단위(unit) 또는 용기당 약 0.001mg 내지 약 500mg의 활성 성분을 함유한다. 이들 제약 조성물에서, 상기 활성 성분은 일반적으로 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5-99.999 중량%의 양으로 존재할 것이다.
효과량은 단일 (가령, 볼루스), 다중 또는 연속 투여 당 약 0.001 내지 약 500mg/kg, 또는 본원에서 기재된 바와 같이, 또는 관련 분양 공지된 바와 같은 공지된 방법을 이용하여 실행하고 측정될 때, 단일, 다중 또는 연속 투여 마다, 혈청 ml 당 0.01-5000μg의 혈청 농도, 또는 이의 임의의 효과 범위 또는 이 범위 안의 값을 얻기 위한 양을 포함할 수 있다.
이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물이 본원에 기재된 변형된 세포들이 되는 측면들에서, 상기 세포들은 약 1x103 ~ 1x1015 세포; 약 1x104 ~ 1x1012 세포; 약 1x105 ~ 1x1010 세포; 약 1x106 ~ 1x109 세포; 약 1x106 ~ 1x108 세포; 약 1x106 ~ 1x107 세포; 또는 약 1x106 ~ 25x106 세포로 투여될 수 있다. 한 측면에서, 상기 세포들은 약 5x106 ~ 25x106 세포로 투여된다.
약제학적으로 수용가능한 부형제, 제형, 개시된 조성물들 및 약제학적 조성물들의 투여량 및 투여 방법은 PCT 공개 번호 WO 2019/049816에 개시되어 있다.
본 명세서의 상기 조성물들을 이용하는 방법들
본 명세서는 전위 활성을 개선시키기 위한 용도로 개시된 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 전위 활성에는 절제, 통합 또는 이의 조합이 내포될 수 있다. 특히, 상기 방법은 세포 또는 다수의 세포에 a) 제1 ITR 및 제2 ITR을 포함하는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 이때 상기 제1 ITR 및/또는 상기 제2 ITR은 핵산 치환을 포함하며; 그리고 b) 트란스포사제 효소를 인코딩하는 서열을 인코딩하는 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 상기 LE ITR에 상응한다. 일부 측면들에서, 상기 제2 ITR은 상기 RE ITR에 상응한다.
일부 측면들에서, 상기 핵산 치환은 상기 제1 ITR에 위치한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 핵산 위치 31 및 위치 33 중 적어도 하나에서 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 31G>T의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 33A>C의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 31G>T의 핵산 치환 및 33A>C의 핵산 치환을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 14의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 15의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 명세서의 상기 트랜스포존을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 야생형 제1 ITR (즉, LE ITR) 및 야생형 제2 ITR (즉, RE ITR)을 갖는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 절제를 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 증가시킨다.
한 측면에서, 본 명세서의 상기 트랜스포존을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 야생형 제1 ITR (즉, LE ITR) 및 야생형 제2 ITR (즉, RE ITR)을 갖는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 통합을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 증가시킨다.
한 측면에서, 본 명세서의 상기 트랜스포존을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 야생형 제1 ITR (즉, LE ITR) 및 야생형 제2 ITR (즉, RE ITR)을 갖는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 전위 활성을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 증가시킨다.
본 명세서는 개시된 조성물들 및 약제학적 조성물들을 이용하여 당분야에 공지된 또는 본원에서 기재된 바와 같이, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 대상체에서 질환 또는 장애 치료용으로 개시된 조성물 또는 약제학적 조성물의 사용, 가령, 상기 세포, 조직, 장기, 동물 또는 대상체에게 상기 조성물 또는 약제학적 조성물의 치료요법적 효과량을 접촉시키거나 또는 투여하는 용도를 제공한다. 한 측면에서, 상기 대상체는 포유류다. 바람직하게는, 상기 대상체는 인간이다. 대상 및 환자라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서는 세포, 조직, 장기, 동물 또는 대상체에서 적어도 하나의 악성 질환 또는 장애를 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 악성 질환은 암이다. 악성 질환 또는 장애의 비-제한적인 에시에는백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 림프구성 백혈병, B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 털세포백혈병, 골수이형성증후군(MDS), 림프종, Hodgkin 질환, 악성 림프종, 비-Hodgkin 림프종, Burkitt 림프종, 다발성 골수종, Kaposi 육종, 대장암종, 췌장암종, 비인두암종, 악성 조직구증, 부신생물증후군/악성 고칼슘혈증, 고형 종양, 방광암, 유방암, 대장암, 자궁내막암, 두부암, 경부암, 유전성 비용종증암, Hodgkin 림프종, 간암, 폐암, 비소세포폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암종, 고환암, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 골흡수, 암 관련 골통, 및 이와 유사한 것들이 내포되어 있다.
일부 측면들에서, 상기 악성 질환 또는 장애의 치료는 적응성 세포 요법을 포함한다. 예를 들면, 한 측면에서, 본 명세서는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 선택된 및/또는 확장된 적어도 하나의 개시된 단백질 스캐폴드 및/또는 단백질 스캐폴드 (가령, 본 명세서의 조성물과 함께 세포로 전달되는 scFv, 단일 도메인 항체, 센티린)을 포함하는 CAR을 발현시키는 변형된 세포를 제공한다. 변형된 세포들은 실온과 체온을 포함한 모든 온도에서 보관할 수 있도록 제형화될 수 있다. 변형된 세포들은 냉동보존 및 후속 해동을 위해 제형화될 수 있다. 변형된 세포들은 멸균 포장에서 대상체에게 직접 투여하기 위해 약학적으로 허용되는 담체로 제형화될 수 있다. 변형된 세포들은 최소 수준의 세포 기능 및 CAR 발현을 보장하기 위해, 세포 생존율 및/또는 CAR 발현 수준의 지표를 갖는 약학적으로 허용되는 담체에 제형화될 수 있다. 변형된 세포들은 추가 팽창을 억제하고, 및/또는 세포 사멸을 방지하기 위해 하나 또는 그 의 시약과 함께 처방된 밀도로 약학적으로 허용되는 담체에 제형화될 수 있다.
비-제한적인 예로써, 본 명세서는 대상체에서 대사성 간 장애를 치료하는 방법들을 제공하는데, 이 방법은 상기 대상체에게 다음을 투옇하는 단계를 포함한다: a) 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 본 명세서의 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 조성물의 적어도 하나의 치료요법적 효과량; 그리고 b) 적어도 하나의 트란스포사제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물의 적어도 하나의 치료요법적 효과량. 일부 측면들에서, 상기 대사성 간 장애는 오르니틴 트란스카르바밀라제 (OTC) 결핍일 수 있고, 상기 적어도 하나의 치료요법적 단백질은 오르니틴 트란스카르바밀라제 (OTC) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 대사성 간 장애는 메틸말론산혈증 (MMA)일 수 있고, 상기 적어도 하나의 치료요법적 단백질은 메틸말로닐-CoA 무타제 (MUT1) 폴리펩티드를 포함한다.
비-제한적인 예로써, 본 명세서는 대상체에서 혈우병질환을 치료하는 방법들을 제공하는데, 이 방법은 상기 대상체에게 다음을 투옇하는 단계를 포함한다: 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 본 명세서의 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 조성물의 적어도 하나의 치료요법적 효과량; 그리고 b) 적어도 하나의 트란스포사제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물의 적어도 하나의 치료요법적 효과량. 일부 측면들에서, 상기 혈우병질환은 혈우병 A일 수 있고, 상기 하나의 치료요법적 단백질은 인자 VIII을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 혈우병질환은 혈우병 B일 수 있고, 상기 적어도 하나의 치료요법적 단백질은 인자 IX를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 조성물 또는 약제학적 조성물의 효과량을 이러한 조정, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 장기, 동물 또는 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 방법은 이러한 질환 또는 장애를 치료하기 위한 공동-투여 또는 병용 요법을 임의선택적으로 더 포함할 수 있고, 이때 본원에 개시된 임의의 조성물 또는 약제학적 조성물의 투여는 적어도 하나의 화학치료요법 작용제 (가령, 알킬화제, 유사분열 억제제, 방사능치료제)의 투여 전, 투여후, 및/또는 동시 투여를 포함한다.
일부 측면들에서, 상기 대상체에서는 투여 후, 이식편 대 숙주(GvH) 및/또는 숙주 대 이식편(HvG)이 발생하지 않는다. 한 측면에서, 상기 투여는 전신투여다. 전신 투여는 당업계에 공지되어 있고, 본원에 상세히 기술된 임의의 수단일 수 있다. 바람직하게는, 전신 투여는 정맥 주사 또는 정맥 주입에 의해 이루어진다. 한 측면에서, 상기 투여는 국소투여다. 국소 투여는 당업계에 공지되어 있고, 본원에 상세히 기술된 임의의 수단일 수 있다. 바람직하게는, 국소 투여는 종양내 주사 또는 주입, 척수내 주사 또는 주입, 뇌실내 주사 또는 주입, 안구내 주사 또는 주입, 또는 골내 주사 또는 주입에 의해 이루어진다.
일부 측면들에서, 상기 치료요법적으로 효과적인 용량은 단일 용량이다. 일부 측면들에서, 상기 단일 용량은 제조되는 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100회 또는 이들 사이의 임의의 수의 용량 중 하나이다. 일부 측면들에서, 상기 조성물이 자가조직의 세포들 또는 동종이계의 세포들인 경우, 상기 용량은 질환 또는 장애를 치료하기에 충분한 시간 동안 세포가 생착 및/또는 지속되기에 충분한 양이다.
하나의 예시에서, 본 명세서는 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 단백질 스캐폴드, 또는 단백질 스캐폴드 (가령, scFv, 단일 도메인 항체, 센티린)를 포함하는 CAR, 종양 세포 상에 있는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 CAR을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 조성물이 변형된 세포 또는 세포 집단을 포함하는 측면들에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 자가조직의 세포 또는 동종이계의 세포일 수 있다.
본원에 개재된 치료 방법들의 일부 측면들에서, 상기 치료는 변형될 수 있거나, 종료될 수 있다. 구체적으로, 치료에 이용되는 조성물이 유도성 사전-세포자멸성 폴리펩티드를 포함하는 측면들에서, 상기 세포에 유도 작용체를 접촉시킴으로써 세포자멸이 선택적으로 유도될 수 있다. 치료는 예를 들어, 회복 징후 또는 질환 중증도/진행 감소 징후, 질환 완화/중단 징후 및/또는 부작용 발생에 반응하여 수정되거나 종료될 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 방법은 세포 치료법의 변형을 억제하기 위해 상기 유도 작용제의 억제제를 투여하고, 이로 인하여 상기 세포 요법의 기능 및/또는 효능 (예를 들면, 상기 질환의 징후나 증상이 다시 나타나거나 중증도가 증가하거나 부작용이 해결된 경우)이 복원되는 단계를 포함한다.
단백질 스캐폴드 생산, 스크리닝 및 정제
본 명세서의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드 (가령, 단클론 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, VHH, VH, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 센티린, 항원-결합 단편 (Fab) 또는 Fab 단편)는 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 선택적으로 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포 또는 불멸화 세포의 클론 집단에 의해 생산될 수 있다. 가령, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001) 참고.
단백질 스캐폴드의 아미노산은 당업계에 공지된 바와 같이, 면역 원성을 감소시키거나, 또는 결합, 친화력, 결합-속도 (on-rate), 해리-속도 (off-rate), 항원항체결합력, 특이성, 반감기, 안정성, 용해도 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소, 강화 또는 변형하는데 사용될 수 있다.
임의선택적으로, 단백질 스캐폴드는 항원에 대한 높은 친화력과 기타 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 조작될 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 스캐폴드 단백질은 모계 서열 및 조작된 서열의 3-차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 조작 생성물의 분석 과정에 의해 선택적으로 제조될 수 있다. 상기 3-차원 모델은 일반적으로 이용 가능하며 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3-차원 형태적 구조를 설명하고, 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하며, 그리고 가능한 면역원성을 측정할 수 있다 (가령, Immunofilter program of Xencor, Inc. of Monrovia, Calif.). 이러한 디스플레이의 검사는 후보 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 가령, 후보 단백질 스캐폴드가 이의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, 이를 테면, 상기 표적 항원(들)에 대한 친화성과 같은 원하는 특성이 달성되도록 모계 서열과 참조 서열로부터 잔기를 선택하고, 조합할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 위의 절차에 따라, 다른 적절한 엔지니어링 방법을 사용할 수 있다.
유사한 단백질 또는 단편에 대한 특이적 결합에 대한 단백질 스캐폴드의 스크리닝은 뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA 디스플레이) 또는 펩티드 디스플레이 라이브러리 예를 들면, 시험관 내 디스플레이)를 사용하여 편리하게 달성될 수 있다. 이 방법은 원하는 기능이나 구조를 가진 개별 구성원에 대한 대규모의 펩티드 컬렉션을 스크리닝하는 과정이 연루된다. 상기 디스플레이된 뉴클레오티드 서열 또는 펩티드 서열은 길이가 3 ~ 5000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산, 빈번하게는 5-100개 길이의 아미노산, 흔히 대략 8-25개 길이의 아미노산이 될 수 있다. 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 직접적인 화학적 합성 방법 외에도, 여러 가지 재조합 DNA 방법이 설명되었다. 한 가지 유형은 박테리오파지 또는 세포 표면에 펩티드 서열을 표시하는 것과 관련된다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 표시된 특정 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이러한 방법들은 PCT 특허 공개 번호 WO 91/17271, WO 91/18980, WO 91/19818, 및 WO 93/08278에 기재되어 있다.
펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 다른 시스템은 시험관 내 화학적 합성과 재조합 방법의 측면을 모두 갖고 있다. PCT 특허 공개 번호 WO 92/05258, WO 92/14843, 및 WO 96/19256 참고. 또한 U.S. 특허 번호 5,658,754; 및 5,643,768 참고. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 공급업자, 이를 테면, Invitrogen (Carlsbad, Calif.), 및 Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)에서 상업적으로 이용가능하다. 가령, Enzon의 U.S. 특허 번호 4,704,692, 4,939,666, 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030, 5,518,889, 5,534,621, 5,656,730, 5,763,733, 5,767,260, 5856456; Dyax의 5,223,409, 5,403,484, 5,571,698, 5,837,500, Affymax의 5,427,908, 5,580,717; Cambridge Antibody Technologies의 5,885,793; Genentech의 5,750,373, Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra의 5,618,920, 5,595,898, 5,576,195, 5,698,435, 5,693,493, 5,698,417; 또는 Sambrook, supra 참고.
본 명세서의 단백질 스캐폴드는 광범위한 친화성 (KD)으로 인간 또는 다른 포유동물 단백질에 결합할 수 있다. 선호되는 측면에서, 본 명세서의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드는 높은 친화력, 예를 들면, 이는 당업자가 실시하는 표면 플라스몬 공명 또는 Kinexa 방법에 의해 결정될 때, 약 10-7 M에 대등한 또는 이보다 낮은 KD, 이를 테면, 0.1-9.9 (또는 그 안의 임의의 범위 또는 값) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)로 표적 단백질에 임의선택적으로 결합할 수 있다.
항원에 대한 단백질 스캐폴드의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. (예를 들면, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); 그리고 본원에 기술된 방법들 참고). 특정 단백질 스캐폴드-항원 상호작용의 측정된 친화력은 상이한 조건 (가령, 염 농도, pH) 하에서 측정될 때 가변적일 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 항원-결합 매개변수 (가령, KD, Kon, Koff)의 측정은 바람직하게는, 단백질 스캐폴드 및 항원의 표준화된 용액, 그리고 본원에 기술된 완충액과 같은 표준화된 완충액을 사용하여 수행된다.
어떤 단백질, 항체 및 기타 길항제가 단백질 스캐폴드와 표적 단백질에 결합하기 위해 경쟁하고, 및/또는 에피토프 영역을 공유하는지 확인하기 위해, 단백질 스캐폴드를 사용하여 경쟁 분석을 수행할 수 있다. 당업자에게 쉽게 공지된 이들 검정은 단백질 상의 제한된 수의 결합 부위에 대한 길항제 또는 리간드 간의 경쟁을 평가한다. 경쟁 전 또는 후, 상기 단백질 및/또는 항체가 고정화 또는 불용화되고, 표적 단백질에 결합된 샘플은 결합되지 않은 시료와 분리되는데, 예를 들면, 디캔팅 (단백질/항체가 사전- 불용화되어 있는 경우) 또는 원심분리 (경쟁 반응 후, 단백질/항체가 침전된 경우)를 통해 분리된다. 또한, 상기 경쟁적 결합은 상기 표적 단백질에 대한 단백질 스캐폴드의 결합 또는 결합 결여에 의해 기능이 변경되는지 여부, 예를 들어, 상기 단백질 스캐폴드가 예를 들어, 라벨의 효소 활성을 억제하거나 강화하는지 여부에 의해 결정될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, ELISA 및 기타 기능 분석이 사용될 수 있다.
핵산 분자들
단백질 스캐폴드를 인코딩하는 본 명세서의 핵산 분자들은 복제를 통해 얻거나 합성하여 생산된, 또는 이들의 조합에 의해 획득된 RNA 형태, 이를 테면 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태, 또는 cDNA 및 게놈 DNA를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 DNA 형태일 수 있다. 상기 DNA는 삼중-가닥의, 이중-가닥의 또는 단일-가닥의, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 상기 DNA의 적어도 하나의 가닥 또는 RNA의 임의의 일부분은 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥일 수도 있거나, 안티-센스 가닥으로도 또한 지칭되는 넌-코딩 가닥일 수 있다.
본 명세서의 단리된 핵산 분자들에는 하나 또는 그 이상의 인트론을 갖는 오픈 리딩 프레임(ORF), 가령, 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 적어도 하나의 명시된 일부분을 갖는, 그러나 이에 국한되지 않는 핵산 분자들; 상기 표적 단백질에 결합하는 단백질 스캐폴드 또는 루프 영역에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자들; 그리고 상기 유전자 코드의 축중으로 인하여 상기 기재된 것과는 실질적으로 상이하지만, 그러나 단백질 스캐폴드 본원에서 기재된 바와 같이 및/또는 당분야에 공지된 것과 같이 단백질 스캐폴드를 여전히 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자들이 내포될 수 있다. 물론, 상기 유전적 코드는 당분야에 잘 공지되어 있다. 따라서, 본 명세서의 특정 단백질 스캐폴드를 코딩하는 이러한 축중성 핵산 변이체를 생성하는 것은 당업자에게 일상적인 일일 것이다. 가령, Ausubel, et al., supra 참고, 이러한 핵산 변이체들이 본 명세서에 내포되어 있다.
본원에 나타낸 바와 같이, 단백질 스캐폴드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 본 명세서의 핵산 분자들에는 단백질 스캐폴드 단편 자체의 아미노산 서열을 인코드하는 것들; 상기 전체 단백질 스캐폴드 또는 이의 일부분의 코딩 서열; 단백질 스캐폴드, 단편 또는 일부분 뿐만 아니라 추가 서열들, 이를 테면, 넌코딩 5' 서열 및 3' 서열을 비롯한 추가 넌코딩 서열과 함께 이를 테면, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예를 들면, 리보솜 결합 및 mRNA의 안정성)를 비롯하여 전사, mRNA 프로세싱에 역할을 하는 전사된, 해독되지 않은 서열, 전술한 추가 코딩 서열들, 이를 테면, 적어도 하나의 인트론을 갖는, 또는 이런 것들 없이 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열에 대한 코딩 서열; 추가 아미노산을 코딩하는 추가 코딩 서열, 이를 테면, 추가 기능을 제공하는 서열이 내포될 수 있다. 따라서, 상기 단백질 스캐폴드를 인코딩하는 서열은 마커 서열, 이를 테면, 단백질 스캐폴드 단편 또는 일부분을 포함하는 융합된 단백질 스캐폴드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 인코딩하는 서열에 융합될 수 있다.
본원에서 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드
본 명세서는 선택적 혼성화 조건 하에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 분리, 검출 및/또는 정량화에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드는 보관된 라이브러리에 있는 부분 또는 전장의 클론의 식별, 단리 또는 증폭에 사용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 포유류 핵산 라이브러리로부터 단리된 또는 그렇지 않으면, 이의 cDNA에 상보적인 게놈 서열 또는 cDNA 서열일 수 있다.
바람직하게는, 상기 cDNA 라이브러리는 전장 서열들의 적어도 80%의 서열, 바람직하게는, 전장 서열의 적어도 85% 또는 90%의 서열, 그리고 더욱 바람직하게는, 전장 서열의 적어도 95%의 서열을 포함한다. 상기 cDNA 라이브러리는 희귀 서열들의 현시를 증가시키기 위해 규정화될 수 있다. 낮거나 중간 정도의 엄격성 혼성화 조건은 일반적으로 상보적 서열에 비해 서열 동일성이 감소된 서열과 함께 사용되지만, 이에 국한되지는 않는다. 더 큰 동일성을 갖는 서열을 위해, 중간 및 높은 엄격성 조건이 임의선택적으로 사용될 수 있다. 낮은 엄격성 조건은 대략 70% 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적 혼성화를 허용하고, 이종성(orthologous) 또는 평행성(paralogous) 서열의 식별에 사용될 수 있다.
임의선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 단백질 스캐폴드의 적어도 일부를 인코드할 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 명세서의 단백질 스캐폴드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 선택적 혼성화를 위해 사용될 수 있는 핵산 서열이 포괄된다. 가령, Ausubel, supra; Colligan, supra, 참고, 이들 각각은 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입되어 있다.
핵산의 구축
본 명세서의 단리된 핵산들은 당분야에 공지된 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 및/또는 (d) 이의 조합을 이용하여 만들어질 수 있다.
상기 핵산들은 본 명세서의 폴리뉴클레오티드에 대해 추가적인 서열을 편의상 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중-클로닝 부위들이 상기 핵산에 삽입되어, 상기 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있다. 또한, 본 명세서의 상기 해독된 폴리뉴클레오티드의 단리에 도움이 되도록 해독가능한 서열들이 삽입될 수 있다. 예를 들면, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 명세서의 단백질을 정제시키기 위한 통상적인 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 명세서의 핵산은 임의선택적으로 본 명세서의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어뎁터, 또는 링커다.
이러한 클로닝 서열 및/또는 발현 서열에는 클로닝 및/또는 발현에서 기능을 최적화시키고, 상기 폴리뉴클레오티드의 단리를 지원하거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 세포로의 도입이 개선되도록 하기 위한 추가 서열들이 부가될 수 있다. 클로닝 벡터들, 발현 벡터들, 어뎁터들, 및 링커들의 용도는 당분야에 공지되어 있다. (가령, Ausubel, supra; 또는 Sambrook, supra 참고).
핵산 구축용 재조합 방법
본 명세서의 단리된 핵산 조성물들, 이를 테면 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이의 임의의 조합은 당업자에게 알려진 임의의 수의 클로닝 방법론을 사용하여 생물학적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 측면들에서, 엄격한 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 식별해내는 데 사용된다. RNA의 분리, cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축은 당업자에게 잘 알려져 있다. (가령, Ausubel, supra; 또는 Sambrook, supra 참고).
핵산 스크리닝 및 단리 방법
본 명세서의 폴리뉴클레오티드 서열을 기반으로 한, 프로브를 이용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리가 스크리닝될 수 있다. 프로브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화하여 동일하거나 상이한 유기체에서 상동성 유전자의 단리에 사용될 수 있다. 당업자는 다양한 정도의 혼성화 엄격성이 분석에 사용될 수 있음을 인지할 것이며; 혼성화 또는 세척 배지가 엄격할 수 있다. 혼성화 조건이 더욱 엄격해짐에 따라, 듀플렉스 형성이 발생하려면 상기 프로브와 표적 사이에 더 높은 수준의 상보성이 있어야 한다. 엄격함의 정도는 온도, 이온 강도, pH 및 포름아미드와 같은 부분 변성 용매의 존재 중 하나 또는 그 이상에 의해 제어될 수 있다. 예를 들면, 혼성화의 엄격성은 예를 들어, 0% ~ 50% 범위 내에서 포름아미드 농도 조작을 통하여, 반응물 용액의 극성을 변경함으로써 편리하게 변경된다. 검출가능한 결합에 필요한 상보성 (서열 동일성)의 정도는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격성에 따라 달라질 것이다. 상보성 정도는 최적으로 100%, 70-100% 또는 그 안의 모든 범위나 값이 될 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머의 미미한 서열 변화는 혼성화 및/또는 세척 배지의 엄격성을 감소시킴으로써 보상될 수 있음을 이해해야 한다.
RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 과도한 실험 없이 본 본 명세서에 따라 사용될 수 있다.
DNA 또는 RNA 증폭의 알려진 방법에는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 과정(가령, Mullis, et al.의 U.S. 특허 번호 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188; Tabor, et al의 U.S. 특허 번호 4,795,699 및 4,921,794; Innis의 U.S. 특허 번호 5,142,033; Wilson, et al.의 U.S. 특허 번호 5,122,464; Innis의 U.S. 특허 번호 5,091,310; Gyllensten, et al의 U.S. 특허 번호 5,066,584; Gelfand, et al의 U.S. 특허 번호 4,889,818; Silver, et al의 U.S. 특허 번호 4,994,370; Biswas의 U.S. 특허 번호 4,766,067; Ringold의 U.S. 특허 번호 4,656,134), 그리고 이중-가닥 DNA 합성을 위한 주형으로 표적 서열에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭 (상표명 NASBA와 함께, Malek, et al의 U.S. 특허 번호 5,130,238)이 포함되지만, 이에 국한되지는 않으며, 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입되어 있다 (가령, Ausubel, supra; 또는 Sambrook, supra. 참고).
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 서열 및 관련된 유전자를 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 증폭시킬 수 있다. PCR 및 기타 시험관내 증폭 방법은 예를 들어, 발현될 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하고, 핵산 시퀀싱 또는 다른 목적으로 샘플에서 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로 사용할 핵산을 만들 때 유용할 수 있다. 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자에게 지시하기에 충분한 기술의 예시들은 Berger, supra, Sambrook, supra, 및 Ausubel, supra, 뿐만 아니라 Mullis, et al., U.S. 특허 번호 4,683,202 (1987); 그리고 Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)에서 찾아볼 수 있다. 게놈 PCR 증폭을 위해 시판되는 키트는 해당 분야에 알려져 있다. 가령, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech) 참고. 추가적으로, 긴 PCR 산물의 수율을 향상시키는 데 가령, 상기 T4 유전자 32 단백질 (Boehringer Mannheim)을 사용할 수 있다.
핵산 구축을 위한 합성 방법
본 명세서의 단리된 핵산들은 당분야에 공지된 방법에 의한 직접적인 화학적 합성에 의해 또한 준비될 수 있다 (가령, Ausubel, et al., supra). 화학적 합성은 일반적으로 단일-가닥의 올리고뉴클레오티드를 생성하며, 이는 상보적 서열과의 혼성화에 의해 또는 단일 가닥을 주형으로 사용하는 DNA 중합효소와의 중합에 의해 이중-가닥의 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개 또는 그 이상의 염기 서열로 제한될 수 있지만, 더 짧은 서열을 결찰함으로써 더 긴 서열을 얻을 수 있다는 것을 인식할 것이다.
재조합 발현 카세트
본 명세서는 본 명세서의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 더 제공한다. 본 명세서의 핵산 서열, 예를 들면, 본 명세서의 단백질 스캐폴드를 인코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열을 이용하여 적어도 하나의 바람직한 숙주 세포로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 구축할 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도된 상기 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시할 전사 개시 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 명세서의 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 이종성 프로모터 및 비-이종성 (즉, 내생성) 프로모터는 모두 본 명세서의 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다.
일부 측면들에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향-조절 또는 하향-조절하기 위해, 프로모터, 인핸서 또는 다른 요소들로 작용하는 분리된 핵산들은 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 비이종 형태의 적절한 위치 (상류, 하류 또는 인트론 내)에 도입될 수 있다. 예를 들면, 내생성 프로모터는 돌연변이, 결손 및/또는 치환에 의해 생체내 또는 시험관내에서 변경될 수 있다.
발현 벡터들과 숙주 세포들
본 명세서는 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 본 명세서의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 재조합 벡터로 유전적으로 조작된 숙주 세포, 그리고 재조합 기술에 의한 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 생산에 또한 관계한다. 가령, Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra 참고, 이들 각각은 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입되어 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 숙주에서 증식을 위한 선택가능한 마커를 함유하는 벡터에 임의선택적으로 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 이를 테면, 인산칼슘 침전물로, 또는 하전된 지질과 복합체로 존재로 도입된다. 상기 벡터가 바이러스인 경우, 적절한 포장 세포주를 사용하여 시험관 내에서 포장한 다음, 숙주 세포로 형질도입할 수 있다.
상기 DNA 삽입물은 적절한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어야 한다. 상기 발현 구조체들은 전사 개시, 종료를 위한 부위 및 전사된 영역에서 해독을 위한 리보솜 결합 부위를 더 함유할 것이다. 상기 구조체에 의해 발현된 성숙한 전사체의 코딩 부분에는 바람직하게는 시작 부분에서 개시되는 해복 및 해독될 mRNA의 말단에 적절하게 위치하는 종료 코돈 (가령, UAA, UGA 또는 UAG)이 내포될 것이며, 포유류 또는 진핵 세포 발현용으로 UAA 및 UAG가 바람직하다.
발현 벡터들에는 바람직하게는, 그러나 임의선택적으로 적어도 하나의 선택가능한 마커가 내포될 것이다. 이러한 마커들에는 가령, 암피실린, 제오신 (Sh bla 유전자), 퓨로마이신 (pac 유전자), 하이그로마이신 B (hygB 유전자), G418/Geneticin (neo 유전자), DHFR (디히드로엽산 환원효소를 인코딩하고, 메토트렉세이트에 대해 저항성을 부여하는), 마이코페놀산, 또는 글루타민 합성효소 (GS, U.S. 특허 번호 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739), 블라스티시딘 (bsd 유전자), 진핵 세포 배양에 대한 저항 유전자, 뿐만 아니라 대장균 및 기타 박테리아 또는 원핵생물에서의 배양용 암피실린, 제오신 (Sh bla 유전자), 퓨로마이신 (pac 유전자), 하이그로마이신 B (hygB 유전자), G418/Geneticin (neo 유전자), 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리스로마이신, 폴리믹신 B, 또는 테트라사이클린 저항성 유전자들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다 (상기 특허들은 본원의 참고자료에 전문이 편입된다). 상기 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 벡터는 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 숙주 세포 내로 벡터 구조물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 양이온성 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 기타 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법들은 당분야, 이를 테면 Sambrook, supra, Chapters 1-4 및 16-18; Ausubel, supra, Chapters 1, 9, 13, 15, 16에 기재되어 있다.
발현 벡터들에는 본 명세서의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포들의 단리를 위한 적어도 하나의 선택가능한 세포 표면 마커가 바람직하게는, 그러나 임의선택적으로 내포될 것이다. 본 명세서의 선택가능한 세포 표면 마커들은 세포 또는 세포의 하위 집합을 다른 정의된 세포 하위 집합과 구별하는 표면 단백질, 당단백질 또는 단백질 그룹을 포함한다. 바람직하게는, 상기 선택가능한 세포 표면 마커는 본 개시내용의 조성물 또는 방법에 의해 변형된 세포를 본 개시내용의 조성물 또는 방법에 의해 변형되지 않은 세포와 구별한다. 이러한 세포 표면 마커들에는 예를 들어, "지정 클러스터(cluster of designation)" 또는 "분류 결정자(classification determinant)"(흔히 "CD" 약어로 불림) 단백질, 이를 테면, CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52의 절두 형 또는 전장 형, 또는 이의 임의의 조합이 내포되지만, 이에 국한되지는 않는다. 세포 표면 마커에는 자살 유전자 마커 RQR8 (Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87)이 더 내포된다.
발현 벡터들에는 본 명세서의 조성물 및 방법에 의해 변형된 약물 조헝송 마커가 바람직하게는, 그러나 임의선택적으로 내포될 것이다. 본 명세서의 선택가능한 약물 저항성 마커는 야생형 또는 돌연변이 Neo, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호 뿐만 아니라 추가적인 이종성 기능 영역도 내포될 수 있다. 예를 들어, 추가 아미노산 영역, 특히 하전된 아미노산을 단백질 스캐폴드의 N-말단에 추가시킴으로써, 정제 또는 후속 취급 및 보관 중에 숙주 세포의 안정성과 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하기 위해 펩티드 부분을 본 명세서 단백질 스캐폴드에 첨가할 수 있다. 이러한 영역은 단백질 스캐폴드 또는 이의 적어도 하나의 단편을 최종적으로 제조하기 전, 제거될 수 있다. 이러한 방법들은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 이를 테면 Sambrook, supra, Chapters 17.29-17.42 및 18.1-18.74; Ausubel, supra, Chapters 16, 17 및 18에 설명되어 있다.
당업자는 본 명세서의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 이용가능한 수많은 발현 시스템에 대해 잘 알고 있다. 대안으로, 명세서의 핵산은 본 명세서의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 내생성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 켜짐(조작에 의해)에 의해 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법들은 예를 들어, U.S 특허 번호 5,580,734, 5,641,670, 5,733,746, 및 5,733,761에 기술된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있고, 이들은 전문이 본원의 참고자료에 편입되어 있다.
단백질 스캐폴드, 특정 부분 또는 이의 변이체의 생산에 유용한 세포 배양의 예로는 당업계에 공지된 박테리아, 효모 및 포유동물 세포가 있다. 포유류 세포 시스템은 종종 세포 단층 형태이지만, 포유류 세포 현탁액이나 생물반응기도 사용될 수 있다. 무손상 글리코실화된 단백질을 발현시킬 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었으며, 여기에는 COS-1 (가령, ATCC CRL 1650), COS-7 (가령, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (가령, ATCC CRL-10), CHO (가령, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1 (가령, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포들, CHO 세포들, hep G2 세포들, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포들, HeLa 세포들 및 이와 유사한 것들이 있으며, 이는 예를 들어, American Type Culture Collection, Manassas, Va.(www.atcc.org)에서 쉽게 구할 수 있다. 바람직한 숙주 세포에는 골수종 및 림프종 세포와 같은 림프계 기원의 세포들이 내포된다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포 (ATCC 기탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포 (ATCC 기탁 번호 CRL-1851)이다. 선호되는 측면에서, 상기 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 세포 또는 SP2/0-Ag14 세포다.
이들 세포들을 위한 발현 벡터에는 다음의 발현 제어 서열들, 이를 테면, 복제 원점; 프로모터 (가령, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터 (U.S. 특허 번호 5,168,062; 5,385,839), HSV tk 프로모터, pgk (포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터 (U.S. 특허 번호 5,266,491), 적어도 하나의 인간 프로모터; 인헨서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 이를 테면, 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 (가령, SV40 거대 T Ag 폴리 A 부가 부위), 및 전사 종료 서열들 중 하나 또는 그 이상이 내포될 수 있다. 가령, Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra 참고. 본 명세서의 핵산 또는 단백질의 생산에 유용한 다른 세포는 공지되어 있고 및/또는, 예를 들어, American Type Culture Collection Catalog of Cell Lines and Hybridomas(www.atcc.org) 또는 기타 공지되거나 상업적인 공급처로부터 입수 가능하다.
진핵 숙주 세포가 사용되는 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 종결자 서열이 일반적으로 벡터에 통합된다. 종결자 서열의 예시는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다. 상기 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 시퀀스 또한 내포될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예시는 SV40의 VP1 인트론이다 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). 또한, 당업계에 공지된 바와 같이, 숙주 세포에서 복제를 제어하기 위한 유전자 서열을 벡터에 혼입시킬 수 있다.
단백질 스캐폴드 정제
단백질 스캐폴드는 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 잘 알려진 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")도 정제를 위해 사용될 수 있다. 가령, Colligan, Current Protocols in Immunology, 또는 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 가령, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10 참고, 각각은 전문이 본원의 참고자료에 편입된다.
본 명세서의 단백질 스캐폴드에는 예를 들어, 대장균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포를 비롯한, 원핵 숙주 또는 진핵 숙주로부터 정제된 생성물, 화학적 합성 과정의 생성물 및 재조합 기술에 의해 생산된 생성물이 내포된다. 재조합 생산 절차에 사용되는 숙주에 따라, 본 명세서의 단백질 스캐폴드는 글리코실화될 수 있거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 설명되어 있는데, 이를 테면, Sambrook, supra, Sections 17.37-17.42; Ausubel, supra, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 및 20, Colligan, Protein Science, supra, Chapters 12-14 참고, 전문이 본원의 참고자료에 편입된다.
아미노산 코드
본 명세서의 단백질 스캐폴드를 구성하는 아미노산은 종종 약어로 나타낸다. 아미노산 명칭은 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이, 단일 문자 코드, 3-문자 코드, 이름 또는 3개의 뉴클레오티드 코돈(들)에 의해 아미노산을 지정함으로써 표시될 수 있다 (Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, 제3 Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994 참고). 본 명세서의 단백질 스캐폴드는 본원에 명시된 바와 같이 자발적 또는 돌연변이 및/또는 인간 조작으로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 포함할 수 있다. 기능에 필수적인 본 명세서의 단백질 스캐폴드 내 아미노산은 부위 지정 돌연변이 유발 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다 (가령, Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). 후자의 절차는 분자의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그 다음 생성된 돌연변이 분자를 생물학적 활성, 예를 들어, 적어도 하나의 중화 활성에 대해 테스트되지만, 이에 국한되지 않는다. 단백질 스캐폴드 결합에 중요한 부위는 결정화, 핵자기공명 또는 광친화성 라벨링과 같은 구조 분석을 통해 식별할 수도 있다 (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) 및 de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 명세서에는 본 명세서의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 단백질 스캐폴드가 내포된다. 생물학적으로 활성인 단백질 스캐폴드는 고유의 (비-합성), 내생성 또는 관련된 그리고 공지의 단백질 스캐폴드의 특이적 활성의 적어도 20%, 30%, 또는 40%의 활성, 그리고 바람직하게는, 적어도 50%, 60%, 또는 70%의 활성, 그리고 가장 바람직하게는, 적어도 80%, 90%, 또는 95%-99% 또는 그 이상의 특이적 활성을 보유한다. 효소 활성 및 기질 특이성의 측정을 검정하고, 정량화하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 본원에서 기재된 바와 같이, 유기 모이어티의 공유적 부착에 의해 변형되는 단백질 스캐폴드 및 단편들에 관계한다. 이러한 변형은 향상된 약동학적 특성 (가령, 생체내 혈청 반감기 증가)을 갖는 단백질 스캐폴드 단편을 생성할 수 있다. 상기 유기 모이어티는 선형 또는 분지형 친수성 중합체 그룹, 지방산 그룹, 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 특정 측면에서, 친수성 중합체 그룹은 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고, 폴리알칸 글리콜 (가령, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 폴리머, 아미노산 폴리머 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 기는 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 명세서의 상기 변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 공유 결합된 하나 또는 그 이상의 유기 부분을 포함할 수 있다. 본 명세서의 단백질 스캐폴드 또는 단편에 결합된 각각의 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지방산"은 모노-카르복실산 및 디-카르복실산을 포괄한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친수성 중합체성 기"는 옥탄보다 물에 더 잘 용해되는 유기 중합체를 의미한다. 예를 들면, 폴리리신은 옥탄보다 물에 더 잘 녹는다. 따라서, 폴리리신의 공유 부착에 의해 변형된 단백질 스캐폴드가 본 명세서에 포괄된다. 본 명세서의 단백질 스캐폴드를 변형시키는데 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들면, 폴리알칸 글리콜 (가령, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), PPG 및 이와 유사한 것들), 탄수화물 (가령, 덱스트란, 셀룰로오스, 올리고당, 다당류 및 이와 유사한 것들), 중합체 친수성 아미노산 중합체 (가령, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르트산염 및 이와 유사한 것들), 폴리알칸 산화물 (가령, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌옥사이드 및 이와 유사한 것들) 및 폴리비닐피롤리돈이 내포될 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서의 단백질 스캐폴드를 변형시키는 친수성 중합체는 별도의 분자 엔터티로서 약 800 ~ 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들면, PEG5000 및 PEG20,000 (여기서 아래첨자는 중합체의 평균 분자량(달톤 단위)임)이 이용될 수 있다. 상기 친수성 중합체 그룹은 1개 ~ 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환된 친수성 중합체는 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 아민 기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트 (가령, N,N-카르보닐 디이미다졸로 활성화됨)는 중합체 상의 히드록실기에 커플링될 수 있다.
본 명세서의 단백질 스캐폴드를 변형시는데 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 또는 그 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 명세서의 단백질 스캐폴드를 변형시키는데 적합한 지방산에는 예를 들면, n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-에이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), 시스-Δ9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 모두 시스-Δ5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄디오산, 테트라데칸디오산, 옥타데칸디오산, 도코산디오산, 및 이와 유사한 것들이 내포된다. 적합한 지방산 에스테르에는 선형 또는 분지형 저급 알킬기를 포함하는 디카르복실산의 모노-에스테르가 내포된다. 저급 알킬 그룹은 1 ~ 약 12개, 바람직하게는 1 ~ 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
상기 변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 이를 테면, 하나 이상의 변형제와의 반응과 같은 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "개질제"는 활성화 기를 포함하는 적합한 유기 그룹 (가령, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 의미한다. "활성화 그룹"은 적절한 조건 하에서, 두 번째 화학 그룹과 반응하여 개질제와 두 번째 화학 그룹 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 화학적 엔터티 또는 작용 그룹이다. 예를 들면, 아민-반응성 활성화 그룹에는 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 (NHS) 및 이와 유사한 것들과 같은 친전자성 그룹이 내포된다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 그룹에는 예를 들어, 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤릴, 피리딜 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올 (TNB-티올) 및 이와 유사한 것들이 내포된다. 알데히드 작용기는 아민- 또는 히드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있고, 아지드 기는 3가의 인 기와 반응하여 포스포라미데이트 또는 포스포이미드 결합을 형성할 수 있다. 활성화기를 분자에 도입하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)). 활성화 그룹은 유기 그룹 (가령, 친수성 고분자, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접 결합될 수 있거나, 링커 모이어티, 예를 들면, 이가 C1-C12 그룹을 통하여 결합할 수 있고, 이때 하나 또는 그 이상의 탄소원자는 이종원소, 이를 테면, 산소, 질소 또는 황으로 대체될 수 있다. 적합한 링커 모이어티에는 예를 들면, 테트라에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- 및 -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-이 내포된다. 예를 들면, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 존재 하에서 유리 아민과 지방산 카르복실산염 사이에 아미드 결합이 형성되도록, 모노-Boc-알킬디아민 (가령, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 지방산과 반응시켜 아미드를 형성함으로써, 링커 모이어티를 포함하는 개질제가 생산될 수 있다. 설명된 바와 같이, 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 처리하여 또다른 카르복실산염에 커플링될 수 있는 일차 아민을 노출시킴으로써 Boc 보호기를 생성물에서 제거할 수 있거나, 말레산 무수물과 반응하여 생성된 생성물이 고리화되어 활성화된 지방산의 말레이미도 유도체를 생성할 수 있다. (예를 들면, Thompson, et al., WO 92/16221 참고, 이의 교시 내용은 본 명세서에 전문이 참고자료에 편입된다).
본 명세서의 상기 변형된 단백질 스캐폴드는 단백질 스캐폴드 또는 단편과 개질제를 반응시킴으로써, 만들어질 수 있다. 예를 들면, 상기 유기 모이어티는 아민-반응성 개질제, 예를 들어, PEG의 NHS 에스테르를 사용하여 비-부위 특이적 방식으로 단백질 스캐폴드에 결합될 수 있다. 본 명세서의 단백질 스캐폴드의 특정 부위에 결합된 유기 부분을 포함하는 변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 적합한 방법, 이를 테면, 역단백질분해(Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)) 및 Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)에 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
정의
본 명세서를 통하여 사용된 바와 같이, 단수형 관사("a", "and" 및 "the")는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 복수형이 내포된다. 따라서, 예를 들면, "방법"에 대한 언급은 이러한 방법의 복수를 포함하며, "용량(dose)"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 또는 그 이상의 용량 및 그 등가물에 대한 언급을 포함하는 등, 이러한 것이 적용된다.
용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용가능한 오차를 의미한며, 이는 어떻게 이러한 값이 측정되는 또는 결정되는 방법에 따라 부분적으로 의존적일 것이며, 예를 들면, 측정 시스템의 제약이 있을 것이다. 예를 들면, "약(about)"이란 1 또는 그 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안으로, "약"이란 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 이 용어는 값의 배수 이내, 바람직하게는 5-배 이내, 또는 더욱 바람직하게는 2-배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기술된 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약"이라는 용어는 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 것으로 추정해야 한다.
본 명세서는 단리된 또는 실질적으로 순수분리된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 조성물들을 제공한다. "단리된" 또는 "순수분리된" 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 또는 생물학적으로 활성인 이의 일부분이란 이의 자연 발생 환경에서 발견되는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 일반적으로 동반되거나 상호작용하는 성분이 실질적으로 없거나, 본질적으로 없음을 나타낸다. 따라서, 단리된 또는 순수분리된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질은 다른 세포의 물질이 실질적으로 없거나, 또는 재조합 기술에 의해 생산될 때 배양 배지가 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 최적으로, "단리된" 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드가 파생된 유기체의 게놈 DNA에서 자연적으로 폴리뉴클레오타이드(즉, 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부와 3' 단부에 위치하는 서열)의 측면에 있는 서열 (최적으로는 단백질 코딩 서열)이 없다. 예를 들면, 다양한 측면들에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드가 파생된 세포의 게놈 DNA에서 자연적으로 이 폴리뉴클레오티드의 측면에는 약 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb, 또는 0.1kb 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질에는 오염 단백질이 약 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1%(건조 중량 기준) 미만인 단백질 조제물이 내포된다. 본 명세서 단백질 또는 생물학적으로 활성인 이의 일부분이 재조합적으로 만들어질 경우, 최적의 배양 배지는 화학 전구체 또는 관심대상의 비-단백질적 화학 물질의 약 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1%(건조 중량 기준) 미만을 나타낸다.
본 명세서는 개시된 DNA 서열의 단편 및 변이체 그리고 이들 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질을 제공한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "단편"은 DNA 서열의 일부 또는 아미노산 서열의 일부 및 그에 따라 인코딩되는 단백질을 지칭한다. 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열의 단편들은 천연 단백질의 생물학적 활성 및 이에 따른 DNA 인식 또는 본원에 기술된 표적 DNA 서열에 대한 결합 활성을 유지하는 단백질 단편을 인코딩할 수 있다. 대안으로, 혼성화 프로브로서 유용한 DNA 서열의 단편들은 일반적으로 생물학적 활성을 유지하거나, 프로모터 활성을 유지하지 않는 단백질을 코딩하지 않는다. 따라서, DNA 서열의 단편들은 적어도 약 20개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드, 그리고 최대 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 전장 범위일 수 있다.
본 명세서의 핵산 또는 단백질은 최종 목적지 벡터로 조립될 수 있는 표적 벡터의 단량체 단위 및/또는 반복 단위를 사전 조립하는 것을 비롯하여, 모듈식 접근 방식으로 구축될 수 있다. 본 명세서의 폴리펩티드는 본 명세서의 단량체들의 반복을 포함할 수 있으며, 이후에 최종 대상 벡터로 어셈블리될 수 있는 표적 벡터의 반복 단위를 사전 조립하여, 모듈식 접근 방식으로 구성할 수 있다. 본 명세서는 이 방법에 의해 생산된 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 명세서는 이러한 모듈적 접근법을 생산하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 유기체 및 세포를 제공한다.
"항체"라는 용어는 특히 단일 단클론 항체 (작용제 및 길항제 항체를 비롯) 및 다중에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물을 포괄하여, 가장 넓은 의미로 사용된다. 본 명세서에 정의된 항체의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자, 상동체 및 오솔로그(본원에서는 집합적으로 "유사체"로 지칭함)를 사용하는 것도 본 명세서의 범위 내에 속한다. 따라서, 본 문서의 한 측면에 따르면, 가장 넓은 의미에서 "본 명세서의 항체"라는 용어는 이러한 유사체들도 포괄한다. 일반적으로, 이러한 유사체들에서, 본원에 정의된 항체와 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 교체, 삭제 및/또는 추가될 수 있다.
"항체 단편", 및 본원에서 사용된 이의 모든 문법적 변이들은 해당 무손상 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부분으로 정의되며, 이때 상기 일부분은 해당 무손상 항체의 Fc 영역의 중쇄 도메인 (즉, 항체 아이소타입에 따라 CH2, CH3, 및 CH4)이 없다. 항체 단편들의 예시에는 Fab, Fab', Fab'- SH, F(ab')2, 및 Fv 단편들; 디아바디(diabodies); 연접 아미노산 잔기들의 하나의 미중단 서열로 구성된 일차 구조를 갖는 폴리펩티드 ("단일-쇄 항체 단편" 또는 "단일 쇄 폴리펩티드"로 본원에서 지칭됨)인 임의의 항체 단편, 여기에는 (1) 단일-쇄 Fv (scFv) 분자들 (2) 오직 하나의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단일 쇄 폴리펩티드, 또는 연합된 중쇄 없이 경쇄 가변 도메인의 세 개 CDRs를 함유하는 이의 단편, 그리고 (3) 오로지 하나의 중쇄 가변 영역을 함유하는 단일 쇄 폴리펩티드 또는 연합된 경쇄 모이어티 없이, 중쇄 가변 영역의 세 개 CDRs를 함유하는 이의 단편; 그리고 항체 단편들로부터 형성된 다중-특이적 또는 다가-구조들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 하나 또는 그 이상의 중쇄들을 포함하는 항체 단편에서, 상기 중쇄(들)은 무손상 항체의 비-Fc 영역에서 발견되는 임의의 불변 도메인 서열 (가령, 상기 IgG 아이소타입에서 CHI)을 함유할 수 있고, 및/또는 무손상 항체에서 발견되는 임의의 힌지 영역 서열을 함유할 수 있고, 및/또는 상기 힌지 영역 서열 또는 상기 중쇄(들)의 불변 도메인 서열에 융합되거나 위치한 류신 지퍼 서열을 함유할 수 있다. 이 용어에는 단일 도메인 항체들 ("sdAB")이 더 내포되며, 이는 단일 단량체성 가변 항체 도메인 (예를 들면, 낙타의)을 갖는 항체 단편으로 일반적으로 지칭된다. 이러한 항체 단편 유형들은 당업자들이 곤란없이 이해할 것이다.
"결합"이란 거대분자들 간 (가령, 단백질과 핵산 사이) 서열-특이적, 비-공유적 상호작용을 지칭한다. 전체 상호작용이 서열-특이적이라면, 결합 상호작용의 모든 구성요소들이 서열-특이적일 필요는 없다 (가령, DNA 백본의 인산염 잔기와의 접촉).
"~을 포함하는"이라는 용어는 조성물 및 방법이 인용된 요소들을 내포되지만, 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미한다. 구성 및 방법을 정의하는 데 사용되는 "~로 본질적으로 구성되는"이란 의도된 목적으로 사용될 때, 조합에 필수적인 의미를 갖는 다른 요소를 제외하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 정의된 요소들로 본질적으로 구성된 조성물은 미량 오염물질 또는 불활성 담체를 배제하지 않을 것이다. "~로 구성된다"는 것은 다른 성분들의 미량 원소들과 실질적인 방법 단계들을 제외함을 의미한다. 이러한 이행 용어들 각각에 의해 정의된 측면들은 본 개시의 범위 내에 있다.
용어 "에피토프"란 폴리펩티드의 항원성 결정부위를 지칭한다. 에피토프는 이 에피토프에 독특한 공간 형태로 3개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 4개, 5개, 6개 또는 7개의 이러한 아미노산으로 구성되며, 더 일반적으로는 적어도 8개, 9개 또는 10개의 이러한 아미노산으로 구성된다. 아미노산의 공간 형태를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵자기 공명이 내포된다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 해독되는 과정을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현에는 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱이 내포될 수 있다.
"유전자 발현"이란 유전자에 함유된 정보를 유전자 산물로 변환시키는 것을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자 (가령, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, shRNA, 마이크로 RNA, 구조적 RNA 또는 기타 모든 유형의 RNA)의 직접적인 전사 산물이거나 mRNA의 해독에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 산물에는 프로세싱, 이를 테면, 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집에 의해 변형된 RNAs, 그리고 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질 또한 내포된다.
유전자 발현의 "조정(modulation)" 또는 "조절(regulation)"이란 유전자 활성의 변화를 지칭한다. 발현의 조정에는 유전자 활성화 및 유전자 억제가 내포될 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다.
용어 "작동적으로 연결된" 또는 그 등가적 표현 (가령, "작동적으로 연계된")이란 2개 또는 그 이상의 분자가 상호작용하여, 하나 또는 둘 모두의 분자 또는 이들의 조합에 기인하는 기능에 영향을 미칠 수 있도록 서로에 대해 위치함을 의미한다.
비-공유적으로 연계된 구성요소들, 그리고 비-공유적으로 연계된 구성요소들의 제조 및 사용 방법이 개시된다. 다양한 성분들 본 명세서에 설명된 바와 같이, 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 비-공유적으로 연계된 (즉, 작동적으로 연계된) 단백질은 일시적인 상호작용을 허용하여, 당업계에서 하나 또는 그 이상의 문제를 회피하는 사용될 수 있다. 단백질과 같은 비-공유적으로 연계된 구성요소들의 결합 및 해리 능력은 원하는 활성을 위해 이러한 결합이 필요한 상황에서만, 또는 주로 이러한 상황에서만 기능적 결합이 가능하게 한다. 상기 링키지는 원하는 효과를 허용하기에 충분한 지속 시간을 가질 수 있다.
유기체 게놈에서 특정 유전자좌로 단백질을 지향시키는 방법이 개시된다. 상기 방법은 DNA 국소화 성분을 제공하는 단계 및 작동체 분자를 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 상기 DNA 국소화 성분와 작동체 분자는 비-공유적 링키지를 통하여 작동적으로 연계될 수 있다.
용어 "scFv"란 단일-쇄 가변 단편을 지칭한다. scFv는 면역글로불린의 중쇄(VH)와 경쇄(VL)의 가변 영역들이 링커 펩티드에 의해 연결된 융합 단백질이다. 상기 링커 펩티드의 길이는 약 5개~40개 아미노산이거나, 약 10개~30개 아미노산이거나, 또는 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 또는 40개의 아미노산이다. 단일-쇄 가변 단편들은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 결여되고, 따라서, 공통적인 결합 부위 (가령, 단백질 G)를 정제시키는데 이용된다. 이 용어에는 세포의 세포질에 안정이며, 세포내 단백질에 결합할 수 있는 항체인, 인트라바디(intrabody)인 scFv가 추가로 내포된다.
용어 "단일 도메인 항체"는 특이적 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 단일 단량체성 가변 항체 도메인을 갖는 항체 단편을 의미한다. 단일-도메인 항체는 일반적으로 약 110개 아미노산 길이의 펩티드 쇄이며, 중쇄 항체, 또는 흔한 IgG의 하나의 가변 도메인(VH)를 포함하는데, 이는 일반적으로 전체 항체들과같이 항원에 대해 유사한 친화력을 보유하지만, 그러나 내열성이 더 뛰어나고, 세제 및 고농도 요소에 대해 더 안정적이다. 예로는 낙타나 물고기 항체에서 유래된 항체들이 있다. 대안으로, 단일-도메인 항체들은 4개의 쇄를 가진 일반적인 뮤린 또는 인간 IgG로 만들 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적으로 ~에 결합한다" 및 "특이적 결합"이란 다양한 항원의 균질한 혼합물에 존재하는 특정 항원에 우선적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 나노바디의 능력을 지칭한다. 일부 측면들에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플에서 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원을 구별할 것이다. 일부 측면들에서, 약 10-배 ~ 100-배 또는 그 이상 (가령, 약 1000-배 또는 10,000-배 이상). "특이성"이란 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편, 이를 테면, 나노바디가 상이한 항원 표적에 비해 하나의 항원 표적에 우선적으로 결합하는 능력을 의미하며, 반드시 높은 친화도를 의미하지는 않는다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다면, 결합 분자가 결합할 핵산의 일부를 정의하는 핵산 서열이다.
"핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 서로 공유적으로 연계된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 지칭한다. 단일 가닥의 묘사는 상보적 가닥 서열로 또한 정의된다. 따라서, 핵산은 표시된 단일 가닥의 상보적 가닥을 또한 포괄할 수 있다. 본 명세서의 핵산은 또한 동일한 구조를 유지하거나 동일한 단백질을 코딩하는 실질적으로 동일한 핵산 및 그의 상보체를 포괄한다.
본 명세서의 프로브는 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 단일 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서의 핵산은 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 지칭할 수 있다.
본 명세서의 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 본 명세서의 핵산은 분자의 대부분이 단일-가닥인 경우에도, 이중-가닥 서열을 함유할 수 있다. 본 명세서의 핵산은 이 분자의 대부분이 이중-가닥인 경우에도, 단일-가닥 서열을 함유할 수 있다. 본 명세서의 핵산에는 게놈 DNA, cDNA, RNA, 또는 이의 하이브리드가 내포될 수 있다. 본 명세서의 핵산은 데옥시리보-뉴클레오티드 및 리보-뉴클레오티드의 조합을 함유할 수 있다. 본 명세서의 핵산은 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 하이포크산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함한 염기의 조합을 함유할 수 있다. 본 명세서의 핵산은 비-천연 아미노산 변형을 포함하도록 합성될 수 있다. 본 명세서의 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본 명세서의 핵산, 이의 전체 서열 또는 이의 임의의 부분은 비-자연적으로 발생될 수 있다. 본 명세서의 핵산은 자연적으로 발생하지 않는 하나 또는 그 이상의 돌연변이, 치환, 결실 또는 삽입을 함유함으로써, 이 전체 핵산 서열이 비-자연적으로 발생되게 할 수 있다. 본 명세서의 핵산은 하나 또는 그 이상의 중복, 역위 또는 반복 서열을 함유할 수 있으며, 그 결과 해당 서열은 자연적으로 발생하지 않은 것으로, 이 전체 핵산 서열이 비-자연적으로 발생하게 된다. 본 명세서의 핵산은 자연적으로 발생하지 않는 변형, 인공 또는 합성 뉴클레오티드를 함유함으로써, 이 전체 핵산 서열이 비-자연적으로 발생하도록 할 수 있다.
유전자 코드의 중복성을 고려하면, 복수의 뉴클레오티드 서열이 임의의 특정 단백질을 인코딩할 수 있다. 이러한 모든 뉴클레오티드 서열들이 본원에서 고려된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "작동가능하게 연계된"이란 프로모터의 제어 하에 공간적으로 연결된 유전자의 발현을 지칭한다. 프로모터는 자신의 제어 하에 유전자의 5' (상류) 또는 3' (하류)에 배치될 수 있다. 프로모터와 유전자 사이에 거리는 프로모터 및 상기 프로모터가 유래되는 유전자에서 이것이 제어하는 유전자 사이에 거리와 대략 동일할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 향상시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 지칭한다. 프로모터는 발현을 더욱 증강하고, 및/또는 이의 공간 발현 및/또는 시간 발현을 변경하기 위해 하나 또는 그 이상의 특정한 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한, 원위(distal) 인핸서 또는 억제인자 원소를 포함할 수 있고, 이것은 전사의 출발 부위로부터 많게는 수천 개의 염기쌍으로서 위치될 수 있다. 프로모터는 바이러스, 세균, 진균, 식물, 곤충, 그리고 동물을 비롯한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 발생하는 세포, 조직 또는 장기에 대하여 또는, 발현이 발생하는 발달기에 대하여, 또는 외부 자극, 예를 들면, 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도제에 응하여 유전자 성분의 발현을 구조성으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 실례는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, EF-1 알파 프로모터, CAG 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
본 명세서를 통하여 사용된, 용어 "실질적으로 상보적"이란 제2 서열의 보체에 대해 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 서열을 지칭하거나, 또는 엄격한 혼성화 조건 하에서 두 서열이 혼성화되는 서열을 지칭한다.
본 명세서를 통하여 사용된, 용어 "실질적으로 동일한"이란 제1 서열과 제2 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한, 또는 핵산의 경우, 제1 서열이 제2 서열의 보체에 대해 실질적으로 동일하다면 이들은 실질적으로 동일하다라고 지칭한다.
본 명세서를 통하여 사용된, 핵산을 기술하는데 이용될 경우, 용어 "변이체"란 (i) 참조된 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 부분의 보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 보체와 실제적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 이의 보체, 또는 이와 실제적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산을 지칭한다.
본 명세서를 통하여 사용된, 용어 "벡터"란 복제 원점을 힘우하는 핵산 서열을 지칭한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 세균 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 벡터 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자기 복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는, DNA 플라스미드이다. 벡터는 아미노산과 DNA 서열, RNA 서열, 또는 DNA와 RNA 서열 모두의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서를 통하여 사용된, 펩티드 또는 폴리펩티드를 기술하는데 이용될 경우, 용어 "변이체"란 아미노산의 삽입, 결손, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 그러나 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체는 또한, 최소한 하나의 생물학적 활성을 유지하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실제적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다.
아미노산의 보존성 치환, 다시 말하면, 아미노산을 유사한 성질 (가령, 하전된 영역의 친수성, 정도와 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 경미한 변화를 전형적으로 수반하는 것으로 당분야에서 인식된다. 당분야에서 인지되는 바와 같이, 이러한 작은 변화는 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)를 고려하여 부분적으로 확인될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). 아미노산의 소수성 지수는 이 아미노산의 소수성 및 전하를 근거로 한다. 유사한 수치 지수의 아미노산이 치환될 수 있고, 단백질 기능을 여전히 유지할 수 있다. 한 측면에서, ±2의 수치 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성 역시 생물학적 기능을 유지하는 단백질을 유발하는 치환을 드러내는데 이용될 수 있다. 펩티드의 문맥에서 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 충분히 상관하는 것으로 보고된 유용한 척도인, 펩티드의 최대 국부 평균 친수성의 계산을 허용한다. U.S. 특허 번호 4,554,101, 이는 본원에 전문이 참고자료로 편입된다.
유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들면, 면역원성을 유지하는 펩티드를 유발할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내에 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수와 친수성 값 모두 아미노산의 특정 측쇄에 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일관되게, 생물학적 기능과 양립가능한 아미노산 치환은 아미노산의 관련 유사성에 의존적이며, 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 성질에 의해 드러나는 것과 같이, 이들 아미노산의 측쇄에 의존적인 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "보존적" 아미노산 치환은 하기 표 A, B, 또는 C에서 제시된 바와 같이, 정의될 수 있다. 일부 측면들에서, 융합 폴리펩티드 및/또는 이러한 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들에는 본 명세서의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변형에 의해 도입된 보존적 치환이 내포되어 있다. 아미노산은 물리적 특성과 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여도에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산을 유사한 성질을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 예시적인 보존적 치환은 표 A에서 제시된다.
표 A -- 보존적 치환 I
대안적으로, 보존적 아미노산은 표 B에 제시된 바와 같이 Lehninger, (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY, NY (1975), pp. 71-77)에 설명된 대로 그룹화될 수 있다.
표 B -- 보존적 치환 II
대안적으로, 예시적인 보존적 치환은 표 C에서 제시된다.
표 C -- 보존적 치환 III
본 명세서의 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 하나 또는 그 이상의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 이들의 임의의 조합, 뿐만 아니라 아미노산 잔기들의 삽입, 결실 또는 치환 이외의 변형을 보유하는 폴리펩티드들이 내포되도록 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서의 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 또는 그 이상의 보존적 치환을 함유할 수 있다.
본 명세서를 통하여 사용된, 용어 전술한 아미노산 치환의 "하나 이상"이란 언급된 아미노산 치환이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 또는 그 이상임을 지칭한다. 용어 "하나 이상"이란 언급된 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환을 지칭한다.
본 명세서의 폴리펩티드 및 단백질, 이의 전체 서열 또는 이의 임의의 부분은 비-자연적으로 발생될 수 있다. 본 명세서의 폴리펩티드 및 단백질 자연적으로 발생하지 않는 하나 또는 그 이상의 돌연변이, 치환, 결실 또는 삽입을 함유함으로써, 이 전체 아미노산 서열이 비-자연적으로 발생되게 할 수 있다. 본 명세서의 폴리펩티드 및 단백질은 하나 또는 그 이상의 중복, 역위 또는 반복 서열을 함유할 수 있으며, 그 결과 해당 서열은 자연적으로 발생하지 않은 것으로, 이 전체 아미노산 서열이 비-자연적으로 발생하게 된다. 본 명세서의 폴리펩티드 및 단백질은 자연적으로 발생하지 않는 변형, 인공 또는 합성 아미노산을 함유함으로써, 이 전체 아미노산 서열이 비-자연적으로 발생하도록 할 수 있다.
본 명세서를 통하여 사용된, "서열 동일성"은 2개의 서열(bl2seq)을 블라스팅시키기 위한 독립형(stand-alone) 실행 가능 BLAST 엔진 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 이는 기본 매개변수를 사용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information) ftp 사이트에서 검색할 수 있다. (Tatusova and Madden, FEMS 마이크로biol Lett., 1999, 174, 247-250; 이는 전체 내용이 참조로 본원에 내포된다). 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 사용되는 경우 "동일한" 또는 "동일성"이라는 용어는 각 서열의 특정 영역에 걸쳐 동일한 특정 비율의 잔기를 의미한다. 상기 백분율은 두 서열을 적절하게 배열하고, 명시된 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하고, 정합된 위치의 숫자를 얻기 위하여 두 서열 모두에서 동일한 잔기가 있는 위치들의 수를 파악하고, 명시된 영역에서 전체 위치 수를 정합되는 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 얻음으로써, 산출될 수 있다. 두 서열의 길이가 상이한 경우 또는 배열이 어긋난 단부(staggered ends)를 만들고, 명시된 비교 영역에 오직 하나의 서열을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기들은 분모에 포함되고, 산출 분자에 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민 (T)과 우라실 (U)은 등가인 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수작업으로 실행되거나 또는 컴퓨터 서열 알고리즘, 이를 테면 BLAST 또는 BLAST 2.0를 이용하여 실행될 수 있다.
본 명세서를 통하여 사용된, "내생성"이란 용어는 표적 유전자 또는 이것이 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 결합된 핵산 또는 단백질 서열을 의미한다.
본 명세서를 통하여 사용된, "외생성"이란 용어는 표적 유전자 또는 이것이 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 결합된 핵산 또는 단백질 서열을 의미하는데, 자연 발생 핵산, 예를 들어, DNA 서열, 또는 비-자연 발생 게놈 위치에 위치한 자연 발생 핵산 서열의 비-자연 발생적 다수 복사체들이 내포된다.
본 명세서는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체를 숙주 세포 내로 도입시키는 방법들을 제공한다. "도입하는"이란 구조체가 숙주 세포의 내부에 접근할 수 있는 방식으로 상기 폴리뉴클레오티드 구조체를 세포에 제시한다는 것을 의도한다. 본 명세서의 방법은 폴리뉴클레오티드 구성물을 숙주 세포에 도입하기 위한 특정 방법에 의존하지 않으며, 단지 폴리뉴클레오티드 구조체가 숙주의 한 세포 내부에 접근한다는 점에서만 상이하다. 폴리뉴클레오티드 구조체를 박테리아, 식물, 진균 및 동물에 도입하는 방법은 안정한 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법 및 바이러스 매개 방법을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 당업계에 공지되어 있다.
실시예
실시예 1: PiggyBac 매개된 전위를 향상시키는 트랜스포손의 ITR 영역 내 돌연변이 식별
돌연변이 PiggyBac (PB) 트랜스포존 라이브러리는 PB 트랜스포사제 또는 Super PiggyBac(SPB) 트랜스포사제 매개 전이의 증가를 제공하는 트랜스포존의 ITR 영역 내 돌연변이를 식별하는 것을 목표로 설계되었다. 증가된 전위 활성을 갖는 돌연변이를 스크리닝하기 위해, 세포를 PB 트랜스포사제 및 본원에 개시된 다양한 돌연변이 라이브러리로부터의 돌연변이 ITR 서열을 함유하는 PB 트랜스포존 풀로 공동 형질감염시켰다. 모든 돌연변이체들은 PB 트랜스포존으로 클로닝되었다(도 1에 나타냄). PuroR은 선별용으로 사용되었고, GFP는 시각화 및 정량화에 사용되었다. 게놈으로 통합되는 유익한 또는 중립 돌연변이가 있는 PB 트랜스포존을 선택하고, 통합에 실패한 플라스미드가 있는 세포를 14일 동안 세포를 계대배양하여 고갈시켰다. 링커 매개된 (LM)-PCR을 사용하여 돌연변이를 포함하는 ITR 서열을 포획하고 식별했다. 분석에 통합된 트랜스포존만 포함되어 있는지 확인하기 위해 게놈 접합이 LM-PCR 분석에 내포되었다.
LE ITR의 DDBD 결합 부위 라이브러리
LE ITR의 이량체화 및 DNA 결합 도메인 (DDBD) 결합 부위 주변의 13bp 창의 단일 염기쌍 치환 돌연변이가 제1 라이브러리 기획 (즉, "DDBD 라이브러리")에서 조사되었다 (도 2A). 13bp 창의 각 위치는 단독으로 또는 조합하여, 돌연변이를 일으켜 6,700만 개의 가능한 돌연변이를 생성할 수 있다. DDBD 라이브러리를 생성하기 위해, 6,700만 개의 가능한 돌연변이 중에서 100만 개의 돌연변이의 무작위 하위 집합이 생성되었다. LE ITR의 DDBD 결합 부위 주변의 13개 염기쌍 각각의 풍부화도 점수를 분석한 결과, 상기 야생형 뉴클레오티드가 항상 가장 많이 풍부한 것은 아니라는 사실이 나타났다 (도 2B).
LE ITR 및 RE ITR의 치환, 삽입, 결손 및 조합 돌연변이성 라이브러리
트랜스포존의 5' 좌측 단부 ITR (즉, "5' 말단 라이브러리" 또는 "5' 좌측 반복 라이브러리"), 상기 5' 내부 반복된 영역 (즉, "내부 반복 라이브러리" 또는 "5' 내부 라이브러리") 및 3' 우측 단부 ITR (즉, 3' 단부 라이브러리" 또는 3' 좌측 반복 라이브러리")의 치환, 삽입, 결손 돌연변이는 다음 라이브러리 기획에서 조사되었다 (도 3). 각 위치에서 1bp, 2bp 또는 3bp 치환, 결실 또는 삽입 돌연변이를 생성하여, 이들 세 영역 각각에 대해 돌연변이 라이브러리를 준비했다 (도 4). 상기 5' 좌측 단부 반복된 영역, 5' 및 3' 우측 단부 반복된 영역 돌연변이성 라이브러리에 대해 각 라이브러리의 구성과 돌연변이의 다양성 및 개수는 차례로 표 3, 4 및 5에 나타낸다.
표 3. 5' 단부 돌연변이성 라이브러리의 조성물 및 다양성
표 4. 5' 내부 돌연변이성 라이브러리의 조성물 및 다양성
표 5. 3' 단부 돌연변이성 라이브러리의 조성물 및 다양성
상기 5' 단부, 5' 내부 및 3' 단부 라이브러리로부터 1bp, 2bp 및 3bp 결손 돌연변이들을 전위 활성에 대해 테스트하였다 (도 5). 13bp 반복 영역 내의 삭제와 반복 사이의 링커는 허용되지 않는다. 19bp 반복 영역은 다양한 유형의 삭제를 용인한다 그러나, 결실이 거의 없는 것은 전위에 도움이 되는 것으로 보인다. 내부 "ITR 유사" 영역 내의 삭제는 중립적이다.
상기 5' 단부, 5' 내부 및 3' 단부 라이브러리로부터 삽입 돌연변이를 전위 활성에 대해 테스트하였다 (도 6). 전반적으로, 삽입은 13bp 반복 영역 내에서 해롭고, 내약성이 좋지 않았다. 19bp 반복 영역과 내부 ITR-유사 영역에 삽입하면, 중립 효과가 더 커졌다. 그러나, 결실이 거의 없는 것은 전위에 도움이 되는 것으로 보인다. 전반적으로, 트랜스포존의 LE ITR 또는 RE ITR 영역 내의 삽입 및 결실은 대부분 해롭고 전치 활동을 개선할 가능성이 낮다.
상기 5' 단부, 5' 내부 및 3' 단부 라이브러리로부터 치환 돌연변이를 전위 활성에 대해 테스트하였다 (도 7). 5' 단부의 13bp 반복 영역과 3' 단부의 일부 내에서는 치환이 용인되었다. 특정 치환은 5' 단부의 13bp 반복 영역 내에 강화되었다. 전반적으로, 1bp 치환은 잘 용인되었다. 그러나, 5' 단부와 3' 단부에서는 풍부화도의 차이가 관찰되었다. 전반적으로, 돌연변이는 내부 "ITR-유사" 영역보다 5' 및 3' ITR 영역들에서 더 극단적인 영향을 미친다. 13bp 반복 영역 내의 돌연변이는 19bp 반복 영역 내의 돌연변이보다 더 강한 효과를 나타낸다.
돌연변이 ITR 라이브러리
전위 활성을 향상시키는 치환 돌연변이 및 조합 치환 돌연변이를 추가로 조사하기 위해, 5' 단부 및 3' 단부 라이브러리의 3bp 치환 돌연변이를 테스트했다. 좌측 단부 ITR 돌연변이성 라이브러리 (LE ITR) (라이브러리 5 - 1888개 돌연변이) 및 우측 단부 ITR (RE ITR) 돌연변이성 라이브러리 (라이브러리 6 - 3232개 돌연변이)에 대응하는 두 라이브러리를 만들었다 (도 8). 돌연변이 라이브러리를 생성하기 위해, 삼량체 치환의 64가지 다른 조합을 생성시켰고, LE ITR 및 RE ITR의 각 위치에서 대체했다. 라이브러리에는 ITRs의 TTAA 위치에서의 돌연변이들은 배제되었다.
누적된 풍부화도 점수는 ITRs의 각 위치에 대해 분석되었으며, 스크리닝에서 LE ITR 및 RE ITR 모두 많은 위치들에서 풍부하였다 (도 9A 및 9B). 그러나, LE ITRs과 RE ITRs 간에는 다른 경향이 관찰되었다.
상기 LE ITR에서, PB 트랜스포사제의 제1 CRD 단량체 (가령, CRD1)의 예상된 결합 위치는 돌연변이를 허용하지 않았다. 그러나, 제2 CRD 단량체 (가령, CRD2)에 대한 예상 결합 위치는 돌연변이에 내성이 있었다. 예기치 않게, DDBD 도메인 (가령, DDBD1 및 DDBD2)의 예상 결합 부위 내의 대부분의 돌연변이가 강화되었다. 이는 LE ITR의 특정 위치 내의 돌연변이가 더 높은 전위 활성에 기여하는 반면, 대부분의 다른 위치는 전위 활성에 유해하다는 것을 암시한다.
RE LTR에서, ITR의 TTAA 위치에 인접한 PB 트랜스포사제의 예상 결합 위치는 위치 4~6을 제외하고는 돌연변이에 내성이 없었다. 2개의 PB 트랜스포사제 결합 부위 사이의 ITR의 스페이서 영역 내에서 예상되는 서열 특이적 상호작용은 없으며, 이 스페이서 영역은 돌연변이를 용인하였다. 상기 제2 PB 트란스포사제 이량체 결합 부위에 대한 경향은 덜 명확했다.
이차 돌연변이 ITR 라이브러리
위에서 설명한 LE ITRs 라이브러리 및 RE ITRs 라이브러리의 각 3bp 창에 대해 가장 높은 풍부화도 점수를 가진 상위 3개 히트(hits)를 사용하여, 각각 표 6 및 표 7에 표시된 보다 집중된 2차 라이브러리를 구축했다. 상기 제2 돌연변이 ITR 라이브러리는 위에서 설명한 대로 스크리닝되었다. 가장 높은 것부터 가장 낮은 것 순으로 나열된, 각 돌연변이체의 강화 점수는 표 6-7에 나와 있다. 돌연변이 LE ITR 서열의 하위세트는 WT LE ITR 서열(서열 식별 번호: 4) (서열 식별 번호: 16, 160-163, 165-204, 214, 230 및 237)에 비해 증가된 풀링된 강화 점수를 초래했다. 돌연변이 RE ITR 서열의 서브세트는 WT RE ITR 서열(서열 식별 번호: 5) (서열 식별 번호: 267-277 및 279-329)에 비해 증가된 풀링된 강화 점수를 결과하였다.
표 6. LE ITR 풀링된, 개별 돌연변이 라이브러리 풍부화도 점수 및 통합 효율
표 7. RE ITR 풀링된 돌연변이 라이브러리 풍부화도 점수
다음으로, 스크리닝에서 최고의 돌연변이 히트를 확인하기 위해, 돌연변이 LE ITRs의 하위 집합을 SPB 트랜스포사제를 사용하여 HEK 293T 세포에 개별적으로 공동 형질감염시켰다. GFP 양성 세포(전위 활성에 대한 프록시)의 백분율은 7일 후에 유동 세포측정법으로 측정되었다. LE ITR 돌연변이체의 하위세트를 개별적으로 테스트했다. 이들 결과는 표 6의 개별 테스트 통합(%GFP) 열에 나와 있다. 이 하위 집합 내에서, 일부 LE ITR 돌연변이들은 야생형 LE ITR을 갖는 트랜스포존에 비해, 증가된 전위 활성 (즉, 통합된 전위된 세포의 백분율)을 갖는 것으로 확인되었다 (표 6 및 도 10).
실시예 2: K562 세포들, HEK 293T 세포들 및 일차 T-세포들에서 돌연변이 ITR 트랜스포존 및 Super PiggyBac 트란스포사제를 갖는 경우 개선된 전위
스크린에서 상위 LE ITR 돌연변이의 전위 활성을 확인하기 위해, 돌연변이를 이중 절재 및 통합 리포터 시스템에 클로닝하였고, SPB 트랜스포사제와 함께 K562 세포에 핵감염시켰다 (도 11). 모든 돌연변이체 (서열 식별 번호: 16, 166 및 548-556)는 활성이었지만, 단 하나만이 야생형 LE ITR을 갖는 트랜스포존에 비해 개선을 보였다. LE ITR의 31TCC 돌연변이 (서열 식별 번호: 16) (즉, 치환 31G>T 및 33A>C)를 이용하면 전위 활성 (즉, 절제 및/또는 통합)이 있는 세포들의 비율이 가장 높았다 (도 14). 상기 31TCC 돌연변이는 또한 대체 루시퍼라제 이중 리포터를 사용하여 전위 활성을 증가시켰고, 이는 PB 트랜스포존의 LE ITR에 있는 31TCC 돌연변이와 연합된 현상임을 확인시켜 준다.
이 실험은 K562 세포, HEK293T 세포 및 일차 T 세포에서 반복되었다 (도 15). K562 세포들에서, 야생형 SPB 및 야생형 ITR 트랜스포존의 전위와 비교하여, 야생형 SPB 및 LE ITR에서 31TCC 돌연변이가 있는 돌연변이 트랜스포존을 사용한 전위는 통합 (즉, 전위 활성)에서 약 1.5-배 증가하는 결과를 갖는다. HEK293T 세포들에서, 야생형 SPB 및 야생형 ITR 트랜스포존의 전위와 비교하여, 야생형 SPB 및 LE ITR에서 31TCC 돌연변이가 있는 돌연변이 트랜스포존을 사용한 전위는 절제 (즉, 전위 활성)에서 약 1.6-배 증가하는 결과를 갖는다. 전위 활성도 2명의 공여자로부터 분리된 일차 T 세포에서 테스트되었다. LE ITR에 31TCC 돌연변이가 있는 트랜스포존은 야생형 LE ITR이 있는 트랜스포존에 비해 통합이 약 5% 증가했다.
더욱이, LE ITR의 31TCC 돌연변이는 추가 돌연변이가 있는 SPB 트랜스포사제와 함께 사용하면, 전위를 더욱 향상시킨다 (도 15). 두 SPB 트란스포사제 돌연변이 (즉, 야생형 "SPB" 및 "M226F SPB")들이 테스트되었다. K562 세포들에서, 야생형 SPB 및 야생형 ITR 트랜스포존의 전위와 비교하여, 돌연변이 M226F SPB 및 LE ITR에서 31TCC 돌연변이가 있는 돌연변이 트랜스포존을 사용한 전위는 통합 (즉, 전위 활성)에서 약 2-배 증가하는 결과를 갖는다. HEK293T 세포들에서, 야생형 SPB 및 야생형 ITR 트랜스포존의 전위와 비교하여, 돌연변이 M226F SPB 및 LE ITR에서 31TCC 돌연변이가 있는 돌연변이 트랜스포존을 사용한 전위는 절제 (즉, 전위 활성)에서 약 2.5-배 증가하는 결과를 갖는다. 돌연변이 SPB를 갖는 세포 및 LE ITR에서 31TCC 돌연변이를 갖는 돌연변이 트랜스포존을 공동-형질감염시키면, 동일한 트랜스포존 및 야생형 SPB를 갖는 세포의 공동-형질감염에 비해 전위 활성이 증가된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (21)

  1. 다음을 포함하는 트랜스포존을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드:
    a) 서열 식별 번호: 4에 대해 적어도 99% 동일성을 보유한 핵산 서열을 포함하는 제1 역전된 말단 반복부 (ITR); 그리고
    b) 서열 식별 번호: 5에 대해 적어도 99% 동일성을 보유한 핵산 서열을 포함하는제2 ITR; 그리고
    이때 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 4의 핵산 위치 31 및 위치 33 중 적어도 하나에서 핵산 치환을 포함한다.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 제1 ITR은 31G>T의 핵산 치환을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 제1 ITR은 33A>C의 핵산 치환을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  4. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 제1 ITR은 31G>T 및 33A>C의 핵산 치환을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 제1 ITR은 서열 식별 번호: 16의 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  6. 청구항 1-5 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존 또는 piggyBac-유사 트랜스포존인, 폴리뉴클레오티드.
  7. 청구항 6에 있어서, 이때 상기 piggyBac 트랜스포존은 서열 식별 번호: 144-156 및 158에서 제시된 핵산 서열들 중 임의의 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  8. 전술한 청구항들 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 외생성 핵산 서열을 더 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  9. 청구항 8에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 외생성 핵산 서열은 비-자연 발생적 항원 수용체, 치료요법적 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 또는 이의 조합을 인코드하는, 폴리뉴클레오티드.
  10. 청구항 8에 있어서, 이때 적어도 하나의 외생성 핵산 서열은 키메라 항원 수용체를 포함하는 비-자연 발생적 항원 수용체를 인코드하는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 청구항 8에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 외생성 핵산 서열은 치료요법적 폴리펩티드를 인코드하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 청구항 1-11 중 임의의 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  13. 청구항 1-11 중 임의의 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  14. 청구항 13의 세포와 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 변형된 세포들의 집단을 만드는 방법:
    a) 청구항 1-11 중 임의의 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 그리고
    b) 트란스포사제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 전달하는 단계, 이로 인하여 전위 활성이 유도되며, 변형된 세포들의 집단이 생성되는 단계를 포함하며, 그리고
    이때 상기 폴리뉴클레오티드의 전위 활성은 서열 식별 번호: 4의 핵산 서열을 포함하는 제1 ITR 및 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열을 포함하는 제2 ITR을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배 적어도 2.9 배 또는 적어도 3.0 배 증가된다.
  16. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 트란스포사제 효소는 piggyBac 트란스포사제 또는 piggy-Bac 유사 트란스포사제인, 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 트란스포사제 효소는 Super piggyBac™ (SPB) 트란스포사제 효소인, 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 트란스포사제 효소는 서열 식별 번호: 107 또는 109를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  19. 청구항 15-18 중 임의의 한 항의 방법에 따라 생성된 변형된 세포들의 집단을 포함하는 조성물.
  20. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 상기 대상체에세 전술한 청구항들 중 임의의 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 및/또는 조성물의 적어도 하나의 치료요법적으로 효과적인 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 이때 상기 질환 또는 장애는 암, 간 질환 또는 장애, 요소 주기 장애, 대사성 간 장애 또는 혈우병 질환인, 방법.
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