KR20240113400A

KR20240113400A - 종양 내 Treg의 바이오마커를 포함하는 진단용 조성물 및 약학 조성물

Info

Publication number: KR20240113400A
Application number: KR1020240004632A
Authority: KR
Inventors: 박수형; 전승혁; 정유승; 전민우
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2023-01-11
Filing date: 2024-01-11
Publication date: 2024-07-22
Also published as: WO2024151091A1

Abstract

본 발명은 종양 내 새로운 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명에서는 전사체 및 단백질 발현 분석을 통해 종양내 Treg의 이질성을 자세히 조사하였다. 발명자들은 암 배아 항원 관련 세포 부착 분자 1(CEACAM1)을 매우 억제적인 특징을 나타내고 종양 진행과 함께 축적되는 종양 내 Treg를 식별하는 새로운 마커로 확인했다. CEACAM1⁺ 종양 내 Treg의 제거는 효과 T 세포 증식을 상당히 증가시켰고 탈진화된 T 세포의 항-PD-1 매개 활성화를 강화했다. 그러므로 본원발명에 따르면 CEACAM1이 Treg 제거 기반 암 면역 요법의 유망한 표적이 될 수 있다.

Description

종양 내 Treg의 바이오마커를 포함하는 진단용 조성물 및 약학 조성물 {A diagnostic and pharmaceutical composition comprising a biomarker of intratumoral Treg}

본 발명은 종양 내 Treg의 바이오마커를 포함하는 진단용 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

종양 미세 환경에 존재하는 다양한 면역 세포 중에서 조절 T 세포(Treg)는 암 면역 회피의 핵심적인 역할을 한다. Treg는 종양 침윤 효과 T 세포의 활성을 억제하며 종양 세포는 다양한 메커니즘을 활용하여 Treg를 축적할 수 있으므로 종양 미세 환경에서 Treg의 비율이 높아진다. 종양 내 Treg이 많으면 환자의 예후가 좋지 않고, 이는 실제로 Treg이 종양 미세 환경에서 중요한 역할을 하고 있음을 의미한다. 최근 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)의 분석 결과는 종양 내 Treg가 균일한 집단이 아니라 덜 활성화된 Treg와 더 활성화된 Treg의 두 하위 집단으로 이루어진 이질적인 집단임을 보여준다. 보다 활성화된 Treg는 Tnfrsf9와 같은 공동자극 수용체와 Entpd1 및 Ctla4등의 억제 기능에 관여하는 분자를 높게 발현하며, 다양한 암종에서 이러한 종양 내 Treg의 이질성이 규명되었다. 그러나 이러한 종양 내 Treg의 이질성이 Treg의 종양 미세 환경에서의 축적과 어떻게 관련되어 있는지는 아직 밝혀지지 않았다.

막횡단 단백질 암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 1 (CEACAM1, 이는 또한 담관 당단백질 (BGP), CD66a 및 CCAM1로도 알려져 있다)은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 암배아성 항원 패밀리 (CEA)의 구성원이다. CEACAM1은 CD66a (CEACAM1), CD66c (CEACAM6) 및 CD66e (CEACAM5, CEA) 단백질을 비롯한, 다른 CEACAM 단백질과 결합한다. 이는 상피 세포에서부터 조혈모세포 기원의 세포 (예컨대, 면역 세포)에 이르기까지, 매우 광범위한 범위의 세포에서 발현된다.

CEACAM1 단백질은 여러 기능을 하는 것으로 알려져있다. 예를 들어, CEACAM1 단백질은 여러 종류의 암세포에서 과다 발현하고 있는 것으로 알려져있다. 또한, CEACAM1은 혈관신생 및 암의 전이에도 중심적인 역할을 하고 있는 것으로 확인되었다. CEACAM1은 또한 선천성 및 적응성 면역 반응의 조절에도 역할을 하고 있다. 예를 들어, CEACAM1은 인간 장 상피 내에 존재하는 활성화된 T 세포에서 억제성 수용체로써의 역할을 하는 것으로 보고되었다.

종양 내 Treg (Intratumoral Treg)는 PD-1 신호 차단 시 활성화되면서 항 PD-1 치료 저항성에 기여한다. 따라서, 종양 내 Treg의 제거는 종양 특이적 T 세포의 항종양 활성을 촉발시킬 뿐만 아니라 항-PD-1 차단의 치료 효능을 향상시킬 것으로 기대된다. 종양 내 Treg의 특이적인 표현형을 기반으로 종양 내 Treg를 선택적으로 제거하는 전략이 시급히 필요하다. 그러나 PD-1, CD39 또는 4-1BB와 같이 활성화된 Treg에서 높게 발현하는 대부분의 분자는 활성화된 종양 반응성 CD8+ T 세포에서도 높게 발현된다. 따라서, 이들 마커를 표적으로 하는 Treg 제거 항체를 이용한 치료는항 종양 면역 반응의 감소를 수반할 가능성이 있다. 따라서 종양 내 Treg에서는 발현하지만 효과 T 세포를 포함한 다른 면역 세포에서는 발현하지 않는 새로운 분자를 발견하는 것이 Treg을 제거하는 치료의 개발에 매우 중요하다. 종양 내 Treg의 축적과 이질성 사이의 관계를 연구하면 종양 내 Treg의 선택적 제거를 촉진하는 새로운 표적 분자를 찾을 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 (a) CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1) 단백질을 포함하는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 감소 조절되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항암제임을 판별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) CEACAM1 단백질을 포함하는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)의 양 또는 활성이 감소 조절되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항암제임을 판별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CEACAM1 단백질을 포함하는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)의 양 또는 활성을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 생물학적 시료에서 측정된 CEACAM1 단백질을 포함하는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)의 양 또는 활성이 대조군에 비하여 높은 수준이면 암이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계; 를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면 (a) CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1) 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 감소 조절되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항암제임을 판별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 “CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1, 담즙 당단백질(BGP), CD66a 및 C-CAM1이라고도 함)”은 면역글로불린 슈퍼패밀리에도 속하는 암배아 항원 패밀리(CEA)의 구성원이다. CEACAM1은 CD66a, CD66c 및 CD66e 단백질을 포함하여 다른 알려진 CD66 단백질과 상호 작용하고 상피 세포에서 조혈 기원 세포(예: 면역 세포)에 이르기까지 광범위한 세포에서 발현되는 단백질을 의미한다.

본 발명에서 “Treg”은 “조절 T 세포”를 의미하며, 조절 T 세포(Treg)는 면역계를 조절하며 자가항원에 대한 면역관용을 유지하며, 자가 면역 질환을 예방하는 데에 중요한 T세포의 하위 집단이다. 또한 조절 T세포는 효과 T세포의 유도와 증식을 억제한다. 기존에 CD4+CD25+ 세포 집단으로 알려진 Treg는 forkhead family 전사 인자 FoxP3의 발현을 특징으로 한다.

본 발명에서 “종양 내 조절 T 세포”는 종양 또는 암 세포 내부에 존재하는 조절 T 세포를 의미한다.

본 발명에서 상기 조성물은 목적하는 개체에서 분리된 생물학적 시료에 적용하기 위한 것으로, 생물학적 시료에는 고체 조직 시료, 조직 배양액, 액체 조직 시료, 세포 또는 세포 단편이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 생물학적 시료의 비 제한적인 예시로써, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체로, 인간을 포함하는 포유 동물일 수 있고, 예를 들면, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 본 발명에 따른 마커의 발현 수준을 측정하는 경우, 매우 신속하고 간편하게 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인할 수 있다.

본 발명에서 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 상기 암은 췌장암, 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있고, 바람직하게는 신장암일 수 있으나, 종양의 분화 및/또는 증식 등 암의 진행이 본 발명에서 기술하는 암 세포 및/또는 암 줄기세포에 의존적인 암의 종류라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 암의 발병, 성장, 진행 또는 전이 등의 가능성을 예측하는 것일 수 있고, 혹은 암을 다른 질환과 구별하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당 업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당 업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 상기 "올리고펩타이드"는 펩타이드로 2 내지 20 개의 아미노산으로 구성되며 디 펩티드, 트리 펩티드, 테트라 펩티드 및 펜타 펩티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.

본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.

본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA: 올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 CEACAM1이나, 이들을 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당 업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.

본 발명에서 상기 진단용 조성물은 암의 발병, 성장, 진행 또는 전이 등의 가능성을 예측하는 데에 사용될 수 있고, 혹은 암을 다른 질환과 구별하여 진단하는 데에도 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 진단용 조성물을 포함하는 암의 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 "키트"는 바이오 마커 성분에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 항체를 검출 가능한 표지로 표지하여 바이오 마커의 발현 수준을 평가할 수 있는 도구를 말한다. 프로브 또는 항체 관련하여 검출 가능한 물질을 기질과의 반응에 의해서 직접적으로 표지하는 것뿐만 아니라, 직접적으로 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 발색하는 표지체가 접합된 간접적 표지도 포함한다. 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 기타 다른 용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하여 제작될 수 있다. 본 발명에서 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소, 역전사효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 암 진단을 위한 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 당 업계에 공지되어 있는 것이라면, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산 서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로써, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 암의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 암의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충 용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.

본 발명에서 상기 세척액은 인산염 완충 용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충 용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합 반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지 용액은 황산 용액(H₂SO₄)이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1) 단백질; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 목적하는 개체는 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체로, 인간을 포함하는 포유 동물일 수 있고, 예를 들면, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.

본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타깃 펩타이드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩타이드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의할 수 있다.

본 발명의 상기 방법에서 29 개의 바이오 마커, 암, 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer) 등에 관한 기재와 프라이머, 프로브 등에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 방법은 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1) 단백질; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 높을 경우, 상기 목적하는 개체에 암이 발병하였거나 발병할 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 "대조군"이란 건강한 정상 대조군에서의 해당 바이오 마커 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이거나, 환자 유래의 생물학적 시료에서 해당 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준의 평균 내지 중간 값이거나, 암 환자로 타 암종 환자 유래의 생물학적 시료에서 해당 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준의 평균 내지 중간 값일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 방법에서 상기 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 것은 암의 발병, 성장, 진행 또는 전이 등의 가능성을 예측하는 것을 모두 포함할 뿐만 아니라, 상기 목적하는 개체에서 발병하였거나 발병한 것으로 의심되는 질환을 타 질환과 구별하여 암인 것으로 예측하는 것을 포함하며, 그 외에도 상기 목적하는 개체에서 발병하였거나 발병한 것으로 의심되는 암을 타 암종과 구별하여 예측하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 암은 췌장암, 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있고, 바람직하게는 신장암일 수 있으나, 종양의 분화 및/또는 증식 등 암의 진행이 본 발명에서 기술하는 암 세포 및/또는 암 줄기세포에 의존적인 암의 종류라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 암의 진단기기에 관한 것이다.

본 발명의 상기 진단기기는 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1) 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성 수준을 측정하는 측정부; 및 (b) 상기 측정부에서 측정된 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성 수준으로부터 암의 유무를 출력하는 검출부; 를 포함하는 암의 진단기기에 관한 것이다.

본 발명의 상기 기기에서 CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1) 단백질, 암, 예후, 목적하는 개체, 생물학적 시료, 대조군 등에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)를 제거한 대상체에 대하여, 면역체크포인트 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 조절 T 세포는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)인, 약학 조성물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 암의 예방 또는 치료용 조성물 또는 기존의 다른 항암제와 혼합되어 제공될 수 있고, 상기 다른 항암제는 종래에 알려져 있는 암의 예방 또는 치료용 조성물, 기존의 항암제 또는 새롭게 개발되는 항암제일 수 있다.

상기 약학적 조성물이 암의 예방 또는 치료 효과를 가지는 다른 항암제를 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 상기 면역체크포인트 억제제는 IDO 억제제(Indoleamine 2,3-dioxigenase inhibitor), TDO 억제제(Tryptophan 2,3-dioxygenase inhibitor), PD1 억제제(Programmed cell death protein 1 inhibitor), PD-L1 억제제(Programmed death-ligand 1) 및 CTLA4 억제제(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 inhibitor)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 억제제일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 PD-1 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, PDR001, REGN2810 (SAR-439684), BGB-A317, BI754091, IBI308, INCSHR-1210, JNJ-63723283, JS-001, MEDI0680 (AMP-514), MGA-012, PF-06801591, REGN2810, TSR-042, 아테졸리주맙, 아벨루맙, CX-072, 두르발루맙, FAZ053, LY3300054, PD-L1 밀라몰레큘, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 PD-L1 억제제는 아테졸리주맙, 두르발루맙, 아벨루맙, LY3300054, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 CTLA4 억제제는 이필리무맙, 트레멜리무맙 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물이 다른 항암제를 더 포함하는 경우, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염만을 유효성분으로 포함하는 경우보다 항암 효과, 즉 종양 성장 억제, 면역활성 등의 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "병용 요법" 또는 "병용 치료(combined treatment)" 또는 "병용하여(in combination)"는 적어도 2개의 별개의 치료제들을 사용한 임의 형태의 동시 또는 병행 치료를 지칭한다.

병용 요법의 성분들은 동시에, 순차적으로 또는 임의의 순서로 투여될 수 있다. 성분들은 상이한 복용량으로 또는 상이한 투여 빈도로 또는 상이한 경로를 통해 적절한 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "동시에 투여되는"은 특별히 제한되지 않으며, 병용 요법의 성분들이 예를 들면 혼합물로서 또는 즉시 이어지는 순서로 실질적으로 동시에 투여되는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "순차적으로 투여되는"은 특별히 제한되지 않으며, 병용 요법의 성분들이 동시에 투여되지 않고, 투여 사이에 특정한 시간 간격을 두고 하나씩 차례로 또는 무리지어 투여됨을 의미한다. 시간 간격은 병용 요법의 성분들의 각각의 투여 사이에서 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들면, 2분 내지 96시간, 1일 내지 7일 또는 1주, 2주 또는 3주의 범위에서 선택될 수 있다. 일반적으로, 투여 사이의 시간 간격은 수 분 내지 수 시간, 예를 들면 2분 내지 72시간, 30분 내지 24시간, 또는 1 내지 12시간 범위일 수 있다. 추가의 예는 24 내지 96시간, 12 내지 36시간, 8 내지 24시간, 및 6 내지 12시간 범위의 시간 간격을 포함한다.

또한, 본 발명에서, "치료는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.

본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.

본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 안구에 직접 투여하거나, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 안구에 직접 투여하는 것이 더 바람직하다.

본 발명에서 상기 "비경구"란, 안구에 직접 투여하거나, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 안구에 직접 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 "용법 및 용량"은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, CEACAM1 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조절 T 세포는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)인, 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 고형암인, 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 췌장암, 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 진단용 조성물을 포함하는, 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, CEACAM1 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료에서 측정된 CEACAM1 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성이 대조군에 비하여 높은 수준이면 암이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계; 를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조절 T 세포는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 고형암인, 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 췌장암, 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, (a) 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1) 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성 수준을 측정하는 측정부; 및 (b) 상기 측정부에서 측정된 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성 수준으로부터 암의 유무를 출력하는 검출부; 를 포함하는 암의 진단기기를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조절 T 세포는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)인, 암의 진단기기를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)를 감소 또는 제거한 대상체에 대하여, 면역체크포인트 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 면역체크포인트 억제제는 IDO 억제제(Indoleamine 2,3-dioxigenase inhibitor), TDO 억제제(Tryptophan 2,3-dioxygenase inhibitor), PD1 억제제(Programmed cell death protein 1 inhibitor), PD-L1 억제제(Programmed death-ligand 1) 및 CTLA4 억제제(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 inhibitor)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 억제제인, 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 PD-1 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, PDR001, REGN2810 (SAR-439684), BGB-A317, BI754091, IBI308, INCSHR-1210, JNJ-63723283, JS-001, MEDI0680 (AMP-514), MGA-012, PF-06801591, REGN2810, TSR-042, 아테졸리주맙, 아벨루맙, CX-072, 두르발루맙, FAZ053, LY3300054, PD-L1 밀라몰레큘, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 PD-L1 억제제는 아테졸리주맙, 두르발루맙, 아벨루맙, LY3300054, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 고형암인, 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 췌장암, 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, (a) CEACAM1 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 조절 T세포의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 조절 T세포의 양 또는 활성이 감소 조절되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항암제임을 판별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조절 T 세포는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)인, 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 고형암인, 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 췌장암, 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서는 전사체 및 단백질 발현 분석을 통해 종양내 Treg의 이질성을 자세히 조사하였다. 발명자들은 암 배아 항원 관련 세포 부착 분자 1(CEACAM1)을 매우 억제적인 특징을 나타내고 종양 진행과 함께 축적되는 종양 내 Treg를 식별하는 새로운 마커로 확인했다. CEACAM1⁺ 종양 내 Treg의 제거는 효과 T 세포 증식을 상당히 증가시켰고 탈진화된 T 세포의 항-PD-1 매개 활성화를 강화했다. 그러므로 본원발명에 따르면 CEACAM1이 Treg 제거 기반 암 면역 요법의 유망한 표적이 될 수 있다.

도 1은 유세포 분석에서의 Treg을 어떻게 정의했는지를 나타낸 것이다.
도 2는 RCC 환자의 말초 혈액, 정상인 종양 인접 조직 및 종양 조직에서의 Treg 비율을 나타낸 것이고, 도면에서 PB는 말초 혈액; NAT는 정상 인접 조직을 의미한다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 3a는 종양 내 Treg의 비율과 종양 크기 사이의 상관관계를 도시한 것이다. P-값은 Pearson 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 3b는 비 Treg CD4⁺ T 세포와 종양 크기와의 상관관계를 도시한 것이다. P-값은 Pearson 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 3c는 CD8⁺ T 세포와 종양 크기와의 상관관계를 도시한 것이다. P-값은 Pearson 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 4a는 말초 혈액과 종양 내 RNA-seq 결과를 나타낸 것으로, 종양 내 Treg 및 말초 혈액의 Treg의 전사체의 주성분을 분석한 결과이다.
도 4b 역시 말초 혈액과 종양 내 RNA-seq 결과를 나타낸 것으로, 여러 유전자 세트에 대한 gene set enrichment analysis를 한 결과이다.
도 5는 종양 내 Treg과 말초 Treg에서 DEG의 발현을 나타내는 히트 맵(각각 n = 6)이다. 각 행은 개별 유전자를 나타내고 각 열은 샘플을 나타낸다.
도 6은 TITR 시그너쳐 유전자의 GSEA 결과(왼쪽)와 활성화된 Treg 시그너쳐 유전자의 GSEA 결과(오른쪽)를 도시한 것이다.
도 7은 종양 내 Treg에서 상향 조절된 DEG 및 기존의 종양 Treg 시그니처 유전자를 벤 다이어그램으로 나타낸 것이다.
도 8a는 말초 혈액, 정상 인접 조직 및 종양의 Treg에 대한 CEACAM1 발현의 유세포 분석 대표 그림을 나타낸 것이다.
도 8b는 말초 혈액, 정상 인접 조직 및 종양의 Treg에서 CEACAM1 발현을 나타낸 것이다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 9a는 종양 내 T 세포와 CD8 T, CD8⁺ T 세포에 대한 CEACAM1 발현을 비교하여 도시한 것이다.
도 9b는 CEACAM1 발현 비율을 다른 세포들에서 확인한 결과이다 A는 non-Treg CD4⁺ T 세포인 경우, B는 B 세포의 경우, C는 NK 세포의 경우, D는 단핵구/대식세포의 경우, E는 수지상 세포의 경우, F는 말초 혈액과 암의 경우를 나타낸 것이다. 도면에서 PB는 말초 혈액을 의미하며 P-value는 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 10a는 비소세포 폐암의 공개 scRNA-seq 데이터에서 Foxp3 및 Ceacam1의 발현을 나타낸 것이다.
도 10b는 대장암의 공개 scRNA-seq 데이터에서 Foxp3 및 Ceacam1의 발현을 나타낸 것이다.
도 10c는 간세포 암의 공개 scRNA-seq 데이터에서 Foxp3 및 Ceacam1의 발현을 나타낸 것이다.
도 11a는 유세포 분석에서 종양 내 Treg 관련 마커의 발현 수준에 대한 히트 맵을 도시한 것이다. 각 분자를 발현하는 세포의 비율은 z-점수로 정규화되었다.
도 11b는 종양 크기와 개별 마커들의 발현 수준 사이의 Pearson 상관 계수 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 11c는 종양 크기와 종양 내 Treg에서 CEACAM1, 4-1BB 및 CCR8의 발현 수준 사이의 상관 관계를 나타낸 것이다. P-값은 Pearson의 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 11d는 종양 내 Treg 관련 분자의 발현 수준과 종양 크기 사이의 상관관계를 나타낸 것이다. 즉, CD39, CTLA-4, ICOS, GITR, OX40, HLA-DR, TIGIT, PD-1의 종양 내 Treg에서의 발현과 종양 크기와의 상관 관계를 나타낸 것이다. P-값은 Pearson의 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 12는 전이 유무에 따른 종양 내 Treg에서 CEACAM1 발현을 도시한 것이다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 13은 종양 내 Treg의 비율과 종양 내 Treg에 대한 CEACAM1 발현 사이의 상관관계를 나타낸 것이다. P-값은 Pearson의 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 14는 CEACAM1- 또는 CEACAM1+ 종양 내 Treg의 비율과 종양 크기 사이의 상관관계를 도시한 것이다. P-값은 Pearson의 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 15는 CEACAM1 - 및 CEACAM1+ 종양 내 Treg에서 Ki-67 발현을 도시한 것이다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 16a는 종양 및 비장에서 얻은 Treg의 유세포 분석 대표 그림을 도시한 것이다.
도 16b는 총 CD4+ T 세포 중 종양 내 Treg 및 비장 Treg의 비율을 도시한 것이다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 17a는 종양 이식 시간에 따른 종양 내 Treg에서의 CEACAM1 발현을 도시한 것이다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 17b는 종양 내 Treg에 대한 CEACAM1 발현 수준과 종양 부피 사이의 상관관계를 도시한 것이다. P-값은 Pearson의 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 17c는 CEACAM1+ 종양 내 Treg 및 CEACAM1- 종양 내 Treg의 비율과 종양 부피 사이의 상관관계를 도시한 것이다. P-값은 Pearson의 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 17d는 CEACAM1 상태에 따른 종양 내 Treg에서의 Ki-67 발현을 도시한 것이다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 18a는 Foxp3 및 CD45RA의 발현을 기반으로 하위 집단을 정의하기 위한 Treg의 대표적인 유세포 분석 플롯을 도시한 것이다.
도 18b는 말초 혈액, 정상 종양 인접 조직 및 종양 조직의 분획 I, II 및 III Treg에 대한 CEACAM1의 발현 수준을 도시한 것이다. 분획 I Treg는 정상 종양 인접 조직 및 종양 조직에 없었기 때문에 분석하지 않았다. 도면에서 N/A는 분석되지 않은 것을 의미한다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 19는 외부 scRNA-seq 데이터 세트의 Treg로 지정된 세포에서 개별 활성화 점수에 따른 Ceacam1의 발현을 도시한 것이다.
도 20은 PD-1- 및 PD-1+ 종양 내 Treg에서 CEACAM1의 발현 수준을 도시한 것이다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 21은 CEACAM1^- 종양 내 Treg 및 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg에서 CD39, CTLA-4, TIGIT, ICOS, 4-1BB, GITR 및 OX40의 발현 수준을 도시한 것이다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 22는 CEACAM1^- 및 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg의 RNA-seq로부터 선택된 유전자의 발현 패턴을 도시한 것이다.
도 23a는 식별된 6개 모듈의 유전자 네트워크 플롯을 도시한 것이다.
도 23b는 6개 모듈의 선택된 유전자 온톨로지 경로의 과잉 표현 분석을 도시한 것이다. FDR(False Discovery Rate) < 0.05인 경로는 빨간색 막대로 표시하였다.
도 23c는 말초 및 종양 내 Treg(왼쪽) 및 CEACAM1^- 및 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg에서 각 모듈의 강화 여부를 나타낸 것이다.
도 24는 말초 Treg와 비교하여 종양 크기와 종양 내 Treg의 CEACAM1⁺ Treg 시그니처 enrichment score 사이의 상관관계를 도시한 것이다. P-값은 Pearson의 상관 분석에 의해 결정되었다.
도 25a는 억제 Treg 상향 조절 유전자(왼쪽) 및 TCR 신호 유전자 세트(오른쪽)의 GSEA를 나타낸 것이다.
도 25b는 CEACAM1^- 및 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg에서 클론 크기에 따라 TCR-β CDR3 서열에 의해 결정된 클론의 비율을 도시한 것이다.
도 25c는 CEACAM1 발현에 따른 종양내 Treg의 상위 10개 클론(왼쪽) 및 정규화된 Shannon 지수(오른쪽)의 누적 빈도를 도시한 것이다.
도 26a는 PMA 및 이오노마이신으로 자극 4시간 후 CEACAM1- 및 CEACAM1+ 종양 내 Treg로부터의 IL-10 및 TGF-β 분비의 유세포 분석 대표 그림을 도시한 것이다.
도 26b는 CEACAM1 발현에 따라 IL-10, TGF-β 또는 둘 모두를 분비하는 종양 내 Treg의 비율을 도시한 것이다. P-값은 Wilcoxon signed-rank test에 의해 결정되었다.
도 27a는 비-Treg CD4⁺ T 세포의 유세포 분석 대표 그림을 도시한 것으로 비-Treg CD4⁺ T 세포는 단독으로 또는 이펙터 세포(CEACAM1^- 또는 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg)와 함께 증식한다는 것을 보여준다. E는 effector cells을 의미하고, R은 responder cells을 의미한다.
도 27b는 CEACAM1^- 및 CEACAM1⁺ 종양 내 Tregs의 절대적 및 상대적 억제 능력을 도시한 것이다.
도 28은 종양 내 Treg에 대한 CEACAM1의 긴 동형체와 짧은 동형체의 비율을 도시한 것이다.
도 29는 종양 침윤성 백혈구 (tumor-infiltrating leukocytes, TIL)의 체외 제거에 대한 실험 계획 및 이펙터 T 세포의 증식에 미치는 영향 평가를 도시한 것이다.
도 30a는 동형체 및 항-CEACAM1 항체로 고갈된 Treg의 대표적인 유세포 분석 결과를 도시한 것이다.
도 30b는 제거 전후의 Treg, 비Treg CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 빈도를 도시한 것이다.
도 30c는 CEACAM1 제거 전후의 CEACAM1- 및 CEACAM1+ 종양 내 Treg의 비율 변화를 도시한 것이다.
도 30d는 동형체 항체 및 항-CEACAM1 항체로 제거된 TIL에서 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 및 수지상 세포의 비율을 도시한 것이다.
도 31a는 제거된 TIL에서 자극 시 이펙터 T 세포 증식의 대표적인 유세포 분석 플롯을 도시한 것이다.
도 31b는 제거된 TIL에서 비-Treg CD4⁺ T 세포(왼쪽) 및 CD8⁺ T 세포(오른쪽)의 증식을 도시한 것이다.
도 32a는 자극 지수를 이용하여 in vitro에서 평가한 항 PD-1 차단 효능의 대표적인 예를 도시한 것이다.
도 32b는 자극 지수와 PD-1⁺ CD8⁺ T 세포 대 PD-1⁺ Treg의 비율 간의 연관성을 도시한 것이다.
도 33a는 제거 방법 및 항-PD-1 항체의 첨가에 따른 CD8+ T 세포의 증식을 도시한 것이다.
도 33b는 동형체 및 항-CEACAM1 항체로 제거된 TIL에서 항-PD-1 차단의 자극 지수를 도시한 것이다.
도 34는 제거 후 TIL에서 PD-1⁺ CD8⁺ T 세포 대 PD-1⁺ Treg의 비율을 도시한 것이다.
도 35는 CEACAM1⁺ 및 CEACAM1^- 종양 내 Treg의 생체내 입양 전달에 대한 실험 계획을 도시한 것이다.
도 36은 PBS, CEACAM1^- 종양 내 Treg 및 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg (그룹당 n = 8)로 옮겨진 마우스의 종양 성장 곡선을 나타낸 것이다.
도 37은 이식 후 16일째에 마우스 종양의 종양 침윤 CD8⁺ T 세포 중 Ki-67⁺ 세포의 비율 (그룹당 n = 8)을 나타낸 것이다.
도 38은 이소형, 항-CEACAM1, 항-CTLA-4 및 항-CCR8 항체가 고갈된 TIL에서 항PD-1 차단의 자극 지수 (n = 8)을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

준비예

[준비예 1] 인간의 종양 및 정상 세포 샘플 획득

42명의 신세포암 (renal cell carcinoma, RCC) 환자로부터 원발성 종양 샘플 과 인접한 정상 신장 조직의 샘플을 얻었다. 상기 모든 환자는 표준 치료 수술 절제술을 받았다. 각 환자로부터 림프구 분리 배지 (Corning)를 사용한 밀도 구배 원심 분리에 의해 백혈구가 분리된 말초 혈액 샘플도 얻었다. 이후 제조업체의 지침에 따라 종양 해리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 기계적 및 효소적 해리를 통해 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 준비했다.

[준비예 2] 세포주 획득

HepG2 세포주는 ATCC에서 구입하였고, CT26 세포주는 하상준 박사(연세대학교 생화학과)로부터 획득하였다. 세포주는 10% FBS, 스트렙토마이신(100μg/mL), 페니실린(100μg/mL)과 DMEM을 포함하는 완전 배지에서 배양되었다.

[준비예 3] 마우스 종양 모델과 샘플 준비

실험은 암컷 BALB/c 마우스(6-8주령)를 이용하여 수행되었다. 동계 (Syngeneic) CT26 세포(0.5 x 10⁶ cells)를 우측 옆구리에 피하 이식하였고 마우스들은 종양 세포에 희생되었다. 마우스들은 접종 후 10일, 13일 또는 16일에 희생되었다. 희생 당일 종양 크기는 캘리퍼스를 사용하여 측정했으며, 종양의 크기는 부피 = (D × d²)/2로 계산되었다. 여기서 D와 d는 종양의 긴 직경과 짧은 직경을 나타낸다. 림프구들은 기계적 및 효소적 해리에 의해 비장 및 종양 조직으로부터 얻었다.

실시예

[실시예 1] 유세포 분석(Flow cytometry) 및 면역 표현형 분석

죽은 세포를 배제하기 위해 LIVE/DEAD fixable dead cell stain kit (Invitrogen)를 사용하여 세포를 염색했다. 세척 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 표면 마커에 대한 형광색소 결합 항체로 염색하였다. 세포 내 염색을 위해 FoxP3 염색 완충액 키트(Thermo Fisher Scientific)로 세포를 투과 및 고정한 후 4℃에서 30분 동안 세포 내 단백질에 대한 형광 결합 항체로 추가 염색하였다. 모든 유세포 분석은 LSR II 기기 및 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 수행되었다. FlowJo 소프트웨어(Treestar)를 사용하여 데이터를 분석했고 FACSAria II 세포 분류기(BD Biosciences)를 사용하여 세포 분류를 수행하였다.

결론

도 1은 상기 유세포 분석을 통해서 Treg를 분리한 것을 나타낸 것이고, 도 2는 RCC 환자의 말초 혈액, 정상인 종양 인접 조직과 종양 조직에서의 Treg 비율을 타낸 것이다. 도 2에서 알 수 있듯 종양 조직에서 Treg의 비율이 다른 조직보다 현저하게 높음을 알 수 있었다.

[실시예 2] RNA 염기서열 분석 (RNA-seq)

유세포 분석기로 분류한 세포의 mRNA 시퀀싱을 위해 제조업체의 지침에 따라 SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit(Clontech-Takara)를 사용하여 라이브러리를 제작했다. 각 샘플에서 합성된 cDNA의 품질은 Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)를 사용하여 검증하였다. 모든 샘플은 Illumina HiSeq 2500을 사용하여 평균 2,000만 개 이상의 100-bp 페어드 엔드 read로 시퀀싱되었고, FASTQ 파일은 Hisat2를 사용하여 인간 게놈 DNA 레퍼런스(GRCh37/hg19)에 매핑되었다. 또한 StringTie는 매핑된 read를 기반으로 유전자 발현을 정량화하는 데 사용되었다. 모든 데이터는 정규화되었으며, 허위 발견률 (False Discovery Rate, FDR) < 0.05 및 절대 배수 변화 (an absolute fold change) > 4로 정의된 차별적으로 발현된 유전자들(DEGs)을 DESeq2 R 패키지를 사용하여 분석했다. GSEA 및 유전자 집합 변이 분석(GSVA)은 각각 R 패키지 fgsea 및 gsva를 사용하여 수행되었고 공동 발현된 모듈은 R 패키지 CEMiTool을 사용하여 식별하였다. MiXCR은 TCR 유전자의 참조 서열에 대한 판독을 매핑하고 CDR3 유전자 영역에 따라 TCR 클론형을 정량화하는 데 사용되었다.

[실시예 3] RNA 염기서열 시퀀싱 데이타 재분석 (RNA-seq)

유전자 발현 옴니버스 (Gene Expression Omnibus)로부터 NSCLC(GSE99254), 결장직장암(GSE108989) 및 간세포 암(GSE98638)의 T 세포의 scRNA-seq에서 읽은 카운트 데이터를 다운로드 받았다. 이어서 해당 연구의 주 저자가 정의한 클러스터를 사용하여 세포에 주석을 달고 Seurat R 패키지(v.4.0.2)를 사용하여 이후 분석을 수행했다. 각 세포에 대한 활성화 점수는 휴식 Treg (resting Tregs)와 비교하여 활성화된 Treg에서 높게 발현하는 유전자 세트를 기반으로 R 패키지 UCell(v.1.1.1)을 사용하여 계산되었다.

[실시예 4] 억제성 사이토카인 분비 평가

다음과 같은 프로토콜을 사용하여 Treg에서 IL-10 및 TGF-β의 분비를 평가했다. 항-CD4 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 종양 분리물로부터 CD4+ 세포들을 분리한 후 플레이트에 결합된 항-CD3 항체(0.5 ug/mL; OKT-3; Miltenyi Biotec), 항-CD28 항체 (1ug/mL; CD28.2; Biolegend) 및 IL-2(200U/mL; Peprotech)을 이용하여 10% FBS가 보충된 RPMI 배지에서 하룻밤 동안 자극되었다. 다음으로, 세포를 brefeldin A(biolegend) 및 monensin(biolegend)의 존재 하에 37℃에서 4시간 동안 PMA(100 ng/mL; Sigma) 및 ionomycin(1 ug/mL; Sigma)으로 재자극하였다. 그런 다음 세포를 LIVE/DEAD fixable dead cell stain kit 및 세포 표면 항원에 대한 형광 결합 항체로 염색했다. 이후 Foxp3/Transcription factor 염색 키트(eBioscience)를 사용하여 IL-10 및 TGF-β를 포함한 세포내 분자의 염색을 수행했다.

[실시예 5] 시험관 내 억제 분석 (In vitro suppression assay)

FACS Aria II 세포 분류기 (BD Biosciences)를 이용하여 종양 해리물로부터 CEACAM^-, CEACAM⁺ Treg과 PBMC로부터 non-Treg CD4⁺ T 세포 (CD25^-CD4⁺)를 분류하였다. CellTrace Violet (CTV) 염색된 non-Treg CD4⁺ 세포 (5 x 10⁴ cells)는 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 효과 세포들의 비존재 혹은 존재 하에서 (CEACAM^-, CEACAM⁺ Treg, 1 x 10⁴ cells) 항 CD3/CD28 코팅된 비드 (1개 비드 당 50 세포)를 이용하여 자극되었다. 96시간 배양 후, CTV표지가 낮은 세포들의 분율이 분석되었고, Treg의 억제능은 % 억제 = (%CTV^lo without effector - %CTV^lo with effector)/%CTV^lo without effecter 공식에 따라 계산하였다.

[실시예 6] CEACAM1 동형체(isoforms)의 정량적 실시간 PCR

전체 RNA는 HepG2 세포 (CEACAM1의 길고 짧은 동형체를 모두 발현하는 간암 세포주)와 FACS에서 분류된 종양 침윤 Tregs (CD25⁺CD127^-CD4⁺)로부터 Ribospin™ (GeneAll)을 제조업체의 지침에 따라 분리되었다. 상보적 DNA는 LeGene cDNA Synthesis Master Mix(LeGene Biosciences)를 사용하여 합성되었고 이후 SYBR Green(Thermofisher) 및 프라이머(각각 100nM)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 GAPDH 및 CEACAM1의 두 동형체의 mRNA 수준을 정량화했다. CEACAM1-L과 CEACAM1-S의 동형체에 대한 프라이머는 엑손 7의 존재를 기반으로 해당 동형체에 특이적으로 결합하도록 설계되었다. 설계된 프라이머 서열은 다음과 같다.

GAPDH	forward	5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'	서열번호 1
GAPDH	reverse	5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'	서열번호 2
CEACAM1-L	forward	5'-GAGCACAAACCCTCAGTCTCC-3'	서열번호 3
CEACAM1-L	reverse	5'-GTTGCTGGGCTTCAAAGTTCAGG-3'	서열번호 4
CEACAM1-S	forward	5'-GCAGCTCAGGACCACTCCAAT-3'	서열번호 5
CEACAM1-S	reverse	5'-GTTGCTGGGCTTCAAAGTTCAGG-3'	서열번호 6

[실시예 7] 시험관 내 제거 실험 (In vitro depletion experiment)

본 발명에서 CEACAM1을 발현하는 세포를 제거하는 방법으로 magnetic bead separation (MACS) 기법을 이용하였다. 세포에 PE-conjugated anti-CEACAM1 Ab를 처리한 후 Anti-PE-microbead를 처리하고, MACS를 이용하여 CEACAM1-발현 세포를 제거하였다. 본 발명에서 사용한 상기 MACS 기법은 하기 사이트 등에 공지되어 있다 (www.miltenyibiotec.com/US-en/products/macs-cell-separation/macs-cell-separation-strategies.html#gref).

구체적으로 암 환자에서 얻어진 종양 침윤 면역세포들은 항-CEACAM1-PE (clone #283340, R&D Systems) 또는 대조군 마우스 IgG2b-PE (R&D Systems)로 실온에서 15분 동안 염색했다. 그 이후 제조업체의 프로토콜에 따라 항-PE 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)로 염색했다. 세척 후 세포를 MACS LS 컬럼 (Miltenyi Biotec)에 2회 통과시켜 얻은 세포 (the flow-through cells), 즉 특이적인 제거가 되지 않은 면역 세포들과 CEACAM1을 발현하는 면역 세포들이 선택적으로 제거된 세포들을 실험에 사용하였다. 이들 세포를 CellTrace Violet(CTV; Invitrogen)으로 표지하고 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 웰당 2-3 x 10⁵ 세포만큼 분주한 후 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에서 항-CD3 항체(1ng/mL; OKT-3; Miltenyi Biotec)로 자극하였다. 96시간 자극 후, 세포를 수확하고 Live/Dead 염색 키트 및 세포 표면 항원에 대한 항체로 염색하여 유세포 분석을 시행하였다. 세포 증식을 평가하기 위해 CTV가 낮게 표지된 CD8⁺ T 세포와 Foxp3^-CD4⁺ T 세포의 비율을 분석했다.

[실시예 8] T 세포 기능 회복 실험 (T-cell restoration assay)

항-PD-1 차단 시 종양 침윤 CD8⁺과 CD4⁺ non-Treg 세포의 증식 능력 회복을 평가하기 위해, CTV-표지된 전체 TIL 또는 항체로 제거된 TIL을 항-CD3 항체(1ng/mL)와 다른 동형체 대조군(10 ug/mL; MOPC-21; Biolegend) 또는 항인간 PD-1 항체(10 ug/mL; EH12.2H7; Biolegend)를 사용하여 자극했다. 96시간의 자극 후, 분석을 위해 세포를 수확하였다. 유사분열 지수 (The mitotic index)는 초기 1개의 세포당 유사분열 회수로 정의되었고 자극 지수 (The stimulation index)는 항-PD-1 항체-처리된 웰과 동형체 대조군-처리된 웰의 유사분열 지수 사이의 비율로 결정되었다.

[결론]

1. CEACAM1은 특히 종양 내 Treg에서 상향조절 된다.

종양 내 Treg (intratumoral Tregs)의 양과 종양 성장 간의 연관성을 조사하기 위해 신세포암 (renal cell carcinoma, RCC) 환자 42명의 종양 침윤 T 세포를 검사했다. 그 결과 Foxp3⁺CD25⁺CD127^-CD4⁺ T 세포 (도 1)로 정의되는 Treg의 비율이 인접한 정상 조직 및 말초 혈액에 비해 종양 조직에서 증가하는 것을 관찰했다 (도 2). 종양 크기는 전체 CD4⁺ T 세포 중 종양 내 Treg의 비율과 유의한 상관관계가 있었지만 (도 3a), 비 Treg CD4⁺ T 세포(Foxp3^-CD25^-CD4⁺ T 세포)의 비율 또는 CD8⁺ T 세포의 비율과는 그렇지 않았다 (도 3b, 도 3c). 이 결과는 종양 성장이 종양 내 Treg의 증가와 관련되어 있음을 시사한다.

그리고 종양 내 Treg의 면역학적 특징을 조사하기 위해 6명의 RCC 환자에서 상기 준비예 및 실시예에서 획득한 종양 조직과 말초 혈액에서 유세포 분석을 통하여 분리된 non-naive Treg(CD4⁺CD25⁺CD127^-CD45RA^- T 세포)에서 RNA-seq를 수행하였다. 그 결과 종양 내 Treg은말초 혈액의 Treg과 명확하게 구별됨을 확인하여 도 4a에 나타내었다. 총 634개의 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 확인했으며, 도 5에 도시한 바와 같이 그 중 391개의 유전자가 말초 혈액의 Treg와 비교하여 종양 내 Treg에서 높게 발현하고 243개의 유전자가 낮게 발현한다는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 면역 조절(예: Tigit 및 Cd274), 활성화(예: Tnfrsf4, Tnfrsf9, Tnfrsf18 및 Icos) 및 억제 기능(예: Entpd1 및 Ctla4)에 관여하는 유전자는 종양 조직의 Treg에서 말초 혈액의 Treg에서보다 확연히 더 높게 발현하는 것을 확인하여 도 5에 도시하였다. 또한 도 4b에 도시한 바와 같이, Gene set enrichment analysis에서 종양 내 Treg가 대사 및 면역체계와 관련된 유전자 세트의 발현이 말초 혈액의 Treg보다 유의미하게 높음을 확인했다. 종양 내 Treg에서 높게 발현하는 유전자는 여러 암종에서 나온 종양 침윤 Treg의 시그니처 유전자 (pan-cancer tumor-infiltrating Treg signature genes) 및 활성화된 Treg 시그니처 유전자가 많이 포함되어 있음을 확인하여 도 6에 도시하였다.

특히, 종양 내 Treg에서 기존에 알려지지 않은 CEACAM1이 높게 발현함을 보여주었다. 또한, CEACAM1은 본 발명에서 밝혀진 종양 내 Treg에서 높게 발현하는 유전자와 이전에 보고된 폐암 및 결장암 환자의 종양 내 Treg에서 높게 발현된 유전자에 모두 포함되었으며, 이는 도 7에 도시하였다. 이는 CEACAM1이 다양한 인간 종양에 걸쳐 보존된 종양 내 Treg 시그너쳐 유전자일 수 있음을 나타낸다.

유세포 분석 결과, CEACAM1이 RCC 환자에서 종양 조직의 Treg에서 정상 인접 조직 및 말초 혈액의 Treg와 비교하여 유의하게 높게 발현되었음을 알 수 있었다 (도 8a, 8b). 흥미롭게도 종양 내 Treg에 서의 CEACAM1 발현은 효과 T 세포 및 기타 면역 세포에서의 수준보다 현저하게 높았다(도 9a, 9b). 또한 비소세포 폐암, 대장암 및 간세포 암의 scRNA-seq 데이터를 재분석한 결과 CEACAM1 발현이 억제능이 높은 Treg에서 높게 발현하고 억제능이 낮은 Treg 및 효과 T 세포에서는 현저히 낮은 것으로 나타났다(도 10a 및 도 10b, 도 10c).

2. 종양 내 Treg에서 CEACAM1의 발현은 종양 성장과 관련이 있다.

종양 내 Treg의 CEACAM1 발현과 종양 성장과의 연관성을 조사하기 위해 CCR8, CD39, PD-1, TIGIT, CTLA-4, 4-1BB, OX40, ICOS, GITR 및 HLA-DR과 같은 Treg의 활성화 및 억제 기능과 관련된 분자의 단백질 발현을 RCC 환자 27명의 종양 내 Treg에서 분석했다 (도 11a). 그 결과 CEACAM1이 발현 수준이 종양 크기와 유의한 상관관계가 있는 유일한 분자라는 것을 발견했다 (도 11b, 11c, 11d). 또한 전이가 있는 RCC에서는 CEACAM Tregs의 비율이 더 높았다는 것도 확인하였고 (도 12) 종양 미세환경에 있는 전체 CD4+ Treg의 빈도와 CEACAM⁺ Treg의 빈도 사이에 유의미한 상관관계를 확인했다 (도 13). 이러한 결과는 CEACAM1 발현이 종양 내 Treg의 축적과 특징 사이에 연결성이 있음을 시사한다.

다음으로 종양 성장에 따른 CEACAM1⁺ 및 CEACAM1^- 종양 내 Treg의 비율 변화를 분석했다. 특히, CEACAM1^- 종양 내 Treg의 빈도는 종양 크기에 따라 변하지 않았지만, CEACAM1⁺ 종양 내 Treg은 종양 크기에 따라 유의하게 증가했다(도 14). 이는 CEACAM1^- Treg와 비교하여 더 높은 Ki-67 발현을 보인다는 점에서 CEACAM1⁺ Treg이 더욱 증식 활동이 높은 것으로 추론할 수 있다 (도 15).

다음으로 마우스 CT26 종양 모델에서 시간에 따라 종양 내 Treg에서 CEACAM1 발현을 관찰함으로써 암 진행과 CEACAM1의 발현이 연관되어 있는지 조사했다. 그 결과 전체 CD4+ T 세포 중 Treg의 비율은 비장보다 종양 조직에서 더 높았다(도 16a, 16b). 그리고 종양 진행에 따라 종양 내 Treg에서 CEACAM1 발현이 증가하고 종양 미세 환경에서 CEACAM1⁺ Treg가 종양 성장에 따라 선택적으로 증가한다는 것을 확인했다 (도 17a 내지 17d).

3. CEACAM은 고도로 활성화되었으며 면억억제능이 높은 종양 내 Treg를 표시한다.

인간 Treg는 Foxp3 및 CD45RA의 발현 수준에 따라 하기와 같은 3개의 하위 집단으로 나뉠 수 있다: Foxp3^loCD45RA⁺ 휴식 Treg(분획 I), Foxp3^hiCD45RA^- 이펙터 Treg(분획 II) 및 Foxp3^loCD45RA^- 비억제 Treg(분획 III). 그 중 이펙터 Treg는 면역 억제 기능을 발휘하며 종양 미세 환경에 풍부하다. 따라서 이 기능적 이질성과 종양 내 Treg의 CEACAM1 발현 사이의 관계를 조사했다. 그 결과 종양 내 이펙터 Treg(분획 II)는 정상 조직 및 말초 혈액의 이펙터 Treg에 비해 CEACAM1의 발현이 유의하게 더 높았다는 것을 발견하였다 (도 18a, 18b). 또한, CEACAM1의 발현은 종양 내 비억제 Treg(분획 III)보다 종양 내 이펙터 Treg(분획 II)에서 유의하게 높았으며, 이는 CEACAM1이 억제능이 높고 안정적인 종양 내 이펙터 Treg (분획 II)를 표시함을 나타낸다.

scRNA-seq을 이용한 연구에서Treg 내에서 덜 활성화되고 더 활성화된 클러스터를 일관되게 나타내었기 때문에 공개 데이터 세트를 사용하여 단일 세포 수준에서 CEACAM1 발현과 Treg의 활성화 상태 사이의 상관관계를 조사했다. 그 결과 더 높은 활성화 점수를 가진 Treg가 CEACAM1이 높게 발현하고 있음을 확인했다 (도 19).

또한 PD-1 신호 차단 시 Treg의 활성화에 의해 항-PD-1 요법에 대한 내성에 기여하는 것으로 알려진 PD-1⁺ 종양 내 Treg는 더 높은 수준의 CEACAM1을 발현했다는 것을 발견하였다 (도 20). 이러한 결과는 CEACAM1이 종양 미세환경에서 고도로 활성화되었으며 면억억제능이 높은 표현형을 갖는 종양 내 Treg를 선택적으로 제거할 수 있는 특이적인 마커로 활용될 수 있음을 시사한다.

CEACAM1⁺ 종양 내 Treg이 Treg 제거 치료 (Treg-depletion treatment)의 주요 표적으로써 적합한지 확인하기 위해 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg 및 CEACAM1^- 종양 내 Treg의 면역학적 표현형을 비교했다. 유세포 분석 결과 CEACAM1⁺ Treg이 CEACAM1^- Treg에 비해 억제 분자(CD39 및 CTLA-4), 억제 수용체(PD-1 및 TIGIT) 및 보조자극 수용체(ICOS, 4-1BB, GITR 및 Ox40)의 발현이 더 높은 것으로 나타났다 (도 21).

이어서 6명의 RCC 환자의 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg 및 CEACAM1^- 종양 내 Treg의 RNA-seq를 통해 종양에서 CEACAM1⁺ Treg의 상세한 특성을 조사했다. CEACAM1⁺ 종양 내 Treg는 Treg에 특징적인 분자(Foxp3 및 Il2ra), 사이토카인 수용체(Il1r1 및 Il1r2) 및 케모카인 수용체(Ccr4 및 Cxcr6)에 대한 유전자뿐만 아니라 PD-1, CD39, CTLA-4 및 4-1BB 과 같은 유세포 분석에 의해 확인된 분자 또한 높게 발현하고 있음을 나타냈다 (도 22).

CEACAM1⁺ 및 CEACAM1^- 종양 내 Treg의 RNA-seq에서 확인된 공동 발현 모듈을 조사한 결과, 서로 다른 패턴의 생물학적 과정과 관련된 유전자의 6개 공동 발현 모듈을 확인했다 (도 23a, 23b). CEACAM1은 Treg을 정의하는 전사 인자 Foxp3와 긴밀하게 공동 발현되었지만 다른 종양 내 Treg 관련 유전자(Tnfrsf4, Tnfrsf18, Cd274 및 Hla-dra)는 그렇지 않았다. 6개 모듈 모두 말초 혈액의 Treg와 비교하여 종양 내 Treg에서 더욱 높게 발현했다. 또한 CEACAM1^- (도 23c)과 비교하여 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg에서 3개의 모듈이 상향 조절되었고 하나의 모듈이 하향 조절되어 CEACAM¹+ 하위 집합의 뚜렷하게 활성화된 상태를 나타내었다.

또한, CEACAM1⁺ 종양 내 Treg의 시그너처 유전자 세트(상위 50개의 상향조절된 유전자)를 말초 및 종양 내 Treg를 비교한 RNA-seq 데이터에 적용했을 때, 이 말초 혈액 Treg에 비해 유전자들의 발현이 종양 내 Treg에서 높을 수록 종양의 크기가 증가했다(도 24). 이는 암 진행에서 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg의 중요성을 시사한다.

또한 억제능이 높은 Treg에 특이적인 유전자 세트와 TCR 신호전달과 관련된 유전자 세트는 모두 CEACAM1^- Treg와 비교하여 CEACAM1⁺ Treg에서 현저하게 높게 발현했으며(도 25a), 이는 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg가 지속적인 항원 자극을 통해 더 큰 억제 능력을 획득했을 수 있음을 시사한다.

이 가설을 뒷받침하는 증거를 찾기 위해 RNA-seq 데이터에서 TCR-β CDR3 서열을 추출하여 CEACAM1⁺와 CEACAM1^- 종양 내 Tregs 사이의 클론 분포를 비교했다. 특히, CEACAM1^- 과 비교하여 CEACAM1⁺ Tregs에서 빈도가 더 높은 클론이 더 많음을 알 수 있었다 (도 25b). 이와 유사하게, CEACAM1^-과 비교하여 CEACAM1⁺Treg는 상위 10개 클론의 누적 빈도가 더 높았고 정규화된 Shannon 지수는 더 낮았다(도 25c). 종합적으로, 이러한 결과는 CEACAM1을 발현하는 종양 내 Treg가 항원 자극으로 인해 고도로 활성화되고 억제능이 높아져 있음을 시사한다.

Treg는 염증 유발 환경에서 Foxp3 발현을 유지하면서도 억제 기능을 상실할 수 있으므로 CEACAM1^-과 비교하여 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg의 억제 기능을 검증하기 위해 기능 분석을 수행했다. 전사체와 단백질 발현에 기초한 추론과 일치하게, CEACAM1⁺Tregs는 CEACAM1^- Tregs에 비해 PMA + ionomycin으로 자극했을 때 IL-10 및 TGF-β을 더 많이 분비했다 (도 26a, 26b).

또한, CEACAM1^- 종양 내 Treg와 비교하여 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg은 효과 T 세포의 증식에 상당히 큰 억제능을 발휘했다 (도 27a, 27b). 따라서 CEACAM1^-종양 내 Treg와 비교하여 CEACAM1⁺ 종양내 Treg이 실제로 면역억제능이 높음을 확인했다.

생체 내에서 항암 면역에 대한 CEACAM1⁺ 종양 내 Treg의 억제 활성을 확인하기 위해 우리는 CEACAM1⁺ 및 CEACAM1^- 종양 내 Treg의 마우스 입양 전달을 수행했다(도 35). 특히, 대조군 및 CEACAM1^- 종양 내 Treg와 비교하여, CEACAM1⁺ 종양 내 Treg의 입양 전달은 종양 성장을 가속화했다(도 36). 결과적으로, CEACAM1⁺ 종양 내 Treg의 입양 전달은 CD8⁺ TIL의 증식 활성을 크게 감소시켰다(도 37). 종합하면, 이러한 발견은 CEACAM1^- 종양 내 Tregs와 비교하여 CEACAM1⁺ 종양 내 Tregs의 매우 억제적인 표현형을 확인했으며, CEACAM1⁺ 종양 내 Tregs는 항종양 CD8+ T 세포 반응을 억제하여 종양 성장을 촉진한다는 것을 확인하였다.

4. CEACAM1 ⁺ Treg의 제거는 종양 침윤 탈진화된 T 세포의 항-PD-1 매개 재활성을 더욱 향상시킨다.

상기 데이터들은 CEACAM1이 매우 억제적인 종양 내 Treg에 발현되어있고 다른 면역 세포에는 그 발현이 종양 내 Treg보다 현저히 낮다는 것을 나타내므로 다음으로 CEACAM1이 Treg을 제거하는 암 면역 요법의 표적이 될 수 있는지 여부를 평가했다. CEACAM1의 CEACAM1-L 동형체는 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프가 있는 세포질 꼬리를 갖고 있지만 CEACAM1-S 동형체는 갖지 않기 때문에 T 세포에서 다른 역할을 한다. 즉, CEACAM1-L이 리간드에 결합하면 억제 신호를 개시하는 반면, CEACAM1-S는 T 세포를 활성화하는 역할을 하는 것으로 생각된다. HepG2 세포주를 사용하여 각 동형체에 대해 설계된 프라이머를 검증한 후 종양 내 Treg에서 정량적 실시간 PCR을 수행했다. 모든 환자에서 두 동형체가 서로 비슷한 정도로 발현하는 것을 보였으며 (도 28), 이는 단순히 CEACAM1의 기능을 조작하는 것이 적절한 치료 방법이 아닐 수 있음을 나타낸다.

추가 조사를 위해 다음으로 종양 미세 환경에서 CEACAM1⁺ 세포를 제거하는 것이 항-종양 면역에 어떤 영향을 미치는지 평가하기 위해 시험관 내 실험을 수행했다(도 29). RCC 환자의 종양 침윤 백혈구(TIL) 중에서 CEACAM1⁺ 세포의 제거는 비-Treg CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 기타 면역 세포들의 수를 보존하면서 Treg(주로 CEACAM1⁺ Treg)를 부분적으로 제거했다(도 30a, 30b, 30c, 30d). 시험관 내 실험에서 CEACAM1을 표적으로 한 세포 제거가 대조군과 비교하여 종양 침윤성 비-Treg CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 증식 능력을 유의하게 증가시켰음을 보였다 (도 31a, 31b). 이는 CEACAM1을 이용한 Treg 제거 전략이 종양내 Treg의 면역 억제 기능을 성공적으로 완화했음을 나타낸다.

최근 종양 내 Treg에서 PD-1 발현은 항 PD-1 치료의 효능을 제한하고 PD-1⁺ CD8⁺와 PD-1⁺ Treg의 수적인 비율로 항 PD-1 요법의 효능을 예측할 수 있다고 여겨진다. 마찬가지로, 자극 지수 (the stimulation index)로 평가된 CD8+ T 세포 증식에 대한 항-PD-1 차단의 효능은 PD-1⁺ Treg에 대한 PD-1⁺ CD8⁺ T 세포의 수적 비율에 비례함을 확인할 수 있었다 (도 32a, 32b).

이어서 PD-1⁺ Treg의 수를 줄임으로써 종양 침윤 탈진화된 T 세포의 기능 회복을 테스트했다. 그 결과 PD-1 차단제 단독으로는 CD8+ TIL의 증식 능력을 회복시켰고 (도 33a, 33b), CEACAM1 발현 세포의 제거와 PD-1 차단제의 조합은 PD-1⁺CD8⁺TIL에 대한 PD-1⁺ 종양 내 Treg의 비율 증가로 인해 CD8+ TIL의 증식 능력이 더욱 큰 폭으로 증가했다(도 34).

종합하면, 이 결과는 CEACAM1이 말초 Treg 및 기타 종양 침윤 면역 세포에는 발현이 매우 낮고 종양 내 Treg에만 특징적으로 발현하는 세포 표면 단백질이며 CEACAM1⁺ Treg을 제거하면 항-PD-1 면역요법의 효능을 향상시킬 수 있음을 의미한다.

다음으로 CEACAM1 고갈의 효능을 종양 내 Tregs 고갈을 위한 대체 전략과 비교했다. 항-CTLA-4 또는 항-CCR8 항체를 이용한 시험관 내 고갈은 TIL 중 Treg의 빈도를 감소시키는 반면, 비-Treg CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포의 빈도는 유지되었다. T 세포 외에도 CCR8 매개 고갈에 의한 대식세포의 현저한 감소를 제외하고는 면역 세포 집단의 빈도에 있어서 어떠한 주목할만한 변화도 관찰하지 못했다. CEACAM1 매개 고갈과 유사하게, CCR8 매개 고갈은 종양 침윤 효과기 T 세포의 증식을 향상시켰다. 그러나 이 효과는 CTLA-4 매개 고갈에서는 관찰되지 않았다.

중요한 것은 항PD-1 차단의 효능이 다른 전략과 비교할 때 CEACAM1이 고갈된 TIL에서 최대화되었다는 것이다 (도 38). 종합하면, 실험 결과는 CEACAM1이 말초 Treg와 다른 종양 침윤 면역 세포를 구별할 수 있는 종양 내 Treg에 대한 특정 마커이며 CEACAM1+ Treg가 고갈되면 항PD-1 매개 면역요법에 대한 종양 저항성이 감소할 수 있음을 의미한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

CEACAM1 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조절 T 세포는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)인, 암 진단용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는, 진단용 키트.
제5항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 진단용 키트.
목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서,
CEACAM1 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서,
상기 생물학적 시료에서 측정된 CEACAM1 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성이 대조군에 비하여 높은 수준이면 암이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계; 를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제8항에 있어서,
상기 조절 T 세포는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
(a) 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1) 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성 수준을 측정하는 측정부; 및
(b) 상기 측정부에서 측정된 조절 T 세포 (Regulatory T cell)의 양 또는 활성 수준으로부터 암의 유무를 출력하는 검출부; 를 포함하는 암의 진단기기.
제10항에 있어서,
상기 조절 T 세포는 종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)인, 암의 진단기기.
종양 내 조절 T 세포 (intratumoral Treg)를 감소 또는 제거한 대상체에 대하여, 면역체크포인트 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제12항에 있어서,
상기 면역체크포인트 억제제는 IDO 억제제(Indoleamine 2,3-dioxigenase inhibitor), TDO 억제제(Tryptophan 2,3-dioxygenase inhibitor), PD1 억제제(Programmed cell death protein 1 inhibitor), PD-L1 억제제(Programmed death-ligand 1) 및 CTLA4 억제제(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 inhibitor)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 억제제인, 약학적 조성물.
제13항에 있어서,
상기 PD-1 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, PDR001, REGN2810 (SAR-439684), BGB-A317, BI754091, IBI308, INCSHR-1210, JNJ-63723283, JS-001, MEDI0680 (AMP-514), MGA-012, PF-06801591, REGN2810, TSR-042, 아테졸리주맙, 아벨루맙, CX-072, 두르발루맙, FAZ053, LY3300054, PD-L1 밀라몰레큘, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학적 조성물.
(a) CEACAM1 단백질을 포함하는 조절 T 세포 (Regulatory T cell)에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 조절 T세포의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 조절 T세포의 양 또는 활성이 감소 조절되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항암제임을 판별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.