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KR20240126870A - 조절 rna들을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 유전자 전사의 조절 - Google Patents

조절 rna들을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 유전자 전사의 조절 Download PDF

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KR20240126870A
KR20240126870A KR1020247024526A KR20247024526A KR20240126870A KR 20240126870 A KR20240126870 A KR 20240126870A KR 1020247024526 A KR1020247024526 A KR 1020247024526A KR 20247024526 A KR20247024526 A KR 20247024526A KR 20240126870 A KR20240126870 A KR 20240126870A
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KR
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aso
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Pending
Application number
KR1020247024526A
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English (en)
Inventor
알피카 세갈
브라이언 제이. 매튜스
데이비드 에이. 범크로
저스틴 에이. 카라벨라
마리오 에스테반 콘트레라스 감보아
라차나 에스. 켈카르
정윤준
유팅 리우
루투자 수다카르 파이
헨리 무니르 뮤하이버
서브호딥 로이
유춘 구오
Original Assignee
캠프4 테라퓨틱스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

요약서
조절 RNAs, 이를 테면, 프로모터-연합된 RNAs 및 인핸서 RNAs를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASOs)를 이용하여 유전자 전사를 조절하는 방법들이 본원에서 기술된다. 이들 방법은 유전자 산물의 수준을 조절, 예를 들면, 카르바모일-포스페이트 합성효소 1 (CPS1)의 발현 수준을 증가시키고, 이로 인하여 비정상적 유전자 발현과 연합된 질환의 치료에 유용하다.

Description

조절 RNA들을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 유전자 전사의 조절
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2021년 12월 22일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 번호 63/292,920, 2022년 2월 9일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 번호 63/308,373에 대해 우선권을 주장하며, 이들 출원은 이들 전문이 참고자료로 편입된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통하여 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 전술한 ASCII 사본은 2022년 12월 21일자로 생성되었으며, CTC-028WO_140628340009.xml 이름으로 불리며, 크기는 925,586 바이트이다.
발명의 분야
본 명세서는 조절 RNAs (가령, CPS1 조절 RNAs), 이를 테면, 프로모터-연합된 RNAs 및 인핸서 RNAs를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들 (ASOs)을 이용하여 유전자 전사를 상형조절 또는 하향조절하는 방법에 관계한다.
배경
전사 인자들은 프로모터 및 인핸서 DNA 요소들의 특정 서열과 결합하여, 유전자 전사를 조절한다. 활성 프로모터와 인핸서 요소들 자체가 전사되어, 넌-코딩 조절 RNAs (regRNAs), 이를 테면, 프로모터-연합된 RNAs (paRNAs) 및 인핸서 RNAs (eRNAs)를 생성하는 것으로 최근에 보고된 바 있다 (Sartorelli and Lauberth, Nat. Struct. Mol. Biol. (2020) 27, 521-28 참고). 코딩 RNAs와 달리, regRNAs는 양-방향으로 전사된다. 뉴클레오솜 리모델링 (Mousavi et al., Mol. Cell (2013) 51(5):606-17 참고), 인핸서-프로모터 루핑 조절 (Lai et al., Nature (2013) 494(7438):497-501 참고), 그리고 전사 조절자들과의 직접적인 상호작용 (Sigova et al., Science (2015) 350, 978-81 참고)을 비롯한, regRNAs의 기능에 대해 다양한 모델이 제안되었다.
유전자 발현은 일반적으로 다루기 힘든 생물학적 과정으로 알려져 있다. 유전자 전사 및 regRNAs의 생물학을 이해하려는 지속적인 노력에도 불구하고, 유전자 발현을 조절하는 임상적으로 적합한 방법은 제한되어 있다. 비정상적 유전자 발현과 관련된 질환을 치료하기 위한 새롭고 유용한 방법이 여전히 필요하다.
요약
한 측면에서, 카르바모일-포스페이트 합성효소 1 (CPS1)의 조절 RNA (regRNA)의 적어도 8개 인접 뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)가 본원에서 제공되며, 이때 상기 regRNA는 서열 식별 번호: 49, 50, 69-79 및 89-90로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 상기 regRNA에서 이 regRNA의 3' 단부로부터 200개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 서열에 상보적이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 상기 regRNA에서 이 regRNA의 5' 단부로부터 200개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 서열에 상보적이다.
일부 구체예들에서, 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 49의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 49의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 2의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 49의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 1-3으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 50의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 4-15로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 89의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 487-574로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 90의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 575-662로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 50개, 40개, 30개, 또는 25개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO는 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함하는 RNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO는 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함하는 RNA 및 DNA를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 5' 단부에서 적어도 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드, 그리고 3' 단부에서 적어도 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 화학적 변형은 하나 또는 그 이상의 2'-O-C1-4알킬 이를 테면, 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-데옥시 (2'-H), 2'-O-C1-3알킬-O-C1-3알킬 이를 테면, 2'-메톡시메틸 ("2'-MOE"), 2'-플루오르 ("2'-F"), 2'-아미노 ("2'-NH2"), 2'-아라비노실 ("2'-아라비노") 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노실 ("2'-F-아라비노") 뉴클레오티드, 2'-잠금된 핵산 ("LNA") 뉴클레오티드, 2'-아미도 브릿지 핵산 (AmNA), 2'-풀린 핵산 ("ULNA") 뉴클레오티드, L 형태의 당 ("L-당"), 4'-티오리보실 뉴클레오티드, 속박된(constrained) 에틸 (cET), 2'-플루오르-아라비노 (FANA), 또는 티오몰포리노를 포함하는 뉴클레오티드 당 변형을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 화학적 변형은 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 ("PS" 또는 (P(S))), 포스포르아미데이트 (P(NR1R2) 이를 테면, 디메틸아미노포스포르아미데이트 (P(N(CH3)2)), 포스포노카르복실레이트 (P(CH2)nCOOR) 이를 테면, 포스포노아세테이트 "PACE"(P(CH2COO-)), 티오포스포노카르복실레이트 ((S)P(CH2)nCOOR) 이를 테면, 티오포스포노아세테이트 "티오PACE"((S)P(CH2COO-)), 알킬포스포네이트 (P(C1-3알킬) 이를 테면, 메틸포스포네이트 -P(CH3), 보라노포스포네이트 (P(BH3)), 또는 포스포로디티오에이트 (P(S)2)를 포함하는 뉴클레오티드간 링키지 변형을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 화학적 변형은 하나 또는 그 이상의 2-티오우라실 ("2-티오U"), 2-티오시토신 ("2-티오C"), 4-티오우라실 ("4-티오U"), 6-티오구아닌 ("6-티오G"), 2-아미노아데닌 ("2-아미노A"), 2-아미노퓨린, 슈도우라실, 하이포산틴, 7-데아자구아닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 7-데아자아데닌, 7-데아자-8-아자아데닌, 5-메틸시토신 ("5-메틸C"), 5-메틸우라실 ("5-메틸U"), 5-히드록시메틸시토신, 5-히드록시메틸우라실, 5,6-데히드로우라실, 5-프로피닐시토신, 5-프로피닐우라실, 5-에티닐시토신, 5-에티닐우라실, 5-알릴우라실 ("5-알릴U"), 5-알릴시토신 ("5-알릴C"), 5-아미노알릴우라실 ("5-아미노알릴U"), 5-아미노알릴-시토신 ("5-아미노알릴C"), 무염기 뉴클레오티드, Z 염기, P 염기, 비-구조적 핵산 ("UNA"), 이소구아닌 ("이소G"), 이소시토신 ("이소C") 글리세롤 핵산 (GNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 또는 티오포스포르아미데이트 몰포리노 (TMOs)를 포함하는 핵염기 변형을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 화학적 변형은 2'-O-메톡시메틸, 5-메틸 시티딘, 잠금된 핵산 (LNA), 및 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 변형된 리보뉴클레오티드 5' 단부와 3' 단부 각각에서 변형된 리보뉴클레오티드의 적어도 3개의 뉴클레오티드의 측면에 있는 변형안된 DNA의 8개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 16, 22-27, 31-39, 403-412, 414-415, 417-432, 435-480, 또는 482-486 중 임의의 하나의 서열의 뉴클레오티드 서열 및/또는 화학적 변형을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 409의 뉴클레오티드 서열 및/또는 화학적 변형을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 403-406, 409-415, 417-424, 470, 473, 477, 480, 또는 486의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 화학적 변형은 cET이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 425-432 또는 435-442의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 화학적 변형은 LNA이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 443-458의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 화학적 변형은 LNA 및 2'-O-메톡시메틸이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 400, 408, 460, 462, 464-466, 468, 469, 471, 472, 475, 476, 또는 479의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 변형안된 DNA의 8개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하지 않는다
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 변형안된 리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 길이는 2 × n + 4개의 뉴클레오티드 (n은 8 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 2 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 남아있는 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸로 변형된 리보뉴클레오티드이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 393 또는 394의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 길이는 3 × n + 2개의 뉴클레오티드 (n은 4 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 3 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 남아있는 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸로 변형된 리보뉴클레오티드이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 392 또는 395의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 길이는 3 × n + 2개의 뉴클레오티드 (n은 6 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 3 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 3' 위치 및 5' 위치에서 5개 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸로 변형된 리보뉴클레오티드이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 19 또는 20의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 길이는 4 × n개의 뉴클레오티드 (n은 3 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 4 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 3' 위치 및 5' 위치에서 5개 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸로 변형된 리보뉴클레오티드이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 길이는 4 × n + 4개의 뉴클레오티드 (n은 3 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 4 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 남아있는 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸로 변형된 리보뉴클레오티드이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 396 또는 397의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 각 리보뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 17, 28-30, 및 40-48 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 각 리보뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된 리보뉴클레오티드이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 17, 28-30, 및 40-48 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO에서 각 시티딘은 5-메틸에 의해 변형된다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 길이는 5 × n + 5개의 뉴클레오티드 (n은 3 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 5 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 남아있는 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된 리보뉴클레오티드이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 398 또는 399의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 GalNAc 모이어티, 임의선택적으로 GalNAc3 모이어티를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 비오틴 또는 콜레스테롤 모이어티를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO에서 각 시티딘은 5-메틸에 의해 변형된다.
일부 구체예들에서, 상기 regRNA는 인핸서 RNA (eRNA)이다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 ASO 및 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다.
또다른 측면에서, 인간 세포에서 CPS1의 전사를 증가시키는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 상기 세포에 본원에서 기술된 ASO 또는 본원에서 기술된 약제학적 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 세포는 간세포이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 이 ASO 또는 상기 약제학적 조성물과 접촉되지 않았던 세포와 비교하였을 때, 상기 세포에서 상기 조절 RNA의 양을 증가시킨다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 이 ASO 또는 상기 약제학적 조성물과 접촉되지 않았던 세포와 비교하였을 때, 상기 세포에서 상기 조절 RNA의 안정성을 증가시킨다.
또다른 측면에서, 요소 주기 장애를 치료하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 이러한 치료를 요하는 대상체에게 본원에서 기술된 ASO 또는 본원에서 기술된 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 CPS1-결핍이다.
일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 고-암모니아혈증이다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 상기 대상체의 세포(가령, 상기 ASO 또는 상기 약제학적 조성물에 접촉되지 않았던 세포(가령, 상기 대상체로부터 취한 유사 세포)와 비교하였을 때)에서 상기 조절 RNA의 양을 증가시킨다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 상기 대상체의 세포(가령, 상기 ASO 또는 상기 약제학적 조성물에 접촉되지 않았던 세포(가령, 상기 대상체로부터 취한 유사 세포)와 비교하였을 때)에서 상기 조절 RNA의 안정성을 증가시킨다.
일부 구체예들에서, 상기 세포는 간세포이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 염색체 상에서 유전자의 eRNA, paRNA, mRNA 및 천연 안티센스 전사체 (NAT)의 예시적인 개략도를 보여준다. 상기 eRNA, paRNA, 및 NAT는 모두 넌-코딩 RNAs이다. 상기 eRNA는 이 유전자의 인핸서로부터 양방량으로 전사된다. 상기 paRNA는 mRNA와 동일하게 이 유전자의 프로모터로부터 전사되지만, 안티센스 방량으로 전사된다. NAT는 그 자체의 다운스트림 프로모터로부터 안티센스 방향으로 전사되어, 상기 전사체가 이 mRNA와 적어도 부분적으로 중첩된다. 일반적으로, eRNAs 및 paRNAs는 유전자 발현을 상향조절하지만, 반면 NATs는 유전자 발현을 하향조절한다.
도 2는 regRNAs의 식별을 위한 마우스와 인간의 CPS1 ATAC-seq 및 H3K27Ac ChIP-SEQ 분석을 보여준다.
도 3은 ASO 및 비-표적화 대조군 (NTC)으로 처리된 간세포에서 상대적 CPS1 mRNA 발현을 보여준다.
도 4A는 화학적 변형이 있는 다양한 인간 CPS1 ASOs의 개략도를 보여준다. 밝은 회색은 2'-O-(2-메톡시메틸) (2'-MOE) 변형을 나타낸다. 짙은 회색은 잠금된 핵산 (LNA) 변형을 나타낸다. *C는 시티딘 상에서 5-메틸을 나타낸다. 도 4B는 상기 ASOs로 처리된 간 세포에서 상대적 CPS1 mRNA 발현을 나타낸다.
도 5A는 화학적 변형이 있는 다양한 인간 CPS1 ASOs의 개략도를 보여준다. 밝은 회색은 2'-O-(2-메톡시메틸) (2'-MOE) 변형을 나타낸다. 짙은 회색은 잠금된 핵산 (LNA) 변형을 나타낸다. 줄 괄호는 포스포디에스테르 (PO) 링키지를 나타낸다. *C는 시티딘 상에서 5-메틸을 나타낸다. 이 도면에 표시된 특이적 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드 서열들에는 고유한 서열 식별자가 할당된다. 도 5B는 화학적 변형이 있는 다양한 마우스 CPS1 ASOs의 개략도를 보여준다.
도 6A는 CPS1 ASOs로 처리된 야생형 및 OTC-결핍 간세포들에서 CPS1 mRNA 수준을 보여준다. CPS1 및 OTC mRNA 수준의 히트맵은 도 6B 및 도 6C에서 보여준다.
도 7A는 CPS1 ASOs로 처리된 야생형 및 OTC-결핍 간세포들에서 OTC mRNA 수준을 보여준다. CPS1 및 OTC mRNA 수준의 히트맵은 도 7B 및 도 7C에서 보여준다.
도 8은 CPS1 ASOs로 처리된 마우스에서 생체내 암모니아 공격의 개략도이다.
도 9A는 마우스 간에서 상대적 CPS1 mRNA 발현을 보여준다. 도 9B는 처리된 마우스의 혈장 암모니아 수준을 보여준다. 도 9C는 처리된 마우스에서 다른 요소 주기 유전자의 상대적 mRNA 발현을 보여준다. 도 9D는 ASO 처리 후 CPS1 유전자좌 주변 유전자들의 mRNA 발현을 보여준다.
도 10은 CPS1 ASO로 처리된 OTC 결핍 마우스들에서 암모니아 수준을 보여준다.
도 11A에서는 수컷 OTC-D 마우스들 (Otc spf/ash )에서 상기 ASO 처리 이후 생체내 혈장 암모니아 상에 분량투여 의존적 효과(dose dependent effect)를 보여준다. 도 11B에서 수컷 OTC-D 마우스들 (Otc spf/ash )에서 상기 ASO 처리 후 생체내 요소 상에 분량투여 의존적 효과가 있었다. 도 11C에서 암모니아의 감소는 투여된 총 ASO와 상관관계가 있음을 보여준다.
도 12A에서 CPS1 ASO 처리로 OTC 결핍 마우스들 (CPS1의 1.26 FC 및 OTC의 1.43 FC)에서 마우스 OTC 및 CPS1 mRNA 발현이 증가되었음을 보여준다. 도 12B에서 ASO 처리로 추가적인 요소 주기 유전자들, 이를 테면, Nags, Ass1, Asl, 및 Arg1이 증가되었음을 보여준다. 이들 두 도면 모두에서, WT C57 마우스들의 mRNA는 좌측 막대로 나타내며, PBS로 처리된 Otcspf-ash/J　는 중간 막대로 나타내며, ASO로 처리된 Otcspf-ash/J　는 우측 막대로 나타낸다.
도 13에서 마우스 Otc 결핍 간은 암모니아 처리 후 30분 시점에서 고-암모니아혈증이 나타남을 보여준다. 마우스 CPS1 ASO로 처리하면 암모니아가 WT 수준으로 감소되었다.
도 14는 화학적 변형을 갖는 다양한 인간 CPS1 ASOs의 개략도를 제공한다. 이 도면에 표시된 특이적 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드 서열들에는 고유한 서열 식별자가 할당된다.
도 15A에서 hCPS1-ASO-1x는 인간화된 간을 갖는 OTCdef 마우스들에서 생체내 혈장 암모니아를 감소시켰음을 보여준다. 도 15B에서 hCPS1-ASO-1x는 인간화된 간을 갖는 OTCdef 마우스들에서 생체내 요소를 증가시켰음을 보여준다. 도 15C에서 hCPS1-ASO-1g는 5mg/kg 및 20mg/kg의 ASO로 처리후 OTC 단백질 수준을 또한 증가되었음을 보여준다.
도 16에서 표시된 ASOs는 건강한 인간 간세포 및 OTCdef 일차 인간 간세포 모두에서 CPS1 mRNA 및 요소생성을 증가시켰음을 보여준다.
도 17에서 hCPS1-ASO-1x는 27일차 시점까지 오로지 PBS만으로 처리한 것과 비교하여, NHPs에서 암모니아 생산을 통계적으로 유의미한 양만큼 감소시켰음을 보여준다. 도 17에서 NHP 실험에서 시간 경과 및 분량투여마다 암모니아 AUC를 또한 제공한다.
도 18에서 hCPS1-ASO-1x는 최대 5주 동안 5mg/kg의 단일 분량투여한 후, NHPs에서 암모니아를 감소시켰다는 것을 보여준다.
도 19는 상기 NHP가 22일차, 29일차 및 36일차 시점에서 암모니아 AUC 정량화의 연구를 제공한다.
도 20에서 hCPS1-ASO-1x와 13C-아세트산 나트륨 처리의 조합은 hCPS1-ASO-1x 단독에 비해 43일차 시점에서 NHPs에서 요소 생성을 향상시켰음을 보여준다.
상세한 설명
본 명세서는 조절 RNAs, 이를 테면, 프로모터-연합된 RNAs 및 인핸서 RNAs를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASOs), 그리고 유전자 발현을 조절하기 위해 이들 ASOs를 이용하는 방법들을 제공한다. 이들 방법들은 예를 들면, 질환-유발 유전자들, 이를 테면, 카르바모일-포스페이트 합성효소 1 (CPS1)의 발현 수준을 조절하고, 이로써 비정상적 유전자 발현과 연합된 질환 이를 테면, 요소 주기 장애를 치료하는 유전자 산물들의 수준 조절에 유용하다. 요소 주기 장애는 Haberle et al., 2012, Orphanet J. Rare Dis. 7:32에서 파악되며, 본원에 이의 전문이 참고자료에 편입된다. 요소 주기 장애로 인해 암모니아 및 기타 전구체 대사산물들이 축적되고, 이로써 고-암모니아혈증 및 관련 증상들, 이를 테면, 뇌부종, 그리고 무기력증 식욕부진, 호흡과다 또는 저호흡, 저체온증, 발작, 신경학적 자세 및 혼수상태의 관련 징후들이 발생하게 된다. 경미하거나 부분적인 요소 주기 효소 결핍은 암모니아 축적 및 혈장 암모니아 농도 상승을 유발시킨다. CPS1 결핍은 상기 요소 주기 장애들 중 가장 심각한 장애다. CPS1이 완전히 결핍된 개체들은 급속히 고-암모니아혈증이 발생하고, 추가적인 고-암모니아혈증이 발생할 위험이 있다.
I. 정의
본 출원의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어 및 구문이 아래에 정의되어 있다.
본원에 사용된 용어 관사("a" 및 "an")는 "하나 또는 그 이상"은 문맥 상에서 부적절하지 않는 한, 복수를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "카르바모일-포스페이트 합성효소 1" 또는 "CPS1"이란 본 출원의 우선일 현재 적용 가능한 데이터베이스에 기재된 UniProt 수탁번호 P31327의 단백질 및 관련된 이소형(isoforms) 및 오솔로그(orthologs), 해당 단백질을 인코딩하는 유전자 (가령, NCBI Entrez Gene: 1373), 또는 이 단백질을 인코딩하는 mRNA (가령, 수탁번호 NM_001122633.3, NM_001369256.1, NM_001369257.1, 및 NM_001875.5)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 RNA" 및 "regRNA"는 호환적으로 이용되며, 유전자(가령, 단백질-코딩 유전자)의 조절 요소로부터 전사된 넌코딩 RNA를 지칭하며, 이때 상기 유전자는 넌코딩 RNA 자체는 아니다. 예시적인 조절 요소들에는 프로모터, 인핸서, 및 슈퍼-인핸서들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 안티센스 방향으로 프로모터로부터 전사된 넌코딩 RNA를 "프로모터 RNA" 또는 "paRNA"로 또한 부른다. 센스 방향 또는 안티-센스 방향으로 인핸서 또는 슈퍼-인핸서로부터 전사된 넌코딩 RNA를 또한 "인핸서 RNA" 또는 "eRNA"로 또한 불린다. 유전자 전사체의 적어도 일부와 상보적인 천연 안티센스 전사체 (NAT)는 본원에 사용된 바와 같은 조절 RNA가 아닌 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "발생기(nascent) RNA"라는 용어는 아직 전사 중이거나, RNA 중합효소에 의해 방금 전사되었으며, 전사되는 DNA에 묶여 있는 상태로 남아 있는 RNA를 의미한다. 전사되는 DNA에서 분리된 RNA를 "묶여있지 않은 RNA"라고도 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "ASO"는 적합한 조건에서 표적 핵산과 혼성화하는 염기서열을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 접합체를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, regRNA의 안정성은 regRNA의 분해 속도와 역-상관관계가 있다. ASO가 regRNA의 안정성을 증가시키는 경우, 상기 regRNA의 분해 속도는 감소된다. ASO가 regRNA의 안정성을 감소시키는 경우, 상기 regRNA의 분해 속도는 증가된다. regRNA의 분해 속도는 새로운 regRNA의 합성을 차단시키고, 기존 regRNA의 반감기를 평가함으로써, 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료되는 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체에는 바람직하게는 포유동물 (가령, 설치류, 영장류, 유인원, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 및 이와 유사한 것들)이 내포되지만, 이에 국한되지 않고, 더욱 바람직하게는 인간이 내포된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "효과량"이란 유익한 또는 원하는 효과를 얻는데 충분한 화합물 (가령, 본 출원의 화합물)의 양을 지칭한다. 효과량은 한 번 또는 그 이상의 투여, 적용 또는 용량으로 투여될 수 있고, 특정한 제형 또는 투여 경로로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"이란 상태, 질환, 장애 등의 개선, 또는 증상의 개선을 초래하는 임의의 효과, 가령, 경감(lessening), 감소(reducing), 조절, 개선 또는 제거를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"이란 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료 용도에 특별히 적합한 조성물로 만들기 위하여, 활성 제제와 운반체 (비활성 또는 활성)의 조합을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 수용가능한 운반체"란 표준 약제학적 운반체, 이를 테면, 인산염 완충된 염 용액, 물, 에멸젼 (가령, 이를 테면, 유중수(oil/water) 또는 수중유(water/oil) 에멸젼), 그리고 각종 형태의 가습 제제를 지칭한다. 상기 조성물들에는 또한 안정화제 및 보존제가 내포될 수 있다. 운반체, 안정화제 및 어쥬번트(adjuvants)의 예들은 가령, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA (1975)을 참고한다.
본 명세서 전체를 통하여, 조성물이 특정 성분을 갖거나, 내포하거나, 포함하는 것으로 기술된 경우, 또는 공정 및 방법이 특정 단계를 갖거나, 내포하거나, 포함하는 것으로 기술되는 경우, 추가적으로, 언급된 구성 요소로 본질적으로 구성되거나, 구성되는 본 출원의 조성물이 있고, 본 출원에 따라 언급된 구성 요소로 본질적으로 구성되거나, 구성되는 방법 및 공정들이 있는 것으로 간주된다.
일반적으로, 백분율을 특정하는 조성물은 달리 명시되지 않는 한, 중량 기준이다. 더욱이, 변수에 정의가 동반되지 않는 경우, 기존의 변수 정의가 관리한다.
II. 안티센스 올리고뉴클레오티드
본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASOs)는 표적 유전자의 조절 요소로부터 전사된 regRNA와 혼성화된다. eRNAs 및 paRNAs는 모두 유전자 발현을 촉진하거나 상향조절하는 regRNAs인 것으로 이해된다 (도 1). 특정 구체예들에서, 상기 표적 regRNA는 eRNA이다. 특정 구체예들에서, 상기 표적 regRNA는 paRNA이다. eRNAs 는 당분야에 공지된 방법들, 이를 테면, 시퀀싱을 이용한 트랜스포사제 접근 가능 크로마틴 분석 (ATAC-seq), 글로벌 런-온(run-on) 시퀀싱, 정밀 런-온 시퀀싱, 캡(cap) 분석 유전자 발현, 그리고 히스톤 변형 분석 (가령, Sartorelli & Lauberth, Nat. Struct. Mol. Biol. (2020) 27:521-28; PCT 출원 공개 번호 WO2013/177248 참고)를 이용하여 식별할 수 있다. paRNAs는 안티센스 방향으로 표적 유전자들의 프로모터들로부터 전사된 RNAs이다 (센스 방향의 전사체들은 상기 표적 유전자들의 mRNAs이다). 특정 위치와 방향을 고려하여, 유사한 방법으로 식별할 수 있다. 인간 CPS1 유전자에서, 동일한 인핸서 영역으로부터 전사되는 여러 개의 서로 다른 eRNAs가 확인되었다. 예시적인 regRNA의 뉴클레오티드 서열들은 아래 표 1에 제공되어 있다. 이들 regRNAs 중 임의의 것이 본 명세서에 개시된 ASO의 표적 regRNA로서 고려된다.
표 1. 예시적인 regRNAs
본 명세서는 표적 regRNA의 양 또는 안정성을 증가시키고, 이로 인하여 상기 표적 유전자의 발현을 증가시키는 ASOs를 기술한다. 이는 eRNA를 억제하도록 설계된 이전에 설명한 ASOs와는 상이하다 (가령, PCT 출원 공개 번호 WO2013/177248 및 PCT 출원 공개 번호 WO2017/075406). 이론에 얽매이지 않고, regRNAs를 상향 조절하는 ASOs의 능력은 regRNA의 표적 서열 선택 및/또는 상기 ASOs의 화학적 변형에 기인한다고 가정한다.
ASOs의 서열들
본원에서 기술된 바와 같이, 표적 CPS1 regRNA의 5' 단부 또는 3' 단부에 더 가까운 서열에 결합하는 ASOs는 상기 regRNA를 상향조절할 가능성이 더 높다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 ASO는 상기 표적 CPS1 regRNA의 말단 영역에 혼성화되고, 상기 regRNA의 기능적 영역 차단없이, 5'→3' 및/또는 3'→5' RNA 분해를 방지하거나, 지연시키는 것으로 가정한다. 특정 구체예들에서, 본원에서 기술된 ASO는 상기 표적 regRNA에서 이 표적 regRNA의 5' 단부 또는 3' 단부로부터 300개, 250개, 200개, 150개, 100개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 10개를 넘지 않는 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 본원에서 기술된 ASO는 상기 표적 regRNA에서 이 표적 regRNA의 5' 단부로부터 300개, 250개, 200개, 150개, 100개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 10개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 서열에 상보적이다 (가령, 상기 ASO와 듀플렉스를 형성하는 regRNA 서열의 가장 5'의 뉴클레오티드는 상기 표적 regRNA의 5' 단부로부터 300개, 250개, 200개, 150개, 100개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 10개를 넘지 않는 뉴클레오티드이다). 특정 구체예들에서, 본원에서 기술된 ASO는 상기 표적 regRNA에서 이 표적 regRNA의 3' 단부로부터 300개, 250개, 200개, 150개, 100개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 10개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 서열에 상보적이다 (가령, 상기 ASO와 듀플렉스를 형성하는 regRNA 서열의 가장 3'의 뉴클레오티드는 상기 표적 regRNA의 3' 단부로부터 300개, 250개, 200개, 150개, 100개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 10개를 넘지 않는 뉴클레오티드이다).
특정 구체예들에서, 상기 ASO는 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개를 넘지 않는 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 8개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 또는 100개를 넘지 않는 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 적어도 8개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 또는 100개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 적어도 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
특정 구체예들에서, 상기 ASO는 그 자체 내에서 또는 다른 동일한 ASO 분자들 사이에 형성된 안정적인 2차 구조가 부족하도록 설계되어, 상기 표적 regRNA와 혼성화할 수 있는 단일-가닥 형태의 ASO 양을 증가시킨다. 2차 구조를 예측하는 방법들은 해당 분야에 알려져 있고 (가령, Seetin and Mathews, Methods Mol. Biol. (2012) 905:99-122; Zhao et al., PLoS Comput. Biol. (2021) 17(8) 참조):e1009291) 및 웹 기반 프로그램(가령, RNAfold)을 일반 사용자가 사용할 수 있다.
예를 들면, ASOs는 인간 CPS1 eRNA를 표적으로 하도록 기획되었다. 이들 ASOs의 뉴클레오티드 서열들은 하기 표 2에 제공되어 있다.
표 2. regRNAs를 표적으로 하는 예시적인 ASO 서열들
표 3은 선별된 hCPS1-ASOs의 추가적인 화학적 변형을 제공한다.
일부 구체예들에서, hCPS1-ASO-317-492 (서열 식별 번호: 487-662)는 pS 결합, 5-메틸시토신, 그리고 온전한 MOE 뉴클레오티드들을 포함한다.
혼성화 및 ΔG
본원에 사용된 용어 "혼성화하는" 또는 "혼성화하다"란 2개의 핵산 가닥 (가령, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산)이 반대 가닥의 염기쌍 사이에 수소 결합을 형성하고, 이로 인하여 듀플렉스를 형성하는 것으로 이해되어야 한다. 두 핵산 가닥 사이의 결합 친화성는 혼성화의 강도다. 이는 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 이중화되는 온도로 정의되는 용융 온도 (Tm)로 종종 설명된다. 생리학적 조건에서 Tm은 친화성에 엄격하게 비례하지 않는다 (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides　13:515-537). 표준 상태 Gibbs 자유 에너지 ΔG°는 결합 친화성를 보다 정확하게 나타내는데, 이는 ΔG°=-RTIn(Kd)에 의한 반응의 해리 상수 (Kd)와 관련되며, 여기서 R은 기체 상수이고, T는 절대 온도이다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 상기 표적 핵산 사이의 반응의 매우 낮은 ΔG°는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 강한 혼성화를 반영한다. ΔG°는 수용성 농도가 1M, pH가 7이며, 온도가 37℃인 반응과 관련된 자유 에너지이다. 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 자발적인 반응이며, 자발적인 반응의 경우 ΔG°는 0보다 작다. ΔG°는 예를 들어, Hansen et al., 1965, Chem, Comm.　36-38 및 Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today에서 기술된 등온 적정 열량계 (ITC) 방법을 사용하여 실험적으로 측정할 수 있다.　당업자는 ΔG° 측정에 상용 장비를 사용할 수 있다는 것을 알 것이다. ΔG°는 Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 및 McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405에서 기술된 적절하게 도출된 열역학적 매개변수 사용하여, SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA.　95: 1460-1465에서 기술된 가장 가까운 이웃 모델을 사용하여 수치적으로 추정할 수도 있다. 혼성화를 통해 의도한 핵산 표적을 조절할 수 있는 가능성을 갖기 위해, 본 명세서의 올리고뉴클레오티드는 길이가 10-30개 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10kcal/mol 미만의 추정된 ΔG° 값으로 표적 핵산에 혼성화된다. 일부 구체예들에서, 혼성화 정도 또는 강도는 표준 상태 Gibbs 자유 에너지 ΔG°로 측정된다. 올리고뉴클레오티드는 -10kcal/mol 범위 미만의, 이를 테면, -15kcal/mol 미만, 이를 테면, -20kcal/mol 미만, 이를 테면, 8-30개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드의 경우 -25kcal/mol 미만 범위의 추정된 ΔG° 값으로 표적 핵산에 혼성화할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60kcal/mol, 이를 테면, -12 내지 -40kcal/mol, -15 내지 -30kcal/mol, -16 내지 -27kcal/mol, 또는 -18 내지 -25kcal/mol의 추정된 ΔG° 값으로 표적 핵산에 혼성화할 수 있다.
듀플렉스 영역
구절 "듀플렉스 영역"이란 Watson-Crick 염기쌍 결합에 의해 서로 염기쌍을 형성하거나, 상보적이거나 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥 사이에 안정화된 이중나선을 허용하는 다른 방식으로 염기상을 형성하는 두 개의 상보적이거나 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미한다. 예를 들면, 21개 뉴클레오티드 단위를 갖는 폴리뉴클레오티드 가닥은 21개 뉴클레오티드 단위를 갖는 또 다른 폴리뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있지만, 각 가닥의 19개 염기만이 상보적이거나 실질적으로 상보적이므로 "듀플렉스 영역"은 19개 염기쌍을 갖는다. 나머지 염기들은 예를 들어, 5' 및 3' 오버행으로 존재할 수 있다. 더욱이, 상기 듀플렉스 영역 내에서 100% 상보성을 요구하지는 않는다. 듀플렉스 영역 내에서는 실질적인 상보성이 허용된다. 실질적인 상보성은 70% 또는 그 이상의 상보성을 의미한다. 예를 들면, 19개 염기쌍으로 구성된 듀플렉스 영역의 불일치로 인해 94.7%의 상보성이 발생하고, 상기 듀플렉스 영역이 실질적으로 상보적이 된다. 듀플렉스 영역은 2개의 별도의 올리고뉴클레오티드 가닥에 의해 형성될 수 있을 뿐만 아니라, 듀플렉스 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일 올리고뉴클레오티드 가닥에 의해 형성될 수 있다.
dsRNA에는 dsRNA가 사용되는 조건 하에서 듀플렉스 구조를 형성하기 위해 상보적인, 혼성화되는 두 개의 RNA 가닥이 내포된다. dsRNA의 한 가닥 (안티센스 가닥)에는 표적 서열에 실질적으로 상보적이고, 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역이 내포된다. 상기 표적 서열은 CPS1 regRNA, 이를 테면, eRNA 또는 paRNA의 서열로부터 파생될 수 있다. 다른 가닥 (센스 가닥)에는 안티센스 가닥에 상보적인 영역들이 내포되어, 적절한 조건에서 결합하면 두 가닥이 혼성화되어 듀플렉스를 형성한다. 본 명세서의 도처에서 기술되고, 당업계에 공지된 바와 같이, dsRNA의 상보적 서열은 별도의 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 것과는 대조적으로 단일 핵산 분자의 자가-상보적 영역으로서 또한 함유될 수도 있다. 일반적으로, 상기 듀플렉스 구조의 길이는 15개 내지 50개 염기 상, 가령, 15-50, 15-49, 15-48, 15-47, 15-46, 15-45, 15-44, 15-43, 15-42, 15-41, 15-40, 15-39, 15-38, 15-37, 15-36, 15-35, 15-34, 15-33, 15-32, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-50, 18-49, 18-48, 18-47, 18-46, 18-45, 18-44, 18-43, 18-42, 18-41, 18-40, 18-39, 18-38, 18-37, 18-36, 18-35, 18-34, 18-33, 18-32, 18-31, 18-30, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18- 21, 18-20, 19-50, 19-49, 19-48, 19-47, 19-46, 19-45, 19-44, 19-43, 19-42, 19-41, 19-40, 19-39, 19-38, 19-37, 19-36, 19-35, 19-34, 19-33, 19-32, 19-31, 19-30, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-50, 20-49, 20-48, 20-47, 20-46, 20-45, 20-44, 20-43, 20-42, 20-41, 20-40, 20-39, 20-38, 20-37, 20-36, 20-35, 20-34, 20-33, 20-32, 20-31, 20-30, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-50, 21-49, 21-48, 21-47, 21-46, 21-45, 21-44, 21-43, 21-42, 21-41, 21-40, 21-39, 21-38, 21-37, 21-36, 21-35, 21-34, 21-33, 21-32, 21-31, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 21-22, 22-50, 22-49, 22-48, 22-47, 22-46, 22-45, 22-44, 22-43, 22-42, 22-41, 22-40, 22-39, 22-38, 22-37, 22-36, 22-35, 22-34, 22-33, 22-32, 22-31, 22-30, 22-29, 22-28, 22-27, 22-26, 22-25, 22-24, 22-23, 23-50, 23-49, 23-48, 23-47, 23-46, 23-45, 23-44, 23-43, 23-42, 23-41, 23-40, 23-39, 23-38, 23-37, 23-36, 23-35, 23-34, 23-33, 23-32, 23-31, 23-30, 23-29, 23-28, 23-27, 23-26, 23-25, 또는 23-24개 길이의 염기이다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본 명세서의 일부인 것으로 고려된다.
유사하게, 상기 표적 서열에 상보적인 영역의 길이는 15개 내지 50개 뉴클레오티드, 가령, 15-50, 15-49, 15-48, 15-47, 15-46, 15-45, 15-44, 15-43, 15-42, 15-41, 15-40, 15-39, 15-38, 15-37, 15-36, 15-35, 15-34, 15-33, 15-32, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-50, 18-49, 18-48, 18-47, 18-46, 18-45, 18-44, 18-43, 18-42, 18-41, 18-40, 18-39, 18-38, 18-37, 18-36, 18-35, 18-34, 18-33, 18-32, 18-31, 18-30, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18- 21, 18-20, 19-50, 19-49, 19-48, 19-47, 19-46, 19-45, 19-44, 19-43, 19-42, 19-41, 19-40, 19-39, 19-38, 19-37, 19-36, 19-35, 19-34, 19-33, 19-32, 19-31, 19-30, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-50, 20-49, 20-48, 20-47, 20-46, 20-45, 20-44, 20-43, 20-42, 20-41, 20-40, 20-39, 20-38, 20-37, 20-36, 20-35, 20-34, 20-33, 20-32, 20-31, 20-30, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-50, 21-49, 21-48, 21-47, 21-46, 21-45, 21-44, 21-43, 21-42, 21-41, 21-40, 21-39, 21-38, 21-37, 21-36, 21-35, 21-34, 21-33, 21-32, 21-31, 21-30, 21- 29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 21-22, 22-50, 22-49, 22-48, 22-47, 22-46, 22-45, 22-44, 22-43, 22-42, 22-41, 22-40, 22-39, 22-38, 22-37, 22-36, 22-35, 22-34, 22-33, 22-32, 22-31, 22-30, 22-29, 22-28, 22-27, 22-26, 22-25, 22-24, 22-23, 23-50, 23-49, 23-48, 23-47, 23-46, 23-45, 23-44, 23-43, 23-42, 23-41, 23-40, 23-39, 23-38, 23-37, 23-36, 23-35, 23-34, 23-33, 23-32, 23-31, 23-30, 23-29, 23-28, 23-27, 23-26, 23-25, 또는 23-24개 길이의 뉴클레오티드이다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본 명세서의 일부인 것으로 고려된다.
ASOs의 화학적 변형
특정 구체예들에서, 상기 ASO는 오로지 DNA만으로 구성되지 않는다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 천연 뉴클레오티드 (가령, 리보뉴클레오티드)에 비해 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다. 본 명세서의 ASOs에는 다양한 화학적 변형이 내포될 수 있다. 이러한 변형들에는 리보스 그룹에서 하나 또는 그 이상의 변형, 포스페이트 그룹에서 하나 또는 그 이상의 변형, 핵염기에서 하나 또는 그 이상의 변형, 하나 또는 그 이상의 말단 변형, 또는 이의 조합이 내포될 수 있다. 일부 구체예들에서, 표 2에서 나타낸 바와 같이, regRNA를 표적으로 하는 예시적인 ASO 서열은 화학적으로 변형된다. 예를 들면, hCPS1-ASO-1은 도 5A에 도시된 바와 같이, hCPS1-ASO1-1a 내지 hCPS1-ASO1-1g 중 임의의 어느 하나의 변형을 포함하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형들은 2'-O-(2-메톡시메틸) (2'-MOE, MOE), 잠금된 핵산 (LNA), 시티딘 상의 5-메틸, cET, 포스포로티오에이트 (PS) 링키지, 및/또는 포스포디에스테르 (PO) 링키지, 또는 이의 임의의 조합일 수 있지만, 이에 국한되지 않을 수 있다. RNA의 화학적 변형은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, PCT 출원 공개 번호 WO2013/177248에 기재되어 있다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO에서 각 시티딘은 5-메틸에 의해 변형된다. 화학적 변형을 포함하는 예시적인 ASOs는 도 5A 및 도 14에서 나타낸다.
본 명세서의 ASOs와 함께 사용되는 다양한 화학적 변형에는 다음의 것들이 내포되지만, 이에 국한되지 않는다: 3'-말단 데옥시-티민 (dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-플루오르 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠금된 뉴클레오티드, 풀린 뉴클레오티드, 형태학적으로 속박된 뉴클레오티드, 속박된 에틸 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴-변형된 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-변형된 뉴클레오티드, 2'-히드록실-변형된 뉴클레오티드, 2'-메톡시메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬-변형된 뉴클레오티드, 몰포리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비-천연 염기를 포함하는 뉴클레오티드, 테트라히드로피란 변형된 뉴클레오티드, 1,5-안히드로헥시톨 변형된 뉴클레오티드, 시클로헥세닐 변형된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트 그룹을 포함하는 뉴클레오티드, 5 '-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 그리고 5 '-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드.
특정 구체예들에서, 상기 ASO는 하나 또는 그 이상의 핵 RNases에 저항성인 화학적으로 변형된 RNA 폴리뉴클레오티드 (가령, 엑소좀 복합체)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO에서 모든 뉴클레오티드 염기는 변형된다. 특정 구체예들에서, 상기 화학적 변형은 β-D-리보뉴클레오시드, 2'-변형된 뉴클레오시드 (가령, 2'-O-(2-메톡시메틸) (2'-MOE), 2'-O-CH3, 또는 2'-플루오르-아라비노 (FANA)), 이환의 당 변형된 뉴클레오시드 (가령, 속박된 에틸 또는 잠금된 핵산 (LNA)을 보유하는), 및/또는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드간 결합 (가령, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 링키지)을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 화학적 변형은 2'-MOE 및 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO의 적어도 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드들이 2'-MOE에 의해 변형된다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO의 각 리보뉴클레오티드는 2'-MOE에 의해 변형된다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO의 적어도 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO의 각 뉴클레오티드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이다.
상기 본 명세서의 ASOs와 함께 이용될 수 있는 뉴클레오티드간 링키지 변형에는 포스포로티오에이트 "PS"(P(S)), 포스포르아미데이트 (P(NR1R2) 이를 테면, 디메틸아미노포스포르아미데이트(P(N(CH3)2)), 포스포노카르복실레이트 (P(CH2)nCOOR) 이를 테면, 포스포노아세테이트 "PACE"(P(CH2COO-)), 티오포스포노카르복실레이트 ((S)P(CH2)nCOOR) 이를 테면, 티오포스포노아세테이트 "티오PACE"((S)P(CH2COO-)), 알킬포스포네이트 (P(C1-3알킬) 이를 테면, 메틸포스포네이트 -P(CH3), 보라노포스포네이트 (P(BH3)), 및 포스포로디티오에이트 (P(S)2)가 내포될 수 있지만, 이에 국한되지는 않는다.
상기 화학 구조들은 글로 설명될 수도 있다. 이러한 경우들에서, 'M'은 MOE를 나타내고; 'd'는 DNA를 나타내고, 'L'은 LNA를 나타내고, '='는 포스포로티오에이트 (PS) 링키지를 나타내고, '-'는 포스포디에스테르 (PO) 링키지를 나타내고; '5C'는 5-메틸시토신을 나타내고, 'ag'는 GalNAc를 나타내고, 'tg' 또는 "TEG"는 Teg-GalNAc를 나타내고, 'ag' 또는 'AlGal'는 GalNAc를 나타내고, 'BioTEG'는 비오틴을 나타내고, 'CholTEG'는 콜레스테롤을 나타내고, 'c'는 cET를 나타내고, 그리고 '^'는 FANA를 나타낸다.
모호함을 피하기 위해, 이 LNA는 다음 구조를 갖는다:
이때 B는 특정 지정된 염기다.
선택된 ASOs에 대한 예시적인 서면 설명이 해당 도면과 함께 표 3에서 제공되며, 도 5A 및 도 14는 이들 변형의 시각적 현시를 제공한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 1-15, 91-391, 또는 487-662로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 16-48, 392-480, 또는 482-486로 구성된 군에서 선택된 서열 및 화학적 변형을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 1-48 또는 91-662로 구성된 군에서 선택된 서열 및/또는 화학적 변형을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 80-88로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 51-68로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 표 2에서 제시된 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO는 표 3, 그리고 도 4A, 도 5A, 도 5B, 및 도 14에서 제시된 서열 및/또는 상기 화학적 변형을 포함한다.
특정 구체예들에서, 상기 ASO는 5' 단부, 3' 단부, 또는 이둘 모두에서 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함한다. 이론에 얽매이지 않고, 폴리뉴클레오티드 (가령, 폴리리보뉴클레오티드)의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 화학적 변형으로 이 폴리뉴클레오티드가 안정화될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 이 ASO의 5' 단부에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드에서 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 이 ASO의 3' 단부에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드에서 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 이 ASO의 5' 단부에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드에서 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함하고, 이 ASO의 3' 단부에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드에서 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함한다.
고-친화성 변형된 뉴클레오시드
고-친화성 변형된 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드이며, 올리고뉴클레오티드에 통합되면, 예를 들면, 용융 온도 (Tm)로 측정하였을 때, 이의 상보적 표적에 대한 해당 올리고뉴클레오티드의 친화성를 강화시킨다. 본 명세서의 고-친화성 변형된 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드당 선호적으로 용융 온도를 +0.5 내지 +12℃, 이를 테면, +1.5 내지 +10℃ 또는 +3 내지 +8℃ 증가시키게 된다. 다수의 고-친화성 변형된 뉴클레오시드는 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 많은 2' 치환된 뉴클레오시드 뿐만 아니라 잠금된 핵산 (LNA)이 내포되며 (가령, Freier & Altmann, Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 참고), 이들 각각은 본원의 참고자료에 편입된다.
당 변형
본원에서 기술된 ASOs들은 변형된 당 모이어티, 가령, DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 모이어티와 비교하였을 때, 이런 당 모이어티의 변형을 보유하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 주로 친화성 및/또는 뉴클레아제 저항성과 같은 올리고뉴클레오티드의 특정 속성들을 개선하려는 목적으로 리보스 당 잔기가 변형된 수많은 뉴클레오시드가 만들어졌다. 이러한 변형에는 리보스 고리 구조가 변형된 것들이 내포되는데, 가령, 일반적으로 리보스 고리(LNA)의 C2와 C4 탄소 사이에 2-라디칼 브리지가 있는 육탄당 고리(HNA) 또는 이환 고리로 대체된 변형, 또는 일반적으로 C2와 C3 탄소 사이의 결합이 부족한 비-연계된 리보스 고리 (가령, UNA)으로 대체된 변형이 내포된다. 기타 당 변형된 뉴클레오시드에는 예를 들면, 비시클로헥소스 핵산 (가령, PCT 출원 공개 번호 WO2011/017521 참고) 또는 삼환 핵산 (가령, PCT 출원 공개 번호 WO2013/154798)이 내포되며, 이들 모두 본원의 참고자료에 편입되어 있다. 변형된 뉴클레오시드에는 예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA) 또는 몰포리노 핵산의 경우 예를 들어, 당 부분이 비-당 부분으로 대체된 뉴클레오시드들이 또한 내포된다.
당 변형에는 리보스 고리의 치환기를 수소 이외의 기, 또는 DNA 및 RNA 뉴클레오시드에서 자연적으로 발견되는 2'-OH 기로 변경함으로써 이루어진 변형도 또한 내포된다. 치환체들은 예를 들어, 2', 3', 4' 또는 5' 위치에 도입될 수 있다.
일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티, 이를 테면, 2'-O-메틸 (2'OMe) 모이어티, 2'-O-메톡시메틸 모이어티, 이환 당 모이어티, PNA (가령, 당-포스페이트 백본 위치에 반복 단위로써 아미드 결합 또는 카르보닐 메틸렌 링키지에 의해 연계된 하나 또는 그 이상의 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위를 포함하는 올리고뉴클레오티드), 잠금된 뉴클레오시드 (LNA) (가령, 하나 또는 그 이상의 잠김 리보스를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 그리고 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 2'OMe 뉴클레오티드의 혼합물일 수 있음), c-ET (가령, 하나 또는 그 이상의 cET 당을 포함하는 올리고뉴클레오티드), cMOE (가령, 하나 또는 그 이상의 cMOE 당을 포함하는 올리고뉴클레오티드), 몰포리노 올리고머 (가령, 하나 또는 그 이상의 포스포로디아미데이트 몰포리노 올리고머를 포함하는 백본을 포함하는 올리고뉴클레오티드), 2'-데옥시-2'-플루오르 뉴클레오시드 (가령, 하나 또는 그 이상의 2'-플루오르-β-D-아라비노뉴클레오시드를 포함하는 올리고뉴클레오티드), tcDNA (가령, 하나 또는 그 이상의 tcDNA 변형된 당을 포함하는 올리고뉴클레오티드), 속박된 에틸 2'-4'-브릿지연결된 핵산 (cEt), S-cEt, 에틸렌 브릿지연결된 핵산 (ENA) (가령, 하나 또는 그 이상의 ENA 변형된 당을 포함하는 올리고뉴클레오티드), 헥시톨 핵산 (HNA) (가령, 하나 또는 그 이상의 HNA 변형된 당을 포함하는 올리고뉴클레오티드), 또는 삼환 유사체 (tcDNA) (가령, 하나 또는 그 이상의 tcDNA 변형된 당을 포함하는 올리고뉴클레오티드)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드는 2-티오우라실 ("2-티오U"), 2-티오시토신 ("2-티오C"), 4-티오우라실 ("4-티오U"), 6-티오구아닌 ("6-티오G"), 2-아미노아데닌 ("2-아미노A"), 2-아미노퓨린, 슈도우라실, 하이포산틴, 7-데아자구아닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 7-데아자아데닌, 7-데아자-8-아자아데닌, 5-메틸시토신 ("5-메틸C"), 5-메틸우라실 ("5-메틸U"), 5-히드록시메틸시토신, 5-히드록시메틸우라실, 5,6-데히드로우라실, 5-프로피닐시토신, 5-프로피닐우라실, 5-에티닐시토신, 5-에티닐우라실, 5-알릴우라실 ("5-알릴U"), 5-알릴시토신 ("5-알릴C"), 5-아미노알릴우라실 ("5-아미노알릴U"), 5-아미노알릴-시토신 ("5-아미노알릴C"), 무염기 뉴클레오티드, Z 염기, P 염기, 비-구조적 핵산 ("UNA"), 이소구아닌 ("이소G"), 및 이소시토신 ("이소C"), 글리세롤 핵산 (GNA), 티오몰포리노 (C4H9NS) 또는 티오포스포르아미데이트 몰포리노 (TMOs)로 구성된 군에서 선택된 핵염기를 포함한다. 글리세롤 핵산 (GNA) (글리콜 핵산으로도 또한 알려짐)은 Zhang et al, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 4.40.1-4.40.18, 2010년 9월에 기재되어고, 본원의 참고자료에 편입되어 있다. 티오포스포르아미데이트 몰포리노 올리고뉴클레오티드의 합성은 Langer et al, J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 38, 16240-16253에 기술되어 있다.
2' 당 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖는 뉴클레오시드 (2' 치환된 뉴클레오시드) 또는 LNA (2'-4' 바이라디칼 브릿지연결된) 뉴클레오시드와 같이 리보스 고리의 2' 탄소와 두 번째 탄소 사이에 브리지를 형성할 수 있는 2' 연결된 바이라디칼을 포함한다.
이론에 얽매이지 않고, 상기 2' 변형된 당은 올리고뉴클레오티드에 대한 향상된 결합 친화성 및/또는 증가된 뉴클레아제 저항성을 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예시들은 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시메틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오르-RNA, 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예시로써, 가령, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, 그리고 Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937을 참고하며, 이들 각각은 본원의 참고자료에 편입된다.
잠금된 핵산 뉴클레오시드 (LNA 뉴클레오시드)
"LNA 뉴클레오시드"는 전술한 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2' 및 C4'를 연결하는 2-라디칼 연결("2'-4' 브릿지"로도 지칭됨)을 포함하는 2'-당 변형된 뉴클레오시드이며, 상기 연결로 리보스 고리의 형태를 제한하거나, 잠금한다. 환언하면, 잠금된 뉴클레오시드는 4'-CH2-O-2' 브릿지를 포함하는 이환 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드다. 이 구조는 3'-단부 구조적 입체형태에서 리보스를 효과적으로 "잠금"한다. 올리고뉴클레오티드에 잠금된 뉴클레오시드를 추가하면 혈청 내 올리고뉴클레오티드의 안정성이 증가하고, 표적-외 효과가 감소하는 것으로 나타났다 (Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). 이들 뉴클레오시드는 때로 브릿지화된 핵산 또는 이환 핵산 (BNA)으로 불린다. 리보스 형태의 잠금은 LNA가 상보적 RNA 또는 DNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드에 통합될 때 향상된 혼성화 친화도(듀플렉스 안정화)와 연관된다. 이는 올리고뉴클레오티드/보체 듀플렉스의 용융 온도를 측정하여 일상적으로 결정할 수 있다. 예시적인 LNA 뉴클레오시드에는 베타-D-옥시-LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA, 이를 테면, (S)-6'-메틸-베타-D-옥시-LNA (ScET) 및 ENA가 내포된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에 사용하기 위한 이환식 뉴클레오시드의 예시에는 4'와 2' 리보실 고리 원자들 사이에 브릿지를 포함하는 뉴클레오시드들이 내포함되지만, 이에 국한되지는 않는다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 제제에는 4'에서 2'로의 브릿지를 포함하는 하나 또는 그 이상의 이환 뉴클레오시드가 내포된다. 이러한 4'에서 2'로의 브릿지화된 이환 뉴클레오시드의 예시에는 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' ("속박된 에틸" 또는 "cEt"로도 또한 지칭됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (그리고 이의 유사체들; 가령, U.S. 특허 번호 7,399,845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (그리고 이의 유사체들; 가령, U.S. 특허 번호 8,278,283 참고); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (그리고 이의 유사체들; 가령, U.S. 특허 번호 8,278,425 참고); 4'-CH2-O-N(CH3)2-2' (가령, U.S. 특허 공고 번호 2004/0171570 참고); 4'-CH2-N(R)-O-2', 이때 R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호 그룹임 (가령, U.S. 특허 번호 7,427,672 참고); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (가령, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134 참고); 그리고 4'-CH2-C(=CH2)-2' (그리고 이의 유사체들; 가령, U.S. 특허 번호 8,278,426 참고)가 내포되나, 이들에 국한되지 않는다. 상기-언급된 각각의 전문은 본원에 참고자료에 편입된다.
잠김 핵산 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 추가적인 대표적인 미국 특허 및 미국 특허 공개에는 다음의 것들이 내포되지만, 이에 국한되지는 않는다: U.S. 특허 번호 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133; 7,084,125; 7,399,845; 7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467; 8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; US 2008/0039618; 및 US 2009/0012281, 이들 각각의 전문은 본원의 참고자료에 편입된다.
임의의 전술한 이환식 뉴클레오시드는 예를 들어, α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 비롯한 하나 또는 그 이상의 입체화학적 당 구조를 갖도록 제조될 수 있다 (PCT 공고 번호 WO 99/14226, 이의 내용은 본원의 참고자료에 편입됨).
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 속박된 에틸 뉴클레오시드가 내포되도록 또한 변형될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "속박된 에틸 뉴클레오시드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 브릿지를 포함하는 이환 당 모이어티를 포함하는 잠금된 뉴클레오시드이다. 일부 구체예들에서, 속박된 에틸 뉴클레오시드는 "S-cEt"로 지칭되는 S 입체형태이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에는 하나 또는 그 이상의 "형태학적으로 속박된 뉴클레오시드" ("CRN")가 또한 내포될 수 있다. CRN은 리보스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보스의 -C3 및 -C5' 탄소를 연결하는 링커가 있는 뉴클레오시드 유사체다. CRN은 리보스 고리를 안정적인 형태로 고정하고, mRNA에 대한 혼성화 친화성을 증가시킨다. 상기 링커는 산소를 안정성과 친화성을 위한 최적의 위치에 위치시키기에 충분한 길이를 갖고 있어, 리보스 고리 주름이 덜 발생한다.
상기 언급된 CRN 중 특정의 제조를 교시하는 대표적인 간행물에는 US 특허 공개 번호 2013/0190383; 그리고 PCT 공개번호 WO 2013/036868가 내포되나, 이에 국한되지 않으며, 이들 각 전문은 본원의 참고자료에 편입된다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 UNA (풀린 뉴클레오시드) 뉴클레오시드인 하나 또는 그 이상의 단량체들을 포함한다. UNA는 잠금 해제된 비-고리형 뉴클레오시드이며, 여기서 당의 결합이 제거되어 잠금 해제된 "당" 잔기를 형성한다. 한 예시에서, UNA는 C1'-C4' 사이의 결합 (즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 탄소-산소-탄소 공유 결합)이 제거된 단량체도 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합 (즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다 (Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) 및 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 참고, 이들은 본원의 참고자료에 편입됨).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 공고에는 U.S. 특허 번호 8,314,227; 및 US 특허 공개 번호 2013/0096289; 2013/0011922; 및 2011/0313020들이 내포되나, 이에 국한되지 않으며, 이들 각 전문은 본원의 참고자료에 편입된다.
상기 리보스 분자는 사이클로프로판 고리로 변형되어 트리사이클로데옥시핵산 (삼환 DNA)을 생성할 수도 있다. 상기 리보스 모이어티는 1,5-안히드로헥시톨, 트레오스와 같은 다른 당으로 대체되어, 트레오스 뉴클레오시드(TNA)를 생성하거나 아라비노로 대체되어 아라비노 뉴클레오시드를 생성할 수 있다. 상기 리보스 분자는 또한 시클로헥센과 같은 비-당으로 대체되어, 시클로헥센 뉴클레오시드를 생성하거나 글리콜을 생성하여 글리콜 뉴클레오시드를 또한 생성할 수 있다.
뉴클레오시드 분자의 단부에 대한 잠재적인 안정화 변형에는 N-(아세틸아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀 (Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-히드록시프롤리놀 (Hyp-C6), N-(아세틸-4-히드록시프롤리놀 (Hyp-NHAc), 티미딘-2'-O-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀 (Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3''-포스페이트, 역전된 염기 dT(idT) 및 기타 것들이 내포될 수 있다. 이러한 변형의 개시는 PCT 공개 번호 WO 2011/005861에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 또다른 대체 화학물에는 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체, 가령, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 모방체가 내포된다. 적합한 포스페이트 모방체들은 예를 들면, US 특허 공고 번호 2012/0157511에 개시되어 있으며, 이의 전문이 본 명세서에 참고자료에 편입된다.
추가적인 비-제한적인, 예시적인 LNA 뉴클레오시드들은 PCT 공고 번호 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, Morita et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238, 및 Wan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667에서 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원의 참고자료에 편입된다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO의 길이는 5 × n + 5개의 뉴클레오티드 (n은 3 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 5 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 남아있는 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된 리보뉴클레오티드이다.
일부 구체예들에서, 상기 뉴클레오티드 당 변형은 2'-O-C1-4알킬 이를 테면, 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-데옥시 (2'-H), 2'-O-C1-3알킬-O-C1-3알킬 이를 테면, 2'-메톡시메틸 ("2'-MOE"), 2'-플루오르 ("2'-F"), 2'-아미노 ("2'-NH2"), 2'-아라비노실 ("2'-아라비노") 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노실 ("2'-F-아라비노") 뉴클레오티드, 2'-잠김 핵산 ("LNA") 뉴클레오티드, 2'-아미도 브릿지 핵산 (AmNA), 2'-풀린 핵산 ("ULNA") 뉴클레오티드, L 형태의 당 ("L-당"), 또는 4'-티오리보실 뉴클레오티드이다.
믹시머(Mixmers) 및 갭머(Gapmers)
상기 ASO는 도 5A, 도 5B, 또는 도 14에서 상기 ASOs에 의해 개시된 패턴에서 믹시머 및/또는 갭머 구조를 가질 수 있다.
특정 구체예들에서, 상기 ASO는 믹시머이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "믹시머"란 올리고뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 걸쳐 DNA 단량체 및 뉴클레오시드 유사체 단량체들의 교차 조성을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 갭머 구조를 기반으로 한 믹시머로써, 이는 날개에 있는 RNA 서열들 측면에 있는 갭(gap)에 DNA 뉴클레오티드들과 2'-MOE 뉴클레오티드들의 혼합물을 포함한다. 믹시머는 친화성 강화 뉴클레오티드 유사체들, 이를 테면, 비-제한적인 예시로써, 2'-O-알킬-RNA 단량체들, 2'-아미노-DNA 단량체들, 2'-플루오르-DNA 단량체들, LNA 단량체들, 아라비노 핵산 (ANA) 단량체들, 2'-플루오르-ANA 단량체들, HNA 단량체들, INA 단량체들, 2'-MOE-RNA (2'-O-메톡시메틸-RNA), 2'플루오르-DNA, 및 LNA의 혼합물을 포함하도록 기획될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 믹시머는 RNase H를 소집할 수 없다. 일부 구체예들에서, 상기 믹시머는 DNA 및/또는 RNA와 함께, 한 가지 유형의 친화성 강화 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
여러 가지 상이한 변형이 믹시머에 개삽될 수 있다. 예를 들면, 상기 ASO는 다수의 뉴클레오티드에서 LNA 변형 및 나머지 뉴클레오티드의 일부 또는 전부에서 다른 변형을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 임의의 두 개의 인접하는 LNA-변형된 뉴클레오티드들은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 떨어져 있다. ASO 전체에서 인접해 있는 LNA-변형된 뉴클레오티드들 사이의 거리는 일정하거나 (가령, 임의의 두 개의 인접해 있는 LNA 변형 뉴클레오티드들이 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 뉴클레오티드로 분리됨), 가변적일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO의 길이는 3 × n, 3 × n - 1, 또는 3 × n - 2개의 뉴클레오티드 (n은 6 또는 이보다 더 큰 정수임)이며, 이때 (a) (i) 위치 3 × m - 2 (m은 1부터 n까지의 정수임)에서 뉴클레오티드는 제1 변형 (가령, LNA)을 포함하는 리보뉴클레오티드이며, (ii) 위치 3 × m - 1 (m은 1부터 n까지의 정수임)에서 뉴클레오티드는 제1 변형 (가령, LNA)을 포함하는 리보뉴클레오티드이며, 또는 (iii) 위치 3 × m (m은 1부터 n까지의 정수임)에서 뉴클레오티드는 제1 변형 (가령, LNA)을 포함하는 리보뉴클레오티드이며; 그리고 (b) 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 제2의, 상이한 변형 (가령, 2'-O-메톡시메틸)를 포함한다. 본원에서 소위 hCPS1-ASO-1d로 불리는 ASO는 이러한 구조를 보유한다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO의 길이는 2 × n 또는 2 × n - 1개의 뉴클레오티드 (n은 9 또는 이보다 더 큰 정수임), 이때 (a) (i) 위치 2 × m - 1 (m은 1부터 n까지의 정수임)에서 뉴클레오티드는 제1 변형 (가령, LNA)을 포함하는 리보뉴클레오티드이며, 또는 (ii) 위치 2 × m (m은 1부터 n까지의 정수임)에서 뉴클레오티드는 제1 변형 (가령, LNA)을 포함하는 리보뉴클레오티드이며; 그리고 (b) 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 제2의, 상이한 변형 (가령, 2'-O-메톡시메틸)을 포함한다. 본원에서 소위 hCPS1-ASO-1e로 불리는 ASO는 이러한 구조를 보유한다. 예를 들어, 첫 번째 변형이 4개, 5개 또는 그 이상의 뉴클레오티드마다 반복되는 유사한 변형 패턴도 본원에서 고려된다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO는 이 ASO의 5' 단부 또는 3' 단부에서 GalNAc 또는 Teg-GalNAc 모이어티를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO는 이 ASO의 5' 단부 또는 3' 단부에서 콜레스테롤 또는 비오틴 모이어티를 더 포함한다.
특정 구체예들에서, 상기 ASO는 RNA 서열들의 측면에 DNA 서열 (가령, 변형안된 DNA의 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개의 인접 뉴클레오티드를 보유하는)을 포함한다. 이러한 구조는 "갭머(gapmer)"로 알려져 있는데, 내부 DNA 영역을 "갭(gap)"이라고 하고, 외부 RNA 영역을 "날개(wings)"라고 한다 (가령, PCT 출원 공개 번호 WO2013/177248 참고). 갭머는 핵 RNAse (가령, RNase H)를 소집하여, 표적 RNA의 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 놀랍게도, 본 명세서에서, 동일한 서열을 갖지만 화학적 변형이 상이한 regRNA (가령, hCPS1-ASO-1g)와 같이 regRNA (가령, hCPS1-ASO-1a)에 결합하는 갭머도 표적 유전자 발현을 증가시킬 수 있다는 것이 발견되었다.
특정 구체예들에서, 상기 갭머는 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 특정 구체예들에서, 상기 갭은 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 특정 구체예들에서, 한 쪽 날개 또는 양쪽 날개는 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 특정 구체예들에서, 한 쪽 날개 또는 양쪽 날개는 RNA 변형, 예를 들면, β-D-리보뉴클레오시드, 2'-변형된 뉴클레오시드 (가령, 2'-O-(2-메톡시메틸) (2'-MOE), 2'-O-CH3, 또는 2'-플루오르-아라비노 (FANA)), 및 이환 당 변형된 뉴클레오시드 (가령, 속박된 에틸 또는 잠김 핵산 (LNA)을 갖는)를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 갭머에서 각 리보뉴클레오티드는 2'-MOE에 의해 변형된다. 특정 구체예들에서, 상기 갭머는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드간 결합, 가령, 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드간 링키지를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 갭머에서 각 두 개의 인접하는 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합에 의해 연계된다.
특정 구체예들에서, 상기 ASO는 변형안된 DNA에서 7개 또는 그 이상의, 8개 또는 그 이상의, 9개 또는 그 이상의, 10개 또는 그 이상의, 10개 또는 그 이상의, 11개 또는 그 이상의, 12개 또는 그 이상의, 13개 또는 그 이상의, 14개 또는 그 이상의, 또는 15개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 이러한 DNA 서열은 매 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 마다 변형된 (가령, 2'-MOE 변형된) 리보뉴클레오티드에 의해 분열된다. 일부 구체예들에서, 상기 ASO는 오로지 리보뉴클레오티드 만을 포함하고, 데옥시리보뉴클레오티드는 포함하지 않는다.
믹스머와 갭머의 구조적 특징들이 복합될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 본원에서 기술된 믹시머의 것과 유사한 구조 (가령, 하나는 개삽된 변형을 보유)를 가지지만, 예외적으로 상기 갭에서 제2 변형이 제3 변형 (가령, 데옥시리보뉴클레오티드)으로 변경된다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO는 본원에서 기술된 갭머의 것과 유사한 구조를 가지나, 상기 갭에서 뉴클레오티드는 믹시머 패턴에서 변형된다.
특정 구체예들에서, 상기 ASO는 리간드 모이어티를 더 포함하는데, 가령, 대상체의 조직 또는 장기를 특이적으로 표적하는 리간드 모이어티를 더 포함한다. 예를 들면, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)은 간을 특이적으로 표적한다. 특정 구체예들에서, 상기 리간드 모이어티는 GalNAc를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 리간드 모이어티는 3개-클러스터 GalNAc 모이어티를 포함하는데, 흔히 이를 GAlNAc3로 표시한다. 다른 유형의 GalNAc 모이어티는 1개-클러스터, 2개-클러스터 또는 4개-클러스터 GAlNAc이며, GAlNAc1, GAlNAc2, 또는 GAlNAc4로 표시된다. 특정 구체예들에서, 상기 리간드 모이어티는 GalNAc1, GALNAc2, GAlNAc3, 또는 GalNAc4를 포함한다.
III. 약제학적 조성물
특정 구체예들에서, 본원에 기술된 ASOs는 약제학적 조성물 안에 존재할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 다양한 약물 전달계로 이용되도록 제형화될 수 있다. 적절한 제형을 위해 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 수용가능한 부형제 또는 담체들이 이 조성물에 또한 내포될 수 있다. 본 명세서에서 사용을 위한 적합한 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985에서 찾아볼 수 있다. 약물 전달을 위한 방법의 간단한 검토는 가령, Langer (Science 249:1527-1533, 1990)을 참고하며, 이는 본원에 이의 전문이 참고자료에 편입된다.
핵산을 전달하는데 적합한 예시적인 담체 및 약제학적 제형이 Durymanov and Reineke (2018) Front. Pharmacol. 9:971; Barba et al. (2019) Pharmaceutics 11(8): 360; Ni et al. (2019) Life (Basel) 9(3): 59에 기술되어 있다. 상기 ASO에 접합된 리간드 부분의 존재는 리간드 부분에 의해 표적화되는 조직 또는 장기로의 전달을 위한 담체의 필요성을 회피할 수 있는 것으로 이해된다.
세포, 예를 들어, 대상체, 이를 테면, 인간 대상체, 가령, CPS1 관련 장애 또는 기타 요소 주기 장애가 있는 대상체과 같이 이를 필요로 하는 대상체 내의 세포에 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드를 전달하는 것은 다양한 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 전달은 시험관 내 또는 생체 내에서 세포를 본 명세서의 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 생체내 전달은 또한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 직접 수행될 수도 있다. 이러한 대안은 아래에서 자세히 설명된다.
일반적으로, 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법(시험관내 또는 생체내)은 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하도록 조정될 수 있다 (가령, Akhtar S. and Julian R L., (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 및 PCT 공개번호 WO 94/02595 참고, 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입된다). 생체내 전달의 경우, 올리고뉴클레오티드 분자를 전달하기 위해 고려해야 할 요인에는 예를 들어, 전달된 분자의 생물학적 안정성, 비-특이적 효과의 방지 및 표적 조직에서 전달된 분자의 축적이 내포된다. 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 효과는 국소 투여, 예를 들어, 조직에 직접 주사 또는 이식하거나 제제를 국소 투여함으로써 최소화될 수 있다. 치료 부위에 국소 투여하면 약제의 국소 농도가 극대화되며, 작용제에 의해 해를 입을 수 있거나 작용제를 분해할 수 있는 전신 조직에 대한 이 작용제의 노출을 제한시키고, 이는 올리고뉴클레오티드 분자의 더 낮은 총 용량이 투여되도록 허용한다.
질환 치료를 위해 올리고뉴클레오티드를 전신 투여하기 위해, 상기 올리고뉴클레오티드에는 대체 핵염기, 대체 당 모이어티 및/또는 대체 뉴클레오시드간 결합이 내포될 수 있거나, 대안적으로 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있고; 두 가지 방법 모두 생체 내에서 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의한 올리고뉴클레오티드의 급속한 분해를 방지하는 역할을 한다. 올리고뉴클레오티드 또는 약제학적 담체의 변형은 또한 올리고뉴클레오티드 조성물의 표적 조직으로의 표적화를 허용하고, 바람직하지 않은 표적-외 효과를 피할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 분자들은 콜레스테롤과 같은 친유성 그룹에 대한 화학적 접합으로 변형되어 세포 흡수를 향상시키고, 분해를 방지할 수 있다. 대체 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 약물 전달 시스템, 이를 테면, 나노입자, 지질 나노입자, 폴리플렉스 나노입자, 리포플렉스 나노입자, 덴드리머, 폴리머, 리포솜, 또는 양이온 전달 시스템 사용하여 전달될 수 있다. 양으로 하전된 양이온 전달 시스템은 올리고뉴클레오티드 분자 (음으로 하전됨)의 결합을 촉진하고, 음으로 하전된 세포 막에서의 상호작용을 향상시켜 세포에 의한 올리고뉴클레오티드의 효율적인 흡수를 또한 허용한다. 양이온성 지질, 덴드리머 또는 중합체는 올리고뉴클레오티드에 결합되거나, 올리고뉴클레오티드를 둘러싸는 소포 또는 미셀을 형성하도록 유도될 수 있다. 소포 또는 미셀의 형성은 전신 투여 시 올리고뉴클레오티드의 분해를 추가로 방지한다. 일반적으로, 당업계에 공지된 임의의 핵산 전달 방법은 본 명세서의 올리고뉴클레오티드 전달에 적용될 수 있다. 양이온성 올리고뉴클레오티드 복합체를 제조하고, 투여하는 방법은 당업자의 능력 범위 안에 있다 (가령, Sorensen, D R., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, U N. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, A S et al., (2007) J. Hypertens. 25:197-205, 이의 전문이 참고로 본 명세서에 편입되어 있다). 올리고뉴클레오티드의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비-제한적 예시들에는 DOTAP (Sorensen, D R., et al (2003), supra; Verma, U N. et al., (2003), supra), OligofectamineTM, "고체 핵산 지질 입자" (Zimmermann, T S. et al., (2006) Nature 441:111-114), 카르디오리핀 (Chien, P Y. et al., (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A. et al., (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), 폴리에틸렌이민 (Bonnet M E. et al., (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) 펩티드 (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), 폴리아미도아민 (Tomalia, D A. et al., (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804)이 내포된다. 일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드는 전신 투여를 위해 시클로덱스트린과 복합체를 형성한다. 올리고뉴클레오티드 및 시클로덱스트린의 약제학적 조성물 및 투여 방법들은 U.S. 특허 번호 7,427,605에서 찾아볼 수 있고, 이의 전문은 본원의 참고자료에 편입된다.　 일부 구체예들에서, 본 명세서의 올리고뉴클레오티드는폴리플렉스 또는 리포플렉스 나노입자들에 의해 전달된다. 올리고뉴클레오티드 및 폴리플렉스 나노입자들 그리고 리포플렉스 나노입자들의 약제학적 조성물 및 투여 방법들은 U.S. 특허 공고 번호 2017/0121454; 2016/0369269; 2016/0279256; 2016/0251478; 2016/0230189; 2015/0335764; 2015/0307554; 2015/0174549; 2014/0342003; 2014/0135376; 및 2013/0317086에서 찾아볼 수 있으며, 이들의 각 전문은 본원의 참고자료에 편입된다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 화합물들은 추가 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 추가 치료법의 예로는 글리세롤 페닐부티레이트, 벤조산나트륨, 페닐부티레이트 또는 페닐아세테이트를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 저단백 식이요법 또는 질소 제거제와 같은 요소 주기 장애 치료의 표준이 내포된다.
막 분자 어셈블리 전달 방법
본 명세서의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 액체 나노입자 (LNPs), 중합체성, 생분해성 미세입자, 또는 마이크로캡슐 전달 장치를 포함하는 다양한 막 분자 어셈블리 전달 방법을 사용하여 또한 전달될 수 있다. 예를 들면, 콜로이드성 분산 시스템은 본 명세서에 기술된 올리고뉴클레오티드 제제의 표적 전달을 위해 사용될 수 있다. 콜로이드성 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 그리고 수중유 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 리포좀은 인공 막 소포로, 시험관내 및 생체내 운반 비이클로 유용하다. 직경이 0.2-4.0μm인 대형 단층 소포 (LUVs)는 대형 거대분자를 함유한 수성 완충액의 상당 부분을 캡슐화할 수 있는 것으로 나타났다. 리포솜은 활성 성분을 작용 부위로 전달 및 운반에 유용하다. 리포솜 막은 구조적으로 생물학적 막과 유사하기 때문에, 이 리포솜을 조직에 적용시킬 때, 이 리포솜 이중층이 세포막의 이중층과 융합된다. 리포솜과 세포의 병합이 진행됨에 따라 올리고뉴클레오티드를 포함하는 내부 수성 내용물은 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA에 특이적으로 결합할 수 있는 세포 내로 전달된다. 일부 경우들에서, 상기 리포솜은 가령, 올리고뉴클레오티드를 특정 세포 유형으로 유도하기 위해 특이적으로 또한 표적화된다.　 리포좀의 조성물은 통상 인지질의 조합으로, 스테로이드, 구체적으로, 콜레스테롤과 통상적으로 복합된다. 다른 인지질 또는 다른 지질도 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 성질은 pH, 이온 강도 그리고 이가양이온 존재에 따라 달라진다.
올리고뉴클레오티드를 함유하는 리포솜은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 일례로, 리포솜의 지질 성분을 세제에 용해시켜 지질 성분과 함께 미셀을 형성하는 경우도 있다. 예를 들면, 상기 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 접합체일 수 있다. 세제는 높은 임계 미셀 농도를 가질 수 있으며, 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제에는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜레이트 및 라우로일 사르코신이 내포된다. 그런 다음, 올리고뉴클레오티드 조제물을 지질 성분이 내포된 미셀에 첨가한다. 상기 지질 상의 양이온성 그룹은 올리고뉴클레오티드와 상호작용하고, 이 올리고뉴클레오티드 주위에 응축되어 리포솜을 형성한다. 응축 후, 상기 세제는 가령, 투석에 의해 제거되어, 올리고뉴클레오티드의 리포솜 조제물이 생성된다.
필요한 경우, 축합 반응 중에 축합을 지원하는 담체 화합물을 가령, 조절된 첨가에 의해 추가될 수 있다. 예를 들면, 상기 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체 (가령, 스페르민 또는 스페르미딘)일 수 있다. 응축이 일어나도록, pH를 또한 조정할 수 있다.
전달 비히클의 구조적 성분으로서 폴리뉴클레오티드/양이온성 지질 복합체를 포함하는 안정한 폴리뉴클레오티드 전달 비히클을 생산하는 방법이 가령, WO 96/37194에 추가 기술되어 있으며, 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입된다. Feigner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417; U.S. 특허 번호 4,897,355; U.S. 특허 번호 5,171,678; Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol. 23:238; Olson et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9; Szoka et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169; Kim et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339; 그리고 Fukunaga et al., (1984) Endocrinol. 115:757에서 기술된 예시적인 방법의 하나 이상의 측면이 리포좀 형성에 또한 내포될 수 있다. 전달 수단으로 사용하기에 적합한 크기의 지질 응집체를 준비하기 위해 일반적으로 사용되는 기술에는 초음파 처리, 동결-해동 및 압출이 내포된다 (가령, Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161. 미세유동화는 일관되게 작은 경우 (50 내지 200nm) 사용할 수 있고, 상대적으로 균일한 집합체가 바람직하다 (Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169). 이러한 방법들은 올리고뉴클레오티드 조제물을 리포솜으로 포장하는 데 쉽게 적용된다.
리포솜은 크게 두 가지 종류로 나뉜다. 양이온성 리포솜은 음전하를 띤 핵산 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 양전하를 띤 리포솜이다. 양전하를 띤 핵산/리포솜 복합체는 음전하를 띤 세포 표면에 결합하고, 엔도솜에 내재화된다. 엔도솜 내의 산성 pH로 인해 리포솜이 파열되어 그 내용물이 세포질로 방출된다 (Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980-985).
pH-민감하거나, 음전하를 띠는 리포솜은 핵산과 복합체를 형성하기보다는 핵산을 포획한다. 핵산과 지질 모두 유사하게 전하를 띠고 있으므로, 복합체 형성보다는 반발이 발생한다. 그럼에도 불구하고, 일부 핵산은 이러한 리포솜의 수성 내부에 갇혀 있게 된다. pH 민감성 리포솜은 티미딘 키나제 유전자를 인코딩하는 핵산을 배양물의 세포 단층으로 전달하는 데 사용되었다. 표적 세포에서 외인성 유전자의 발현이 검출되었다 (Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19:269-274).
리포솜 조성물의 주요 유형 중 하나는 자연-유래된 포스파티딜콜린 이외의 인지질이 내포된다. 예를 들어, 중성 리포솜 조성물은 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포솜 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 음이온성 융합 생성 리포솜은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 또 다른 유형의 리포솜 조성물은 포스파티딜콜린 (PC), 이를 테면, 예를 들어, 대두 PC 및 난(egg) PC로부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로 형성된다.
시험관 내 및 생체 내에서 리포솜을 세포에 도입하는 다른 방법의 예시들은 U.S. 특허 번호 5,283,185; U.S. 특허 번호 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Feigner, (1994) J. Biol. Chem. 269:2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3:649; Gershon, (1993) Biochem. 32:7143; 및 Strauss, (1992) EMBO J. 11:417에 내포되어 있다.
비-이온성 리포솜 시스템, 특히 비-이온성 계면활성제와 콜레스테롤을 포함하는 시스템으로 피부에 약물을 전달하는 데 있어서의 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. NOVASOMETM I (글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NOVASOMETM II (글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비-이온성 리포좀성 제제가 사이클로스포린-A를 마우스 피부의 진피로 전달하는 데 사용되었다. 결과에서 이러한 비-이온성 리포솜 시스템이 사이클로스포린 A가 피부의 여러 층으로의 침착 촉진에 효과적이라는 것을 나타났다 (Hu et al., (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466).
리포솜은 또한 이러한 특화된 지질이 결여된 리포솜에 비교하여, 향상된 순환 수명을 초래하는 하나 또는 그 이상의 특화된 지질을 포함하는 입체적으로 안정화된 리포솜일 수 있다. 입체적으로 안정화된 리포솜의 예는 리포솜 (A)의 소포-형성 지질 부분의 일부가 모노시알로강글리오시드 GM1과 같은 하나 또는 그 이상의 당지질을 포함하고, 또는 (B) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분과 같은 하나 또는 그 이상의 친수성 중합체로 유도체화된 리포좀들이다. 특정 이론에 얽매이기를 원하지 않으면서도, 적어도 강글리오시드, 스핑고미엘린 또는 PEG-유도된 지질을 함유하는 입체적으로 안정화된 리포솜의 경우, 이들 입체적으로 안정화된 리포솜의 향상된 순환 반감기는 세망내피계(RES)의 세포들로의 감소된 취입으로 부터 유래되는 것으로 생각된다 (Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53:3765).
하나 또는 그 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포솜이 해당 분야에 알려져 있다. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507:64)는 모노시알로신경절 측 GM1, 갈락토세레브로시드 황산염 및 포스파티딜이노시톨이 리포솜의 혈액 반감기를 향상시키는 능력을 보고했다. 이러한 발견은 Gabizon et al.에 의해 설명되었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85:6949) Allen et al., 의 두 U.S. 특허 번호 4,837,028 및 WO 88/04924에는 (1) 스핑고미엘린 및 (2) 강글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 황산 에스테르를 포함하는 리포솜이 개시되어 있다. U.S. 특허 번호 5,543,152 (Webb et al.)는 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜을 개시한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포솜은 WO 97/13499 (Lim et al)에 개시되어 있다.
한 구체예에서, 양이온성 리포좀이 이용된다. 양이온성 리포좀은 세포 막에 융합될 수 있다는 장점을 가지고 있다. 비-양이온성 리포솜은 원형질막과 효율적으로 융합할 수는 없지만, 생체 내에서 대식세포에 의해 흡수되어 올리고뉴클레오티드를 대식세포로 전달하는 데 사용될 수 있다.
리포솜의 추가 장점은 다음과 같다: 천연 인지질에서 얻은 리포솜은 생체 적합성 및 생분해성이 있고; 리포솜은 광범위한 수용성 및 지용성 약물을 편입시킬 수 있고; 리포솜은 내부 구획에 있는 캡슐화된 올리고뉴클레오티드를 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다 (Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). 리포솜 제제 제조 시 중요한 고려 사항은 지질 표면 전하, 소포 크기 및 리포솜의 수성 부피이다.
양전하를 띤 합성 양이온 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)를 사용하여 작은 리포솜을 형성할 수 있는데, 이 리포솜은 핵산과 자발적으로 상호작용하여, 조직 배양 세포의 세포막의 음전하 지질과 융합할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성하고, 결과적으로 올리고뉴클레오티드 전달한다 (가령, Feigner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417, 그리고 DOTMA에 대한 설명과 DNA와의 사용과 관련하여 U.S. 특허 번호 4,897,355 참고).
DOTMA 유사체인 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니아)프로판(DOTAP)은 인지질과 함께 사용되어 DNA-복합체화된 소포를 형성할 수 있다. LIPOFECTINTM Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)는 고도의 음이온성 핵산을 살아있는 조직 배양 세포로 전달하는 효과적인 제제로써, 음으로 하전된 폴리뉴클레오티드와 자발적으로 상호작용하여 복합체를 형성하는 양으로 하전된 DOTMA 리포솜을 포함한다. 양전하를 띤 리포솜이 충분히 사용되면, 생성된 복합체의 순 전하도 양전하를 띈다. 이러한 방식으로 준비된 양전하를 띤 복합체는 음전하를 띤 세포 표면에 자발적으로 부착되어 원형질막과 융합되고, 기능성 핵산을 예를 들어, 조직 배양 세포에 효율적으로 전달한다. 상업적으로 이용 가능한 또 다른 양이온성 지질인 1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아)프로판 ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)은 올레오일 부분이 에테르 결합이 아닌 에스테르로 연결되어 있다는 점에서 DOTMA와 상이하다.
보고된 다른 양이온성 지질 화합물에는 예를 들어, 두 가지 유형의 지질 중 하나에 접합된 카르복시스페르민을 비롯한 다양한 부분에 접합된 것들이 있으며, 5-카르복시스페르밀글리신 디옥타올레오일아미드("DOGS")(TRANSFECTAM™, Promega, Madison, WI) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카르복시스페르밀-아미드 ("DPPES")와 같은 화합물이 내포된다 (가령, U.S. 특허 번호 5,171,678).
또다른 양이온성 지질 접합체에는 DOPE와 조합하여 리포솜으로 제형화된 콜레스테롤 ("DC-Chol")을 사용한 지질의 유도체화가 내포된다 (Gao, X. and Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280 참고). 폴리리신을 DOPE에 결합시켜 만든 리포폴리리신은 혈청 존재 하에서 형질감염에 효과적인 것으로 보고되었다 (Zhou, X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065:8). 특정 세포주의 경우, 접합된 양이온성 지질을 함유하는 이러한 리포솜은 DOTMA-함유하는 조성물보다 낮은 독성을 나타내고, 보다 효율적인 형질감염을 제공한다고 한다. 시판되는 기타 양이온성 지질 제품에는 DMRIE 및 DMRIE-HP(Vical, La Jolla, Calif.) 및 Lipofectamine (DOSPA)(Life Technology, Inc., Gaithersburg, Md)이 내포된다. 올리고뉴클레오티드의 전달에 적합한 다른 양이온성 지질은 WO 98/39359 및 WO 96/37194에 기재되어 있다.
리포솜 제형은 특히 국소 투여에 적합하며, 리포솜은 다른 제형에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 이러한 이점에는 투여된 약물의 높은 전신 흡수와 관련된 부작용 감소, 원하는 표적에 투여된 약물의 축적 증가, 올리고뉴클레오티드를 피부에 투여하는 능력이 내포된다. 일부 구현에서, 리포솜은 올리고뉴클레오티드를 표피 세포에 전달하고 또한 진피 조직, 가령, 피부로의 올리고뉴클레오티드의 침투를 향상시키기 위해 사용된다. 예를 들면, 상기 리포솜은 국소적으로 적용될 수 있다. 리포솜으로 제형화된 약물을 피부에 국소적으로 전달하는 것이 문서화되었다 (가령, Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18:259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6:682-690; Itani, T. et al., (1987) Gene 56:267-276; Nicolau, C. et al. (1987) Meth. Enzymol. 149:157-176; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527; Wang, C. Y. and Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855 참고).
비-이온성 리포솜 시스템, 특히 비-이온성 계면활성제와 콜레스테롤을 포함하는 시스템으로 피부에 약물을 전달하는 데 있어서의 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. NOVASOME I (글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NOVASOME II (글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비-이온성 리포좀성 제제가 약물을 마우스 피부의 진피로의 전달에 사용되었다. 올리고뉴클레오티드를 함유한 이러한 제제는 피부과 장애의 치료에 유용하다.
리포좀의 표적화는 예를 들면, 장기(organ)-특이성, 세포-특이성, 및 소기관-특이성에 기반을 두고, 당분야에 공지되어 있다. 리포솜 표적 전달 시스템의 경우, 지질 그룹은 리포솜 이중층과 안정적인 결합에서 표적 리간드를 유지하기 위해 리포솜의 지질 이중층에 통합될 수 있다. 지질 사슬을 표적화 리간드에 연결하기 위해 다양한 연계 그룹을 사용할 수 있다. 추가 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, U.S. 특허 출원 공개 번호 20060058255에 설명되어 있으며, 이의 연계 그룹은 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
올리고뉴클레오티드가 내포된 리포솜은 고도로 변형 가능하게 만들어질 수 있다. 이러한 변형성은 리포솜이 리포솜의 평균 반경보다 작은 기공을 통과할 수 있도록 할 수 있다. 예를 들면, 트랜스퍼솜(transfersomes)은 또다른 유형의 리포솜이며, 약물 전달 수단의 매력적인 후보인 고도로 변형 가능한 지질 응집체다. 트랜스퍼솜은 매우 변형성이 커서 물방울보다 작은 구멍을 통해 쉽게 침투할 수 있는 지질 방울로 설명될 수 있다. 트랜스퍼솜은 표면 가장자리 활성화제, 통상적으로 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가하여 만들 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 트랜스퍼솜은 올리고뉴클레오티드를 피부의 각질세포에 전달하기 위해 예를 들어, 감염에 의해 피하로 전달될 수 있다. 손상되지 않은 포유류 피부를 통과하려면, 지질 소포가 적절한 경피 구배의 영향을 받아 각각 직경이 50nm 미만인 일련의 미세한 구멍을 통과해야 한다. 또한, 지질 특성으로 인해 이러한 트랜스퍼솜은 자가-최적화 (가령, 피부의 모공 모양에 적응), 자가-복구가 가능하며, 단편화 없이 표적에 도달할 수 있는 경우가 많으며, 자가-로딩되는 경우도 많다.　 트랜스퍼솜은 혈청 알부민을 피부에 전달하는 데 사용되었다. 혈청 알부민의 트랜스퍼솜 매개 전달은 혈청 알부민을 함유한 용액의 피하 주사만큼 효과적인 것으로 나타났다.
본 명세서에 따른 다른 제제가 PCT 공개 번호 WO 2009/088891, WO 2009/132131, 및 WO 2008/042973에 기재되어 있으며, 이들 전문이 본원의 참조에 편입된다.
계면활성제는 제형, 이를 테면, 에멀젼(마이크로에멀젼 포함) 및 리포솜에 폭넓게 적용된다. 천연 및 합성 계면활성제의 다양한 유형의 특성을 분류하고, 순위를 매기는 가장 일반적인 방법은 친수성/친유성 균형(HLB)을 사용하는 것이다. 친수성 그룹 ("헤드"라고도 함)의 특성은 제형에 사용되는 다양한 계면활성제를 분류하는 가장 유용한 수단을 제공한다 (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않으면, 이는 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 제약 및 화장품에 폭넓게 적용되며, 광범위한 pH 값에 걸쳐 사용할 수 있다. 일반적으로, 이들의 HLB 값은 이들 구조에 따라 2 내지 약 18 정도다. 비이온성 계면활성제에는 비이온성 에스테르, 이를 테면, 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로스 에스테르 및 에톡실화 에스테르가 내포된다. 비이온성 알칸올아미드 및 에테르, 이를 테면, 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화 알코올, 에톡실화/프로폭실화 블록 폴리머도 이 클래스에 내포된다. 상기 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 종류 중 가장 널리 사용되는 성분이다.
상기 계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 띠는 경우, 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제에는 카르복실산염, 이를 테면, 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 설폰산 에스테를 이를 테면, 알킬 설페이트 및 에톡실화된 알킬 설페이트, 설폰산염, 이를 테면, 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포숙시네이트가 내포된다. 음이온성 계면활성제 종류의 가장 중요한 구성원은 알킬 설폰산염과 비누다.
상기 계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 양전하를 띠는 경우, 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제에는 4차 암모늄염과 에톡실화 아민이 내포된다. 4차 암모늄염은 이 계열에서 가장 많이 사용되는 구성원이다.
상기 계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 운반하는 능력을 갖고 있는 경우, 이 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제에는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 인지질이 내포된다.
의약품, 제제, 유제에 계면활성제를 사용하는 방법이 검토되었다 (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
본 명세서의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 미셀 제제로 또한 제공될 수 있다. 미셀은 양친매성 분자가 구형 구조로 배열되어 있는 특정 유형의 분자 집합체로써, 이 분자의 모든 소수성 부분은 안쪽으로 향하고 친수성 부분은 주변 수성 상과 접촉하게 된다. 상기 환경이 소수성인 경우, 역-배열이 존재한다.
지질 나노입자-기반 전달 방법
본 명세서의 올리고뉴클레오티드는 지질 제제, 가령, 지질 나노입자(LNP) 또는 다른 핵산-지질 입자에 완전히 캡슐화될 수 있다. LNPs는 정맥 (i.v.) 주사 후 순환 수명이 연장되고, 원위 부위(가령, 투여 부위와 물리적으로 분리된 부위)에 축적되므로 전신 적용에 유용하다. LNPs에는 PCT 공개 번호 WO 00/03683에 제시된 바와 같이, 캡슐화된 축합제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"가 내포된다. 본 명세서의 입자들은 전형적으로 약 50nm 내지 약 150nm, 더욱 전형적으로 약 60nm 내지 약 130nm, 더욱 전형적으로 약 70nm 내지 약 110nm, 가장 전형적으로 약 70nm 내지 약 90nm의 평균 직경을 보유하고, 실질적으로 비-독성이다. 또한, 본 명세서의 핵산-지질 입자 안에 존재할 때, 이 핵산들은 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 내성을 갖는다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조방법은 가령, U.S. 특허 번호 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; U.S. 공고 번호 2010/0324120 및 PCT 공개 번호 WO 96/40964에서 기술된다.
양이온성 지질의 비제한적 예에는 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(I-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), N--(I-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레일옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레오일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레오일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ) 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 또는 이의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔에테트라히드로--3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민 (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-예에틸아잔디예디도데칸-2-올(Tech G1) 또는 이들의 혼합물이 내포된다. 상기 양이온성 지질은 예를 들어, 이 입자에 존재하는 전체 지질의 약 20mol% 내지 약 50mol% 또는 약 40mol%를 포함할 수 있다.
이온화 가능/비양이온성 지질은 음이온성 지질 또는 중성 지질, 이를 테면, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티드 일에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 콜레스테롤 또는 이의 혼합물 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않은 것들일 수 있다. 비-양이온성 지질은 예를 들어, 이 입자에 존재하는 총 지질의 약 5mol% 내지 약 90mol%, 약 10mol%, 또는 콜레스테롤이 포함된 경우 약 60mol%일 수 있다.
입자들의 응집을 억제하는 접합된 지질은 예를 들어, PEG-디아실글리세롤 (DAG), PEG-디알킬옥시프로필 (DAA), PEG-인지질, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-세라마이드 (Cer) 또는 이들의 혼합물을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 PEG-지질일 수 있다. 상기 PEG-DAA 접합체는 예를 들어, PEG-디라우릴옥시프로필 (C12), PEG-디미리스틸옥시프로필 (C14), PEG-디팔미틸옥시프로필 (C16) 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필 (C18)일 수 있다. 이들 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질은 예를 들어, 이 입자에 존재하는 총 지질의 0mol% 내지 약 20mol% 또는 약 2mol%일 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 핵산-지질 입자에는 이 입자에 존재하는 전체 지질의 예를 들어 약 10mol% 내지 약 60mol% 또는 약 50mol%의 콜레스테롤이 추가로 내포된다.
상기 ASO는 또한 리피도이드 형태로 전달될 수도 있다. 리피도이드의 합성은 광범위하게 설명되었으며, 이러한 화합물을 포함하는 제제는 변형된 핵산 분자 또는 ASOs의 전달에 특히 적합하다 (Mahon et al, Bioconjug Chem. 2010 21: 1448-1454; Schroeder et al, J Intern Med. 2010 267:9-21; Akinc et al, Nat Biotechnol. 2008 26:561- 569; Love et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107: 1864-1869; Siegwart et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108: 12996-3001 참고; 이들 모두는 이들의 전문이 본원의 참고자료에 편입된다).
RNA 전달용 지질 조성물은 PCT 공개 번호 WO2012/170930A1, WO2013/149141A1, 및 WO2014/152211A1에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전문이 본원의 참고자료에 편입된다.
IV. 치료요법적 적용
본 명세서는 유전자 발현 (가령, CPS1 유전자 발현의 감소)이 감소된 것과 연합된 질환 및 장애를 치료하는 방법들을 제공한다. 상기 방법은 표적 유전자의 조절 요소 (가령, CPS1)로부터 전사된 조절 RNA 또는 ASO를 포함하는 약학적 조성물과 혼성화하는 ASO를 사용한다. 본 명세서에 기술된 상기 올리고뉴클레오티드 조성물은 본 명세서의 방법에 유용하고, 이론에 결부되지는 않지만, 예를 들어, 대상체 (가령, 포유류, 영장류, 또는 인간)의 세포에서 CPS1 단백질의 수준을 증가시킴으로써 CPS1의 수준, 상태 및/또는 활성을 조절하는 능력을 통해 바람직한 효과를 발휘하는 것으로 믿는다.
본원에는 본원에 기술된 ASO를 대상체에게 투여하는 것을 비롯하여, 이 대상체에서 고-암모니아혈증을 치료 또는 예방하는 방법들이 또한 제공된다. 본 명세서는 고-암모니아혈증을 앓고 있거나 발생할 위험이 있는 대상체에서 대상체에게 본원에 기술된 ASO를 투여하는 것을 포함하는 고-암모니아혈증을 치료 또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 구체예들에서, 고-암모니아혈증을 앓고 있거나, 발병할 위험이 있는 대상체는 다음 중 하나 또는 그 이상을 가지고 있다: 요소 주기 장애, 간성 뇌증, 급성 간 부전, 간경변, 비알코올성 지방간 질환, 신부전 및/또는 신부전, 프로피온산혈증, 메틸말론산혈증, 이소길초산혈증, 요로 감염, 장내 세균 과증식, 지방산 산화 장애 및 전신 감염. 일부 구체예들에서, 상기 대상체는 약물 (가령, 발프로산, 카르바마제핀, 플루오로우라실, 설파디아진, 리바비린, 살리실산염 및 글리신) 섭취와 관련된 고-암모니아혈증을 앓고 있거나, 발병할 위험이 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법들에는 상기 대상체에게 본원에 기술된 ASO를 투여하는 단계가 내포된다. 특정 구체예들에서, 본원에 기술된 ASO로 치료하면 상기 ASO로 치료받지 않았던 대상체 (가령, 치료전 동일한 대상체)와 비교하였을 때, 이 대상체에서 암모니아 수치의 감소 (가령, 혈중 암모니아 수치, 혈장 암모니아 수치, 전신 암모니아 수치 또는 뇌척수액 암모니아 수치)가 있다. 일부 구체예들에서, 암모니아 수준 (가령, 혈액 암모니아 수준, 전신 암모니아 수준, 또는 뇌척수액 암모니아 수준)에서의 감소는 대상체 (가령, 상기 ASO를 투여하기 전 동일한 대상체와 비교하였을 때)에서 암모니아 수준 (가령, 혈액 암모니아 수준, 전신 암모니아 수준, 또는 뇌척수액 암모니아 수준)과 비교하였을 때, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소다.
암모니아 수준 (가령, 혈장 샘플 내)을 측정하는 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 효소 동역학 분석이 내포되며, 이때 암모니아는 L-글루타메이트 탈수소효소의 존재 하에서 α-케토글루타레이트 및 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 (NADPH)과 반응하여 글루타메이트와 NADP+를 생성한다. 그런 다음, 산화된 NADPH의 양을 측정하고 (가령, 측광법으로) 암모니아의 양과 동일하다.
본 명세서의 측면은 치료가 필요한 대상체 (가령, 인간 대상체)에서 장애 (가령, 요소 주기 장애)를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본원에는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 요소 주기 장애의 치료를 요하는 대상체에서 이를 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 본원에 제공된 ASO를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 카르바모일-포스페이트 합성효소 1 (CPS1) 결핍, 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 결핍, 시트룰린혈증 유형 I (아르기니노석신산염 합성효소(ASS) 결핍), 아르기니노석신산 분해효소(ASL) 결핍, N-아세틸 글루타메이트 합성효소(NAGS) 결핍, 아르기나제 결핍(고아르기닌혈증, ARG1 결핍), 오르니틴 트랜스로카제 결핍(ORNT1) 결핍, 고오르니틴혈증-고-암모니아혈증-호모시트룰린뇨증 증후군(HHH)), 또는 시트린 결핍이다. 일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 N-아세틸 글루타메이트 합성효소(NAGS) 결핍이 아니다. 일부 구체예들에서, 요소 주기 장애가 있는 대상체에게 본 문서에 제공된 ASO를 투여하면 해당 대상체에서 고-암모니아혈증 위기의 위험, 빈도 및/또는 심각도가 감소된다 (가령, ASO를 투여받지 않은 대상체 (가령, ASO 투여 전의 동일한 대상체)와 비교하여).
일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 카르바모일포스페이트 합성효소 I 결핍 (CPS1 결핍)이다. 일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 고-암모니아혈증이다. 일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍 (OTC 결핍)이다. 일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 시트룰린혈증 유형 I (ASS1 결핍)이다. 일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 아르기니노숙신 산뇨증 (ASL 결핍결핍)이다. 일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 아르기나제 결핍 (고아르기닌혈증, ARG1 결핍)이다. 일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 오르니틴 트랜스로카제 결핍 (ORNT1 결핍, 고오르니틴혈증-고-암모니아혈증-호모시트룰린뇨증 증후군)이다. 일부 구체예들에서, 상기 요소 주기 장애는 시트린 결핍이다.
본 명세서의 또다른 측면에는 CPS1 관련된 장애 (가령, CPS1 결핍) 또는 기타 요소 주기 장애를 보유하는 것으로 확인된 대상체의 세포 내에서 CPS1 수준을 증가시키는 방법들이 내포된다. 또 다른 측면에는 대상체의 세포에서 CPS1의 발현을 증가시키는 방법이 내포된다. 상기 방법들에는 세포에서 CPS1의 발현을 증가시켜 세포에서 CPS1의 발현 증가에 효과적인 양으로 세포를 본원에 기술된 ASO와 접촉시키는 단계가 내포될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 방법들에는 세포에서 CPS1의 발현을 증가시켜 세포에서 OTC의 발현을 증가시키는데 효과적인 양으로 세포를 본원에 기술된 ASO와 접촉시키는 단계가 내포된다. 특정 구체예들에서, 상기 방법들에는 세포에서 CPS1의 발현 증가에 효과적인 양으로 세포를 본원에 기술된 ASO와 접촉시키는 단계가 내포되며, 이로써 상기 세포에서 기타 요소 주기 유전자들, 이를 테면, OTC, ASS1, ASL, ARG1, 또는 ORNT1의 발현이 증가된다.
상기 방법들에 기초하여, 본 명세서의 추가 측면들에는 CPS1 관련된 장애 (가령, CPS1 결핍) 또는 기타 요소 주기 장애의 치료를 요하는 대상체에서 이의 치료를 위한 요법에서의 용도, 약물로써의 용도, 또는 치료에서의 용도, 또는 CPS1 관련된 장애 또는 기타 요소 주기 장애를 갖는 것으로 확인된 대상체의 세포 내에서 CPS1 수준을 증가시키는 용도, 또는 대상체의 세포 내에서 CPS1 발현 증가를 위한 용도로 본 명세서의 ASO 또는 올리고뉴클레오티드, 또는 이러한 ASO 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 내포된다. 상기 용도에는 세포에서 CPS1의 발현을 증가시켜 세포에서 CPS1의 발현 증가에 효과적인 양으로 세포를 본원에 기술된 상기 ASO 또는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계가 내포될 수 있다. 본 명세서의 방법과 관련하여 아래에 설명된 구체예들은 이러한 추가 측면에도 또한 적용 가능하다.
세포에 ASO 또는 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 단계는 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 생체내 세포에 상기 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 단계에는 대상체, 가령, 인간 대상체 내 세포 또는 세포 군에 상기 ASO 또는 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 단계가 내포된다. 세포를 접촉시키는 시험관내 방법과 생체내 방법의 조합도 또한 가능하다. 위에서 설명한 것처럼, 세포 접촉은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 더욱이, 세포 접촉은 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 달성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 표적화 리간드는 탄수화물 모이어티, 가령, GalNAc3 리간드, 또는 관심 부위로 상기 올리고뉴클레오티드를 지향시키는 기타 리간드이다. 상기 세포는 간 세포 (가령, 간세포)일 수 있다.
본원에 기술된 상기 ASO 또는 올리고뉴클레오티드 또는 약제학적 조성물의 투여는 카테테르를 통한 주입 또는 직접 병변에 주사에 의해 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 흉막 내, 척수강 내, 체강 내(intracavitary)로 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO 또는 올리고뉴클레오티드 또는 약제학적 조성물은 전신으로 투여된다. 특정 구체예들에서, 상기 ASO 또는 올리고뉴클레오티드 또는 약제학적 조성물은 장관외로 투여된다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 상기 ASO 또는 올리고뉴클레오티드 또는 약제학적 조성물은 예를 들어, 사전-충전된 백, 사전-충전된 펜 또는 사전-충전된 주사기를 사용하여 정맥 내 (가령, 정맥 주입)로 투여된다. 기타 구체예들에서, 상기 ASO 또는 올리고뉴클레오티드 또는 약제학적 조성물은 상기 표적 유전자 발현의 증가가 바람직한 장기 또는 조직 (가령, 간)으로 국소적으로 투여된다.
일부 구체예들에서, 상기 ASO 또는 올리고뉴클레오티드가 대상체로 투여되어, 상기 ASO 또는 올리고뉴클레오티드는 상기 대상체 내에서 특정 부위로 전달된다. 이러한 표적화된 전달은 전신 투여 또는 국소 투여에 의해 달성될 수 있다. CPS1 발현의 증가는 대상체 내의 특정 부위에서 유래된 시료 내 CPS1 mRNA 또는 CPS1 단백질 수준의 변화 또는 수준 측정을 사용하여 평가할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법들에는 상기 대상체로부터 유래된 샘플 (가령, 혈액, 뇨, 혈장 또는 뇌척수액)에서 암모니아 수준을 측정하는 단계가 내포된다. 암모니아 수준을 측정하는 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있으며, 위에 설명되어 있다. 특정 구체예들에서, 상기 방법들은 가령, CPS1의 발현을 증가시키는 제제로 대상체를 치료한 후 임상적으로 관련된 결과에 의해 입증된 바와 같이 임상적으로 관련된 CPS1 발현의 증가를 포함한다.
기타 구체예들에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 CPS1 관련된 장애 또는 요소 주기 장애의 하나 또는 그 이상의 증후, 이를 테면, 혈액 내 높은 암모니아 수준이 감소 (가령, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소)를 이끄는 데 효과적인 양 및 시간으로 투여된다.
CPS1 발현 수준의 증가
CPS1을 표적으로 하는 ASO를 사용하는 본원에 개시된 치료 방법은 치료받지 않은 대상체(가령, 상기 ASO 또는 상기 약제학적 조성물의 투여 전 동일한 대상체)와 비교하여 이 대상체에서 CPS1 발현 수준을 증가시키도록 설계되었다. CPS1 유전자의 발현 증가에는 CPS1 유전자의 임의의 수준 증가, 가령, CPS1 유전자 발현의 적어도 부분적 증가가 내포된다. 증가는 대조군 수준과 비교하여, 이러한 변수들 중 하나 또는 그 이상의 절대적 또는 상대적 수준의 증가로 평가될 수 있다. 대조군 수준은 당업계에서 활용되는 임의의 유형의 대조 수준일 수 있으며, 가령, 투여 전 기준선 수준, 또는 대조군으로 처리되거나 처리되지 않은 유사한 대상체, 세포 또는 샘플 (이를 테면, 가령, 완충액 만의 대조군 또는 비활성 물질 대조군)로부터 측정된 수준일 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 방법들은 가령, CPS1의 발현을 증가시키는 제제로 대상체를 치료한 후 임상적으로 관련된 결과에 의해 입증된 바와 같이 임상적으로 관련된 CPS1 발현의 증가를 유발한다.
특정 구체예들에서, 본원에 기술된 방법들은 CPS1 유전자 발현을 분량투여-전 기준 수준과 비교하여, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 증가시킨다. 특정 구체예들에서, 본원에 기술된 방법들은 분량투여-전 기준 수준과 비교하여, CPS1 유전자 발현을 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 또는 적어도 10-배 증가시킨다. 특정 구체예들에서, 상기 대상체는 CPS1 발현 결핍을 보유하며, 본원에 기술된 방법으로 유사한 나이 및 성별의 대상체에서의 평균 CPS1 발현 수준 또는 활성에 대해 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%로 상기 CPS1 발현 수준 또는 활성을 복원시킨다.
CPS1 유전자의 발현은 CPS1 유전자 발현과 연합된 임의의 변수 수준, 가령, CPS1 mRNA 수준 또는 CPS1 단백질 수준의 수준에 근거하여 평가될 수 있다. CPS1은 특정 포유류 (가령, 인간 및 마우스)에서 염색체-2 유전자인 것으로 이해된다. 특정 구체예들에서, 본원에서 CPS1의 발현 수준 또는 활성은 간에서 평균 발현 수준 또는 활성을 지칭한다.
특정 구체예들에서, 대리(surrogate) 마커를 사용하여 CPS1 발현 수준의 증가를 감지할 수 있다. 예를 들면, CPS1 발현을 증가시키는 제제를 사용한 허용 가능한 진단 및 모니터링 기준에 의해 입증된 바와 같이, CPS1 관련 장애의 효과적인 치료는 CPS1의 임상적으로 관련된 증가를 입증하는 것으로 이해될 수 있다.
CPS1 유전자의 발현 증가는 첫 번째 세포 또는 세포 그룹 (이러한 세포는 예를 들어, 대상체로부터 유래된 시료에 존재할 수 있고)에 의해 발현되는 mRNA 양의 증가로 나타날 수 있고, CPS1 유전자가 전사되고, 처리를 받거나 받았던 (가령, 세포 또는 세포들을 본 명세서의 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써, 또는 세포가 존재하거나 존재했던 대상체에게 본 명세서의 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써), 상기 CPS1 유전자의 발현이 첫 번째 세포 또는 세포 그룹과 실질적으로 동일하지만, 이러한 처리를 받지 않았거나 처리되지 않은 두 번째 세포 또는 세포 그룹 (올리고뉴클레오티드로 처리되지 않거나 관심 유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 대조 세포(들))과 비교하여 증가된다.
기타 구체예들에서, CPS1 유전자의 발현 증가는 CPS1 유전자 발현과 기능적으로 연결된 매개변수, 예를 들어, CPS1 단백질 발현 또는 CPS1 활성의 증가로 평가될 수 있다. CPS1 증가는 발현 구조체로부터 내인성 또는 이종성 CPS1을 발현시키는 임의의 세포에서 당업계에 공지된 임의의 분석에 의해 결정될 수 있다.
CPS1 발현의 증가는 대조군 세포 또는 대조군 세포 군과 비교하여, 세포 또는 세포군에 의해 발현되는 CPS1 단백질 수준 (가령, 대상체로부터 유래된 샘플에서 발현된 단백질의 수준)의 증가로 나타날 수 있다. CPS1 발현의 증가는 대조군 세포 또는 대조군 세포군에 비해 처리된 세포 또는 세포군에서 CPS1 mRNA 수준의 증가에 의해 또한 나타날 수 있다.
CPS1 유전자의 발현 증가를 평가하기 위해 사용될 수 있는 대조군 세포 또는 세포군에는 본 명세서의 올리고뉴클레오티드와 아직 접촉되지 않은 세포 또는 세포군이 내포된다. 예를 들면, 대조군 세포 또는 대조 세포군은 개별 대상체 (가령, 인간 또는 동물 대상체)를 올리고뉴클레오티드로 처리하기 전, 이 대상체로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포군에 의해 발현되는 CPS1 mRNA의 수준은 mRNA 발현을 평가하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 샘플 내 CPS1의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부, 예를 들어, CPS1 유전자의 mRNA를 검출함으로써 결정된다. 예를 들어, 산성 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출(RNAzol B; Biogenesis), RNEASYTM RNA 조제물 키트(Qiagen) 또는 PAXgene (PreAnalytix, Switzerland)을 사용하는 것을 비롯한, RNA 추출 기술을 사용하여 세포로부터 RNA를 추출할 수 있다. 리보핵산 혼성화를 활용하는 일반적인 분석 형식에는 핵-실행 분석, RT-PCR, RNase 보호 분석, 노던 블롯팅, 제자리(in situ) 혼성화 및 마이크로어레이 분석이 내포된다. 순환하는 CPS1 mRNA는 PCT 공개 번호 WO 2012/177906에 기술된 방법을 사용하여 검출할 수 있으며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 일부 구체예들에서, CPS1의 발현 수준은 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로브"란 특정 CPS1 서열, 가령, mRNA 또는 폴리펩티드에 선택적으로 결합할 수 있는 모든 분자를 의미한다. 프로브는 당업자에 의해 합성되거나, 적절한 생물학적 제제로부터 유래될 수 있다. 프로브는 라벨링이 될 수 있도록 특별히 설계될 수 있다. 프로브로 활용될 수 있는 분자의 예로는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자가 내포되지만, 이에 국한되지는 않는다.
분리된 mRNA는 Southern 또는 Northern 분석, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 및 프로브 어레이를 포함하되, 이에 국한되지 않는 혼성화 또는 증폭 분석에 사용될 수 있다. mRNA 수준을 결정하는 한 가지 방법은 분리된 mRNA를 CPS1 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것이다. 한 구체예에서, 예를 들어, 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에 전개하고, 이 겔로부터의 mRNA를 니트로셀룰로오스와 같은 막으로 전달함으로써, mRNA를 고체 표면에 고정시키고 프로브와 접촉시킨다. 대체 구체예에서, 상기 프로브(들)는 고체 표면에 고정되고, mRNA는 예를 들어, AFFYMETRIX 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)와 접촉된다. 당업자는 CPS1 mRNA 수준의 결정에 사용하기 위해 공지된 mRNA 검출 방법을 용이하게 채택할 수 있다.
샘플에서 CPS1의 발현 수준을 결정하기 위한 대안적인 방법은 샘플 내 예를 들어, mRNA의 핵산 증폭 및/또는 역전사효소(cDNA를 제조하기 위한) 과정, 가령, RT-PCR (Mullis, 1987, U.S. 특허 번호 4,683,202에서 제시된 실험 구체예), 리가제 연쇄 반응 (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), 자가-지속된 서열 복제 (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사적 증폭 시스템 (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 복제효소 (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제 (Lizardi et al., U.S. 특허 번호 5,854,033) 또는 임의의 기타 핵산 증폭 방법에 의해, 이어서 당분야에 잘 공지된 기술을 이용하여 이러한 증폭된 분자들의 검출 과정이 연루되어 있다. 이러한 검출 방식들은 핵산 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 이들 핵산 분자를 검출하는 데 특히 유용하다. 본 발명의 특정 측면들에서, CPS1 발현 수준은 정량적 형광성 RT-PCR (즉, TAQMANTM System) 또는 DUAL-GLO®Luciferase 분석에 의해 결정된다.
CPS1 mRNA의 발현 수준은 멤브레인 블롯 (이를 테면, Northern, Southern, 도트 및 이와 유사한 것들과 같은 혼성화 분석에 사용되는 것), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 젤, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체).을 사용하여 모니터링할 수 있다. U.S. 특허 번호 5,770,722; 5,874,219; 5,744,305; 5,677,195; 및 5,445,934 참고, 이들은 본원의 참고자료에 편입되어 있다. CPS1 발현 수준의 결정은 또한 용액내 핵산 프로브들을 이용하는 것을 또한 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, mRNA 발현 수준은 분기화된 DNA (bDNA) 분석 또는 실시간 RT PCR 또는 qPCR를 이용하여 평가된다. 이러한 방법은 CPS1 핵산 검출에도 사용될 수 있다.
CPS1 단백질 발현 수준은 단백질 수준 측정을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법들에는 예를 들면, 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 과다확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광학, 비색 분석, 분광광도 분석, 유세포분석, 면역확산 (단일 또는 이중), 면역전기영동, 웨스턴 블롯팅, 방사면역분석 (RIA), 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 면역형광 분석, 전기화학발광 분석 및 이와 유사한 것들이 내포된다. 이러한 분석은 CPS1 단백질의 존재 또는 복제를 나타내는 단백질의 검출에도 사용될 수 있다.
V. 추가적인 구체예들
구체예 1 카르바모일-포스페이트 합성효소 1 (CPS1)의 조절 RNA (regRNA)의 적어도 8개 인접 뉴클레오티드에 상보적인 ASO, 이때 상기 ASO는 상기 regRNA에서 이 regRNA의 말단으로부터 200개를 넘지 않는 뉴클레오티드인 서열에 상보적이다.
구체예 2 구체예 1의 ASO에서, 이때 상기 ASO는 상기 regRNA에서 이 regRNA의 3' 단부로부터 200개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 서열에 상보적이다.
구체예 3 구체예 1의 ASO에서, 이때 상기 ASO는 상기 regRNA에서 이 regRNA의 5' 단부로부터 200개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 서열에 상보적이다.
구체예 4 구체예 1 또는 2의 ASO에서, 이때 상기 ASO는 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
구체예 5 구체예 1의 ASO에서, 이때 ASO의 5' 단부에서 적어도 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드, 그리고 3' 단부에서 적어도 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함한다.
구체예 6 구체예 1 또는 2의 ASO에서, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 화학적 변형은 2'-O-메톡시메틸, 5-메틸 시티딘, 잠금된 핵산 (LNA), 및 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다.
구체예 7 구체예 1-3의 ASO에서, 이때 상기 ASO는 변형안된 DNA의 8개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
구체예 8 CPS1 유전자의 조절 RNA의 적어도 8개 인접 뉴클레오티드에 상보적인 ASO, 이때 상기 ASO는 변형안된 DNA의 8개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
구체예 9 구체예 1-8의 ASO에서, 이때 상기 ASO는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
구체예 10 구체예들 1-9의 ASO에서, 이때 상기 ASO는 변형안된 리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
구체예 11 구체예 1-10의 ASO에서, 이때 상기 ASO의 길이는 3 × n + 2개의 뉴클레오티드 (n은 6 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 3 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 남아있는 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된 리보뉴클레오티드이다.
구체예 12 구체예 1-11의 ASO에서, 이때 상기 ASO의 각 리보뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된 리보뉴클레오티드이다.
구체예 13 구체예 1-12의 ASO에서, 이때 상기 ASO에서 각 시티딘은 5-메틸에 의해 변형된다.
구체예 14 구체예 1-13의 ASO에서, 이때 상기 ASO는 50개, 40개, 30개, 또는 25개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
구체예 15 구체예 1-14의 ASO에서, 이때 상기 regRNA는 eRNA이다.
구체예 16 구체예 1-15 중 임의의 하나의 구체예의 ASO 및 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
구체예 17 세포에서 조절 RNA의 양 및/또는 안정성을 증가시키는 방법, 이 방법은 상기 조절 RNA와 혼성화되는 구체예 1-15 중 임의의 하나의 구체예의 ASO를 상기 세포에 접촉시키는 단계를 포함한다.
구체예 18 세포에서 표적 유전자의 전사를 증가시키는 방법, 이 방법은 상기 표적 유전자의 조절 RNA와 혼성화되는 구체예 1-15 중 임의의 하나의 구체예의 ASO를 상기 세포에 접촉시키는 단계를 포함한다.
구체예 19 구체예 17 또는 18의 방법에서, 이때 상기 세포는 포유류 세포다.
구체예 20 구체예 19의 방법에서, 이때 상기 세포는 인간 세포다.
구체예 21 구체예 17-20의 방법에서, 이때 상기 표적 유전자는 CPS1이다.
실시예들
실시예 1: regRNA-표적화 ASOs를 이용하여 CPS1 발현 조정
본 실시예는 인간 CPS1의 인핸서에서 전사된 eRNAs를 표적으로 하는 ASOs를 사용하여, 인간 간세포에서 CPS1 발현의 조절을 평가하도록 기획되었다.
CPS1 인핸서 내의 조절 RNAs (regRNAS)는 인간 및 마우스 데이터의 ATAC-seq 및 H3K27Ac ChIP-SEQ 데이터를 사용하여 생물정보학적으로 식별되었다. 도 2에 도시된 바와 같이, 인간과 마우스 사이에 보존되어 있는 2개의 regRNA (RR44_v1 및 RR44_v2)가 확인되었다.
CPS1을 표적으로 하는 330개의 고유한 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASOs)가 설계되었으며, 그 중 94개는 위에서 설명한 CPS1 regRNA(RR44)를 표적으로 한다.
공여자-유래된 간세포를 시험관 내에서 배양했다. 세포들을 정상 배지에서 플레이킹하였고, 최종 농도 1.25μM, 2.5μM, 또는 5μM, 또는 hCPS1-ASO-1a 또는 대조군으로 플레이팅한 후 4-6 시간 처리했다 (도 5A, 인간 CPS1 서열 및 선별된 ASOs의 화학적 변형). 치료 후 48시간 후에 세포를 수집하였고, RNA 분리, cDNA 합성 및 QPCR 분석을 위해 처리했다. CPS1 발현에 60X의 Taqman 프로브가 사용되었다. CPS1 수준은 B2M 발현으로 정규화되었다. 도 3에서는 hCPS1-ASO-1a로 처리한 후 CPS1 mRNA를 보여주며, 이는 regRNA RR44를 표적으로 하는 ASO가 용량 의존적 방식으로 인간 CPS1 mRNA를 증가시켰음을 입증한다.
hCPS1-ASO-1a를 출발점으로 사용하여, 베이스-워킹(base-walking)을 통해 추가 ASOs를 설계했다. 이 ASOs는 도 4A에 나타낸다. 위에서 설명한 방법들을 사용하여 이러한 추가 ASOs를 CPS1 mRNA에 대한 효과에 대해 평가하였고, 그 결과는 도 4B에 나타낸다. 추가적인 ASOs는 도 5A에 나타낸다.
대부분의 regRNAs에는 인간과 마우스 게놈 사이에 보존되는 큰 서열 영역이 없다. 생체내 개념 증명을 위해, 마우스 CPS1 영역 주변의 regRNA를 식별하였고, 해당 마우스 regRNA (프로모터 및 인핸서)를 표적으로 하는 ASOs를 기획했고, 야생형 (B6EiC3SnF1/J, [WT]) 일차 마우스 간세포 및 CPS1 결핍 공여자 (B6EiC3Sn　a/A-CPS1 spf-ash /J, [CPS1D]) 일차 마우스 간세포 모두에서 스크리닝되었다.
일차 간세포들은 마우스 균주 B6EiC3SnF1/J (대조군 WT) 및 OTC 결핍 공여자 (B6EiC3Sn　a/A-OTC1 spf-ash /J, 카탈로그: 001811, JAX 실험실)마우스로부터 단리되었다. 상기 spfash　마우스는 OTC　유전자에서 스플라이싱에 영향을 주는 변이체 c.386G>A, p.Arg129His를 보유하며, 이로써 spf/ash 간에서 OTC mRNA 수준의 감소를 초래한다 (대조군의 5~12%) 따라서, 수컷 spf　ash　마우스는 낮은 OTC 활성 (야생형의 5%-10%)을 갖는 약한 생화학적 표현형을 갖는다.
일차 간세포를 0일차 시점에 웰당 20,000개의 세포로 접종했다. 세포를 2일차에 1.25μM, 2.5μM 및 5μM의 농도로 ASO로 처리했다. 세포를 2일 동안 항온처리하였고, mRNA 분석을 위해 처리 후 2일차 시점에 용해물을 수집했다. 마우스 CPS1 및 OTC 발현을 결정하기 위해 Taqman 프로브가 사용되었다. Ppia와 Hprt는 유전자 발현 정상화를 위한 하우스키퍼 유전자로 사용되었다. 통계는 Prism (GraphPad)에서 일원 ANOVA를 사용하여 수행되었다.
처리된 야생형 및 OTC-결핍 간세포들에서 생체내 CPS1 mRNA 수준은 도 6A에 나타내며, 히트맵은 도 6B 및 도 6C에 나타낸다. 표시된 바와 같이, 확인된 ASOs의 하위 집합은 처리된 간세포에서 CPS1 mRNA를 2배까지 상향 조절한다. 추가적으로, CPS1을 상향조절하는 ASOs는 OTC의 발현을 또한 증가시킬 수 있음이 관찰되었다 (도 7A에서는 OTC mRNA를, 그리고 도 7B 및 도 7C에서는 히트맵을 보여준다). 따라서, ASO 표적화 regRNA는 질환에 걸린 마우스의 간 세포에서 CPS1 발현 증가에 사용될 수 있다. AOTC 결핍 마우스 세포에서 ASO 매개된 CPS1 상향 조절을 통해 질환 모델에서 테스트할 수 있으며, 생체내 표현형 판독이 가능하다.
CPS1의 생체내 조절
수컷 B6EiC3Sn　a/A-Otcspf-ash/J　마우스 (동형접합성), 4-5마리 마우스/그룹을 단식시킨 후, 그 다음 0.75M NH4Cl을 복강 내 주사하여 감염시켰다. 2 시간 후, GalNAc-접합된 ASO를 200mg/kg/wk 피하 주사로 투여했다. 약 48 시간 후에 마우스에게 GalNAc-접합된 ASO를 다시 투여했다. 약 24 시간 후, 마우스에게 0.75M NH4Cl을 복강 내 주사하고, 약 24 시간 후에 다시 GalNAc-접합된 ASO를 투여했다. 72시간 후, 마우스에게 0.75M NH4Cl을 복강 내 주사하였고, GalNAc-접합된 ASO를 투여했다. 48 시간 후, 마우스에게 0.75M NH4Cl을 복강내 주사하였고, 2시간 후에 희생시켰다. 타임라인은 도 8에 도시되어 있다. NH4Cl 주입-후 30-60분 시점에 혈청을 수집하였고, 최종 혈장 샘플을 IDEXX로 분석하여 암모니아 수준을 확인했다. 희생시킨 후 간, 혈청 및 소변을 수집했다.
도 9A에서 나타낸 것과 같이, ASO 처리로 마우스 간에서 CPS1 mRNA가 약 1.4-배 증가되었다. 추가적으로, 치료 후 혈장 암모니아 수준은 감소하여, 요소 생성이 증가한 것으로 나타났다 (도 9B). CPS1 regRNA를 표적으로 하는 ASOs는 OTC-결핍된 마우스들에서 ASS1, ASL 및 ARG1을 비롯한, 여러 다른 요소 주기 유전자들을 추가로 증가시켰다 (도 9C). 중요한 것은, CPS1 regRNA를 표적으로 하는 ASOs는 이웃 유전자들의 발현 수준에는 영향을 주지 않았다 (도 9D).
추가적인 실험에서, 수컷 B6EiC3Sn　a/A-Otcspf-ash/J　마우스 (동형접합성), 4-5 마리/그룹단식시킨 후, 그 다음 0.75M NH4Cl를 복막으로 주사하고, GalNAc-접합된 ASO를 복막으로 주사하였다. NH4Cl 주입 후 60분에 수집된 최종 혈장 샘플은 IDEXX를 통해 암모니아 수준을 분석했으며, 검출 상한치는 1020μg/dL이다. 도 10에서 나타낸 것과 같이, CPS1 regRNA 표적화 mCPS1-ASO-2는 OTC 결핍 마우스에서 암모니아를 야행형 수준으로 다시 감소시켰다.
도 11A 및 11B에서 나타낸 것과 같이, 상기 ASO 처리 후 수컷 OTCD 마우스들 (Otc spf/ash )에서 생체내 혈장 암모니아 (도 11A) 및 요소 (도 11B)에서의 분량투여 의존적 영향이 있었다. 마우스를 밤새 단식시킨 후 상기 암모니아 공격이 이루어졌다. 간단히 말하면, 마우스에게 IP 주사를 통해 0.75M 염화암모늄 용액을 투여했다. 각 암모늄 공격 후, 30분 (±5%)에 중간 혈장을 수집했다. Beckman Coulter AU®화학 분석기를 사용하여 신선한 혈장 샘플에서 암모니아 수준을 측정했다. 또한, 암모니아 감소는 투여된 총 ASO와 상관관계가 있었다 (도 11C). 이론에 얽매이지 않고, 이 데이터는 ASO의 분량투여 축적을 시사하므로, 따라서 ASO의 장-기간 작용을 뒷받침한다. 또한, 데이터는 ASO 효능이 시간 경과에 따라 분량투여를 분할하여, 분량투여 중 더 큰 안전 한계를 허용함으로써 달성될 수 있음을 시사한다. 예를 들면, 적어도 1개월 분량투여 간격을 사용할 수 있다.
ASO의 작용 기간을 평가하기 위해 두 번째 생체 내 실험이 수행되었다. 수컷 B6EiC3Sn　a/A-Otcspf-ash/J　마우스 (동형접합성) 또는 야생형 (C57BL/6) 마우스, 5마리 마우스/그룹를 단식시킨 후, 그 다음 0.75M NH4Cl을 복강 내 주사하여 공격하였다. 2 시간 후, GalNAc-접합된 ASO를 100mg/kg/wk 피하 주사로 투여했다 (1일차 시점). WT 및 OTC-결핍 마우스의 한 그룹에는 대조군으로 PBS가 투여되었다. 3일차 및 5일차 시점에 마우스에게 GalNAc-접합된 ASO를 다시 투여했다. 암모니아는 8일차, 11일차, 15일차, 19일차, 22일차, 26일차 시점에 마우스의 복강 내로 투여되었다. 순환 암모니아는 IP 암모니아 공격-후 측정되었다. 26일차 시점에 마우스를 희생시켰고, 간을 수집하여 mRNA 및 단백질 발현을 위해 처리했다. mRNA 기하학(geomean)은 Gusb, Gapdh, Actb, Ppia 및 Hprt 유전자에 의해 정량화되었다. 통계는 이원(two way) ANOVA로 수행되었다. 이원 ANOVA, *: P<0.05, **: P < 0.01, ***: P<0.001, ****: P<0.0001.
도 12A에 나타낸 바와 같이, Cps1 ASO 처리로 OTC 결핍 마우스들에서 마우스 Otc 및 Cps1 mRNA 발현(CPS1의 1.26 FC 및 OTC의 1.43 FC)이 증가되었다. WT C57 마우스들의 mRNA는 좌측 막대로 나타내며, PBS로 처리된 Otcspf-ash/J　는 중간 막대로 나타내며, ASO로 처리된 Otcspf-ash/J　는 우측 막대로 나타낸다. 또한, ASO 처리로 추가적인 요소 주기 유전자들, 이를 테면, Nags, Ass1, Asl, 및 Arg1이 증가되었다 (도 12B). WT C57 마우스들의 mRNA는 좌측 막대로 나타내며, PBS로 처리된 Otcspf-ash/J　는 중간 막대로 나타내며, ASO로 처리된 Otcspf-ash/J　는 우측 막대로 나타낸다.
PBS 대조군 그룹에서, 마우스 Otc 결핍 간에서 암모니아 처리 후 30분 시점에서 고-암모니아혈증이 나타났다 (도 13, 1.0에서 검정 삼각형 참고). 암모니아 수준은 연구 전반에 걸쳐 일관되게 나타났다. 마우스 Cps1 ASO (역삼각형)로 처리하면 암모니아가 WT 수준 (사각형)으로 감소하였고, 이 연구 전반에 걸쳐 야생형(WT) 수준을 유지했다 (도 13). ASO는 1일차, 3일차, 5일차 시점에 투여됐으나, 작용기간은 약 4주였다.
Yecuris 마우스들 (OTC 결핍 인간화된 간을 갖는 Fah -/- ;Rag2 -/- ;Il2rg -/- (FRG) 마우스) 마우스에서 hCPS1-ASO-1x를 사용하여 생체 내 분석을 반복했다. 수컷 인간화된 Yecuris 마우스들에게 인간 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍 간세포(OTCD) 또는 건강한 야생형 간세포 (WT)를 5마리/그룹으로 다시 채웠다. 밤새 금식시킨 후, 0.75M 15NH4Cl을 복강내 주사하였다. 2 시간 후, GalNAc-접합된 hCPS1-ASO-1x의 다중 용량을 1일차, 8일차, 15일차 시점에 피하 주사했다. 일부 그룹에서, 5, 20, 50mg/kg/주 분량용량의 단일 주사가 수행되었다. WT 및 OTCD Yecuris FRG 마우스의 한 그룹에는 대조군으로 PBS가 투여되었다. 인간화된 Yecuris 마우스의 암모니아 유발 및 요소 생성 분석은 암모니아 유발 전에 단식 상태, 즉 밤새 음식 금단 상태에서 수행되었다. 1일차, 8일차, 15일차 및 22일차 (최종 수확)에 밤새 금식한 후 동물에게 복강내 주사를 통해 15NH4Cl을 투여했다. 30분 후, 소변과 혈장을 채취하였다.
도 15A 및 15B에서 나타낸 바와 같이, hCPS1-ASO-1x는 인간화된 간을 가진 OTCdef 마우스들에게서 생체내 혈장 암모니아를 감소시켰고, 생체내 요소를 증가시켰다. hCPS1-ASO-1g를 5mg/kg 및 20mg/kg로 처리-후, OTC 단백질 수준을 또한 증가시켰다 (도 15C).
일차 인간 간세포에서 요소생성의 시험관내 조절
ASOs는 또한 시험관 내 인간 세포에서 요소 생성을 촉진하는 능력에 대해 테스트되었다. 건강한 공여자 일차 인간 간세포 및 OTCdef 일차 인간 간세포를 플레이팅하였고, 1.25uM의 hCPS1-ASO-1a 또는 hCPS1-ASO-1g를 세포와 함께 2일 동안 항온처리했다. 둘째 날, 2 M NH4Cl을 세포 혼합물에 첨가했다. mRNA 및 요소 정량화를 위해 3일째에 세포 및 세포 배지를 수집했다. 도 16에서 나타낸 바와 같이, ASOs는 건강한 인간 간세포 및 OTCdef 일차 인간 간세포 모두에서 CPS1 mRNA 및 요소생성을 증가시켰음을 보여준다.
추가적인 ASOs의 합성 및 특징화
추가적인 ASOs를 합성하였고, 특징화하였다. 간세포를 위에서 설명한 대로 5uM ASO로 처리하고 CPS1 mRNA-배수 변화를 결정했다.
표 4는 CPS1 mRNA의 mRNA FC와 표준 편차를 증명한다.
hCPS1-ASO-1a 및 hCPS1-ASO1g는 농도를 증가시키면서 간세포에서 테스트되었다. 0.156 내지 5uM ASO를 위에서 설명한 대로 간세포와 함께 항온처리했다. 표 5에 나타낸 바와 같이, hCPS1-ASO-1a 및 hCPS1-ASO1g 모두 CPS1 mRNA에서 분량투여 의존적 증가를 유도했다.
추가적인 화학적 변형이 선별된 ASOs에서 있었다. 상기 화학적 변형은 도 14에서 제공된다. 간세포를 위에서 설명한 대로, 선별된 ASO 1.25~5uM과 함께 항온처리했다. 가장 높은 CSP1 mRNA 배수 변화(FC) 및 표준 편차(SD)는 표 6에서 제공된다.
종합하면, CPS1 RR44를 표적으로 하는 109개의 초기 ASOs가 만들어졌으며, 그 중 69개의 갭머로 구성된 76개의 ASOs와 7개의 입체 ASOs가 첫 번째 통과 스크린을 통과했다. 이 76개의 ASOs는 타일링(tiling)을 위해 선택되었으며, 4개의 갭머와 5개의 입체체로 구성된 9개의 ASOs가 이 스크린에서 선택되었다. 추가 화학 물질이 포함된 12개의 갭머와 12개의 믹시머를 포함하는 추가 24개의 ASOs가 미세 조정을 통해 만들어졌다. 추가 특성화를 위해 hCPS1-ASO-1g (서열 식별 번호: 22)을 선택했다. PO 결합, GalNAc 모이어티 및 추가적인 5meC 모이어티가 생체내 연구용으로 추가되어, hCPS1-ASO-1x (서열 식별 번호: 409)가 되었다.
실시예 2: 추가적인 CPS1 regRNA-표적화 ASOs의 합성 및 특징화
추가적인 두 개의 regRNAs, RR89 및 RR90이 확인되었다. 새로운 regRNA를 표적으로 하는 ASOs를 합성하였고, 위에서 설명한 대로 간세포에서 5uM로 테스트했다. 이 ASOs로 처리한 후, CPS1 mRNA 배수 증가는 아래 표 7에 제공된다.
실시예 3: 비-인간 영장류에서 ASOs의 생체내 특징화
2~4세의 수컷 시노몰구스 원숭이(NHP)에게 0일차 시점에 hCPS1-ASO-1x 20mg/kg 또는 50mg/kg을 피하주사하였고, 21일차 시점에 일부 그룹에게 반복 분량투여하였다. 3개의 NHPs가 하나의 그룹으로 무작위로 할당되었다. 한 그룹에는 음성대조군으로 PBS를 투여하였다. NHPs에서 암모니아 공격 및 요소생성 분석은 암모니아 공격 전에 하룻밤의 공복 상태에서 수행되었다. 200mg/kg의 15NH4Cl 용액을 NHP에 피하 주사하였고, 0-120분에 걸쳐 여러 번 혈액을 채취하고, 원심분리에 의해 바로 혈장을 얻었다.
hCPS1-ASO-1x는 27일차 시점까지 오로지 PBS만으로 처리한 것과 비교하여, NHPs에서 암모니아 생산을 통계적으로 유의미한 양만큼 감소시켰다. 도 17에서 시간 경과 및 분량투여마다 암모니아 AUC를 또한 제공한다.
제2 생체내 NHP 연구는 더 낮은 hCPS1-ASO-1x의 분량투여 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 2~4세의 암컷 시노몰구스 원숭이(NHP)에게 1일차 시점에 hCPS1-ASO-1x 5mg/kg 또는 15mg/kg을 피하주사하였고, 36일차 시점에 일부 그룹에게 반복 분량투여하였다. 각 그룹은 3개의 NHPs로 구성되었다. 한 그룹에는 음성 대조군으로 PBS를 투여했다. NHPs에서 암모니아 공격 및 요소생성 분석은 암모니아 공격 전에 하룻밤의 공복 상태에서 수행되었다. 200mg/kg의 15NH4Cl 용액을 NHP에 피하 주사하였고, 0-120분에 걸쳐 몇 차례 혈액을 채취하고, 원심분리에 의해 바로 혈장을 얻었다. 13C-요소생성 분석은 아세트산 나트륨 전달 전에 하룻밤의 공복 상태에서 수행되었다. 55mg/kg의 13C-아세트산 나트륨을 경구 위관 영양법으로 제공하였고, 0-240분에 걸쳐 여러 번 혈액을 채취하고 원심분리에 의해 바로 혈장을 얻었다. 도 18에서 hCPS1-ASO-1x는 최대 5주 동안 5mg/kg의 단일 분량투여한 후, NHPs에서 암모니아를 감소시켰다는 것을 보여준다 (22일차 및 36일차 시점에 암모니아 수준을 나타낸다). 또한, 상기 ASOs를 처리한 NHPs에서 요소 수준은 투여 후 최대 29일까지 증가했다. 도 19는 22일차, 29일차 및 36일차 시점에서 암모니아 AUC 정량화의 연구를 제공한다.
hCPS1-ASO-1x와 13C-아세트산 나트륨 처리의 조합은 hCPS1-ASO-1x 단독에 비해 43일차 시점에서 NHPs에서 요소 생성을 향상시켰다 (도 20).
요약하면, CPS1의 상향 조절은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 마우스, NHP 및 인간 간세포에서 요소 주기의 산출을 증가시켰다. ASO 처리를 통해 마우스 OTCdef 모델에서 CPS1 mRNA를 증가시키면 암모니아에서 요소로의 대사가 증가했으며 NHP 데이터와 인간화된 마우스 간 데이터는 이 발견을 뒷받침한다.
참고자료로의 편입
다른 언급이 없는 한, 본원에 언급된 각각의 특허 문헌 및 과학 논문의 전체 개시는 모든 목적을 위해 참고로 통합된다.
등가물(EQUIVALENTS)
본 발명은 그 사상 또는 본질적인 특성을 벗어나지 않으면 서, 다른 특정 형태로 구체화될 수 있다. 그러므로, 전술한 구체예들은 본 명세서에 기술된 모든 측면에서 본 발명을 제한하기보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 첨부된 청구 범위에 의해 표시되며, 청구범위의 의미 및 동등 범위 내에 있는 모든 변경은 그 안에 포함되는 것으로 의도된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (62)

  1. 카르바모일-포스페이트 합성효소 1 (CPS1)의 조절 RNA (regRNA)의 적어도 8개 뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)에 있어서, 이때 상기 regRNA는 서열 식별 번호: 49, 50, 69-79 및 89-90로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 ASO는 상기 regRNA에서 이 regRNA의 3' 단부로부터 200개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 서열에 상보적인, ASO.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 ASO는 상기 regRNA에서 이 regRNA의 5' 단부로부터 200개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 서열에 상보적인, ASO.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 이때 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 49의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  5. 청구항 1, 2, 또는 4 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 RNA는 서열 식별 번호: 49의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  6. 청구항 1, 2, 또는 4 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 49의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 1-3으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  7. 청구항 1 또는 2에 있어서, 이때 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 50의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 4-15로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  8. 청구항 1-3에 있어서, 이때 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 89의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 487-574로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  9. 청구항 1-3에 있어서, 이때 상기 조절 RNA는 서열 식별 번호: 90의 뉴클레오티드 서열을 보유하며, 상기 ASO는 서열 식별 번호: 575-662로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  10. 청구항 1-9 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 50개, 40개, 30개, 또는 25개를 넘지 않는 뉴클레오티드의 길이를 갖는, ASO.
  11. 청구항 1-10 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, ASO.
  12. 청구항 11에 있어서, 이때 ASO의 5' 단부에서 적어도 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드, 그리고 3' 단부에서 적어도 3개, 4개, 또는 5개 뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함하는, ASO.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 화학적 변형은 하나 또는 그 이상의 2'-O-C1-4알킬 이를 테면, 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-데옥시 (2'-H), 2'-O-C1-3알킬-O-C1-3알킬 이를 테면, 2'-메톡시메틸 ("2'-MOE"), 2'-플루오르 ("2'-F"), 2'-아미노 ("2'-NH2"), 2'-아라비노실 ("2'-아라비노") 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노실 ("2'-F-아라비노") 뉴클레오티드, 2'-잠금된 핵산 ("LNA") 뉴클레오티드, 2'-아미도 브릿지 핵산 (AmNA), 2'-풀린 핵산 ("ULNA") 뉴클레오티드, L 형태의 당 ("L-당"), 4'-티오리보실 뉴클레오티드, 속박된(constrained) 에틸 (cET), 2'-플루오르-아라비노 (FANA), 또는 티오몰포리노를 포함하는 뉴클레오티드 당 변형을 포함하는, ASO.
  14. 청구항 11-13 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 화학적 변형은 포스포로티오에이트 ("PS" 또는 (P(S))), 포스포르아미데이트 (P(NR1R2) 이를 테면, 디메틸아미노포스포르아미데이트 (P(N(CH3)2)), 포스포노카르복실레이트 (P(CH2)nCOOR) 이를 테면, 포스포노아세테이트 "PACE" (P(CH2COO-)), 티오포스포노카르복실레이트 ((S)P(CH2)nCOOR) 이를 테면, 티오포스포노아세테이트 "티오PACE" ((S)P(CH2COO-)), 알킬포스포네이트 (P(C1-3알킬) 이를 테면, 메틸포스포네이트 -P(CH3), 보라노포스포네이트 (P(BH3)), 또는 포스포로디티오에이트 (P(S)2) 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 뉴클레오티드간 링키지 변형을 포함하는, ASO.
  15. 청구항 11-14 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 화학적 변형은 2-티오우라실 ("2-티오U"), 2-티오시토신 ("2-티오C"), 4-티오우라실 ("4-티오U"), 6-티오구아닌 ("6-티오G"), 2-아미노아데닌 ("2-아미노A"), 2-아미노퓨린, 슈도우라실, 하이포산틴, 7-데아자구아닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 7-데아자아데닌, 7-데아자-8-아자아데닌, 5-메틸시토신 ("5-메틸C"), 5-메틸우라실 ("5-메틸U"), 5-히드록시메틸시토신, 5-히드록시메틸우라실, 5,6-데히드로우라실, 5-프로피닐시토신, 5-프로피닐우라실, 5-에티닐시토신, 5-에티닐우라실, 5-알릴우라실 ("5-알릴U"), 5-알릴시토신 ("5-알릴C"), 5-아미노알릴우라실 ("5-아미노알릴U"), 5-아미노알릴-시토신 ("5-아미노알릴C"), 무염기 뉴클레오티드, Z 염기, P 염기, 비-구조적 핵산 ("UNA"), 이소구아닌 ("이소G"), 이소시토신 ("이소C") 글리세롤 핵산 (GNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 또는 티오포스포르아미데이트 몰포리노 (TMOs) 중 하나 또는 그 이상의 핵염기 변형을 포함하는, ASO.
  16. 청구항 11-15 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 화학적 변형은 2'-O-메톡시메틸, 5-메틸 시티딘, 잠김 핵산 (LNA), 및 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함하는, ASO.
  17. 청구항 11-16 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 변형된 리보뉴클레오티드 5' 단부와 3' 단부 각각에서 변형된 리보뉴클레오티드의 적어도 3개의 뉴클레오티드의 측면에 있는 변형안된 DNA의 8개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하는, ASO.
  18. 청구항 17에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 16, 22-27, 31-39, 400, 403-415, 417-432, 435-480, 또는 482-486 중 임의의 하나의 서열의 뉴클레오티드 서열 및/또는 화학적 변형을 포함하는, ASO.
  19. 청구항 17 또는 18에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 409의 뉴클레오티드 서열 및/또는 화학적 변형을 포함하는, ASO.
  20. 청구항 17 또는 18에 있어서, 이때 상기 ASO는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 더 포함하는, ASO.
  21. 청구항 20에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 403-406, 409-415, 417-424, 470, 473, 477, 480, 또는 486의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  22. 청구항 17에 있어서, 이때 상기 화학적 변형은 cET인, ASO.
  23. 청구항 22에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 425-432 또는 435-442의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  24. 청구항 17에 있어서, 이때 상기 화학적 변형은 LNA인, ASO.
  25. 청구항 24에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 443-458의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  26. 청구항 17에 있어서, 이때 상기 화학적 변형은 LNA 및 2'-O-메톡시메틸인, ASO.
  27. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 400, 408, 460, 462, 464-466, 468, 469, 471, 472, 475, 476, 또는 479의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  28. 청구항 11-16 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 변형안된 DNA의 8개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하지 않는, ASO.
  29. 청구항 11-16 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 변형안된 리보뉴클레오티드를 포함하지 않는, ASO.
  30. 청구항 11-16 또는 29 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하지 않는, ASO.
  31. 청구항 11-16, 29, 또는 30 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO의 길이는 2 × n + 4개의 뉴클레오티드 (n은 8 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 2 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 남아있는 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸로 변형된 리보뉴클레오티드인, ASO.
  32. 청구항 35에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 393 또는 394의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  33. 청구항 11-16, 29, 또는 30 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO의 길이는 3 × n + 2개의 뉴클레오티드 (n은 4 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 3 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 남아있는 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸로 변형된 리보뉴클레오티드인, ASO.
  34. 청구항 33에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 392 또는 395의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  35. 청구항 11-16, 29, 또는 30 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO의 길이는 3 × n + 2개의 뉴클레오티드 (n은 6 또는 그 이상의 정수임)이며, 이때 위치 3 × m에서 뉴클레오티드는 LNA (m은 1부터 n까지의 정수임)에 의해 변형된 리보뉴클레오티드이며, 3' 위치 및 5' 위치에서 5개 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된 리보뉴클레오티드인, ASO.
  36. 청구항 35에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 19 또는 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  37. 청구항 11-16, 29, 또는 30 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO의 길이는 4 × n개의 뉴클레오티드 (n은 3 또는 그 이상의 정수임)이며, 이때 위치 4 × m에서 뉴클레오티드는 LNA (m은 1부터 n까지의 정수임)에 의해 변형된 리보뉴클레오티드이며, 3' 위치 및 5' 위치에서 5개 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된 리보뉴클레오티드인, ASO.
  38. 청구항 37에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  39. 청구항 11-16, 29, 또는 30 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO의 길이는 4 × n + 4개의 뉴클레오티드 (n은 3 또는 이보다 큰 정수임)이며, 이때 위치 4 × m에서 뉴클레오티드는 LNA에 의해 변형된 리보뉴클레오티드 (m은 1부터 n까지의 정수임)이며, 남아있는 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸로 변형된 리보뉴클레오티드인, ASO.
  40. 청구항 39에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 396 또는 397의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  41. 청구항 11-16, 29, 또는 30 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO의 각 리보뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된, ASO.
  42. 청구항 41에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 17, 28-30, 및 40-48 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  43. 청구항 11-16, 29, 또는 30 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO의 각 리보뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된 리보뉴클레오티드인, ASO.
  44. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 17, 28-30, 및 40-48 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  45. 청구항 11-44 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO에서 각 시티딘은 5-메틸에 의해 변형된, ASO.
  46. 청구항 11-16 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO의 길이는 5 × n +5개의 뉴클레오티드 (n은 3 또는 이보다 더 큰 정수임)이며, 이때 위치 5 × m에서 뉴클레오티드는 LNA (m은 1부터 n까지의 정수임)에 의해 변형된 리보뉴클레오티드이며, 나머지 위치에서 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시메틸에 의해 변형된 리보뉴클레오티드인, ASO.
  47. 청구항 46에 있어서, 이때 상기 ASO는 서열 식별 번호: 398 또는 399의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ASO.
  48. 청구항 11-47 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 GalNAc 모이어티, 임의선택적으로 GalNAc3 모이어티를 더 포함하는, ASO.
  49. 청구항 11-48 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 비오틴 또는 콜레스테롤 모이어티를 더 포함하는, ASO.
  50. 청구항 11-49 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO에서 각 시티딘은 5-메틸에 의해 변형된, ASO.
  51. 청구항 1-50 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 regRNA는 인핸서 RNA (eRNA)인, ASO.
  52. 청구항 1-51 중 임의의 한 항에 따른 ASO 및 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  53. 인간 세포에서 CPS1 전사를 증가시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 세포에 청구항 1-51 중 임의의 한 항에 따른 ASO 또는 청구항 52의 약제학적 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  54. 청구항 53에 있어서, 이때 상기 세포는 간세포인, 방법.
  55. 청구항 53 또는 54에 있어서, 이때 상기 ASO는 이 ASO 또는 상기 약제학적 조성물과 접촉되지 않았던 세포와 비교하였을 때, 상기 세포에서 상기 조절 RNA의 양을 증가시키는, 방법.
  56. 청구항 53-55 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 이 ASO 또는 상기 약제학적 조성물과 접촉되지 않았던 세포와 비교하였을 때, 상기 세포에서 상기 조절 RNA의 안정성을 증가시키는, 방법.
  57. 요소 주기 장애를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 이러한 치료를 요하는 대상체에게 청구항 1-51 중 임의의 한 항에 따른 ASO 또는 청구항 52의 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 이때 상기 요소 주기 장애는 CPS1-결핍인, 방법.
  59. 청구항 57 또는 58에 있어서, 이때 상기 요소 주기 장애는 고-암모니아혈증인, 방법.
  60. 청구항 57-59 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 이 ASO 또는 상기 약제학적 조성물과 접촉되지 않았던 세포와 비교하였을 때, 상기 세포에서 상기 조절 RNA의 양을 증가시키는, 방법.
  61. 청구항 57-60 중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 ASO는 이 ASO 또는 상기 약제학적 조성물과 접촉되지 않았던 세포와 비교하였을 때, 상기 세포에서 상기 조절 RNA의 안정성을 증가시키는, 방법.
  62. 청구항 60 또는 61에 있어서, 이때 상기 세포는 간세포인, 방법.
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Family Cites Families (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
DE69233087T2 (de) 1991-11-22 2003-12-24 Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) Verfahren zur Herstellung von Polymerarrays
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
WO1994000569A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5843705A (en) 1995-02-21 1998-12-01 Genzyme Transgenic Corporation Transgenically produced antithrombin III
EP0833613A1 (en) 1995-05-26 1998-04-08 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
JP4335310B2 (ja) 1995-06-07 2009-09-30 ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 疎水性脂質−核酸複合中間体を通して調製される脂質−核酸粒子、及び遺伝子移送のための使用
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
AU747597B2 (en) 1998-07-20 2002-05-16 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
IL144338A0 (en) 1999-02-12 2002-05-23 Sankyo Co Nucleoside and oligonucleotide analogues and pharmaceutical compositions containing the same
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
DK1178999T3 (da) 1999-05-04 2007-08-06 Santaris Pharma As L-RIBO-LNA-analoger
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US20050019841A1 (en) 1999-05-14 2005-01-27 Arbor Vita Corporation Modulation of signaling pathways
IL150196A0 (en) * 1999-12-13 2002-12-01 Bioniche Life Sciences Inc Therapeutically useful synthetic oligonucleotides
DE60119562T2 (de) 2000-10-04 2007-05-10 Santaris Pharma A/S Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga
WO2003025229A1 (en) 2001-09-19 2003-03-27 The University Of Queensland A method for identifying effector molecules for gene network integration
JP4683922B2 (ja) 2002-09-06 2011-05-18 トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ 遺伝子発現の定量方法
AU2003290596B2 (en) 2002-11-05 2011-05-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
EP1562971B1 (en) 2002-11-05 2014-02-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
ATE517992T1 (de) 2002-11-14 2011-08-15 Dharmacon Inc Funktionelle und hyperfunktionelle sirna
DK2141233T3 (en) 2002-11-18 2017-01-09 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense Design
US7217807B2 (en) 2002-11-26 2007-05-15 Rosetta Genomics Ltd Bioinformatically detectable group of novel HIV regulatory genes and uses thereof
US7888497B2 (en) 2003-08-13 2011-02-15 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
EP1737956A2 (en) 2004-03-01 2007-01-03 Massachusetts Institute of Technology Rnai-based therapeutics for allergic rhinitis and asthma
US7943754B2 (en) 2004-04-02 2011-05-17 Rosetta-Genomics Bioinformatically detectable group of novel regulatory bacterial and bacterial associated oligonucleotides and uses thereof
US7687616B1 (en) 2004-05-14 2010-03-30 Rosetta Genomics Ltd Small molecules modulating activity of micro RNA oligonucleotides and micro RNA targets and uses thereof
US7860656B2 (en) 2005-02-03 2010-12-28 Assistance Publique-Hopitaux De Paris (Ap-Hp) Diagnosis method of hepatic steatosis using biochemical markers
US20060263798A1 (en) 2005-02-11 2006-11-23 International Business Machines Corporation System and method for identification of MicroRNA precursor sequences and corresponding mature MicroRNA sequences from genomic sequences
ES2381201T3 (es) 2005-03-31 2012-05-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos
CN101437933B (zh) 2005-12-28 2013-11-06 斯克里普斯研究所 作为药物靶标的天然反义和非编码的rna转录物
CA2636607C (en) 2006-01-10 2021-05-25 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Nucleic acid molecules and collections thereof, their application and identification
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
US8178503B2 (en) 2006-03-03 2012-05-15 International Business Machines Corporation Ribonucleic acid interference molecules and binding sites derived by analyzing intergenic and intronic regions of genomes
WO2007106503A2 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Combined treatment with an egfr kinase inhibitor and an agent that sensitizes tumor cells to the effects of egfr kinase inhibitors
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2389737T3 (es) 2006-05-11 2012-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5'
CN110066224A (zh) 2006-10-03 2019-07-30 阿尔尼拉姆医药品有限公司 含脂质的制品
WO2008046510A1 (en) 2006-10-16 2008-04-24 Bayer Healthcare Ag Fn1 as a biomarker, therapeutic and diagnostic target
US20100105134A1 (en) 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
US8314227B2 (en) 2007-05-22 2012-11-20 Marina Biotech, Inc. Hydroxymethyl substituted RNA oligonucleotides and RNA complexes
ES2388590T3 (es) 2007-05-30 2012-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos con puente aminometileno N-sustituido.
ES2386492T3 (es) 2007-06-08 2012-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos
EP2176280B2 (en) 2007-07-05 2015-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
US20110097720A1 (en) 2008-01-02 2011-04-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Screening method for selected amino lipid-containing compositions
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
WO2009143371A2 (en) 2008-05-21 2009-11-26 Intradigm Corporation COMPOSITIONS COMPRISING mTOR SIRNA AND METHODS OF USE THEREOF
EP2356129B1 (en) 2008-09-24 2013-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
JP5816556B2 (ja) 2008-12-03 2015-11-18 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 治療剤のためのｕｎａオリゴマー構造
US20100166784A1 (en) * 2008-12-30 2010-07-01 The Washington University Method and compositions for modulating th17 cell development
CN102625696B (zh) 2009-06-10 2015-06-03 阿尔尼拉姆医药品有限公司 改进的脂质制剂
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
EP2456443A1 (en) 2009-07-21 2012-05-30 Gilead Calistoga LLC Treatment of liver disorders with pi3k inhibitors
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
WO2011038031A1 (en) 2009-09-22 2011-03-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dual targeting sirna agents
US9603862B2 (en) 2009-12-14 2017-03-28 Cornell University Activation and activators of SIRT5
US20130190383A1 (en) 2010-04-26 2013-07-25 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers and uses thereof
US8846637B2 (en) 2010-06-08 2014-09-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2012068340A2 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Opko Curna Llc Antagonat compositions and methods of use
JO3003B1 (ar) 2011-01-14 2016-09-05 Lilly Co Eli مركب أيميدازو [4، 5 -c ] كينولين-2- واحد واستخدامه كمثبط كيناز PI3/mtor
WO2012109199A1 (en) 2011-02-07 2012-08-16 Innovative Surface Technologies, Inc. Neural transfection reagents
EP2673001B1 (en) 2011-02-10 2016-12-21 Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional Nts-polyplex nanoparticles system for gene therapy of cancer
AU2012224653A1 (en) 2011-03-07 2013-10-03 Fondazione Telethon TFEB variants and uses thereof
US9012424B2 (en) 2011-05-27 2015-04-21 20Med Therapeutics B.V. Nanogels
KR102128248B1 (ko) 2011-06-08 2020-07-01 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Mrna 전달을 위한 지질 나노입자 조성물 및 방법
CA2839896A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
HK1198766A1 (en) 2011-09-07 2015-06-05 玛瑞纳生物技术有限公司 Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
US9272043B2 (en) 2011-12-02 2016-03-01 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
HK1206644A1 (en) 2012-03-29 2016-01-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
US9221864B2 (en) 2012-04-09 2015-12-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
EP2850186B1 (en) 2012-05-16 2018-12-19 Translate Bio MA, Inc. Compositions and methods for modulating smn gene family expression
JP2015518714A (ja) 2012-05-16 2015-07-06 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法
CA2873779A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
US9518261B2 (en) 2012-05-22 2016-12-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of enhancer RNA mediated gene expression
US8828998B2 (en) 2012-06-25 2014-09-09 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of lupus, fibrotic conditions, and inflammatory myopathies and other disorders using PI3 kinase inhibitors
US9567581B2 (en) 2012-08-07 2017-02-14 The General Hospital Corporation Selective reactivation of genes on the inactive X chromosome
MX360179B (es) 2012-09-04 2018-10-16 Centro De Investig Y De Estudios Avanzados Del I P N Star Complejo nanomolecular nts-poliplex que comprende el gen bdnf, para usarse en el tratamiento de la enfermedad de parkinson y composiciones farmacéuticas que lo contienen.
US20140287932A1 (en) 2012-10-25 2014-09-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Super-enhancers and methods of use thereof
WO2014078399A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Baylor College Of Medicine Multi-arm biodegradable polymers for nucleic acid delivery
WO2014085154A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for treating renal disease
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20160045498A1 (en) 2013-04-04 2016-02-18 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Methods of treating diseases characterized by excessive wnt signalling
WO2014201276A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 The Methodist Hospital Polycation-functionalized nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing agents
CA2921459A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 Rana Therapeutics, Inc. Oligonucleotides targeting euchromatin regions of genes
CN105579068A (zh) 2013-09-23 2016-05-11 伦斯勒理工学院 在各种细胞群中纳米颗粒介导的基因传递、基因组编辑和靶向配体的修饰
CN105793423A (zh) 2013-10-02 2016-07-20 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制lect2基因表达的组合物和方法
WO2015061768A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput synthesis of nanoparticles
WO2015081821A1 (zh) 2013-12-02 2015-06-11 北京键凯科技有限公司 聚乙二醇-多爪寡肽键合的雷帕霉素衍生物
TWI533873B (zh) 2014-02-12 2016-05-21 中央研究院 治療肝臟疾病之醫藥組成物
SG10201809157VA (en) 2014-04-18 2018-11-29 Editas Medicine Inc Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
WO2015187295A2 (en) 2014-06-02 2015-12-10 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
EP3169776B1 (en) 2014-07-14 2025-09-03 The Regents of The University of California Crispr/cas transcriptional modulation
AU2016209295B2 (en) 2015-01-21 2021-08-12 Genevant Sciences Gmbh Methods, compositions, and systems for delivering therapeutic and diagnostic agents into cells
AU2016219263B2 (en) 2015-02-13 2022-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (PNPLA3) iRNA compositions and methods of use thereof
EP3271460A4 (en) 2015-03-17 2019-03-13 The General Hospital Corporation RNA INTERACTOM OF POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 1 (PRC1)
IL254734B2 (en) 2015-03-27 2023-09-01 Harvard College Modified t cells and methods for their preparation and use
EP3748004A1 (en) 2015-04-01 2020-12-09 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating duchenne muscular dystrophy and becker muscular dystrophy
AU2016261600B2 (en) 2015-05-08 2021-09-23 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
EP3302490B1 (en) 2015-05-27 2022-04-13 Sabre Therapeutics LLC Autotaxin inhibitors and uses thereof
JP2017010161A (ja) 2015-06-18 2017-01-12 本田技研工業株式会社 無人作業機の制御装置
JP2018527016A (ja) 2015-06-24 2018-09-20 オックスフォード バイオダイナミックス リミテッド 染色体相互作用の検出
WO2017011710A2 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Chromosome neighborhood structures and methods relating thereto
AU2016308339A1 (en) 2015-08-18 2018-04-12 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains
EP3350328A1 (en) 2015-09-14 2018-07-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) and methods of use thereof
WO2017049157A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Duke University Methods and compositions for the treatment of steatosis-associated disorders
WO2017049386A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The University Of British Columbia Suppressors of premature termination codons as therapeutics and methods for their use
US20170130247A1 (en) 2015-09-30 2017-05-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for altering gene expression
EP3368063B1 (en) 2015-10-28 2023-09-06 Vertex Pharmaceuticals Inc. Materials and methods for treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2017075406A1 (en) 2015-10-29 2017-05-04 Whitehead Institute For Biomedical Research Transcription factor trapping by rna in gene regulatory elements
US12043843B2 (en) 2015-11-04 2024-07-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US10765665B2 (en) 2015-11-24 2020-09-08 Melin Jeffrey Composition comprising combination of rapamycin and an activator of AMP kinase and use thereof for treating diseases
EP3871695A1 (en) 2015-12-07 2021-09-01 Arc Bio, LLC Methods and compositions for the making and using of guide nucleic acids
US11241506B2 (en) 2015-12-14 2022-02-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composition for treatment of Crigler-Najjar syndrome
WO2017139212A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Cyta Therapeutics, Inc. Particle delivery of rapamycin to the liver
EP3417064A4 (en) 2016-02-18 2019-10-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. KLK3 ACTIVATOR RNA MODULATORS
US20190127805A1 (en) 2016-03-15 2019-05-02 Almac Diagnostics Limited Gene signatures for cancer detection and treatment
US20190136230A1 (en) 2016-05-06 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and methods of making the same
MA45052A (fr) 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour jagged1 pour le traitement du syndrome d'alagille
US10036024B2 (en) 2016-06-03 2018-07-31 Purdue Research Foundation siRNA compositions that specifically downregulate expression of a variant of the PNPLA3 gene and methods of use thereof for treating a chronic liver disease or alcoholic liver disease (ALD)
CN118542952A (zh) 2016-07-06 2024-08-27 沃泰克斯药物股份有限公司 用于治疗疼痛相关病症的材料和方法
WO2018154412A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of merosin-deficient cogenital muscular dystrophy (mdcmd) and other laminin, alpha 2 (lama2) gene related conditions or disorders
US20210254056A1 (en) 2017-05-05 2021-08-19 Camp4 Therapeutics Corporation Identification and targeted modulation of gene signaling networks
US12139546B2 (en) * 2017-08-22 2024-11-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating urea cycle disorders by interfering with glucagon receptor signaling
EP3691656A1 (en) 2017-10-06 2020-08-12 Camp4 Therapeutics Corporation Methods and compositions for treating urea cycle disorders, in particular otc deficiency
EP3701029A1 (en) 2017-10-26 2020-09-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CA3095040A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Camp4 Therapeutics Corporation Treating diseases via targeted modulation of gene signaling networks
US12297428B2 (en) 2018-08-01 2025-05-13 Yale University Compositions for identification of membrane targets for enhancement of T cell activity against cancer
US20220107328A1 (en) 2018-08-14 2022-04-07 Camp4 Therapeutics Corporation Methods of treating liver diseases
US20230078265A1 (en) 2019-03-19 2023-03-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020210642A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Camp4 Therapeutics Corporation Methods and compositions for treating urea cycle disorders
WO2021050593A1 (en) 2019-09-09 2021-03-18 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of sod1
US12258599B2 (en) 2019-11-06 2025-03-25 Emendobio Inc. Method to inactivate a mutant allele of an ELANE gene
US20240309365A1 (en) 2020-11-25 2024-09-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Modulating transcriptional condensates
JP2024518413A (ja) 2021-05-06 2024-05-01 アーティザン ディヴェロップメント ラブス インコーポレイテッド 修飾ヌクレアーゼ
EP4419672A2 (en) 2021-06-01 2024-08-28 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
EP4396353A2 (en) 2021-09-03 2024-07-10 Camp4 Therapeutics Corporation Modulation of gene transcription using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas
WO2023089153A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Universität Zürich Molecular cloning method and vector therefore
WO2023102188A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Quralis Corporation Gapmer antisense oligonucleotides with modified backbone chemistries
US20250283164A1 (en) 2022-04-25 2025-09-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna-binding by transcription factors

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