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KR20240134108A - Rna-프로그램가능한 세포 편집을 위한 조성물 및 시스템 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

Rna-프로그램가능한 세포 편집을 위한 조성물 및 시스템 및 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Publication number
KR20240134108A
KR20240134108A KR1020247017921A KR20247017921A KR20240134108A KR 20240134108 A KR20240134108 A KR 20240134108A KR 1020247017921 A KR1020247017921 A KR 1020247017921A KR 20247017921 A KR20247017921 A KR 20247017921A KR 20240134108 A KR20240134108 A KR 20240134108A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rna
cell
protein
modular
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
KR1020247017921A
Other languages
English (en)
Inventor
제트. 조쉬 후앙
용준 치엔
Original Assignee
듀크 유니버시티
콜드스프링하버러보러토리
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 듀크 유니버시티, 콜드스프링하버러보러토리 filed Critical 듀크 유니버시티
Publication of KR20240134108A publication Critical patent/KR20240134108A/ko
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

readrRNA (RNA sensing by Endogenous ADAR) 분자는 세포 유형 또는 세포 상태의 세포 감지 및 검출을 촉진하고/하거나 선택된 세포로 이펙터 단백질의 전달을 촉진하는 모듈식 RNA 분자이다. 이러한 모듈식 RNA 분자 및 다른 핵산 (모듈식 RNA 분자에 연결 또는 미연결)을 포함하는 조성물은 CellREADR (Cell access through RNA sensing by Endogenous ADAR)이다. readrRNA 및 CellReadR은 선택된 세포 RNA의 존재를 감지하고, 세포 또는 포유동물에서 하나 이상의 이펙터 단백질의 번역과 세포-정의 RNA의 검출을 커플링시키기 위해 ADAR (adenosine deaminase acting on RNA)에 의해 매개되는 RNA 편집을 이용한다.

Description

RNA-프로그램가능한 세포 편집을 위한 조성물 및 시스템 및 이의 제조 및 사용 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 PCT 출원은 2022년 5월 19일 출원된 미국 가출원 제63/343,669호, 및 2021년 10월 29일 출원된 미국 가출원 제63/273,343호의 이득을 청구하고, 각각의 내용은 그들 전체로 본 명세서에 편입된다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원이 수여하는 연방 정부 보조금 번호 U19MH114821-03 및 DP1MH129954 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 연방 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 갖는다.
서열 목록
본 출원은 특허청을 통해서 WIPO Standard ST.26 XML 파일로 제출된 서열 목록을 함유한다. 상기 XML 파일은 2022년 10월 31일 생성되었고, "123658-10902.xml"로 명명되며, 193,921 바이트 크기이다. 서열 목록은 참조로 본 명세서에 편입된다.
다양한 세포 유형은 개별 유기체 내에서 다양한 생명 형태 및 생리적 체계가 기저를 이루고 있다 [1]. 그들의 독특한 유전자 발현 프로파일, 형태학적 및 생리학적 성질, 및 조직 기능으로 정의되는 세포 유형은 유전 정보가 유기체의 표현형 및 거동을 형성하는 중간체이다. 모든 신체의 기능은 세포 유형 간 상호작용으로부터 생겨나고, 비정상적인 세포 유형 생리학 및 기능은 수많은 질환을 일으킨다 [2]. 최근의 고속 대량 단일-세포 게놈 접근법은 인간 체내 및 많은 다른 유기체에서 모든 분자적으로 정의된 주요 세포 유형을 확인할 수 있는 가능성을 제시한다 [3][4]. 분자 프로파일링을 넘어, 생물학적 조직 수준 전반에서 조직 구조 및 시스템 기능에 있어 그들의 특정 역할을 확인하기 위해 각각 및 모든 세포 유형을 모니터링하고 조작하는 것이 필요하다.
다세포 유기체에서 세포 유형 접근 및 조작의 상황에서, 지금까지 전부는 아니지만 대부분의 유전적 접근법은 배선(germline)을 통해서 또는 체세포에서 게놈의 DNA 조절 성분을 조작하거나, 또는 전사 인핸서-기반 바이러스 벡터를 사용하여 세포 유형 특이적 mRNA 발현을 반복하고자 시도한다. 지금까지, 세포 유형에 대한 거의 모든 유전적 접근법은 대체로 오직 소수의 유기체에서 배선 조작을 통해서, 일정 세포-특이적 RNA 발현을 모방하는 도구-유전자 (예를 들어, 마커, 센서, 이펙터)를 발현시키기 위한 DNA-기반 전사 조절 성분에 의존한다 [5-7]. CRISPR [8-10]을 포함한, 모든 배선 접근법은 본질적으로 번거롭고, 느리며, 규모 확장 및 일반화시키는 것이 어렵고, 특히 영장류 및 인간에서 윤리적 문제를 야기한다 [11, 12]. 최근에, 전사 인핸서 기반 바이러스 벡터는 동물에서 세포 유형을 표적화할 가능성을 보여주지만 [13-19]; 이러한 인핸서는 확인하고 검증하는 것이 어렵고, 표적 유전자와 세포 유형에 대한 그들의 복잡한 관계로 인해서 종종 대규모 노력을 요구한다 [13]. 일반적으로 CRISPR/Cas9 기술에 의한 체세포 조작은 현재 효율이 낮고, 의도하지 않은 표적-이탈을 포함하는 경향이 있다. 인핸서 바이러스 벡터 접근법은 또한 유전자 발현 및 세포 유형과 이의 복잡한 관계에 뿌리를 둔 주요한 한계를 갖는데; 대규모 노력, 특수한 전문지식, 광범위한 검증을 요구하고, 진정으로 규모확장가능하거나, 사용자 친화적이거나, 종 전반에서 일반화가능한 것으로 보이지 않는다. 따라서, 전사 인핸서-기반 바이러스 벡터가 동물의 체세포 유형을 표적화할 가능성을 보여주지만, 이러한 인핸서는 확인 및 검증이 어렵고, 종종 표적 유전자 및 세포 유형과 그들의 복잡한 관계로 인해, 대규모 노력을 요구한다. 본질적으로, 모든 DNA-기반 및 전사-기반 접근법은 세포 유형 특이적 RNA 발현 패턴을 모방하고 영향을 미치려는 시도에서 본질적으로 간접적이다.
본 개시는 부분적으로, DNA-기반 전사 과정을 우회하여 세포 유형-정의 RNA가 직접적으로 관여되는 새로운 부류의 세포 유형 기술의 발굴을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 이러한 새로운 기술 (CellREADR: Cell access through RNA sensing by Endogenous ADAR [adenosine deaminase acting on RNA]라고 함)은 세포 RNA의 존재를 검출하고 이펙터 단백질의 번역을 켜서 세포 유형을 모니터링하고 조작하기 위해 모든 동물 세포에 편재하는 RNA 감지 및 편집 기전을 이용한다. 본 명세서에 제공되는 조성물 및 방법은 표적 RNA의 존재를 통해서 특정한 세포 유형을 표적으로 삼는 왓슨-크릭 염기 쌍형성을 통해 작동되는 단일 RNA 분자로서 배치가능하다. 그러므로, CellREADR은 본질적으로 특이적이고, 구축 및 사용이 용이하고, 규모 확장가능하고, 프로그램가능하며, 종 전반에서 일반적이다.
따라서, 본 개시는 (a) 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 센서 도메인은 ADAR에 의해 편집가능한 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (b) 단백질을 코딩하는 도메인을 포함하는 3' 영역으로서, 단백질 코딩 도메인은 센서 도메인과 인-프레임으로 이의 하류에 있는 것인 3' 영역을 포함하는, 모듈식 RNA 분자를 제공하고, Adar 효소를 포함하는 세포로 모듈식 RNA의 도입 시에, 센서 도메인의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치 및 세포 RNA의 상응하는 뉴클레오티드 스트레치는 중지 코돈을 포함하는 RNA 듀플렉스를 형성하고, RNA 듀플렉스에 포함된 중지 코돈은 세포에서 ADAR에 의해 편집되어서, 단백질의 번역을 허용한다.
모듈식 RNA 분자에 대한 일 양태에서, 센서 도메인의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치는 mRNA의 적어도 일부분과 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다. 모듈식 RNA 분자에 대한 다른 양태에서, 단백질 코딩 영역은 이펙터 단백질을 코딩한다. 모듈식 RNA 분자에 대한 다른 양태에서, 모듈식 RNA 분자는 센서 도메인 및 이펙터 도메인 사이에 위치되는 자기-절단성 2A 펩티드를 코딩하는 연속적인 뉴클레오티드를 더 포함한다. 모듈식 RNA 분자에 대한 다른 양태에서, 자기-절단성 2A 펩티드는 T2A 펩티드, P2A 펩티드, E2A 펩티드, 및 F2A 펩티드 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시는 (a) (i) 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인으로서, ADAR에 의해 편집가능한 중지 코돈을 포함하는 것인 센서 도메인; 및 (ii) 이펙터 단백질을 코딩하는 제1 단백질-코딩 도메인으로서, 제1 단백질-코딩 영역은 센서 도메인과 인-프레임으로, 이의 하류에 있는 것인 제1 단백질-코딩 도메인을 포함하는 모듈식 RNA 분자를 포함하는 제1 핵산, 및 (b) 제2 단백질 코딩 도메인을 포함하는 제2 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물과 관련된 일 양태에서, 제1 및 제2 핵산은 단일 핵산 분자를 포함한다. 조성물과 관련된 다른 양태에서, 제1 및 제2 핵산은 2개 핵산 분자를 포함한다. 조성물과 관련된 다른 양태에서, 제1 및 제2 핵산은 공유적으로 연결된다. 조성물과 관련된 다른 양태에서, 제2 단백질 코딩 도메인은 전사 제어 구성요소, 임의로, 프로모터를 포함하는 유전자 내에 포함된다. 조성물과 관련된 다른 양태에서, 이펙터 단백질은 유전자에 결합된다. 조성물과 관련된 다른 양태에서, 제2 단백질 코딩 도메인의 발현은 이펙터 단백질에 의해 조절된다. 조성물과 관련된 다른 양태에서, 제1 단백질-코딩 도메인은 전사 활성인자를 코딩하거나 또는 제1 단백질-코딩 도메인은 DNA 리콤비나제를 코딩한다. 조성물과 관련된 다른 양태에서, 제1 단백질-코딩 영역은 티미딘 키나제 (TK) 및 시토신 데아미나제 (CD)로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 사멸 단백질, CASP3, CASP9, BCL, GSDME, GSDMD, GZMA 및 GZMB로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로그램된 세포 사멸 단백질, ChR2 및 DREADD-M3Dq로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경 활성화 단백질, IFNB, IFNG, TNFA, IL2, IL12, IL15 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역력 증강인자 단백질, NaChBac 및 Kir2.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 생리학적 편집 단백질, 리신을 포함하는 단백질 합성 억제 단백질, DREADD-hM4D, NpHR 및 GtACR1로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경 억제인자 단백질, 신경 세포 운명에 관여되는 단백질 예컨대 NEUROD, 상피 성장 인자를 포함하는 세포 재생에 관여되는 단백질을 코딩한다.
본 개시는 상기 언급된 모듈식 RNA 분자 또는 상기 언급된 조성물을 포함하는 핵산 전달 비히클을 제공한다. 일 양태에서, 전달 비히클은 리포솜, 벡터, 엑소솜, 미세-소포, 유전자총, 및 SEND (Selective Endogenous encapsulation for cellular Delivery) 시스템으로서, 우선적으로, 바이러스 벡터, 리포솜, 벡터, 엑소솜, 미세-소포, 유전자총, 및 SEND (Selective Endogenous encapsulation for cellular Delivery) 시스템을 포함하고, 여기서 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에서, 모듈식 RNA 분자는 DNA 벡터에 의해 코딩된다. 상기 언급된 조성물의 일 구현예에서, 모듈식 RNA 분자는 DNA 벡터에 의해 코딩된다. 본 발명의 일 구현예에서, 전달 비히클은 DNA 벡터에 의해 코딩되는 모듈식 RNA 분자를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 약학 조성물은 상기 언급된 모듈식 RNA 분자, 상기 언급된 조성물, 또는 상기 언급된 전달 비히클, 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 세포는 상기 언급된 모듈식 RNA 분자, 상기 언급된 조성물, 또는 상기 언급된 전달 비히클을 포함한다.
일 양태에서 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 언급된 모듈식 RNA 분자, 상기 언급된 조성물, 또는 상기 언급된 전달 비히클, 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제 및 이를 위한 포장재를 포함하는 키트가 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 모듈식 RNA 또는 모듈식 RNA를 코딩하는 핵산 조성물, 또는 모듈식 RNA 또는 모듈식 RNA를 코딩하는 핵산 조성물을 포함하는 전달 비히클을 포유동물의 선택된 세포에 도입시키는 방법이 있고, 방법은 포유동물의 세포가 모듈식 RNA, 또는 모듈식 RNA 또는 모듈식 RNA를 코딩하는 핵산 조성물을 포함하는 전달 비히클을 포함하도록 허용하는 조건 하에서, 포유동물의 세포를 모듈식 RNA 분자, 모듈식 RNA를 코딩하는 핵산 조성물, 또는 모듈식 RNA 또는 모듈식 RNA를 코딩하는 핵산 조성물을 포함하는 전달 비히클과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 언급된 모듈식 RNA 분자, 상기 언급된 조성물, 또는 상기 언급된 전달 비히클, 및 상기 언급된 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제.
본 발명의 일 구현예에서, 선택된 표적 세포 RNA를 포함하는 포유동물의 세포에서 인-프레임으로, 하류에서 코딩되는 단백질의 발현을 허용하도록 중지 코돈의 ADAR 편집을 유발시키는 방법이 있고, 방법은 모듈식 RNA가 세포에 포함되는 조건 하에서 모듈식 RNA 분자를 포유동물의 세포에 도입시키는 단계를 포함하고, 모듈식 RNA는 (i) 선택된 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 센서 도메인은 ADAR에 의해 편집가능한 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (ii) 이펙터 단백질을 코딩하는 도메인을 포함하는 3' 영역으로서, 단백질 코딩 영역은 센서 도메인과 인-프레임으로, 이의 하류에 있는 것인 3' 영역을 포함하고, 포유동물로 모듈식 RNA 분자의 도입 시, RNA 듀플렉스가 세포에서 센서 도메인의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치 및 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치 간에 형성되고, RNA 듀플렉스는 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하고, ADAR은 RNA 듀플렉스에 포함된 중지 코돈을 편집하여서, 단백질의 번역을 허용하고, 단백질이 포유동물에서 생산된다.
본 발명의 일 구현예에서, 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 있고, 방법은 작용제를 제공하는 단계로서, 작용제는 상기 언급된 모듈식 RNA 분자, 상기 언급된 조성물, 또는 상기 언급된 전달 비히클, 및 상기 언급된 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 것인 단계, 포유동물의 선택된 세포에서 이펙터 단백질의 번역을 허용하기위한 치료적 유효량으로 작용제를 포유동물에게 투여하여서, 세포에서 단백질을 생산하는 단계로서, 세포에서 단백질의 생산은 포유동물에서 질환 또는 장애의 치료를 제공하는 것인 단계를 포함한다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 작용제는 상기 언급된 조성물 또는 상기 언급된 전달 비히클을 포함하고, 이펙터 단백질을 코딩하는 제1 단백질 코딩 영역은 제2 단백질 코딩 영역의 발현을 활성화시키는 트랜스활성인자 단백질을 코딩하는 작용제에 포함되고, 선택된 세포에서 제2 단백질 코딩 영역의 발현은 질환 또는 장애의 치료에서 치료적으로 유효하다. 세포는 암 세포이고, 전이성 암 세포일 수 있다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 선택된 세포 RNA는 HER2를 코딩하고, 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인은 HER2 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적이다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 모듈식 RNA의 단백질 코딩 도메인은 CASP3, CASP9, BCL, BCL2, GSDME, GSDMD, GZMA 및 GZMB로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩한다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 포유동물은 병원체에 감염되고, 선택된 세포 RNA는 선택된 세포에서 병원체에 의해 발현된다.
상기 언급된 방법의 일 양태에서, 포유동물은 세포 RNA에 의해 코딩되고 그로부터 발현되는 결함성 단백질을 포함하고, 모듈식 RNA 분자는 결함성 단백질을 코딩하는 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 센서 도메인의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치, 및 결함성 단백질의 야생형 기능성 단백질인 이펙터 단백질을 코딩하는 단백질 코딩 도메인을 포함하고, 포유동물에 작용제의 도입 시, 모듈식 RNA 분자의 센서 도메인의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치는 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치와 듀플렉스를 형성하고, 듀플렉스는 세포에서 ADAR에 의해 편집되고, 야생형 기능성 단백질이 포유동물에서 생산된다.
상기 언급된 방법의 일 양태에서, 선택된 세포는 심장 조직의 경색 구역 주위의 경계 구역 (BZ) 세포를 포함하고, 선택된 세포 RNA는 NPPB, MYH7, ANKRD1, DES, UCHL1, JUN, 및 FOXP1 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 모듈식 RNA의 단백질 코딩 도메인은 VEGFA를 코딩한다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 모듈식 RNA의 단백질 코딩 영역은 트랜스활성인자를 코딩하고, 선택된 포유동물의 세포는 트랜스활성인자의 제어 하에 VEGFa 유전자를 더 포함한다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 선택된 세포 RNA는 NPPB RNA이다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 포유동물은 인간이고, 교모세포종을 앓고 있으며, 선택된 세포는 암성 교모세포종 세포이고, 선택된 세포 RNA는 SPARC 및/또는 VIM RNA를 포함하고, 모듈식 RNA 분자는 선택된 세포 SPARC 및/또는 VIM RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인을 포함하고, 단백질 코딩 도메인은 캐스파제를 포함한다.
상기 언급된 방법의 일 양태에서, 모듈식 RNA 분자는 2개 직렬 인-프레임 센서 도메인을 포함하고, 2개 직렬 인-프레임 센서 도메인 중 제1 도메인은 선택된 세포 SPARC RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하고, 2개 직렬 인-프레임 센서 도메인 중 제2 도메인은 선택된 세포 VIM RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하고, 제1 RNA 듀플렉스는 모듈식 RNA 분자 및 선택된 세포 SPARC RNA 간에 형성되고, 제2 RNA 듀플렉스는 모듈식 RNA 분자 및 선택된 세포 VIM RNA 간에 형성되며, 이펙터 단백질은 오직 SPARC RNA 및 VIM RNA 둘 모두의 존재 하에서만 발현된다.
상기 언급된 방법의 일 양태에서, 모듈식 RNA의 단백질 코딩 도메인 분자은 자살 유전자 코딩 영역, 세포 사멸 유도 유전자 코딩 영역, 종양 억제인자 유전자 코딩 영역, 및 항-종양 면역력 증강 유전자 코딩 영역을 포함할 수 있다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 모듈식 RNA의 단백질 코딩 도메인 분자는 항-종양 면역력을 증강시키는 단백질을 코딩하거나 또는 인터페론 β를 코딩하는 유전자의 코딩 영역을 포함한다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 모듈식 RNA의 단백질 코딩 도메인 분자는 자살 유전자의 단백질 코딩 영역을 포함하고, 자살 유전자는 티미딘 키나제 (SEQ ID NO:151) 또는 시토신 데아미나제 (SEQ ID NO:150)이다.
상기 언급된 방법의 일 양태에서, 모듈식 RNA의 단백질 코딩 도메인 분자는 세포 사멸 유도 유전자의 단백질 코딩 영역를 포함하고, 세포 사멸 유도 유전자는 캐스파제3, 캐스파제9, Bcl 또는 GSDM이다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 모듈식 RNA 분자의 단백질 코딩 도메인은 종양 억제인자 유전자의 단백질 코딩 영역을 포함하고, 종양 억제인자 유전자는 Rb 및 PTEN으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, 환자는 미만성 거대 B 세포 림프종 (B NHL)을 앓고 있고, efRNA는 항CD19-CAR을 코딩하고, sesRNA는 CD3E이다. 상기 언급된 방법의 일 양태에서, PCAG-sesRNACD3E-CD19-CAR 플라스미드 또는 시험관내 전사된 mRNA는 T 세포 지향 흡수를 증강시키도록 i.v. 주사를 통해 CD5-표적화 LNP에 의해서 전달된다. 일 양태에서, 환자는 크리글러-나자르 증후군 (CNS)을 앓고 있고, SES 표적은 Apoa2 (아포리포단백질 A-2), AHSG (알파 2-HS 당단백질) 및 알부민 (Alb) 유전자에 의해 전사되는 RNA를 향하고, efRNA는 기능성 UGT1A1 유전자를 코딩한다.
본 명세서의 일 구현예에서, 세포에서 단백질의 발현을 검출하는 방법이 기술되고, 방법은 (a) 모듈식 RNA가 세포에 포함되는 조건 하에서 세포에 모듈식 RNA 분자를 도입시키는 단계로서, 모듈식 RNA는 (i) 선택된 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 센서 도메인은 ADAR에 의해 편집가능한 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (ii) 단백질을 코딩하는 도메인을 포함하는 3' 영역으로서, 단백질 코딩 영역은 센서 도메인과 인-프레임으로 이의 하류에 있는 것인 3' 영역을 포함하고, 세포에 모듈식 RNA 분자의 도입 시, RNA 듀플렉스가 세포에서 센서 도메인의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치 및 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치 간에 형성되고, RNA 듀플렉스는 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하고, ADAR은 RNA 듀플렉스에 포함된 중지 코돈을 편집하여서, 단백질의 번역을 허용하고, 단백질이 세포에서 생산되는 것인 단계; 및 세포에서 단백질을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 기술된 방법의 일 양태에서, 세포 유형은 단일유전인자 장애를 일으키는 단일 유전자 내 돌연변이를 갖는 세포이고, 모듈식 RNA 분자의 단백질 코딩 영역은 야생형 단백질을 코딩한다. 상기 기술된 방법의 일 양태에서, 질환 또는 장애는 근이영양증, 낭포성 섬유증, 선천성 난청, 뒤센형 근이영양증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 혈색소증, 1형 신경섬유종증 (NF1), 겸상적혈구병 및 테이-삭스 병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일유전인자 장애이고, 모듈식 RNA 분자의 단백질 코딩 영역은 야생형 단백질을 코딩한다. 상기 기술된 방법의 일 양태에서, 번역 시, 이펙터 단백질은 세포에서 기능성이다. 상기 기술된 방법의 일 양태에서, 번역 시, 이펙터 단백질은 세포로부터 분비된다.
본 명세서의 일 구현예에서, 시험관내 샘플에서 바이러스의 존재를 검출하는 방법을 기술하고, 방법은
(1) 작용제를 제공하는 단계로서, 작용제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 모듈식 RNA 분자를 포함하고, 센서 도메인은 바이러스 RNA 또는 DNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하고, 이펙터 단백질은 표지를 코딩하는 것인 단계;
(2) 작용제를 샘플과 인큐베이션시키는 단계로서, 표지는 바이러스 DNA 또는 RNA의 존재 하에서 발현되는 것인 단계
를 포함한다.
본 개시의 다른 양태는 본 명세서에 기술하고 예시한 모두를 제공한다.
첨부된 도면 및 실시예는 제한하려는 것이 아니라 예시로 제공된다. 본 개시의 전술한 양태 및 다른 특성은 하나 이상의 구현예에 관한 첨부된 예시 도면 (또한 "도")과 함께, 하기 설명에서 설명된다:
도 1. A. 세포 유형 기술의 부족은 해부학과 관련하여 인간 조직을 보여주는 현대 생물학 및 의학 슬라이드의 병목 현상이다; B. 인간 장기 네트워크의 상호작용에서 세포 네트워크의 집중, C. 세포 네트워크, 분자 네트워크 및 유전자; 발생 단계와 관련된 인간 조직; D. 유기체의 순환; E. 태아 및 성인 조직.
도 2. 배선 DNA에서 체세포 RNA로 이동.
도 3. A. 핵산 수준에서 아데노신에서 이노신으로 ADAR 매개 변환 기전; B. ADAR을 발현하는 다세포 유기체의 가계도.
도 4. CellREADR의 성질.
도 5. A. CellREADR은 T2a 코딩 영역에 의해 분리된, 번역 인-프레임 5'-센서 도메인 (sesRNA) 및 3'-이펙터-도메인 (efRNA)으로 이루어진 단일 모듈식 readrRNA 분자이다. sesRNA는 세포 RNA에 상보적이고, efRNA 번역을 방지하는 인-프레임 중지 코돈을 함유한다. sesRNA 및 표적 RNA 간 염기 쌍 형성은 ADAR을 동원하고, 이것은 A -> I 편집을 매개하고, UAG 중지를 UGG Trp 코돈으로 전환시켜서, 이펙터 단백질의 번역을 켠다. B-D. B. CAG-tdT (상단)는 CAG 프로모터로부터 tdTomato 표적 RNA를 발현하고, READR tdT-GFP (하단)은 CAG 프로모터에 의해 구동되는, sesRNAtdT 및 efRNAGFP 가 후속되는 BFP 코딩 영역으로 이루어진 readrRNA를 발현한다. C. CAG-tdT 및 READR tdT-GFP 둘 모두로 형질감염된 293T 세포는 BFP 및 RFP와 공동-국재하는 강력한 GFP 발현을 보여주었다 (하단). READR tdT-GFP 단독 (상단) 또는 CAG-tdT 및 중지 코돈을 함유하는 스크램블 코딩 서열을 갖는 sesRNACtrl 을 발현하는 대조군 READR Ctrl (중간)로 형질감염된 세포는 GFP 발현을 거의 보이지 않았다. GFP 및 RFP 발현의 대표적인 FACS 분석은 우측에 도시된다. D. FACS에 의한 CellREADR 효율성의 정량. E.-G. CellREADR에 대한 표적 RNA 수준의 효과. E. CellREADR에 대한 표적 RNA 수준의 효과를 정량하기 위한 발현 벡터. rtTA-TRE-ChETA (상단)에서, BFP-ChETA 융합 표적 RNA는 테트라사이클린 농도 의존적 방식으로 항상적으로 발현되는 rtTA에 의해 구동되는, TRE로부터 전사된다. READR ChETA-GFP (하단)는 sesRNAChETA 및 efRNAGFP 가 후속되는 mCherry 코딩 영역으로 이루어지는 readrRNA를 발현한다. F. rtTA-TRE-ChETA 및 READR ChETA-GFP 가 공-형질감염된 293T 세포에서, 배지 중 증가된 테트라사이클린 농도는 FACS 분석을 통해 밝혀진 RFP+ 세포 중 BFP+ 의 증가된 백분율을 야기시켰다. G. GFP+ 대 RFP + 비는 테트라사이클린 농도 증가에 따라 증가되었다. BFP-ChETA RNA를 항상적으로 발현하는 CAG-ChETA 는 양성 대조군으로서 제공되었고, sesRNACtrl 을 발현하는 READR Ctrl 은 음성 대조군으로서 제공되었다. H-I, ADAR1은 CellREDAR 기능에 필수적이다. (H.) sesRNAtdT 단독, sesRNACtrl 및 tdT, sesRNAtdT 및 tdT, 또는 sesRNAtdT 및 ADAR2 과발현의 tdT를 발현하는 ADAR1KO 293T 세포 또는 야생형 세포의 FACS 분석. 화살표는 GFP +/RFP+ 개체군을 표시한다. I, 세포 전환비의 정량화. J, 표시한 바와 같이 상이한 샘플에서 의도하는 편집 부위에서 A-에서-G 전환을 보여주는 생어 (Sanger) 시퀀싱의 전기영동도. K, 막대 그래프는 표적화된 편집 부위에서 A-에서-G 전환율의 정량화를 도시한다. D, F, G, 및 K의 오차 막대는 평균 값 ± s.e.m.이고, n = 3으로서, n은 동시에 수행된 독립 실험의 수를 표시한다.
도 6. sesRNA 성질. A. 최적 sesRNA 길이는 ∼200-300 nt이다. 표적 RNA로서 READR BFP-tdT-GFP 및 tdT를 사용하여, 가변적 길이를 갖는 sesRNAtdT 는 최적 길이를 확인하기 위해 시험되었고, FACS 어세이에서 세포 전환율로서 정량되었다. B. sesRNA 및 표적 RNA 염기 쌍형성 간 불일치의 효과. 불일치의 수 (상단) 및 sesRNAtdT 및 tdT 표적 RNA 간 동일성 백분율 (하단)이 각 경우에 대해 표시된다. C. EF1a-ChETA-tdT 벡터로부터 발현된 표적 RNA 내 상이한 위치 및 서열 (예를 들어, 상이한 ChETA 및 tdT 코딩 영역)의 sesRNA 감지의 효과; 프로모터 영역은 음성 대조군으로서 사용되었다. readrRNA 효율을 도시하였다 (하단). D. 엄격성을 개선하기 위해서, sesRNAtdT 는 READR tdT-Luc 벡터에 1 내지 3개 중지 코돈 (X-TAG)을 함유하도록 디자인되었다. E-F. READR tdT-Luc 단독으로 형질감염 (e)되거나 또는 CAG-tdT로 공-형질감염 (F)된 293T 세포의 발광성. G. EF1a-ChETA-tdT로부터 발현된 ChETA-tdT 융합 전사물의 상이한 영역을 표적화하는 sesRNA 어레이를 갖는 이중 및 삼중 센서 READR ChETA/tdT-GFP 벡터의 개략도. H. EF1a-ChETA-tdT 및 이중 또는 삼중 READR tdT-GFP 벡터로 공-형질감염된 293T 세포의 FACS 분석. 화살표는 GFP +/RFP + 개체군을 표시한다. I. (H)의 다양한 이중 또는 삼중 READR tdT-GFP 벡터의 효율의 정량화. J. 이중-센서 READR ChETA/tdT-GFP 또는 READR ChETA/tdT-Luc 벡터를 사용한 2개 표적 RNA (ChETA 및 tdT)를 발현하는 세포의 교차 표적화의 개략도; 이중-센서 어레이의 각각의 sesRNA는 편집가능 중지를 포함한다. K. FACS 분석은 READR Cheta/tdT-GFP 및 CAG-ChETA 또는 CAG-tdT로 293T 세포의 공-형질감염으로 GFP 번역이 거의 일어나지 않았고, 단지 삼중 삼중 형질감염만이 GFP 발현을 일으켰음을 보여주었다. EF1a-ChETA-tdT (ChETA-tdT 융합 전사물을 발현) 공-형질감염은 양성 대조군으로서 사용되었다. 정량화는 FACS (L.) 및 루시퍼라제 어세이 (M.)로 보여주었다. A-C, E-F, I, 및 L-M의 오차 막대는 평균값 ±s.e.m.이고, n = 3으로서, n은 동시에 수행된 독립 실험의 수를 표시한다.
도 7. 본 개시의 일 구현예에 따른 CellREADR을 사용한 내생성 RNA 감지를 도시한 데이터. A. 엑손 및 인트론 구조 (비척도), 프리-mRNA (중간), 및 mRNA (하단)를 도시한 인간 EEF1A1 유전자의 게놈 유전자좌의 개략도. sesRNAEEF1A1(1-7) 는 코딩 서열 (CDS)을 포함하는 EEF1A1 전사물 전반에서 샘플채취되도록 디자인되었다. B. sesRNAEEF1A1(1-7) 를 시험하기 위한 READR EF1A1-GFP 벡터의 개략도; 하류 PKG-tdT 발현 카세트는 모든 형질감염된 세포를 표지한다. 외생성 ADAR2 또는 ClipF 코딩 영역은 스페이서로서 사용되었다. C. 각각 내생성 ADAR 또는 ADAR2 과발현 (OE)을 갖는 293T 세포에서 sesRNAEEF1A1(1-7)의 CellREADR 효율의 정량화. D. 내생성 ADAR 또는 ADAR2 과발현 (OE)을 갖는 몇몇 내생성 세포 RNA에 대한 CellREADR 효율의 정량화. E. (a) 및 (d)에서 표적화된 RNA의 발현 수준에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주는 정량적 PCR. F. CellREADR은 RNA 시퀀싱에 의해 어세이된 세포 전사체를 변경시키지 않았다. sesRNAEEF1A1(7) 또는 sesRNACtrl (상단) 및 sesRNAPCNA 또는 sesRNACtrl (하단)로 형질감염된 세포 간 전사체의 비교를 수행하였다.
도 8. CellREADR에 의한 내생성 RNA 감지. A. 엑손 및 인트론 구조 (비척도), 프리-mRNA (중간), 및 mRNA (하단)를 도시한, 인간 EEF1A1 유전자의 게놈 유전자좌의 개략도. sesRNAEEF1A1 (1-7)는 코딩 서열 (CDS)을 포함하는 EEF1A1 전사물 전반에서 샘플채취를 위해 디자인되었다. B. SsesRNAEEF1A1 (1-7)를 시험하기 위한 READREEF1A1-GFP 벡터의 개략도; BFP 발현 카세트는 모든 형질감염된 세포를 표지한다. C. 293T 세포에서 sesRNAEEF1A1 (1-7)의 효율의 정량화. D. CellREADR의 높은 민감도. 상이한 발현 수준을 갖는 몇몇 내생성 세포 RNA에 대한 CellREADR 효율의 정량화; RNAseq 데이터의 TPM (transcript per million)을 사용하여 세포 RNA 발현 수준을 표시하였다. 1-3개 sesRNA를 각 표적에 대해 디자인하였다. E. 이중-센서 READR EEF1A1/ACTB-GFP 벡터를 사용한 2개 내생성 RNA (EEF1A1 및 ACTB)의 교차 표적화에 대한 개략도; 이중-센서 어레이의 각각의 sesRNA는 편집가능 중지를 함유한다. 이중-센서 READR Ctr1/Ctrl-GFP , READR EEF1A1/Ctrl-GFP 또는 READR Ctr1/ACTB-GFP 는 대조군으로서 사용되었다. 효율의 정량화는 오직 READR Chet/atdT-GFP 형질감염된 293T 세포만이 유의한 GFP 발현을 일으켰음을 보여주었다. F. CellREADR는 RNA 시퀀싱으로 어세이된 세포 전사체를 변경시키지 않았다. sesRNAEEF1A1(7) 또는 sesRNACtrl (상단) 및 sesRNAPCNA 또는 sesRNACtrl (하단)으로 형질감염된 세포 간 전사체의 비교. G. sesRNAEEF1A1 또는 sesRNACtrl (상단), sesRNAPCNA 또는 sesRNACtrl (하단) 간 차등적 유전자 발현 분석의 화산 도표. 조정된 P 값 < 0.01 및 log2 (배수 변화) > 2를 갖는 유전자는 유의하게 차등적으로 발현된 유전자로서 정의되었고, 붉은색으로 표지된다. 1개 유전자 OAS2는 sesRNAEEF1A 그룹에서 유의하게 증가된 발현으로 검출되었다. H. RNA-시퀀싱에 의한 A-에서-I 편집에 대한 sesRNAEEF1A1 (상단) 또는 sesRNAACTB (하단)의 효과의 전사체-와이드 분석. 피어슨 (Pearson) 상관 계수 분석을 사용하여 차등 RNA 편집율을 평가하였다. c-e의 오차 막대는 평균값 ± s.e.m.이고, n = 3으로서, n은 동시에 수행된 독립 실험의 수를 표시한다.
도 9. 본 개시의 일 구현예에 따른 마우스 대뇌 피질에서 뉴런 세포 유형의 CellREADR 표적화를 보여주는 데이터를 도시한다. A. - B. 각각, 표시된 바와 같은 sesRNA의 위치를 갖는 마우스 Fezf2 (a) 및 Ctip2 (b) 유전자의 게놈 구조. c-i, 마우스 피질에서 뉴런 유형의 CellREADR 표적화. C. 뇌 조직에서 신경 세포 유형의 표적화를 위한 이원 AAV 벡터의 개략도. READRFezf2-tTA에서, hSyn 프로모터는 ADAR2에 이어서 sesRNAFezf2, 2A, 및 tTA2 이펙터를 코딩하는 서열의 발현을 구동시킨다. TRE3gmRuby 에서, TRE 프로모터는 READR 바이러스로부터 tTA에 반응하여 mRuby3을 구동시킨다. D. Fezf2-CreER;LoxpSTOPLoxp-H2bGFP 마우스 뇌로부터의 관상 절편의 이미지, [Rodrigo Munoz-Castaneda et al. Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex Nature volume 598, pages159-166 (2021)]; Cre-리포터 유전자이식 마우스는 [Kim, Y. et al. Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism. Cell 171, 456-469.e422 (2017)]에서 이전에 기술된 바와 같이 리포터 마우스 (CAG-LoxP-STOP-LoxP-H2B-GFP)와 '녹-인' Cre 구동인자를 교차시켜서 생성되었다. Fezf2-CreER;LoxpSTOPLoxp-H2bGFP 마우스 뇌로부터의 관상 절편의 이미지는 S1 체성감각 피질에서 Fezf2+ 피라미드 뉴런 (PN)의 분포 패턴을 보여준다 (d1). L5b 및 L6에서 AAV READRFezf2-tTA 및 TREmRuby 특이적으로 표지된 PN의 동시-주사 (d2). (d4)에서 확대 보기된 CellREADR AAV 및 H2bGFP에 의한 동시-표지화 (d3). 화살표는 동시-표지된 세포를 표시하고; 화살촉은 Fezf2-H2bGFP 가 아닌 CellREADR AAV로 표지된 뉴런을 표시한다 (d4). E. READR Fezf2-tTA 의 특이성. F. CTIP2 항체로 면역-염색된 WT 뇌의 관성 절편으로서, S1 피질에서 Ctip2+ PN의 분포 패턴을 보여준다 (f1). L5b에서 AAV READR Ctip2 및 TRE mRuby 특이적으로 표지된 PN의 동시-주사 (f2). (f4)에서 확대 보기된 CellREADR AAV 및 CTIP2 항체에 의한 동시-표지화 (f3). 화살표는 동시-표지된 세포를 표시하고; 화살촉은 READR Ctip2 에 의해 오-표지된 세포를 표시한다(f4). G. READRCtip2의 특이성. H. S1 피질에서 AAV READR Ctip2-rTA 및 TREeYFP 감염된 PN의 축삭 돌출 패턴. 선조체, 시상, 중뇌, 뇌교 및 수질로의 돌출을 보여주는 대표적인 이미지. I, 관상 절편의 개략적인 위치는 우측 패널에 도시된다.
도 10. 단일 및 이원 CellREADR 벡터의 디자인 및 시험. A, 단일 CellREADR 벡터의 개략도. 좌측, PGK-tdT 는 PGK 프로모터로부터 tdTomato 표적 RNA를 발현한다. READR tdT-GFP 는 CAG 프로모터에 의해 구동되는, sesRNAtdT 및 efRNAGFP 로 이루어지는 READR RNA를 발현한다. 수직 점선은 tdT mRNA 및 sesRNAtdT 간 상보적 염기 쌍형성 영역을 표시하는 것으로서, 편집가능한 중지 코돈 주변 서열이 우측에 표시된다. 편집 부위에서, sesRNAtdT (시안색)의 편집가능 아데닌은 tdT mRNA의 시토신과 불일치한다. TdTomato는 2개 dTomato 유전자의 직렬 반복부이고, 따라서, tdT RNA는 sesRNAtdT 염기 쌍형성을 위한 표적 서열의 2개 카피를 함유한다. B. - D. READR tdT-G'P 벡터의 검증. READR tdT-GFP 및 PGK-tdT 로 공-형질감염된 293T 세포에서 B. 많은 것들이 GFP 번역 및 형광을 켰다 (C. 위쪽 화살표). 대조군 빈 벡터로 공-형질감염된 세포에서, GFP 발현을 보이는 세포가 거의 없었다 (C. 하단). GFP 발현은 웨스턴 블롯팅을 통해 추가로 어세이되었다 D.-E. CellREADR 루시퍼라제 어세이를 위한 이원 벡터 디자인. READR tdT-tTA2 는 sesRNAtdT 및 efRNAtTA2 로 이루어진 readrRNA를 발현하고, TRE-ffLuc 는 tTA2 활성화 시에 루시퍼라제 RNA를 발현한다. F. 루시퍼라제 활성은 (E)의 3개 벡터로 형질감염된 세포에서만 극적으로 증가되었다. tTA2를 항상적으로 발현하는, CAG-tTA2 와 TRE-ffLuc 의 공-형질감염이 양성 대조군으로서 제공되었다. G, sesRNAtdT 코딩 영역 앞에 스페이서 서열이 삽입된 개략적인 READRtdT-G'P 벡터. H, 293T 세포는 각각 tdT 표적 RNA 발현이 부재 (회색) 또는 존재 (핑크색)하는 가변적 길이의 스페이서를 코딩하는 READRtdT-G'P 벡터로 형질감염되었다. 전환율의 정량화는 RFP+ 세포 중 GFP+ 세포의 백분율로서 계산되었다. I, CellREADR 어세이를 위한 이원 벡터 디자인. J, (i)에서 이원 벡터를 사용한 GFP 전환의 대표적인 이미지. sesRNACtrl 벡터가 공-형질감염된 세포에서, GFP+ 세포가 거의 관찰되지 않았다. 전환 백분율은 우측에 표시된다. f 및 h의 오차 막대는 평균값 ±s.e.m.이고, f 경우 n = 3이고, h 경우 n = 2로서, n은 동시에 수행된 독립 실험의 수를 나타낸다.
도 11. 본 개시의 일 구현예에 따라서 스페이서 서열이 readrRNA의 누수를 감소시킨 것을 보여주는 데이터이다. A. sesRNAtdT 코딩 영역 앞에 스페이서 서열이 삽입된 개략적인 READR tdT-GFP 벡터. B. 각각 tdT 표적 RNA 발현이 존재 (상단) 또는 부재 (하단)하는 가별적 길이의 스페이서를 코딩하는 READR tdT-GFP 벡터로 형질감염된 293T 세포에서 GFP 및 RFP 발현의 대표적인 FACS 분석. C. (B)에 도시된 RFP+ 세포 중 GFP+ 세포의 백분율로서 계산된 전환율의 정량화.
도 12. CellREADR 효율은 표적 RNA의 발현 수준과 상관있다. A. 삼색 CellREADR 어세이 시스템의 벡터 디자인. B. 293T 세포의 공-형질감염에 사용된 CAG-tdT 벡터의 양이 증가됨에 따른 READR tdT-GFP 효율의 정량화. C. rtTA-TRE-ChETA 및 READR ChETA-GFP 벡터의 개략도 (도 1E를 또한 참조). D. 배양 배지 중 상이한 농도의 테트라사이클린으로 처리된 공-형질감염된 293T 세포의 대표적인 이미지 (도 5E, 5F, 5G를 또한 참조); E. - F. ChETA (e)를 항상적으로 발현하는 벡터와 READR ChETA-GFP 의 공-형질감염은 (D)의 것과 비교하여 GFP 발현 세포로의 최고 전환을 일으켰다 (F). B 의 오차 막대는 평균값 ±s.e.m.이고, n = 3으로서, n은 동시에 수행된 독립 실험의 수를 나타낸다.
도 13. CellREADR은 RNA 감지 의존적 유전자 편집 및 세포 제거를 가능하게 한다. A. CellREADR-매개 및 표적 RNA-의존적 유전자 편집을 위한 벡터 디자인. READR tdT-Cas9/GFP 에서, CAG 프로모터는 BFP에 이어서 sesRNA tdT , Cas9, 및 eGFP 이펙터를 코딩하는 서열의 발현을 구동한다. 다른 벡터에서, EF1a 프로모터는 tdT 발현을 구동하고, U6b 프로모터는 293T 세포에서 DYRK1A 유전자를 표적화하는 가이드 RNA (gRNA)의 발현을 구동한다. B. tdT 표적 RNA 존재 또는 부재의 RFP 및 BFP 발현 세포 중 GFP의 백분율로서 READR tdT-Cas9/GFP 효율의 정량화. C. U6b-gRNA DYRK1A -CAG-tdT 및 READR tdT-Cas9/GFP 둘 모두로 형질감염된 세포는 BFP 및 RFP와 공동-국재된 강건한 GFP 발현을 보여주었다 (하단). READR tdT-Cas9/GFP 단독으로 형질감염된 세포 (상단)는 GFP 발현을 거의 보이지 않았다. D. SURVEYOR 어세이는 인간 DYRK1A 유전자좌에서 Cas9-매개 절단을 보여주었다. DNA 절단은 U6b-gRNA DYRK1A- CAG-tdT 및 READR tdT-Cas9/GFP 로 형질감염된 세포 용해물에서 관찰되었지만, tdT 표적 RNA가 결여된 U6b-gRNA DYRK1A 및 READR tdT-Cas9/GFP 에서는 그렇지 않았다. CAG-Cas9와 U6b-gRNA DYRK1 세포 용해물 및 플라스미드 형질감염없는 293T 세포 용해물은 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 사용되었다. 화살표는 절단 생산물을 표시한다. E. CellREADR-매개 및 표적 RNA-의존적 세포 사멸 유도를 위한 벡터 디자인. READR tdT-taCasp3-TEVp 에서, CAG 프로모터는 BFP에 이어서 세포 사멸을 유도하기 위한 이펙터로서 sesRNAtdT 및 taCasp3-TEVp를 코딩하는 서열의 발현을 구동한다. F. 발광도로 측정된 세포 아폽토시스 수준은 tdT RNA가 없는 세포와 비교하여 READR tdT-taCasp3-TEVp 및 EF1a-tdT가 형질감염된 세포에서 증가되었다. b 및 f의 오차 막대는 평균값 ± s.e.m.이고, n = 3으로서, n은 동시에 수행된 독립 실험의 수를 나타낸다.
도 14. ADAR1은 293T 세포에서 CellREADR에 필수적이다.
A. CRISPR/Cas9를 사용해 ADAR1 녹아웃 세포주를 생성시키기 위한 개략도. B. 야생형에서 ADAR1 발현을 보이고 ADAR1 녹아웃 세포에서 발현이 없음을 보여주는 웨스턴 블롯 분석. C(1). EF1a-ChETA-tdT 및 READR tdT-GFP 벡터 (좌측) 및 ADAR1 이소폼 발현 벡터 (우측)의 개략도. C(2), 대표 이미지가 각각 도시되었다. D (1). Both p110 및 p150 ADAR1 이소폼 둘 모두는 ADAR1 녹아웃 세포에서 세포 전환율로 어세이된 CellREADR 기능성을 구제하였다. D (2). EF1a-Chea-tdT 표적 발현 및 READR tdT-GFP 벡터 (좌측), 및 ADAR1 이소폼 발현 벡터 (우측)의 개략도. E. ADAR1KO 293T 세포에서 ADAR1 이소폼 구제 벡터에 의한 GFP 및 RFP 발현의 대표적인 FACS 분석. F (1). (e)에서 READR tdT-GFP 효율의 정량화. F(2). 인터페론 처리 후 ADAR1-p110 단백질의 증가된 발현 및 ADAR1-p150 이소폼의 유도를 보여주는 웨스턴 블롯 분석. G. 모의군 (좌측) 또는 인터페론 처리 (우측)에 의한 GFP 및 RFP 발현의 대표적인 FACS 분석. H. (G)에서 인터페론 처리에 의해 증가된, READR tdT-GFP 효율의 정량화. F 및 D 및 H 의 오차 막대는 평균값 ±s.e.m.이고, n = 3으로서, n은 동시에 수행된 독립 실험의 수를 나타낸다.
도 15. 본 개시의 일 구현예에 따라서 INF-β가 CellREADR 효율 및 Adar 발현을 증가시켰음을 보여주는 데이터를 도시한다. A, EF1a-Chea-tdT 표적 발현 및 READR tdT-GFP 벡터의 개략도. B, 모의군 (좌측) 또는 인터페론 처리 (우측)에 의한 GFP 및 RFP 발현의 대표적인 FACS 분석. C, 인터페론 처리 후에, ADAR1-p110 단백질의 발현이 증가되었고, ADAR1-p150 이소폼 단백질이 유도되었음을 보여주는 웨스턴 블롯 분석. D, 인터페론 처리에 의해 증가된, (b)에서 READR tdT-GFP 효율의 정량화.
도 16. 본 개시의 일 구현예에 따라서 다수의 인간 및 마우스 세포주에서 CellREADR이 작동된다는 것을 보여주는 데이터를 도시한다. CellREADR 시스템은 인간 (Hela) 및 마우스 (N2a, KPC1242) 유래의 상이한 세포에서 작동되었다.
도 17. sesRNA 및 표적 RNA 간 상이한 뉴클레오티드 불일치의 효과, CellREADR 벡터의 개략도 (상단, 도 2b와 관련). CellREADR 효율은 UAG 중지 코돈 내 2개 불일치 또는 indel의, 상이한 유형의 불일치 수를 갖는, RFP에서 GFP로 전환율로서 측정되었다. 오차 막대는 평균값 ± s.e.m.이고, n = 3으로서, n은 동시에 수행된 독립 실험의 수를 나타낸다.
도 18. CellREADR 매개 RNA 감지 및 이펙터 번역은 시간에 따라 축적된다. 293T 세포에서 내생성 EEF1A1 mRNA 및 이펙터 번역의 CellREADR 매개 감지는 형질감염 후에 인큐베이션 시간이 더 길어지면 증가되었다. 오차 막대는 평균값 ± s.e.m.이고, n = 3으로서, n은 동시에 수행된 독립 실험의 수를 나타낸다.
도 19. 표적화된 mRNA에 대한 CellREADR의 효과. A. CellREADR-매개 sesRNA 발현이 표적화된 RNA의 발현 수준에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주는 정량적 PCR. B. EEF1A1 mRNA 및 sesRNAEEF1A1-CDS 의 염기 쌍형성. EEF1A1 mRNA 또는 sesRNA는 각각 파란색 및 적색으로 표시되었다. EEF1A1 mRNA로부터 번역된 펩티드는 갈색으로 강조되었다. EEF1A1 mRNA의 표적화된 영역은 RNAseq.에 의해 분석되었다. C. 각각의 아데노신 위치에서 EEF1A1 mRNA 중 A-에서-G 변화의 비를 정량하였고, 히트맵으로 도시하였다. 2개 아데노신 (A107 및 A115)은 A-에서-G로의 더 높은 편집율을 보였다. 2개의 민감한 아데노신의 오프-표적 편집은 잠재적인 아미노산 변화를 유도하였다 (B의 밑줄). 오차 막대는 평균값 ±s.e.m.이고, n = 3으로서, n은 수행된 생물학적 복제물의 수를 표시한다.
도 20. 본 개시의 일 구현예에 따른 차등적 유전자 발현 분석을 보여주는 데이터. sesRNAEEF1A1-CDS 및 sesRNACtrl 간 (A), sesRNAPCNA 및 sesRNACtrl 간 (B) 차등적 유전자 발현 분석의 화산 도표. 조정된 P 값 < 0.01 및 log2 (배수 변화) > 2를 갖는 유전자는 화산 도표에서 붉은색으로 표지된, 유의하게 차등적으로 발현된 유전자로서 정의되었다. 1개 유전자 OAS2는 sesRNAEEF1A1-CDS 그룹에서 발현의 유의한 증가로서 검출되었다. 2회 독립 실험이 수행되었다.
도 21. 시험관내 및 생체내에서 Fezf2 및 Ctip2 RNA를 표적화하는 sesRNA의 디자인 및 스크린. A-B, 표시된 바와 같이 다양한 sesRNA의 위치를 갖는 마우스 Fezf2 (a) 및 Ctip2 (b) 유전자의 게놈 구조. C. sesRNA 스크린에 사용된 sesRNA 및 Fezf2 및 Ctip2 표적 유전자 단편의 정보. D. 표적 RNA 발현 벡터 CAG-BFP-Fezf2 또한 CAG-BFP-Ctip2 에서, (A, B)의 sesRNA 영역에 상응하는 Fezf2 또는 Ctip2 유전자의 200 bp-3000 bp 게놈 영역은 CAG 프로모터에 의해 구동되는 BFP 및 2A 코딩 영역의 하류에 클로닝되었다. READR Fezf2-GFP 또는 READR Ctip2-GFP 는 (A, B)에 도시된 상응하는 sesRNA를 발현한다. E.-F. 각각 CAG-BFP-Fezf2 또는 CAG-BFP-Ctip2 표적 벡터로 공-형질감염된 293T 세포의 FACS 어세이에 의한 READR Fezf2-GFP (E) 또는 READR Ctip2-GFP (F) 효율의 정량화. CAG-BFP-Cheta, 공-형질감염은 sesRNA의 엄격성을 평가하기 위한 음성 대조군 (우측 패널)로서 제공되었다.
G. 이원 READR AAV 벡터의 개략도. READR 벡터에서, hSyn 프로모터는 mCherry에 이어서 sesRNACtip2, smFlag 및 tTA2 이펙터를 코딩하는 서열의 발현을 구동한다. 리포터 벡터에서, TRE 프로모터는 READR 벡터로부터 tTA2에 반응하여 mNeonGreen을 구동시킨다. H. 이원 READRFezf2 벡터가 주사된 마우스 피질 관상 절편. mNeonG는 READRFezf2 표지된 세포를 표시한다. 4개 Fezf2 sesRNA가 스크리닝되었다. I. (H)의 4개 Fezf2 sesRNA의 특이성의 정량화. Fezf2 sesRNA 생체내 스크리닝 경우에, 각각의 sesRNA의 특이성은 READR AAV 및 CTIP2 항체 (FEZF2 항체 결여에 의함)에 의한 동시-표지화를 통해 계산되었고; Ctip2가 Fezf2+ 세포의 서브세트를 나타내므로 (미도시), CTIP2 항체는 Fezf2 sesRNA의 특이성을 과소평가한다. SesRNA1은 최고 특이성을 보였다. J. 이원 READRCtip2 벡터가 주사된 마우스 피질의 관상 절편. mNeonG는 이원 READR 표지된 세포를 표시한다. 8개 Ctip2 sesRNA가 스크리닝되었다. K. (J)의 8개 sesRNA의 특이성의 정량화. 각각의 sesRNA의 특이성은 이원 READRCtip2 AAV 및 CTIP2 항체에 의한 동시-표지화를 통해 계산되었다 (미도시). SesRNA3 및 sesRNA8은 최고 특이성을 보였다.
도 22. 재생을 위해 경계 구역 심근세포의 표적화. A. 인간 Nppb 유전자 및 mRNA 구조. 7개 RNA 센서의 위치가 도시된다. B. sesRNA2 및 sesRNA3은 HEK293T 세포에서 외생적으로 형질감염된 인간 Nppb RNA을 검출하였는데, GFP 리포터 발현에 의해 표시된다. C. BZ CM에서 VEGFA의 CellREADR-매개 발현을 위한 벡터 디자인. VEGFA는 AAV에 의해 DNA 벡터로서 또는 LNP에 의해 RNA로서 전달될 수 있다.
도 23. 암 (A) CellREADR 디자인. CellREADR은 T2a 코딩 영역에 의해 분리된, 5'-센서 도메인 (sesRNA) 및 3'-이펙터-도메인 (efRNA)으로 이루어진 모듈식 readrRNA 분자이다. sesRNA는 세포 RNA에 상보적이고, efRNA 번역을 방지하는 중지 코돈을 함유한다. sesRNA 및 표적 RNA 간 염기 쌍형성은 ADAR를 동원하고, 이것은 A-에서-I 편집을 매개하여, UAG 중지를 UGG Trp 코돈으로 전환시켜서, 이펙터 단백질의 번역을 작동시킨다. (B) 종양유전자 감지: HEK293T 세포에서 HER2 표적 RNA를 검출하기 위한 CellREADR의 사용. 2개 센서가 디자인되었다. (C) 세포 사멸 유도: CellREADR-매개 및 표적 RNA-의존적 세포 사멸 유도를 위한 벡터 디자인 (상단). CAG 프로모터는 BFP에 이어서 세포 사멸을 유도하기 위한 이펙터로서 sesRNAtdT (tdT를 위한 센서) 및 taCasp3-TEVp (활성화된 캐스파제3)를 코딩하는 서열의 발현을 구동한다. 하단, 발광성으로 측정된 세포 아폽토시스 수준은 CellREADR 벡터 및 표적 RNA가 형질감염된 세포에서 증가되었다.
도 24. B 세포 악성종에 대한 생체내 CAR T 요법의 개략도. a. CD3+ 세포를 표적화하기 위한 LNP 패킹된 CellREADR CD19-CAR 구성체. b. 환자에게 LNP 카고의 i.v. 주입. c. CD19-CAR을 통해 악성 B 세포를 사멸하기 위한 T 세포의 생체내 형질감염.
도 25. 마우스 간세포 세포주 AML12 세포에서 Apoa2, A-B, Ahsg, C-D, 및 Alb, E-F 에 대한 크리글러-나자르 증후군 치료 sesRNA 디자인 및 검증을 위한 UTG1A1의 유전자 편집 간세포 제한-발현. G, 페이로드 발현의 2개 전략.
도 26. COVID 스파이크 mRNA를 표적화하도록 디자인된 감염성 질환 sesRNA. A. 스크리닝 벡터. B. COVID의 스파이크 mRNA를 검출하는 CellREADR의 예.
도 27. 시험관내 cellREADR 시스템. A. IVT CellREADR 시스템의 개략도. B. 표적 RNA로서 tdTom 및 chetaTom 및 그들의 상응하는 RNA 센서를 사용한 특이적 이펙터 발현을 보이는 루시퍼라제 어세이. C. 표적 RNA에 대한 IVT cellREADR 시스템 용량-반응 곡선. D. IVT cellREADR 시스템의 시간 과정.
따라서, 본 개시의 일 양태는 (i) 센서 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 센서 도메인은 적어도 하나의 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (ii) 센서 도메인과 인-프레임으로 하류에 있는 이펙터 RNA (efRNA) 영역을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어지는 모듈식 readrRNA 분자를 제공한다.
일 구현예에서, 모듈식 readrRNA 분자는 센서 도메인 및 이펙터 RNA 영역 사이에 위치되는 자기-절단성 2A 펩티드를 코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 자기-절단성 2A 펩티드는 T2A, P2A, E2A, F2A, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 자기-절단성 2A 펩티드는 T2A 펩티드를 포함한다.
다른 구현예에서, 센서 RNA는 세포 RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 센서 RNA는 mRNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 이펙터 RNA (efRNA)는 다양한 이펙터 단백질을 코딩한다.
다른 양태에서, 본 개시는 적어도 2개 이원 성분을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어지는 CellREADR 시스템을 제공하고, 제1 성분은 본 명세서에 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자를 포함하고, 제2 성분은 반드시 물리적으로 연결될 필요는 없지만, efRNA-코딩 단백질에 작동적으로 연결된 efRNA 반응 유전자를 포함한다. 즉, 제2 성분은 efRNA-코딩 단백질에 반응성인 유전자를 포함한다.
일 구현예에서, efRNA-코딩 단백질은 전사 활성인자를 포함한다 그리고, efRNA-코딩 전사 활성인자에 반응성인 유전자는 RNA 및/또는 단백질 수준에서 이의 발현을 상향조절한다.
다른 구현예에서, efRNA-코딩 단백질은 DNA 리콤비나제를 포함한다. 그리고, 리콤비나제에 반응성인 유전자는 그에 따라 재조합된다.
다른 구현예에서, 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템은 전달 시스템에 존재한다. 일부 구현예에서, 전달 시스템은 나노입자, 리포솜, 벡터, 엑소솜, 미세소포, 유전자총, SEND 시스템, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 비히클을 포함한다.
다른 구현예에서, 전달 시스템은 재조합 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터를 포함한다.
본 개시의 다른 양태는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템, 또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템을 포함하는 전달 시스템, 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 개시의 다른 양태는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템, 또는 본 명세서에 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템을 포함하는 전달 시스템을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵생물 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포 또는 식물 세포를 포함한다.
본 개시의 다른 양태는 본 명세서에 제공되는 바와 같은 세포를 포함하는 동물 모델 또는 식물 모델을 제공한다.
본 개시의 다른 양태는 세포 상태-정의 세포 RNA의 존재 또는 역학을 검출하고/하거나 하나 이상의 이펙터 단백질의 번역을 켜기 위한 방법을 제공하고, 방법은 표적 이펙터 RNA를 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템, 또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템을 포함하는 전달 시스템, 또는 본 명세서에 제공되는 바와 같은 약학 조성물로 검출/혼성화하는 단계로서, 센서 도메인이 서열-특이적 염기 쌍형성을 통해 특이적 세포 유형 RNA를 검출하여 결합하고, 하나 이상의 ADAR-편집가능 중지 코돈은 번역 스위치로서 작용하여서, 이펙터 단백질을 코딩하는 이펙터 RNA의 번역을 허용하는 것인 단계를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 세포 내에 있다.
본 개시는 본 명세서에서 제공하는 조성물을 포함하고 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 대상 방법을 수행하기 위한 키트를 더 제공한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 대상 키트는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있거나, 그로 이루어질 수 있거나, 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있다: (i) 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자; (ii) 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 CellREADR 시스템; (iii) 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 및/또는 CellREADR 시스템을 포함하는 전달 시스템; (iv) 모듈식 readrRNA 및/또는 CellREADR 시스템 및/또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 및/또는 CellREADR 시스템을 포함하는 전달 시스템을 포함하는 세포; 및/또는 (v) 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 약학 조성물. 다른 구현예에서, 키트는 하나 이상의 성분 및/또는 사용 설명서를 더 포함한다.
본 명세서는 마커 세포 RNA가 선택된 세포 유형인, 세포에 의해서 우선적으로 발현되는 세포에서 마커 세포 RNA 전사물을 간접적으로 검출하는 방법을 기술하고, 방법은 (i) (a) 이의 5' 영역이 센서 도메인을 포함하고, 센서 도메인은 적어도 하나의 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하고; (b) 3' 영역이 이펙터 단백질을 코딩하는 이펙터 RNA (efRNA) 도메인을 포함하고, efRNA 도메인은 센서 도메인과 인-프레임으로 이의 하류에 있는 것인 모듈식 readrRNA를 제공하는 단계; (ii) 포유동물에서 RNA 듀플렉스의 형성 및 ADAR-편집가능 중지 코돈의 Adar 효소에 의한 편집을 허용하는 조건 하에서 모듈식 readrRNA 분자와 세포를 접촉시키는 단계로서, 모듈식 readrRNA 분자의 센서 도메인은 서열-특이적 염기 쌍형성을 통해서 선택된 세포 유형의 마커 세포 RNA에 특이적으로 결합하여 RNA 듀플렉스를 형성하고, ADAR-편집가능 중지 코돈은 번역 스위치로서 작용하여서 이펙터 단백질을 생산하도록 efRNA 영역의 번역을 허용하는 것인 단계; 및 (iii) 이펙터 단백질 또는 이의 효과를 검출하는 단계를 포함한다.
본 명세서는 환자에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법/시스템을 제공하고, 환자에서 질환 또는 장애에 의해 영향받는 선택 세포 또는 세포 그룹은 건강한 대조군 환자로부터의 선택된 세포 또는 세포 그룹에 대해서 유전자의 차등적 RNA 발현을 포함하고, 방법은 (i) (a) 센서 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 센서 도메인은 적어도 하나의 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (b) 이펙터 단백질을 코딩하는 이펙터 RNA (efRNA) 영역을 포함하는 3' 영역으로서, efRNA 영역은 센서 도메인과 인-프레임이고 이의 하류에 있는 것인 3' 영역을 포함하는 모듈식 readrRNA를 제공하는 단계; (ii) 환자에서 RNA 듀플렉스의 형성 및 ADAR-편집가능 중지 코돈의 Adar 효소에 의한 편집을 허용하는 조건 하에서 모듈식 readrRNA 분자와 세포 또는 세포 그룹을 접촉시키는 단계로서, 모듈식 readrRNA 분자의 센서 도메인은 서열-특이적 염기 쌍형성을 통해서 선택 세포의 마커 세포 RNA에 특이적으로 결합하여 RNA 듀플렉스를 형성하고, ADAR-편집가능 중지 코돈은 번역 스위치로서 작용하여, 이펙터 단백질을 생산하도록 efRNA 영역의 번역을 허용하는 것인 단계를 포함한다. 일 구현예에서, efRNA 영역은 표지 및/또는 치료 단백질을 코딩한다. 다른 구현예에서, efRNA 영역은 트랜스활성인자를 코딩하고, 선택 세포 또는 세포 그룹은 트랜스활성인자의 제어 하에 내생성 유전자를 포함하고, 트랜스활성인자의 제어 하에 내생성 유전자는 치료제를 코딩한다. 다른 구현예에서, efRNA 영역은 트랜스활성인자를 코딩하고, 환자의 선택 세포 또는 세포 그룹은 트랜스활성인자의 제어 하에 치료 유전자를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 세포는 암 세포이고, 차등적으로 발현되는 유전자는 HER2를 코딩한다. 다른 구현예에서, 세포 유형은 전이성 암 세포이다.
치료 방법의 다른 구현예에서, 환자는 감염성 질환에 감염되고, 차등적으로 발현된 RNA는 감염원의 것이다.
치료 방법의 다른 구현예에서, 환자는 체세포의 단일 유전자에서 변이를 통해서 초래되는 단일유전 유전 장애를 갖고, 모듈식 readrRNA 분자의 센서 도메인은 유전자 변이체에 의해 전사된 세포 RNA에 특이적으로 결합하고, efRNA 영역은 정상 mRNA/단백질의 세포 유형-특이적 상보체를 코딩한다.
치료 방법의 다른 구현예에서, 환자는 체세포의 단일 유전자에서 변이에 의해 초래되는 단일유전 유전 장애를 갖고, 모듈식 readrRNA 분자의 센서 도메인은 유전자 변이체에 의해 전사된 세포 RNA에 특이적으로 결합하고, efRNA 영역은 트랜스활성인자를 코딩하고, 환자의 선택 세포 또는 세포 그룹은 트랜스활성인자의 제어 하에 정상 mRNA/단백질의 상보체를 코딩하는 유전자를 더 포함한다.
치료 방법의 다른 구현예에서, 환자는 심근 감염을 갖고, 선택 세포 또는 세포 그룹은 심장 조직의 경색 구역 주위 경계 구역 (BZ) 세포이고, 차등적으로 발현되는 유전자는 NPPB, MYH7, ANKRD1, DES, UCHL1, JUN, 및 FOXP1로 본질적으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이 구현예의 일 양태에서, 이펙터 영역은 VEGFA를 코딩한다. 이 구현예의 다른 양태에서, 이펙터 영역은 트랜스활성인자를 코딩하고, 환자의 선택 세포 또는 세포 그룹은 트랜스활성인자의 제어 하에 VEGFa 유전자를 더 포함한다. 이 구현예의 다른 양태에서, 차등적으로 발현되는 유전자는 NPPB이다.
치료 방법의 다른 구현예에서, 환자는 교모세포종을 갖고, 선택 세포 또는 세포 그룹은 암성 교모세포종 세포이고, 차등적 RNA 발현은 SPARC 및/또는 VIM의 것이다. 이 구현예 또는 본 발명 자체의 일 양태에서, 모듈식 readrRNA 분자는 2개 직렬 인-프레임 센서 도메인을 포함하고, 2개 직렬 인-프레임 센서 도메인의 제1 도메인은 서열-특이적 염기 쌍형성을 통해 선택 세포의 SPARC RNA에 특이적으로 결합하여 제1 RNA 듀플렉스를 형성하고, 2개 직렬 인-프레임 센서 도메인의 제2 도메인은 서열-특이적 염기 쌍형성을 통해 선택 세포의 VIM RNA에 특이적으로 결합하여 제2 RNA를 형성하며, 이펙터 단백질은 오직 SPARC RNA 및 VIM RNA 둘 모두의 존재 하에서만 발현된다. 본 발명의 일 양태에서, SPERC RNA 및 VIM RNA는 RNA 전사물의 임의 쌍일 수 있다.
이 구현예, 및/또는 본 발명 자체의 다른 양태에서, 이펙터 RNA 영역은 자살 유전자, 세포 사멸 유도 유전자, 종양 억제인자 유전자, 및 항-종양 면역력 증강 유전자로부터 선택된다. 이 구현예, 및/또는 본 발명 자체의 다른 양태에서, 이펙터 RNA 영역은 항-종양 면역력 증강 유전자이고, 인터페론 β를 코딩한다. 이 구현예, 및/또는 본 발명 자체의 다른 양태에서, 이펙터 RNA 영역은 자살 유전자이고, 자살 유전자는 티미딘 키나제 및 시토신 데아미나제의 군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 이 구현예, 및/또는 본 발명 자체의 다른 양태에서, 이펙터 RNA 영역은 세포 사멸 유도 유전자이고, 세포 사멸 유도 유전자는 캐스파제3, 캐스파제9, Bcl 및 GSDM 중 하나 이상이다. 이 구현예, 및/또는 본 발명 자체의 다른 양태에서, 이펙터 RNA 영역은 종양 억제인자이고, 종양 억제인자 유전자는 Rb 또는 PTEN이다. 이 구현예, 및/또는 본 발명 자체의 다른 양태에서, 세포 사멸 유도 유전자는 항상적으로 활성이다.
치료 방법의 다른 구현예에서, 환자는 심근 경색을 갖고, 특정 세포 유형은 경계 구역 (BZ) 심근세포이고, 표적 RNA는 NPPB, MYH7, ANKRD1, DES, UCHL1, JUN, 및 FOXP1 중 하나 이상을 코딩하는 RNA이다.
본 발명의 일 양태에서, 번역 시 이펙터 단백질은 세포 내에서 기능한다. 본 발명의 일 양태에서, 이펙터 단백질은 세포로부터 분비된다.
치료 방법의 다른 구현예에서, 세포 유형은 단일유전인자 장애를 일으키는 단일 유전자에 돌연변이를 갖는 세포이다. 이 구현예의 비제한적인 양태에서, 단일유전인자 장애는 근이영양증, 낭포성 섬유증, 선천성 난청, 뒤센형 근이영양증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 혈색소증, 1형 신경섬유종증 (NF1), 겸상적혈구병 및 테이-삭스 병으로부터 선택된다. 이 구현예의 일 양태에서, 이펙터 유전자는 단일유전인자 장애를 일으키는 돌연변이를 갖는 단일 유전자의 야생형 형태를 코딩한다.
치료 방법의 다른 구현예에서, 환자는 미만성 거대 B 세포 림프종 (B NHL)을 앓고, efRNA는 항CD19-CAR을 코딩하고, sesRNA는 CD3E이다. 이 구현예의 일 양태에서, PCAG-sesRNACD3E-CD19-CAR 플라스미드 또는 시험관내 전사된 mRNA는 T 세포 지향 흡수를 증강시키도록 i.v. 주사를 통해서 CD5-표적화 LNP에 의해 전달된다.
치료 방법의 다른 구현예에서, 환자는 크리글러-나자르 증후군 (CNS)을 앓고, SES 표적은 Apoa2 (아포리포단백질 A-2), AHSG (알파 2-HS 당단백질) 및 알부민 (Alb) 유전자에 의해 전사된 RNA에 대한 것이고, efRNA는 기능성 UGT1A1 유전자를 코딩한다.
본 발명의 일 양태에서, 모듈식 readrRNA 분자는 DNA 벡터에 의해 코딩된다. 본 발명의 일 양태에서, 이펙터 단백질은 표지이다. 본 발명의 일 양태에서, 이펙터 단백질은 전사 활성인자 또는 전사 억제인자이다.
정의
본 개시의 원리의 이해를 촉진하려는 목적을 위해서, 이제 바람직한 구현예를 참조하게 되고, 이를 설명하기 위해 특정 언어를 사용하게 될 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 개시의 범위를 한정하려는 의도가 아니고, 본 명세서에 예시된 바와 같은 본 개시의 이러한 변경 및 추가 변형은 본 개시과 관련된 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 발생되는 것으로 고려된다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "중지 코돈"은 세포에서 단백질 합성에 대한 중단 신호를 보내는 DNA 또는 메신저 RNA (mRNA)의 3개 뉴클레오티드 (트리뉴클레오티드)의 서열을 의미한다.
메신저 RNA의 "코돈"은 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 삼중항에 상응한다. RNA의 연속적 코돈은 단백질로 번역가능하다. 자연적으로, 중지 코돈은 mRNA의 코딩 영역(들)의 3' 말단부에 위치하여, 결합 방출 인자에 의한 번역의 종결에 신호를 보내고, 이러한 결합은 리보솜 서브유닛이 해리되게 하여서, 아미노산 사슬이 방출되게 한다. 64개 상이한 트리뉴클레오티드 코돈이 존재한다: 61개는 아미노산을 지정하고, 3개는 중지 코돈 (즉, RNA에서 UAA, UAG 및 UGA, 및 DNA에서 TAA, TAG 및 TGA)이다.
본 명세서에서 사용되는, "편집가능 중지 코돈"은 중지 코돈에서 번역가능한 코돈으로 세포에 의해 편집가능한 중지 코돈을 의미한다. 따라서, RNA에서, UAA, UAG 또는 UGA인 편집가능 중지 코돈은 세포에 의해서 UII, UIG, 또는 UGI로 편집가능하다. 편집가능 중지 코돈은 편집가능 중지 코돈 하류의 임의 코돈에 대한 번역 스위치로서 기능한다. 중지 코돈의 편집은 내생성 Adar 효소가 존재하는 세포에서 발생된다.
중지 코돈의 "편집"은 편집가능 중지 코돈을 함유하는 센서 RNA가 표적 RNA와 dsRNA를 형성하여서, 내생성 Adar 효소를 동원할 때 발생된다. ADAR은 중지 코돈에서 작용하여서, A에서 I로 편집을 수행하고, 따라서 예를 들어 UAG 중지를 UIG (트립토판) 코돈으로 전환시켜서, 하류 코돈의 번역을 허용한다.
용어 "ADAR"은 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제를 의미하는 명확한 표현이다. Adar 효소는 이중 가닥 RNA (dsRNA)에 결합하고 탈아미노화를 통해서 아데노신을 이노신 (하이포잔틴)으로 전환시킨다. ADAR 단백질은 전사 후에 작용하여서, RNA의 뉴클레오티드 함량을 변화시킨다. RNA에서 아데노신으로부터 이노신으로 전환 (A에서 I)은 정상 A:U 쌍형성을 파괴하여, RNA를 탈안정화시킨다. 이노신은 시토신에 대한 이노신 (I:C)의 결합을 일으키는 구아닌 (G)과 구조적으로 유사하다. 이노신은 전형적으로 번역 동안 구아노신을 모방하지만, 선호되지 않더라도, 또한 우라실, 시토신, 및 아데노신에 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "readrRNA"는 5' 영역 및 3' 영역을 갖는 분자를 의미하고, 여기서 readrRNA 분자는 (i) 센서 (ses) 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 센서 도메인은 적어도 하나의 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (ii) 센서 도메인과 인-프레임이고 하류에 있는 이펙터 RNA (efRNA) 영역을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
readrRNA에서, ADAR-편집가능 중지 코돈은 센서 RNA 내에 위치하고 인-프레임 이펙터 코딩 영역의 상류에 있다.
본 명세서에서 사용되는, "ADAR-편집가능 중지 코돈"은 ADAR에 의해 세포에서 편집가능한 중지 코돈을 의미한다. Schneider, M. F., Wettengel, J., Hoffmann, P. C., & Stafforst, T. (2014). Optimal guide RNAs for re-directing deaminase activity of hADAR1 and hADAR2 in trans. Nucleic acids research, 42(10), e87. https://doi.org/10.1093/nar/gku272
본 명세서에서 사용되는, "센서 도메인"은 readrRNA의 일부를 형성하는 뉴클레오티드의 연속 세트를 의미하고, 센서 도메인은 또한 적어도 하나의 편집가능 중지 코돈 및 하류 이펙터-도메인을 포함한다. 센서 도메인은 서열-특이적 염기 쌍형성을 통해서 특이적 세포 유형의 RNA에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드를 함유한다. 센서 도메인은 적어도 10개 뉴클레오티드 내지 적어도 1000개 뉴클레오티드 또는 그 이상을 포함하는, 임의 개수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 센서 도메인은 약 100개 내지 약 900개 뉴클레오티드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 다른 구현예에서, 센서 도메인은 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 300개 뉴클레오티드의 범위를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 센서 도메인은 10개, 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
센서 도메인 중 적어도 하나의 편집가능 중지 코돈(들)은 readrRNA의 센서 도메인 내에 어디에든 위치된다. 센서 도메인은 readrRNA 분자에서 5'에서 3' 배향을 갖게 되고, 상류 (5)' 부분 및 하류 (3)' 부분을 포함한다. 편집가능 중지 코돈은 센서 도메인 상류 부분 또는 센서 도메인 하류 부분에 위치될 수 있다. 편집가능 중지 코돈은 센서 도메인의 중간에 더 가까운 센서 도메인의 상류 부분에 위치될 수 있거나 또는 편집가능 중지 코돈은 센서 도메인의 하류 말단에 더 가까운 센서 도메인의 하류 부분에 위치될 수 있다. 예를 들어, 센서 도메인이 600개 뉴클레오티드 길이이고, 공간적으로 절반으로 나뉘어져 있고, 제1 뉴클레오티드는 센서 도메인의 5' 말단을 의미하고, 300번째 뉴클레오티드는 센서 도메인의 중간을 의미하고, 센서 도메인의 마지막 (600번째) 뉴클레오티드은 센서 도메인의 3' 말단을 의미하는 경우에, 편집가능 중지 코돈은 하류 부분의 상류 부분에 또는 센서 도메인의 중간에 더 가깝게 위치될 수 있다. 대략 동일한 길이를 갖는 센서 도메인을 4등분으로 나누면, 편집가능 중지 코돈은 센서 도메인의 1/4 부분 (뉴클레오티드 1-250), 센서 도메인의 2/4 부분 (뉴클레오티드 150-300), 센서 도메인의 3/4 부분 (뉴클레오티드 300-450), 또는 센서 도메인의 4/4 부분 (뉴클레오티드 450-600)에 위치될 수 있다. 따라서, 센서 도메인의 소정 길이 경우에, 편집가능 중지 코돈은 센서 도메인의 선택된 부분에 위치될 수 있다. 일반적으로, 편집가능 중지 코돈은 센서 도메인의 하류 절반, 또는 센서 도메인의 하류 1/4에 위치될 수 있다. 편집가능 중지 코돈을 함유하는 센서 도메인의 선택된 부분은 센서 도메인의 3' 말단의 10-50개 뉴클레오티드 내에 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "이펙터 RNA (efRNA)"는 번역가능하고 이펙터 단백질을 코딩하는 RNA이다.
"이펙터 단백질"은 발현되는 세포에 대한 효과를 갖고 이펙터 RNA 도메인에 의해 코딩되는 단백질이다. 이펙터 단백질은 세포에서 이펙터 RNA로부터 번역되고, 따라서, 이를 코딩하는 RNA같이, 이펙터 단백질은 동일한 내생성 단백질을 함유할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 세포에 도입된다. 이펙터 단백질은 이것이 번역되는 세포에 대한, 또는 세포로부터 분비되는 경우에, 주위 세포에 대한 효과를 갖는 단백질이다. 이펙터 단백질의 비제한적인 예는 효소, 검출가능한 단백질, 사이토카인, 독소, 폴리머라제, 전사 또는 번역 인자, 종양 억제인자, 뉴론 활성인자 또는 억제인자, 아폽토시스 단백질 또는 생리학적 인자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, "이펙터 RNA (efRNA) 영역"은 센서 도메인과 인-프레임으로 하류에 있는 이펙터 RNA를 포함하는 readrRNA의 일부를 의미한다.
이펙터 RNA (efRNA)는 관심 이펙터 단백질을 코딩할 수 있다. 바람직한 이펙터 단백질의 선택은 당업자의 지식 내에서 충분하고, readrRNA의 바람직한 용도에 따라 좌우된다. 예를 들어, 소정 질환을 치료하는 것이 바람직한 경우에, 이펙터 단백질은 질환의 확립 및/또는 연장에 핵심적인 세포에 대해 이것이 갖는 억제인자 효과를 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들어, CellREADR의 이펙터 모듈 (efRNA)은 활성 및 기능 증강, 활성 및 기능 억제, 결실되거나 또는 돌연변이된 단백질의 온전한 형태를 재도입하여 돌연변이체 세포 기능 구제, 활성 및 기능 변경 및 편집, 세포 정체, 운명 및 기능 재프로그램, 세포 유형 사멸 및 결실, 한 유형의 세포 수의 생산 증가 또는 감소, 및 세포 유형-특이적 게놈 편집 및 유전자 조절을 포함하는, 다수 방식으로 세포를 조작하기 위해 구축될 수 있다.
일 양태에서, 모듈식 readrRNA의 이펙터 (efRNA) 도메인은 검출가능 단백질 또는 검출가능 단백질 단편 (표지) 및/또는 전사 활성인자 또는 억제인자를 코딩한다.
이펙터의 비제한적인 예는 하기 표 1에 열거된다. 표 1은 본 발명에 따라 유용한 이펙터 단백질 (페이로드)의 비제한적인 목록을 비롯하여 세포에 대한 그들 효과(들)를 제공한다.
[표 1]
이펙터 RNA "페이로드"와 관련하여 용어 "페이로드"는 이펙터 단백질을 코딩하는 RNA에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 어구 "세포 유형"은 유기체, 장기, 조직, 세포의 개체군, 또는 세포주, 또는 하이브리도마, 동종 세포 개체군, 또는 이종 세포 개체군의 체세포, 휴지기 또는 정지기 또는 활성화, 또는 형질전환 또는 질환 또는 스트레스 또는 염증 또는 열충격을 겪은 세포, 또는 선천성 면역계의 일부, 자연 면역계의 일부, 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 장 줄기 세포, 줄기 세포, 태아 세포, 항상성에 기여하는 세포, 심장 또는 혈관 관련 세포, 소화계의 세포, 신경계의 세포, 골격 구조의 세포, RNA의 차등적 발현을 통해 확인할 수 있는 장기의 세포이다.
아마도 모든 세포 또는 이의 그룹은 상이하고, 단일 세포 RNA 분석은 세포 계통, 이의 활성화 상태, 발생 상태, 다른 세포, 조직 및 장기, 및 가용성 분자와 상호작용의 결과로서 이의 상태, 및/또는 세포가 질환이 있거나, 형질전환 또는 감염된 경우와 관련하여 이러한 다양성의 증거를 보유한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "자기-절단성 2A 펩티드" 또는 "2A 펩티드"는 세포에서 단백질의 번역 동안 리보솜 스키핑을 유도할 수 있는 18-22개 아미노산-길이 펩티드 부류를 의미한다. 이들 펩티드는 DxExNPGP의 중심 서열 모티프를 공유하고, 광범위한 바이러스과에서 발견되며, 리보솜이 펩티드 결합을 만드는데 실패하게 하여서 폴리단백질의 생성을 돕는다. 2A 펩티드의 적합한 예는 T2A, P2A, E2A, F2A 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (Liu, Ziqing et al. "Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector." Scientific reports vol. 7,1 2193. 19 May. 2017, doi:10.1038/s41598-017-02460-2). 이러한 자기-절단성 2A 펩티드는 T2A 펩티드를 포함한다.
몇몇 2A 펩티드는 피코르나바이러스, 곤충 바이러스 및 C형 로타바이러스에서 확인되었다. 본 명세서에서 사용되는, T2A는 토세아아시그나 바이러스 2A에서 확인된 2A 펩티드이고; P2A는 돼지 테스코바이러스-1 2A에서 확인된 2A 펩티드이고; E2A는 말 비염 A 바이러스 (ERAV) 2A에서 확인된 2A 펩티드이고; F2A는 구제역 바이러스 (FMDV)에서 자기-절단성 2A 펩티드로서 확인된 2A 펩티드이다. 하기 표는 다양한 2A 펩티드의 상응하는 아미노산 서열 및 DNA를 제공한다. 밑줄 표시된 서열은 아미노산 GSG를 코딩하고, 이것은 절단 효율을 개선시키도록 디자인된, 천연 2A 서열에 대한 선택적 추가 예이고; P2A는 돼지 테스코바이러스-1 2A; T2A, 토세아아시그나 바이러스 2A; E2A, 말 비염 A 바이러스 (ERAV) 2A; F2A, FMDV 2A를 의미한다. 이것은 [Kim J.H. et al. (High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice) PLoS One. 2011; 6(4): e18556. 2011년 4월 29일 온라인 공개. doi: 10.1371/journal.pone.0018556]의 표 1로부터 개조된다.
[표 2]
본 명세서에서 사용되는, "자기-절단성 2A 펩티드를 코딩하는 서열"은 상기 기술된 바와 같은 자기-절단성 2A 펩티드를 코딩하는, 핵산, 바람직하게 RNA이다. 본 발명에 따라서, 자기-절단성 2A 펩티드를 코딩하는 서열은 전형적으로 센서 도메인과 이펙터 RNA 영역 사이에 위치된다.
"모듈식 readrRNA 분자"의 어구에서 사용될 때 용어 "모듈식"은 핵산 수준에서, 바람직하게 RNA 수준에서 디자인된 단백질 도메인을 코딩하는 핵산 서열 (바람직하게, RNA 서열)을 포함하는 재조합 readrRNA 분자를 의미하고, 여기서 상이한 단백질 도메인이 반복부의 명시된 개수 (0 포함)로 바람직한 순서로 재조합 readrRNA 분자에서 조립될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "CellREADR"은 "내생성 ADAR [adenosine deaminase acting on RNA]"에 의한 RNA 감지를 통한 세포 접근"을 의미하고, 자기-절단성 펩티드 T2A 및 모든 동물 세포에 편재하는 편집 기전을 코딩하는 연결 서열, 예컨대 ADAR-편집가능 중지 코돈에 의해 분리된, 5' 센서-편집-스위치 영역 (sesRNA) 및 3' 이펙터 코딩 영역 (ef RNA)으로 이루어진, 단일, 모듈식 Readr RNA 분자로서 디자인된다. CellREADR은 세포 유형의 생리학, 기능 및/또는 구조를 모니터링하고 조작하기 위해 세포 RNA의 존재를 검출하고 이펙터 단백질의 번역을 켜기 위한 기전을 제공한다. 하기 표 3은 농축된 mRNA 표시와 함께, 다양한 조직의 세포 유형을 제공한다.
[표 3]
본 명세서에서 사용되는, "CellREADR 시스템"은 하기 성분을 포함한다: (i) 선택된 세포 RNA의 일부에 상보적인 뉴클레오티드의 연속적인 세트를 포함하는 센서 RNA 도메인, (ii) 이펙터 단백질을 코딩하는 이펙터 RNA (efRNA) 도메인으로서, 센서 RNA 도메인과 인-프레임으로 하류에 있는 것인 efRNA 도메인, (iii) 센서 RNA 도메인 내에 있거나 또는 센서와 이펙터 RNA 도메인 사이에 있는 ADAR-편집가능 중지 코돈, 및 (iv) 임의로 유전자 제어 구성요소를 포함하는 핵산 또는 유전자를 코딩하는 제2 단백질로서, (iv)는 센서 RNA 및 이펙터 RNA 도메인에 물리적으로 연결될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수도 있다. CellREADR 시스템은 readrRNA에 물리적으로 연결되지 않은 외생성 유전자 (DNA 또는 RNA)를 포함할 수 있다 (예를 들어, 별도 벡터 상에). CellREADR 시스템은 readrRNA 핵산을 함유하는 세포를 포함할 수 있고, 핵산은 제2 단백질을 코딩하고, 세포는 다세포 유기체, 식물, 동물, 또는 인간에게 전달을 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는, "전달 시스템"은 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템을 투여하기 위한 비히클을 포함하는 시스템을 의미하고, 비히클은 나노입자, 리포솜, 벡터, 엑소솜, 미세소포, 유전자총, SEND 시스템, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"SEND 시스템"은 인간 게놈에 존재하는 역구성요소를 기반으로 하는 인간화 바이러스-유사 입자 (VLP)를 포함하는 mRNA 전달 시스템이다 (Segel M, et al. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. Science. 2021;373:882-889. doi: 10.1126/science.abg6155). 이러한 전달 시스템의 벡터는 재조합 바이러스 벡터 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스. 렌티바이러확인, 또는 관심의 세포 또는 특정 세포 또는 세포 그룹의 수많은 생리적 상태 중 어느 하나를 확인하는 한 수단이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의 길이의 아미노산 중합체를 의미하고자 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 개재될 수도 있다. 이 용어는 또한 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지화 성분과 접합에 의해서 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다.
본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드 및 분자의 경우에, 용어 "융합", "융합된", "조합", 및 "연결된"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함한 모든 수단을 통해서, 둘 이상의 단백질 성분을 함께 연결하는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결된 DNA 서열이 연속적이고 리딩 단계이거나 또는 인-프레임인 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "인-프레임" 또는 "인 프레임"은 본래 ORF의 올바른 리딩 프레임을 유지하는 방식으로, 연속적인 더 긴 ORF를 형성하기 위한 둘 이상의 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 연결을 의미한다. 따라서, 최종 재조합 분자는 본래 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 상응하는 둘 이상의 절편 (이풍부 서열이다. 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드에 적용되는 용어 "이종성"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 비교되는 독립체의 나머지의 것과 유전자형적으로 구별되는 독립체로부터 유래되는 것을 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산", "뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 그들은 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 알려지거나 또는 알려지지 않은, 임의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연관 분석으로 정의된 유전자좌들 (유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에, 뉴클레오티드 구조에 대한 변는 cDNA일 수 있다. "융합 유전자"는 함께 연결된 적어도 2개의 이종성 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자이다.
"상동성" 또는 "상동성의"는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 둘 이상의 폴리펩티드 서열 간 서열 유사성 또는 상호교환성을 의미한다. 2개의 상이한 아미노산 서열 간 서열 동일성, 유사성 또는 상동성을 결정하기 위해 BestFit 같은 프로그램을 사용하는 경우에, 디폴트 설정을 사용할 수 있거나, 또는 적절한 채점 매트릭스, 예컨대 blosum45 또는 blosum80은 동일성, 유사성, 또는 상동성 점수를 최적화하도록 선택될 수 있다. 바람직하게, 상동성인 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 엄격 조건 하에서 혼성화하고, 그 서열과 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 95%, 보다 바람직하게 97%, 보다 바람직하게 98%, 및 보다 더 바람직하게 99% 서열 동일성을 갖는 것이다.
본 명세서에서 사용되는, "치료", "요법" 및/또는 "요법 용법"은 환자에 의해 나타나거나 또는 환자가 민감할 수 있는 질환, 장애 또는 생리적 병태에 반응하여 이루어지는 임상적 중재를 의미한다. 치료의 목적은 증상의 완화 또는 예방, 질환, 장애, 또는 병태의 진행 또는 악화의 둔화 또는 중단 및/또는 질환, 장애 또는 병태의 관해를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 등은 질환, 장애 또는 병태를 갖지 않지만, 발생될 위험성이 있거나 또는 발생에 민감한 대상체에서 질환, 장애 또는 병태가 발생될 확률을 감소시키는 것을 의미한다. 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유익하거나 또는 바람직한 생물학적 및/또는 임상적 결과를 실시하기에 충분한 양을 의미한다.
다양한 상황에서, 본 명세서에서 사용되는 유효량은 또한 질환 증상의 발생을 지연시키거나, 질환 증상 과정을 변경시키거나 (예를 들어, 제한없이, 질환 증상 진행의 둔화), 또는 질환 증상을 반전시키는데 충분한 양을 포함한다. 따라서, 정확한 "유효량"을 특정하는 것은 일반적으로 실행가능하지 않다. 그러나, 임의의 소정 경우에, 적절한 "유효량"은 단지 통상의 실험을 사용하여 당업자가 결정할 수 있다.
유효량, 독성, 및 치료적 효능은 예를 들어, LD50 (개체군의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50 (개체군의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하기 위해서, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차를 통해 결정될 수 있다. 임의의 특정 용량의 효과는 적합한 생물어세이, 예를 들어, 특히 종양 성장 및/또는 크기에 대한 어세이를 통해서 모니터링될 수 있다. 용량은 의사가 결정할 수 있고, 필요에 따라, 관찰된 치료 효과에 맞도록 조정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 동물 또는 세포에 치료적 독립체같은 작용제를 "투여하는"이라는 용어는 의도하는 표적에 물질을 분배, 전달 또는 도포하는 것을 의미하고자 의도된다. 치료제와 관련하여, 용어 "투여하는"은 비경구 또는 경구 경일유전성 체세포 장애는 단일 유전자 중 변이체에 의해 초래되는 단일유전인자 장애를 의미한다. 변이체는 한 쌍의 염색체 중 하나 또는 둘 모두에 존재할 수 있다. 단일유전인자 장애의 비제한적인 예는 낭포성 섬유증, 헌팅톤병 및 겸상적혈구병이다.
당분야에 공지된 바와 같이, 암은 일반적으로 비제어적인 세포 성장으로서 간주된다. 본 발명의 방법은 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 암, 및 이의 임의의 전이를 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평 세포 암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 난소암, 자궁경부암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 간암, 방광암, 간종양, 직결장암, 자궁경부암, 자궁내막 암종, 타액선 암종, 중피종, 신장암, 외음부암, 췌장암, 갑상선암, 간암종, 피부암, 흑색종, 뇌암, 신경모세포종, 골수종, 다양한 유형의 두경부암, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 유잉 육종 및 말초 신경상피종을 포함한다.
예를 들어, "샘플과 접촉시키는"처럼, 본 명세서에서 사용되는 "접촉시키는"은 샘플 또는 세포 직접적으로 또는 간접적으로, 시험관내에서, 생체외에서, 또는 생체내에서 (즉, 본 명세서에 정의된 바와 같은 대상체 내에서) 샘플 또는 세포를 접촉시키는 것을 의미한다. 샘플을 접촉시키는 것은 샘플에 화합물 (예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 readrRNA 분자 및/또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 readrRNA 분자를 포함하는 전달 시스템)의 첨가, 또는 대상체에게 투여를 포함할 수 있다. 접촉은 용액, 세포, 조직, 포유동물, 대상체, 환자, 또는 인간에게 투여를 포괄한다. 추가로, 세포를 접촉시키는 것은 세포 배양에 작용제를 첨가하는 것을 포함한다.
하락을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "감소" 또는 "억제"는 기준 수준과 비교하여 완전 억제 또는 감소를 포괄하지 않는다. "완전 억제"는 기준 수준과 비교하여 100% 억제이다. 하락은 바람직하게 소정 장애가 없는 개체에 대한 정상 범위 내로서 허용되는 수준까지 하락일 수 있다.
용어 "증가된", "증가하다", "증강되다" 또는 "활성화되다"는 모두 통계적으로 유의한 양만큼 증가를 의미하고자 본 명세서에서 사용된다. 일부 구현예에서, 용어 "증가된", "증가하다", "증강되다", 또는 "활성화되다"는 기준 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 증가 또는 기준 수준과 비교하여 100% 증가 또는 10%와 100% 사이의 임의의 증가를 포함한 증가, 또는 적어도 약 2-배, 또는 적어도 약 3-배, 또는 적어도 약 4-배, 또는 적어도 약 5-배 또는 적어도 약 10-배 증가, 또는 기준 수준과 비교하여 2-배 내지 10-배 사이 또는 그 이상의 임의 증가를 의미할 수 있다. 마커 또는 증상의 경우에, "증가"는 이러한 수준으로 통계적으로 유의한 증가이다.
본 명세서에서 사용되는, "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로 동물은 척추동물 예컨대 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥 동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰거스 원숭이, 거미 원숭이, 및 마카크 원숭이, 예를 들어, 레서스 상의 위험 인자를 나타내는 개체 또는 위험 인자를 나타내지 않는 대상체일 수 있다.
특정 병태에 대한 치료를 "필요로 하는 대상체"는 병태를 갖거나, 병태를 갖는 것으로 진단되거나, 또는 병태가 발생될 위험성이 있는 대상체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 (또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)는 본 명세서에 기술된 아미노산 서열 중 하나의 기능성 단편일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "기능성 단편"은 본 명세서에서 이하 기술되는 어세이에 따라서 야생형 기준 폴리펩티드의 활성의 적어도 50%를 보유하는 펩티드의 단편 또는 절변이다. 기능성 단편은 본 명세서에 개시된 서열의 보존성 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 서열의 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 보존적으로 변형된 변이체이다. 보존성 치환 변이체는 예를 들어, 천연 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 수득될 수 있다. 본 명세서에서 언급되는 "변이체"는 천연 또는 기준 폴리펩티드에 실질적으로 상동성이지만, 하나 또는 다수의 결실, 삽입 또는 치환때문에 천연 또는 기준 폴리펩티드의 것과 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 변이체 폴리펩티드-코딩 DNA 서열은 천연 또는 기준 DNA 서열과 비교했을 때 뉴클레오티드의 하나 이상의 첨가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 활성을 보유하는 변이체 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포괄한다. 광범위하게 다양한 PCR-기반 부위-특이적 돌연변이유발 접근법은 당분야에 공지되어 있고, 당업자가 적용할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치환 및/또는 변형은 대상체에서 폴리펩티드의 단백질가수분해를 방지 또는 감소시킬 수 있고/있거나 반감기를 연장시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 이를 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 예컨대, 비제한적인 예로서, 트랜스페린 (W006096515A2), 알부민 (Yeh et al., 1992), 성장 호르몬 (US2003104578AA); 셀룰로스 (Levy and Shoseyov, 2002); 및/또는 Fc 단편 (Ashkenazi and Chamow, 1997)에 접합시키거나 또는 융합시켜서 변형될 수 있다. 전술한 단락의 참조는 그들 전체로 본 명세서에 참조로 편입된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 이의 유사체의 단위를 포함하는, 임의의 분자, 바람직하게 중합체 분자를 의미한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 변성된 이중 가닥 DNA 중 한 핵산 가닥일 수 있다. 대안적으로, 임의의 이중 가닥 DNA로부터 유래되지 않은 단일 가닥 핵산일 수 있다. 일 양태에서, 핵산은 DNA일 수 있다. 다른 양태에서, 핵산은 RNA일 수 있다. 적합한 DNA는 예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 적합한 RNA는 예를 들어, mRNA를 포함할 수 있다.
용어 "발현"은 적용가능한 경우에, 제한없이, 예를 들어, 전사, 전사물 처리, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 처리를 포함하여, RNA 및 단백질의 생산, 및 적절한 경우, 단백질의 분비에 관여되는 세포 과정을 의미한다. 발현은 본 발명의 핵산 단편 또는 단편들로부터 유래되는 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적 및/또는 폴리펩티드로 mRNA의 번역을 의미할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 생물마커(들), 표적(들), 또는 유전자/폴리펩티드의 발현은 조직-특이적이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 생물마커(들), 표적(들), 또는 유전자/폴리펩티드의 발현은 포괄적이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 생물마커(들), 표적(들), 또는 유전자/폴리펩티드의 발현은 전신적이다.
"발현 생산물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동적으로 연결될 때 시험관내 또는 생체내에서 RNA로 전사되는 핵산 서열 (DNA)을 의미한다. 유전자는 코딩 영역에 선행하고 후속되는 영역, 예를 들어, 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열을 비롯하여, 개별 코딩 절편 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수도 있다.
"작동적으로 연결된"은 구성요소의 배열을 의미하고, 이렇게 기술된 성분은 그들의 일반적인 기능을 수행하기 위해 구성된다. 따라서, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 제어 구성요소는 코딩 서열의 발현을 실시할 수 있다. 제어 구성요소는 그들이 이의 발현을 유도하도록 기능하는 한, 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개재된 비번역이지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동적으로 연결된"것으로 간주될 수 있다. 추가로 그들은 물리적으로 연결될 필요가 없다.
본 발명에서 "마커"는 대조군 대상체 (예를 들어, 건강한 대상체)로부터 채취된 비슷한 샘플과 비교하여, 당뇨병 또는 암을 갖는 대상체로부터 채취된 샘플에 차등적으로 존재하는 발현 생산물, 예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "생물마커"는 용어 "마커"와 상호교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 적어도 하나의 마커의 수준을 측정, 검출 또는 결정하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "검출하는" 또는 "측정하는"은 샘플 중 분석물의 존재를 의미하는, 예를 들어, 프로브, 표지, 또는 표적 분자로부터의 신호를 관찰하는 것을 의미한다. 특정 표지 모이어티를 검출하기 위해 당분야에 공지된 임의의 방법은 검출에 사용될 수 있다. 예시적인 검출 방법은 분광법, 형광, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학, 또는 화학 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 임의 양태의 일부 구현예에서, 측정은 정량적 관찰일 수 있다.
임의 양태의 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산, 또는 세포는 조작될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "조작된"은 인간의 손으로 조작되는 측면을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 적어도 하나의 측면, 예를 들어, 이의 서열이 자연계에 존재하는 측면과 상이하도록 사람의 손으로 조작되었을 때 "조작된"것으로 간주된다. 일반적인 관행으로서 당업자가 이해하는 바와 같이, 조작된 세포의 자손은 전형적으로 실제 조작이 이전의 독립체에 대해 수행되었더라도 여전히 "조작된"이라고 한다.
용어 "외생성"은 이의 천연 공급원 이외의 세포에 존재하는 물질을 의미한다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "외생성"은 정상적으로 발견되지 않고 핵산 또는 폴리펩티드를 그러한 세포 또는 유기체에 도입시키기를 원하는, 생물학적 시스템 예컨대 세포 또는 유기체에 인간의 손이 관여되는 과정을 통해 도입된 핵산 (예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산) 또는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 대안적으로, "외생성"은 상대적으로 적은 양으로 발견되고 예를 들어, 이소성 발현 또는 수준을 생성시키기 위해, 세포 또는 유기체에서 핵산 또는 폴리펩티드의 양을 증가시키기를 원하는, 생물학적 시스템 예컨대 세포 또는 유기체로 사람의 손이 관여되는 과정을 통해 도입된 핵산 또는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 대조적으로, 용어 "내생성"은 생물학적 시스템 또는 세포에 천연적인 물질을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, "이소성"은 흔치 않은 위치 및/또는 양으로 발견되는 물질을 의미한다. 이소성 물질은 소정 세포에서 정상적으로 발견되지만, 훨씬 더 적은 양 및/또는 상이한 시간에 발견되는 것일 수 있다. 이소성은 또한 이의 자연 환경에서 소정 세포에서 자연적으로 발견 또는 발현되지 않는 폴리펩티드 또는 핵산같은 물질을 포함한다.
본 명세서에 기술된 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 소정 폴리펩티드, 또는 이의 임의 모듈을 코딩하는 핵산 서열은 벡터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 숙주 세포로의 전달 또는 상이한 숙주 세포 간 전달을 위해 디자인된 핵산 구성체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, 벡터는 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있다. 용어 "벡터"는 적절한 제어 구성요소와 연관될 때 복제할 수 있고 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 유전적 구성요소를 포괄한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스 및 비리온을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
임의 양태의 일부 구현예에서, 벡터는 재조합체이고, 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 공급원으로부터 기원하는 서열을 포함한다. 임의 양태의 일부 구현예에서, 벡터는 적어도 2개의 상이한 종으로부터 기원하는 서열을 포함한다. 임의 양태의 일부 구현예에서, 벡터는 적어도 2개의 상이한 유전자로부터 기원하는 서열을 포함하고, 예를 들어, 적어도 하나의 비-천연 (예를 들어, 이종성) 유전자 제어 구성요소 (예를 들어, 프로모터, 억제인자, 활성인자, 인핸서, 반응 구성요소 등)에 작동적으로 연결된 발현 생산물을 코딩하는 핵산 또는 융합 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 지정하는 벡터를 의미한다. 발현된 서열은 종종, 반드시는 아니지만, 세포에 이종성일 것이다. 발현 벡터는 추가적인 구성요소를 포함할 수 있고, 예를 들어, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가지므로, 2개 유기체, 예를 들어, 발현을 위해 인간 세포, 및 클로닝 및 증폭을 위해 원핵생물 숙주에서 유지되도록 허용한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 적어도 하나의 구성요소를 포함하고, 바이러스 벡터 입자로 패키징되는 능력을 갖는 핵산 벡터 구성체를 의미한다. 바이러스 벡터는 불필수 바이러스 유전자대신에 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 벡터 및/또는 입자는 시험관내 또는 생체내에서 세포로 임의 핵산을 전달하려는 목적을 위해 이요오딜 수 있다. 수많은 형태의 바이러스 벡터가 당분야에 공지되어 있다.
본 명세서에 기술된 벡터는 일부 구현예에서, 다른 적합한 조성물 및 요법제와 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 에피솜이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 관심 뉴클레오티드를 대상체에서 높은 카피수의 염색체외 DNA로 유지시켜서 염색체 통합의 잠재적 효과를 제거하는 수단을 제공한다.
임의 양태의 일부 구현예에서, 본 명세서는 예방적 치료 방법을 기술한다. 본 명세서에서 사용되는 "예방적"은 질환 또는 증상에 대한 치료의 시기 및 의도를 의미하고, 즉, 치료는 환자를 질환 또는 증상으로부터 보호하기 위해서 특정 질환 또는 증상의 임상적 검출 또는 진단 전에 투여된다. 예방적 치료는 질환 또는 증상의 개시 속도 또는 중증도의 감소를 포괄할 수 있거나 또는 질환 또는 증상으로부터의 보다 빠른 회복에 기여할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법은 전이 또는 종양 형성에 대해서 예방적일 수 있다. 임의 양태의 일부 구현예에서, 예방적 치료는 질환의 모든 증상 또는 징후의 예방이 아니다.
본 명세서에서 사용되는, "조합"은 예를 들어, 동일 대상체에게 투여를 위해서, 함께 사용을 위한 둘 이상의 물질 그룹을 의미한다. 둘 이상의 물질은 동일한 제제에 임의의 분자적 또는 물리적 배열로, 예를 들어, 혼화물, 용액, 혼합물, 현탁물, 콜로이드, 에멀션으로 존재할 수 있다. 제제는 균질 또는 불균질 혼합물일 수 있다. 임의 양태의 일부 구현예에서, 둘 이상의 물질 활성 화합물(들)은 동일하거나 또는 상이한 상부구조, 예를 들어, 나노입자, 리포솜, 벡터, 세포, 스캐폴드 등에 포함될 수 있고, 상부구조는 용매, 담체, 또는 둘 이상의 물질의 일부가 존재하는 용액, 혼합물, 혼화물, 현탁물로 존재한다. 대안적으로, 둘 이상의 물질은 동일한 대상체에게 투여되는, 둘 이상의 별개 제제로, 예를 들어, 별개 용기에 다수 제제를 포함하는 키트 또는 패키지로 존재할 수 있다.
키트는 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 시약을 포함하는, 재료 또는 성분의 조립체이다. 키트에 구성된 성분의 정확한 성질은 이의 의도되는 목적에 의존적이다. 임의 양태의 일부 구현예에서, 키트는 사용 설명서를 포함한다. "사용 설명서"는 전형적으로 예를 들어, 대상체를 치료하거나 또는 대상체에게 투여를 위해서, 키트의 성분을 사용하는데 적용하려는 기술을 설명하는 유형의 표현을 포함한다. 여전히 본 발명에 따라서, "사용 설명서"는 전형적으로 의도하는 목적을 위해서, 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 시약의 제조를 설명하는 유형의 표현, 예컨대 희석, 혼합, 또는 인큐베이션 설명서 등을 포함할 수 있다. 임의로, 키트는 또한 당업자가 쉽게 인식하게 되는 바와 같이, 다른 유용한 성분, 예컨대 측정 도구, 희석제, 완충제, 시린지, 약학적으로 허용되는 담체, 또는 다른 유용한 용품을 함유한다.
키트에 조립된 재료 또는 성분은 그들 조작성 및 유용성을 보존하는 임의의 편리하고 적합한 방식으로 저장되어 의사에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 성분은 용해, 탈수, 또는 동결건조 형태일 수 있고; 그들은 실온, 냉장 또는 냉동 온도에서 제공될 수 있다. 성분은 전형적으로 적합한 포장재(들)에 함유된다. 본 명세서에 적용되는 바와 같이, 어구 "포장재"는 키트의 내용물, 예컨대 본 발명의 조성물 등을 수용하는데 사용되는 하나 이상의 물리적 구조를 의미한다. 포장재는 바람직하게 멸균, 무오염 환경을 제공하도록, 충분히 공지된 방법에 의해 구축된다. 패키징은 또한 바람직하게 빛, 습기, 및 산소로부터 보호되는 환경을 제공할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "패키지"는 개별 키트 성분을 수용할 수 있는, 적합한 고체 매트릭스 또는 재료 예컨대 유리, 플라스틱, 종이, 호일, 폴리에스테르 (예컨대 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 또는 Mylar) 등을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 패키지는 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 시약의 부피를 함유하는 조성물의 적합한 분량을 함유하는데 사용되는 유리 바이알일 수 있다. 포장재는 일반적으로 키트 및/또는 이의 성분의 목적 및/또는 내용물을 표시하는 외부 표지를 구비한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "나노입자"는 대략적으로 약 1 내지 1,000 나노미터 직경 또는 너비인 입자를 의미한다. 용어 "나노입자"는 나노구; 나노막대; 나노쉘; 및 나노프리즘을 포함하고; 이들 나노입자는 나노네트워크의 일부일 수 있다. 용어 "나노입자"는 또한 나노입자 크기를 갖는 리포솜 및 지질 입자를 포괄한다. 예시적인 나노입자는 지질 나노입자 또는 페리틴 나노입자를 포함한다. 지질 나노입자는 예를 들어, 이온가능한 지질 (예컨대, MC3, DLin-MC3-DMA, ALC-0315, 또는 SM-102), PEG화 지질 (예컨대, PEG2000-C-DMG, PEG2000-DMG, ALC-0159), 인지질 (예컨대 DSPC), 및 콜레스테롤을 포함하는, 다수 성분을 포함할 수 있다.
예시적인 리포솜은 예를 들어, DSPC, DPPC, DSPG, 콜레스테롤, 수소화 대두포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜 콜린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG-DSPE) 포스파티딜 콜린 (PC), 포스파티딜 글리세롤 (PG), 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "투여하는"은 적어도 부분적으로 바람직한 부위에 작용제의 전달을 일으키는 방법 또는 경로를 통해서 대상체에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물의 배치를 의미한다. 본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 약학 조성물은 대상체에서 유효한 치료를 일으키는 임의의 적절한 경로를 통해서 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 인간 신체 활동, 예를 들어, 주사, 섭취 행위, 도포 행위, 및/또는 전달 장치 또는 기계의 조작을 포함한다. 이러한 활동은 예를 들어, 의료 전문가 및/또는 치료되는 대상체에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "접촉하는"은 적어도 하나의 세포에 작용제를 전달, 또는 노출시키기 위한 임의의 적합한 수단을 의미한다. 예시적인 전달 방법은 세포 배양 배지로 직접 전달, 관류, 주사, 또는 당업자에게 충분히 공지된 다른 전달 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 접촉은 인간 신체 활동, 예를 들어, 주사; 분배, 혼합, 및/또는 디캔팅 행위; 및/또는 전달 장치 또는 기계의 조작을 포함한다.
용어 "통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"는 통계적 유의성을 의미하고, 일반적으로 2 표준 편차 (2SD) 또는 더 큰 차이를 의미한다.
작업예에서, 또는 달리 표시된 경우를 제외하고, 본 명세서에서 사용되는 반응 조건 또는 성분의 분량을 표시하는 모든 수치는 모든 예에서 용어 "약"으로 수식되는 것으로 이해해야 한다. 백분율과 함께 사용될 때 용어 "약"은 ±1%를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "포함하는"은 표시된 정의된 구성요소이외에도 다른 구성요소가 존재할 수도 있다는 것을 의미한다. "포함하는"의 사용은 제한보다는 포함을 의미한다.
용어 "이루어지는"은 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물, 방법, 및 이의 개별 성분을 의미하는 것으로서, 구현예의 설명에서 언급되지 않은 임의의 구성요소는 배제한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "본질적으로 이루어지는"은 소정 구현예에 필요한 구성요소를 의미한다. 이 용어는 본 발명의 구현예의 기본적이고 새롭거나 또는 기능적인 특징(들)에 본질적으로 영향을 미치지 않는 추가 구성요소의 존재를 허용한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "특이적 결합"은 2개 분자, 화합물, 세포 및/또는 입자 간 화학적 상호작용을 의미하는 것으로서, 제1 독립체가 비표적인 제3 독립체에 결합하는 것에 비해서 더 큰 특이성 및 친화성으로 제2, 표적 독립체에 결합한다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 제3 비표적 독립체에 대한 친화성에 비해서 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 이상인 제2 표적 독립체에 대한 제1 독립체의 친화성을 의미할 수 있다. 소정 표적에 특이적인 시약은 어세이가 이용되는 조건 하에서 표적에 대한 특이적 결합을 나타내는 것이다.
본 명세서에서 달리 정의하지 않으면, 본 출원과 함께 사용되는 과학 및 기술 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않고 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용되는 전문용어는 단지 특정 구현예를 설명하려는 목적이고, 오로지 청구항에 의해 한정되는, 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니다. 면역학 및 분자 생물학 관점에서 일반 용어의 정의는 다음의 문헌들에서 확인할 수 있고, 이들 내용은 모두 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978-0911910421); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978-0815345053); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737).
당업자는 사용되는 화학치료제를 쉽게 확인할 수 있다 (참조: 예를 들어, Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning; Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 18th edition; Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chs. 28-29 in Abeloff's Clinical Oncology, 2013 Elsevier; and Fischer D S (ed): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 2003).
mCherry는 디스코소마 (Discosoma) 종으로부터 유래된, 2004년 공개된 기본 (항상적으로 형광성) 붉은색 형광 단백질이다. 이것은 산 민감도가 낮은 매우 빠르게 성숙화되는 단량체로 보고되어 있고, 실제로 발현된 mCherry는 가색상 마젠타이다.
SmV5는 스파게티 몬스터 V5이다.
smFLAG는 스파게티 몬스터 FLAG를 의미한다: 10개 카피수의 에피토프 태그FLAG-(DYKDDDDK).
tTA2는 테트라사이클린 의존적 전사 활성인자이다.
W3SL은 절두된 우드척 간염 전사후 조절 구성요소 및 폴리아데닐화 신호 카세트이다 (Choi et al., 2014). Choi JH, Yu NK, Baek GC, Bakes J, Seo D, Nam HJ, Baek SH, Lim CS, Lee YS, Kaang BK (2014).
eYFP는 증강된 노란색 형광 단백질이다.
PT 인핸서는 CFPN의 서브세트인 L5 추체로 (PT) 뉴런을 표지하는 mscRE4 인핸서이다.
칼슘-포화 GCaMP6s는 이의 부모 형광 단백질인, 증강된 GFP (EGFP)에 비해 27% 더 밝다.
PlxnD1 (L2/3 및 L5a의 종뇌내-IT PN), Satb2 (상부 및 하부 층 둘 모두에 걸친 IT PN), Rorb (L4 피라미드 뉴런), 및 vGAT (범-GABA성 뉴런).
Fezf2는 FEZ 패밀리 아연 핑거 2 유전자이다. FEZF2와 연관된 질환은 부분 태아 알콜 증후군 및 흉선 이형성증을 포함한다.
Ctip2 tip2/Bcl11b는 다양한 조직의 발생 동안 후생적 조절을 유전자 전사와 결합시키는 이중 작용 (억제/활성화)을 갖는 아연 핑거 전사 인자이다. 전사 인자COUP TF1-상호작용 단백질 2 (CTIP2)는 대뇌 피질의 대뇌하 돌출 뉴런에 의한 축삭 확장 및 경로탐색 동안 핵심적인 역할을 한다 (Arlotta et al., 2005). 여기서, 우리는 선조체 내에서 Ctip2는 MSN에 의해 고유하게 발현되고, 특히 초기 유사분열후 단계로부터의 이러한 핵심 뉴런 개체군을 표지한다고 보고한다. Ctip2 기능의 상실은 MSN 분화 실패, MSN의 패치-매트릭스 구성의 파괴, 및 패치 구획의 신규 분자 식별자를 포함하여, 다수 유전자의 발현에서 뚜렷한 변화를 일으킨다. 또한 패치 응집의 결함은 선조체의 비정상적인 도파민성 신경분포를 일으킨다. 최종적으로, 돌연변이체 선조체 내에서 헤테로토피아의 출현 및 세포 반발에 관여되는 분자 발현의 변경이 존재하여서, Ctip2의 상실이 발생 동안 세포 반발의 정상 기전을 파괴한다는 것을 강력하게 시사한다 (Journal of Neuroscience 16 January 2008, 28 (3) 622-632; DOI: doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2986-07.2008).
PlxnD1 (L2/3 및 L5a의 종뇌내-IT PN), Satb2 (상부 및 하부 층 둘 모두에 걸친 IT PN), Rorb (L4 피라미드 뉴런), 및 vGAT (범-GABA성 뉴런)을 포함한, 피질 출력 채널을 구성하는 CFPN (Corticofugal projection neuron).
hSyn은 성체 래트 뇌에서 아데노바이러스 벡터로부터 고도의 뉴런-특이적 장기간 이식유전자 발현을 부여하기 위해 당분야에서 인식하는, 인간 시냅신 1 유전자 프로모터를 의미한다.
TRE-3G는 진핵생물 유도성 프로모터를 의미하고; TRE는 최소 프로모터 (일반적으로 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 급초기 프로모터로부터 유래된 최소 프로모터 서열)에 융합된 Tet 오퍼레이터 (tetO) 서열 콘카티머로 구성되고; Tc 또는 Dox의 부재 하에서, tTA가 TRE에 결합하여 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다.
mNeonGreen은 브란키오스토마 란세올라툼 (Branchiostoma lanceolatum)으로부터 유래된, 2013년 공개된 기본 (항상적으로 형광성) 녹색/노란색 형광 단백질이다.
WPRE는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 구성요소 (WPRE)로서, 다양한 바이러스 벡터로부터 이식유전자 발현을 증가시키지만, 정확한 기전은 알려져 있지 않다. WPRE는 폴리아데닐화 신호에 가깝게, 이식유전자의 하류에 위치될 때 가장 효과적이다.
dTomato 유전자는 디스코소마 (Discosoma) 종으로부터 유래되는, 기본 (항상적으로 형광성) 오렌지색 형광 단백질인, dTomato를 코딩하는 유전자이다.
tdTomato는 2개 카피의 dTomato 유전자의 유전적 융합체이고; tdTomato는 매우 밝은 붉은색 형광 단백질이다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
상세한 설명
본 개시는 부분적으로, (i) 이의 전사물 프로파일을 기반으로 선택된 체세포의 표저고하, 및 (ii) RNA 분자에 의해 코딩되는 바람직한 이펙터 단백질의 선택된 세포에서의 번역을 허용하는 이중 기능 RNA 분자 (readrRNA)의 발굴을 기반으로 하며, 이펙터 단백질의 번역은 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)에 의해 매개되는 RNA 편집을 통해서 구현된다.
ADAR 매개 RNA 편집
RNA 편집은 모든 후생동물 세포에 편재하는, DNA 주형에 의해 코딩되는 RNA의 서열을 변경시키는 광범위한 전사후 과정이다. 동물계 전반에서, RNA 편집의 가장 우세한 형태는 포유동물에서 3개 구성원 (ADAR1, ADAR2, ADAR3)을 갖는, 효소의 ADAR (adenosine deaminase acting on RNA) 패밀리에 의해 촉매되는, 아데노신-에서-이노신 (A-에서-I) 전환이다. 그러면, 편집된 이노신은 대신 시스테인과 염기 쌍형하고, 다양한 세포 기구에 의해서 구아노신 (G)으로 인식된다. ADAR-매개 A-I 편집은 모든 후생동물 세포에 편재한다. 도 3을 참조한다.
인간 및 동물의 전사체에는 수백만개의 ADAR 편집 부위가 존재하고, 이러한 편집의 오직 작은 분획만이 코딩 mRNA에서 발생되어서, 단백질 성질을 변경시킨다. 대다수는 비-코딩 영역에서 일어나는데, RNA 스플라이싱, 마이크로RNA 및 shRNA 기능에 영향을 미칠 수 있다. 그들의 가장 본질적인 역할은 자기-생성 dsRNA에 대한 선천성 면역 반응으로부터 세포를 보호하면서 감염 동안 면역계가 바이러스 dsRNA를 파괴하도록 두는 것이다.
readrRNA
"readrRNA"는 5' 영역 및 3' 영역을 갖는 RNA 기반 분자를 의미하고, readrRNA 분자는 (i) 센서 (ses) 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 센서 도메인은 적어도 하나의 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (ii) 센서 도메인과 인-프레임이고 하류에 있는 이펙터 RNA (efRNA) 영역을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 출원인의 발명의 이중-기능 readrRNA는 선택된 체세포에서 발현되는 표적 RNA와 불일치를 갖는 dsRNA의 형성을 통해서 readrRNA의 특이적 부위(들)를 편집하도록 ADAR 데아미나제의 동원을 허용한다. readrRNA 분자로부터 중지 코돈의 ADAR-매개 제거 시에, readrRNA에 의해 코딩되는 하류의 작동적으로 연결된 이펙터 단백질의 번역은 선택된 체세포에서 발생된다. 도 4. 선택된 체세포에서 표적 RNA의 부재 하에, readrRNA는 세포에서 불활성으로 남아 있는다.
readrRNA는 선택된 체세포에서 표적 RNA를 검출하거나 또는 "감지"하기 때문에, readrRNA는 체세포에서 이펙터 단백질(들)의 번역과 세포-유형 정의 RNA의 검출을 결합시키기 위해 ADAR (adenosine deaminase acting on RNA)에 의해 매개되는 RNA 편집을 활용하는 프로그램가능한 RNA 감지 기술인, CellREADR (Cell access through RNA sensing by Endogenous ADAR)에 포함된 시스템의 필수 성분이다.
세포-유형 정의 RNA
RNA는 수명 및 종에 걸쳐서 조직 구성 및 유기체 기능을 함께 형성하는, 세포 유형 및 세포 상태의 다양성의 근간이 되는 유전적 정보의 중심적이고 보편적인 매개인자이다. 생명 과학 전반에서 전사체 데이터세트의 대량 축적 및 RNA 시퀀싱의 진보에도 불구하고, 세포 유형을 관찰하고 조작하는데 RNA를 활용하는 기술의 부족은 생물학 및 의학에서 여전히 엄청난 병목 현상으로 남아있다 (Zeng et al. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
세포 유형은 진화의 산물이고, 유기체의 기본 기능 단위이다. 뇌 및 신체의 세포 유형의 전체 레파토리는 단일 수정란인, 접합자로부터 시작되는 순차적이고 평행적인 공간적 및 시간적으로 조정된 일련의 발생 사건을 통해서 구축된다. 이러한 발생 프로그램은 진화를 통해서 게놈에서 코딩되는 모든 세포 유형의 정체를 밝혀주는 놀라운 구현 계획을 수행한다. 전사 및 후생유전적 조절 프로그램은 게놈 서열로부터 전개되어서 일련의 단계적인 세포 증식 및 분화 과정을 구동시켜서, 다양한 세포 표현형의 발현을 이끌게 된다 (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
RNA 발현 프로파일은 거의 틀림없이 세포가 특징규명된 시점 또는 상태에서 세포의 모든 표현형 특성의 기초가 되고, 세포의 1회성 스냅샷이다. 구별의 핵심 요점은 선택된 세포에서 발현되는 RNA가 세포 유형이 상이한 상태로 존재할 수 있으므로, 세포 유형 또는 특정 세포 상태 - 상황에 대한 세포의 일시적 또는 동적 반응성 성질 - 를 나타내는지 여부이다. 상이한 세포 상태와 연관된 RNA 발현에서 세포 유형-특이적 변화는 일주기성 순환, 가변적 물질대사 상태, 발생, 노화, 또는 행동, 약리학적 또는 질환 상태 동안에 확인될 수 있다 (Mayr et al., 2019; Morris, 2019). (Zeng et al. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
단일-세포 전사체는 오직 세포의 1회성 스냅샷이다. 그러나, 상이한 시점 또는 상이한 행동, 생리학적 또는 병리학적 상태로부터 수집된 전사체를 비교할 수 있다. 세포 유형 및 세포 상태 간 구별은 발생 동안 특히 어려운데, 세포는 연속적으로 그들 상태를 변화시키고, 일정 핵심 시점에, 그들의 세포 유형 정체를 변환시킬 수 있기 때문이다. 그러나, 절대적이지 않지만, 전사체 변화는 세포 상태 전이 동안 보다 연속적인 경향이 있는 한편, 세포가 그들 유형을 변환시킬 때 보다 갑작스럽거나 또는 불연속적인 경향이 있다고 가정하는 것이 합리적이다 (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
의미있는 세포-유형의 정의를 위해서, 세포 유형이 수행하는 것과 이상적으로 연관된다. 따라서, 이의 세포-유형 정의 RNA를 기반으로 세포 유형을 정의하는 것이외에도, 세포 유형은 해부학적 및 기능적 정보에 이의 RNA 발현을 연결시켜서 정의된다. 지금까지, 전사체 유형은 그들의 공간 분포 패턴과 탁월한 상응성을 갖는 것으로 확인되었다. 공간 분포 패턴은 발생 동안 정의되므로, 이것은 전사체가 발생 계획을 유지할 수 있다는 것을 시사한다 (Zeng et al. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
계통 추적 및 다른 표현형 특징규명과 결합된, 높은 시간 해상도를 갖는 체계적인 단일-세포 전사체, 후생유전체 및 공간적으로 분해된 전사체 프로파일링은 이들 일련의 사건에 관여되는 유전자 및 게놈 조절 네트워크의 핵심 세트를 포착하고 세포 유형 및 상태의 극도로 복잡한 공간 및 시간 전이를 해결하기 시작하여 세포 유형의 성인-단계 단계 레파토리를 야기할 엄청난 잠재성을 보유한다 (Allaway et al., 2021; Bandler et al., 2022; Bhaduri et al., 2021; Cao et al., 2019b; Chen et al., 2022; Delgado et al., 2022; Di Bella et al., 2021; Klingler et al., 2021; La Manno et al., 2021; Romanov et al., 2020; Schmitz et al., 2022; Sharma et al., 2020; Shekhar et al., 2022; Tiklovaet al., 2019; Zhu et al., 2018) (Zeng et al. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
전사체적으로 정의된 세포 유형의 계측정 구성
각각의 이들 주요 뇌 구조 내에서, 각각이 많은 세포 유형을 갖는 다수 영역 및 하위영역이 존재한다. 포유동물 뇌의 기본 구조 (Swanson, 2000, 2012)는 종뇌, 간뇌, 중간뇌 (중뇌), 및 능뇌 (후뇌)로 구성된다 (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
종뇌 ((1) 피질, (2) 해마 형성 [HPF], (3) 후각 영역, (4) 피질 하위판, 및 (5) 대뇌 핵의 5개 주요 뇌 구조로 이루어짐). 종뇌 및 간뇌 (시상 및시상하부 포함)는 집합적으로 전뇌라고 한다. 중간뇌 (중뇌)는 시개 및 피개로 나뉜다. 능뇌 (후뇌)는 뇌교, 수질, 및 소뇌로 나뉜다 (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
피질에서, 분지의 제1 (최고) 수준은 뉴런 및 다양한 비-뉴런 세포 부류의 분리이다 (도 2A). 뉴런 경우에, 분지의 제2 수준은 주요 뇌 구조/영역에 의해 구동되고, 제3 수준은 각각의 주요 뇌 구조 내에 다양한 세포 하위부류 및 유형을 포함하지만, 발생 동안 세포 이동으로 인해 뇌 구조 간에 교차되거나 또는 공유되는 세포 유형일 수도 있다 (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
피질은 다수의 피질 영역 (시각 피질 및 운동 피질 포함)으로 구성되고, 각각은 감각, 운동 또는 연관 기능을 매개한다. 이들 영역 각각에서, 그들이 방출하는 우세한 신경전달물질을 기반으로 하는 2개 뉴런 부류, 글루타메이트성 및 GABA성을 비롯하여, 몇몇 비-뉴런 부류가 존재한다 (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
글루타메이트성 흥분 뉴런은 대부분이 다른 피질 및/또는 피질하 영역으로 장거리 축삭 돌출을 갖는다. 그들은 그들 층 특이성 및 장기간 돌출 패턴을 기반으로 9개 하위부류로 나뉜다: L2/3 종뇌내 돌출 [IT], L4/5 IT, L5 IT, L6 IT, Car3 IT, L5 종뇌외 돌출 [ET], L5/6 근접-돌출 [NP], L6 피질시상 돌출 [CT], 및 L6b (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
GABA성 억제 뉴런은 대부분이 국소 영역 내에 한정된 그들의 축삭 돌출을 갖는다. 그들은 정규 마커 유전자의 이름을 딴 6개 하위부류로 나뉜다: Lamp5, Sncg, Vip, Sst, Sst-Chodl, 및 Pvalb (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
각각의 글루타메이트성 또는 GABA성 하위부류를 비롯하여, 각각의 비-뉴런 부류 내에서, 각 피질 영역 내에 총 110 전사체 세포 유형을 생성시키는, 몇몇 전사체 클러스터 또는 유형이 존재한다 (Brain Initiative Cell Census Network, 2021; Tasic et al., 2018). 이러한 구성은 지난 50년 동안 다양한 표현형 양상으로 광범위하게 연구된 피질 세포 유형에 대한 기존 지식과 매우 일관적이어서 (Harris and Shepherd, 2015; Tremblay et al., 2016; Yuste et al., 2020; Zeng and Sanes, 2017), 단일-세포 전사체 단독으로 부류 및 하위부류 수준에서 전체 세포 유형 구성을 충실하게 포착할 수 있다는 것을 시사한다 (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
그러나, 피질 내에서 피질 영역에 특이적이거나 또는 영역 중에 공유된 세포 유형이 모두 확인되었다. 공유된 세포 유형은 종종 유형 간에 별개이고 연속적인 변이가 공존하는 영역 전반에서 구배 분포 또는 구배 유전자 발현을 나타낸다 (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
일반적으로 계층의 더 높은 분지에 있는 세포 하위부류 및 주요 유형 중에 개별적인 변이가 존재한다. 연속적인 변이는 일반적으로 보다 낮은 분지에서 밀접하게 관련된 전사체 클러스터 또는 아형, 예컨대 L2/3 내지 L6의 피질 깊이에 걸쳐서 많은 IT 뉴런 유형 중에서 발견된다 (도 2C). 연속체의 반대 말단에 세포는 명확하게 구별되는 전사체 프로파일을 갖지만, 한 말단에서 나머지 말단으로 전이는 연속체를 구성하는 세포 중에서 점진적이다 (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
전사체학 및 공간적으로 분해된 전사체 방법인 MERFISH의 통합은 마우스 운동 피질 세포 유형의 공간적 구성을 밝혀준다 (Zhang et al., 2021a). 이 연구의 주요 발견은 예상대로 글루타메이트성 뉴런 하위부류의 층류 분포이외에도, 각 하위부류 내 GABA성 유형이 층-선택적 국재화를 나타내고, 개별 글루타메이트성 유형 또는 GABA성 유형 중에서 연속적인 변이가 피질층/깊이를 따라서 그들 연속적인 분포와 충분히 상관있다는 것이다 (두드러진 예는 L2/3 내지 L6에서 피질 깊이를 따라서 모든 흥분성 L2/3-L6 IT 유형이 정렬되어 있다는 것임). (Zeng https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.031).
그러나, 상이한 표현형 특성으로 정의되는 세포 유형이 서로 일치하는가 또는 어떠한 특성이 세포 유형을 정의하는 올바른 것인가에 대해 종종 불명료하다.
표적화된 특이적 RNA 전사물을 코딩된 이펙터 분자 예컨대 형광 단백질의 발현과 연결시켜서, 세포 readrRNA 시스템은 공간적/형태학적으로 뿐만 아니라, 전사물을 기반으로, 세포 유형 및 상태를 동시에 모니터링하기 위한 시스템을 제공한다.
본 명세서에 기술되는 발명은 왓슨-크릭 염기 쌍형성 및 RNA 편집을 기반으로 하고, CellREADR은 1) 세포 RNA 및 RNA 발현으로 정의되는 세포에 대한 고유하고 절대적인 특이성을 제공하고; 3) 임의 조직에서 모든 RNA-정의 세포 유형의 표적화를 위해 무한대로 확장가능하며; "세포 전설비"의 라이브러리 4) 인간을 포함한 대부분의 동물 종에 대해 일반화가능하고; 5) 대부분의 세포 유형 및 조직에 대해 종합적이고, 6) 동물 종 전반에서 일반적이며, 7) 인간 생물학 및 의학에 적용가능하고, 8) 둘 이상의 RNA에 의해 정의된 세포의 교차 표적화 및 동일 조직에서 몇몇 세포 유형의 다중 표적화 및 조작을 달성하도록 프로그램가능하다.
CellREADR 기술
CellREADR 기술의 핵심은 이펙터 분자에 작동적으로 연결된 RNA 서열 특이적 분자 센서-스위치인 readrRNA이다. 이것은 5'-프라임 감지-편집-변환 도메인 (sesRNA) 및 3'-프라임 이펙터-도메인 (efRNA)을 포함하는 단일 모듈식 readrRNA이다. sesRNA의 표적 특이성은 표적 mRNA에서 상보적 서열과 이의 상호작용에 기인한다. 상보성 정도는 sesRNA의 ADAR-매개 편집이 존재하는지 여부를 결정한다. 표적 RNA에 완전하게 상보적인 sesRNA는 ADAR 편집가능 중지 코돈에서 sesRNA의 ADAR-매개 편집을 유도한다.
readrRNA는 통상적인 DNA, 발현 벡터로부터 생성될 수 있다. 이들 벡터는 프로모터, sesRNA 및 efRNA를 코딩하는 DNA 카세트, 및 3' 비번역 영역으로 이루어지고, 통상의 DNA 합성 및 분자 클로닝에 의해 조립될 수 있다. 일 구현예에서, sesRNA 코딩 카세트는 -∼200-300 염기쌍일 수 있고, 이펙터 유전자 카세트는 -∼1-2 킬로 염기쌍일 수 있다. 이들 발현 벡터는 다양한 바이러스 입자로 쉽게 패키징될 수 있다. readrRNA는 필요한 경우에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 도입과 함께, 직접 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 합성을 통해서 생성될 수 있다.
모듈식 readrRNA
따라서, 본 개시의 일 양태는 (i) 센서 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 센서 도메인은 적어도 하나의 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (ii) 센서 도메인과 인-프레임이고, 하류에 있는 이펙터 RNA (efRNA) 영역을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어지는 모듈식 readrRNA 분자를 제공한다. "모듈식 readrRNA 분자"의 어구에서 사용될 때 용어 "모듈식"은 훨씬 더 적은 수의 연결된 구조 단위의 조합을 포함하는 재조합 readrRNA 분자를 의미하는 것으로서, 각각의 구조 단위는 독립적으로 기능성 단백질 분자를 코딩한다.
상이한 단백질 코딩 도메인이 RNA 수준에서 디자인되고, 명시된 수의 반복 디자인과 함께 바람직한 순서로 재조합 readrRNA 분자에 조립되는 readrRNA 분자의 모듈식 디자인은 다양한 성질을 갖는 readrRNA 분자의 생산을 가능하게 한다. 번역 기구는 또한 바람직한 readrRNA 분자가 명시된 아미노산 서열을 갖게 되도록 높은 충실도를 갖는다.
일반적으로, readrRNA 분자는 세포 간 상호작용의 촉진, 환경 자극 감지, 생물학적 시스템에서 시공간 입력/출력의 실시를 포함한 환경 자극에 대한 반응 실시를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 특정 기능을 부여하는 모듈식 도메인으로 구성된다.
모듈식 readrRNA의 센서 도메인
센서 도메인 (sesRNA)은 특정 세포 유형에 존재하는 RNA에 대해 상보적이고, 그와 서열-특이적 염기 쌍형성을 통해서 특정 세포 유형을 검출할 수 있는 뉴클레오티드의 세트를 포함한다. 센서 도메인은 임의 개수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 센서 도메인은 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 450개, 적어도 500개, 적어도 550개, 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 적어도 750개, 적어도 800개, 적어도 850개, 적어도 900개, 적어도 950개, 적어도 1000개를 포함한다. 일부 구현예에서, 센서 도메인은 약 100 내지 약 900개 뉴클레오티드 범위를 포함한다. 다른 구현예에서, 센서 도메인은 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 300 뉴클레오티드 범위를 포함한다. 바람직하게, 센서 도메인 (sesRNA)은 특정 세포 유형 RNA에 상보적이고, 따라서 염기 쌍형성을 통해 그를 검출할 수 있는 ∼200개 뉴클레오티드를 함유한다.
센서 도메인은 또한 번역 스위치 (본 명세서에서 감지-편집-변환 RNA (sesRNA)라고 함)로서 작동하는 하나 이상의 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함한다. 따라서 센서 도메인은 감지-편집-변환 RNA (sesRNA)로서 기능한다. 센서 RNA는 세포 RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
모듈식 readrRNA 분자는 또한 자기-절단성 2A 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 2A 펩티드는 도메인들 사이에, 바람직하게 센서 도메인과 이펙터 RNA 영역 사이 및/또는 본 명세서에서 추가로 논의되는 바와 같은, readrRNA 분자 또는 CellREADER 시스템에 존재할 수 있는 추가 도메인/영역 사이에 위치할 수 있다.
모듈식 readrRNA의 인-프레임 이펙터 RNA (efRNA) 코딩 영역
센서 도메인 하류에 있고, 임의로 자기-절단성 2A 펩티드를 코딩하는 서열에 의해 분리된, 인-프레임 이펙터 RNA (efRNA) 코딩 영역이 있다. 이펙터 RNA (efRNA)는 관심 이펙터 단백질, 예컨대 표지화된 세포의 가시화를 허용하는 표지를 코딩할 수 있다. 이펙터 RNA (efRNA)는 세포의 생리를 변화시키는 이펙터 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 단일 유전자 내 돌연변이에 의해 초래되는 질환을 치료하는 경우에서, 코딩되는 이펙터 단백질은 돌연변이된 유전자의 올바른 카피일 수 있다. 유기체에 대해 내생성이거나 또는 외생성인, 일정 단백질을 제공하여 질환을 치료하는 경우에, 단백질은 이펙터 영역에서 코딩될 수 있다.
소정 efRNA의 선택은 readrRNA 분자의 readrRNA의 원하는 용도 (예를 들어, 질환 치료, 단백질/경로 연구 등)에 의존적이고, 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, CellREADR의 이펙터 모듈 (efRNA)은 활성 및 기능 강화, 활성 및 기능 억제, 결실 또는 돌연변이된 단백질의 온전한 형태의 재도입에 의한 돌연변이체 세포 기능 구제, 활성 및 기능 변경 및 편집, 세포 정체, 운명, 및 기능 재프로그램, 세포 유형 사멸 및 결실, 한 유형의 세포 수 생성 증가 또는 감소, 및 세포 유형-특이적 게놈 편집 및 유전자 조절을 포함하여, 다수의 방식으로 세포를 조작하도록 구축될 수 있다.
표적 RNA를 발현하는 세포에서, sesRNA는 dsRNA를 형성하여서, 내생성 Adar 효소를 동원한다. 중지 코돈에서, A에서 I 편집은 중지를 TI(G)G 트립토판 코돈을 전환시키고, efRNA의 번역을 켜서, 이펙터 단백질을 생성한다. N-말단 펩티드, T2A 및 C-말단 이펙터를 포함하는 최종 융합 단백질은 이후에, T2A를 통해 자기-절단하여, 기능성 이펙터 단백질을 방출한다. 표적 RNA를 발현하지 않는 세포에서, readrRNA은 온전한 채로 남아있는다.
efRNA-코딩 단백질은 세포 복제, 유전자 발현, 및/또는 전사/번역에 관여되거나, 또는 그에 영향을 미칠 수 있는 임의 단백질을 포함할 수 있다. 적합한 예는 전사 활성인자, 전사 억제인자, 및 DNA 리콤비나제 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이펙터 단백질은
A) 효소, 예를 들어, 프로테아제, 포스파타제, 글리코실라제, 아세틸라제, 또는 리파제, b) 숙주 세포 단백질의 기능을 모방하는 단백질, c) 전사 인자, d) 단백질-단백질 상호작용을 촉진하는 단백질 파트너, d) 예를 들어, 감염의 촉진 (병독성 인자 또는 독소) 및/또는 방어 반응의 촉발, 및/또는 형태형성의 촉진 (Cachat, E., Liu, W., Hohenstein, P. et al. A library of mammalian effector modules for synthetic morphology. J Biol Eng 8, 26 (2014). https://doi.org/10.1186/1754-1611-8-26)을 통해서, 숙주 세포 구조 및 기능을 변경시키는 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 예시적인 이펙터 단백질은 하기 표 4에 열거된다.
[표 4]
따라서, 이펙터 기능은 식세포작용, 사이토카인 분비, 수송 또는 촉진 기능,면역 세포의 이동, 생존, 및 증식을 포함한, 선천성 면역 세포 반응의 활성에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 코딩되는 이펙터 분자는 세포 후방 시스템의 일부로서 투여되는 외생성 유전자, 또는 내생성 유전자인, 관심 유전자의 프로모터/인핸서 영역에 결합하여 관심 유전자의 발현을 각각 자극 또는 억제하는, 트랜스활성인자 또는 트랜스억제인자일 수 있다.
전사 활성인자는 DNA (또는 레트로바이러스 경우 RNA)의 하나 이상의 특정 조절 서열에 결합하고, 하나 이상의 근처 유전자의 전사를 자극하는 단백질 또는 소형 분자이다. 대부분의 활성인자는 DNA 폴리머라제 결합 (닫힌 복합체의 형성) 또는 전사의 개시에 필요한 개방 복합체로의 전이를 증강시킨다. 대부분의 활성인자는 RNA 폴리머라제의 서브유닛과 직접적으로 상호작용한다.
전사 억제인자는 일반적으로 히스톤 변형 효소를 포함한 다수 단백질을 함유하는, 보조억제인자 복합체를 동원하여서 기능하는 것으로 여겨지는, 서열-특이적 DNA 결합 단백질이다.
본 명세서에서 사용되는, "조절된"은 활성화되거나 또는 억제되는 의미에서 조절된을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 원체는 인간에서 질환을 초래하는 유기체를 포함한다. 병원체는 박테리아, 바이러스, 기생충, 곤충, 조류, 프라이온, 및 진균을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
CellREADR 시스템2의 리포터 유전자
본 개시의 다른 양태는 CellREADR 시스템을 제공하고, CellREADR 시스템은 적어도 2개 성분을 포함하며, 제1 성분은 본 명세서에 기술된 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 및 임의로 readrRNA 분자의 efRNA-코딩 단백질 (예를 들어, 전사 조절인자, 예를 들어, AP1 및 SP1)에 작동적으로 연결된 (이 구현예에서, 물리적으로 연결되지 않음) 반응 유전자를 포함하는 추가 성분(들)을 포함한다. 이것은 readrRNA 분자가 물리적으로 분리된, 외생적으로 첨가된 핵산 분자에서 코딩되는 다른 단백질, 예컨대 세포 사멸을 일으키는 캐스파제 분자의 전사를 활성화, 증가, 감소, 또는 억제하도록 허용한다.
ADAR 매개된 프로그램가능성 및 교차 표적화
센서 및 이펙터 모듈은 조합적이고 쉽게 프로그램가능하여서, 각각이 특이적이고 조정된 방식으로, 다수 방식으로 각 세포 유형을 조작하고 조직 중 다수 세포 유형을 동시에 조작하는 것을 허용한다. 상기 제공되는 바와 같이, 일부 구현예에서 모듈식 readrRNA 분자는 자기-절단성 펩티드 2A를 코딩하는 선택적 연결 서열에 의해 분리된, 5' 센서-편집-변환 영역 (sesRNA) 및 3' 이펙터 코딩 영역 (efRNA)을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어진다. 일부 구현예에서, sesRNA는 번역 스위치로서 작용하는 하나 이상의 ADAR-편집가능 중지 코돈을 또한 포함하면서, 특이적 세포 유형 RNA에 상보적이고, 따라서 염기 쌍형성을 통해 특이적 세포 유형 RNA를 검출할 수 있는 약 200개 내지 약 300개 뉴클레오티드를 함유하고, 하류에는 다양한 관심 이펙터 단백질을 생성하기 위한 인-프레임 이펙터 코딩 영역이 있다.
표적 RNA를 발현하는 세포에서, sesRNA는 표적 RNA와 dsRNA를 형성하고, 이것은 내생성 Adar 효소를 동원한다. 중지 코돈에서, A에서 I 편집은 중지 코돈을 TI(G)G 트립토판 코돈으로 전환시켜서, efRNA의 번역이 켜지고, 이펙터 단백질이 생성된다. 최종 융합 단백질은 N-말단 펩티드, 2A 및 C-말단 이펙터를 포함하고, 이후에 2A를 통해 자기-절단되어, 기능성 이펙터 단백질을 방출시킨다. 중요한 것은, 표적 RNa를 발현하지 않는 세포에서, readrRNA는 온전한 채로 남아있는다. 이와 같이, 모듈식 readrRNA 분자는 따라서, 단일 RNA 분자로서 배치될 수 있고, ADAR이 세포 내생성이므로, 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV 벡터)에 쉽게 맞춰질 수 있다.
일부 상황에서, ADAR 단백질(들)은 고도로 발현되지 않거나, 또는 일부 경우에, 세포에 부재한다. 이러한 경우에, 본 개시는 모듈식 readrRNA 분자에 포함되고/되거나 별개 벡터를 통해 시스템에 첨가되는 ADAR 단백질 (예를 들어, ADAR2)의 첨가를 제공한다. CellREADR의 가장 기본적인 특성은 이것이 전적으로 RNA 서열을 기반으로 하고, (i) 세포 RNA에 대한 고유하고 절대적인 특이성; (ii) (DNA 벡터) 지다인, 구축, 사용, 및 공유의 용이성; (iii) "세포 전설비"의 무한하게 확장가능한 라이브러리; (iii) 대부분의 세포 유형 및 조직에 종합적; (iv) 동물 종에 걸쳐 일반적; 및 (v) 인간 생물학 및 의학을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 수많은 매우 바람직한 성질을 부여하는 왓슨-크릭 염기 쌍형을 통해 작동된다는 것이다. 따라서, 종합적이고 조합적인 CellREADR 센서-이펙터 라이브러리가 기관계 및 동물종에 걸쳐서 세포 유형을 확인, 특징규명 및 조작하기 위해 구축될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 모듈식 readrRNA 분자의 프로그램가능성은 추가의 힘을 부여한다. 따라서, 본 개시의 다른 구현예는 본 명세서에 제공되는 바와 같은모듈식 readrRNA 분자의 프로그램가능성 및/또는 모듈식 readrRNA 분자를 사용한 교차 표적화를 제공한다.
첫째로, 둘 이상의 RNA 센서는 둘 이상의 특이적 세포 유형의 교차 표적화를 달성하기 위해 둘 이상의 별개 세포 RNA를 검출하도록 디자인될 수 있다. 둘째로, 동일한 RNA 센서는 동일한 세포 유형을 표지하고, 기록, 및 조작할 수 있도록 상이한 이펙터에 연결될 수 있다. 세째로, 다수 RNA 센서의 코호트는 대등하게 모듈 조직 기능에 대해서, 각각이 상이한 이펙터를 발현하는, 동일 조직 중 명몇 세포 유형을 표적화하도록 디자인될 수 있다. 네째로, RNA 센서는 RNA 수준에 의해 정의되는 상이한 세포 상태를 모니터링하고 조작하기 위해 표적 RNA의 상이한 임계값 수준을 검출하도록 디자인될 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시는 보다 특이적인 세포 유형의 교차 표적화를 달성하도록 2개의 별도 세포 RNA를 검출하도록 디자인된 2개 센서를 제공한다. 일 양태에서, 각각의 센서 모듈은 중지 코돈을 갖고, 오직 둘 모두가 제거될 때만이 이펙터 분자를 발현할 수 있다. 일 구현예에서, 각각의 센서는 적어도 하나의 중지 코돈을 포함한다. 다른 구현예에서, 동일한 센서는 동일한 세포 유형을 표지하고, 기록, 및 조작하도록 상이한 이펙터를 발현하는데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 다수의 센서는 각각이 상이한 이펙터를 발현하는, 동일 조직 중 몇몇 세포 유형을 표적화하도록 디자인되어서, 모듈 조직 기능을 조정할 수 있다.
따라서, RNA 감지 도메인은 임의의 세포 RNA를 검출하는 능력, 및 따라서 임의의 인간 조직에서 임의의 RNA-정의 세포 유형 및 세포 상태에 접근하는 능력을 갖는다. 이펙터-도메인는 임의의 단백질을 코딩하는 능력, 및 따라서 많은 세포 성질을 모니터링, 조작, 및 편집하는 능력을 갖는다.
세포 유형 및 세포 상태 표적화의 일반성
RNA 센서 도메인은 세포 유형 및 세포 상태를 정의하는 RNa 마커를 검출할 수 있다. 단일 세포 RNA 시퀀싱에서 최근의 진보로 모든 인간 및 동물 조직에서 대량 데이터세트가 생성되고 있다1,2,3. Human Cell Atlas project (www.humancellatlas.org); the NIH Human Biomolecular atlas program (commonfund.nih.gov/hubmap); BRAIN Initiative Cell Census Network (biccn.org/); 및 the Allen Brain Cell Atlas (portal.brain-map.org/)을 포함한, 몇몇 주요 노력들이 진행되고 있다.
모든 단일 세포 전사체 데이터세트는 공개적으로 접근가능하다. RNA 마커는 모든 주요 인간 세포 유형은 아니지만 대부분에 대해 식별된다 1,2,3. 더 나아가서, RNA 마커는 많은 질환 세포 상태에 대해 식별된다4. 모든 이들 RNA 마커는 세포 유형 및 세포 상태를 표적화하기 위해 CellREADR에 의해 사용될 수 있다. 이들 마커 중 일부를 하기 표 5에 열거한다.
[표 5]
참조 문헌
1. Regev A, Teichmann SA, Lander ES, Amit I, Benoist C, Birney E, Bodenmiller B, Campbell P, Carninci P, Clatworthy M, Clevers H, Deplancke B, Dunham I, Eberwine J, Eils R, Enard W, Farmer A, Fugger L, Gotgens B, Hacohen N, Haniffa M, Hemberg M, Kim S, Klenerman P, Kriegstein A, Lein E, Linnarsson S, Lundberg E, Lundeberg J, Majumder P, Marioni JC, Merad M, Mhlanga M, Nawijn M, Netea M, Nolan G, Pe'er D, Phillipakis A, Ponting CP, Quake S, Reik W, Rozenblatt-Rosen O, Sanes J, Satija R, Schumacher TN, Shalek A, Shapiro E, Sharma P, Shin JW, Stegle O, Stratton M, Stubbington MJT, Theis FJ, Uhlen M, van Oudenaarden A, Wagner A, Watt F, Weissman J, Wold B, Xavier R, Yosef N; Human Cell Atlas Meeting Participants. (2017) The Human Cell Atlas. Elife. 2017 Dec 5;6:e27041. doi: 10.7554/eLife.27041. PMID: 29206104
2. Osumi-Sutherland D, Xu C, Keays M, Levine AP, Kharchenko PV, Regev A, Lein E, Teichmann SA. (2021) Cell type ontologies of the Human Cell Atlas. Nat Cell Biol. 2021 Nov;23(11):1129-1135. doi: 10.1038/s41556-021-00787-7. Epub 2021 Nov 8. PMID: 34750578 Review.
3. Haniffa M, Taylor D, Linnarsson S, Aronow BJ, Bader GD, Barker RA, Camara PG, Camp JG, Chedotal A, Copp A, Etchevers HC, Giacobini P, Gotgens B, Guo G, Hupalowska A, James KR, Kirby E, Kriegstein A, Lundeberg J, Marioni JC, Meyer KB, Niakan KK, Nilsson M, Olabi B, Pe'er D, Regev A, Rood J, Rozenblatt-Rosen O, Satija R, Teichmann SA, Treutlein B, Vento-Tormo R, Webb S; Human Cell Atlas Developmental Biological Network. (2021) A roadmap for the Human Developmental Cell Atlas. Nature. 2021 Sep;597(7875):196-205. doi: 10.1038/s41586-021-03620-1. Epub 2021 Sep 8. PMID: 34497388
4. Jagadeesh KA, Dey KK, Montoro DT, Mohan R, Gazal S, Engreitz JM, Xavier RJ, Price AL, Regev A. (2022) Identifying disease-critical cell types and cellular processes by integrating single-cell RNA-sequencing and human genetics. Nat Genet. 2022 Oct;54(10):1479-1492. doi: 10.1038/s41588-022-01187-9. Epub 2022 Sep 29. PMID: 36175791
전달
CellREADR은 ADAR이 세포 내생성이므로, 단일 RNA 분자로서 배치될 수 있다. 그리고 <4.7 Kbs의 AAV 바이러스 벡터에 쉽게 맞춰질 수 있다. 실제로, 전체 readrRNA는 특이적 센서 및 이펙터가 분자에 통합되어 있는지에 따라서, 수 킬로베이스이고, 따라서 전달 시스템을 통해 세포에 전달가능하다. 표적 RNA를 발현하는 세포에서, sesRNA는 표적화 dsRNA를 형성하고, 이것은 ADAR을 동원하여서 편집 복합체를 조립한다. 편집가능 중지 코돈에서, ADAR은 A를 I로 전환시켜서, 표적 RNA 내 반대쪽 C와 쌍형성한다. 이러한 A -> G 치환은 TAG 중지 코돈을 TI(G)G 트립토판 코돈으로 전환시켜서, efRNA의 번역이 켜지게 된다. 인-프레임 번역은 N-말단 펩티드, 2A (사용되는 경우), 및 C-말단 이펙터를 포함하는 융합 단백질을 생성시켜서, 이후에 2A를 통해 자기-절단되어 기능성 이펙터 단백질을 방출한다 (참조: 예를 들어, 도 1a). readrRNA는 표적 RNA를 발현하지 않는 세포에서 불활성인 채로 남아있는다.
본 개시 및 당분야의 지식을 통해서, 본 명세서에 제공되는 모듈식 readrRNA 분자, 또는 이의 임의 성분, 이의 핵산 분자, 및/또는 핵의 성분을 코딩하거나 또는 제공하는 핵산 분자를 비롯하여, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 임의의 CellREADR 시스템은 다양한 전달 시스템을 통해서 전달될 수 있다. 이러한 전달 시스템의 예는 DNA 또는 RNA 형질감염 방법: 화학 시약 (PEI, 리포펙타민, 칼슘 포스페이트 등) 또는 전기천공을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. DNA 발현 벡터는 리포솜 나노입자에 패키징될 수 있다. readrRNA는 시험관내에서 전사 또는 합성되고, 리포솜 나노입자, 나노입자, 리포솜, 재조합 바이러스 벡터 (바이러스 벡터: 아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스, 및 수포성 구내염 바이러스가 바람직한 바이러스 비히클임), 전기천공 엑소솜, 미세소포, 유전자-총, SEND (Selective Endogenous eNcapsidation for cellular Delivery) 시스템, (인간 게놈에 존재하는 역구성요소를 기반으로 하는 인간화 바이러스-유사 입자 (VLP)를 포함하는 mRNA 전달 시스템 (Segel M, et al. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. Science. 2021;373:882-889. doi: 10.1126/science.abg6155), 이의 조합 등에 패키징될 수 있다.
모듈식 readrRNA 분자 및/또는 임의의 RNA (예를 들어, sesRNA, efRNA 등) 및/또는 임의의 보조 단백질 및/또는 CellREADR 시스템은 적합한 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스, 및 다른 바이러스 벡터 또는 이의 조합을 사용해 전달될 수 있다. 단백질, 예를 들어, sesRNA, efRNA, efRNA 반응 유전자, 단백질 코딩 또는 비-코딩 RNA (예를 들어, sgRHA, shRNA 등), 세포 READR 시스템 등은 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 패키징될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, efRNA-코딩 단백질에 작동적으로 연결된 efRNA 반응 유전자를 포함하는 제2 발현 벡터는 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템과 동시-전달되고, 모듈식 readrRNA 분자 및 이펙터 RNA의 성공적인 번역 시에 리포터 생산물의 성공적인 결합 및 활성화를 야기한다. 일부 구현예에서, efRNA 반응 유전자는 리포터 유전자 (예를 들어, GFP, mRuby, mCherry, ChR2, DTA, Gcamp, TK, 인터페론 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 리포터 유전자)를 포함한다. 다른 구현예에서, efRNA 반응 유전자는 2차 이펙터 유전자를 포함한다.
박테리아 적용 경우에, 적용가능하면, 본 명세서에 기술된 모듈식 readrRNA 분자 시스템의 임의의 성분을 코딩하는 핵산은 파지를 사용하여 박테리아에 전달될 수 있다. 예시적인 파지는 T4 파지, μ, λ 파지, T5 파지, T7 파지, T3 파지, Φ29, M13, MS2, Qβ, 및 ΦX174를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 구현예에서, 외생성 ADAR의 첨가를 필요로 할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터는 예를 들어, 근육내 주사, 정맥내 주사, 경피 투여, 비내 투여, 경구 투여, 또는 점막 투여를 통해서 관심 조직에 전달된다. 이러한 전달은 단일 용량, 또는 다수 용량을 통할 수 있다. 당업자는 본 명세서에서 전달하려는 실제 용량이 다양한 인자, 예컨대 벡터 선택, 표적 세포, 유기체, 조직, 치료하려는 대상체의 일반적인 상태, 추구하는 형질전환/변형의 정도, 투여 경로, 투여 방식, 추구하는 형질전환/변형의 유형 등에 의존하여 매우 다양할 수 있다는 것을 이해한다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 적어도 1x105 입자 (입자 단위, pu라고도 함)의 아데노바이러스를 함유하는 단일 용량일 수 있는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 용량은 바람직하게 적어도 약 1x106 입자, 적어도 약 1x107 입자, 적어도 약 1x108 입자, 및 적어도 약 1x109 입자의 아데노바이러스이다.
일부 구현예에서, 전달은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 통한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변형된 AAV 벡터가 전달을 위해 사용될 수 있다. 변형된 AAV 벡터는 AAV1, AV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2. AAV9, AAV rhlO, 변형된 AAV 벡터 (예를 들어, 변형된 AAV2, 변형된 AAV3, 변형된 AAV6) 및 위형 AAV (예를 들어, AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6), AAV-PHP.eB, 및 이의 임의의 변이체, AAV-PHP.S 및 이의 임의의 변이체, AAV-PHP.V1 및 이의 임의의 변이체 등을 포함한, 몇몇 캡시드 유형 중 하나 이상을 기반으로 할 수 있다. 예시적인 AAV 벡터 및 rAAV 입자를 생산하는데 사용될 수 있는 기술은 당분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 전달은 플라스미드를 통한다. 용량은 반응을 유발시키기에 충분한 수의 플라스미드일 수 있다. 일부 경우에, 플라스미드 조성물 중 플라스미드 DNA의 적합한 분량은 약 0.1 내지 약 2 mg일 수 있다. 플라스미드는 일반적으로 (i) 프로모터; (ii) 각각이 프로모터 (예를 들어, 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터)에 작동적으로 연결된 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템을 코딩하는 서열; (iii) 선별 마커; (iv) 복제 기원; 및 (v) (ii)의 하류에서 작동적으로 연결된 전사 종결인자를 포함하게 된다. 플라스미드는 또한 다른 RNA 성분을 코딩할 수 있지만, 이들 중 하나 이상은 대신에 상이한 벡터에서 코딩될 수도 있다. 투여 빈도는 의학 또는 수의학 전문가 (예를 들어, 의사, 수의사), 또는 당업자의 범위 내에 있다.
ADAR 단백질이 발현되지 않거나, 또는 낮은 수준으로 발현되는 세포/시스템 (예를 들어, 박테리아 세포 및 일정 식물 세포)에서, 플라스미드 (단독으로 또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 CellREADR 시스템을 발현하는 것)는 ADAR 유전자 (예를 들어, Adar1, Adar2 등)를 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다.
외생성 ADAR 또는 조작된 ADAR (즉, 개선된 기능성을 가짐)은 CellREADR 시스템의 효율을 증가시킬 수 있다. 외생성 ADAR은 다음의 방식으로 동물 (또는 식물) 세포에 전달될 수 있다:
1) ADAR1 또는 ADAR2는 형질감염 또는 바이러스 감염 (AAV, 렌티바이러스 등)을 통해서, CMV, CAG 프로모터를 갖는 별개 구성체/DNA 벡터 (Readr 구성체 유래)와 전달된다.
2) ADAR1 또는 ADAR2는 동일한 CellReadr 구성체/DAN 벡터에서 SesRNA 서열의 앞에 위치되고, 형질감염 또는 바이러스 감염을 통해 세포에 전달된다.
3) ADAR1 또는 ADAR2 mRNA는 CellReadr DNA 벡터 또는 RNA와 함께, LNP를 통해서 세포에 전달된다.
4) ADAR1 또는 ADAR2 단백질은 CellReadr DNA 벡터 또는 RNA와 함께, LNP 또는 VLP (바이러스 유사 입자)를 통해서 세포에 전달된다.
다른 구현예에서, 전달은 리포솜 또는 리포펙션 제제 등을 통하고, 당업자에게 공지된 방법으로 제조될 수 있는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어, WO 2016205764 및 미국 특허 제5,593,972호; 제5,589,466호; 및 제5,580,859호에 기술되어 있고, 이들 각각은 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다.
일부 구현예에서, 전달은 나노입자 또는 엑소솜을 통한다. 예를 들어, 엑소솜은 전달 RNA에서 특히 유용한 것으로 확인되었다.
세포에 본 명세서에 제공된 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 시스템의 하나 이상의 성분을 도입하는 추가 수단은 세포 투과성 펩티드 (CPP)를 사용하는 것이다. 일부 구현예에서, 세포 투과성 펩티드는 모듈식 readrRNA 분자에 연결된다. 일부 구현예에서, 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 이의 임의 성분은 하나 이상의 CPP에 커플링되어서 그들을 세포 내부 (예를 들어, 식물 원형질체)로 효과적으로 수송한다. 일부 구현예에서, 모듈식 readrRNA 분자 및/또는 이의 임의 성분은 세포 전달을 위해 하나 이상의 CPP에 커플링되는 하나 이상의 원형 또는 비-원형 DNA 분자에 의해 코딩된다.
CPP는 수용체 독립적 방식으로 세포막을 가로질러서 생체분자를 수송할 수 있는 키메라 서열 또는 단백질로부터 유래되는 35개 아미노산 미만의 짧은 펩티드이다. CPP는 양이온성 펩티드, 소수성 서열을 갖는 펩티드, 양쪽성 펩티드, 프롤린-풍부 및 항미생물 서열을 갖는 펩티드, 및 키메라 또는 이분 펩티드일 수 있다. CPP의 예는 예를 들어, Tat (1형 HIV에 의한 바이러스 복제에 필요한 핵 전사 활성인자 단백질), 페너트라틴, 카포시 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 신호 펩티드 서열, 인테그린 3 신호 펩티드 서열, 폴리아르기닌 펩티드 Args 서열, 구아닌 풍부-분자 수송체, 및 스위트 애로우 펩티드를 포함한다.
세포로 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 시스템의 하나 이상의 성분을 도입하는 또 다른 수단은 SEND의 사용에 의한다 (참조: 예를 들어, Segel, M. et al., 2021. Science 373:6557; 882-889, 이의 내용은 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입됨). 이러한 구현예에서, 세포외 바이러스-유사 캡시드 중 그 자신의 mRNA에 직접 결합하여 분비하는, 레트로바이러스-유사 단백질, 예컨대 PEG10은 포유동물 세포로 기능성 기능성 mRNA 카고 (즉, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자)를 전달하도록 융합원과 위형화된다.
본 개시의 다른 구현예는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자의 변형을 제공한다. 이러한 변형은 임의의 목적, 예컨대 증가된 안정성, 대상체의 면역력을 회피하는 모듈식 readrRNA 분자의 능력 등을 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 모듈식 readrRNA 분자가 원형 RNA 분자를 포함하는 예에서, 이러한 변형은 N6-메틸아데노신 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, N6-메틸아데노신 리더 YTHDF2 서열의 포함은 N6-메틸아데노신-원형RNA의 격리를 가능하게 하여서, 내재 면역력의 억제를 허용한다 (참조: 예를 들어, Chen, Y.G. et al., (2019) Molecular 세포 (76):1; 96-109, 이의 내용은 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입됨). 다른 구현예에서, 이러한 변형은 대상체의 면역계를 회피하는데 도움이 되도록 슈도우리딘으로 우리딘을 치환시키는 것을 포함할 수 있다 (참조: 예를 들어, Dolgin, E. (2021) Nature 597; 318-324, 이의 내용은 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입됨).
약학 조성물
다른 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 중 하나 이상, 또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자 (본 명세서에서 단독으로 또는 함께 "분자"로서 사용됨)를 포함하는 전달 시스템 및 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 담체, 부형제 또는 희석제의 정확한 성질은 조성물에 대한 바람직한 용도에 따라 좌우될 것이고, 수의학적 용도에 적합하거나 또는 허용되는 것부터 인간 용도에 적합하거나 또는 허용되는 것까지의 범위일 수 있다. 조성물은 임의로 하나 이상의 추가적인 화합물 및/또는 치료제를 포함할 수 있다.
약학 조성물은 예를 들어, 국소, 안구, 경구, 구강, 전신, 비강, 주사, 경피, 직장, 질 등을 포함하는, 사실상 모든 투여 경로에 적합한 형태, 또는 흡입 또는 통기를 통한 투여에 적합한 형태를 취할 수 있다.
대안적으로, 다른 약학 전달 시스템이 적용될 수도 있다. 리포솜 및 에멀션은 분자(들)를 전달하는데 사용될 수 있는 전달 비히클의 잘 알려진 예이다. 일정 유기 용매 예컨대 디메틸 술폭시드 (DMSO)가 또한 적용될 수 있지만, 일반적으로 독성이 더 크다.
약학 조성물은 바람직하다면 분자(들)를 함유하는 하나 이상의 단위 제형을 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치에 존재할 수 있다. 팩은 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 설명서가 동봉될 수 있다.
본 명세서에 기술된 분자(들), 또는 이의 약학 조성물은 일반적으로 의도하는 결과를 획득하는데 유효한 양으로, 예를 들어, 치료하려는 특정 질환을 예방하거나 또는 치료하는데 유효한 양으로 사용된다. 치료적 이득이란 환자가 여전히 기저 질환을 앓고 있을 수 있지만, 환자가 기분 또는 상태의 개선을 보고하도록 치료되는 기저 장애의 근절 또는 호전 및/또는 기저 질환과 연관된 증상 중 하나 이상의 근절 또는 호전을 의미한다. 치료적 이득은 또한 일반적으로 개선이 실현되는지 여부와 무관하게, 질환 진행의 중단 또는 둔화를 포함한다.
특정 용도 및 투여 방식에 대한 분자(들)의 유효 용량의 결정은 당업자의 능력 내에서 충분하다. 유효 용량은 초기에 시험관내 활성 및 물질대사 어세이로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 동물에서 사용을 위한 화합물의 초기 용량은 시험관내 어세이에서 측정되는 특정 화합물의 IC50 이상인 대사산물 활성 화합물 (예를 들어, efRNA 산물)의 순환 혈액 또는 혈청 농도를 획득하여 공식화될 수 있다. 바람직한 투여 경로를 통한 특정 화합물의 생체이용률을 고려하는 이러한 순환 혈액 또는 혈청 농도를 획득하기 위한 용량의 계산은 당업자의 능력 내에서 충분하다. 화합물의 초기 용량은 또한 생체내 데이터, 예컨대 동물 모둘에서 추정할 수 있다. 상기 기술된 다양한 질환을 치료하거나 또는 예방하기 위해 활성 대사산물의 효능을 시험하는데 유용한 동물 모델은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 활성 대사산물로 화합물의 물질대사 및/또는 생체이용률을 시험하는데 적합한 동물 모델도 역시 잘 알려져 있다. 당업자는 통상적으로 이러한 정보를 조정하여 인간 투여에 적합한 특정 화합물의 용량을 결정할 수 있다.
용량은 특히, 활성 화합물의 활성, 화합물의 생체이용률, 이의 물질대사 동역학 및 다른 약동학적 성질, 투여 방식, 및 상기 논의된, 다양한 다른 인자들에 따라 좌우된다. 용량 및 간격은 치료적 또는 예방적 효과를 유지하기에 충분한 화합물(들) 및/또는 활성 물질대사 화합물(들)의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 특히, 투여 방식, 치료되는 특정 적응증 및 처방 의사의 판단에 따라서, 1주에 1회, 1주에 수회 (예를 들어, 격일로), 1일 1회 또는 1일 다수회 투여될 수 있다. 국소 투여 또는 선택적 흡수, 예컨대 국소 국부 투여 경우에, 화합물(들) 및/또는 활성 대사산물 화합물(들)의 유효한 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있따. 당업자는 과도한 실험없이, 유효한 용량을 최적화할 수 있다.
세포 조작
관심 세포, 또는 세포 그룹의 생리를 모니터링하고/하거나 변화시키기 위해서, 관심 세포(들)는 readrRNA의 SES 성분을 통해 세포(들)의 하나 이상의 RNA 전사물의 차등적 발현을 기반으로 확인된다. ADAR 매개 편집을 통해서, 작동적으로 연결된 이펙터 분자(들)가 번역되고, 세포를 형광으로 표지할 수 있고/있거나, 세포 사멸을 포함하여, 세포(들)의 생리에서 일부 원하는 변화를 실시할 수 있다.
readrRNA의 코딩된 이펙터에 readrRNA의 SES 성분의 물리적 연결이외에도, 관심 세포는 CellREADR 시스템이라고 불리는 시스템을 포함하는, readrRNA의 코딩된 이펙터의 제어 하에 있는 제2 핵산 독립체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, ReadrRNA의 이펙터는 제2 핵산 독립체에서 코딩되는 각각의 유전자를 활성화할 수 있는 트랜스활성인자를 코딩할 수 있고, 여기서 제2 핵산 독립체는 세포에 내생성인 트랜스활성인자의 제어 하에 유전자를 코딩하는 세포에 내생성이고/이거나, 제2 핵산 독립체는 세포에 외생적으로 첨가되고, 세포에 외생성 및/또는 내생성인 트랜스활성인자의 제어 하에 유전자(들)를 코딩한다.
트랜스활성인자 또는 억제인자는 또한 침묵하는 단단한 헤어핀 루프 (shRNA)를 코딩하는 외생성 유전자의 발현을 제어하여서 세포에서 명시된 내생성 유전자의 발현을 침묵화시킬 수 있거나 또는 감소시킬 수 있다. 제2 핵산 독립체에 위치되는 것의 대안으로, 트랜스활성인자의 제어 하의 유전자는 readrRNA 분자 그 자체에 위치할 수 있다는 것도 역시 유의한다. 환자에서 궁극적으로 질환 또는 장애를 초래하는 돌연변이된 유전자를 포함하는 세포 경우에, 이펙터는 기능성 유전자를 코딩할 수 있고/있거나 기능성 유전자를 코딩하는 핵산의 발현을 야기할 수 있다.
따라서, 세포 또는 조직은 모듈식 readrRNA 분자, 및 이러한 모듈식 readrRNA 분자를 포함하는 시스템을 발현한다. 그래서, 본 개시의 다른 양태는 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자, 또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자를 포함하는 전달 시스템을 포함하는 세포를 제공한다. 본 명세서에서 제공되는 readrRNA 분자는 원핵생물 및 진핵생물 세포에서 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵생물 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포 또는 식물 세포를 포함한다.
본 개시의 다른 양태는 본 명세서에 제공되는 바와 같은 세포를 포함하는 동물 모델 또는 식물 모델을 제공한다.
치료
본 개시는 본 명세서에서 제공되는 바와 같고, 이하 실시예에서 제공되는 바와 같은 readrRNA 분자를 포함하는 방법을 더 포괄한다.
본 개시의 다른 양태는 세포 상태-정의 세포 RNA의 존재 또는 역학을 검출하고/하거나 하나 이상의 이펙터 단백질의 번역을 켜기 위한 방법을 제공하고, 방법은 표적 이펙터 RNA를 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자, 또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자를 포함하는 전달 시스템, 또는 본 명세서에 제공되는 바와 같은 약학 조성물에 의해 검출/혼성화하는 단계를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어지고, 센서 도메인은 서열-특이적 염기 쌍형성을 통해 특이적 세포 유형 RNA를 검출하고 결합하며, 하나 이상의 ADAR-편집가능 중지 코돈은 번역 스위치로서 작용하여서, 이펙터 단백질을 코딩하는 이펙터 RNA의 번역을 허용한다.
일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 세포 내에 있다.
세포의 동적 상태의 검출/평가는 진단을 위해서, 개체에서 질환을 검출하는데 중요하다. 세포의 동적 상태의 검출/평가는 치료제가 가장 효과적이고 다면발현성 부작용이 감소된 명시된 표적화된 세포에 대해 특이적으로 치료제를 제공함으로써 개체에서 질환의 표적화 치료를 위해 중요하다. 그러나, 이펙터 분자는 이후에 예를 들어, 분비된 사이토카인 및 인터루킨, 및 T-CAR의 경우에, 특정된 세포의 외부에서 기능할 수 있다.
본 개시의 다른 양태는 이를 필요로 하는 대상체에서 병태 및/또는 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 방법은 대상체에게 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자, 또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자를 포함하는 전달 시스템을 투여하여서, 대상체에서 병태 및/또는 질환을 치료하는 것인 단계를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어진다.
일부 구현예에서, 병태 및/또는 질환은 암, 감염성 질환, 유전 장애 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는, 병태 및/또는 질환을 "치료하는"은 병태 및/또는 질환과 연관된 임의의 병태 또는 증상을 호전시키는 것이다. 동등한 미치료 대조군과 비교하여, 이러한 감소는 임의의 표준 기술로 측정시 적어도 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상이다. 대상체에게 본 명세서에 기술된 조성물을 투여하기 위한 다양한 수단이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법은 경구, 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도 (에어로졸), 폐, 피부, 국소, 주사, 또는 종양내 투여를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 투여는 국소적이거나 또는 전신일 수 있다. 임의 양태의 일부 구현예에서, 투여는 피하이다.
체세포 유형-특이적 유전자 요법의 예는 근이영양증, 낭포성 섬유증 낭포성 섬유증, 선천성 난청, 뒤센형 근이영양증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 혈색소증, 1형 신경섬유종증 (NF1), 겸상적혈구병 및 테이-삭스 병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 단일 유전자 질환에서정상 mRNA/단백질의 세포 유형-특이적 보완을 포함한다.
암의 치료 (예를 들어, 고형 종양; 백혈병)는 그들의 상향조절 및/또는 이상 형태의 RNA에 의한 암 세포의 검출을 위해서, 그리고 캐스파제, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1, 캐스파제 8, Bcl-2-연관 X 단백질, PDL-L1, 캐스파제 3, CFLAR, Bcl-xl, SMAC/디아블로, 디아블로 상동체, Bcl-2 상동성 길항제 사멸자, FADD, BECN1, 사멸 수용체 5, PDCD6, RIP1 키나제, RIP3 키나제, 및 효소; 또는 CD16, 케모카인 수용체 (CCR2, CCR5, CXCR3 및 CX3CR1) 및 β2-인테그린 LFA-1을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 면역 살해 세포를 동원하기 위한 수용체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 세포 사멸 단백질의 발현에 의해 암 세포를 제거하기 위해서, readrRNA 및 cellREADR을 사용하는 것을 포함한다.
readrRNA 및 cellREADR은 만성 B형, C형 간염, 비-알콜성 지방간염 (NASH)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 간 질환 (간문맥 등을 통한 지질 나노입자에 의한 전달의 장점); 심장 질환을 비롯하여, 잠복성 바이러스 감염 (세포내 기생충) 및 내성 감염, 예를 들어, 엡스타인 바 바이러스, 헤르페스, 결핵, 프라이온, 지카, HIV를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 감염성 질환의 치료에서 사용될 수 있다.
readrRNA 및 cellREADR은 만성 통증의 치료: 광범위하고 넓은 영향; 예를 들어, 당뇨병성 신경병증; NIDA, NINDS HEAL Initiative) > 비중독성 통증 치료에 사용될 수 있다. readrRNA 및 cellREADR은 표적화된 국소 AAV 벡터 주사를 통해서 말초 신경절에서 특정 감각 뉴런 및 신경교 세포 유형의 이온 채널 및 수용체 발현을 조절할 수 있다.
readrRNA 및 cellREADR은 현재 종종 뇌 조직의 외과적 절제를 통해 치료되는 뇌전증의 치료에 사용될 수 있다. 뇌전증은 종종 일정 뉴런 세포 유형에서 이상 신경 활성으로 인해 야기된다. 즉, 뇌전증은 병리학적 뇌 네트워크의 과-동기화된 신경 활동을 특징으로 한다. 뇌 회로는 각각이 정보 처리 및 흥분-억제 균형에 고유한 기여를 하는, 다수의 흥분성 및 억제성 세포 유형을 포함한다. 일부 세포 유형에서 신경 활동은 촉진되는 반면 다른 세포 유형은 뇌전증의 상이한 단계 (개시, 유지)에서 발작을 억제한다. RNA 센서(들)-이펙터(들)를 통해서 뇌 회로 활동의 세포 유형 특이적 조절 (예를 들어, 약물사용가능한 GPCR, 이온 채널 등)을 위해 readrRNA 및 cellREADR을 사용하는 것은 뇌전증을 제어하고 치료하는 유망한 접근법이다. 따라서, readrRNA 및 cellREADR은 뇌전증을 억제하고 치료하는 신경 활동의 세포 유형-표적화 조절에 사용될 수 있다.
키트
본 개시는 본 명세서에 제공되는 조성물을 포함하고 본 명세서에서 제공되는 대상 방법을 수행하기 위한 키트를 더 제공한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 대상 키트는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있거나, 그로 이루어질 수 있거나, 또는 본질적으로 그로 이루어질 수 있다: (i) 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 분자; (ii) 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 CellREADR 시스템; (iii) 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 및/또는 CellREADR 시스템을 포함하는 전달 시스템; (iv) 모듈식 readrRNA 및/또는 CellREADR 시스템 및/또는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 모듈식 readrRNA 및/또는 CellREADR 시스템을 포함하는 전달 시스템을 포함하는 세포; 및/또는 (v) 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 약학 조성물.
다른 구현예에서, 키트는 다른 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 개별적으로 또는 조합하여 제공될 수 있고, 임의의 적합한 용기 예컨대 바이알, 병, 또는 튜브에 제공될 수 있다. 이러한 성분의 예는 (i) 하나 이상의 추가 시약, 예컨대 하나 이상의 희석 완충액; 하나 이상의 재구성 용액; 하나 이상의 세척 완충액; 하나 이상의 저장 완충액, 하나 이상의 대조군 시약 등, (ii) 하나 이상의 대조군 발현 벡터 또는 RNA 폴리뉴클레오티드; (iii) 본 명세서에 제공되는 바와 같은 분자, 세포, 전달 시스템 등의 시험관내 생산 및/또는 유지를 위한 하나 이상의 시약 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 성분 (예를 들어, 시약)은 또한 특정 어세이에서 사용가능한 형태로, 또는 사용 전에 하나 이상의 다른 성분의 첨가에 필요한 형태 (예를 들어, 농축물 또는 동결건조 형태)로 제공될 수도 있다. 적합한 완충액은 포스페이트 완충 염수, 탄산나트륨 완충액, 중탄산나트륨 완충액, 보레이트, 완충액, Tris 완충액, MOPS 완충액, HEPES 완충액, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 키트 성분은 또한 개별적으로 또는 조합하여 제공될 수 있고, 임의의 적합한 용기, 예컨대 바이알, 병 또는 튜브에 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 키트는 본 명세서에 개시된 구현예에서 사용을 위한 하나 이상의 시약을 포함한다.
상기 언급된 성분이외에도, 대상 키트는 대상 방법을 실시하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있다. 대상 방법을 실시하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 기재, 예컨대 종이 또는 플라스틱 등에 인쇄될 수 있다. 이와 같이, 설명서는 패키징 삽입물로서 키트에, 키트 또는 이의 성분 등의 용기 표지에 (즉, 패키징 또는 하부패키징과 함께) 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 설명서는 적합한 컴퓨터 판독가능 저장 매체, 예를 들어, CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 또 다른 구현예에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, 예를 들어, 인터넷을 통해 원격 소스로부터 설명서를 얻기 위한 수단이 제공된다. 이러한 구현예의 예는 설명서를 볼 수 있고/있거나 설명서를 다운로드할 수 있는 웹주소를 포함한 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻는 이러한 수단은 적합한 기재에 기록된다.
본 개시의 다른 양태 본 명세서에 기술되고 예시되는 모두를 제공한다. 하기 실시예는 제한이 아닌 예시로 제공된다.
실시예
하기 작업예에 공통적인 일반 방법
플라스미드: 모든 구성체는 표준 분자 클로닝 절차를 사용해 생성되었다. 백터 골격은 제한효소 분해를 사용해 선형화되었고, DNA 단편 삽입부는 PCR 또는 gBlock 합성 (IDT)을 사용해 생성되었다. 모든 플라스미드에 대한 정보는 표 6에 포함된다. 모든 sesRNA 삽입부는 gBlock 합성 (IDT)을 통해 생성되었고, sesRNA 서열은 표 7에 포함된다.
세포 배양 및 형질감염: HeLa 세포주는 A. Krainer 실험실 (Cold Spring Harbor Laboratory)에서 얻었다. 마우스 신경모세포종 Neuro-2a (N2a) 세포는 Millipore-Sigma (Sigma, Cat. 89121404)에서 구매하였다. HEK293T 및 KPC1242 세포주는 D. Fearon 실험실 (Cold Spring Harbor Laboratory)에서 얻었다. HEK293T, Hela 및 N2a 세포주는 10% 태아 소 혈청 (FBS) (Gibco, Cat. 16000036) 존재의 둘베코 변형 Eagle 배지 (Corning, 10-013-CV)에서 5% CO2 및 37℃ 하에 배양되었다. 1% 페니실린-스트렙토마이신이 배지에 보충되었다. 세포는 제조사의 설명서에 따라서 Lipofectamine2000 (Invitrogen, Cat. 11668019) DNA 형질감염 시약을 사용해 형질감염되었다. 인터페론 처리 경우에, 1 nM 재조합 마우스 IFN-β (R&D, Cat. 8234-MB)를 함유하는 배지가 사용되었고, 형질감염 과정 동안 24시간 마다 바꿔주었다. 테트라사이클린 처리 경우에, 표시된 테트라사이클린 농도를 함유하는 배지는 형질감염 후 24시간에 테트라사이클린 무함유 배지를 교체하기 위해서, 그리고 분석 전 48시간 동안 사용되었다.
동물: 야생형 마우스는 Jackson Laboratory (C57BL/6J, 000664)에서 구매하였다. Fezf2-CreER 및 Rosa26- LoxpSSTOLoxp-H2bGFP 마우스는 이전에 설명되었다. Fezf2+ 피질 피라미드 뉴런을 표지하기 위해서, 200 mg/kg 용량의 타목시펜 (T56648, Sigma)은 AAV 주사 전 2일에 복강내 주사를 통해 투여되었다.
ADAR1 녹아웃 세포주 구성체: ADAR1 녹아웃 세포주는 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 통해 생성되었다. gRNA는 pSpCas9 (BB)-2A-puro (pX459) (Addgene, Cat. 62988)에 클로닝되었다. gRNA 서열은 5' GGATACTATTCAAGTCATCTGGG 3' (gRNA1) 및 5' GTTATTTGAGGCATTTGATG 3' (gRNA2)이다.
간략하게, ADAR1 녹아웃 세포는 ADAR1-p110 및 ADAR1-p150 이소폼 둘 모두에 의해 공유되는, 엑손 2를 표적화하는 2개 gRNA를 사용해 생성되었다. HEK293T 세포는 6웰 플레이트에 파종되었고, pX459-gRNA1 및 pX459-gRNA2의 1 ug 플라스미드 혼합물과 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Cat. 11668019)을 사용해 형질감염되었다. 다음 날에, 형질감염 시약을 함유하는 모든 배지를 제거하였고, 푸로마이신 (최종 농도 2 ug/ml)이 보충된 신선한 배지로 교체하였다. 푸로마이신이 존재하는 신선한 배지로 3회 동안 2일마다 기존 배지를 교체하였다. 푸로마이신 선택 후 나머지 세포는 TrypLE (Gibco, Cat. 12605036)를 사용해 수확되었고, 각 웰에 1∼2 세포로 96-웰 플레이트에 분배되었다. 확장된 단일 클론은 웨스턴 블롯을 통해 ADAR1 결핍에 대해 스크리닝되었고, ADAR1 게놈 유전자좌의 파괴는 생어 시퀀싱을 통해 확인하였다.
외생성 또는 내생성 전사물에 대한 CellREADR 효율: 형광 리포터 유전자로 CellREADR 효율을 어세이하기 위해서, HEK293T 세포 또는 HEK293T ADAR1 녹아웃 세포를 먼저 24-웰 플레이트에 파종하였다. 24시간 후에, 세포는 총 1.5 μg 플라스미드로 형질감염되었다. 형질감염 후 48시간에, FACS 분석을 위해 세포를 수집하여 준비하였다. CellREADR 효능은 FACS 데이터로부터 GFP+ 대 GFP+ + XFP+)의 비로서 계산되었다. 일부 대조군 (CAG-tdT 생성된 tdTomato 표적 RNA가 없어서, RFP+ 세포없음) 경우에, CellREADR 효율은 모든 계수된 세포 중에서 GFP+ 세포의 백분율로서 계산되었다.
sesRNA 디자인: 하기 절차가 sesRNA 디자인에 사용된다: 1) sesRNA는 특이적 세포 코딩 또는 비-코딩 RNA 서열에 상보적이고, 즉 안티-센스이다; 2) sesRNA의 최적 길이는 200-300개 뉴클레오티드이다; 3) readrRNA는 연속적인 번역 리딩 프레임으로 배열된 sesRNA 및 efRNA로 이루어진다; 4) 하나 이상의 중지 코돈 (TAG)은 sesRNA 중심 근처에 위치된다 (5'으로부터 ∼80개 내지 220개 사이 범위의 뉴클레오티드); 5) sesRNA의 5'-TGG-3' 서열에 상보적인, 표적 RNA의 5'-CCA-3' 서열을 찾고; 그 다음에 5'-TGG-3'을 5'-TAG-3'으로 치환시켜서, sesRNA가 표적 RNA와 염기 쌍형성될 때 불일치 A-C가 도입된다; 6) sesRNA에 다른 중지 코돈이 없다는 것을 보장하기 위해서, sesRNA의 모든 다른 TAG, TAA, TGA 서열은 각각 GAG, GAA, GGA로 전환된다; 바람직하게 전환된 중지 코돈은 단계 5에서 정의된 TAG 근처가 아니다 (즉, 이로부터 10 bp 초과); 7) 의도하지 않은 번역 개시의 가능성을 배제하기 위해서 단계 5에서 정의된 TAG 이후에 ATG (개시 코돈)가 존재하지 않아야 한다; 8) sesRNA는 엑손, 인트론, UTR 영역, 또는 스플라이싱 이후 성숙한 mRNA를 포함하는, 세포 전사물의 임의 영역에 대해 지정될 수 있다. 9) 복잡한 2차 구조를 갖는 sesRNA를 피한다.
CellREADR에 의한 A-에서-I 편집율: A-에서-I 편집율을 평가하기 위해서, HEK293T 세포는 12-웰 플레이트에 파종되었다. 형질감염 후 48시간에, 세포를 수집하고 RNA를 추출하였다. RNA는 RNeasy Mini 키트 (Qiagen Cat. 74106)를 사용해 정제되었고, PrimeScript™ RT 시약 키트 (Takara, RR037A)를 사용해 cDNA로 전환되었다. 전체 sesRNA 영역을 포괄하는 PCR 생산물은 CloneAmp HiFi PCR Premix (Takara, Cat. No. 639298)를 사용해 생성되었고, 생어 시퀀싱을 위해서 NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up 키트 (Takara, Cat. No. 74061)를 사용해 정제되었다. 편집 효율은 Sanger 피크 높이 G/(A + G)의 비로서 계산되었다.
전사체-와이드 RNA-시퀀싱 분석: readrRNACtrl 또는 readrRNAPCNA, 붉은색 형광 단백질 (tdTomato) 발현 카세트를 갖는 readrRNAEEF1A1-CDS-발현 플라스미드로 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. RFP+ 세포는 형질감염 이후 48시간에 FACS 분류를 통해 농축되었고, RNA는 RNeasy Mini 키트 (Qiagen Cat. 74106)를 사용해 정제되었다. 라이브러리를 제조하기 위해서, RNA 샘플은 TrueSeq Stranded mRNA library Prep 키트 (Illumina, 20020594) 및 TrueSeq RNA Single Indexes (Illumina, 20020492)로 처리되었다. 심층 시퀀싱 분석은 Cold Spring Harbor Laboratory NGS 생물정보학 센터에서 Illumina NextSeq500 플랫폼으로 수행되었다. FastQC는 시퀀싱 품질을 검토하기 위해 RNA-seq 데이터에 적용되었다. 품질 검사를 통과한 모든 샘플은 기준 게놈 (GRCh38-hg38)에 대해서 맵핑되었다. STAR (버전 2.7.2) 및 RSEM (버전 1.3.2) 44 43 42 41을 사용하여 유전자에 주석을 달았다. TPM 값은 RSEM으로부터 계산되었다. 0 판독값 이상인 라이브러리 중 적어도 하나를 갖는 모든 유전자 경우에, 생물학적 복제물 전반의 평균 발현 값은 DESeq232313131을 사용하여, 차등적으로 발현된 유전자를 검출하기 위해 샘플 간에 비교되었다. 조정된 p-값 < 0.01 및 배수 변화 > 2 또는 < 0.5를 갖는 유전자는 유의하게 차등적으로 발현되는 것으로 확인되었다.
웨스턴 블롯: ADAR1에 대한 1차 항체 (Santa Cruz, sc-271854, 1:500), GFP 항체 (mAb Cat. 2956, 1:10000), β-액틴 항체 (β-액틴 (8H10D10) mAb Cat. 3700, 1:10000)가 이 연구에서 사용되었다. 표준 웨스턴 블롯 프로토콜이 적용된다. 간략하게, ∼2 Х 106 세포를 용해시켰고, 동량의 각각의 용해물을 SDS-PAGE에 로딩하였다. 그 다음에, 샘플 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (Bio-Rad Laboratories)으로 옮겼고 ADAR1 또는 GFP에 대한 1차 항체에 이어서, 2차 항체 인큐베이션 (1:10,000) 및 노출에 의해 면역블롯팅하였다.
루시퍼라제 보완 어세이: 형질감염 후 48시간에, 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 발현하는 HEK293T 세포를 PBS에 세척하였고, 분쇄를 통해 수집하고, 96-웰 플레이트로 옮겼다. Promega 루시퍼라제 어세이 시스템 (Promega, E1500)을 사용하였다. 반딧불이 발광은 SpectraMax 다중-모드 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices)를 사용해 측정되었다.
유세포측정 분석: 형질감염 후 2일에, 세포를 TrypLE (Gibco,Cat. 12605036)를 사용해 수확하였고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 분배하고, 500 rpm으로 1분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하였고, 세포를 1% PFA 완충액에 재현탁하고, 4℃에서 밤새 또는 더 긴 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 200 ul의 유세포측정 염색 완충액 (Invitrogen, Cat. 00-4222-26)에 재현탁한 다음에 LSR Fortessa (BD Biosciences)를 사용해 분석하였다. Fortessa는 FACSDIVA (BD Biosciences) 소프트웨어에 의해 작동되었다. 데이터 분석은 FlowJo 10 (FlowJo, LLC)을 사용해 수행되었다. 분류를 위해서, 세포는 1% PFA 처리없이 유세포측정 분석과 동일한 절차가 수행되었고, BD FACSAria (BD Biosciences)를 사용해 처리되었다.
qRT-PCR: RNA는 RNeasy Mini 키트 (Qiagen Cat. 74106)를 사용해 추출 및 정제되었다. RNA는 PrimeScript™ RT 시약 키트 (Takara, RR037A)를 사용해 cDNA로 전환되었다. qRT-PCR은 QuantStudio 6 Flex 실시간 PCR 시스템에서 Taqman 프로브를 사용해 수행되었다. 하우스키핑 유전자 TBP가 정규화에 사용되었다. 유전자 프로브는 Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific EEF1A1: Hs01591985, PCNA: Hs00427214, XIST: Hs00300535, ACTB: Hs03023943)에서 구매하였다. 하우스키핑 유전자 TBP (Thermo Fisher Scientific TBP: Hs00427620)가 정규화에 사용되었다.
면역조직화학: 4주령 내지 10주령 마우스를 마취하였고 (Avertin 사용), 염수에 이어서 0.1 M PBS 완충액 중 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 심장내 관류하였다. 4℃에서 밤새 고정 후에, 뇌를 3회 세정하였고, 50 μm 두께로 Leica 1000s vibratome을 사용해 절단하였다. 10% 정상 염소 혈청 (NGS) 및 0.1% Triton-X100을 PBS1X 중에 함유하는 차단 용액에 절편을 1시간 동안 위치시킨 다음에, 4℃에서 밤새 1차 항체 희석된 차단 용액과 인큐베이션시켰다. 항-GFP (1:1000, Aves, GFP-1020); 항-CTIP2 (1:250, Abcam 18465)를 사용하였다. 절편은 PBS 중에서 3회 세정하였고, 1시간 동안 실온에서 상응하는 2차 항체 (1:500, Life Technologies)와 인큐베이션하였다. 절편은 Fluoromount (Sigma, F4680) 고정 매체를 사용하여 슬라이드에 건조-고정시켰다.
정위 바이러스 주사: 성체 마우스는 일정한 기류 (0.4 L/분)로 전달되는 2% 이소플루오란의 흡입에 의해 마취되었다. 케토프로펜 (5 mg/kg) 및 덱사메타손 (0.5 mg/kg)은 선행 진통제로서, 그리고 뇌 부종을 예방하기 위해서, 각각, 수술 전에, 피하로 투여되었고, 리도카인 (2-4 mg/kg)이 도포되었다. 마우스를 정위 헤드프레임 (Kopf Instruments, 940 series 또는 Leica Biosystems, Angle Two)에 고정시켰다. 정위 좌표를 확인하였다. 두피를 절개하였고, 두개골에 작은 구멍을 뚫어서 뇌 표면을 노출시켰다. 바이러스 현탁액을 함유하는 20-30 μm의 당겨진 유리 페펫 팁을 뇌쪽으로 낮추었고; 500 nl 부피의 단일 또는 혼합 바이러스가 30 nl/분의 속도로 Picospritzer (General Valve Corp)를 사용하여 전달되었고; 피펫은 철회 전에, 역류를 방지하기 위해서 10분 동안 제자리에 남겨졌고, 이후에 절개부를 나일론 봉합사 (Ethilon Nylon Suture, Ethicon Inc. Germany) 또는 Tissueglue (3M Vetbond)를 사용해 봉합하였고, 동물은 완전한 회복까지 가열 패드에서 따뜻하게 유지하였다.
바이러스 생산: 모든 아데노-연관 바이러스 (AAV)는 상업적 벡터 회사 Vigene Inc.에 의해 패키징되었다. hSyn-Adar2-sesRNAFezf2-tTA2, TRE3g-mRuby3, TRE3g-eGFP는 AAV-DJ 혈청형으로서 패키징되었다. hSyn-Adar2-sesRNACtip2-tTA2는 PHP.eb 혈청형으로서 패키징되었다.
현미경 및 이미지 분석: 조직 배양에서 세포 이미지화는 ZEISS Axio Observer (CSHL St. Giles Advanced Microscopy Center)에서 수행되었다. 연속으로 고정된 뇌 절편의 이미지화는 Zeiss LSM 780 또는 710 공초점 현미경 (CSHL St. Giles Advanced Microscopy Center) 및 Nikon Eclipse 90i 형광 현미경에서, 배아 조직 경우에 대물렌즈 X63 및 x5, 및 성체 조직 경우에 x20를 사용하여 수행되었고, 또한 MBF Neurolucida 소프트웨어 (MBF)가 구비된 Zeiss Axioimager M2 시스템에서 x5로 수행되었다.정량화 및 이미지 분석은 Image J/FIJI 소프트웨어를 사용해 수행되었다. 통계학 및 그래프 작성은 GraphPad Prism 9를 사용해 수행되었다.
통계학: 독립 표본 양측 Student t-검정이 그룹 비교에 사용되었다. 통계학적 분석은 Prism 9 (GraphPad Software, Inc.)으로 수행되었다. DESeq2는 전사체-와이드 RNA-seq 데이터의 통계적 유의성을 분석하는데 사용되었다.
본 명세서에서 언급되는 임의의 참조, 공개물, 온라인 리소스, 특허 및/또는 비특허 문헌 그 전체로 본 명세서에 참조로 편입된다.
프로그램가능한 RNA 감지를 통한 세포 유형 접근의 개요
다세포 유기체의 다양한 세포 유형은 게놈이 유기체 표현형을 구성하고 조율하는 필수 중간체이다. 이러한 생물학적 정보 흐름 및 질환에서 이의 변경의 조직적 논리의 해독은 다양한 종에 걸쳐서 세포 유형의 특이적이고 종합적인 분석을 허용하는 방법을 요구한다. 하기 실시예는 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)에 의해 매개되는 RNA 편집을 통해서 구현되는, 바람직한 이펙터 단백질의 번역과 체세포 유형-정의 RNA의 검출을 결합시킨, CellREADR (Cell access through RNA sensing by Endogenous ADAR)을 기술한다. 하기 실시예는 바이러스 벡터에 의해서 전달되었을 때 CellREADR이 인간 및 마우스 세포주, 및 마우스 대뇌 피질의 별개 뉴런 유형에서, 특이적 RNA 서열을 감지하여서 리포터 단백질을 번역시킨다는 것을 입증한다. 이러한 RNA-프로그램가능한 기술은 생물학, 의학 및 생명공학에서 널리 적용성을 가지면서, 특이적이고, 단순하며, 다재다능하고, 기관계 및 종에 걸쳐서 일반적인 방식으로, 동물 세포 유형을 발굴하고, 모니터링하며, 편집하는 잠재성을 강조한다.
실시예 I. 포유동물 세포에서 CellREADR 디자인 및 검증
RNA 편집은 기록, 스플라이싱, 마이크로RNA 표적화, 및 다른 RNA 프로세싱 및 세포 과정에 관여되는 후생동물 유전자 조절 툴키트에 필수적인 광범위하고 강력한 전사후 기전이다 [20,21]. RNA 편집의 가장 우세한 형태는 아데노신-에서-이노신 (A -> I) 전환으로서, ADAR에 의해 촉매되고; 이노신은 세포 기구에 의해 구아노신 (G)으로 인식된다 [21]. ADAR은 염기-쌍형성된 이중 가닥 (ds) RNA의 스트레치에 의해 인식되어 동원되고 [20], 따라서, 서열-가이드된 염기 편집 기구로서 작동될 수 있고 전사체 편집에 활용되어 왔다 [22-26]. ADAR이 동물 세포에 편재하므로 [27], CellREADR은 단일 및 모듈식 readrRNA 분자로서 조정가능하다 (도 5a). readrRNA의 5' 영역은 특이적 세포 유형 RNA에 상보적이고 따라서 서열-특이적 염기 쌍형성을 통해서 특이적 세포 유형 RNA를 검출하는, ∼300개 뉴클레오티드의 센서 도메인을 함유한다. 이러한 센서 도메인은 번역 스위치로서 작용하는 하나 이상의 ADAR-편집가능 중지 코돈을 함유하고; 이 영역은 감지-편집-변환 RNA (sesRNA)라고 한다. sesRNA의 하류에서 중지에 인-프레임으로 자기-절단성 펩티드 2A를 코딩하는 서열이 있고, 이어서 인-프레임으로 다양한 이펙터 단백질을 코딩하는 이펙터 RNA (efRNA) 영역이 후속된다. 전체 readrRNA는 특이적 센서 및 이펙터에 따라서, 수 킬로베이스이고, 따라서 바이러스 벡터 또는 리포솜 나노입자를 통해 세포에 전달가능하다. 표적 RNA를 발현하는 세포에서, sesRNA는 표적과 dsRNA를 형성하고, 이것은 ADAR을 동원하여 편집 복합체를 조립한다. 편집가능 중지 코돈에서, ADAR은 A를 I로 전환시키고, 이것은 표적 RNA에서 반대쪽 C와 쌍형성한다. 이러한 A -> G 치환은 TAG 중지 코돈을 TI(G)G 트립토판 코돈으로 전환시켜서, efRNA의 번역이 켜진다. 인-프레임 번역은 N-말단 펩티드, 2A, 및 C-말단 이펙터를 포함하는 융합 단백질을 생성시키는데, 이후에 이것은 2A를 통해서 자기-절단되어, 기능성 이펙터 단백질을 방출시킨다 (도 5a). readrRNA는 표적 RNA를 발현하지 않는 세포에서는 온전한 채로 남아있는다.
실시예 2. 인간 세포에서 조작성
CellREADR의 원리 증명 형태가 구축되었고, 인간 293T 세포주에서 시험되었다. 발현 벡터 (PGK-tdT)는 외생성 표적 RNA로서 tdTomato 유전자를 발현하고 형질감염된 세포를 표지하는데 사용되었다. 다음으로, TAG 중지 코돈이 내장된 tdT서열에 대한 5' 센서 영역 (sesRNAtdT), 2A 코딩 서열, 및 녹색 형광 (GFP)에 대한 3' 코딩 카세트로 이루어진 readrRNA를 발현하는 READR 벡터 (READRtdT-GFP)를 디자인하였다 (도 10a, b). PGK-tdT와 READRtdT-GFP의 공-형질감염은 tdT+ 세포의 서브세트에서 GFP 발현을 일으켰다 (도 10c, d). 이 결과를 입증하기 위해서, READR 벡터의 GFP 코딩 영역은 테트라사이클린 반응 구성요소 (TRE) 프로모터로부터 반딧불이 루시퍼라제 유전자 (Luc)의 발현을 구동하는, 테트라사이클린 유도성 전사 활성인자 (tTA2)의 것으로 치환되었다 (도 10e). PGK-tdT와 READRtdT-tTA2 및 TRE Luc의 공-형질감염은 빈 벡터 대조군과 비교하여 극적인 발광 유도를 일으켰다 (도 10f). 각각, 희박하고 약한 GFP 또는 루시퍼라제 발현은 READRtdT-GFP 단독 또는 빈 PGK 벡터와 공-형질감염되었을 때 READRtdT-tTA2/TRE Luc에서 관찰되었고 (도 10b-f), 이것은 때때로 sesRNA에서 중지 코돈의 리드-쓰루로 인한 것일 수 있다 [28].
실시예 3. 스페이서
도 11은 본 개시의 일 구현예에 따라서 스페이서 서열이 readrRNA의 누수를 감소시켰다는 것을 보여주는 데이터이다. sesRNA 앞에 대략 600 bp의 인-프레임 스페이서 영역의 포함은 실제로 잔여 GFP 번역을 제거하였다. 확장 데이터 도 11a는 스페이서 서열이 sesRNAtdT 코딩 영역 앞에 삽입된 개략적인 READRtdT-G'P 벡터이다. 도 11b는 각각 tdT 표적 RNA 발현이 존재 (상단) 또는 부재 (하단)하는 다양한 길이의 스페이서를 코딩하는 READRtdT-G'P 벡터로 형질감염된 293T 세포에서 GFP 및 RFP 발현의 대표적인 FACS 분석이다. (도 11a, b); 더 긴 스페이서는 tdT 표적 RNA의 존재 하에서 readrRNA의 효율을 감소시켰고 (도 11c), 이것은 도 11b에 도시된 RFP+ 세포 중에서 GFP+ 세포의 백분율로서 계산된 전환율의 정량화를 보여준다.
실시예 4. 정량화
CellREADR 효율을 보다 정량적으로 특징규명하기 위해서, BFP 코딩 카세트는 READRtdT-GFP에서 sesRNAtdT 영역의 상류에 삽입되었고, 이것은 스페이서로서 뿐만 아니라 CAG-tdT 형질감염된 세포와 함께 모든 READRtdT- GFP 형질감염된 세포를 표지하는 기능을 한다 (도 5b, c). CellREADR 효율은 FACS 분석으로 BFP+ 세포에 대해 게이팅된 RFP+ 세포 중에서 GFP+ 세포의 비로서 계산되었다. tdT 표적 RNA의 부재 하에서, READRtdT-GFP는 누수 leaky GFP 발현을 보이지 않았다. tdT RNA의 존재 하에서, READRtdT-GFP의 효율은 15.2%였고 (Fig 5c, d), 그에 반해 중지 코돈을 함유하는 스크램블 코딩 서열을 갖는 sesRNACtrl을 발현하는 대조군 READR 벡터는 GFP 번역을 보이지 않았다.
실시예 5. CellREADR 효율은 표적 RNA 수준과 상관있다
다음으로, CellREADR 효율이 표적 RNA 수준과 상관있는지 여부를 조사하였다. READRtdT-GFP의 효율은 293T 세포 형질감염에서 CAG-tdT 벡터의 양이 증가함에 따라서 증가되었다 (도 12 a, b). 테트라사이클린 유도성 발현 벡터는 ChETA (광-게이팅된 채널로돕신-2의 변이체) 코딩 서열이 파란색 형광 단백질 단백질 (BFP)에 융합되고, TRE에 의해 구동되어서, BFP 형광 수준이 배양 배지 중 테트라사이클린 농도와 상관있는, Cheta 전사물 수준을 의미하도록 추가로 디자인되었다 (도 5e). 테트라사이클린 농도 및 BFP 발현 수준의 증가는 READRCheta-GFP 효율을 Cheta RNA 의존적 방식으로 증가시켰다 (도 5g 및 도 12c, d). 항상성 프로모터 구동된 BFP-Cheta 발현에 의해서, READRCheta-GFP 효율은 41.5% 만큼 높게 도달하였다 (도 5g 및 도 12 e, f). 이들 결과는 CellREADR의 표적 RNA 수준 의존성 및 견고성을 의미하였다.
실시예 6. CellREADR 기능에서 ADAR 단백질의 역할
CellREADR 기능에서 ADAR 단백질의 역할을 조사하기 위해서, ADAR1 유전자 녹아웃 (KO) 293T 세포주를 CRISPR을 사용해 생성시켰다 (도 14a, b). ADAR1이 고도로 발현되는 반면 ADAR2는 293T 세포에서 거의 발현되지 않으므로, ADAR1KO 293T는 본질적으로 ADAR-무효 세포주를 대표한다. ADAR1 의 제거는 READRtdT-GFP 기능성을 제거하고 (도 5h, i, 도 14c), 이것은 p110 또는 p150 ADAR1 이소폼 (도14d-f)을 비롯하여 ADAR2 단백질 (도 5h, i)의 외생성 발현에 의해 구제되었다. 야생형 세포에서 ADAR2의 과발현은 READRtdT-GFP 효율을 ∼25-30% 까지 증가시켰다 (도 5h, i). 생어 시퀀싱은 TAG 중지 코돈에서 TGG 트립토판 코돈으로 전환되는 의도된 부위에서 A-to-I/G 편집을 확인하였다 (도 5j, k). ADAR 발현이 인터페론 자극에 의해 유도될 수 있으므로 [32, 33], ADAR1-p110 및 ADAR1-p150 ADAR이 야생형 293T 세포에서 인터페론 자극에 의해 유도되었다는 것을 추가로 확인하였고, READRtdT- GFP 효율이 그에 따라 증가되었다는 것을 입증하였다 (도 15).
실시예 7. 광범위 세포에서 CellREADR 기능
293T 세포 이외에도, CellREADR 기능성은 인간 HeLa, 마우스 N2a, 및 마우스 KPC1242 세포주를 포함하여, 상이한 조직 또는 종으로부터 기원하는 몇몇 다른 세포주에서 입증되었다 (확장 데이터 도 16). 종합적으로, 이들 결과는 세포-내생성 ADAR을 이용하여서, CellREADR는 특이적이고, 효율적이며, 강건한 방식으로 이펙터 단백질의 번역을 세포 RNA의 검출과 커플링시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 8. sesRNAs 성질은 CellREADR 프로그램가능성을 부여한다
sesRNA가 CellREADR의 핵심 성분이므로, sesRNAs의 몇몇 성질은 견고한 어세이로서 ADAR2 과발현 READRAdar2-tdT-GFP 벡터를 사용해 적용될 수 있다 (도 6a). 100개 뉴클레오티드 미만의 sesRNA는 대체로 비효율적이지만, 길이가 증가된 sesRNA는 CellREADR 효율과 양의 상관관계가 있는 것으로 확인되었고, 최적 길이는 200-250 nt이다 (도 6a).
실시예 9. 프로그램가능성에서 불일치의 역할
표적 RNA와 서열 불일치의 관점에서, ∼200 nt의 sesRNA는 최대 10개 불일치 (서열 길이의 5%) 또는 READRAdar2-tdT-GFP 효율의 주요한 감소없이 인-프레임 indel을 허용하였고 (도 6b 및 도 17); 이러한 성질은 sesRNA 디자인에 가요성을 부여한다 (방법 참조).
그러나, 편집 부위 근처 불일치는 CellREADR 효율을 유의하게 감소시켰다 (도 17). sesRNAs 디자인에 대한 표적 전사물에 따른 위치의 효과를 조사하기 위해서, EF1a-Cheta-tdT 발현 벡터를 사용하였고, 각각 프로모터, 상이한 코딩 영역, 및 3' UTR을 표적화하는 5개 sesRNA를 시험하였다. 프로모터를 표적화하는 하나를 제외하고, 전사물 영역을 표적화하는 모든 4개 sesRNA는 강건한 효율을 보였다 (도 6c). 마지막으로, 더 많은 중지 코돈의 포함이 sesRNA 엄격성을 더 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하였다 (즉, 표적 RNA의 부재 하에서 기본 번역 감소, 도 5d). 누수 번역의 민감한 지시자로서 루시퍼라제를 사용하여 (도 6d), 2개 중지 코돈을 갖는 sesRNA가 1개 중지 코돈을 갖는 것과 비교하여 비슷한 효율로 누수 감소를 보였지만 (도 6e), 3개 중지 코돈은 효율을 유의하게 감소시켰다 (도 6f). 함께, 이들 결과는 CellREADR의 엄격성, 효율, 및 가요성을 증강시키기 위한 전략을 시사한다.
실시예 10. CellREADR은 고유하게 프로그램가능하다
왓슨-크릭 염기 쌍형성을 기반으로 구축되는, CellREADR은 고유하게 프로그램가능하여서, 보다 특이적인 세포 유형 정의를 위해 둘 이상의 세포 RNA의 교차 표적화를 위한 잠재성을 부여한다. 이러한 성질을 조사하기 위해서, 이중- 또는 삼중- sesRNA 어레이는 동일 전사물의 상이한 영역을 표적화하도록 디자인되었다 (도 6g). 모든 시험된 sesRNA 어레이는 단일 sesRNA의 것과 비슷한, 강건한 CellREADR 효율을 보였다 (도 6h, i).
2개 표적 RNA의 교차 표적화를 위한 가능성을 조사하기 위해서, sesRNA 어레이는 직렬로 배열된 sesRNAtdT 및 sesRNACheta (sesRNAtdT/Cheta)로 이루어진 것이 사용된다 (도 6j). 단일 표적 RNA, tdTomato 또는 Cheta가 readrRNAtdT/Cheta에 의해서 GFP 또는 Luc 발현을 유도하는데 실패한데 반해서, tdTomato 및 Cheta 벡터 둘 모두가 형질감염되었을 때, 유의한 GFP 발현 또는 증가된 발광이 각각 관찰되었다 (도 6k-m). 이러한 결과는 CellREADR의 프로그램가능성을 기반으로 교차 세포 유형 표적화의 잠재성을 입증하였다.
실시예 11. CellREADR에 의한 내생성 RNA 감지
외생성 RNA를 발현하는 합성 유전자와 비교하여, 내생성 유전자는 종종 수많은 엑손, 인트론, 및 조절 구성요소를 포함하여, 보다 복잡한 게놈 구조를 가지며; 전사된 내생성 RNA는 성숙한 mRNA로서 처리되기 전에 스플라이싱 및 화학적 변형과 같은 다수의 정교한 전사후 단계를 겪는다. 세포 내생성 RNA를 표적화하기 위한 CellREADR의 능력을 조사하기 위해서, 293T 세포에서 고도로 발현되는 하우스키핑 유전자인 EEF1A1을 먼저 선택하였고, 이의 다양한 엑손, 인트론, 5' 및 3' UTR, 및 mRNA를 표적화하는 sesRNA의 세트를 체계적으로 디자인하였다 (도 7a, b). 이들 sesRNA는 efRNA 번역을 켜도록 모든 의도하는 EEF1A1 영역을 감지하는데 효과적이었고; 엑손은 UTR 및 인트론에 비해 더 나은 표적이었다. 특히, 2개 엑손으로부터 연결된 mRNA 영역에 상보적인 sesRNA는 엑손 내에 함유된 것과 비슷한 효율을 달성하여서, CellREADR이 mRNA를 비롯하여 프리-mRNA에 작용하였다는 것을 의미한다 (도 7c). EEF1A1 RNA에 대한 CellREADR 효능은 세포 형질감염 이후에 인큐베이션 시간에 따라 증가되었다 (도 18). 몇몇 다른 내생성 RNA는 고도로 발현되는 ACTB, 중간 정도로 발현되는 PCNA, 및 긴 비-코딩 RNA XIST를 포함하는, 293T 세포에서 추가로 시험되었다. 모든 이들 RNA에 대한 강건한 CellREADR 효능 (도 7d)이 관찰되었다. 외생성 ADAR2 과발현은 약 30%까지 CellREADR 효능의 다소 중간정도 증가를 야기하였다 (도 7c, d). 이들 결과는 함께 세포 내생성 ADAR이 세포 내생성 RNA에 대해서 효율적이고 강건한 CellREADR 기능성을 가능하게 한다는 것을 시사한다.
실시예 12. 표적화된 전사물의 수준에 대한 CellREADR의 효과
CellREADR은 정량적 PCR (qPCR)을 통해서 어세이된 표적화된 전사물의 수준을 변경시키지 않았고 (도 7e); 이러한 결과는 또한 readrRNA에 의해 유도된 RNA 간섭의 가능한 효과를 배제하였다. RNA-시퀀싱 분석은 sesRNAEEF1A 또는 sesRNAPCNA 를 발현하는 293T 세포의 전사체 프로파일을 스크램블된 sesRNACtrl의 것과 비교하여서 CellREADR의 전사체 효과를 평가하기 위해 추가로 수행되었다. 상관 분석은 sesRNAEEF1A 또는 sesRNAPCNA 발현이 전반적인 전사체에 유의한 영향을 갖지 않았다는 것을 보여주었고 (도 7f), DESeq2 분석은 sesRNAEEF1A 또는 sesRNAPCNA 및 sesRNACtrl 그룹 간에 유의한 차등적 유전자 발현을 보이지 않아서 (도 20), CellREADR은 세포 전사체에 유의한 효과를 갖지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 13. CellREADR에 의한 추가 내생성 RNA 감지
외생성 RNA를 발현하는 합성 유전자와 비교하여, 내생성 유전자는 종종 수많은 엑손, 인트론, 및 조절 구성요소를 포함한, 보다 복잡한 구조를 갖고; 전사된 내생성 RNA는 성숙한 mRNAs34로 처리되기 전에 스플라이싱 및 화학적 변형과 같은 다수의 정교한 전사후 단계를 겪는다. 세포 내생성 RNA를 검출하기 위한 CellREADR의 능력을 조사하기 위해서, 당업자는 293T 세포에서 고도로 발현되는 하우스키핑 유전자, EEF1A1을 선택할 수 있었고, 이의 다양한 엑손, 인트론, 5' 및 3' UTR, 및 mRNA를 표적화하는 sesRNA의 세트를 체계적으로 디자인하였다 (도 7a, b). 이들 sesRNA는 efRNA 번역을 켜도록 모든 의도된 EEF1A1 영역을 감지하는데 효과적이었고; 엑손은 인트론에 비해 더 나은 표적인 것으로 보였다 (도 7c). 특히, 2개의 스플라이싱된 엑손으로부터 연결된 mRNA 영역에 상보적인 sesRNA는 엑손 내에 함유된 것과 비슷한 효율을 달성하여서, sesRNA가 프리-mRNA 및 mRNA 서열 둘 모두를 표적화하도록 디자인될 수 있다는 것을 의미한다. EEF1A1 RNA에 대한 CellREADR 효능은 세포 형질감염 이후 인큐베이션 시간에 따라 증가되었다 (도 18).
실시예 14. 민감성
표적 RNa 수준에 대한 CellREADR의 민감도를 조사하기 위해서, 몇몇 다른 내생성 RNA가 고도로 발현되는 ACTB, 중간정도로 발현되는 PCNA, 및 긴 비-코딩 RNA XIST를 포함하여, 293T 세포에서 추가로 시험되었다. 당업자는 고수준 (ACTB, PCNA), 중간수준 (TP53, XIST)에서, 저수준 (HER2, ARC)까지의 범위로 발현하는 몇몇 내생성 RNA를 선택할 수 있다. 모든 이들 RNA에 대한 강건한 CellREADR 효능 (도 7d)이 관찰되었다. 외생성 ADAR2 과발현은 약 30% 까지 CellREADR 효능의 다소 중간정도 증가를 일으켰다 (도 7c, d). CellREADR은, 훨씬 낮은 효율이지만, 낮은 수준의 ARC RNA에도 불구하고 신뢰할만하게 검출할 수 있었다. 함께 이들 결과는 세포 내생성 ADAR이 세포 내생성 RNA에 대해서 효율적이고 강건한 CellREADR 기능성을 가능하게 한다는 것을 시사한다.
실시예 1-14의 요약.
CellREADR은 인간 293T 세포에서 리포터 RNA 편집 어세이를 구축하여 인간 및 마우스 세포주에서 시험되었는데, 여기서 표적 RNA가 RFP 발현 벡터로부터 만들어지고, 센서 RNA는 RFP 표적에 안티-센스이고, 제3 벡터에서 GFP 발현을 활성화시키고 증폭시키는, tTA 전사 활성인자가 후속된다. 세포로 형질감염되었을 때, 센서 RNA는 RFP RNA와 쌍형성하고, ADAR가 동원되어서 중지 코돈을 편집하여, GFP를 활성화시키는 tTA의 번역을 켜서, 세포가 붉은색에서 녹색으로 바뀐다. 편집은 또한 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) 어세이로 정량될 수 있는데, 여기서 상단 우측 사분면이 RFP/GFP 양성 세포이다.
이러한 전환은 ADAR1 녹아웃 세포주에서 일어나지 않으므로 ADAR 매개이고, 이후 Adar2 발현에 의해 구제될 수 있다. 생어 시퀀싱은 실제로 중지 코돈을 올리는 의도된 A-I (G) 전환에 기인하는 것임을 입증하였다.
이 시스템은 또한 인간 Hela 세포, 및 마우스 N2a 세포에서, 그리고 세포 내생성 RNA에서도 작용한다. Ef1a 유전자 및 프리-mRNA의 상이한 영역이 표적으로서 사용되었을 때, 엑손 및 코딩 영역이 인트론 및 비번역 영역에 비해서 더 나은 감지 표적인 것으로 확인되었다. 또한, 비-코딩 RNA를 포함하여 5개의 다른 세포 RNA에 대해 작용하였다.
실시예 15. 심근 경색을 치료하기 위한 경계 구역 심근세포 표적화
질환 및 임상적 배경
심근 경색 (MI)은 사망률의 주요 원인 중 하나이다 [1]. 후생유전적 상태 변화는 마우스 경색 후 경계 구역 심근세포에서 물질대사 변환의 근간이 된다. 산소 및 대사산물 공급의 급격한 중단은 급격한 저산소증 반응 및 물질대사 변화를 초래한다. 산소 부족은 산화적 지방산 (FA) 물질대사를 억제하고 혐기성 해당작용을 활성화시켜서 제한된 산소 소비를 감소시킨다. 이러한 급성 단계는 허혈성 영역 중 대체불가한 심근세포 및 다른 세포의 사멸, 면역 반응 및 흉터 형성이 뒤따른다. 경색 구역 (IZ)은 괴사 조직, 침윤성 섬유아세포 및 면역 세포로 이루어지고, 이후에 섬유 조직을 생성하게 된다. 경색 구역으로부터 멀리 떨어진, 원격 심근 (RM)은 허혈에 의해서 영향을 덜 받는다. 중요한 것은, IZ 주위 경계 구역 (BZ)의 심근 세포는 여전이 생존가능하지만, 이웃 경색 구역의 허혈증, 침윤성 면역 세포 및 섬유아세포에 의해서 심각하게 영향받는다 [1]. BZ는 전기생리학적으로 리모델링되고, BZ로부터 기원하는, MI 이후 환자에서 급작스러운 심정지의 일반적인 원인인, 심실빈맥의 기원일 수 있다. 더 나아가서, BZ는 추가적인 허혈성 에피소드에 더 취약할 수 있다 [1]. 그러므로, BZ는 MI에 대한 고도로 전략적이고 효과적인 치료 표적을 의미할 수 있다. 그러나, 현재 요법들은 BZ를 특이적으로 표적화할 수 없다.
표적 세포
BZ는 내피 세포, 증가된 수의 섬유아세포, 침윤성 면역 세포, 및 소수의 심근세포를 포함하여, 몇몇 상이한 세포-유형으로 구성된다 [1]. 모든 이들 세포 유형은 손상-반응성 유전자 프로그램을 유도하거나 또는 억제하여서 손상에 반응한다. BZ 심근세포는 그들 근섬유분절을 탈조립하고, 그들 근소포체를 분해하여, 글리코겐을 축적하는 등 탈분화 과정을 겪는 것으로 보이고; 그들은 비대성이 되고 이웃 심근세포 및 세포외 매트릭스와 상호작용 및 연결성의 감소를 보인다 [1,2]. 중요한 것은, BZ 심근세포는 특히 손상 후 심장 재생에 연루되었고, BZ에서 활성화된 세포 과정은 심근 경색 후 회복에 필요하다 [1,2]. 그러므로, BZ 심근세포는 MI에서 핵심 질환 세포 유형을 의미하고, 아마도 매우 효과적인 치료 표적일 수 있다. 그러므로, 현재 치료 접근법은 질환 BZ 심근세포의 특이성을 획득할 수 없다.
표적 유전자
허혈 손상된 심실벽의 BZ는 RM과 구별되는 전사적으로 분리된 구획이다 [1,2]. 단일 세포 전사체 및 후생유전체 분석은 MI 이후 BZ 심근세포에서 유전자 발현 프로파일 및 프로그램의 실질적인 변경을 입증하였다. 이들 변경은 MEF2-구동된 항상성 계통-특이적에서 AP-1-구동된 손상-유도 유전자 발현 프로그램으로의 변환에 의한다. 이러한 프로그램은 마우스와 인간 사이에서 보존된다 [1,2]. BZ 심근세포에서 하향조절된 유전자는 지방산 물질대사, 산화적 인산화 및 미토콘드리아 기능에 관여되는 것들을 포함한다 [1,2]. 특히, BZ 심근세포는 sparc, MYH7, ANKRD1, DES, UCHL1, JUN, 및 FOXP1을 포함하여, 마우스와 인간 사이에 보존된 마커 유전자의 세트에 의해 식별될 수 있다 [2]. 이들 잘 특징규명된 마커 및 유전자 발현 변화는 BZ 심근세포를 표적화하여서 MI의 치료를 위한 세포 유형 특이적 접근법으로서 CellREADR 기술을 활용하기 위한 기반을 제공한다. NPPB, MYH7은 BZ 심근세포를 표적화하기 위한 마커로서 선택되었다. 도 22a는 인간 NPPB RNA의 엑손 및 인트론에 대한 우리의 7개 RNA 센서의 디자인을 예시한다. 이들 중에서, 3개 센서는 인간 NPPB RNA를 발현하는 발현 벡터로 형질감염된 인간 HEK297 세포에서 유의한 특이성 및 효율을 보였다 (도 22b). 이들 센서는 iPS-유래 인간 심근세포에서 시험되어서, 심장 발달에서 처럼 상승된 NPPB 발현을 보인다.
이펙터 발현
심장 재생은 심근 경색에 대한 그럴듯한 치료적 접근법이고 심근세포 (CM)가 가능하기 위해 다수 세포 유형을 요구한다 [3,4]. 발달 심장에서, 심장 내피 세포 (CEC) 및 CM은 순환 CEC가 CM 증식을 촉진하도록 유도적 미세환경을 확립하는, 근혈관 성장 니쉐 내에서 시공간적으로 커플링된다. 이러한 커플링된 근혈관 확장은 VEGF-VEGFR2 신호전달에 의존적인데, 여기서 CM-유래 VEGFA는 국소 혈관 확장을 자극하여서, 혈관분비 (예를 들어, Igf2, reelin)를 통해 CM 증식을 인도한다 [4]. MI 이후에, 적절한 근혈관 성장 니쉐는 파괴되고, CEC 순환은 경계 구역에서 순환 CM 주변에 농축되지 않는다. 근혈관 커플링 복구는 재생 능력을 강화시킬 수 있다. 마스터 안지오카인 VEGFa의 외생성 과발현을 통해 증가된 CED 밀도는 CM 증식을 증강시키고 MI 후 흉터를 감소시키며, 둘 모두 강화의 징후이다 [3,4].
따라서, VEGF의 정확한 부위는 아마도 심장 재생 및 치료제에 핵심적인 듯 하다. 몇몇 임상 시험은 더 새로운 전달 방법 예컨대 변형된 RNA, 더 새로운 세대 바이러스 벡터 및 보다 효율적인 플라스미드 전달 시스템의 사용을 포함하여, 인간 심혈관 질환을 치료하기 위해 외생성 VEGFA를 사용한다 (NCT03409627, NCT03370887 및 NCT04125732) [5]. 그러나, VEGFA의 광범위한 과발현 및 오발현은 실제로 재생을 손상시키고, 손상 부위로부터 멀리 떨어져서 심장 성장이 발생된다 [3]. 대조적으로, 경계 구역에서 VEGFA의 표적화된 과발현은 신생 마우스에서 재생을 개선시킨다 [4]. 변형된 VEGFA mRNA가 손상 부위를 향해 직접 주사될 수 있지만 [5], 시술은 개방 심장 우회 수술을 필요로 하고, 이것은 많은 환자들이 견딜 수 없다.
CellREADR은 덜침습적이거나 또는 침습적이지 않은 접근법을 사용하여 BZ의 CM에서 특이적으로 VEGFA 과발현을 가능하게 한다. VEGFA 단백질 번역이 BZ의 심근세포에서 Nppb mRNA의 검출에 조건적인 CellREADR 벡터를 생성시켰다 (도 22C). 이 벡터, PCAG-sesRNANppb-VEGFA에서, 편재성 프로모터 (PCAG)는 5' Nppb mRNA 센서 (sesRNANppb) 및 3' VEGFA 코딩 영역으로 이루어진 모듈식 RNA를 전사한다. VEGFA 번역은 sesRNANppb 가 BZ 심근세포에서 세포 Nppb mRNA와 혼성화할 때만 개시된다.
한 접근법에서, 이러한 벡터는 아데노-연관 바이러스 AAV9 혈청형에 패키징되고, 이것은 심장 조직에 대한 강력한 향성을 보인다 [6] (BZ CM은 아님). AAV9-PCAG-sesRNANppb-VEGFA는 정맥내 주사를 통해 전달되고, 심장 조직을 우선적으로 감염시키지만, IZ, RZ, 및 BZ 심근세포에 대해서는 무차별적이다. 그러나, Nppb mRNA를 발현하는 심근세포만이 VEGFA 단백질의 번역을 촉발시킬 수 있다.
다른 접근법에서, sesRNANppb-VEGFA RNA는 시험관내 전사를 통해 생성되어서, 적절한 지질 나노입자 (LNP) 또는 바이러스-유사 입자 (VLP)에 패키징된다. 이들 LNP 또는 VLP는 정맥내 주사를 통해 전달되어서, 광범위하게 심장 조직 세포로 들어간다. 그러나, 오직 BZ 심근세포만이 상기 기술된 바와 같이 VEGFA 단백질의 번역을 촉발시킬 수 있다.
BZ 심근세포에서 VEGFA의 특이적 과발현은 CEC 및 적절한 근혈관 성장 니쉐에 대한 국소 커플링을 복원시켜, MI를 복구하도록 심근세포의 기능성 재생을 자극한다.
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실시예 16. 암에서 CellREADR 요법
실시예 16(a). 교모세포종 고형 종양 에서 CellREADR 요법
교모세포종 (GBM)은 성인에서 가장 일반적인 악성 뇌 종양이다 [1]. 수십년 동안, GBM에 대한 치료 양식은 화학요법과 방사선의 병용을 수반하는데, 이것이 때때로 종양 성장을 둔화시키는데 도움이 되지만, 질환이 거의 항상 재발되고 치명적인 것으로 증명되었다. 수십년 동안 GBM으로 진단받은 환자의 생존은 유의하게 개선되지 않았고, 교모세포종 환자의 단지 5%만이 5-년 생존율을 갖는다 [2]. 불행하게도, 수술 시 교모세포종의 재발율은 매우 높다. 전통적인 치료이외에도, 몇가지 새로운 치료법이 유망해 보인다. 한 접근법은 특이적 항종양 효과를 실행하도록 표적 세포에 바이러스 (예를 들어, AAV) 또는 비-바이러스 전달 (예를 들어, 지질 나노입자 (LNP))로 치료적 분자를 전달하기 위해 유전자 요법을 사용하는 것이다. 다른 접근법은 암 세포-특이적 바이러스 복제로 인해 종양 세포를 사멸시키도록 종양용해성 바이러스를 사용한 바이러스-면역요법의 구현이다. 신경교종에 효과적인 요법의 개발에서 가장 도전적인 측면 중 하나는 정상 세포에 최소 효과로 GBM 세포를 정확하게 표적화하는 치료제의 능력이다 [3-5].
최근 수년간, GBM의 단일 세포 RNA 시퀀싱 연구는 이러한 악명높은 질환에 대한 우리의 지식을 상당히 진보시켰다. RNA 생물마커, 체세포 돌연변이, 및 전사 프로파일이 확인되어 특징규명되어서, 분자 및 세포 분해능에서 GBM의 전례없는 정확하고 종합적인 정보를 제공한다 [6-10]. 그러나, 이들 RNA 서명은 일반적으로 단지 특이적 아형을 분류하거나, 또는 치료의 결과를 예측하기 위한 진단 및 예후 생물마커로서만 사용된다. 잠재적으로 새롭고 보다 효과적인 치료 전략을 개발하기 위해서, 이들 가치있는 데이터세트, 특히 RNA 생물마커를 활용하는 것이 필수적이다.
GBM에 대한 CellREADR-기반 치료는 정확한 GBM 표적화 및 절제를 위해서 sesRNA를 efRNA와 연결시킨다. sesRNA는 GBM 종양 세포에서 특이적으로 및/또는 고도로 발현되는 RNA에 대한 이의 상보성을 기반으로 선택된다. CellREADR-부여된 치료적 접근법은 고도로 발현되거나 또는 세포-특이적 RNA 생물마커(들)을 검출하여서 GBM 세포를 특이적으로 인식하도록 RNA 센서를 구현시키고, 이후 암 세포를 사멸시키거나 또는 세포 사멸을 유도하는 단백질을 코딩하는 efRNA의 번역을 촉발시킨다.
GBM 세포를 표적화하는 RNA 센서. GBM 종양 세포에서 고도로 발현되는 RNA는 당분야에 공지되어 있고 [refs. 6-15], 이의 예는 SPARC 유전자로부터 발현되는 RNA 및 VIM 유전자로부터 발현되는 RNA를 포함한다 [12]. GBM 세포에 특이적인 RNA 센서는 다음을 포함한다: CCA 하위서열을 함유하는 SPARC 유전자로부터 발현되는 RNA에 상보적인 ∼200 뉴클레오티드 또는 CCA 하위서열을 함유하는 VIM 유전자로부터 발현되는 RNA에 상보적인 ∼200 뉴클레오티드.
종양유전자 감지 및 세포 사멸의 유도
HEK293T 세포에서 HER2 표적 RNA를 검출하기 위해 CellREADR 사용. 2개 센서를 디자인하였다.
(C) CellREADR-매개 및 표적 RNA-의존적 세포 사멸 유도를 위한 벡터 디자인 (상단). CAG 프로모터는 BFP에 이어서 세포 사멸을 유도하기 위한 이펙터로서 sesRNAtdT (tdT에 대한 센서) 및 taCasp3-TEVp (활성화된 캐스파제3)를 코딩하는 서열의 발현을 구동시킨다. 하단. 발광으로 측정된 세포 아폽토시스 수준은 CellREADR 벡터 및 표적 RNA로 형질감염된 세포에서 증가되었다. 데이터는 예로서 293T 세포에서 HER2 종양유전자를 표적화하는 센서 RNA를 보여준다 (도 23B). CellREADR의 프로그램가능성을 이용하여, 2개 RNA 마커의 교차 표적화를 위한 센서가 또한 더 높은 특이성을 획득하는데 사용될 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다 [16]. 특히, 센서는 또한 특이적 세포 유형의 존재를 확인하거나, 또는 동물 모델에서 GBM의 진행을 모니터링하기 위한 진단 목적에 사용될 수 있다.
efRNA는 종양 근절에 효과적인 단백질, 예를 들어, 1) "자살" 단백질 예컨대 티미딘 키나제 또는 시토신 데아미나제, (2) 세포 사멸 유도 단백질 예컨대 캐스파제3, 캐스파제9, Bcl, 또는 GSDM [17, 18], (3) 종양 억제인자 단백질 예컨대 Rb, PTEN, 및 (4) 항종양 면역력을 증가시키는 단백질, 예컨대 인터페론 β를 코딩할 수 있다 [19]. 우리의 데이터는 원칙적으로, 항상적 활성 캐스파제3 (ta-Casp3)가 SES를 표적화하고, 항상적 활성 캐스파제3이 표적 RNA가 존재하는 경우에 작동적으로 연결된 암 특이적 RNA의 존재 하에서 24시간 이내에 효율적으로 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것을 의미한다 (도 23C의 tdTom RNA로서 예시).
CellREADR은 DNA 또는 RNA 벡터를 사용해 전달된다 [20]. 데이터는 설치류, 원숭이 및 인간에서 AAV에 의한 효율적인 뉴런 시스템 형질도입을 입증하였다 (인간 샘플 경우 도 23D). 또한, 전달은 바이러스 벡터 (아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스, 또는 캡시드 조작된 AAV 유래), LNP, 및 VLP (바이러스-유사 입자)를 사용해 수행될 수 있다.
GL 참조문헌
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실시예 16(b). 췌장암 고형 종양 에서 CellREADR 요법
질환 및 임상적 배경
일반적으로 췌장암으로 알려진, 췌장관 선암종 (PDAC)은 서구 세계에서 암관련 사망의 4번째 주요 원인이다1. PDAC의 5년 상대적 생존률은 단지 11%이다2. PDAC의 발생률은 매년 상승되는 경향을 보이지만, 느린 진단, 조기 전이, 및 화학요법 또는 방사선요법에 대한 제한된 반응때문에 사망률이 유의하게 감소되지는 않고 있다1. 지난 십년간, 면역 체크포인트 차단 (ICB) 요법은 유망한 암 치료가 되었지만, PDAC는 ICB 요법 (예를 들어, 항-PD-1 차단) 단독에 대한 객관적 반응이 없다3. ICB에 대한 PDAC의 내성의 핵심 성분은 이의 획득 면역 특권인데, 면역억제성 미세환경, 불충분한 T 세포 침윤, 및 낮은 돌연변이 부담으로 인해 발생된다3. PDAC에 대한 면역요법을 포함하여 새로운 치료의 개발이 시급하게 요구된다.
표적 세포
췌장관 암세포가 우리의 표적 세포이다.
표적 유전자
이 실시예에서, 췌장관 암 세포에서 우세한 RNA를 생산하는 2개 유전자 세트가 확인된다. 제1 유전자 세트는 정상 췌장관 세포와 비교하여 암 세포에서 상향조절된다 (예를 들어, AGR2 및 GCNT3)4. AGR2 (Anterior Gradient 2, 단백질 디술피드 이소머라제 패밀리 구성원)는 단백질 폴딩 및 티올-디술피드 상호교환 반응을 촉매하는 소포체 (ER) 단백질의 디술피드 이소머라제 (PDI) 패밀리 구성원을 코딩하는 유전자이다. 코딩된 단백질은 N-말단 ER-신호 서열, 촉매적 활성 티오레독신 도메인, 및 C-말단 ER-체류 서열을 갖는다. 이 단백질은 세포 이동, 세포 형질전환 및 전이에서 역할을 하고, p53 억제인자이다. ER-국재화된 분자 샤페론으로서, 이것은 시스테인-풍부 경막 수용체 및 시스테인-풍부 장 당단백질 뮤신의 폴딩, 수송, 및 조립에서 역할을 한다. 이 유전자는 염증성 장 질환 및 암 진행에 연루되어 있다. GCNT3 (글루코사미닐 (N-아세틸) 트랜스퍼라제 3, 뮤신형)은 단백질 코딩 유전자이다. 코딩된 단백질은 뮤신-형 당단백질의 코어 2 및 코어 4 O-글리칸의 형성을 촉매하는 베타-6-N-아세틸글루코사민-트랜스퍼라제이다. 이러한 유전자 세트는 악성 췌장관 세포와 정상 췌장관 세포를 구별할 수 있지만, 이들 중 일부는 또한 다른 몇몇 정상 조직의 일정 세포 유형에서도 발현된다.
유전자의 제2 세트는 일반적으로 관 세포에 의해 특이적으로 발현된다 (예를 들어, PDX1, CFTR, 및 AQP1). PDX1 유전자 (췌장 및 십이지장 호메오박스 1)에 의해 코딩되는 단백질은 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나제, 섬 아밀로이드 폴리펩티드, 및 글루코스 수송체 2형을 포함한, 몇몇 유전자의 전사 활성인자이다. 코딩된 핵 단백질은 췌장의 초기 발달에 관여되고, 인슐린 유전자 발현의 글루코스-의존적 조절에서 주요한 역할을 한다. CFTR 유전자 (CF 경막 컨덕턴스 조절인자)는 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체 수퍼패밀리 구성원을 코딩한다. 코딩되는 단백질은 클로라이드 채널로서 기능하여서, 이 단백질 패밀리의 구성원 중에서 고유하게 만들고, 상피 세포에서 이온 및 물 분비 및 흡수를 제어한다. AQP1 유전자 (아쿠아포린 1 (콜튼 혈액 그룹))은 물 채널 단백질로서 기능하는 6개 이중층 포괄 도메인을 갖는 작은 통합 막 단백질을 코딩한다. 이 단백질은 삼투압 구배를 따라서 물의 수동적 수송을 허용한다. 이 유전자는 안구액 이동의 불균형이 관여되는 장애에 대한 가능한 후보이다. 유전자 PDX1, CFTR, 및 AQP1의 세트는 췌장관 세포에 매우 특이적이지만, 악성 및 정상 췌장관 세포 둘 모두에서 발현된다.
그러므로, sesRNA은 2개 표적 RNA를 교차 표적화하는데 적용되고, 그 각각의 세트는 더 높은 특이성을 획득하기 위해 적용될 수 있다 (Refs. 6-8). 각 유전자에 의해 코딩되는 mRNA에 상보적인 sesRNA는 PDAC 세포주에서 시험된다 (예를 들어, KPC1242, PANC-1). 다른 sesRNA는 또한 환자의 종양 전사 프로파일을 사용하여 소정 환자의 종양에서 발현되는 암 세포 특이적 RNA를 표적화하는데 사용될 수 있다.
PDAC CellREADR efRNAs
이 실시예에서, 2개 상이한 전략이 CellREADR 시스템을 사용해 PDAC를 치료하기 위해 기재된다.
전략 1) 암 세포 사멸 또는 암 세포 증식 억제의 직접 유도. 이러한 목적을 위해서, efRNA는 하나 이상의 세포 사멸 유도 유전자 (예를 들어, CASP3, DFNA5, GZMB, GZMA) 및 종양 억제 유전자 (예를 들어, TP53 및 CDKN2A)를 기반으로 한다. 캐스파제 3 (CASP3) 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세포 아폽토시스의 실행 단계에서 핵심 역할을 하는 시스테인-아스파르트산 프로테아제이다. 상염색체 우성 난청, 5 (DFNA5) 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 신규한 아폽토시스-유도 단백질이다. 아폽토시스 동안 캐스파제-3에 의한 DFNA5의 절단은 2차 괴사/파이롭토시스 세포 사멸로의 진행을 매개한다. 그랜자임 B (GZMB) 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세린 프로테아제의 펩티다제 S1 패밀리의 일부인, 단백질의 그랜자임 수퍼패밀리 구성원이다. 코딩되는 프리프로단백질은 자연 살해 (NK) 세포 및 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해 분비되어서 단백질가수분해적으로 처리되어 활성 프로테아제를 생성시키고, 표적 세포 아폽토시스를 유도한다. 그랜자임 A (GZMA) 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세포독성 T-세포 및 NK-세포의 시토졸 과립 중에 풍부한 프로테아제로서 가스더민-B (GSDMB)의 절단을 촉매하여 면역학적 시냅스를 통해 표적 세포로 전달되었을 때 캐스파제-독립적 파이롭토시스를 활성화시키는데, GSDMB의 포어-형성 모이어티를 방출하여서, 파이롭토시스 및 표적 세포 사멸을 촉발시킨다1. 종양 단백질 P53 (TP53) 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 전사 활성화, DNA 결합, 및 올리고머화 도메인을 함유하는 종양 억제인자 단백질이다. 코딩되는 단백질은 다양한 세포 스트레스에 반응하여 표적 유전자의 발현을 조절하여서, 세포 주기 정지, 아폽토시스, 노화, DNA 복구, 또는 물질대사 변화를 유도한다2.
1https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TP53&keywords=TP53
2https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TP53
이중-센서 어레이의 각 sesRNA가 편집가능 중지를 포함하고, 이펙터 RNA는 세포 사멸 유도 유전자인, 이중-센서 READR PDX1 / PANC -1- CASP3 을 사용한 2개 표적 RNA (예를 들어, PDX1 및 PANC-1)를 발현하는 세포의 교차 표적화를 위한 계획. 2개 중지 코돈이 편집되는, 양쪽 표적 RNA의 존재 하에서만, 세포 사멸 유도 유전자가 발현될 수 있다.
특히, sesRNA 센서의 효율 및 세포 사멸 유도 유전자의 발현 수준에 의한 제한으로, 한번에 모든 암 세포를 사멸시키는 것이 어려울 수 있다. 더 나아가서, 종양내 불균질성때문에5,6, 암 세포의 하위개체군은 선택된 표적 유전자를 발현하지 않을 수 있고, 따라서 사멸을 피할 수 있다. 결국, 탈출한 암 세포가 과성장되어서 암의 재발을 초래하게 된다. 이러한 한계를 극복하기 위해서, 면역계는 또한 제2 전략으로 PDAC를 치료하는데 사용될 수 있다.
전략 2) 면역요법을 해제하기 위해 종양 미세환경의 변형. 이러한 목적을 위해서, 프로-면역 유전자 (예를 들어, IFNB, IFNG, TNFA, IL2, IL12, IL15, CD40L) 및 케모카인 유전자 (예를 들어, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL16)가 efRNA로서 사용된다. 이 전략에서, 표적화된 암 세포는 직접적으로 사멸되지 않지만, 사이토카인 및 케모카인을 발현하여 분비하여서 면역억제 미세환경을 프로-면역 미세환경으로 변화시킨다. 케모카인은 종양 니쉐를 침윤하도록 항종양 면역 세포 (예를 들어, T 세포, DC, iNKT 세포)를 유인하고, 사이토카인은 침윤된 면역 세포의 항-종양 반응을 증강시킨다. 침윤된 T 세포는 CellREADR 표적화 암 세포뿐만 아니라, 비표적화 암 세포도 사멸시켜서 상기 언급된 직접 사멸의 한계를 극복한다. 또한, 면역 체크포인트 억제인자 (ICB) 약물 (예를 들어, 항-PD1, 항-CTLA4)은 항-종양 반응을 강화시키도록 병용하여 사용될 수 있다.
당업자는 양쪽 전략이 항-종양 효율을 더 강화시키기 위해 적용될 수 있다는 것을 이해하게 된다.
CellREADR 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은, DNA 또는 RNA 벡터에 의해 전달될 수 있다.
당업자는 소정 유형의 암에서 우선적으로 또는 고유하게 발현되는 RNA를 확인하여서, CellREADR를 소정 고형 종양 유형에 적용할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
참조문헌:
1. Zeng S, Potler M, Lan B, Grozmann R, Pilarsky C, Yang H. Chemoresistance in Pancreatic Cancer. Int J Mol Sci. 2019 Sep 11;20(18):4504. doi: 10.3390/ijms20184504.
2. Park W, Chawla A, O'Reilly EM. Pancreatic Cancer:　A Review.　JAMA.　2021;326(9):851-862. doi:10.1001/jama.2021.13027.
3. Morrison AH, Byrne KT, Vonderheide RH. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends Cancer. 2018 Jun;4(6):418-428. doi: 10.1016/j.trecan.2018.04.001.　
4. Sylvia　F. Boj, Chang-Il Hwang, Lindsey　A. Baker, Iok　In　Christine Chio, Dannielle　D. Engle, et al., Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer, Cell, Volume 160, Issues 1-2, 2015, Pages 324-338, ISSN 0092-8674. doi.org/10.1016/j.cell.2014.12.021.
5. Fisher R, Pusztai L, Swanton C. Cancer heterogeneity: implications for targeted therapeutics. Br J Cancer. 2013 Feb 19;108(3):479-85. doi: 10.1038/bjc.2012.581.　
6. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.　Nat Rev Clin Oncol　15, 81-94 (2018). doi: 10.1038/nrclinonc.2017.166.
실시예 16(c) B-세포 만성 림프구성 백혈병에서 CellREADR 요법
질환 및 임상적 배경
B-세포 만성 림프구성 백혈병 백혈병 (CLL)은 서구 세계에서 백혈병의 가장 흔한 원인이고, 매년 새로운 백혈병 사례의 1/3을 차지한다.
표적 세포
B-세포 만성 림프구성 백혈병 세포가 표적 세포이다.
표적 유전자
RRAS2　mRNA는 분석된 인간 CLL 샘플 중에서 이의 야생형 형태로 과발현되는 것으로 확인되어서, CellREADR에 의해 표적화될 수 있다 [1-2].
CLL CellREADR efRNA
이 실시예에서, 2개 상이한 전략이 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 CellREADR 시스템을 사용하여 B-세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 치료하기 위해 기재된다.
간략하게, 전략 1) 암 세포 사멸 또는 암 세포 증식 억제의 직접 유도. 이러한 목적을 위해서, efRNA는 readrRNA 분자의 SES에 직접적으로 연결되거나 또는 readrRNA에 의해 코딩되는 트랜스활성인자 이펙터에 의해서 readrRNA 분자의 SES에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 세포 사멸 유도 유전자 (예를 들어, CASP3, DFNA5, GZMB, GZMA, GSDMs) 및 종양 억제 유전자 (예를 들어, TP53 및 CDKN2A)를 기반으로 한다.
전략 2) 면역요법을 해제하도록 종양 미세환경의 변형. 이러한 목적을 위해서, 프로-면역 유전자 (예를 들어, IFNB, IFNG, TNFA, IL2, IL12, IL15, CD40L) 및 케모카인 유전자 (예를 들어, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL16)가 efRNA로서 사용된다. 또한, 면역 체크포인트 억제인자 (ICB) 약물 (예를 들어, 항-PD1, 항-CTLA4)이 항-종양 반응을 강화시키기 위해 병용하여 사용될 수 있다.
당업자는 양쪽 전략이 항-종양 효율을 더 강화시키기 위해 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
CellREADR 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, DNA 또는 RNA 벡터에 의해 전달될 수 있다.
참조문헌:
1. Hortal, Alejandro M., et al. "Overexpression of wild type RRAS2, without oncogenic mutations, drives chronic lymphocytic leukemia."　Molecular cancer　21.1 (2022): 1-24.
실시예 16(d). 신장 세포 암종에서 CellREADR 요법
질환 및 임상적 배경
신장 세포 암종 (RCC)은 1차 소변을 수송하는 신장의 매우 작은 관의 일부인, 근위 곡세뇨관의 내벽에서 기원하는 신장암이다. RCC는 성인에서 가장 흔한 유형의 신장암으로서, 사례의 대략 90-95%를 차지한다. RCC 발생은 1.5:1의 비로 여성보다 남성에서 우세하게 나타난다. RCC은 가장 흔하게 60대에서 70대 사이에 발생된다.
표적 세포
신장 세포 암종 세포가 표적 세포이다.
표적 유전자
SLC6A3　mRNA는 분석된 인간 신장 세포 암종 샘플에서 이의 야생형 형태로 과발현되는 것으로 확인되어서2, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 CellREADR 시스템에 의해 표적화될 수 있다 [1].
CLL CellREADR efRNA
이 실시예에서, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 CellREADR 시스템을 사용하여 신장 세포 암종을 치료하기 위해 2개의 상이한 전략이 기재된다.
간략하게, 전략 1) 암 세포 사멸 또는 암 세포 증식 억제의 직접 유도. 이러한 목적을 위해서, efRNA는 readrRNA 분자의 SES에 직접적으로 연결되거나 또는 readrRNA에 의해 코딩되는 트랜스활성인자 이펙터에 의해서 readrRNA 분자의 SES에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 세포 사멸 유도 유전자 (예를 들어, CASP3, DFNA5, GZMB, GZMA, GSDMs) 및 종양 억제 유전자 (예를 들어, TP53 및 CDKN2A)를 기반으로 한다.
전략 2) 면역요법을 해제하도록 종양 미세환경의 변형. 이러한 목적을 위해서, 프로-면역 유전자 (예를 들어, IFNB, IFNG, TNFA, IL2, IL12, IL15, CD40L) 및 케모카인 유전자 (예를 들어, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL16)가 efRNA로서 사용된다. 또한, 면역 체크포인트 억제인자 (ICB) 약물 (예를 들어, 항-PD1, 항-CTLA4)이 항-종양 반응을 강화시키기 위해 병용하여 사용될 수 있다.
당업자는 양쪽 전략이 항-종양 효율을 더 강화시키기 위해 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
CellREADR 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, DNA 또는 RNA 벡터에 의해 전달될 수 있다.
참조문헌:
1. Hansson, Jennifer, et al. "Overexpression of Functional SLC6A3 in Clear Cell Renal Cell CarcinomaSLC6A3 in Clear Cell Renal Cell Carcinoma."　Clinical Cancer Research　23.8 (2017): 2105-2115.
실시예 16(e). 난소암에서 CellREADR 요법
질환 배경
난소암은 여성에서 가장 치명적인 부인과 악성종양으로서, 2014년도 미국에서만 21,290명이 신규 사례로 추정되었고, 14,180명이 사망한 것으로 추정된다.
표적 세포
난소 암 세포가 표적 세포이다.
표적 유전자
CLDN3, CLDN4, 또는 HER2 mRNA는 분석된 인간 난소암에서 과발현되는 것으로 확인되어서3, CellREADR에 의해 표적화될 수 있다 [1].
CLL CellREADR efRNA
이 실시예에서, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 CellREADR 시스템을 사용하여 난소암을 치료하기 위해 2개의 상이한 전략이 기재된다.
간략하게, 전략 1) 암 세포 사멸 또는 암 세포 증식 억제의 직접 유도. 이러한 목적을 위해서, efRNA는 readrRNA 분자의 SES에 직접적으로 연결되거나 또는 readrRNA에 의해 코딩되는 트랜스활성인자 이펙터에 의해서 readrRNA 분자의 SES에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 세포 사멸 유도 유전자 (예를 들어, CASP3, DFNA5, GZMB, GZMA, GSDM) 및 종양 억제 유전자 (예를 들어, TP53 및 CDKN2A)를 기반으로 한다.
전략 2) 면역요법을 해제하도록 종양 미세환경의 변형. 이러한 목적을 위해서, 프로-면역 유전자 (예를 들어, IFNB, IFNG, TNFA, IL2, IL12, IL15, CD40L) 및 케모카인 유전자 (예를 들어, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL16)가 efRNA로서 사용된다. 또한, 면역 체크포인트 억제인자 (ICB) 약물 (예를 들어, 항-PD1, 항-CTLA4)이 항-종양 반응을 강화시키기 위해 병용하여 사용될 수 있다.
당업자는 양쪽 전략이 항-종양 효율을 더 강화시키기 위해 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
CellREADR 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, DNA 또는 RNA 벡터에 의해 전달될 수 있다.
참조문헌:
1. Honda, Hiroshi, et al. "Regulation of the CLDN3 gene in ovarian cancer cells."　Cancer biology & therapy　6.11 (2007): 1733-1742.
실시예 16(f). 소세포 폐암에서 CellREADR 요법
질환 및 임상적 배경
소세포 폐암 (SCLC)은 빠른 세포 성장, 조기 전이성 확산, 및 표적-기반 요법의 완전한 결여와 연관된다. 결론적으로, 화학요법, 방사선요법, 및 수술에 의한 현재 SCLC의 치료는 6%의 암울한 5년 생존률과 연관있다. SCLC 종양의 종합적인 게놈 시퀀싱은 이 질환에서 높은 돌연변이 부하를 밝혀주었는데, 대부분의 종양이 종양 억제인자RB1　및　TP53　의 불활성화 돌연변이 또는 결실을 보유하였지만 이용가능한 종양유전자 표적은 거의 없었다.
표적 세포
SCLC 암 세포가 표적 세포이다.
표적 유전자
이 실시예에서, 대부분의 SCLC 종양은 POU2F3, ASCL1, 또는 NEUROD1의 발현을 기반으로 3개 계통 중 하나로 분류될 수 있다. POU2F3, ASCL1, 또는 NEUROD1은 환자의 질환 유전자형에 따라서 표적 유전자로서 사용될 것이다 [1-2].
SCLC CellREADR efRNA
이 실시예에서, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 CellREADR 시스템을 사용하여 SCLC를 치료하기 위해 2개의 상이한 전략이 기재된다.
간략하게, 전략 1) 암 세포 사멸 또는 암 세포 증식 억제의 직접 유도. 이러한 목적을 위해서, efRNA는 readrRNA 분자의 SES에 직접적으로 연결되거나 또는 readrRNA에 의해 코딩되는 트랜스활성인자 이펙터에 의해서 readrRNA 분자의 SES에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 세포 사멸 유도 유전자 (예를 들어, CASP3, DFNA5, GZMB, GZMA, GSDMs) 및 종양 억제 유전자 (예를 들어, TP53 및 CDKN2A)를 기반으로 한다.
전략 2) 면역요법을 해제하도록 종양 미세환경의 변형. 이러한 목적을 위해서, 프로-면역 유전자 (예를 들어, IFNB, IFNG, TNFA, IL2, IL12, IL15, CD40L) 및 케모카인 유전자 (예를 들어, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL16)가 efRNA로서 사용된다. 또한, 면역 체크포인트 억제인자 (ICB) 약물 (예를 들어, 항-PD1, 항-CTLA4)이 항-종양 반응을 강화시키기 위해 병용하여 사용될 수 있다.
당업자는 양쪽 전략이 항-종양 효율을 더 강화시키기 위해 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
CellREADR 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, DNA 또는 RNA 벡터에 의해 전달될 수 있다.
참조문헌:
1.George　J,　Lim　JS,　Jang　SJ,　Cun　Y,　Ozretic　L,　Kong　G,　Leenders　F,　Lu　X,　Fernandez-Cuesta　L,　Bosco　G,　et al.　2015.　Comprehensive genomic profiles of small cell lung cancer.　Nature　524:　47-53.
2. Huang, Y.-H. et al. POU2F3 is a master regulator of a tuft cell-like variant of small cell lung cancer.　Genes Dev.　32, 915-928 (2018).
실시예 16(g). 유방암 에서 CellREADR 요법
질환 및 임상적 배경
유방암은 유방의 세포가 통제를 벗어나 성장하는 질환이다. 상이한 종류의 유방암이 존재한다. 여성 호르몬 에스트로겐, 프로게스테론에 대한 수용체 및 인간 상피 성장 인자가 종종 유방암에서 과발현된다.
표적 세포
유방암 세포가 표적 세포이다.
표적 유전자
이 실시예에서, 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR) 및 인간 상피 성장 인자 (HER2)가 암 유형에 따라서 유방암에 대한 표적 유전자일 것이다 [1].
SCLC CellREADR efRNA
이 실시예에서, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 CellREADR 시스템을 사용하여 SCLC를 치료하기 위해 2개의 상이한 전략이 기재된다.
간략하게, 전략 1) 암 세포 사멸 또는 암 세포 증식 억제의 직접 유도. 이러한 목적을 위해서, efRNA는 readrRNA 분자의 SES에 직접적으로 연결되거나 또는 readrRNA에 의해 코딩되는 트랜스활성인자 이펙터에 의해서 readrRNA 분자의 SES에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 세포 사멸 유도 유전자 (예를 들어, CASP3, DFNA5, GZMB, GZMA, GSDMs) 및 종양 억제 유전자 (예를 들어, TP53 및 CDKN2A)를 기반으로 한다.
전략 2) 면역요법을 해제하도록 종양 미세환경의 변형. 이러한 목적을 위해서, 프로-면역 유전자 (예를 들어, IFNB, IFNG, TNFA, IL2, IL12, IL15, CD40L) 및 케모카인 유전자 (예를 들어, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL16)가 efRNA로서 사용된다. 또한, 면역 체크포인트 억제인자 (ICB) 약물 (예를 들어, 항-PD1, 항-CTLA4)이 항-종양 반응을 강화시키기 위해 병용하여 사용될 수 있다.
당업자는 양쪽 전략이 항-종양 효율을 더 강화시키기 위해 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
CellREADR 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, DNA 또는 RNA 벡터에 의해 전달될 수 있다.
참조문헌:
1. Iqbal, Nida, and Naveed Iqbal. "Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in cancers: overexpression and therapeutic implications." Molecular biology international 2014 (2014).
실시예 16(h). 간암 에서 CellREADR 요법
질환 및 임상적 배경
간세포 암종 (HCC)의 75%∼85% 사례를 포함하는, 간암은 2018년 전세계적으로 6번째로 가장 흔하게 진단되는 암이고, 4번째로 많은 암 관련 사망이 될 것으로 예상된다.
표적 세포
간암 세포가 표적 세포이다.
표적 유전자
이 실시예에서, 글리피칸-3 (GPC3) 및 그래뉼린-에피텔린 전구체 (GEP)가 암 유형에 따라 간암 세포에 대한 표적 유전자이다 [1].
CellREADR efRNA
이 실시예에서, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 CellREADR 시스템을 사용하여 간암을 치료하기 위해 2개의 상이한 전략이 기재된다.
간략하게, 전략 1) 암 세포 사멸 또는 암 세포 증식 억제의 직접 유도. 이러한 목적을 위해서, efRNA는 readrRNA 분자의 SES에 직접적으로 연결되거나 또는 readrRNA에 의해 코딩되는 트랜스활성인자 이펙터에 의해서 readrRNA 분자의 SES에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 세포 사멸 유도 유전자 (예를 들어, CASP3, DFNA5, GZMB, GZMA, GSDM) 및 종양 억제 유전자 (예를 들어, TP53 및 CDKN2A)를 기반으로 한다.
전략 2) 면역요법을 해제하도록 종양 미세환경의 변형. 이러한 목적을 위해서, 프로-면역 유전자 (예를 들어, IFNB, IFNG, TNFA, IL2, IL12, IL15, CD40L) 및 케모카인 유전자 (예를 들어, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL16)가 efRNA로서 사용된다. 또한, 면역 체크포인트 억제인자 (ICB) 약물 (예를 들어, 항-PD1, 항-CTLA4)이 항-종양 반응을 강화시키기 위해 병용하여 사용될 수 있다.
당업자는 양쪽 전략이 항-종양 효율을 더 강화시키기 위해 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
CellREADR 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, DNA 또는 RNA 벡터에 의해 전달될 수 있다.
참조문헌:
1. Yip, Chi Wai, et al. "Granulin-epithelin precursor interacts with heparan sulfate on liver cancer cells."　Carcinogenesis　35.11 (2014): 2485-2494.
실시예 17. B 세포 악성종에 대한 생체내 CAR T 요법
질환 및 임상적 배경
키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포는 일정 혈액학적 암 환자에 대한 강력한 치료적 접근법으로서 출현하였는데, 다수의 CAR T 세포 생산물이 재발성 및/또는 난치성 B 세포 악성종에 대해 FDA에 의해 현재 승인받았다 (1). 그러나, 원하는 수준의 유효성을 달성하기 위해서, 환자는 시기적절한 방식으로 CAR T 세포 주입을 성공적으로 받는 것이 필요하다. 이러한 과정은 환자의 T 세포의 성분채집술에 이은 생체외 CAR T 세포 제조를 수반한다. 주입을 기다리는 동안 대부분의 환자는 또한 지속적인 반응을 가능하게 하는 중요한 인자로서 출현된, 프리-CAR T 세포 림프구고갈 과정을 받게 된다 (1). 힘든 CAR T 제조 절차는 환자에게 비용 및 위험성을 증가시킨다.
공여자로부터의 동종이계 CAR T 세포의 사용은 자기유래 접근법보다 많은 잠재적 장점을 갖는데, 예컨대 환자 치료를 위한 저온저장된 뱃치의 즉각적 이용가능성, CAR T 세포 생산물의 가능한 표준화, 다수 세포 변형을 위한 시간, 상이한 표적에 대해 유도된 CAR T 세포의 조합 또는 재투여, 및 산업화된 과정을 사용하여 비용 절감 등이다 (2). 그러나, 동종이계 CAR T 세포는 생명 위협적인 이식편 대 숙주 질환을 초래할 수 있고, 숙주 면역계에 의해 빠르게 제거될 수 있다 (2).
생체외 CAR T 세포 생산의 단점을 극복하기 위해서, 지질 나노입자 (LNP) 기반 전달 시스템은 생체내 생산 CAR T 세포에서 시험되었고, 적어도 전임상 심장 손상 모델에서 유망한 진보를 보였는데, T 세포 기원된 형질감염은 항-CD5 항체 (CD5-표적화 LNP)로 LNP를 장식하여서 매개되고 증강되었다 (3). 그러나, CD5가 오로지 CD3+ T 세포에 의해서만 발현되는 것이 아니고, LNP는 천연적으로 간에 축적되어서, CD3- 세포에서 원치않는 CAR 발현이 관찰되었고 (3), 이것은 치료적 효능을 감소시키고 부작용을 일으킬 수 있다.
CellREADR 시스템은 또한 CD3-엡실론 유전자로부터 발현되는 RNA를 표적화하는 sesRNA를 사용하여 CD3+ T 세포 특이적 생체내 CAR 발현에 적용가능하다.
표적 세포
이 실시예에서, T 세포는 CELLREADR을 사용하여 생체내 CAR T 생성을 위해 제조된다.
표적 유전자
CD3은 T 세포 특이적 마커이다. 이것은 T-세포 수용체 (TCR)와 회합되어서 세포독성 T 세포 (CD8+ T 세포) 및 T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포) 둘 모두를 포함하는 T 림프구에서 활성화 신호를 발생시킨다. 항체에 의한 CD3의 결합이 정상 T 세포 활성화를 방해하게 되므로, 항체 매개 LNP 전달을 위해 실현가능한 표적은 아니다. CellREADR 시스템의 RNA-감지 장점을 사용하여, CD3+ T 세포 특이적 생체내 CAR 발현은 CD3E RNA를 표적화하는 (상보적인) sesRNA를 사용하고 CD3 단백질을 적절한 T 세포 활성화를 위해 비변경된 채로 남겨서 획득된다. sesRNA 센서는 다음의 인간 CD3엡실론 RNA (sesRNACD3E) [여기서, T-세포 수용체 복합체 (CD3E)의 CD3E 호모 사피언스 CD3 엡실론 서브유닛, mRNA 유전자좌 NCBI 참조번호는 NM_000733이고, 좌표 염색체 11: GRCh38 유래, 118,304,730-118,316,175 전방향 가닥을 갖고; 전사물 ID는 ENST00000528600.1임]를 포함한다.
오직 T 세포에서만 인간 Jurkat T 세포주에서 CAR 발현을 제한하는 각각의 sesRNA 센서의 능력이 결정된다. 동일한 방식으로, CD8A 또는 CD4 RNA에 대한 RNA 센서는 따라서 세포독성 T 세포 (CD8+ T 세포) 또는 T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포)에 CAR 발현을 제한하는 그들 능력에 대해 평가된다.
CAR T efRNA
현재, 4개 CAR T 세포 제품이 (티사겐렉류셀, 악시캅타겐 실로류셀, 리소캅타겐 마라류셀, 브렉수캅타겐 오토류셀)이 B-NHL 환자에 대해 FDA의 승인을 받았는데, 이들 모두는 CD19에 대한 것이다. 이 실시예에서, 4개 항-CD19-CAR 구성체가 기술된다. 선택된 sesRNACD3E 는 PCAG-sesRNACD3E-(CD19-CAR) 구성체를 생성하여서 CD3+ 세포에서 항-CD19-CAR 발현을 제한하는데 사용된다. PCAG-sesRNACD3E-CD19-CAR 플라스미드 또는 시험관내 전사된 mRNA는 T 세포 지향 흡수를 증강시키기 위해 i.v. 주사를 통해 CD5-표적화 LNP에 의해 전달된다. LNP에 의해 형질감염된 T 세포는 항-CD19-CAR을 발현하고, 악성 B 세포를 사멸시켜 환자 생존을 연장시킨다. 이러한 생체내 CAR T 요법은 더 짧은 시간 기간, 비용 절감, 기성품 (상이한 환자에 대해 개별 또는 동종 CAR T 세포를 맞춤할 필요가 없음)으로, 이식편 대 숙주 위험없이 보다 안전하고 더 효과적인 치료이다. 또한, 이 시스템은 CAR 성분을 변화시켜서 다른 질환을 치료하기 위한 임의의 생체내 CAR T 세포 생산을 위해 쉽게 적합화될 수 있다. 도 24는 B 세포 악성종에 대한 생체내 CAR T 요법의 개략도를 보여준다. a. CD3+ 세포를 표적화하기 위한 CellREADR CD19-CAR 구성체가 패킹된 LNP. b. 환자에게 LNP 카고의 i.v. 주입. c. CD19-CAR을 통해 악성 B 세포를 사멸시키기 위한 T 세포의 생체내 형질감염.
참조문헌:
1. Amini, L., Silbert, S.K., Maude, S.L.　et al.　Preparing for CAR T cell therapy: patient selection, bridging therapies and lymphodepletion.　Nat Rev Clin Oncol　19, 342-355 (2022).
2. Depil, S., Duchateau, P., Grupp, S.A.　et al.　'Off-the-shelf' allogeneic CAR T cells: development and challenges.　Nat Rev Drug Discov　19, 185-199 (2020).
3. Rurik J.G., Tombacz, I., Amir Yadegari, A. et al. CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury. Science 375, 91-96 (2022).
실시예 18
크리글러-나자르 증후군 치료를 위해 UTG1A1의 간세포 제한-발현
질환 및 임상적 배경
크리글러-나자르 증후군 (CNS)은 간에 의해 처리되는 빌리루빈이 이의 수용성 형태 (포합형 빌리루빈)로 변화될 수 없는 어린이에서 발견되는 희귀 유전성 질환이다. 이것은 간에서 비포합형 빌리루빈의 글루쿠로니드화에 필요하고, 체내에서 제거될 수 있는 물질로 빌리루빈을 전환시키는 역할을 하는 효소인, UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 (UGT1A1)(SEQ ID NO:149)의 활성 부재 또는 감소에 의해 초래된다. UGT1A1 결핍은 제때 치료되지 않으면 상당한 신경학적 손상 및 사망을 일으킬 수 있다. 2개 형태의 크리글러-나자르 증후군이 존재한다. 1형 질환은 영구적인 신경학적 후유증을 초래할 수 있는 빌리루빈 뇌병증으로 인한 중증 황달 및 신경학적 손상과 연관있다. 2형 질환은 낮은 혈청 빌리루빈 농도와 연관있고, 영향받은 환자는 신경학적 손상없이 성인까지 생존한다. 광선요법 (빌리루빈 및 이의 신경독소 효과 제어), 정위성 간 이식, 간 세포 이식이 CNS에 대한 전통적인 치료이다. 소형 동물 모델에서 유전자 요법의 유망한 보고를 통해서, 유전자 요법 접근법은 CNS 2,3의 안전하고 효과적인 치료를 개발하기 위한 전임상 연구에서 계속될 것으로 예상된다. 재조합 바이러스, 예컨대 아데노바이러스를 사용한 유전자 전달 벡터는 CNS의 Gunn 래트 모델의 간으로 UGT1A1 유전자를 전달하는데 성공적으로 적용되었다. 크리글러-나자르 증후군에 대해 기능성 UGT1A1의 유전자 전달을 위한 임상 시험 (예를 들어, NCT0322319, NCT03466463)은 또한 새로운 치료로서 잠재성을 보여주었다. 그러나, 모든 현재 유전자 요법은 특이적 조직 또는 간세포에서 발현되도록 치료제 (UGT1A1 기능성 유전자)를 제한해야 하는 과제에 직면해 있고, 이것은 치료적 효능을 증가시킬뿐만 아니라 부작용도 감소시켜야 한다.
표적 세포 및 유전자
간세포 (HC), 간 성상세포 (HSC), 쿠퍼 세포 (KC), 및 간 동모양 혈관 내피 세포 (LSEC)는 간 기능을 형성하고 유지하기 위해 시공간적으로 협력한다. 간의 주요 실질 세포인, 간세포는 물질대사, 해독, 및 단백질 합성에서 중추적인 역할을 한다. 간세포는 UGT1A1유전자를 발현하는 주요 세포 유형이고, 유전자 요법의 표적 세포이다 (4). 간세포의 세포는 Apoa2 (아포리포단백질 A-2), AHSG (알파 2-HS 당단백질), 알부민 (Alb)을 포함하여, 인간 및 마우스 간에 보존된 몇몇 특이적 RNA 마커를 갖는다. 이들 특이적 마커는 특이적으로 간세포를 표적화하고 기능성 UGT1A1을 발현시켜서 크리글러-나자르 증후군을 치료하기 위한 세포 유형 특이적 접근법으로서 CellREADR 기술을 활용하기 위한 기반을 제공한다. 마우스 간 세포주인 AML12에서, 마우스 Apoa2, Ahsg 및 Alb RNA에 대해서 각각 6개, 7개, 및 10개 sesRNA가 선택되었다. 이러한 방식으로, 3개 유전자 모두에 대해 AML 세포에서 유의한 특이성 및 효율을 보이는 센서를 확인하였다 (도 25A. 내지 25F.). 특이적 센서를 함유하는 CellREADR은 간세포에서 제한된 페이로드 발현을 달성하게 된다.
EfRNA 및 벡터
약 800 bp인 기능성 UGT1A1 유전자가 CellREADR 벡터에 도입된다. 다른 유전자 요법 방법과 마찬가지로, 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스), 지질 나노입자 (LNP) 또는 바이러스-유사 입자 (VLP)는 정맥내 주사를 통해 전달 벡터로서 사용된다. 2개 전략이 efRNA로서 기능성 UGT1A1 유전자를 발현하는데 사용된다 (도 25G). 전략 I은 단일 CellREADR 벡터로부터 UGT1A1 유전자를 직접적으로 발현시키는 것이다. 전략 II는 UGT1A1 유전자 발현의 증폭을 제공하기 위해 이원 tTA2/TRE3g 벡터를 사용하는 것이다. AAV, 아데노바이러스 및 렌티바이러스, 지질 나노입자 (LNP) 또는 바이러스-유사 입자 (VLP)를 포함한 바이러스 벡터는 정맥내 주사를 통해 전달 벡터로서 사용된다.
특히, 많은 단일유전자성 질환에서, 유전적 돌연변이는 특정 장기에서 특이적 체세포 유형을 파괴하여 인간 건강에 영향을 미친다. 여기서 크리글러-나자르 증후군의 치료를 위해 CellREADR을 사용하는 예가 간세포로 정상 mRNA 및 단백질을 제공하여, 즉, 세포 특이적 유전적 보완에 의해 예시되지만, 당업자는 유전적 돌연변이가 특이적 체세포 유형에 영향을 미치는 다른 단일유전자성 질환을 치료하는데 적용될 수 있다는 것을 이해하게 된다.
참조문헌:
1. Ebrahimi, A. & Rahim, F. Crigler-Najjar Syndrome: Current Perspectives and the Application of Clinical Genetics. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 18, 201-211, doi:10.2174/1871530318666171213153130 (2018).
2. Chaubal, A. N. et al. Management of pregnancy in Crigler Najjar syndrome type 2. World J Hepatol 8, 530-532, doi:10.4254/wjh.v8.i11.530 (2016).
3. Tcaciuc, E., Podurean, M. & Tcaciuc, A. Management of Crigler-Najjar syndrome. Med Pharm Rep 94, S64-S67, doi:10.15386/mpr-2234 (2021).
4. Ding, C. et al. A Cell-type-resolved Liver Proteome. Mol Cell Proteomics 15, 3190-3202, doi:10.1074/mcp.M116.060145 (2016).
실시예 19(a). 감염성 질환 - AIDS의 세포 유형 표적화 치료
질환 및 임상적 배경
후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)은 면역계의 점진적인 실패가 생명 위협적인 기회 감염 및 암을 번성하게 하는 병태이다1. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)는 AIDS를 초래한다. HIV는 다양한 면역 세포 예컨대 CD4+ T 세포, 마크로파지, 및 소고세포를 감염시킬 수 있다. 향성을 기반으로, HIV 바이러스는 CCR5-향성 (R5), CXCR4-향성 (X4), 또는 이중 향성 (R5/X4) 균주로 분류된다. R5 바이러스는 단핵구-마크로파지에서 복제될 수 있고 (일명 M-향성), X4 균주는 T 세포에서 우선적으로 복제된다 (일명 T-향성)2.
현재 HIV 치료는 제3 약물로서, 인테그라제 억제제, 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 또는 프로테아제 억제제와 병용된 2개 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 억제제로 이루어진, 3-약물 경구 일일 항레트로바이러스 용법으로 이루어진다3. 현재 치료 용법을 사용하여서, 환자는 치유될 수 없지만, 그들이 치료를 굳게 지키면 정상적인 수명을 가질 것으로 기대된다3. 그러나, 약물 피로는 현재 치료 구현의 과제 중 하나이다4.
표적 세포
HIV-감염된 CD4+ T 세포 및 마크로파지는 바이러스 RNA를 감지하여 CellREADR 시스템에 의해 표적화된다.
표적 유전자
HIV RNA 게놈은 10개 유전자 (gag, pol, env, tat, rev, nef, vif, vpr, asp and vpu (HIV-1) 또는 vpx (HIV-2))를 함유한다5. 그 중에서, env 는 세포 프로테아제에 의해서 2개로 절단되어 gp120 및 gp41을 형성하는 당단백질 (gp)160이라고 불리는 단백질을 코딩한다. gp120 및 gp41은 HIV 스파이크를 형성하는데, 바이러스가 표적 세포에 부착되어서 바이러스 외피가 표적 세포막과 융합되도록 허용한다6. env 는 HIV-감염된 세포를 확인하기 위한 우리의 초기 표적 유전자이다. 8 내지 10개 RNA 센서가 env 유전자로 형질감염된 HEK293T 세포에서 특이성 및 효율을 위해 최적화된다. 나머지 9개 HIV 유전자/RNA에 대한 RNA 센서가 또한 env 유전자로 형질감염된 HEK293T 세포에서 특이성 및 효율을 위해 최적화된다.
efRNA 유전자
현재 HIV 치료와 유사하게, HIV 바이러스 복제에 참여하는 역전사효소, 인테그라제 또는 프로테아제는 소형 조작 항체 유도체인, 중화 나노바디를 발현시켜서 억제된다. 그러나, 억제는 RNA 센서 sesRNA env 를 사용하여 HIV-감염된 세포에 대해 특이적으로 유도된다. 체내 모든 세포에 영향을 미치는 현재 치료의 광범위 비-특이적 억제와 비교하여, CellREADR 가이드된 나노바디 발현은 더 적은 독성 및 부작용을 보이는 한편 감염된 세포에서 HIV 복제를 보다 효율적으로 억제한다. 유전자 요법의 내구성 관점에서, CellREADR-가이드된 나노바디 AIDS 치료는 현행 약물 치료의 알약 피로를 극복한다.
전임상 모델에서 항-CD5 항체 앵커링된 지질 나노입자 (CD5-표적화 LNP)가 T 세포 지향 형질감염을 증강시킬 수 있다는 것을 보였주었으므로7, CD5-표적화 LNP를 사용하여서 CellREADR-가이드된 나노바디 생산물 (mRNA 또는 DNA 플라스미드)를 표적 T 세포로 전달한다. 유사하게, CD68 (단핵구 및 조직 마크로파지에 의해 고도로 발현됨8) 항체 앵커링된 LNP는 CellREADR 가이드된 나노바디의 마크로파지 전달을 지향하고 증강시키는데 사용된다.
넓은 맥락에서, HIV의 CellREADR 치료는 단지 하나의 예이고, 유사한 전략이 많은 잠복 감염 (예를 들어, 엡스타인 바 바이러스 감염, 헤르페스, 지카, COVID19, 에볼라)의 치료에 적용될 수 있다. 일반적인 접근법은 감염된 세포를 검출한 다음에 1) 프로그램된 세포 사멸을 촉발하고, 2) 면역 살해 세포에 대해 세포 표면을 표지하는 단백질을 발현시켜서 이들 세포를 제거할 수 있는 RNA 센서를 개발하는 것이다.
잠복 감염을 치료하기 위한 다른 예로서, CellREADR은 스파이크 mRNA에 대한 센서를 사용하여 COVID19의 치료에 사용된다. 15개 sesRNA가 스파이크 mRNA의 표적화를 위해 제공되었고, HEK 세포에서 시험되었는데, 15개 sesRNA 중 3개는 스파이크 mRNA 발현에 반응하는 유망한 결과를 보였다 (도 26).
참조문헌:
1. Daniel C. Douek, Mario Roederer, and Richard A. Koup. Emerging Concepts in the Immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 2009. 60:471-84. doi: 10.1146/annurev.med.60.041807.123549.
2. Poveda, Eva, Briz, Veronica, Quinones-Mateu, Miguel, and Soriano, Vincent. HIV tropism: diagnostic tools and implications for disease progression and treatment with entry inhibitors. AIDS: June 26, 2006 - Volume 20 - Issue 10 - p 1359-1367. doi: 10.1097/01.aids.0000233569.74769.69.
3. Nittaya Phanuphak, and Roy M Gulick. HIV treatment and prevention 2019: current standards of care. Curr Opin HIV AIDS 2020 Jan;15(1):4-12. doi: 10.1097/COH.0000000000000588.
4. Eisinger RW, Fauci AS. Ending the HIV/AIDS Pandemic. Emerg Infect Dis. 2018 Mar;24(3):413-416. doi: 10.3201/eid2403.171797.
5. Foley, Brian Thomas, Korber, Bette Tina Marie, Leitner, Thomas Kenneth, Apetrei, Cristian, Hahn, Beatrice, Mizrachi, Ilene, Mullins, James, Rambaut, Andrew, and Wolinsky, Steven. HIV Sequence Compendium 2018. United States: N. p., 2018. Web. doi:10.2172/1458915.
6. David C. Chan, Deborah Fass, James M. Berger, and Peter S. Kim. Core Structure of gp41 from the HIV Envelope Glycoprotein. Cell, Vol. 89, 263-273, April 18, 1997. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80205-6.
7. Rurik J.G., Tombacz, I., Amir Yadegari, A. et al. CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury. Science 375, 91-96 (2022).
8. Holness C.L., and Simmons D.L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood (1993) 81 (6): 1607-1613. doi: 10.1182/blood.V81.6.1607.1607.
실시예 19(b). 감염성 질환 - C형 감염의 세포 유형 표적화 치료
질환 및 임상적 배경
C형 간염은 C형 간염 바이러스 (HCV)에 의해 초래되는 간 감염이다. C형 간염은 감염된 사람의 혈액과 접촉을 통해서 전파된다. 일부 사람에게, C형 간염은 단기간의 질병이지만, C형 간염 바이러스로 감염된 사람의 절반 이상은 장기간, 만성 감염이 된다. 만성 C형 간염은 간경변 및 간암같이 심각하고, 심지어 생명 위협적인 건강 문제를 야기할 수 있다. C형 간염을 위한 백신은 없다.1
표적 세포
HCV 감염된 간세포가 바이러스 RNA를 감지하여 CellREADR 시스템에 의해 표적화된다.
표적 유전자
HCV는 플라비비리다에 과에 속하고, 이의 게놈은 약 9.6 킬로베이스의 양성-가닥 RNA 분자로 이루어지고, 대형 폴리단백질 전구체 (약 3000개 아미노산)를 코딩한다. 이러한 전구체 단백질은 숙주 및 바이러스 프로테아제에 의해 절단되어서 적어도 10개 단백질을 생성한다: 코어 (C), 외피 1 (E1), E2, p7, 비구조 (NS) 2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B.2,3
코어 단백질 (c)의 CDS는 HCV-감염된 세포를 확인하기 위한 우리의 초기 표적 유전자이다. 8개 내지 10개 RNA 센서가 HCV c 유전자로 형질감염된 HEK293T 세포에서 특이성 및 효율을 위해 최적화된다. 폴리단백질 전구체에 대한 나머지 CDS에 대한 RNA 센서도 역시 개별 CDS로 형질감염된 HEK293T 세포에서 특이성 및 효율을 위해 최적화된다.
efRNA 유전자
C, E1 및 E2가 HCV 바이러스 입자 패키징에 중요하므로2,3, C, E1 또는 E2에 대한 중화 나노바디는 HCV 패키징을 차단할 것으로 기대되고, RNA 센서 sesRNA c 이후에 로딩되는 efRNA로서 사용될 것이다. 체내에서 모든 세포에 영향을 미치는 광범위 비특이적 항바이러스 치료와 비교하여, CellREADR 가이드된 나노바디 발현은 적은 독성 및 부작용을 나타내면서, 감염된 세포에서 HCV 복제를 보다 효과적으로 억제한다.
지질 나노입자 (LNP)는 간에서 자발적으로 농축되므로, LNP는 간세포로 CellREADR 가이드된 나노바디의 전달에 이상적이다. 간-향성 AAV를 사용하여서 역시 간세포로 CellREADR 가이드된 나노바디를 전달할 수 있다4.
참조문헌:
1. https://www.cdc.gov/hepatitis/hcv/index.htm.
2. De Francesco R (1999). "Molecular virology of the hepatitis C virus".　J Hepatol.　31　(Suppl 1): 47-53.
3. Kato N (2000). "Genome of human hepatitis C virus (HCV): gene organization, sequence diversity, and variation".　Microb. Comp. Genom.　5　(3): 129-51.
4. Marti C, Renina N, Erhua Z, et. al. (2022), "Novel human liver-tropic AAV variants define transferable domains that markedly enhance the human tropism of AAV7 and AAV8", Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 24: 88-101.
실시예 19(c). 감염성 질환 - B형 간염의 세포 유형 표적화 치료
질환 및 임상적 배경
B형 간염 바이러스 (HBV)는 부분 이중 가닥 DNA 바이러스로서, 오르토헤파드나바이러스 속의 종이고 헤파드나비리다에 바이러스과의 구성원이다. 이러한 바이러스는 B형 간염 질환을 초래한다. B형 간염을 예방하는 백신이 존재함에도 불구하고, HBV는 여전히 전세계적인 건강 문제로 남아있다. B형 간염은 급성일 수 있고 이후에 만성이 되어서, 다른 질환 및 건강 병태로 이어질 수 있다. 감염을 초래하는 것 이외에도, HBV 감염은 간경변증 및 간세포 암종을 유발할 수 있다. 또한 췌장암의 위험성을 증가시킬 수 있다고도 제안되었다.
표적 세포
HBV 감염된 세포는 바이러스 RNA를 감지하여서 CellREADR 시스템에 의해 표적화된다.
표적 유전자
C, P, S, 및 X라고 불리는 게놈에 의해 코딩되는 4개의 기지 유전자가 존재한다. 코어 단백질은 유전자 C (HBcAg)에 의해 코딩되고, 이의 출발 코돈은 프리-코어 단백질이 생산되는 상류의 인-프레임 AUG가 선행된다. HBeAg는 프리-코어 단백질의 단백질가수분해적 처리에 의해 생성된다. DNA 폴리머라제는 유전자 P에 의해 코딩된다. 유전자 S는 표면 항원 (HBsAg)을 코딩하는 유전자이다. HBsAg 유전자는 하나의 긴 오픈 리딩 프레임이지만, 유전자를 프리-S1, 프리-S2, 및 S의 3개 부분으로 나누는 3개의 인-프레임 "출발" (ATG) 코돈을 함유한다. 다수의 출발 코돈때문에, 대형, 중형, 및 소형이라고 불리는 3개의 상이한 크기의 폴리펩티드 (프리-S1 + 프리-S2 + S, 프리-S2 + S, 또는 S)가 생성된다. 유전자 HBV-C, HBV-P, HBV-S, HBV-X는 CellREADR에 의한 표적 유전자이다.
efRNA 유전자
HBV-C, HBV-P, HBV-S, HBV-X에 대한 중화 나노바디는 HCV 패키징을 차단할 것으로 예상되고, RNA 센서 sesRNA 이후에 로딩되는 efRNA로서 사용될 것이다. 체내의 모든 세포에 영향을 미치는 광범위 비-특이적 항바이러스 치료와 비교하여, CellREADR 가이드된 나노바디 발현은 적은 독성 및 부작용을 나타내면서 감염된 세포에서 HBV 복제를 보다 효과적으로 억제한다. CellREADR 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, DNA 또는 RNA 벡터에 의해 전달될 수 있다.
실시예 19(d). 감염성 질환 - 코로나바이러스 질환 2019의 세포 유형 표적화 치료
질환 및 임상적 배경
코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19)는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 바이러스에 의해 초래되는 전염성 질환이다. 이 질환은 전세계적으로 빠르게 전파되어서, COVID-19 대유행을 초래하였다.
표적 세포
SARS-CoV-2 감염된 세포는 바이러스 RNA를 감지하여 CellREADR 시스템에 의해 표적화된다.
표적 유전자
SARS-CoV-2의 오픈 리딩 프레임 1a (ORF1a), 오픈 리딩 프레임 1b (ORF1a) 및 스파이크 유전자가 CellREADR 시스템의 표적 유전자이다.
efRNA 유전자
스파이크 단백질에 대한 중화 나노바디는 SARS-CoV-2 패키징을 차단할 것으로 예상되고, RNA 센서 sesRNA 이후에 로딩되는 efRNA로서 사용될 것이다. RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRp)에 대한 중화 나노바디는 SARS-CoV-2 복제를 차단할 것으로 예상된다. 이들 나노바디는 CellREADR 시스템의 efRNA 유전자이다. CellREADR 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, DNA 또는 RNA 벡터에 의해 전달될 수 있다.
실시예 20. RNA-기반 진단제로서 CellREADR
임상적 배경
표적 RNA의 검출 시 이펙터 단백질의 생산과 커플링되는 RNA 센서로서, CellREADR은 조직 및 체액으로부터 질환 상태 또는 바이러스 감염을 의미하는 RNA를 검출하는 고유 능력을 갖고, 이후에 진단을 위해 가시화가능하고 정량가능한 신호 (형광, 화학 반응 산물)를 발생시키는 효소 또는 다른 이펙터 단백질의 번역을 촉발시킨다. 그러므로, CellREADR은 RNA 마커를 기반으로 하는 진단에서 매우 광범위한 적용성을 갖는다.
예를 들어, 현재 COVID-19를 초래하는 SARS-CoV-2에 대한 진단 검사의 2개 주요 유형이 존재하는데, 즉, 핵산 증폭 검사 (NAAT) 및 항원 검사이다. NAAT, 예컨대 PCR-기반 검사는 실험실에서 가장 흔하게 수행된다. 그들은 전형적으로 증상이 있거나 또는 없는 사람들에게 가장 신뢰할만한 검사이다. 항원 검사는 신속 검사로서 15분 내지 30분 안에 결과를 얻는다. 그들은 특히 증상이 없는 사람들 경우에, NAAT에 비해서 신뢰성이 낮다. 자가 검사, 또는 재책 검사는 일반적으로 항원 검사로서, 특정 검사 장소에 갈 필요없이 어디에서도 받을 수 있다1.
SARS-CoV-2는 RNA 바이러스이므로, PCR-기반 검사는 cDNA를 제조하기 위한 역전사 단계를 하나 추가하여, 바이러스 핵산을 증폭하기 위한 주형으로서 cDNA를 사용해야만 한다. 더 나아가서, PCR은 실험실에서 열순환기에서 수행되어야 한다. 이들 단점은 새로운 핵산 검사 기술의 개발을 요구한다. CellREADR은 RNA 서열을 직접적으로 인식하므로, cDNA를 제조할 필요가 없어서, 시간을 절약하고, 보다 쉬운 검사로서 수행될 수 있다. 이의 실현가능성을 입증하기 위해서, RNA 검출 및 진단을 위한 시험관내 전사/번역 (IVT) CellREADR 시스템을 개발하였다(도 27).
샘플
바이러스 감염/오염 샘플 (예를 들어, 세포 용해물, 조직 생검, 체액).
표적 유전자
CellREADR은 RNA 서열을 직접 인식하므로, 전체 RNA 바이러스 게놈이 잠재적인 표적이다 (예를 들어, SARS-CoV-2 게놈 RNA, C형 간염 바이러스 게놈 RNA, 인플루엔자 바이러스 게놈 RNA). DNA 바이러스 경우에, mRNA로 전사되는 바이러스 유전자가 역시 잠재적 표적이다 (예를 들어, 파필로마바이러스의 E1, E2, E4, E5, E6, 및 E7).
페이로드 리포터 유전자 및 예상 결과
반딧불이 루시퍼라제는 시험 튜브 중에서 IVT cellREADR 시스템의 이펙터 표지로서 시험되었고 (도 27), 원리의 증명으로서 표적 RNA에 대한 강건하고 특이적인 판독값을 보여주었다. 추가적인 이펙터 표지는 다른 유형의 루시퍼라제, b-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)를 포함한다. 센서-이펙터 유전자의 5' UTR은 시험관내 번역 효율을 증강시키도록 변형된다 (예를 들어, RNA G-사중체(RG4) 구조2). 어세이는 30℃ 인큐베이션의 1 단계로서 수행된다. 대안적으로, 인큐베이션은 실온에서 수행된다.
요약하면, IVT cellREADR 기술은 감염성 질환 및 질환 세포 및 조직에 대해서 보다 빠르고 보다 쉬운 핵산 시험을 생성한다. 중요한 것은, 가정에서도 수행할 수 있는 잠재성을 갖는다는 것이다. 더 나아가서, 이 어세이는 규모확장가능하고, 96웰 또는 384웰 플레이트 등에서, 동시에 많은 샘플에 대해 수행될 수 있다.
참조 문헌:
1. CDC Guideline; COVID-19 Testing: What You Need to Know, Updated Sept. 28, 2022 https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/symptoms-testing/testing.html.
2. Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K. et al. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nat Rev Mol Cell Biol 21, 459-474 (2020). https://doi.org/10.1038/s41580-020-0236-x.
표 6. (i) 원리 증명 실험을 위한 표적화된 외생성 전사물, (ii) readrRNA, 또는 (iii) 이펙터 유전자, 예를 들어, 트랜스활성인자를 코딩하도록 (물리적으로 연결되지는 않음) 반응성인 유전자를 코딩하는 플라스미드가 본 명세서에 기술된다.
[표 6]
이펙터로서 UGT1A1 유전자
ATGGCTCGCACAGGGTGGACCAGCCCCATTCCCCTATGTGTTTCTCTGCTGCTGACCTGTGGCTTTGCTGAGGCAGGGAAGCTGCTGGTAGTGCCCATGGATGGGAGTCACTGGTTCACCATGCAGTCGGTGGTGGAGAAACTTATCCTCAGGGGGCATGAGGTGGTTGTAGTCATGCCAGAGGTGAGTTGGCAACTGGGAAAATCACTGAATTGCACAGTGAAGACTTACTCAACCTCATACACTCTGGAGGATCTGGACCGGGAATTCATGGATTTCGCCGATGCTCAATGGAAAGCACAAGTACGAAGTTTGTTTTCTCTATTTCTGAGTTCATCCAATGGTTTTTTTAACTTATTTTTTTCGCATTGCAGGAGTTTGTTTAATGACCGAAAATTAGTAGAATACTTAAAGGAGAGTTCTTTTGATGCGGTGTTTCTTGATCCTTTTGATGCCTGTGGCTTAATTGTTGCCAAATATTTCTCCCTCCCCTCTGTGGTCTTCGCCAGGGGAATAGCTTGCCACTATCTTGAAGAAGGTGCACAGTGCCCTGCTCCTCTTTCCTATGTCCCCAGAATTCTCTTAGGGTTCTCAGATGCCATGACTTTCAAGGAGAGAGTACGGAACCACATCATGCACTTGGAGGAACATTTATTTTGCCAGTATTTTTCCAAAAATGCCCTAGAAATAGCCTCTGAAATTCTCCAAACACCTGTCACAGCATATGATCTCTACAGCCACACATCAATTTGGTTGTTGCGAACAGACTTTGTTTTGGACTATCCCAAACCCGTGATGCCCAATATGATCTTCATTGGTGGTATCAACTGCCATCAGGGAAAGCCATTGCCTATGGAATTTGAAGCCTACATTAATGCTTCTGGAGAACATGGAATTGTGGTTTTCTCTTTGGGATCAATGGTCTCAGAAATTCCAGAGAAGAAAGCTATGGCAATTGCTGATGCTTTGGGCAAAATCCCTCAGACAGTCCTGTGGCGGTACACTGGAACCCGACCATCGAATCTTGCGAACAACACGATACTTGTTAAGTGGCTACCCCAAAACGATCTGCTTGGTCACCCGATGACCCGTGCCTTTATCACCCATGCTGGTTCCCATGGTGTTTATGAAAGCATATGCAATGGCGTTCCCATGGTGATGATGCCCTTGTTTGGTGATCAGATGGACAATGCAAAGCGCATGGAGACTAAGGGAGCTGGAGTGACCCTGAATGTTCTGGAAATGACTTCTGAAGATTTAGAAAATGCTCTAAAAGCAGTCATCAATGACAAAAGTTACAAGGAGAACATCATGCGCCTCTCCAGCCTTCACAAGGACCGCCCGGTGGAGCCGCTGGACCTGGCCGTGTTCTGGGTGGAGTTTGTGATGAGGCACAAGGGCGCGCCACACCTGCGCCCCGCAGCCCACGACCTCACCTGGTACCAGTACCATTCCTTGGACGTGATTGGTTTCCTCTTGGCCGTCGTGCTGACAGTGGCCTTCATCACCTTTAAATGTTGTGCTTATGGCTACCGGAAATGCTTGGGGAAAAAAGGGCGAGTTAAGAAAGCCCACAAATCCAAGACCCATTGA (SEQ ID NO: 148)
이펙터로서 VEGFA 코딩 서열
ATGGCGGCTTCTCAGGCGGTGGAGGAAATGCGGAGCCGCGTGGTTCTGGGGGAGTTTGGGGTTCGCAATGTCCATACTACTGACTTTCCCGGTAACTATTCCGGTTATGATGATGCCTGGGACCAGGACCGCTTCGAGAAGAATTTCCGTGTGGATGTAGTACACATGGATGAAAACTCACTGGAGTTTGACATGGTGGGAATTGACGCAGCCATTGCCAATGCTTTTCGACGAATTCTGCTAGCTGAGGTGCCAACTATGGCTGTGGAGAAGGTCCTGGTGTACAATAATACATCCATTGTTCAGGATGAGATTCTTGCTCACCGTCTGGGGCTCATTCCCATTCATGCTGATCCCCGTCTTTTTGAGTATCGGAACCAAGGAGATGAAGAAGGCACAGAGATAGATACTCTACAGTTTCGTCTCCAGGTCAGATGCACTCGGAACCCCCATGCTGCTAAAGATTCCTCTGACCCCAACGAACTGTACGTGAACCACAAAGTGTATACCAGGCATATGACATGGATCCCCCTGGGGAACCAGGCTGATCTCTTTCCAGAGGGCACTATCCGACCAGTGCATGATGATATCCTCATCGCTCAGCTGCGGCCTGGCCAAGAAATTGACCTGCTCATGCACTGTGTCAAGGGCATTGGCAAAGATCATGCCAAGTTTTCACCAGTGGCAACAGCCAGTTACAGGCTCCTGCCAGACATCACCCTGCTTGAGCCCGTGGAAGGGGAGGCAGCTGAGGAGTTGAGCAGGTGCTTCTCACCTGGTGTTATTGAGGTGCAGGAAGTCCAAGGTAAAAAGGTGGCCAGAGTTGCCAACCCCCGGCTGGATACCTTCAGCAGAGAAATCTTCCGGAATGAGAAGCTAAAGAAGGTTGTGAGGCTTGCCCGGGTTCGAGATCATTATATCTGTAAGAAAGATTTGCTGGCTGCGGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAA (SEQ ID NO:149)
[표 7]
[표 5](계속-2) 본 명세서에 포함된sesRNA
[표 8]
차등적 유전자 발현
다른 구현예
당업자는 본 개시가 목적을 수행하고 언급된 목적과 장점을 비롯하여, 내재된 것들을 수득하도록 잘 적합화된다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 본 명세서에 기술된 본 개시는 현재 바람직한 구현예를 대표하고, 예시적이며, 본 개시의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 이의 변화 및 다른 용도가 당업자에게 발생할 수 있고 그것은 청구항의 범위에 의해 한정되는 본 개시의 정신 내에 포괄된다.
본 명세서에서 인용하는 임의의 비-특허 또는 특허 문헌을 포함한, 임의의 참조가 선행 기술을 구성한다고 인정하는 것이 아니다. 참조의 임의 논의는 저자가 주장하는 것을 명시하고, 출원인은 본 명세서에서 인용하는 임의 문헌의 정확성 및 타당성에 이의를 제기할 권리를 보유한다. 본 명세서에 인용되는 모든 참조는 달리 명확하게 표시하지 않으면, 참조로 완전하게 편입된다. 본 개시는 인용된 참조에서 발견되는 임의의 정의 및/또는 설명 간에 임의의 차이가 존재하는 경우에 통제되어야 한다.
다른 구현예는 하기 청구항 내에 속한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (62)

  1. 모듈식 RNA 분자로서,
    a. 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 상기 센서 도메인은 ADAR에 의해 편집가능한 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및
    b. 단백질을 코딩하는 도메인을 포함하는 3' 영역으로서, 상기 단백질 코딩 도메인은 상기 센서 도메인과 인-프레임 (in-frame)으로 이의 하류에 있는 것인 3' 영역
    을 포함하고,
    Adar 효소를 포함하는 세포로 상기 모듈식 RNA의 도입 시에, 상기 센서 도메인의 상기 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치 및 상기 세포 RNA의 상기 상응하는 뉴클레오티드 스트레치는 상기 중지 코돈을 포함하는 RNA 듀플렉스를 형성하고, 상기 RNA 듀플렉스에 포함되는 상기 중지 코돈은 상기 세포에서 ADAR에 의해 편집되어서, 상기 단백질의 번역을 허용하는 것인 모듈식 RNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 센서 도메인의 상기 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치는 mRNA의 적어도 일부분과 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있는 것인 모듈식 RNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 코딩 영역은 이펙터 단백질을 코딩하는 것인 모듈식 RNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분자는 상기 센서 도메인 및 상기 이펙터 도메인 사이에 위치되는 자기-절단성 2A 펩티드를 코딩하는 연속적인 뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 모듈식 RNA 분자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 자기-절단성 2A 펩티드는 T2A 펩티드, P2A 펩티드, E2A 펩티드, 및 F2A 펩티드 중 하나 이상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 모듈식 RNA 분자.
  6. a) (i) 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인으로서, 상기 센서 도메인은 ADAR에 의해 편집가능한 중지 코돈을 포함하는 것인 센서 도메인; 및 (ii) 이펙터 단백질을 코딩하는 제1 단백질-코딩 도메인으로서, 상기 제1 단백질-코딩 영역은 상기 센서 도메인과 인-프레임으로 이의 하류에 있는 것인 제1 단백질-코딩 도메인을 포함하는 모듈식 RNA 분자를 포함하는 제1 핵산, 및
    b) 제2 단백질 코딩 도메인을 포함하는 제2 핵산
    을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산은 단일 핵산 분자를 포함하는 것인 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산은 2개 핵산 분자를 포함하는 것인 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산은 공유적으로 연결되는 것인 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 제2 단백질 코딩 도메인은 전사 제어 구성요소, 임의로, 프로모터를 포함하는 유전자 내에 포함되는 것인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이펙터 단백질은 상기 유전자에 결합하는 것인 조성물.
  12. 제6항에 있어서, 상기 제2 단백질 코딩 도메인의 발현은 상기 이펙터 단백질에 의해 조절되는 것인 조성물.
  13. 제6항에 있어서, 제1 단백질-코딩 도메인은 전사 활성인자를 코딩하는 것인 조성물.
  14. 제6항에 있어서, 제1 단백질-코딩 도메인은 DNA 리콤비나제를 코딩하는 것인 조성물.
  15. 제6항에 있어서, 제1 단백질-코딩 영역은 티미딘 키나제 (TK) 및 시토신 데아미나제 (CD)로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 사멸 단백질, CASP3, CASP9, BCL, GSDME, GSDMD, GZMA 및 GZMB로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로그램된 세포 사멸 단백질, ChR2 및 DREADD-M3Dq로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경 활성화 단백질, IFNB, IFNG, TNFA, IL2, IL12, IL15 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역력 증강인자 단백질, NaChBac 및 Kir2.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 생리학적 편집 단백질, 리신을 포함하는 단백질 합성 억제 단백질, DREADD-hM4D, NpHR 및 GtACR1로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경 억제인자 단백질, 신경 세포 운명에 관여되는 단백질 예컨대 NEUROD, 상피 성장 인자를 포함하는 세포 재생에 관여되는 단백질을 코딩하는 것인 조성물.
  16. 제1항의 모듈식 RNA 분자 또는 제6항의 조성물을 포함하는 핵산 전달 비히클.
  17. 제16항에 있어서, 나노입자, 리포솜, 벡터, 엑소솜, 미세-소포, 유전자총, 및 SEND (Selective Endogenous encapsulation for cellular Delivery) 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 전달 비히클.
  18. 제16항에 있어서, 바이러스 벡터를 포함하는 것인 전달 비히클.
  19. 제18항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 수포성 구내염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 전달 비히클.
  20. 제1항에 있어서, 상기 모듈식 RNA 분자는 DNA 벡터에 의해 코딩되는 것인 모듈식 RNA 분자.
  21. 제6항에 있어서, 상기 모듈식 RNA 분자는 DNA 벡터에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  22. 제16항에 있어서, 상기 모듈식 RNA 분자는 DNA 벡터에 의해 코딩되는 것인 전달 비히클.
  23. 제1항의 모듈식 RNA 분자, 제6항의 조성물, 또는 제16항의 전달 비히클, 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  24. 제1항의 모듈식 RNA 분자, 제6항의 조성물, 또는 제16항의 전달 비히클을 포함하는 세포.
  25. 제24항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 세포.
  26. 제1항의 모듈식 RNA 분자, 제6항의 조성물, 또는 제16항의 전달 비히클, 및 이를 위한 포장재를 포함하는 키트.
  27. 모듈식 RNA 또는 상기 모듈식 RNA를 코딩하는 핵산 조성물, 또는 상기 모듈식 RNA 또는 상기 모듈식 RNA를 코딩하는 상기 핵산 조성물을 포함하는 전달 비히클을 포유동물의 선택된 세포에 도입시키는 방법으로서,
    상기 포유동물의 상기 세포가 상기 모듈식 RNA 또는 상기 모듈식 RNA 또는 상기 모듈식 RNA를 코딩하는 상기 핵산 조성물을 포함하는 상기 전달 비히클을 포함하도록 허용하는 조건 하에서, 상기 포유동물의 세포를 상기 모듈식 RNA 분자, 상기 모듈식 RNA를 코딩하는 상기 핵산 조성물, 또는 상기 모듈식 RNA 또는 상기 모듈식 RNA를 코딩하는 상기 핵산 조성물을 포함하는 상기 전달 비히클과 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 모듈식 RNA는 제1항에 따른 것이고, 상기 핵산 조성물은 제6항에 따른 것이고, 상기 전달 비히클은 제16항에 따른 것인, 도입 방법.
  28. 선택된 표적 세포 RNA를 포함하는 포유동물의 세포에서 인-프레임의 하류 코딩 단백질의 발현을 허용하도록 중지 코돈의 ADAR 편집을 유발시키는 방법으로서, 방법은
    상기 포유동물의 상기 세포로 모듈식 RNA 분자를, 상기 모듈식 RNA가 상기 세포에 포함되는 조건 하에서, 도입시키는 단계를 포함하고, 상기 모듈식 RNA는 (i) 상기 선택된 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 상기 센서 도메인은 ADAR에 의해 편집가능한 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (ii) 이펙터 단백질을 코딩하는 도메인을 포함하는 3' 영역으로서, 상기 단백질 코딩 영역은 상기 센서 도메인과 인-프레임으로 이의 하류에 있는 것인 3' 영역을 포함하고,
    상기 포유동물에 상기 모듈식 RNA 분자의 도입 시에, RNA 듀플렉스가 상기 세포에서 상기 센서 도메인의 상기 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치 및 상기 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상기 상응하는 스트레치 간에 형성되고, 상기 RNA 듀플렉스는 상기 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하고, ADAR은 상기 RNA 듀플렉스에 포함되는 상기 중지 코돈을 편집하여서, 상기 단백질의 번역을 허용하며,
    상기 단백질은 상기 포유동물에서 생산되는 것인 유발 방법.
  29. 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법으로서, 방법은
    작용제를 제공하는 단계로서, 상기 작용제는 제1항에 따른 모듈식 RNA 분자, 또는 제6항에 따른 핵산 조성물 또는 제16항에 따른 전달 비히클을 포함하는 것인 단계; 및
    상기 포유동물의 선택된 세포에서 상기 이펙터 단백질의 번역을 허용하기위한 치료적 유효량으로 상기 작용제를 상기 포유동물에게 투여하여서, 상기 세포에서 상기 단백질을 생산하는 단계로서, 상기 세포에서 상기 단백질의 생산은 상기 포유동물에서 상기 질환 또는 장애의 치료를 제공하는 것인 단계
    를 포함하는 것인 치료 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 작용제는 제6항의 상기 조성물을 포함하거나 또는 제16항의 상기 전달 비히클이 투여되고, 상기 작용제에 포함되는 상기 이펙터 단백질을 코딩하는 상기 제1 단백질 코딩 영역은 상기 제2 단백질 코딩 영역의 발현을 활성화시키는 트랜스활성인자 단백질을 코딩하고, 상기 선택된 세포에서 상기 제2 단백질 코딩 영역의 발현은 상기 질환 또는 장애의 치료에서 치료적으로 유효한 것인 치료 방법.
  31. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 암 세포인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 암 세포는 전이성 암 세포인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 선택된 세포 RNA는 HER2를 코딩하고, 상기 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 상기 센서 도메인은 상기 HER2 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 모듈식 RNA의 상기 단백질 코딩 도메인은 CASP3, CASP9, BCL, GSDME, GSDMD, GZMA 및 GZMB로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  35. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유동물은 병원체에 감염되고, 상기 선택된 세포 RNA는 상기 선택된 세포에서 상기 병원체에 의해 발현되는 것인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 포유동물은 세포 RNA에 의해 코딩되어 발현되는 결함성 단백질을 포함하고,
    상기 모듈식 RNA 분자는
    상기 결함성 단백질을 코딩하는 상기 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 상기 센서 도메인의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치, 및
    상기 결함성 단백질의 야생형 기능성 단백질인 이펙터 단백질을 코딩하는 단백질 코딩 도메인을 포함하고,
    상기 포유동물에 상기 작용제의 도입 시에, 상기 모듈식 RNA 분자의 상기 센서 도메인의 상기 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치는 상기 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상기 상응하는 스트레치와 듀플렉스를 형성하고, 상기 듀플렉스는 상기 세포에서 ADAR에 의해 편집되고, 상기 야생형 기능성 단백질은 상기 포유동물에서 생산되는 것인 치료 방법.
  37. 제29항에 있어서, 선택된 세포는 심장 조직의 경색 구역 주위의 경계 구역 (BZ) 세포를 포함하고, 상기 선택된 세포 RNA는 NPPB, MYH7, ANKRD1, DES, UCHL1, JUN, 및 FOXP1 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 모듈식 RNA의 상기 단백질 코딩 도메인은 VEGFA를 코딩하는 것인 치료 방법.
  39. 제30항에 있어서, 상기 모듈식 RNA의 상기 단백질 코딩 영역은 트랜스활성인자를 코딩하고, 상기 포유동물의 상기 선택된 세포는 상기 트랜스활성인자의 제어 하에 VEGFa 유전자를 더 포함하는 것인 치료 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 선택된 세포 RNA는 NPPB RNA인 치료 방법.
  41. 제29항에 있어서, 상기 포유동물은 인간이고 교모세포종을 앓고 있고, 상기 선택된 세포는 암성 교모세포종 세포이며, 상기 선택된 세포 RNA는 SPARC 및/또는 VIM RNA이고, 상기 모듈식 RNA 분자는 상기 선택된 세포 SPARC 및/또는 VIM RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인을 포함하고, 상기 단백질 코딩 도메인은 캐스파제를 포함하는 것인 치료 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 모듈식 RNA 분자는 2개 직렬 인-프레임 센서 도메인을 포함하고, 상기 2개 직렬 인-프레임 센서 도메인 중 제1 도메인은 상기 선택된 세포 SPARC RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하고, 상기 2개 직렬 인-프레임 센서 도메인 중 제2 도메인은 상기 선택된 세포 VIM RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하며, 제1 RNA 듀플렉스는 상기 모듈식 RNA 분자 및 상기 선택된 세포 SPARC RNA 간에 형성되고, 제2 RNA 듀플렉스는 상기 모듈식 RNA 분자 및 상기 선택된 세포 VIM RNA 간에 형성되며, 상기 이펙터 단백질은 오직 상기 SPARC RNA 및 상기 VIM RNA 둘 모두의 존재 하에서만 발현되는 것인 치료 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 모듈식 RNA 분자의 상기 단백질 코딩 도메인은 자살 유전자 코딩 영역, 세포 사멸 유도 유전자 코딩 영역, 종양 억제인자 유전자 코딩 영역, 및 항-종양 면역력 증강 유전자 코딩 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 모듈식 RNA 분자의 상기 단백질 코딩 도메인은 항-종양 면역력을 증강시키는 단백질을 코딩하거나 또는 인터페론 β를 코딩하는 유전자의 코딩 영역을 포함하는 것인 치료 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 모듈식 RNA 분자의 상기 단백질 코딩 도메인은 자살 유전자의 단백질 코딩 영역을 포함하고, 자살 유전자는 티미딘 키나제 및 시토신 데아미나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 모듈식 RNA 분자의 상기 단백질 코딩 도메인은 세포 사멸 유도 유전자의 단백질 코딩 영역을 포함하고, 세포 사멸 유도 유전자는 캐스파제3, 캐스파제9, Bcl2 및 GSDM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  47. 제43항에 있어서, 상기 모듈식 RNA 분자의 상기 단백질 코딩 도메인은 종양 억제인자 유전자의 단백질 코딩 영역을 포함하고, 종양 억제인자 유전자는 Rb 및 PTEN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  48. 제29항에 있어서, 상기 환자는 미만성 거대 B 세포 림프종 (B NHL)을 앓고 있고, efRNA는 항CD19-CAR을 코딩하고, sesRNA는 CD3E인 치료 방법.
  49. 제48항에 있어서, PCAG-sesRNACD3E-CD19-CAR 플라스미드 또는 시험관내 전사된 mRNA는 T 세포 지향 흡수를 증강시키기 위해 i.v. 주사를 통해서 CD5-표적화 LNP에 의해 전달되는 것인 치료 방법 .
  50. 제29항에 있어서, 상기 환자는 크리글러-나자르 증후군 (CNS)을 앓고 있고, SES 표적은 Apoa2 (아포리포단백질 A-2), AHSG (알파 2-HS 당단백질) 및 알부민 (Alb) 유전자에 의해 전사된 RNA에 대해 지정되고, efRNA는 기능성 UGT1A1 유전자를 코딩하는 것인 치료 방법.
  51. 세포에서 단백질의 발현을 검출하는 방법으로서, 방법은
    a) 상기 세포에 모듈식 RNA 분자를, 상기 모듈식 RNA가 상기 세포에 포함되는 조건 하에서 도입시키는 단계로서, 상기 모듈식 RNA는 (i) 상기 선택된 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 센서 도메인을 포함하는 5' 영역으로서, 상기 센서 도메인은 ADAR에 의해 편집가능한 중지 코돈을 포함하는 것인 5' 영역; 및 (ii) 상기 단백질을 코딩하는 도메인을 포함하는 3' 영역으로서, 상기 단백질 코딩 영역은 상기 센서 도메인과 인-프레임으로 이의 하류에 있는 것인 3' 영역을 포함하고,
    상기 세포에 상기 모듈식 RNA 분자의 도입 시에, RNA 듀플렉스가 상기 세포에서 상기 센서 도메인의 상기 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치 및 상기 세포 RNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상기 상응하는 스트레치 간에 형성되고, 상기 RNA 듀플렉스는 상기 ADAR-편집가능 중지 코돈을 포함하고, ADAR은 상기 RNA 듀플렉스에 포함되는 상기 중지 코돈을 편집하여서, 상기 단백질의 번역을 허용하고, 상기 단백질이 상기 세포에서 생산되는 것인 단계; 및
    b) 상기 세포에서 상기 단백질을 검출하는 단계
    를 포함하는 것인 검출 방법.
  52. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 세포 유형은 단일유전인자 장애를 일으키는 단일 유전자 내 돌연변이를 갖는 세포이고, 모듈식 RNA 분자의 단백질 코딩 영역은 야생형 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  53. 제29항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 근이영양증, 낭포성 섬유증, 선천성 난청, 뒤센형 근이영양증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 혈색소증, 1형 신경섬유종증 (NF1), 겸상적혈구병 및 테이-삭스 병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일유전인자 장애이고, 모듈식 RNA 분자의 단백질 코딩 영역은 야생형 단백질을 코딩하는 것인 치료 방법.
  54. 제27항 또는 제28항에 있어서, 번역 시, 이펙터 단백질은 상기 세포에서 기능성인 방법.
  55. 제27항 또는 제28항에 있어서, 번역 시, 이펙터 단백질은 세포로부터 분비되는 것인 방법.
  56. 시험관내 샘플에서 바이러스의 존재를 검출하는 방법으로서, 방법은
    (1) 작용제를 제공하는 단계로서, 상기 작용제는 제1항에 따른 모듈식 RNA 분자를 포함하고, 상기 센서 도메인은 바이러스 RNA 또는 DNA의 연속적인 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 상보적인 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하고, 상기 이펙터 단백질은 표지를 코딩하는 것인 단계;
    (2) 상기 작용제를 상기 샘플과 인큐베이션시키는 단계로서, 상기 표지는 상기 바이러스 DNA 또는 RNA의 존재 하에서 발현되는 것인 단계
    를 포함하는 것인 검출 방법.
  57. 제45항에 있어서, 상기 자살 유전자는 시티딘 키나제이고, SEQ ID NO:150의 서열을 포함하는 것인 치료 방법.
  58. 제45항에 있어서, 상기 자살 유전자는 티미딘 키나제1이고, SEQ ID NO:151의 서열을 포함하는 것인 치료 방법.
  59. 제46항에 있어서, 상기 세포 사멸 유도 유전자는 캐스파제 3이고, SEQ ID NO:152의 서열을 포함하는 것인 치료 방법.
  60. 제46항에 있어서, 상기 세포 사멸 유도 유전자는 캐스파제 9이고, SEQ ID NO:153의 서열을 포함하는 것인 치료 방법.
  61. 제46항에 있어서, 상기 세포 사멸 유도 유전자는 BCL2이고, SEQ ID NO:154의 서열을 포함하는 것인 치료 방법.
  62. 제46항에 있어서, 상기 세포 사멸 유도 유전자는 GSDMD이고, SEQ ID NO:155의 서열을 포함하는 것인 치료 방법.
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