KR20240177794A - Composition Comprising Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine - Google Patents
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Abstract
본 발명은 질 유래 락토바실러스 람노서스 CBT LR6-feminine (Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine) 균주에 관한 것이다. 본 발명의 락토바실러스 람노서스 CBT LR6-feminine 균주는 젖산(lactic acid) 생성능 및 과산화수소 생성능이 우수하며, 질염 원인균뿐만 아니라, 요로감염 원인균에 대한 항균 활성을 가지며, 우수한 질 내 접착능, 내산성 및 내담즙성을 가지는 것으로 실험적으로 입증 및 확인하였으므로, 여성 건강과 관련된 질염의 예방, 완화 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.The present invention relates to a vaginal-derived Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine strain. The Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine strain of the present invention has excellent lactic acid production ability and hydrogen peroxide production ability, and has antibacterial activity against not only vaginitis-causing bacteria but also urinary tract infection-causing bacteria, and has excellent vaginal adhesiveness, acid resistance, and bile resistance. Therefore, it can be effectively used for the prevention, alleviation, or treatment of vaginitis related to women's health.
Description
본 발명은 락토바실러스 람노서스 CBT LR6-feminine (Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine) 균주 에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 균주, 이의 사균체 또는 이의 배양물에 관한 것이며, 이를 포함하는 항균용 조성물, 질염 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 질염 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 질염 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine strain, and more specifically, to the strain, a killed cell thereof, or a culture thereof, and to an antibacterial composition comprising the same, a pharmaceutical composition for preventing or treating vaginitis, a food composition for preventing or improving vaginitis, and an quasi-drug composition for preventing or improving vaginitis.
전 세계적으로 여성 인구의 3/4이 살아가면서 세균성 질염을 포함한 염증성 여성 질환의 감염을 겪으며, 이 중 50%는 재발을 경험하는 것으로 보고된다. 또한, 여성 질염의 60% 이상이 무증상 감염에 해당하며, 항생제, 스트레스, 폐경기 이후의 호르몬 변화 등을 겪으며 질염에 대한 감수성이 크게 증가하게 된다.Worldwide, 3/4 of the female population suffers from inflammatory female diseases, including bacterial vaginosis, during their lifetime, and 50% of them are reported to experience recurrence. In addition, more than 60% of female vaginitis is asymptomatic infection, and susceptibility to vaginitis increases significantly due to antibiotics, stress, and hormonal changes after menopause.
여성의 질은 외음부와 자궁의 연결 통로로 여성의 몸에서 가장 습기가 많고 따뜻한 곳이다. 따라서 질염의 주 원인인 세균이나 곰팡이가 서식하기 적합한 환경이므로 그로 인한 질환이 발생할 가능성이 크다. 정상적인 조건에서는 질 내부에 많은 유산균이 서식하면서 질 내부를 약산성으로 만들어 병원균이나 곰팡이가 증식하는 것을 억제하지만, 항생제 장기복용이나 피임약 장기복용, 탐폰이나 루프사용 또는 임신이나 출산, 수유, 폐경 등으로 여성 호르몬의 균형 변화 등의 이유로 질 내부의 균형이 깨어질 때 질 내에서 정상적인 조건에서는 성장이 통상적으로 억제되는 기회감염성 병원체의 증식이 일어나 질염이 발병할 수 있다. 질염은 세균성 질염(Bacterial vaginosis), 칸디다성 질염(Candida vaginitis), 트리코모나스 질염(Trichomonas vaginitis), 위축성 질염(Atrophic vaginitis) 등이 보고되어 있는데, 이 중 가장 흔한 질염은 세균성 질염이다.The vagina is the passage connecting the vulva and the uterus, and is the most moist and warm part of the female body. Therefore, it is a suitable environment for bacteria and fungi, which are the main causes of vaginitis, to grow, and there is a high possibility of disease caused by them. Under normal conditions, many lactic acid bacteria grow inside the vagina, making the inside of the vagina slightly acidic, which inhibits the growth of pathogens and fungi. However, when the balance inside the vagina is disrupted due to long-term use of antibiotics or birth control pills, use of tampons or loops, or changes in the balance of female hormones due to pregnancy, childbirth, breastfeeding, menopause, etc., opportunistic pathogens that normally grow under normal conditions can grow inside the vagina, causing vaginitis. Vaginitis has been reported to include bacterial vaginosis, candidal vaginitis, trichomoniasis, and atrophic vaginitis, but the most common vaginitis is bacterial vaginosis.
세균성 질염(Bacterial vaginosis)은 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)에 의해 발병한다. 이 질염은 질 내 산도의 불균형으로 질 내에 서식하는 유산균이 줄어드는 반면 1% 미만으로 존재하던 혐기성 세균이 과증식하여 발생한다. 정상 질 세균총의 변화를 일으키는 유발인자에 관해서는 알려져 있지 않으나, 잦은 성교나 질 세척으로 질의 반복되는 알칼리성화가 그 역할을 하는 것으로 추정되고 있다. 정상적으로 있어야 할 과산화수소를 생성하는 유산균이 소실되면 정상 질 세균총의 재생은 어려워지기 때문에 세균성 질염의 재발이 자주 일어난다. 또한 세균성 질염을 가진 여성은 골반내 감염(Pelvic inflammatory disease, PID), 유산 후 PID, 자궁 절제술 후 질정염(postoperative cuff cellulitis), 비정상 자궁경부 세포진 등 심각한 후유증의 빈도가 높아지며 임산부는 조기 양막파수, 조기진통, 조산, 융모양막염(chorioamnionitis), 제왕절개술 후 자궁내막염 등의 위험이 있다.Bacterial vaginosis is caused by Gardnerella vaginalis . This vaginitis occurs when the number of lactic acid bacteria residing in the vagina decreases due to an imbalance in vaginal acidity, while anaerobic bacteria, which account for less than 1%, proliferate. The causative factor that causes changes in the normal vaginal flora is unknown, but it is thought that repeated alkalinization of the vagina due to frequent sexual intercourse or vaginal douching plays a role. When the lactic acid bacteria that normally produce hydrogen peroxide disappear, it is difficult to regenerate the normal vaginal flora, so bacterial vaginosis often reoccurs. Additionally, women with bacterial vaginosis have a higher incidence of serious complications, including pelvic inflammatory disease (PID), post-miscarriage PID, postoperative cuff cellulitis, and abnormal cervical cytology, and pregnant women are at risk for premature rupture of membranes, preterm labor, preterm birth, chorioamnionitis, and post-cesarean endometritis.
세균성 질염과 함께 흔한 질환인 칸디다성 질염(Candida vaginitis)은 진균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)균이 습한 음부에 서식하면서 염증을 일으키는 질환으로서, 약 75%의 여성이 살아가는 동안 한 번 이상 질과 외음부의 칸디다성 질염을 겪으며 45%의 여성이 1년에 2회 이상의 재발을 겪는 흔한 질환이다. 건강한 사람의 구강, 장, 질 등에 정상적으로 보유하고 있는 칸디다(주로 Candida albicans)가 임신이나 경구용 피임약 장기 복용 등으로 여성 호르몬의 상태가 비정상적일 때, 감기나 당뇨병, 에이즈의 이유로 면역성이 극도로 쇠약할 때 감염을 유발하게 된다. 비만, 항생제의 알레르기나 관절염 등의 치료제로 쓰이는 부신 피질 호르몬의 복용 등에 의해서도 발병할 수 있다. 항생제의 투여로 인한 발병의 경우 항생제가 질 내의 유익한 유산균을 죽임으로써 발생하는데 이런 경우 재발의 가능성도 크다.Candidal vaginitis, a common disease along with bacterial vaginosis, is a disease in which the fungus Candida albicans lives in the moist genital area and causes inflammation. Approximately 75% of women experience vaginal and vulvar candidal vaginitis at least once during their lifetime, and 45% of women experience recurrence more than twice a year. Candida (mainly Candida albicans), which is normally present in the oral cavity, intestines, and vagina of healthy people, can cause infection when the female hormone status is abnormal due to pregnancy or long-term use of oral contraceptives, or when the immune system is extremely weakened due to colds, diabetes, or AIDS. It can also occur due to obesity, antibiotic allergies, or taking adrenal cortex hormones used to treat arthritis. In cases of outbreaks due to antibiotic administration, the antibiotics kill the beneficial lactic acid bacteria in the vagina, and in such cases, the possibility of recurrence is high.
최근에 여성의 질 내에 우점하고 있는 유산간균(Lactobacilli)이 세균성 질염의 위험을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 건강한 여성의 질은 다양한 종류의 유산간균이 군집하면서 질 내 pH를 4.5이하로 유지하여 다른 병원성 미생물의 생장을 억제하는 가장 중요한 방어 수단으로 알려져 있다.Recently, it has been known that Lactobacilli , which are prevalent in the vagina of women, reduce the risk of bacterial vaginosis. In general, the vagina of a healthy woman is known to be the most important defense mechanism that suppresses the growth of other pathogenic microorganisms by maintaining the pH of the vagina below 4.5 with various types of Lactobacilli colonizing it.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.The patent documents and references mentioned in this specification are incorporated by reference into this specification to the same extent as if each document was individually and specifically designated by reference.
본 발명자들은 여성 건강과 관련된 질염의 예방, 완화, 치료에 적용할 수 있는 프로바이오틱스 유산균 균주를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 젖산(lactic acid) 생성능 및 과산화수소 생성능이 우수한 질 유래 유산균을 개발하였고, 이 유산균이 질염 원인균뿐만 아니라, 요로감염 원인균에 대한 항균 활성을 가지며, 우수한 질 내 접착능, 내산성 및 내담즙성을 가지는 것으로 실험적으로 입증 및 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have conducted research efforts to develop probiotic lactic acid bacteria strains that can be applied to the prevention, alleviation, and treatment of vaginitis related to women's health. As a result, they developed vaginal lactic acid bacteria with excellent lactic acid production and hydrogen peroxide production abilities, and experimentally verified and confirmed that this lactic acid bacteria has antibacterial activity not only against vaginitis-causing bacteria but also against urinary tract infection-causing bacteria, and has excellent vaginal adhesiveness, acid resistance, and bile resistance, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 기탁번호 KCTC19091P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 CBT LR6-feminine (Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine) 균주를 제공하는 것에 있다.Accordingly, the purpose of the present invention is to provide a Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine strain deposited under the deposit number KCTC19091P.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 제공하는 것에 있다.Another object of the present invention is to provide a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, dead cells thereof, and cultures thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것에 있다.Another object of the present invention is to provide an antibacterial composition comprising a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, a dead cell thereof, and a culture thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 질염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating vaginitis, comprising (i) a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, its dead cells and its culture; and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 포함하는 질염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것에 있다.Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving vaginitis, comprising a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, a dead cell thereof, and a culture thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 포함하는 질염 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것에 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or improving vaginitis, comprising a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, a dead cell thereof, and a culture thereof.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.Other objects and technical features of the present invention are more specifically presented in the detailed description of the invention, the claims and the drawings below.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 기탁번호 KCTC19091P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 CBT LR6-feminine (Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine) 균주를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine strain deposited under the deposit number KCTC19091P.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 유전자를 포함할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the strain may comprise a 16S rRNA gene represented by sequence number 1.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균주는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 또는 대장균(Escherichia coli)에 항균 활성을 갖는다.According to one embodiment of the present invention, the strain has antibacterial activity against Candida albicans, Gardnerella vaginalis or Escherichia coli .
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, dead cells thereof, and cultures thereof.
본 발명에서 용어 “균주”란 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 임의의 가공형태를 포함하는 것으로 예를 들어 건조물, 동결물, 파쇄물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 '배양물'은 '발효물'을 포함하는 의미이며, 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등의 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다.The term “strain” in the present invention includes not only the live bacteria obtained from the culture medium, but also any processed form known to those skilled in the art, including, but not limited to, dried products, frozen products, and fragments. In addition, the term “culture” includes “fermented products,” and includes processed products derived from the culture solution itself, such as the culture solution cultured in a liquid medium, and the filtrate (centrifuged supernatant) obtained by filtering or centrifuging the culture solution to remove the strain.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, an antibacterial composition is provided, comprising a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, a dead cell thereof, and a culture thereof.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (i) 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 질염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. According to another aspect of the present invention, a pharmaceutical composition for preventing or treating vaginitis is provided, comprising (i) a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, a dead cell thereof, and a culture thereof; and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier.
상기 질염은 세균성 질염(Bacterial vaginosis), 칸디다성 질염(Candida vaginitis), 트리코모나스 질염(Trichomonas vaginitis) 및 위축성 질염(Atrophic vaginitis)을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 질병일 수 있으며, 바람직하게는 세균성 질염(Bacterial vaginosis) 또는 칸디다성 질염(Candida vaginitis)일 수 있다.The above vaginitis may be at least one disease selected from the group consisting of bacterial vaginosis, candida vaginitis, Trichomonas vaginitis, and atrophic vaginitis, and preferably bacterial vaginosis or candida vaginitis.
본 발명에서 용어 “예방”은 질환, 질병, 또는 질환으로 인한 증상을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환, 질병, 또는 증상에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환, 질병 또는 증상의 발생을 억제하는 것을 의미한다. The term “prevention” in the present invention means inhibiting the occurrence of a disease, condition or symptom in an animal that has not been diagnosed as having a disease, condition or symptom due to the disease, condition or symptom, but is prone to such disease, condition or symptom.
본 발명에서 용어 “치료”는 (i) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제, (ⅱ) 질환, 질병 또는 증상의 경감, 또는 (ⅲ) 질환, 질병 또는 증상의 제거를 의미한다. The term “treatment” in the present invention means (i) inhibition of the development of a disease, condition or symptom, (ii) alleviation of a disease, condition or symptom, or (iii) elimination of a disease, condition or symptom.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in formulation, and include, but are not limited to, carbohydrate compounds (e.g., lactose, amylose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, cellulose, etc.), acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, salt solutions, alcohol, gum arabic, vegetable oils (e.g., corn oil, cottonseed oil, soy milk, olive oil, coconut oil), polyethylene glycol, methyl cellulose, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain, in addition to the above components, a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, etc. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 - 1000 mg/kg (체중)이다. The suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be prescribed variously depending on factors such as the formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. Meanwhile, the oral dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001 to 1000 mg/kg (body weight) per day.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be manufactured in a unit dose form or can be manufactured by introducing it into a multi-dose container by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person having ordinary skill in the art to which the present invention pertains. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granules, tablets or capsules, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 포함하는 질염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a food composition for preventing or improving vaginitis is provided, comprising a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, a dead cell thereof, and a culture thereof.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 또는 식품 첨가제(food additives)로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The food composition of the present invention can be manufactured as a functional food, a nutritional supplement, a health food, or a food additive, but is not limited thereto.
본 발명의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있으며, 예를 들어, 발효유와 같은 음료, 또는 분말 형태로도 제조될 수 있다. The food composition of the present invention can be manufactured in various forms according to conventional methods known in the art, and can be manufactured in the form of, for example, a beverage such as fermented milk, or a powder.
본 발명의 식품 조성물은 상술한 본 발명의 유효성분 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. The food composition of the present invention contains not only the effective ingredient of the present invention described above, but also components commonly added during food manufacturing, such as proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings, and flavoring agents. Examples of the carbohydrates described above include monosaccharides, such as glucose, fructose, etc.; disaccharides, such as maltose, sucrose, oligosaccharides, etc.; and polysaccharides, such as dextrin, cyclodextrin, etc., and conventional sugars and sugar alcohols, such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As flavoring agents, natural flavoring agents [thaumatin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.]) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
본 발명의 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출물, 대추 추출물, 감초 추출물 등을 추가로 포함시킬 수 있다. When the food composition of the present invention is manufactured in the form of a beverage, citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, juice, Eucommia extract, jujube extract, licorice extract, etc. may be additionally included in addition to the effective ingredient of the present invention.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 균주, 이의 사균체 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 포함하는 질염 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a pharmaceutical composition for preventing or improving vaginitis is provided, comprising a composition comprising at least one selected from the group consisting of the strain, a dead cell thereof, and a culture thereof.
본 발명의 락토바실러스 람노서스 CBT LR6-feminine (Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine) 균주를 의약외품 조성물로 사용할 경우, 상기 균주, 이의 사균체 또는 이의 배양물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다.When the Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine strain of the present invention is used as an quasi-drug composition, the strain, its dead cells or its culture may be added as is or used together with other quasi-drug ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. The mixing amount of the effective ingredients may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). Preferably, the quasi-drug composition may be a disinfectant, shower foam, gargle, wet tissue, detergent soap, hand wash, humidifier filler, mask, ointment or filter filler.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 상술한 본 발명의 다른 일 양태에서 설명된 내용과 동일하므로 이들을 원용하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.Considering the complexity of this specification, the overlapping contents are identical to those described in other aspects of the present invention described above, and therefore, they are cited, and terms not otherwise defined in this specification have the meanings commonly used in the technical field to which the present invention belongs.
이상에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명의 질 유래 락토바실러스 람노서스 CBT LR6-feminine (Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine) 균주는 젖산(lactic acid) 생성능 및 과산화수소 생성능이 우수하며, 질염 원인균뿐만 아니라, 요로감염 원인균에 대한 항균 활성을 가지며, 우수한 질 내 접착능, 내산성 및 내담즙성을 가지는 것으로 실험적으로 입증 및 확인하였으므로, 여성 건강과 관련된 질염의 예방, 완화 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. As described in detail above, the Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine strain of the present invention has excellent lactic acid production ability and hydrogen peroxide production ability, and has antibacterial activity against not only vaginitis-causing bacteria but also urinary tract infection-causing bacteria, and has excellent vaginal adhesiveness, acid resistance, and bile resistance. Therefore, it has been experimentally proven and confirmed that it can be effectively used for the prevention, alleviation, or treatment of vaginitis related to women's health.
도 1은 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주 및 분리균주 3종(L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3)의 유기산 생성능을 측정한 결과이다.
도 2는 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주 및 분리균주 3종(L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3)의 과산화수소 생성능을 측정한 결과이다.
도 3은 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주 및 분리균주 3종(L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3)의 유해균 저해능(항균능)을 측정한 결과이다.
도 4는 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주 및 분리균주 3종(L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3)의 공동응집 분석(co-aggregation assay)에 의한 유해균 접착능을 측정한 결과이다.
도 5는 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주 및 분리균주 3종(L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3)의 자궁경부암세포주 HeLa와의 부착능 분석에 의한 질 내 접착능을 측정한 결과이다.
도 6은 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주 및 분리균주 3종(L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3)의 내산성 분석에 의한 산성 혐기성 내 배양성을 측정한 결과이다.
도 7은 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주 및 분리균주 3종(L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3)의 내담즙성을 측정한 결과이다.Figure 1 shows the results of measuring the organic acid production ability of the control strain L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type), L. rhamnosus LGG (LGG) strain, and three isolated strains ( L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3).
Figure 2 shows the results of measuring the hydrogen peroxide production ability of the control strain L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type), L. rhamnosus LGG (LGG) strain, and three isolated strains ( L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3).
Figure 3 shows the results of measuring the inhibitory activity (antibacterial activity) against harmful bacteria of the control strain L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type), L. rhamnosus LGG (LGG) strain, and three isolated strains ( L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3).
Figure 4 shows the results of measuring the adhesive ability of harmful bacteria by co-aggregation assay of the control strain L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type), L. rhamnosus LGG (LGG) strain, and three isolated strains ( L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3).
Figure 5 shows the results of measuring the intravaginal adhesiveness of the control strain L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type) and L. rhamnosus LGG (LGG) and three isolated strains ( L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3) against the cervical cancer cell line HeLa by adhesion analysis.
Figure 6 shows the results of measuring the cultivability in acidic anaerobic conditions through acid resistance analysis of the control strain L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type), L. rhamnosus LGG (LGG) strain, and three isolated strains ( L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3).
Figure 7 shows the results of measuring the bile resistance of the control strain L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type), L. rhamnosus LGG (LGG) strain, and three isolated strains ( L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3).
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.The specific embodiments described in this specification are meant to represent preferred embodiments or examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereby. It will be apparent to those skilled in the art that modifications and other uses of the present invention do not depart from the scope of the invention described in the claims of this specification.
실시예 1: 건강한 한국인 여성의 질 유래 균주 분리Example 1: Isolation of strains derived from the vagina of healthy Korean women
2022년 건국대학교 산부인과로부터 19살부터 50살의 건강한 20명의 한국인(Nugent score 3점 이하) 자원자의 질 면봉(vaginal swab) 검체를 IRB 심의 하에 vaginal swap kit (Noblebio, South korea)를 사용하여 전달받았다(KUMC 2022-04-030). 상기 질 면봉(vaginal swab) 검체는 곧바로 MRS 배양액(Difco)으로 0.01%의 아지드화나트륨(sodium azide)을 넣은 조건 하에 37℃에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 배양된 콜로니는 균주(strain) 동정을 위해 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 및 1492R (5′-GGTTACCTTGTTAGACTT-3′) 프라이머를 이용하여 16S rDNA PCR을 진행하였으며, PCR 산물로 분석된 16S rRNA 유전자(16S rDNA)의 염기서열은 서열번호 1과 같으며, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus (L. rhamnosus)) 균주로 동정되었다. 이후 3종의 L. rhamnosus가 분리 동정되었으며, 각각의 균주명을 순서대로 L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, L. rhamnosus LR6-v3로 명명하였다.Vaginal swab specimens from 20 healthy Korean volunteers (Nugent score 3 or lower) aged 19 to 50 years were received from the Department of Obstetrics and Gynecology, Konkuk University in 2022 using a vaginal swap kit (Noblebio, South Korea) under IRB review (KUMC 2022-04-030). The vaginal swab specimens were immediately cultured at 37°C in MRS culture medium (Difco) containing 0.01% sodium azide. After 24 hours of incubation, the cultured colony was subjected to 16S rDNA PCR using the primers 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) and 1492R (5′-GGTTACCTTGTTAGACTT-3′) for strain identification. The base sequence of the 16S rRNA gene (16S rDNA) analyzed from the PCR product is the same as SEQ ID NO: 1, and it was identified as a Lactobacillus rhamnosus ( L. rhamnosus ) strain. Afterwards, three strains of L. rhamnosus were isolated and identified, and the strain names were named as L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, and L. rhamnosus LR6-v3, respectively.
실시예 2: 균주 배양 조건(strain and culture condition)Example 2: Strain and culture condition
대조군으로 사용된 균주는 Lactobacillus rhamnosus (L. rhamnosus) ATCC 7469, Lactobacillus rhamnosus (L. rhamnosus) LGG이며 분리균주 3종을 포함하여 총 5종의 Lactobacillus rhamnosus (L. rhamnosus) 균주가 본 발명의 실시예에 사용되었으며 모두 MRS 배지에서 37℃에서 18시간 배양하였다. 칸디다성 질염 (Candida vaginitis) 원인균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans (C. albicans))와 요로감염 원인균인 대장균(Escherichia coli (E. coli))은 각각 YPD와 TSB 배지를 사용하여 37℃에서 18시간 호기배양하였고, 세균성 질염(Bacterial vaginosis) 원인균인 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis (G. vaginalis))는 TSB(k1-hemin solution) 배지로 37℃에서 24시간 혐기배양하였다. The strains used as controls were Lactobacillus rhamnosus ( L. rhamnosus ) ATCC 7469, Lactobacillus rhamnosus ( L. rhamnosus ) LGG, and a total of five Lactobacillus rhamnosus ( L. rhamnosus ) strains, including three isolated strains, were used in the examples of the present invention, and all were cultured in MRS medium at 37°C for 18 hours. Candida albicans ( C. albicans ), the causative agent of Candida vaginitis, and Escherichia coli ( E. coli ), the causative agent of urinary tract infection, were cultured aerobically at 37°C for 18 hours using YPD and TSB media, respectively, and Gardnerella vaginalis ( G. vaginalis ), the causative agent of bacterial vaginosis, was cultured anaerobically at 37°C for 24 hours using TSB (k1-hemin solution) media.
실시예 3: 유기산 생성능 측정(acid producing ability)Example 3: Measurement of acid producing ability
Lactobacillus 속은 젖산을 포함한 유기산을 다량 생성하여 주변 환경에 pH를 떨어뜨려 주변 병원성 미생물의 증식을 억제하는 특징이 있다. 특히, 질 내 환경은 Lactobacillus 속이 우점하여 산성 조건을 유지하는 것이 매우 중요하다. 분리된 균주들의 산 생성능을 확인하기 위해, 각각의 유산균을 MRS 배지를 이용하여 37℃에서 배양하였다. 배양액의 균체는 원심분리하여 제거하였고 0.45μm의 필터를 이용하여 비가열 멸균을 진행하였다. 이후 HPLC(agilent)를 이용하여 배양여액의 초산(acetic acid)와 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid)의 농도를 측정하였다. 그 결과, 대조군 균주와 비교하여 분리균주의 유기산 생성능이 통계적으로 우수한 것으로 확인하였다(도 1). 특히, 젖산의 농도는 분리균주 3종(LR6-v1, LR6-v2, LR6-v3) 모두 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주에 비해 매우 유의하게 높은 것으로 확인하였다(도 1).The genus Lactobacillus has the characteristic of producing a large amount of organic acids including lactic acid, which lowers the pH of the surrounding environment and inhibits the growth of surrounding pathogenic microorganisms. In particular, the vaginal environment is dominated by the genus Lactobacillus, so it is very important to maintain acidic conditions. To confirm the acid-producing ability of the isolated strains, each lactic acid bacteria was cultured at 37℃ using MRS medium. The cells in the culture solution were removed by centrifugation and sterilized without heat using a 0.45 μm filter. Afterwards, the concentrations of acetic acid, citric acid, and lactic acid in the culture filtrate were measured using HPLC (agilent). As a result, it was confirmed that the organic acid-producing ability of the isolated strain was statistically superior to that of the control strain (Fig. 1). In particular, the concentration of lactic acid was confirmed to be significantly higher in all three isolated strains (LR6-v1, LR6-v2, LR6-v3) compared to the control strains L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type) and L. rhamnosus LGG (LGG) (Fig. 1).
실시예 4: 과산화수소 생성능 측정(hydrogen peroxide producing ability)Example 4: Measurement of hydrogen peroxide producing ability
Lactobacillus 속은 유기산 생성에 의한 산성화뿐만 아니라 과산화수소를 생성하여 세균뿐만 아니라 바이러스나 효모에 대한 광범위한 항균 활성을 나타낸다. 분리균주의 과산화수소 생성능을 확인하기 위해, 각각의 유산균을 TMB(1,3,5-trimethyl benzene)-MRS 고체배지를 이용하여 37℃, 혐기조건에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 30분간 호기상태로 노출시켜 과산화수소를 생성하게 한 뒤 콜로니의 색상 변화를 관찰하였다. 그 결과, 분리균주 3종(LR6-v1, LR6-v2, LR6-v3) 모두 대조군 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 비교하여 푸른색으로 변한 것을 확인할 수 있었다. 이를 토대로 L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2 및 L. rhamnosus LR6-v3 균주가 과산화수소 생성능이 우수한 것으로 확인하였다(도 2). Lactobacillus genus exhibits a wide range of antibacterial activity against not only bacteria but also viruses and yeast by producing hydrogen peroxide as well as acidification through organic acid production. To confirm the hydrogen peroxide production ability of the isolated strains, each lactic acid bacteria was cultured for 48 h under anaerobic conditions at 37℃ using TMB (1,3,5-trimethyl benzene)-MRS solid medium. After culturing, the cultures were exposed to aerobic conditions for 30 minutes to produce hydrogen peroxide, and then the color change of the colonies was observed. As a result, it was confirmed that all three isolated strains (LR6-v1, LR6-v2, LR6-v3) turned blue compared to the control group, L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type). Based on this, it was confirmed that L. rhamnosus LR6-v1, L. rhamnosus LR6-v2, and L. rhamnosus LR6-v3 strains had excellent hydrogen peroxide production abilities (Fig. 2).
실시예 5: 유해균 저해능(항균능) 측정Example 5: Measurement of harmful bacteria inhibition ability (antibacterial activity)
대조군 및 분리균주의 질염 원인균 및 요로감염 원인균에 대한 항균력을 확인하기 위해 질염 원인균인 C. albicans와 G. vaginalis, 요로감염 원인균인 E. coli 를 각각 YPD, LB 및 TSB 배지를 사용하여 96-웰 플레이트에 접종한 후, Lactobacillus 속 균주들의 배양여액을 처리하여 37℃ 조건에서 18시간 혐기 배양하였고 상기 유해균(질염 원인균, 요로감염 원인균)에 대한 생장 저해 능력은 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, L. rhamnosus LR6-v3 균주에서 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type) 또는 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주에 비해 유사하거나 우수한 유해균 저해능(항균능)을 가지는 것으로 확인하였다(도 3).To confirm the antibacterial activity of the control group and the isolated strains against vaginitis and urinary tract infection pathogens, C. albicans and G. vaginalis , which are vaginitis pathogens, and E. coli , which is a urinary tract infection pathogen, were inoculated into 96-well plates using YPD, LB, and TSB media, respectively, and the culture filtrates of Lactobacillus strains were treated and anaerobically cultured for 18 hours at 37℃. The growth inhibition ability against the harmful bacteria (vaginitis pathogens, urinary tract infection pathogens) was measured by measuring the absorbance at a wavelength of 600 nm. As a result, it was confirmed that the L. rhamnosus LR6-v3 strain had similar or superior harmful bacteria inhibition ability (antibacterial activity) compared to the control group, L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type) or L. rhamnosus LGG (LGG) strain (Fig. 3).
실시예 6: 유해균 접착능 측정(co-aggregation assay)Example 6: Measurement of harmful bacteria adhesion (co-aggregation assay)
질 내에 살고 있는 균주들은 표면에 부착하여 군집을 이루며 살아가는데 프로바이오틱스는 이에 물리적으로 흡착하여 성장 및 부착을 방해하는 기능을 가진다. 이에 대조군 및 분리균주가 유해균과 얼마나 잘 접착하여 프로바이오틱스로써의 기능을 가질 수 있는지 확인하기 위하여, 질염 원인균인 C. albicans와 G. vaginalis, 요로감염 원인균인 E. coli를 사용하여 공동응집 분석(co-aggregation assay)을 수행하였다. 상기 유해균(질염 원인균, 요로감염 원인균)과 Lactobacillus 속 균주를 각각 600 nm에서 흡광도를 1로 맞춰 균체 비율을 동일하게 한 뒤 PBS로 2번 세척한 후 함께 PBS에 다시 접종하여 37℃ 조건에서 24시간 동안 반응시킨 후 PBS 균주 현탁액의 윗부분 1 mL씩 채취하여 다시 600 nm에서 흡광도를 측정하여 반응 전과 후의 차이를 공동응집 비율(co-aggregation ratio)을 계산하였다. 그 결과, 질염 원인균 및 요로감염 원인균에 대한 접착능력이 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (type) 또는 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주에 비해 분리균주 3종(v1, v2, v3) 모두 우수한 것으로 나타났다(도 4). The strains living in the vagina attach to the surface and live in colonies, but probiotics physically adsorb to them and inhibit their growth and attachment. Therefore, in order to confirm how well the control group and the isolated strains attach to harmful bacteria and function as probiotics, a co-aggregation assay was performed using C. albicans and G. vaginalis , which are causes of vaginitis, and E. coli , which is the cause of urinary tract infection. The harmful bacteria (causative bacteria of vaginitis and urinary tract infection) and Lactobacillus strains were each adjusted to have an absorbance of 1 at 600 nm to make the cell ratio the same, then washed twice with PBS and re-inoculated together in PBS and reacted for 24 hours under 37℃ conditions. After collecting 1 mL of the upper part of the PBS strain suspension, the absorbance was measured at 600 nm again, and the co-aggregation ratio was calculated as the difference before and after the reaction. As a result, all three isolated strains (v1, v2, v3) were found to have superior adhesive ability to the causative bacteria of vaginitis and urinary tract infection compared to the control strains , L. rhamnosus ATCC 7469 (type) or L. rhamnosus LGG (LGG) (Fig. 4).
실시예 7: 질 내 접착능 측정(cell adhesion assay)Example 7: Measurement of adhesion in the vagina (cell adhesion assay)
자궁경부암세포주 HeLa에 대조군 및 분리균주의 세포 부착능을 확인하기 위하여 HeLa 세포를 5 X 104 cells/웰로 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. 대조군 및 분리균주 현탁액(2 X 108 cfu/mL)을 500 μL씩 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 HeLa 세포를 멸균 PBS로 세척한 후 멸균 증류수로 HeLa 세포를 플레이트에서 떼어내었다. 상기 생존세포에 부착된 대조군 및 분리균주의 생균수를 측정하기 위하여 MRS 고체배지에 접종하여 37℃ 배양기에 24시간 배양한 후, 배양 증식한 균주를 colony counting 방법으로 계수한 결과, L. rhamnosus LR6-v2 및 L. rhamnosus LR6-v3 균주에서 대조군인 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)와 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주에 비해 통계적으로 유의하게 자궁경부암세포에 잘 부착하는 것으로 확인하였다(도 5).To confirm the cell adhesion ability of the control and isolated strains to the cervical cancer cell line HeLa, HeLa cells were seeded at 5 X 10 4 cells/well and cultured in an incubator at 37°C, 5% CO 2 for 48 hours, and then washed twice with PBS. 500 μL of the control and isolated strain suspensions (2 X 10 8 cfu/mL) were added to each well, and then cultured at 37°C for 1 hour. The cultured HeLa cells were washed with sterile PBS, and then the HeLa cells were detached from the plate with sterile distilled water. In order to measure the number of viable cells of the control and isolated strains attached to the above-mentioned surviving cells, the strains were inoculated onto MRS solid medium and cultured in an incubator at 37℃ for 24 hours. The cultured strains were counted using the colony counting method. As a result, it was confirmed that L. rhamnosus LR6-v2 and L. rhamnosus LR6-v3 strains attached to cervical cancer cells statistically significantly better than the control strains, L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type) and L. rhamnosus LGG (LGG) (Fig. 5).
실시예 8: 산성 혐기성 내 배양성 측정(내산성 분석(acid tolerance assay))Example 8: Measurement of culturability in acidic anaerobic conditions (acid tolerance assay)
질 내 환경은 보통 혐기상태이며 pH가 4 ~ 5.5의 산성인 조건으로 균주가 자라기 힘든 환경이다. 따라서, 이러한 산성 혐기성 조건에서 균주 배양성의 차이는 정착 이후에 매우 주요한 요건이 될 수 있다. 대조군 및 분리균주의 내산성을 확인하기 위하여 유산균 배양 배지인 MRS 배지를 pH 별로 조정하여 배양을 진행하였다. 상기 배양 배지는 pH 3, 4, 5 및 6까지 보정하였고, 37℃, 혐기 조건으로 18시간 배양하였다. 배양완료 이후 595 nm의 파장을 이용하여 흡광도를 측정한 후 분석결과를 도 6에 나타내었다. 그 결과, pH 3 조건에서는 균주 별로 큰 차이없이 모두 OD 값이 0.2 정도의 생장 저해를 나타내었지만, pH 4 조건에서는 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type) 균주에 비해 L. rhamnosus LR6-v2 및 L. rhamnosus LR6-v3 균주가 유의하게 우수한 내산성을 가지며, L. rhamnosus LGG (LGG) 균주에 비해 L. rhamnosus LR6-v3 균주가 유의하게 우수한 내산성을 가지는 것으로 나타났다. pH 5 조건에서는 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type) 및 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주에 비해 L. rhamnosus LR6-v1, LR6-v2 및 LR6-v3 균주가 유의하게 우수한 내산성을 가지는 것으로 나타났다. 또한, pH 6 조건에서는 L. rhamnosus LR6-v3 균주가 가장 우수한 내산성을 가지는 것으로 확인하였다.The vaginal environment is usually anaerobic and has an acidic pH of 4 to 5.5, which is an environment in which it is difficult for strains to grow. Therefore, the difference in strain cultivability under these acidic anaerobic conditions can be a very important requirement after settlement. In order to confirm the acid resistance of the control group and the isolated strain, the MRS medium, a lactic acid bacteria culture medium, was adjusted according to pH and cultured. The culture medium was adjusted to pH 3, 4, 5, and 6, and cultured at 37°C under anaerobic conditions for 18 hours. After the culture was completed, the absorbance was measured using a wavelength of 595 nm, and the analysis results are shown in Fig. 6. As a result, under pH 3 conditions, all strains showed growth inhibition of about 0.2 OD values without much difference, but under pH 4 conditions, L. rhamnosus LR6-v2 and L. rhamnosus LR6-v3 strains showed significantly better acid resistance than L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type) strain, and L. rhamnosus LR6-v3 strain showed significantly better acid resistance than L. rhamnosus LGG (LGG) strain. Under pH 5 conditions, L. rhamnosus LR6-v1, LR6-v2, and LR6-v3 strains showed significantly better acid resistance than L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type) and L. rhamnosus LGG (LGG) strains. In addition, under pH 6 conditions, L. rhamnosus LR6-v3 strain was confirmed to have the best acid resistance.
실시예 9: 내담즙성 측정(bile acid tolerance)Example 9: Measurement of Bile Acid Tolerance
대조군 및 분리균주의 내담즙성을 확인하기 위하여, 유산균 배양 배지인 MRS에 oxgall을 0.3% 또는 0.5%를 첨가하여 37℃ 혐기성 조건에서 4시간 배양하였다. 배양완료 후 희석하여 MRS 고체배지에 접종하여 다시 동일 조건으로 24시간 배양한 후 생균수를 측정하여 내담즙성을 분석하였다(도 7). 그 결과, 0.5% oxgall 첨가 배지에서는 대조군 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)에 비해 또 다른 대조군 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주 및 분리균주 3종(L. rhamnosus LR6-v1, LR6-v2 및 LR6-v3)의 생존율(내담즙성)이 모두 낮은 것으로 나타났으나, 0.3% oxgall 첨가 배지에서는 대조군 L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type)에 비해 또 다른 대조군 L. rhamnosus LGG (LGG) 균주 및 분리균주 L. rhamnosus LR6-v3가 함께 우수한 생존율(내담즙성)을 나타내는 것으로 확인하였다.To confirm the bile resistance of the control group and the isolated strain, 0.3% or 0.5% oxgall was added to MRS, a lactic acid bacteria culture medium, and cultured for 4 hours under anaerobic conditions at 37℃. After culture was completed, the solution was diluted and inoculated onto MRS solid medium, and cultured again for 24 hours under the same conditions, and the number of viable cells was measured to analyze the bile resistance (Fig. 7). As a result, in the medium supplemented with 0.5% oxgall, the survival rates (bile tolerance) of another control strain L. rhamnosus LGG (LGG) and three isolated strains ( L. rhamnosus LR6-v1, LR6-v2, and LR6-v3) were all lower than those of the control strain L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type). However, in the medium supplemented with 0.3% oxgall, it was confirmed that another control strain L. rhamnosus LGG (LGG) and the isolated strain L. rhamnosus LR6-v3 together showed superior survival rates (bile tolerance) than those of the control strain L. rhamnosus ATCC 7469 (LR type).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is obvious to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred implementation examples and that the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
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Claims (8)
Lactobacillus rhamnosus CBT LR6-feminine strain deposited under the accession number KCTC19091P.
상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 균주.
In the first paragraph,
A strain characterized in that the strain comprises a 16S rRNA gene represented by sequence number 1.
상기 균주는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 또는 대장균(Escherichia coli)에 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 균주.
In the first paragraph,
The strain is characterized in that it has antibacterial activity against Candida albicans, Gardnerella vaginalis or Escherichia coli .
A composition comprising at least one selected from the group consisting of a strain according to any one of claims 1 to 3, a dead cell thereof, and a culture thereof.
An antibacterial composition comprising a composition according to claim 4.
(i) a composition according to paragraph 4; and (ii) a pharmaceutical composition for preventing or treating vaginitis, comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
A food composition for preventing or improving vaginitis, comprising a composition according to Article 4.
A pharmaceutical composition for preventing or improving vaginitis, comprising a composition according to Article 4.
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