KR20250005214A - 클로토 단백질을 발현시키는 유전자 요법을 통한 신경근 질환의 치료 - Google Patents

Abstract

본 개시는, 예를 들어 신경근 장애 또는 질환에서 나타날 수 있는 운동 손상의 치료에 사용하기 위한, 근육 세포 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 포유류 s-KL을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 유전자 작제물을 제공하며, 근육 세포 특이적 프로모터와 같은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 포유류 s-KL을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 유전자 작제물을 함유하는 근육 세포 및 운동 신경 향성을 갖는 바이러스 및 비-바이러스 벡터의 활용은, 상기 발현 벡터를 함유하는 약학적 조성물, 상기 발현 벡터를 함유하는 단리된 세포, 그리고 운동 손상 및 운동 신경 질환을 치료하는 방법으로 전달된다.

Description

클로토 단백질을 발현시키는 유전자 요법을 통한 신경근 질환의 치료

관련 출원

본 출원은, 35 U.S.C. § 119(e)에 따라 2022년 4월 13일에 출원된, 미국 가출원 제63/330,684호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

기술 분야

본 개시는 의학 분야에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 운동 장애 및 근위축성 측색 경화증과 같은 운동 신경 질환을 특징으로 하는 신경근 장애 또는 질환을 치료하기 위한 의학적 접근법에 관한 것이다.

서열 목록

본 출원은 ASCHII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 통합된다. 2023년 4월 11일에 생성된 상기 XML 사본의 명칭은 58578-001PCT .xml이며, 그 파일 크기는 162 KB 바이트이다.

국제 신경조절학회(International Neuromodulation Society)에 따르면, 운동 장애는 신체 부위, 일반적으로 사지 중 하나 또는 사지의 기능의 부분적 또는 전체적 상실을 수반한다. 운동 장애를 유발하는 질환은 근육 약화, 불량한 체력(즉, 피로), 근육 조절 부족, 또는 완전 마비를 야기할 수 있다. 운동 장애는 신체 장애의 주요 원인이다. 이는 근육에 영향을 미치는 말초 문제, 근육으로의 출력에 영향을 미치는 중추신경계의 문제, 및 근육, 움직임 및 균형에 영향을 미치는 감각 문제에 의해 광범위하게 야기된다. 운동 손상은 신경근 질환, 신경 병태, 및 운동 신경 질환에서 주로 나타나지만, 중추 및 말초 신경계의 암, 또는 심지어 외상성 손상으로부터 발생할 수 있다.

신경근 질환은 척수 또는 중추신경계(CNS), 말초 신경계(PNS), 신경근 접합부, 또는 골격근의 운동 신경에 영향을 미치는 임의의 질환이며, 이들 모두는 운동 유닛의 구성 요소로서, 궁극적으로 대상체의 운동 능력에 영향을 미친다. 척수, CNS, PNS, 신경근 접합부, 또는 골격근에서의 운동 신경에 대한 손상은 근육 위축 및 쇠약을 야기할 수 있다. 감각 문제 또한 발생할 수 있다. 신경근 질환은 후천성 또는 유전적일 수 있다. 500개가 넘는 유전자의 돌연변이가 신경근 질환의 원인인 것으로 밝혀졌다. 다른 원인은 신경 또는 근육의 퇴행, 자가면역, 독소, 약물, 영양실조, 대사 이상, 호르몬 불균형, 감염, 신경 압박/포획, 혈액 공급 부족, 및 외상을 포함한다.

신경근 질환 및 장애의 예는, 근위축성 측색 경화증(ALS), 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth)병, 다발성 경화증, 근육 이영양증, 중증근무력증, 근육병증, 다발성근염 및 피부근염을 포함하는 근육염, 말초 신경병증, 신경근긴장증, 램버트-이튼(Lambert-Eaton)병, 프리드라이히(Friedreich) 운동실조증, 척추 근육 위축증(SMA), 척수 손상, 말초 신경 손상, 외상성 신경 손상, 및 근육 대사 질환을 포함한다. 이들 신경근 질환 중 일부는, 운동 신경 질환, 또는 신체의 수의근을 제어하는 세포인 운동 신경에 선택적으로 영향을 미치는 희귀 신경퇴행성 장애의 군인, 운동 신경 질환(MND)으로 추가로 분류된다. MND의 예는 근위축성 측색 경화증(ALS), 진행성 연수 마비(PBP), 가성연수 마비, 진행성 근육 위축증(PMA), 원발성 측색 경화증(PLS), 척수성 근육 위축증(SMA), 및 단핵성 근위축증(MMA)뿐만 아니라 ALS와 유사한 일부 희귀 변형을 포함한다.

근위축성 측색 경화증(ALS)은 운동계의 치명적인 신경퇴행성 장애이고 가장 빈번한 형태의 운동성 질환(MND)으로서, 이의 발생률은 매년 100,000명당 1 내지 5명이다. ALS 환자는 근육의 진행성 약화 및 마비를 앓고 있으며, 일반적으로 진단 후 2~5년 이내에 대부분 호흡 부전으로 인해 사망한다. 임의의 골격근이 이에 영향을 받을 수 있으며, 이는 환자 간에 다수의 상이한 임상 증상으로 이어진다. 이들은 경련으로부터 근경련, 현저한 쇠약 및 근육 위축, 과다반사 및 경직에 이르기까지 다양하게 나타나며, 일부 경우에는 기분 및 기억 기능을 변경시킨다. 여기에는 산발성 ALS(sALS)이 대부분의 사례를 차지하며, 이의 발병은 약 60세 연령에서 최고로 나타난다. 해당 사례의 약 5~10%는 유전된 돌연변이에 의해 야기되는 가족성(fALS)이며, 대부분 상염색체 우성을 동반하고, 이의 발병은 산발성 사례 대비 10년 더 이른 연령에서 발생한다. 25세 미만의 환자에서의 사례는 청소년 발병 ALS(jALS)로 지정되며, 일반적으로 상염색체 열성 유전을 동반한다. 가장 흔한 fALS 유전적 원인 중 일부는 육종(FUS) 내에 융합된, Cu/Zn 초산화물 디스뮤타아제 1(SOD1), TAR-DNA 결합 단백질(TDP-43) 중의 돌연변이 및 염색체 9 개방 해독 프레임 72(C9orf72)의 헥사뉴클레오티드 반복 확장이다. ALS의 신경병리학적 특징은, 다른 MND와 구별되는, 상부 및 하부 운동신경(MN) 둘 모두에 영향을 미친다는 것이다. 신경퇴행은 피질척수 및 피질연수관에서 발생하며, 이는 일차 운동 피질 및 뇌간 및 척수의 전각에서의 대형 피라미드 신경의 손실을 동반한다.

종판(endplate)의 탈신경 및 축삭의 수축은 "후방-사멸(dying-back)" 패턴으로, MN의 사멸 및 후속하는 근육 위축을 유도하는 것으로 여겨진다. "전방-사멸(dying-forward)" 프로세스 또한 논의되고 있으며, 여기에서 일차 손상은 상부 또는 하부 MN에서 발생하며, 퇴행은 하행 축삭 돌기까지 전방성으로 확장된다.

불행하게도, 다른 신경근 질환, 특히 운동 신경 질환에 대해, 현재까지 ALS에 대한 효과적인 치료제는 존재하지 않는다. 수십 년간의 집중적인 연구 및 임상시험에도 불구하고, 가장 유망한 전임상 요법마저 성공적인 인간 임상시험으로의 전환에 실패하였다. 리루졸(Riluzole®) 및 에다라본(Radicava®)은 ALS의 치료에 대해 승인된 유일한 약물이다. 둘 모두 단지 몇 개월만큼의 생존을 연장시키고 운동 기능을 소폭으로 개선할 뿐이므로, 증상 완화 및 완화 조치(섭식 및 호흡 보조 포함)가 환자 관리의 핵심이 된다. 흥미롭게도, 연구된 대부분의 화합물은 MN 사멸에 관여하는 단일 메커니즘에 관여한다. 따라서, ALS에 대한 효과적인 요법의 개발에 있어서의 주요 난관 중 하나는 MN 사멸에 기여하는 다수의 이벤트에 기인한다. ALS 병인에 대한 다중 인자성 메커니즘을 고려하면, 여러 메커니즘에 동시에 작용하고 상이한 세포 유형을 표적화하는 조합 또는 다중 표적 요법의 사용은 치료 결과를 개선시키고 번역 효과를 최대화할 수 있을 것이다.

따라서, 지금까지의 노력에도 불구하고, 상이한 병인의 운동 손상에 대한 효율적이고 안전한 치료에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

본 개시는 포유류 클로토(klotho) 단백질의 특정 변이체, 특히 클로토의 대체 RNA 스플라이싱 변이체(s-KL)의 투여에 기초하여 신경근 질환 및 다른 운동 장애에서의 운동 손상의 예방 및/또는 치료를 위한 신규 요법에 관한 것이다. 현재까지, 운동 손상을 치료하기 위해 근육 세포에 (단백질 형태 또는 유전자 요법으로서) 특정 클로토 변이체를 안전하게 투여할 수 있다는 증거는 존재하지 않는다.

일 양태에서, 본 개시는 포유류 s-KL 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는 유전자 작제물을 제공하며, 여기에서 제1 프로모터는 근육 세포 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, s-KL 아미노산 서열은 인간 s-KL, 예를 들어 서열번호 1이다. 일부 구현예에서, s-KL 아미노산 서열은 마우스 s-KL, 예를 들어 서열번호 3이다. 대표적인 기능성 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 85%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 근육 세포 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 근육 세포 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 근육 세포 특이적 프로모터는 인간 데스민 프로모터이다. 일부 구현예에서, 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산 서열은 제1 프로모터와 상이한 적어도 하나의 추가 프로모터, 예를 들어 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 근육 세포 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 신경 세포 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 유도성이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 구성적이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 유비쿼터스성이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 아연-구동 메탈로티오네인 프로모터이다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 포유류 s-KL 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는(예를 들어, 이에 통합되거나 클로닝된) 유전자 작제물(여기에서 제1 프로모터는 근육 세포 특이적 프로모터임) 및 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 개시 서열을 포함하는 플라스미드를 제공한다. 플라스미드는, 벡터 그 자체로서 기능할 수 있지만, 보다 복잡한 발현 벡터, 예를 들어 AAV 및 렌티바이러스 벡터의 제조에 유용할 수 있다. 플라스미드는 또한 플라스미드의 선형화 및 적절한 시험관 내 전사 후 mRNA를 수득하는 데 유용할 수 있으며, 이는 원하는 경우 양이온성 지질과 함께 추가로 캡슐화되거나 복합체화될 수 있다.

다른 양태에서, 본 개시는 발현 벡터를 제공하며, 이는: (a) 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 근육 세포 특이적 제1 프로모터(여기에서, 발현 벡터는 근육 세포 향성을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있음); 또는 (b) 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 근육 세포, 신경 세포, 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)에서 기능하는 제1 프로모터를 포함하는 핵산 작제물(여기에서, 상기 발현 벡터는 근육 세포 향성을 가짐)을 함유하는 유전자 작제물 또는 플라스미드를 포함한다(예를 들어, 이에 통합되거나 클로닝된다). 일부 구현예에서, 프로모터는 근육 세포 특이적 프로모터이고, 발현 벡터는 벡터를 신경 세포에 우선적으로 표적화하는 역할을 하는 신경 세포 향성을 갖는다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 발현 벡터, 예컨대 DNA-바이러스 발현 벡터 또는 RNA-바이러스 발현 벡터이다. 다른 구현예에서, 발현 벡터는 비-바이러스 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 근육 세포 향성을 갖는 혈청형의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이거나; 신경 세포 향성을 갖는 혈청형의 AAV 벡터이다.

일부 구현예에서, s-KL 폴리펩티드는 인간 s-KL인 서열번호 1, 또는 이의 기능성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 변이체는 서열번호 1과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 90% 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 쥣과 s-KL인 서열번호 2의 서열을 갖는다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는, 일부 구현예에서, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9p31, AAVrh10, PHPeB, 9P31, AAVrh74 및 AAVMyo 중 어느 하나인 혈청형의 아데노-연관 바이러스이다.

일부 구현예에서, AAV 벡터는 서열번호 17~29 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 아데노-연관 바이러스 캡시드 폴리펩티드를 함유한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 서열번호 17 또는 26의 아미노산 서열을 갖는 아데노-연관 바이러스 캡시드 폴리펩티드를 함유한다.

일부 구현예에서, 바이러스 벡터는, 일부 구현예에서, AAV1, AAV8, 또는 AAV9 중 어느 하나인, 신경 세포 향성을 갖는 혈청형의 AAV 벡터이다.

일부 구현예에서, 벡터는 지질계 벡터이다. 일부 구현예에서, 지질계 벡터는 지질 나노입자(LNP) 또는 리포솜이다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에서 정의된 바와 같은 플라스미드 또는 발현 벡터의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 바와 같은 유전자 작제물 또는 플라스미드를 함유하는 단리된 세포를 제공하며, 여기에서 단리된 세포는 인간 근육 세포, 인간 신경 세포, 또는 인간 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)(이는 근육 세포 또는 신경 세포로 분화되도록 생체 외에서 유도될 수 있거나 생체 내에서 분화될 수 있음)이다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 신경 세포, 예를 들어 운동 신경이다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 가로무늬 근육 세포 또는 골격근 세포이다.

본 개시의 또 다른 양태는 대상체에서의 운동 손상을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이다. 일부 구현예에서, 신경근 질환은 근위축성 측색 경화증(ALS)이다. 일부 구현예에서, ALS는 산발성 ALS(sALS) 또는 가족성 ALS(fALS)이다. 일부 구현예에서, 신경근 질환은 다발성 경화증이다. 일부 구현예에서, 신경근 질환은 근육 이영양증이다. 일부 구현예에서, 신경근 질환은 척수근 위축증(SMA)이다. 일부 구현예에서, 신경근 질환은 척수 손상, 말초 신경 손상 또는 외상성 신경 손상이다. 일부 구현예에서, 방법은 유전자 작제물을 함유하는 플라스미드 또는 발현 벡터의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에 대한 조성물의 연속 투여(예를 들어, 주입)를 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 연속 주입은 약 1시간에서 약 24시간/일 동안, 하루 또는 며칠 동안에 걸쳐 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 운동 장애 증상을 나타내지 않는다.

본 개시의 또 다른 양태는 본원에 개시된 바와 같은 단리된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 세포 요법이다. 이러한 방법은 근육 세포 또는 신경 세포가 대상체로부터 단리되고 유전자 작제물, 플라스미드, 또는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 다음 대상체에게 투여되는 생체 외 접근법을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 근육 세포 또는 신경 세포는 형질전환 전 또는 후에 농축된다. 다른 구현예에서, 부분적으로 다능성 또는 줄기 세포 유사 세포는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염되고, 시험관 내에서 특정 세포 유형(예를 들어, 근육 세포 또는 신경)으로 분화되도록 유도된다. 발현 벡터와 통합되면(분화 전 또는 후에 발생할 수 있음), 세포는 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터 최종적으로 분화된 세포를 단리하는 단계, 이들 세포에서 다능성을 재프로그래밍(즉, 유도)하여 iPSC를 생성하는 단계, 발현 벡터를 iPSC 내에 통합하는 단계, iPSC를 신경 세포 또는 근육 세포로 분화시키는 단계, 및 분화된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 수반할 수 있다는 의미에서 자가적이다. 일부 구현예에서, 세포는 근육 세포로 분화된다. 일부 구현예에서, 세포는 신경 세포로 분화된다. 일부 구현예에서, iPSC 세포는 대상체에게 투여된 후 분화될 수 있다.

이론에 구속되지 않고, 본원에 개시된 작제물, 방법 등은 골격근 세포에서 포유류 s-KL 단백질 수준을 증가시킬 수 있으며, 이는 독성 배설물로부터 세포를 보호하고 근육 세포 기능 및/또는 운동 신경 기능을 보존하거나 운동 장애를 특징으로 하는 ALS와 같은 질환 및 장애와 연관된 운동 장애를 개선한다.

본원의 작업 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 ALS 질환의 마우스 모델에서, 클로토(s-KL) 단백질의 포유류 분비 RNA 스플라이싱 변이체의 투여가 질환의 진행을 유의미하게 지연시켰음을 발견하였다. 추가적으로, ALS 질환의 마우스 모델에서 AAVmyo 근육 세포 향성 발현 벡터를 사용한 유전자 요법에서의 포유류 s-KL 단백질의 투여는 다른 AAV 벡터와 비교 시, 요구되는 발현 벡터의 양을 감소시키는 동시에 질환의 진행을 지연시켰다.

본 개시는 공지된 요법, 예컨대 클로토 단백질을 사용하는 치료와 연관된 하나 이상의 단점을 극복할 수 있다. 생체 내 클로토 단백질의 반감기는 상대적으로 짧은 약 7.5시간이며, 이는 대략적으로 매 24시간마다의 1 단위의 로그 감소로 이어진다. 대조적으로, 본 개시에 따른 치료는 지속적인 주입을 통한 포유류 s-클로토 단백질의 투여와 유사한 효과를 가질 수 있다.

도 1은 여러 연구된 조직에서의 평균 ± SEM으로서 예시된 s-KL mRNA 발현(WT 동물 대비 ALS 마우스에서의 배수 변화)을 나타낸다(n = 7 SOD1, 군 당 3~10 WT 마우스, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05).
도 2a 및 도 2b는, s-KL의 유도된 과발현에 의해 유발된 글루탐산염-유도 흥분독성(GLUT +)으로부터의, 척수의 복측각(VH)에 위치된 보존된 신경 세포 생존을 Glut + 흥분독성에 노출시키고 null 벡터로 형질도입된(또는 형질도입되지 않은) 샘플과 비교하여 나타낸다. 도 2a는 이의 형광 현미경 이미지이며, 도 2b의 막대 도표에서, 각각의 세트의 두번째 막대는 글루탐산염-유도 흥분독성(GLUT +)에 대한 것이다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다(군 당 n = 6, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05). SMI 32는 SMI32 항체에 의해 인식되는 운동 신경 세포이다.
도 3은, 근육 세포 향성을 갖는 벡터 및 가로무늬(골격) 근육 세포에 특이적인 프로모터를 포함하는 유전자 작제물을 사용하여 마우스를 전신 치료하는 유전자 요법 전략(SOD1 모델)의 개략도이다.
도 4a 및 도 4b는 야생형(WT), SOD1 모의(AAV-null), SOD1 s-KL 저용량(AAV-s-KL), SOD1 s-KL 고용량(AAV-s-KL)에 대한 발바닥 근육(도 4a) 또는 전경골근(도 4b)의 복합 근육 활동 전위(Compound Muscle Action Potential, CMAP) 값을 나타내는 2-라인 도표이다.
도 5는 전경골(TA) 근육으로부터 기록된 운동 유발 전위(MEP)를 도시하는 막대 도표이다. 해당 세트의 첫번째 막대는 SOD1 모의 검정에 대한 것이고, 두번째 막대는 SOD1 s-KL 저용량에 대한 것이며, 세번째 막대는 SOD1 s-KL 고용량에 대한 것이다(***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, SOD1 모의 대비, 평균 ± SEM).
도 6a 및 도 6b는, 위의 도 4a~도 5에 개시된 바와 같은 동물에서 관찰된, 로타로드로부터 추락하는 데 걸리는 시간(시간, 초)(도 6a), 및 그립 강도(도 6b의 힘(g))를 나타내는 라인 도표이다(***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, SOD1 모의 대비 SOD1 고용량, 평균 ± SEM).
도 7은 위의 도 4a~도 5에 개시된 바와 같은 동물의 임상 질환 발병을 나타낸다.
도 8a~도 8c는 시냅스-전 말단의 점유도를 확인하기 위한 신경근 접합부(NMJ)를 나타낸다. 도 8a에서, 비복근 길이방향 섹션에 대한 형광 현미경 이미지를 신경미세섬유 200(NF200, 이미지 내 짙은 회색), 항-시냅토피신 및 알파-붕가로독소(BTX, 이미지 내 밝은 회색)에 대해 표지하였다. 도 8b는 WT 마우스, 그리고 모의군(SOD1 모의) 및 치료군(SOD1s-KL)에서의 점유된 종판의 백분율을 나타낸다. 도 8c에서는, WT 마우스, 그리고 모의군(SOD1 모의) 및 치료군(SOD1s-KL)의 체중 당 근육량(mg/g)을 나타낸다(***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, SOD1 모의 대 SOD1 고용량, 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시됨).
도 9a~도 9b는 s-KL의 유도된 과발현에 의해 유발된 SOD1 마우스에서의, 요추 척수에 위치된 보존된 운동 신경 생존을 야생형 및 null 벡터로 형질도입된 SOD1 마우스의 샘플과 비교하여 나타낸다. 도 9a는 백색광 현미경 이미지이며, 도 9b는 도 9a에 시각화된 운동 신경의 수를 나타내거나 정량화한 막대 도표이다(모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시됨(군 당 n = 8, ***p < 0.001)).
도 10a~도 10d는 s-KL의 유도된 과발현에 의해 유발된 SOD1 마우스에서의, 척수에서의 소교세포 활성의 감소를 야생형 및 null 벡터로 형질도입된 SOD1 마우스의 샘플과 비교하여 나타낸다. 도 10a는 형광 현미경 이미지이며, 도 10b~도 10d는 Iba1, GFAP, 및 비멘틴(Vimentin)에 대해 염색된 각각의 이미지의 통합 밀도(상대적 단위)의 수를 나타내거나 정량화하는 막대 도표 세트이다(모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시됨(군 당 n = 8, **p < 0.01, *p < 0.05)).
도 11은, 근육 세포 향성을 갖는 AAV 벡터(AAVmyo) 및 가로무늬(골격) 근육 세포에 특이적인 프로모터를 포함하는 유전자 작제물을 사용하여 마우스를 전신 치료하는 유전자 요법 전략((SOD1^G93A 모델)의 개략도이다.
도 12a~12b는 야생형(WT 모의), SOD1 모의, SOD1 s-KL 저용량(AAVmyo-AAV-s-KL), SOD1 s-KL 고용량(AAVmyo-AAV-s-KL)에 대한 발바닥 근육(도 12a) 또는 전경골근(도 12b)의 복합 근육 활동 전위(CMAP) 값을 나타내는 라인 도표 세트이다.
도 13은 전경골(TA) 근육으로부터 기록된 운동 유발 전위(MEP)를 도시하는 막대 도표이다. 해당 세트의 첫번째 막대는 SOD1 모의 검정에 대한 것이고, 두번째 막대는 SOD1 AAVmyo-s-KL 저용량에 대한 것이며, 세번째 막대는 SOD1 AAVmyo-s-KL 고용량에 대한 것이다(***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, SOD1 모의 대비, 평균 ± SEM).
도 14a~도 14b는, 도 12a~도 13에 예시된 바와 같은 동물에서 관찰된, 로타로드로부터 추락하는 데 걸리는 시간(시간, 초)(도 14a), 및 그립 강도(도 14b의 힘(g))를 나타내는 라인 도표이다.
도 15은 도 12a~도 14b에 예시된 동물의 임상 질환 발병을 나타낸다.

정의

본 출원에 있어서, 본원에서 사용되는 모든 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 당업계에 공지된 바와 같은 통상적인 의미로 이해되어야 한다. 본 출원에서 사용되는 특정 용어에 대한 보다 구체적인 다른 정의는 아래에 제시된 바와 같으며, 달리 명시적으로 제시된 정의가 보다 넓은 정의를 제공하지 않는 한, 본 명세서 및 본 청구범위 전체에 걸쳐 일관적으로 적용되는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 부정관사 "일" 및 "하나"는 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"과 같은 의미를 갖는다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 정관사, 예컨대 "그(the)"는 또한 복수의 해당 명사를 포함한다.

본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함한다" 및 이의 변형은 다른 기술적 특징부, 첨가물, 성분, 요소 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다. 또한, 용어 "~(들)을 포함한다"는 "~로 이루어진다"의 경우를 포함한다.

유전자 작제물

일 양태에서, 본 개시는 근육 세포 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 유전자 작제물(본원에서 발현 카세트로도 지칭됨)을 제공한다. 용어 "유전자 작제물" 및 "발현 카세트"는 본원에서 동의어로 사용되며, 이는 근육 세포 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 포유류 클로토(s-KL) 또는 이의 기능성 변이체의 포유류 분비 RNA 스플라이싱 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 본원에서 "핵산 서열"로도 지칭되며, 이들 각각은 뉴클레오시드(핵염기 및 5-탄소 당) 및 인산염으로 이루어진 유기 분자인 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 문맥으로부터 구체적으로 언급되거나 명백하지 않는 한, 용어 뉴클레오티드는 리보오스 당(즉, 리보핵산, RNA를 형성하는 리보뉴클레오티드) 또는 2'-데옥시리보오스 당(즉, 데옥시리보핵산, DNA를 형성하는 데옥시리보뉴클레오티드)을 갖는 뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵산 중합체 또는 폴리뉴클레오티드의 단량체 단위로서 작용한다. DNA 중의 4개의 핵염기는 구아닌(G), 아데닌(A), 시토신(C) 및 티민(T)이다. RNA 중의 4개의 핵염기는 구아닌(G), 아데닌(A), 시토신(C) 및 우라실(U)이다. 핵산은 인접한 뉴클레오티드에서 하나의 뉴클레오티드의 포스포릴기 및 당(즉, 리보오스 또는 2'-데옥시리보오스)의 하이드록실기 사이의 일련의 에스테르 결합에 의해 화학적으로 결합된 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 3개의 뉴클레오티드)의 선형 사슬이다.

본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 작동 가능하게 연결되는 상응하는 핵산 서열의 전사를 직접 또는 간접적으로 조절하는 핵산 서열을 지칭하며, 이는 본 개시의 맥락에서 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체이다. 프로모터는 전사를 조절하기 위해 단독으로 작용할 수 있거나, 하나 이상의 다른 조절 서열(예를 들어, 유전자 작제물 또는 발현 벡터에 존재할 수 있는 조절 요소, 또는 인핸서 또는 사일렌서)과 함께 작용할 수 있다. 프로모터는 유전자의 전사 개시 부위 근처에, 동일한 가닥 상에, 그리로 DNA에 대해 상류에 위치된(센스 가닥의 5' 영역을 향함). 대체적으로, 프로모터의 길이는 약 100~1000 염기쌍 범위이다. "구성적 프로모터"는, 단지 특정 자극에만 반응하여 세포 내에서만 활성화되도록 조절되는 다른 프로모터, 예컨대 "유도성 프로모터"와 달리, 세포 내 모든 상황에서 활성인 프로모터이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "근육"은 골격근을 포함하며, 이는 골격에 부착되는 자발적으로 조절되는 가로무늬 근육 유형을 지칭하며, 이의 대표적인 예는 횡격막, 이두근, 삼두근, 사두근, 전경골근, 및 비복근을 포함한다.

프로모터의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "근육 세포 특이적" 및 "근육 특이적"은 다른(즉, 비-근육) 세포 및 조직과 비교 시, 근육 세포 또는 근육 조직에서의 포유류 s-KL(또는 이의 기능성 변이체)의 우선적, 선택적 또는 우세한 발현을 지칭한다. 일부 구현예에서, 발현의 적어도 50%, 보다 구체적으로는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%는 근육 세포 또는 조직 내에서 발생한다. 일부 구현예에서, "근육 세포 특이적"은 발현된 포유류 s-KL(또는 이의 기능성 변이체)이 폐, 간, 뇌, 신장 및/또는 비장과 같은 근육 이외의 다른 기관 또는 조직으로 실질적으로 누출되지 않는다는 것을 지칭한다.

프로모터의 맥락에서 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "근육 세포에서 기능하는"은 작동 가능하게 연결되는 포유류 s-KL 핵산의 전사를 직접 또는 간접적으로 조절하는 프로모터를 지칭하지만, 반드시 근육 세포 특이적인 것은 아니다.

본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 s-KL 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 핵산 서열이 핵산 코딩 서열의 발현을 유도하도록, 프로모터에 대해 유전자 작제물 내에 공간적으로 위치되거나 배치된다는 것을 이해해야 한다.

클로토(KL)는 주로 신장과 뇌에서 발현되고, 골격근, 폐, 방광, 고환 및 난소에서는 보다 적은 정도로 발현되는 단백질이다. 클로토는 2개의 상이한 이소형을 가지며, 이 중 하나는 약 140 KDa의 전장 막관통 단백질(mKL)을 코딩하며, 이는 약 130 KDa의 가용성 형태(p-KL)로 처리될 수 있다. 다른 이소형은 분비되지만 더 짧은 이소형(s-KL)을 코딩하며, 약 63 KDa이다. mKL은 α/β/γ-세크레타아제에 의해 배출되어 p-KL을 생산하거나 p-KL1 및 p-KL2 도메인을 유리하도록 추가로 절단될 수 있는 KL1 및 p-KL2 도메인(각각 약 70KDa)을 함유한다. s-KL은 KL1-유사 도메인 + 추가 꼬리(마우스 s-KL에서 C-말단에 있는 15개의 아미노산 및 인간 s-KL에서 C-말단에 있는 16개의 아미노산)를 함유한다. 이소형, m-KL 및 s-KL은 모두 상이한 발현 수준 및 상이한 시공간적 발현 프로파일을 가지므로, 역할 또한 상이할 것으로 보인다.

가용성 및 분비된 클로토는 순환계(예를 들어, 혈액) 및 대뇌 척수액(CSF) 중에 존재하고 순환 호르몬으로서 기능하며, 세포 표면 수용체에 결합하고 인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1) 신호와 같은 신호를 억제함으로써 원격 기관 및 다수의 시스템에 생물학적 작용을 한다. 비록 유사한 약어(s-KL)가 가용성 클로토(막관통 클로토의 가공된 버전임) 및 분비된 클로토(RNA 스플라이싱 변이체임)를 지칭하기 위해 종래 기술에서 때때로 사용되지만, 이들 2개의 변이체는 상이한 구조를 나타낸다는 점에 주목해야 한다.

본원에서 "s-KL"로 약칭되는 "포유류 클로토의 분비된 RNA 스플라이싱 변이체"라는 용어는 클로토 단백질(m-KL)의 전장 막관통 형태를 암호화하는 전사체의 대체 RNA 스플라이싱으로 인해 생성되는 단백질을 지칭하며, 이는, m-KL 전사체에서 발견되지 않는, 마우스의 15개 아미노산 꼬리 및 인간의 16개 아미노산 꼬리로 이루어진 특이적 분비 신호와 함께, 약 63 kDa의 무게를 가진, KL1-유사 도메인에 의해 형성되는 단백질의 절단된 형태를 생성하며, 이러한 이유로, 이는 클로토의 분비된 이소형, s-KL, 또는 클로토 단백질의 분비된 RNA 스플라이싱 변이체로도 지칭된다. S-KL은 상이한 형태의 가용성 클로토, 즉 p-KL, p-KL1 및 p-KL2와 상이하다. 본 개시에서, m-KL은 전장 막관통 형태를 지칭하고; p-KL은 m-KL의 절단에 의해 생성되고 약 130 kDa의 분자량을 갖는 가용성 단백질분해된 클로토(즉, KL1-KL2)를 나타내며; p-KL1 및 p-KL2는 각각 p-KL의 KL1 도메인 및 KL2 도메인으로 이루어진 가용성 클로토 형태를 지칭한다. m-KL은 약 140 kDa의 분자량을 갖는 단일 통과 막관통 단백질을 암호화하는 전장 전사체를 지칭한다(m-KL). 이러한 단백질은 C-말단에서의 짧은 막관통 도메인, 각각 KL1 및 KL2로 지칭되는 약 550개 아미노산의 2개의 내부 반복 서열로 구성된 세포외 도메인, 및 10개 아미노산의 매우 짧은 세포내 도메인을 포함하는, 3개의 도메인을 함유한다. 막관통 형태의 세포외 도메인은 금속단백분해효소 ADAM10 및 ADAM17에 의해 절단되어 약 130 kDa의 다른 형태의 가용성 클로토를 생성할 수 있다(단백질분해 막 이소형의 경우 p-KL로 약칭됨). 또한, KL1 도메인과 KL2 도메인 사이에 위치된 프로테아제 ADAM10 및 17에 대한 제2 인식 부위가 존재하며, 이는 2개의 새로운 70 kDa 단백질, 즉 KL1 도메인만을 함유하는 단백질 및 KL2 도메인을 함유하는 단백질을 생성한다. s-KL 및 이의 기능성 변이체는 전장 m-KL 또는 p-KL(KL1 및 KL2 도메인 둘 모두를 함유함)을 포함하지 않는다. 본원에 기술된 핵산에 의해 암호화된 포유류 s-KL 폴리펩티드 및 이의 기능성 변이체는, 각각 약 130 kDa의 분자량을 갖는, 클로토의 전장 m-KL 및 p-KL(KL1-KL2 도메인 둘 모두를 함유함) 형태를 배제한다.

서열번호 1은 인간 s-KL의 아미노산 서열이고, 전술한 바와 같이, 이는 α-클로토 인간 유전자의 대체 스플라이싱으로부터의 전사체이고, 약 63 kDa의 대략적인 중량을 갖고, m-KL 또는 KL1 전사체에서 발견되지 않는 16개-아미노산 꼬리로 이루어진 특이적 분비 신호를 갖는 KL1 도메인을 포함한다. α-클로토 인간 유전자는 게놈 기준 컨소시엄(Genome Reference Consortium)에서 관리하는 인간 게놈에 대한 어셈블리 GRCh38(24.12.2013)의 염색체 13 NC_000013.11(33016063..33066145) 상에 위치한다. 서열번호 1은 서열번호 3의 상응하는 cDNA로부터 유래되며, 이는 결과적으로 5012개 염기쌍의 GenBank 데이터베이스 수탁 번호 NM_004795(2014년 5월 3일 버전 3)(이의 서열은 참조로서 본원에 통합됨)을 갖는 mRNA의 대체 스플라이싱 전사체로부터 유래된다.

인간 s-KL의 아미노산 서열은 다음과 같다(서열번호 1):

인간 s-KL(서열번호 1)을 암호화하는 대표적인 상보적 DNA(cDNA)의 핵산 서열은 아래에 제시되며, 서열번호 3(아래에 박스화된 s-KL 특이적 분비 서열)으로서 식별된다:

설치류 s-KL의 것들 또한 본 개시에서 유용할 수 있다. 서열번호 2는 70 kDa의 대략적인 중량을 갖고, m-KL 전사체에서 발견되지 않은 15개의 아미노산 꼬리로 이루어진 특이적 분비 신호를 갖는, KL1 도메인 서열을 포함하는, α-클로토 마우스 유전자의 대체 스플라이싱으로부터의 전사체의 아미노산 서열이다. α-클로토 마우스 유전자는 마우스 게놈에 대한 UCSC Genome Browser on Mouse July 2007 (NCBI37/mm9) Assembly의 염색체 5(150,952,607-150,993,809)에 위치하는 유전자이다. 서열번호 2는 서열번호 4의 상응하는 cDNA로부터 유래되며, 이는 결과적으로 5124개 염기쌍의 GenBank 데이터베이스 수탁 번호 NM_013823(2015년 2월 15일 버전 2)(이의 서열은 참조로서 본원에 통합됨)을 갖는 mRNA 서열의 대체 스플라이싱 전사체로부터 유래된다.

마우스 s-KL의 아미노산 서열(서열번호 2)은 다음과 같이 아래에 제시된다:

마우스 s-KL의 대표적인 상보적 DNA(cDNA) 핵산 서열의 핵산 서열은 아래에 제시되어 있다(서열번호 4):

추가적인 포유류 s-KL가 본 개시의 용도에 적합할 수 있다. KL1 및 KL2 도메인을 함유하는 포유류 클로토 유전자는 당업계에 공지되어 있고/있거나, 표준 기술에 따라 용이하게 식별될 수 있다. 주어진 포유류 종으로부터의 s-KL 이소형이 식별되지 않은 경우, s-KL 이소형은 표준 기술에 따라, 식별된 포유류 클로토 유전자로부터, 특히 적절한 C-말단 꼬리를 갖는 KL1 및/또는 KL2 도메인으로부터 쉽게 유도될 수 있다.

포유류 종, 판 파니스쿠스(Pan paniscus)(피그미 침팬지, 수탁 번호: XP_034792458.1), 판 트로콜로디테스(Pan troglodytes)(침팬지, 수탁 번호: XP_522655.2), 고릴라 고릴라(Gorilla gorilla)(웨스턴 롤란드 고릴라, 수탁 번호: XP_030857339.1), 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(크랩-섭식 마카카 원숭이, 수탁 번호: AAC77917.1, Q8WP17.1, XP_005586019.2, XP_005586019.3), 퐁고 아벨리(Pongo abelii)(수마트라 오랑우탄, 수탁 번호: XP_024086695.2, PNJ48590.1), 퐁고 피그마에우스(Pongo pygmaeus)(보르네오 우랑우탄, 수탁 번호: XP_054302967.1), 필로코로부스 테프로셀레스(Piliocolobus tephrosceles)(우간다 레드 콜로부스, 수탁 번호: XP_023064573.2), 노마스쿠스 레우코게니스(Nomascus leucogenys)(북부 흰뺨 긴팔원숭이, 수탁 번호: XP_030674267.1), 마카카 티베나타(Macaca thibetana)(티벳 마카카 원숭이, 수탁 번호: XP_050621876.1), 마카카 네메스트리나(Macaca nemestrina)(돼지-꼬리 마카카 원숭이, 수탁 번호: XP_011746941.1), 마카카 물라타(Macaca mulatta)(레서스 원숭이, 수탁 번호: EHH28941.1, XP_001101127.2), 하이로바테스 몰로크(Hylobates moloch)(은빛 긴팔원숭이, 수탁 번호: XP_032005041.1), 테로피테쿠스 겔라다(Theropithecus gelada)(겔라다비비, 수탁 번호: XP_025220255.1), 리노피테쿠스 록셀라나(Rhinopithecus roxellana)(황금코원숭이, 수탁 번호: XP_030778249.1), 트라키피테쿠스 프랑소이스(Trachypithecus francoisi)(프랑소와 랑구르 원숭이, 수탁 번호: XP_033091442.1), 크로로세부스 세바에우스(Chlorocebus sabaeus)(녹색 원숭이, 수탁 번호: XP_007958284.1), 및 파피오 아누비스(Papio anubis)(올리브 개코원숭이, 수탁 번호: XP_031511616.1)에 고유한 추가의 포유류 클로토 유전자의 아미노산 서열은 이에 첨부된 서열 목록에 서열번호 42~63으로 공개되어 있다(이의 서열은 참고로서 본원에 포함됨). 각각의 포유류 클로토는 서열번호 1 및 서열번호 2와 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

본 개시는 포유류 s-KL의 기능성 변이체 및 개시된 조성물 및 방법에서의 이의 용도를 포함한다. 기능성 변이체는 자연적으로 발생되는 것이 아닐 수 있다.

단백질 변이체는 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 전형적으로 치환, 삽입 또는 결실 변이체의 3가지 부류 중 하나 이상에 속하는 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 본 개시에서, 변이체는, 예를 들어 신경근 질환 및 장애와 같은 다양한 질환 또는 장애에서 발생할 수 있는 운동 장애의 치료에 치료적으로 효과적이라는 의미에서 "기능성"이다.

폴리펩티드를 지칭할 경우 본원에서 사용되는 용어 "치환 변이체"는, 폴리펩티드의 고유 또는 시작 서열에서 적어도 하나의 아미노산이 제거되고 상이한 아미노산이 그 자리에 삽입된다는 것을 의미한다. 치환은 폴리펩티드 분자 내의 단 하나의 아미노산이 치환되는 단일 치환일 수 있거나, 둘 이상의 아미노산이 동일한 폴리펩티드 분자 내에서 치환되는 다중 치환일 수 있다.

폴리펩티드를 지칭할 경우 본원에서 사용되는 용어 "보존적 치환"은 폴리펩티드의 고유 또는 시작 서열 내의 적어도 하나의 아미노산이 유사한 크기, 전하 또는 극성을 갖는 상이한 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 보존적 치환의 예는 또 다른 비-극성 잔기, 예를 들어 이소류신, 발린 또는 류신을 교환하는 비-극성(소수성) 잔기의 치환을 포함한다. 마찬가지로, 보존적 치환의 예는 하나의 극성(친수성) 잔기의 다른 잔기로의 치환, 예를 들어 아르기닌과 리신 간, 글루타민과 아스파라긴 간, 및 글리신과 세린 간의 교환을 포함한다. 보존적 치환의 추가적인 예는 리신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 염기성 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 하나의 산성 잔기의 다른 산성 잔기로의 치환을 포함한다.

폴리펩티드를 지칭할 경우 본원에서 사용되는 용어 "삽입 변이체"는 고유 또는 시작 서열의 특정 위치에서 아미노산에 바로 인접하게 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖는 변이체를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 아미노산에 "바로 인접하는"은, 해당 아미노산의 알파-카르복시 또는 알파-아미노 작용기를 통한 아미노산 연결을 의미한다.

폴리펩티드를 지칭할 경우 본원에서 사용되는 용어 "결실 변이체"는 고유 또는 시작 아미노산에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 변이체를 의미한다. 통상적으로, 결실 변이체는 해당 분자의 특정 영역에서 결실된 하나 이상의 아미노산을 가질 것이다.

본 개시에서, 용어 "동일성"은 2개의 서열이 최적으로 정렬될 때 해당 서열에서의 동일한 잔기의 백분율을 지칭한다. 최적의 정렬에서, 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산에 의해 점유되는 경우, 해당 서열은 해당 위치에 대한 동일성을 나타낸다. 동일성 백분율은 주어진 정렬에서 정의된 길이에 걸쳐 동일한 잔기의 수를 결정한다. 따라서, 2개의 서열 사이의 동일성 수준 또는 ("서열 동일성 백분율")은 비교된 위치의 수에 대해 해당 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 비율로서 측정된다(즉, 서열 동일성 백분율 = (동일 위치의 수/비교된 위치의 총 수) x 100). 갭, 즉, 잔기가 하나의 서열에 존재하지만 다른 서열에는 존재하지 않는 정렬에서의 위치는, 동일하지 않은 잔기를 갖는 위치로서 간주되고, 비교 대상 위치로서 계수된다.

예시로서, 예를 들어, 서열번호 1의 기준 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 해당 폴리펩티드 서열이 서열번호 1의 기준 아미노산의 각각의 100개 아미노산 당 최대 5개의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 해당 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 즉, 기준 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 기준 서열 내의 아미노산 잔기의 최대 5%가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 기준 서열 내의 총 아미노산 잔기의 최대 5%인 아미노산의 수가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노산 또는 카르복시 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이의 어느 곳에서나 발생할 수 있으며, 이는 기준 서열 내의 잔기들 사이에 개별적으로, 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 연속적인 기에 산재된다.

2개 이상의 서열 간의 최적의 정렬을 신속하게 수득하고 동일성을 계산하기 위한 다수의 수학적 알고리즘이 공지되어 있으며, 이들은 다수의 이용 가능한 소프트웨어 프로그램에 통합된다. 본 개시의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은 바람직하게는, 기본 설정을 사용하는, 전역 정렬에 기초한 알고리즘, 예컨대 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch의 문헌[J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)], 바람직하게는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램(Rice 등의 문헌[Trends Genet. 16(6):276-277 (2000)])이 장착됨); 또는 BLAST Global Alignment 도구(Altschul 등의 문헌[J. Mol. Biol. 215(3):403-410 (1990)])를 사용하여 결정된다. 또한, 비교되는 서열이 실질적으로 동일한 길이일 경우 국부적 정렬이 사용될 수 있다.

자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있는 대표적인 기능성 변이체 포유류 s-KL은 서열번호 1 및/또는 서열번호 2와 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 따라서, 대표적인 기능성 s-KL 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 85%, 86%, 87%, 88%, 88.5%, 89%, 89.5%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 서열번호 1과 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 포유류 s-KL의 하나의 대표적인 기능성 변이체는 KL1 도메인(예를 들어, p-KL의 절단 산물 p-KL1)이다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 88% 또는 98% 동일성의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 2와 적어도 88% 또는 98% 동일성의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 아미노산 삽입을 갖는 변이체이며, 예를 들어, 일 구현예에서, 서열번호 1의 마지막 15개의 아미노산은 제거될 수 있으며, SQLTASVSSPPTRALSLASSAFLLGWRSWRILCPEPTR(서열번호 17)로 대체될 수 있다.

서열번호 1 또는 서열번호 2 중 어느 하나와 적어도 88%의 동일성 백분율을 갖는 폴리펩티드는 인간 및 마우스 s-KL 이외의 포유류 s-KL을 포함한다.

다른 구현예에서, 선택적으로 아래에 제공된 구현예 중 어느 하나와 조합하여, 포유류 s-KL 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체는 645개 아미노산, 600개 아미노산, 또는 550개 아미노산 이하의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체를 가지며, 645개 아미노산, 600개 아미노산, 또는 550개 아미노산 이하의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 85% 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체를 가지며, 여기에서 변이체는 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 584, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 또는 600개 아미노산 길이, 또는 545개 내지 600개의 아미노산 길이를 갖는다.

일부 구현예에서, 전술한 구현예 및 아래에 제공된 구현예 중 어느 하나와 임의로 조합하여, 핵산 서열에 의해 암호화된 s-KL 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 이종 모이어티에 연결된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "이종 모이어티"는 공유 펩티드 결합을 통해 폴리펩티드에 커플링된 임의의 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 이종 모이어티는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 단부 중 어느 하나에 위치된다. 특정 구현예에서, 이종 모이어티는 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 단부 둘 모두에 위치된다.

이종 모이어티는, 예를 들어 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 분자일 수 있다. 특정 구현예에서, 이종 모이어티는 펩티드이다. 보다 더 구체적인 구현예에서, 이종 모이어티는 폴리히스티딘 트랙이다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 단백질의 정제를 돕는 소형 펩티드는 이의 기능에 영향을 미치지 않고 최종 화합물 중에 유지될 수 있다.

일부 구현예에서, 이종 모이어티는 소포화제이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이들 제제는 폴리펩티드의 흡수, 수송 및 전달을 용이하게 한다. 소포화제의 대표적인 예는 디팔미토일-포스파티딜-콜린(DPCC) 리포좀, 미세포 유화액, 디메티포름아미드(DMF), 및 할로겐화 펜티아진을 포함한다.

포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 근육 세포 특이적 프로모터이다. 본 개시에서 사용하기에 적합할 수 있는 근육 세포 특이적 프로모터의 대표적인 예는 다음을 포함한다: 포유류 데스민(DES, CSM1 또는 CSM2로도 알려짐) 프로모터, 알파 2 액티닌(ACTN2, CMD1AA로도 알려짐) 프로모터, 필라민-C(FLNC, 액틴-결합-유사 단백질(ABLP)로도 알려짐, 필라민-2(FLN2), ABP-280, ABP280A, ABPA, ABPL, MFM5 또는 MPD4) 프로모터, 사르코플라스믹/엔도플라스믹 칼슘 ATPase 1(ATP2A1, ATP2A 또는 SERCA1로도 알려짐) 프로모터, 트로포닌 I 1형(TNNI1, SSTNI 또는 25TTNI로도 알려짐) 프로모터, 미오신-1(MYH1) 프로모터, 인산화성, 신속 골격근 미오신 경쇄(MYLPF) 프로모터, 미오신 1(MYH1, MYHSA1, MYHa, MyC-2X/D 또는 MyHC-2x로도 알려짐) 프로모터, 알파-3 사슬 트로포미오신(TPM3, CFTD, NEM1, OK/Scl.5, TM-5, TM3, TM30, TM30 nm, TM5, TPMsk3, TRK, h TM5 또는 hscp30으로도 알려짐) 프로모터, 안키린 반복 도메인-함유 단백질 2(ANKRD2, ARPP로도 알려짐) 프로모터, 미오신 중쇄(MHC) 프로모터, 미오신 경쇄(MLC) 프로모터, 근육 크레아틴 키나아제(MCK) 프로모터, Li 등의 문헌[Nat. Biotechnol. 17(3):241-245 (1999)]에 기술된 합성 근육 프로모터, 예컨대 SPc5-12 프로모터, 근육 크레아틴 키나아제(MCK) 프로모터, dMCK 프로모터, MCK 기초 프로모터에 대한 MCK 인핸서의 이중 또는 삼중 탠덤으로 각각 구성된 tMCK 프로모터(Wang 등의 문헌[Gene Ther. 15(22):1489-1499 (2008)]에 기술된 바와 같음).

혼성(합성) 근육 세포 특이적 프로모터 또한 유용할 수 있다. 이러한 프로모터의 유형은 바이러스 또는 인간 서열의 다른 프로모터 요소(예를 들어, CMV, CAG, 또는 PGK)와의 조합을 포함하는, 근육 특이적 인핸서 및/또는 전사 인자 결합 부위를 포함할 수 있다. 하이브리드 프로모터의 대표적인 예는 다음을 포함한다: 하이브리드 알파-미오신 중쇄 인핸서/MCK 인핸서(MHCK7; 770 bp); Wang 등의 문헌[Gene Ther. 15(22):1489-1499 (2008)]에 기술된 바와 같은 MCK-C5-12 프로모터; 및 Rudeck 등의 문헌[Genesis 54(8):431-438 (2016)]에 기술된 바와 같은 심장 및 골격근-특이적 미오신 샤페론 Unc45b(195 bp) 프로모터. 일부 구현예에서, 프로모터는 인간 또는 쥣과 데스민 프로모터와 같은 포유류 근육 세포 프로모터이며, 이의 예는, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2020/00407746호에 기술되어 있다.

일부 구현예에서, 프로모터는 인간 데스민 단백질을 암호화하는 유전자와 자연적으로 연관되며, 이에 대한 프로모터 서열은 서열번호 5로서 아래에 제시된다:

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 유전자 작제물은 서열번호 2의 마우스 s-KL에 작동 가능하게 연결된 서열번호 5의 인간 데스민 프로모터를 포함할 수 있으며, 다음과 같은 핵산 서열을 갖는다(서열번호 6):

일부 구현예에서, 유전자 작제물은 인간 s-KL을 암호화하는 핵산 열(예를 들어, 서열번호 3의 핵산 서열)에 작동 가능하게 연결된 인간 데스민 유전자 프로모터를 포함한다.

일부 구현예에서, 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산은 s-KL을 암호화하는 핵산에 모두 작동 가능하게 연결된 둘 이상, 예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 추가 프로모터는 또한 근육 세포 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 추가 프로모터는 신경 세포 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 추가 프로모터는 유비쿼터스성 프로모터이다. "유비쿼터스성 프로모터"는 가상 조직에서 발현을 유도하는 프로모터이다. 일부 구현예에서, 추가 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 추가 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 추가 프로모터는 신경 세포 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유전자 작제물은 3개의 프로모터, 즉 s-KL을 암호화하는 핵산에 모두 작동 가능하게 연결된 근육 세포 특이적 제1 프로모터, 신경 세포 특이적 프로모터, 및 유도성 프로모터를 함유한다.

일부 구현예에서, 추가 프로모터는 혼성(합성) 신경이며- 근육-특이적 프로모터 또한 유용할 수 있다. 이러한 프로모터의 유형은 바이러스 또는 인간의 다른 프로모터 요소(예를 들어, CMV, CAG, 또는 PGK)와의 조합을 포함하는, 근육 특이적 인핸서 및/또는 전사 인자 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 신경 세포 특이적 프로모터는 하이브리드 프로모터이며, 전술한 프로모터 중 하나는 CMV 인핸서에 융합된다. 하이브리드 프로모터의 대표적인 예는 Liu 등의 문헌[Gene Ther. 11(1):52-60 (2004)]에 기술된 PDGF-β 프로모터에 대한 거대세포바이러스 인핸서(CMV E-380 bp) 5' 및 Hioki 등의 문헌[Gene Ther. 14(11):872-882 (2007)]에 기술된 SYN 프로모터에 융합된 CMV 인핸서를 포함한다. 추가적인 하이브리드 신경 세포-특이적 프로모터는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2009/0055941호에 기술되어 있다. 근육 세포 특이적 프로모터의 또 다른 예는 자연 발생 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 합성 신경 세포 특이적 프로모터를 포함한다.

다른 구현예에서, 추가적인 프로모터는 조직 특이적 프로모터 이외의 것이며, 이의 대표적인 유형은 구성적 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한다. 구성적 프로모터는 조절 영향과 독립적으로 RNA 합성을 개시한다. 유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고 외인성으로 공급된 화합물, 온도와 같은 환경 인자, 또는 특정 생리학적 상태의 존재에 의해 조절될 수 있다. 특이적 프로모터의 대표적인 예는 다음을 포함한다: CMV 프로모터(예를 들어, 거대세포바이러스 중간-초기(CMV IE) 프로모터), 베타-액틴 프로모터(예를 들어, 닭 베타 액틴(CAG) 프로모터), CASI 프로모터(예를 들어, CMV 인핸서의 조합으로서 기술된 합성 프로모터, 닭 베타-액틴 프로모터, 및 유비퀴틴(UBC) 인핸서의 측면에 위치하는 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자(미국 특허 제8,865,881에 기술된 바와 같음), 인간 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, TBG 프로모터, 레트로바이러스 루스 육종 바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터, EF1a 프로모터, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억제성 시스템, 테트라사이클린 유도성 시스템, RU486-유도성 시스템 및 라파마이신-유도성 시스템.

일부 구현예에서, 추가적인 프로모터는 아연 구동 유도성 프로모터이다. 아연-구동 프로모터의 대표적인 예는, 아연-구동 메탈로티오네인 프로모터, Brocklehurst 등의 문헌[Mol. Microbiol. 31(3):893-902 (1999)]에 기술된 대장균 zntA 유전자의 프로모터/작동자 영역, 및 미국 특허 제8,354,272호에 기술된 아연-조절 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 프로모터는 아연-구동 메탈로티오네인 프로모터이다.

일부 구현예에서, 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결되는 추가적인 프로모터는 신경 세포 특이적 프로모터이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신경 세포"는 CNS, PNS 및 척수의 세포를 포함하며, 이의 대표적인 세포 유형은 신경(운동 신경, 감각 신경 및 인터뉴런 포함), 교세포, 및 성상세포를 포함한다. 운동 신경은 뇌 및 척수로부터 신호를 보내 근육 수축으로부터 분비선의 출력까지의 모든 것을 조절한다. 용어 "신경 세포 특이적" 및 "신경 특이적"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 다른(즉, 비-신경) 세포 및 조직과 비교 시, 신경 세포 또는 신경 조직에서의 포유류 s-KL(또는 이의 기능성 변이체)의 우선적, 선택적 또는 우세한 발현을 지칭한다. 일부 구현예에서, 발현의 적어도 50%, 보다 구체적으로는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%는 신경 세포 또는 조직 내에서 발생한다. 일부 구현예에서, "신경 세포 특이적"은 발현된 포유류 s-KL(또는 이의 기능성 변이체)이 폐, 간, 뇌, 신장 및/또는 비장과 같은 신경 이외의 다른 세포, 기관 또는 조직으로 누출되지 않는다는 것을 지칭한다.

본 개시에서 사용하기에 적합할 수 있는 신경 세포 특이적 프로모터의 대표적인 예는 다음을 포함한다: 시냅신 1(SYN) 프로모터, 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II 프로모터, 튜불린 알파 I 프로모터, 신경-특이적 에놀라아제(NSE) 프로모터, 혈소판 유래 성장 인자 베타 사슬(PDGF-β) 프로모터, 미세관-연관 단백질 1B(MAP1B), 도파민 수용체 1(Drd1a) 프로모터, 67 kDa 글루탐산 데카르복실라아제(GAD67) 프로모터, 호메오박스 Dlx5/6, 글루탐산염 수용체 1(GluR1) 프로모터, 신경교섬유성 단백질(GFAP) 프로모터, 및 프리프로타키키닌 1(Tac1) 프로모터.

하나 이상의 프로모터 이외에, 그리고 발현 벡터에 달리 함유되지 않는 한, 유전자 작제물/발현 카세트는 발현 조절 서열로도 알려진 하나 이상의 다른 비암호화 조절 요소 중 하나를 추가로 포함할 수 있다. 조절 요소의 대표적인 예는 다음을 포함한다: 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예를 들어, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화(폴리 A) 꼬리 서열; 폴리 A 컨센서스 서열, 테트라사이클린 조절가능 시스템, 전사후 조절 요소, 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(예를 들어, 코작 컨센서스 서열); 및 단백질 안정성을 향상시키는 서열. 본원에서 사용되는 "전사후 조절 요소"는, 전사될 때, 본 개시의 바이러스 벡터에 의해 전달되는 이식유전자(들) 또는 이의 단편의 발현을 향상시키는 DNA 서열이다. 전사후 조절 요소의 대표적인 예는 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE) 및 우드척 간염 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함한다. WPRE는 모든 프로모터가 아닌 특정 프로모터에 의해 유도되는 이식유전자 발현을 향상시키는 것으로 입증된 삼자 시스-작용 요소이다.

일부 구현예에서, 유전자 작제물은 포유류 s-KL을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 사이토메갈로바이러스 중간-초기(CMV IE) 프로모터, 우드척 간염 바이러스(WPRE)의 전사 후 조절 요소 및 폴리 A를 포함한다.

일부 구현예에서, 유전자 작제물은 s-KL를 암호화하는 핵산(마우스 또는 인간 s-KL의 cDNA)에 작동 가능하게 연결된 CAG 프로모터 및 폴리 A 꼬리를 포함한다.

유전자 작제물은 DNA의 형태(플라스미드 및 다양한 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터)와 함께 사용되는 경우) 또는 RNA의 형태(선형화된 mRNA 작제물의 경우, 또는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터와 같은 다른 바이러스 벡터와 함께 사용되는 경우)일 수 있다. 유전자 작제물이 선형화된 mRNA 작제물에 대한 RNA 형태인 일부 구현예에서, 유전자 작제물은 플라스미드에 통합되며, 여기에서 플라스미드는 효소(예를 들어, 제한 효소)로 처리되어 선형 DNA를 생성하고, 이는 생체외 전사로서 생물반응기에서 전사되어 mRNA를 생성한다. 선형화된 mRNA는 양으로 하전된 중합체, 양이온성 지질, 또는 다른 복합체와 복합체를 형성하여 압출된 나노입자, 압출된 미크론 크기 입자, 또는 미셸 유화액을 형성한다.

유전자 작제물이 레트로바이러스 및 렌티바이러스 전달을 위한 RNA의 형태인 일부 구현예에서, 유전자 작제물은 5' 및 3' 긴 말단 반복부(LTR)뿐만 아니라 그룹 항원(Group Antigen(gag)), 역전사효소(pol), 및 외피(env) 유전자를 함유한다. 일부 구현예에서, 5' LTR은 렌티바이러스 tat 단백질에 의한 전사 활성화에 의존하지 않는 이종 프로모터를 함유하는 키메라 5' LTR이다. 렌티바이러스 LTR은 U3, R, 및 U5로 명명된 3개의 원소로 분할될 수 있다. U3 요소는 렌티바이러스 RNA 게놈의 3' 말단에 대해 고유성을 갖는다. R은 렌티바이러스 RNA 게놈의 양쪽 단부에서 반복되고, U5는 렌티바이러스 RNA 게놈의 5' 단부에 대해 고유성을 갖는다. 3개 요소의 크기는 상이한 바이러스에 대해 크게 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, LTR 중 어느 하나의 부분은 변형, 교체, 또는 결실되며, 예를 들어, 3' U3의 일부는 결실된다. 일 구현예에서, 3' U5 요소는 폴리 A로 대체된다. 일 구현예에서, 5' U3은 절단된 CMV 즉시 초기(IE) 인핸서/TATA 프로모터로 대체된다. 추가의 렌티바이러스 비-코딩 조절자 요소는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO 2021/181108A1, 및 WO 2021/160993A1, 그리고 미국 특허 제6,669,936호, 제6,924,123호 및 제10,544,429호를 참조한다.

일부 구현예에서, 이러한 유전자 작제물(또는 핵산 작제물)은 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다:

(a) 폴리 A 신호, 예를 들어 SV40 폴리 A 꼬리;

(b) 단백질 번역 개시 부위 컨센서스 핵산;

(c) 전사-후 조절 요소 핵산;

(d) 5' 및 3' 역위 말단 반복부; 및

(e) 인트론.

당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "인트론"은 핵 스플라이싱 장치에 의해 인식되고 스플라이싱되기에 충분히 큰 전체 인트론의 임의의 부분을 포함한다. 통상적으로, 발현 카세트의 작제 및 조작을 용이하게 하도록 발현 카세트의 크기를 가능한 한 작게 유지하기 위해, 짧고, 기능성인 인트론 서열이 바람직하다. 일부 구현예에서, 인트론은 발현 카세트 내의 코딩 서열에 의해 암호화되는 단백질을 암호화하는 유전자로부터 수득된다. 인트론은 코딩 서열에 대해 5', 코딩 서열에 대해 3', 또는 코딩 서열 내에 위치될 수 있다. 인트론을 코딩 서열에 대해 5'에 위치시키는 장점은 해당 인트론이 폴리아데닐화 신호의 기능을 방해할 가능성을 최소화하는 것이다. 적합한 인트론의 대표적인 예는 마우스의 미세 바이러스(MVM) 인트론, 베타-글로빈 인트론(betaIVS-1), IX 인자(FIX) 인트론 A, 시미안 원숭이 바이러스 40(SV40) 소형-t 인트론, 및 베타-액틴 인트론을 포함한다.

이들 요소 (a) 내지 (e) 모두는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자의 적절한 발현을 가능하게 하는 서열이다. 당업자는 언급된 서열 및 이의 기능을 이해할 것이다.

일부 구현예에서, 유전자 작제물은 포유류 s-KL 코딩 서열의 근육 특이적 발현을 향상시킬 수 있는, 근육 특이적 조절 요소, 예를 들어, 근육 세포 특이적 프로모터 이외의 요소를 포함할 수 있다. 이러한 서열의 대표적인 예는 CSk-SH1, CSk-SH2, CSk-SH3, CSk-SH4, CSk-SH51, 및 CSk-SH6 조절 요소를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2020/00407746호를 참조한다. 일부 구현예에서, 이러한 조절 요소는 프로모터의 상류에 위치될 수 있다.

서열번호 6을 암호화하는 핵산, WPRE 및 폴리 A를 포함하는 유전자 작제물의 핵산 서열은 아래에 (서열번호 7)로서 제시된다:

핵산 및 유전자 작제물을 벡터로 클로닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열, 또는 전체 유전자 작제물은 코돈 최적화, 예를 들어 CpG 디뉴클레오티드가 고갈될 수 있다. 일 구현예에서, 유전자 작제물의 프로모터는 CpG 디뉴클레오티드가 완전히 고갈된다. CpG 디뉴클레오티드 고갈은 부위 지향 돌연변이유발, 시험관 내 유전자 작제물 합성, 또는 임의의 적절한 분자 생물학 기술에 의해 달성될 수 있다.

발현 벡터

발현 작제물로서도 알려진 발현 벡터는 일반적으로 세포에서 단백질 발현을 위해 설계된 바이러스 또는 플라스미드(예를 들어, 바이러스 게놈 또는 이의 일부를 함유할 수 있음)이다. 발현 벡터는 복제 기점, 선택성 마커, 및 유전자 작제물의 삽입에 적합한 부위, 예컨대 다중 클로닝 부위(MCS)와 같은, 임의의 벡터가 가질 수 있는 특징을 갖는다.

일 양태에서, 본 개시는 발현 벡터를 제공하며, 이는: (a) 포유류 s-KL 또는 이의 기능 변이체를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 근육 세포 특이적 프로모터를 포함하는 핵산 작제물(여기에서, 벡터는 근육 세포 향성을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있음); 또는 (b) 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 근육 세포에서 기능적으로 작동 가능한 제1 프로모터를 포함하는 핵산 작제물(여기에서, 상기 발현 벡터는 근육 세포 향성을 가짐)을 포함한다.

바이러스 발현 벡터

일부 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다.

본원에서 사용되는 용어 "아데노-연관 바이러스"는 분열 및 정지 영장류(및 인간) 세포 둘 모두를 감염시키는 바이러스 벡터를 지칭한다. 임의의 병원성 효과가 결여되어 있고, 대체적으로 게놈의 동일한 위치(AAVS1 부위, 염색체 19 내)에 통합되는 이러한 바이러스 벡터는 유전자 요법 응용에서 외래 DNA를 인간 세포 내로 형질도입하는 데 안전하게 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV)이다. AAV 벡터는 인간(h), 개코원숭이, 침팬지, 및 붉은털 원숭이(rh), 돼지꼬리 원숭이(pi), 및 시노몰구스 마카크 원숭이를 포함하는 임의의 적절한 숙주 종으로부터 유래될 수 있다. 모든 공지된 AAV 혈청형의 게놈 조직은 유사하다. AAV 의 게놈은 약 5,000개 뉴클레오티드(nt) 길이 미만인 선형, 단일-가닥 DNA 분자이다. 역위 말단 반복부(ITR)는 비-구조적 복제(Rep) 단백질 및 구조적(VP) 단백질에 대한 고유 코딩 뉴클레오티드 서열의 측면에 위치한다. VP 단백질(VP1, -2 및 -3)은 캡시드를 형성하고 바이러스의 향성에 기여한다. 말단 145 nt ITR은 자가-상보성이고, T-형상 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정적인 분자내 이중체가 형성될 수 있도록 구성된다. 이들 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제의 기원으로서 기능하며, 세포 DNA 중합효소 복합체에 대한 프라이머로서 기능한다. 포유류 세포에서 야생형(wt) AAV 감염 후, Rep 유전자가 발현되고, 이는 바이러스 게놈의 복제에 작용한다.

AAV 발현 벡터의 대표적인 예는 AAV1, AAV3, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVrh.43, AAVrh74, AAVpi.2, AAVrh.8, AAVhu.11, AAVhu.32, and AAVhu.37, PHPeB, 9P31, 및 AAVmyo를 포함하는 AAV의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. AAV 혈청형 9(AAV9)는 심장 및 골격근에서 효율적인 형질도입을 달성하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 발현 벡터는 AAV9 벡터, 예를 들어, 자가-상보성 AAV9 벡터(scAAV9)이다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 근육 세포 향성을 갖는 혈청형의 AAV이다. 본원에서 사용되는 용어 "근육 세포 향성"은 근육 세포에 우선적으로 영향을 미치는 벡터, 예를 들어, 신체의 다른 세포 유형보다 근육 세포를 우선적으로 감염시키는 바이러스 벡터를 지칭한다. 근육 세포 향성을 갖는 혈청형의 이러한 AAV의 대표적인 예는 AAV1, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 (BBB), AAVrh.74, 및 AAVmyo를 포함한다. 근육 세포 향성을 갖는 추가적인 AAV는 당업계에 공지되어 있다. 미국 특허 출원 공개 제2021/0363193호; Tabebordbar 등의 문헌[Cell 184(19):4919-4938 (2021)]; 및 Weinmann 등의 문헌[Nat. Commun. 11(1):5432 (2020)]을 참조한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 AAV8 및 AAVmyo로부터 선택되는, 근육 세포 향성을 갖는 혈청형의 아데노-연관 바이러스이다. 이들 구현예에서, 프로모터는 근육 세포 특이적 프로모터일 필요는 없다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열번호 18~29 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 서열번호 30~41 중 어느 하나의 서열을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 AAV 캡시드 폴리펩티드를 함유하는 아데노-연관 바이러스이다. Grimm 등, 미국 특허 출원 공개 제2021/0363193호를 참조한다.

일부 구현예에서, AAV 캡시드 폴리펩티드는 서열번호 30의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 미국 특허 출원 공개 제2021/0363193호에 개시된 AAV9P1에 상응하는, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 폴리펩티드는 서열번호 38의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 미국 특허 출원 공개 제2021/0363193호에 개시된 AAV9S10P1에 상응하는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 폴리펩티드는 서열번호 39의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 미국 특허 출원 공개 제2021/0363193호에 개시된 AAVS1P1에 상응하는, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 AAV8 혈청형의 아데노-연관 바이러스이며, 이는 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 해당 서열은 인간 데스민 프로모터, 마우스 s-KL에 대한 핵산 코딩, WPRE 서열 및 SV40 폴리 A 꼬리를 포함하는 유전자 작제물이다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지지만, 여기에서 유전자는 인간 s-KL, 예를 들어 서열번호 3의 핵산 서열을 암호화하는, AAV8 혈청형의 아데노-연관 바이러스이다.

서열번호 7에서의 상이한 서열의 위치는 표 A에 제시된다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 신경 향성을 갖는 혈청형의 AAV이다. 본원에서 사용되는 용어 "신경 세포 향성"은 신경 세포에 우선적으로 영향을 미치는 벡터, 예를 들어, 신체의 다른 세포 유형보다 운동 신경을 우선적으로 감염시키는 바이러스 벡터를 지칭한다. 신경 세포 향성을 갖는 혈청형의 이러한 AAV의 대표적인 예는 AAV1, AAV6, 및 AAV7을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 성상세포에 특이적인 신경 세포 향성을 갖는 혈청형, 예를 들어, AAV5의 아데노-연관 바이러스이다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2019/0030138호 및 제2020/0339960호에 기술된 바와 같은 신경 세포 향성을 갖는 벡터이다. 이들 구현예에서, 프로모터는 신경 특이적 프로모터일 필요는 없다.

일부 구현에서 발현 벡터는 척수를 표적화하는 신경 세포 향성을 가진 혈청형의 AAV를 이용한 실질내 주사로 전달된다. 이들 구현예 중 일부에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV5, AAV9이다. 일부 구현예에서, AAV 발현 벡터는 정맥내 전달되고 신경 세포 향성을 갖는다. 정맥내 주사에 양호하게 구성된 신경 세포 향성을 갖는 AAV 벡터 혈청형은 AAV9, AAVhr.10, AAVrh.8, 및 AAVrh43을 포함한다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 축삭 역행 수송을 거치도록 구성된다. 이들 구현예 중 일부에서, 발현 벡터는 AAV1, AAV5, AAV8, AAV9, 또는 AAVrh.10의 AAV 혈청형이다. 일 구현예에서, AAV1 혈청형 발현 벡터는 근육 또는 좌골 신경에 주사되고 운동 신경을 우선적으로 표적화한다.

일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 혈청형으로부터의 적어도 하나의 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV(rAAV)이다. AAV 캡시드 단백질은 AAV가 원하는 조직 또는 기관에 유전자 작제물을 감염시키고 전달하도록, 조직 특이적 표적화를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV는 둘 이상의 바이러스로부터의 바이러스 외피 단백질을 갖는 바이러스 또는 바이러스 벡터를 포함하는 위형 AAV(pAAV)이다. pAAV는 변경된 숙주 또는 조직 향성을 갖거나, 증가 또는 감소된 입자 안정성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, pAAV는 2개 이상의 상이한 AAV로부터의 핵산을 포함하며, 예를 들어, 하나의 AAV 공급원으로부터의 핵산은 캡시드 단백질을 암호화하고, 적어도 하나의 다른 AAV 공급원의 핵산은 다른 바이러스 단백질 및/또는 바이러스 게놈을 암호화한다. 일부 구현예에서, pAAV는 하나의 AAV 혈청형의 역위 말단 반복부(ITR) 및 상이한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 AAV를 지칭한다. 예를 들어, Y의 단백질로 캡슐화된 혈청형 X의 ITR을 함유하는 pAAV 벡터는 AAVX/Y로 명명된다(예를 들어, AAV2/1은 AAV2의 ITR 및 AAV1의 캡시드를 가짐). 일부 구현예에서, pAAV는 하나의 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질의 조직 특이적 표적화 능력을 다른 AAV 혈청형으로부터의 바이러스 DNA(예를 들어, 바이러스 ITR)와 조합함으로써, 이식유전자를 표적 조직으로 표적화 전달시키는 데 유용할 수 있다.

AAV 벡터 생산은 가장 통상적으로, 시험관 내에서 이중 플라스미드 형질감염에 이어지는 헬퍼 아데노바이러스 감염으로 달성된다. 이중 플라스미드 형질감염의 2개의 플라스미드는 벡터 플라스미드 및 패키징 플라스미드이다. 벡터 플라스미드는 AAV 역위 말단 반복부(ITR)가 측부에 위치된 본원에 기술된 유전자 작제물을 함유하는 한편, 패키징 플라스미드는 벡터 DNA 복제 및 패키징을 위한 AAV 레플리카제(Rep) 및 캡시드(Cap) 유전자를 제공한다. 적절한 세포주(예를 들어, HeLa)가 2개의 플라스미드로 형질감염되면, 이는 헬퍼 아데노바이러스로 감염되고, AAV 유전자가 발현되며, 플라스미드 둘 모두로부터의 유전자가 발현되어 AAV 입자 내로 패키징된다. 패키징 플라스미드 상에 암호화된 단백질은 AAV 입자를 구성하는 한편, 벡터 플라스미드(유전자 작제물을 함유함)는 AAV 입자 내에 패키징된다. AAV 입자는 헬퍼 아데노바이러스 입자로부터 정제되거나, 아데노바이러스 입자는 선택적으로 열 불활성화된다. 이러한 절차는 유전자 작제물을 함유하는 복제 결핍 AAV를 생산하며, 이는 추가로 제형화되어 대상체에게 전달될 수 있다.

대안적으로, 시험관 내 헬퍼 아데노바이러스 감염을 대신하여, 아데노바이러스로부터의 필수 복제 유전자(예를 들어, E1A, E1B, E2A, E4, 및 VA RNA)를 함유하는 제3 아데노바이러스-유래 플라스미드가 벡터 플라스미드 및 패키징 플라스미드와 함께 형질감염될 수도 있다. 일부 구현예에서, 패키징 및 아데노바이러스-유래 플라스미드는 세포주에 안정적으로 통합될 수 있다.

AAV, rAAV 및 pAAV의 생산 및 전달을 위한 추가적인 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2015/0065560호, 제2013/0090374호, 및 제2012/0309050호, 및 미국 특허 제11,041,171호, 제11,020,443호, 및 제7,858,367호를 참조한다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 비-통합 및 비-복제 재조합 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 벡터의 작제는, 예를 들어 미국 특허 제5,665,577호, 제5,981,276호, 제6,013,516호, 제7,090,837호, 제8,119,119호 및 제10,954,530호에 기술되어 있다. 렌티바이러스 벡터는 결함이 있는, 즉, 렌티바이러스 유전자 gag, pol, 및 env 중 적어도 하나는 불활성화되거나 결실된 렌티바이러스 게놈을 포함한다. 추가적인 렌티바이러스 유전자 및 서열은, 종종 cPPT CTS로 약칭되는, 중앙 폴리퓨린 관(cPPT)과 중앙 종결 서열(CTS) 사이에서 바이러스 cDNA의 중심에 있는 Rev 반응 요소(RRE) 및 DNA 플랩을 포함한다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 재조합 게놈을 포함하는 재조합 렌티바이러스이며, 재조합 게놈은, LTR 5'와 3' 렌티바이러스 서열 사이에, 렌티바이러스 캡슐화 psi 서열, RNA 핵 배출 요소, 이식유전자, 및 프로모터 및/또는 RNA의 핵 도입에 유리한 서열을 포함할 뿐만 아니라, 이의 게놈이 단리된 세포의 게놈 내로 통합되는 것을 방지하는 돌연변이된 통합효소를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는, 예를 들어, 서열 5'LTR-psi-RRE-cPPT CTS-이식유전자-LTR3'을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 서열을 암호화하는 바이러스 벡터는 본 개시의 임의의 핵산 서열이 없는 캡시드 단백질을 포함하는 빈(empty) 벡터와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 빈 벡터는, 바이러스 벡터에 대한 대상체의 면역 반응을 면역조절하도록, 바이러스 벡터에 대해 5:1 내지 3:1의 비율로 투여된다.

일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 면역조절된다. 면역조절은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 바이러스 벡터에 첨가함으로써, 통상적으로 바이러스 벡터의 표면 상에 노출된 리신 잔기의 페길화에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2021/0139860호 및 미국 특허 제6,399,385호 및 제10,022,457호를 참조한다. 페길화는 바이러스 벡터 입자에 대한 보다 긴 순환 시간뿐만 아니라 면역 반응 감소(즉, 면역원성 저하)를 야기한다.

추가적인 바이러스 벡터는 본원에 개시된 바이러스 벡터와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2019/0030138호에 기술된 바이러스 벡터는 본원에 기술된 바이러스 벡터와 조합될 수 있다.

비-바이러스 발현 벡터

다른 구현예에서, 발현 벡터는 비-바이러스 벡터이며, 이의 대표적인 예는 플라스미드, 미니서클, 및 트랜스포존계 벡터, 예컨대 Sleeping Beauty(SB)계 벡터 및 piggyBac(PB)계 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스 및 비-바이러스 요소 둘 모두를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 유전자 작제물은 플라스미드 발현 벡터에 통합된다. 플라스미드는 유전자 작제물을 암호화하는 서열(프로모터 및 포유류 s-KL 서열), 개시 서열, 폴리-A 꼬리 서열, 선택적인 조절 요소, 및 다른 선택적인 서열(예를 들어, 다중 클로닝 부위)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 원형 플라스미드로부터 생산된다. 플라스미드는 제한 효소로 선형화될 수 있고, 시험관 내에서 전사되어 mRNA를 생성하고, 5' 캡 및 3' 폴리-A 꼬리를 사용하여 변형될 수 있다.

일부 구현예에서, 담체는 유전자 작제물 또는 플라스미드를 캡슐화한다. 담체는 지질계, 예를 들어 지질 나노입자(LNP), 리포솜, 지질 소포, 또는 리포플렉스일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 LNP이다. 특정 구현예에서, LNP는 수성 구획부에 의해 분리된 2개 이상의 동심 이중층을 포함한다. 지질 이중층은 관능화되고/되거나 서로에 대해 가교될 수 있다. 지질 이중층은 하나 이상의 리간드, 단백질, 또는 채널을 포함할 수 있다.

지질 담체, 예를 들어, LNP는 하나 이상의 양이온성/이온화성 지질, 하나 이상의 중합체 접합 지질, 하나 이상의 구조적 지질, 및/또는 하나 이상의 인지질을 포함할 수 있다. "양이온성 지질"은 양전하 지질 또는 양전하를 유지할 수 있는 지질을 지칭한다. 양이온성 지질은 pH 의존성으로 양전하를 보유하는 하나 이상의 아민기(들)를 포함한다. "중합체 접합 지질"은 접합된 중합체 부분을 갖는 지질을 지칭한다. 중합체 접합 지질은 폴리에틸렌 글리콜에 접합된 지질인 페길화 지질을 포함한다. "구조적 지질"은 생리학적 pH에서 순 전하를 갖지 않는 비-양이온성 지질을 지칭한다. 예시적인 구조적 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤 등을 포함한다. "인지질"은 2개의 지방산 및 1개의 인산염 이온과 함께 글리세롤의 트리에스테르를 갖는 지질을 지칭한다. LNP 중의 인지질은 해당 지질을 하나 이상의 지질 이중층으로 조립한다. LNP, 이의 제조, 제형화, 및 전달 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제9,364,435호, 제9,518,272호, 제10,022,435호, 및 제11,191,849호, 그리고 미국 특허 출원 공개 제2004/0142025호, 제2007/0042031호, 및 제2020/0237679호에 개시되어 있다.

리포플렉스, 리포솜, 및 지질 나노입자는 지질 분자, 예를 들어, 양이온성 지질, 중성 지질, 음이온성 지질, 폴리펩티드-지질 접합체, 및 다른 안정화 성분의 조합을 포함할 수 있다. 대표적인 안정화 성분은 항산화제, 계면활성제, 및 염을 포함한다. 리포플렉스, 리포솜, 및 지질 나노입자의 조성물 및 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,058,069호, 제8,969,353호, 제9,682,139호, 제10,238,754호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0064026호 및 제2018/0291086호, 그리고 Lasic의 문헌[Trends Biotechnol. 16(7):307-21 (1998)], Lasic 등의 문헌[FEBS Lett. 312(2-3):255-8 (1992)], 및 Drummond등의 문헌[Pharmacol. Rev. 51(4):691-743 (1999)]을 참조한다.

약학적 조성물

본 개시의 발현 벡터를 함유하는 약학적 조성물은, 일부 구현예에서, 임의의 적합하고 의학적으로 허용 가능한 투여 모드를 통해 대상체에게 투여하기 위해, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 부형제(총칭하여 약학적으로 허용 가능한 "비히클")와 함께 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 비경구(예를 들어, 정맥내) 전달을 통해 이루어진다.

"약학적으로 허용 가능한 담체" 및 "약학적으로 허용 가능한 부형제"라는 표현은, 생리학적으로 불활성(예를 들어, 비면역원성)이고 비독성이며, 약학적 조성물의 다른 모든 성분과 양립할 수 있고, 그렇지 않으면 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는, 대상체(예를 들어, 인간 및 비인간 동물 둘 모두를 포함하는 포유동물)의 조직 또는 기관과의 접촉에 적합한 성분을 지칭한다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 전신, 예를 들어 비경구 투여의 목적으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 담체는 수성이며, 이의 대표적인 예는 물, 식염수 용액(예를 들어, 생리 식염수, 정균수, 및 인산염 완충 식염수(PBS)), 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액을 포함한다. 수성 담체는 또한 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 폴리올을 포함할 수 있다. 수성계 조성물은 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 같은 추가적인 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 수성계 제형은 용액, 현탁액 또는 분산액의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 비-수성이다.

약학적 조성물은 부형제를 추가로 함유할 수 있다. 담체의 경우에서와 같이, 부형제의 선택은 특정 벡터에 의해서, 그리고 조성물의 투여에 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 따라서, 당업자는 본 개시의 약학적 조성물에 대해 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 부형제의 대표적인 예는 코팅제, 계면활성제 및 유화제, 항균제 및 다른 보존제, 가용화제, 등장화제, 흡수 차단제 및 현탁제를 포함한다. 레시틴은 적절한 유동성을 설정하고 예시적인 코팅제이며, 이는 분산의 경우에 필요한 입자 크기를 유지한다. 계면활성제 또한 입자 크기 유지에 도움을 줄 수 있다. 예시적인 항균제는 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등을 포함한다. 예시적인 등장제는 당 및 폴리알코올(예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨)을 포함한다. 예시적인 흡수 차단제는 조성물에서 유전자 작제물의 흡수를 연장시키는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함한다.

약학적 조성물의 제조, 이의 제형화, 및 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터의 전달에 사용되는 추가적인 약학적으로 허용 가능한 부형제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2013/0090374호, 및 제2012/0309050호, 및 미국 특허 제7,858,367호, 제11,020,443호, 및 제11,041,171호를 참조한다.

발현 벡터를 함유하는 약학적 조성물은 또한, 예를 들어 경구(액상 및 고상 투여 형태 둘 모두를 포함함), 흡입(가압 추진제를 통함), 국소(예를 들어, 로션, 크림, 겔, 연고, 스틱, 스프레이 및 페이스트), 및 점막(예를 들어, 질)을 포함하는 여러 다른 투여 경로 또는 투여 모드를 위해 제형화될 수 있다.

조성물은 앰플 및 바이알과 같은 단위-용량 또는 다회-용량 밀봉 용기로 제공될 수 있다.

치료 방법

본 방법은 근육 기능 상실 또는 운동 신경의 수준에서의 신경-근육 기능 장애로 인한 운동 장애를 앓고 있는 대상체의 치료를 수반한다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 이러한 결과는, 검출 가능 또는 검출 불가능의 여부에 관계없이, 운동 장애의 하나 이상의 증상의 완화 또는 경감, 질환 또는 장애의 정도의 감소, 질환 또는 장애의 상태의 안정화, 질환 또는 장애의 지연 또는 둔화, 질환 또는 장애의 완화 또는 경감, 및 질환 또는 장애의 관해(부분적 또는 전체적) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물(예를 들어, 비인간 영장류, 가축 동물, 가축 동물, 반려 동물, 및 설치류와 같은 실험실 동물)을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "운동 손상"은 근육 기능 상실로 인한 운동 능력 상실을 지칭한다. 기능 상실은 주로 근육 약화, 근육 위축, 운동 기능 상실, 근육 수축성 장애, 및 다른 근육 세포 장애(예를 들어, 대사), 척수 손상, 운동 신경 손상, 또는 운동 신경 질환으로 인한 것이다. 운동 장애의 예는 전체 또는 부분 마비(예를 들어, 걷거나 서지 못함, 말하거나 삼킬 수 없으며 최종적으로 호흡할 수 없음(예를 들어, 호흡 부전), 후자는 사망에 이르게 됨), 근육 조절 부족, 체력 저하, 근육 경련, 경직, 근육 약화 및 근육 위축을 포함한다.

국제 신경조절학회(International Neuromodulation Society)에 따르면, 운동 장애는 신체 부위, 일반적으로 사지 중 하나 또는 사지의 기능의 부분적 또는 전체적 상실을 수반한다. 운동 장애를 유발하는 질환은 근육 약화, 불량한 체력(즉, 피로), 근육 조절 부족, 또는 완전 마비를 야기할 수 있다. 운동 장애는 신체 장애의 주요 원인이다. 이는 근육에 영향을 미치는 말초 문제, 근육으로의 출력에 영향을 미치는 중추신경계의 문제, 및 근육, 움직임 및 균형에 영향을 미치는 감각 문제에 의해 광범위하게 야기된다. 운동 손상은 신경근 질환에서 주로 나타나지만, 중추 및 말초 신경계의 암, 또는 심지어 외상성 손상으로부터 발생할 수 있다.

특정 신경퇴행성 질환과 같은 운동 신경 질환을 포함하는 많은 신경근 및 근육 질환 및 장애는 운동 손상의 하나 이상의 증상에서 나타날 수 있다. 운동 손상의 하나 또는 증상을 특징으로 하거나 해당 증상을 나타내는 질환 및 장애는 신경근 질환을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "신경근 질환"은 척수 또는 중추신경계(CNS), 말초 신경계(PNS), 신경근 접합부, 또는 골격근의 운동 신경에 영향을 미치는 임의의 질환을 포함하며, 이들 모두는 운동 유닛의 구성 요소로서, 궁극적으로 대상체의 운동 능력에 영향을 미친다. 척수, CNS, PNS, 신경근 접합부, 또는 골격근에서의 운동 신경에 대한 손상은 근육 위축 및 쇠약을 야기할 수 있다. 감각 문제 또한 발생할 수 있다. 신경근 질환은 후천성 또는 유전적일 수 있다. 500개가 넘는 유전자의 돌연변이가 신경근 질환의 원인인 것으로 밝혀졌다. 다른 원인은 신경 또는 근육의 퇴행, 자가면역, 독소, 약물, 영양실조, 대사 이상, 호르몬 불균형, 감염, 신경 압박/포획, 혈액 공급 부족, 및 외상을 포함한다.

운동 손상을 특징으로 하는 질환 및 장애의 대표적인 예는 신경근 질환 및 장애의 예는, 근위축성 측색 경화증(ALS)(보다 흔하거나 산발성인 형태(sALS) 및 가족성 형태(fALS) 포함), 샤르코-마리-투스병, 다발성 경화증, 근육 이영양증, 뒤시엔-베커(Duchenne and Becker) 근육 이영양증, 중증근무력증, 근육병증, 다발성근염 및 피부근염을 포함하는 근육염, 말초 신경병증, 신경근긴장증, 램버트-이튼(Lambert-Eaton)병, 프리드라이히 운동실조증, 외상성 신경 손상, 당뇨병성 신경병증, 운동 능력 장애, 및 척추 근육 위축증(SMA), 척수 손상, 말초 신경 손상, 또는 외상성 신경 손상, 및 근육 대사 질환을 포함한다. 개시된 발현 벡터를 사용한 치료로 치료될 수 있는 또 다른 질환 및 장애는, 유전성 근육병증, 독성 신경병증, 자가면역 말초 다발신경병증, 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경근병증(AIDP), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경근병증(CIDP), 혈관염성 다발성 단일신경병증, 부신경병증, 특발성 신경절염, 근위축성 측색 경화증, 다초점 운동 전도 잠금 신경병증 또는 하부 운동 뉴런 증후군, 신경근 질환, 근위축증, 약물 유발성 근병증, 근육감소증, 악액질, II형 근섬유 위축증, 연령 관련 근위축증 및 후천성 자가면역 원발성 근육 장애를 포함한다.

본 개시된 유전자 작제물 및 발현 벡터를 사용하는 치료로 치료될 수 있는 일부 질환 및 장애는, 신체의 수의근을 조절하는 세포인 운동 신경에 선택적으로 영향을 미치는 희귀 신경퇴행성 장애의 군인 운동 신경 질환(MND)으로 분류되는 질환 및 장애를 포함한다. MND의 예는 ALS, 진행성 연수 마비(PBP), 가성연수 마비, 진행성 근육 위축증(PMA), 원발성 측색 경화증(PLS), 척수성 근육 위축증(SMA), 및 단핵성 근위축증(MMA)뿐만 아니라 ALS와 유사한 일부 희귀 변형을 포함한다.

일부 구현예에서, 방법은, sALS의 운동 손상을 포함하고, fALS의 운동 손상을 포함하고, jALS의 운동 손상을 포함하는, ALS의 운동 손상을 앓고 있는 가진 대상체의 치료를 수반한다.

일부 구현예에서, 방법은 발현 벡터(또는 생체 외 구현예에 따라 형질전환된 세포)가 운동 손상이 나타나기 전에 대상체에게 투여된다는 점에서 "예방적" 또는 "방지적"일 수 있다. 이러한 구현예는 대상체가 신경근 장애의 초기 단계를 겪고 있는 것으로 의심되고/되거나 검정된 예비 양성 진단을 받았거나 그렇지 않은 경우(예를 들어, 가족 병력을 통해) 질병이나 장애(예를 들어, ALS)에 대한 소인이 있다고 믿어지는 상황에서 특히 유리할 수 있다. 예방적 또는 방지적 치료는 운동 손상의 발병 지연, 또는 일단 증상이 나타났을 경우 운동 손상의 중증도 감소를 야기할 수 있다. 운동 손상 소인을 결정하기 위한 검정은, 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같은 유전자 검정, 근육 생검, 및 근전도를 포함할 수 있다. 예를 들어, fALS는 유전자 검사에 의해 진단될 수 있다.

투여 방법

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대상체에게 비경구(예를 들어, 연속적 또는 비연속적일 수 있는 볼루스 또는 주입을 통한, 경막내, 피하, 정맥내, 뇌실내, 근육내, 또는 동맥내 주사를 통해) 투여된다. 다른 투여 경로/모드는 임의의 의학적으로 허용 가능한 경로를 포함하며, 이의 대표적인 예는 경구, 흡입, 국소 및 점막을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 치료 방법은 발현 벡터의 세포 투여를 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 치료를 필요로 하는 대상체로부터 세포를 단리하는 단계(본원에서 "단리된 세포"로도 지칭됨), 단리된 세포를 적절한 생체 외 배양 시스템에 배치하는 단계, 포유류 s-KL을 암호화하는 유전자 작제물을 사용하여 단리된 세포를 발현 벡터에 노출시키는 단계, 및 단리된 세포를 대상체에게 다시 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 분화제를 사용하여 단리된 세포를 임의의 세포 유형으로 선택적으로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 단리된 세포를 발현 벡터에 노출시키기 전 또는 후에 단리된 세포를 선택적으로 농축시키는 단계를 포함한다. 대상체로부터 단리된 세포는 근육 세포, 신경 세포, 또는 iPSC일 수 있다. 일부 구현예에서, 신경 세포는 운동 신경이다.

일부 구현예에서, 단리된 세포는 다능성이거나 다능성으로 유도된 다능성 줄기 세포(예를 들어, iPSC)이다. PSC는 대상체로부터(예를 들어, 지방 조직으로부터) 수득될 수 있으며, 이 경우 이들은 다능성 상태로 재프로그래밍될 수 있다(자가). 대안적으로, iPSC는 적절한 세포 은행(동종이계), 예를 들어 제대혈 세포 은행으로부터 수득될 수 있다. 다능성 유도는 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적절한 수단에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 다능성 유도는, 핵산 서열, 폴리펩티드, 소분자, 또는 이들의 조합일 수 있는 다능성 인자를 갖는 단리된 세포에서의, 특이적 세포 경로에 대한 직접 또는 간접적 조절을 포함한다. 일 구현예에서, 다능성 인자는 폴리펩티드 전사 인자 또는 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 다능성 인자 전사 인자의 대표적인 예는 다음을 포함한다: Oct-3/4, Cdx-2, Gbx2, Gsh1, HesX1, HoxA10, HoxA11, HoxB1, Irx2, Isl1, Meis1, Meox2, Nanog, Nkx2.2, Onecut, Otx1, Oxt2, Pax5, Pax6, Pdx1, Tcf1, Tcf2, Zfhx1b, Klf-4, Atbf1, Esrrb, Gcnf, Jarid2, Jmjd1a, Jmjd2c, Klf-3, Klf-5, Mel-18, Myst3, Nac1, REST, Rex-1, Rybp, Sall4, Sall1, Tif1, YY1, Zeb2, Zfp281, Zfp57, Zic3, Coup-Tf1, Coup-Tf2, Bmi1, Rnf2, Mta1, Pias1, Pias2, Pias3, Piasy, Sox2, Lef1, Sox15, Sox6, Tcf-7, Tcf711, c-Myc, L-Myc, N-Myc, Hand1, Mad1, Mad3, Mad4, Mxi1, Myf5, Neurog2, Ngn3, Olig2, Tcf3, Tcf4, Foxc1, Foxd3, BAF155, C/EBPβ, mafa, Eomes, Tbx-3; Rfx4, Stat3, Stella, 및 UTF-1. 일 구현예에서, 다능성 인자는 전사 인자 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, 및 Nanog를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.

iPSC는 당업계에 공지된 바와 같이, 분화제를 사용하여 근육 세포 또는 신경 세포로 분화시킬 수 있다. iPSC를 근육 세포로 분화시키기 위한 분화제의 대표적인 예는, TGF-β, 올-트랜스 레티노산, 디부티릴-환형 아데노신 일인산염(cAMP), 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB), 및 이들의 조합을 포함한다. iPSC를 신경 세포로 분화시키기 위한 분화제의 대표적인 예는, 레티노산, 골 형성 단백질 4(BMP4) 신경 성장 인자(NGF), 레티노산 수용체(RAR) 작용제(예를 들어, TTNPB), 글리코겐 합성효소 키나아제 3 억제제(예를 들어, CHIR99021), Neurotrophin-3(NT-3), 및 이들의 조합을 포함한다. 치료되고/되거나 분화된 세포에 대해 추가적인 농축 또는 선별이 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CD34+ 세포는 평활근 세포를 단리하기 위해 선택적으로 농축된다. 일부 구현예에서, iPSC는 가로무늬 근육 세포를 단리하기 위해 분화되고 선택적으로 농축된다. 일부 구현예에서, 신경 세포는 Forkhead 박스 A2(HNF3β, 및 TCF-3B로도 알려진 FOXA2) 양성 세포를 선별함으로써 농축된다. 일부 구현예에서, 신경 세포는 CD133 양성 세포를 선별함으로써 농축된다.

다른 구현예에서, 근육 세포 및/또는 신경 세포는 대상체로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 근아세포, 및 위성 세포(휴면 및 활성화 상태 중 어느 하나)는 수술 방법(예를 들어, 근육 생검) 및 단리된 형광 활성화 세포 분류(예를 들어, Pax7 양성 세포 단리)에 의해 대상체로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 유도된 다능성 줄기 세포, 혈관모세포, 불멸화 근육 전구체 세포, 또는 다른 다능성 세포주가 수득되고 국소적으로 또는 전신적으로 대상체에게 투여된다.

발현 벡터를 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 벡터의 성질에 따르는 특정 방법을 용이하게 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 전달 또는 통합은 발현 벡터로 세포를 형질감염, 감염 또는 형질도입하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터는 리포펙션에 의해 근육 세포에 전달된다. 리포펙션은, 예를 들어, 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호; 및 제4,897,355호에 기술되어 있다. 전기천공은 플라스미드 벡터에 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, 인자 H는, 예를 들어 대상체로부터 지방 조직을 수확하는 단계, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 정제하는 단계, 줄기 세포를 치료하여 인자 H(예를 들어, 소분자 화합물, 선택적으로 셀레그린)의 분비를 증가시키는 단계, 및 치료된 줄기 세포를 대상체에게 투여하는 단계에 의해, 치료 동안 증가된다. 지방 조직 수확 및 치료는, 예를 들어 미국 특허 공개 제2016/0193251호에 기술되어 있다.

세포는 해당 세포가 유전자 작제물로 형질전환되고 임의의 선택적인 분화 및/또는 농축이 완료된 후에 대상체에게 투여된다. 이들 세포의 투여는 당업계에 공지되고, 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같은 임의의 적절한 수단에 의해 달성될 수 있다.

치료적 유효 투여량

본 개시의 맥락에서, 대상체, 특히 인간에게 투여되는 용량은, 합리적인 기간에 걸쳐, 전술한 바와 같은 임상 결과를 포함하는 유익하거나 원하는 결과를 대상체에서 달성하는 데 충분해야 한다는 의미에서 "치료적으로 유효"하다. 용량은 사용된 특이적 발현 벡터의 강도, 대상체의 병태, 및 대상체의 체중, 및 운동 장애의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 용량의 크기는 또한 발현 벡터의 투여에 수반될 수 있는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다.

발현 벡터를 함유하는 약학적 조성물의 단위 투여 형태는 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "단위 용량 형태"는 인간 및 동물 대상체를 위한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 소정량의 발현 벡터를 함유한다. 단위 용량 형태는 임의의 구현예에 요구되는 적절한 주입 또는 주사에 대한 임의의 적합한 부피의 액체로 투여될 수 있다. 용량은 단위 체중(예를 들어, 대상체 kg 당 용량), 종종 평방 미터 BSA로 표시되는 체표면적(BSA), 또는 대상체의 임의의 적절한 측정치에 의해 결정될 수 있다.

바이러스 발현 벡터를 사용하는 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 대상체의 체중 kg 당 1 x 10⁶ 내지 5 x 10¹⁴ 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 전달된다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터 게놈"(또는 "vg")은 바이러스 벡터의 유전자를 구성하는 핵산 서열 + 그 안에 암호화된 임의의 이식유전자(예를 들어, 포유류 s-KL)를 지칭한다.

일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이고, 용량(예를 들어, 1회 정맥내 주입) 당 1 x 10⁸ 내지 5 x 10¹² 형질도입 단위/kg(TU/kg)으로 투여된다.

일부 구현예에서, 발현 벡터는 적어도 약 1 x 10⁵ 바이러스 게놈/mL 내지 적어도 약 100 x 10¹⁶ 바이러스 게놈/mL의 역가로 대상체에게 투여된다. 바이러스 역가와 관련하여 사용되는 용어 "바이러스 게놈"(vg)(또한 "게놈 등가물", "게놈 카피"(gc) 또는 "게놈 입자"(gp)로도 알려짐)는 감염성 또는 기능성에 관계없이, 발현 벡터, 예를 들어 재조합AAV를 함유하는 비리온의 수를 지칭한다.

일부 구현예에서, s-KL 유전자 작제물을 전달하는 바이러스 벡터는, 유효량의 바이러스 게놈의 혈액 및 조직 수준을 달성하기 위한 적절한 부피로 1 x 10⁵ 바이러스 게놈 내지 5 x 10¹⁴ 바이러스 게놈으로 인간에게 투여되며, 이는 혈액, CSF, 또는 원하는 표적 조직 유사 근육에서 200~1300 pg/ml의 s-KL 단백질 또는 폴리펩티드를 달성하는 s-KL 게놈 용량이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 단일 바이알에서 전달 가능한 부피로 1 x 10⁶ vg 이상으로 투여된다. 일부 구현예에서, 1 x 10⁹ 바이러스 게놈의 초기 용량이 투여되고, 1 x 10¹¹ vg의 후속 용량이 투여된다.

일부 구현예에서, 유효량은 혈액, CSF, 또는 원하는 표적 조직에서 1~2,000 pg/ml의 폴리펩티드를 달성하는 용량이다. 일부 구현예에서, 유효량은 혈액, CSF, 또는 원하는 표적 조직에서 200~1300 pg/ml의 폴리펩티드를 달성하는 용량이다. 일부 구현예에서, 유효량은 성인 대상체의 순환계에서 또는 평균보다 높거나 낮은 200의 범위 내에서 평균 약 550 pg/ml를 달성하는 용량이다. 일부 구현예에서, 유효량은 아동 대상체의 순환계에서 또는 평균보다 높거나 낮은 300의 범위 내에서 평균 약 950 pg/ml를 달성하는 용량이다.

일부 구현예에서, 치료적 유효 용량은 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산 서열의 유전자 발현의 배수 증가를 야기한다. 일부 구현예에서, 유효 용량은 발현을 적어도 2배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 유효 용량은 유전자 발현의 적어도 3배, 또는 적어도 4배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 6배, 또는 적어도 8배, 또는 적어도 10배 증가를 야기한다.

이를 필요로 하는 대상체에게 조성물을 투여하는 횟수는 다수의 인자 중 임의의 하나 이상에 따라, 그리고 질환 또는 장애 및 이의 중증도, 및 제형에 대한 대상체의 반응을 포함하는 의료 전문가의 재량에 따라 달라질 수 있다. 발현 벡터의 치료적 유효량의 투여는 적어도 1회 수행된다. 다른 구현예에서, 투여는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 주어진 기간 내에 여러 번, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 수행된다. 각각의 투여의 용량 및/또는 투여 빈도는 대상체의 병태 및 생리학적 반응에 기초하여 필요 시 조정될 수 있다. 대상체의 병태가 개선되지 않는 경우, 의사의 재량에 따라, 즉 대상체의 질환 또는 병태의 증상을 개선하거나 달리 조절하거나 제한하기 위해, 조성물은 대상체의 생애의 지속 기간 전체를 포함하는 연장된 기간 동안 만성적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체의 상태가 개선되는 경우, 의사의 재량에 따라 조성물은 연속적으로 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 치료는 약 1시간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 하루에 약 1시간 내지 약 24시간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 단지 예로서, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 15일, 및 20일을 포함하여, 며칠 동안 하루 24시간 투여될 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 치료는 특정 기간 동안 일시적으로 감소되거나 일시적으로 정지될 수 있다(즉, "휴약 기간"). 휴약 기간의 길이는, 단지 예로서, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일, 및 365일을 포함하는, 2일 내지 1년과 같이 광범위하게 다양할 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 치료는 특정 기간 동안 일시적으로 감소될 수 있다. 감소 기간 동안 용량 감소는, 단지 예로서, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 및 95%를 포함하는, 10% 내지 100% 미만일 수 있다.

병용 요법

치료 방법은 운동 손상(예를 들어, 신경근 질환 및 장애와 연관됨)의 치료에 효과적인 것으로 알려진 다른 활성제의 공동 투여(즉, 동일한 치료 기간 내의 투여)를 포함할 수 있다. 대표적인 추가 활성제는 릴루졸 및 에다바론, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 IGF-1, TDP-43(TAR DNA 결합 단백질 43), EEAT2(흥분성 아미노산 수송체 2), GDNF(교세포 유래 신경영양 인자), 카디오트로핀-1, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 폴리스타틴 344(FSTN-344), 및 인자 H를 발현하는 재조합 단백질 또는 유전자 요법의 직접 주입과 병용으로 사용된다.

본 발명은 전술한 양태 및 구현예와 관련하여 설명되었으며, 전술한 설명 및 다음의 실시예는 본 발명의 범주를 예시하는 것으로 의도되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 범위 내의 다른 양태, 장점 및 변형은 본 발명이 속하는 당업자에게 명백할 것이다.

실시예

물질 및 방법

동물 수용. ALS의 (SOD1^G93A, SOD1로도 약칭됨) 마우스 모델에 따라 본 연구를 위한 마우스 모델을 생성하였다. 동물은 음식 및 물에 자유롭게 접근할 수 있었고, 표준 온도 조건(22±2℃) 및 12시간 명/암 사이클(300 lux/0 lux) 하에 유지하였다.

유전자이식 마우스. G93A 인간 SOD1 돌연변이(C57bl6-Tg[SOD1-G93A]1Gur)를 갖는 유전자이식 마우스를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)로부터 수득하였다. C57bl6 암컷을 교배시켜 반접합성 C57bl6 SOD1^G93A 수컷을 수득하였다. 꼬리 조직으로부터 추출된 DNA의 PCR로 자손을 식별되었다. 실험 절차는 Universitat Autonoma de Barcelona의 윤리 위원회(Ethics Committee)의 승인을 받았다. 다음의 마우스 실험군을 사용하였다: AAV8-hDes-s-KL(서열번호 7) 또는 AAV8-모의(서열번호 8)이 주사된 SOD1^G93A, AAV8-hDes-s-KL 또는 AAV8-Mock로 치료된 WT 한배 새끼(n=15~19/조건, 각 성별당 7~10마리). 실험군을 보상하기 위해, 체중 및 출생배경에 따라 동물을 할당하였다. 전반적인 건강 상태를 모니터링하기 위해 4주마다 동물을 칭량하였다.

바이러스 생산 및 주사. 마우스 s-KL cDNA를 인간 데스민 프로모터의 조절 하 AAV2 ITR 사이에서 클로닝하였다. 발현 플라스미드, AAV 유전자를 함유하는 Rep8Cap2 플라스미드, 및 헬퍼 바이러스로서 필요한 아데노바이러스 유전자를 함유하는 pXX6 플라스미드의 HEK293-AAV 세포 내로의 삼중 형질감염으로 AAV8 바이러스 스톡을 생산하였다. 플라스미드를 암호화하는 AAV2 ITR은 Piedra 등의 문헌[Hum. Gene Ther. Methods 26(1):35-42 (2015)]에 기술되어 있다. 플라스미드를 암호화하는 pXX6은 Xiao 등의 문헌[J. Virol. 72(3):2224-2232 (1998)]에 기술되어 있다. 플라스미드를 암호화하는 Rep8Cap2는 Gao 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99(18):11854-11859 (2002)]에 기술되어 있다.

AAV 입자를 이오딕사놀 구배로 정제하였다. 피코그린(Invitrogen) 정량화로 적정을 평가하고, 밀리리터당 바이러스 게놈(vg/ml)으로 계산하였다. 대조군 혈청형 일치 AAV 빈 벡터(모의)를 대조군으로서 사용하였다.

정맥내 투여의 경우, 총 부피 250 μl 현탁액 중 1.8x10¹⁴ 및 3x10¹⁴ vg/kg의 AAV8-s-KL 또는 AAV8-모의를 6주령 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다.

실시간 PCR. RNA 추출을 위해, 1000 μl의 Qiazol(Qiagen)을 첨가하고, 조직을 50 Hz의 Tyssue Lyser LT(Qiagen)로 6분 동안 2회 균질화하였다. 이어서, 샘플을 클로로포름으로 정제하고, 이소프로판올로 침전시키고, 70% 에탄올로 세척하고, 20 μl RNAse 유리수에 재현탁하였다. NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific)을 사용하여 RNA 농도를 측정하였다.

1 μg의 RNA를 10 μmol/l DTT, 200 U M-MuLV 역전사효소(New England BioLabs), 10 u RNase Out 리보뉴클레아제 억제제(Invitrogen), 1 μmol/l 올리고(dT), 및 1 μmol/l의 무작위 헥사머(BioLabs)를 사용하여 역전사하였다. 역전사 사이클 조건은 25℃에서 10분, 42℃에서 1시간, 및 72℃에서 10분이었다. s-KL의 mRNA 발현은 Taqman 프로브 5'- 6FAM -3'BHQ-1 s-KL-Pr: 5'- AGAAGAGTCCTCGCCGGATGCTGTA -3'(서열번호 11)을 사용하여, 특이적 프라이머 세트(s-KL-순방향: 5'- TCATAATGGAAACCTTAAAAGCAA -3'(서열번호 9) 및 s-KL-역방향: 5'- CACTGGGTTTTGTCAAAGGA -3'(서열번호 10))로 분석하였다. 마우스 36B4를 사용하여 s-KL(m36b4-순방향 (Rplp0): 5'-ATGGGTACAAGCGCGTCCTG-3'(서열번호 12); m36b4-역방향 (Rplp0): 5'-AGCCGCAAATGCAGATGGATC-3'(서열번호 13); 프로브 5-HEX -3'BHQ-1 m36B4-Pr (Rplp0): 5'-TGTGGAGACTGAGTACACCTTCCCA-3'(서열번호 14)의 발현 수준을 정규화하였다.

열 순환 조건은 95℃에서의 5분 중합효소 활성화, 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초, 및 65℃ 내지 95℃에서 5초의 45회 사이클(5초마다 0.5℃ 증가)로 구성되었다. PCR 연장 종료 시 형광 검출을 수행하고, Taqman 프로브의 형광을 모니터링하여 용융 곡선을 분석하였다.

척수 기관형(Organotypic) 배양. 출생 후 8일차 스프래그-다울리 랫트를 안락사시키고, 척수를 무균적으로 수확하고, 얼음-냉각 고 글루코오스 Gey's Balanced Salt 용액에 넣어 수막을 제거하였다. 초퍼(chopper)를 사용하여 척수를 350 mm 두께의 슬라이스로 가로 방향으로 절단하였다. L4-L5 요추 섹션을 인큐베이션 배지가 담긴 플레이트에서 Millicell-CM 다공성 막으로 옮겼다.

배양 절차 중에 축삭절단술을 수행한 후 다수의 뉴런이 자연적으로 사멸하고 신경교세포는 강한 반응성을 나타내므로, 배양물을 안정화하기 위해 1주일 동안 방치할 필요가 있다. 이어서, 10⁸ IU의 Ad5-CMV-s-KL 또는 Ad5-CMV-Null, 또는 대조군으로서 배지를 함유하는 1-마이크로리터 방울을 각각의 슬라이스의 상단에 첨가하였다. 대안적인 검정에서, 아데노-연관 바이러스, 즉 AAV9-CMV-s-KL, AAV9-CMV-Null 벡터, 또는 대조군으로서의 배지를 사용하였다. 이식유전자가 발현될 수 있도록 슬라이스를 1주일 동안 유지하였다. 시험관 내 14일차(DIV)에, Locke 용액 중 글루탐산(50 mM)을 30분 동안 플레이트에 첨가하여 급성 흥분독성을 유도한 다음, 이를 배지로 대체하였다. 19 DIV에서, 절편을 수확하고 조직학적 염색을 위해 파라포름알데히드 4%로 고정시켰다.

전기생리학적 검사. 8로부터 16주령까지 4주마다 운동 신경 전도 검사를 수행하였다. 좌골 노치에 배치된 바늘 전극을 통해 전달되는 단일 펄스(Grass S88 자극기)로 좌골 신경을 자극하였다. 발바닥 골간(PL) 근육으로부터, 마이크로바늘 전극으로 유발된 복합 근육 활동 전위(CMAP)를 비복근(GM) 및 기록하였다. CMAP의 진폭 및 대기 시간을 측정하기 위해, 근전도 신호를 증폭시키고 이를 디지털 오실로스코프(Tektronix 450S) 상에 디스플레이하였다.

운동 유발 전위를 평가하여 중심 운동 경로를 평가하였다. 감각운동 피질을 덮고 있는 두개골 위에 피하로 배치된 바늘 전극을 사용하여 최고 강도의 전기 자극을 전달하였으며, 마이크로바늘 전극을 사용하여 GM 근육으로부터의 MEP를 기록하였다.

운동 검사. 치료 및 미치료 SOD1^G93A 동물에서 로타로드 시험으로 운동 배위, 강도 및 균형을 평가하였다. 각각의 마우스를 14 rpm의 일정한 속도로 회전하는 로타로드에 3회 배치시키고, 이로부터, 추락까지의 최장 시간을 기록하였다. 180초의 최대 시간을 설정하였다. 검정은 8 내지 20주령에서 격주로 수행하였다. 각각의 마우스에 대한 임상 질환 발병은 유지 시간이 180초 미만일 경우 해당 첫번째 주로서 결정하였다.

조직학. 16주령에, PBS 중 4% 파라포름알데히드로 마우스를 경심 관류시키고, 요추 척수, 경골 신경 및 비복근 근육을 채취하였다.

NMJ 표지를 위해, GM 근육을 PBS 중 30% 수크로오스에서 동결 보존하고, 동결절편기로 60 μm 길이 방향 섹션을 연속 절단하고, 10개의 연속 시리즈로 수집하였다. 섹션을 PBS-Triton-FBS로 차단하고, 일차 항체 항-시냅토파이신(1:500, AB130436, Abcam), 항-신경미세섬유 200(NF200, 1:1000, AB5539, Millipore), 및 항-S100β(1:1, 22520, Immunostar)와 함께 4℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 섹션을 Alexa 594-접합 이차 항체(1:200; Life Science) 및 Alexa 488 접합 α-붕가로독소(1:200, B-13422, Life technologies)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 각각의 종판을 점유된 것(종판 위에 전-시냅스 터미널이 있는 경우) 또는 비어 있는 것(종판과 접촉하는 전-시냅스 표지 없음)으로 분류하여 신경이 분포된 종판의 비율은 결정하였다. 근육당 최소 4개의 필드에서 총 >100개의 종판을 분석하였다. 측부 스프라우팅(collateral sprouting)에 대해, 종판당 스프라우트의 수는 공초점 z 투영에 대한 전-시냅스 전 터미널 또는 전-시냅스 노드로부터의 신경섬유 양성 돌출부로서 계수되었다. 분석에 대해, 총 스프라우트 수 및 측부 스프라우트에 의해 신경이 분포된 점유된 종판의 비율 둘 모두를 고려하였다.

데이터 분석. 모든 실험은 각각의 마우스 군의 상이한 치료에 대해 맹검된 연구원에 의해 수행되었으며, 체중 및 출생배경을 고려하여 군에 대한 동물의 무작위 배정이 수행되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 전기생리학 및 운동 시험 결과는 Tukey 사후 검정을 이용한 1-방향 또는 반복 측정 ANOVA를 사용하여 통계적으로 분석하였다. MEP 전기생리학적 결과의 경우, Student t 검정을 적용하였다. 임상 질환 발병의 경우, 로그 순위(Mantel-Cox) 검정을 적용하였다. 조직학 및 분자 생물학 데이터는 Tukey 또는 Holm-Sodak 사후 검정을 이용한 t-Student, 1-방향 또는 2-방향 ANOVA를 사용하여 분석하였다.

결과

1 - 클로토는 SOD1 ^G93 마우스 모델에서 하향조절됨

마우스 모델의 여러 조직의 mRNA 추출을 수행한 후, 분비된 클로토(s-KL)의 mRNA 발현은 SOD1^G93A의 운동 피질, 척수, 비복근, 및 비장근에서 감소한다는 것이 관찰되었으며, 이는 분석된 근육에서 유의미하다. 16주차, 즉 질환의 말기에서의 야생형(WT) 대비 s-KL의 발현 비율(군당 n = 7 SOD1, 3~10 WT 마우스, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05). 도 1에 해당 데이터를 나타내며, 여기에서 s-KL mRNA 발현(배수 변화)은 여러 연구된 조직에서의 평균 ± SEM으로서 제시된다.

2 - 시험관 내 검정. 클로토는 기관형 배양물에서, 흥분독성으로부터 척추 운동신경을 보호함

랫트 척수 기관형 슬라이스를 s-KL(서열번호 15) 또는 null 서열(서열번호 16)에 대한 AAV9 코딩으로 치료하고 글루탐산염에 노출시켰다. 데이터는 도 2a 형광 현미경 이미지 및 도 2b의 막대 도표(각각의 세트의 두번째 막대는 글루탐산염-유도 흥분독성(GLUT +)에 해당함)로 제시된다. s-KL의 과발현은 치료되지 않은 대조군 또는 AAV9-Null과 비교 시, 글루탐산염-유도 흥분독성으로부터 척수의 복측각(VH)에 위치된 신경을 보존한다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다(군 당 n = 6, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05).

표 C 및 표 D는 각각, 서열번호 15 및 16 각각의 특정 단편 서열을 열거한다.

sKL 또는 null 서열을 코딩하는 아데노바이러스 벡터로 치료하고 세포독성 효과를 유도하는 글루탐산염(GLUT+)에 노출시킨 랫트 척수 기관형 절편을 사용하여 동등한 분석을 수행했으며, 이는 동등한 결과를 나타냈다. 이러한 대안적인 검정의 데이터는 도시되지는 않았지만, 높은 사망률을 나타낸 치료되지 않은 대조군(GLUT -) 또는 Ad-Null과 비교 시, s-KL의 과발현이 글루탐산염-유도 흥분독성으로부터 척수의 복측각(VH)에 위치된 신경 생존율을 보존하는 것으로 관찰되었다.

3 - 유전자 요법 전략

SOD1 암컷 마우스를 6주령에 1.8 x 10¹⁴ vg/kg 또는 3 x 10¹⁴ vg/kg의 AAV-hDesmin-s-KL-WPRE 벡터로 정맥내 치료하였다(n=15). WT(n = 10) 및 SOD1 암컷 마우스(n = 15)를 대조군으로서 AAV-hDesmin-Null-WPRE로 동일한 용량으로 치료하였다. 인간 데스민 프로모터를 사용하여 가로무늬 근육으로의 발현을 제한하였다. WPRE 서열을 사용하여 mRNA를 안정화시켰다. 로타로드 및 그립 강도 시험으로 매주, 그리고 신경 전도 시험으로 8, 12 및 16주차에 동물을 추적관찰하였다. 질환의 말기에서 조직을 수확하고 조직학적 및 발현 분석을 위해 처리하였다.

도 3은 유전자 요법 전략 구현예의 개략도를 도시한다.

4 - 개선된 복합 근육 활동 전위(CMAP)

이전 섹션에 따른 유전자 요법 후, 좌골 노치에 배치되고 20 μs 지속 시간의 단일 펄스로 좌골 신경을 자극하는 2개의 바늘 전극으로 운동 신경 전도 검정을 수행하였다. 복합 근육 활동 전위(CMAP)는 8, 12, 및 16주령에서 마이크로바늘 전극을 사용하여 전경골근(TA) 및 발바닥 골간근(PL)으로부터 기록하였다.

치료는 전경골근 및 발바닥 골간근의 CMAP 진폭의 유의미한 보존을 촉진하였으며, 이는 s-KL 과발현이 SOD1^G93A 암컷 마우스의 운동 기능 개선을 촉진함을 나타낸다.

이들 데이터는 운동 신경과 근육 세포가 양호하게 통신하며, 이에 따라 운동 기능이 보존됨을 나타낸다.

CMAP 값(mV 단위의 진폭)은, 야생형(WT), SOD1 모의, SOD1 s-KL 저용량, SOD1 s-KL 고용량에 대해 다음과 같이 제시된다: 도 4a, 발바닥 근육(PL), 그리고 도 4b, 전경골근(TA). (***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05 SOD1 모의 대 SOD1 고용량, 평균 ± SEM).

5 - 증가된 운동 유발 전위 진폭(MEP)

중심 피질척수 하행 경로를 평가하기 위해, TA 근육으로부터의 운동 유발 전위(MEP)를 기록하였다. 운동 피질을 0.1 ms 지속시간의 펄스로 전기적으로 자극하고, 두개골 위에 피하에 배치된 바늘 전극으로 초-최대 강도로 전달하였다. 유전자 요법은 MEP의 진폭을 증가시켰으며, 이는 상부 및 하부 운동신경 사이의 강화된 연결을 나타낸다(***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, SOD1 모의 대비, 평균 ± SEM). 도 5는 해당 데이터를 도시하며, 여기에서 해당 세트의 첫번째 막대는 SOD1 모의 검정에 대한 것이고, 두번째 막대는 SOD1 s-KL 저용량에 대한 것이며, 세번째 막대는 SOD1 s-KL 고용량에 대한 것이다.

6 - 클로토는 SOD1 ^G93A 마우스의 운동 기능을 향상시킴

동물의 운동 조정 및 균형을 평가하기 위해 로타로드 시험을 수행하였다. 마우스를 14 rpm의 일정한 속도로 회전 로드 위에 올려놓았다; 180초를 컷오프 시간으로 선택하였다. 앞다리 및 뒷다리 그립 강도를 시험하기 위해, 마우스를 금속 그리드 위에 배치하고, 4개의 발이 꼬리에 의해 당겨지는 동안 막대를 잡도록 하였다. 시험 동안, 기기는 이를 놓기 전의 최고 당김력을 기록하였다

근육에 의한 s-KL의 과발현 및 분비는 미치료 대조군과 비교 시 로타로드에 대한 SOD1^G93A 마우스 운동 성능을 개선하였다. 그립 강도 검정으로 평가 시, 고용량 치료 마우스의 강도는 또한 종료 단계에서 개선되었다(***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, SOD1 모의 대비 SOD1 고용량, 평균 ± SEM). 도 6a~6b는 해당 데이터를 도시한다(로타로드에 대해 시간(초)으로서 도 6a, 및 그립 강도에 대해 힘(g)으로서 도 6b).

7 - 지연된 임상 질환 발병

이전 섹션에서의 각각의 마우스에 대한 임상 질환 발병은 해당 동물이 로타로드 상에서 180초 동안 유지될 수 없는 첫번째 주로서 결정하였다. 치료는 질환 발병을 유의미하게 지연시킬 수 있었으며, 16주차에, 모의 치료 마우스(AAV9-null 벡터, 서열번호 16으로 치료됨)와 비교 시, 고용량 치료 마우스(AAV9-s-KL 벡터, 서열번호 15로 치료됨)의 35%만이 운동 결함을 나타냈다. 도 7은 해당 데이터를 도시하며, 이는 각각의 마우스 유형의 발병 확률을 나타낸다.

8 - s-KL은 신경근 접합부(NMJ) 및 근육량을 보존함

비복근 길이방향 섹션을 신경미세섬유 200(NF200), 항-시냅토피신 및 알파-붕가로독소(BTX)에 대해 표지하였다. 종판은 점유된 것(전-시냅스 터미널이 종판 위에 놓이거나 종판과 접촉하는 경우) 또는 빈 것(종판과 접촉한 것으로 표지된 전-시냅스 없음)으로 분류되었다. 골격근에 의한 s-KL의 분비는 전-시냅스 터미널에 의해 점유된 NMJ의 비율을 유의하게 증가시켰으며, 보다 높은 근육량으로 입증된 바와 같이 근육 소모를 완화시켰다(***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, SOD1 모의 대 SOD1 고용량, 데이터는 평균 ± SEM으로 제시됨). 도 8a~도 8c는 해당 데이터를 도시한다. 형광 현미경 이미지인 도 8a는 NF200에 대해 표지된 섹션(짙은 회색) 및 BTX에 대해 표지된 섹션(밝은 회색)을 나타낸다. 도 8b는 WT 마우스 그리고 모의군(SOD1 모의) 및 치료군(SOD1s-KL)에서의 점유된 종판의 백분율을 나타낸다. 도 8c는 WT 마우스, 모의군(SOD1 모의) 및 치료군(SOD1s-KL)에서의 체중당 근육량(mg/g)을 나타낸다.

9 - 근육에 의한 s-KL의 분비는 척수 운동 신경을 보호함

16주령에, 4% 파라포름알데히드로 마우스를 경심 관류시키고, 요추 척수를 채취하였다. 척수 MN 평가를 위해, 척수를 4시간 동안 고정시키고, PBS 중 30% 수크로오스에 동결 보존하고, 동결절편기를 사용하여 20 μm 횡단 섹션을 연속 절단하였다. 각각의 동물의 L4 내지 L6을 포함하는 요추 척수 영역으로부터의 모든 2개의 슬라이드 중 1개를 크레실 바이올렛으로 염색하였다. 운동신경은 엄격한 크기 및 형태학적 기준을 따른, 복측각에서의 이들의 국소화로 식별되었다.

골격근은 SOD1 마우스 모델에서 보다 많은 운동신경 사멸을 겪는 영역인 요추 척수에서 s-KL 보호 운동신경을 분비하였다(n = 8/군, 2-방향 ANOVA 검정, ***p < 0.001; 데이터는 평균 ± SEM으로 제시됨). 도 9a~도 9b는 해당 데이터를 도시한다. 백색 광학 현미경 이미지인 도 9a는 신경 및 세포 핵에서 Nissl 물질을 염색하여 신경 구조를 드러내는, 크레실 바이올렛에 대해 표지된 섹션(짙은 회색)을 나타낸다. 도 9b는 WT 마우스(WT 모의), 및 모의군(SOD1 모의) 및 치료군(SOD1 sKL) 마우스에서 신경 구조를 정량화한다.

10 - 클로토는 ALS의 신경염증성 손상으로부터 척수를 보호함

근육에 의한 s-KL의 전달은 Iba1 형광으로 평가 시 치료된 SOD1^G93A 마우스의 요추 척수에서의 소교세포 반응성을 감소시켰다. GFAP 및 비멘틴 표지로 성상세포증을 분석하고 WT 수준에 가깝게 보정하였다(n = 8/군, 2-방향 ANOVA 검정, **p < 0.01, *p < 0.05). 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 도 10a~도 10d는 해당 데이터를 도시한다. 형광 현미경 이미지인 도 10a는, lba1로 표지된 섹션(상단 행), GFAP로 표지된 섹션(중간 행), 및 비멘틴으로 표지된 섹션(하단 행)을 나타낸다. 도 10b~10d는 WT 마우스(WT 모의), 및 모의군(SOD1 모의) 및 치료군(SOD1 sKL)에 대한, 도 10a의 염색의 정량화를 나타내며, 이는 s-KL 치료 후 Iba1, GFAP 및 비멘틴에 대한 염색 감소를 나타낸다. 도 10b는 lba1-표지된 이미지의 통합 밀도(상대적 단위)를 나타낸다. 도 10c는 GFAP-표지된 이미지의 통합 밀도(상대적 단위)를 나타낸다. 도 10d는 비멘틴-표지된 이미지의 통합 밀도(상대적 단위)를 나타낸다.

11 - AAVmyo 벡터를 이용한 유전자 요법 전략

AAVmyo는 마우스 및 비인간 영장류에서 우수한 형질도입 효율을 갖는 가로무늬 근육에 대한 향성을 갖는 AAV 혈청형(Tabebordbar 등의 문헌[Cell 184(19):4919-4938 (2021)])이다. 투여되는 AAV 벡터의 용량을 감소시키고 가능한 부작용을 피하기 위해, AAVmyo 혈청형을 s-KL 유전자 요법에 대해 검정하였다. 도 11은 유전자 요법 전략의 일 구현예의 개략도를 도시한다.

6주령 SOD1 마우스에게 2Х10¹² vg/kg(n=6; AAVmyo-s-KL 저용량) 또는 8Х10¹² vg/kg(n=8; AAVmyo-s-KL 고용량)의 AAVmyo-hDesmin-sKL-WPRE 발현 벡터를 정맥내 투여하였다. AAVmyo-s-KL 고용량 및 AAVmyo-sKL-저용량은 도 3의 AAV8 발현 벡터를 사용한 유전자 발현 실험에 사용된 용량 대비, 각각 150-배 및 37.5-배 낮았다. WT(n = 14) 및 SOD1 암컷 마우스(n = 18)를 대조군으로서 AAVmyo-hDesmin-Null-WPRE로 동일한 용량으로 치료하였다. 이전 연구에서와 같이 동물을 추적 관찰하고 조직 수확을 위해 16주령에 안락사시켰다.

12 - AAVmyo-Des-sKL은 복합 근육 활동 전위(CMAP)를 개선함

고용량의 AAVmyo-Des-sKL를 사용한 치료는 대조군 SOD1^G93A 마우스와 비교 시, 치료된 SOD1^G93A 마우스에서 각각 12주차 및 8주차부터 발바닥(PL) 및 GM 복합 근육 활동 전위(CMAP) 진폭의 유의한 보존을 나타냈다. 이러한 신규 혈청형을 사용함으로써, AAV8-Des-sKL의 것과 유사한 수준의 신경근 연결성 보존이 달성되는 동시에, 투여된 바이러스 역가는 37.5배 감소하였다(2-방향 ANOVA 검정, *p < 0.05; * SOD1 모의 대 SOD1 sKL 고용량; 데이터는 평균 ± SEM으로 제시됨).

도 11a~도 11b는 해당 데이터를 도시한다. CMAP 값(mV 단위의 진폭)은, 야생형 WT 모의, SOD1 모의, SOD1 Myo-AAV-s-KL 저용량, SOD1 Myo-AAV-s-KL 고용량에 대해 다음과 같이 제시된다: 도 11a, 발바닥 근육(PL), 그리고 도 11b, 전경골근(TA). (*p < 0.05 SOD1 모의 대 SOD1 Myo-AAV-s-KL, 평균 ± SEM.)

13 - AAVmyo-Des-sKL은 운동 유발 전위 진폭(MEP)을 증가시킴

운동 유발 전위의 진폭은 SOD1-모의 마우스 대비, SOD1^G93A 마우스에서 더 높았으며, 이 또한 중심 운동 경로의 보다 높은 보존을 나타낸다. AAV8-DessKL 치료와 비교 시, AAVmyo-Des-sKL 치료는 MEP 진폭을 보다 큰 정도로 보존하였다(2-방향 ANOVA 검정, **p < 0.01, *p < 0.05; * SOD1 모의 대 SOD1 sKL 고용량; 데이터는 평균 ± SEM으로 제시됨). 도 12는 해당 데이터를 도시하며, 여기에서 해당 세트의 첫번째 막대는 SOD1 모의 검정에 대한 것이고, 두번째 막대는 SOD1 AAVmyo-s-KL 저용량에 대한 것이며, 세번째 막대는 SOD1 AAVmyo-s-KL 고용량에 대한 것이다.

14 - 클로토는 SOD1 ^G93A 마우스의 운동 기능을 향상시킴

AAVmyo-Des-sKL로 치료한 SOD1 마우스에서는 운동 감소의 보다 느린 진행이 관찰되었다. 동물의 힘도 보존되었으며, 특히 고용량 치료군에서, SOD1 마우스가 AAV8-DessKL을 주사한 동물에 비해 보다 양호한 성능을 나타냈다(2-방향 ANOVA 검정, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05; * SOD1 모의 대 SOD1 sKL 고용량, # SOD1 모의 대 WT 모의; 평균 ± SEM). 도 13a~13b는 해당 데이터를 도시한다(로타로드에 대해 시간(초)로서 도 13a, 및 그립 강도에 대해 힘(g)으로서 도 13b).

15 - 지연된 임상 질환 발병

임상 질환 발병은 AAVmyo-Des-sKL-치료 SOD1 마우스의 두 군 모두에서 유의하게 지연되었으며, 이는 AAV8-Des-sKL의 고용량으로 치료된 마우스와 유사하였다(로그 순위 Mantel-Cox 시험). 도 14는 해당 데이터를 도시하며, 이는 각각의 마우스 유형의 발병 확률을 나타낸다.

본원에 참조로서 통합된 다른 간행물

Zeldich 등의 문헌["Klotho Is Neuroprotective in the Superoxide Dismutase (SOD1G93A) Mouse Model of ALS" J. Mol. Neurosci. 69(2):264-285 (2019)]

Minamizaki 등의 문헌["Soluble Klotho causes hypomineralization in Klotho-deficient mice" J. Endocrinol. 237(3):285-300 (2018)]

WO2017085317(Universitat Autonoma de Barcelona 등)

모든 특허 간행물 및 비특허 공개 간행물은 본 개시가 속하는 기술 분야의 숙련된 기술 수준을 나타낸다. 이들 간행물(인용된 이의 임의의 특정 부분을 포함함)은 각각의 개별 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로서 통합되는 것으로 명시하는 것과 동일한 정도로, 본원에 참조로서 통합된다.

본원의 발명은 특정 구현예를 참조하여 설명되었지만, 이들 구현예는 단지 본 발명의 원리 및 응용을 예시하는 것임을 이해해야 한다. 따라서, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서, 예시적인 구현예에 대해 다수의 변형이 이루어질 수 있으며 다른 배열이 고려될 수 있음을 이해해야 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (56)

1. 유전자 작제물로서, 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하되, 상기 제1 프로모터는 근육 세포 특이적 프로모터인, 유전자 작제물.
2. 제1항에 있어서, 핵산 서열에 의해 암호화된 포유류 s-KL은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 s-KL인, 유전자 작제물.
3. 제2항에 있어서, 핵산 서열은 서열번호 3인, 유전자 작제물.
4. 제1항에 있어서, 핵산 서열에 의해 암호화된 포유류 s-KL은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 쥣과 s-KL인, 유전자 작제물.
5. 제4항에 있어서, 핵산 서열은 서열번호 4인, 유전자 작제물.
6. 제1항에 있어서, 기능성 변이체는 서열번호 1과 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 유전자 작제물.
7. 제1항에 있어서, 기능성 변이체는 서열번호 1과 적어도 88%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 유전자 작제물.
8. 제1항에 있어서, 기능성 변이체는 서열번호 1과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 유전자 작제물.
9. 제1항에 있어서, 기능성 변이체는 서열번호 1과 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 유전자 작제물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프로모터는 포유류 데스민 프로모터인, 유전자 작제물.
11. 제10항에 있어서, 포유류 데스민 프로모터는 인간 데스민 프로모터인, 유전자 작제물.
12. 제11항에 있어서, 인간 데스민 프로모터는 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는, 유전자 작제물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하되; 제1 프로모터와 상기 제2 프로모터는 상이한, 유전자 작제물.
14. 제13항에 있어서, 제2 프로모터는 근육 세포 특이적 프로모터이거나; 제2 프로모터는 신경 세포 특이적 프로모터인, 유전자 작제물.
15. 제13항에 있어서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터인, 유전자 작제물.
16. 제15항에 있어서, 구성적 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터인, 유전자 작제물.
17. 제13항에 있어서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터인, 유전자 작제물.
18. 제17항에 있어서, 유도성 프로모터는 아연-구동 메탈로티오네인 프로모터인, 유전자 작제물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 유전자 작제물 및 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 개시 서열을 포함하는 플라스미드.
20. 발현 벡터로서:
    (b) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 유전자 작제물 또는 제19항의 플라스미드(여기에서, 상기 발현 벡터는 근육 세포 향성을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있음); 또는
    (b) 포유류 s-KL 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 근육 세포, 신경 세포, 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)에서 기능하는 제1 프로모터를 포함하는 핵산 작제물(여기에서, 상기 발현 벡터는 근육 세포 향성을 가짐)을 포함하는, 발현 벡터.
21. 제20항에 있어서, 바이러스 발현 벡터인, 발현 벡터.
22. 제21항에 있어서, 근육 세포 향성을 갖는 혈청형의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이거나; 신경 세포 향성을 갖는 혈청형의 AAV 벡터인, 발현 벡터.
23. 제22항에 있어서, AAV 벡터는 근육 세포 향성을 갖는 혈청형인, 발현 벡터.
24. 제23항에 있어서, AAV 벡터는 AAV1, AAV8, AAV9, 또는 AAVmyo 벡터이거나; AAV 벡터는 서열번호 17~29 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 AAV 캡시드 폴리펩티드를 포함하는, 발현 벡터.
25. 제24항에 있어서, AAV 벡터는 AAVmyo 벡터인, 발현 벡터.
26. 제24항에 있어서, AAV 벡터는 서열번호 17~29 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 AAV 캡시드 폴리펩티드를 포함하는, 발현 벡터.
27. 제26항에 있어서, AAV 벡터는 서열번호 17 또는 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 AAV 캡시드 폴리펩티드를 포함하는, 발현 벡터.
28. 제24항에 있어서, AAV 벡터는 AAV9 벡터인, 발현 벡터.
29. 제22항에 있어서, AAV 벡터는 신경 세포 향성을 갖는 혈청형인, 발현 벡터.
30. 제29항에 있어서, AAV 벡터는 AAV1 벡터인, 발현 벡터.
31. 제29항에 있어서, AAV 벡터는 AAV8 벡터인, 발현 벡터.
32. 제29항에 있어서, AAV 벡터는 AAV9 벡터인, 발현 벡터.
33. 제20항에 있어서, 지질계 벡터인, 발현 벡터.
34. 제33항에 있어서, 지질 나노입자(LNP) 또는 리포솜인, 발현 벡터.
35. 제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-코딩 조절 요소를 추가로 포함하는, 발현 벡터.
36. 제35항에 있어서, 조절 요소는 폴리 A 서열, 단백질 번역 개시 부위 컨센서스 핵산 서열, 전사 후 조절 요소 핵산 서열, 5' 및 3' 역위 말단 반복 핵산 서열, 또는 인트론 중 임의의 하나 이상인, 발현 벡터.
37. 제36항에 있어서, 폴리 A 서열은 SV40 폴리 A 서열인, 발현 벡터.
38. 제37항에 있어서, 전사 후 조절 요소 핵산 서열은 B형 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(HPRE) 또는 우드척 간염 전사 후 조절 요소(WPRE)인, 발현 벡터.
39. 제19항의 플라스미드 또는 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항의 발현 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
40. 단리된 세포로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 유전자 작제물 또는 제19항의 플라스미드를 포함하되, 상기 단리된 세포는 근육 세포 또는 신경 세포로 분화될 수 있는 인간 근육 세포, 인간 신경 세포, 또는 인간 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)인, 단리된 세포.
41. 제40항에 있어서, 근육 세포인, 단리된 세포.
42. 제41항에 있어서, 골격근 세포인, 단리된 세포.
43. 제41항에 있어서, 가로무늬 근육 세포인, 단리된 세포.
44. 제40항에 있어서, 신경 세포인, 단리된 세포.
45. 제44항에 있어서, 신경 세포는 운동 신경인, 단리된 세포.
46. 제40항에 있어서, 근육 세포 또는 신경 세포로 분화될 수 있는 iPSC인, 단리된 세포.
47. 세포 요법으로서, 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항의 단리된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포 요법.
48. 운동 장애를 치료하는 방법으로서, 제39항의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 제48항에 있어서, 대상체는 운동 장애의 증상을 특징으로 하거나 운동 장애의 증상을 나타내는 질환 또는 장애를 앓고 있는, 방법.
50. 제48항에 있어서, 질환 또는 장애는 신경근 질환 또는 장애인, 방법.
51. 제50항에 있어서, 신경근 질환은 근위축성 측색 경화증(ALS)인, 방법.
52. 제51항에 있어서, ALS는 산발성 ALS(sALS)인, 방법.
53. 제51항에 있어서, ALS는 가족성 ALS(fALS)인, 방법.
54. 제35항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체는 운동 장애를 나타내지 않지만 운동 장애에 걸릴 성향이 있는, 방법.
55. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 비경구 투여되는, 방법.
56. 제42항에 있어서, 약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 두개내, 또는 경막내 투여되는, 방법.