KR20250033434A - Mlkl의 다형성을 이용한 비소세포폐암 예후 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MLKL유전자의 단일염기다형성(Single Nucloetide Polymorphism, SNP)을 이용한 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 마커, 이를 이용한 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 조성물, 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 키트, 마이크로 어레이, 진단방법 및 예후 예측 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 기술은 비소세포폐암(NSCLC)이 발병한 환자에 대하여 빠르고 정확한 진단을 할 수 있으며, 또한 예후예측, 구체적으로는 근치적 절제술 이후 종양 재발 및 보조치료요법 효과 여부의 신속, 간편, 및 정확한 확인을 통해, 비소세포폐암(NSCLC) 환자의 치료효과를 높일 수 있다.

Description

MLKL의 다형성을 이용한 비소세포폐암 예후 진단 방법{Diagnostic methods for prognosis of non-small-cell lung cancer using MLKL SNP}

본 발명은, MLKL의 다형성을 이용한 비소세포폐암의 진단 및 예후 예측 방법에 관한 것이다.

폐암은 전 세계적으로 암으로 인한 사망 원인의 30%를 차지할 정도로 암으로 인한 사망의 주요 원인 중의 하나이다. 전체 폐암의 75% 이상이 비소세포폐암 (non-smallcell lung cancer, NSCLC)이며, 평균 5년 생존율이 15%에 해당한다.

이러한 비소세포폐암은 폐 조직의 비소세포에서 발생하여, 주로 세포의 크기와 형태에서 다양한 변이를 나타내며, 대표적으로는 세포암종(Adenocarcinoma), 근제세포암종(Squamous Cell Carcinoma), 대세포암종(Large Cell Carcinoma) 등의 형태를 나타낸다. 상기 비소세포폐암의 치료방법으로는 방사선 치료, 항암제 치료, 표적 요법 등이 있으며, 기존 항암제 외에도 크리자노티닙(Crizotinib), 제프리티닙(Gefitinib), 에르로티닙(Erlotinib)과 같은 표적 요법 약물을 사용하기도 한다.

상기 기술한 바와 같이, 비소세포폐암은 높은 발병율을 가지며, 다양한 치료법이 존재함에 따라, 환자별로 그 예후를 효과적으로 예측할 수 있는 방법에 대한 수요가 증가하고 있다. 이에 따라, 최근 비소세포폐암환자들의 특정 유전자 변이를 치료방법 및 예후예측에 이용하는 방법에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 상기 유전자 변이를 이용한 방법은 종양의 악화 정도나 약물 치료 등에 대한 반응을 예측하는데 효과적으로 사용될 수 있으며, 비교적 간편하며 정확도가 높다고 평가된다.

상기 비소세포폐암의 치료를 위해 근치적 폐 절제술이 주로 이용되고 있으나, 비소세포폐암 환자의 약 30 내지 75%는 근치적 수술 후 국소 또는 전이성 재발을 겪으며, 이러한 재발 질환으로 사망한다. 백금 기반의 보조 화학 요법은 2000년대 초반부터 표준 보조 용법으로 사용되어 왔으나, 확실한 생존율 개선 효과가 있다고 보기 어려우며, 최근 표적 치료법과 면역 치료법의 발전으로, 초기 비소세포폐암 환자의 생존율을 개선하고 있으나, 그러한 효과적인 보조 요법을 개발하는 것 이외에, 종양 재발을 예측하는 분자 바이오마커를 발굴하여 초기 단계 비소세포폐암 환자의 생존율을 개선하는 것에 대한 필요성이 증대되고 있다. 또한, 종양-결절-전이(TNM) 병기는 현재 비소세포폐암 환자의 근치적 절제술 이후 종양 재발 및 보조치료요법 효과여부를 예측하는 지표로 통상적으로 사용되고 있으나, 상기 병기를 이용한 예후 예측 방법은 같은 병기라도 환자마다 재발 및 사망 위험이 크게 다르기 때문에 근치적 절제술 이후 비소세포폐암의 예후 예측에 대한 정확도가 높지 않다.

유전자 다형성(genetic polymorphism)은 한 종의 개체 집단에서 빈도가 1% 이상인 유전자형의 변이를 의미하며, 유전자 염기서열, 위치, 또는 수의 차이 등 다양한 형태로 나타날 수 있다. 상기 유전자 다형성은 유전질환 및 병리학, 약물대사 및 반응 예측, 암 예후 예측, 및 개인 맞춤형 치료방법 선정 등에 사용될 수 있으며, 그 응용 가능성이 방대하여 여러 분야에서 개발중에 있다.

단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)은 인간 유전자 변이의 가장 일반적인 형태로, 유전체(genome)상에서 A, T, G, C로 구성되는 염기서열 중 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 말한다. SNP는 인간의 유전체에서 발생하는 변이의 약 90%를 차지하고 있으며, 인간 게놈에는 약 100만 개의 SNP가 존재할 수 있다. 비슷한 형질 또는 같은 가계도를 가지고 있는 사람들은 동일하거나 비슷한 SNP 패턴을 가짐에 따라, 임상에서 개체의 질병에 대한 감수성(susceptibility)을 예측하는 지표로 사용될 수 있고, 약물에 대한 효과 및 부작용을 예측하는 지표로 사용될 수도 있다. 상기 SNP는 주로 질병의 발병과 관련이 있어, 특정 SNP를 가진 사람은 특정 질병에 걸릴 위험이 더 높다. 이에 따라 SNP를 이용하여 질병의 발병 원인을 이해하고 새로운 치료법을 개발할 수 있으며, 특정 질병을 진단하고, 예후를 예측하는데 사용할 수 있다.

MLKL(Mixed Lineage Kinase Domain Like Pseudokinase) 유전자는 Necropsis key regulator중 하나로, 단백질 코딩 유전자이며, 성숙 발병 당뇨병 및 염증성 장 질환 등의 질병과 연관성이 밝혀진 바 있다. 종래 연구들은 MLKL의 necropsis 매개능을 주요 대상으로 하고 있으나, MLKL 유전자의 다형성을 비소세포폐암의 진단 및 예후 예측에 이용하는 방법에 대해서는 알려진 바 없다.

이에 따라 본 발명자들은 MLKL 유전자 시작 지점으로부터 상위 107bp 지점에 존재하는 rs877375 위치의 promoter 활성 및 luciferase활성을 분석하였으며, 이에 따라 상기 rs877375부위가 promoter 활성을 가지며, C유전자형에 비해 G유전자형의 promoter 활성이 더 높음을 확인하였다. 또한, 폐암환자조직의 MLKL mRNA 발현 분석결과, rs877375 G 유전자형에서 폐암 발현 확률이 낮고, C 유전자형을 가질수록 폐암 발현 확률이 높음을 확인하였고, 이에 따라 MLKL rs877375G>C 다형성은 비소세포폐암의 진단 및 예후 예측에 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하였고, 추가적으로 비소세포폐암의 subtype인 AC(폐선암)에서 더 정확한 바이오 마커로 사용 될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 상기 비소세포폐암을 진단 및 예후를 예측할 수 있는 MLKL 유전자의 다형성 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 마커를 포함하는 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 마커를 포함하는 비소세포폐암 환자의 진단 및 예후 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 마커를 포함하는 비소세포폐암 환자의 진단 및 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, MLKL 유전자의 다형성을 이용한 비소세포폐암 진단 및 예후 예측 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 특정 위치의 뉴클레오티드를 포함하는 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이를 포함하는 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 이용하는 비소세포폐암 진단 및 예후 예측방법을 제공한다.

본 발명은 MLKL 유전자의 rs877375 위치에서 C 유전자형을 가질수록 비소세포폐암 mRNA 발현 확률이 높음을 확인하였고, 이에 따라 MLKL rs877375G>C 다형성을 상기 비소세포폐암의 진단 및 예후 예측용 바이오마커로 발굴하였다.

이에 따라 본 발명에 따른 상기 MLKL rs877975G>C를 이용한 폐암 진단 및 예후 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 발병여부를 진단하고, 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 등으로 활용할 수 있음에 따라, 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있으며, 추가적인 SNP 표식자를 발굴할 수 있는 기술로 그 적용범위를 확대할 수 있다.

도 1은 전체 환자군(A 및 D), 폐선암 환자군(B 및 E),및 편평세포암 환자군(C 및 F)의 MLKL rs877375 G>C 유전자형에 따른 전체 생존율 및 무병 생존율 곡선을 나타낸 도이다(AC: 선암종, SCC: 편평세포암종, 다변량 콕스 비례 위험 모델에 의한 P값).
도 2는 본 발명의 MLKL rs877375 G>C의 이중 루시퍼라제 리포터 분석 결과를 나타낸 것이며, rs877375 G>C가 MLKL 프로모터 활성에 미치는 영향을 확인한 도이다. rs877375 G 및 C 대립유전자의 루시퍼라제 활성은 pRL-SV40 레닐라 루시퍼라제 활성으로 정규화 되었으며, 데이터는 평균 ±SEM(n=8)로 표시되었다(NC: 음성대조군).
도 3의 좌측 도표는 rs877375 G>C 유전자형에 따른 MLKL의 상대적 mRNA 발현 수준을 나타낸 도이며(박스 안 가로선: 중앙값), 우측 도표는 상기 rs877375 G>C 유전자형에 따른 전체 생존율의 카플란-마이어 플롯을 나타낸 도이다(AC: 선암종, SCC: 편평세포암종). GG, GC, 및 CC는 각각 유전자형(Genotype)을 말한다.

이하, 본 발명의 실시예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

본 발명에서 어떤 구성요소를 “포함”한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 서열번호 1의 특정 위치의 뉴클레오티드를 포함하는 비소세포폐암 예후 예측용 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 221번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 221번째 염기를 포함하는 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 마커를 제공한다.

본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 221번째 염기의 SNP를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 키트는 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 마커인, MLKL 유전자의 프로모터 내 MLKL rs877375 G>C 다형성 부위(SNP)를 확인함으로써 비소세포폐암의 예후를 예측하는데 사용될 수 있다. 상기 키트는 MLKL rs877375 G>C의 SNP를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 또는 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.

또한 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 비소세포폐암 예후 예측용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 상기 SNP에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비소세포폐암 진단 및 예후 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.

본 발명은 분리된 핵산으로부터, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 221번째 염기의 SNP를 확인하는 단계를 포함하는, 비소세포폐암의 진단 및 예후 예측 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 치료효과 또는 예후 예측 방법은, 분리된 핵산에서 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 221번째 염기의 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 rs877375 G>C는 MLKL의 프로모터 위치로서, 전사인자의 결합을 조절하여 MLKL의 발현 수준을 변화시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 환자의 핵산으로부터 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 221번째 염기의 SNP의 유전자형이 G인 경우 비소세포폐암 예후가 나쁘다고 예측될 수 있다. 반면에, 환자의 핵산으로부터 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 221번째 염기의 SNP의 유전자형이 C인 경우 생존률과 무병생존률이 증가하여 비소세포폐암 예후가 좋다고 예측될 수 있다. 상기 핵산은 이들 폐암 환자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등의 시료로부터 수득할 수 있으며, 그 핵산 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다. 또한, 상기 폐암 환자의 핵산은 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리방법과 같은 통상의 방법과 분리방법에 의하여 수행될 수 있으며, 또한 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.

본 발명의 SNP 유전자형의 확인은 시퀀싱 분석, 자동염기서열분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법 (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법 (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법 (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqManPCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명의 SNP 다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트(Chi-square test), 선형 회귀선분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석(multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수(continuous variables), 절대 변수(categorical variables), 대응비(odds ratio) 및 95% 신뢰구간(confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

본 발명의 “MLKL”은 “Mixed Lineage Kinase Domain Like Pseudokinase”의 약어로 단백질 키나아제 슈퍼패밀리에 속하며, 본 발명의 “MLKL 유전자”는 괴사 경로의 핵심 신호 전달 분자인 수용체 상호 작용 단백질 3(RIP3)과의 상호작용을 통해 프로그램된 세포 사멸 과정인 종양괴사인자(TNF)에 의한 괴사에 중요한 역할을 하며, 이에 TNF에 의한 괴사에 대한 억제능이 알려진 바 있다(RefSeq, Sep.2015). 또한, 상기 MLKL의 관련 질환으로는 성숙 발병 당뇨병 및 염증성 장 질환이 대표적으로 알려져있으며, 관련된 유전자 온톨로지(GO) 주석에는 전이 효소 활성, 인 함유 그룹 전달 및 단백질 티로신 키나아제 활성이 포함된다. MLKL 변이는 폐암을 포함한 다양한 종류의 암의 위험성과 예후와 관련이 있을 수 있으며, MLKL의 과발현은 다양한 종류의 암에서 화학요법 또는 방사선요법에 대한 저항성과 악성 예후와 관련이 있을 수 있다.

본 발명에서 사용된 MLKL의 다형성 부위는 “MLKL rs877375 G>C”로 표시할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequenc)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다.

본 발명은 374명의 비소세포폐암 환자를 대상으로, MLKL rs877375 G>C가 비소세포폐암의 예후를 예측할 수 있는 바이오마커임을 확인하였다.

보다 구체적으로, 본 발명은 MLKL rs877375 G>C를 이용하여 비소세포폐암(NSCLC) 치료효과 또는 예후 예측이 가능함을 확인하였다.

본 발명에서 용어 “다형성(Polymorphism)”이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며, 다형성 부위 중에서 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(Single Nuclotide Polymorphism, SNP)이라 한다.

본 발명에서 용어 “유전자형(genotype)”이라는 용어는 세포 또는 조직의 샘플에서 특정 유전자의 특이적인 대립유전자를 말한다.

본 발명에서 용어 “대립유전자(allele)”는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 상기 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용될 수 있으며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에서 용어 “예후”는 폐암과 같은 질환의 발병, 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 폐암-기인성 사망, 또는 진행 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다.

본 발명의 목적상, 상기 “예후”는 근치적 절제술 이후 비소세포폐암의 재발 위험성, 경과, 또는 생존 예후를 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어 “예측”이란 화학요법 등의 치료법에 대해 환자가 선호적 또는 비선호적으로 반응하여 상기 치료법에 의해 암 재발없이 특정 시기동안 생존할 여부 및/또는 가능성에 대한 것일 수 있으며, 본 발명에서는 환자가 폐암이 발병할 가능성이 있는지를 판별하고, 화학요법 등에 대해 선호적 또는 비선호적으로 반응하여 환자가 치료된 후 생존할 여부 및/또는 가능성에 대한 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 말하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커"란 폐암 발병 위험성, 발병한 폐암의 완치 여부, 혹은 경과를 예측할 수 있는 다형성을 가진 마커를 의미하며, 바람직하게는 상기에서 서술한 뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 상기 환자는 폐암 발병 위험성을 판별하기 위한 환자 또는 폐암, 특히 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미할 수 있다. 상기 폐암을 수술로 절제한 환자는 바람직하게는 비소세포암, 편평상피암, 선암, 대세포암 등의 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미할 수 있으며, 보다 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자를 의미할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일뿐, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

또한, 하기 실시예는 경북대학교 병원 및 전남대학교 병원의 기관윤리심의위원회의 승인을 받았으며, 두 병원의 기관윤리심의위원회에서 승인한 연구 프로토콜에 따라 실시되었다.

<실시예 1> 연구대상의 선정

본 연구에 사용된 환자군은 경북대학교 병원에서 337명, 및 전남대학교 병원에서 337명으로 총 674명의 한국인 환자를 대상으로 한다. 상기 환자군은 병리학적으로 병기 1기, 2기, 또는 2IA인 비소세포폐암으로 진단받았으며, 2000년 4월부터 2010년 6월까지 경북대학교 병원, 2005년 1월부터 2012년 8월까지 전남대학교 병원에서 근치적 절제술을 받았으며, 본 수술 이전에 기타 항암화학요법 또는 방사선 치료는 시행하지 않았다.

<실시예 2> 비소세포폐암과 관련된 SNP 발굴

비소세포폐암과 연관성이 있는 유전자 다형성을 선정하기 위하여, 실시예 1에서의 환자군을 연구대상으로 선정한 후, NCBI SNP 데이터베이스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)를 이용하였다. SNPinfo 웹서버 (https://snpinfo.niehs.nih.gov/)에서 기능적 SNP 예측을 위한 FuncPred 유틸리티와 연결 불균형 태그 SNP 선택을 위한 TagSNP 유틸리티를 사용하여, 강력한 연결 불균형(LD)( > 0.8)인 것을 제외하고 HapMap JPT데이터에 기반하여 부대립유전자 빈도가 0.1이상인 15개의 SNP를 선택하였고, 이에 따라 MLKL 유전자에서 3종, RIPK1 유전자에서 5종, 및 RIPK3 유전자에서 7종의 SNP가 선택되었다.

이후 상기 15개의 SNP를 iPLEX Assay 및 MassARRAY system(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재, Agena Bioscience)을 이용하여 유전자형을 분석하였다.

그 결과, 상기 15개의 SNP 중 하디-바인버그 평형에서 벗어난 5개의 SNP(P<0.05)를 제외하고, 10개 SNP를 추가로 분석하였으며, 그 중 근치적 절제술을 받은 비소세포폐암환자의 생존율과 유의한 연관성을 보이는 SNP를 선택하였다.

<실시예 3> rs877375 G>C의 표적유전자 발현 수준 분석

<3.1> Dual-Luciferase Reporter Assay 시스템을 통한 프로모터 분석

실시예 2에서 선택된 비소세포폐암환자의 생존율과 유의한 연관성을 보이는 SNP인 rs877375 G>C가 MLKL 유전자의 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위해, Dual-Luciferase Reporter Assay 시스템을 이용한 프로모터 분석 을 실시하였다.

MLKL유전자 시작 지점으로부터 상위 107bp 지점에 존재(유전자마다 다르지만 보통 유전자 시작 지점으로부터 5’말단 쪽으로 100-1000bp 정도를 promoter 라고 말하고 RNA polymerase 가 붙는 등 유전자 발현에 중요한 신호 역할을 함)하는 rs877375 위치의 프로모터 활성을 확인하기 위해, PGL3 basic vector에 rs877375 G>C를 포함한 MLKL promoter region 851bp를 삽입하였고, 상기 벡터를 비소세포폐암세포주 A549, H1299 에 transfection 시켜 Dual Luciferase reporter assay system을 이용해 luciferase 활성을 분석하였다. 상기 Luciferase 활성은 pRL-SV40 Renila Luciferase 활성으로 정규화하였다.

이를 통해 도 2와 같이, rs877375부위는 promoter 활성을 가지고, C 유전자형에 비해 G 유전자형의 promoter 활성이 더 높음을 확인하였다.

<3.2> TaqMan 분석을 통한 MLKL rs877375G>C의 유전자형 확인

qRT-PCR에 의해 결정된 MLKL의 mRNA 발현 데이터가 있는 253명의 환자에 대해 TaqMan 분석(Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA, USA)을 사용하여 MLKL rs877375G>C의 유전자형을 분석하였다.

이를 통해 도 3과 같이, MLKL의 mRNA 발현 수준은 MLKL rs877375G-to-C 변화와 유의한 양의 상관관계를 가짐을 확인하였다(각각 Ptrend = 5x10-5 및 0.01). 또한, 하위 그룹 분석에 따라 유전자형과 발현 수준 사이의 연관성은 선암종에서 유의한 것을 확인하였다(각각 Ptrend = 2x10-5 및 0.002).

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Claims (11)

1. MLKL 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 1의 rs877375 폴리뉴클레오티드의 221번째 염기를 포함하는 연속염기로 구성되는, 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 마커 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 연속 염기는 1 내지 100개의 연속염기인 것인 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 마커 조성물.
3. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 221번째 염기의 SNP를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 221번째 염기의 SNP를 포함하는 1 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머인 것을 특징으로 하는 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 비소세포폐암(NSCLC)은 폐선암인 것인, 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 단일염기다형성(SNP).
7. 제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 마이크로어레이.
8. 제7항의 마이크로어레이를 포함하는 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측용 키트.
9. 분리된 핵산 시료로부터, MLKL 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 1의 rs877375 폴리뉴클레오티드의 221번째 염기 타입을 상기 핵산 시료에서 확인하는 단계를 포함하는, 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 서열번호 1의 221번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 G로 확인되면 대체 대립유전자의 C염기에 비해 비소세포폐암(NSCLC)의 예후가 우수한 것으로 예측하는 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 비소세포폐암(NSCLC)은 폐선암인 것인, 비소세포폐암(NSCLC) 진단 및 예후 예측방법.