KR20250058131A - Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지 및 이의 제조방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 Cas9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 Cas9 단백질을 발현하는 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터는 형질 전환된 동물에서 Cas9 유전자를 암호화하는 DNA 가닥을 돼지 ROSA26 좌위에 삽입시켜 Cas9 유전자의 발현을 돼지의 내재된 프로모터를 활용하여 효과적으로 유도할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지는 생체 내에서 유전자의 편집이 가능할 것으로 생각됨으로 이를 활용하여 인간 질환 관련 유전자 연구 및 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있으며 나아가 가축의 경제형질에 관련된 유전자 연구에도 활용할 수 있다.

Description

Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 {Transgenic cloned piglets for expressing Cas9 gene and producing method thereof}

본 발명은　Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 이용하여 Cas9 유전자가 ROSA26 좌위에 삽입되어 발현되게 함으로 생체 내에서 목표 유전자의 편집을 가능하게 하여 동물 수준에서 목표 유전자의 기능 검정이 가능하게 하는 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) 시스템은 3세대 유전자 편집 기술로서 기존 유전자 편집 기술에 비해 간편하면서도 효율적으로 목표 유전자의 편집이 가능하다. 이 유전자 가위 기술은 Cas9 엔도뉴클레아제와 19~20 뉴클레오타이드 길이의 가이드 RNA로 구성되어 있으며, Cas9 엔도뉴클레아제는 DNA 이중나선 염기가닥을 절단하는 가위 역할을 하고, 가이드 RNA는 Cas9이 표적 DNA 염기서열을 인식 하고 결합할 수 있는 역할을 한다.　

한편, 이 두 물질에 의해 DNA 염기서열이 절단 되면 세포 자체적으로 절단된 DNA 염기서열이 복구(연결)된다. 복구는 NHEJ (Non-homologous end joining) 또는 HDR (homology-directed repair) 경로를 통해 복구된다. NHEJ 복구 방법의 경우 DNA 절단 부위가 연결될 때 연결 부위에 DNA 염기가 무작위로 삽입되거나 결실이 일어나게 되어 돌연변이가　발생하게 되는 데 만약 절단 부위가 기능을 가지는 염기서열(예, 유전자)일 경우, 해당 유전자의 기능은 변화하게 된다. HDR 복구 방법은 DNA 절단 부위와 동일한 서열을 가진 DNA 서열(템플릿)이 있으면 그 서열을 활용하여 복구를 하는 방법인데 만약 절단 부위에 동일한 서열 사이에 외래 DNA를 추가로 넣어 놓는다면 복구 시 외래 DNA를 기존 DNA 내로 정확 하게 삽입할 수 있다. 따라서, CRISPR/Cas9 기술을 활용하여 다양한 형질전환 동물을 개발 할 수 있다.

CRISPR/Cas9 기술과 함께, 체세포의 핵을 난자의 핵과 치환한 후 난자를 활성화하여 배아를 생성한 후 대리모에 이식함으로 체세포의 유전 정보와 동일한 개체를 생산 할 수 있는 기술인 체세포 핵이식 (somatic cell nuclear transfer, SCNT)기법의 발달은 형질전환 동물 개발 연구를 가속화 하였다.

3세대 유전자 편집 기술인 CRISPR/Cas9 유전자 가위 시스템은 Cas9 endonuclease 와 single-guided RNA(sgRNA)를 활용하여 DNA 염기서열을 절단함으로 유전자의 기능을 불활성화 시키는 기술이다. 이 기술을 활용하여 특정 유전자 편집 동물을 개발하면 특정유전자의 기능을 생체 내에서 검증할 수가 있다.

이와 관련하여 구체적으로 한국등록특허 10-1961667호 “돼지유행성설사병 바이러스에 내성을 가지는 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법”, 한국공개특허 10-2023-0036561호 “CRISPR/Cas9 매개 폴리시스트론성 종양유전자 발현 벡터 및 이를 이용한 동물 종양 모델”, 한국등록특허 10-2058015호 “돼지 GGTA1 유전자가 결손되고, 인간 CD55 및 CD39 유전자가 발현되는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법” 등의 종래 기술이 존재한다. 그러나, 이들 종래 기술은 모두 특정 유전자의 넉인 또는 넉아웃을 위하여 Cas9 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 핵치환 등의 기술을 이용하여 형질전환 돼지를 제조하는 단계의 순서로 이루어지는 것을 공통으로 한다. 이와 같은 선 유전자 편집(Cas9 도입 및 유전자 편집) 후 핵이식 방법을 통한 형질전환 동물의 개발은 여전히 대상 적정 유전자의 선정, 체세포 복제란 생산, 복제란 이식 및 복제동물의 생산에 이르기까지 많은 시간과 노동력이 요구 되고 있다. 특히, 문제점으로는 선정한 유전자의 편집 효과가 생산된 복제 개체에서 재현되지 않는 경우가 빈번하다. 이는, 보통 유전자의 선정은 기존 연구결과를 참조하거나, 세포 수준에서 연구한 결과를 통해 이루어지는 경우가 대부분이기 때문이다. 따라서, 형질전환 돼지 개발의 효율성을 높이기 위해 후보 유전자 선발을 위한 기능 검증을 세포 단계가 아닌 생체 내에서 하기 위한 시스템이 필요하다.

이를 위하여, 본 발명자들은 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지를 개발하였다. Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 활용하여 Cas9 유전자 발현 세포를 제조하였고, 이 세포를 활용하여 체세포 복제 후 외과적으로 대리모에 이식하여 체내에서 Cas9 유전자를 발현하는 자돈을 생산하였다. 또한, 형광 현미경을 활용하여 Cas9 단백질과 공발현하는 적색 형광 단백질(Red fluorescent protein, RFP)의 발현을 확인하였다. ALK 및 EML 4 유전자의 돌연변이 시, 두 유전자가 inversion이 일어나는 현상을 활용하여 ALK 및 EML 4 유전자를 타겟하는 gRNA를 도입하여 유전자 좌위가 일어나는 것을 확인함으로써 상기 형질전환 복제돼지의 생체 내 유전자 편집능을 검증하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 돼지 ROSA26 유전좌위에서 내재된 프로모터에 의해 Cas9 유전자를 발현시킴으로 생체 내에서 목표 유전자의 기능을 검증할 수 있는 형질전환 복제 돼지를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 돼지 ROSA26 유전좌위의 특정 부위를 표적 할 수 있는 합성 sgRNA(synthetic small guide RNA)를 제공한다.

또한 본 발명은 돼지 ROSA26 유전좌위의 엑손 1번 일부 서열을 포함하는 레프트 암(Left Arm) 및 인트론 1번의 일부 서열을 포함하는 라이트 암(Right Arm)을 포함하는 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 돼지 ROSA26 유전좌위 표적용 합성 sgRNA 및 재조합 Cas9 단백질을 활용하여 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 복제 돼지 제조용 형질전환 세포를 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 재조합 벡터로 제조된 형질전환된 체세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성한 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 인간을 제외한 생체 내 유전자 편집이 가능한 Cas9 발현 동물 모델을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 Cas9 발현 동물 모델 제조 방법에 의하여 제조된 Cas9 발현 동물 모델을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터 및 이를 이용하여 제조된 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지는 CRISPR-Cas9 시스템의 핵심 요소인 Cas9 유전자 가위를 전 조직에서 발현함으로써 상대적으로 쉽게 생체 내로 도입할 수 있는 가이드 RNA만 도입함으로써 살아있는 동물의 생체 내에서 목표 유전자의 발현을 제어함으로써 생체 내에서 목표 유전자의 기능을 연구 할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 형질전환 복제 돼지는 인간 질병 연관 유전자 등의 연구 및 질환 모델 동물 개발뿐만 아니라 가축의 질병 경제 형질 연관 유전자 연구를 위한 동물로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 활용하여 개발한 형질전환 세포로부터 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지의 제조 방법을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 복제 돼지 ROSA26 유전좌위의 특정부위 인트론 1번을 표적하는 합성 gRNA 타겟 서열을 나타내는 도이다.
도 3은 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 제조 하기 위한 합성 벡터 #1 구성을 나타낸 도이다.
도 4는 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 제조 하기 위한 합성 벡터 #2 구성을 나타낸 도이다.
도 5는 합성 벡터 #1과 #2를 활용하여 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 제조하는 방법 및 구성을 나타낸 도이다.
도 6은 합성 벡터 #1과 #2를 제한효소를 처리한 후 잘려진 패턴을 보여주는 도이다.
도 7은 합성 벡터 #1과 #2를 제한효소 처리 후 필요 절편을 회수한 결과를 보여주는 도이다.
도 8은 합성 벡터 #1과 #2의 필요 절편을 연결 후 대장균에 도입한 후 회수된 벡터를 확인한 도이다.
도 9는 도 8에서 회수된 벡터를 제한효소를 처리하여 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터의 후보 선별 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 선형화된 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터의 구성 및 선형화된 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터가 ROSA26 좌위에 넉인(knock-in)되는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 11은 PCR을 활용하여 제조된 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터의 선형화 유무를 확인한 도이다.
도 12은 CRE, Flippase(FLP) 단백질에 의해서 삽입된 Cas9 유전자 카세트를 구성하는 유전자들의 가능한 재조합 과정을 나타낸 도이다.
도 13은 형질전환 후보 세포주에서 삽입된 Cas9 유전자 카세트의 레프트 암과 라이트암 부위를 PCR 한 결과를 나타내는 도이다.
도 14는 형질전환 후보 세포주에서 삽입된 Cas9 유전자 카세트의 삽입 유무를 확인한 long PCR 결과를 나타내는 도이다.
도 15는 형질전환 세포주에서 붉은 형광 단백질 발현을 분석한 결과이다.
도 16은 형질전환 세포주에서 Cas9 발현을 분석한 결과이다.
도 17은 본 발명을 통해 생산된 Cas9 형질전환 복제 돼지를 나타내는 도이다.
도 18는 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제 돼지에서 표적 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. 88, 164는 Cas9의 삽입이 확인되는 positive control, 83, 103, 105는 negative control이며 SK1 내지 SK13은 Cas9을 발현하는 자돈(SK)이다.
도 19는 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제 돼지 유래 귀 섬유아세포에서 붉은 형광 단백질 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제 돼지 유래의 다양한 조직에서 Cas9 유전자 발현을 분석한 결과이다.
도 21은 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제 돼지에서 유래된 체세포에서 유전자 편집능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 제공한다.

Cas9 유전자 공여 재조합 벡터는 {레프트암}-SA-LoxP2272-LoxP-{Cas9-P2A-tdTomato}-LoxP-LoxP2272-FRT-{PGK-Neomycin}-FRT-{라이트암}으로 구성된다.

Cas9 유전자 공여 재조합 벡터는 그 크기로 인해 합성 벡터 #1 (도 3), 합성 벡터 #2 (도 4)를 각각 제조한 다음, 유전자 재조합 방법을 이용하여 제조된다(도 5).

자세히 설명하면 벡터 #1은 Cas9 유전자와 붉은 형광 단백질인 tdTomato 두 유전자가 한꺼번에 발현 될 수 있도록 2A 펩타이드에 의해 조절되는 폴리시트로닉 (polycistronic) 발현시스템인 Cas9-P2A-tdTomato 발현 벡터로 제조되고, Cas9-P2A-tdTomato 발현을 CRE 단백질로 조절할 수 있도록 Cas9-P2A-tdTomato 유전자의 양 끝에 LoxP 2272-LoxP 및 LoxP-LoxP2272 염기서열을 가지는 발현 벡터로 제조된다. 벡터 #1은 서열번호 8의 염기서열로 표시된다.

벡터 #2는 ROSA26 타겟 부위와 상동인 염기서열, Cas9-P2A-tdTomato 유전자가 돼지가 본래 가지고 있는 ROSA26 프로모터에 의해 발현 될 수 있도록 하는 스플라이싱 수용체(splicing acceptor)의 염기서열, 형질 전환된 세포주의 선별에 필요한 PGK 프로모터에 의해 발현되는 Neomycin 유전자, 필요시 PGK 프로모터 및 Neomycin 유전자 염기서열을 Flipase 단백질을 통해서 제거 할 수 있는 FRT 염기서열을 가지고 있다. 벡터 #2 는 서열번호 9의 염기서열로 표시된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 돼지 ROSA26 유전좌위의 특정 부위를 표적 할 수 있는 합성 sgRNA(synthetic small guide RNA)를 제공한다.

Cas9-P2A-tdTomato 유전자가 넉인 될 타겟 부위를 ROSA26 유전자의 엑손 1번 바로 다음의 인트론 1번으로 선택하였기 때문에, 돼지 ROSA26 유전자의 엑손 1번 및 인트론 1 염기서열을 분석하여 돼지 ROSA26 유전자의 엑손 1의 일부 서열과 인트론 1의 일부 서열을 포함하며 크기가 800 bp인 레프트 암(Left arm)과 인트론1의 일부 서열을 포함하며 각각 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시된다.

Cas9 유전자 공여 재조합 벡터는 서열번호 10의 염기서열로 표시된다.

본 발명의 일 구체적 예에 있어서, 레프트 암은 돼지 ROSA26 유전자의 엑손 1 일부와 인트론 1 일부 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, ROSA26 유전좌위는 long non-coding RNA (lncRNA)의 생합성을 담당하는 것으로, 돼지의 경우 2개의 엑손 및 1개의 인트론으로 구성되어 있다.

본 발명의 바람직한 구체 예에 따르면, 상기 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터는 돼지 ROSA26 유전자의 1번 엑손과 1번 인트론의 일부분을 인지하여 Cas9 유전자 카세트을 넉인시킨다.

본 발명에 있어서, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목표 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 유전자 발현 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드(plasmid), 코즈미드(Cosmid), 파지(phage) 입자, 바이러스(virus) 벡터일 수 있다.

본 발명의 돼지 Cas9　유전자 공여 재조합 벡터는 바람직하게는 도 5에 개시된 벡터맵으로 표시될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 돼지 ROSA26 유전좌위 엑손 1 일부와 인트론 1 일부 서열을 포함하는 레프트 암(Left arm) 및 ROSA26 유전자의 1번 인트론의 일부 서열을 포함하는 라이트 암(right arm)을 포함하는 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, "레프트 암(left arm)" 및 "라이트 암(right arm)“ 은 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나는 영역을 의미한다.

본 발명에 있어서, "상동 재조합"은 상동성을 지닌 유전자 좌위에서 교환을 통하여 일어나는 유전자 재조합을 의미하며, 기능이 소실된 대립유전자를 지닌 형질전환 동물의 제조에 이용된다.

본 발명의 일 구체적 예에서, 레프트 암은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체적 예에 따르면, 라이트 암은 돼지 ROSA26 유전자의 인트론 1의 일부 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체적 예에서, 라이트 암은 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.

상기 레프트 및 라이트 암의 크기는 벡터가 선형화 되고 양 끝에 레프트 및 라이트 암이 위치할 경우, 500bp 내지 1000bp일 수 있으며, 더 바람직하게는 800bp이다.　 암의 크기가 800bp이더라도 벡터가 원형 상태이거나 선형 상태라도 양 끝의 암의 크기가 1000bp이상이면 상동재조합이 잘 일어나지 않아 형질전환이 원하는 대로 잘 이루어지지 않을 수 있어 바람직하지 않다.

본 발명에서는 레프트 암 염기서열에 이어서 Splicing acceptor (SA) DNA 염기서열을 위치하게 함으로써 돼지 ROS26 유전자의 전사 프로모터를 이용하여 Cas9 단백질 및 형광단백질을 발현하게 할 수 있다.

본 발명에서 상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소로서, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성하여, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)로 작용할 수 있다.

상기 Cas9 단백질은 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터 (Campylobacter) 속 유래인 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 스트렙토코커스 피요젠스로부터 유래한 Cas9 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드 (trinucleotide)를 인식할 수 있다.

상기 Cas9 단백질을 암호화하는 염기서열은 서열번호 3의 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.

상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein; GFP), 변형된 녹색 형광 단백질 (modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein; RFP), 증강된 적색 형광 단백질 (enhanced red fluorescent protein;ERFP), 붉은 형광 텐덤 다이머 토마토(tdTomato), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서 상기된 형광 단백질은 tdTomato이다.

상기 Cas9 및 형광단백질 유전자는 2A 펩타이드 (2A peptide) 서열로 연결될 수 있다.

상기 2A 펩타이드는 20개 내외의 아미노산 서열로, P2A, E2A, F2A 및 T2A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서 상기 2A 펩타이드는 P2A이다. 상기 P2A 펩타이드는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서는 Cas9 단백질과 형광단백질의 발현을 필요시 CRE 단백질을 통해 억제하기 위하여 Cas9　유전자의 왼쪽 끝에 LoxP2272-LoxP DNA 염기서열을 형광 단백질 유전자의 오른쪽 끝에　LoxP-LoxP2272 DNA 염기서열을 첨가할 수 있다.

본 발명의 일 구체적 예에서, 레프트 암쪽 LoxP2272-LoxP 및 라이트 암쪽 LoxP-LoxP2272 DNA 염기서열은 각각 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 재조합 벡터는 Cas9 단백질과 형광단백질이 삽입된 형질전환 세포주를 선별하기 위한 항생제 내성유전자가 삽입되어 있으며, 선별 후에 항생제 내성유전자는 Flipase에 의해서 제거 될 수 있는 FRT DNA 염기서열이 항생제 내성 유전자의 프로모터 왼쪽 및 항생제 내성 유전자의 오른쪽에 위치하고 있다.

본 발명의 일 구체적 예에서, FRT DNA 염기서열은 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.

상기 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 제조하기 위한 재조합 벡터는 바람직하게는 도5 및 도10에 개시된 벡터맵으로 표시된 벡터의 조합으로서, 서열번호 8로 표시되는 합성 벡터 #1과 서열번호 9로 표시되는 합성 벡터 #2의 재조합에 의해 제조된, 서열번호 10으로 표시되는 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 돼지 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터가 도입된 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 제공한다.

본 발명에 있어서, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 플라스미드 또는 비플라스미드성 나출(naked DNA)에 의한 진핵세포의 형질전환을 세포의 종양화의 의미로서의 형질전환과 구분하기 위해, '형질감염(transfection)'이라고 부르기도 하는데, 본 발명에서는 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서, 상기 "형질전환 세포주"는 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지 제조용 재조합 벡터가 도입된 세포주로, 핵 공여 세포로 사용된다.

형질전환 세포주로 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있고, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 돼지 유래의 귀 섬유아세포이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 본 발명의 형질전환 세포주(Cas9 pEF)는 생물자원센터에 2023.09.26일자로 기탁번호 KCTC 15634BP로 기탁되었다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵이식란을 형성하는 단계 및 상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는, Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지의 제조방법 및 상기 방법에 의해 생산된 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지를 제공한다.

상기 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지의 제조방법은 체세포 핵이식(SCNT; somatic cell nuclear transfer)에 의한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 "체세포 핵이식"은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 유전자 조작기술로써 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식 후 융합하여 핵 이식란을 생산하고 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.

본 발명에 있어서, 상기 "핵 이식란"은 공여 세포 또는 공여 세포의 핵이 도입 또는 융합된 난자를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 "융합"은 핵 공여 세포와 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또 는 핵 공여세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로 써 일어날 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "형질전환 세포주"는 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지 제조용 재조합 벡터가 도입된 세포주로, 핵 공여 세포로 사용하였다. 상기 형질전환 세포주는 핵 수용체인 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 "난자"는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙 난자를 말하며, 바람직하게는 돼지의 난자를 의미한다.

본 발명에 따른 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지는 CRISPR-Cas9 시스템의 핵심 요소인 Cas9 유전자 가위를 전 조직에서 발현하는 바 상대적으로 쉽게 생체 내로 도입할 수 있는 가이드 RNA만 도입함으로써 살아있는 동물의 생체 내에서 목표 유전자의 발현을 제어하여 생체 내에서 목표 유전자의 기능을 연구 할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지는 인간 질병 연관 유전자 등의 연구 및 질환 모델 동물 개발뿐만 아니라 가축의 질병 경제 형질 연관 유전자 연구를 위한 동물로서 유용하게 활용될 수 있다.

구체적인 실시예에 의하면,

본 발명자들은 가이드 RNA의 타겟 부위(target site)를 가지고 있어 상대적으로 쉽게 동물 생체 내에서 목표 유전자의 발현을 제어할 수 있는 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지를 생산하기 위해(도 1 및 도 2), 합성 벡터 #1(도 3)과 합성 벡터 #2(도 4)를 이용하여 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 제조하였다(도 5). 우선 상기의 합성 벡터 #1과 합성 벡터 #2의 필요 부위를 얻기 위해 AvrII 및 ClaI 제한 효소로 처리(도 6)하고, 전기 영동 후 겔 정제 방법에 의해 필요 절편을 회수하였다(도 7). 회수한 절편을 클로닝하여 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터 후보를 정제하였다(도 8). 상기 재조합 벡터 후보를 제한효소 처리하여 잘려진 DNA 사이즈에 의해 예상 패턴을 보이는 벡터를 선별하였고(도 9), 시퀸싱을 통해 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 제조하였다.

상기의 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터가 돼지 ROSA 좌위에 효율적으로 넉인될 수 있도록 선형화하였다(도 10). 선형화는 프라이머(Linear-F 및 Linea-R)를 이용한 PCR에 의해 수행하였고, 증폭된 PCR 산물은 겔 전기 영동으로 확인한 후 정제하여 회수하였다(도 11).

선형화된 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 도입하기 위한 세포주는 난축맛돈 수컷의 귀에서 유래한 섬유아세포를 사용하였다. 선형화된 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 ROSA26 인트론 1번 부위를 표적하는 합성된 gRNA와 Cas9 단백질과 함께 귀섬유아세포에 도입하여 형질전환을 유도하였다. 형질전환 이후 획득한 단일 콜로니들을 계대배양하여 총 168개의 클론을 획득하였다.

이들 중 형질전환 세포 클론을 스크리닝하기 위해 프라이머 P1과 P2, P3와 P4를 사용하여 PCR을 수행하였고(도 12), 그 결과 36개의 형질전환 세포 클론을 획득하였다(도 13). Cas9 유전자 공여 재조합 벡터의 {레프트암}-SA-LoxP2272-LoxP-{Cas9-P2A-tdTomato}-LoxP-LoxP2272-FRT-{PGK-Neomycin}-FRT-{라이트암}의 전체가 제대로 삽입 되어있는 지 확인하기 위해 프라이머 P1과 P4를 사용하여 full-length PCR을 수행한 결과 11개의 세포 클론을 획득하였다(도 14).

11개의 세포 클론 중 증식이 되지 않는 1개 클론을 제외한 나머지 10개의 세포 클론 중에서, 웨스턴 블랏에 의해 8개의 형질전환 세포 클론이 Cas9 단백질을 발현하는 것을 확인하였고(도 15), 이들 8개의 형질전환 세포 중 정상적인 핵형을 가지며 tdTomato 형광 단백질을 발현하는 7개의 형질전환 세포를 최종 선발하였다(도 16).

상기의 최종 선발된 형질전환 세포를 체세포 핵이식 방법에 이용하여 총 13마리의 형질전환 복제돼지(자돈 SK1~13)를 생산하였고, 그 중 SK7 개체는 출산 2주 이후에도 문제없이 생존하였다(도 17). 상기의 형질전환 복제돼지 SK1~13 유전체에 정상적으로 Cas9 카세트가 도입되었는지 검증하기 위해 자돈의 탯줄에서 유전체 DNA를 추출하여 프라이머 P1과 P2, P3과 P4를 활용하여 PCR을 수행하였고, SK6를 제외한 SK1 내지 SK5, SK7 내지 SK13에서 Cas9 카세트의 유전자가 ROSA26 좌위에 도입되어 있음을 확인하였다(도 18). 태어난 형질전환 복제돼지의 귀 섬유아세포로부터 tdTomato가 발현하는 것을 확인하였고(도 19), 다양한 조직(귀, 간, 심장, 폐, 비장, 신장, 정소, 혀, 근육, 대장, 소장, 위)에서 Cas9 유전자가 발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 20).

나아가 Cas9 발현 형질전환 복제돼지 SK7에서 유래한 귀 섬유아세포에 ALK 및 EML4 유전자를 표적하는 gRNA 도입한 결과, 역위(A&D 및 B&C)및 결실(B&D) 돌연변이가 관찰됨(도 21)에 의해 Cas9 발현 형질전환 복제돼지 유래 체세포를 활용하여 유전자 편집이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1. 돼지 ROSA26 좌위 적중 합성 gRNA 제작>

돼지 ROSA 26 좌위에 Cas9 및 형광단백질 넉인을 위하여, 타겟 부위를 ROSA26 유전자의 인트론 1번으로 선별하였다. 돼지 ROSA26 좌위의 염기서열을 분석하여 gRNA가 결합할 수 있는 염기서열 부위를 결정한 후 합성하였다. 그 합성 서열을 표 1에 나타내었다. 도 2는 합성된　gRNA가 ROSA26 좌위에 결합하는 부위를 일례로 나타낸 것이다.

sgRNA 염기서열(5'->3') (서열번호 11)	PAM 염기서열 (인식 부위)
ACCACCCAGAAGCCTCGGCC	CGG

<실시예 2. Cas9 유전자 공여 재조합 벡터의 제조>

Cas9 유전자 공여 재조합 벡터는 그 크기로 인해 벡터 #1 (도 3), 벡터 #2 (도 4)를 각각 제조한 다음 유전자 재조합 방법을 이용하여 제작되었다(도 5).

자세히 설명하면 벡터 #1 (도 3)은 Cas9 유전자와 빨강 형광 단백질인 tdTomato 두 유전자가 한꺼번에 발현 될 수 있도록 2A 펩타이드에 의해 조절되는 폴리시트로닉 (polycistronic) 발현시스템인 Cas9-P2A-tdTomato 발현 벡터로 제조 되었으며, Cas9-P2A-tdTomato 발현을 CRE 단백질로 조절할 수 있도록 Cas9-P2A-tdTomato 유전자의 양 끝에 LoxP 2272-LoxP 및 LoxP-LoxP2272 염기서열을 가지고 있다.

벡터 #1은 서열번호 8의 염기서열로 표시된다.

벡터 #2 (도 4)는 ROSA26 타겟 부위와 상동인 염기서열, Cas9-P2A-tdTomato 유전자가 돼지가 본래 가지고 있는 ROSA26 프로모터에 의해 발현 될 수 있도록 하는 splicing acceptor 염기서열, 형질 전환된 세포주를 선별에 필요한 PGK 프로모터에 의해 발현되는 Neomycin 유전자, 필요 시 PGK 프로모터 및 Neomycin 유전자 염기서열을 Flipase 단백질을 통해서 제거 할 수 있는 FRT 염기서열을 가지고 있다. 벡터 #2 는 서열번호 9의 염기서열로 표시된다.

Cas9-P2A-tdTomato 유전자가 넉인 될 타겟 부위를 ROSA26 유전자의 엑손 1번 바로 다음의 인트론 1번으로 선택하였기 때문에, 돼지 ROSA26 유전자의 엑손 1번 및 인트론 1 염기서열을 분석하였고, 돼지 ROSA26 유전자의 엑손 1의 일부 서열과 인트론 1의 일부 서열을 포함하며 크기가 800 bp인 레프트 암(Left arm)과 인트론1의 일부 서열을 포함하며 크기가 800 bp인 라이트 암(right arm)의 서열을 결정하였다. 레프트 암 및 라이트 암은 각각 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시된다.

상기 제작된 벡터1 과 벡터 2 의 필요 부위를 얻기 위하여 AvrII 및 ClaI 제한 효소로 처리(도 6)하였고 필요 절편을 전기 영동 후 겔 정제 방법(gel purification) 을 이용하여 회수 하였다(도 7). 회수한 절편은 ligase를 활용하여 클로닝하였고 후보 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 정제하였다(도 8). 원하는 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 찾기 위해 제한효소를 처리하여 잘려진 DNA 사이즈를 확인하였고(도 9), 그 중 예상 패턴을 보이는 벡터를 선별하였고 시퀀싱을 통해 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 제작하였다. Cas9 유전자 공여 재조합 벡터는 서열번호 10의 염기서열로 표시된다.

<실시예 3. Cas9 유전자 공여 재조합 벡터 선형화 및 Cas9 유전자가 삽입된 세포주의 구축>

ROSA26 좌위의 목표 지점에 효율적으로 넉인되게 하기 위해, Cas9 유전자 공여 재조합 벡터의 {레프트암}-SA-LoxP2272-LoxP-{Cas9-P2A-tdTomato}-LoxP-LoxP2272-FRT-{PGK-Neomycin}-FRT-{라이트암} 염기서열 부분을 선형화 하였다 (도 10). 선형화는 하기 표 2의 프라이머(Linear-F 및 Linea-R)를 이용하여 PCR방법을 통해 이루어졌다. PCR은 Platinum SuperFi II　중합효소(Invitrogen), 1X Platinum SuperFi II　버퍼, 10 uM 프라이머, 10 mM 데옥시리보 뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP) 믹스를 포함하는 20 μL PCR 반응에서 gDNA를 증폭하였다. PCR은　98도에서 3분 동안 사전 변성; 98도에서 10초 동안 변성, 60도에서 10초 동안 어닐링, 72도에서 6분 동안 연장, 35회 반복; 72도에서 5분 동안 연장; 으로 수행되었다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스겔에서 30분 동안 100V에 서 겔 전기 영동을 통해 확인 한 후 정제를 하여 회수하였다(도 11).

이 름	프라이머 염기서열 (5'-3')
Linear-F (서열번호 12)	ATA ATA CCG CGC CAC ATA GC
Linear-R (서열번호 13)	AAC CGT ATT ACC GCC TTT GA

선형화된 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 도입하기 위한 세포주는 난축맛돈 수컷의 귀에서 유래한 섬유아세포를 사용하였다. 이 귀 섬유아세포는 완전배지[DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) with high glucose, GlutaMAX™ Supplement, pyruvate, 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum), 1 % (v/v) 비필수 아미노산, 1% (v/v) 항생제-항균제 및 0.1% (v/v) 2-메르캅토 에탄올 (모두 미국 캘리포니아 주 라이프 테크놀로지스에서 입수)] 에서 유지되었다. 1차 배양을 위한 배양 조건은 37도 및 5% CO₂ 조건 의 습한 배양기에서 이루어졌다.

세포 형질전환을 위해 구축한 선형화된 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터를 ROSA26 인트론 1번 부위를 표적하는 합성된 gRNA 와 Cas9 단백질(Invitrogen)과 함께 lipofectamine 3000(Invitrogen) 및 CRISPRMAX(Invitrogen)를 사용하여 귀섬유아세포에 도입함으로 형질전환을 유도하였다. 실험은 제조사의 메뉴얼에 따라 수행하였다.

형질도입 48시간 후에 세포를 한계희석법으로 재 시딩 하였다. 24시간 후 500mg/ml 농도의 G418을 포함하는 완전배지로 교체하였고 이어 48시간 후 1,000mg/ml 농도의 G418을 포함하는 완전배지로 교체해 주었다. 독립적인 콜로니를 획득 할 때까지 3~4일 마다 G418(1,000mg/ml)가 포함된 배지로 교체 해 주었다. 3 내지 4주 동안 획득한 단일 콜로니들을 48-웰 플레이트, 24-웰 플레이트 및 6-웰 플레이트 연속적으로 계대 배양하였다. 이를 통해 총 168개의 네오마이신 (Neomycin) 저항 세포 클론을 획득하였다.

형질전환 세포 클론을 찾기 위해 획득한 세포로부터 genomic DNA를 추출하였고 하기 표 3 의 프라이머 (P1과 P2 및 P3와 P4)를 서열을 사용하여 PCR을 수행하였다 (도 12). 프라이머 P1과 P2를 사용하여 레프트암 부위를, 프라이머 P3와 P4를 사용하여 라이트암 부위를 증폭하였다. PCR은 상기와 동일하나 72도 연장 반응을 1분 30초 수행하였다.　 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스겔에서 30분 동안 100V에 서 겔 전기 영동을 통해 분석되었다. 그 결과 36개의 세포 클론을 획득하였다 (도 13).

P1 (서열번호 14)	TGG GAA AGG AAG CAA TCA TC
P2 (서열번호 15)	ATG GTG GGG TAC TTC TCG TG
P3 (서열번호 16)	AGT CTG GAG CAT GCG CTT TA
P4 (서열번호 17)	GGT CCA ATC GCA GTG GTA GT

{레프트암}-SA-LoxP2272-LoxP-{Cas9-P2A-tdTomato}-LoxP-LoxP2272-FRT-{PGK-Neomycin}-FRT-{라이트암} 염기 서열 전체가 삽입이 되어 있는지 확인하기 위하여 상기 표 3 의 프라이머 P1와 P4를 서열을 사용하여 full-length PCR을 수행하였다. PCR은 상기 조건과 동일하나 72도 연장 반응을 6분 수행하였다.　 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스겔에서 30분 동안 100V에 서 겔 전기 영동을 통해 분석되었다. 그 결과 11개(73, 79, 85, 87, 88, 100, 123, 127, 130, 143, 164)의 세포 클론을 획득하였다 (도 14).

더 이상 증식이 되지 않은 1개 세포를 제외하고 웨스턴 블랏을 수행하여 8개의 형질전환 세포(73, 85, 87, 88, 127, 131, 143, 164)가 Cas9 단백질을 발현하는 것을 확인하였고 (도 15),　핵형 분석 결과 그 중 7개의 형질전환 세포가 정상적인 핵형을 가진 것 확인하였으며, 상기 7개의 형질전환 세포는 tdTomato 형광 단백질이 발현하는 것을 확인하였다 (도 16).

<실시예 4. 공여세포의 체세포 핵이식(SCNT; Somatic cell nuclear transfer) 및 이에 따른 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지의 제조>

<4-1. SCNT에 사용되는 난모 세포(oocyte)의 제조>

공여세포의 핵이 주입될 난자를 준비하기 위해, 지역 도축장으로부터 채취된 난소를 30~35℃로 유지된 0.9% 생리식염수 용액에 넣어 실험실로 운반하였다. 직경 3-6 mm의 난포로부터 18 guage -주사바늘이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하여 미성숙 난포란을 채취하였다. 채취한 난자는 실체 현미경 하에서 난구세포 및 세포질이 균질한 것을 선별하여 0.1% PVA(Polyvinyl alcohol)가 첨가된 TL-Hepes에 3회 세척 후에 성숙배양에 이용하였다. 성숙배양액은 0.1% PVA(w/v), 3.05 mM D-glucose, 0.91mM sodium pyruvate, 0.57 mM cysteine, 0.5 μg/ml LH, 0.5 μg/ml FSH, 75 μg/ml penicillin G 및 50 μg/ml streptomycin이 첨가된 TCM-199 (Gibco-BRL, USA)을 사용하였다. 성숙배양은 4-well dish (Nunc, Denmark)를 이용하여 well 당 50-70개의 난자를 40-42시간 동안 38.5℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 실시하였다.

<4-2. SCNT의 수행>

SCNT는 다음과 같이 수행되었다. 우선, 체외 성숙이 완료된 난자를 0.1% PVA 및 0.1% hyaluronidase가 포함된 PBS에 위치시켜 4분 동안 교반(vortex) 처리하여 난구 세포를 제거하였고, 난구 세포가 제거된 난자들은 제1극체 주변의 세포질을 흡입하여 제거함으로써 제핵을 실시하였다. 모든 미세 조작 과정은 3 mg/ml BSA와 5 μg/ml cytochalasin B가 포함된 미세 조작용 배양액 내에서 실시하였다. 제핵 후 난자들은 공여 세포 도입 때까지 3 mg/ml BSA가 포함된 배양액 내에 보관하였다.

상기 실시예 3 과정을 통해 {레프트암}-SA-LoxP2272-LoxP-{Cas9-P2A-tdTomato}-LoxP-LoxP2272-FRT- {PGK-Neomycin}-FRT-{라이트} 염기서열의 삽입이 확인된 핵 공여자 세포 하나를, 실시예 4-1에서 제조한 탈핵화된 난자의 위란강(perivitelline space)으로 주입(injection)하였다. 난자 세포질-세포 복합체를 0.1 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2 및 0.5 mM HEPES가 포함된 0.3M mannitol 용액에서 전기적인 펄스 (1.5 kV/cm의 직류전압을 30 μsec 동안 1초의 간격으로 2회)로 융합하였다.

<4-3. SCNT 배아를 이용한 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지의 제조>

상기 실시예 4-2를 통해 제작된 SCNT 배아를 4마리의 암컷 돼지 대리모에 이식하여 총 13마리의 돼지 (SK1~13)가 생산되었으나, 태어난 13마리 중 12 마리는 출산 직후에서 2주 정도 후에 폐사 하였고 SK7 개체는 문제없이 생존하였다(도 17).

구체적으로, Landrace Х Duroc 교배종 어미가 대리모로 사용되었다. 　발정이 확인된 대리모가 마취된 상태를 확인한 후 난관 내 이식을 실시하였다. 　마취가 깬 대리모는 회복실로 이송하여 안정을 취할 수 있도록 하였다. 임신 여부는 형질전환 난자들 이식한 날짜를 day 0으로 하여 28일째에 초음파기를 이용하여 임신낭 형성여부로 판단하였으며 임신 유지 확인을 위해 태아의 골격 및 심장박동 등을 초음파기를 이용하여 지속적으로 관찰하였다.

태어난 돼지들의 유전체에 정상적으로 Cas9 카세트가 도입되었는지　검증하기 위해 자돈의 탯줄에서 유전체 DNA를 추출하여 상기한 표 3의 프라이머(P1과 P2 및 P3과 P4)를 활용하여 상기 실시예 3에서 기술한 조건으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 한 마리(SK6)을 제외하곤 모두 Cas9 카세트의　일부 염기 서열을 ROSA26 유전좌위에 도입되어 있음을 확인하였다 (도 18).

또한, 태어난 돼지의 귀섬유아세포를 추출하여 toTomato 붉은 형광 단백질이 발현하는 것을 확인 하였다. 이를 통해 Cas9 카세트 시스템이 정상적으로 도입된 것을 확인 하였다 (도 19).

상기의 결과들은 Cas9　유전자 발현 카세트 시스템을 보유한 형질전환 돼지가 SCNT를 통해 성공적으로 생산되었으며, Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지를 제조하였음을 나타낸다.

<실시예 5. Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지의 검증>

<5-1. 유전자 발현 분석>

상기 실시예 4에서 제조된 형질전환 복제돼지에서 삽입된 tdTomato 유전자의 발현을 확인 하기 위해　형질전환 복제 돼지에서 분리된 귀 섬유아세포를 형광현미경을 통해 관찰하였으며 그 결과를 도 19에 나타내었다. 또한 Cas9 유전자의 발현을 확인 하기 위해 형질전환 복제돼지의 다양한 조직 (귀, 간, 심장, 폐, 비장, 신장, 정소, 혀, 근육, 대장, 소장, 위) 으로부터 RNA를 분리하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하였다.

구체적으로, 500 mg의 조직 샘플들을　1 ml Trizol(Invitrogen)에 넣은 후 homogenizer 를 사용하여 균질화시켰다. 제조사의 매뉴얼에 따라, 상기 조직 샘플로부터 RNA를 추출하였다. 상기 RNA 추출은 RNA extraction 키트 (Zymo Research)를 사용하였다.

추출된 RNA는 High-Capacity cDNA Reverse Transcription 키트(Applied Biosystems)에 의해 cDNA 로 합성 되었고 하기 표 4의 프라이머를 활용한 qRT-PCR 실험의 주형(template) 로 사용되었다.

qRT-PCR실험은 Cas9 유전자 발현을 측정하기 위해서 하기 표 4의 Cas9-F 및 Cas9-R 프라이머를 이용하여 최종 반응 부피가 20 ㎕으로 10μl 의2X Power SYBR Green PCR Mater mix(Thermoscientific), 1 μl 의 10 μM 프라이머, 1 μl 의 template를 사용하였고 GAPDH 유전자 발현을 측정하기 위해서 하기 표 4의 GAPDH-F 및 GAPDH-R프라이머를 이용하여 최종 반응 부피가 20 ㎕으로 10μl 의2X Power SYBR Green PCR Mater mix(Thermoscientific), 1 μl 의 10 μM 프라이머, 1 μl 의 template를 사용하였다. 상기 실시간 RT-PCR는 홀딩 스테이지에서는 95 ℃에서 15초 동안 변성; 사이클링 스테이지에서는95 ℃에서 15초 동안 변성 및 60 ℃에서 1분 어닐링하는 단계를 40 사이클 반복하였다. 멜팅 커브 스테이지에서는 95 ℃에서 15초, 60 ℃에서 1분, 95 ℃에서 15초를 수행 하였다. 　이 과정을 통해 나온 각 조직의 Cas9 CT 값 결과를 각 조직의 GAPDH의 CT값을 통해 보정하였으며 와일드 타입 귀섬유아세포에서 나온 보정된 Cas9 CT 값(DCT)를 기준으로 나머지 조직의 보정된 Cas9 CT 값(DCT)의 차를 계산함으로 Cas9의 상대적 발현량을 계산하였다. 그 결과 테스트한 모든 조직에서 Cas9 유전자의 발현을 확인 할 수 있었으며 이를 도 20에 나타내었다.

이름	프라이머 염기서열 (5'-3')
Cas9-F (서열번호 18)	AAA CAG CAG ATT CGC CTG GA
Cas9-R (서열번호 19)	TCA TCC GCT CGA TGA AGC TC
GAPDH-F (서열번호 20)	GCT ACA CTG AGG ACC AGG TTG
GAPDH-R (서열번호 21)	AGG AGA TGC TCG GTG TGT TG

<5-3. Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지의 유전자 편집능 평가>

Cas9 유전자 발현 형질전환　복제 돼지의 생체내 유전자 편집 가능성을 알아 보기 위해 SK7 돼지로부터 확보한 귀섬유아세포에, 절단 시 염기서열의 역위 (inversion)가 일어나는 것으로 알려진 ALK 및 EML4 유전자를 목표로 하는 gRNA를 도입함으로써 역위를 유도할 수 있는 지 검증하였다 (도 21). 이를 위해 ALK gRNA 및 EML4 gRNA를 SK7 돼지 유래 귀섬유아세포에 도입하였다. 도입 후 48시간 후에 세포의 유전체 DNA 를 회수하였고 하기 표 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

이름	프라이머 염기서열 (5'-3')
A (서열번호 22)	GCC CCC TCC CCA TGA ATC AT
B (서열번호 23)	TAG GGG CCA AAG TCA GCC ATC
C (서열번호 24)	GCC TTA CTC CTG CTC AAG CA
D (서열번호 25)	CCA ACA CCA CAC AGT TAG CTA G

그 결과 전기영동 결과에서 나타난 바와 같이 ALK 및 EML4 gRNA를 도입하였을 때 역위(A&D 및 B&C)및 결실(B&D) 돌연변이가 일어나 PCR 산물이 검출 된 것을 확인 하였다. 반면에 gRNA 가 도입되지 않은 경우에는 PCR 산물을 검출 할 수 없었다(도 21).

이상의 실험 결과를 통해 본 발명에 따른 Cas9 유전자 공여 재조합 벡터는 돼지의 ROSA26 유전좌위에 Cas9 유전자를 넉인 시킨다는 것을 확인하였다.

또한 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지 유래 체세포를 활용하여 유전자 편집이 가능 하다는 것을 확인한 바, 본 발명에 따른 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지는 유전자의 생체내 제어가 가능할 것으로 생각 됨으로 이를 활용하여 인간 질환 관련 유전자 연구 및 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있으며 나아가 가축의 경제 형질에 관련된 유전자 연구에도 활용할 수 있다.

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15634BP 20230926

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Claims (18)

1. 순차적으로 레프트암-SA-LoxP2272-LoxP-{Cas9-P2A-tdTomato}-LoxP-LoxP2272-FRT-{PGK-Neomycin}-FRT-라이트암의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지 제조용 재조합 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 돼지의 ROSA26 유전좌위에 도입되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
3. 제2항에 있어서, 상기 ROSA26 유전좌위는 돼지 ROSA26 유전자의 엑손 1번 및 인트론 1번의 사이인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
4. 제1항에 있어서, 상기 레프트암은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는, 재조합 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 라이트암은 서열번호 2의 염기서열로 표시되는, 재조합 벡터.
6. 제1항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터 (Campylobacter) 속 유래의 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
7. 제6항에 있어서, 상기 Cas9 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는, 재조합 벡터.
8. 제1항에 있어서, 상기 P2A 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는, 재조합 벡터.
9. 제1항에 있어서, 레프트암-SA와 Cas9 사이에 연결되는 LoxP2272-LoxP 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는, 재조합 벡터.
10. 제1항에 있어서, tdTomato 와 FRT 사이에 연결되는 LoxP2272-LoxP 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는, 재조합 벡터.
11. 제1항에 있어서, 상기 FRT 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는, 재조합 벡터.
12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된, Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포주.
14. 제13항에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 돼지 유래의 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포주.
15. 제13항의 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포주에서 채취한 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계;
    상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계; 및
    상기 대리모의 출산에 의해 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지를 수득하는 단계;를 포함하는 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지의 제조 방법.
16. 제15항의 제조 방법에 의해 제조된 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제돼지.
17. 제16항의 Cas9 유전자 발현 형질전환 복제 돼지에 가이드 RNA (gRNA)와 목표 유전자를 도입하여 목표 유전자가 발현되는 것을 특징으로 하는, 목표 유전자 발현 형질전환 복제돼지.
18. 제17항에 있어서, 상기 가이드 RNA (gRNA)는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 목표 유전자 발현 형질전환 복제돼지.