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KR20250111222A - Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles containing the same - Google Patents

Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles containing the same

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Publication number
KR20250111222A
KR20250111222A KR1020257021748A KR20257021748A KR20250111222A KR 20250111222 A KR20250111222 A KR 20250111222A KR 1020257021748 A KR1020257021748 A KR 1020257021748A KR 20257021748 A KR20257021748 A KR 20257021748A KR 20250111222 A KR20250111222 A KR 20250111222A
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KR
South Korea
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lipid
alkyl
glycero
peg
independently
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020257021748A
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Korean (ko)
Inventor
김경진
김욱일
김다영
이주영
이지은
Original Assignee
에스티팜 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은 생분해성 결합을 포함하는 신규한 이온화 가능한 지질에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 생분해성 에스터 및/또는 아마이드 결합을 포함한 이온화 가능한 지질은 지질나노입자 제조 시 음이온성 약물을 안정적으로 전달하고, 특히 핵산 전달 시 우수한 효과를 보여 지질나노입자 매개 유전자치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a novel ionizable lipid comprising a biodegradable bond. Specifically, the ionizable lipid comprising a biodegradable ester and/or amide bond of the present invention stably delivers anionic drugs when manufacturing lipid nanoparticles, and particularly shows excellent effects in nucleic acid delivery, so that it can be usefully used in related technical fields such as lipid nanoparticle-mediated gene therapy.

Description

신규 이온화 가능한 지질 및 이를 포함하는 지질나노입자 Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles containing the same

본 발명은 생분해성 결합을 포함하는 신규한 이온화 가능한 지질에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 생분해성 결합으로 에스터 및/또는 아마이드 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질, 이를 이용해 제조된 지질나노입자 및 그 용도에 관한 것이다.The present invention relates to novel ionizable lipids comprising a biodegradable bond. Specifically, the present invention relates to ionizable lipids comprising an ester and/or amide bond as a biodegradable bond, lipid nanoparticles prepared using the same, and uses thereof.

약물전달시스템 (DDS; Drug Delivery System)은 약물의 부작용을 줄이고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 기술이다. 특히, 유전자 치료에 있어서 약물 전달체로는 종래 바이러스 전달체가 효과적임이 입증되었으나, 면역원성 (immunogenicity), 주입된 DNA 크기의 한계 및 대량생산의 어려움과 같은 여러 결점으로 인해 유전자전달 시스템으로서 바이러스의 이용이 제한되고 있다. Drug Delivery System (DDS) is a technology designed to efficiently deliver the required amount of drugs while reducing the side effects of drugs and maximizing their efficacy and effectiveness. In particular, in gene therapy, conventional viral vectors have been proven to be effective as drug delivery vehicles, but the use of viruses as gene delivery systems is limited due to several drawbacks such as immunogenicity, limitations in the size of injected DNA, and difficulties in mass production.

이에, 바이러스성 시스템의 대체 수단으로서 핵산을 세포 내로 운반하는 방법으로는 현재까지 양전하 지질 또는 중합체와 섞어 운반하는 방법 (각각 지질-DNA 접합체(lipoplex) 및 폴리머-DNA 접합체(polyplex)라 명명됨)이 주로 사용되고 있다 (Hirko et al., Curr, Med, Chem., 10, 1185-1193, 2003; Merdan et al., Adv. Drug. Deliv.Rev., 54, 715-758, 2002; Spagnou et al., Biochemistry, 43, 13348-13386, 2004). 특히, 지질-DNA 접합체는 핵산과 결합하여 세포 내로 핵산을 잘 전달시켜 세포수준에서 많이 사용되고 있으나, 생체 내에서는 국부적으로 주사 시 많은 경우 체내에서 염증을 유발시키며 (Filonand and Phillips, Biochim. Biophys/Acta, 1329, 345-356, 1997), 혈관 내 주사 시 주로 1 차 통과기관들인 폐, 간, 비장 등과 같은 조직에 축적되는 단점이 있다 (Ren et al., Gene Therapy. 7, 764-768, 2000).Accordingly, as an alternative to viral systems, the method of transporting nucleic acids into cells by mixing them with positively charged lipids or polymers (respectively called lipid-DNA conjugates (lipoplex) and polymer-DNA conjugates (polyplex)) has been mainly used (Hirko et al., Curr, Med, Chem., 10, 1185-1193, 2003; Merdan et al., Adv. Drug. Deliv. Rev., 54, 715-758, 2002; Spagnou et al., Biochemistry, 43, 13348-13386, 2004). In particular, lipid-DNA conjugates are widely used at the cellular level because they bind to nucleic acids and deliver nucleic acids well into cells, but in vivo, they often cause inflammation in the body when injected locally (Filonand and Phillips, Biochim. Biophys/Acta, 1329, 345-356, 1997), and when injected intravascularly, they accumulate mainly in tissues such as the lungs, liver, and spleen, which are the first passage organs (Ren et al., Gene Therapy. 7, 764-768, 2000).

본 발명자들은 약물의 봉입률이 우수하며 목적하는 기관 또는 세포에 핵산 등 음이온성 약물을 효율적으로 전달할 수 있는 신규 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 생분해성 결합을 포함하는 신규 이온화 가능한 지질의 우수한 약물 전달 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have made extensive efforts to develop a novel material having an excellent drug encapsulation rate and capable of efficiently delivering anionic drugs such as nucleic acids to a target organ or cell, and as a result, have confirmed the excellent drug delivery effect of a novel ionizable lipid including a biodegradable bond of the present invention, thereby completing the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 구조의 생분해성 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide an ionizable lipid comprising a biodegradable bond of novel structure, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 지질나노입자를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a lipid nanoparticle comprising the ionizable lipid, a stereoisomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 지질나노입자 및 음이온성 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a drug delivery composition comprising the lipid nanoparticle and an anionic drug.

본 발명의 생분해성 결합을 포함한 이온화 가능한 지질은 지질나노입자 제조 시 음이온성 약물을 안정적으로 전달하고, 특히 핵산 전달 시 우수한 효과를 보여 지질나노입자 매개 유전자치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.The ionizable lipid including the biodegradable bond of the present invention stably delivers anionic drugs when manufacturing lipid nanoparticles, and particularly shows excellent effects in nucleic acid delivery, so that it can be usefully used in related technical fields such as lipid nanoparticle-mediated gene therapy.

발명의 실시를 위한 최선의 형태Best mode for carrying out the invention

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.This is explained specifically as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present invention can also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of various elements disclosed in the present invention fall within the scope of the present invention. In addition, the scope of the present invention cannot be considered limited by the specific description described below.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들이 연구 노력한 결과, 하기 화학식 1로 표시되는 생분해성 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질이 지질나노입자 제조 시 약물을 안정적이고 효과적으로 전달하고, 간 독성 등 부작용이 적음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.To achieve the above purpose, the inventors of the present invention have conducted research efforts and confirmed that an ionizable lipid including a biodegradable bond represented by the following chemical formula 1 stably and effectively delivers a drug and has fewer side effects such as liver toxicity when producing lipid nanoparticles, thereby completing the present invention.

생분해성 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질Ionizable lipids containing biodegradable bonds

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.One embodiment of the present invention for achieving the above object is an ionizable lipid represented by the following chemical formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

여기서, R1은 각각 독립적으로 -C1-4알킬이고,Here, R 1 is each independently -C 1-4 alkyl,

R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬, 또는 -COO-R2A이고,R 2 is independently -H, -C 1-4 alkyl, or -COO-R 2A ,

R2A는 -(CH2)-아릴, -(CH2)-헤테로아릴, -아릴, 또는 -헤테로아릴이고,R 2A is -(CH 2 )-aryl, -(CH 2 )-heteroaryl, -aryl, or -heteroaryl,

X는 -O-, -NR4-, 또는 -NR4-C1-4알킬-O(C=O)-이고,X is -O-, -NR 4 -, or -NR 4 -C 1-4 alkyl-O(C=O)-,

R3는 각각 독립적으로 -H, -C2-16알킬, 또는 -C2-16알케닐이고, R 3 is each independently -H, -C 2-16 alkyl, or -C 2-16 alkenyl,

R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬-O(C=O)-C2-16알킬, 또는 -C1-4알킬-O(C=O)-C2-16알케닐이고, 및R 4 is each independently -H, -C 1-4 alkyl-O(C=O)-C 2-16 alkyl, or -C 1-4 alkyl-O(C=O)-C 2-16 alkenyl, and

n은 0 내지 2의 정수이다.n is an integer from 0 to 2.

이에 제한되는 것은 아니나, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 구체적으로 상기 화학식 1에서, Although not limited thereto, the compound represented by the chemical formula 1 is specifically, in the chemical formula 1,

R1은 각각 독립적으로 -C1-3알킬이고,R 1 is each independently -C 1-3 alkyl,

R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, 또는 -COO-R2A이고,R 2 is independently -H, -C 1-3 alkyl, or -COO-R 2A ,

R2A는 -페닐 또는 -벤질이고,R 2A is -phenyl or -benzyl,

X는 -O-이고, 및X is -O-, and

R3는 각각 독립적으로 -H, -C4-12알킬, 또는 -C4-12알케닐일 수 있고, R 3 can each independently be -H, -C 4-12 alkyl, or -C 4-12 alkenyl,

더욱 구체적으로More specifically

R1은 모두 -CH3이고,R 1 is all -CH 3 ,

R2는 각각 독립적으로 -H, -CH3, 또는 -COO-R2A이고,R 2 is independently -H, -CH 3 , or -COO-R 2A ,

R2A는 -페닐 또는 -벤질이고,R 2A is -phenyl or -benzyl,

X는 -O-이고,X is -O-,

R3는 각각 독립적으로 -H, -C6-10알킬, 또는 -C6-10알케닐이고, 및R 3 is each independently -H, -C 6-10 alkyl, or -C 6-10 alkenyl, and

n은 1일 수 있다.n can be 1.

또한 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 구체적으로 상기 화학식 1에서, In addition, but not limited thereto, the compound represented by the chemical formula 1 is specifically, in the chemical formula 1,

R1은 각각 독립적으로 -C1-3알킬이고,R 1 is each independently -C 1-3 alkyl,

R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, 또는 -COO-R2A이고,R 2 is independently -H, -C 1-3 alkyl, or -COO-R 2A ,

R2A는 -페닐 또는 -벤질이고,R 2A is -phenyl or -benzyl,

X는 -NR4- 또는 -NR4-C1-3알킬-O(C=O)-이고,X is -NR 4 - or -NR 4 -C 1-3 alkyl-O(C=O)-,

R3는 각각 독립적으로 -H, -C4-12알킬, 또는 -C4-12알케닐이고, 및R 3 is each independently -H, -C 4-12 alkyl, or -C 4-12 alkenyl, and

R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬-O(C=O)-C6-12알킬, 또는 -C1-3알킬-O(C=O)-C6-12알케닐일 수 있고, 더욱 구체적으로 R 4 can each independently be -H, -C 1-3 alkyl-O(C=O)-C 6-12 alkyl, or -C 1-3 alkyl-O(C=O)-C 6-12 alkenyl, and more specifically

R1은 모두 -CH3이고,R 1 is all -CH 3 ,

R2는 각각 독립적으로 -H, -CH3, 또는 -COO-R2A이고,R 2 is independently -H, -CH 3 , or -COO-R 2A ,

R2A는 -페닐 또는 -벤질이고,R 2A is -phenyl or -benzyl,

X는 -NR4- 또는 -NR4-C2알킬-O(C=O)-이고,X is -NR 4 - or -NR 4 -C 2 alkyl-O(C=O)-,

R3는 각각 독립적으로 -H, -C6-10알킬, 또는 -C6-10알케닐이고, R 3 is each independently -H, -C 6-10 alkyl, or -C 6-10 alkenyl,

R4는 각각 독립적으로 -H, -C2알킬-O(C=O)-C8-10알킬, 또는 -C2알킬-O(C=O)-C8-10알케닐이고, 및R 4 is each independently -H, -C 2 alkyl-O(C=O)-C 8-10 alkyl, or -C 2 alkyl-O(C=O)-C 8-10 alkenyl, and

n은 1일 수 있다.n can be 1.

또한 본 발명의 구체예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 표 1에 기재된 화합물로부터 선택된 것일 수 있다.In addition, according to a specific example of the present invention, the compound represented by the chemical formula 1 may be selected from the compounds described in Table 1 below.

본 발명에 있어서, 용어 "알킬"은 다른 기재가 없는 한, 직쇄 또는 분지쇄의 비고리형 포화 탄화수소를 의미한다. 예를 들어, "C1-6알킬"은 탄소원자를 1 내지 6 개 포함하는 알킬을 의미할 수 있다. 본 발명에서 용어 "알케닐"은 적어도 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄의 비고리형 불포화 탄화수소를 의미하며, 구체적으로 하나 또는 두 개의 이중 결합을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 하나의 이중 결합을 포함 (예를 들어, -(CH2)p-CH=CH-(CH2)q-CH3일 수 있고, 여기서 p는 1 내지 5의 정수, q는 1 내지 11의 정수일 수 있음)하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 알킬 또는 알케닐 구조에서 단순한 치환기의 부가 등을 한 경우라도, 본 발명의 이온화 가능한 지질과 동등한 효과를 가지는 한 모두 균등 범위로 본 발명의 범주에 포함된다.In the present invention, the term "alkyl" means a straight-chain or branched-chain acyclic saturated hydrocarbon, unless otherwise specified. For example, "C 1-6 alkyl" may mean alkyl having 1 to 6 carbon atoms. The term "alkenyl" in the present invention means a straight-chain or branched-chain acyclic unsaturated hydrocarbon having at least one double bond, and may specifically contain one or two double bonds, and more specifically may contain one double bond (for example, -(CH 2 ) p -CH=CH-(CH 2 ) q -CH 3 , wherein p is an integer from 1 to 5, and q is an integer from 1 to 11), but is not limited thereto. Even in the case of addition of a simple substituent, etc. in the alkyl or alkenyl structure of the present invention, as long as it has an effect equivalent to the ionizable lipid of the present invention, it is included in the scope of the present invention to an equivalent extent.

본 발명에 있어서, 용어 "이온화 가능한 지질 (ionizable lipid)"은 용이하게 양성자화 될 수 있는 아민-함유 지질을 의미하고, 지질 유사체 (lipidoid)로도 명명된다. 상기 이온화 가능한 지질은, 주변 pH에 따라 전하상태가 변할 수 있으므로, 음이온성 약물과 정전기적 상호작용을 통하여 상기 약물이 지질나노입자 내에 높은 효율로 봉입되도록 하는 역할을 수행하며, 지질나노입자의 구조를 형성하는데 기여한다. 본 발명의 이온화 가능한 지질은 하나의 삼차 아민을 포함하는 아민 헤드에 생분해성 에스터 결합 및/또는 아마이드 결합을 포함하고 선택적으로 이중 결합을 포함하는 알킬 사슬이 결합된 형태를 갖는 것을 특징으로 하며, 핵산 전달 시 기존에 알려진 다른 이온화 가능한 지질에 비하여 생체 내에서 조직 특이성, 유전자 발현율과 같은 효능이 우수하고 약물 전달 이후 생체 내에서 쉽게 분해되어 간독성과 같은 부작용이 크지 않다는 장점을 갖는다. In the present invention, the term "ionizable lipid" means an amine-containing lipid that can be easily protonated, and is also called a lipid analogue. Since the charge state of the ionizable lipid can change depending on the surrounding pH, it plays a role in allowing the drug to be encapsulated into lipid nanoparticles with high efficiency through electrostatic interaction with an anionic drug, and contributes to forming the structure of the lipid nanoparticle. The ionizable lipid of the present invention is characterized by having a form in which an amine head including one tertiary amine is bonded to an alkyl chain including a biodegradable ester bond and/or an amide bond and optionally including a double bond, and has an advantage in that it has superior efficacy such as tissue specificity and gene expression rate in vivo when delivering nucleic acids, and is easily decomposed in vivo after drug delivery, so that side effects such as hepatotoxicity are not significant.

본 발명에 있어서, 용어 "입체 이성질체"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 입체적으로 다른 본 발명의 화합물을 의미한다. 이러한 각각의 입체 이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 다른 설명이 없는 한, 비대칭 탄소 원자와 연결되는 실선 결합 ()은 입체 중심의 절대적 배열을 나타내는 쐐기형 실선 결합 () 또는 쐐기형 점선 결합 ()을 포함할 수 있다.In the present invention, the term "stereoisomer" means a compound of the present invention having the same chemical formula or molecular formula but having different stereochemistry. Each of these stereoisomers and mixtures thereof are also included in the scope of the present invention. Unless otherwise stated, a solid bond ( ) is a wedge-shaped solid line combination representing the absolute arrangement of the stereocenter ( ) or wedge-shaped dotted line joint ( ) may be included.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 "약학적으로 허용가능한 염"의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기산 또는 무기산 부가염, 또는 염기부가염을 의미한다.The compound of formula 1 of the present invention may exist in the form of a "pharmaceutically acceptable salt". As a salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid may be useful, but is not limited thereto. The term "pharmaceutically acceptable salt" of the present invention means any organic or inorganic acid addition salt, or base addition salt of the compound, which has an effective effect that is relatively nontoxic and harmless to the patient, and the side effects due to the salt do not reduce the beneficial efficacy of the compound represented by formula 1.

산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤, 또는 아세토나이트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example, by dissolving the compound in an excess of an aqueous acid solution and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent, such as methanol, ethanol, acetone, or acetonitrile. Equimolar amounts of the compound and the acid or alcohol in water can be heated, and the mixture can then be evaporated to dryness, or the precipitated salt can be filtered off with suction.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 또는 질산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메테인설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 또는 아이오딘화수소산 등을 사용할 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.At this time, organic acids and inorganic acids can be used as the free acid, and inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, or nitric acid can be used, and organic acids such as methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, mandelic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanillic acid, or hydroiodic acid can be used, but are not limited thereto.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이때, 금속염으로는 예컨대 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조할 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다. In addition, a pharmaceutically acceptable metal salt can be prepared using a base. An alkali metal salt or an alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving a compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering out the undissolved compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, the metal salt can be prepared, for example, sodium, potassium, or calcium salts, but is not limited thereto. In addition, a corresponding silver salt can be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (e.g., silver nitrate).

생분해성 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자Lipid nanoparticles comprising ionizable lipids comprising biodegradable bonds

본 발명의 다른 하나의 양태는 상술한 화학식 1로 표시되는 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid), 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 지질나노입자이다. 본 발명의 지질나노입자는 화학식 1로 표시되는 이온화 가능한 지질을 1 종 포함하거나, 또는 2 종 이상 포함하는 것일 수 있다. 또한, 목적에 따라 본 발명 외의 이온화 가능한 지질을 추가적으로 더 포함할 수 있다.Another aspect of the present invention is a lipid nanoparticle comprising an ionizable lipid represented by the above-described chemical formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The lipid nanoparticle of the present invention may comprise one kind of ionizable lipid represented by the chemical formula 1, or two or more kinds. In addition, depending on the purpose, an ionizable lipid other than that of the present invention may be additionally included.

상기 지질나노입자는 보조 지질 (Helper lipid), 구조적 지질, 및 PEG-지질로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The above lipid nanoparticles may further include, but are not limited to, one or more selected from a helper lipid, a structural lipid, and a PEG-lipid.

상기 보조 지질은 지질나노입자 내에서 이온화 가능한 지질 및 약물이 상호 작용하여 형성된 코어를 감싸서 보호하는 역할을 수행하며, 타겟 세포의 보조 지질 이중층과 결합하여 약물의 세포 내 전달 시 세포막 통과 및 엔도좀 탈출 (endosomal escape)을 용이하게 한다. 상기 보조 지질은 지질나노입자의 융합을 촉진할 수 있는 보조 지질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예컨대, 디올레일포스파티딜에탄올아민 (dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 디스테아로일포스파티딜콜린 (distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린 (egg phosphatidylcholine, EPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모니움-프로판 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP), 포스파티딜에탄올아민 (Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate, 18-PA), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, ME 16:0 PE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DOPS), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린 (1,2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine, DUPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine, C16 Lyso PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 스핑고미엘린, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. The above auxiliary lipid plays a role in wrapping and protecting the core formed by the interaction of the ionizable lipid and the drug within the lipid nanoparticle, and combines with the auxiliary lipid bilayer of the target cell to facilitate passage through the cell membrane and endosomal escape during intracellular delivery of the drug. The above auxiliary lipid may be any auxiliary lipid capable of promoting the fusion of lipid nanoparticles, and may include, without limitation, dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), egg phosphatidylcholine (EPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), distearoylphosphatidylethanolamine. (distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP), phosphatidylethanolamine (PE), dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate (18-PA), 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ME 16:0 PE), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (POPE), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine] (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DOPS), 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC), 1,2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 18:0 diether PC), 1-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (OChemsPC), 1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine (C16 Lyso PC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, sphingomyelin, or a mixture thereof.

상기 구조적 지질은 지질나노입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노입자의 안정성을 향상시키는 역할을 한다. 상기 구조적 지질은 예컨대, 콜레스테롤, 콜레스테놀, 스피나스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 에르고스테놀, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산, 알파-토코페롤, 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The above structural lipids provide morphological rigidity to the lipid charging within the lipid nanoparticles and serve to enhance the stability of the nanoparticles by being dispersed in the core and surface of the nanoparticles. The above structural lipids may be, but are not limited to, cholesterol, cholesterolol, spinasterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, tomatidine, ursolic acid, alpha-tocopherol, or mixtures thereof.

본 발명에서 PEG-지질은 지질과 PEG가 컨쥬게이트된 형태를 지칭하는 것으로, 일측 단부에 친수성 중합체인 폴리에틸렌글리콜 중합체가 결합된 지질을 의미한다. 상기 PEG-지질은 지질나노입자 내에서 나노입자의 혈청 내 입자 안정성에 기여하며, 나노입자 간 응집을 막는 역할을 수행한다. 또한, PEG-지질은 핵산의 생체 내 전달 시 분해효소로부터 핵산을 보호하여 핵산의 체내 안정성을 강화시키며, 나노입자 내 봉입된 약물의 반감기를 증가시킬 수 있다. 상기 PEG-지질은 예컨대, PEG-세라마이드, PEG-DMG, PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE, 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, PEG-lipid refers to a form in which lipid and PEG are conjugated, and means a lipid having a polyethylene glycol polymer, which is a hydrophilic polymer, bound to one end. The PEG-lipid contributes to the stability of the nanoparticles in the serum within the lipid nanoparticles, and plays a role in preventing aggregation between nanoparticles. In addition, the PEG-lipid protects the nucleic acid from a decomposing enzyme when the nucleic acid is delivered in the body, thereby enhancing the stability of the nucleic acid in the body, and can increase the half-life of a drug encapsulated in the nanoparticle. The PEG-lipid may be, for example, PEG-ceramide, PEG-DMG, PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE, or a mixture thereof, but is not limited thereto.

구체예로서, 본 발명의 이온화 가능한 지질과 보조 지질, 구조적 지질 및 PEG-지질을 혼합하여 지질나노입자를 제조할 경우, 이온화 가능한 지질 : 보조 지질 : 구조적 지질 : PEG-지질의 몰비는 20 내지 60 : 5 내지 30 : 20 내지 60 : 1 내지 5일 수 있다. 구체적으로 상기 몰비는 30 내지 60 : 5 내지 20 : 30 내지 50 : 1 내지 2일 수 있고, 더욱 구체적으로 36.5 내지 50 : 10 내지 15 : 38.5 내지 47 : 1.5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. As a specific example, when preparing lipid nanoparticles by mixing the ionizable lipid of the present invention, the auxiliary lipid, the structural lipid, and the PEG-lipid, the molar ratio of the ionizable lipid: the auxiliary lipid: the structural lipid: the PEG-lipid may be 20 to 60:5 to 30:20 to 60:1 to 5. Specifically, the molar ratio may be 30 to 60:5 to 20:30 to 50:1 to 2, and more specifically, 36.5 to 50:10 to 15:38.5 to 47:1.5, but is not limited thereto.

본 발명의 지질나노입자는 산성 pH 조건에서 양전하를 나타내어 음전하를 나타내는 핵산 및 음이온성 약물 등의 치료제와 정전기적 상호작용을 통해 용이하게 약물과의 복합체를 형성하여 높은 효율로 음이온성 약물을 봉입할 수 있으며, 약물의 세포 내 또는 생체 내 약물 전달 조성물로서 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 지질나노입자는 핵산뿐만 아니라 음이온을 띄는 모든 형태의 약물의 전달에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 지질나노입자는 최종적으로 음이온성 약물을 추가로 포함하는 형태 (봉입된 형태)로 제조될 수 있다.The lipid nanoparticle of the present invention exhibits a positive charge under acidic pH conditions, and thus can easily form a complex with a therapeutic agent such as a nucleic acid or anionic drug exhibiting a negative charge through electrostatic interaction, thereby enabling high-efficiency encapsulation of anionic drugs, and can be used as an intracellular or in vivo drug delivery composition. Therefore, the lipid nanoparticle of the present invention can be usefully used for the delivery of not only nucleic acids but also all forms of drugs having anions. That is, the lipid nanoparticle of the present invention can be ultimately manufactured in a form (encapsulated form) additionally including an anionic drug.

본 명세서에서, "봉입 (encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입 시키기 위해 캡슐화하는 것을 말하고, 약물 봉입률 (캡슐화 효율, Encapsulation efficiency)은 제조에 사용된 전체 약물 함량에 대하여 지질나노입자 내에 봉입된 약물의 함량을 의미한다.In this specification, “encapsulation” refers to encapsulating a delivery substance to surround it and efficiently introduce it into a living body, and the encapsulation efficiency refers to the content of a drug encapsulated in a lipid nanoparticle with respect to the total drug content used in manufacturing.

상기 음이온성 약물은 핵산, 저분자 화합물, 펩타이드, 단백질, 단백질-핵산 구조체 또는 음이온성 생체고분자-약물 접합체 등일 수 있으나, 본 발명의 이온화 가능한 지질과 함께 지질나노입자를 형성하여 안정적이고 효율적으로 전달될 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.The above anionic drug may be a nucleic acid, a low molecular weight compound, a peptide, a protein, a protein-nucleic acid structure, or an anionic biopolymer-drug conjugate, but is not limited thereto, as long as it can be stably and efficiently delivered by forming a lipid nanoparticle together with the ionizable lipid of the present invention.

본 발명에서 상기 핵산은 siRNA, rRNA, DNA, 앱타머 (aptamer), mRNA, tRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, sgRNA, tracrRNA, gRNA, 리보자임 (ribozyme), PNA, DNAzyme 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the nucleic acid may be, but is not limited to, siRNA, rRNA, DNA, aptamer, mRNA, tRNA, antisense oligonucleotide, shRNA, miRNA, sgRNA, tracrRNA, gRNA, ribozyme, PNA, DNAzyme or a mixture thereof.

상기 지질나노입자에서 이온화 가능한 지질/핵산의 중량비는 1 내지 20일 수 있다. 예컨대 mRNA를 사용할 경우 이온화 가능한 지질/mRNA의 중량비는 5 내지 15일 수 있고, 구체적으로 10 내지 15, 더욱 구체적으로 12 내지 12.53일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The weight ratio of ionizable lipid/nucleic acid in the above lipid nanoparticles may be 1 to 20. For example, when mRNA is used, the weight ratio of ionizable lipid/mRNA may be 5 to 15, specifically 10 to 15, and more specifically 12 to 12.53, but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 지질나노입자는 예컨대 50 내지 180 nm의 지름 크기를 갖는 것일 수 있고, 구체적으로 70 내지 160 nm, 더욱 구체적으로 100 내지 150 nm의 지름 크기를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the lipid nanoparticle may have a diameter size of, for example, 50 to 180 nm, specifically 70 to 160 nm, and more specifically 100 to 150 nm, but is not limited thereto.

지질나노입자를 포함하는 약물 전달용 및 약학적 조성물Drug delivery and pharmaceutical compositions comprising lipid nanoparticles

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명에 따른 음이온성 약물 함유 지질나노입자를 포함하는, 약물 전달용 조성물이다.Another aspect of the present invention is a drug delivery composition comprising an anionic drug-containing lipid nanoparticle according to the present invention.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명에 따른 음이온성 약물 함유 지질나노입자를 유효성분으로 포함하는, 약학적 조성물이다.Another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition comprising an anionic drug-containing lipid nanoparticle according to the present invention as an active ingredient.

지질나노입자 및 음이온성 약물에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.For lipid nanoparticles and anionic drugs, the same is as described above.

본 발명의 지질나노입자는 핵산 등의 음이온성 약물과 안정된 복합체를 형성하고 낮은 세포독성 및 효과적인 세포 흡수성을 나타내므로, 음이온성 약물을 전달하는데 효과적이다. 따라서, 상기 지질나노입자는 사용되는 음이온성 약물의 종류, 핵산의 종류에 따라 관련 질환에 예방 또는 치료 효과를 가지며, 약물 전달용 조성물로서 제한 없는 활용 가능성이 있다.The lipid nanoparticle of the present invention forms a stable complex with anionic drugs such as nucleic acids and exhibits low cytotoxicity and effective cellular uptake, and is therefore effective in delivering anionic drugs. Accordingly, the lipid nanoparticle has a preventive or therapeutic effect on related diseases depending on the type of anionic drug and the type of nucleic acid used, and has unlimited potential for use as a drug delivery composition.

본 발명에서 용어, "치료"는 질병을 갖는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 개입하는 것을 지칭하고, 이는 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 특히, 본 발명에서는 생분해성 결합을 포함한 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 음이온성 약물을 유효성분으로 포함하는 지질나노입자의 투여로 질병의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, 용어 "예방"은 상기 지질나노입자의 투여로 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명의 지질나노입자가 치료 또는 예방 목적으로 사용될 경우, 개체에 치료학적으로 유효한 양으로 투여된다.In the present invention, the term "treatment" refers to an intervention to alter the natural course of an individual or cell having a disease, which may be performed during the progression of the pathological condition or to prevent it. The desired therapeutic effect includes preventing the occurrence or recurrence of the disease, alleviating symptoms, reducing all direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, reducing the rate of disease progression, alleviating or temporarily alleviating the disease condition, and improving the prognosis. In particular, the present invention includes all acts of improving the course of the disease by administering lipid nanoparticles comprising an ionizable lipid including a biodegradable bond, a stereoisomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and an anionic drug as active ingredients. In addition, the term "prevention" refers to all acts of inhibiting or delaying the onset of the disease by administering the lipid nanoparticles. When the lipid nanoparticles of the present invention are used for treatment or prevention purposes, they are administered to a subject in a therapeutically effective amount.

본 발명에서 사용되는 "치료학적으로 유효한 양"이라는 용어는 음이온성 약물 함유 지질나노입자의 유효한 양을 나타낸다. 구체적으로, "치료학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 시판되는 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분은 안전성이 우수하므로, 결정된 투여 용량 이상으로도 사용될 수 있다.The term "therapeutically effective amount" used in the present invention refers to an effective amount of anionic drug-containing lipid nanoparticles. Specifically, "therapeutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dosage level can be determined according to factors including the type and severity of the individual, age, sex, type of disease, activity of the drug, sensitivity to the drug, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and can be administered sequentially or simultaneously with commercially available therapeutic agents. And it can be administered singly or in multiple doses. It is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects by considering all of the above factors, and can be easily determined by those skilled in the art. The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by an expert according to various factors such as the patient's condition, age, sex, and complications. Since the effective ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention has excellent safety, it can be used in amounts exceeding the determined dosage.

상기 지질나노입자를 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 근육, 정맥, 동맥, 피하, 복강, 폐, 및 비강 주사 등으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The composition containing the above lipid nanoparticles as an active ingredient can be administered orally, intramuscularly, intravenously, intraarterially, subcutaneously, intraperitoneally, pulmonaryly, and intranasally, but is not limited thereto.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 패치제, 액제, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 좌제 등일 수 있다. 이들 제제는 당 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다. The composition of the present invention may further comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers for administration. Pharmaceutically acceptable carriers include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and mixtures of one or more of these components, and may further include other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents, as needed. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate the composition into an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, or emulsion, or into pills, capsules, granules, or tablets. Accordingly, the composition of the present invention may be a patch, a solution, a pill, a capsule, a granule, a tablet, a suppository, or the like. These preparations can be prepared by conventional methods used in formulation in the art or by methods disclosed in a literature [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA], and can be formulated into various preparations depending on each disease or ingredient.

본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.The embodiments of the present invention can be modified in various different forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below. In addition, the embodiments of the present invention are provided so that a person having average knowledge in the relevant technical field can more completely explain the present invention. Furthermore, throughout the specification, the term "including" a certain component does not exclude other components unless specifically stated to the contrary, but rather means that other components can be further included.

발명의 실시를 위한 형태Form for carrying out the invention

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples and experimental examples. However, the following examples and experimental examples are only intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited by them.

실시예 1. 생분해성 결합 포함 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid)의 제조Example 1. Preparation of ionizable lipids containing biodegradable bonds

화합물 1 내지 3의 제조방법은 하기 반응식 1과 같다.The method for preparing compounds 1 to 3 is as shown in the following reaction scheme 1.

[반응식 1][Reaction Formula 1]

실시예 1-1. 이온화 가능한 지질 (화합물 1)의 합성Example 1-1. Synthesis of ionizable lipid (compound 1)

[단계 1] Cbz-L-라이신 (1.0 g, 3.56 mmol)을 증류수 (8.92 mL, 0.4 M)에 녹이고 HCl conc. (650 μL, 6.0 eq)를 넣어주었다. 반응액의 온도를 0 ℃로 낮춘 후 37% 포름알데히드 용액 (1.32 mL, 17.84 mmol, 5.0 eq)을 넣고 NaBH4 (1.174 g, 31.0 mmol, 8.7 eq)를 거품이 넘치지 않게 넣은 후 교반하였다. NaBH4가 절반 정도 사라지면 37% 포름알데히드 용액 (1.32 mL, 17.84 mmol, 5.0 eq)을 넣고 HCl conc. (3 mL)로 pH 3.0 ~ 6.0 이내로 조정하며 6시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 종결 후 5 N NaOH (3.8 mL)를 적가하여 pH 7.0으로 조정하고, 농축 및 건조한 후 에탄올을 넣어 염화나트륨 고체를 석출 및 여과하여 제거하였다. 여액을 농축한 후 메탄올을 넣고 3 ~ 4번의 농축을 진행하여 흰색 고체의 전구체 1 (1.23 g, 3.99 mmol, 수율: quant.)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 309.1 (M+H+). [Step 1] Cbz-L-lysine (1.0 g, 3.56 mmol) was dissolved in distilled water (8.92 mL, 0.4 M) and HCl conc. (650 μL, 6.0 eq) was added. After lowering the temperature of the reaction solution to 0 ℃, a 37% formaldehyde solution (1.32 mL, 17.84 mmol, 5.0 eq) was added and NaBH 4 (1.174 g, 31.0 mmol, 8.7 eq) was added without overflowing bubbles, followed by stirring. When about half of NaBH 4 disappeared, a 37% formaldehyde solution (1.32 mL, 17.84 mmol, 5.0 eq) was added and the pH was adjusted to 3.0 to 6.0 with HCl conc. (3 mL) and the reaction was performed for 6 hours. After completion of the reaction, 5 N NaOH (3.8 mL) was added dropwise to adjust the pH to 7.0, concentrated and dried, and then ethanol was added to precipitate and remove the sodium chloride solid by filtration. After concentrating the filtrate, methanol was added, and concentration was performed 3 to 4 times to obtain precursor 1 (1.23 g, 3.99 mmol, yield: quant.) as a white solid. LC-MS (ESI, m/z) = 309.1 (M+H + ).

[단계 2] 상기 단계 1에서 수득한 전구체 1 (545 mg, 1.76 mmol) 및 (6Z,16Z)-12-((Z)-덱-4-엔-1-일)도코사-6,16-디엔-11-올 (543 mg, 1.17 mmol)을 DCM (0.3 M, 3.92 mL)에 녹이고, EDC (452 mg, 2.35 mmol) 및 DMAP (28.8 mg, 0.236 mmol)을 상온에서 넣고 4시간 동안 반응하였다. 반응액을 농축한 후 MPLC로 정제하여 투명한 오일 형태의 화합물 1 (655 mg, 0.87 mmol, 수율: 74.0%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 751.6 (M+H+). [Step 2] Precursor 1 (545 mg, 1.76 mmol) obtained in Step 1 and (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1-yl)docosa-6,16-dien-11-ol (543 mg, 1.17 mmol) were dissolved in DCM (0.3 M, 3.92 mL), EDC (452 mg, 2.35 mmol) and DMAP (28.8 mg, 0.236 mmol) were added at room temperature, and the mixture was reacted for 4 hours. The reaction solution was concentrated and purified by MPLC to obtain compound 1 (655 mg, 0.87 mmol, yield: 74.0%) as a transparent oil. LC-MS (ESI, m/z) = 751.6 (M+H + ).

실시예 1-2. 이온화 가능한 지질 (화합물 2)의 합성Example 1-2. Synthesis of ionizable lipid (compound 2)

화합물 1 (300 mg, 0.399 mmol)을 메탄올 (0.3 M, 13 mL)에 녹이고, 10% Pd/C (120 mg, 40 wt%)을 상온에서 넣고 H2 기체 하에서 밤새 반응하였다. 반응액을 셀라이트 여과 후 농축하여 투명한 오일 형태의 화합물 2 (187 mg, 0.300 mmol, 수율: 75%)를 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 623.6 (M+H+).Compound 1 (300 mg, 0.399 mmol) was dissolved in methanol (0.3 M, 13 mL), and 10% Pd/C (120 mg, 40 wt%) was added at room temperature, and the mixture was reacted overnight under H 2 gas. The reaction solution was filtered through Celite and concentrated to obtain compound 2 (187 mg, 0.300 mmol, yield: 75%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 623.6 (M+H + ).

실시예 1-3. 이온화 가능한 지질 (화합물 3)의 합성Example 1-3. Synthesis of ionizable lipid (compound 3)

화합물 2 (187 mg, 0.300 mmol)를 메탄올 (0.15 M, 2 mL)에 녹이고, 37% 포름알데히드 용액 (66.9 μL, 0.90 mmol, 3.0 eq)을 넣고 30분 동안 반응을 진행하였다. 이후 10% Pd/C (37.4 mg, 20 wt%)을 상온에서 넣고 H2 기체 하에서 밤새 반응하였다. 반응액을 셀라이트 여과 후 MPLC로 정제하여 투명한 오일 형태의 화합물 3 (150 mg, 0.23 mmol, 수율: 76.7%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 651.7 (M+H+).Compound 2 (187 mg, 0.300 mmol) was dissolved in methanol (0.15 M, 2 mL), and 37% formaldehyde solution (66.9 μL, 0.90 mmol, 3.0 eq) was added and reacted for 30 min. Then, 10% Pd/C (37.4 mg, 20 wt%) was added at room temperature, and the reaction was performed overnight under H 2 gas. The reaction solution was filtered through Celite and purified by MPLC to obtain compound 3 (150 mg, 0.23 mmol, yield: 76.7%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 651.7 (M+H + ).

화합물 4 내지 6의 제조방법은 하기 반응식 2와 같다.The method for preparing compounds 4 to 6 is as shown in the following reaction scheme 2.

[반응식 2][Reaction Formula 2]

실시예 1-4. 이온화 가능한 지질 (화합물 4)의 합성Example 1-4. Synthesis of ionizable lipid (compound 4)

[단계 1] 2-헥실데칸산 (800 mg, 3.12 mmol)을 무수 DCM (15.6 mL, 0.2 M)에 녹인 후 벤질 비스(2-히드록시에틸)카바메이트 (3.73 g, 5 eq), EDC·HCl (718 mg, 1.2 eq), DIPEA (2.18 mL, 4 eq), 및 DMAP (76 mg, 0.2 eq)을 순차적으로 적가하고 상온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응액을 DCM (50 mL)으로 희석하고 포화 NaHCO3 수용액 (50 mL)을 이용하여 총 3번 세척하였다. 세척된 유기층을 Na2SO4를 이용하여 건조시키고 여과 후 농축하였다. 농축된 잔여물을 MPLC로 정제하여 투명한 오일 형태의 전구체 2 (877 mg, 1.84 mmol, 수율: 58.8%)를 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 478.3 (M+H+). [Step 1] 2-Hexyldecanoic acid (800 mg, 3.12 mmol) was dissolved in anhydrous DCM (15.6 mL, 0.2 M), and benzyl bis(2-hydroxyethyl)carbamate (3.73 g, 5 eq), EDC·HCl (718 mg, 1.2 eq), DIPEA (2.18 mL, 4 eq), and DMAP (76 mg, 0.2 eq) were sequentially added dropwise and stirred at room temperature for 6 h. The reaction solution was diluted with DCM (50 mL) and washed three times with saturated NaHCO 3 aqueous solution (50 mL). The washed organic layer was dried over Na 2 SO 4 , filtered, and concentrated. The concentrated residue was purified by MPLC to obtain precursor 2 (877 mg, 1.84 mmol, yield: 58.8%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 478.3 (M+H + ).

[단계 2] 상기 단계 1에서 수득한 전구체 2 (877 mg, 1.84 mmol)를 무수 DCM (9.2 mL, 0.2 M)에 녹인 후 데칸산 (380 mg, 2.20 mmol), EDC·HCl (422 mg, 1.2 eq), DIPEA (1.28 mL, 4 eq), 및 DMAP (44.9 mg, 0.2 eq)을 순차적으로 적가하고, 상기 단계 1과 유사한 방법으로 진행하여 투명한 오일 형태의 전구체 3 (977.7 mg, 1.55 mmol, 수율: 84.0%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 632.5 (M+H+). [Step 2] The precursor 2 (877 mg, 1.84 mmol) obtained in Step 1 was dissolved in anhydrous DCM (9.2 mL, 0.2 M), and decanoic acid (380 mg, 2.20 mmol), EDC·HCl (422 mg, 1.2 eq), DIPEA (1.28 mL, 4 eq), and DMAP (44.9 mg, 0.2 eq) were sequentially added dropwise, and the mixture was stirred for 1 h in a similar manner to Step 1 to obtain precursor 3 (977.7 mg, 1.55 mmol, yield: 84.0%) as a transparent oil. LC-MS (ESI, m/z) = 632.5 (M+H + ).

[단계 3] 상기 단계 2에서 수득한 전구체 3 (467 mg, 0.739 mmol)을 메탄올 (4.93 mL, 0.15 M)에 녹인 후 10% Pd/C (46.7 mg, 10 wt%)를 적가하고 H2 기체 하에 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후 반응액을 셀라이트 여과하고 농축하였다. 농축된 잔여물을 MPLC로 정제하여 투명한 오일 형태의 전구체 4 (312 mg, 0.63 mmol, 수율: 85%)를 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 498.4 (M+H+). [Step 3] The precursor 3 (467 mg, 0.739 mmol) obtained in the above step 2 was dissolved in methanol (4.93 mL, 0.15 M), 10% Pd/C (46.7 mg, 10 wt%) was added dropwise, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours under H 2 gas. After completion of the reaction, the reaction solution was filtered through Celite and concentrated. The concentrated residue was purified by MPLC to obtain precursor 4 (312 mg, 0.63 mmol, yield: 85%) as a transparent oil. LC-MS (ESI, m/z) = 498.4 (M+H + ).

[단계 4] 상기 단계 3에서 수득한 전구체 4 (650 mg, 1.31 mmol)를 DCM (4.35 mL, 0.3 M)에 녹인 후 전구체 1 (604 mg, 1.96 mmol), EDC·HCl (501 mg, 2 eq), 및 DMAP (31.9 mg, 0.2 eq)을 순차적으로 적가하고, 상기 단계 1과 유사한 방법으로 진행하여 투명한 오일 형태의 화합물 4 (467 mg, 0.59 mmol, 수율: 45.4%)를 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 788.6 (M+H+). [Step 4] Precursor 4 (650 mg, 1.31 mmol) obtained in Step 3 was dissolved in DCM (4.35 mL, 0.3 M), and then precursor 1 (604 mg, 1.96 mmol), EDC·HCl (501 mg, 2 eq), and DMAP (31.9 mg, 0.2 eq) were sequentially added dropwise, and the mixture was stirred for 1 h in a similar manner to Step 1 to obtain compound 4 (467 mg, 0.59 mmol, yield: 45.4%) as a transparent oil. LC-MS (ESI, m/z) = 788.6 (M+H + ).

실시예 1-5. 이온화 가능한 지질 (화합물 5)의 합성Example 1-5. Synthesis of ionizable lipid (compound 5)

화합물 4 (414.7 mg, 0.53 mmol)를 실시예 1-2와 유사한 방법으로 진행하여 투명한 오일 형태의 화합물 5 (312 mg, 0.48 mmol, 수율: 91%)를 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 654.6 (M+H+).Compound 4 (414.7 mg, 0.53 mmol) was prepared in a similar manner to Example 1-2 to obtain compound 5 (312 mg, 0.48 mmol, yield: 91%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 654.6 (M+H + ).

실시예 1-6. 이온화 가능한 지질 (화합물 6)의 합성Example 1-6. Synthesis of ionizable lipid (compound 6)

화합물 5 (60 mg, 0.09 mmol)를 실시예 1-3과 유사한 방법으로 진행하여 투명한 오일 형태의 화합물 6 (36 mg, 0.05 mmol, 수율: 57.5%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 682.6 (M+H+).Compound 5 (60 mg, 0.09 mmol) was prepared in a similar manner to Example 1-3 to obtain compound 6 (36 mg, 0.05 mmol, yield: 57.5%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 682.6 (M+H + ).

화합물 7의 제조방법은 하기 반응식 3과 같다.The method for preparing compound 7 is as shown in the following reaction scheme 3.

[반응식 3][Reaction Formula 3]

실시예 1-7. 이온화 가능한 지질 (화합물 7)의 합성Example 1-7. Synthesis of ionizable lipid (compound 7)

[단계 1] 벤질 (2-히드록시에틸)카바메이트 (200 mg, 1.02 mmol) 및 2-헥실데칸산 (315 mg, 1.22 mmol)을 실시예 1-1의 단계 2와 유사한 방법으로 진행하여 투명한 오일 형태의 전구체 5 (336.9 mg, 0.77 mmol, 수율: 76%)를 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 434.3 (M+H+). [Step 1] Benzyl (2-hydroxyethyl)carbamate (200 mg, 1.02 mmol) and 2-hexyldecanoic acid (315 mg, 1.22 mmol) were treated in a similar manner to Step 2 of Example 1-1 to obtain precursor 5 (336.9 mg, 0.77 mmol, yield: 76%) as a transparent oil. LC-MS (ESI, m/z) = 434.3 (M+H + ).

[단계 2] 상기 단계 1에서 수득한 전구체 5 (100 mg, 0.231 mmol)를 실시예 1-2와 유사한 방법으로 진행하여 투명한 오일 형태의 전구체 6 (71.5 mg, 0.239 mmol, 수율: quant.)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 300.3 (M+H+). [Step 2] Precursor 5 (100 mg, 0.231 mmol) obtained in Step 1 was treated in a similar manner to Example 1-2 to obtain precursor 6 (71.5 mg, 0.239 mmol, yield: quant.) in the form of a transparent oil. LC-MS (ESI, m/z) = 300.3 (M+H + ).

[단계 3] 상기 단계 2에서 수득한 전구체 6 (400 mg, 1.33 mmol) 및 전구체 1 (577 mg, 1.87 mmol)을 실시예 1-1의 단계 2와 유사한 방법으로 진행하여 투명한 오일 형태의 화합물 7 (170 mg, 0.288 mmol, 수율: 21.6%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 590.3 (M+H+). [Step 3] Precursor 6 (400 mg, 1.33 mmol) and precursor 1 (577 mg, 1.87 mmol) obtained in Step 2 were treated in a similar manner to Step 2 of Example 1-1 to obtain compound 7 (170 mg, 0.288 mmol, yield: 21.6%) as a transparent oil. LC-MS (ESI, m/z) = 590.3 (M+H + ).

화합물 8의 제조방법은 하기 반응식 4와 같다.The method for preparing compound 8 is as shown in the following reaction scheme 4.

[반응식 4][Reaction Formula 4]

실시예 1-8. 이온화 가능한 지질 (화합물 8)의 합성Example 1-8. Synthesis of ionizable lipid (compound 8)

Cbz-D-라이신 (100 mg, 0.357 mmol)을 출발물질로 사용하고 실시예 1-1의 단계 1과 단계 2의 방법으로 진행하여 투명한 오일 형태의 화합물 8 (33.7 mg, 0.045 mmol, 2단계 수율: 20.75%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 751.4 (M+H+).Using Cbz-D-lysine (100 mg, 0.357 mmol) as a starting material and proceeding with steps 1 and 2 of Example 1-1, compound 8 (33.7 mg, 0.045 mmol, 2-step yield: 20.75%) was obtained as a transparent oil. LC-MS (ESI, m/z) = 751.4 (M+H + ).

화합물 9 내지 10의 제조방법은 하기 반응식 5와 같다.The method for preparing compounds 9 to 10 is as shown in the following reaction scheme 5.

[반응식 5][Reaction Formula 5]

실시예 1-9. 이온화 가능한 지질 (화합물 9)의 합성Example 1-9. Synthesis of ionizable lipid (compound 9)

화합물 1 (200 mg, 0.267 mmol)을 DCM (0.89 mL, 0.3 M)에 녹이고 반응액을 0 ℃로 낮춘 후 TMSI 용액 (1 M in DCM, 0.585 mL, 0.585 mmol)을 적가하였다. 상온으로 승온 후 2시간 동안 교반하였다. 반응액을 0 ℃로 낮춘 후 TMSI 용액 (1 M in DCM, 1.33 mL, 1.33 mmol)을 적가 후 상온으로 승온하였다. 5시간 교반 후 반응액을 0 ℃로 낮추고 메탄올 (2 mL)을 적가 후 0.5시간 동안 교반하였다. 10% Na2S2O3을 반응액이 투명해질 때까지 넣고 DCM (100 mL)으로 3번 추출하였다. 유기층을 Na2SO4를 이용하여 건조시키고 여과 후 농축하였다. 농축된 잔여물을 MPLC (아민 카트리지 사용)로 정제하여 투명한 오일 형태의 화합물 9 (116 mg, 0.188 mmol, 수율: 70%)를 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 617.3 (M+H+).Compound 1 (200 mg, 0.267 mmol) was dissolved in DCM (0.89 mL, 0.3 M) and the reaction solution was cooled to 0 °C, then TMSI solution (1 M in DCM, 0.585 mL, 0.585 mmol) was added dropwise. The mixture was warmed to room temperature and stirred for 2 hours. The reaction solution was cooled to 0 °C, TMSI solution (1 M in DCM, 1.33 mL, 1.33 mmol) was added dropwise, then the mixture was warmed to room temperature. After stirring for 5 hours, the reaction solution was cooled to 0 °C, methanol (2 mL) was added dropwise, and then stirred for 0.5 hours. 10% Na 2 S 2 O 3 was added until the reaction solution became transparent, and extracted three times with DCM (100 mL). The organic layer was dried using Na 2 SO 4 , filtered, and concentrated. The concentrated residue was purified by MPLC (using an amine cartridge) to give compound 9 (116 mg, 0.188 mmol, yield: 70%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 617.3 (M+H + ).

실시예 1-10. 이온화 가능한 지질 (화합물 10)의 합성Example 1-10. Synthesis of ionizable lipid (compound 10)

화합물 9 (106 mg, 0.172 mmol)를 메탄올 (1.71 mL, 0.1 M)에 녹이고 37% 포름알데히드 용액 (51.2 μL, 0.687 mmol)을 넣어주었다. 반응액을 상온에서 30분 동안 교반하였다. NaBH(OAc)3 (109 mg, 0.515 mmol)를 넣고 6시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 종결 후 증류수를 넣고 DCM으로 3번 추출하였다. 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 세척하였다. 세척된 유기층을 Na2SO4를 이용하여 건조시키고 여과 후 농축하였다. 농축된 잔여물을 MPLC로 정제하여 투명한 오일 형태의 화합물 10 (71 mg, 0.110 mmol, 수율: 64.1%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 645.3 (M+H+).Compound 9 (106 mg, 0.172 mmol) was dissolved in methanol (1.71 mL, 0.1 M) and 37% formaldehyde solution (51.2 μL, 0.687 mmol) was added. The reaction solution was stirred at room temperature for 30 min. NaBH(OAc) 3 (109 mg, 0.515 mmol) was added and the reaction was performed for 6 h. After the reaction was completed, distilled water was added and extracted three times with DCM. The organic layer was washed with saturated NaCl aqueous solution. The washed organic layer was dried using Na 2 SO 4 , filtered, and concentrated. The concentrated residue was purified by MPLC to obtain compound 10 (71 mg, 0.110 mmol, yield: 64.1%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 645.3 (M+H + ).

화합물 11의 제조방법은 하기 반응식 6과 같다.The method for preparing compound 11 is as shown in the following reaction scheme 6.

[반응식 6][Reaction Formula 6]

실시예 1-11. 이온화 가능한 지질 (화합물 11)의 합성Example 1-11. Synthesis of ionizable lipid (compound 11)

[단계 1] (Z)-2-((Z)-덱-4-엔-1-일)도덱-6-엔알 (1.0 g, 3.12 mmol)을 DCM (0.47 M, 6.64 mL)에 녹이고 2-메틸프로판-2-설핀아마이드 (0.567 g, 4.68 mmol) 및 티타늄(IV) 아이소프로폭사이드 (1.83 mL, 6.24 mmol)를 상온에서 넣고 밤새 반응을 진행하였다. 2-메틸프로판-2-설핀아마이드 (0.189 g, 1.56 mmol)를 추가로 넣고 4시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후 반응액을 셀라이트 여과하였다. 여과된 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 세척하였다. 세척된 유기층을 Na2SO4를 이용하여 건조시키고 여과 후 농축하였다. 농축된 잔여물을 MPLC로 정제하여 투명한 오일 형태의 전구체 8 (910.2 mg, 2.14 mmol, 수율: 68.9%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 424.4 (M+H+). [Step 1] (Z)-2-((Z)-dec-4-en-1-yl)dodec-6-enal (1.0 g, 3.12 mmol) was dissolved in DCM (0.47 M, 6.64 mL) and 2-methylpropane-2-sulfinamide (0.567 g, 4.68 mmol) and titanium (IV) isopropoxide (1.83 mL, 6.24 mmol) were added at room temperature, and the reaction was carried out overnight. 2-Methylpropane-2-sulfinamide (0.189 g, 1.56 mmol) was additionally added, and the mixture was stirred for 4 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was filtered through Celite. The filtered organic layer was washed with a saturated NaCl aqueous solution. The washed organic layer was dried using Na 2 SO 4 , filtered, and concentrated. The concentrated residue was purified by MPLC to give precursor 8 (910.2 mg, 2.14 mmol, yield: 68.9%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 424.4 (M+H + ).

[단계 2] 오븐에 건조된 3구 둥근바닥 플라스크에 마그네슘 (83 mg, 3.42 mmol, 1.59 eq)을 N2 기체 하에서 무수 THF (1.12 mL, 3.1 M)에 녹여주었다. 반응액에 DIBAL-H (453 μL, 0.453 mmol)을 25 ~ 40℃에서 넣고 10분 동안 교반하였다. (Z)-1-브로모덱-4-엔 (706 mg, 3.22 mmol)을 N2 기체 하에서 무수 THF (1.4 mL, 2.34 M)에 녹인 후 반응액의 온도를 30 ~ 34 ℃로 유지하면서 15분 동안 반응액에 천천히 적가하고 3시간 동안 반응하였다. 상기 단계 1에서 수득한 전구체 8 (910.2 mg, 2.148 mmol)을 N2 기체 하에서 무수 THF (2.75 mL,0.78 M)에 녹인 후 반응액의 온도를 10 ℃ 이하로 낮추고 15분 동안 천천히 적가하였다. 반응액을 상온으로 승온한 후 5시간 동안 반응하였다. 반응 종결 후 반응액을 10 ℃ 이하로 낮춘 후 20% NH4Cl 용액 (30 mL)을 천천히 적가하였다. 셀라이트 필터 후 MTBE (5 mL)로 3번 세척하였다. 유기층을 MTBE (12 mL)로 추출 후 15% NaCl 용액 (12 mL)으로 세척하였다. 세척된 유기층을 Na2SO4를 이용하여 건조시키고 여과 후 농축하였다. 농축된 잔여물을 MPLC로 정제하여 투명한 오일 형태의 전구체 9 (673 mg, 1.194 mmol, 수율: 55.5%)를수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 564.5 (M+H+). [Step 2] Magnesium (83 mg, 3.42 mmol, 1.59 eq) was dissolved in anhydrous THF (1.12 mL, 3.1 M) under N 2 gas in an oven-dried 3-necked round-bottom flask. DIBAL-H (453 μL, 0.453 mmol) was added to the reaction solution at 25 to 40°C and stirred for 10 minutes. (Z)-1-Bromodec-4-ene (706 mg, 3.22 mmol) was dissolved in anhydrous THF (1.4 mL, 2.34 M) under N 2 gas and slowly added dropwise to the reaction solution over 15 minutes while maintaining the temperature of the reaction solution at 30 to 34°C and reacted for 3 hours. The precursor 8 (910.2 mg, 2.148 mmol) obtained in the above step 1 was dissolved in anhydrous THF (2.75 mL, 0.78 M) under N 2 gas, and the temperature of the reaction solution was lowered to 10 ℃ or lower, and the solution was slowly added dropwise for 15 minutes. The reaction solution was warmed to room temperature and reacted for 5 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was lowered to 10 ℃ or lower, and a 20% NH 4 Cl solution (30 mL) was slowly added dropwise. The mixture was filtered through Celite and washed three times with MTBE (5 mL). The organic layer was extracted with MTBE (12 mL) and washed with 15% NaCl solution (12 mL). The washed organic layer was dried using Na 2 SO 4 , filtered, and concentrated. The concentrated residue was purified by MPLC to obtain precursor 9 (673 mg, 1.194 mmol, yield: 55.5%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 564.5 (M+H + ).

[단계 3] 상기 단계 2에서 수득한 전구체 9 (472 mg, 0.837 mmol)를 메탄올 (2.1 mL, 0.4 M)에 녹이고 HCl 용액 (4 M in dioxane, 628 μL, 2.51 mmol)을 넣어주었다. 반응액을 상온에서 3시간 교반 후 농축하였다. 농축된 잔여물을 증류수에 녹이고 포화 NaHCO3 수용액을 적가하여 pH 7.0으로 조정하였다. EA로 수층을 3번 추출 후 포화 NaCl 수용액으로 세척하였다. 세척된 유기층을 Na2SO4를 이용하여 건조시키고 여과 후 농축하였다. 농축된 잔여물을 MPLC로 정제하여 투명한 오일 형태의 전구체 10 (147 mg, 0.320 mmol, 수율: 38.2%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 460.4 (M+H+). [Step 3] The precursor 9 (472 mg, 0.837 mmol) obtained in Step 2 was dissolved in methanol (2.1 mL, 0.4 M) and HCl solution (4 M in dioxane, 628 μL, 2.51 mmol) was added. The reaction solution was stirred at room temperature for 3 hours and then concentrated. The concentrated residue was dissolved in distilled water and saturated NaHCO 3 aqueous solution was added dropwise to adjust the pH to 7.0. The aqueous layer was extracted three times with EA and washed with saturated NaCl aqueous solution. The washed organic layer was dried using Na 2 SO 4 , filtered, and concentrated. The concentrated residue was purified by MPLC to obtain precursor 10 (147 mg, 0.320 mmol, yield: 38.2%) as a clear oil. LC-MS (ESI, m/z) = 460.4 (M+H + ).

[단계 4] 상기 단계 3에서 수득한 전구체 10 (147 mg, 0.320 mmol)을 실시예 1-1의 단계 2와 유사한 방법으로 진행하여 투명한 오일 형태의 화합물 11 (104.2 mg, 0.139 mmol, 수율: 64.2%)을 수득하였다. LC-MS (ESI, m/z) = 750.5 (M+H+). [Step 4] The precursor 10 (147 mg, 0.320 mmol) obtained in Step 3 was treated in a similar manner to Step 2 of Example 1-1 to obtain compound 11 (104.2 mg, 0.139 mmol, yield: 64.2%) as a transparent oil. LC-MS (ESI, m/z) = 750.5 (M+H + ).

본 발명의 생분해성 결합 포함 이온화 가능한 지질의 구체적인 실시예 화합물 1 내지 11의 구조식 및 MS 데이터를 하기 표 2에 나타내었다.The structural formulas and MS data of specific examples of compounds 1 to 11 of the ionizable lipids containing biodegradable bonds of the present invention are shown in Table 2 below.

실시예 2. 지질나노입자의 제조Example 2. Preparation of lipid nanoparticles

본 발명의 생분해성 결합 포함 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자를 제조하였다. 구체적으로, 본 발명의 이온화 가능한 지질 (화합물 1, 2, 3, 또는 8) 및 음이온성 약물 (SARS-CoV-2 Spike mRNA)을 포함하는 지질나노입자 (이하, mRNA 봉입 LMP)의 제조방법은 하기 표 3에 따라 실시예 2-1 내지 2-2에 자세히 기재하였다.Lipid nanoparticles comprising an ionizable lipid containing a biodegradable bond of the present invention were prepared. Specifically, a method for preparing lipid nanoparticles (hereinafter, mRNA-encapsulated LMPs) comprising an ionizable lipid (compound 1, 2, 3, or 8) of the present invention and an anionic drug (SARS-CoV-2 Spike mRNA) is described in detail in Examples 2-1 to 2-2 according to Table 3 below.

실시예 2-1. mRNA가 봉입된 지질나노입자 (mRNA 봉입 LNP 1, mRNA 봉입 LNP 2, 또는 mRNA 봉입 LNP 8)의 제조Example 2-1. Preparation of mRNA-encapsulated lipid nanoparticles (mRNA-encapsulated LNP 1, mRNA-encapsulated LNP 2, or mRNA-encapsulated LNP 8)

상기 실시예 1에서 제조한 이온화 가능한 지질 (화합물 1, 화합물 2, 또는 화합물 8), 보조 지질로서 인지질 (DOPE, Avanti Polar Lipids, CAS: 4004-05-1 또는 DSPC, Avanti Polar Lipids, CAS: 816-94-4), 구조적 지질 (콜레스테롤, Sigma-aldrich, CAS: 57-88-5), 및 PEG-지질 (PEG-2000-세라마이드, Avanti Polar Lipids, CAS: 212116-78-4)을 에탄올에 50 : 10 : 38.5 : 1.5의 몰비로 용해시켜 유성상을 만들었다. mRNA를 100 mM 아세트산나트륨 완충액에 용해시켜 수성상을 제조하였다. 유성상과 수성상 및 희석을 위한 완충액 (PBS, pH 7.4)을 각각 1 : 1 : 4의 부피비로 설정하고, 12 mL/min의 유량으로 미세 유체 혼합 장치 (PNI Ignite, Precision Nanosystems, NIN0001)를 통해 혼합하여 mRNA가 봉입된 지질나노입자 (mRNA 봉입 LNP 1, mRNA 봉입 LNP 2, 또는 mRNA 봉입 LNP 8)를 제조하였다. The ionizable lipid (compound 1, compound 2, or compound 8) prepared in Example 1, a phospholipid (DOPE, Avanti Polar Lipids, CAS: 4004-05-1 or DSPC, Avanti Polar Lipids, CAS: 816-94-4) as an auxiliary lipid, a structural lipid (cholesterol, Sigma-aldrich, CAS: 57-88-5), and a PEG-lipid (PEG-2000-ceramide, Avanti Polar Lipids, CAS: 212116-78-4) were dissolved in ethanol at a molar ratio of 50:10:38.5:1.5 to prepare an oily phase. The mRNA was dissolved in 100 mM sodium acetate buffer to prepare an aqueous phase. The volume ratio of the lipid phase, aqueous phase, and buffer for dilution (PBS, pH 7.4) was set to 1:1:4, respectively, and mixed at a flow rate of 12 mL/min using a microfluidic mixing device (PNI Ignite, Precision Nanosystems, NIN0001) to produce mRNA-encapsulated lipid nanoparticles (mRNA-encapsulated LNP 1, mRNA-encapsulated LNP 2, or mRNA-encapsulated LNP 8).

실시예 2-2. mRNA가 봉입된 지질나노입자 (mRNA 봉입 LNP 3)의 제조Example 2-2. Preparation of mRNA-encapsulated lipid nanoparticles (mRNA-encapsulated LNP 3)

상기 실시예 1에서 제조한 이온화 가능한 지질 (화합물 3), 보조 지질로서 인지질 (DOPE, Avanti Polar Lipids, CAS: 4004-05-1), 구조적 지질 (콜레스테롤), 및 PEG-지질 (PEG-2000-세라마이드, Avanti Polar Lipids, CAS: 212116-78-4)을 에탄올에 36.5 : 15 : 47 : 1.5의 몰비로 용해시켜 유성상을 만들었다. mRNA를 100 mM 아세트산나트륨 완충액에 용해시켜 수성상을 제조하였다. 유성상과 수성상 및 희석을 위한 완충액 (PBS, pH 7.4)을 각각 1 : 1 : 4의 부피비로 설정하고, 12 mL/min의 유량으로 미세 유체 혼합 장치 (PNI Ignite, Precision Nanosystems, NIN0001)를 통해 혼합하여 mRNA가 봉입된 지질나노입자 (mRNA 봉입 LNP 3)를 제조하였다. The ionizable lipid (compound 3) prepared in Example 1, a phospholipid (DOPE, Avanti Polar Lipids, CAS: 4004-05-1) as an auxiliary lipid, a structural lipid (cholesterol), and a PEG-lipid (PEG-2000-ceramide, Avanti Polar Lipids, CAS: 212116-78-4) were dissolved in ethanol at a molar ratio of 36.5:15:47:1.5 to prepare an oily phase. The mRNA was dissolved in 100 mM sodium acetate buffer to prepare an aqueous phase. The lipid nanoparticles loaded with mRNA (mRNA-loaded LNP 3) were prepared by mixing the lipid phase, aqueous phase, and buffer for dilution (PBS, pH 7.4) in a volume ratio of 1:1:4 using a microfluidic mixing device (PNI Ignite, Precision Nanosystems, NIN0001) at a flow rate of 12 mL/min.

실험예 1. 지질나노입자의 물리화학적 특성 확인Experimental Example 1. Confirmation of physicochemical properties of lipid nanoparticles

지질나노입자의 입자 크기, 다분산도 (PDI, polydispersity index) 및 약물 봉입률 측정Measurement of particle size, polydispersity index (PDI), and drug loading ratio of lipid nanoparticles

본 실험예에서는 상기 실시예 2의 방법으로 제조된 mRNA (SARS-CoV-2 Spike mRNA)가 봉입된 지질나노입자의 물리화학적 특성을 확인하고자 하였다. 구체적으로, mRNA가 봉입된 지질나노입자 5 μL를 취하여 1 x PBS 완충액으로 100배 희석하였다. 희석된 샘플 약 500 μL를 일회용 큐벳 (Malvern, ZEN0040)에 넣고 Zetasizer (Malvern, Zetasizer Ultra) 크기 (Z-Average) 및 다분산도 (PDI) 값을 측정하였다. In this experimental example, the physicochemical properties of mRNA (SARS-CoV-2 Spike mRNA)-encapsulated lipid nanoparticles manufactured by the method of Example 2 were examined. Specifically, 5 μL of mRNA-encapsulated lipid nanoparticles was taken and diluted 100-fold with 1 x PBS buffer. Approximately 500 μL of the diluted sample was placed in a disposable cuvette (Malvern, ZEN0040), and the size (Z-Average) and polydispersity index (PDI) values were measured using a Zetasizer (Malvern, Zetasizer Ultra).

다음으로, Ribogreen 분석 (Quant-iT™ RiboGreen® RNA kit, Invitrogen)을 통해 상기 mRNA를 봉입한 지질나노입자의 캡슐화 효율 (약물 봉입률, %)을 측정하였다. mRNA를 봉입한 지질나노입자를 3 mL 기준 mRNA의 최종 농도가 4 ~ 7 μg/mL가 되도록 1 x TE 완충액으로 희석하여 2 mL를 만들었다. 큐벳에 희석된 지질나노입자 2 mL와 Ribogreen 시약 1 mL를 넣고 분광 형광계 (Spectrofluorometer, Jasco, FP-8350)를 이용하여 특정 파장 대역폭 (excitation: 500 nm, emission: 525 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 측정을 완료한 큐벳에 10% Triton-X 완충액 30 μL를 처리한 후 특정 파장 대역폭 (excitation: 500 nm, emission: 525 nm)에서 흡광도를 측정하였으며, 약물 봉입률 (캡슐화 효율, %)은 하기 수학식 1과 같이 계산하였다. Next, the encapsulation efficiency (drug loading rate, %) of the mRNA-encapsulated lipid nanoparticles was measured using Ribogreen analysis (Quant-iT™ RiboGreen® RNA kit, Invitrogen). The mRNA-encapsulated lipid nanoparticles were diluted with 1 x TE buffer to a final mRNA concentration of 4 to 7 μg/mL per 3 mL, to make 2 mL. 2 mL of the diluted lipid nanoparticles and 1 mL of Ribogreen reagent were added to a cuvette, and the absorbance was measured at a specific wavelength bandwidth (excitation: 500 nm, emission: 525 nm) using a spectrofluorometer (Spectrofluorometer, Jasco, FP-8350). After the measurement was completed, 30 μL of 10% Triton-X buffer was treated to the cuvette, and the absorbance was measured at a specific wavelength bandwidth (excitation: 500 nm, emission: 525 nm), and the drug encapsulation rate (encapsulation efficiency, %) was calculated using the following mathematical equation 1.

[수학식 1][Mathematical Formula 1]

약물 봉입률 (%) = (Triton LNP(+)의 형광도 - Triton LNP(-)의 형광도)/(Triton LNP(+)의 형광도) X 100Drug loading rate (%) = (Fluorescence of Triton LNP(+) - Fluorescence of Triton LNP(-))/(Fluorescence of Triton LNP(+)) X 100

각각의 결과값은 다음과 같다 (표 4).The results for each are as follows (Table 4).

실험예 2. 지질나노입자의 시험관 내 효능 확인Experimental Example 2. In vitro efficacy of lipid nanoparticles

본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자의 시험관 내 효능을 확인하기 위하여 hEPO Quantikine ELISA 키트 (R&D Systems)를 이용하여 hEPO (인간 적혈구형성인자, Human Erythropoietin) 단백질의 발현량을 측정하였다. To confirm the in vitro efficacy of lipid nanoparticles containing ionizable lipids of the present invention, the expression level of hEPO (Human Erythropoietin) protein was measured using an hEPO Quantikine ELISA kit (R&D Systems).

구체적으로, 상기 실시예 2의 방법으로 hEPO mRNA를 봉입한 지질나노입자 (mRNA 봉입 LNP 1, mRNA 봉입 LNP 3)를 형질감염시킨 HEK-293T 세포의 용해물 (lysate) 시료에 적정 농도 범위 안에 들어올 수 있도록 희석하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 희석한 시료를 100 μL 분주한 후, hEPO Conjugate 시약을 200 μL 분주하였다. 2시간 후 각 웰의 용액을 제거하고 기질 (Substrate) 시약을 200 μL씩 분주한 후, 특정 파장 (450 nm)에서 흡광도를 측정함으로써 hEPO 단백질의 발현을 확인하였다.Specifically, the lysate sample of HEK-293T cells transfected with lipid nanoparticles (mRNA-encapsulated LNP 1, mRNA-encapsulated LNP 3) encapsulating hEPO mRNA by the method of Example 2 was diluted to fall within the appropriate concentration range. 100 μL of the diluted sample was dispensed into each well of a 96-well plate, and 200 μL of the hEPO Conjugate reagent was dispensed. After 2 hours, the solution in each well was removed, 200 μL of the substrate reagent was dispensed, and the expression of the hEPO protein was confirmed by measuring the absorbance at a specific wavelength (450 nm).

그 결과, 본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자는 HEK-293T 세포에 mRNA를 효과적으로 전달하고 hEPO 단백질의 발현이 높게 나타나, 우수한 효율로 세포에 음이온성 약물을 전달할 수 있음을 확인하였다 (표 5).As a result, it was confirmed that the lipid nanoparticles containing the ionizable lipid of the present invention effectively delivered mRNA to HEK-293T cells and showed high expression of hEPO protein, thereby delivering anionic drugs to cells with excellent efficiency (Table 5).

실험예 3. 지질나노입자의 생체 내 효과 확인Experimental Example 3. Confirmation of the in vivo effects of lipid nanoparticles

실험예 3-1. 지질나노입자의 생체 내 전달 효능 확인Experimental Example 3-1. Confirmation of in vivo delivery efficacy of lipid nanoparticles

본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자의 생체 내 전달 효능을 확인하기 위하여 쥐에 hEPO mRNA를 전달한 후, 생체발광을 확인하여 hEPO 단백질의 발현량을 측정하였다.In order to confirm the in vivo delivery efficacy of lipid nanoparticles containing the ionizable lipid of the present invention, hEPO mRNA was delivered to mice, and then the expression amount of hEPO protein was measured by confirming bioluminescence.

구체적으로, 상기 실시예 2의 방법으로 hEPO mRNA를 봉입한 지질나노입자 (mRNA 봉입 LNP 1, mRNA 봉입 LNP 3)를 0.1 μg/μL 농도로 BALB/c 쥐의 근육에 주사하였다. 근육 주사 6시간 후에 50 μL의 피를 채취하여 혈장을 분리한 후, hEPO Quantikine ELISA 키트 (R&D Systems)를 이용하여 hEPO 단백질의 농도를 측정하였다. 혈장 시료를 적정 농도 범위 안에 들어올 수 있도록 희석한 후 96 웰 플레이트의 각 웰에 희석한 시료를 100 μL 분주하고, hEPO Conjugate 시약을 200 μL 분주하였다. 2시간 후 각 웰의 용액을 제거하고 기질 (Substrate) 시약을 200 μL씩 분주하여, 특정 파장 (450 nm)에서 흡광도를 측정하였다.Specifically, lipid nanoparticles (mRNA-encapsulated LNP 1, mRNA-encapsulated LNP 3) encapsulating hEPO mRNA by the method of Example 2 were injected into the muscle of BALB/c mice at a concentration of 0.1 μg/μL. Six hours after the intramuscular injection, 50 μL of blood was collected, plasma was separated, and the concentration of hEPO protein was measured using an hEPO Quantikine ELISA kit (R&D Systems). After diluting the plasma sample to fall within the appropriate concentration range, 100 μL of the diluted sample was dispensed into each well of a 96-well plate, and 200 μL of the hEPO Conjugate reagent was dispensed. After 2 hours, the solution in each well was removed, 200 μL of the substrate reagent was dispensed, and the absorbance was measured at a specific wavelength (450 nm).

그 결과, 본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자는 mRNA를 생체 내로 효과적으로 전달하여 혈액 내 hEPO 단백질이 상당 수준 검출되었으며, 우수한 효율로 생체 내에 음이온성 약물을 전달할 수 있음을 확인하였다 (표 6).As a result, it was confirmed that the lipid nanoparticles containing the ionizable lipid of the present invention effectively delivered mRNA into a living body, and a significant level of hEPO protein was detected in the blood, and anionic drugs could be delivered into a living body with excellent efficiency (Table 6).

실험예 3-2. 지질나노입자의 생체 내 분포 및 잔존 효능 확인Experimental Example 3-2. Confirmation of in vivo distribution and residual efficacy of lipid nanoparticles

본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자의 생체 내 분포 및 잔존 효능을 확인하기 위하여 쥐에 fLUC mRNA를 전달한 후, IVIS 스펙트럼 (전임상 단층 촬영 광학 이미징)을 통해 생체발광을 확인하여 fLUC (파이어플라이 루시퍼라아제, firefly Luciferase) 단백질의 발현량을 측정하였다.In order to confirm the in vivo distribution and residual efficacy of lipid nanoparticles containing ionizable lipids of the present invention, fLUC mRNA was delivered to mice, and then bioluminescence was confirmed through IVIS spectrum (preclinical tomographic optical imaging) to measure the expression level of fLUC (firefly Luciferase) protein.

구체적으로, 상기 실시예 2의 방법으로 fLUC mRNA를 봉입한 지질나노입자 (mRNA 봉입 LNP 1, mRNA 봉입 LNP 3)를 0.1 g/L의 농도로 BALB/c 쥐의 오른쪽 네갈래근에 투여하였다. 근육 주사 후 각 시간대 별로 (0.5시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 6일) 루시페린 (luciferin) 시약을 100 μL 투입한 후, IVIS 스펙트럼 장비 (IVIS Spectrum, PerkinElmer)를 이용하여 각 쥐의 생체 내 발광을 확인하였다. 총 발광 값은 지질나노입자 투여 후 6일 동안 발광을 측정하여 계산하였다 (표 7).Specifically, lipid nanoparticles (mRNA-encapsulated LNP 1, mRNA-encapsulated LNP 3) encapsulating fLUC mRNA by the method of Example 2 were administered at a concentration of 0.1 g/L into the right quadriceps muscle of BALB/c mice. After intramuscular injection, 100 μL of luciferin reagent was injected at each time point (0.5 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, and 6 days), and then the in vivo luminescence of each mouse was confirmed using IVIS Spectrum equipment (IVIS Spectrum, PerkinElmer). The total luminescence value was calculated by measuring luminescence for 6 days after lipid nanoparticle administration (Table 7).

그 결과, 본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자는 주사부위에서 최소 48시간까지 단백질을 높은 수준으로 발현하는 것을 확인하였다 As a result, it was confirmed that the lipid nanoparticles containing the ionizable lipid of the present invention expressed high levels of protein at the injection site for at least 48 hours.

이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing the technical idea or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are exemplary in all respects and not restrictive. The scope of the present invention should be interpreted as including all changes or modifications derived from the meaning and scope of the patent claims described below rather than the above detailed description and their equivalent concepts within the scope of the present invention.

Claims (15)

하기 화학식 1로 표시되는 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid), 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]

여기서, R1은 각각 독립적으로 -C1-4알킬이고,
R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬, 또는 -COO-R2A이고,
R2A는 -(CH2)-아릴, -(CH2)-헤테로아릴, -아릴, 또는 -헤테로아릴이고,
X는 -O-, -NR4-, 또는 -NR4-C1-4알킬-O(C=O)-이고,
R3는 각각 독립적으로 -H, -C2-16알킬, 또는 -C2-16알케닐이고,
R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-4알킬-O(C=O)-C2-16알킬, 또는 -C1-4알킬-O(C=O)-C2-16알케닐이고, 및
n은 0 내지 2의 정수이다.An ionizable lipid represented by the following chemical formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
[Chemical Formula 1]

Here, R 1 is each independently -C 1-4 alkyl,
R 2 is independently -H, -C 1-4 alkyl, or -COO-R 2A ,
R 2A is -(CH 2 )-aryl, -(CH 2 )-heteroaryl, -aryl, or -heteroaryl,
X is -O-, -NR 4 -, or -NR 4 -C 1-4 alkyl-O(C=O)-,
R 3 is each independently -H, -C 2-16 alkyl, or -C 2-16 alkenyl,
R 4 is each independently -H, -C 1-4 alkyl-O(C=O)-C 2-16 alkyl, or -C 1-4 alkyl-O(C=O)-C 2-16 alkenyl, and
n is an integer from 0 to 2. 제1항에 있어서,
R1은 각각 독립적으로 -C1-3알킬이고,
R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, 또는 -COO-R2A이고,
R2A는 -페닐 또는 -벤질이고,
X는 -O-이고, 및
R3는 각각 독립적으로 -H, -C4-12알킬, 또는 -C4-12알케닐인, 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.In the first paragraph,
R 1 is each independently -C 1-3 alkyl,
R 2 is independently -H, -C 1-3 alkyl, or -COO-R 2A ,
R 2A is -phenyl or -benzyl,
X is -O-, and
An ionizable lipid, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein each R 3 is independently -H, -C 4-12 alkyl, or -C 4-12 alkenyl. 제1항에 있어서,
R1은 각각 독립적으로 -C1-3알킬이고,
R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, 또는 -COO-R2A이고,
R2A는 -페닐 또는 -벤질이고,
X는 -NR4- 또는 -NR4-C1-3알킬-O(C=O)-이고,
R3는 각각 독립적으로 -H, -C4-12알킬, 또는 -C4-12알케닐이고, 및
R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬-O(C=O)-C6-12알킬, 또는 -C1-3알킬-O(C=O)-C6-12알케닐인, 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.In the first paragraph,
R 1 is each independently -C 1-3 alkyl,
R 2 is independently -H, -C 1-3 alkyl, or -COO-R 2A ,
R 2A is -phenyl or -benzyl,
X is -NR 4 - or -NR 4 -C 1-3 alkyl-O(C=O)-,
R 3 is each independently -H, -C 4-12 alkyl, or -C 4-12 alkenyl, and
An ionizable lipid, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein each R 4 is independently -H, -C 1-3 alkyl-O(C=O)-C 6-12 alkyl, or -C 1-3 alkyl-O(C=O)-C 6-12 alkenyl. 제1항에 있어서,
상기 이온화 가능한 지질은 하기 표에 기재된 화합물 1 내지 화합물 11로부터 선택되는, 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:

.In the first paragraph,
The ionizable lipid is an ionizable lipid selected from compounds 1 to 11 described in the table below, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid), 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 지질나노입자.A lipid nanoparticle comprising an ionizable lipid according to any one of claims 1 to 4, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제5항에 있어서, 상기 지질나노입자는 보조 지질, 구조적 지질, 및 PEG-지질로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는, 지질나노입자.In claim 5, the lipid nanoparticle further comprises at least one selected from an auxiliary lipid, a structural lipid, and a PEG-lipid. 제6항에 있어서, 상기 보조 지질은 DOPE, DSPC, POPC, EPC, DOPC, DPPC, DOPG, DPPG, DSPE. DOTAP, 포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, POPE, DOPS, DLPC, DMPC, DUPC, 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 및 스핑고미엘린으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자.In the 6th paragraph, the auxiliary lipid is DOPE, DSPC, POPC, EPC, DOPC, DPPC, DOPG, DPPG, DSPE. DOTAP, phosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate, 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE, DOPS, DLPC, DMPC, DUPC, 1,2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, A lipid nanoparticle, wherein the lipid nanoparticle is at least one selected from 1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, and sphingomyelin. 제6항에 있어서, 상기 구조적 지질은 콜레스테롤, 콜레스테놀, 스피나스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 에르고스테놀, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산 및 알파-토코페롤로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자.A lipid nanoparticle in claim 6, wherein the structural lipid is at least one selected from cholesterol, cholesterolol, spinasterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, tomatidine, ursolic acid, and alpha-tocopherol. 제6항에 있어서, 상기 PEG-지질은 PEG-세라마이드, PEG-DMG, PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC 및 PEG-DSPE로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자. A lipid nanoparticle in claim 6, wherein the PEG-lipid is at least one selected from PEG-ceramide, PEG-DMG, PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, and PEG-DSPE. 제6항에 있어서, 상기 지질나노입자는 이온화 가능한 지질 : 보조 지질 : 구조적 지질 : PEG-지질을 20 내지 60 : 5 내지 30 : 20 내지 60 : 1 내지 5의 몰 비로 포함하는, 지질나노입자.In claim 6, the lipid nanoparticle comprises ionizable lipid: auxiliary lipid: structural lipid: PEG-lipid in a molar ratio of 20 to 60: 5 to 30: 20 to 60: 1 to 5. 제6항에 있어서, 상기 지질나노입자는 음이온성 약물을 추가로 포함하는 지질나노입자.In claim 6, the lipid nanoparticle further comprises an anionic drug. 제11항에 있어서, 상기 음이온성 약물은 핵산, 저분자 화합물, 펩타이드, 단백질, 단백질-핵산 구조체, 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자.A lipid nanoparticle in claim 11, wherein the anionic drug is at least one selected from a nucleic acid, a low molecular weight compound, a peptide, a protein, a protein-nucleic acid structure, and an anionic biopolymer-drug conjugate. 제12항에 있어서, 상기 핵산은 siRNA, rRNA, DNA, 앱타머 (aptamer), mRNA, tRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, sgRNA, tracrRNA, gRNA, 리보자임 (ribozyme), PNA, 및 DNAzyme로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자.A lipid nanoparticle in claim 12, wherein the nucleic acid is at least one selected from siRNA, rRNA, DNA, aptamer, mRNA, tRNA, antisense oligonucleotide, shRNA, miRNA, sgRNA, tracrRNA, gRNA, ribozyme, PNA, and DNAzyme. 제13항에 있어서, 상기 지질나노입자에서 이온화 가능한 지질/핵산의 중량비는 1 내지 20인, 지질나노입자.In claim 13, a lipid nanoparticle having a weight ratio of ionizable lipid/nucleic acid in the lipid nanoparticle of 1 to 20. 제11항에 따른 지질나노입자를 포함하는, 약물 전달용 조성물.A composition for drug delivery comprising a lipid nanoparticle according to claim 11.
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