[go: up one dir, main page]

PL182459B1 - Sposób indukowania u roślin odporności na patogeny - Google Patents

Sposób indukowania u roślin odporności na patogeny

Info

Publication number
PL182459B1
PL182459B1 PL96323823A PL32382396A PL182459B1 PL 182459 B1 PL182459 B1 PL 182459B1 PL 96323823 A PL96323823 A PL 96323823A PL 32382396 A PL32382396 A PL 32382396A PL 182459 B1 PL182459 B1 PL 182459B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
polypeptide
gly
hypersensitive
leu
Prior art date
Application number
PL96323823A
Other languages
English (en)
Other versions
PL323823A1 (en
Inventor
Zhong-Min Wei
Steven V. Beer
Original Assignee
Cornell Res Foundation Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cornell Res Foundation Inc filed Critical Cornell Res Foundation Inc
Publication of PL323823A1 publication Critical patent/PL323823A1/xx
Publication of PL182459B1 publication Critical patent/PL182459B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/27—Erwinia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N61/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing substances of unknown or undetermined composition, e.g. substances characterised only by the mode of action
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/80—Elimination or reduction of contamination by undersired ferments, e.g. aseptic cultivation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/847—Erwinia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

1. Sposób indukowania u roslin odpornosci na patogeny, znamienny tym, ze otrzymuje sie polipeptyd lub bialko, w postaci niezakaznej, wyzwalajace reakcje hipersensytywna, od- powiadajace polipeptydowi lub bialku, pochodzacym od lub bedacym analogiem patogenu z Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solancea- rum, Xanthomonas campestris oraz ich mieszaniny, nastepnie polipeptyd lub bialko przyklada sie do rosliny, wyzwalajac reakcje hipersensytywna. 28. Komórka roslinna odporna na patogen, znamienna tym, ze weszla w kontakt z nie zakaznym polipeptydem lub bialkiem, wyzwalajacym reakcje hipersensytywna, odpowia- dajacym polipeptydowi lub bialku, pochodzacym od lub bedacym analogiem patogenu nalezacego do grupy obejmujacej Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solancearum, Xanthomonas campestris oraz ich mieszaniny. 46. Kompozycja do nadawania roslinom odpornosci przeciwko patogenowi, znamien- na tym, ze jako czynnik aktywny zawiera niezakazny polipeptyd lub bialko, wyzwalajacy re- akcje hipersensytywna, odpowiadajacym polipeptydowi lub bialku, pochodzacym od lub bedacym analogiem patogenu z Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas sy- ringae, Pseudomonas solancearum, Xanthomonas campestris oraz ich mieszaniny i nosnik. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nadawanie roślinom odporności indukowanej przez hipersensytywną reakcję. Organizmy żywe rozwinęły złożony zespół procesów biochemicznych, które umożliwiają im rozpoznawanie i odpowiadanie na sygnały płynące z otoczenia. W procesach tych biorąudział organy receptorowe, hormony, wtórne przekaźniki informacji oraz modyfikacje enzymatyczne. Obecnie niewiele jest wiadomo o ścieżkach przekaźnictwa sygnałowego, które aktywowane sąprzez reakcję rośliny na atak patogenu, chociaż taka wiedza jest szczególnie ważna dla zrozumienia podatności i odporności roślin na choroby. Powszechną formą odporności roślin jest ograniczenie rozprzestrzeniania się patogenu do małego obszaru otaczającego centrum infekcji. W wielu przypadkach takiemu ograniczeniu towarzyszy lokalne zamieranie (na przykład nekroza) tkanek gospodarza. Reakcję hipersensytywną charakteryzują łącznie: ograniczenie patogenu i miejscowa nekroza tkanek. Oprócz miejscowych reakcji obronnych wiele roślin reaguje na infekcję przez aktywowanie mechanizmów obronnych w niezakażonych częściach rośliny. W wyniku tego cała roślina staje się bardziej odporna na infekcje wtórne. Taka nabyta odporność systemowa może trwać szereg tygodni, a nawet dłużej (R.E.F. Matthews, Plant Virology (Academic Press, New York, wydanie 2,1981)) i często nadaje odporność krzyżową na patogeny mespokrewnione (J. Kuc, w Innovative Approaches to Plant Disease Control, I. Chet, wydawnictwo (Wiley, New York, 1987), strony 255-274, podane tu w bibliografii jako odnośnik).
Ekspresja nabytej odporności systemicznej związana jest z faktem, że normalnie zjadliwe patogeny nie mogą zaatakować uodpornionych tkanek (Kuc, J., „Induced Immunity to Plant Disease”, Bioscience, 32:859-856 (1992), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Uzyskanie nabytej odporności systemicznej związane jest z ogólnoustrojowymi przyrostami ściany komórkowej w poziomach hydroksyprolinowych oraz aktywnością peroksydazy (Smith, J.A., i wsp., „Comparative Study of Acidic Peroxidases Associated with Induced Resistance in Cucumber, Muskmelon, and Watermelon”, Physiol. Mol. Plant Pathol. 19:329-338 (1988), włączone tu do bibliografii jako odnośnik) oraz z ekspresją zespołu dziewięciu rodzin tak zwanego genu nabytej odporności systemicznej (Ward, E.R., i wsp., „Coordinate Gene Activity in Response to Agents that Induce Systemie Acquired Resistance”, Plant Celi, 3: 99-59 (1991), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Pięć z tych rodzin genowych obronnych koduje związane z patogenezą białka, których funkcje fizjologiczne nie zostały jeszcze ustalone. Jednakże niektóre z tych białek wykazują in vitro aktywność przeciwgrzybiczną (Boi, J.F., i wsp., „Plant Pathogenesis-Related Proteins Induced by Virus Infection”, Ann. Rev. Phytopathol., 28:113-38 (1990), włączone tu do bibliografii jako odnośnik) oraz konstytutywna ekspersja genu kodującego chitynazę z fasoli w transgenicznym tytoniu chroni przed infekcjąprzez grzyb Rhizoctoniasolani (Broglie, K., i wsp., „Transgenic Plants with Enhanced Resistance to the Fungal Pathogen Rhizoctonia Solani”, Science, 259:1199-1197 (1991), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Powyższe obserwacje sugerują, że białka nabytej odporności systemicznej mogąprzyczymć się do stanu uodpornienia (Uknes, S, i wsp., „Acquired Resistance in Arabidopsis”, Plant Celi 4:654-656 (1992), włączone tu do bibliografii jako odnośnik).
Wydaje się, że kwas salicylowy pełni pewną funkcję sygnałową w indukcji nabytej odporności sygnałowej, ponieważ po immumzacji wzrastają poziomy endogeniczne (Malamy, J., i wsp., „Salicylic Acid: A Likely Endogeneous Signal in the Resistance Response of Tobacco to Viral Infection”, Science 250:1002-1009(1990), włączone tu do bibliografii jako odnośnik), a egzogeniczny salicylan indukuje geny nabytej odporności systemicznej (Yalpini, N., i wsp., „Sa
182 459 licylic Acid is a Systemie Signal and an Inducer of Pathogenesis-Related Proteins in Virus-Infected Tobacco”, Plant Celi 3:809-818 (1991); włączone tu do bibliografii jako odnośnik), oraz odporność nabytą(Uknes, S., i wsp., „Acquired Resistance in Arabidopsis, Plant Celi 9:695-656 (1992), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Co więcej, transgeniczne rośliny tytoniu, w których salicylan jest niszczony przez działanie przeniesionego genu bakteryjnego kodującego hydroksylazę salicylanową, nie wykazuje nabytej odporności systemicznej (Gaffney, T., i wsp., „Reąuirement of Salicylic Acid for the Induction of Systemie Acąuired Resistance” Science 261:759-296 (1993), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Jednakże wspomniany efekt może odzwierciedlać hamowanie raczej lokalnej niż systemicznej funkcji sygnałowej, a szczegółowa analiza kinetyki transmisji sygnału w ogórku sugeruje, że salicylan może nie mieć istotnego wpływu na przekazywania sygnałów na większe odległości (Rasmussen, J.B., i wsp. „Systemie Induction of Salicylic Acid Accumulation in Cucumber after Inoculation with Pseudomonas Syringaepv. Syringae”, Plant Physiol. 97:1392-1397) (1991), włączone tu do bibliografii jako odnośnik).
Immunizacja wykorzystująca środki biotyczne została zbadana bardzo obszernie. Zielone ziarna fasoli poddawano systematycznie immunizacji przeciwko chorobie wywoływanej przez patogeniczne dla kultywarów odmiany Colletotrichum lindemuthianum przez uprzednią infekcję za pomocą albo odmian niepatogenicznych dla kultywarów (Rahe, J.E., „Induced Resistance inPhaseolus vulgaris to Bean Anthracnose”, Phytopathology 59-1641-5 (1969); Elliston, J. i wsp. „Induced Resistance to Anthracnose at a Distance from the Site of the Inducing Interaction”, Phytopathology 61:1110-12(1971); Skipp, R. i wsp., „Studies on Cross Protection in the Anthracnose Disease ofBean”, Physiological Plant Pathology 3:299-313 (1973), włączone tu do bibliografii jako odnośnik), odmiany patogeniczne dla kultywarów osłabiane przez działanie ciepła w tkance gospodarza przed pojawieniem się objawów (Rahe, J.E. i wsp., „Metabolic Naturę of the Infection-Limiting Effect of Heat on Bean Anthracnose”, Phytopathology 60:1005-9 (1970), włączone tu do bibliografii), lub odmiany nie będące patogenami fasoli. Grzybowy patogen ogórka, Colletotrichum lagenarium, okazał się równie skuteczny, jak odmiany niepatogeniczne, jako środek indukujący ochronę systemiczną przed zakażeniem wszystkimi odmianami mączlika fasoli. Ochrona była indukowana przez C. lagenarium w kultywarach odpornych na jedną lub więcej odmian C. lindemuthianum, jak również w kultywarach podatnych na wszystkie podane odmiany grzyba, co odpowiednio oznaczono jako „brak odporności genetycznej” na patogen (Elhston, J. i wsp., „Protection ofBean Against Anthracnose by Colletotrichum Species Nonpathogenic on Bean”, Phytopathologische Zeitschrift 86:117-26 (1976); Elliston, J, i wsp., „A Comparative Study on the Development of Compatible, Incompatible and Induced Incompatible Interactions Between Collectotrichum Species and Phaseolus Yulgaris ”, Phytopathologische Zeitschrift 87:289-303 (1976), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Wyniki te sugerują, że te same mechanizmy mogą być indukowane w kultywarach określonych jako „posiadające” lub „nieposiadające” geny odpornościowe (Elliston, J. i wsp., „Relation of Phytoalexin Accumulation to Local and Systemie Protection ofBean Against Anthracnose”, Phytopathologisthe Zeitschrift 88:114-30 (1977), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Jest także widoczne, że kultywary podatne na wszystkie rasy C. lindemuthianum nie wykazują braku genów biorących udział w mechanizmach odpornościowych przeciwko patogenom.
Kuc, J. i wsp., w „Protection of Cucnmber Against Colletotrichum lagenarium by Colletorichum lagenarium ”, Physiological Plant Pathology 7:195-9 (1975), włączonej tu do bibliografii jako odnośnik, wykazali, że rośliny ogórka powinny być systemicznie chronione przed chorobami powodowanymi przez Colletotrichum lagenarium drogą uprzedniego szczepienia liściem lub pierwszych prawdziwych liści tymi samymi grzybami. W związku z tym, ogórki były chronione systemicznie przed grzybami, bakteriami i chorobami wirusowymi drogą uprzedniej zlokalizowanej infekcji grzybami, bakteriami lub wirusami (Hammerschmidt, R. i wsp., „Protection of Cucumbers Against Colletotrichum Lagenarium i Cladosporium Cucumerinum ”, Phytopathology 66:790-3 (7.976); Jenns, A.E. i wsp., Localized infection with Tobacco Necrosis Virus Protects Against Colletotrichum Lagenarium”, Physiological Plant Pathology 11:207-2 (1977);
182 459
Caruso, F.K. i wsp., „Induced Resistance of Cucumber to Anthracnose and Angular Leaf Spot by Pseudomonas Lachrymans and Colletotrichum lagenarium, Physiological Plant Pathology 19:191-201 (1979); Staub, T. i wsp., „Systemie Protection of Cucumber Plants Against Disease Causedby Clado.sporium Cucumerinum and Colletotrichum Lagenarium by Prior Localized Infection with either Fungus”, Physiological Plant Pathology, 17:389-93 (1980); Bergstrom, G.C. i wsp., „Effects of Local Infection of Cucumber by Colletotrichum Lagenarium, Pseudomonas Lachrymans or Tobacco Necrosis Virus on Systemie Resistance to Cucumber Mosaic Virus”, Phytopathology 72:922-6 (1982) Gessler, C. i wsp., „Induction of Resistance to Fusarium Wilt in Cucumber by Root and Foliar Pathogens”, Phytopathology 72:1439-41 (1982) Basham, B. i wsp., „Tobacco Necrosis Virus Induces Systemie Resistance in Cucumbers Against Sphaerothec&Fuliginea , Physiological Plant Pathology 23:137-44 (1983), włączone tu do bibliografii jako odnośniki. Niespecyficzna ochrona indukowana przez infekcję za pomocą C. lagenarium lub wirusa obumierania tytoniu była skuteczna przeciwko co najmniej 13 patogenom, włącznie z obligatoryjnymi i fakultatywnymi grzybami pasożytniczymi, obrażeniami lokalnymi i wirusami systemicznymi, grzybami powodującymi więdnięcie oraz bakteriami. Podobnie indukowana i skuteczna była ochrona przed patogenami korzeni. Inne rośliny ogórkowe, włącznie z arbuzem i melonem, były chronione systemicznie przeciwko C. Lagenarium (Caruso F.L. i wsp., „Pratection of Watermelon and Muskmelon Against Colletotrichum Lagenarium by Colletotrichum lagenarium, Phytopathology 67:1285-9 (1977), włączone tu do bibliografii jako odnośnik).
Ochrona systemiczna w tytoniu indukowana była także przeciwko szeregowi chorób (Kuc J. i wsp., „Immunization for Disease Resistance in Tobacco”, Recent Advances in Tobacco Science 9:179-213 (1983), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Obrażenia nekrotyczne spowodowane przez wirus choroby mozaikowej tytoniu zwiększały odporność w górnych liściach na chorobę wywoływaną przez wirus (Ross A.F. i wsp., „Systemie Acquired Resistance Induced by Localized Virus Infections in Plants”, Virology 19:390-58 (1961); Ross A.F. i wsp., „Systemie Effects of Local. Lesion Formation” w: Viruses of Plants, strony 127-50 (1966), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Phytophora parasitica var. nicotianae, P. tabacina i Pseudomonas tabaci oraz zmniejszona reprodukcja mszycy Myzus persicae (Mclntyte J.L. i wsp., „Induction of Localized and Systemie Protection Against Phytophora Parasitica var, nicotianae by Tobacco Mosaic Virus Infection of Tobacco Hypersensitive to the Virus”, Physiological Plant Pathology 15:321-30(1979); Mclntyre J.L. i wsp. „Effects of Localized Infections of Nicotiana Tabacum by Tobacco Mosaic Virus on Systemie Resistance Against Diverse Pathogens and an Insecf’, (Phytopathology 71:297-301 (1981), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Naciek zabitych na gorąco P tabaci (Lovrekovich L. i wsp., „Induced Reaction Against Wildfire Disease in Tobacco Leaves Treated with Heat-killed Bacteria”, Naturę 705:823-4 (1965), włączone tu do bibliografii jako odnośnik) oraz Pseudomonas solanacearum (Sequeira L. i wsp., „Interaction of Bacteria and Host Celt Walls: Its Relation to Mechanisms of Induced Resistance”, Physiological Plant Pathology 10:93-50 (1977), włączone tu do bibliografii jako odnośnik), do liści tytoniu indukował odporność przeciwko tym samym bakteriom, które były stosowane do wprowadzenia. Rośliny tytoniu były chronione przeciwko P parasitica var. nicotiana także przez nicieniowate Pratylenchus penetrans (Mclntyre J.L. i wsp., „Protection of Tobacco Against Phytophthora Parasitica Var Nicotianae by Cuitivar-Nonpathogenic Races, Cell-Free Sonicates and Pratyienchus Penetrans”, Phytopathology 68:235-9 (1978), włączona tu do bibliografii jako odnośnik).
Cruikshank I.A.M. i wsp., „The Effect of Stern Infestation of Tobacco with Peronospora Tabacina Adam on Foliage Reaction to Blue Mould”, Journal od the Australian Institute of Agricultural Science 26:369-72 (1960), włączone tu do bibliografii jako odnośnik, po raz pierwszy opisał immunizację liści tytoniu przeciwko pleśni (blue mould) (na przykład P tabacina) przez wstrzykiwanie do korzeni grzybów, co powodowało także karłowacenie i przedwczesne starzenie. Ostatnio odkryto, że wstrzyknięcie do drewna nie tylko zmniejszało zahamowanie wzrostu, lecz także promowało wzrost i rozwój. Uodpornione rośliny tytoniu, zarówno w doświadczeniach w szklarni, jak na polu, były w przybliżeniu o 90% wyższe, miały 40% przyrostu suchej
182 459 masy, 30% przyrostu świeżej masy oraz 9-6 więcej liści niż rośliny kontrolne (Tuzun S. i wsp., „The Effect od Stern Injections with Peronospora Tabacina and Metalaxyl Treatment Against Blue Mould in the Field”, Phytopathology 79:809 (1989), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Rośliny te zakwitały w przybliżeniu o 2-3 tygodnie wcześniej niż rośliny kontrolne (Tuzun S. i wsp., „Movement of a Factor in Tobacco Infected with Peronospora Tabacina Adam which Systemically Protects Against Blue Mould”, Physiological Plant Pathology 2H:321-30 (1985), włączone tu do bibliografii jako odnośnik).
Ochrona systemowa nie nadaje całkowitej odporności przeciwko infekcji, lecz zmniejsza ostrość choroby i opóźnia pojawianie się objawów. Liczba obrażeń, wielkość obrażeń oraz stopień wytwarzania zarodników patogenów grzybowych, wszystko to ulegało zmniejszeniu. Obszar dotknięty chorobą może ulec zmniejszeniu o ponad 90%.
Gdy ogórki poddawano szczepieniu dawką przypominającą 3-6 tygodni po szczepieniu początkowym, to uodpornienie indukowane przez C. layenarium trwało przez czas kwitnienia i owocowania (Kuc J. i wsp., „Aspects of the Protection of Cucumber Against Colletotrichum Lagenarium by Colletotrichum Lagenarium , Phytopathology 67:533-6 (1977), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Ochrona nie mogła być indukowana, gdy rośliny wydały już owoce. Rośliny tytoniu poddawano uodpornieniu w okresie wzrostu przez wstrzyknięcie do łodygi zarodni P. tabacina. Jednakże dla zapobieżenia systemicznemu rozwojowi pleśni (blue mould), technika ta była skuteczna tylko wtedy, gdy rośliny miały wysokość ponad 20 cm.
Usunięcie liści induktora z uodpornionych roślin ogórka nie zmniejszyło poziomu odporności istniejących wcześniej, rozwiniętych liści. Jednakże liście, które następnie wyłaniały się z pączków szczytowych, były stopniowo coraz mniej chronione niż ich poprzednicy, (Dean R.A i wsp., „Induced Systemie Protection in Cucumber: Time of Production and Movement of the „Signal”, Pathology 76:966-70 (1986), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Podobne wyniki podał Ross A.F. „Systemie Effects of Local Lesion Formation”, w: Viruses of Plants, strony 127-50 (1966), włączone tu do bibliografii jako odnośnik, z tytoniem (jako gospodarzem lokalnego obrażenia) uodpornionym przeciwko wirusowi mozaikowej choroby tytoniu. Przeciwnie nowe liście, które pojawiły się z odrośli wyciętych z roślin tytoniu uodpornionych przez zastrzyk P. tabacina do łodygi, były silnie chronione (Tuzun S. i wsp., „Transfer of Induced Resistance in Tabacco to Blue Mould (Peronospora Tabacina Adam.) Via Callus”, Phytopathology 75:1304 (1985), włączone tu do bibliografii jako odnośnik). Rośliny regenerowane drogą hodowli tkanek z liści roślin uodpornionych wykazywały znaczną redukcję pleśni (blue mould) w porównaniu z roślinami regenerowanymi z liści nieuodpomionych roślin rodzicielskich. Młode zregenerowane rośliny wykazywały tylko zmniejszone wydzielanie zarodników. U roślin dojrzałych, zarówno rozwój obrażenia, jak i wydzielanie zarodników, były mniejsze. Inni badacze nie doszli jednak do tych samych wniosków, chociaż doniesiono o znacznym zmniejszeniu wydzielania się zarodników w jednym doświadczeniu (Lucas J.A, i wsp., „Nontransmissibility to Regenerants Erom Protected Tabacco Explants of Induced Resistance to Peronospora Hyoscyami, Phytopathology 75:1222-5 (1985), włączone tu do bibliografii jako odnośnik).
Ochrona ogórków i arbuzów jest skuteczna zarówno w szklarni, jak i na polu (Caruso F.L, i wsp. „Field Protection of Cucumber Against Colletotrichum Lagenarium by C. Lagenarium”, Phytopathology 67:1290-2 (1977), włączone tu do bibliografii jako odnośnik. W jednej próbie cały obszar obrażenia C. lagenarium na chronionych ogórkach był mniejszy niż 2% powierzchni obrażenia na niechronionych roślinach kontrolnych. Podobnie tylko 1 z 66 chronionych roślin zginęła, natomiast niechronionych arbuzów zginęło 47 z 69. W obszernych doświadczeniach potowych w Kentucky i Puerto Rico wstrzykiwanie zarodni P. tabacina do łodygi tytoniu było co najmniej tak samo skuteczne do kontroli pleśni (blue mould); jak przy stosowaniu najlepszego fungicydu, metalaksylu. Rośliny były chronione w 95-99%, w oparciu o obumarły obszar i stopień wydzielania się zarodników, co prowadzi do 10-25% wzrostu wydajności leczonego tytoniu.
Indukowana odporność przeciwko bakteriom i wirusom wydaje się polegać na tłumieniu objawów choroby lub rozmnażania się patogenu, albo obydwu tych czynników (Caruso F.L. i wsp. „Induced Resistance of Cucumber to Anthracnose and Angular Leaf Spot by Pseudomonas
182 459
Lachrymans and Colletotrichum Lagenarium”, Physiological Plant Pathology 14:191-201 (1979); Doss M, i wsp. „Systemie Acquired Resistance of Cucumber to Pseudomonas Lachrytnans as Espressed in Suppresion of Symptoms, but not in Multiplication of Bacteria”. Acta Phytopathologia Academiae Scientarum Hungaricae 16:(3-4), 269-72 (1981); Jenns A.E. i wsp., „Non-specific Resistance to Pathogens Induced Systemically by Local Infection of Cucumber with Tabacco Necrosis Vurus, Colletotrichum Lagenarium ot Pseudomonas Lachrymans ”, Phytopathologia Mediterranea 18:129-34 (1979), włączone tu do bibliografii jako odnośniki).
Jak opisano wyżej, badania dotyczące nabytej odporności systemicznej obejmują infekowanie roślin patogenami zakaźnymi. Jakkolwiek badania w tej dziedzinie są użyteczne do zrozumienia, w jaki sposób działa nabyta odporność systemowa, to nadawanie takiej odporności za pomocą środków zakaźnych nie jest handlowo użyteczne, ponieważ taki kontakt roślina-patogen może osłabić lub zabić rośliny. Zadaniem niniejszego wynalazkujest przezwyciężenie tej niedogodności.
Przedmiotem wynalazkujest sposób nadawania roślinom odporności na patogeny. Sposób ten obejmuje nanoszenie na rośliny polipeptydu lub białka, wywołujących hipersensytywnąreakcję, w postaci niezakaźnej w warunkach, w których polipeptyd lub białko stykają się z komórkami rośliny.
Inny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy komórki odpornej na patogen, która jest w kontakcie z niezakaźnym polipeptydem lub białkiem, wywołującymi reakcję hipersensytywną.
Jeszcze inny aspekt wynalazku dotyczy kompozycji do nadawania roślinom odporności przeciwko patogenom, przy czym kompozycja zawiera niezakaźny polipeptyd lub białko, wywołujące reakcję hipersensytywną oraz nośnik.
Niniejszy wynalazek może być wykorzystywany do: leczenia chorób roślin, które wcześniej nie poddawały się leczeniu, do systemicznego leczenia chorób, których leczenie oddzielne było nieekonomiczne oraz uniknięcia stosowania środków zakaźnych do leczenia chorób. Sposobem według wynalazku można nadawać roślinom odporności bez nanoszenia na leczone rośliny lub rośliny usytuowane blisko leczonych roślin środków patogenicznych. Dzięki temu, że wynalazek opiera się na stosowaniu produktu naturalnego, to nie powoduje to skażenia środowiska.
Poniżej na rysunku przedstawiono przykładowo przedmiot wynalazku, na którym fig. 1 przedstawia organizację genetyczną zespołu genów kodujących białko lub polipeptyd, wywołujące reakcję hipersensytywnąuErwinia amylovora (to jest hrpN). Linia górna przedstawia mapę enzymów restrykcyjnych wektora plazmidowego pCPP430, gdzie E=Eco, PL,B=Bam HI, a H=Hind ΙΠ. Prostokąty oznaczają jednostki transkrypcyjne, natomiast strzałki pod prostokątami wskazują kierunek transkrypcji. Dłuższa strzałka wskazuje obszar konieczny do końcowej translacji białka lub pohpeptydu, wyzwalających reakcję hipersensytywną. pCPP430 hrpN)osX pochodną pCPP430, w której hrpNzostało zmutowane przez wstawienie transpozonu TnStac; fig. 2 przedstawia mapę wektora plazmidowego pCPP9. Ważną cechą jest centrum mobilizacyjne (mop) do sprzężenia, centrum kohezyjne λ (cos) oraz obszar partycji (par) dla trwałego dziedziczenia plazmidu, przy czym stosuje się następujące oznaczenia: B, BamHI; E, EcoRI; H, Hindlll; P, Pstl; S, Sali; Sm, Smal, oriV, początek replikacji; Spr odporność na spektinomycynę, Smr odporność na streptomycynę.
Przedmiotem wynalazkujest sposób nadawania roślmom odporności na patogeny. Sposób obejmuje przykładanie pohpeptydu lub białka, wyzwalających reakcję hipersensytywną, w postaci niezakaźnej do wszystkich lub części rośliny w warunkach, w których polipeptyd lub białko stykają się ze wszystkimi lub częścią komórek rośliny.
W innym aspekcie przedmiotem wynalazkujest roślina odporna na patogen, z komórkami stykającymi się z niezakaźnym białkiem lub polipeptydem wywołującymi reakcję hipersensytywną.
Jeszcze w innym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazkujest kompozycja do nadawania roślinom odporności na patogeny. Kompozycja zawiera niezakaźny polipeptyd lub białko, wywołujące reakcję hipersensytywną, oraz nośnik.
Polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną stosowane w niniejszym wynalazku, może odpowiadać polipeptydom lub proteinom, powodującym reakcję hipersensy
182 459 tywną pochodzącym od wielu różnych patogenów. Takie polipeptydy lub białka mogą powodować miejscowe obumarcie w tkance roślinnej stykającej się z wyzwalaczem. Do korzystnych patogenów należy Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solanacearum, Xanthomonas campestris lub ich mieszaniny.
Dla celów niniejszego wynalazku niezakaźne postacie polipeptydu lub białka, powodujących reakcję hipersensytywną mogą indukować reakcję hipersensytywną bez wywoływania choroby w roślinie, z którą styka się polipeptyd lub białko. Można to osiągnąć w różny sposób, poprzez 1) naniesienie wydzielonego, wyzwalającego polipeptydu lub białka, 2) zastosowanie bakterii, które nie wywołują choroby i ulegają transformacji pod działaniem genów kodujących polipeptyd lub białko, powodujące reakcję hipersensytywną oraz 3) wykorzystanie bakterii, które wywołują chorobę w pewnych gatunkach roślin (lecz nie w tych, do których sąone wykorzystywane) i zawierają naturalny gen kodujący polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną.
W jednym z rozwiązań niniejszego wynalazku pohpeptydy lub białka, wyzwalające reakcję hipersensytywną, można wydzielić z ich odpowiednich organizmów i zastosować do roślin. Takie procedury wydzielania są dobrze znane, jak na przykład procedury opisane u Arlata, M.F. Gijsegem, J.C.Huet, J.C. Pemollet oraz C.A. Boucher „PopAl, a Protein which induces a Hypersensitive-like Response in Specific Petunia Genotypes is Secreted via Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum”, EMBO J. 13:543-553 (1994); He, S.Y.H.C.Huang i A. Collmer „ Pseudomonas Syringaepv. syringae HarpinPS S. a Protein Chat is secreted via Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitiwe Response in Plants”, Celi 73:1255-1266 (1993) oraz Wei, Z.-M., R.J. Laby, C.H. Zumoff, D.W. Bauer, S.-Y. He, A. Collmer i S.V Beer „Harpin Elicitor of Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora, Science 257:85-88 (1992), włączone tu do bibliografii jako odnośnik. Patrz także rozpatrywane amerykańskie zgłoszenia patentowe nr 08/200024 oraz nr 08/062024, włączone tu do bibliografii jako odnośniki. Korzystnie jednakże, jeżeli wydzielone peptydy lub białka, wyzwalające reakcję hipersensytywną według niniejszego wynalazku wytwarzane są drogą rekombinacji i oczyszczane w sposób opisany poniżej.
W innych rozwiązaniach niniejszego wynalazku polipeptyd lub białko według wynalazku, wywołujące reakcję hipersensytywną można stosować do roślin wykorzystując bakterie zawierające geny kodujące polipeptyd lub białko, wywołujące reakcję hipersensytywną. Takie bakterie muszą być zdolne do wydzielania lub eksportowania polipeptydu lub białka, tak aby środek wywołujący odpowiedź mógł stykać się z komórkami rośliny. W takich rozwiązaniach polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną wytwarzane są przez bakterie in plama lub bezpośrednio przed wprowadzeniem bakterii do roślin.
W jednym z rozwiązań wynalazku, polegającym na wykorzystaniu bakterii, bakterie nie wywołujące choroby zostały poddane transformacji (na przykład w drodze rekombinacji) przez geny kodujące polipeptyd lub białko, wywołujące reakcję hipersensytywną. Na przykład E. coli, która nie wywołuje reakcji hipersensytywnej w roślinach, może zostać transformowana genami kodującymi polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną a następnie być wykorzystana do uodporniania roślin. W tym rozwiązaniu według wynalazku można wykorzystać także inne szczepy bakterii (inne niż E. coli).
W innym rozwiązaniu wynalazku, wynalazek obejmuje wykorzystanie bakterii wywołujących chorobę i zawierających naturalny gen kodujący polipeptyd lub białko, powodujące reakcję hipersensytywną. Przykłady takich bakterii podano wyżej. Jednakże w tym rozwiązaniu bakterie stosowane są do uodporniania roślin, które nie są podatne na choroby powodowane przez te bakterie. Na przykład Erwinia amylovora powoduje chorobę jabłek lub gruszek, lecz nie powoduje choroby pomidorów. Takie bakterie jednakże wyzwalają reakcję hipersensytywną w pomidorach. Zatem zgodnie z tym rozwiązaniem wynalazku Erwinia amylovora może być wykorzystana do pomidorów do nadania im odporności na patogen bez wywołania w tym gatunku choroby.
182 459
Polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, z Erwinia chrysanthemi mają następującą sekwencję aminokwasową odpowiadającą SEQ. ID Nr I:
Met 1 Gly Gin Leu Ile Gly Thr Ala 20 Ile 5 Gin Lys Ala His Gly Leu Lys Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser 10 15 Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser 25 30
Leu Gly Ser 35 Ser Val Asp Lys Leu 40 Ser Ser Thr ile Asp 45 Lys Leu Thr
Ser Ala 50 Leu Thr Ser Met Met 55 Phe Gly Gly Ala Leu 60 Ala Gin Gly Leu
Gly 65 Ala Ser Ser Lys Gly 70 Leu Gly Met Ser Asn 75 Gin Leu Gly Gin Ser 80
Phe Gly Asn Gly Ala 85 Gin Gly Ala Ser Asn 90 Leu Leu Ser Val Pro 95 Lys
Ser Gly Gly Asp 100 Ala Leu Ser Lys Met 105 Phe Asp Lys Ala Leu 110 Asp Asp
Leu Leu Gly 115 His Asp Thr Val Thr 120 Lys Leu Thr Asn Gin 125 Ser Asn Gin
Leu Ala 130 Asn Ser Met Leu Asn 135 Ala Ser Gin Met Thr 140 Gin Gly Asn Met
Asn 145 Ala Phe Gly Ser Gly 150 Val Asn Asn Ala Leu 155 Ser Ser Ile Leu Gly 160
Asn Gly Leu Gly Gin 165 Ser Met Ser Gly Phe 170 Ser Gin Pro Ser Leu 175 Gly
Ala Gly Gly Leu 180 Gin Gly Leu Ser Gly 185 Ala Gly Ala Phe Asn 190 Gin Leu
Gly Asn Ala 195 Ile Gly Met Gly Val 200 Gly Gin Asn Ala Ala 205 Leu Ser Ala
Leu Ser 210 Asn Val Ser Thr His 215 Val Asp Gly Asn Asn 220 Arg His Phe Val
Asp 225 Lys Glu Asp Arg Gly 230 Met Ala Lys Glu Ile 235 Gly Gin Phe Met Asp 240
Gin Tyr Pro Glu Ile 245 Phe Gly Lys Pro Glu 250 Tyr Gin Lys Asp Gly 255 Trp
Ser Ser Pro Lys 260 Thr Asp Asp Lys Ser 265 Trp Ala Lys Ala Leu 270 Ser Lys
Pro Asp Asp 275 Asp Gly Met Thr Gly 280 Ala Ser Met Asp Lys 285 Phe Arg Gin
Ala Met 290 Gly Met Ile Lys Ser 295 Ala Val Ala Gly Asp 300 Thr Gly Asn Thr
Asn 305 Leu Asn Leu Arg Gly 310 Ala Gly Gly Ala Ser 315 Leu Gly Ile Asp Ala 320
Ala Val Val Gly Asp 325 Lys Ile Ala Asn Met 330 Ser Leu Gly Lys Leu 335 Ala
Asn Ala
182 459
Taki polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, ma masę cząsteczkową 34 kDa, są odporne na ciepło, majązawartość glicyny większąniż 16% i w zasadzie nie zawierają reszt cysteiny. Polipeptyd lub białko, powodujące reakcję hipersensytywnąz Erwinia chrysanthemi jest kodowany przez cząsteczkę DNA o następującej sekwencji nukleotydów odpowiadającej SEQ.ID Nr 2:
CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60
GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120
GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180
CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240
TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300
CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG
360
ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420
CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480
CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540
GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600
AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660
TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720
GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780
GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840
TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900
TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960
CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA. GCCAGATGAC 1020
CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG 1080
CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT 1140
GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT 1200
GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA 1260
CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320
TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA 1380
GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440
CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA 1500
TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1560
GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA 1620
182 459
ATCTGTGCTG TTATTATGCG ACGCACATTT GTCGCTCAGA CAGATGGAGA CAGATAGATT GATCACCACA AAAATAGGGC GTTCGTCATC
GCCTGATAAA GTTTATGCGG TCCCGTTCAT TTGCGCGGCT CACGTCTGCG GCGGTTTCGT ATATTCATAG AGTTTTTGCG ATCTTTCTCC
GCGGAAACGA TTACCTGGAC TCGCGTCGTT GATGGGGAAC ATAAATCTGT AATCAACATG AAAGCTGTCT TGGTATCCGT ATCTGGGCGA
AAAAAGAGAC CGGTTAATCA ACGCGCCACA GCCGGGTGGA GCCGTAACGT GTAATGCGGT TGCACCTACC GGGGTGTTCC CCTGATCGGT
GGGGAAGCCT TCGTCATCGA ATCGCGATGG ATATAGAGAA GTTTCTATCC TCCGCCTGTG GTATCGCGGG GGCCTGACAA T
GTCTCTTTTC TCTGGTACAA CATCTTCCTC ACTCGCCGGC GCCCCTTTAG CGCCGGCCGG AGATACCGAC TCTTGAGTTG
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2141
Polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, pochodzące z Erwinia amylovora, mają następującą sekwencję odpowiadającą SEQ. ID Nr 3:
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu 15
Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn 20
Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser 3540
Gin Asn Asp Thr Val Asn Gin Leu 5055
Gly Ala Ser Thr Met Gin Ile Ser 1015
Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gin 2530
Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn 45
Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met 60
Met Met Met Ser Met Met Gly Gly 65 70
Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu 85
Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp 100
Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn 115120
Leu Asp Gin Ala Leu Gly Ile Asn 130135
Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser 145150
Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile 165
Gin Asp Gly Thr Gin Gly Ser Ser 180
Gly Glu Gin Asn Ala Tyr Lys Lys 195200
Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gin 210215
Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu 7580
Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu 9095
Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr 105110
Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro 125
Ser Thr Ser Gin Asn Asp Asp Ser 140
Asp Ser Ser Asp Pro Met Gin * Gin 155160
Met Gin Ser Leu Phe Gly Asp Gly 170175
Ser Gly Gly Lys Gin Pro Thr Glu 185190
Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly 205
Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly 220
182 459
Gly Gly Gin Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu
225 230 235240
Gly Gly Lys Gly Leu Gin Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr GinGin
245 250255
Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gin 260 265270
Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe 275 280285
Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gin Phe Met 290 295300
Asp Gin Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gin Tyr Gin Lys GlyPro
305. 310 315320
Gly Gin Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala LeuSer
325 330335
Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gin Phe Asn 340 345350
Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn 355 360365
Gly Asn Leu Gin His Ala Val Pro Val Val Leu Arg Trp Val Leu Met 370 375380
Pro 3β5
Taki polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną ma masę cząsteczkową około 37 kDa, pi w przybliżeniu 4,3 i są odporne na ciepło do temperatury 100°C przynajmniej w ciągu 10 minut. Taki polipeptyd lub białko, wyzwalający reakcję hipersensytywną praktycznie nie zawiera reszt cysteiny. Polipeptyd lub białko, wyzwalający reakcję hipersensytywną pochodzące z Erwinia amylovora, są opisane dokładniej przez Wei Z. M., R. J. Laby, C.H. Zumoff, D.W. Bauer, S.-Y. He, A. Collmer oraz S. V. Beer „Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Producedby the Plant Pathogen Erwinia amylovora”, Science 257:85-88 (1992), włączone tu do bibliografii jako odnośnik. Cząsteczka DNA kodująca ten polipeptyd lub białko ma następującą sekwencję odpowiadającą SEQ. ID Nr 4:
ATGAGTCTGA ATACAAGTGG GCTGGGAGCG TCAACGATGC AAATTTCTAT CGGCGGTGCG60
GGCGGAAATA ACGGGTTGCT GGGTACCAGT CGCCAGAATG CTGGGTTGGG TGGCAATTCT120
GCACTGGGGC TGGGCGGCGG TAATCAAAAT GATACCGTCA ATCAGCTGGC TGGCTTACTC180
ACCGGCATGA TGATGATGAT GAGCATGATG GGCGGTGGTG GGCTGATGGG CGGTGGCTTA240
GGCGGTGGCT TAGGTAATGG CTTGGGTGGC TCAGGTGGCC TGGGCGAAGG ACTGTCGAAC300
GCGCTGAACG ATATGTTAGG CGGTTCGCTG AACACGCTGG GCTCGAAAGG CGGCAACAAT360
ACCACTTCAA CAACAAATTC CCCGCTGGAC CAGGCGCTGG GTATTAACTC AACGTCCCAA420
AACGACGATT CCACCTCCGG CACAGATTCC ACCTCAGACT CCAGCGACCC GATGCAGCAG480
CTGCTGAAGA TGTTCAGCGA GATAATGCAA AGCCTGTTTG GTGATGGGCA AGATGGCACC540
CAGGGCAGTT CCTCTGGGGG CAAGCAGCCG ACCGAAGGCG AGCAGAACGC CTATAAAAAA600
GGAGTCACTG ATGCGCTGTC GGGCCTGATG GGTAATGGTC TGAGCCAGCT CCTTGGCAAC660
GGGGGACTGG GAGGTGGTCA GGGCGGTAAT GCTGGCACGG GTCTTGACGG TTCGTCGCTG720
182 459
GGCGGCAAAG GGCTGCAAAA CCTGAGCGGG CCGGTGGACT ACCAGCAGTT AGGTAACGCC780
GTGGGTACCG GTATCGGTAT GAAAGCGGGC ATTCAGGCGC TGAATGATAT CGGTACGCAC840
AGGCACAGTT CAACCCGTTC TTTCGTCAAT AAAGGCGATC GGGCGATGGC GAAGGAAATC900
GGTCAGTTCA TGGACCAGTA TCCTGAGGTG TTTGGCAAGC CGCAGTACCA GAAAGGCCCG960
GGTCAGGAGG TGAAAACCGA TGACAAATCA TGGGCAAAAG CACTGAGCAA GCCAGATGAC1020
GACGGAATGA CACCAGCCAG TATGGAGCAG TTCAACAAAG CCAAGGGCAT GATCAAAAGG1080
CCCATGGCGG GTGATACCGG CAACGGCAAC CTGCAGCACG CGGTGCCGGT GGTTCTTCGC 1140
TGGGTATTGA TGCCATGA1158
Polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, pochodzące zPseudomonas syringae, mają następującą sekwencję aminokwasową odpowiadającą SEQ. ID Nr 5:
Met Gin Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gin Thr Pro Ala Met 15 1015
Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser 20 2530
Ser Lys Ala Leu Gin Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met 35 4045
Arg Asn Gly Gin Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala 50 5560
Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu AspVal
70 7580
Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp AsnPhe
9095
Taki polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną o masie cząsteczkowej 34-35 kDa. Jest ono bogate w glicynę (około 13,50 i nie zawierają reszt cysteiny i tyrozyny). Dalsze informacje na temat środka wyzwalającego reakcję hipersensytywną pochodzącego z Pseudomonas syringae, można zastosować u He, S. Y., H.C. Huang oraz A. Collmera „Pseudomonas syringaepv. syrigae HarpinPss: a Protein that is secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants”, Celi 73:1255-1266 (1993), włączone tu do bibliografii jako odnośnik. Cząsteczka DNA kodująca polipeptyd lub białko wyzwalające reakcje hipersensytywne ma następującą sekwencję nukleotydów odpowiadającą SEQ. ID Nr 6:
ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG60
GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC120
GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA180 aaactgttgg CCAAGTCGAT ggccgcagat ggcaaggcgg gcggcggtat tgaggatgtc240
ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG300
GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC360 aagtcgatgc TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC420
182 459
GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480
AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540
GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600
AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660
AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720
GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA 780
TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840
GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900
GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960
GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020
1026
GCCTGA
Polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, pochodzące z Pseudomonas solanacearum, ma następującą sekwencję aminokwasów odpowiadającą SEQ. ID Nr 7:
Met Ser Val Gly Asn Ile Gin Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gin 15 1015
Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gin Gin Ser Gly Gin Ser 20 2530
Val Gin Asp Leu Ile Lys Gin Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile 35 4045
Ala Ala Leu Val Gin Lys Ala Ala Gin Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly 50 5560
Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala
70 7580
Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gin Ala Pro Gin Ser
9095
Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gin Asp Pro Met 100 105110
Gin Ala Leu Met Gin Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala 115 120125
Ala Leu His Met Gin Gin Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val 130 135140
Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gin Gly Gly Leu Ala
145 150 155160
Glu Ala Leu Gin Glu Ile Glu Gin Ile Leu Ala Gin Leu Gly Gly Gly
165 170175
Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly 180 185190
Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala 195 200205
182 459
Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gin Ala Asn Gly Pro Gin Asn 210 215220
Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser GluAsp
225 230 235240
Gin Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gin Lys Leu Met Lys Ile LeuAsn
245 250255
Ala Leu Val Gin Met Met Gin Gin Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gin 260 265270
Ala Gin Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly 275 280285
Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gin Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gin Ser Ser 290 295300
Gly Gin Asn Asn Leu Gin Ser Gin Ile Met Asp Val Val Lys GluVal 305 310 315
Val Gin Ile Leu Gin Gin Met Leu Ala Ala Gin Asn Gly Gly SerGin 325 330335
Gin Ser Thr Ser Thr Gin Pro Met 340
Są one kodowane przez cząsteczkę DNA o następującej sekwencji nukleotydów odpowiadającej SEQ. ID. Nr 8:
ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60
AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC 120
GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC 180
GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC 240
AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC 300
GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 360
GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420
GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480
GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC 540
GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT 600
GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660
GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 720
CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 780
ATGATGCAGC AAGGCGGCCT C GGC GGC GGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840
GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT 900
182 459
GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC960
GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG1020
ACGCAGCCGA TGTAA1035
Dalsze informacje dotyczące polipeptydu lub białka, wyzwalających reakcję hipersensytywną pochodzącą z Pseudomonas solanacearum, można znaleźć u Arlata M., F. Van Gijsegem, J.C. Huet, J.C. Pemollet i C.A. Boucher „PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive-like Response in Specific Petunia Genotypes, is Secreted via
Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum, EMBO J. 13:543:533 (1994), włączone tu do bibliografii jako odnośnik. Polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną pochodzące zXanthomomas campestris i zawierające glicynę, mająnastępującąsekwencję aminokwasów odpowiadającą SEQ.ID,Nr 9:
Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala 15 10 15
Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gin Asp Tyr
25
Sekwencja ta jest aminową sekwencją końcową zawierającą tylko 26 reszt z polipeptydu lub białka, wyzwalających reakcję hipersensytywną pochodzących zXanthomonas campestris, o wysokiej zawartości glicyny. Pasuje ona do strzępiastych białek oznaczonych w innych patowarach tanthomouas campestris.
Powyższe czynniki wyzwalające podane są tytułem przykładu. Inne czynniki wyzwalające można zidentyfikować drogą hodowli bakterii, które wyzwalają reakcję hipersensywną w których następuje ekspresja genów kodujących czynnik wyzwalający. Bezkomórkowe preparaty z klarownych cieczy kultur można badać pod kątem aktywności wyzwalającej (na przykład lokalna nekroza) wykorzystując je do infiltracji odpowiednich tkanek roślin.
W sposobie według wynalazku możliwe jest także wykorzystanie fragmentów powyższych polipeptydów lub protein, wyzwalających reakcję hipersensytywną jak również fragmentów czynników wyzwalających o pełnej długości pochodzących z innych patogenów.
Odpowiednie fragmenty można wytwarzać kilkoma sposobami. W jednym ze sposobów klony genów kodujących znane białko wyzwalające reakcję hipersensytywną wytwarza się drogą konwencjonalnej, molekularnej manipulacji przez klonowanie fragmentów genów. W komórkach bakteryjnych uzyskuje się w wyniku klonowania ekspresję in vitro lub in vivo mniejszego białka lub peptydu, którego aktywność wyzwalania odpowiedzi hipersensytywne zgodnie z niżej opisanym postępowaniem może być badana.
W innym rozwiązaniu fragmenty białka wyzwalającego reakcję można wytwarzać przez trawienie białka wyzwalającego o pełnej długości za pomocą enzymów proteolitycznych, takich jak chymotrypsyna, albo A ze Staphyllococcus albo trypsyny. Różne enzymy preteolityczne będą prawdopodobnie trawić białka wyzwalające reakcję hypersensytywną w różnych miejscach w zależności od sekwencji aminokwasowej białka wyzwalającego. Niektóre z tych fragmentów uzyskanych w wyniku proteohzy mogą być aktywnymi środkami wyzwalającymi odporność.
W innym rozwiązaniu, opartym na znajomości pierwotnej struktury białka, fragmenty genu białka wyzwalającego można zsyntezować stosując technikę PCR wraz ze specyficznymi zestawami primerów wybranych do reprezentowania poszczególnych części białka. Następnie byłyby one klonowane do odpowiedniego wektora dla wzrostu i ekspresji skróconego peptydu lub białka.
Warianty te można także (lub alternatywnie) modyfikować na przykład przez delecję lub addycję aminokwasów mających minimalny wpływ na właściwości, budowę wtórną i naturę hydropatyczną polipeptydu. Polipeptyd może być na przykład sprzęgany z sekwencją sygnałową (lub wiodącą) na końcu N białka, która kieruje przeniesieniem w trakcie translacji lub po transla
182 459 cji białka. Dla ułatwienia syntezy, oczyszczania lub identyfikacji polipeptyd może być także sprzęgany z linkerem lub inną sekwencją.
Białko lub polipeptyd według niniejszego wynalazku wytwarza się korzystnie w oczyszczonej postaci (korzystnie czystość co najmniej 80%, a zwłaszcza 90%). W sposób typowy białko lub polipeptyd według wynalazku wydziela się do pożywki hodowlanej dla zrekombinowanej E. coli. W celu wydzielenia białka komórkę gospodarza E. coli, zawieraj ącązrekombinowany plazmid, rozmnaża się i homogenizuje, a homogenat wiruje w celu usunięcia fragmentów bakterii. Klarownąciecz poddaje się wtedy kolejnemu strąceniu za pomocą siarczanu sodowego. W celu oddzielenia frakcje protein zawierające polipeptyd lub białko według wynalazku poddaje się filtracji na żelu w kolumnie z dekstranem lub pohakryloamidem o odpowiedniej wielkości. Jeżeli jest to konieczne, to frakcje proteinową można dalej oczyszczać drogą wysokosprawnej chromatografii cieczowej.
Cząsteczka DNA kodująca polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, może być wprowadzona do komórki zwykłym sposobem rekombinowanego DNA. W ogólności taki sposób obejmuje insercję cząsteczki DNA do układu ekspresyjnego, względem którego cząsteczka DNA jest heterologiczna (to jest normalnie nie jest obecna). Heterologiczną cząsteczek DNA poddaje się insercji do układu ekspresyjnego lub wektora we właściwej sensowej orientacji i właściwej ramce odczytu. Wektor zawiera fragmenty potrzebne do transkrypcji i translacji sekwencji, które mają być wprowadzone, i kodują białko.
Z amerykańskiego opisu patentowego dla Cohena i Boyera nr US 4237224, włączonego tu do bibliografii jako odnośnik, znane jest wytwarzanie systemów ekspresyjnych w postaci plazmidów zrekombinowanych stosując cięcie enzymami restrykcyjnymi i ligację za pomocąligazy DNA. Takie zrekombinowane plazmidy wprowadza się następnie drogą transformacji i w kulturach jednokomórkowych zawierających organizmy prokariotyczne i komórki eukariotyczne wyhodowane w kulturze tkanki, ulegają one replikacji.
Geny po rekombinacji można następnie wprowadzać do wirusów, takich jak wirus ospy krowiej. Wirusy zrekombinowane można generować przez transsekcję plazmidów do komórek zainfekowanych wirusem.
Odpowiednie wektory obejmują, między innymi następujące wektory, takie jak układ gtll wektora lambda, gt WES.tB, Charon 4 oraz wektory plazmidowe, takie jak pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKCIOl, SV 40, pBluescript IISK +/- lub KS +/- (patrz Katalog (1993) „Stratagene Cloning Systems” firmy Stratagene, La Jolla, Kalifornia, włączony tu do bibliografii jako odnośnik), pQE, pIH821, pGEX, szereg pET (patrz F.W. Studier i wsp., „Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes”, Gene Expression Technology, tom 185 (1990), włączone tu do bibliografii jako odnośnik), oraz każdą ich pochodną.
Zrekombinowane cząsteczki można wprowadzić do komórek drogą transformacji, a zwłaszcza transdukcji, koniugacji, mobilizacji lub elektroporacji. Sekwencje DNA klonuje się do wektora stosując standardowe techniki klonowania, jak na przykład opisane przez Maniatis i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (1982), włączone tu do bibliografii jako odnośnik. Do ekspresji sekwencji kodujących białko można wykorzystywać szereg układów wektor-gospodarz. Układ wektorowy musi być przede wszystkim zgodny z wykorzystywaną komórką gospodarza. Układy gospodarz-wektor obejmują, między innymi bakterie poddane transformacji za pomocą DNA bakteriofagów, DNA plazmidów lub DNA kosmidów, drobnoustroje, takie jak drożdże zawierające wektory drożdżowe, układy komórkowe ssaków zainfekowane wirusem (na przykład wirus krowianki, adenowirus i tym podobne), układy komórkowe owadów zainfekowane wirusem (na przykład baculowirus) oraz komórki roślinne zainfekowane bakteriami. Elementy ekspresji tych wektorów zmieniają się z ich nasileniem i specyficznością. W zależności od stosowanego układu gospodarz-wektor może być wykorzystana każda liczba odpowiednich elementów transkrypcji i translacji.
182 459
Różne sygnały i zjawiska genetyczne regulują wiele poziomów ekspresji genów (na przykład transkrypcja DBA, translacja RNA informacyjnego (nRNA). , . . .
Transkrypcja DNA zależy od obecności promotora o sekwencji DNA, która kieruje wiązaniem polimerazy RNA, a zatem promuje syntezę mRNA. Sekwencje DNA promotorów eukariotycznych różnią się od sekwencji DNA promotorów propkariotycznych. Co więcej, promotory eukariotyczne oraz towarzyszące sygnały genetyczne mogąbyć nierozpoznane w układzie prokariotycznym lub mogą w nim nie fiinkcjonować, a promotory prokariotyczne me sąrozpoznane i nie fimkcjonują w komórkach eukariotycznych.
Podobnie translacja mRNA u prokariota zależy od obecności właściwych sygnałów prokarietycznych, które różnią się od sygnałów eukariotycznych. Skuteczna translacja mRNA u eukariota wymaga centrum wiążącego rybosom mRNA, nazywanym sekwencją, Shine-Dalgamo („SD”). Sekwencja ta jest krótką sekwencją nukleotydową mRNA, zlokalizowaną przed kodonem strat, zwykle AUG, która koduje aminotermirialną metioninę białka. Sekwencje SD są komplementarne z końcem 3' 16S rRNA (RNA rybosomowy) i prawdopodobnie promująwiązanie się mRNA z rybosomami przez tworzenie podwójne nici z rRNA, umożliwiając prawidłowe usytuowanie rybosomu. Artykuł przeglądowy dotyczący maksymalizacji ekspresji genów opracował Roberts i Lauer, Methods in Enzymology, 68;473 (1979), włączone tu do bibliografii jako odnośnik.
Promotory zmieniają się, co do siły (to jest ich zdolności do promowania transkrypcji). Do ekspresji klonowanego genu pożądane jest zastosowanie silnych promotorów celem uzyskania wysokiego poziomu transkrypcji, a zatem i ekspresji genu. W zależności od stosowanego układu komórek gospodarza, może być wykorzystana każda lilczba odpowiednich promotorów. Jeżeli na przykład klonuje się w E. coli,}c'} bakteriofagach lub plazmidach, to promotory, takie jak promotor faga T7, promotor lac, promotor trp, promotor recA, promotor rybosomowego RNA, promotory PR i PL koli faga lambda i inne, włącznie, lecz nie tylko, z lacUV5, ompF, bla, Ipp i tym podobnymi, można stosować do kierowania wysokimi poziomami transkrypcji przyległych segmentów DNA. Hybrydowy promotor frp-laUV5 (tac) lub inne promotory E. coli, wytwarzane za pomocą rekombinowanego DNA lub innymi technikami syntezy DNA, można ponadto wykorzystać do zabezpieczenia transkrypcji genu poddanego insercji.
Szczepy bakteryjne komórek gospodarza oraz wektory ekspresji można tak dobrać, aby hamowały działanie promotora do czasu specyficznej indukcji. W innych operacjach dodatek specyficznych mduktorów jest konieczny dla skutecznej transkrypcji DNA poddanego insercji. Na przykład lac indukowany jest przez dodatek laktozy lub IPTG (izopropylotiobeta-D-galaktozyd). Szereg innych operonów, takich jak trp, pro i tym podobne, regulowany jest w różny sposób.
Do skutecznej transkrypcji i translacji genów wymagane są także specyficzne sygnały inicjacyjne. Takie sygnały inicjacyjne transkrypcji i translacji mogą zmieniać się, co do swojej skuteczności, jak zmierzono odpowiednio ilość specyficznego RNA informacyjnego genu i zsyntetyzowanego białka. Wektor ekspresyjny DNA, zawierający promotor, może zawierać także każdą kombinację różnych, „silnych” inicjacyjnych sygnałów transkrypcji i ewentualnie translacji. Skuteczna translacja w E. coli wymaga na przykład sekwencji Shine-Dalgamo 7-9 zasad 5' do zainicjowania kodonu (ATG) dla zabezpieczenia centrum wiążącego rybosom. Zatem można stosować każdą kombinację, która może być wykorzystana przez rybosomy komórek gospodarza. Takie kombinacje obejmują, lecz nie są ograniczone do SD-ATG, kombinacje genu ero lub genu N kohfaga lambda, albo kombinacje tryptofanowych genów E, D, C, B lub A z E. coli. Wykorzystana może być ponadto każda kombinacja SD-ATG wytwarzana za pomocąrekombinowanego DNA lub innymi sposobami obejmującymi inkorporację syntetycznych nukleotydów.
Gdy wyizolowana cząsteczka DNA kodująca polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, została już raz sklonowana do układu ekspresyjnego, to jest może być ona włączona do komórki gospodarza. Takie włączenie można przeprowadzić za pomocą różnych sposobów transformacji, podanych wyżej, w zależności od układu komórkowego wektor/gospodarz. Do odpowiednich komórek gospodarza należą, między innymi, bakteria, wirusy, komórek drożdży, ssaków, owadów, roślin i tym podobne. Sposób według wynalazku można wykorzystać
182 459 do leczenia szeregu roślin przez nadanie im odporności przeciw patogenom. Do odpowiednich roślin należą rośliny dwuliścienne i jednoliścienne. Dokładniej, do użytecznych roślin uprawnych należy ryż, pszenica, jęczmień, żyto, bawełna, słonecznik, orzech ziemny, kukurydza, ziemniak, ziemniak słodki, fasola, groch, cykoria, sałata, endywia, kapusta, kalafior, brokuły, rzepa, rzodkiewka, cebula, czosnek, bakłażan, pieprz, seler, marchew, dynia, cukinia, ogórek, jabłoń, grusza, melon, poziomka, truskawka, winna latorośl, malina, ananas, soja, tytoń, pomidor, sorgo i trzcina cukrowa. Przykładem odpowiednich roślin ozdobnych jest Arabidopsism thaliana, Saintpaulia, petunia, pelargonia, poinsecja, złocień, goździk i cynia.
Sposób nadawania roślinom odporności przeciw patogenom według wynalazku nadaje się do nadawania odporności przeciw szeregu patogenom, włącznie z wirusami, bakteriami i grzybami.
Sposobem według wynalazku można uzyskać odporność między innymi przeciw następującym wirusom: wirus choroby mozaikowej tytoniu i wirus choroby mozaikowej pomidora.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem odporność można nadać między innymi przeciw następującym bakteriom: Pseudomonas solanacearum, Pseudornonas syringae pv. tabaci oraz Xanthamonas campestris pv. pelargonii.
Sposobem według wynalazku rośliny można uodpornić między innymi na grzyby, takie jak Fusarum oxysporum i Phytophora infestans.
Przykładanie polipeptydu lub białka, wyzwalających reakcję hipersensytywną, do wszystkich lub jednej części leczonej rośliny według wynalazku można realizować różnymi drogami. Może to obejmować, lecz nie tylko, infiltrację polipeptydu lub białka, wyzwalających reakcję hipersensytywną, do rośliny. Do odpowiednich sposobów przykładania należy natryskiwanie pod niskim lub wysokim ciśnieniem, wstrzykiwanie oraz wycieranie najbliższych liści, gdy ma miejsce stosowanie środka wyzwalającego. Specjaliści w tej dziedzinie mogą brać pod uwagę również i inne sposoby przykładania, pod warunkiem, że mogą one powodować zetknięcie się polipeptydu lub białka, wyzwalających reakcję hipersensytywną, z komórkami rośliny.
Polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, można przykładać do roślin sposobem według wynalazku samodzielnie lub w mieszaninie z innymi materiałami.
Jeden z aspektów niniejszego wynalazku obejmuje kompozycję do nadawania roślinom odporności przeciw patogenom, zawierającąpolipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, w nośniku. Do odpowiednich nośników należy woda lub roztwory wodne. W rozwiązaniu tym kompozycja zawiera więcej niż 500 nM polipeptydu lub białka, wyzwalających reakcję hipersensytywną.
Chociaż nie jest to konieczne, to kompozycja może zawierać dodatkowe składniki, włącznie z nawozem, insektycydem, fungicydem lub ich mieszaninami. Do odpowiednich nawozów należy (NH4)2NO3. Przykładem odpowiedniego insektycydu jest Malathion. Do użytecznych fungicydów należy Captan.
Do innych odpowiednich dodatków należą środki buforowe, środki nawilżające i środki ścierne. Materiały te można stosować dla ułatwienia realizacji sposobu według wynalazku.
Przykład I. Indukowana przez harpinę odporność pomidora przeciw południowej, bakteryjnej chorobie widnięcia (Pseudomonas solanacearum).
Dwutygodniowe siewki pomidorów, wyhodowane na 8 x 15 cm poletkach w szklarni, potraktowano następująco: 20 roślin wykorzystano do każdego z sześciu zabiegów, które oznaczono od A do F, jak opisano niżej:
(A) Około 100 μΐ surowego preparatu harpiny o stężeniu 200 pg/ml (polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną) (Z-M. Wei, „Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Producedby the Plant PathogenErwinia amylovora”, Science 257:85-88 (1992), włączone tu do bibliografii jako odnośniki) wprowadzono drogą infiltracji do najniższego liścia właściwego każdej z sadzonek.
(B) Ten sam preparat harpiny, jak stosowano w (A), natryskiwano z karborundem o ziarnistości 400 mesh na powierzchnie liścia sadzonek, a następnie łagodnie wcierano za pomocąkciuka.
(C) E. coli DH5(pCPP430) (patrz fig. 1 mapa wektora plazmidowego pCPP430) hodowano w pożywce LB do OD620 = 0,7. Następnie kulturę wirowano i ponownie zawieszono w 5 mM
182 459 buforu fosforanu potasowego, pH 6,5. Około 100 μΐ zawiesiny komórek wprowadzono drogą infiltracji do każdego liścia sadzonek.
(D) E. coli DH5(pCPP340::hrpN) (patrz fig. 1 mapa wektora plazmidowego pCPP430::hrpN’) wykorzystano jak w (C). Komórki rozmnażały się, a zawiesina i ilości szczepionki były takie same jak w (C).
(E) komórki E. coli DH5(pCPP9) (patrz fig. 2) hodowano i ilości stosowanej szczepionki były takie same jak w (C).
(F) Infiltrację liści za pomocą 5 mM buforu fosforanu potasowego przeprowadzono w sposób opisany w (C).
Bakterie patogeniczne, Pseudomonas solanacearum szczep K60, hodowano w pożywce B Kinga do OD620 = 0,7 (około 108 cfii/ml). Hodowlę wirowano, a następnie ponownie zawieszono w 100 objętościach 5 mM buforu fosforanu potasowego do końcowego stężenia około 1 x 106 cfu/ml. Trzy dni po potraktowaniu sadzonek pomidorów harpiną lub bakteriami zostały one wyrwane i odcięto im nożycami około 1 cm korzenia. Następnie sadzonki zanurzono na 3 minuty w zawiesinie P. solanacearum K60. Zaszczepione rośliny posadzono ponownie w tych samych doniczkach i pozostawiono w szklarni notując przypadki choroby 7 dni po zaszczepieniu.
A. Skutki potraktkowania harpiną
Po 24 godzinach zamarły tylko te części liści, które poddano infiltracji harpiną lub za pomocą DH5(pCPP430) z E. coli. Liście spryskane harpiną i karborundem wykazywały tylko plamiste obumarcie.
B. Wpływ potraktowania harpiną na rozwój południowego więdnięcia bakteryjnego.
Żadna z 20 roślin poddanych infiltracji harpiną nie wykazywała żadnych objawów po 1 tygodniu po szczepieniu za pomocą P. solanacearum (tabela 1). Jedna z 20 roślin wykazywała objawy karłowacenia. Także 7 z 20 roślin poddanych infiltracji za pomocą buforu wykazywało objawy karłowacenia. Potraktowanie za pomocą DH5(pCPP430‘) E coli (mutant indukowany transposonem, niezdolny do powodowania opadnięcia hipersensytywnego) lub za pomocą DH5(pCPP9) z E. coli nie dawało istotnej różnicy w porównaniu z roślinami potraktowanymi buforem. Wyniki te sugerują, że harpina lub DH5(pCPP430) z E. coli, który wytwarza harpinę, indukowały odporność w roślinach pomidora na południowe więdnięcie bakteryjne powodowane przez P. solanacearum K60.
Tabela 1.
Przypadki choroby siewek pomidorów po 7 i 14 dniach po zaszczepieniu za pomocąP. solanacearum K.60
Liczba roślin
Po 7 dniach Po 14 dniach
Zabieg Karłowate Zdrowe Karłowate Zdrowe
A. Infiltracja harpiną 0 20 2 18
B. Natryskiwanie harpiną 1 19 3 17
C. E. Coli DH5(pCPP430) 2 18 3 17
D. E. coli DH 5 (pCPP430-) 4 16 7 13
E. E. coli DH5(pCPP9) 5 15 6+1 zwiędnięte 13
E. Bufor 7 13 8+1 11
Brak patogenu 0 20 0 20
Cztery tygodnie po zaszczepieniu rośliny potraktowane harpiną lub za pomocą E. coli DH5(pCPP430) były wyższe i szersze w porównaniu z roślinami potraktowanymi buforem. Średnią wysokość 10 roślin, które poddano infiltracji harpiną lub buforem, podano w tabeli 2.
182 459
Tabela 2.
Wysokości (cm) roślin pomidora 4 tygodnie po zaszczepieniu za pomocą Pseudomonas solanacearum K60. po potraktowaniu karpiną lub buforem.
Poddane infiltracji buforem Poddane infiltracji karpiną Poddane infiltracji buforem
Niezaszczepione Zaszczepione K60 Zaszczepione K60
36 32 11
41 29 21
35 38 33
34 35 12
39 37 15
35 33 32
36 22 25
35 35 15
41 40 37
37 29 38
Średnio 36,9 Średnio 33 Średnio 23,9
Przykładll. Indukowana harpiną odporność pomidorów przeciw południowej bakteryjnej chorobie więdnięcia Pseudomonas solanacearum
Wszystkie sposoby stosowane do infiltracji i szczepienia były takie same, jak opisano w przykładzie I, z tym wyjątkiem, że stężenie P solanacearum K60 wynosiło około 5 x 104 cfu/ml.
Rośliny poddane infiltracji buforem dawały objawy 15 dni po zaszczepieniu za pomocąR solanacearum K60. Sześć z 20 roślin wykazywało objawy karłowatości po 15 dniach; dwie rośliny zwiędły po 21 dniach. Rośliny zwiędnięte ewentualnie zamierały. Jednakże żadna z 20 roślin potraktowanych harpiną nie wykazywała objawów karłowacenia. Trzy tygodnie po zaszczepieniu 3 z 20 roślin potraktowanych harpiną wykazywały objawy karłowatości. Możliwe, że po 13 tygodniach rośliny być może utraciły swoją indukowaną odporność. Tak jak w pierwszym doświadczeniu cały obwód i wysokości roślin potraktowanych harpina były większe niż w przypadku roślin potraktowanych buforem.
Przykład III. Indukowana harpiną odporność pomidorów przeciw południowej bakteryjnej chorobie więdnięcia Pseudomonas solanacearum
Doświadczenie to było podobne, jak w przypadku przykładu I, z tym wyjątkiem, że do doniczek zawierających potraktowane rośliny pomidora dodano dodatkowo szczepionkę Pseudomonas solanacearum.
Karpinę infiltrowano do dwutygodniowych siewek pomidora. Dwa panele każdej rośliny infiltrowano za pomocą około 200 μΐ harpiny zawieszonej w 5 ml buforu fosforanu potasowego przy stężeniu około 200 pg/ml. Infiltracji poddano wszystkie 20 siewek pomidora. Tę samą liczbę siewek pomidora infiltrowano buforem. Po dwóch dniach rośliny zaszczepiono za pomocą Pseudomonas solanacearum K60 przez zanurzenie korzeni. Rośliny infiltrowane harpiną lub buforem wyciągnięto z mieszanki glebowej, nożycami odcięto małe kawałki korzeni, a pozostałe korzenie zanurzono na trzy minuty w zawiesinie P solanacearum K60. Stężenie zawiesiny komórek bakteryjnych wynosiło około 5 x 108 cfu/ml. Siewki posadzono ponownie do tej samej doniczki. Do mieszanki glebowej każdej indywidualnej doniczki o średnicy 10 cm dodano dodatkowo 3 ml zawiesiny bakteryjnej. Przypadki choroby rejestrowano po jednym tygodniu. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w szkłami z ograniczoną regulacją temperatury.
182 459
Po trzech tygodniach 11 i 20 roślin pomidora infiltrowanych buforem zamarło, a 2 rośliny, które wcześniej zwiędły, wyzdrowiały, lecz pozostały karłowate. Tylko 4 rośliny rosły normalnie w porównaniu z roślinami nieszczepionymi. Jednakże 15 roślin potraktowanych harpiną wyglądało na zdrowe, trzy rośliny były karłowate, a dwie rośliny zwiędły w 3 tygodnie po zaszczepieniu. Wyniki te zebrano w tabeli 3.
Tabela 3.
Indukowana harpiną odporność pomidora przeciw bakteryjnej chorobie więdnięcia spowodowanej przez P solanacearum
Tygodnie po zaszczepieniu
Zabieg 1 2 3
Harpina
Zdrowe 20 17 15
Zwiędnięte 0 1 2
Karłowe 0 2 3
Bufor
Zdrowe 8 5 4
Zwiędnięte 8 12 13
Karłowate 4 3 3
Przykład IV. Indukowana harpiną odporność pomidora na wirus choroby mozaikowej tytoniu
Jeden panel czterotygodniowych siewek pomidora z dolnymi liśćmi (cultivar, Xanthi, z genem N) poddano infiltracji harpinąz E. Amylovora przy stężeniu 200 pg/ml. Po trzech dniach rośliny potraktowano wirusem choroby mozaikowej tytoniu („YMV”), przy czym stosowano dwa stężenia wirusa (5 pg i 100 pg/ml). Około 50 μΐ zawiesiny wirusowej umieszczono na jednym górnym liściu tytoniu. Liść napylono za pomocą karborundu o wielkości ziaren 400 mesh i lekko przetarto liście. Każde stężenie było testowane na trzech roślinach. Obrażenia z obumarciem rejestrowano 4 dni po zaszczepieniu i 2 kolejnych dniach oraz rejestrowano średniąliczbę na trzech liściach (tabela 4). Trudno wyróżnić poszczególne obrażenia po 10 dniach, ponieważ niektóre obrażenia nekrotyczne zlewały się ze sobą. Zatem liczba odnotowanych obrażeń wydawała się mniejsza niż w przypadku obrażeń w 7 dniu. Wielkość obrażeń nekrotycznych w liściach potraktowanych buforem była znacznie wyższa niż w liściach potraktowanych harpiną.
Tabela 4.
Indukowana harpiną odporność tytoniu przeciwko TMW, zaszczepionego za pomocą 5 pg/ml wirusa
Średnia liczba obrażeń na liść
Zabieg 4 dzień 7 dzień 10 dzień
Harpina 21 32 35
Bufor 67 102 76
Nie było znaczącej różnicy w liczbie obrażeń miejscowych, które rozwinęły się na tytoniu potraktowanym harpiną i buforem, jeżeli stężenie szczepionki wirusa choroby mazaikowej tytoniu wynosiło 100 pg/ml.
182 459
PrzykładV. Indukowana harpiną odporność pomidora na chorobę więdnięcia wywołaną przez Fusarium
Sześciotygodniowe rośliny pomidora potraktowano harpiną w sposób opisany w przykładzie III. Patogen grzybowy, Fusarium oxysporum, hodowano w ciągu 5 dni w temperaturze 27°C na pożywce agarowej z fasoli Lima. Dwie pełne płytki z grzybnią zanurzono w 20 ml 5 mM buforu fosforanu potasowego. Korzenie roślin pomidora potraktowane harpiną lub buforem zraniono przez wciśnięcie drewnianego kołka do gleby doniczek. Następnie glebę każdej z 4-calowych doniczek podlano 3 ml zawiesiny grzybów. Zaszczepione rośliny pozostawały w komorze o regulowanym środowisku w temperaturze 24°C w ciągu 16 godzin na świetle dziennie. Przypadki choroby notowano w 7 dni po zaszczepieniu. Każdy zabieg stosowano do 10 roślin. Wyniki zebrano niżej w tabeli 5.
Tabela 5.
Wpływ potraktowania harpiną lub buforem na chorobę więdnięcia pomidorów, spowodowaną przez Fusarium
Liczba roślin (z 10) wykazujących objawy więdnięcia przy wskazanym czasie po szczepieniu
Zabieg 7 dni 10 dni 15 dni 20 dni
Harpina 1 2 4 4 (1 zamarła)
Bufor 3 6 7 7 (4 zamarły)
Przykład VI. Indukowana harpiną odporność tytoniu przeciw chorobie „ognia greckiego” (Pseudomonas syringae pv. tabaci)
Harpinę infiltrowano do pojedynczych paneli dolnych liści 4-tygodniowych roślin tytoniu (20 cm wysokości). Po trzech dniach do pojedynczych paneli górnych liści infiltrowano zawiesiny Pseudomonas syringepv. tabaci. Po dalszych czterech dniach notowano przypadki choroby, jak przedstawiono w tabeli 6.
Tabela 6.
Objawy infekcji przez chorobę „ognia greckiego” w liściach tytoniu zaszczepionych za pomocą Pseudomonas syringe pv tabaci po potraktowaniu dolnych liści harpiną
Stężenie P. s. tabaci Traktowane harpiną Nie traktowane harpiną
104 cfu/ml Brak objawów Nerkoza i nasiąkanie wodą
105 cfu/ml Brak objawów Nerkoza i nasiąkanie wodą
106 cfu/ml Brak objawów Nerkoza i nasiąkanie wodą
107 cfu/ml Brak objawów Nerkoza i nasiąkanie wodą
LO8 cfu/ml Nerkoza Nerkoza i nasiąkanie wodą
P r z y k ł a d VII. Inkubowana harpiną odporność pelargonii (pelargonium hortorum) przeciw bakteryjnej plamistości liści (Xanthamonas campestris pv. pelargonii)
Doświadczenie prowadzono z odciętymi korzeniami pelargonii rosnącej w indywidualnych 4” i 6” doniczkach w sztucznej mieszance glebowej w szklarni. Dwa dolne liście każdej rośliny poddano infiltracji za pomocą0,05 M buforu fosforanu potasowego, pH 6,5 (kontrola) albo harpiny albo zawiesiny DH5(pCPP430) z Escherichia coli (cały klonowany zespół genów hrp z E. amylovora). Dwa do 7 dni po infiltracji wszystkie rośliny zaszczepiono czystą kulturą patogenu bakteryjnej plamistości liści, Xanthamonas campestris pv. pelargonii. Następnie nad górnymi i dolnymi powierzchniami liści roślin rozpylo pod niskim ciśnieniem zawiesinę bakterii (5 χ 106 cfu/ml). Każde traktowanie preparatami stosowano do dwóch roślin, (oznaczonych jako „A” i „B” w tabeli 7). Rośliny trzymano w zamkniętej komorze w ciągu 48 godzin z dodatkowym rozpylaniem
182 459 za pomocą rozpylaczy zimnomgłowych. Następnie rośliny trzymano na ławie w szklarni przy wilgotności otoczenia i w temperaturze 23°C do 32°C w ciągu 10 dni przed stwierdzeniem rozwoju choroby.
Tabela 7
Wpływ harpiny i skupiska genowego hrp z Erwinia amylowra na rozwój bakteryjenj plamistości liści pelargonii Czas pomiędzy potraktowaniem preparatami i szczepieniem za pomocąXanthomonas campestris pv pelargonii
Zabieg 7 dni 5 dni 4 dni 3 dni 2 dni
Roślina Roślina Roślina Roślina Roślina
A B A B A B A B A B
Bufor 3* 5 5 4 3 2 4 3 4 5
Harpina 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
DH5 (pCPP430) 0 0 NT NT 0 0 0 1 1 0
* Liczby w tabeli są liczbami liści wykazujących objawy choroby (wyraźna nekroza, chloroza lub zwiędnięcie) 10 dni po szczepieniu
Przykład VII. Aktywność niektórych harpin w indukowaniu odporności przeciw chorobie „ognia greckiego” powodowanej przez Pseudomonas syringae pv. Tabaci
Rośliny tytoniu (Nicotiana tabacum var. Xanthi) hodowano w szklarni. Do pojedynczego panelu dwóch dolnych liści każdej czterotygodniowej rośliny infiltrowano preparaty harpiny. Dwanaście roślin potraktowano każdym preparatem harpiny, a trzy rośliny potraktowano tylko buforem fosforanu potasowego, stosowanym do otrzymania harpin. Nekrozę hipersensytywną rozwiniętą w ciągu 24 godzin w panelach liści poddano infiltracji preparatami harpiny, lecz nie buforem.
Po 7,10,11 i 12 dniach po potraktowaniu harpiną wszystkie rośliny zaszczepiono zawiesinami 104 do 106 komórek/ml Pseudomonas syrigaepv. tabaci przez infiltrowanie paneli na górnych liściach. Następnie rośliny hodowano w szklarni w ciągu 7 dni, zanim dokonano oceny rozwoju choroby. Wyniki zebrano niżej w tabeli 8.
Tabela 8
Źródło harpiny Dni pomiędzy potraktowaniem preparatem i szczepieniem
12 11 10 7
log(szczepienie) 4 5 6 4 5 6 4 5 6 4 5 6
Brak (bufor) 4 4- -H- + + 4-4- 4- 4- 4-4- 4- 4- 4-4-
P. syringae - - 4- - - 4- - - 4- - - 4-
E. chrysanthemi - - 4- - - 4- - - 4- - - 4-
E. amylovora - - 4- - - - - - 4- - - 4-
- - brak objawów + = nekroza z żółtym halo, typowym dla choroby „greckiego ognia” ++ = ostra nekroza z żółtym halo, typowym dla choroby „greckiego ognia”
Wyniki wskazują, że preparaty harpiny z trzech bakterii były skuteczne przy indukowaniu odporności przeciw patogenowi choroby „greckeigo ognia”. Rośliny potraktowane harpiną nie wykazywały objawów przy stosowanych dwóch niższych stężeniach szczepionki. Przy stężeniu wyższym objawy były silniejsze na roślinach potraktowanych buforem niż na roślinach potraktowanych harpiną.
182 459
Przykład IX. Indukowana harpiną odporność przeciw późnej zarazie roślinnej, powodowanej przez Phytophora infectans
Patogen późnej zarazy roślinnej wpływa przede wszystkim na ziemniaki i pomidory. Odpowiada on za sławny dotkliwy brak ziemniaków w Irlandii. Aktywność harpiny przy indukowaniu odporności przeciw temu patogenowi była badana na siewkach ziemniaków hodowanych w szklarni. Trzytygodniowe siewki (linia hodowlana „MamaMia”, około 15 do 20 cm wysokości) potraktowano harpiną a następnie zaszczepiono za pomocąPhytophlora infectans. Dwa panele dolnego liścia każdej rośliny poddano infiltracji zapomocązawiesiny DH5(pCPP430) z Escherichia coli, która wytwarza i wydziela harpinę, lub buforu fosforanu potasowego.
Dwa, trzy lub cztery dni po infiltracji rośliny zaszczepiono za pomocą zawiesiny grzybni Phytophlora infectans, przy czym wykorzystano szczep U.S.7, który jest bardzo zakaźny dla ziemniaków. Zawiesinę grzybni przygotowano przez ostrożne zmieszanie zawartości płytek agarowych z mączką jęczmienną na których i w których hodowano grzyb w ciągu 2 tygodni w temperaturze 21°Ć. Zawiesiną za pomocą szerokiego pędzla artystów-malarzy, pędzlowano górną i dolną powierzchnię jednego liścia w każdej roślinie.
Potraktowane preparatem i zaszczepione rośliny poddano inkubacji w specjalnie skonstruowanej komorze mgłowej w szklarni, przeznaczonej do utrzymywania temperatury 20-23°C, utrzymując wysoką wilgotność względną. Wilgoć doprowadzono za pomocą kilku rozpylaczy mgłowych, pracujących z maksymalną szybkością z czystą wodą. Przypadki choroby oceniano po 13 dniach po zaszczepieniu za pomocą Phytophlora infectans, a wyniki zebrano w tabeli 9. Każde traktowanie preparatem stosowane było do czterech indywidualnych roślin.
Tabela 9.
Liczba obrażeń późną zarazą roślinną, obecnych na liściach pomidorów 13 dni po zaszczepieniu
Traktowanie Dni pomiędzy potraktowaniem preparatem i preparatem szczepieniem
4 3 2
Roślina A B c D A B C D A B c D
Bufro 3 2 0 0 1 2 2 0 0 0 4 1
Harpina 0 0 1 0 0 0 0 1 2 1 0 0
DH5(pCPP430) 0 0 0 1 0 2 2 1 0 1 1 0
Potraktowanie harpiną zmniejszyło liczbę obrażeń, które rozwinęły się na roślinach we wszystkich przedziałach czasowych pomiędzy potraktowaniem a szczepieniem. Liczba obrażeń późnej zarazy roślinnej zmniejszyła się także przez wcześniejsze potraktowanie za pomocą DH5(pCPP430), który wytwarza i wydziela harpinę.
Chociaż wynalazek opisano szczegółowo celem jego ilustracji, to rozumie się, że te szczegóły są tylko dla tego celu i specjaliści w tej dziedzinie mogą dokonywać modyfikacji bez naruszenia zakresu i idei wynalazku, określonego następującymi zastrzeżeniami.
182 459
Lista sekwencji
Informacja ogólna:
i) Zgłaszający: Cornell Research Foundation, Inc.
ii) Tytuł wynalazku: Odporność roślin indukowana przez reakcję hipersensytywną (iii ) Liczba sekwencji: 9 (iv) Adres korespandencyjny:
(A) Adres: Nixon, Hargrave, Devans & Doyle LLP (B) Ulica: Clinton Sguare, P.O. Box 1051 (C) Miasto: Rochester (D) Stan: New York (E) Kraj: U.S.A.
(F) Nr kodu: 14603 (v) Postać odczytywalna z komputera:
(A) Rodzaj nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1,0, wersja # 1,30 (vi) Aktualne dane zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia:
(B) Data wpływu:
(C) Klasyfikacja:
(vii) Dane zgłoszenia poprzedniego:
(A) Numer zgłoszenia: US 08/475, 775 (B) Data wpływu: 07 czerwca 1995 (viii) Informacja o adwokacie/agencie:
(A) Nazwisko: Goldman, Michael L.
182 459 (B) Numer rejestracyjny: 30727 (C) Numer referencyjny: 19603/10051 (ix) Informacja telekomunikacyjna:
(A) Telefon: (716) 263-1304 (B) Telefaks: (716) 263-1600 (2) Informacja o SEQ ID Nr 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A ^Długość: 338 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Ilość nici:
(D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID
Met Gin Ile Thr Ile Lys Ala His 15
Gly Leu Gly Ala Gin Gly Leu Lys 20
Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu 3540
Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe 5055
Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly 6570
Phe Gly Asn Gly Ala Gin Gly Ala 85
Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys 100
Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr 115120
Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala 130135
Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn 145150
Asn Gly Leu Gly Gin Ser Met Ser 165
Nr: 1
Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser 1015
Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser 2530
Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr 45
Gly Gly Ala Leu Ala Gin Gly Leu 60
Met Ser Asn Gin Leu Gly Gin Ser 7580
Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys 9095
Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp 105110
Lys Leu Thr Asn Gin Ser Asn Gin 125
Ser Gin Met Thr Gin Gly Asn Met 140
Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly 155 160
Gly Phe Ser Gin Pro Ser Leu Gly 170 175
Ala Gly Gly Leu Gin Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gin Leu
180 185 190
182 459
Gly Asn Ala Ile Gly 195
Leu Ser Asn Val Ser 210
Met Gly Val Gly Gin Asn 200
Thr His Val Asp Gly Asn 215
Ala Ala Leu Ser Ala 205
Asn Arg His Phe Val 220
Asp Lys Glu Asp Arg 225
Gin Tyr Pro Glu Ile 245
Ser Ser Pro Lys Thr 260
Pro Asp Asp Asp Gly 275
Ala Met Gly Met Ile 290
Asn Leu Asn Leu Arg 305
Ala Val Val Gly Asp 325
Gly Met Ala Lys Glu Ile 230 235
Phe Gly Lys Pro Glu Tyr 250
Asp Asp Lys Ser Trp Ala 265
Met Thr Gly Ala Ser Met 280
Lys Ser Ala Val Ala Gly 295
Gly Ala Gly Gly Ala Ser 310 315
Lys Ile Ala Asn Met Ser 330
Gly Gin Phe Met Asp 240
Gin Lys Asp Gly Trp 255
Lys Ala Leu Ser Lys 270
Asp Lys Phe Arg Gin 285
Asp Thr Gly Asn Thr 300
Leu Gly Ile Asp Ala 320
Leu Gly Lys Leu Ala 335
Asn Ala (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 2141 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: pojedyńcza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 2
CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60
GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120
GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180
CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240
TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300
CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG 360
182 459
ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420
CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480
CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540
GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600
AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660
TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720
GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780
GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840
TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900
TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960
CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC 1020
CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG 1080
CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT 1140
GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT 1200
GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA 1260
CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320
TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA 1380
GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440
CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA 1500
TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1560
GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA 1620
ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC 1680
TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA 1740
ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC 1800
GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC 1860
CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1920
CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980
GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040
182 459
AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100
GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141 (2) Informacja dla SEQ ID Nr 3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 385 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Ilość nici:
(C) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 3
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gin Ile Ser 15 io15
Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gin 20 2530
Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn 35 4045
Gin Asn Asp Thr Val Asn Gin Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met 50 5560
Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu 65 70 75gę
Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu 85 9095
Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr 100 105110
Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro 115 120125
Leu Asp Gin Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gin Asn Asp Asp Ser 130 135140
Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met GinGin
145 150 155160
Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gin Ser Leu Phe Gly AspGly
165 170175
Gin Asp Gly Thr Gin Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gin Pro Thr Glu 180 185190
Gly Glu Gin Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly 195 200205
182 459
Leu Met Gly 210 Asn Gly Leu Ser Gin Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly
215 220
Gly Gly Gin 225 Gly Gly Asn 230 Ala Gly Thr Gly Leu Asp 235 Gly Ser Ser Leu 240
Gly Gly Lys Gly Leu 245 Gin Asn Leu Ser Gly Pro Val 250 Asp Tyr Gin Gin 255
Leu Gly Asn Ala Val 260 Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys 265 Ala Gly Ile Gin 270
Ala Leu Asn 275 Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser 280 Thr Arg Ser Phe 285
Val Asn Lys 290 Gly Asp Arg Ala 295 Met Ala Lys Glu Ile 300 Gly Gin Phe Met
Asp Gin Tyr 305 Pro Glu Val 310 Phe Gly Lys Pro Gin Tyr 315 Gin Lys Gly Pro 320
Gly Gin Glu Val Lys 325 Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala 330 Lys Ala Leu Ser 335
Lys Pro Asp Asp Asp 340 Gly Met Thr Pro Ala Ser Met 345 Glu Gin Phe Asn 350
Lys Ala Lys 355 Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly 360 Asp Thr Gly Asn 365
Gly Asn Leu 370 Gin His Ala Val 375 Pro Val Val Leu Arg 380 Trp Val Leu Met
(2) Informacja dla SEQ ID Nr 4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1158 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: pojedyńcza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 4
ATGAGTCTGA ATACAAGTGG GCTGGGAGCG TCAACGATGC AAATTTCTAT CGGCGGTGCG 60
GGCGGAAATA ACGGGTTGCT GGGTACCAGT CGCCAGAATG CTGGGTTGGG TGGCAATTCT 120
GCACTGGGGC TGGGCGGCGG TAATCAAAAT GATACCGTCA ATCAGCTGGC TGGCTTACTC 180
ACCGGCATGA TGATGATGAT GAGCATGATG GGCGGTGGTG GGCTGATGGG CGGTGGCTTA 240
GGCGGTGGCT TAGGTAATGG CTTGGGTGGC TCAGGTGGCC TGGGCGAAGG ACTGTCGAAC 300
182 459
GCGCTGAACG ATATGTTAGG CGGTTCGCTG AACACGCTGG GCTCGAAAGG CGGCAACAAT 360
ACCACTTCAA CAACAAATTC CCCGCTGGAC CAGGCGCTGG GTATTAACTC AACGTCCCAA 420
AACGACGATT CCACCTCCGG CACAGATTCC ACCTCAGACT CCAGCGACCC GATGCAGCAG 480
CTGCTGAAGA TGTTCAGCGA GATAATGCAA AGCCTGTTTG GTGATGGGCA AGATGGCACC 540
CAGGGCAGTT CCTCTGGGGG CAAGCAGCCG ACCGAAGGCG AGCAGAACGC CTATAAAAAA 600
GGAGTCACTG ATGCGCTGTC GGGCCTGATG GGTAATGGTC TGAGCCAGCT CCTTGGCAAC 660
GGGGGACTGG GAGGTGGTCA GGGCGGTAAT GCTGGCACGG GTCTTGACGG TTCGTCGCTG 720
GGCGGCAAAG GGCTGCAAAA CCTGAGCGGG CCGGTGGACT ACCAGCAGTT AGGTAACGCC 780
GTGGGTACCG GTATCGGTAT GAAAGCGGGC ATTCAGGCGC TGAATGATAT CGGTACGCAC 840
AGGCACAGTT CAACCCGTTC TTTCGTCAAT AAAGGCGATC GGGCGATGGC GAAGGAAATC 900
GGTCAGTTCA TGGACCAGTA TCCTGAGGTG TTTGGCAAGC CGCAGTACCA GAAAGGCCCG 960
GGTCAGGAGG TGAAAACCGA TGACAAATCA TGGGCAAAAG CACTGAGCAA GCCAGATGAC 1020
GACGGAATGA CACCAGCCAG TATGGAGCAG TTCAACAAAG CCAAGGGCAT GATCAAAAGG 1080
CCCATGGCGG GTGATACCGG CAACGGCAAC CTGCAGCACG CGGTGCCGGT GGTTCTTCGC 1140
TGGGTATTGA TGCCATGA (2) Informacja dla SEQ ID Nr 5: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 341 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Ilość nici: (E) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 5 Met Gin Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gin Thr Pro Ala Met 1158
1 5 Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu 10 Ala Glu Thr 15 Thr Gly Ser Thr Ser
20 Ser Lys Ala Leu Gin Glu Val Val 25 Val Lys Leu 30 Ala Glu Glu Leu Met
35 Arg Asn Gly Gin Leu 40 Asp Asp Ser Ser Pro Leu 45 Gly Lys Leu Leu Ala
50 Lys Ser Met Ala Ala 55 Asp Gly Lys Ala Gly Gly 60 Gly Ile Glu Asp Val
65 70 75 80
182 459
Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe 85 9095
Qlv Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gin Gin Asp Leu Met y 100 105110
Thr Gin Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu
115 120125
Thr Lys Gin Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met 130 135140
Leu Asn Lys Ile Ala Gin Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gin PhePro
145 150 155160
Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp AsnPhe
165 170175
Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile 180 185190
Gly Gin Gin Leu Gly Asn Gin Gin Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly 195 200205
Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser 210 215220
Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly AspSer
225 230 235240
Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gin Leu Ile Gly Glu Leu IleAsp
245 250255
Arg Gly Leu Gin Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val 260 265270
Asn Thr Pro Gin Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gin Ser Ala Gin 275 280285
Asp Leu Asp Gin Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala 290 295300
Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gin Thr Gly Thr Asp Val Gin Ser SerAla
305 310 315320
Ala Gin Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gin Gly ThrArg
325 330335
Asn Gin Ala Ala Ala 340
Informacja o SEQ ID Nr 6:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1026 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa
182 459 (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 6
ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60
GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120
GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180
AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240
ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300
GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360
AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420
GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480
AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT.TGATGGCGAC 540
GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600
AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660
AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720
GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA 780
TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840
GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900
GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960
GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020
GCCTGA 1026 (2) Informacja o SEQ ID Nr 7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 344 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Ilość nici:
(C) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 7
182 459
Met i 1 Ser 1 yal ( 31y ; i isn ] ile Gin 1 Ser 1 Pro 1 Ser J 10 &sn : Leu : Pro < 31y 1 Leu ( 15 31n
Asn Leu . Asn : Leu j 20 ksn * rhr J ksn ' rhr . Asn ; 25 Ser < Gin ' Gin Ser ( 31y Gin ; 30 Ser
Val Gin . Asp 35 Leu : Ile : Lys f 31n ’ Val 40 Glu Lys Asp Ile Leu 4 45 Asn Ile Ile
Ala Ala 50 Leu Val Gin Lys Ala 55 Ala Gin Ser Ala Gly 60 Gly Asn Thr Gly
Asn 65 Thr Gly Asn Ala Pro 70 Ala Lys Asp Gly Asn 75 Ala Asn Ala Gly Ala 80
Asn Asp Pro Ser Lys 85 Asn Asp Pro Ser Lys 90 Ser Gin Ala Pro Gin 95 Ser
Ala Asn Lys Thr 100 Gly Asn Val Asp Asp 105 Ala Asn Asn Gin Asp 110 Pro Met
Gin Ala Leu 115 Met Gin Leu Leu Glu 120 Asp Leu Val Lys Leu 125 Leu Lys Ala
Ala Leu 130 His Met Gin Gin Pro 135 Gly Gly Asn Asp Lys 140 Gly Asn Gly Val
Gly 145 Gly Ala Asn Gly Ala 150 Lys Gly Ala Gly Gly 155 Gin Gly Gly Leu Ala 160
Glu Ala Leu Gin Glu 165 Ile Glu Gin Ile Leu 170 Ala Gin Leu Gly Gly 175 Gly
Gly Ala Gly Ala 160 Gly Gly Ala Gly Gly 185 Gly Val Gly Gly Ala 190 Gly Gly
Ala Asp Gly 195 Gly Ser Gly Ala Gly 200 Gly Ala Gly Gly Ala 205 Asn Gly Ala
Asp Gly 210 Gly Asn Gly Val Asn 215 Gly Asn Gin Ala Asn 220 Gly Pro Gin Asn
Ala 225 Gly Asp Val Asn Gly 230 Ala Asn Gly Ala Asp 235 Asp Gly Ser Glu Asp 240
Gin Gly Gly Leu Thr 245 Gly Val Leu Gin Lys 250 Leu Met Lys Ile Leu 255 Asn
Ala Leu Val Gin 260 Met Met Gin Gin Gly 265 Gly Leu Gly Gly Gly 270 Asn Gin
Ala Gin Gly 275 Gly Ser Lys Gly Ala 280 Gly Asn Ala Ser Pro 285 Ala Ser Gly
Ala Asn 290 Pro Gly Ala Asn Gin 295 Pro Gly Ser Ala Asp 300 Asp Gin Ser Ser
Gly 305 Gin Asn Asn Leu Gin 310 Ser Gin Ile Met Asp 315 Val Val Lys Glu Val 320
Val Gin Ile Leu Gin 325 Gin Met Leu Ala Ala 330 Gin Asn Gly Gly Ser 335 Gin
Gin Ser Thr Ser Thr Gin . Pro 1 Met
340
182 459 (2) Informacja o SEQ ID Nr 8:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1035 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość nici: pojedyńcza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr: 8 ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60 AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC120 GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC180 GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC240 AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC300 GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA360 GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG420 GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC480 GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC540 GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT600 GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC660 GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC720 CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG780 ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC840 GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT900 GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC960 GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020
ACGCAGCCGA TGTAA
1030
182 459 (2) Informacja o SEQ ID Nr 9:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 26 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Ilość nici:
(C) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Nr:9
Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile
10
Leu Ala Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gin Asp Tyr
20 25
FIG. 2
182 459
ΕΒΗ
ΒΗΕΕΗ ΗΗΗΒ II III II II
Β ΗΒΕ Ε ι ι II I
EH ΗΒΕΗ ju—U—1^/—pCPP43O
ΕΒΗ
ΒΗΕΕΗ ΗΗΗΒ 1 -Ą- Tac4
Β ΗΒΕ _Ι_____Lll_
Ε ε Η ΗΒ ΕΗ
J---u—u—ą /— pCPP43O hrpN , obszar podstawowy dla fenotypu Hrp hrpN □o □ nmni i —m
T π ni ίν v vi vii ' vin ixx
FIG. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.

Claims (57)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób indukowania u roślin odporności na patogeny, znamienny tym, że otrzymuje się polipeptyd lub białko, w postaci niezakaźnej, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadające polipeptydowi lub białku, pochodzącym od lub będącym analogiem patogenu z Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solancearum, Xanthomonas campestris oraz ich mieszaniny, następnie polipeptyd lub białko przykłada się do rośliny, wyzwalając reakcję hipersensytywną.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, odpowiadają polipeptydowi lub białku z Erwinia chrysanthemi.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej SEQ. ID Nr 1.
  4. 4. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną o masie cząsteczkowej 34 kDa.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym z Erwinia amylovora.
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej SEQ. ID Nr 3.
  7. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną o masie cząsteczkowej 37 kDa.
  8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym z Pseudomonas syringae.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej SEQ. ID Nr 5.
  10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną o masie cząsteczkowej 34-35 kDa.
  11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym z Pseudomonas solanacearum.
  12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej SEQ. ID Nr 7.
  13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym zXanthomonas campestris.
  14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej SEQ. ID Nr 9.
  15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd lub białko przykłada się do rośliny dwuliściennej lub jednoliściennej.
  16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że roślina należy do grupy roślin obejmującej ryż, pszenicę, jęczmień, żyto, bawełnę, słonecznik, orzech arachidowy, kukurydzę, ziemniak, słodki ziemniak, fasolę, groch, cykorię, sałatę, endywię, kapustę, kalafior, brokuły, rzepę, rzodkiewkę, szpinak, cebulę, czosnek, bakłażan, pieprz, seler, marchew, dynię (Cucurbita moschata lub maxima), dynię (Cucurbitapepo), cukinię, ogórek, jabłoń, gruszę, melon, truskawkę, winną latorośl, malinę, ananas, soję, tytoń, pomidor, proso oraz trzcinę cukrową.
  17. 17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że roślina należy do grupy roślin obejmującej Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunię, pelargonię, poinsetię, złocień, karnację i cynię.
    182 459
  18. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że patogen, na który roślina jest odporna, należy do grupy obejmującej wirusy, bakterie, grzyby i ich połączenia.
  19. 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białka lub polipeptydy przykłada się do rośliny przez natryskiwanie, wstrzykiwanie lub ścieranie liści w czasie najbliższym czasowi stosowania.
  20. 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną przykłada się do rośliny w postaci kompozycji zawierającej nośnik.
  21. 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się wodę lub roztwory wodne.
  22. 22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosuje się kompozycję zawierającą więcej niż 500 nM polipeptydu lub białka, wyzwalających reakcję hipersensytywną.
  23. 23. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosuje się kompozycję zawierającą dodatki z grupy obejmującej nawóz, insektycyd, fungicyd i ich mieszaniny.
  24. 24. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że izoluje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną.
  25. 25. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną stosuje się w postaci bakterii, które nie wywołują choroby i ulegają transformacji pod działaniem genu kodującego polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną.
  26. 26. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną w postaci bakterii, które wywołują chorobę u gatunków roślin innych niż rośliny poddawane przykładaniu, i zawierąjągen kodujący polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną.
  27. 27. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się infiltrację polipeptydu lub białka do rośliny.
  28. 28. Komórka roślinna odporna na patogen, znamienna tym, że weszła w kontakt z niezakaźnym polipeptydem lub białkiem, wyzwalającym reakcję hipersensytywną odpowiadającym polipeptydowi lub białku, pochodzącym od lub będącym analogiem patogenu należącego do grupy obejmującej Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solancearum, Xanthomonas campestris oraz ich mieszaniny.
  29. 29. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadają polipeptydowi lub białku z Erwinia chrysanthemi.
  30. 30. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną ma sekwencję aminokwasową odpowiadającą SEQ. ID Nr 1.
  31. 31. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym z Erwinia amylovora.
  32. 32. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną ma sekwencję aminokwasową odpowiadającą SEQ. ID Nr 3.
  33. 33. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym z Pseudomonas syringae.
  34. 34. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną ma sekwencję aminokwasową odpowiadającą SEQ. ID Nr 5.
  35. 35. Polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym z Pseudomonas solanacearum.
  36. 36. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną ma sekwencję aminokwasową odpowiadającą SEQ. ID Nr 7.
  37. 37. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym zXanthomonas campestris.
    182 459
  38. 38. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną ma sekwencję aminokwasową odpowiadającą SEQ, ID Nr 9.
  39. 39. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że roślina należy do grupy obejmującej ryż, pszenicę, jęczmień, żyto, bawełnę, słonecznik, orzech arachidowy, kukurydzę, ziemniak, słodki ziemniak, fasolę, groch, cykorię, sałatę, endywię, kapustę, kalafior, brokuły, rzepę, rzodkiewkę, szpinak, cebulę, czosnek, bakłażan, pieprz, seler, marchew, dynię {Cucurbita moschata lub maxima), dynię (Cucurbitapepó), cukinię, ogórek, jabłoń, gruszę, melon, truskawkę, winną latorośl, malinę, ananas, soję, tytoń, pomidor, proso oraz trzcinę cukrową.
  40. 40. Komórka roślinna według zastrz. 39, znamienna tym, że roślina należy do grupy roślin obejmującej Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunię, pelargonię, poinsetię, złocień, karnację oraz cynię.
  41. 41. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że patogen, na który roślina jest odporna, należy do grupy obejmującej wirus, bakterię, grzyb oraz ich połączenia.
  42. 42. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, mają postać wyizolowaną.
  43. 43. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że jest transformowana genem kodującym białko lub polipeptyd wyzwalający reakcję hipersensytywną, w kontakcie z niechorobotwórczą bakterią.
  44. 44. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że zawiera gen kodujący hipersensytywne białko lub polipeptyd wyzwalający reakcję hipersensytywną, w kontakcie z niechorobotwórczą bakterią.
  45. 45. Komórka roślinna według zastrz. 29, która nie powoduje choroby, znamienna tym, że jest infiltrowana przez polipeptyd lub białko.
  46. 46. Kompozycja do nadawania roślinom odporności przeciwko patogenowi, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera niezakaźny polipeptyd lub białko, wyzwalający reakcję hipersensytywną odpowiadającym polipeptydowi lub białku, pochodzącym od lub będącym analogiem patogenu z Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solancearum, Xanthomonas campestris oraz ich mieszaniny i nośnik.
  47. 47. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku zErwinia chrysanthemi.
  48. 48. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym z Erwinia amylovora.
  49. 49. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym z Pseudomonas syringae.
  50. 50. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym z Pseudomonas solanacearum.
  51. 51. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną odpowiadająpolipeptydowi lub białku pochodzącym zXanthomonas campestris.
  52. 52. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że jako nośnik zawiera wodę i roztwory wodne.
  53. 53. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że kompozycja zawiera więcej niż 500 nM polipeptydu lub białka, wyzwalających reakcję hipersensytywną.
  54. 54. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że kompozycja zawiera ponadto dodatki należące do grupy obejmującej nawóz, insektycyd, fungicyd oraz ich mieszaniny.
  55. 55. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną mają postać wyizolowaną.
  56. 56. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną są wytwarzane lub mogą być wytwarzane przez bakterie w kom
    182 459 pozycji, przy czym wymienione bakterie nie wywołują choroby i ulegają transformacji pod działaniem genu kodującego polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną.
  57. 57. Kompozycja według zastrz. 46, znamienna tym, że polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną, są wytwarzane lub mogą być wytwarzane przez bakterie zdolne do wywoływania choroby w roślinach i zawierające gen kodujący polipeptyd lub białko, wyzwalające reakcję hipersensytywną.
    * * *
PL96323823A 1995-06-07 1996-06-05 Sposób indukowania u roślin odporności na patogeny PL182459B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47577595A 1995-06-07 1995-06-07
PCT/US1996/008819 WO1996039802A1 (en) 1995-06-07 1996-06-05 Hypersensitive response induced resistance in plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL323823A1 PL323823A1 (en) 1998-04-27
PL182459B1 true PL182459B1 (pl) 2002-01-31

Family

ID=23889089

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96323823A PL182459B1 (pl) 1995-06-07 1996-06-05 Sposób indukowania u roślin odporności na patogeny

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5859324A (pl)
EP (1) EP0871354B1 (pl)
JP (1) JP3961023B2 (pl)
KR (1) KR100529261B1 (pl)
CN (1) CN1131663C (pl)
AU (1) AU714512B2 (pl)
BR (1) BR9609073A (pl)
CA (1) CA2223616C (pl)
DE (1) DE69635307T2 (pl)
DK (1) DK0871354T3 (pl)
ES (1) ES2248810T3 (pl)
FI (1) FI974430A7 (pl)
NZ (1) NZ309611A (pl)
PL (1) PL182459B1 (pl)
WO (1) WO1996039802A1 (pl)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6235974B1 (en) * 1996-12-05 2001-05-22 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment with a hypersensitive response elicitor
US6277814B1 (en) * 1997-01-27 2001-08-21 Cornell Research Foundation, Inc. Enhancement of growth in plants
US6998515B1 (en) 1997-01-27 2006-02-14 Cornell Research Foundation, Inc. Use of a nucleic acid encoding a hypersensitive response elicitor polypeptide to enhance growth in plants
US5977060A (en) * 1997-02-28 1999-11-02 Cornell Research Foundation, Inc. Insect control with a hypersensitive response elicitor
NZ501138A (en) * 1997-05-30 2002-11-26 Cornell Res Foundation Inc Hypersensitive response elicitor protein or polypeptide fragments from Erwinia
US6172184B1 (en) 1997-08-06 2001-01-09 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response elicitor from Pseudomonas syringae and its use
US6228644B1 (en) 1997-08-06 2001-05-08 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response elicitor from Erwinia amylovora, its use, and encoding gene
US6262018B1 (en) 1997-08-06 2001-07-17 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response elicitor from Erwinia amylovora and its use
US6333302B1 (en) 1997-09-03 2001-12-25 Cornell Research Foundation, Inc. Use of hypersensitive response elicitor protein or polypeptide from Clavibacter michiganensis for disease resistance, growth enhancement and insect control
ID27274A (id) * 1998-02-25 2001-03-22 Wisconsin Alumni Res Found Gen spesifitas kultivar dari patogen padi magnaporthe grisea, dan metode-metode penggunaannya
US6960705B2 (en) 1998-10-05 2005-11-01 Eden Bioscience Corporation Nucleic acid encoding a hypersensitive response elicitor from Xanthomonas campestris
US6858707B1 (en) * 1998-10-05 2005-02-22 Eden Bioscience Corporation Hypersensitive response elicitor fragments which are active but do not elicit a hypersensitive response
US6624139B1 (en) * 1998-11-05 2003-09-23 Eden Bioscience Corporation Hypersensitive response elicitor-induced stress resistance
EP1127145A2 (en) * 1998-11-06 2001-08-29 Cornell Research Foundation, Inc. HYPERSENSITIVE RESPONSE ELICITOR FROM $i(AGROBACTERIUM VITIS)
US6190716B1 (en) * 1999-02-17 2001-02-20 Scott O. Galbreath, Jr. Method for preparing a grape derived product
FR2799935A1 (fr) * 1999-10-25 2001-04-27 Mycos Procede de stimulation des defenses naturelles des plantes, utilisations et compositions correspondantes
AU2001233007A1 (en) 2000-01-26 2001-08-07 Cornell Research Foundation Inc. Oomycete-resistant transgenic plants by virtue of pathogen-induced expression ofa heterologous hypersensitive response elicitor
US20020019337A1 (en) 2000-04-19 2002-02-14 Zhong-Min Wei Treatment of fruits or vegetables with hypersensitive response elicitor to inhibit postharvest disease or desiccation
WO2001098501A2 (en) * 2000-06-16 2001-12-27 Eden Bioscience Corporation Hypersensitive response eliciting domains of bacterial harpins and use thereof
JP2002325519A (ja) 2000-09-07 2002-11-12 Japan Tobacco Inc 病害抵抗性植物及びその作出方法
US20030104979A1 (en) * 2000-11-13 2003-06-05 Zhong-Min Wei Methods of inhibiting desiccation of cuttings removed from ornamental plants
KR20030015010A (ko) * 2001-08-14 2003-02-20 주식회사 파이오니아 신규한 가지검은마름병원균 ｗｔ＃３（ｋｃｃｍ１０２８３）유래 ｗｔ＃３－１유전자를 이용한 새로운생물농약
US6887980B2 (en) * 2001-08-31 2005-05-03 National Chung Hsing University OrfF and OrfF′ polypeptides from Xanthomonas campestris
WO2004057957A2 (en) * 2002-12-16 2004-07-15 Eden Bioscience Corporation Method for increasing the efficacy of agricultural chemicals
US6743752B2 (en) 2003-03-28 2004-06-01 Northern Quinoa Corporation Method of protecting plants from bacterial diseases
US7638841B2 (en) * 2003-05-20 2009-12-29 Fairchild Semiconductor Corporation Power semiconductor devices and methods of manufacture
KR100959251B1 (ko) * 2007-11-20 2010-05-26 한국생명공학연구원 세균의 유전물질을 포함하는 식물 병원균에 대한 저항성을증가시키기 위한 조성물, 방법 및 상기 방법에 의해 제조된식물체
CN105707127A (zh) * 2008-08-12 2016-06-29 植物保健公司 稳定的液体harpin蛋白制剂的制备、制剂及用途
CA2832939C (en) 2011-04-15 2022-06-21 Syngenta Participations Ag Pesticidal compositions comprising a nematode-antagonistic biocontrol agent
US10856546B2 (en) 2014-10-01 2020-12-08 Plant Health Care, Inc. Hypersensitive response elicitor peptides and use thereof
JP2017532981A (ja) 2014-10-01 2017-11-09 プラント ヘルス ケア インコーポレイテッド 破壊された過敏感反応ボックスを有するエリシターペプチド及びその使用
EP3439682B1 (en) 2016-04-06 2025-08-13 Plant Health Care, Inc. Hypersensitive response elicitor-derived peptides and use thereof
BR112018069945A2 (pt) 2016-04-06 2019-02-05 Plant Health Care Inc micróbios benéficos para distribuição de peptídeos ou proteínas efetoras e uso dos mesmos
CN113621074B (zh) * 2021-08-06 2023-04-25 苏州乙水茉生物科技有限公司 一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用
CN114163549B (zh) * 2022-01-06 2022-10-04 苏州乙水茉生物科技有限公司 壳寡糖与二价植物疫苗共价偶联体及其制备方法和应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA19798A1 (fr) * 1982-06-08 1983-12-31 Novartis Ag Agent de lutte contre les maladies des plantes ; sa preparation et son application a la protection des plantes .
US4597972A (en) * 1983-06-10 1986-07-01 Aplin & Barrett, Ltd. Nisin as an antibotulinal agent for food products
US4569841A (en) * 1983-06-10 1986-02-11 Chevron Research Company Erwinia herbicola strain that inhibits pathogenic plant bacteria
US4601842A (en) * 1983-08-01 1986-07-22 University Patents, Inc. Prevention of freezing at moderate supercooling using biogenic ice nucleation inhibitors
US4740593A (en) * 1983-09-06 1988-04-26 Microlife Technics, Inc. Derived nisin producing microorganisms, method of production and use and products obtained thereby
EP0162551B1 (en) * 1984-04-03 1992-01-08 Michael James Sampson Agricultural pesticides
US5243038A (en) * 1986-11-04 1993-09-07 Protein Polymer Technologies, Inc. Construction of synthetic DNA and its use in large polypeptide synthesis
US5061490A (en) * 1987-07-29 1991-10-29 W. R. Grace & Co.-Conn. Biological inoculant
ATE82668T1 (de) * 1987-08-21 1992-12-15 Ciba Geigy Ag Benzothiadiazole und ihre verwendung in verfahren und mitteln gegen pflanzenkrankheiten.
US5614395A (en) * 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
NL8800725A (nl) * 1988-03-23 1989-10-16 Mogen International N V En Rij Recombinant dna; getransformeerde microorganismen, plantecellen en planten; werkwijze voor het produceren van een polypeptide of eiwit m.b.v. planten of plantecellen; werkwijze voor het produceren van planten met virusresistentie.
US5217950A (en) * 1988-06-22 1993-06-08 Applied Microbiology, Inc. Nisin compositions for use as enhanced, broad range bactericides
US5135910A (en) * 1988-06-22 1992-08-04 The Public Health Research Institute Of The City Of New York Nisin compositions for use as enhanced, broad range bactericides
US5260271A (en) * 1988-06-22 1993-11-09 Applied Microbiology, Inc. Nisin compositions for use as enhanced broad range bactericides
US5244658A (en) * 1988-08-03 1993-09-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Biological inoculant effective against aphanomyces
US5173403A (en) * 1989-02-24 1992-12-22 Oklahoma Medical Research Foundation Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius and gene
CA2066627C (en) * 1989-10-27 2001-02-20 Pappachan E. Kolattukudy Protection of growing crops from pathogens by treatment with enzymes
PH30997A (en) * 1990-03-12 1997-12-23 Ciba Geigy Antipathologenically effective compositions comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes.
WO1994001546A1 (en) * 1992-07-01 1994-01-20 Cornell Research Foundation, Inc. Elicitor of the hypersensitive response in plants
EP0612848A3 (fr) * 1993-02-24 1995-05-24 Sandoz Ltd Gène associé à l'hypersensibilité.
US5708139A (en) * 1993-05-17 1998-01-13 Cornell Research Foundation, Inc. Pseudomonas syringae pv syringae hrpZ gene
US5494684A (en) * 1994-02-23 1996-02-27 Bar-Ilan University Plant protection from infection by Phytophthora infestans using fish oil

Also Published As

Publication number Publication date
JP3961023B2 (ja) 2007-08-15
WO1996039802A1 (en) 1996-12-19
JPH11506938A (ja) 1999-06-22
ES2248810T3 (es) 2006-03-16
FI974430L (fi) 1998-01-26
EP0871354A1 (en) 1998-10-21
KR19990022577A (ko) 1999-03-25
US5776889A (en) 1998-07-07
CN1131663C (zh) 2003-12-24
EP0871354A4 (en) 2000-07-19
US5859324A (en) 1999-01-12
DE69635307T2 (de) 2006-07-13
DK0871354T3 (da) 2006-03-06
MX9709781A (es) 1998-10-31
NZ309611A (en) 1999-08-30
KR100529261B1 (ko) 2006-04-21
EP0871354B1 (en) 2005-10-19
FI974430A0 (fi) 1997-12-05
DE69635307D1 (de) 2006-03-02
CA2223616C (en) 2011-02-15
CA2223616A1 (en) 1996-12-19
FI974430A7 (fi) 1998-01-26
PL323823A1 (en) 1998-04-27
BR9609073A (pt) 1999-01-26
AU5982196A (en) 1996-12-30
AU714512B2 (en) 2000-01-06
CN1192647A (zh) 1998-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU714512B2 (en) Hypersensitive response induced resistance in plants
AU744776B2 (en) Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment
US6624139B1 (en) Hypersensitive response elicitor-induced stress resistance
WO1998024297A9 (en) Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment
AU740564B2 (en) Insect control with a hypersensitive response elicitor
AU750732B2 (en) Hypersensitive response elicitor fragments and uses thereof
WO1998037752A9 (en) Insect control with a hypersensitive response elicitor
US20020062500A1 (en) Hypersensitive response eliciting domains and use thereof
US6858707B1 (en) Hypersensitive response elicitor fragments which are active but do not elicit a hypersensitive response
WO2000020452A9 (en) Hypersensitive response elicitor fragments which are active but do not elicit a hypersensitive response
MXPA97009781A (en) Induced resistance of hypersensitive response in plan
MXPA99005166A (en) Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20050605