PL191414B1

PL191414B1 - Sfermentowany, wysuszony materiał roślinny o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe, sposób jego wytwarzania, środek farmaceutyczny, dodatek żywnościowy oraz zastosowanie sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego

Info

Publication number: PL191414B1
Application number: PL338891A
Authority: PL
Inventors: Maté Hidvégi; Farkas Rita Tömösközine; Karoly Lapis; Erzsébet Rasó; Béla Szende
Original assignee: Hidvegi Mate; Karoly Lapis; Raso Erzsebet; Szende Bela; Tomoskozine Farkas Rita
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 2006-05-31
Also published as: ME00638B; HK1033097A1; CN1192099C; JP4387586B2; EP1003536B1; DE69809434D1; SK282917B6; UA67747C2; SK1862000A3; TR200000404T2; CZ298654B6; EP1003536A1; IL134493A; CA2300208A1; JP2009240327A; NO20000675L; NO323562B1; PL338891A1; HUP9801797A2; AU8880298A

Abstract

1. Sfermentowany, wysuszony material roslinny o dzialaniu immunosty- mulujacym i hamujacym przerzuty nowotworowe, znamienny tym, ze pochodzi z cieczy fermentacyjnej wytworzonej droga fermentacji zarodków pszenicznych z uzyciem Saccharomyces cerevisiae w srodowisku wodnym. 5. Sposób wytwarzania sfermentowanego, wysuszonego materialu ro- slinnego o dzialaniu immunostymulujacym i hamujacym przerzuty nowotworo- we, znamienny tym, ze zmielone zarodki pszeniczne poddaje sie fermentacji w srodowisku wodnym w obecnosci Saccharomyces cerevisiae, a ciecz fermentacyjna oddziela sie, dokladnie filtruje, odparowuje, utrzymuje w stanie wrzenia i suszy, jako taka lub w obecnosci pomocniczych materialów suszacych. 8. Srodek farmaceutyczny o dzialaniu immunostymulujacym i hamuja- cym przerzuty nowotworowe zawierajacy substancje czynna oraz ewentualnie znane substancje pomocnicze, znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera sfermentowany, wysuszony material roslinny pochodzacy z cieczy fermentacyjnej wytworzonej droga fermentacji zarodków pszenicznych w srodowisku wodnym w obecnosci Saccharomyces cerevisiae. 9. Dodatek zywnosciowy dla ssaków, znamienny tym, ze zawiera sfer- mentowany, wysuszony material roslinny pochodzacy z cieczy fermentacyjnej wytworzonej droga fermentacji zarodków pszenicznych w srodowisku wodnym w obecnosci Saccharomyces cerevisiae. 11. Zastosowanie sfermentowanego, wysuszonego materialu roslinnego pochodzacego z cieczy fermentacyjnej wytworzonej droga fermentacji zarod- ków pszenicznych w srodowisku wodnym w obecnosci Saccharomyces cerevisiae, do wytwarzania srodka farmaceutycznego o dzialaniu immunosty- mulujacym i hamujacym przerzuty nowotworowe. 12. Zastosowanie sfermentowanego, wysuszonego materialu roslinnego pochodzacego z cieczy fermentacyjnej wytworzonej droga fermentacji zarodków pszenicznych w srodowisku wodnym w obecnosci Saccharomyces cerevisiae do wytwarzania dodatku zywnosciowego przeznaczonego dla ssaków. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są sfermentowany, wysuszony materiał roślinny o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe, sposób jego wytwarzania, środek farmaceutyczny, dodatek żywnościowy oraz zastosowanie sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego.

Jednym z podstawowych celów leczenia nowotworów jest hamowanie przerzutów, ponieważ guz powstały na skutek złośliwego wzrostu komórek rozprzestrzenia się poprzez tworzenie przerzutów do sąsiednich komórek i narządów, co prowadzi do powstania wtórnych nowotworów, których nie można usunąć chirurgicznie i które mogą również stać się oporne na chemioterapię.

Badania naukowe koncentrują się w coraz większym stopniu na opracowywaniu materiałów o działaniu immunomodulującym, a intensywnym badaniom poddano materiały pochodzenia naturalnego, przede wszystkim roślinnego.

Dobrze wiadomo, że związki o budowie chinonu odgrywają istotną rolę biologiczną. W niektórych roślinach znaleziono pewne pochodne chinonu, jak ubichinony, plastochinony, menachinony, które odgrywają rolę w procesie fotosyntezy, ale również stanowią część układu oddechowego kręgowców, a więc również ludzi, a także biorą udział w procesie wykrzepiania krwi. Pewne pochodne benzochinonu stosowane są również w celach medycznych. Adriamycyna, daunorubicyna i mitomycyna C to pochodne chinonu o działaniu cytostatycznym, podczas gdy inne benzo- i hydrochinony wykazują działanie przeciwdrobnoustrojowe i są czynnymi składnikami antybiotyków stosowanych w leczeniu zakażeń bakteryjnych, takich jak tetran-B, metacyklina i doksycyklina.

W literaturze fachowej istnieją doniesienia, że 2,6-dimetoksy-p-benzochinon (2,6-DMBQ) i 2-metoksy-p-benzochinon (2-MBQ) mają działanie grzybobójcze i bakteriostatyczne, a także charakteryzują się cytotoksycznością w stosunku do komórek nowotworów złośliwych [Int. J. Quant. Chem.: Quant. Biol. Symp. 7, 217-222 (1980), 9., 27-30 (1982) i 12., 257-261 (1985); Phytochemistry 27., 225 (1971), J. Agric. Food Chem. 39., 266 (1991)]. Wykazano, że mieszanina 2,6-dimetoksy-pbenzochinonu i kwasu askorbinowego hamuje wzrost komórek nowotworowych puchliny brzusznej Ehrlicha u myszy. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81., 2088-2091 (1984) i 82, 1439-1442 (1985)].

2,6-Dimetoksy-p-benzochinon i 2-metoksy-p-benzochinon odkryto i wyizolowano z szeregu roślin [Magy. Kem. Folyóirat 102/7., 320-325 (1996)]. Te dwa związki występują w dużych ilościach w postaci glukozydu w pszenicy (Tricitum vulgaris), a dokładniej w zarodkach pszenicznych. W latach pięćdziesiątych izolowano te związki z zarodków pszenicznych poddanych fermentacji z użyciem drożdży i identyfikowano celem badania spadku jakości chleba, do którego dodano zarodki pszeniczne [Helv. Him. Acta 33., 433 (1950); J. Chem. Soc. London 1952, 4821-4823].

Zgodnie z literaturą fachową zawartość 2-MBQ w zarodkach pszenicznych wynosi około 0,05 % wagowych, a zawartość 2,6-DMBQ około 0,01% wagowych (w postaci glukozydu). Obecność chinonów w postaci glukozydów tłumaczy się faktem, że chinony, a zwłaszcza p-benzochinony podstawione grupą metoksylową, są wysoce reaktywne, podczas gdy glukozydy hydrochinonu są trwalsze i obojętne.

W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 684306 ujawniono biomasę użyteczną jako zaczyn do produkcji chleba. Biomasa ta stanowi produkt otrzymany przez hodowlę pożywki zbożowej z Saccharomyces cerevisiae w środowisku wodnym. Gotową biomasę stosuje się bezpośrednio lub po nieznacznym zatężeniu przed użyciem.

Podczas prowadzenia naszych doświadczeń z fermentacją zarodków pszenicznych doszliśmy do wniosku, że suchy ekstrakt pochodzący z cieczy fermentacyjnej otrzymanej w procesie fermentacji zarodków pszenicznych z użyciem drożdży piekarniczych (Saccharomyces cerevisiae) charakteryzuje się nieoczekiwanymi właściwościami immunostymulującymi i hamującymi przerzuty nowotworowe, i że można go z dobrym skutkiem stosować jako substancję czynną środków farmaceutycznych o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe.

To odkrycie jest nieoczekiwane, ponieważ mimo istnienia pewnych doniesień w literaturze fachowej [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80., 129 (1983)], mówiących, że mieszanina 2,6-DMBQ i kwasu askorbinowego hamuje wzrost komórek nowotworowych puchliny brzusznej Ehrlicha -są one wysoce odpowiednie do celów analizy ilościowej wzrostu nowotworów i w badaniu ich funkcji biochemicznych - ekstrakt opisany w wynalazku, zawierający, oprócz niemożliwych do określenia składników, 2,6-DMBQ i 2-MBQ -okazał się w praktyce nieskuteczny w przypadku tych pierwotnych komórek nowotworowych, nawet w połączeniu z kwasem askorbinowym - w zasadzie w stosunku do wszystkich nowotworów pierwotnych, i okazał się bardzo skuteczny jedynie w leczeniu przerzutów nowotworoPL 191 414 B1 wych. Aspekty terapii pierwotnych nowotworów i powstających z nich przerzutów są zupełnie odmienne, toteż dla osoby prowadzącej badanie nie było oczywiste, czy ekstrakt roślinny zawierający składniki, o których wiadomo, że są skuteczne w leczeniu pierwotnych nowotworów, a których skład chemiczny nie został całkowicie poznany, będą wywierały działanie immunostymulujące i hamujące przerzuty nowotworowe. [Cancer, Principles and Practice of Oncology, tom 1, wydanie 4, J. B. Lippincott Company, Filadelfia, 1993].

Zatem wynalazek dotyczy sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe pochodzącego z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych z użyciem Saccharomyces cerevisiae w środowisku wodnym.

Korzystnie materiał według wynalazku cechuje się chromatogramem HPLC zasadniczo odpowiadającym podanemu na fig. 3.

Korzystnie według HPLC zawartość 2,6-dimetoksy-p-benzochinonu wynosi 0,12 - 0,52 mg/g suchego materiału, a zawartość 2-metoksy-p-benzochinonu wynosi 0,05 -0,28 mg/g suchego materiału, korzystniej zawartość 2,6-dimetoksy-p-benzochinonu wynosi 0,4 mg/g suchego materiału.

W tym miejscu należy zaznaczyć, że pełna identyfikacja składu chemicznego ekstraktu nie była możliwa z zastosowaniem dostępnych metod, toteż wszystkie dane dotyczą zawartości 2,6-dimetoksyp-benzochlnonu jako wartości podstawowej.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania powyżej określonego sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe, który charakteryzuje się tym, że zmielone zarodki pszeniczne poddaje się fermentacji w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae, a ciecz fermentacyjną oddziela się, dokładnie filtruje, odparowuje, utrzymuje w stanie wrzenia i suszy, jako taką lub w obecności pomocniczych materiałów suszących.

Korzystnie fermentację prowadzi się w temperaturze około 30°C, przez około 18 godzin, ze stałym napowietrzaniem i mieszaniem, suszenie zaś prowadzi się w obecności maltodekstryny.

Ponadto wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe zawierającego substancję czynną oraz ewentualnie znane substancje pomocnicze, którego cechą jest to, że jako substancję czynną zawiera powyżej określony sfermentowany, wysuszony materiał roślinny pochodzący z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae.

Ponadto wynalazek dotyczy dodatku żywnościowego dla ssaków zawierającego powyżej określony sfermentowany, wysuszony materiał roślinny pochodzący z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae.

Korzystnie dodatek żywnościowy według wynalazku zawiera wysuszony materiał roślinny otrzymany sposobem według wynalazku, zawierający 60% wagowych sfermentowanego materiału i 40% wagowych maltodekstryny.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania powyżej określonego sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego pochodzącego z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae, do wytwarzania środka farmaceutycznego o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania powyżej określonego sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego pochodzącego z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae do wytwarzania dodatku żywnościowego przeznaczonego dla ssaków.

Substancją odpowiednią do stosowania w wytwarzaniu sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego okazały się zarodki pszeniczne - produkt uboczny powstający w procesie mielenia mąki, dostępny w dużych ilościach - rozdrobnione podobnie jak mąka, w stanie naturalnym lub odtłuszczonym. Z zastosowaniem odtłuszczonych zarodków pszenicznych nie wiążą się żadne specjalne korzyści. Fermentację prowadzono z użyciem drożdży piekarniczych (Saccharomyces cerevisiae). Ten gatunek drożdży dostępny jest na rynku. Okres fermentacji wynosił około 10-24 godzin, korzystnie 15-20 godzin lub około 18 godzin. Fermentację prowadzono w temperaturze około 25-35°C, korzystnie w temperaturze około 30°C. Stosunek wagowy zarodków pszenicznych do drożdży wynosił 4:1 -2:1, korzystnie około 3:1, a stosunek wagowy substancji suchej do wody wynosił około 1:6 - 1:12, korzystnie około 1:9.

PL 191 414 B1

Proces fermentacji w skali laboratoryjnej można przeprowadzić w szklanym naczyniu do fermentacji, przez dodanie do świeżo zmielonych zarodków pszenicznych zawiesiny drożdży w wodzie i poprzez mieszanie lub wytrząsanie mieszaniny. Ciecz fermentacyjna pieni się.

Po fermentacji mieszaninę wiruje się przez 5-15 minut przy 2000 - 4500 obr./min., korzystnie przy około 3000 obr./min. Płyn znad osadu doprowadza się do wrzenia, chłodzi i suszy w odpowiedni sposób, np. przez liofilizację lub przez suszenie rozpryskowe.

Produkt, czerwonawo-brązowy proszek, stanowi materiał według wynalazku. Korzystne jest utrzymywanie go w postaci schłodzonej do chwili użycia, a z uwagi na właściwości higroskopowe powinien być on przechowywany w szczelnych pojemnikach. Zawartość 2,6-DMBQ w powstałym suchym materiale wynosi około 0,4 mg/g.

W przypadku fermentacji prowadzonej na dużą skalę (np. 4 m³) korzystne jest stałe napowietrzanie, np. 0,5 l powietrza/litr cieczy fermentacyjnej/minutę, i powolne mieszanie. Okres fermentacji wynosi około 18 godzin. Celem zahamowania pienienia można stosować standardowe dodatki - korzystne jest stosowanie oleju słonecznikowego. Pod koniec procesu fermentacji przerywa się napowietrzanie i mieszanie, a ciecz fermentacyjną oddziela się od zawiesiny zarodków pszenicznych i drożdży w znany sposób, np. z użyciem dekantera ślimakowego, a potem rozdzielacza i prasy filtracyjnej. Jeżeli jest to konieczne, można dodać materiał wspomagający filtrację. Odpowiednie jest stosowanie 5-10 kg filtrującego perlitu na 1 m³ cieczy fermentacyjnej. Ciecz fermentacyjną filtruje się dokładnie, a jakość procesu filtracji sprawdza się z użyciem mikroskopu. Przefiltrowana ciecz fermentacyjna nie zawiera praktycznie żadnych komórek, co oznacza, że w dziesięciu polach widzenia nie znajduje się więcej niż jednej komórki drożdży. Uzyskaną ciecz fermentacyjną, zawierającą około 1,5% wagowych suchego materiału, odparowuje się w wyparce próżniowej, korzystnie w temperaturze około 40 - 50°C, a po zakończeniu procesu próżniowego ogrzewa się go do wrzenia pod ciśnieniem atmosferycznym przez około 15 minut. Powoduje to zmniejszenie szkodliwej aktywności enzymów. Następnie mieszaninę suszy się rozpryskowo, np. w rozpryskowej wyparce obrotowej. Gdy stosuje się taki proces fermentacji, jak wspomniano powyżej, zawartość 2,6-DMBQ w uzyskanym sfermentowanym, wysuszonym materiale roślinnym wynosi około 0,12 - 0,52 mg/g suchego materiału, a zawartość 2 MBQ wynosi 0,05 - 0,28 mg/g suchego materiału - w zależności od zawartości benzochinonu w stosowanych zarodkach pszenicznych.

Ponieważ produkt końcowy jest higroskopijny, celem zwiększenia skuteczności suszenia rozpryskowego i zastosowania produktu końcowego, podczas suszenia rozpryskowego można stosować zwykłe dodatki, np. maltodekstrynę, gumę arabską, żywicę guar, ksantan, mąkę z nasion grochodrzewu itp. Korzystnie stosuje się maltodekstrynę. Odpowiednio prowadzony proces polega na tym, że ustala się zawartość suchego materiału w mieszaninie odparowanej w wyparce próżniowej i ogrzanej, po czym dodaje się taką ilość maltodekstryny, by zawartość suchego materiału w suszonej mieszaninie wynosiła około 30% wagowych. Można rozpuścić maltodekstrynę w gorącej wodzie, a po ochłodzeniu dodać do zatężonej mieszaniny. Po wysuszeniu produkt końcowy - proszek - zawiera około 60% wagowych sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego i około 40% wagowych maltodekstryny.

Trwałość otrzymanego materiału można sprawdzić monitorując zmiany stężenia 2,6-DMBQ. Analizę ilościową można prowadzić z użyciem HPLC. Proszek uzyskany powyższym sposobem pozostaje trwały przez okres około 3 lat w temperaturze pokojowej.

Sfermentowany, wysuszony materiał roślinny według wynalazku można stosować jako substancję czynną środków farmaceutycznych o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe. Taki środek farmaceutyczny może, oprócz tej substancji czynnej, zawierać również kwas askorbinowy lub inny materiał o działaniu cytostatycznym.

Sfermentowany, wysuszony materiał roślinny można poddawać obróbce dla nadania mu postaci znanych stałych lub ciekłych środków farmaceutycznych, przeznaczonych do stosowania drogą doustną lub pozajelitową. W procesie wytwarzania środków farmaceutycznych należy uwzględnić higroskopowe właściwości sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego. Odpowiednią postacią jest kapsułka, która chroni substancję czynną przed wilgocią atmosferyczną.

W procesie wytwarzania środków farmaceutycznych można zastosować znane substancje pomocnicze stosowane w praktyce farmaceutycznej. Ponieważ te materiały i ich możliwe zastosowania są szczegółowo opisane w literaturze fachowej, wybór i wytworzenie odpowiedniej postaci stanowi zadanie rutynowe. Jednorazowe dawkowanie skutecznego środka może znacznie różnić się w zależności od stanu zdrowia pacjenta, a wybór odpowiedniej skutecznej dawki należy zawsze do lekarza.

PL 191 414 B1

Ogólnie, korzystne wyniki można uzyskać poprzez zastosowanie dawki w zakresie 0,001 -100 g, korzystnie 0,01 -50 g, a korzystniej 0,1 -40 g na kg masy ciała, np. w dawkach 0,1 -10, 1-25 lub 10 -30 g.

Sfermentowany, wysuszony materiał roślinny według wynalazku można także mieszać z kwasem askorbinowym (witaminą C). Zgodnie z wynikami naszych doświadczeń, kwas askorbinowy może nasilać działanie hamujące przerzuty nowotworowe materiału według wynalazku. Stosunek wagowy sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego i kwasu askorbinowego może wynosić np. 10:1 - 1:1, korzystnie 6:1 -2:1, a korzystniej 3:1, 4:1 lub 5:1.

Sfermentowany, wysuszony materiał roślinny, według wynalazku, znajduje zastosowanie do leczenia immunostymulującego i/lub hamującego przerzuty nowotworowe. Zasadą leczenia jest podanie pacjentowi skutecznej ilości sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego.

W przypadku stosowania sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego jako dodatku żywnościowego dla ssaków korzystne jest stosowanie mieszaniny zawierającej maltodekstrynę i znane w przemyśle spożywczym materiały pomocnicze, np. dodatki zapachowo-smakowe, słodzące, koloryzujące itp. Dodatek żywnościowy można wytworzyć np. poprzez granulację mieszaniny zawierającej 60% wagowych wysuszonego materiału i 40% wagowych maltodekstryny oraz materiały zapachowe i słodzące w podłożu płynnym, i zapakowanie granulatu instant np. w torebki.

Poniżej przedstawiono opis załączonych figur:

Figura 1. Wykres kalibracyjny dla pomiarów 2,6 DMBQ metodą HPLC.

Figura 2. Chromatogram HPLC chloroformowego ekstraktu materiału.

Figura 3. Chromatogram HPLC etanolowego ekstraktu materiału.

Figura 4. Wiązanie komórek nowotworowych B16 w obecności liofilizatu w różnych stężeniach w 60. i 90. minucie po ich umieszczeniu. (Każda wartość przedstawia średnią uzyskaną z 8 równoległych pomiarów ± odchylenie standardowe, ocena spektrofotometryczna).

Figura 5. Wpływ różnych dawek liofilizatu na proliferację komórek B16 po 24 i 48 godzinach od rozpoczęcia leczenia. (Każda wartość przedstawia średnią uzyskaną z 8 równoległych pomiarów ± odchylenie standardowe, ocena spektrofotometryczna).

Figura 6. Rozwój komórek ludzkiego czerniaka A2058 w obecności różnych dawek liofilizatu 24 godziny po rozpoczęciu zabiegu. Ocenę hodowli prowadzono na podstawie oceny białka (SRB) i aktywności dehydrogenazy (MTT) w równoległych pomiarach spektrofotometrycznych. (Każda wartość przedstawia średnią uzyskaną z 8 równoległych pomiarów ± odchylenie standardowe).

Figura 7. Liczba komórek apoptotycznych (analiza FACS) ludzkiego czerniaka A2058 w warunkach hodowli in vitro, po podziałaniu różnymi dawkami liofilizatu.

Poniższe przykłady stanowią ilustrację sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego według wynalazku, jego wytwarzania i czynności farmakologicznej.

Przykład 1

Fermentacja zarodków pszenicznych prowadzona w skali laboratoryjnej

Zawiesinę 33,3 g drożdży (Saccharomyces cerevisiae) w 1000 ml wody pitnej dodano do 100 g świeżych zarodków pszenicznych (zgodnie z węgierskim standardem MSZ-081361-80), zmielonych do mąki. Mieszaninę wystrząsano we wstrząsarce przez 18 godzin w temperaturze 30°C. W tym czasie ciecz fermentacyjna spieniła się i powiększyła około trzykrotnie swoją objętość. Po fermentacji mieszaninę wirowano przez 15 minut przy 3000 obr./min. Po zagotowaniu i schłodzeniu, płyn znad osadu wysuszono poprzez liofilizację, a uzyskany liofilizat trzymano do późniejszego zastosowania w zamrażarce (-10°C). Zawartość 2,6-DMBQ w uzyskanym liofilizacie wynosiła 0,4 mg/g suchego materiału (0,04% wagowych).

Przykład 2

Fermentacja zarodków pszenicznych prowadzona na dużą skalę

300 kg zarodków pszenicznych zmielonych do konsystencji mąki (zgodnie ze standardem węgierskim) i 100 kg drożdży umieszczono w naczyniu do fermentacji o objętości 5 metrów sześciennych, a następnie dodano wodę pitną aż do uzyskania objętości 4000 l. Okres fermentacji wynosił 18 godzin i w tym czasie stosowano ciągłe napowietrzanie (0,5 l powietrza/l cieczy fermentacyjnej/minutę) i powolne mieszanie (30 obr./min). Dla zahamowania pienienia do mieszaniny dodano 1 litr oleju słonecznikowego na 1 m³. Po zakończeniu fermentacji przerywano napowietrzanie i mieszanie, ciecz fermentacyjną oddzielano najpierw w dekanterze, następnie w rozdzielaczu, a na koniec w prasie filtracyjnej z użyciem filtra tekstylnego. Jako materiał pomocniczy stosowano 10 kg perlitu filtracyjnego na 1 m³. Ciecz fermentacyjną dokładnie przefiltrowano, a jakość procesu filtracji sprawdzono z użyciem mikroskopu. Przefiltrowana ciecz fermentacyjna nie zawierała praktycznie żadnych

PL 191 414 B1 komórek, co oznacza, że w dziesięciu polach widzenia znajdowała się nie więcej niż jedna komórka drożdży. Uzyskaną ciecz fermentacyjną, zawierającą około 1,5% wagowych suchego materiału, odparowano w wyparce próżniowej, w temperaturze około 40 - 50°C, a po zakończeniu procesu próżniowego prowadzono ogrzewanie pod ciśnieniem atmosferycznym przez około 15 minut. Następnie określono zawartość suchego materiału w roztworze i dodano taką ilość maltodekstryny - uprzednio rozpuszczonej w gorącej wodzie, a następnie ochłodzonej -aby zawartość suchego materiału w roztworze wyniosła 30% wagowych. Następnie roztwór wysuszono rozpryskowo w obrotowej wyparce rozpryskowej z dyszą ścinającą, w której temperatura wychodzącego powietrza wynosiła 90°C. Uzyskany produkt końcowy - proszek - zawierał około 60% wagowych sfermentowanego materiału roślinnego według wynalazku i 40% wagowych maltodekstryny. Zawartość 2,6 DMBQ określono z użyciem HPLC, zgodnie z metodą opisaną w poniższym przykładzie; wynosiła ona 0,4 mg/g suchego materiału.

Przykład 3

Właściwości materiału według wynalazku

Materiał według wynalazku można scharakteryzować dwojako, albo przez ustalenie zawartości w nim 2,6 DMBQ, albo z użyciem chromatogramu obszaru „odcisków palców („fingerprint). W obu przypadkach stosuje się chromatografię HPLC.

Analizę przeprowadzono zarówno na materiale wytworzonym jak w przykładzie 1, jak i na materiale wytworzonym jak w przykładzie 2, a wyniki były w obu przypadkach identyczne.

A. Ilościowa i jakościowa analiza pochodnych benzochinonu

Przygotowanie próbki

Przed wykonaniem analizy konieczne było zwiększenie stężenia benzochinonów w liofilizacie. Aby to osiągnąć, liofilizat rozcieńczono do pierwotnego stężenia wodą destylowaną (zawartość suchej substancji - 1% wagowy) - (0,5 g liofilizatu, 50 ml wody destylowanej). Roztwór poddano ekstrakcji z użyciem 3 x 25 ml chloroformu w trzech etapach. Resztkową wilgoć w warstwie chloroformowej usunięto z użyciem bezwodnego siarczanu sodu. Po filtracji odparowano warstwę chloroformową, a do stanowiącej pozostałość substancji dodano tyle chloroformu by uzyskać ostateczną objętość 5 ml. Tę próbkę wstrzyknięto podczas analizy HPLC.

Ilościową i jakościową analizę pochodnych benzochinonu przeprowadzono z użyciem metody HPLC.

Opis metody HPLC

Zastosowany sprzęt do HPLC składał się z pompy model Beckman 114 M, detektora UV LaborMim z diodą Merck-Hitachi-DAD mod. 4500, i integratora Waters 740. W pomiarach stosowano kolumnę Chromsil C18 (250 x 4 mm) 10 μm. Detekcję UV prowadzono przy częstotliwości 290 mm, a szybkość przepływu wynosiła 2 ml/min.

Skład stosowanego eluentu był następujący: 25 mmoli Na2HPO4, 25 mmoli NaH2PO4, 25 mmoli EDTA, 20 mmoli NH₂OH^HCl, 10% objętościowych metanolu, pH = 6,05.

Analizie poddano trzy różne benzo-i hydrochinony, które analizowano zgodnie z opisaną powyżej metodą. Różnica czasu retencji tych związków była bardzo mała. Poprzez zmniejszanie stężenia eluenta -fazy organicznej do 10% -uzyskano znaczny wzrost wybiórczości. Analiza danych dotyczących retencji wykazała, że p-benzochinony charakteryzują się wyższą retencją niż odpowiadające im hydrochinony i że retencja wzrasta wraz ze wzrostem liczby grup metoksylowych. Stężenie wszystkich trzech standardów wynosiło 0,1 mg/ml. Tabela 2 przedstawia czasy retencji (tR) standardów i współczynnik pojemności (k'). Celem tych pomiarów było wykrycie i ilościowe określenie zawartości

2.6- dimetoksy-p-benzochinonu, w związku z czym część z tych pomiarów zostanie poniżej opisana w bardziej szczegółowy sposób. Zbadano, czy zastosowana metoda nadaje się do ilościowej analizy

2.6- dimetoksy-p-benzochinonu. Zastosowany diagram kalibracyjny przedstawia fig.1. Przy współczynniku korelacji wynoszącym 0,99, wynik jest linią prostą. Sprawdzono również, czy pomiary są powtarzalne i dla każdej próbki wykonano trzy równoległe pomiary, obliczając rozproszenie wyników. Tabela1 przedstawia równoległe wyniki pomiarów prowadzonych na próbkach w okresie sześciu miesięcy i ich rozproszenie. Uzyskane przez nas wyniki pokazują, że metoda pomiarów jest dokładna i przynosi powtarzalne wyniki zawartości 2,6-dimetoksy-p-benzochinonu.

PL 191 414 B1

T ab el a 1

Równoległe wartości z ilościowej analizy zawartości 2,6-DMBQ i rozrzut wyników

Data	Zawartość 2, 6-dimetoksy-p-benzochinonu (mg/50 g próbki)	(s-%)
27.04.	3,45	3,54	3,66	0,08-2
28.04.	3,27	3,68	3,31	0,18-5
10.05.	1,56	1,49	1,48	0,03-1,9
10.05.	3,65	3,42		0,12-3
08.06.	3,00	2,98	2,86	0,06-2
09.06.	2,92	3,06	2,87	0,08-2,3
10.06.	3,34	3,23	3,36	0,05-1,5

T a b e l a 2

Wartości czasu retencji (tR) i współczynnika pojemności (k') dla badanych materiałów

Standard	tR	k'
2,6-DMBQ	13,4	5,0
2,6-DMBQ	5,1	1,2
2-MBQ	8,5	2,7

Figura 2 przedstawia chromatogram HPLC próbki w chloroformie przygotowanej w opisany powyżej sposób. Chromatogram wykazuje tylko jeden pik charakterystyczny 2,6-DMBQ. Zawartość 2,6-DMBQ w próbce określono na jego podstawie.

B. Chromatogram obszaru „odcisków palców”

Przygotowanie próbki

Do 5 g materiału wysuszonego w suszarce rozpryskowej (przygotowanego jak opisano w przykładzie 2) dodano 50 ml etanolu o stężeniu 96% objętościowych. Mieszaninę wstrząsano przez 30 minut w temperaturze 50°C przy 200/min. Następnie mieszaninę przefiltrowano, odparowano do sucha, a uzyskany materiał rozpuszczono w 10 ml metanolu. Przefiltrowany roztwór wstrzyknięto do kolumny.

Metoda HPLC

Stosowano wyżej opisane przyrządy do HPLC, kolumnę i warunki, ale skład eluentu był następujący: 1,25 mmola Na₂HPO₄, 1,25 mmola NaH₂PO₄, 1,25 mmola Na₂EDTA, 2,50 mmola NH₂OH-HCl, 5% objętościowych metanolu.

Figura 3 przedstawia uzyskany chromatogram HPLC. Wynika z niej, że w tych warunkach powstały dwa charakterystyczne piki, jeden po około 4,7 minutach (5), a drugi po 5,8 minutach (6). Przy czasie retencji odpowiednio 7,3 i 7,7 minut, dwa piki (7, 8) wystąpiły szybko po sobie i nie można ich całkowicie rozdzielić. Pik o mniejszej intensywności wystąpił po 9,8 minutach (9), a po nim wystąpił charakterystyczny, intensywny pik (11) po około 13,1 minuty. Po około 15 minutach wystąpił mniejszy pik (12) i kolejny, intensywny pik (14) po 18 minutach. Po 21,8 minuty na chromatogramie pojawił się mniejszy pik (15), a po około 31 minutach bardziej płaski pik, zawierający kilka materiałów.

C. Badania trwałości

Rozkład materiału według wynalazku badano na podstawie zmian stężenia 2,6-dimetoksy-p-benzochinonu. Przeprowadziliśmy próby przechowywania w trzech różnych temperaturach (temperatura pokojowa 20°C, 40°C i 60°C). Liofilizat - około 1 g - przechowywano w probówkach, których końce uszczelniono tak, aby nie przedostawało się do nich powietrze. Eksperymenty prowadzono przez 8 tygodni, a co tydzień wykonywano trzy równoległe pomiary na próbkach pobranych ze wszystkich trzech serii, przechowywanych w innej temperaturze. Ilościową analizę pochodnych benzochinonu prowadzono z użyciem HPLC.

Przeprowadzone badania wykazały, że wysuszony materiał według wynalazku był trwały nawet po przechowywaniu przez trzy lata w temperaturze pokojowej, to znaczy, że zawartość 2,6-DMBQ pozostała praktycznie niezmieniona. Zarazem materiał był nietrwały w temperaturze 40°C - 2,6 DMBQ

PL 191 414 B1 rozkładał się w ciągu kilku tygodni, a w temperaturze 60°C 2,6 DMBQ rozkładał się gwałtownie, w ciągu kilku dni.

W obu seriach pomiarów badano również rozkład 2-metoksy-p-benzochinonu. Ten związek jest mniej trwały niż 2,6-dimetoksy-p-benzochinon, a zatem jego obecności nie można było wykazać po tygodniu przechowywania w temperaturze 40°C i 60°C. W temperaturze pokojowej stężenie związku również pozo stało niezmienione.

Przykład 4

Badanie skuteczności

Badano skuteczność zarówno liofilizatu wytworzonego jak w przykładzie 1, jak i wysuszonego w suszarce rozpryskowej, wytworzonego jak w przykładzie 2. Stosowano wzorcowy wysuszony materiał o zawartości 2,6 DMBQ 0,4 mg/g suchego materiału i krzywą HPLC z fig. 2. Oba materiały dały takie same wyniki, tak więc materiał według wynalazku będzie dalej nazywany po prostu liofilizatem. Poniżej omówiono wyniki badań biologicznych i toksykologicznych tego liofilizatu, ze specjalnym naciskiem na odbudowę czynności układu odpornościowego i hamowanie wzrostu nowotworu i jego przerzutów.

1. Działanie hamujące wzrost nowotworu i przerzutów (badania w warunkach in vivo)

W badaniach stosowano następujące rodzaje wstrzykiwanych nowotworów, rosnących u myszy bądź szczurów: wariant o wysokiej skłonności do tworzenia przerzutów (3LL-HH) raka płuc Lewisa (mysi rak płuc), czerniak mysi B16 i ludzki heteroprzeszczep raka jelita grubego HCR-25.

Komórki nowotworów 3LL-HH (LLT-HH) i B16 wprowadzono hodowanym wsobnie myszom C57B1/6. Heteroprzeszczep HCR-25 wstrzyknięto myszom CBA/CA uprzednio poddanym immunosupresji poprzez tymektomię i napromienianie całego ciała. W przypadku nowotworów 3LL-HH i HCR-25, komórki nowotworów wszczepiano do śledziony, a w przypadku czerniaka B16 do mięśni lewej kończyny dolnej. Zwierzęta w grupie leczonej i w grupie kontrolnej, które otrzymały komórki HCR-25, poddawano zabiegowi splenektomii (usunięcie śledziony) 21 dni po przeszczepieniu nowotworu.

Leczenie liofilizatem według wynalazku rozpoczynano 24 godziny po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Dzienne dawki 3 g/kg masy ciała podawano doustnie, poprzez sondę żołądkową, w postaci zawiesiny wodnej 0,6 g/ml.

Badania zakończono 14 dni po wykonaniu wszczepu w przypadku nowotworu 3LL-HH, 21 dni po wykonaniu wszczepu w przypadku nowotworu B16 i 51 dni po wykonaniu wszczepu w przypadku nowotworu HCR-25, poprzez śmiertelne skrwawienie zwierząt w znieczuleniu.

Tabele 3, 4 i5 podsumowują wyniki uzyskane w tych badaniach.

T a b e l a 3

Wpływ leczenia liofilizatem według wynalazku na liczbę przerzutów w wątrobie w przypadku komórek mysiego raka płuc 3LL-HH, wstrzykniętych do śledziony

Leczenie	Liczba wstrzykniętych komórek	Liczba przerzutów w wątrobie
Kontrola	3 x 10³	104,0 ± 28,2
Liofilizat	3 x 10³	29, 8 ± 16,4*

p < 0,01

W każdej badanej grupie znajdowało się 10 zwierząt.

T a b e l a 4

Wpływ leczenia liofilizatem według wynalazku na liczbę przerzutów w wątrobie 51 dni po wstrzyknięciu komórek ludzkiego raka jelita grubego HCR-25 do śledziony myszy CBA/CA poddanych uprzednio immunosupresji

Leczenie	Waga śledziony z nowotworem (g)	Liczba przerzutów w wątrobie
Kontrola, bez splenektomii	1,02 ± 0,59	42,0 ± 25,8
Liofilizat, bez splenektomii	0,62 ± 0,47	19,5 ± 19,0
Kontrola, po splenektomii*	0,10 ± 0,02	19,1 ± 13,5
Liofilizat, po splenektomii*	0,08 + 0,02	10,6 ± 11, 6

* Splenektomię wykonano 21 dni po wstrzyknięciu nowotworu do śledziony.

W każdej badanej grupie znajdowało się 12 zwierząt.

PL 191 414 B1

Tabel a 5

Wpływ leczenia liofilizatem według wynalazku na wagę kończyny, do której wstrzyknięto komórki nowotworu, i na liczbę przerzutów do płuc w przypadku komórek czerniaka B16 wstrzykniętych do kończyny 21 dni po wstrzyknięciu nowotworu

Leczenie	Waga kończyny z nowotworem (średnia)	Liczba przerzutów do płuc (średnia)
Kontrola	7,6 ± 0,43	42,4 ± 10,2
Liofilizat	7,2 ± 0,38	6,2 ± 3,7*

* p < 0,01

W każdej badanej grupie znajdowało się 10 zwierząt.

Przedstawione powyżej wyniki wykazują, że leczenie liofilizatem według wynalazku spowodowało istotny statystycznie - o 71% - spadek liczby przerzutów do płuc w przypadku, gdy do śledziony wstrzyknięto komórki nowotworu 3LL-HH (tabela 3).

W przypadku komórek ludzkiego raka jelita grubego HCR-25, 50-dniowe leczenie spowodowało zarówno spadek masy śledziony, jak i liczby przerzutów do wątroby. Liczba przerzutów w porównaniu z grupą kontrolną zmniejszyła się o około 50% zarówno u zwierząt, u których przeprowadzono splenektomię, jak i u tych, u których tego zabiegu nie przeprowadzono (tabela 4).

W przypadku komórek czerniaka B16 wstrzykniętych do mięśni, waga nowotworu rosnącego w mięśniach nie zmieniła się na skutek leczenia, ale liczba przerzutów w płucach zmniejszyła się w bardzo istotny sposób, o 85% w porównaniu z grupą kontrolną (tabela 5).

II. Badania w warunkach in vitro

Ponieważ przedstawione powyżej badania w sposób jednoznaczny wykazały, że liofilizat według wynalazku może w istotny sposób zmniejszać liczbę przerzutów nowotworów złośliwych, zbadano również działania produktów na różne fazy powstawania przerzutów. Na powstawanie przerzutów składa się szereg faz, w których oprócz proliferacji i aktywności apoptotycznej komórek nowotworu pierwotnego, pewną rolę odgrywa również potencjał adhezyjny komórek nowotworowych i mechanizmy obronne organizmu, przeciwdziałające inwazji komórek nowotworowych. W prowadzonych w warunkach in vitro badaniach badano wpływ liofilizatu na proliferację, apoptozę i adhezję.

Ponieważ znaczną część prowadzonych w warunkach in vitro badań prowadzono na komórkach mysiego czerniaka B16, w pierwszym etapie zastosowano ten nowotwór w ocenie liofilizatu.

1. Badanie adhezji

Adhezję komórek nowotworowych badano na płytce 96-studzienkowej. Stosowane dawki liofilizatu wynosiły 300, 3000 i 30000 μg/ml. Stosowano podłoże do hodowli RPMI, zarówno bez dodatku surowicy, jak i w obecności 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Adhezję badano 10, 30, 60, 90 i 120 minut po inkubacji w zwykłych warunkach. Ocenę przeprowadzono z użyciem procesu kolorymetrycznego w oparciu o oznaczenie SRB (Mossmann, T.: J. Immunol. Neth. 65, 55-63 (1983)). Badanie opiera się na wybarwieniu całkowitej zawartości białka w hodowli sulforodaminą B, a absorbancję odczytano przy 570 nm w spektrofotometrze. Figura 4 pokazuje jedynie dwa punkty czasowe, które jednak we właściwy sposób przedstawiają działanie liofilizatu. Wykazano, że jeżeli dawka liofilizatu wynosiła 3000 μg/ml lub była dziesięciokrotnie wyższa, powodowała dramatyczny spadek adhezji komórek nowotworowych, zarówno przy braku, jak i w obecności surowicy. Jeżeli dawka wynosiła 300 μg/ml, nie obserwowano takiego działania.

2. Badanie proliferacji

W tym badaniu komórki nowotworowe umieszczano na 24 godziny przed leczeniem na płytce 96-studzienkowej. Po leczeniu odpowiednimi dawkami liofilizatu badano również aktywność proliferacyjną komórek z użyciem oznaczenia SRB, 24, 48 i 72 godziny po leczeniu. Wyniki powtórnych badań wykazały, że na skutek leczenia dawką 900 - 15 000 ^g/ml komórki nowotworowe podchodziły do powierzchni warstwy i - jak wykazano poprzez metodę eliminacji błękitu trypanu - ginęły (Kaltenbach, J.P. i wsp.: Exp. CellRes. 15, 112-117 (1985)) (fig. 5).

Przeprowadzone przez nas badania na ludzkim czerniaku złośliwym bezbarwnikowym (komórki nowotworowe A2058 - Todaro, G.J. i wsp.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5258-5262 (1980)) dały wyniki podobne do uzyskanych w przypadku mysiego czerniaka barwnikowego (fig. 6). W przypadku tego nowotworu, równolegle do oceny SRB przeprowadzono również ocenę MTT, odzwierciedlającą aktywność metaboliczną komórek (Cole, S.P.C.: Cancer Chemother. Pharmacol. 17, 259-263 (1986)). Niniejsze badanie opiera się na zjawisku, że metabolicznie aktywne komórki przekształcają sól tetra10

PL 191 414 B1 zoliową w barwny produkt formazanowy, przede wszystkim poprzez aktywność dehydrogenazową. Reakcja barwna, proporcjonalna do aktywności, może zostać odczytana w spektrofotometrze przy 570 nm. Ocena MTT wykazała jasno, że aktywność funkcjonalna komórek nowotworowych malała nawet wówczas, gdy dawka wynosiła 300 μg/ml (fig. 4). Ponieważ w przypadku przemieszczania komórek w kierunku powierzchni przyczyna apoptozy była nieznana, aktywność apoptotyczną całej populacji komórek zbadano z użyciem cytometrii przepływowej (FACS) (Fig. 7). Jak pokazuje fig.7, odsetek apoptotycznych komórek nowotworowych -w zależności od dawki -był niespotykanie wysoki.

III. Badanie wpływu na reakcje immunologiczne

Działanie liofilizatu według wynalazku badano w dwóch różnych modelach. W jednej serii badań badano możliwość transformacji blastycznej komórek jednojądrzastych pozyskanych ze śledziony zwierząt leczonych liofilizatem, a w drugim przypadku badano całkowite wiązanie skóry przeszczepionej w okolicę szyi myszy w modelu alloprzeszczepu skórnego.

1. Badanie transformacji blastycznej limfocytów T

Leczenie liofilizatem według wynalazku w istotny sposób zmniejsza blastyczną transformację limfocytów T, biorących ważny udział w reakcjach immunologicznych. Wykazano to w poniższym eksperymencie.

Myszy C57Bl16 leczono przez sześć tygodni pięć razy w tygodniu liofilizatem według wynalazku doustnie poprzez sondę żołądkową w dawce 3 g/kg (zawiesina wodna 0,6 g/ml). Po zakończeniu leczenia limfocyty uzyskane poprzez perfuzję ze śledziony zwierząt przenoszono do hodowli komórkowej i traktowano Con A w dawce 1 μg/ml. Po 48 godzinach komórki syntetyzujące DNA znakowano 0,4 pCi ^{2 3}H tymidyną. Stopień wyznakowania określono z użyciem przepływowego licznika scyntylacyjnego (Beckman). Jak pokazano w Tabeli 6, traktowanie Con A w istotny sposób zwiększyło, w porównaniu z kontrolą, wbudowywanie ³H-TdR, toznaczy transformację blastyczną.

Tabela 6

Wbudowywanie ³H-tymidyny do limfocytów pochodzących ze śledziony u myszy kontrolnych iu myszy leczonych liofilizatem

Leczenie	1 pg/ml Con A
	średnia (cpm)	SEM
Kontrola	3760,6	583,3
Liofilizat	8041,8	957,1

2. Badanie działania immunostymulującego w modelu alloprzeszczepu skórnego

Najlepszym modelem do zobrazowania przywrócenia upośledzonej uprzednio odpowiedzi immunologicznej jest model alloprzeszczepu skórnego u myszy, u których częściową dysfunkcję układu odpornościowego uzyskano poprzez tymektomię (operacyjne usunięcie grasicy). Rasy myszy C57Bl10 i B10LP różnią się jedynie miejscem H-3, tak żeskóra przeszczepiona od osobników jednej rasy osobnikom drugiej rasy nie zostaje odrzucona w ciągu 7 dni, ale dopiero po około 3 tygodniach. Jeżeli biorca poddany został zabiegowi tymektomii, odrzucenie zachodzi po około 50 dniach. Wszystkie materiały powodujące dojrzewanie i różnicowanie limfocytów w szpiku kostnym, jak hormony grasicy, zmniejszają czas potrzebny do odrzucenia przeszczepionej skóry (J. Immunopharmacology 7, 67-78 (1985)). Podobne zjawisko można było zaobserwować w przeprowadzonych przez nas badaniach, gdzie zastosowano leczenie liofilizatem według wynalazku.

Jako biorców wykorzystano myszy C57Bl10, a myszy B10LP były dawcami. Biorców poddawano zabiegowi tymektomii, a 7 dni później wykonywano przeszczep skóry. Po tygodniu po zabiegu tymektomii rozpoczynano leczenie liofilizatem doustnie w dawce 30 mg/kg, stosowanym 5 dni w tygodniu. Leczenie zakończono 70 dni po wykonaniu przeszczepu skóry. Myszy obserwowano codziennie i sprawdzano, czy nie zachodzi odrzucenie przeszczepu.

Tabela 7 pokazuje, że czas odrzucenia przeszczepu umyszy nie poddanych tymektomii wynosił21 (samce) i 28,7 (samice) dni. U myszy poddanych tymektomii czas, jaki upłynął do odrzucenia przeszczepu wydłużył się do 52,4 i 41,6 dni, odpowiednio. Leczenie liofilizatem według wynalazku spowodowało u leczonych myszy poddanych tymektomii istotne skrócenie czasu przeżycia przeszczepu skórnego. Wynik ten wskazuje, że upośledzenie odporności spowodowane tymektomią zostało w istotny sposób zmniejszone w wyniku leczenia, co oznacza, że liofilizat wywiera działanie immunostymulujące.

PL 191 414 B1

Tabel a 7

Wpływ leczenia liofilizatem według wynalazku na odrzucenie przeszczepów skórnych (biorca: myszy C57Bl10, dawca: myszy B10LP)

Leczenie	Czas odrzucenia
Samce	Samice
średnia (dni)	SEM	średnia (dni)	SEM
Kontrola (nie poddane tymektomii)	21,0	3,1	28,7	4,5
Kontrola (poddane tymektomii)	52,4	5,0	41,6	5,5
Liofilizat (30 mg/kg)	28,8*	8,6	32,6**	4,5

* 0,001 < p < 0,01 w porównaniu z kontrolą po tymektomii ** 0,01 < p < 0,05 w porównaniu z kontrolą po tymektomii

Prowadzone w warunkach in vivo i in vitro badania liofilizatu zgodnie z wynalazkiem wykazują, że produkt ten wywiera istotne działanie przeciw przerzutom nowotworowym w szeregu modelach zwierzęcych. Działanie to wiąże się prawdopodobnie z działaniem immunostymulującym, obserwowanym zarówno w badaniach prowadzonych w warunkach in vivo, jak i in vitro, ale możliwe jest, że na spadek liczby przerzutów ma także wpływ działanie antyproliferacyjne i działanie stymulujące apoptozę, wpływ materiału na adhezję i wytwarzanie wolnych rodników.

IV. Badanie aktywności wiązania rodników

Ponieważ benzochinony wywierają dobrze znany wpływ na powstawanie wolnych rodników, zbadano również aktywność wiążącą liofilizatu według wynalazku. Mierzono zarówno wiązanie rodnika nadtlenkowego (SSA), jak i rodnika hydroksylowego (OH-SA), z użyciem metody rezonansu elektronowego. Liofilizat charakteryzował się istotną SSA; aktywność wiązania rodnika 1 mg odpowiada aktywności 5,64 μg dysmutazy nadtlenkowej (SOD). Liofilizat nie charakteryzował się aktywnością OH-SA, ale powodował rozbicie tworzącego rodniki hydroksylowe układu nadtlenek wodoru/Fe, tak że można przypuszczać, że wykazuje tak zwaną aktywność nie-chelatującą.

V. Badania toksykologiczne (podostre)

Prowadzone przez 77 dni badania toksykologiczne były wykonywane zgodnie z zaleceniami Registry of Industrial Toxicology Animal (RITA) (Exp. Toxic. Pathol. 47, 247-266 (1995)) na szczurach F344 i myszach C57Bl16. Zwierzęta leczono codziennie dawką 3 g/kg (zawiesina wodna 0,6 g/ml). Podczas leczenia obserwowano zmiany masy ciała zwierząt, ewentualne zmiany patologiczne i spontaniczne pogarszanie się stanu zwierząt. Po przeprowadzeniu badania zmierzono masę serca, płuc, grasicy, śledziony, wątroby, nerek i jąder i poddano badaniom patologicznym 34 narządy zalecane przez RITA. Nie zaobserwowano spontanicznego pogarszania się narządów, a masa ciała zwierząt zmieniała się podobnie jak w grupie kontrolnej. Po zakończeniu badania masy różnych narządów nie wykazywały zmian w porównaniu z grupą kontrolną. Podczas wykonywania badań patologicznych leczonych zwierząt nie obserwowano występowania zmian, które mogły by być spowodowane liofilizatem.

Powyższe wyniki wykazują, że sfermentowany materiał roślinny według wynalazku nie jest toksyczny, a ze względu na działanie immunostymulujące jest wskazany we wszystkich stanach, w których występuje upośledzenie układu odpornościowego. Z uwagi na opisane powyżej właściwości biologiczne, materiał ten znajduje zastosowanie w medycznym leczeniu nowotworów złośliwych, przede wszystkim w hamowaniu przerzutów nowotworowych.

Claims

1. Sfermentowany, wysuszony materiał roślinny o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe, znamienny tym, że pochodzi z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych z użyciem Saccharomyces cerevisiae w środowisku wodnym.

2. Materiał według zastrz. 1, znamienny tym, że ma chromatogram HPLC zasadniczo odpowiadający podanemu na fig. 3.

PL 191 414 B1

3. Materiał według zastrz. 1, znamienny tym, że według HPLC zawartość 2,6-dimetoksy-p-benzochinonu wynosi 0,12 - 0,52 mg/g suchego materiału, a zawartość 2-metoksy-p-benzochinonu wynosi 0,05 -0,28 mg/g suchego materiału.

4. Materiał według zastrz. 3, znamienny tym, że zawartość 2, 6-dimetoksy-p-benzochinonu wynosi 0,4 mg/g suchego materiału.

5. Sposób wytwarzania sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe, znamienny tym, że zmielone zarodki pszeniczne poddaje się fermentacji w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae, a ciecz fermentacyjną oddziela się, dokładnie filtruje, odparowuje, utrzymuje w stanie wrzenia i suszy, jako taką lub w obecności pomocniczych materiałów suszących.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że fermentację prowadzi się w temperaturze około 30°C, przez około 18 godzin, ze stałym napowietrzaniem i mieszaniem.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że suszenie prowadzi się w obecności maltodekstryny.

8. Środek farmaceutyczny o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe zawierający substancję czynną oraz ewentualnie znane substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera sfermentowany, wysuszony materiał roślinny pochodzący z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae.

9. Dodatek żywnościowy dla ssaków, znamienny tym, że zawiera sfermentowany, wysuszony materiał roślinny pochodzący z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae.

10. Dodatek żywnościowy według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera wysuszony materiał roślinny otrzymany sposobem określonym w zastrz. 5, zawierający 60% wagowych sfermentowanego materiału i 40% wagowych maltodekstryny.

11. Zastosowanie sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego pochodzącego z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae, do wytwarzania środka farmaceutycznego o działaniu immunostymulującym i hamującym przerzuty nowotworowe.

12. Zastosowanie sfermentowanego, wysuszonego materiału roślinnego pochodzącego z cieczy fermentacyjnej wytworzonej drogą fermentacji zarodków pszenicznych w środowisku wodnym w obecności Saccharomyces cerevisiae do wytwarzania dodatku żywnościowego przeznaczonego dla ssaków.