PT1904636E

PT1904636E - Melhoramentos na ou relacionados com a produção de proteínas

Info

Publication number: PT1904636E
Application number: PT06762561T
Authority: PT
Inventors: Gilbert Gorr; Heike Launhardt; Christian Stemmer; Marta Rodriguez Franco
Original assignee: Greenovation Biotech Gmbh
Priority date: 2005-07-12
Filing date: 2006-07-12
Publication date: 2010-09-14
Also published as: US7741539B2; ES2348857T3; WO2007006570A3; ATE472605T1; JP2009501011A; CA2614998C; CA2614998A1; AU2006268851A1; AU2006268851B2; US20080201804A1; DK1904636T3; DE602006015195D1; WO2007006570A2

Description

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DESCRIÇÃO

"MELHORAMENTOS NA OU RELACIONADOS COM A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS"

Antecedentes A presente invenção relaciona-se com um método para produzir proteínas glicosiladas heterólogas em células de briófitas transformadas. Em particular, o método relaciona-se com um método para produzir proteínas glicosiladas compreendendo padrões de glicosilação animal compreendendo resíduos do ácido siálico -, tais como proteínas farmacêuticas para uso em mamíferos, e.g. seres humanos, em células de briófitas tais como as de Physcomitrella patens, o material genético necessário para isso, tal com DNA e RNA, vectores, células hospedeiras, métodos para neles introduzir o material genético, e seus usos. Para além disso, a presente invenção relaciona-se com novos polipéptidos e proteínas obtidos pelo método de acordo com a invenção. Além disso, a presente invenção fornece um método para produzir ácido siálico ou ácido CMP-siálico numa célula eucariótica transformada não de mamífero, tecido ou organismo.

As plantas são organismos adequados para a produção de uma vasta gama de proteínas recombinantes (Ma et al. (2003) Nat

Gen 4, 794-805). Em termos de proteínas farmacêuticas para uso em mamíferos, incluindo seres humanos, transformações pós-traducionais, tais como glicosilação, são muitas vezes necessárias. No entanto, um problema encontrado em sistemas de células eucarióticas que tenham sido transformados com genes heterólogos adequados para a produção de sequências de proteínas destinadas para uso, por exemplo, como produtos farmacêuticos em seres humanos, é que o padrão de glicosilação nessas proteínas adquire muitas vezes um 2 padrão nativo, ou seja, do sistema de células eucarióticas no qual a proteína tenha sido introduzida: as proteínas glicosiladas são produzidas compreendendo, padrões de glicosilação não de animal ou seja, por exemplo, não de mamífero e estes, por sua vez, podem ser imunogénicos e/ou alergénicos se aplicados em animais, tais como mamíferos, e.g. seres humanos.

Comparadas com glicoproteínas derivadas de mamíferos, as glicoproteínas específicas de plantas contêm dois resíduos adicionais. No passado, o uso de glicoproteínas recombinantes produzidas por plantas era limitado pela N-glicosilação específica de plantas que é obtida nessas proteínas. No caso de briófitas Koprivova et al. ((2004), Plant Biotechnol J 2, 517-523) e no caso de sementes de plantas Strasser et al. ((2004) FEBS Lett. 561, 132-136)) tiveram sucesso em ultrapassar esta limitação usando diferentes abordagens. As plantas geradas nos dois estudos mostraram N-glicosilação complexa sem os dois resíduos de açúcar acima mencionados específicos de plantas.

Além disso, em plantas não se encontram os resíduos beta 1,4-galactose terminais da glicoproteína, indicando que a beta 1,4-galactosiltransferase não está presente nas plantas. Foi descrita a integração e expressão estável desta enzima em plantas de tabaco (Bakker et al. (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98, 2899-2904), em células BY2 de tabaco (Palacpac et al. (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96, 4692-4697) assim como em briófitas haplóides gametofíticas Huether et al. (2005) Plant Biol 7, 292-299). A beta 1,4-galactosiltransferase recombinante humana era funcional e as proteínas isoladas do material transgénico apresentaram resíduos de beta 1,4-galactose terminais. 3 A presente invenção está relacionada com um melhoramento adicional dos métodos existentes com vista a garantir que são produzidos plipéptidos e proteínas com funcionalidade ainda mais melhorada em animais, tais como mamíferos.

As estruturas N-glicano mais complexas presentes em proteínas de mamíferos, incluindo proteínas humanas, contêm ácidos siálicos e resíduos de açúcares terminais. Embora a presença de glicoconjugados sialilados em células de Arabidopsis thaliana não-transgénicas cultivadas em suspensão tenha sido descrita recentemente por Shah et al. ((2003) Nat Biotechnol 21, 1470-1471), estes resultados estão sob discussão (Seveno et al. (2004) Nat Biotechnol 11, 1351-1353).

Porém, a técnica anterior não fornece qualquer informação sobre se a sialilação ocorre também em briófitas e pode permitir a expressão recombinante de glicoproteínas heterólogas tendo as características de N-glicano desejadas. Adicionalmente, não está disponível nenhuma informação na técnica anterior em relação à existência pura de ácido siálico em qualquer briófita.

Um pré-requisito para a sialilação em N-glicanos é a presença de ácido neuramínico activado (CMP NeuAc). Em mamíferos, diferentes enzimas estão envolvidas na síntese de NeuAc (ácido siálico) - o precursor de CMP NeuAc. A UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase (número de acesso do genbank: AF155663) é responsável por gerar ManNAc-6P que é processado pela fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico (número de acesso do genbank: NM_018946) em NeuAc-9P. A enzima responsável por processar NeuAc-9P em NeuAc não está descrita até agora. A activação de NeuAc ocorre nos núcleos das células de mamíferos. A responsável pela formação do 4 ácido siálico activado (CMP NeuAc) é a enzima sintase de ácido CMP-N-acetilneuramínico (número de acesso do genbank: NM_018686). 0 produto activado tem de ser translocado do núcleo para o Aparelho de Golgi - neste processo está envolvido o transportador de ácido CMP-siálico (número de acesso do genbank: NM__006416) . Finalmente, a sialilação em N-glicanos ocorre pela transferência de CMP NeuAc nos resíduos de açúcares terminais - e.g. resíduos de galactose ligados em 1,4. Para este fim, a expressão de uma sialiltransferase (e.g. alfa- 2,6 sialiltransferase; número de acesso NM_003032, genbank) tem de ser assegurada. A briófita, Physcomitrella patens, uma planta terrestre não vacuular haplóide, pode ser usada para a produção de proteínas recombinantes (WO 01/25456). O ciclo de vida das briófitas é dominado por produção gametofítica fotoautotrófica. O ciclo de vida é completamente diferente do das plantas superiores em que o esporófito é a geração dominante e há notoriamente muitas diferenças a observar entre as plantas superiores e as briófitas. O gametófito das briófitas é caracterizado por dois estádios de desenvolvimento distintos. O protonema que se desenvolve por meio de crescimento apical, cresce numa rede filamentosa de apenas dois tipos de células (células de cloronema e de caulonema). O segundo estádio, chamado de gametóforo, diferencia-se pelo crescimento caulinar a partir de um sistema apical simples. Ambos os estádios são fotoautotroficamente activos. O cultivo do protonema sem diferenciação no gametóforo mais complexo tem sido mostrado em culturas em suspensão em frascos assim como em culturas em bioreactores (WO 01/25456). O cultivo de tecido multicelular fotoautotroficamente activo e completamente diferenciado contendo somente poucos tipos de células não 5 está descrito para as plantas superiores. A estabilidade genética do sistema de células da briófita fornece uma vantagem importante em relação a culturas de células vegetais. Em culturas de células de plantas superiores o metabolismo secundário é mais diferenciado e isto resulta em diferenças nos perfis dos metabolitos secundários.

Adicionalmente, há algumas diferenças importantes entre as briófitas e as plantas superiores ao nivel bioquímico. A assimilação de sulfato em Physcomitrella patens difere significativamente da das plantas superiores. A enzima chave da assimilação de sulfato nas plantas superiores é a adenosina 5'-fosfosulfato reductase. Em Physcomitrella patens co-existe um caminho alternativo por via da fosforadenosina 5'-fosfosulfato reductase (Koprivova et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 32195-32201). Este caminho não foi caracterizado em plantas superiores.

Outras diferenças são reflectidas na regeneração da parede celular. Protoplastos derivados das plantas superiores regeneram novas paredes celulares de um modo rápido, independentemente do meio de cultura. A transferência directa de DNA por via de polietileno glicol (PEG) para os protoplastos de plantas superiores requer pré-incubação a 4 até 10 °C para abrandar o processo de regeneração da parede celular (Patente US 5,508,184). Em contraste, a regeneração da parede celular dos protoplastos derivados do protonema de Physcomitrella é dependente do meio de cultura. Os protoplastos podem ser cultivados sem regeneração da parede celular durante longos períodos. Sem pretender estar limitado pela teoria, parece que o mecanismo de secreção do protoplasto, essencial para a regeneração da parede celular e glicosilação de proteínas, difere do das plantas superiores. Além disso, a Physcomitrella patens apresenta 6

recombinação homóloga altamente eficiente no seu DNA nuclear, uma caracteristica única das plantas, que permite a disrupção de genes dirigida (Girke et al. (1998) Plant J 15, 39-48; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95,4368-4373; Koprivova (2002) J Biol Chem 277, 32195- 32201; revisto por Reski (1999) Planta 208, 301-309;

Schaefer e Zryd (2001) Plant Phys 127, 1430-1438; Schaefer (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 53, 477-501) ilustrando adicionalmente as diferenças fundamentais em relação às plantas superiores. E um objecto da presente invenção fornecer um método mais eficiente de produzir proteínas animais compreendendo padrões de glicosilação animal, e em particular, proteínas humanas glicosiladas compreendendo padrões de glicosilação humanos sobre isso - contendo resíduos de ácido siálico. É um objecto adicional fornecer um processo eficiente para a produção de proteínas animais heterólogas compreendendo padrões de glicosilação animal, particularmente proteínas humanas compreendendo padrões de glicosilação humanos contendo resíduos de ácido siálico - em briófitas, tais como Physcomitrelia patens.

Estes e outros objectos vão tornar-se notórios na descrição e exemplos seguintes aqui fornecidos.

Descrição Pormenorizada A célula de briófita da invenção é uma seleccionada a partir do grupo que consiste em musgos e hepáticas, de espécies dos géneros Physcomltrella, Funaria, Sphagnum, Ceratodon, Marchantla e Sphaerocarpos. A célula de briófita é preferencialmente de Physcomltrella patens. 7 A célula de briófita, tal como a célula de Physcomitrella patens, pode ser qualquer célula adequada para transformação de acordo com os métodos da invenção conforme aqui descrito, e pode ser uma célula de protoplasto de briófita, uma célula encontrada no tecido do protonema ou outro tipo de célula. Claro que, o destinatário qualificado vai apreciar que o tecido vegetal da briófita compreendendo populações de células de briófitas transformadas de acordo com a invenção, tal como tecido de protonema transformado seja também um aspecto da presente invenção.

De acordo com a presente invenção, é fornecida uma célula de briófita transformada, preferencialmente uma célula de Physcomitrella patens, que compreende pelo menos seis sequências de nucleótidos operacionalmente ligadas a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita, em que pelo menos as seis referidas sequências de nucleótidos codificam seis proteínas funcionais que são expressas na célula de briófita, em que as referidas seis proteínas funcionais são uma UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase/N-acetilmanosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico) , uma sintase do ácido CMP-N-acetilneuramínico de mamífero, um transportador do ácido CMP-siálico de mamífero, uma galactosiltransferase, e uma sialiltransferase de mamífero.

Do mesmo modo, a célula de briófita transformada compreende pelo menos seis das sequências de ácidos nucleicos aqui mencionadas acima em relação à célula de briófita transformada, tais sequências sendo capazes de codificar proteínas funcionais em que as referidas sequências de ácidos nucleicos estão cada uma operacionalmente ligadas a um promotor exógeno. Tipicamente, tais sequência de nucleótidos são sequências de mamífero e preferencialmente sequências de ácidos sao seleccionadas a partir de nucleicos de humanos. A célula de briófita transformada da invenção compreende tipicamente uma beta-1,4 galactosiltransferase, preferencialmente uma sequência de nucleótidos da beta 1,4 galactosiltransferase humana. A sialiltransferase usada nas células de briófitas transformadas da invenção é seleccionada tipicamente a partir de uma alfa -2,6 ou alfa 2,3 sialiltransferase de mamífero, e é preferencialmente uma sequência de nucleótidos da alfa-2,6 sialiltransferase humana. A célula de briófita transformada da invenção é uma célula na qual a actividade da fucosiltransferase e/ou xilosiltransferase é significativamente reduzida ou eliminada. Este efeito pode e.g. ser obtido usando uma célula de briófita transformada da invenção que compreende preferencialmente i) uma sequência de nucleótidos de fucosiltransferase disfuncional e/ou ii) uma sequência de nucleótidos de xilosiltransferase disfuncional.

"Disfuncional" conforme aqui usado significa que as sequências de nucleótidos da transferase da fucosiltransferase (fucT) e da xilosiltransferase (xylT) indicadas são substancialmente incapazes de codificar mRNA que codifica as proteínas fucT e xylT funcionais que são capazes de modificar glicanos N-ligados vegetais com padrões de glicosilação semelhantes aos das plantas compreendendo resíduos fucosil ligados em 1,3 e xilosil ligados em 1,2. Em nomeação, as sequências de nucleótidos da transferase vegetal fucT e xylT disfuncionais compreendem inserções dirigidas de sequências de nucleótidos exógenas para endógenas, ou seja, os genes fucT 9 e xylT nativos genómicos, compreendidos no genoma nuclear da briófita (se é um genoma de briófita realmente nativo, ou seja em células de briófitas que não tenham sido transformadas previamente pelo homem com outras sequências de ácidos nucleicos, ou num genoma nuclear de briófita transformado em que as inserções de sequência de ácidos nucleicos foram feitas antes a partir de sequências de ácidos nucleicos desejadas) as quais inibem ou reprimem substancialmente a transcrição de mRNA que codifica a actividade da transferase de fucT e xylT funcionais.

Conforme é sabido por uma pessoa especialista, as células de briófitas por serem deficientes em relação à actividade da fucosiltransferase e/ou xilosiltransferase podem também ser produzidas por outras técnicas incluindo RNAi e tecnologia antisentido. Todos estes métodos conduzem a uma célula de briófita preferida na qual a actividade da fucosiltransferase e/ou xilosiltransferase é significativamente reduzida ou eliminada.

As células de briófitas da invenção ou os seus antecessores podem ser qualquer uma que tenha sido transformada previamente com genes heterólogos de interesse que codificam sequências primárias de proteínas de interesse que são glicosiladas com padrões de glicosilação de mamífero conforme aqui descrito. Preferencialmente, os padrões de glicosilação são do tipo humano. Alternativamente, a célula de briófita pode ser transformada separadamente, ou seja, simultaneamente ou ao longo do tempo com sequências de nucleótidos que codificam pelo menos uma sequência de proteína primária de interesse, tipicamente pelo menos uma proteína farmacêutica de interesse para uso em seres humanos ou mamíferos tais como espécies pecuárias incluindo as espécies bovina, ovina, equina e porcina, que requerem padrões de glicosilação de 10 mamífero sejam colocados neles de acordo com os métodos da invenção como aqui descritos. Essas glicoproteínas farmacêuticas para uso em mamíferos, incluindo o Homem incluem mas não estão limitadas a proteínas, preferencialmente proteínas humanas, tais como VEGF, interferões tal como alfa-interferão, beta-interferão, gama-interferão, factores de coagulação do sangue seleccionados de entre os Factores VII, VIII, IX, X, XI, e XII, hormonas de fertilidade incluindo hormona luteinizante, hormona folículo-estimulante, factores de crescimento incluindo factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento derivado de plaquetas, factor estimulador de colónias de granulócitos e afins, prolactina, oxitocina, hormona estimulante da tiróide, hormona adrenocorticotrópica, calcitonina, hormona da paratiróide, somatostatina, eritropoietina (EPO), enzimas tais como beta-glucocerebrosidase, proteínas de fusão, tais como a proteína de fusão do domínio de ligação receptor ligando do TNF alfa com a porção Fc da IgG e afins, receptores, proteínas de superfície, proteínas transmembranares, e seus fragmentos fisiologicamente activos. Para além disso, o método da invenção pode ser usado para a produção de anticorpos tais como anticorpos monoclonais específicos ou seus fragmentos fisiologicamente activos. Estes anticorpos ou seus fragmentos podem ser anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos.

Nomeadamente, é fornecida uma célula de briófita que compreende i) uma sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase de mamífero funcional que é expressa na célula de briófita, ii) a sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um 11 promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico funcional de mamífero (sintase do ácido siálico) que é expressa na célula de briófita, iii) uma sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma sintase de ácido CMP-N-acetilneuramínico funcional de mamífero que é expressa na célula de briófita, iv) a sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica um transportador CMP de ácido siálico funcional de mamífero que é expresso na célula de briófita, v) uma sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma galactosiltransferase funcional de mamífero que é expressa na célula de briófita, e vi) uma sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma sialiltransferase funcional de mamífero que é expressa na célula de briófita.

Nomeadamente, é fornecida uma célula de briófita transformada que compreende i) uma sequência de nucleótidos de fucosiltransferase disfuncional, ii) uma sequência de nucleótidos de xilosiltransferase disfuncional, iii) uma sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase funcional de mamífero que é 12 expressa na célula de briófita, iv) a sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma fosfato sintase de ácido N-acetilneuramínico funcional de mamífero (sintase do ácido siálico) que é expressa na célula de briófita, v) uma sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma sintase de ácido CMP-N-acetilneuramínico funcional de mamífero que é expressa na célula de briófita, vi) uma sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica um transportador de ácido CMP-siálico funcional de mamífero que é expresso na célula de briófita, vii) uma sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma galactosiltransferase funcional que é expressa na célula de briófita, e viii) a sequência de nucleótidos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que a referida sequência de nucleótidos codifica uma sialiltransferase funcional de mamífero que é expressa na célula de briófita. 0 destinatário qualificado apreciará que as sequências de nucleótidos de enzimas possam ser sequências de cDNA ou possam ser sequências de DNA genómico e possam compreender sequências de nucleótidos degenerativamente equivalentes desde que o padrão de glicosilação do N-glicano de qualquer proteína exógena glicosilada desejada produzida nas células transformadas de briófitas ou tecidos de briófita da invenção seja substancialmente de padrão de mamífero - o 13 que significa que compreendem resíduos do ácido siálico -, caso não seja completamente em padrão de mamífero, e o mais preferencialmente, caso apropriado, seja em padrão humano.

Informação pormenorizada sobre o cultivo de briófitas que são adequadas para uso na invenção, tais como Leptobryum pyriforme e Sphagnum magellanicum em biorreactores, é conhecida na técnica anterior (ver, por exemplo, E. Wilbert, "Biotechnological studies concerning the mass culture of mosses with particular consideration of the arachidonic acid metabolism", Ph.D. thesis, Universidade de Mainz (1991); H. Rudolph e S. Rasmussen, Studies on secondary metabolism of Sphagnum cultivated in bioreactors, Crypt. Bot., 3, 67-73 (1992)). Especialmente preferido para os objectivos da presente invenção é o uso de Physcomitrella patens, uma vez que técnicas de biologia molecular são praticadas neste organismo (para uma revisão ver R. Reski, Development, genetics and molecular biology of mosses, Bot. Acta, 111, pp. 1-15 (1998)). Para o cultivo de briófitas podem ser usados meios com (Baur et al. (2005) Plant Biotechnol J 3, 331-340) ou sem suplementos tais como oligoelementos (Weise et al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol., 70, 337-345).

Sistemas de transformação adequados têm sido desenvolvidos para a exploração biotecnológica de Physcomitrella para a produção de proteínas heterólogas. Por exemplo, transformações de sucesso têm sido realizadas por transferência directa de DNA para tecido do protonema usando pistolas de partículas, transferência de DNA mediada por PEG em protoplastos de musgo foram também obtidas com sucesso. A transferência de DNA para protoplastos do musgo mediada por PEG tem sido conseguida com sucesso. O método de transformação mediado por PEG foi descrito muitas vezes 14 para Physcomitrella patens e conduz tanto a transformantes transitórios como a estáveis (ver, por exemplo, K. Reutter e R. Reski, Production of a heterologous proteína in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants, Pl. Tissue culture and Biotech., 2, 142-147 (1996)). Além disso, a transformação sem marcadores pode também ser conseguida pelo método de transformação mediada por PEG em briófitas (Stemmer C, Koch A e Gorr G (2004), Marker-free transformation of Physcomitrella patens, Moss 2004, The 7th Annual Moss International Conference, Freiburg, Alemanha) e pode ser usada para a subsequente introdução de várias sequências de nucleótidos.

Num aspecto adicional da invenção, é fornecido um método para produzir pelo menos uma proteína de mamífero glicosilada exógena compreendendo pelo menos um resíduo de ácido siálico numa célula de briófita transformada, que compreende: i) introduzir numa célula de briófita seis sequências de ácidos nucleicos isoladas cada uma compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita em que as referidas seis sequências de ácidos nucleicos isoladas codificam seis proteínas funcionais, preferencialmente proteínas humanas, que são expressas na célula de briófita, em que as referidas seis proteínas funcionais são uma UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetil-neuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico), uma sintase do ácido CMP-N-acetilneuramínico de mamífero, um transportador de ácido CMP-siálico de mamífero, uma galactosiltransferase, e uma sialiltransferase de mamífero; ou quando uma célula de 15 briófita que já tenha sido transformada e que seja capaz de expressar as referidas seis proteínas funcionais; e ii) introduzir na referida célula de briófita uma outra sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende uma sequência de ácidos nucleicos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita, em que o referido ácido nucleico codifica a referida proteína exógena de mamífero; ou usando uma célula de briófita que já tenha sido transformada e que seja capaz de expressar a referida proteína exógena de mamífero. 0 método de transformar a célula de briófita compreende transformar a referida célula com seis das sequências de ácidos nucleicos aqui mencionadas acima em relação à célula de briófita transformada, tais sequências sendo capazes de codificar proteínas funcionais em que as referidas sequências de ácidos nucleicos estão operacionalmente ligadas a um promotor exógeno. Tipicamente, tais sequência de nucleótidos são sequências de mamífero e preferencialmente são seleccionadas a partir de sequências de ácidos nucleicos humanas. 0 método da invenção tipicamente compreende introduzir uma galactosiltransferase funcional, por exemplo uma sequência de nucleótidos beta-1,4 galactosiltransferase de mamífero, preferencialmente uma sequência de nucleótidos beta 1,4 galactosiltransferase humana numa célula briófita transformada da invenção. 0 método da invenção também emprega tipicamente uma sialiltransferase usada nas células de briófitas transformadas da invenção, que é tipicamente codificada por um polinucleótido seleccionado entre uma sequência de nucleótidos alfa-2,6 ou alfa 2,3 sialiltransferase de 16 mamífero, e é preferencialmente uma sequência de nucleótidos alfa-2,6 sialiltransferase humana. A célula de briófita transformada da invenção é tipicamente uma célula em que a actividade da fucosiltransferase e/ou da xilosiltransferase é significativamente reduzida ou eliminada.

Numa forma de realização preferida da presente invenção é fornecido um método para produzir pelo menos uma proteína heteróloga ou exógena glicosilada de mamífero compreendendo pelo menos um resíduo siálico numa célula de briófita transformada que compreende: i) introduzir na referida célula uma primeira sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita em que o referido ácido nucleico codifica pelo menos uma UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase; ii) introduzir na referida célula uma outra sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita em que o referido ácido nucleico codifica pelo menos uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico (sintase do ácido siálico); iii) introduzir na referida célula uma outra sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita em que o referido ácido nucleico codifica pelo menos uma sintase de ácido CMP-N-acetilneuramínico; 17 iv) introduzir na referida célula uma outra sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita em que o referido ácido nucleico codifica pelo menos um polipéptido transportador de ácido CMP-siálico de mamífero; v) introduzir na referida célula uma outra sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita em que o referido ácido nucleico codifica pelo menos um polipéptido de galactosiltransferase; vi) introduzir na referida célula uma outra sequência de ácidos nucleicos adicional que compreende ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita em que o referido ácido nucleico codifica pelo menos um polipéptido de sialiltransferase de mamífero; vii) introduzir na referida célula uma outra sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita em que o referido ácido nucleico codifica pelo menos um polipéptido glicosilado de mamífero.

Como mencionado indirectamente aqui, o pelo menos um polipéptido de galactosiltransferase é preferencialmente uma beta-1,4 galactosiltransferase (beta-1,4 galT) de mamífero e o mais preferencialmente é um polipéptido de beta-1,4 galactosiltransferase humana, e o pelo menos um polipéptido de sialiltransferase de mamífero é preferencialmente uma alfa-2,3 ou alfa-2,6 18 sialiltransferase e o mais preferencialmente é um polipéptido de alfa-2,6 sialiltransferase humana.

Numa outra nomeação, o método acima compreende adicionalmente os seguintes passos: viii) uma sequência de nucleótidos que torna disfuncional a sequência de nucleótidos da fucosiltransferase endogénica; ix) uma sequência de nucleótido que torna disfuncional a sequência de nucleótido da xilosiltransferase endogénica.

Alternativamente, o método acima faz uso de uma célula de briófita na qual a actividade da fucosiltransferase e/ou da xilosiltransferase é significativamente reduzida ou eliminada.

Preferencialmente, todas as proteínas de mamíferos glicosiladas aqui mencionadas acima são do tipo humano. Outras proteínas que são contempladas para produção na presente invenção incluem proteínas para uso em tratamento veterinário e podem corresponder a homólogos animais das proteínas humanas aqui mencionadas.

Um promotor exógeno é um que indica um promotor que é introduzido na frente de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse e está operacionalmente a ela associado. Portanto, um promotor exógeno é um que foi colocado na frente de um componente de ácido nucleico seleccionado como aqui definido e não consiste no promotor natural ou nativo normalmente associado ao componente de ácido nucleico de interesse conforme encontrado em circunstâncias do tipo selvagem. Assim um promotor pode ser nativo para uma célula de briófita de interesse mas pode não estar operacionalmente associado ao ácido nucleico de interesse 19 na frente em células de briófitas do tipo selvagem. Tipicamente, um promotor exógeno é um que é transferido para uma célula de briófita hospedeira a partir de uma outra fonte que não a célula hospedeira.

Os cDNAs que codificam as enzimas (de mamífero) e as proteínas de mamífero glicosiladas conforme aqui descrito contêm pelo menos um tipo de promotor que é operacional numa célula de briófita, por exemplo, um promotor indutível ou um constitutivo operacionalmente ligado a uma sequência de ácidos nucleicos codificando uma enzima (de mamífero) e/ou uma segunda sequência de ácidos nucleicos para uma proteína de mamífero glicosilada conforme aqui definido e como fornecido pela presente invenção. Conforme discutido, isto permite o controlo da expressão dos genes. 0 termo "indutível" conforme aplicado a um promotor é bem entendido pelos especialistas na técnica. Em essência, a expressão sob o controlo de um promotor indutível é "ligada" ou tem resposta aumentada em relação a um estímulo aplicado (o qual pode ser gerado dentro da célula ou fornecido exogenamente). A natureza do estímulo varia entre os promotores. Alguns promotores indutíveis causam níveis de expressão pequenos ou indetectáveis (ou nenhuma expressão) na ausência dos estímulos apropriados. Outros promotores inductíveis causam expressão constitutiva detectável na ausência dos estímulos. Seja qual for o nível de expressão na ausência dos estímulos, a expressão a partir de qualquer promotor indutível é aumentada na presença do estímulo correcto. A situação preferível é quando o nível de expressão aumenta com a aplicação do estímulo relevante numa quantidade eficiente para alterar uma característica fenotípica. Assim, um promotor indutível (ou "ligável") pode ser usado o qual causa um nível de expressão básico na ausência do estímulo cujo nível é 20 demasiado baixo para produzir um fenótipo desejado (e pode de facto ser zero). Após a aplicação do estimulo, a expressão é aumentada (ou ligada) a um nivel, que produz o fenótipo desejado.

Conforme aqui referido indirectamente, os sistemas de expressão de briófita são também conhecidos dos especialistas na técnica. Um promotor de briófita, em particular um promotor de Physcomitrella patens, é qualquer sequência de DNA capaz de ligar uma RNA polimerase dependente de DNA hospedeiro e de iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência de codificação (e.g. gene estrutural) para mRNA. Um promotor vai ter uma região de iniciação de transcrição que é normalmente colocada proximal à terminação 5' da sequência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição inclui normalmente um sitio de ligação da RNA polimerase (a "TATA Box") e um sitio de iniciação da transcrição. Um promotor de briófita pode também ter um segundo domínio chamado de sequência activadora a montante (UAS), o qual, se presente, é normalmente distai ao gene estrutural. A UAS permite uma expressão regulada (indutível). A expressão constitutiva ocorre na ausência de uma UAS. A expressão regulada pode ser positiva ou negativa aumentando ou reduzindo desse modo a transcrição. O destinatário qualificado vai apreciar que as sequências promotoras de briófita que codificam enzimas nos passos metabólicos de briófitas possam fornecer sequências promotoras particularmente úteis.

Adicionalmente, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza podem também funcionar como promotores de briófitas. Por exemplo, as sequências UAS de um promotor de briófita podem ser unidas com a região de activação da 21 transcrição de outro promotor de briófita, criando um promotor híbrido sintético. Um exemplo de um promotor adequado é aquele usado no sistema de expressão TOP 10 para Physcomitrella patens por Zeidler et al. (1996) Plant. Mol.

Biol. 30, 199-205). Para além disso, um promotor de briófita pode incluir promotores que ocorrem naturalmente, de origem que não de briófita, que têm a capacidade de ligar uma RNA polimerase dependente de DNA de briófita e iniciar a transcrição. Exemplos desses promotores incluem aqueles descritos, inter alia, o promotor P-Actin 1 do arroz e o promotor RbcS de Chlamydomonas (Zeidler et al. (1999) J. Plant Physiol. 154, 641-650), Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 1078, 1980; Henikoff et al. ,

Nature, 283: 835, 1981; Hollenberg et al. , Curr. Topics

Microbiol. Immunol., 96: 119, 198 1; Hollenberg et al. , "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", in: Plasmids of

Medicai, Environmental e Commercial Importance (eds. K. N. Timms e A. Puhler), 1979; Mercerau-Puigalon et al., Gene, 1 1: 163, 1980; Panthier et al., Curr. Genet., 2: 109, 1980.

Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente nas briófitas. Uma sequência promotora pode estar directamente ligada a uma molécula de DNA, em cujo caso o primeiro aminoácido na terminação N da proteína recombinante será sempre uma metionina, a qual é codificada por códão de iniciação AUG no mRNA. Se desejado, a metionina na terminação N pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Alternativamente, proteínas externas podem também ser segregadas pela célula de briófita para os meios de crescimento criando moléculas de DNA quiméricas que codificam uma proteína de fusão composta por um fragmento 22 de sequência líder que promove a secreção dentro ou fora das células de briófitas da proteína externa. Preferencialmente, existem sítios de processamento codificados entre o fragmento líder e o gene externo que podem ser clivados tanto in vivo como in vitro. 0 fragmento de sequência líder normalmente codifica um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirige a secreção da proteína da célula. 0 DNA que codifica sequências de sinal adequadas pode derivar de genes para proteínas de briófita que são dirigidas para a via secretora, tais como líderes de origem não briófita, tal como um líder aVEGF, existem e podem também promover a secreção em células de briófitas.

As sequências de terminação da transcrição que são reconhecidas e funcionais nas células de briófitas são regiões reguladoras localizadas em 3' em relação ao codão de stop da tradução, e assim, em conjunto com o promotor, flanqueiam a sequência de codificação. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. Um exemplo de sequência de terminação adequada que funciona em Physcomitrella patens é a região de terminação do vírus do mosaico da couve-flor.

Tipicamente, os componentes, compreendendo um promotor, líder (se desejado), sequência de codificação de interesse, e sequência de terminação de transcrição, são colocados em conjunto nos elementos de construção da expressão da invenção. Os elementos de construção da expressão são muitas vezes mantidos num plasmidio de DNA, o qual é um elemento extracromossomal capaz de uma manutenção estável num hospedeiro, tal como uma bactéria. 0 plasmidio de DNA pode ter duas origens de replicação, permitindo assim que 23 seja mantido, por exemplo, numa briófita para expressão e num hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação. Em geral, é suficiente se o plasmídio tiver uma origem de replicação para clonagem e amplificação numa célula hospedeira procariótica. Para além disso, um plasmídio de DNA pode ser um plasmídio de alto ou de baixo número de cópias. Um plasmídio de alto número de cópias vai ter geralmente um número de cópias variando desde cerca de 5 até cerca de 200, e usualmente cerca de 10 até cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmídio de alto número de cópias deve ter preferencialmente pelo menos cerca de 10, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20. Pode ser seleccionado tanto um vector de alto como de baixo número de cópias, dependendo do efeito do vector e da proteína externa no hospedeiro (ver, e.g., Brake et al., supra).

Alternativamente, os elementos de construção da expressão podem ser integrados no genoma da briófita com um vector de integração. Vectores de integração normalmente contêm pelo menos uma sequência homóloga a um cromossoma de briófita que permite ao vector integrar-se, e contém preferencialmente duas sequências homólogas que flanqueiam o elemento de construção da expressão. Um vector de integração pode ser dirigido para um local específico em musgo seleccionando a sequência homóloga adequada para inclusão no vector como aqui descrito e exemplificado. Podem integrar-se um ou mais elementos de construção de expressão. As sequências cromossómicas incluídas no vector podem ocorrer tanto como um segmento único no vector, o que resulta na integração de todo o vector, ou como dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e flanqueando o elemento de construção de expressão no vector, o que pode resultar na integração estável apenas do elemento de construção de expressão. 24

Normalmente, os elementos de construção de expressão extracromossómicos e de integração podem conter marcadores seleccionáveis para permitir a selecção das células de briófitas que tenham sido transformadas. Adicionalmente, podem ser usados métodos de transformação sem marcadores.

Marcadores seleccionáveis podem incluir genes biossintéticos que podem ser expressos no hospedeiro do musgo, tais como os genes de resistência ao G418 ou à higromicina B, os quais conferem resistência nas células de briófitas a G418 e à higromicina B, respectivamente. Adicionalmente, um marcador seleccionável adequado pode também fornecer às células de briófitas a capacidade de crescer na presença de compostos tóxicos, tais como metais.

Alternativamente, alguns dos componentes acima descritos podem ser colocados juntos nos vectores de transformação. Os vectores de transformação são normalmente compostos por um marcador seleccionável que é mantido num plasmidio de DNA ou desenvolvido num vector de integração, conforme descrito acima. Métodos para introduzir DNA exógeno nas células de briófitas são bem conhecidos na técnica, e são descritos inter alia por Schaefer D. G. "Principies and protocols for the moss Physcomitrella patens", (May 2001) Institute of Ecology, Laboratory of Plant Cell Genetics, University of Lausanne Didier. Schaefer@ie-pc.unil.ch; Reutter K. e Reski R., Plant Tissue Culture and Biotechnology September 1996, Vol. 2, No.3; Zeidler M et al., (1996), Plant Molecular Biology 30:199-205.

Os especialistas na técnica são capazes de construir vectores e de conceber protocolos para sequências recombinantes de ácidos nucleicos ou para expressão de 25 genes como descrito acima. Vectores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, fragmentos terminadores, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências conforme adequado. Para mais pormenores ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácidos nucleicos, por exemplo na preparação de elementos de construção de ácidos nucleicos, mutagénese, sequenciação, introdução de DNA nas células e expressão de genes, e análise de proteínas, são descritos em pormenor em Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. As divulgações de Sambrook et al. e Ausubel et al. são aqui incorporadas como referência.

Naturalmente, o destinatário qualificado vai apreciar que cada sequência de ácidos nucleicos que codifica as enzimas e polipéptidos apropriados (humanos) a serem glicosilados, e incluindo os que vão ser sialilados, vai estar sob o controlo regulador do seu próprio promotor e terminador exógeno. Quando duas ou mais proteínas alvo são destinadas a serem produzidas a partir de um único RNA transportador é preferível que eles sejam capazes de ser facilmente separados, por exemplo ligando-se a diferentes anticorpos específicos de proteínas (monoclonal ou policlonal) na fase de colheita do sistema de cultura de células de briófita.

Conforme descrito acima, marcadores genéticos seleccionáveis podem facilitar a selecção de células de briófitas transgénicas e podem consistir em genes quiméricos que conferem fenótipos seleccionáveis como aqui referido indirectamente. 26

Quando se introduz sequências de polipéptidos e sequências de ácidos nucleicos de enzimas humanas seleccionadas para glicosilação e/ou sialilação numa célula de briófita, certas considerações devem ser tidas em conta, bem conhecidas dos especialistas na técnica. 0(s) ácido(s) nucleico(s) a ser(em) inserido(s) deve(m) ser montado(s) dentro de um elemento de construção, que contém elementos reguladores eficientes, que vão conduzir a transcrição. Deve estar disponível um método de transportar o elemento de construção para a célula. Uma vez que o elemento de construção esteja dentro da membrana da célula, a integração no material cromossómico endógeno ou vai ocorrer ou não vai. A presente invenção fornece um vector de ácido nucleico adequado para transformação de uma célula de briófita e incluindo pelo menos uma sequência de polinucleótidos isolada que codifica pelo menos um polipéptido funcional seleccionado a partir de uma UDP-N- acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico), uma sintase do ácido CMP-N-acetilneuramínico de mamífero, um transportador de ácido CMP-siálico de mamífero, uma galactosiltransferase, e uma sialiltransferase de mamífero. 0 técnico vai apreciar que a invenção forneça também um conjunto de vectores de ácido nucleico adequados para transformação de uma célula de briófita em que o referido conjunto compreende pelo menos dois vectores cada um incluindo pelo menos uma sequência de polinucleótidos isolada como aqui definido acima. Do mesmo modo, a invenção fornece este conjunto de vectores de ácido nucleico para uso num método para produzir a célula de briófita transformada como aqui definido acima. 27 A invenção engloba ainda uma célula hospedeira de briófita transformada com vectores ou elementos de construção conforme indicado acima. Assim, é fornecido uma célula hospedeira de briófita incluindo as sequências de nucleótidos da invenção conforme aqui indicado. Dentro da célula, a sequência de nucleótidos pode ser incorporada dentro do cromossoma.

Também de acordo com a invenção, é fornecida uma célula de briófita tendo incorporada no seu genoma pelo menos uma sequência de nucleótidos, particularmente sequências de nucleótidos heterólogas, como fornecido pela presente invenção sob controlo operacional das sequências reguladoras para controlo da expressão como aqui descrito. A sequência de codificação pode ser operacionalmente ligada a uma ou mais sequências reguladoras as quais podem ser heterólogas ou externas às sequências de ácidos nucleicos empregues na invenção, tais como sequência(s) não naturalmente associada(s) a ácido nucleicos para a sua expressão. A sequência de nucleótidos de acordo com a invenção pode ser colocada sob o controlo de um promotor indutível externamente para colocar a expressão sob controlo do utilizador. Um aspecto adicional da presente invenção fornece um método de fazer essa célula de briófita, particularmente uma célula de Physcomitrella patens envolvendo a introdução da sequência(a) de ácidos nucleicos contemplada(s) para uso na invenção ou pelo menos um vector ou conjunto de vectores adequados incluindo a(s) sequência(s) contemplada(s) para uso na invenção numa célula de briófita e causando ou permitindo a recombinação entre o(s) vector(s) e o genoma da célula de briófita para introduzir as referidas sequências no genoma. A invenção extende-se a células de briófitas, particularmente a células de Physcomitrella patens contendo um nucleótido GaIT e/ou uma sequência de nucleótidos que codificam uma 28 sequência de polipéptido destinada para a adição de um padrão de glicosilação de mamífero e adequado para uso na presente invenção como resultado da introdução da sequência de nucleótidos na célula progenitora. 0 termo "heterólogo" pode ser usado para indicar que o gene/sequência de nucleótidos em questão foram introduzidos nas células de briófitas ou na sua progenitora, usando manipulação genética, i.e. por intervenção humana. Um célula transgénica de briófita, i.e. transgénica em relação à(s) sequência (s) de nucleótidos em questão, pode ser fornecida. 0 transgene pode estar num vector extra-genómico ou incorporado, preferencialmente de forma estável, no genoma. Um gene heterólogo pode substituir um gene equivalente endógeno, ie um que normalmente realiza a mesma função ou uma semelhante, ou a sequência inserida pode ser adicional ao gene endógeno ou outra sequência. Uma vantagem da introdução de um gene heterólogo é a capacidade de colocar a expressão de uma sequência sob o controlo de um promotor de escolha, com vista a ser capaz de influenciar a expressão de acordo com a preferência. As sequências de nucleótidos heterólogas, ou exógenas ou externas, em relação a uma célula de briófita podem ser de ocorrência não natural em células desse tipo, estirpes ou espécies. Portanto, a sequência de nucleótidos pode incluir um sequência de codificação ou derivada de um tipo particular de célula de briófita, tal como uma célula de Physcomitella patens, colocada no contexto de uma célula de briófita de um tipo ou espécies diferente. Um outra possibilidade é a de uma sequência de nucleótidos ser colocada dentro da célula de briófita na qual ela ou um homólogo se encontra naturalmente, mas em que a sequência de nucleótidos é ligada e/ou adjacente ao ácido nucleico, o que não ocorre naturalmente dentro da célula, ou células desse tipo ou espécie ou estirpe, tal como operacionalmente ligada a uma 29 ou mais sequências reguladoras, tais como uma sequência promotora, para controlo da expressão. Uma sequência dentro da briófita ou de outra célula hospedeira pode ser identificavelmente heteróloga, exógena ou externa. A presente invenção compreende também o produto da expressão do polipéptido desejado da combinação das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção como aqui divulgado ou obtenível de acordo com a informação e sugestões daqui. São também fornecidos os métodos de fazer esse produto de expressão por expressão a partir da sequências de nucleótidos que codificam, portanto, sob condições adequadas em células hospedeiras adequadas e.g. E. coli. Os especialistas na técnica são capazes de construir vectores e conceber protocolos e sistemas para a expressão e recuperação dos produtos da expressão de genes recombinantes. A presente invenção engloba também o uso de seis sequência de polinucleótidos que codificam uma UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico), uma sintase do ácido CMP-N-acetilneuramínico de mamífero, um transportador do ácido CMP-siálico de mamífero, uma galactosiltransferase, e uma sialil-transferase de mamífero na produção de uma célula transgénica de briófita.

Numa nomeação adicional, a célula hospedeira da invenção está compreendida numa briófita, ou numa parte da briófita, ou num extracto ou derivado de uma briófita ou numa cultura de células de briófita. 30

Para além disso, é fornecida uma planta de briófita ou um tecido de briófita compreendendo uma célula de briófita como aqui definido acima. A presente invenção também fornece um método para produzir uma planta de briófita transformada, o método incluindo a incorporação de pelo menos um vector de ácido nucleico ou um conjunto de vectores de ácido nucleico como aqui definido acima numa célula de briófita e regenerar uma briófita a partir da referida célula.

Além disso, a presente invenção fornece um método para produzir ácido siálico ou ácido CMP-siálico numa célula, tecido ou organismo de briófita transformada, que compreende i) transformar a referida célula, tecido ou organismo de briófita com três sequências de polinucleótidos que codificam três polipéptidos sendo uma UDP-N-acetil-glucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico), uma sintase do ácido CMP-N-acetilneuramínico de mamífero; ou ii) usar uma célula, tecido ou organismo de briófita já transformada que compreende três sequências de polinucleótidos que codificam três polipéptidos sendo uma UDP-N-acetil-glucosamina-2-epimerase / N-acetil-manosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico), e uma sintase do ácido CMP-N-acetilneuramínico de mamífero; e, opcionalmente, 31 iii) recuperar, purificar ou isolar o ácido siálico ou o ácido CMP-siálico da célula, tecido ou organismo como tratado ou definido em i) e/ou, ii).

Um polipéptido produzido de acordo com a presente invenção pode ser um alelo, variante, fragmento, derivado, mutante ou homólogo de polipéptidos como aqui mencionado. 0 alelo, variante, fragmento, derivado, mutante ou homólogo pode ter substancialmente a mesma função dos polipéptidos referidos acima e conforme aqui mostrado ou pode ser um mutante funcional seu. No contexto de proteínas farmacêuticas conforme aqui descrito para uso em seres humanos, o destinatário qualificado vai apreciar que a sequência primária dessas proteínas e seu padrão de glicosilação vão simular ou preferencialmente ser idênticos aos encontrados em seres humanos. "Homologia" em relação a uma sequência de aminoácidos da invenção pode ser usada para se referir a identicidade ou semelhança, preferencialmente identicidade. Como já indicado acima, um alto nível de identidade de aminoácidos pode ser limitada a domínios ou regiões funcionalmente significativos, e.g. qualquer dos domínios aqui identificados.

Em particular, homólogos de sequências de polipéptidos específicas derivadas de briófita aqui fornecidas, são fornecidos pela a presente invenção, assim como mutantes, variantes, fragmentos e derivados desses homólogos. Tais homólogos são facilmente obteníveis usando as divulgações aqui feitas. Naturalmente, o destinatário qualificado vai apreciar que homólogos das sequências de proteínas glicosiladas per se, que não os homólogos que, devido à degenerescência do código genético dão origem a sequências de aminoácidos que são verdadeiras cópias (i.e. 100% 32 idênticas) das proteínas de mamíferos de interesse, e especialmente de proteínas humanas de interesse, estejam englobadas dentro da presente invenção. Assim, a presente invenção também se estende a polipéptidos que incluem sequências de aminoácidos com função de enzimas humanas como é aqui definido e como é obtenível usando a informação conforme aqui fornecida. Os homólogos podem, ao nível dos aminoácidos, ter homologia, ou seja identicidade, com as sequências de aminoácidos descritas na técnica anterior como aqui descrito i.e. sob os números de acesso da base de dados fornecidos na secção dos exemplos, preferencialmente pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos 55%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 80% de homologia, ou pelo menos cerca de 85 %, ou pelo menos cerca de 88% de homologia, ou pelo menos cerca de 90% de homologia e o mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% ou maior homologia desde que essas proteínas tenham actividade que se enquadra no contexto da presente invenção.

Em certas formas de realização, um alelo, variante, derivado, derivado mutante, mutante ou homólogo da sequência específica pode mostrar uma pequena homologia global, ou seja cerca de 20%, ou cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40% ou cerca de 45%, com a sequência específica. No entanto, em domínios ou regiões funcionalmente significativos, a homologia dos aminoácidos pode ser muito mais alta. Domínios ou regiões putativos funcionalmente significativos podem ser identificados usando processos de bioinformática, incluindo a comparação das sequências de homólogos.

Domínios ou regiões funcionalmente significativos de polipéptidos diferentes podem ser combinados para expressão 33 a partir de ácidos nucleicos de codificação como uma proteína de fusão. Por exemplo, propriedades particularmente vantajosas ou desejáveis de diferentes homólogos podem ser combinadas numa proteína híbrida, de modo a que o produto de expressão resultante, com actividade de enzima, possa incluir fragmentos de várias proteínas parentes, se apropriado. A semelhança das sequências de aminoácidos pode ser conforme definido e determinada pelo programa TBLASTN, de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, o qual é de uso padrão na técnica. Em particular, o TBLASTN 2.0 pode ser usado com Matrix BLOSUM62 e penalizações de GAP: existência: 11, extensão: 1. Outro programa padrão que pode ser usado é o BestFit, o qual é parte do Pacote Wisconsin, Versão 8, Setembro 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711). O BestFit faz um alinhamento óptimo do melhor segmento de semelhança entre duas sequências. Os alinhamentos óptimos são encontrados inserindo espaços para maximizar o número de correspondências usando o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482-489). Outros algoritmos incluem GAP, o qual usa o algoritmo de Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências completas o que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de espaços. Como com qualquer algoritmo, geralmente são usados os parâmetros padrão, que, para o GAP são uma penalização para a criação de um gap = 12 e penalização para a extensão de um gap = 4. Alternativamente, pode ser usada uma penalização de criação de um gap de 3 e uma penalização de extensão de um gap de 0,1. O algoritmo FASTA (o qual usa o método de Pearson e Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448) é uma outra alternativa. 34 0 uso dos termos "homologia" e "homólogos" agui não implica gualquer relação evolutiva necessária entre as sequências comparadas, mantendo por exemplo o uso comum de termos como "recombinação homóloga" que requer simplesmente que duas sequências de nucleótidos sejam suficientemente semelhantes para se combinarem sob condições apropriadas.

Deve ser entendido que os ensinamentos de todas as referências aqui citadas são incorporados nos ensinamentos da especificação.

Exemplos Métodos e Materiais

Material vegetal

Foi usada a estirpe de tipo selvagem de Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. caracterizada por Reski et al. ((1994) Genome analysis of the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.. Mol Gen Genet 244, 352-359)). É uma subcultura da estirpe 16/14 a qual foi colhida por H. L. K. Whitehouse em Gransden Wood, Huntingdonshire, UK e foi propagada por Engel ((1968) Am J Bot 55, 438-446)). Foram também usadas estirpes de Physcomitrella transgénicas glico-manipuladas sem os dois resíduos de açúcar específicos de plantas na estrutura do núcleo dos N-glicanos (Koprivova et al. (2004) Plant Biotechnol J 2, 517-523) e/ou contendo 1,4 galactosiltransferase humana (Huether et al. (2005) Plant Biol 7, 292- 299). 35

Condições de cultura padrao

As plantas foram crescidas axenicamente sob condições de esterilidade em meio de Knop simples modificado liquido inorgânico (1000 mg/L Ca(N03)2 x 4H20 250 mg/L KC1, 250 mg/L KH2P04, 250 mg/L MgS04 x 7 H20 e 12,5 mg/L FeS04 X 7 H20; pH 5,8 (Reski e Abel (1985) Planta 165, 354-358). As condições de cultura podem ser modificadas e.g. conforme descrito por Baur et al. (2005) Plant Biotechnol J 3, 331-340 ou Weise et al. (2006) Appl Microbiol Biotechnol, 70, 337-345). As plantas foram crescidas em frascos de Erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL de meio de cultura e os frascos foram agitados num agitador Certomat R (B. Braun Biotech International, Alemanha) a 120 rpm. As condições na câmara de crescimento foram de 25 +/- 3°C e um regime de luz-escuro de 16:8 h. Os frascos foram iluminados por cima por dois tubos fluorescentes (Osram L 58 W/25) fornecendo 35 micromoles_1m”2. As culturas foram subcultivadas uma vez por semana por desintegração usando um homogeneizador Ultra-Turrax (IKA, Staufen, Alemanha) e inoculação de dois novos frascos de Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de meio de Knop fresco.

Isolamento dos protoplastos e transformação O isolamento dos protoplastos foi realizado como descrito anteriormente (Baur et al. (2005) J Biotechnol, 119, 332-342). Para contagem dos protoplastos foi transferido um pequeno volume da suspensão para uma câmara de Fuchs-Rosenthal. A transformação foi realizada por transferência directa de DNA mediada por PEG para os protoplastos com marcadores de selecção (Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95, 4368-4373) ou sem marcadores (Stemmer C, Koch A e Gorr G (2004) Marker-free transformation of Physcomitrella patens. Moss 2004, The 7th Annual Moss 36

International Conference, Freiburg, Alemanha). Foram realizadas co-transformações introduzindo os elementos de construção de DNA relevantes simultaneamente nos protoplastos por transferência de DNA mediada por PEG.

Selecção de PCR A introdução dos elementos de construção de DNA heterólogo foi analisada por PCR usando primers apropriados (ver abaixo).

Analise de ácidos siálicos (Neu5Ac)

Para isolamento de glicoproteinas foi suspendido tecido em 15 mL de 25 mM de tampão Tris/HCl de pH 7,5 - contendo 2 mM de ditiotreitol e 1 μρ/ιτΛ de leupeptina - e homogenizado com um ultraturrax. Foi adicionado Triton X-100 (0,25%, p/v) à mistura semi-liquida, e a mistura agitada durante 60 min a 4°C. A suspensão foi centrifugada e o material solúvel foi passado através de um filtro de 0,45 μιη. Os extractos foram dialisados extensivamente contra 25 mM de acetato de amónio de pH 6,0. O dialisado resultante foi misturado com um volume igual de 4 M de ácido acético e mantido durante 3 h a 80°C. As amostras foram depois ultrafiltradas usando um aparelho Centriprep YM-3 com um limite de 3 kDa (Amicon) . O filtrado foi concentrado em vácuo.

Aliquotas de 50 \iL foram derivatizadas com DMB (Altmann e Lomonossoff (2000), J. Gen. Virol. 81, 1111-1114; Hara et al. (1987), Anal. Biochem. 164, 138-145). Foram separados ceto açúcares ácidos marcados com DMB numa coluna de fase reversa (Thermo Hypersil ODS, 250x4 mm, 5 μπι) eluida com 50 mM de acetato de amónio, pH 5,5, a uma taxa de fluxo de 1,2 37 mL/min. Os analitos foram eluídos com um gradiente superficial desde 7,6 até 11,4% de acetonitrilo em 20 min e detectados fluorimetricamente (Hara et al. (1987), Anal. Biochem. 164, 138-145).

As fracções isoladas contendo DMB-Neu5Ac foram analisadas por análise de espectrometria de massa ESI (ESI-MS). O ácido siálico activado (CMP-Neu5Ac) foi analisado por ESI-MS no modo MSMS.

Exemplos 1.1 Clonagem de UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N- acetilmanosamina-6-guinase humana O cDNA que codifica a UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase humana (número de acesso: AF155663) foi clonado no vector de expressão da planta pRTIOl (Toepfer et al. (1987) Nucl Acids Res 15, 5890). No elemento de construção resultante, a UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase estava sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S - em conjunto denominado como elemento de construção de expressão. Para o procedimento de transformação, o elemento de construção de expressão foi excisado. O fragmento linearizado contendo UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase/N-acetiImanosamina-6-quinase sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S foi usado para transformação de estirpes de Physcomitrella patens.

Numa abordagem paralela, o cDNA que codifica a UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase humana (número de acesso: AF155663) foi clonado no plasmidio pBS sob regulação do promotor tub3 (número de acesso: AY724471) e do terminador do gene alfa 1,3 38 fucosiltransferase da Physcomitrella patens (Pp). Antes da clonagem do cDNA da UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase humana em pBS, o terminador do gene alfa 1,3 fucosiltransferase (5'-

CGGTGATCCCGTTTTCATATCAGTGTATTATCATCAGTGACTGGATATTGACACCCAAT

TCTGATGATTTTTTATTTTTTATTTTTTATTTTTT

TTGGTATGGTTACATGCTTTTCAGAGGTTTCTATGCCGCTGAGTATTTTCCTGAATCGC

GAGGT

GTGACAGGTTATCTGCGCCGTCCACCCAATATTTTATGATGAGTCGATGATTCGTGAGA

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CTAGCTTAACCTTTTTCTTACTGGCAAGTCAAAATT

GAGTTTAAAATATTTCAGTATCCTGTTA

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TAAAAGTTTTTTTTAATTTAAAAAGATTAATTTTTATTAATAAGAAGAAC T TGGAAAGT TAGAA

AAATAT T TAACT T TAAAAATTAAGAAAACAAGGCAAAAC T T TAAT T TACAAATAC T TAA TGTAG ATTAATTTTCTTATTATATATTAGCACAAATTATCATTATGTGATATTTTATGTTATTG T-3') (SEQ ID NO 1) de Physcomitrella patens foi amplificado por PCR usando o primer MoB558 (5' — GTTCCGCGGTGATCCCGTTTTCATATCAGTGTATT-3') (SEQ ID NO 2) e o primer MOB557 (5'-TTTGAGCTCTACGTAACAATAACAT-AAAATATCACA-3') (SEQ ID NO 3) . 0 fragmento amplificado foi cortado com

SacII e Saci e foi ligado no pBS o qual foi também cortado com SacII e Saci. 39 0 cDNA que codifica a UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase humana (número de acesso: AF155663) foi ligado com o promotor Pp tub3 e 5'UTR (número de acesso: AY724471) e amplificado por PCR de sobreposição usando os primers MOB1108 (5'-GATGGATCCATTGCCAATGTATTGATTGGC-3') (SEQ ID NO 4); MOB1124 (5'-GTTATTTCCATTCTTCTCCATCTTCGCTAAGGATGATCTAC-3') (SEQ ID NO 5) e M0B1125 (5'-GTCTCTAGACTAGTAGATCCTGCGTGT-3') (SEQ ID NO 6). O fragmento resultante foi cortado com BamHI e Xbal e foi ligado no pBS contendo o terminador do gene Pp alfa 1,3 fucosiltransferase e cortado com BamHI e Xbal. Para transformação de Physcomitrella patens, foi usado o elemento de construção de expressão excisado com Kpnl e SnaBI excisaram compreendendo o promotor Pp tub3, o cDNA de UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase humana e o terminador do gene Pp alfa 1,3 fucosiltransferase. 1.2 Clonagem de fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico humana 0 cDNA que codifica a fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico humana (número de acesso: NM_018946) foi clonado num vector de expressão de planta pRTIOl (Toepfer et al. (1987) Nucl Acids Res 15, 5890). O cDNA que codifica a fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico humana foi amplificado por PCR usando o primer_MOB785 (5'-GGCCTGCAGATGCCGCTGGAGCTGGAGCTG-3') (SEQ ID NO 7) e o primer MOB786 (5'-GCCGGATCCTTAAGACTTGATTTTTTTGCCATGA-3') (SEQ ID NO 8) . O produto da amplificação foi cortado com Pstl e BamHI e clonado no pRTIOl. No elemento de construção resultante, a fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico estava sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S -em conjunto chamados de elemento de construção de expressão. Para o procedimento de transformação, o elemento 40

de construção de expressão foi excisado com Sph I. O fragmento linearizado contendo a fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S foi usado para transformação de estirpes de Physcomitrella patens. 1.3 Clonagem da sintase de ácido CMP-N-acetilneuramínico humana O cDNA que codifica a sintase de ácido CMP-N- acet ilneuramínico humana (número de acesso: NM_018686) foi clonado no vector de expressão da planta pRTIOl (Toepfer et al. (1987) Nucl Acids Res 15, 5890) . O cDNA que codifica a sintase de ácido CMP-N-acetilneuramínico humana foi amplificado por PCR usando o primer MOB835 (5' — ATCGAATTCATGGACTCGGTGGAGAAGGG-3') (SEQ ID NO 9) e o primer MOB836 (5'-TGAGGATCCCTATTTTTGGCATGAATTATTAACCT-3') (SEQ NO ID 10) . O produto da amplificação foi cortado com EcoRI e BamHI e clonado no pRTIOl. No elemento de construção resultante, a sintase de ácido CMP-N-acetilneuramínico estava sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S -em conjunto designados por elemento de construção de expressão. Para o procedimento de transformação, o elemento de construção de expressão foi excisado com Sph I. O fragmento linearizado contendo a sintase de ácido CMP-N-acetilneuramínico sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S foi usado para transformação de estirpes de Physcomitrella patens. 1.4 Clonagem do transportador de ácido CMP-siálico humano O cDNA que codifica o transportador de ácido CMP- siálico humano (número de acesso: NM_006416) foi clonado no vector de expressão de planta pRTIOl (Toepfer et al. (1987) Nucl

Acids Res 15, 5890) . O cDNA que codifica o transportador de ácido CMP-siálico humano foi amplificado por PCR usando o 41 primer MOB638 (5'-GTCGAGCTCGGAACCATGGCTGCCCCGA-3 ' ) (SEQ ID NO 11) e o primer MOB639 (5'- ATCGGATCCTCACACACCAATAACTCTC-3') (SEQ ID NO 12). O fragmento resultante foi cortado com Saci e BamHI e clonado no pRTIOl. No elemento de construção resultante, o transportador de ácido CMP-siálico estava sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S - em conjunto denominados como elemento de construção de expressão. Para o procedimento de transformação, o elemento de construção de expressão foi excisado com Hind III. 0 fragmento linearizado contendo o transportador de ácido CMP-siálico sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S foi usado para transformação de estirpes de Physcomitrella patens. 1.5 Clonagem de beta-1,4 galactosiltransferase humana A clonagem da beta-1,4 galactosiltransferase humana foi realizada como descrito por Huether et al. ((2005) Plant

Biol 7, 292-299). No elemento de construção resultante, a beta-1,4 galactosiltransferase estava sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S - em conjunto designados como elemento de construção de expressão. Para o procedimento de transformação, o elemento de construção de expressão foi excisado. O fragmento linearizado contendo beta-1,4 galactosiltransferase sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S foi usado para transformação de estirpes de Physcomitrella patens. 1.6 Clonagem da alfa-2,6 sialiltransferase humana

O cDNA que codifica a alfa-2,6 sialil-transferase humana (número de acesso: NM_003032) foi clonado no vector de expressão de planta pRTIOl (Toepfer et al. (1987) Nucl Acids Res 15, 5890). 0 cDNA que codifica a alfa-2,6 sialiltransferase humana foi amplificado por PCR usando o primer MOB 636 (5'-GCTGAGCTCGAACACATCTTCATTATG-3') (SEQ ID NO 13) e o primer MOB637 (5'-GATGGATCCTTAGCAGT-GAATGGTCCG-3') (SEQ ID NO 14) . O produto de amplificação foi cortado 42 com Saci e BamHI e clonado no pRTIOl. No elemento de construção resultante, a alfa-2,6 sialiltransferase estava sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S - em conjunto designados como elemento de construção de expressão. Para o procedimento de transformação, o elemento de construção de expressão foi excisado com Hind III. 0 fragmento linearizado contendo alfa-2,6 sialiltransferase sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S foi usado para transformação de estirpes de Physcomitrella patens. 1.7 Triagem e análise da transformação A transformação de diferentes estirpes de Physcomitrella foi realizada por transferência directa de DNA mediada por PEG por co-transformação simultânea dos elementos de construção descritos em 1.1 - 1.6.

Usando os primers apropriados para cada elemento de construção (1.1: UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase / N-acetilmanosamina-6-quinase humana sob regulação do promotor Pp tub3 e do terminador Pp alfa 1,3 fucosiltransferase com o primer MOB1214 (5'- GCAGGCTGCCCTTCCTAT-3') (SEQ ID NO 15) e o primer MOB1196 (5'-AGAGATATTCTCCTTCAC-3') (SEQ ID NO

16) ; 1.2: fosfato sintase do ácido N-acetilneuraminico humana sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S com o primer MOB1213 (5'- ATGCCGCTGGAGCTGGAG-3') (SEQ ID NO 17) e o primer M0B1212 (5'- GTGTCTCCAGATCCAAC-3') (SEQ ID NO 18); 1.3: sintase do ácido CMP-N-acetilneuraminico humana sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S com o primer MOB835 (5'- ATCGAATTCATGGACTCGGTGGAGAAGGG-3') (SEQ ID NO 9) e o primer MOB1153 (5'-TCGGTCACTTCACGAACT-3') (SEQ ID NO 19); 1.4: transportador de ácido CMP-siálico humano sob regulação do promotor 35S e do terminador 35S com o primer MOB638 (5'-GTCGAGCTCGGAACCATGGCTGCCCCGA-3') (SEQ ID NO 11) e M0B1151 (5' -CAGATCGGAGCCAAGTTCTG-3 ' ) (SEQ ID NO 20); 1.5: beta-1,4 galactosiltransferase humana como 43 descrito por Huether et al. ((2005) Plant Biol 7, 292-299); 1.6: alfa-2,6 sialiltransferase humana sob regulação do promotor 35S e do terminador com o primer MOB 636 (5'-GCTGAGCTCGAACACATCTTCATTATG-3') (SEQ ID NO 13) e o primer MOB1149 (5'-CGCTGACAGCACAACAGC-3') (SEQ ID NO 21)), respectivamente, estirpes transgénicas foram identificadas por PCR em DNA genómico.

Estirpes transgénicas para todos os elementos de construção (1.1 -1.6) foram analisadas em relação a ácidos siálicos ligados a N-glicanos em glicoproteinas assim como em relação a ácido siálico livre (NeuAc5) e ácido CMP-siálico (CMP-NeuAc5).

As estirpes de briófita analisadas que são transgénicas para todos os elementos de construção (1.1-1.6) apresentaram um conteúdo significativo de ácidos siálicos derivados dos N-glicanos das glicoproteinas.

Foram detectadas grandes quantidades (até 100 nmol/g) de ácido siálico livre. O ácido siálico nas briófitas transgénicas foi confirmado por análise de MSMS mostrando um espectro idêntico comparado com o padrão e não foi detectado no tipo selvagem de Physcomitrella patens.

Foram detectadas grandes produções de ácido siálico activado (CMP-Neu5Ac) nas briófitas transgénicas. Pelo contrário, o CMP-Neu5Ac não conseguiu ser detectado na estirpe de tipo selvagem de Physcomitrella patens.

Lisboa, 7 de Setembro de 2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de produzir uma proteína de mamífero glicosada exógena compreendendo pelo menos um resíduo de ácido siálico numa célula de briófita transformada, gue compreende: i) Introduzir numa célula de briófita seis seguências de ácidos nucleicos isoladas cada uma compreendendo uma seguência de ácidos nucleicos operacionalmente ligada a um promotor exógeno gue conduz a expressão numa célula de briófita, em gue as referidas seis seguências de ácidos nucleicos isoladas codificam seis proteínas funcionais gue são expressas na célula de briófita, em gue as referidas seis proteínas funcionais são uma UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase/N-acetil-manosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico), uma sintase do ácido CMP-N-acetilneuramínico de mamífero, um transportador de ácido CMP-siálico de mamífero, uma galactosiltransferase e uma sialiltransferase de mamífero; ou usar uma célula de briófita que já tenha sido transformada e que seja capaz de expressar as seis referidas proteínas; e ii) Introduzir na referida célula uma outra sequência de ácidos nucleicos isolada que compreende uma sequência de ácidos nucleicos operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão numa célula de briófita, em que a referida sequência de 2 ácidos nucleicos codifica a referida proteína de mamífero exógena; ou usar uma célula de briófita que já tenha sido transformada e que seja capaz de expressar a referida proteína de mamífero exógena; e opcionalmente, iii) Recuperar, purificar ou isolar a referida proteína de mamífero glicosilada compreendendo pelo menos um resíduo de ácido siálico da referida célula de briófita.

2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a galactosiltransferase é uma beta-1,4 galactosiltransferase, preferencialmente uma beta 1,4 galactosiltransferase humana.

3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a sialil-transferase é uma alfa-2,6 ou alfa-2,3 sialiltransferase.

4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 3, em que uma célula de briófita é usada na qual a actividade da fucosiltransferase e/ou xilosiltransferase é significativamente reduzida ou eliminada.

5. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4, em que a célula de briófita transformada é uma célula de Physcomitrella patens.

6. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5, em que a célula de briófita transformada está compreendida numa briófita, numa parte da briófita, ou 3 num extracto ou derivado de uma briófita, ou numa cultura de células de briófitas.

7. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 6, em que a proteína de mamífero glicosilada é uma proteína humana.

8. 0 método de acordo com a reivindicação 7, em que a proteína é seleccionada a partir do grupo que consiste em VEGF, interferões tais como alfa-interferão, beta-interferão, gama-interferão, factores de coagulação do sangue seleccionados a partir dos Factores VII, VIII, IX, X, XI e XII, hormonas de fertilidade incluindo hormona luteinizante, hormona folículo-estimulante, factores de crescimento incluindo factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento derivado das plaquetas, factor estimulante de colónias de granulócitos, prolactina, oxitocina, hormona estimulante da tiróide, hormona adrenocorticotrópica, calcitonina, hormona da paratiróide, somatostatina, eritropoietina (EPO), enzimas, tais como beta-glucocerebro-sidase, proteínas de fusão, tais como a proteína de fusão do domínio de ligação receptor ligando do TNF alfa com a porção Fc da IgG, receptores, proteínas de superfície, proteínas transmembranares, anticorpos monoclonais, e seus fragmentos fisiologicamente activos.

9. Método de produzir ácido siálico ou ácido CMP-siálico numa célula de briófita, tecido ou organismo transformados, que compreende codificam que i. Transformar a referida célula, tecido ou organismo de briófita com três sequências de polinucleótidos que codificam três 4 polipéptidos sendo uma UDP-N- acetilglucosamina-2-epimerase/N-acetilmanosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico) e uma sintase do ácido CMP-N-acetilneuramínico; ou ii. Usar uma célula, tecido ou organismo de briófita já transformado que compreende três sequências de polinucleótidos que codificam três polipéptidos sendo uma UDP-N-acetil-glucosamina- 2- epimerase/N- acetil-manosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico), e uma sintase do ácido CMP-N-acetil neuramínico de mamífero; e, opcionalmente, iii. Recuperar, purificar ou isolar o ácido siálico ou o ácido CMP-siálico da célula, tecido ou organismo conforme tratado ou definido em i) e/ou ii).

10. Célula de briófita transformada que compreende seis sequências heterólogas de nucleótidos cada uma operacionalmente ligada a um promotor exógeno que conduz a expressão na referida célula de briófita em que as referidas seis sequências de nucleótidos codificam seis proteínas funcionais que são expressas na célula de briófita, em que as referidas seis proteínas funcionais são uma UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase/N-acetil-manosamina-6-quinase de mamífero, uma fosfato sintase do ácido N-acetilneuramínico de mamífero (sintase do ácido siálico), uma sintase do ácido CMP-N-acetilneuramínico de mamífero, um transportador do ácido CMP-siálico de mamífero, uma 5 5 uma galactosiltransferase e mamífero. sialiltransferase de

11. Célula de briófita transformada de acordo com a reivindicação 10, em que as referidas sequências de ácidos nucleicos são de mamífero, preferencialmente sequências de ácidos nucleicos humanas.

12. Célula de briófita transformada de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que a galactosiltransferase é uma beta-1,4 galactosiltransferase, preferencialmente uma sequência de nucleótidos de beta 1,4 galactosiltransferase humana.

13. Célula de briófita transformada de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 até 12, em que a sialiltransferase é seleccionada a partir de uma alfa -2,6 ou alfa 2,3 sialiltransferase, e é preferencialmente uma sequência de nucleótidos da alfa-2,6 sialiltransferase humana.

14. Célula de briófita transformada de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 até 13, na qual a actividade da fucosiltransferase e/ou xilosiltransferase é significativamente reduzida ou eliminada.

15. Célula de briófita transformada de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 até 14 que é uma célula de Physcomitrella patens.

16. Célula de briófita transformada de acordo com a reivindicação 15 que está compreendida no tecido do protonema de Physcomitrella patens. Lisboa, 7 de Setembro de 2010