PT93070A - Processo de preparacao de altromicinas e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents

Description

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Case 4654,PG.01

MEMÓRIA DESCRITIVA 0 presente invento é uma continuação em parte do pedido de patente, co-pendente, dos E.U.A. MS. 307 555, depositado em 7 de Fevereiro de 1989.

.ÂMBITO TÉCNICO 0 presente invento refere-se a uma mistura de compostos e, srn particular, a novos compostos de altromicina, possuindo actividade citotóxica e antimicrobiana, bem como a um processo para a preparação dos novos compostos de altromicina.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Os compostos do presente invento estão relacionados, mas são distintos, dos compostos da família da pluramicina que se descrevem em Patente dos E.U.A. n£>. 3 314 353; Patente dos EJJ.fi, n2, 3 334 016; Patente Europeia n2. 200 818; Patente Europeia nS. 274 545; Byrne st al., T, Antibiotics. 38:1040-49 (1985); Maeda et al., J. Antibiotics, ssr A, 9:75-81 (1956); ©

Kanda, J. Antibiotics. 24=599-606 (1971).

Os compostos da família da pluramicina pertencem à classe de compostos derivados da antraquinona © foram evidenciados como meíabolitos de Streptomyces e de espécies Actinomadura.

Os compostos da vamília da pluramicina exibe., in vivo, uma potente actividade anti—tumor. No entanto. quando os compostos da família da pluramicina são administrados a animais de laboratório, originam reacções secundárias graves, adversas, tais como toxicidade para os rins. hxiste pois a necessidade de compostos com a potência anti—tumor dos Compostos da família da pluramicina, mas com um maior índice terapêutico de actividade, resultando assim na diminuição das toxiC;^acjes clínicas.

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DO INVENTO 0 presente invento refere-se ao processo de preparação de um produto de lermentaçao contenoo uma ou mais altromicinas, que sao representadas pela seguinte fórmula estrutural: -3- 70 619

Case 4654 = PQ = 01

na qual 9j_ ê seleccionado de entre —NH2, —NHCH3 e -Ν(ΟΗ^)? © na qual $2 3 ^3 são seleccionados, i ndependen temente. ds entre hidrogénio e hidroxilo, de tal modo que pelo menos um dos grupos í?2 3 ^3 seja hidroxilo. 0 presente invento refere-se também ao processo -de preparação das altromicinas individuais e dos seus sais e ésteres farmaceuticamenfce aceitáveis.

Os compostos do invento são produzidos por um microrganismo Actinomvcete do género Nocardia que exibe as caracteristicas de identificação descritas nas Tabelas 1-3. Num aspecto de um processo do presente invento, a estirpe AB1246E-26 da espécie Actinomycete produz altromicinas por cultura do referido microrganismo num meio nutriente.

Os efeitos antibacterianos dos novos compostos, em microrganismos específicos, sm conjunto com a sua estrutura quimic* © as suas propriedades físicas, diferenciam-nos dos outros compostos possuidores ictividade antibacteriana.

Por exemplo. compostos do semelha ítes presente invento são difsrentes dos compostos pluramicina, quer no arranjo dos substituintes no âos substituintes ds glicosido. Os cromofóro, quer na na compostos ds pluramicina possuem um grupo metilo ligado ao a tomo

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Cas© 4654.PQ.01 -4-

de carbono 5 do anel B. Além disso, os membros da classe da pluramicina possuem um amino-açúcar no átomo de carbono 8 s ©utr o amino-açúcar no átomo de carbono 10 do anel D do núcleo antraquino na-gama-pirona.

Por sua vez, as altromicinas do presente invento possuem um glicósido neutro, um C-glicósido ligado por meio do carbono 13, ao carbono 5 do anel B. Mos compostos do presente invento o átomo de carbono 8 não está substituído. As altromicinas possuem uma unidade dissacárido, contendo um 0-glicosido neutro, ligado a um amino-açúcar no carbono 10 do anel D. Assim, as altromicinas do presente invento contêm açúcares neutros que não se encontram nos compostos do tipo da pluramicina. Além disso, as altromicinas são os metabolitos de um organismo do tipo Moeardia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Ma FIGURA 1 mostram-se os espectros UV/visível da altromicina B, registados em soluções de metanol ácidas, neutras e básicas- As altromicinas A, C, D e G exibem espectros, essencialmente, idênticos. A FIGURA 2 é um espectro de infravermelhos (IV) cia altromicina B em solução de deuteroclorofórmio (5¾). As altromicinas A, C e D exibem espectros essencialmente idênticos. A FIGURA 3 é um espectro · R MM de Hl, a 500 HHz, da altromicina A em deuteroclorofórmio (CBCI3), A FIGURA 4 é um espectro RMN de Ví, a 500 MHz, da altromicina S em deuteroclorofórmio (CDCI3).

DE3CRICS0 DETALHADA D0 INVENTO 0s compostos e mistura de compostos do presente invento, são preparados por cultura do microrganismo da espécie Actinomvcêtes^ AB 1246E-26, da ordem dos Actinomycetales. 0 microrganismo produz hifas vegetativas, ramificadas, típicas de. Acti nomycetes.

Além disso, as hifas vegetativas têm tendência a fragmentar-se em unidades snais pequenas, irregulares, muitas vezes bacilares, típicas da espécie Actinomycetes. 70 619

Case 4654=,90,01 A estirpe AS 1246E-26 da espécie Actinomycste foi isolada de solo recolhido na África do Sul, Uma subcultura do microrganismo foi depositada na colecção permanente do “Agricultura! Research Service âfc Northern Regional Research Csnter", Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 E.U.ft., 0 número de acesso para estirpe AB 1246E-26 da espécie Actinomycefce no depositário é NRRL 18371,

Morfologia e Caractsristicas da Culturas 0 microrganismo do presente invento, da espécie Actinomycete, AS 1246E-26, pode ser caracterizado pela morfologia e por -outras caractsristicas da cultura. Além disso, podem-se usar os hidrolisados de células inteiras para prsvêr a composição da parede da célula e pode-se usar ® combinação da morfologia e da composição química para classificar Actinomycetes aeróbios em grupos, de acordo com o seu tipo de parede celular, Lechevalisr e Lecheva 1 i@r, ref er ido em Inter . J, Syst, Bacter io 1,, 20 ? 435-443, (1970), desenvolveram esse esquema de classificação, A morfologia de nocardioforme, a composição química s a resistência a lisozimas da estirpe AE 1246E-26, são todas consistentes com a classificação do organismo produtor, como um organismo do tipo Nocardia. 0 isómero meso do ácido diaminopimélico foi encontrado em todos os hidrolisados celulares, A cromatografia dos açúcares nos hidrolisados de células inteiras, mostrou a arabinose s a galactose como açúcares de diagnóstico, Especificamente, o microrganismo do presente invento possui uma parede celular do Tipo IV, contendo ácido msso-2,6-diaminopimélico e possui um padrão ds açúcares de células inteiras de tipo A (arabinose e galactose). A composição química do microrganismo foi também caracterizada por extracção e análise de menaquinonas «celulares, A menaquinona principal possuía um peso molecular de 720, tal como foi determinado por espeetrometri® ds massa, indicando que a menaquinona estava tetra-hidrogenada com 8 unidades isoprenóides.

Adicionalmente, o microrganismo do presente invento é -6- 70 619

Case 4654.PG.01 resistente à lisozima. A lisozima ê uma enzima que ataca quebra a reticulação de aminoácidos das cadeias amino-hexoss, camada psptidoglicano das paredes celulares de muitas, mas não tocas, as bactérias Gram-posxtxvas e a '•esistência à lisozimí constitui uma caractsristica identificadora útil, A cor do produto de crescimento aéreo da estirpe AB 1246E-26 da espécie Actinomycete tem uma cor ds branco a cinzento claro, 0 microrganismo forma um pigmento difundirei, não-melanóide, tucrxentes, diversos meios capacidade d a estirp· crescei-, com çH V3r“SO' apresentada na Tabsl, esentadas na Tabela 3 0 aparecimento e as earacteristicas das culturas estirpe AB 1246E-26 da espécie Actinomycefce em diversos meios -descrito em maior detalhe na Tabela 1. AB 1246E-26 da espécie Actinomvcete ds ompos· tos de As car ac • ------ —- ---------J-- --- -la

Tabela 1

Caracteristicas da cul fcups, tís AB 1246E-26 da espécie Actinosnyce te I^ÍEXO CARA CTERÍSTICAS DE CULTURA*" Agar de extracto de Gs Abundante lev/edura-extracto de AM: Branco a cinzento claro (264)** mal T-0 R: Cas ta nh o-aver me1hado (43) ISP 2 SP : Acastanhado (58) Agar de farinha de p B Moderado branco aveia ISP 3 AM 2 Disperso, branco TOO T ji» V,·1 li R · Cinzento amarelado (93) SP: Ausente Agar de sais inorgâ- G: Pobre n i cos—amido AM: Disperso, branco ISP 4 SP = Ausente -7- 70 619

Case 4654,96=01 iabela 1 (conti nuação) MEIO CARfiCTERÍSTICAS Dfí CULTURA"' y fígar de glicerol-as- Q: Abundante paragina AMs Disperso., branco TSP 5 Ri Cor-de-1ar an ja f verme1ho--acinzentado (39)? alaranjado (53)? amarelo acinzentado (90) SP = Castanho vermelhc— acinzentado claro (45) a Agar de ferro e ex- e: Moderado tracto de levedura- AM: Branco -peptona R: Cor-de-1ar a n ja f ver me1ho-ac inzs ISP 6 do (39) SP 2 Castanho avermelhado claro (42) / fígar de tirosina 6» Abundante ISP 7 AM: Branco amarelado (92) R5 Castanho avermelhado (43) SPs Castanho vermelho-acinzentado / Agar nutriente G s Moderado AM: Disperso5 branco R: Cor-de-laranja claro (52) SP: Castanho avermelhado levemente acinzentado (45) / fígar de Czapek 6: Moderado AM: Disperso., branco R: Cinzento amarelado (93) SP: Ausente / Agar ds maleato de e: Pobre cálcio AM: D i sper so* branco SP: Ausente 70 619

Case 4654.PG.01

Tabela 1 (continuação) MEIO CARACTERISTICAS DA CULTURA * ATCC #172 G: Moderado AM: Disperso, cinzenta claro (264) R: Cor-de-laranja vermelho acinzen tado (39) SP: Ausente Gause#l modificado G - Moderado (KN03 0,1%, K2HPO4 AM: Disperso, branco 0,05%, MgS04 0,05%, R: Cinzento claro (264) NaCl 0,05%, FeS04 SP: Ausente 0,001%, amido 0,1%, extracto de levedura 0,01%, agar 1,5¾)

As observações foram efectuadas após incubação durante 14 dias a 282C. * Abreviaturas: G = crescimento; AM = micélio aéreo; R = inverso; SP = pigmento solúvel -X’'*

Os nomes e números de cor entre, parêntesis , seguem o padrão de cor de Kelly, K,L. & D.B. Judd, ISCC-NBS Color-Name Charts Illustrated with Centroid Colors, U.S. Dept. of Comm, Suppl. to Cir. 553, Washington, D.C„ (1976).

Segue Tabela 2 70 619

Cass 4654.PG,01 _o_

Tabela 2

Oio única fonte de carbono oor

CRESCIMENTO

Utilização de vários compostos ficfcinomycete sp. AB 1246E-26*

FONTE DE CARBONO

Adonitol Arabinose Celulose Dulcitol Fructose Galactose 61ucose Inositol Inulina Lactose Maltose Manitol

Melesitose

Melibiose

Rafinose

Ramnose

Ribose

Salicina

Sorbitol

Amido

Sacarose T r ealose

Xiloss ++ = Soa utilização = Má utilização = Mão utiliza A incubacão foi

svsda s cabo a 280C durante 43 dias

Shirlingr E.B. & D, Streptomycss species,

Sottlieb* Methods for characterization of

Intern. J, Syst, Sactsriol, 16-313-340 (1966)

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Case 4654PG. 01 -10-

Tabel '.rae ter ísticas fisiológicas· AB 1246E-26

Actinomycete REACC30

TESTE

Hidrólise de amido”'

Produção de H2S"’

Formação de melaninas / agar de pep to na-ex tr ac tg d> levedura-ferro ágar de tiros1na

Tol 0Γ ância a 0 MaCl / (agar de Crescimento a 4%, não a 1% Hl·* ra cto de levsdur a-extracto fifis Its) Qam (1¾ de te / mperatura (agar de Crescimento a 212C - 422C, ext Γ" Si cto de levedur a-extracto nenhum cresc riffl isnto a 540Ç fíííS lie) Lei te litmus Digestão aleal ina

Decomposição de" ;

Ademin® j.-

Caseína +

Xantina

Hipoxaniina *

Resistência a antibióticos (50 micrograma/ml) em ágar nutriente (9 dias a 28SC): eri trofíiicina gentamicina - canamicina novobiocina -i- oxi tetracicli na - rif ampieina estreptomicina vancomicina G ordon, R I n t, J. Svst. ϊ _. Sarnett Bactsriol, D A *, Hía nder h a n 24:54-63 (1974).

J pa Oj JJj >

Tabela 5 (continuação)

Smibert, R.M. e N.R. Krieg, Manual of Methods for General Bacteriology, American Socety for Microbiology, Washington E..U.A., pp 409-443 (1981),

Fermentação

Apesar de se poderem utilizar outros métodos de cultura, prefere-se um processo de cultura, submersa em líquido, agitada, A cultura é desenvolvida num meio de cultura que inclui uma fonte de carbono e uma fonte de azoto. Os meios úteis incluem uma fonte de carbono assimilável, tal como amido, açúcar, melaços, glicerol, uma combinação de glucose e de melaços, etc.; uma fonte de azoto assimilável tal como uma proteína, um hidrolisad© de proteína, polipéptidos, aminoácidos, peptona mais extracto de levedura ou levedura inteira, etc.i e outros ingredientes orgânicos ou inorgânicos que possam ser adicionados para estimular a produção dos compostos, tais como aniões e catiões inorgânicos incluindo potássio, magnésio, cálcio, amónio, sulfato, carbonato, fosfato, cloreto, etc.. Além disso, podem-ss adicionar tampões tais como carbonato de cálcio, para auxiliar o controlo de ρ’-J do meio de fermentação. 0 arejamento pode ser fornecido forçando a passagem de ar esterilizado através do meio de fermentação. A agitação pode ser proporcionada por agitação do próprio recipiente ou por agitação da cultura, por exemplo com um agitador mecânico. A fermentação realiza-se, geralmente, numa gama de temperatura compreendida entre cerca de 24QC e cerca de 35QC. 0 pH da fermentação é mantido preferivelmente entre cerca de 6 e cerca de 9. Os compostos são produzidos e acumulados entre 3 e 9 dias após a inoculação da fermentação.

Isolamento e Purificação

Após se completar a fermentação, os compostos do invento são recuperados do meio por extracções repetidas com um solvente imiscível com água, tal como cloreto de metileno, Obtém-se assim produto de fermentação de AB 1246E-26 da espécie actinomycete que / -12- 70 619

Case 4654=PQ.01 apresenta actividade anti-bacteriana e que inclui os compostos altromicina A, altromicina B, altromicina C, altromicina D, altromicina E, altromicina F e altromicina 6= Os compostos, altromicinas A a 6, podem ser ainda purificados por técnicas cromatográficas sequenciais em contra-corrente, como é bem conhecido na arte. 0 isolamento dos compostos de altromicina pode ser monitorizado por análise de amostras por TLC, com métodos de visualização apropriados,, sensíveis à porção antr aqui nona dos compostos. A TLC pode ser realizada usando placas ds HPLC, siormais, de silica, dos reagentes E.M, (silica gel 60 F054 orsviamente revestidas 10x10 cm, E. Merck , Darmstadt, República Fsd© ral da Alemanha), Os compostos de altromicina são visualisados à luz visível como manchas cor-de-laranja-^aisrelado, à luz U.V. de pequeno comprimento de onda como manchas azuis escuras sobre um fundo azul claro 3 à luz U.V. de «-rande comprimento de onda, como manchas cor-de-laranja, vivo, «cbr© um fundo azul moderadamente escuro. Os compostos são f.-Qcil*®51*® revelados nestas placas usando um pulverizador de !-"oS9*4 ® 5¾ (em EtOH). Os solventes usados para desenvolvimento placas de TLC variam desde 30-90¾ ds clorofórmio com metanol, ^icionado para perfazer os 100%, dependendo da amostra ^gj-ticular em causa. Os compostos ds altromicina encontram—se r0nsistentemente na gama de valores de Rf de 0,2-0,6. 0 isolamento de quantidades maiores de altrcmieinas a partir Αλ extractos em bruto pode também ser sfectuad© pelo uso de «tilice gsl 60 >3 dos Reagentes E.M. para cromatografia em camada .55.; na (E. Merck, Darmstadt, West Qermany), que pode ser usada a emanei como enchimento ds colunas grandes» As cargas d® amostra .>Ddsm ser tão elevadas quanto 0,8 g de amostra/10 ml de silica, ensaios preparativos. Usa—se um gradiente de eluicão simples. r„^,x(©çando com 100% de clorofórmio, aumentando em incrementos o ,t<s0r de metanol até se atingir uma concentração de 20% em MeOH»

As Tracçoes sluidss -».ía coluna »áo s scolhidas s analisadas -13- 70 619

Case 4654.PG.01 -quanto à actividade antibacfceriana, por um ensaio ds difusão num disco ds agar. Uma amostra de 20 microlitros de cada fraccão é aplicada sobre um disco de papel. Os discos são então colocados sobre placas de agar que foram previamente cultivadas com organismos suficientes para proporcionar um fundo turvo apôs incubação, tipicamente 10 a 10w unidades formadoras ds colónias (UFC) por ml. A formação de uma zona clara em torno de um disco de papel é uma indicação de que a fraccão de teste contém um composto ou compostos com actividade antibacteriana. 0 que anteriormente se descreveu pode ser melhor entendido com referência aos exemplos que se seguem e que são apresentados para ilustração e não para limitação, da prática do inventes, EXEMPLO 1 A estirpe AB 1246E-26 da espécie Actinomycete (NRRL 13371.) foi mantida armazenada como inoculo congelado, por congelação de uma porção do inoculo original e armazenamento a -7520, Utilizou--se o meio 5B7 (Tabela 4) para crescimento das sementeiras s o meio N2B1 (Tabela 5) para a fermentação,

Tabela 4

Meio ds sementeira 5B7

Ingredientes g/1

Mono-hidrato de glucose 10

R

Amido, Staclípse JUET‘ (produzido por 15 A.E. Staley Manufacturing Co.,

Decatur, IL, E.U.A.)

Exlraeto de levedura (produzido por 5

Difco Laboratories, Detroit, MI, E.U.A.) M2 amina tipo A (produzido por Humko 5

Shsffield, Memphis, TM, E.U.A.)

Carbonato ds cálcio 1

Adicionou-ss água destilada para perfazer um volume de 1 1, 0 pH foi ajustado a pH 7,0. 70 619Css© 4654 = PG = 01-14- Tabela 5 . Meio de Produção M2ES1 - Ingredientes Mono-hidrato de glucose Peptona F-152 (produzido por Index Corp., Chicago, IL, E.ILA.) O Melaços (Brsr Rabbit*', Qreen Label, produzidos por Del Monte Corp, San Francisco, CA, E.U.A.) Exfcraeto de levedura (produzido por Difeo Laboratories, Detroit, MI, E. U. A, ) Extraeto de levedura (produzido por Difeo Laboratories, Detroit, MI, E.U.A.) Carbonato de cálcio o g/i 20 10 5 1 1 2

Adicionou-se água destilada para perfazer um volume de 1 1= 0 pM não foi ajustado. 0 meio foi preparado para a sementeira, como se segue: colocaram-se 10 ml do meio de sementeira (Tabela 4) em tubos de sementeira de vidro 25x150 mm. Colocaram-se 100 ml do meio de sementeira (Tabela 4) em balões Erlenmeyer de 500 ml. Os tubos foram fechados com cápsulas de aço inoxidável (fechos de Mortc-n) s os balões foram tapados com rolos de compressas de "rayon". Seguidamente, os tubos e os balões foram esterilizados durante 35 minutos a 1212C, 103 kPa. 0 inoculo para a fermentação foi preparado em dois passos, Mo primeiro passo, inocularam-se 5¾ do inoculo congelado nos tubos de sementeira, contendo 10 ml do meio de sementeira 5537, Os tubos foram incubados durante 96 horas a 282C num agitador rotativo, operado a 250 rpm, com uma amplitude de 5,7 cm. Num segundo passo, usaram-se 5¾ do inoculo vegetativo do tubo ds •crescimento, para inocular os balões de sementeira, contendo 100 ml do meio de sementeira 5B7. Os balões ds sementeira foram 70 619 ,Ο '

Case 4654.PQ.Q1 -15- , ./ν'--' - ; incubados., durante 72 horas a 2820, num agitador rotativo, operado a 250 rpm, com uma amplitude de 5,7 cm.

Depois, transferiram-se assepiicamente cinco por cento -do inoculo vegetativo dos balões de sementeira do segundo passo, para 200 balões Erlenmeyer de 500 ml, contendo, cada um, 100 ml do meio de produção N2B1 (Tabela 5). Os balões de fermentação foram incubados, durante 5 dias a 282C, num agitador rotativo. Os agitadores foram operados a 250 rpm com uma amplitude de 5,7 cm. Após ss completar a incubação recolheram-se os conteúdos dos balões de fermentação e combinaram-se. 0 volume recolhido foi de 18,0 litros. EXEMPLO 2 0 caldo de fermentação (18 1) do Exemplo 1, foi ajustado a pH 10,0 com MCI 6N e extractado, três vezes com porções de 4 1 de cloreto de metileno. Os extractos de cloreto de metileno foram combinados s concentrados num evaporador vertical até ss obterem, aproximadamente, 4 g de óleo. 0 concentrado foi repartido num sistema ds solventes, MeOM-S-«2Q-CCl4 (5:2:5), usando um dispositivo de gotas em contra-corrente com a fase mais densa como fase estacionária. Este dispositivo consiste em 30,5 m ds tubo de teflon contínuo, Dl (diâmetro interno) 0,48 cm, enrolado, num esquema repetitivo 2x14 cm, em torno de uma prancha de madeira de 2,5 cm por 15 cm. A serpentina tinha 96 voltas com um volume interno total de 450 ml, aproximadamente metade do qual â "stido como fase estacionária. Os compostos exibindo actividads antibacteriana foram eluídos, com um caudal de 5 ml/minuto, sm frseções numeradas de 26-80 (10-12 ml cada, aqui depois designados por Fracção A) que originaram, aproximadamente, 255 mg ds um óleo cor-de-laranja, avermelhado, após concentração in vácuo, e -em fracçõss numeradas de 117-121 (10-12 ml cada, aqui depois designadas por Fracção B cujo final corresponde ao inicio do arrastamento da fase estacionária) que originaram 570 mg ds um óleo vermelho-alaranjado (após concentração in vácuo),

Fraccionamsnto da Fracção A (fracções numeradas 26-80) 0 concentrado da

Fracção A (exibindo actividade -16- ' 70 619

Casa 4654.PG.01 rntibactsriana) foi fraccionado num dispositivo em contra--corrente "Coil Planet Centrifuge" (CPC), (P.C, Inc. Potomac, Maryland, E.U.A.) empregando as seguintes condições; MeOH-HoO--CCI4 (5;2;5); fase mais densa estacionárias extremidade inferior como entrada; caudal 4 ml/minuto a SOO rpm; retenção de 85-90¾ da fase estacionária; recolha de fracçõss de 10 -sL Obtiveram-se duas bandas de actividade antibacteriana, fracçõss numeradas 35-41 (aqui depois designadas por Fracção Ai) e fracçõss numeradas 71-105 (aqui depois designadas pr Fracção A2)- 9 concentrado da fracção ftp (224,7 mg) foi novamente cromatografado no dispositivo CPC. As condições para a cromatografia da fracção Po foram, as seguintes: MeOM-NH^Oftc aquoso 0,01 M-CCI4 (5:2:5); fase mais densa estacionária; extremidade inferior como entrada; caudal 4 ml/minuto a 800 rpm; retenção de 85-90¾ da fase estacionária; recolha de fracçõss -de

10 ml. Observaram-se duas bandas de actividade antibacteriana, fracçõss numeradas 16-21 (aqui depois designadas por Fracção P00J que originaram 24,7 mg de óleo vermelho-alaranjado após concentração in --/501110 e fracçõss numeradas 43-80 (aqui depois designadas por Fracção &2b) que originaram 230,4 mg de ólsc ver melho-a1aranjado após concentração in vacuo. 0 óleo obtido na concentração da fracção Apa era essencialments idêntico ao material obtido a partir da fracção A, s foi identificado como altromicina A. Verificou-se que a fracção Açb continha altromicina EL

Fraccionamenfco da. Fracção B (fracçõss numeradas 57-45) 0 concentrado da fracção B foi fraccionado no dispositivo em contra-corrente CPC empregando as seguintes condições: hsxano- -FtOAc-MsQH-HoO f3:7:6:4, fase mais densa estacionária!: extremidade inferior como entrada; caudal 4 ml/minuto a SOO rpm;

retenção de 85-90¾ da fase estacionária, recolha de fracçõss de S ml. Obtsvs-ss uma banda de actividade, fracçõss numeradas 37-45 (aqui depois designada por fracção Bj) que originou 29,7 mg ds óleo vermelho-alaranjado após concentração in vacuo, 0 óleo 1 vermelho-alaranjado da fracção B foi identificado como sendo uma mistura de altromicina C s de altromicina D. A altromicina C e a -17- 70 619

Case 4654,PG.01 altromicina D podem ser ainda separadas no dispositivo em contra--corrente descrito anteriormente, usando hexano-EtOAc-MeQH-NH^OAc 0,01 ML 0 rendimento total de altromicina A foi ds 56,7 mg, o rendimento total ds altromicina E foi de 230,4 mg s o rendimento total combinado ds altromicinas C e D foi de 29,7 mg. EXEMPLO 3

Manteve-se a estirpe AS 1246E-26 da espécie Actinomycste (NRRL 18371) como inoculo congelado, por· congelação de uma porção dc inoculo original e armazenamento a -7520, 0 meio ds sementeira para uma fermentação agitada de 80 litros, foi preparado como se segue:

Colocaram-se 10 ml do meio de sementeira 5B7 (Tabela 4) para tubos de vidro, próprios para sementeira, com 25x150 mm.- Colocaram-se seiscentos ml do meio de semeteira 5B7 (Tabela 4) '--m balões Erlenmeyer de 2 1. Os tubos foram cobertos com cápsulas de aço inoxidável (fechos Morton) s os balões foram tapados com rolos de compressas ds "rayon". Os tubos e os balões foram esterilizados durante 35 minutos a 1212C, 103 kPa» 0 inóeulo para a fermentação foi preparado sm dois passos. Mo primeiro passo, inoculou-se 1% do inóeulo congelado nos tubos de sementeira contendo 10 ml ds meio ds sementeira 5B7 (Tabela: 4), Os tubos foram incubados, durante 96 horas a 2820, num agitador rotativo, operado a 225 rpm, com umaamplitude de 5,7 cm. Hum segundo passo, usaram-se 5¾ do inóeulo vegetativo do tubo de crescimento para inocular os balões ds sementeira contendo 600 ml ds meio de sementeira 5B7 (Tabela 4). Os balões de sementeira foram incubados, durante 72 horas a 2820 num agitador rotativo, operado a 225 rpm, com urna amplitude de 5,7 cm.

Prepararam-se 80 litros de meio ds produção N2S1 (Tabela 5) num fermentador agitado de aço inoxidável, Wew Brunswick de 150 litros. 0 meio N2B1 foi esterilizado no fermentador a 1212C e a 103 kPa durante 1 hora. A glucose foi esterilizada, asparadamente, na forma de uma solução aquosa a 50%, a 12120 durante 30 minutos e adicionada ao fermentador após a -18- 70 619 •f

Case 4654.PG.01 esterilização, 0 agente anti-espuma utilizado foi o XFO 371 (produzido por Ivanhos Chemical Co., Mundelein, IL, E.U.A.). Foi adicionado inicialmente numa quantidade de Q,01Ss, ficando disponível em caso de necessidade. 0 fermentador foi inoculado com 4 litros do resultado do segundo passo de crescimento da sementeira, A temperatura foi controlada a 282C, A velocidade de agitação foi de 200 rpm e o fluxo de ar foi de 0,7 vol/vol, minuto. Manteve-se uma pressão de 34,5 kPa. Terminou-se a fermentação ao fim de 120 horas. 0 volume recolhido foi de -SI litros. EXEMPLO 4

Carregou-se o caldo de fermentação (61 1) do Exemplo 3 num tambor rotativo ds aço inoxidável de 200 litros (Morse

Manufacturing Co. Inc., East Syracuse, M.Y., E.U.A.). 0 caldo foi sxfcraetado quatro vezes com porções de 20-24 1 de cloreto ds metileno ou clorofórmio, com rotação, por período de 30-45 minutos s drenagem do solvente orgânico. Os sxtractos de solvente clorado orgânico, Os sxtractos ds solvente clorado foram combinados s concentrados num evaporador vertical até um volume de 1 1. Este volume foi reduzido a, aproximadamsnts, 100 ml de óleo num evaporador rotativo e, em seguida, fraccionado diversas vezes entre metanol e n-heptan© (1=2). As fases de heptano combinadas não revelaram a presença de compostos do tipo a 1 tremidos quando analisadas por TLC. A fase de metanol foi concentrada in vácuo e fraccionada, várias vezes, entre água a pH 10,0 (MH4OH) s clorofórmio, Foi necessário efectuar uma. centrifugação (1000 rpm) para remover um precipitado interfacial do tipo proteose, qus ss desenvolveu durante o fraccionamento. A fase de clorofórmio foi concentrada in vácuo obtendo-se 12,09 g de um sólido oleoso castanho-avermelhado. 0 concentrado foi fraccionado no sistema ds solventes MeOl·!-(5:2:5) usando um dispositivo preparativo ds gotas em contra-corrente (PQCC), com a fase mais densa como fase estacionária. 0 dispositivo PSCC foi fabricado in situ s consistia em 60 metros de tubagem continua ds "teflon", A tubagem apresentava um diâmetro alternado e foi enrolada segunde -19- 70 619

Case 4654.PQ.01 um esquema repetitivo 3x28 cm (estando a tubagem essencialmente direita com excspção de dobras angulosas das secções de menor diâmetro, no topo s na base de cada volta) de forma a que uma tubagem com 24 cm da secção com um D.I. de 4,5 mm ocupasse o lado de formação das gotas da serpentina e uma tubagem com 35 cm de secção com um D.I. de 1,5 mm, ocupasse o lado de retorno de fase móvel da serpentina. A serpentina apresentava 100 voltas com ura volume de retenção da fase estacionária de, apr oximadamen-te, 450 ml em repouso. Durante a utilização reteve-se 90-95¾ deste volume de fase estacionária. A serpentina apresentava, em repouso, um volume de fase móvel de, aproximadamente, 70 ml. A -operação na serpentina foi sfectuada a uma velocidade ds 3-4 al/minuto, recolhendo-se fracções ds 10-15 ml. Efectuaram-se :'uas operações aproximadamsnte idênticas com uma porção de 50¾ ds amostra. Com base sm análises por TLC cias fracções obtiveram--se, em cada operação, duas porções de compostos do tipo altromieina. As primeiras 100 fracções, excluindo as primeiras vinte, ou cerca de vinte, que continham um nível significativo de impurezas e poucos ou nenhuns compostos do tipo altromicina, foram reunidas (aqui depois designadas por Fracção A4). As seguintes ^ 100 fracções que incluía™ o arrastamento de fase estacionária foram também reunidas (aqui depois designadas por Fracção 34).

Fraecionamsnto da Fracção A4 A Fracção A4 foi concentrada e novamente introduzida no dispositivo PGCC, cia mesma forma, usando o sistema de solventes l-lsOH-F^O-CClq (10-5 = 10), Desta operação combinaram-se as primeiras 120 fracções (excluindo as 19 iniciais), com base na análise por TLC (aqui depois designadas por Fracção A4<). Estas fracções foram concentradas para purificações posteriores usando um dispositivo em contra-corrente "Coil Planet Centrifuge” (CPC) (P,C. Inc., Potomac, Maryland, E.LJ.A. ) seguindo-se cromatografias padrão em coluna como se ilustra a seguir no ESQUEMA 1. esta parte do esquema de isolamento resultou no isolamento ds altromicina E (4,7 mg) e G (6,8 mg). -20- 70 619

Cass 4654,PS.01

Fraccioriamento cia Fracção B4 A Fracção 84 foi concentrada e introduzida no dispositivo PQCC (2 operações com carga de 1/2 amostra ), usando o sistema de solventes MsOM-FbO-n-heptano-CCl^. (5 = 2:2:3), De cada uma destas operações combinaram-se as primeiras ~100 fracções (excluindo as '-'é iniciais);, com base em análises por TLC (aqui depois designadas por Fracção B4j)= Estas fracções foram concentradas para purificações posteriores, usando um dispositivo CPC como se ilustra a seguir no ESQUEMA 2, Esta parte do esquema -de isolamento resultou no isolamento de altromicina F (7,8 mg), altromicina A (~4G0 mg), altromicina B (~1 g), altromicina C (~50 mg) e altromicina D (~100 mg), * -01 - 70 619

Case 4654.PQ.01 ESQUEMA 1 hracção A4i

I

CCP

MeOH-MiiOAc 50 mM-CCl.4 (10 = 5; 10) íiais densa estacionária, extremidade inferior como entrada, 3-4 ml/minuto. @ SOO rpm fracções de 10 ml (f) f(16-23)

Silica a baixa pressão ..(R) (Reagentes tM Lobar fa *,

LiCroiorepK‘SJ Si 60 (40-63 μ.), 2,5 x 25 cm, 34,5 kPê CHCI3—MeQM (9:1), f ml f(15-27) HPLC-prep. :ech ^' Macrobore^‘Λ J C1 g (10 μ) (Separation Technologies, Wakefield, R. I.) 2,5 x 35 cm, 30¾ de MsOH - 70¾ de [8¾ de THF em (Et^NHQAc, 50 mM, pH 5,0] •acolha dos picos activos no UV em f de 100-200 m]

Sprec

lavagem com MsOH AItr©mieina Q fí18-20) V CCP hexano-EtOAc-MeOM-MÍ-^OAc 10 mM (3:7=6:4) rase imis densa estacionaria, extremidade inferior como entrada, 4 mi/minuto, Ê 800 rpm fracções de 10 ml

I

Altromicina E f(171-2121 -22- 70 619 'ase 4654.PG.01 ESQUEMA 2

Fracção

CCP

MeOH-H20-n-heptano-CCl4 (10:4:1:9) :ass fflais densa estacionária, extremidade como entrada 4 ml/minuto. 0 SOO rpm, frseções (f) ds 10 ml 58-81)

I

CCP CMC13—CC14-HeOH (Et^NHOAc 50 mM pH 5,0 (15:135:150:60) fase menos densa estacionária, extremidade como entrada 4 ml/minuto @ SOO rpm, f de lOml f(82-113)

I

CCP CCI4-M3OH (Et)3WH0Ac 50 mil pH 5,0 (15:15:6) fase menos densa estacionária, extremidade como entrada 4 ml/minuto @ 800 rpm, f de lOml : (68-124) f(148-159) (fase estacionária recuperada)

CCP CHC13-CC14-MeOH-H20 (1=4:5:2) fase menos densa estacionária, extremidade como entrada 4 ml/minuto 0 800 rpm, í de 10 ml v

CCP hexano-EtOAc-MeOH-NÍ-^OAc 10 mH (3:7:6:4) fase menos densa estacionária, extremidade como entrada 4 ml/minuto ® 800 rpm, f ds lOml

Altromicina B f¢22-80)

Altromicina A f(96-125) (fase estacionária recuperada) •Altromicina D f(72-104)

Altromicina C f(107-118) Altromicina F f(120-128) 70 619

Case 4654, PG. 01 ~ -23- EXEMPLO 5

Caracterização das altromicinas A„ B, C, D, E, F e 8

As altromicinas do presente invento podem ssr secas até as cblsr um vidro e são compostos vermelho-alaranjado que são 'acilmente solúveis em metanol (MeOH) , clorofórmio (CHCI3).. tetracloreto ds carbono (CCI4), dimetilsulfóxido (DMSO), acetato da stilo (EtOAc), benzeno ou ácido diluído; moder adame n ts solúveis sm tampão de fosfato 0,01 M (pH 7); e ligsiramente solúveis sm n-hexano ou em água. Guando cromatografados numa coluna de cromatografia líquida de Alta Eficiência (HPLC) de fase inversa 0^3 (4,6 mm x 25 cm), usando MeQH-NMUiOAc· 0,05 M (60-40) com 2 ml/minuto, a altromicina A apresentou um tempo de retenção de 10,8 minutos 3 a altromicina S um tempo de retenção de 12,8 minutos* A espectrometria de massa com bombardeamento atómico rápido ("Fast A tom Bombardment") (FAB), de alta resolução, no modo ião JL. positivo obteve-se urna massa (M+H)" de 912,3645 (valor calculado, 912,3654) para a altromicina A, correspondendo 2 uma fórmula molecular C45H57NO1Q. Com a altromicina Ξ obteve-se uma massa de 926,3828 (valor calculado, 926,3810) correspondendo a i«a fórmula molecular C47H59NO13. A massa (M-s-H) ‘ da altromicina C foi de 896,3686 (valor calculado, 896,3705), correspondendo a uma fórmula molecular C46M57MO17 s a massa () para a altromicina D foi de 910,3868 (valor calculado 910,3861), correspondendo a uma fórmula molecular C47H59MQ17. A massa (M+H) ‘ da altromicina E foi de 896,3722 (valor calculado, 896,3705) correspondendo a uma fórmula molecular C46H57W®!7. A altromicina F originou uma massa de 910,3832 (valor calculado, 910,3867), correspondendo a uma fórmula molecular 247H59NO17 e a massa (M-s-H)' da altromicina 8 foi de 898,3497 (valor calculado, 898,3497) correspondendo a C46H55NOJ3.

Os resultados espectroscópicos na zona ultravioleta/visível (UV), (Figura 1) foram sssencialmente idênticos para as sltromicinas A, Ξ, C, D e 8 s colocam-nas na classe de compostos derivados da antraquinona. 0s máximos de absorção no UV, em 70 619 *τ..Γ ! 4654.PS.01 & ΰ, -24-solução básica, encontram-se a aproximadamente 490 nm, 368 nm, 304 nm e 252 nm. Os máximos de absorção no UV, em solução neutra, encontram-se a 424 nm, 242 nm e 212 nm. Os máximos de absorção no »JV, sai solução ácida, encontram-se a 424 nm, 276 nm, 243 nm s 215 nm. Os espectros de UV das altromicinas E s F são sssencialmente idênticos entre si, mas diferem dos das altromicinas A a D e Q nos espectros deslocados em solução ácida s básica. 0 resumo dos resultados ds UV para os compostos de altromicina é apresentado seguidamente na Tabela 6, 0 espectro infravermelho (IV) da altromicina B é apresentado na Figura 2.

Tabela 6

Máximos ds absorção no UV para as Altromicinas A a G

Lmax^ *® ^ NaOH- 490 nm. 368 nm, 304 nm e -MeOH 252 nm Altromicinas A-D 424 nm. 242 nm e 212 nm MCI— 424 nm, 276 nm, 243 nm e -MeOH 215 nm NaOH- 545 nm, 338 nm s 250 nm -MeOH Altromicinas E s F Lf(ia>íHs0'~“ 424 nm, 241 nm s 209 nm Lffiax-d-1 M HCl-MeOH 424 rim, 241 nm e 207 nm --niax-f® w NaOH— 488 nm. 366 nm, 302 nm s -MeOH 250 nm Altromicina Q LfiiaxMs0H 424 nm. 242 nm s 209 nm -max^s ® ^ HCl-MeOH 423 na, 273 nm, 242 rmi e 209 nm =-ma; - Lambdamax = comprimento de onda no máximo de absorção.

Os resultados espectroscópicos de RHN (Tabelas 7 e S é FI6U3 in AS 3 e 4) estabelecem que as altromicinas A, B, C, D, E, F constituem um novo grupo de compostos da classe de compostos 70 619 Case 4654. PS, 01 --Τ-1 /

Cj -25-derivados da antraquinona. As altromicinas E s F são semelhantes âs altromicinas A e B, respactivaments, com a sxcepção de que as altromicinas E e F possuem um protão no átomo de carbono 13, em substituição do grupo funcional hidroxilo» Ά altromicina 8 difere das altromicinas A e E porque o carbono 4" do amino-açúcar oomporta uma amina primária em oposição a uma mono ou dimetilamlna. Os resultados dos desvios químicos em RMN de ~~'C e os resultados de desvio quimico/acoplamento por RMN de encontram-se indicados nas tabelas 7 s 8, respectivaments.

Tabela 7 1T ΐ.

Desvios químicos de RMM-—^-Ç para as Altromicinas A--Q ^

Carbono N2. ft B C D rr e_ F G DEPf° Ã*. 167,5 167,4 167,0 167,0 165,7 165,7 167,5 0 3 111,1 110,9 110,9 110,8 111,3 111,3 111,1 Cl·! 4 180,2 180,0 179,4 179,4 178,5 178,6 180,2 Θ 4 a 126,6 126,4 126,5 126,4 126,3 126,3 126,6 Θ 5 149,2 149,1 149,4 149,2 148,2 148,2 149,3 0 6 122,5 122,4 122,9 122,8 Í24,1 124,0 122,5 Cl·! 6a 137,2 137,1 137,0 136,9 Í36,9 136,9 137,2 B 7 131,2 181,0 181,2 181,2 131,5 181,4 181,2 a 7a 130,3 130,2 130,4 130,3 130,5 130,5 130,5 q O O 119,8 119,7 119,7 119,7 119,5 119,5 119,8 CM 9 133,6 133,7 133,4 133,6 133,3 133,5 133,7 CM 10 141,3 141,1 141,0 140,9 141,0 140,9 140,7 0 11 159,1 159,2 159,3 158,9 159,3 159,3 159,4 a 11a 115,8 115,6 115,9 115,7 115,9 115,9 115,9 a 12 186,9 186,9 187,1 186,9 187,5 187,4 186,9 θ 12a 121,8 121,6 121,6 121,6 120,8 120,8 121,8 a 12b 156,8 156,7 156,6 156,5 156,1 156,1 156,8 a 13 80,9 80,8 79,0 78,9 - - 80,9 a 13 - - - - 48,3 48,2 - CH 14 59,8 59,7 59,8 59,7 59,8 59,7 59,8 a

Tabela 7 (continuação) -¾ c 19 "7 19 6 “ * 7 ^ 19,8 19,7 20,0 199 19,6 Vá 16 62,7 /* r- 5 C3 62 y b 62, b £*7 E, 62,5 62,7 CH 13,4 13,3 13,4 13,3 13,5 13,4 1 "7 ç;-s-? 18 170,5 170,4 170,9 170,9 170,4 1 7fi] 4 JL tf -W y 170,5 g 19 b2,6 b2, b 52,4 52,3 H7 3 *· co 75T 3d y -u CIO ^ Vá“j O ? / b 5 s 77 0 í j Cf 7il Q Í u y 7il 9 * « y ~ -7/5 ^ í v , 7ó,S Λ» β Ut S ~Z 7 <o O 68,9 ^ O ET OO y CD> 68 3 2 ^*o 0 OdJi y US ^ ÍT> O OO O 69,0 f* PJI A 7 80.2 80,1 74,8 74,9 Oli c ϋΐ j j 81,4 80,2 Ui í T~i 7 67,9 67,9 - - <<?> 0 UU J V 67,9 68,0 Λυ ϊ_.·Ϊ 2 C 7 - - 26,1 26,0 - - - r-u-Uj 29 .S 7 *T*7 T J· j / 70 7 70,2 *7—^ £ %J* £ > 74.0 73 7 Va a •"“li 7 /fi η « -T- “*Uu 14,1 14 0 14,7 14,7 14 7 14,6 14,0 fMJV» UjrS ϋ *:·. Lj. - 57,9 ζ7 o D / y lU bb ^ 6 ΓΓ ir1 bb b 7 57,1 57,2 Ci-s3 *3" 70,3 70,7 70,2 70,8 70,3 70,8 70,0 CM Τ' n 77 7 * * 5 » θ'·* s XJ^L y C? 77,8 Q^J “7 y / 77 O //.u O UjÍ , t-l 76,0 .f*rj Vá y /, II c ,*i O J 58,1 55,1 58,1 Rcíl O —.· · y -* r* 0 a 30 y 4, 51,7 θ C ti 40.3 dtJ. 7 * - 7 s 40,4 44,7 40 4 y - 44,3 /i £t 9 *' 7 fVJ — Vá j“ ^11 62,1 S O 62,3 69' “ 7 62,3 ^ Th τ Ú-N -'· 'k '—· y ^ á « 011 14,7 13,5 14,8 13,5 14,7 13,o 14 1 7 ' CH3 λ 11 m * ~0'">3 94 1 14,0 23,8 13,9 O/í ^ /£*“V y 14 1 ** * y *» 32,6 CM^ dí ” — 27,9 40,3 27,8 40,3 28,1 40,4 Crí^z N(CM3)n η = 1 r-| _ 7¾ η = 1 n = 2 η = 1 n = 2 n=0 1 11 7 97 <$. 9 A S, ^ . y » 9~^ 7 94,5 97 <á 94,5 93,3 CH n» ? 30, S 31,1 30,9 31,1 30,9 71 1 — y 30,8 CM2 *711 ? 74,8 74,9 74,8 74,9 74,9 75,0 74,8 CM án ’ 72,1 72.1 72,1 72,0 72 _ 2 * *- 7 ^ ΎΟ O " ^ 5 f*u Ufn Cl! 7 65,4 65,0 f c *7 QO y í 65,0 65,4 65,1 .< C / Ow y ·-.- AJJ / II 7 Ό 17,7 17,6 17,7 17,6 *9 i^r Jl S O 17,7 17,8 V-8 6^ T !! ? A 99 9 w ? -- 96 1 56,1 56,1 c,c: 9 9A n 5 ífML-l-» — !_-·* „ J! p, 7K ... νϋ Τ'Ί,Ϊ-' UU Λ^.3 MHz em CDCI3, Οϊ*Ξ553 V? X 03 CjUlíTil — -j-j. W ϋί- ilação ao TMS.

Resultados ds RMN de 13C Dfc.PT para as altr©mieinas TABELA 8 - Desvios químicos e acoplamento por RMN de 1H para ;; altroaicinas A-6 em CDCI3 (ppm a partir de THS) Posição Altromicina A (1) Altromicina B (2) Altromicina C (3) Altromicina D (4) Altromicina E (5) Altromicina F (6) Altromicina S (7)

multiplicidade -28- 70 619

Case 4654.PQ.01 EXEMPLQ 6

Aefcivldade Antibacteriana A aetividade antibacterlana dos compostos de altromicina do presente invento, contra diversas bactérias, é ilustrada na Tabela 9. As concentrações inibidoras mínimas (CIFi) for&m determinadas pelo método de diluição em ágar , o que aqui a seguir se descreve, usando agar "Brain Heart Infusion" (EHI).

Prepararam-se doze placas de petri, contendo cada uma diluições aquosas sucessivas de 1=2 dos compostos teste, misturados com 10 ml de agar SHI esterilizado, Cada placa foi inoculada com diluições 1=100 (ou 1:10, para estirpes de crescimento lento, principalmente, Micrococcus e Streptocoocus) de culturas, produzidas de um dia para o outro, de até 32 microrganismos diferentes, usando um bloco de rsplicação Steers t. calibrado para libertar aproximadamente 10" unidades formadoras de colónias (UFC). Adicionalmente, preparou-se uma placa de controlo usando ágar BHI, não contendo nenhum composto teste, ® que foi inoculada no início e no fim de cada teste. As placas inoculadas foram incubadas a uma temperatura de cerca ds 3520 a cerca ds 372C durante, aproximadamente, 20-24 horas. Utilizou-se a ciprof1oxacina como agente antibacteriano de referência. Após a incubação, cada uma das placas de ágar foi observada relafcivamente à presença ou ausência de crescimento de microrganismos. A CIM foi definida como a menor concentração de composto teste com a qual não se verificou crescimento. Pesprezou-se a pequena auréola, causada pela mancha de inoculo·, comparativamente ao crescimento numa placa controlo não contendo composto teste,

Os resultados são representados pelos dados indicados na Tabela 9 seguinte. -29- 70 619

Case 4654.PQ.01

Tabela 9 CXM («iicrograma/ml) para bactérias de CT8SC1. mento asró bico ORGANISMO ALTR0MICINA A B esp Aofcinetobacter sp. CMX 669 100 >100 25 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 >100 >100 >100 Enterococcus faeciurn ATCC 8043 6,2 3,12 3,1 Eschsrichia coli DC-2 >100 >100 100 Escherichia coli H560 >100 >100 100 Eschsrichia coli JUHL >100 >100 100 Escherichia coli KNK 437 25 25 25 Eschsrichia coli SS 0,39 0,20 <n ^9 Klebsiella pneumonias ATCC 8045 >100 >100 100 Micrococcus luteus ATCC 4698 1,56 0,39 1,56 Micrococcus lutsus ATCC 9341 0,2 0,10 <0,39 Providencia sfcuartii CMX 640 >100 >100 >100 Pseudomonas aeruqinosa A5007 100 >100 50 Pseudomonas asruqinosa BMH10 50 50 100 Pseudomonas aeruqinosa K799/61 0,39 0,10 0,7S Pseudomonas aeruqinosa K799/MT 3,1 3,12 3,1 Pseudomonas cepacia 2961. >100 >100 50 Staphylocoecus aureus 45 1,56 0,39 1,56 Staphylocoecus aureus 45 RAR2 6,2 3,12 6,2 Staphylococcus aureus A5177 1,56 1,56 1,56 Staphylocoecus aureus ATCC 6538P 0,78 0,39 0,73 Staphylococcus aureus CMX 503 - 1,56 - Staphylocoecus aureus CMX 553 3,1 3,12 3,1 staphylocoecus aureus 642A 3,1 - 3 1 ^ > — Staphylocoecus aureus CMX 686B - jL „ - Staphylocoecus aureus 3519 6,2 - 6,2 Staphylocoecus aureus NCTC 10649 3,1 - 3,1 Staphylocoecus epidermidis 3519 6,2 1,56 6,2 Strsptococcus agalactiae CMX 508 0,39 0,39 <0,39 Strsptococcus bovis A5169 0,39 3,12 1,56 Streptococcus pyogenes 930 0,39 0,20 <0,39 Streptococcus pyogenes 2548 0,78 0,39 0,78 Strsptococcus pyogenes EES61 0,39 0,39 <0,39 -30- 70 619

Case 4654=96,01 EXEHPLO 7

Ci totoxicidade

Os compostos do presente invento exibem uma potente actividads in vitro contra ambos os tipos de células de humano a d-3 ©urino. A ei to toxicidade das altromicinas A, E b C-Ml contra células HeLa â ilustrada na Tabela 10 s a cito toxicidade das altromicinas A, E e D contra linhas de células de tumores humanos e de murino á ilustrada na Tabela 11. As concentrações inibidoras capazes de matar 50¾ das células (CI50) foram determinadas num ensaio color imêtr ico para determinação da actividads citotóxica contra células de cultura, de acordo com c protocolo seguinte- utilizou-se um ensaio de microtítulo de três dias para medir a actividads metabólica de células de cultura expostas a uma gama de concentrações de droga. A actividads metabólica foi medida pela capacidade das células em reduzir o corante de tetrazólio, o brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), a um derivado de formazano, corado, quantificável.

Os compostos de teste foram dissolvidos em dimstilsulfóxido (DM30) e diluídos, em primeiro lugar com Solução Salina Equilibrada de Earle e em seguida com meio de cultura, até duas vezes a maior concentração do composto a testar. A partir desta solução concentrada prepararam-se séries de diluições de 1:2, em placas ds microtítulo ds 96 cavidades, contendo, cada cavidade, o dobro da concentração final desejada do composto. Cada concentração foi testada era triplicado e comparada com controlos, em triplicado, isentos de drogas.

As células foram cultivadas no mesmo meio de que o utilizado para diluir os compostos = Depois da colheita por tripsinização, tal como ss descreveu em Bird, S.R. & F.T. Forrester, Basic Labo-ratory Tschniques in Cell Culture, U.8. Dspt. of Health & Human Services, Virology Training Branch, Atlanta Seorgia, ρρ S4-S5, 104-105, 111 (19S1), determinaram,-se as contagens ds células viáveis ® ajustou-se a densidade de células a 25 000 células/ml. Adicionou-se então o inoculo (0,1 ml) a cada cavidade, para uma 70 619 Casa 4654,PQ.01

L- -31-concentração final de 2 500 células por cavidade, A adição do inoculo foi utilizada para diluir os compostos ds teste até â concentração final desejada.

As placas de snicrotítulo foram incubadas durante três dias a 362C numa atmosfera humidificada contendo 5¾ de dióíiido de carbono,

Ao fim ds três dias adicionaram-se 20 microlifcros de MTT a 5 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato, a cada uma «das cavidades da . placa de microtitulo. As placas c!e microtitulo voltaram então para o incubador durante duas a quatro horas para permitir às células sobreviventes, reduzir o corante, Após esta incubação, removeram-se, por aspiração, quer o meio. ;:ρ.·3Γ o corante não reduzido. Adicionou-se DMS0 a cada cavidade para dissolver o produto final corado, insolúvel em água, resultante da redução do corante, ds forma a poder ser medido, sspectrofotometricamente, a 570 nrn.

Tabela 10 CXgn das altromicinas A, Be C-j-D suando usadas contra linh ris ds células sm cultura

Altromicina Linha ds células Clcn* A Hr 'ô~ Mela <0,007 E Mela <0,015 C-:-D Mela <0,006 microgramas por mililitro.

As células Hela foram adquiridas no ATCC, n9 Catálogo CCL2 = 0 meio usado foi o Meio Essencial Mínimo (MEM), com 10¾ de soro fetal ds vitelo e 1¾ ds aminoácidos não essenciais. 70 619 .....

Case 4654=79.01 -32-

Tabsla 11 ICc,n das altromicinas A. B e D quando usadas contra linhas de células de tumor humano e de murino 0549 HCT-S MT—29 P388 (pulmão (cólon (cólon (leucemia Composto hurnano ) humano) humano) ds ratinho 01tromieina A 0,00844 0,00322 0,0235 0,0001292 ftltromieina 1 0,00357 0,00186 0,0013 0,0000867 01tromieina D 0,00515 0,00131 0,00117 Adriamicioa 0,0513 0 7 0,1174 0,0150 Etoposido 1,080 1,033 0,0618

As scfcivxdades anti-tumor in vivo das altromicinas A, 3 s 7 foram determinadas usando a linha de tumor ascítico de leucêraia 7388= Antes do teste, propagou-se o P388, intraperi tonealmente, em ratinhos fêmea DBA/2. Os tumores ascíticos foram injectados, intraperitonaalmente, em ratinhos fêmea S5D2FI numa concentração de 10~ células por ratinho. Os ratinhos foram tratados com agentes anti-tumor administrados uma vez por dia, durante cinco dias consecutivos, usando fluorouracil como controlo positivo.

Todas as drogas foram administradas, intraperitonealmente, em dsxfcrose aquosa a 5¾ ou noutro diluent® adequado» A eficácia da droga foi determinada pela sobrevivência prolongada» 7 tempo •Je sobrevivência foi calculado como % T/C, o valor médio ou o valor intermédio do tempo de sobrevivência dos ratinhos tratados, expresso como uma percentagem do valor médio ou do valor intermédio do tempo de sobrevivência dos ratinhos de controlo» Os compostos possuindo valores % T/C superiores a 125 foram considerados possuidores de actividade significativa» Os grupos de tratamento continham 10 ratinhos e os grupos da controlo continham 20 ratinhos» A toxicidade dos agentes anti-tumor foi avaliada nestes testes por comparação do peso dos ratinhos antes do tratamento e 5 dias após o tratamento» Os valores ds DL50 para ura® só administração intraperitoneal, foram de 0,3, 0,2 3 0,1 mg/kg para as altromicinas A, 2 e D, respectivamente = 0s -33-

/, J 70 619

Case 4654,PG.01 altromicinas demonstraram actividade reprodutível no modelo de leucemia sistémica de P33S, como se ilustra na Tabela 12.

Tabela 12 fictividade in vivo das altromicinas A . S e D contra P3S8 sistémico fT/C- 100) (%'i Composto dose (mg/kg) Esquema Média Valor intermédio Velocidade de cura Altromicina A 0,23 QD 1-5 69 >88 5/10 0,14 0D 1-5 77 90 3/10 0,08 QD 1-5 59 64 0,05 GD 1-5 51 46 0,25 Dl ,D5 57 77 4/10 0,15 D1,D5 61 55 0,09 Dl ,D5 38 32 0,05 Dl ,D5 33 32 Altromicina B 0,05 QD 1-5 53 50 0,03 QD 1-5 51 46 0,018 QD 1-5 43 46 0,011 QD 1-5 33 27 0,014 Dl ,D5 64 73 0,08 Dl ,D5 47 46 1/10 0,05 Dl,D5 55 50 0,03 Dl ,D5 38 36 5-Fluoruracil 10 QD 1-5 65 64 Altromicina D 0,150 QD 1-5 tóxico tóxico 0,075 QD 1-5 -10 24 0,037 QD 1-5 58 68 0,018 QD 1-5 50 59 5-Fluoruracil 10 QD 1-5 98 95 1/10 QD1-5 = Compostos teste administrados diariamente durante 5 dias consecutivos.

Dl ,D5 = Compostos teste administrados diariamente, apenas nos dias 1 e 5. 70 619 ,.-

Case 4654.PG.01 -34- -

EXEMPLO S

As altromicinas A, E e D foram também testadas contra dois tumores sólidos, o carcinoma de pulmão de Lewis e o sarcoma do ovário ΙΊ5076. Antes do teste, estes tumores foram propagados subcutaneamente em ratinhos fêmea C57B1/6. Os tumores (sólidos) de carcinoma do pulmão de Lewis ou do M5076 foram implantados subcutaneamente na forma de um homogeneizado 1:10 em ratinhos fêmea B5D2FI pesando 16-20 gramas. Para os ratinhos implantados com os tumores do carcinoma do pulmão de Lewis, os compostos de teste foram administrados diariamente durante 9 dias consecutivos. Utilizou-se ciclofosfamida como droga de controlo positiva. Para os ratinhos implantados com tumores M5076 (sólidos), os compostos de teste foram administrados 4 vezes por dia, durante 11 dias consecutivos. Utilizou-se cis-platina como controlo positivo. Todas as drogas foram administradas intrape-ritonealmente em dextrose aquosa a 5%. A eficácia da droga foi determinada pela redução do peso do tumor. A inibição do peso do tumor foi expressa como função de T/C, razão entre o peso do tumor do ratinho tratado e o peso do tumor do ratinho controlo e os resultados são ilustrados nas Tabelas 13 e 14, a seguir. A altromicina D produziu, aproximadamente, 90¾ de inibição do peso de tumor relativamente aos tumores dos controlos não tratados; a altromicina B produziu um máximo de 60¾ de inibição. Contra o crescimento do tumor de ovário M5076 como implantação subcutânea, a altromicina A demonstrou ser ligeiramente mais activa que a altromicina D (Tabela 14). -35- 70 619

Case 4654,PG.01

Tabela 13

Actividade in vivo das altromicinas A, B e D contra implantações subcutâneas de carcinoma do pulmão de Lewis

Dose* Inibição do peso do tumor Composto fmg/kg) Média Valor intermédio Altromicina A 0,30 0 0 0,15 27 15 0,075 0 0 0,037 0 0 Altromicina B 0,075 tóxico tóxico 0,037 31 60 0,018 13 20 0,009 0,03 16 Altromicina D 0,075 tóxico tóxico 0,037 86 89 0,018 28 61 0,009 0 0 Ciclofosfamida 100 99 50 90 90

As altromicinas A, B e D foram administradas diariamente durante 9 dias consecutivos? a ciclofosfamida foi administrada apenas no dia um. A inibição de peso de tumor foi calculada como (1-T/C)xl00. 70 619 ;

Case 4654.PG.01 -36-

Tabela 14

Actividade in vivo das altromicinas A, B e D contra implantações subcutâneas de sarcoma de ovário M5076 Dose* Inibição do peso do tumor Composto (mg/kg) Média Valor intermédio Altromicina A 0,20 69 72 0,10 60 47 0,05 51 45 0,025 29 21 0,0125 30 4 Altromicina B 0,15 tóxico tóxico 0,075 tóxico tóxico 0,038 tóxico tóxico Altromicina D 0,075 tóxico tóxico 0,038 45 37 0,019 54 47 Ciclofosfamida 100 100 100 50 94 93 fis altromicinas foram administradas duas vezes por dia durante 6 dias. A ciclofosfamido foi administrada uma vez, no dia 1. EXEMPLO 9

As altromicinas B e D foram testadas contra um xenoenxerto de um tumor humano no ensaio da cápsula subrenal (ECSR) como se descreve em Bogden et al„, Câncer 48:10-20 (1981). A linha de tumor do cólon humano, LS174T foi mantida por propagação em série em ratinhos pelados atímicos BALB/C. Os tumores foram removidos dos ratinhos pelados após atingirem 0,2-0,3 gramas e Foram 3 fragmentados em pedaços de 1 mm . Os fragmentos de tumor foram então implantados na cápsula renal de ratinhos CDF1. Imediatamente após a implantação, a massa de tumor foi medida com um microscópio esteroscópico de dissecação, munido de um micrometro 70 619

Case 4654.PG.01 ./ vi-·' -37- ocular, calibrado em unidades oculares (OMU). Calculou-se a massa média do tumor em OMU. Três dias após a implantação do tumor, os ratinhos receberam uma única injecção intravenosa de altromicina B ou D ou de 5-fluorouracil, como referência. Os resultados encontram-se ilustrados na Tabela 15 seguinte.

Tabela 15

Actividade in vivo das altromicinas A β B contra o tumor do cólon humano LS174T. avaliada pelo ensaio da cápsula subrenal

Dose Peso do Composto (mg/kg) tumor (mg) N Comentário Altromicina B 0,5 2,47 9 Activa 0,025 3,21 10 Activa Altromicina D 0,5 2,92 7 Activa 0,25 3,64 8 Inactiva 5-Fluorouracil 50 3,15 8 Activa 5% Dextrose 4,26 7 Controlo

Formulação

Os compostos do presente invento podem ser administrados oralmente, nasalmente, oftalrnicamente, parentericamente, vaginalmente, rectalmente, topicamente ou em aerossol, em formulações de unidades de dosagem contendo transportadores, adjuvantes e veículos, não tóxicos, farmeceuticamente aceitáveis, convencionais, conforme desejado. 0 termo "parentérico", tal como é aqui utilizado, inclui técnicas subcutâneas, intravenosas ou de perfusão.

As formulações injectáveis, por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injectáveis, estéreis, podem ser formuladas de acordo com a arte conhecida, usando agentes dispersantes ou molhantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injectável estéril pode também ser uma solução ou uma suspensão injectável, estéril, num diluente ou solvente, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, por exemplo, uma solução em 1,3- -butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues encontram—se a água, a solução de Ringer e a solução isotónica de cloreto de sódio. Adicionalmente, pode utilizar—se óleo estéril fixo, incluindo mono— ou diglicéridos sintéticos. É ainda possível utilizar ácidos gordos, tais como o ácido oleíco, na preparação de formulações injectáveis.

Os supositórios, para administração rectal ou vaginal do ingrediente activo, podem ser preparados misturando o ingrediente activo com um excipiente não irritante, adequado, tal como manteiga de cacau e polietilenoglicois que são sólidos à temperatura ambiente mas líquidos às temperaturas rectal/vaginal e que fundirão portanto no recto ou na vagina libertando o ingrediente activo.

As formas de dosagem sólidas, para administração oral, podem incluir cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Nestas formas sólidas de dosagem, o ingrediente activo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte como sacarose, lactose ou amido. Essas formas de dosagem podem também incluir, como é prática corrente, substâncias adicionais além dos diluentes inertes, por exemplo, agentes lubrificantes, tais como, estearato de magnésio. No caso das cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podem também compreender agentes tampão. Os comprimidos e pílulas podem, adicionalmente, ser preparados com revestimentos entéricos.

As formas de dosagem líquidas, para administração oral, podem incluir emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires, farmaceuticamente aceitáveis, contendo diluentes inertes, utilizados vulgarmente na arte, tais como a água. Essas composições podem compreender igualmente adjuvantes tais como agentes molhantes, emulsionantes e de suspensão e agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes.

Os compostos do invento podem ser utilizados para o tratamento terapêutico de um hospedeiro mamífero afectado por uma infecção microbiana ou de um animal hospedeiro experimental afectado por um tumor maligno. Os compostos são úteis para o 70 619

Case 4654.PG.01 L -39- tratamento tópico de doenças infecciosas. Adicionalmente os compostos podem ser utilizados em soluções desinfectantes e esterilizadoras ou como conservantes em plásticos, pinturas ou tecidos.

As doses totais diárias administradas a um paciente, em doses únicas ou divididas, podem ser, por exemplo, de 0,01 a 50 mg e, ma is usualmente, de 0,01 a 10,0 mg. As composições de unidades de dosagem podem conter submúltiplos destes valores para perfazer a dose diária. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com os materiais transportadores para produzir uma forma de dosagem unitária, variará de acordo com o paciente a tratar e com o modo particular de administração.

No entanto, deverá entender-se, que o nível de dosagem, específico para qualquer paciente particular, dependerá de diversos factores como sejam a actividade do composto específico empregue; a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a via de administração; a velocidade de excreção do composto; as drogas utilizadas em combinação e a gravidade da doença particular a tratar.

Embora o presente invento inclua a preparação dos compostos de altromicina não está limitado ao uso da estirpe AB 1246E-26 da espécie Actinomycete ou de outras estirpes correspondendo à mesma descrição, mas incluí, pelo contrário o uso de variantes destes organismos tais como as que são obtidas, por exemplo, por selecção ou mutação, sob a acção de raios ultravioleta ou de raios-X, ou de bombardeamentos de azoto. A descrição anterior é meramente ilustrativa do invento e não pretende, de forma alguma, limitá-lo aos compostos referidos. As variações e modificações, que serão óbvias para os peritos na arte, consideram-se compreendidas no âmbito e na natureza do invento, que são definidas nas reivindicações em apêndice.

Claims (7)

1. 70 619 Case 4óS4> PG > 01 -40- R E I V INDICAÇÕES 1 - Processo de produção de compostos de fórmula

   na qual Ri ê selsccionado de entre -NH2* “NHCH3 e -M(01-13)2 s ^2 3 R3 são, i ndependentemente um do outro, seleccionados entre hidrogénio e hidroxilo, de tal modo que pelo menos um de 1¾ ® R3 seja hidroxilo, caracterizado por compreender a cultura de um microrganismo pertencente à ordem dos Ac11nomyceta1es num meio nutriente.
2. 2 - Processo de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado por o microrganismo ter uma parede celular do Tipo IV e ser resistente a lisosima.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o microrganismo exibir, em ágar com exfcracto de levedura- -extracto de malte, caracteristicas de crescimento abundante com «sieéiíos aéreos brancos a cinzento claro, uma coloração casfcanha--avsrmslhada, moderada, quando observada do lado inverso a 1® pigmento solúvel castanho moderado.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microrganismo exibir as caracteristicas distinguíveis da espécie de Actinomycete AB 1246E-26, depositada sob o número de acesso NRRL 18371. -41- 70 619 Dase 4654,PS,01
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação iP caracterisado por o microrganismo ser AB 1246E-26 da espécie Actinomycete. depositado sob o número de acesso NRRL 18371=
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadc por compreender, adicionalmente, o passo de extractar, do meio de cultura,; um isolado de fermentação contendo os compostos.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, earacterizado por compreender, adicionalmente, o passo da purificação dos compostos por partição cromatográfica do isolado de fermentação = 3 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica possuindo actividade anti-bacteriana ou citotóxica, caracterizado cor sa combinar um veículo farmacêutico e uma quantidade tsrapauticamente eficaz de um composto preparado de acordo com as reivind1cações anteriores, Lisboa. -6. FEV. 1950 Por ABBOTT LABORATORIES