PT998495E

PT998495E - Proteína beta amilóide (união globular e suas utilizações)

Info

Publication number: PT998495E
Application number: PT98905006T
Authority: PT
Inventors: Grant A Krafft; William L Klein; Brett A Chromy; Mary P Lambert; Caleb E Finch; Todd Morgan; Pat Wals; Irina Rozovsky; Ann Barlow
Original assignee: Univ Northwestern; Univ Southern California
Priority date: 1997-02-05
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2007-03-30
Also published as: US7638283B2; DE69836740D1; EP1808444A1; US6218506B1; US20060166275A1; BR9807185A; ES2280090T3; ATE349467T1; JP2001501972A; AU735825B2; EP0998495A1; DE69836740T2; CA2279555C; JP3512815B2; CA2279555A1; JP2004091492A; WO1998033815A1; DK0998495T3; AU6273598A; EP0998495B1

Description

1 DESCRIÇÃO "PROTEÍNA BETA AMILÓIDE (UNIÃO GLOBULAR E SUAS UTILIZAÇÕES)"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção pertence a uma nova composição de matéria, os ligandos da demência derivados de beta amilóide (ADDLs). Os ADDLs compreendem ao pêptido de β amilóide reunido em estruturas oligoméricas não fibrilares globulares solúveis que são capazes de activar processos celulares específicos. A invenção também fornece métodos para ensaiar a formação, a presença, a ligação da proteína do receptor e as actividades celulares de ADDLs. São também descritos são os compostos que bloqueiam a formação ou a actividade de ADDLs, e os métodos para identificar a formação e a actividade de tais compostos de ADDL é relevante inter alia para a aprendizagem e para a memória. A modulação da formação ou da actividade de ADDL pode ser assim empregue de acordo com a invenção no tratamento das perturbações da aprendizagem e da memória, assim como de outras doenças, perturbações ou condições que são devidas aos efeitos dos ADDLs. 2

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa progressiva, caracterizada por distintas patologias, incluindo entrelaçados neurofibrilares, placas neurítícas, atrofia neuronal, corte dendrítico e por morte neuronal. De uma perspectiva histórica, o diagnóstico definitivo da doença de Alzheimer tem sempre contado com a identificação de marcas patológicas específicas, nomeadamente os entrelaçados neurofibrilares os quais representam o citosqueleto colapsado dos neurónios mortos e a morrer, e das placas neurítícas, as quais são depósitos extracelulares de várias proteínas, lípidos, hidratos de carbono e compostos de sal, cujo componente de proteína primária é um péptido do resíduo 39-43 conhecido como ο β amilóide.

Do ponto de vista do impacto da doença, no entanto, são os sintomas manifestados na doença de Alzheimer, a saber a perda da memória, a erosão de funções cognitivas, e as mudanças significativas na personalidade e no comportamento, as quais são as mais significativas. Subjacentes a estas mudanças sintomáticas estão os mecanismos celulares específicos que fazem ccm que as células nervosas funcionem mal, e eventualmente degenerem e morram. Estes mecanismos celulares operam indubitavelmente dentro de um ambiente de fundo que, de diversas maneiras, produz algum nível de protecção, ou exerce efeitos de contribuição e de exacerbação. 0 3 resultado é uma curva de distribuição muito larga da idade/incidência, com poucos indícios dos estudos da população que apontam para as causas especificas. A genética molecular representa uma área de estudo em um quadro claro da doença de Alzheimer familiar está a emergir. Como descrito em mais detalhe a seguir, é agora claro a partir dos estudos que identificam as mutações em 3 proteínas diferentes, APP e as presenilinas 1 e 2, que o caminho comum final conduz à doença de Alzheimer é a produção aumentada do 3 amilóide 1-42 (assim como ο β amilóide 1-43),0 qual ocorre em todas estas mutações de AD familiares diferentes. Isto é particularmente digno de atenção, porque os ADDLs, o foco central da invenção aqui descrita, somente se formam como entidades estáveis desta forma mais longa de amilóide, e não da forma mais curta, mais prevalente do Αβ 1-40. 0 β amilóide na doença de Alzheimer. Em 1984, Glenner e Wong foram bem sucedidos no isolamento e na identificação do amilóide cerebrovascular associado com a doença de Alzheimer (Glenner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 885-890, 1984a). Subsequentemente, os mesmos péptidos do resíduo 39-43 conhecidos agora como os β amilóides foram identificados como o principal componente de proteína de placas neuríticas da doença de Alzheimer (Glenner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1131-1135 4 1984b; Masters et al., EMBO J., 4, 2757-2764 , 1985a; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 82, 4245-4249, 1985b). Esta foi a primeira vez em que uma molécula distinta tinha sido ligada à doença de Alzheimer, uma doença que até esse ponto tinha sido caracterizada somente por descrições de neuroanatomia e de neuropatología. 0 β amilóide foi também identificado como o componente da placa ncs cérebros de indivíduos com o Síndroma de Dawn, (Glenner et al., Biochem. Bíophys. Res, Commun., 122, 1131— -1135, 1984b; Masters et ai., EMBO J., 4, 2757-2764, 1985a; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 82, 4245-4249, 1985b) o que leva à sugestão de que o gene que o codifica poderia existir no cromossoma 21. Em 1987, um número de grupos tinham usado a informação da sequência do β amilóide e as técnicas da genética molecular para validar essa sugestão, identificando o gene para a proteína precursora do amilóide (APP) (Kang et al., Nature, 325, 733, 1987; Tanzi et al., Science, 235, 880-884, 1987). O gene do APP é um gene grande, de multi-exão que é fatiado de forma diferente em um número de APP's (revisto em Selkoe, em, Annual Review of Neuroscience, Cowan (Ed.), 17, ix + 623 p, 489— -517, 1994). As proteínas sâo proteínas transmembranares grandes, agora conhecidas como sendo processadas por diversos caminhos, um ou ma is dos quais podem gerar ο β amilóide. Os estudos mais recentes do processamento de APP têm sugerido que a formação de β amilóide não era um processe normal (Esch et al., Science, 248, 1122-1124 1990; Sisodia et ai., Science, 248, 492-495, 1990), apesar de estudos subsequentes em células cultivadas e de análises de soro e de fluido cerebrospinal terem mostrado que a formação de 3 amilóide ocorre como um processo normal em muitos tipos de células, embora a sua formação possa não representar um caminho predominante no todo.

Os principais estudos genéticos do DNA de indivíduos atormentados com um inicio precoce da doença de Alzheimer familiar revelaram que as mutações em um único gene, este mesmo gene de APP, eram causadoras desta forma muito severa da doença. De forma interessante, diversas mutações diferentes no gene de APP foram verificadas incluindo três diferentes substituições de resíduo singular em Vai 717, quatro resíduos a jusante do β amilóide 1-42 de terminal C (Goate et al., Nature, 349, 704-6 1991; Chartier--Harlan et al., Nature, 353, 844-6 1991; Murrell.et al., Science, 254, 97-9, 1991), e uma mutação de dois resíduos (670-671) imediatamente a montante do β amilóide de terminal N, associado com o início precoce da doença de Alzheimer familiar numa família sueca (Mullan et al., Nature Genetics 1, 345-347, 1992). Quando um vector que codifica o ADNc do gene de APP do mutante sueco foi transfectado em linhas de células para se avaliar o processamento de APP, foi verificado que de seis a oito vezes mais de β amilóide 6 foi formado, quando comparado com os níveis do APP de tipo selvagem (Citron et al., Nature, 360, 672-674, 1992; Cai et al., Science, 259, 514-516, 1993}. Foi também demonstrado que os extractos de tecido do cérebro que contêm as actividades da protease nativa do cérebro humano eram capazes de processar um substrato de octapéptido fluorogénico que abrange a mutação sueca rnais do que 100 vezes mais rapidamente do que o substrato correspondente baseado na sequência de tipo selvagem (Ladror et al., J. Bicl. Chem., 269, 18422-8, 1994). Estes resultados sugerem que o mecanismo pelo qual a mutação sueca causa o início precoce da doença de Alzheimer familiar envolve um excesso de produção substancial de β amilóide. Os estudos similares da formação de amilóide nas células transfectadas com o APP do mutante 717 também foram conduzidos, mas os níveis de β amilóide produzido não eram diferentes dos níveis produzidos pelo APP de tipo selvagem. Isto levou a especulações mecanístícas de que qualquer coisa diferente da produção de β amilóide era patogénica para estas mutações. Uma avaliação mais próxima do processamento do APP do mutante 717, e o APP do mutante sueco por Younkin e colaboradores (Suzuki et al., Science, 264, 1336-1340, 1994) forneceram um quadro unificado destes casos da doença de Alzheimer genética. Neste estudo, não foram somente avaliados os níveis totais da produção de β amilóide, mas os comprimentos específicos dos péptidos de β amilóide / produzidos foram também analisados. Os resultados confirmaram que a mutação 717 conduziu a mais do que o dobro da relação do β amilóide 1-42 em relação ao β amilóide 1-40 (um péptido altamente solúvel sob condições fisiológicas) mesmo embora os níveis totais do β amilóide não mudassem. As recentemente descobertas mutações da presenilina 1 e 2 da doença de Alzheimer familiar nos genes que residem no cromossoma 14 (Sherrington et ai., Nature, 375, 754-758, 1995) e no cromossoma 1 (Levy-Lahad et al., Science, 269, 970-973, 1995), respectivamente, foram também ligados ao excesso de produção significativo do β amilóide 1-42. (Mann et al., Annals of

Neurology, 40, 149-56, 1996; Schuener et al., Nature Medicine, 2, 864-70, 1996). Com base nestas descobertas, parece que o processo patogénico mediado por estas mutações da doença de Alzheimer familiar distintamente diferentes é a produção de níveis maiores de β amilóide 1-42. Esta é a fcrma de amilóide que agrega mais rapidamente (Snyder et al., Biophys. J, 67, 1216-28, 1994), que semeia a agregação do β amilóide para formar placas neuróticas (Roher et al., Neurochem., 61, 1916-1926, 1993; Tamaoka et al.,

Biochem. Biophs. Res. Commun., 205, 834-842, 1994), e, como aqui descrito, a forma a qual inesperadamente forma conjuntos de uma ordem altamente estável denominados "ADDLs".

Componentes de placa não amilóide na doença de Alzheimer. 0 β amilóide é o componente de proteína principal das placas, que 8 compreende mais de 70 % da proteína total. Uma variedade de outros componentes de proteína está também presente, no entanto, incluindo a αΐ-antiquimotripsina (ACT), os proteoglicanos do sulfato de heparina (HSPG), as apolipoproteinas E e J, a butiriicolinesterase (BChE), S-100B, e diversos componentes de complemento. Enquanto que a importância destes componentes no início e na progressão da doença de Aizheimer não tiver sido estabelecida, o envolvimento de isoformas de apo E na doença tem sido estabelecida por estudos genéticos de Roses e colegas (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 1977-81, 1993), que descobriram que um polimorfismo no gene E da apolipoproteína, a saber o apo E4, está correlacionado com o início precoce da doença de Aizheimer em um grande conjunto de casos da doença de Aizheimer familiar com um início tardio. Os estudos subsequentes confirmaram que os grupos de indivíduos com o apo E4 têm um risco significativamente maior da doença de Aizheimer e que o inicio da doença de Aizheimer paraleliza aproximadamente a dosagem do gene para o apo E4. Num nível mecanístico, os estudos revelaram que o apo E4 se liga com afinidade mais baixa ao β amilóide do que o apo E3 ou o apo E2, cujas isoformas são associadas com o início mais tardio da doença de Aizheimer. Foi sugerido que estas isoformas podem exercer um efeito protector através de um aclaramento mais eficaz dos depósitos do β amilóide 1-42 (Ladu et ai., J. Biol. Chem., 269, 9 23403-23406, 1994; Ladu et al., J. Biol. Chem., 270, 9039-42, 1995). O papel de outros componentes de placa não é tão claro, embora os estudos recentes (Oda et al., Exptl. Neurology, 136, 22-31, 1995) tenham mostrado que o apo J (clusterina) pode aumentar significativamente a toxicidade do β amilóide 1-42 agregado in vitro. Foi também relatado que o HSPG aumenta a toxicidade do β amilóide 1-40 quando injectado no cérebro de rato (Sncw et al., Soc. Neurosci. Ãbstr., 18, 1465, 1992). Wright et al. (Ann Neurol., 34, 373-384, 1993) demonstraram que as placas de amilóide de um cérebro com a doença de Alzheimer contêm níveis significativos de BChE, enquanto que as placas de amilóide de indivíduos idosos não dementes, não. A proteína de ACT na fase aguda inflamatória também é regulada no cérebro com a doença de Alzheimer, e é conhecida como associando-se com os resíduos 16 de terminal N de β amilóide. Ma et al. (Ma et al., Nature, 372, 92-94, 1994} informaram que o ACT pode aumentar a agregação do β amilóide 1-42, e estes autores especulam que a agregação aumentada contribui para a sua neurotoxicidade.

Respostas Celulares do β Amilóide e a Patologia In Vivo. Além das placas e entrelaçados que são as marcas da doença de Alzheimer, é claro que uma variedade de respostas celulares foi induzida, tanto em neurónios como nas células gliais que os acompanham. A um nível 10 bioquímico, a hiperfosforílação da proteína tau é evidente, que resulta da perturbação do equilíbrio da quínase/fosfatase. A um nível transcripcionai, uma variedade de genes são activados para produzir um espectro de proteínas normalmente não presentes ou somente presentes a níveis mais baixos no cérebro. Há também evidência significativa de que os processos inflamatórios foram activados. Em particular, a fosforilação de tau tem sido documentada como sendo induzida pelo β amilóide 1-42 agregado em células SH-SY5Y diferenciadas (Lambert et al., J. Neurosci. Res.r 39, 377-384, 1994), e este resultado foi confirmado num relatório mais recente por Busciglio et al. {Neuron, 14, 879-88, 1995), no qual ο β amilóide activou a fosforilação de tau nos neurónios do hipocampo em ratos primeiramente culturados. 0 β Amilóide Fíbrilar e a Neurodegeneração na Doença de Alzheimer. 0 mecanismo pelo qual ο β amilóide 1-42 causa a doença de Alzheimer não foi elucidada, mas a literatura contém mais de 200 estudos da neurotcxicidade do β amilóide, muitos dos quais foram revistos recentemente (por exemplo, Yankner et al.r Neuron, 16, 921-32, 1996; Iversen et al., Biochemical Journal, 311, 1-16, 1995). A visão de consenso é a de que para que ο β amilóide seja tóxico, deve reunir-se em estruturas fibrilares (Pike et al., J. Neurosci., 13, 1676-87, 1993). As soluções que contêm só ο β amilóide monomérico têm sidc repetidamente demonstradas como não tendo nenhum efeito deletério nos neurónios em cultura. Além disso, os estudos correlacionaram a formação de fibrilos que contêm a folha de β amilóide e o tempo e a extensão da toxicidade por se utilizarem técnicas tais como o dicroismo circular e a microscopia de electrão (Simmons et al., Molecular Pharmacology, 45, 373-9, 1994). Um estudo concluiu explicitamente que ο β amilóide deve existir na forma de fibrilos para que seja tóxico (Lorenzo et al., Proc. Natl. Acad. Scl. EUA, 91, 12243-12247, 1994). Apesar deste consenso quanto à estrutura e à actividade do β amilóide, continua a ser um problema de capacidade de reprodução do trabalho experimental publicado que envolve a toxicidade de amilóide (Brining, Neurobiology of Agíng, 18, 581-589, 1997), e a capacidade de variação expandida da actividade obtida com diferentes grupos de amilóides, ou até o mesmo grupo de amilóide tratado de formas ligeiramente diferentes, apesar da composição química idêntica (May et al., Neurobiology of Aging, 13, 1676-87, 1993). Isto levantou questões no que se refere às estruturas exactas de β amilóide que são responsáveis pela sua actividade. A presente invenção procura superar os problemas na técnica anterior. Consequentemente, é um objectivo da presente invenção o de fornecer uma nova composição da matéria, do péptido de β amilóide reunido em estruturas oligomérícas não fibrilares globulares solúveis (ADDLs), que inesperadamente são neurotóxicas.

Estes e outros c-bjectivos e vantagens da presente invenção, bem como as caracteristicas inventivas adicionais, serão evidentes a partir da descrição seguinte.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é uma imagem gerada por computador de um gel de poliacrilamida manchado de prata esquadrinhado por um densitómetro a qual mostra a electroforese dos ADDLs com uma banda primária que corresponde a cerca de 30 kD, uma banda menos abundante que corresponde a cerca de 17 kD, e nenhuma evidência de fibrilos ou de agregados. A Figura 2 é uma imagem gerada por computador de um gel de poliacrilamida de SDS manchado por Coomassie esquadrinhado por um densitómetro que mostra a electroforese dos ADDLs com uma banda primária (dupla superior) que corresponde a um tamanho de cerca de 17 a cerca de 22 kD, e com uma outra banda (banda escura inferior) que indica 4 kD de monómero presente abundante, presumivelmente um produto de emergência. Linhas: primeira, marcadores de tamanho molecular; segunda preparação de ADDL; terceira carregamento mais pesado da preparação de ADDL. A Figura 3 é uma imagem representativa gerada por computador da análise de A FM da "fracção 3" que contém o ADDL (fraccionada numa 13 coluna de filtração de gel Superdex 75}. A Figura 4 é uma imagem gerada por computador de um gel gradiente de poliacriiamida de SDS manchado por Coomassie esquadrinhado por densitómetro de ADDLs preparados através de co-incubação com a clusterina (Linha A) ou meio de F12 frio (Linha B), e de ADDLs preparados através de co-incubação com a clusterina e que passaram através de uma membrana de corte Centricon de 10 kD (Linha C) ou foram retidos por uma membrana de corte Centricon de 10 kD (Linha D): MW, marcadores de tamanho molecular. Ά Figura 5 é um gráfico da concentração de ADDL medida como a concentração de β amilóide 1-42 (nM) versus a % de células mortas de fatias cerebrais de ratos tratados com as preparações de ADDL. A Figura 6 é um diagrama de barra que mostra a % de redução de MTT para o controlo de células de PC 12 não expostas a ADDLs ("Cont".), de células de PC 12 expostas à clusterina sozinhas ("Apo J"), de células de PC 12 expostas a Άβ ("Αβ"), de células de PC 12 expostas a β amilóide co-agregadas com a clusterina e envelhecidas em um dia ("Αβ: Apo J"). A Figura 7 é um esquadrinhado de FAC que mostra a intensidade de fluorescência (0-170) versus eventos (0-300) para as células de BI03 não expostas a ADDLs (pico não sombreado) e células de B103 4 ligadas a ADDLs marcados fluorescentes (pico sombreado), A Figura 8 é um esquadrinhado de FAC que mostra a intensidade de fluorescência (0-200) versus eventos (0-300) para as células do hipocampo não expostas a ADDLs (pico não sombreado, "-ADDLs") e as células do hipocampo ligadas a ADDLs marcados fluorescentes (pico sombreado, "ADDLs"). A Figura 9 é um diagrama de barra de percentagem máxima da ligação de ADDL ou de morte evocada de ADDL para as células de B103 que ou não tenham sido expostas ("-"} ou tenham sido co-expostas ("+") aos péptidos libertados pela tripsinização das células de B103. A Figura 10 é um gráfico da concentração relativa de ADDL versus a % de células mortas de fatias cerebrais de ratos tratados com as preparações de ADDL. Para determinar a concentração relativa, uma concentração inicial de 10 μΜ de proteína Αβ foi empregue para formar os ADDLs no ponto de dados mais alto (ponto "16"), isto foi pcstericrmente diluído a 1/2 (ponto "8"), 1/4 (ponto "4"), e assim por diante. A Figura 11 é um diagrama de barra que mostra a densidade óptica obtida no ensaio de ELISA de ligação de ADDL pelo que as células de B103 foram co-incubadas com os ADDLs e o anticorpo 6E10 (barra de "células, ADDL, 6E10"), as células de B103 foram co-incubadas com os ADDLs e (barra de "células, ADDL"}, as células de B103 foram co-incubadas com o anticorpo 6E10 (barra de "células, 6E10"), as células de B103 foram incubadas sozinhas (barra de "células"), o anticorpo 6E10 foi incubado sozinho (barra de "6E10"), ou a densidade óptica do diluente foi lida (barra em "branco"). A Figura 12 é um diagrama de barra da % de células mortas quer em ratos com fyn +/+ (tipo selvagem, "Fyn +"; barras sombreadas) ou fyn-/- (separador, "Fyn-"; barras sólidas) quer não tratados ("Meio") ou contactados com os ADDLs ("ADDLs"). A Figura 13 é um gráfico da concentração de Αβ (μΜ) versus o glia activado (número) obtido na incubação de astrócitos com os ADDLs (triângulos a cheio) ou ο Αβ 17-42 (quadrados a cheio). A Figura 14 é um gráfico de tempo (minutos) versus a % da amplitude de pico do corpo de ^célula de linha de referência de ratos de controlo não tratados com os ADDLs (triângulos a cheio) ou de ratos tratados com os ADDLs (quadrados a cheio). A Figura 15 é um gráfico de tempo (minutos) versus a amplitude de pico de fatias do hipocampo do rato de controlo não expostas aos ADDLs (triângulos a cheio) versus as farias do hipocampo do rato expostas aos AuDLs (quadrados a cheio. 16

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção abrange uma nova composição da matéria, denominada ligandos da demência derivados do β amilóide ou ligandos difusíveis derivados do β amilóide (ADDLs). Os ADDLs compõem-se do péptido de β amilóide reunido em estruturas olígomérícas não fibrilares solúveis que são capazes de activar processos celulares específicos. Um outro aspecto da invenção consiste de métodos para ensaiar a formação, presença, a ligação da proteína de receptor e as actividades celulares de ADDLs. A invenção abrange além disso métodos de ensaio e métodos de identificação de compostos que modulam (por exemplo, aumento ou redução) a formação e/ou a actividade de ADDLs. Tais compostos podem ser empregues no tratamento de doenças, perturbações, ou condições devidas aos efeitos dos ADDLs.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Foi descoberto que em amostras neurotóxicas de β amilóide não só existem as estruturas fibrilares, mas também, inesperadamente, algumas estruturas de proteína globular existem que parecem ser responsáveis pela neurotoxicidade. Utilizanao métodos novos, as amostras que contêm predominantemente estas reuniões de proteína globular solúveis e nenhumas estruturas fibrilares foram geradas como aqui descrito. Em amostras heterogéneas preparadas por vários 17 métodos, a remoção das formas fibrilares maiores, de β amílóide através de centrifugação não retira estas reuniões globulares solúveis de β amílóide nas fracções do sobrenadante. Estas fracçces do sobrenadante apresentam uma neurotoxicidade signífícativamente maís alra do que as amostras de β amílóide não fraccionadas agregadas sob condições da literatura. Estas novas formas globulares solúveis e inesperadamente neurotóxicas são aqui referidas como ligandos da demência derivados de β amílóide ou ligandos dífusíveis derivados de β amílóide (ADDLs). As amostras de β amílóide que tinham sido "envelhecidas" sob condições padrão da literatura (por exemplo, Pike et al., J. Neurosci., 13, 1676-1687, 1993) durante mais de três semanas perdem a sua neurotoxicidade, mesmo embora estas amostras contenham predominantemente estruturas fibrilares com poucos ou nenhuns ADDLs. Esta descoberta que os ADDLs globulares são neurotóxicos é especialmente surpreendente uma vez que o pensamento corrente considera que são as estruturas de fibrilos que constituem a forma tóxica de β amílóide (Lorenzo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 91, 12243-12247, 1934; Hewlett et al., Neurodegen, 4, 23-32, 1995).

Os ADDLs podem ser formados in vítro. Quando uma solução (por exemplo, uma solução de DMSG) que contém ο β amílóide 1-42 monomérico (ou outro β amílóide apropriado, como além disso aqui descrito) é diluída num meio de cultura de tecido frio (por 18 exemplo, meio de cultura de célula de F12), depois deixada a incubar a cerca de 4 °C durante cerca de 2 a 48 horas e centrifugada durante cerca de 10 minutos a cerca de 14 000 g a uma temperatura de 4 °C, a fracção de sobrenadante contém glóbulos oligoméricos pequenos, solúveis que são altamente neurotóxicos, por exemplo em células neuronais e culturas de fatias cerebrais. Os ADDLs também podem ser formados através da co-incubação de β amilóide com certos agentes apropriados, por exemplo, a clusterina (uma proteína de placa senil que também é conhecida como Apo J). A análise de microscópio de força atómica (AFM) de uma tal fracção de sobrenadante revela um número de glóbulos de tamanho diferente presentes na fracção. Esses glóbulos estão incluídos na variação de cerca de 4,7 nm a cerca de 6,2 nm. Pode haver espécies distintas de glóbulos que estão incluídos nesta variação. A saber, uma variação leve na superfície da altura resulta de como as espécies particulares são assentes na superfície de mica no momento da análise. Apesar desta variação leve no entanto, parece haver dois tamanhos predominantes de glóbulos, isto é, de cerca de 4,9 nm a cerca de 5,4 nm e de cerca de 5,7 nm a cerca de 6,2 nm, que constitui cerca de 50 % das estruturas oligoméricas em uma amostra típica. Pode também haver uma espécie de tamanho distinto do glóbulo que tem dimensões de cerca de 5,3 nm a cerca de 5,7 nm. Parece que os glóbulos de dimensões de cerca de 4,7 nm a cerca de 19 6,2 nm em AFM compreendem a forma de pentâmero e de hexâmero da proteína do β amilóide oligomérico. Os glóbulos de tamanho de AFM de cerca de 4,2 nm a cerca de 4,7 nm parecem corresponder ao tetrâmero Αβ. Os glóbulos de tamanho de cerca de 3,4 nm a cerca de 4,0 nm parecem corresponder ao trímero. Os glóbulos de tamanho de cerca de 2,8 nm a cerca de 3,4 nm correspondem ao dímero (Roher et ai., J. Biol. Chem., 271, 20631-20635, 1996). 0 tamanho de AFM do monómero Αβ varia de cerca de 0,8 nm a cerca de 1,8 - 2,0 nm. Os β amilóides monoméricos e diméricos não são neurotóxicos em culturas de células neuronais ou nas culturas de fatias cerebrais organotípícas.

Assim, a presente invenção fornece uma ligação de proteína de β amilóide não fibrilar solúvel, isolada e homogénea, (isto é, ADDL) que compreende de 4 a 12 proteínas de β amilóide 1-42, em que a estrutura apresenta neurotíxícidade e não contém a proteína de β amilóide 1-40. Em particular a invenção fornece uma ligação de proteína de β amilóide isolada que de um modo preferido compreende uma forma oligomérica seleccionada a partir do grupo que consiste de tetrâmeto, pentâmero e hexâmero. A ligação de proteína apresenta de forma óptima actividade neurotóxica. Ο β amilóide 1-42 com a biocitina na posição 1 pode ser empregue. Ο β amilóide 1-42 com a cisteína no terminal N também pode ser empregue. 20

Desejavelmente, a ligação de proteína de β amilóide isolada de acordo com a invenção compreende glóbulos de dimensões de 4,7 nm a 6.2 nm, como medido por micrcscopia de força atómica. Também, de um modo preferido a ligação de proteína de β amilóide isolada compreende glóbulos de dimensões de 4,9 nm a 5,4 nm, ou de 5,7 nm a 6.2 nm, como medido por microscopia de força atómica. Em particular, de um modo preferido a ligação de proteína de β amilóide isolada de acordo com a invenção é tal que em que de 30 % a 85 I, de ura modo mesmo mais preferido de 40 % a 75 % da ligação compreende dois tamanhos predominantes de glóbulos, a saber, de dimensões de 4,9 nm a 5,4 nm, e de 5,7 nm a 6,2 nm, como medido por microscopia de força atómica. No entanto, também é desejável que a ligação de proteína compreenda glóbulos de tamanho de AFM de 5,3 a 5,7 nm.

Através de electroforese de gel não desnaturado, as bandas que correspondem aos ADDLs correm de 2 6 kD a 28 kD. Sob condições de desnaturação (por exemplo, em 15 % de um gel de SDS-poliacrilamida), os ADDLs compreendem uma banda que corre de A invenção também 22 kD a 24 kD, e podem compreender além disso uma banda que corre de 18 a 19 kD. Por consequência, a invenção fornece de um modo preferido uma ligação de proteína de β amilóide isolada (isto é, ADDL) que tem um peso molecular de 2 6 kD a 28 kD como determinado através de electroforese de gel não desnaturado. 21 fornece de um modo preferido uma ligação de proteína de β amilóide isolada (isto é, ADDL) que corre como uma banda que corresponde a um peso molecular de 22 kD a 24 kD como determinado através de electroforese em 15 % de um gel de SDS-poliacrilamida. É também descrito um método para preparar a ligação de proteína β amilóide não fibrilar solúvel isolada. Este método compreende opcionalmente os passos de: (a) obter-se uma solução da proteína de β amilóide monomérica; (b) diluir-se a solução da proteína num meio apropriado; (c) incubar-se o meio resultante do passo(b) a cerca de 4 °C; (d) centrifugar-se o meio a cerca de 14 000 g a cerca de 4 °C; e (e) recuperar-se o sobrenadante resultante da centrifugação como contendo a ligação de proteína de β amilóide. No passo (c) deste método, a solução é desejavelmente incubada durante cerca de 2 horas a cerca de 48 horas, especialmente de cerca de 12 horas a cerca de 48 horas, e de um modo mais preferido de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. No passo (d) deste método, a centrifugação é de um modo preferido executada durante cerca de 5 minutos a cerca de 1 hora, especialmente durante cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos, e optimamente durante cerca de 10 minutos. Geralmente, no entanto, isto é somente uma medida de precaução para retirar quaisquer estruturas fibrílares ou protofibrilares nascentes e pode 22 não ser necessário, em particular onde a estabilidade de longo prazo da preparação de ADDL não é uma questão. A proteina de Αβ é diluída no passo (b) desejavelmente a uma concentração final que varia de cerca de 5 nM a cerca de 500 μΜ, em particular de cerca de 5 μΜ a cerca de 300 μΜ, especíalmente a cerca de 100 pM.' O "meio apropriado" no qual a solução de proteína de Αβ é diluída no passo (b)é de um modo preferido qualquer meio que a suporte, se não facilitar, a formação de ADDL. Em particular, o meio de F12 (o qual é comercialmente disponível bem como facilmente formulado no laboratório) é preferido para a utilização neste método da invenção. Semelhantemente "o meio de F12 substituto" também pode ser desejavelmente empregue. O meio de F12 substituto diferencia-se do meio de F12 que é comercialmente disponível ou que é formulado no laboratório. De acordo com a invenção, o meio de F12 substituto compreende de um modo preferido os componentes seguintes: N, N-dimetilglicina, D-glicose, cloreto de cálcio, penta-hidrato de sulfato de cobre, hepta-hidrato de sulfato de ferro (II), cloreto de potássio, cloreto de magnésio, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de hidrogénio de díssódio, e hepta-hidrato de sulfato de zinco.

Em particular, o meio de F12 sintético de acordo com a invenção compreende opcionalmente: N, N-dimetilglicina (de cerca de 600 a 2 3 cerca de 850 mg/L), D-glicose (de cerca de 1,0 a cerca de 3,0 g/L) , cloreto de cálcio (de cerca de 20 a cerca de 40 mg/L) , penta-hidrato de sulfato de cobre (de cerca de 15 a cerca de 40 mg/L) , hepta-hidrato de sulfato de ferro (II) (de cerca de 0,4 a cerca de 1,2 mg/L), cloreto de potássio (de cerca de 160 a cerca de 280 mg/L) , cloreto de magnésio (de cerca de 40 a cerca de 75 mg/L) , cloreto de sódio (de cerca de 6,0 a cerca de 9,0 g/L), bicarbonato de sódio (de cerca de 0,75 a cerca de 1,4 g/L), fosfato de hidrogénio de dissódio (de cerca de 120 a cerca de 160 mg/L), e hepta-hidrato de sulfato de zinco (de cerca de 0,7 a cerca de 1,1 mg/L). Optímamente, o meio de F12 sintéticos de acordo com a invenção compreende: N, N-dimetilglicina (cerca de 766 mg/L), D-glicose (cerca de 1,802 g/L), cloreto de cálcio (cerca de 33 mg/L), penta-hidrato de sulfato de cobre (cerca de 25 mg/L), hepta-hidrato de sulfato de ferro (II) (cerca de 0,8 mg/L), cloreto de potássio (cerca de 223 mg/L), cloreto de magnésio (cerca de 57 mg/L), cloreto de sódio (cerca de 7,6 g/L), bicarbonato de sódio (cerca de 1,18 g/L), fosfato de hidrogénio de dissódio (cerca de 142 mg/L), e hepta-hidrato de sulfato de zinco (cerca de 0,9 mg/L). Além disso, o pH do meio de F12 substituto é de um modo preferido ajustado, por exemplo, por se utilizar 0,1 M hidróxido de sódio, desejavelmente a um pH de cerca de 7,0 a cerca de 8,5, e de um modo preferido a um pH de cerca de 8,0. 24 0 método precedente além disso desejavelmente pode ser executado por se formar a estrutura olígomérica de sedimentação lenta na presença de um agente tal como a ciusterina. Isto é feito, por exemplo, por se adicionar a ciusterina no passe (c), e, como estabelecido nos Exemplos que se seguem.

Se os ADDLs forem preparados através da incorporação de 10 % do β amilóide 1-42 biotinilado (ou outra proteína de β amilóíde biotinilado apropriado), eles podem ser utilizados num receptor de ensaio de ligação que utiliza células neuronais e executados, por exemplo, num instrumento de classificação de células activadas por fluorescência (FACS), com a marcação por um conjugado de avidina fluorescente. Alternadamente, em vez de se incorporar a biotina na proteína de β amilóide, um outro reagente capaz de ligar o ADDL para formar uma molécula fluorescentemente marcada, e a qual pode já ser parte de um conjugado marcado fluorescente, pode ser empregue. Por exemplo, a estrutura olígomérica do β amilóide não fibrilar solúvel pode ser formada de tal forma que a proteína de amilóíde inclua uma outra fraeção de ligação, com "fraeção de ligação" como aqui utilizado abrangendo uma molécula (tal como a avidina, a estreptavidina, a polilisina, e semelhantes) que pedem ser empregues para se ligarem a um reagente para formar um composto ou conjugado fluorescentemente marcados. "O reagente fluorescente" ao qual a estrutura olígomérica se liga não precisa ele mesmo de 25 fluorescer directamente, mas em vez disso pode ser simplesmente capaz de fluorescência através da ligação a um outro agente. Por exemplo, o reagente fluorescente o qual liga a estrutura oligomérica pode compreender um anticorpo especifico de β amilóide (por exemplo, ο 6E10) , com a fluorescência gerada pela utilização de um anticorpo secundário fluorescente.

Juntamente com outras experiências, a análise de mapeamento de FAC das células de B103 de CNS do rato foi feita sem e com a incubação de ADDL. Os resultados destes e de estudos adicionais confirmam que a ligação à superfície da célula é saturável, e o tratamento breve com a tripsina retira selectívamente um subconjunto de proteínas da superfície da célula e elimina a ligação de ADDLs. As proteínas que são cliváveis através do breve tratamento com a tripsina a partir da superfície das células de B103 também previnem a ligação de ADDL a células de B103 ou a neurónios do hipocampo do rato primário culturado. Estes resultados suportam todos que os ADDLs actuam através de um receptor de superfície de célula particular, e que os primeiros eventos mediados pelo ADDLs (isto é, os eventos antes da morte da célula) podem ser vantajosamente controlados {por exemplo, para o tratamento ou a pesquisa) por compostos que bloqueiam a formação e a actividade (por exemplo, incluindo a ligação do receptor) dos ADDLs. 26

Assim, a invenção fornece um método para identificar compostos que modulam (isto é, quer facilitam ou bloqueiam) a actividade (por exemplo, a actividade tal como a ligação do receptor) do ADDL. Este método de um modo preferido compreende: (a) fazer contactar as culturas separadas de células neuronais com a estrutura cligomérica da invenção quer na presença ou na ausência de contacto com o composto de teste; (b) adicionar-se um reagente que se liga à estrutura oligomérica, sendo o reagente fluorescente; (c) a análise das culturas de célula separadas através da classificação de célula activada por fluorescência; e (d) comparar a fluorescência das culturas, com os compostos que bloqueiam a actividade (isto é, a ligação a uma proteína da superfície da célula) da estrutura oligomérica sendo identificada como tendo resultado numa fluorescência reduzida da cultura, e os compostos que facilitam a ligação a uma proteína da superfície da célula (isto é, um receptor) sendo identificado como tendo resultado numa fluorescência aumentada da cultura, em comparação com a. cultura correspondente contactada com a estrutura oligomérica na ausência do composto de teste. Alternadamente, em vez de se adicionar um reagente fluorescente que aí e ele próprio é capaz de ligar o complexo de proteína, o método desejavelmente é executado em que a estrutura oligomérica é formada de proteína de β amílóide 27 1-42 (ou um outro β amiióide) preparado de tal forma que compreenda uma fracção de ligação capaz de ligar o reagente fluorescente.

Semelhantemente o método pode ser empregue para identificar compostos que modulam (isto é, quer facilitam ou bloqueiam) a formação ou a actividade (por exemplo, a ligação a uma proteína de superfície de célula, como um receptor) da estrutura oligomérica que compreende: (a) a preparação das amostras separadas do β amiióide quer tenham ou não sido misturadas com o composto de teste; (b) a formação da estrutura oligomérica nas amostras separadas; (c) fazer contactar as culturas separadas de células neuronais com as amostras separadas; (d) adicionar um reagente que se liga à estrutura oligomérica, sendo o reagente fluorescente; (e) analisar as culturas de célula separadas por classificação de célula activada por fluorescência; e (f) a comparação da fluorescência das culturas, com compostos que bloqueiam a formação ou a ligação de receptor da ligação de proteína que é identificada como resultando em uma fluorescência reduzida da cultura, e os compostos que facilitam a formaçãc ou a ligação de receptor à ligação de proteína que é identificada como resultando em uma fluorescência aumentada da cultura, em comparação 28 com a cultura correspondente contactada com a ligação de proteína na ausência do composto de teste. Além disso, em vez de se adicionar um reagente fluorescente que ai e por si só é capaz de ligar o complexo de proteína, o método pode ser executado em que a ligação de proteína é formada de proteína de β amilóide preparada de tal forma que compreenda uma fracçâo de ligação capaz de ligar o reagente fluorescente. A fluorescência das culturas é além disso opcionalmente comparada com a fluorescência de culturas que foram tratadas da mesma forma excepto o facto de que em vez de se adicionar ou de não se adicionar o composto de teste antes da formação da ligação de proteína, o composto de teste é ou não é adicionado depois da formação da ligação de proteína. Nesta situação, os compostos que bloqueiam a formação da ligação de proteína são identificados como resultando em uma fluorescência reduzida da cultura, e os compostos que facilitam a formação da ligação de proteína são identificados como resultando em uma fluorescência aumentada da cultura, em comparação com a cultura correspondente contactada com a ligação de proteína na ausência do composto de teste, só quando o composto é adicionado antes da ligação de proteína.

Em contraste, os compostos que bloqueiam a ligação de receptor da ligação de proteína sâo identificados como resultando em uma 29 fluorescência reduzida da cultura, e os compostos que facilitam a ligação de receptor da ligação de proteína são identificados como resultando em uma fluorescência aumentada da cultura, em comparação com a cultura correspondente contactada com a ligação de proteína na ausência do composto de teste, quando o composto é adicionado antes de ou depois da ligação de proteína.

De uma forma semelhante, um ensaio à base de célula, em particular um ensaio de imunoabsorção ligado por enzima à base de célula (ELISA) pode ser empregue de acordo com a invenção para avaliar a actividade da ligação de ADDL. Em particular, o método pode ser empregue para detectar a ligação da ligação de proteína a um receptor de superfície de célula. Este método de um modo preferido compreende: (a) a formação de uma ligação de proteína de proteína de β amilóíde; (b) fazer contactar uma cultura de células neuronais com a ligação de proteína; (c) a adição de um anticorpo (por exemplo, ο 6E10) que liga a referida ligação de proteína, incluindo o referido anticorpo uma fracção de conjugação (por exemplo, a biotina, ou outro agente apropriado;; (d) tirar por ao lavagem o anticorpo não ligado; 30 (e) a ligação de uma enzima por exemplo, a peroxidase de armorácía) ao referido anticorpo ligado à referida ligação de proteína por meio da referida fracção de conjugação; (f) adicionar um substrato sem cor (por exemplo, o ABTS) que é clivado pela referida enzima para produzir uma modificação de cor; e (g) a determinação da referida modificação de cor (por exemplo, através de espectrofotometria) ou a taxa da modificação de cor como uma medida da ligação de receptor da referida ligação de proteína. Como antes descrito, o anticorpo pode ser qualquer anticorpo capaz de detectar os ADDLs (por exemplo, um anticorpo dirigido a um local exposto em β amilóide}, e a fracção de conjugação do anticorpo pode ser qualquer agente capaz de ligar um meio de detecção (por exemple, uma enzima). A enzima pode ser qualquer fracção (por exemplo, talvez mesmo diferente de uma proteína) que fornece um meio de detecção (por exemplo, a modificação de cor devido à clivagem de um substrato), e além disso, pode ser ligada (por exemplo, covalente ou não covalente) ao anticorpo ligado à ligação de proteína por meio de uma outra fracção (por exemplo, um anticorpo secundário). Também, de um modo preferido de acordo com a invenção as células são aderidas a um substrato sólido (por exemplo, plástico de cultura de tecido) antes da condução do ensaio. Não se pode continuar sem dizer que desejavelmente o passo 31 (b) deve ser executado como aqui descrito de tal forma que os ADDLs sejam capazes de se ligarem a células. Semelhantemente um modo preferido o passo (c) deve ser executado durante um período de tempo suficiente (por exemplo, de cerca de 10 minutos a cerca de 2 horas, desejavelmente durante cerca de 30 minutos) e sob condições apropriadas (por exemplo, à cerca da temperatura ambiente, de um modo preferido com a agitação suave) para permitir que o anticorpo se ligue aos ADDLs. Além disso, os passos de bloqueio apropriados podem ser executados como são conhecidos pelos especialistas na técnica por se utilizarem reagentes de bloqueio apropriados para reduzir qualquer ligação não especifica do anticorpo. O especialista é familiar com o método de ELISA e pode empregar modificações ao ensaio tal como são conhecidas na técnica. O ensaio desejavelmente também pode ser executado para identificar os compostos que modulam (isto é, quer facilitam ou bloqueiam) a formação ou a ligação de receptor da ligação de proteína. Neste método, como nos ensaios prévios descritos de compostos de teste, o composto de teste é quer adicionado à preparação de ADDL, antes do contacto das células com os ADDLs. Este ensaio assim pode ser empregue para detectar os compostos que modulam a formação da ligação de proteína (por exemplo, como anteriormente descrito). Além disso, o composto de teste pode ser adicionado à preparação de ADDL antes de contactar com as células (mas depois da formação de 32 ADDL), ou às células antes de contactar com os ADDLs. Este método por exemplo, como anteriomente descrito) pode ser empregue para descobrir os compostos que modulam o ADDL que se liga à superfície da célula. Também, um composto de teste pode ser adicionado à mistura de células ma is os ADDLs. Este método (por exemplo, como anteriormente descrito) pode ser empregue para detectar os compostos que impactam em eventos mediados por ADDL que ocorrem a jusante da ligação do receptor de ADDL. A especificidade dos compostos para actuarem num efeito a jusante mediado por ADDL pode ser confirmada, por exemplo, por se adicionar simplesmente o composto de teste na ausência de qualquer co-incubação com os ADDLs. Naturalmente, os controlos apropriados adicionais (por exemplo, como estabelecido nos Exemplos seguintes e como conhecido dos especialistas na técnica) devem estar incluídos com todos os ensaies.

Esta informação em compostos que modulam (isto é, quer facilitam ou bloqueiam) a formação e/ou a actividade incluindo a ligação do receptor à ligação de proteína podem ser empregues na pesquisa e no tratamento de doenças, condições, ou perturbações mediadas pelo ADDL. Os métodos da invenção podem ser empregues para investigar a actividade e a neurotoxicidade dos próprios ADDLs. Por exemplo, quando 20 nL da preparação de ADDL foi injectado na região do hipocampo de um rato adulto, 60 - 70 minutos antes da condução de uma experiência de potenciação a longo prazo (LTP) (por exemplo Namgung et al., Brain Research, 689, 85-92, 1995), a fase de estímulo da experiência ocorreu de uma maneira idêntica com injecções de controlo de salina, mas a fase de consolidação mostrou um declínio contínuo, significativo, na actividade sináptica como medido pela amplitude do pico do corpo da célula, sobre as 2 horas subsequentes, em comparação com os animais do controlo, em que a actividade sináptica permaneceu a um nível comparável àquele apresentado durante a fase de estímulo. A análise de fatias cerebrais depois da experiência indicou que não tinha ocorrido nenhuma morte de célula. Estes resultados, bem como outros descritos nos Exemplos seguintes, confirmam que o tratamento com ADDL comprometeu a resposta de LTP. Isto indica que os ADDLs contribuem para a aprendizagem e a memória comprometida observada na doença de Alzheimer pela interferência com processos de sinalização neuronais, e não pela indução da morre de células nervosas. A informação adicional nos efeitos de ADDLs (quer na presença ou na ausência de compostos de teste que potencialmente modulam a formação e/ou a actividade do ADDL) pode ser obtida por se utilizarem os ensaios adicionais de acordo com a invenção. Por exemplo, também é revelado um método para ensaiar os efeitos dos ADDLs que de um modo preferido compreende: 34 (a) a administração da ligação de proteína ao hipocampo de um animal; (b) a aplicação de um estímulo eléctrico; e (c) a medição da amplitude de pico do corpo de célula ao longo do tempo para determinar a resposta à potenciação a longo prazo. 0 método é opcionalmente executado em que a resposta à potenciação a longo prazo do animal é comparada à resposta à potenciação a longo prazo de outro animal tratado da mesma forma excepto o facto de ter sido administrada salina em vez da ligação de proteína antes da aplicação do estímulo eléctrico. Este método além disso pode ser empregue para identificar os compostos que modulam (isto é, quer aumentam ou reduzem) os efeitos dos ADDLs, por exemplo, por se comparar a resposta de LTP em animais administrados com ADDLs quer sozinhos, cu, em conjunto com os compostos de teste.

Ao longo destas linhas, também é revelado um método para identificar os compostos que modulam os efeitos da ligação de proteína do ADDL. 0 método de um modo preferido compreende: (a) a administração quer de salina ou de um composto de teste ao hipocampo de um animal; (b) a aplicação de um estímulo eléctrico; (c) a medição da amplitude de pico do corpo de célula ao longo do tempo para se determinar a resposta à potenciação a longo prazo; e (d) a comparação da resposta à potenciação a longo prazo de animais a quem foi administrada salina à resposta à potenciação a longo prazo de animais a quem fci administrado o composto de teste. 0 método além disso compreende opcionalmente a administração da ligação de proteína ao hipocampo quer antes, quer antes, ao mesmo tempo, ou depois de se administrar a salina ou o composto de teste.

Semelhantemente também é revelado um método para identificar os compostos que modulam (isto é, quer aumentam ou reduzem) a neurotoxicidade da ligação de proteína do ADDL, cujo método compreende: (a) fazer contactar as culturas separadas das células neuronais com a ligação de proteína na presença ou na ausência de contacto com o composto de teste; (b) medir a proporção de células viáveis em cada cultura; e (c) comparar a proporção de células viáveis em cada cultura. Os compostos que bloqueiam a neurotoxicidade da ligação de proteína são identificados, por exemplo, como resultando em uma proporção aumentada de células viáveis na cultura em comparação com a cultura correspondente contactada com a ligação de proteína na ausência do composto de teste. Os compostos que aumentam a neurotoxicidade da ligação de proteína são identificados, por exemplo, como resultando em uma porção reduzida de células viáveis na cultura em comparação 36 com a cultura correspondente contactada com a ligação de proteína na presença do composto de teste.

Os métodos da invenção também podem ser empregues na detecção, em materiais de teste, dos por exemplo, como a parte da pesquisa, diagnóstico, e/ou terapia). Por exemplo, os ADDLs ocasionam uma modificação morfológica rápida em células de B103 privadas de soro, e também activam a actividade da quinase de Fyn nestas células ao longo de 30 minutos de tratamento com ADDL (dados não mostrados) . Os ADDLs também induzem a formação de complexo rápida entre o Fyn e a quinase de adesão focal (FAK; Zhang et al., Neurosci. Letters, 211, 1-4, 1996), e a deslocação de várias proteína fosforiladas e de complexo de Fyn-Fak a uma fracção Insolúvel de Triton (Berg et al., J. Neurosci. Res., 50, 979-989, 1997). Isto sugere que o Fyn e outros caminhos de sinalização activados estão envolvidos no processo neurodegenerativo induzido pelos ADDLs. Isto foi confirmado por experiências em culturas de fatias cerebrais de ratos geneticamente alterados a que falta um gene fyn funcional, em que a adição de ADDLs resultou em neurotoxicidade não aumentada em comparação com controlos de veículo.

Por isso, os compostos que bloqueiam uma ou várias das funções de Fyn, ou a relocalização de Fyn, a saber por impacto nos ADDLs, podem ser fármacos neuroprotectores importantes para a doença de 37

Alzheímer. Semelhantemente quando os ADDLs são adicionados a culturas de astrócitos primários, os astrócitos tornam-se activados e o ARNm para várias proteínas, incluindo o IL-1, a sintase de óxido nítrico induzível, o Apo E, o Apo J e a al-antiquimotripsina tornam-se elevados. Estes fenómenos desejavelmente são empregues num método para detectar num material de teste a ligação de proteína do ADDL. Tais métodos opcionalmente compreendem: (a) fazer contactar o material de teste com um anticorpo (por exemplo, o anticorpo de 6E10 ou um outro anticorpo); e (b) detectar a ligação da ligação de proteína do anticorpo.

Semelhantemente o método desejavelmente pode ser empregue em que: (a) o material de teste é contactado com as células do neuroblastoma privadas de soro (por exemplo, as células do neuroblastoma de B103 ) ; e (b) as modificações morfológicas nas células são medidas por se comparar a morfologia das células contra as células do neuroblastoma que não foram contactadas com o material de teste. 0 método de um modo preferido também pode ser empregue em que: (a) o material de teste é contactado com culturas de fatias cerebrais; e (b) a morte da célula cerebral é medida em comparação contra as 38 culturas de fatias cerebrais que não foram contactadas com o material de teste. 0 método além disso desejavelmente pode ser conduzido em que: (a) o material de teste é contactado com as células do neuroblastoma (por exemplo, as células do neuroblastoma de B1Q3); e (b) os aumentos na actividade da quinase de fyn são medidos por se comparar a actividade da quinase de fyn nas células contra a actividade da quinase fyn em células do neuroblastoma que não foram contactadas com o referido material de teste. Em particular, a actividade da quinase de Fyn pode ser comparada fazendo uso de um conjunto comercialmente por exemplo, o Conjunto #QIA-28 da firma Oncogene Research Products, Cambridge, Mass.) ou per se utilizar um ensaio análogo ao descrito em Borowski et ai., J. Biochem. (Tóquio), 115, 825-829, 1994.

Ainda numa outra forma de realização preferida do método para detectar os ADDLs no material de teste, o método desejavelmente compreende: (a) contactar o material de teste com culturas de astrócitos primários; e (b) a determinação da activação dos astrócitos em comparação com culturas de astrócitos primários que não foram contactados com o material de teste. Numa variação deste método, o método 39 opcionalmente compreende: (a) contactar o material de teste com culturas de astrócitos primários; e (b) a medição nos astrócitos aumenta no ARNm para as proteínas seleccionadas a partir do grupo que consiste de interleucina-1, sintase de óxido nítrico induzível, Apo E, Apo J, e al-antiquimotripsina por comparação com os níveis de ARNm nos astrócitos contra os níveis de ARNm correspondentes em culturas de astrócitos primários que não foram contactados com o material de teste. Há, naturalmente, outros métodos de ensaio, e variações adicionais dos descritos acima que seriam evidentes a um especialista na técnica, em particular com vista à revelação das especificação aqui divulgadas.

Assim, claramente, os ADDLs de acordo com a presente invenção têm utilidade ín vitro. Tais ADDLs podem ser utilizados ínter alia como um instrumento de pesquisa no estudo da ligação e da interacção do ADDL dentro das células e num método de ensaio da actividade do ADDL. Semelhantemente os ADDLs, e os estudos da formação de ADDL, actividade e modulação podem ser empregues in vivo.

Em particular, os compostos identificados que utilizam os métodos da presente invenção podem ser usados para tratar qualquer pessoa com um número cie doenças, perturbações, ou condições que resultam 40 em défice na cognição ou aprendizagem (isto é, devido a uma falha de memória), e/ou um défice na própria memória. Tal tratamento ou prevenção podem ser efectuados através da administração de compostos que previnem a formação e/ou a actividade dos ADDLs, ou que modulam (isto é, aumentam ou diminuem a actividade, desejavelmente como uma consequência do impacto dos ADDLs) os agentes de célula com os quais os ADDLs interagem (por exemplo, os assim chamados eventos "a jusante"). Tais compostos que têm a capacidade de impactar os ADDLs são aqui referidos como "compostos que modulam o ADDL". Os compostos que modulam o ADDL não só podem actuar numa forma negativa, mas também, em alguns casos de um modo preferido são empregues para aumentar a formação e/ou a actividade dos ADDLs.

Desejavelmente, quando empregue in vivo, o método pode ser empregue para proteger um animal contra reduções na cognição, na aprendizagem ou na memória devido aos efeitos da ligação de proteína do ADDL. Este método compreende a administração de um composto que bloqueia a formação ou a actividade dos ADDLs. Semelhantemente ã extensão que os défices em cognição, aprendizagem e/ou memória resultam devido à formação e/ou à actividade do ADDL, tais défices podem ser invertidos ou restabelecidos uma vez que a actividade (e/ou a formação) de ADDLs é bloqueada. A invenção fornece assim de um modo preferido um 41 método para inverter (ou restabelecer) num animal, a diminuição em cognição, aprendizagem ou memória devido aos efeitos de uma ligação de proteína de acordo com a invenção. Este método compreende de um modo preferido o bloqueio da formação ou da actividade dos ADDLs.

Em particular, este método desejavelmente pode ser aplicado no tratamento ou na prevenção de uma doença, perturbação, ou condição que se manifesta como um défice em cognição, aprendizagem e/ou memória e o qual é devido à formação ou actividade do ADDL, especialmente uma doença, perturbação, ou condição seleccionada a partir do grupo que consiste da doença de Alzheimer, da síndroma de Down no adulto (isto é, depois da idade de 40 anos), e demência senil.

Também, este método desejavelmente pode ser aplicado no tratamento ou na prevenção dos primeiros efeitos deletérios na actividade celular, cognição, aprendizagem, e memória que podem ser evidentes antes do desenvolvimento da doença, perturbação, ou da própria condição, e cujos efeitos deletérios podem contribuir para o desenvolvimento de, ou em último caso, constituir a doença, a perturbação, ou a própria condição. Em particular, o método de um modo preferido pode ser aplicado no tratamento ou na prevenção do primeiro mau funcionamento das células nervosas ou outras células cerebrais que podem resultar como uma consequência da formação ou 42 da actividade do ADDL. Semelhantemente o método de um modo preferido pode ser aplicado no tratamento ou na prevenção do défice da memória focal (FMD) tal como foi descrito na literatura (por exemplo, Linn et al., P.rch. Neurol., 52, 485-490, 1995), no caso de tais FMD serem devidos à formação ou à actividade do ADDL. O método além disso desejavelmente pode ser empregue no tratamento ou na prevenção da sinalização neuronal aberrante induzida pelo ADDL, o impedimento de elevada ordem da capacidade de escrever (por exemplo, Snowdon et al., JAMA, 275, 528-532, 1996) ou outra função cognitiva de ordem elevada, as reduções em (ou a ausência de) potenciação a longo prazo, que se segue como uma consequência da formação ou da actividade do ADDL.

De acordo com esta invenção, "a sinalização neuronal aberrante induzida por ADDL" pode ser medida por vários meios. Por exemplo, para a sinalização neuronal normal (bem como a observação de uma resposta à potenciação a longo prazo), parece que entre outras coisas, a quinase de Fyn deve ser activada, a quinase de Fyn deve fosforilar o canal de NMDA (Miyakawa et al., Science, 278, 698-701, 1997; Grant, J Physiol Paris, 90, 337-338, 1996), e o Fyn deve estar presente na posição celular apropriada (o qual pode ser impedido pela formação do complexo de Fyn-FAK, por exemplo, como ocorre em certas reorganizações do citosqueieto induzidas pelo ADDL). Baseado nisto, a sinalização neuronal aberrante induzida 43 pelo ADDL (a qual é um mau funcionamento da sinalização que é induzida pela activação aberrante de caminhos celulares pe los ADDLs) e o seu conhecimento pode ser empregue nos métodos da invenção, tal como seria óbvio para um especialista na técnica. Por exemplo, a sinalização de célula aberrante induzida por ADDL pode ser avaliada (por exemplo, como uma consequência de contactar as células nervosas com os ADDLs, os quais podem ser além disso ser conduzidos na presença ou na ausência de compostos a serem testados para a actividade de modulação do ADDL) usando qualquer destas medidas, ou tal como seria evidente a um especialista na técnica, por exemplo, a activação da quinase de Fyn (ou a sua alteração), a formação de complexo de Fyn-FAK (ou a sua alteração), a reorganização do citosqueleto (ou a sua alteração), a localização subcelular da quinase de Fyn (ou a sua alteração), a fosforilação da quinase de Fyn do canal de NMDA (ou a sua alteração).

Também, os próprios ADDLs podem ser aplicados nc tratamento. Foi descoberto que estas novas ligações aqui descritas têm numerosos efeitos .inesperados em células que de modo conceptível podem ser aplicadas para a terapia. Por exemplo, os ADDLs activam as células endoteliais, cujas células endoteliaís são conhecidas, entre outras coisas para interagirem com as células vasculares. Ao longo destas linhas, os ADDLs podem ser empregues, por exemple, na cura de feridas. Também, por meio de exemplo, a Toxina Botulinum de Tipo A 44 (BoTox) é um agente de bloqueio da ligação neuromuscular produzido pela bactéria Clostridium botulinum que actua por bloquear a libertação da acetilcolina neurotransmissora. 0 Botox provou ser benéfico no tratamento de neutralizar os espasmos musculares, incluindo a distensão. Os próprios ADDLs teoricamente podem ser aplicados quer para ordenar a função da célula neural ou, para destruir selectivamente as células neuronais visadas (por exemplo, em casos do cancro, por exemple do sistema nervoso central, em particular no cérebro). Os ADDLs parecem além disso vantajosos neste sentido dado em que eles têm efeitos precoces em células, e dado que o seu efeito em células (à parte do seu efeito de matar a célula) parece ser reversível.

Como discutido em cima, os compostos de modulação do ADDL da presente invenção, bem como os próprios ADDLs, podem ser empregues para contactar com células quer in vitro ou in vivo. De acordo com a invenção, uma célula pode ser qualquer célula, e, de um modo preferido, é uma célula eucariótica. Uma célula eucariótica é uma célula que tipicamente possui em alguma etapa da sua vida um núcleo rodeado por uma membrana nuclear. De um modo preferido a célula eucariótica é de uma espécie multicelular (por exemplo, ao contrário de uma célula de levedura unicelular), e, de um modo mesmo mais preferido, é uma célula de mamífero (opcionalmente humano). No entanto, o método também pode ser efectivamente levado 45 a cabo por se utilizar uma grande variedade de tipos de célula diferentes como as células das aves, e as células mamíferas incluindo mas não limitadas ao roedor, primata (tal como o chimpanzé, o macaco, o símio, o gorila, o orangotango, ou o gibão), felino, canino, ungulado (tal como o ruminante ou o porco), bem como, em particular, as células humanas. Os tipos de células preferidas são células formadas no cérebro, incluindo as células neuronais e as células gliais. Um tipo de célula especialmente preferido de acordo com a invenção é uma célula neural (quer normal ou aberrante, por exemplo, transformada ou cancerosa). Quando empregue na cultura de tecido, desejavelmente a célula neural é uma célula de neuroblastoma.

Uma célula pode estar presente como uma entidade única, ou pode ser parte de um grupo maior de células . Um tal "grupo maior de células" pode compreender, por exemplo, uma cultura de célula (quer misturada ou pura), um tecido (por exemplo, tecido neural ou outro), um órgão (por exemplo, o cérebro ou outros órgãos), um sistema de órgão (por exemplo, o sistema nervoso ou outro sistema de órgão) , ou um organismo (por exemplo, um mamífero, ou semelhante). De um modo preferido, os órgãos/tecidos/células de interesse no contexto da invenção são do sistema nervoso central (por exemplo, são células neuronais). 46

Também, de acordo com a invenção "contactar" compreende qualquer meio pelo qual estes agentes fisicamente tocam uma célula. 0 método não é dependente de qualquer meio particular de introdução e não deve ser assim interpretado. Os meios da introdução são bem conhecidos dos especialistas na técnica, e também são aqui exemplificados. Consequentemente, a introdução pode ser efectuada, por exemplo, quer in vítro (por exemplo, num método de terapia de tipo ex vivo ou em estudos de cultura de tecido) ou in vivo. Outros métodos são também disponíveis e são conhecidos dos especialistas na técnica.

Tal "contacto" pode ser feito por qualquer meio conhecido dc-s especialistas na técnica, e aqui descrito, pelo qual o toque evidente ou a tangência mútua do ADDLs e dcs compostos de modulação do ADDL e a célula podem ser efectuados. Por exemplo, o contacto pode ser feito por se misturarem estes elementos num pequeno volume da mesma solução. Opcionalmente, os elementos podem ser além disso covalentemente ligados, por exemplo, por meios químicos conhecidos dos especialistas na técnica, ou outros meios, ou de um modo preferido podem ser ligados por meio de interseções não covalentes (por exemplo, ligações iónícas, ligações de hidrogénio, forças de Van der Waals, e/ou interaeções não polares). Em comparação, a célula a ser afectada e o ADDL ou o composto de modulação do ADDL não tem de ser necessariamente posta em contacto num pequeno 47 volume, como, por exemplo, em casos onde o ADDL ou o composto de modulação do ADDL é administrado a um hospedeiro, e o complexo move-se através da circulação sanguínea ou outro fluido corporal tal como o fluido cerebrospinal à célula com a qual se liga. 0 contacto da célula com um ADDL ou com o composto de modulação do ADDL às vezes é feito antes, durante, ou depois de um outro composto de interesse ser administrado. Desejavelmente este contacto é feito tal que haja pelo menos alguma quantidade de tempo em que os agentes co-administrados exerçam ao mesmo tempo os seus efeitos numa célula ou no ADDL.

Um especialista na técnica avaliará que os métodos de administração convenientes de um agente (por exemplo, um ADDL ou um composto de modulação de ADDL) da presente invenção a um animal para objectivos de terapia e/ou de diagnóstico, pesquisa ou estudo são disponíveis, e, embora mais do que uma via possa ser usada para a administração, uma via particular pode fornecer uma reacção mais imediata e mais eficaz do que uma outra via. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis também são bem conhecidos dos que são especialistas na técnica, e são rapidamente disponíveis. A escolha do excipiente será determinada em parte pelo método particular usado para administrar o agente. Consequentemente, há uma grande variedade de formulações convenientes para utilização no contexto da presente invenção. Os métodos e excipientes seguintes são simplesmente 48 exemplificativos e não são de modo nenhum restritivos.

As formulações convenientes para a administração oral podem consistir de (a) soluções líquidas, tal como uma quantidade eficaz do composto dissolvido em diluentes, tal como água, salina, ou sumo de laranja; (b) cápsulas, saquetas ou comprimidos, contendo cada um uma quantidade predeterminada do ingrediente activo, como sólidos ou grânulos; (c) suspensões num liquido apropriado; e (d) emulsões convenientes. As formas de comprimido podem incluir um ou mais de lactose, manitol, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, acácia, qelatina, dióxido de silicone coloidal, croscarmelose de sódio, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico, e outros excipientes, corantes, diluentes, agentes tampão, agentes de humidifícaçâo, conservantes, agentes de saber, e excipientes farmacologicamente compatíveis. As formas de losango podem compreender o ingrediente activo num sabor, normalmente sacarose e acácia ou tragacante, bem como pastilhas que compreendem o ingrediente activo em uma base inerte, tal ccmo a gelatina e glicerina, emulsões, géis, e semelhantes que contêm, em adição ao ingrediente activo, tais excipientes como são conhecidos na técnica.

Um agente da presente invenção, sozinho ou em combinação com outros ingredientes convenientes, pode ser feito em formulações de 49 aerossol a serem administradas por via de inalação. Estas formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores pressurizados aceitáveis, tal como o diclorodifluorometano, propano, azoto, e semelhantes. Eles também podem ser formulados como produtos farmacêuticos para preparações não pressionadas tais como num nebulizador ou num atomizador.

As formulações convenientes para a administração parentérica são preferidas de acordo com a invenção e incluem soluções de injecçâo estéreis isotónicas, aquosas e não aquosas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, e solutos que produzem a formulação isotónica com o sangue do recipiente desejado, e suspensões estéreis aquosas e nâo aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizadores, agentes de espessamento, estabilizadores, e conservantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose individual ou de várias doses seladas, tais como ampolas e frascos, e podem ser armazenadas numa condição de congelado a vácuo (liofilizado) que necessita só da adição do excipiente de liquido estéril, por exemplo, água, para injecções, imediatamente antes da utilização. As soluções de injecçâo extemporâneas e as suspensões podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos, e comprimidos do tipo anteriormente descrito. 50 A dose administrada a um animal, em particular a um ser humano, no contexto da presente invenção vai variar com o agente de interesse, a composição empregue, o método de administração, e o local particular e o organismo a ser tratado. No entanto, de um modo preferido uma dose que corresponde a uma quantidade eficaz de um agente (por exemplo, um ADDL ou um composto de modulação de ADDL de acordo com a invenção) é empregue. Uma "quantidade eficaz" é aquela que é suficiente para produzir o efeito desejado num hospedeiro, o qual pode ser controlado por se utilizarem vários pontos finais conhecidos dos especialistas na técnica. Alguns exemplos de efeitos desejados incluem, mas não são limitados a, um efeito na aprendizagem, na memória, na resposta de LTP, na neurotoxicidade, na formação de ADDL, na ligação do receptor de ADDL, na ligação de anticorpo, nas modificações morfológicas da célula, na actividade da quinase de Fyn, na activação do astrócito, e as modificações em níveis de ARNm para as proteínas tais como a interleucina-1, a sintase do óxido nítrico induzível, o Apo E, o Apo J, e a al-antiquimotrípsina. Estes métodos descritos não são de nenhuma maneira inclusivos, e os métodos adicionais para ajustar a aplicação específica serão evidentes do especialista quotidiano.

Além disso, com determinadas aplicações (por exemplo, quer in vítro ou in vivo) a dose real e a agenda de administração de ADDLs ou de compostos de modulação de ADDL podem variar dependendo se a 51 composição é administrada em combinação com outras composições farmacêuticas, ou dependendo de diferenças interindividuais em farmacocinéticos, na disposição do fármaco, e no metabolismo. Semelhantemente, as quantidades podem variar em aplicações in vitro dependendo do is o ADDL ou o composto de modulação do ADDL é transferido para a cultura. Um especialista na técnica facilmente pode fazer qualquer ajuste necessário de acordo com as exigências da situação particular.

Exemplos

As descrições precedentes (bem como aquelas que se seguem) são só exemplares. Outras aplicações do método e os constituintes da presente invenção serão evidentes a um especialista na técnica. Assim, os exemplos seguintes ilustram além disso a presente invenção mas, naturalmente, não devem ser interpretados como limitando o seu âmbito por qualquer forma.

Exemplo 1: Preparação de Oligómeros de β Ãmilóide

De acordo com a invenção, os ADDLs foram preparados por se dissolver 1 mg de β ãmilóide 1-42 sólido (por exemplo, sintetizado como descrito em Lambert et ai., J. Neurosci. Res., 39, 377-395, 1994) em 4 4 pL de DMSO anidro. Este 5 mM de solução foi depois diluída em meio de F12 frio (4 °C) (Gibco BRL, da firma Life

Technologies) a um volume total de 2,20 mL (diluição de 50 vezes), 52 e vortexada durante cerca de 30 segundos, A mistura foi deixada a incubar a cerca de 0 °C a cerca de 8 °C durante cerca de 24 horas, seguida por centrifugação a 14 000 g durante cerca de 10 minutos a cerca de 4 °C. O sobrenadante foi diluído por factores de 1:10 a 1:10 000 no meio definido determinado, antes da incubação com culturas de fatias cerebrais, culturas de célula ou preparações de proteínas de ligação. Em geral, no entanto, os ADDLs foram formados a uma concentração da proteína de Αβ de 100 μΜ. Tipicamente, a concentração mais alta usada para experiências é de 10 μΜ e, em alguns casos, os ADDLs (medidos como a concentração inicial de Αβ) foram diluídos (por exemplo, em meios de cultura de célula) a 1 nM. Para análise por microscopia de força atómica (AFM), 20 pL de aliquota de 1:100 de diluição foi aplicada à superfície de um disco de mica recentemente clivado e analisada. Outras manipulações foram como descritas como se segue, ou como é evidente.

Alternadamente, a formação de ADDL foi executada como descrito em cima, com a excepção de que o meio de F12 foi substituído por um tampão (isto é, "meio de F12 substituto") contendo os componentes seguintes: N, N-dímetilglícina (766 mg/L), D-glicose (1,802 g/L) , cloreto de cálcio (33 mg/L), penta-hidrato de sulfato de cobre (25 mg/L), hepta-hídrato de sulfato de ferro (II) (0,8 mg/L), cloreto de potássio (223 mg/L), cloreto de magnésio (57 mg/L), cloreto de sódio (7,6 g/L), bicarbonato de sódio (1,18 g/L), fosfato de 53 hidrogénio de dissódio (142 mg/L), e hepta-hidrato de sulfato de zinco (0,9 mg/L). O pH do tampão foi ajustado a 8,0 por se utilizar 0,1 M de hidróxido de sódio.

Exemplo 2: Ligação Transversal de Oligómeros de β Amilóide O glutaraideido tem sido usado com sucesso em vários sistemas bioquímicos. 0 glutaraideido tende a ligar transversalmente proteínas que estão directamente no contacto, ao contrário da reacção não especifica com altas concentrações de proteína monomérica. Neste a ligação transversal de β amilóide comandada pelo glutaraideido foi investigada. A preparação de oligómero foi executada como descrito no exemplo 1, com a utilização do meio de F12 substituto. O sobrenadante que foi obtido a seguir à centrifugação (e em alguns casos, fraccionamento) foi tratado com 0,22 mL de 25 % de uma solução aquosa de glutaraideido (Aldrich), seguido por 0,67 mL de 0,175 M de boro-hidreto de sódio em 0,1 M de NaOH (de acordo com o método de Levite, Neurobiologia do Envelhecimento, 1995) . A mistura foi agitada a 4 °C durante 15 minutos e foi extinta através da adição de 1,67 mL de 20 o. "O de sacarose aquosa. A mistura frt "1 iui concentrada 5 vezes num SpeedVac e dializada pa ra retirar os componentes mais pequenos do que 1 kD. 0 material foi analisado por SDS PAGE. A cromatografia de filtração de gel foi executada de acordo com 0 54 seguinte: Uma coluna de 3,2/3,0 de Superose 75PC (Pharmacia) foi equilibrada com 0,15 % de tampão de carbonato de hidrogénio de amónio filtrado e desgaseifiçado (pH =7,8) a uma taxa de fluxo de 0,02 rriL/min ao longo de 18 h â temperatura ambiente. Δ taxa de fluxo foi modificada para 0,04 mL/min e 20 rriL do solvente foi eluído. 50 microlitros da solução de reacção foram carregados na coluna e a taxa de fluxo foi retomada a 0,04 mL/min. A eluição do composto foi controlada através de detecção de UV a 220 nm, e fracções de 0,5-1,0 mL foram reunidas durante o curso da cromatografia. A fracção No. 3, correspondente ao terceiro pico de absorvência de UV foi isolada e demonstrada por AFM como contendo glóbulos 4,9 +/- 0,8 nm (por análise de largura). Esta fracção foi altamente neurotóxica quando contactada com neurónios de fatias cerebrais, como descrito nos exemplos que se seguem.

Exemplo 3: Caracterização por tamanho dos ADDLs t

Este exemplo estabelece a caracterização de tamanho de ADDLs formados como no Exemplo 1, e a utilização de uma variedade de métodos (por exemplo, a electroforese de gel nativo, a electroforese de gel de poliacrilamida de SDS, AFM, fraccionamento do campe de fluxo, e o imuno-reconhecimento).

O AFM foi executado essencialmente como descrito anteriormente (per exemplo, Stine et a/., J. Protein Chem., 15, 193-203, 1996). A saber, as imagens foram obtidas por se utilizar um microscópio de força Atómico Multimodo Nanoscope Illa da firma Digital Instruments (Santa Barbara, Califórnia.) que usa um mapeador J com variação de xy de 150 μ. 0 Modo de Exploração foi empregue para todas as imagens por se utilizarem Nanossondas TESP com silicone entalhado (Digital Instruments). Os dados de AFM são analisados usando o programa de computador Nanoscope Illa e o programa de computador de análise de forma de onda IGOR Pro®. Para análise de AFM, exames de 4 um (isto é, a avaliação de um quadrado de 4 pm x 4 pm) foram conduzidos. Tipicamente, as dimensões relatadas foram obtidas através da análise de secção, e onde a análise de largura foi empregue, está especificado. A secção e a análise de largura estão em módulos de análise separados no programa de computador Nanoscope Illa. Geralmente, para a análise de ADDL, há um desvio sistemático entre os tamanhos obtidos através da análise de secção e os obtidos através da análise de largura. A saber, para um exame de 4 pm, a análise de secção produz alturas que são normaImente de cerca de 0,5 nm mais altas, resultando assim num desvio de cerca de 0,5 nm nos valores obtidos para os tamanhos dos glóbulos. A análise através de electroforese de gel foi executada em 15 % de géis de poliacrilamida e visualizada por mancheamento azul de Coomassie. Qs ADDLs foram resolvidos em 4 - 20 % de géis de tris-glicína sob condições de não desnaturação (Novex). A electroforese b b foi executada a 20 rnA durante aproximadamente 1,5 horas. A proteína foi resolvida com SDS-PAGE como descrito em Zhang et al., J. Biol. Chem.r 269, 25247-25250, 1994. A proteína foi depois visualizada utilizando mancha de prata (por exemple, como descrito em Sherchenko et al., Anal. Chem., 68, 850-858, 1996). As proteínas de gel foram ambas nativas e os géis de SDS foram transferidos para membranas de nitrocelulose de acordo com Zhang et al. (J, Biol. Chem., 269, 25247-50, 1994). As imuno-manchas foram executadas com anticorpo 6E10 bíotínilado (Senetak, Inc., St. Louis, Missouri) em 1:5000 e visualizadas utilizando ECL (Amersham). Tipicamente, os géis foram mapeados usando um densitómetro. Isto permitiu a provisão das imagens geradas por computador dos géis (por exemplo, versus fotografias dos próprios géis). A caracterização de tamanho de ADDLs por análise de secção AFM (por exemplo, como descrito em Stine et al., J. Protein Chem., 15, 4 193-203, 1996) ou a análise de largura (programa de computador

Nanoscope III) indicou que as espécies predominantes foram glóbulos de cerca de 4,7 nm a cerca de 6,2 nrn ao longo do eixo z. A comparação com pequenas proteínas globulares (monómero de Άβ 1-40, aprotinina, bFGF, anidrase carbónica) sugeriu que os ADDLs tinham massa entre 17 - 42 kD. 0 que parecem ser espécies distintas, podem ser reconhecidas. Estes parecem corresponder a glóbulos de dimensões de cerca de 4,9 nm a cerca de 5,4 nm, de cerca de 5,4 nm 57 a cerca de 5,7 nm, e de cerca de 5,7 nm a cerca de 6,2 nm. Os glóbulos de dimensões de cerca de 4,9 - 5,4 nm e de 5,7 - 6,2 nm parecem compreender cerca de 50 % de glóbulos.

Em harmonia com a análise de AFM, as imuno-manchas de SDS-PAGE de ADDLs identificaram oligómeros de Αβ de cerca de 17 kD a cerca de 22 kD, com abundante 4 kD de monómero presente, presumivelmente um produto de decomposição. Compatível com esta interpretação, os géis de poliacrilamida nâo desnaturados de ADDLs mostram raros monómeros, com uma banda primária perto de 30 kD, uma banda menos abundante a ~17 kD, e nenhuma evidência de fibrilos ou agregados. As imagens geradas por computador de um gel nativo manchado por prata e um gel de poliacrilamida de SDS manchado por Coomassie são estabelecidos na FIG. 1 e Na FIG. 2, respectivamente. A correspondência entre o SDS e os géis não desnaturados confirma que o pequeno tamanho oligoméríco dos ADDLs não foi devido à acção detergente. Os oligómeros vistos em preparações de ADDL foram mais pequenos do que a clusterína (Mr 8 0 kD, 40 kD em géis desnaturados), como esperado a partir da utilização de concentrações de clusterína baixas (1/40 relativamente a Αβ, que impediu a associação de Αβ como 1:1 de complexos de Αβ-clusterína).

Uma preparação de ADDL de acordo com a invenção foi fraccionada numa coluna de Superdex 75 (Pharmacia, coluna de Superose 75PC 58 3,2/3,0 }. A fracção que compreende os ADDLs foi a terceira fracção de absorvêncía de UV que elui da coluna e foi analisada através de electroforese de gel de poliacrilamida de SDS e por A FM. Uma análise de A FM representativa da fracção 3 é representada na FIG. 3. O fraccicnamento resultou em maior homogeneidade para os ADDLs, com a maioria dos glóbulos a terem dimensões de cerca de 4,9 nm a cerca de 5,4 nm. A electroforese de gel de poliacrilamida de SDS da fracção demonstrou uma banda mais baixa pesada que correspondente à forma de monómero/dímero de Αβ. Como também observado para a preparação de ADDLs não fraccionada, isto parece ser um produto de decomposição dos ADDLs. O carregamento mais pesado da fracção revelou uma banda ampla de tamanho maior (possivelmente um par) . Isto além disso confirma a estabilidade das estruturas de Αβ oligoméricas não fibrilares relativamente a SDS.

Exemplo 4: Tratamento de Clusterina de β Amilóide

Embora tenha sido proposto que as estruturas fibrilares representam a forma tóxica de Αβ (Lcrenzo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 91, 12243-12247, 1994; Hewlett et al., Neurodegen, 4, 23-32, 1995), novas neurotoxinas que não se comportam como fibrilos sedimentáveis vão-se formar quando ο Αβ 1-42 é incubado com doses baixas de clusterina, que também é conhecido como "Apo J" (Oda et al., Exper. Neurol., 136, 22-31, 1995; Oda et al., Biochem. Biophvs. Res. 59

Commun., 204, 1131-1136, 1994). Para testar se estas toxinas de sedimentação lenta poderiam ainda conter fibrilos pequenos ou nascentes, as preparações de Αβ tratadas com clusterina foram examinadas através de microscopia de força atómica. 0 tratamento com clusterina foi executado como descrito em Oda et ai. (Exper. Neurol., 136, 22-31, 1995) basicamente por se adicionar a clusterina na incubação descrita no Exemplo 1. Alternativamente, Αβ 1-42 de partida pode ser dissolvido em 0,1 N de HC1, em vez de DMSO, e este Αβ 1-42 de partida pode mesmo ter estruturas fibrilares no início. No entanto, a incubação com a clusterina durante 24 horas à temperatura ambiente de 37 °C resultou em preparações que foram predominantemente livres de fibrilos, consistentes com a sua sedimentação lenta. Isto foi confirmado através de experiências que mostram que a formação de fibrilo diminui à medida que a quantidade de clusterina adicionada aumenta.

As preparações que resultam do tratamento com clusterina compreenderam exclusivamente pequenas estruturas globulares de cerca de 5 - 6 nm em tamanho como determinado através de análise de A FM dos ADDLs fraccíonados numa coluna de gel de Superdex 75. Os resultados equivalentes foram obtidos através da microscopia de electrões convencional. Em contraste c Αβ 1-42 que se tinha auto-associado sob condições padrão (Snyder et al., Biophys. J, 67, 60 1216-28, 1994} na ausência de clusterina mostrou antes de mais nada, espécies fibrilares, não difusiveis, grandes. Além disso, as preparações de ADDL resultantes foram passadas através de 10 kD de uma membrana isolada Centriccn e analisadas em gel gradiente de poliacrilamida de SDS. Como pode ser visto na FIG. 4, só o monómero passa através do filtro 10 de Centricon, ao passo que os ADDLs são conservados pelo filtro. 0 monómero encontrado depois da separação só pode ser formado pelas espécies de maior peso molecular retidas pelo filtro.

Esses resultados confirmam que as preparações de ADDL tóxico compreendem pequenos oligómeros livres de fibrilos de Αβ 1-42, e que os ADDLs podem ser obtidos através de tratamento apropriado com clusterina do β amilóide.

Exemplo 5: Formação Fisiológica de ADDLs

As fracções tóxicas no Exemplo 4 podem compreender estruturas raras que contêm Αβ oligoméríco e clusterina. Enquanto que Oda et al. (Expei. Neurol., 136, 22-31, 1995) relatou que a clusterina foi verificada como aumentando a toxicidade de soluções de Αβ 1-42, outros verificaram que a clusterina a níveis estequiométricos protege contra a toxicidade de Αβ 1-40 (Boggs et al., J-Neurochem., 67, 1324-1327, 1997). Consequentemente, a formação de ADDL na ausência de clusterina além disso foi caracterizada neste 61

Exemplo.

Quando as soluções de Αβ 1-42 monomérico foram mantidas a baixa temperatura num meio apropriado, a formação de fibrilos de Αβ sedimentáveis foi quase completamente bloqueada. Αβ, no entanto, realmente auto associou-se nestas soluções de baixa temperatura, formando ADDLs essencialmente indistinguíveis dos acompanhados por clusterina. Finalmente, os ADDLs também se formaram quando as soluções de Αβ monomérico foram incubadas a37 graus no meio de cultura de fatia cerebral mas a uma concentração muito baixa (50 nM), indicando um potencial para se formar fisiologicamente. Todas as preparações de ADDL foram relativamente estáveis e não mostraram nenhuma conversão para fibrilos durante as 24 horas de experiências de cultura de tecido.

Estes resultados confirmam que os ADDLs se formam e são estáveis sob condições fisiológicas e sugere que eles da mesma forma podem formar-se e ser estáveis in vivo.

Exemplo 6: Os ADDLS são Neurotoxinas de CNS, Extremamente Potentes, Difusíveis

Se os ADDLs foram induzidos pela clusterina, baixa temperatura, ou baixa concentração de Αβ, os oligómeros estáveis que se formaram foram neurotoxinas potentes. A toxicidade foi examinada em culturas 62 de fatia de cérebro de rato organotípicas, que forneceram um modelo físiologícamente relevante para o CNS maduro. 0 tecido cerebral foi apoiado na interface média de atmosfera por um filtro para manter a alta viabilidade em controlos.

Para estas experiências, as fatias cerebrais foram obtidas a partir das estirpes B6 129 F2 e JR 2385 (Jackson Laboratories) e culturadas como anteriormente descrito (Stoppini et ai., J. Neuroscí. Me th., 37, 173-182, 1991), com modificações. A saber, um rato adulto foi sacrificado através de inalação de dióxido de carbono, seguido por decapitação rápida. A cabeça foi emersa em tampão de dissecação estéril, frio (94 mL de solução de sal equilibrada de Gey, pH 7,2, complementado com 2 mL de 0,5 M de MgCl2, 2 ml de 25 % de glicose, e 2 mL de 1,0 M de Hepes), depois do que o cérebro foi removido e colocado numa placa estéril revestida de Sylgard. O cerebelo foi removido e foi feito um corte a meio para separar os hemisférios cerebrais. Cada hemisfério foi cortado separadamente. 0 hemisfério foi colocado com o corte a meio para baixo e uma fatia de 30 graus do lado dorsal foi feita para orientar o hemisfério. 0 hemisfério foi colado com o lado do corte para baixo na posição do plástico de um cortador de tecido Campden (anteriormente limpo com etanol) e emerso no tampão estéril de gelo frio. As fatias de 200 um de espessura foram feitas numa direcção desde o lado até ao meio, reunindo aqueles nos quais c hipocampo 63 era visível.

Cada fatia foi transferida com a extremidade superior de uma pipeta estéril para um pequeno prato de petri que contém o Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contém 10 % de soro fetal de bezerro, 2 % de S/P/F (estreptomicina, penicilina, e fungizona; Life Technologies (Gibco, BRL), Gaithersburg, Md.), observada com um microscópio para verificar a presença do hipocampo, e colocada numa inserção de Millicell-CM (Millipore) num prato de cultura de tecido de cavidade profunda (prato com 6 cavidades, Falcon). Cada cavidade conteve 1,0 mL de meio de crescimento, e normalmente duas fatias estiveram em cada inserção. As fatias foram colocadas numa incubadora (6 % de C02, 100 % de humidade) durante a noite. O meio de crescimento fci removido e as cavidades foram lavadas com 1,0 mL de Hanks BSS quente (Gibco, BRL, Life Technologies). O meio definido (DMEM, suplementos de N2, SPF, por exemplo, como descrito em Bottenstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 76, 514-517, 1979) que contém os oligómeros de β amilóide, com ou sem compostos inibidores, foi adicionado a cada cavidade e a incubação foi continuada durante 24 horas. A morte de célula fci medida usando o conjunto de ensaio LIVE/DEAD® (Molecular Probes, Eugene, Oreg.). Este ensaio de fluorescência de marcação dupla no qual as células vivas sâo detectadas pela 64 presença de uma esterase que cliva a calceina-AM para calceina, resulta em uma flucrescência verde. As células mortas recolhem o homodímero de etídio, o qual intercala com o ADN e tem uma fluorescência vermelha. 0 ensaio foi executado de acordo com direcçôes do fabricante a 2 μΜ de homodímero de etídio e 4 μΜ de calceina. As imagens foram obtidas ao fim de 30 minutos usando um microscópio Nikon Diaphot equipado com epifluorescência. 0 sistema de análise de imagem MetaMorph (Universal Imaging Corporation, Filadélfia, Pa.) foi usado para quantificar o número e/ou a área de células que mostra fluorescência verde ou vermelha.

Para estas experiências, os ADDLs estiveram presentes durante 24 horas a um máximo de 5 μΜ de dose de Αβ total (isto é, ο Αβ total nunca foi mais do que 5 μΜ em qualquer experiência de ADDL) . A morte de célula, como mostrado por "mancheamento amarelo falso", foi quase completamente confinada à camada piramidal (CA 3-4) e circunvolução dentada (DG) sugerindo fortemente que os neurónios principais do hipocampo (células piramidais e de grânulo, respectivamente) são os alvos da toxicidade induzida por ADDL. Além disso, a viabilidade glia não é afectada por um tratamento de ADDL de 24 horas do glia do cérebro de rato primário, como determinado por exclusão de tripano azul e ensaio de MTT (Finch et al., inédito) . A circunvolução dentada (DG) e as regiões de CA3 foram especialmente sensíveis e mostraram que a morte de célula evocada 65 por ADDL em cada cultura obtida de animais envelheceu de P20 (animais desmamados) a P84 (adulto jovem). Até 40 % das células nesta região morrem depois da exposição crónica a ADDLs. O modelo da morte neuronal não foi idêntico ao observado para o NMDA, que matou os neurónios em DG e em CAI mas dispensou o CA3.

Algumas culturas das regiões DG e CA3 do hipocampo de animais com mais de 20 dias de idade foram tratadas com preparações convencionais de Αβ fibrilar. Compatível com a natureza não difusível dos fibrilos, nenhuma morte de célula (mancheamento amarelo) foi evidente mesmo em 20 μΜ. O modelo de mancheamento de células vivas nesta cultura verificou que a região de circunvolução de CA3/dentado do hipocampo estava a ser examinada. A extensão da morte de célula observada depois do tratamento convencional de Αβ (isto é, preparações de Αβ fibrilar) foi indistinguível dos controlos negativos em cujas culturas foi dado o meio, ou o meio com o suplemento de clusterina. Em controlos típicos, a morte de célula foi menor de 5 %. De facto, a alta viabilidade em controlos pode ser encontrada até em culturas mantidas vários dias sob uma experiência típica, o qual confirma que a sobrevivência da célula não foi comprometida por condições de cultura padrão.

Uma experiência de resposta de dose foi executada para determinar a potência de ADDLs na evocação de morte de célula. A análise de 66 imagem foi usada para quantificar o mancheamento da célula morta e da célula viva em campos que contêm as áreas de DG/CA 3. A FIG. 5 ilustra a % de células mortas versos as concentração de ADDL medida como a concentração inicial de β amilóide 1-42 (nM). Por causa das dificuldades para quantificar as fatias cerebrais, os resultados não são detalhados o suficiente para determinar o EC5Q com precisão. No entanto, como pode ser visto na FIG. 5, mesmo depois de 1000 vezes de diluição (~5 nM de Αβ), a morte de célula evocada por ADDL foi mais de 20 %. A toxicidade foi observada mesmo com 0,3 nM de ADDLs. Isto contrasta com os resultados obtidos com ο Αβ convencionalmente envelhecido, o qual é tóxico para os neurónios em cultura a cerca de 20 a cerca de 50 μΜ. Estes dados mostram que os ADDLs são eficazes em doses aproximadamente de 1 000 - 10 000 vezes mais pequenas do que os usados em experiências de Αβ fibrilar.

Estes dados de fatias do hipocampo confirmam assim a natureza ultratóxica de ADDLs. Além disso, porque os ADDLs tiveram de passar pelo filtro de suporte da cultura para causar a morte da célula, os resultados validam que os ADDLs são difusíveis, consistentes com o seu pequeno tamanho oligomérico. Também, os métodos aqui apresentados podem ser empregues como um ensaio para as modificações mediadas por ADDL na viabilidade de célula. Em particular, o ensaio pode ser executado através da co-incubação ou da co-administração juntamente com os agentes de ADDLs que potencialmente podem aumentar ou reduzir a formação e/ou a actividade de ADDL. Os resultados obtidos com tal co-incubação ou co-administração podem ser comparados com resultados obtidos com a inclusão de ADDLs sozinhos.

Exemplo 7: Ensaio de Toxicidade de Tensão de MTT Oxidativo -Células de PC12

Este exemplo estabelece um ensaio que pode ser empregue para detectar uma primeira modificação de toxicidade em resposta a oligómeros de β amilóide.

Para estas experiências, as células de PC12 foram passadas a 4 x 1Q4 células/cavidades num prato de cultura de 96 cavidades e feitas crescer durante 24 hora,s em DMEM + 10 % de soro fetal de bezerro +1 % de S/P/F (estreptomicina, penicilina, e fungizona). Os pratos foram tratados com 200 pg/mL de poli-l-lisina durante 2 horas antes da célula ter sido colocada no prato para aumentar a adesão da célula. Um conjunto de seis cavidades foi deixado não tratado e alimentado com meio fresco, enquanto um outro conjunto de cavidades foi tratado com o controle de veículo (PBS que contém 10 % de 0,01 N de HC1, o/n envelhecido em RT) . Os controlos positivos foram tratados com o triton (1 %) e Azída Na (0,1 %} em meio de crescimento normal. Os oligómeros de β amilóide preparados como descrito no Exemplo 1, ou obtidos por cc—incubação com a 68 clusterina, com e sem compostos inibidores presentes, foram adicionados às células durante 24 horas. Depois de 24 horas de incubação, o MTT (0,5 mg/mL) foi adicionado às células durante 2,5 horas (11 pL de 5 mg/mL de armazenado solubilizado em PBS em 100 pL de meio). As células sãs reduzem o MTT num produto colorido azul de formazano. Depois da incubação com o MTT, o meio foi aspirado e 100 pL de 100 % de DMSO foi adicionado para lisar as células e dissolver os cristais azuis. O prato foi incubado durante 15 minutos em RT e lido num leitor de prato (ELISA) em 550 nm.

Os resultados de uma tal experiência são representados na FIG. 6. Como pode ser visto desta figura, as células de controlo não expostas a células de ADDLs ("Cont".), expostas à clusterina sozinha ("Apo J"), e as células expostas a Αβ monomérico ("Αβ”) não mostram nenhuma toxicidade de célula. Por contraste, as células expostas a β amilóide co-agregado com a clusterina e com um dia de idade ("Αβ: Apo J") mostram uma diminuição na redução de MTT, evidenciando uma primeira modificação de toxicidade. As últimas preparações amilóides foram confirmadas por AFM como necessitando de fibrilos amilóides.

Os resultados desta experiência confirmam assim que as preparações de ADDL obtidas através da co-agregação de Αβ mediado por clusterina aumentou a toxicidade. Além disso, os resultados confirmam que a resposta à tensão oxidativa de PC 12 pode ser 69 empregue ccmo um ensaio para detectar as primeiras modificações de célula devidas a ADDLs. 0 ensaio pode ser executado através de co-incubação ou de co-administração juntamente com os agentes de ADDLs que potencialmente podem aumentar ou reduzir a formação e/ou a actividade de ADDL. Os resultados obtidos com tal co-incubação ou co-administração podem ser comparados com os resultados obtidos com a inclusão de ADDLs sozinhos.

Exemplo 8: Ensaio de Toxicidade de Tensão de MTT Oxidativo -Células de HN2

Este exemplo estabelece um ensaio adicional de modificações de célula mediadas por ADDL. A saber, o ensaio de toxicidade de tensão oxidativa de MTT apresentado no exemplo precedente pode ser executado com células de HN2 em vez de células de PC12. Outras células apropriadas podem ser empregues da mesma forma.

Para este ensaio, as células de HN2 foram passadas a 4 x 104 células/cavidade num prato de cultura de 96 cavidades e feitas crescer durante 24 horas em DMEM + 10 % de soro fetal de bezerro + 1 % de S/P/F (estreptomicina, penicilina, e fungizona). Os pratos foram tratados com 200 pg/mL de poli 1-lisina durante 2 horas antes da colocação da célula no prato para aumentar a adesão de célula. As células foram diferenciadas durante 24 - 48 horas com 5 μΜ de ácido retinóico e o crescimento foi além disso inibido com 1 % de 70 soro. Um conjunto de cavidades foi deixado não tratado e ao qual foi dado meio fresco. Um ourro conjunto de cavidades foi tratado com o controlo de veículo (0,2 % de DMSO). Os controlos positivos foram tratados com triton (1 %) e Azida Na (0,1 %) . Os oligómeros de β amilóide preparados como descrito no exemplo 1, com e sem compostos inibidores presentes, foram adicionados às células durante 24 horas. Depois de 24 horas de incubação, o MTT (0,5 mg/mL) foi adicionado às células durante 2,5 horas (11 pL de 5 mg/mL armazenado em 100 pL de meio). Depois da incubação com o MTT, o meio foi aspirado e 100 pL de 100 % de DMSO é adicionado para lisar as células e dissolver os cristais azuis. O prato foi incubado durante 15 minutos a RT e lido num leitor de prato (ELISA) a 550 nm.

* I

Este ensaio pode ser executado da mesma forma através de co-incubação ou de co-administração juntamente com os agentes de t ADDLs que potencialmente podem aumentar ou diminuir a formação e/ou a actividade de ADDL. Os resultados obtidos com tal co-incubação ou co-administração podem ser comparados com os resultados obtidos com a inclusão de ADDLs sozinhos.

Exemplo 9: Morfologia de Célula por Microscopia de Fase

Este exemplo estabelece ainda um outro ensaio de modificações de célula mediadas por ADDL - o ensaio da morfologia de célula através 71 de microscopia de fase.

Para este ensaio, as culturas foram feitas crescer a baixa densidade (confluência de 50 - 60 %) . Para iniciar a experiência, as células foram privadas de soro em meio de F12 durante 1 hora. As células foram depois incubadas durante 3 horas com oligómeros de β amilóide preparados como descrito no exemplo 1, com e sem compostos inibidores adicionados às células, durante 24 horas. Depois de 3 horas, as células foram examinadas para diferenças morfológicas ou fixadas para a marcação de imunofluorescência. As amostras foram examinadas usando o sistema de Análise de Imagem MetaMorph e uma câmara de vídeo MRI (Universal Imaging, Inc.).

Os resultados de tais ensaios são apresentados nos exemplos que se seguem. Em particular, o ensaio pode ser executado através de co-incubação ou de co-administração juntamente com os agentes de ADDLs que potencialmente podem aumentar ou diminuir a formação e/ou a actividade de ADDL. Os resultados obtidos com tal co-incubaçãc ou co-admínistração podem ser comparados com os resultados obtidos com a inclusão de ADDLs sozinhos.

Exemplo 10: Ensaio de Mapeamento de FAC para a Ligação de ADDLs às

Superfícies de Célula

Porque os receptores de superfície de célula foram recentemente 72 identificados em células gliaís de Αβ convencionalmente preparado. (Yan et al., Nature, 382, 685-691, 1996; EI Khoury et ai., Nature, 382, 716-719, 1996), e porque a morte neuronal em doses baixas de ADDL sugeriu o possível envolvimento de mecanismos de sinalização, foram empreendidas experiências para determinar se os locais de ligação na superfície de célula específica em neurónios existe para os ADDLs.

Para a citometria de fluxo, as células foram dissociadas com 0,1 % de tripsina e colocadas num prato pelo menos durante a noite em plástico de cultura de tecido a baixa densidade. As células foram removidas com salina tamponada de fosfato frio (PBS)/0,5 mM de EDTA, lavadas três vezes e ressuspensas em PBS frio de gelo a uma concentração final de 500 000 células/mL. As células foram incubadas em PBS frio de gelo com oligómeros de β amilóide preparados como descrito no Exemplo 1, excepto que 10 % do β amilóide é um análogo do β amilóide 1-42 que contém a biocitina na posição 1 em substituição de aspartato. Os oligómeros com e sem os compostos inibidores presentes foram adicionados às células durante 24 horas. As células foram lavadas duas vezes em PBS frio para retirar os oligómeros do β amilóide não ligados, livres, ressuspensos numa diluição de 1:1 000 de avidina conjugada para f luoresee.ina, e incubadas durante uma hora a 4 °C com agitação suave. Alternadamente, os anticorpos de β amilóide específicos e o 73 anticorpo secundário fluorescente foram empregues em tez da avidina, eliminando a necessidade de se incorporar 10 % do análogo de β amilóide biotinilado. A saber, o anticorpo monocional 6E1Q biotinilado (1 pL Senetec, Inc., St. Louis, Mo.) foi adicionado à suspensão de célula e incubado durante 30 minutos. O anticorpo ligado foi detectado depois da granulação das células e da ressuspenção em 500 pL de PBS, usando estreptavidina conjugada de FITC (1:500, Jackson Laboratories) durante 30 minutos.

As células foram analisadas por um Mapeador Becton-Dickenson de Célula Activada por Fluorescência (FACScan) . 10 000 ou 20 000 eventos foram tipicamente reunidos tanto para reencaminhar a difusão (tamanho) como a intensidade de fluorescência, e os dados foram analisados pelo programa de computador Consort 30 (Becton-Díckinson). A ligação foi quantificada por se multiplicar a fluorescência média pelo número total de eventos, e por se subtrair o valor da fluorescência de célula de fundo na presença de 6E10 e de FITC.

Para estas experiências, a análise de mapeamento de FAC foi feita para comparar a imunoreactividade de ADDL em suspensões de células de levedura de fase de log (uma superfície basicamente de hidrato de carbono) e da linha de célula neuronal de B103 CNS (Schubert et al., Nature, 249, 224-227, 1974). Para as células de B103, a adição 74 de ADDLs causou um aumento maior na fluorescência associada de célula, como mostrado na FIG. 7. O tratamento com tripsina das células de B103 durante 1 minuto eliminou a ligação de ADDL. Ao contrário as células de levedura de controlo (dados não mostrados) não demonstraram nenhuma ligação de ADDL, verificando a selectividade de ADDLs para as proteínas presentes na superfície de célula. As suspensões de células do hipocampo (tecido tripsinizado seguido por uma recuperação metabólica de duas horas) também ligou os ADDLs, mas com um número reduzido de eventos de ligação comparados com as células de B103, como evidenciado pela intensidade de fluorescência reduzida do pico marcado. Isto aparece na FIG. 3 como um desvio à esquerda do pico marcado.

Estes resultados sugerem assim que os ADDLs exercem os seus efeitos por se ligarem a um receptor de superfície de célula específico. Em particular, a sensibilidade da tripsina de células de B103 mostrou que os seus locais d® ligação de ADDL foram as proteínas de superfície de célula e que a ligação foi selectiva para um subconjunto de determinados domínios dentro destas proteínas.

Além disso, o presente ensaio também pode ser empregue corno um ensaio para a ligação de célula mediada por ADDL. Em particular, o ensaio pode ser executado através de co-incubação ou de co-administração juntamente com os agentes de ADDLs que 75 potencialmente podem aumentar ou diminuir a formação e/ou a activídade de ADDL. Os resultados obtidos com tal co-incubação ou co-administração podem ser comparados com os resultados obtidos com a inclusão de ADDLs sozinhos.

Exemplo 11: Inibição da Formação de ADDL por Gossipol

Este exemplo estabelece a maneira na qual a formação de ADDL pode ser inibida por se utilizar, por exemple, o gossipol.

Para estas experiências, os ADDLs foram preparados como descrito no Exemplo 1. 0 gossipol (Aldrich) foi adicionado a uma concentração de 100 μΜ durante a incubação da proteína do Αβ para formar os ADDLs. A preparação resultante foi avaliada para a neurotoxicidade utilizando o conjunto de ensaio LIVE/DEAD® como anteriormente descrito. A quantidade da morte de célula que ocorreu depois de 24 horas de exposição à preparação de gossipol/ADDL foi menor do que 5 %. Isto é comparável com o nível de toxicidade obtida para uma preparação de controle de DMSO correspondente (isto é, 6 %), ou uma preparação de controlo de gossipol que não continha nenhuns ADDLs (isto é, 4 %) .

Estes resultados confirmam assim que os compostos tais como o gossipol podem ser empregues para inibir a formação de ADDL.

Exemplo 12: Inibição da Ligação de ADDL por Péptidos Trlpticos 76

Como a tripsinização da célula de B103 foi verificada que bloqueia a ligação de ADDL subsequente, foram feitas experiências como estabelecido neste exemplo para testar se os fragmentos trípticos libertados a parrir da superfície de célula retardam a actividade de ligação do ADDL.

Os péptidos trípticos foram preparados por se utilizarem células de B103 confluentes de quatro pratos de 100 mm que foram removidos por tripsinização (0,025 %, Life Technologies) durante aproximadamente 3 minutos. O inibidor de tripsina-quimotripsina (Sigma, 0,5 mg/mL em Salina Tamponada de Hank) foi adicionado, e as células foram removidas através de centrifugação a 500 x g duranre 5 minutos. O sobrenadante (~12 mL) foi concentrado a aproximadamente 1,0 mL utilizando um filtro Centricon 3 (Amicon), e foi congelado depois da concentração de proteína ter sido determinada. Para as experiências de bloqueio, os péptidos trípticos concentrados estéreis (0,25 mg/mL) foram adicionados à fatia cerebral organotípica ou às células de 33103 suspensas no ensaio de FACs ao mesmo tempo que os ADDLs foram adicionados.

Em ensaios de mapeamento de FAC, os péptidos trípticos libertados no meio de cultura (0,25 mg/mL) inibiram a ligação de ADDL por > 90 % como mostrado na FIG. 9. Por comparação, as células de controlo expostas a BSA, mesmo em 100 mg/mL, não tiveram nenhuma perda de ligação. Os péptidos trípticos, se adicionados depois dos ADDLs já terem sido ligados a células, não tiveram intensidades de fluorescência significatívamente mais baixas. Isto indica que os péptidos não comprometeram a capacidade do ensaio de quantificar os ADDLs ligados. Além do bloqueio da ligação de ADDL, os péptidos trípticos também foram antagonistas da morte de célula evocada por ADDL. A saber, como mostrado na FIG. 9, a adição de péptidos trípticos resultou numa redução de 7 5 % da mcrte de célula, p < 0,002.

Estes dados confirmam que as proteínas de superfície de célula particulares que medeiam a ligação de ADDL, e que os péptidos trípticos solubilizados da superfície da célula fornecem actividade de neutralização do ADDL, neuroprotectora. Além disso, o ensaio presente também pode ser empregue como um ensaio para os agentes que medeiam a ligação de célula de ADDL ou os efeitos de ADDL na actividade de célula. Em particular, o ensaio pode ser executado através de co-incubação ou de co-administração juntamente com os agentes de ADDLs que potencialmente podem aumentar ou diminuir a formação e/ou a actividade de ADDL. Os resultados obtidos com tal co-incubação ou co-administração podem ser comparados com os resultados obtidos com a inclusão de ADDLs sozinhos. Além disso, a adição dos agentes antes ou depois de ligação dos ADDLs à superfície de célula pode ser comparada para identificar os agentes que impactam tal ligação, ou que actuam depois da ligação ter ocorrido.

Exemplo 13: Curva de Resposta à Dose para a Ligação de Célula de ADDL

Este exemplo estabelece as experiências de resposta da dose feitas para determinar se a ligação de ADDL à superfície de célula é saturável. Tal capacidade de saturação seria esperada se os ADDLs de facto interagem com um receptor de superfície de célula particular.

Para estes estudos, as células de B103 foram incubadas com quantidades aumentas de ADDLs e a ligação de ADDL foi quantificada pela análise de mapeamento de FAC. Os resultados são apresentados na FIG. 10. Estes resultados confirmam que é conseguido um plano distinto para a ligação de ADDL. A capacidade de saturação da ligação de ADDL ocorre a uma concentração de Αβ 1-42 relativa (isto é, concentração de ADDL relativa a Αβ) de cerca de 250 nm.

Estes resultados confirmam assim que a ligação de ADDL é saturável. Tal capacidade de saturação da ligação de ADDL, sobretudo quando considerada com os resultados dos estudos de tripsina, valida que os ADDLs estão a actuar através de um determinado receptor de superfície de célula. 79

Exemplo 14: ELISA à base de Célula para a Actividade de Ligação de ADDL

Este exemplo estabelece um ensaio à base de célula, em particular um ensaio de imuno-absorvência ligada por enzima à base de célula (ELISA) que pode ser empregue para avaliar a actividade de ligação de ADDL.

Para estes estudos, 48 heras antes da condução da experiência, 2,5 x 104 células de B103 presentes como uma suspensão em 100 pL de DMEM foram colocadas em cada cavidade de ensaio de um prato de microtitulação de 96 cavidades e mantidas numa incubadora a 37 °C 24 horas antes da condução da experiência, os ADDLs foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Para começar o ensaio, cada cavidade do prato de microtitulação que contém as células foi tratada com 50 pL de fixativo (3,7 % de formalina em DMEM) durante 10 minutos à temperatura ambiente. Esta solução fixativa/DMEM foi retirada e um segundo tratamento com 50 pL de formalina (nenhum DMEM) foi executado durante 15 minutos à temperatura ambiente. O fixativo foi retirado e cada cavidade foi lavada duas vezes com 100 pL de salina tamponada de fosfato (PBS). 200 pL de um agente de bloqueio (1 I de BSA em PBS) foi adicionado a cada cavidade e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora.

Depois de 2 lavagens com 100 pL de PBS, 50 pL de ADDLs (previamente 80 diluído 1:10 em PBS), foram adicionados às cavidades apropriadas, ou o PBS sozinho como um controlo, e as cavidades resultantes foram incubadas a 37 °C durante 1 hora. 3 lavagens com 100 pL de PBS foram executadas, e 50 pL de 6E1Q bioiinilado (Senetek) diluído 1:1000 em 1 % de BSA/PBS foi adicionado às cavidades apropriadas. Em outras cavidades, o PBS foi adicionado como um controlo. Depois da incubação durante 1 hora à temperatura ambiente num rotor, as cavidades foram lavadas 3 vezes com 50 pL de PBS, e 50 pL do reagente de ABC (conjunto Elite ABC, Vector Labs) foi adicionado e incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente no rotor. Depois da lavagem 4 vezes com 50 pL de PBS, 50 pL de solução de substrato de ABTS foi adicionado a cada cavidade e o prato foi incubado na escuridão à temperatura ambiente. O prato foi analisado para aumentar a absorção a 405 nm. Só quando os ADDLs, as células, e o 6E10 estiveram presentes houve aí um sinal significativo, como ilustrado na FIG. 11.

Estes resultados além disso confirmam que um ensaio de ELISA à base de célula pode ser empregue como um ensaio para a ligação de célula mediada por ADDL. Em particular, o ensaio pode ser executado através de co-incubação ou de co-administração juntamente com os agentes de ADDLs que potencialmente podem aumentar ou diminuir a formação e/ou a actividade de ADDL. Os resultados obtidos com tal com os co-incubação ou co-adminístração podem ser comparados 81 resultados obtidos com a inclusão de ADDLs sozinhos.

Exemplo 15: Separador da Quinase de Fyn que Protege Contra a Neurotoxicidade de ADDL

Para investigar além disso o envolvimento potencial da transaução de sinal na toxicidade de ADDL, as experiências neste exemplo compararam o impacto de ADDLs em fatias cerebrais de animais fyn -/- e fyn +/+ isogénicos. 0 Fyn pertence à família de Src das quinases da tírosina de proteína, que são centrais a múltiplos sinais e respostas celulares (Clarke et al., Science, 268, 233-238). 0 Fyn é de particular interesse porque ele é regulado para cima em neurónios afligidos por AD (Shirazi et al., Neuroreport, 4, 435-437, 1993). Também parece ser activado por preparações de Αβ convencionais (Zhang et al., Neurosci. Letts., 211, 187-190, 1996) que posteriormente mostraram conter os ADDLs por AFM. Os ratos separados por Fyn, além disso, reduziram a apoptose no desenvolvimento do hipocampo (Grant et al., Science, 258, 1903-1910, 1992).

Para estes estudos, ratos separados por Fyn (Grant et al., Science, 258, 1903-1910, 1992) foram tratados como descrito nos exemplos precedentes, através da comparação de imagens de fatias cerebrais de ratos tratados ou não tratados com os ADDLs durante 24 horas para determinar as células mortas na área de DG e de CA3. A 82 comparação quantitativa (apresentada na FIG. 12) foi obtida com. barras incorrectas que representam meios de +/- SEM para 4-7 fatias.

Em contraste com culturas de animais de tipo selvagem, as culturas de animais com fyn-/- mostraram a morte de célula evocada por ADDL insignificante, como mostrado na FIG. 12. Para os ADDLs, o nível da morte de célula em fatias de fyn +/+ foi mais de cinco vezes do que em culturas de fyn-/-. Em culturas de fyn-/-, a morte de célula na presença de ADDLs foi ao nível de fundo. A resposta neuroprotectora foi selectiva; a morte de célula do hipocampo evocada por agonistas receptores de NMDA (Bruce et al., Exper. Neurol., 132, 209-219, 1995; Vornov et al. Neurochem., 56, 996-1006, 1991) foi não afectada (não mostrado). A análise (ANOVA) que utiliza uma comparação múltipla de Tukey deu um valor de P < 0,001 para os dados do ADDL de fyn +/+ em comparação com todas as outras condições.

Estes resultados confirmam que a perda da quinase de Fyn protegeu as regiões DG e CA3 do hipocampo da morte de célula induzida por ADDLs. Os resultados validam que a toxicidade de ADDL é mediada através de um mecanismo bloqueado pela separação da quinase da tirosina da proteína de Fyn. Estes resultados além disso sugerem que os benefícios neuroprotectores podem ser obtidos através de tratamentos que anulam a actividade da quinase da tirosina da 83 proteína de Fyn ou a expressão do gene que codifica a quinase da proteína de Fyn.

Exemplo 16: Experiências de Activaçâo de Astrócito

Para investigar além disso o envolvimento potencial da transdução de sinal na toxicidade de ADDL, as experiências neste exemplo compararam o impacto em ADDLs na activaçâo de astrócitos.

Para estas experiências, as culturas de astrócito corticais foram preparadas a partir de crias de ratos Sprague-Dawley neonatais (1-2 dias de idade) através do método de Levison e McCarthy (Levison et al., In: Banker et al. (Editores), Culturing Nerve Cells, MIT press, Cambridge, Mass., 309-36, 1991), como anteriormente descrito (Hu et al., J. Biol. Chem., 271, 2543-2547, 1996). Resumidamente, o córtex cerebral foi dissecado fora, trípsinizado, e as células foram culturadas em α-MEM (Gibco, BRL) que contém 10 % de soro fetal de bovino (Hyclone Laboratories Inc., Logan Utah) e antibióticos (100 U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina). Depois de 11 dias em cultura, as células foram tripsinizadas e recolocadas em pratos de 100 mm a uma densidade de ~6 x 105 células/prato e feitas crescer até à confluência (Hu et al., J. Biol. Chem., 271, 2543-2547, 1996).

Os astrócitos foram tratados com os ADDLs preparados de acordo com 84 o Exemplo 1, ou com ο Αβ 17-42 (sintetizado segundo Lambert et al., J. Neurosci. Res., 39, 377-384, 1934; também comercialmente disponíveis), 0 tratamento foi feito através da tripsinização de culturas confluentes de astrócitos e colocados em pratos de cultura de tecido de 60 mm a uma densidade de 1 x 106 eélulas/prato (por exemplo, por análise de ARN e ELISAs), em lâminas de câmara de 4 cavidades a 5 x 104 células/cavidade (por exemplo, para imuno-histoquímica), ou em pratos de 96 cavidades a uma densidade de 5 x 104 células/cavidade (por exemplo, para ensaio de NO). Depois de 24 horas de incubação, as células foram lavadas duas vezes cora PBS para retirar o soro, e as culturas incubadas em α-MEM que contêm suplementos de N2 durante umas 24 horas adicionais antes da adição de péptidos de Άβ ou de tampão de controlo (isto é, diluente que contém tampão). 0 exame da morfologia do astrócito foi feito por se examinarem as células num microscópio invertido Nikon TMS equipado com uma câmara Javelin SmartCam, um monitor de vídeo Sony e uma impressora de vídeo a cores. Tipicamente, quatro campos microscópicos arbitrariamente seleccionados (20 X de ampliação) foram fotografados para cada condição experimental. A activação morfológica foi quantificada das fotografias ccm a Imagem de N1H por se contar o número de células activadas (definidas como uma célula com um ou vários processos pelo menos um corpo de célula no 85 comprimento) nos quatro campos.

Os níveis de ARNm nas culturas foram determinados com a utilização de manchas de Northern e manchas de fenda. Isto foi feito por se exporem as células a ADDLs ou a tampão de controlo durante 24 horas. Depois deste período, as células foram lavadas duas vezes com PBS tratado com dietilpirocarbonato (DEPC), e o ARN total foi isolado através de mini-colunas de purificação de RNeasy (Qíagen, Inc., Chatsworth, Califórnia), como recomendado pelo fabricante. Os rendimentos típicos do ARN foram de 8 a 30 mg do ARN total por prato. Para a análise de manchas de Northern, 5 mg do ARN total por amostra foi separado em um gel de agarose-formaldeído, transferido pela acção capilar à membrana Hybond-N (Amersham, Arlington Heights IL), e ligado transversalmente por UV. Para a análise de mancha de fenda, 200 ng do ARN total por amostra foram manchados na membrana Duralon-UV (Stratagene, La Jolla Califórnia) sob vácuo, e ligado transversalmente por UV. A confirmação dos carregamento de ARN equivalente foi feita por mancheamento de brometo de etídio ou por hibridização e normalização com uma amostra de GAPDH.

As tentas foram geradas por se digerir a enzima de restrição de plasmideos, e purificação de gel subsequente do fragmento apropriado. A saber, os fragmentos de ADNc foram preparados por 86 RT-PCR que se utilizar ARN total dos astrócitos corticais de rato. 0 ARN foi transcrito inversamente com um sistema de Superscript II (GIBCO/BRL), e o PCR foi executado em um controlador térmico PTC-100 (MJ Research Inc, Watertown, Mass.) utilizando 35 ciclos nas cenários seguintes: 52 °C durante 40 segundos; 72 °C durante 40 segundos; 96 °C durante 40 segundos. Os pares de iniciadores usados para amplificar um fragmento de 447 bp de IL-Ιβ de rato foram:

Directo: 5' GCACCTTCITICCCTTCATC 3' [SEQ ID NO: 1]. Inverso: 5' TGCTGATGTACCAGTTGGGG 3' [SEQ ID NO: 2]. Os pares de iniciadores usados para amplificar um fragmento de 4 35 bp de GFAP de rato foram: Directo: 5’ CAGICCTTGACCTGCGACC 3' [SEQ ID NO: 3]. Inverso: 5' GCCTCACAICACATCCTTG 3' [SEQ ID NO: 4]. Os produtos de PCR foram clonados no vector pCR2.1 com o conjunto de clonagem Invitrogen TA, e constructos foram verificados através de sequenciação de ADN. As amostras foram preparadas por digestão do vector de EcoRI, seguido pela purificação de gel dos fragmentos apropriados. Os plasmideos foram o plasmídeo pAstNOS-4 do ADNc iNOS do rato, que corresponde às bases 3007-3943 do ADNc iNOS do rato, (Galea et al., J.

Neurosci. Res., 37, 406-414, 1994), e o plasmídeo pTRl-GAPDH do ADNc GAPDH do rato (Ambion, Inc., Austín Texas).

As amostras (25 ng) foram marcadas com 32?-dCTP por se utilizar um conjunto de marcação Prime-a-Gene Random-Prime (Promega, Madison

Wis.) e separadas por nucleótidos não incorporados por utilização de colunas de impulso (Stratagene). A hibridização foi feita em condições estritas com a solução de QuikHyb (Stratagene), por se utilizar o protocolo recomendado para a hibridização estrita. Resumidamente, a pré-hibridização foi conduzida a 68 °C durante cerca de 30 a 60 minutos, e a hibridização esteve a 68 °C durante cerca de 60 minutes. As manchas foram depois lavadas em condições estritas e expostas quer a chapa de autoradiografia ou de fosfoimagiologia. Os autoradiogramas foram mapeados com um mapeador a laser BioRad GS-670, e a densidade da banda foi quantificada com o programa de computador de análise de imagem Analista Molecular v2.1 (BioRad, Hércules Califórnia). As fosfoimagens foram captadas em um sistema Storm 840 (Molecular Dynamics, Sunnvvale Califórnia), e a densidade da banda foi quantificada com o programa de computador de análise de imagem Image Quant vl.l (Molecular Dynamics).

Para a medição de NO através de ensaio de nitrito, as células foram incubadas com péptidos de A.beta. ou tampão de controlo durante 48 horas, e depois os níveis de nitrito nos meios condicionados foram medidos através da reacção Griess como anteriormente descrito (Hu et al., J. Biol. Chem., 271, 2543-2547, 1996). Quando o inibidor de NOS de metíléster de N-nitro-L-arginina íL-name) ou o ísómero D-name ínactivo foram usados, estes agentes foram adicionados às culturas ao mesmo tempo que ο Αβ.

Os resultados destas experiências são apresentados na FIG. 13. Como pode ser visto nesta figura, a activação de glia aumenta quando os astrócitos são incubados com os ÃDDLs, mas não quando os astrócitos são incubados com ο Αβ 17-42.

Estes resultados confirmam que os ADDLs activam as células gliais. É possível que as proteínas gliais possam contribuir para o défice neural, por exemplo, como ocorre na Doença de Alzheimer, e que alguns efeitos de ADDLs podem ser de facto mediados indirectamente pela activação de células gliais. Em particular, as proteínas gliais podem facilitar a formação de ADDLs, ou dos efeitos mediados por ADDL que ocorrem a jusante da ligação do receptor. Também, é conhecido que a clusterina é regulada no cérebro do sujeito com a doença de Alzheimer, e a clusterina é feita a níveis elevados só em células gliais que são activadas. Baseado nisto, a activação de células gliais por um estímulo não ADDL, não amilóide pede produzir a clusterina a qual por sua vez poderia levar aos ADDLs, os quais por sua vez iriam danificar os neurónios e iriam causar a activação adicional das células gliais.

Sem levar em consideração o mecanismo, estes resultados além disso sugerem que os benefícios neuroprotectores podem ser obtidos através de tratamentos que modulam (isto é, aumentam ou diminuem) a activaçac da célula glial mediada por ADDL. Além disso, os 89 resultados sugerem que o bloqueio destes efeitos em células gliais, à parte do bloqueio dos efeitos neuronais, pode ser benéfico. Exemplo 17: Ensaio de LTP - LTP que Divide os ADDLs A potenciação de longo prazo (LTP) é um paradigma clássico para a plasticidade sináptica e um modelo para a memória e a aprendizagem, faculdades que são selectivamente perdidas na fase inicial de AD. Este exemplo determina as experiências feitas para examinar os efeitos dos ADDLs em LTP, em particular no LTP da célula de grânulo de caminho perforante médio.

Injecções de animais intactos: cs ratos foram anestesiados com uretano e colocados num aparelho esterotáxico. A temperatura do corpo foi mantida usando uma almofada de capa de água aquecida. A superfície cerebral foi exposta através de orifícios no crânio. As posições de Bregma e de lambda para a injecção na camada molecular média do hipocampo são 2 mm posteriores a bregma, 1 mm lateral à linha média, e 1,2-1,5 mm ventral à superfície cerebral. As injecções de oligómero de β amilóide foram por sopro de azoto através de pipetas de vidro de ~10 nm de diâmetro. Os volumes de 20-50 nL de solução de oligómero de 3 amilóide (180 nM β amilóide em salina de tampão de fosfato, PBS) foram dados ao longo do curso de uma hora. Os ratos de controlo receberam um volume equivalente de PBS sozinho. O animal foi deixado a descansar por períodos de 90 tempo variados antes do estímulo de LTP ser dado (tipicamente 60 minutos). LTP em animais injectados: as experiências seguem o paradigma estabelecido por Routtenberg e colegas para o LTP em ratos (Namgung et al., Brain Research, 689, 85-92, 1995). A estimulação do caminho perforante do córtex entorinal foi usada, com o registo da camada molecular média e o corpo de célula da circunvolução dentada. Um potencial pós-sinãptico excitatório da população (pop-EPSP) e um potencial de pico da população (pop-pico) foi observado em estimulação eléctrica. O LTP pode ser induzido nestas respostas por um estímulo de 3 séries de 400 Hz, 8 x 0,4 ms de pulsos/série (Namgung et al., Brain Research, 689, 85-92, 1995). Os registos foram tomados durante 2-3 horas depois do estímulo (isto é, aplicado no tempo 0) para determinar se c LTP é retido. O animal foi depois sacrificado imediatamente, ou foi deixado a recuperar-se durante 1, 3, ou 7 dias e depois sacrificado como em cima. 0 cérebro foi críoprotegido com 30 % de sacarose, e depois seccionado (30 μΜ) com um micrótomo. Algumas secções foram colocadas em lâminas substituídas com a gelatina e as outras foram analisadas usando um protocolo flutuante livre. A imuno-hístoquímica foi utilizada para controlar as modificações em GAP-43, em subtipos de PKC, e na fosforilação da proteína de tau (PHF-l), paxilina, e quinase de adesão focal. As formas de onda foram analisadas por 91 máquina como descrito anteriormente (Colley et al., J. Neuroscí., 10, 3353-3360, 1990). Um ANOVA de 2 vias compara as modificações na amplidão de pico entre os grupos tratados e não tratados. A FIG. 14 ilustra o efeito da amplitude de pico de ADDLs em animais inteiros. Como pode ser claramente visto nesta figura, os ADDLs bloqueiam a fase de persistência de LTP induzido por estímulos eléctricos de alta frequência aplicados ao córtex entorínal e medidos como a amplitude de pico do corpo de célula na camada molecular média da circunvolução dentada.

Depois da experiência de LTP ter sido levada a cabo, os animais foram deixados a recuperar durante vários períodos e depois sacrificados por se utilizar pentobarbitol de sódio anestético e a aspersão com 4 % de paraformaldeído. Para estudos de viabilidade, os períodos de 3 horas, 24 horas, 3 dias, e 7 dias foram usados. O cérebro foi crioprotegido com 30 % de sacarose e depois seccionado (30 μΜ) com um micrótomo. As secções foram colocadas em lâminas substituídas com a gelatina e manchadas inicialmente com violeta de cresilo. A perda de célula foi medida por se contarem os corpos de célula na circunvolução dentada, CA3, CAI, e córtex entorinal, e correlacionada com a dose e o tempo de exposição de ADDLs. Os resultados destas experiências confirmaram que nenhuma morte de célula ocorreu desde 24 horas depois das experiências de LTP. 92

Semelhantemente a resposta de LTP foi examinada era fatias do hipocampo de ratos jovens adultos. Como pode ser visto na FIG. 15, a incubação das fatias do hipocampo de rato com os ADDLs previne bem o LTP antes de qualquer sinal público de degeneração da célula. As farias do hipocampo (n=6) expostas a 500 nM de ADDLs durante 45 minutos prevíamente não mostraram nenhuma potenciação no pico da população 30 minutos depois da estimulação tetânica (amplitude média de 99 % +/- 7,6), apesar de uma capacidade de continuação de potenciais de acção. Em contraste, o LTP foi prontamente induzido em fatias incubadas com o veículo (n=6), com uma amplitude de 138 % + /- 8,1 para os últimos 10 minutos; este valor é comparável com o anteriormente demonstrado neste grupo de idade (Trommer et ai., Exper. Neurol., 131, 83-92, 1995). Embora o LTP estivesse ausente em fatias tratadascom o ADDL, as suas células foram competentes para gerar potenciais de acção e não. mostraram nenhum sinal da degeneração.

Estes resultados validam que t :anto em animais inteiros como em fatias de tecido , a ad íção de ADDLs resulta na interrupção signif. icativa de LTP em menos de u-ma hore r cintes cie qualquer degeneração ou morte de célula. Estas experiências suportam assim que os ADDLs exercem efeitos muiro precoces, e a interferência com a formação e/ou actividade de ADDL pode ser assim empregue para se 93 obter um efeito terapêutico antes do avanço de uma doença, perturbação, ou condição (por exemplo, a doença de Alzheimer) a uma etapa onde a morte de célula resulta. Em outras palavras, estes resultados confirmam que as diminuições na memória ocorrem antes da morte dos neurónios. A interferência antes de tal morte de célula pode ser assim empregue para inverter a progressão, e potencialmente restaurar as diminuições na memória.

Exemplo 18: Efeitos Precoces dos ADDLs In Vivo

Este exemplo estabelece os efeitos precoces dos ADDLs in vive e a maneira no conhecimento em que tais efeitos precoces podem ser manipulados.

Os sintomas primários da doença de Alzheimer envolvem o défice de memória e de aprendizagem. No entanto, a ligação entre o défice comportamental e os depósitos de amilóide agregados tem sido difícil de estabelecer. Em ratos transgénicos, o excesso de expressão do mutante APP sob o controlo do promotor do factor de crescimento crescido derivado de plaquetas resulta na deposição de grandes quantidades de amilóide (Games et al., Nature, 373, 523-527, 1995). Em contraste, nenhum défice comportamental foi relatado usando este sistema. Outros pesquisadores (isto é, Nalbantoglu et al., Nature, 387, 500-505, 1 997 e Ho.lcomb et al., Nat. Med., 4, 97-100, 1998) que trabalham com ratos transgénicos 94 relatam a observação de um défice cognitivo e comportamental significativo que ocorre bem antes de qualquer depósito significativo de amilóide agregado ser observado. Estes defeitos comportamentais e cognitivos incluem o fracasso a potenciar a longo prazo (Nalbantoglu 'et al.r supra). Estes modelos sugerem colectivamente que as formas não depositadas de amilóide são responsáveis pelo défice precoce cognitivo e comportamental que ocorre como um resultado do mau funcionamento neuronal induzido. É compatível com estes modelos que os novos ADDLs descritos aqui sejam esta forma não depositada de amilóide que causa os primeiros defeitos cognitivos e comportamentais. Em vista disto, os compostos que modulam os ADDL de acordo com a invenção podem ser empregues no tratamento e/ou na prevenção destes primeiros défices cognitivos e comportamentais que resultam do mau funcionamento neuronal induzido por ADDL, ou os próprios ADDLs podem ser aplicados, per exemplo, em modelos de animais, para estudar tal mau funcionamento neuronal induzido.

Semelhantemente em seres humanos idosos, o declínio cognitivo e os défices de memória focal podem ocorrer bem antes de um diagnóstico da etapa I provável da doença de Alzheimer ser feita (Linn et al., Arch. Neurol., 52, 485-490, 1995). Estes défices de memória focal podem resultar de sinalização aberrante induzida em neurónios, e não na morte de célula. Outras funções, tais como as elevadas capacidade de escrita em ordem (Snowdon et al., JAMA, 275, 528-532, 1996) também podem ser afectadas peia função neuronal aberrante que ocorre muito antes da morte de célula. É compatível com o que é conhecido quanto a estes defeitos, e a informação quanto aos ADDLs fornecidos aqui, que os ADDLs induzem estes defeitos de uma maneira semelhante à função de LTP comprometida tal como é induzida por ADDLs. Ao longo destas linhas, os compostos que modulam os ADDL de acordo com a invenção podem ser empregues no tratamento e/ou na prevenção deste declínio cognitivo precoce e défice de memória focal, e prejuízo da capacidade de escrever da mais alta ordem, resultando da formação ou da actividade do ADDL, ou os próprios ADDLs podem ser aplicados, por exemplo, em modelos de animais, para estudar tais defeitos induzidos. Em particular, tais estudos podem ser conduzidos como é conhecido dos especialistas na técnica, por exemplo por se compararem sujeitos tratados combinados por idade ou tratados por placebo. LISTA DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Acumen Pharmaceuticals, Inc. et al. 96 (ií) TITULO DA INVENÇÃO: Proteína de β amiióide (União Globular e suas Utilizações) (iií) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: McDonnell Boehnen Hulbert & Berghoff (B) RUA: 300 South Wacker Drive (C) CIDADE: Chicago

(D) ESTADO: IL

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAI 60606 (v) FORMA DE LEITURA POR COMPUTADOR: (A) TIPO MÉDIO: Disco flexível (B) COMPUTADOR: PC IBM compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: Patentin Versão 1.0, Versão 1.30 (US) (vi) DADOS DE PEDIDO CORRENTES:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US (B) DATA DE DEPÓSITO: 05-Fev-1998 (C) DADOS DE CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/796 089 (B) DATA DE DEPÓSITO: 05-Fev-1997 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO.: 1 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: ÍA) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) COMPOSIÇÃO DO CORDÃO: singular (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.: 1: GCACCTTCTT TCCCTTCATC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO.: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) COMPOSIÇÃO DO CORDÃO: singular (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.: 2: TGCTGATGTA CCAGTTGGGG 20 98 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO.: 3 {I} CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) COMPOSIÇÃO DO CORDÃO: singular (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.: 3: CAGTCCTTGA CCTGCGACC 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO.: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) COMPOSIÇÃO DO CORDÃO: singular (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.: 4: GCCTCACATC ACATCCTTG 19

Lisboa, 16 de Março de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Estrutura oligoméríca de amílóide não fibrilar, globular, solúvel, isolada e homogénea que compreende de 4 a 12 proteínas de β amílóide, em que a estrutura apresenta neurotoxicidade e não contém a proteína do β amílóide 1-40.

2. Estrutura oligoméríca de acordo com a reivindicação 1 em que a estrutura oligoméríca compreende uma forma oligoméríca seleccionada a partir dc grupo que consiste de agregados de tetrâmero, pentâmero, e hexâmero da proteína do β amilóide 1-42.

3. Estrutura oligoméríca de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a estrutura oligoméríca tem um peso molecular de 2 6 kD a 28 kD como determinado através de electroforese de gel desnaturado.

4. Estrutura oligoméríca de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 em que a estrutura oligoméríca tem um peso molecular de 22 kD a 24 kD ou de 18 kD a 19 kD como determinado através de electroforese em 15 % de um gel de SDS-poliacrílamída. 2

5. Estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em que a estrutura oligomérica compreende glóbulos de dimensões de 4,7 nm a 6,2 nm como medido através de microscopia de força atómica.

6. Estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 em que a estrutura oligomérica compreende glóbulos de dimensões de 4,9 nm a 5,4 nm como medido através de microscopia de força atómica.

7. Estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 em que a estrutura oligomérica compreende glóbulos de dimensões de 5,7 nm a 6,2 nm como medido através de microscopia de força atómica.

8. Estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 em que de 40 % a 75 % da estrutura oligomérica compreende glóbulos de dimensões de 4,9 nm a 5,4 nm e dimensões de 5,7 nm a 6,2 nm como medido através de microscopi.a de força atómica.

9. Método para identificar os compostos de teste que bloqueiam a neurotoxicidade da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações i a 8, em que o método compreende: (a) fazer contactar as culturas separadas de células neuronais 3 com a estrutura oligomérica quer na presença ou na ausência de contacto com o composto de teste; (b) medir a proporção de células viáveis em cada cultura; e (c) comparar a proporção de células viáveis em cada cultura, com os compostos que bloqueiam a neurotoxicidade da estrutura oligomérica a ser identificada como o resultado de uma proporção aumentada de células viáveis na referida cultura quando comparada a cultura correspondente contactada com a estrutura oligomérica na ausência do composto de teste.

10. Método para identificar os compostos de teste que bloqueiam a ligação a uma proteína da superfície da célula da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o método compreende: (a) fazer contactar as culturas separadas de células neuronais com a estrutura oligomérica quer na presença ou na ausência de contacto com o composto de teste; (b) adicionar um reagente que se liga à estrutura oligomérica, sendo o reagente fluorescente; (c) analisar as referidas culturas de célula separada através de classificação de célula activada por fluorescência; e (d) comparar a fluorescência das culturas, com compostos que bloqueiam a ligação a uraa proteína de superfície de célula da estrutura oligomérica a ser identificada como o resultado de 4 uma fluorescência reduzida da cultura quando comparada a cultura correspondente com a estrutura oligomérica na ausência do composto de teste.

11. Método para identificar os compostos de teste que bloqueiam a ligação a uma proteína da superfície da célula da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o método compreende: (a) formar a estrutura oligomérica da proteína de β amilóide 1-42 de tal forma que se torne em uma estrutura oligomérica marcada que compreende uma fracção de ligação capaz de ligar um reagente fluorescente; (b) fazer contactar as culturas separadas de células neuronais com a estrutura oligomérica marcada quer na presença ou na ausência de contacto com o composto de teste; (c) adicionar nm reagente fluorescente que se liga a uma estrutura oligomérica; (d) analisar as culturas de célula separada por classificação de célula activada por fluorescência; e (e) comparar a fluorescência das culturas, com compostos que bloqueiam a ligação a uma proteína de superfície de célula da estrutura oligomérica a ser identificada numa fluorescência reduzida da cultura quando comparada com a cultura correspondente contactada com a estrutura oligomérica na 5 ausência do composto de teste.

12. Método para identificar os compostos que bloqueiam a formação ou a ligação a uma proteína de superfície de célula da estrutura olígomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o método compreende: (a) preparar amostras separadas da proteína de β amilóide 1-42 quer tenha sido ou não misturada com o composto de teste; (b) formar a estrutura olígomérica nas amostras separadas; (c) fazer contactar as culturas separadas de células neuronais com as amostras separadas; (d) adicionar um reagente que se liga à estrutura olígomérica, sendo o reagente fluorescente; (e) analisar as culturas de célula separada por classificação da célula activada por fluorescência; e (f) comparar a fluorescência das culturas, com os compostos que bloqueiam a formação ou ligação a uma proteína de superfície de célula da estrutura oligomérica a ser identificada como o resultado de uma fluorescência reduzida da cultura quando comparada à cultura correspondente contactada com a estrutura oligomérica na ausência do composto de teste.

13. Método para identificar os compostos que bloqueiam a formação ou a ligação a uma proteína de superfície de célula da 6 estrutura oligoméríca de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o método compreende: (a) preparar amostras separadas da proteína de β amilóide 1-42 quer tenha sido ou não misturada com o composto de teste; < (b) formar a estrutura oligoméríca nas amostras separadas de tal forma que se torne em uma estrutura oligoméríca marcada que compreende uma fracção de ligação capaz de ligar um reagente fluorescente em cada uma das amostras separadas; (c) fazer contactar as culturas separadas de células neuronais com as amostras separadas; (d) adicionar um reagente fluorescente que se liga à estrutura oligoméríca; (e) analisar as culturas de célula separada por classificação da célula activada por fluorescência; e (f) comparar a fluorescência das culturas, com os compostos que bloqueiam a formação ou a ligação a uma proteína de superfície de célula da estrutura oligoméríca a ser identificada como o resultado de uma fluorescência reduzida da cultura quando comparada à cultura correspondente contactada com a estrutura oligoméríca na ausência do composto de teste.

14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que a fluorescência das culturas além disso é comparada com a fluorescência de culturas que foram tratadas da mesma forma 7 excepto que em vez de se adicionar ou não se adicionar o composto de teste antes da formação da estrutura olígomérica, o composto de teste é ou não é adicionado depois da formação da estrutura olígomérica, com compostos que bloqueiam a formação da estrutura olígomérica a ser identificada como o resultado de uma fluorescência reduzida de cultura em comparação com a cultura correspondente contactada com a estrutura olígomérica na ausência do composto de teste, só quando o composto é adicionado antes da estrutura olígomérica, e os compostos que bloqueiam a ligação a uma proteína de superfície de célula a ser identificada como o resultado de uma fluorescência reduzida de cultura em comparação com a cultura correspondente contactada com a estrutura olígomérica na ausência do composto de teste, quando o composto é adicionado antes ou após a estrutura olígomérica.

15. Método para detectar a ligação a uma proteína de superfície de célula da estrutura olígomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 que compreende: (a) formar a estrutura olígomérica da proteína de β amilóide 1-42; (b) fazer contactar as culturas de células neuronais com a estrutura olígomérica; (c) adicionar um anticorpo que liga a referida estrutura oligomérica, incluindo o anticorpo uma fracção de conjugação; (d) lavar ao tirar o anticorpo não ligado; (f) ligar uma enzima ao referido anticorpo ligado à estrutura oligomérica por meio da referida fracção de conjugação; (g) adicionar um substrato sem cor que é clivado pela referida enzima para produzir uma modificação de cor; e (h) determinar a referida modificação de cor como uma medida da ligação a uma proteína de superfície de célula da estrutura oligomérica.

16. Método para identificar os compostos que bloqueiam a ligação a uma proteína de superfície de célula da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o método compreende: (a) preparar amostras separadas da proteína de β amilóide 1-42 quer tenha sido ou não misturada com o composto de teste; (b) formar a estrutura oligomérica nas amostras separadas; (c) fazer contactar as culturas separadas de células neuronais com as amostras separadas; (d) adicionar um anticorpo que liga a estrutura oligomérica, incluindo o anticorpo uma fracção de conjugação; (e) lavar ao tirar o anticorpo não ligado; (f) ligar uma enzima ao anticorpo ligado à estrutura oligomérica por meio da referida fracção de conjugação; (g) adicionar um substrato sem cor que é clivado pela referida enzima para produzir uma modificação de cor; e (h) comparar a modificação de cor produzida por cada uma das amostras separadas, com compostos que bloqueiam a formação ou a ligação a uma proteína de superfície de célula da estrutura oligomérica a ser identificada como o resultado de uma modificação de cor reduzida produzida pela cultura quando comparada a uma cultura correspondente contactada com a estrutura oligomérica na ausência do composto de teste.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a modificação de cor produzida pelas culturas é além disso comparada com a modificação de cor produzida pelas culturas que tinham sido tratadas da mesma forma excepto que em vez de se adicionar ou não adicionar o composto de teste antes da formação da estrutura oligomérica, o referido composto de teste é ou não é adicionado depois da formação da estrutura oligomérica, com os compostos que bloqueiam a formação da estrutura oligomérica a ser identificada como o resultado de uma modificação de cor reduzida produzida pela cultura quando comparada com a cultura correspondente contactada com a estrutura oligomérica na ausência do composto de teste, só quando o composto é adicionado antes da estrutura oligomérica e, os compostos que bloqueiam a ligação do receptor da estrutura oligomérica a ser 10 identificada como o resultado de uma modificação de cor reduzida produzida pela cultura quando comparada com a cultura correspondente contactada com a estrutura oligomérica na ausência do composto de teste, quando o composto é adicionado quer antes ou depois da estrutura oligomérica.

18. Método para identificar os compostos que bloqueiam a formação da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o método compreende: (a) preparar amostras separadas da proteína de β amilóide 1-42 quer tenha sido ou não misturada com o composto de teste; (b) formar a estrutura oligomérica nas amostras separadas; (c) avaliar se algumas reuniões de proteína se formaram nas amostras separadas por se utilizar um método seleccionado a partir do grupo que consiste de electroforese, imunoreconhecimento, e microscopia de força atómica; e (d) comparar a formação das reuniões de proteína nas amostras separadas, com os compostos que bloqueiam a formação da estrutura oligomérica a ser identificada corno o resultado na formação reduzida da estrutura oligomérica na amostra quando comparada com uma amostra na qual a estrutura oligomérica é formada a ausência do composto de teste.

19. Método para preparar a estrutura oligomérica de acordo com 11 qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o método compreende: (a) obter-se uma solução da proteína de β amilóide 1-42 monomérica, sendo a referida proteína de β amilõide 1-42 capaz de formar a estrutura oligomérica; (b) diluir-se a solução de proteína num meio apropriado para uma concentração final de cerca de 5 nM a cerca de 500 μΜ; (c) incubar-se o meio resultante do passo (b) a cerca de 4 °C durante cerca de 2 horas a cerca de 48 horas; (d) centrifugar-se a solução a cerca de 14 000 g a cerca de 4 °C; e (d) recuperar-se o sobrenadante que resulta da centrifugação que contém a estrutura oligomérica do β amilóide 1-42.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o método compreende a incubação do meio que resulta do passo (b) a cerca de 4 °C na presença de clusterina.

21. Estrutura oligomérica do β amilóide não fibrilar, globular, solúvel, isolado, preparada de acordo com a reivindicação 19 ou 20.

22. Utilização da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 para alterar a resposta de potenciação a longo prazo de uma célula nervosa que compreende fazer contactar a célula in vitro com a estrutura oligomérica. 12

23. Utilização da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 para causar a modificação morfológica de uma célula nervosa que compreende fazer contactar a célula in vitro com a estrutura oligomérica.

24. Utilização de acordo com a reivindicação 23, em que a modificação morfológica inclui um efeito seleccionado a partir do grupo que consiste da morte da célula, da activídade da quinase de Fyn alterada, da localização sub-celular da quinase de Fyn alterada, e dos níveis de ARNm alterados para as proteínas que inclui a interleucina-1, a sintase do óxido nítrico induzível, o Apo E, o Apo J, e a al-antiquimotripsina.

25. Utilização da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 para causar a activação do astrócito, que compreende fazer contactar um astrócito in vitro com a estrutura oligomérica.

26. Utilização da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 para identificar os compostos de teste que bloqueiam a neurotoxicidade da estrutura oligomérica, que compreende fazer contactar a célula nervosa in vitro com a estrutura oligomérica e o composto de teste. 13

27. Utilização da estrutura olígoraérica de acordo cora qualquer das reivindicações 1 a 8 para identificar os compostos de teste que bloqueiam a ligação a uma proteína de superfície de célula da estrutura oligomérica, que compreende fazer contactar uma célula nervosa ín vitro com a estrutura oligomérica e o composto de teste.

28. Utilização da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 para identificar os compostos de teste que bloqueiam a formação da estrutura oligomérica, que compreende fazer contactar a proteína de β amilóide 1-42 com o composto de teste durante a incubação para formar a estrutura oligomérica.

29. Utilização da estrutura oligomérica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 para causar a sinalização neuronal aberrante induzida por ADDL a uma célula nervosa, que compreende fazer contactar a célula com a estrutura oligomérica. Lisboa, 16 de Março de 2007