RU2010858C1 - Способ иммобилизации алкогольоксидазы - Google Patents
Способ иммобилизации алкогольоксидазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2010858C1 RU2010858C1 SU915008288A SU5008288A RU2010858C1 RU 2010858 C1 RU2010858 C1 RU 2010858C1 SU 915008288 A SU915008288 A SU 915008288A SU 5008288 A SU5008288 A SU 5008288A RU 2010858 C1 RU2010858 C1 RU 2010858C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- alcohol oxidase
- immobilized
- activity
- concentration
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 title claims description 21
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims abstract description 13
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 10
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 15
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 abstract description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 2
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Использование: биохимия, в частности в анализаторах для определения метаболитов в крови и других биологических растворах. Сущность изобретения: при введении фермента в гелевую структуру, содержащую альбумин, глутаровый альдегид и азид натрия, дополнительно вводят комплекс меди и гистидина Cu(His) в концентрации 0,5 - 1,5 мг/мл. Положительный эффект: активность иммобилизованного фермента увеличивается в 3,6 - 4,6 раз по сравнению с известным; стабильность сохраняется достаточно длительное время. Например, в течение 4 мес активность уменьшается на 30% , тогда как известным способом иммобилизованная алкогольоксида при эксплуатации за это же время полностью теряет активность. 2 табл.
Description
Изобретение относится к способам иммобилизации ферментов, а именно к технологии получения иммобилизованной алкогольоксидазы, которая используется в анализаторах для определения этилового спирта в крови и других биологических растворах.
Известны способы получения иммобилизованных ферментов путем включения фермента в пространственную структуру гелей, например, альбуминового геля в присутствии глутарового альдегида [1] .
Недостаток этого способа связан с трудностью регулировать прочность и эластичность геля, содержащего фермент.
Известен способ иммобилизации ферментов путем их связывания с нерастворимым пленочным носителем в присутствии сывороточного альбумина и глутарового альдегида [2] , но он тоже не обеспечивает высокого качества иммобилизованной алкогольоксидазы.
Недостатком способа является ограниченная применимость, так как полученная этим способом иммобилизованная алкогольоксидаза при использовании в анализаторах определения этилового спирта не отличается высокой активностью и стабильностью. По-видимому алкогольоксидаза быстро инактивируется под действием глутарового альдегида.
Наиболее близким к изобретению является способ иммобилизации алкогольоксидазы при pH 8,0-9,0, включающий введение алкогольоксидазы в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин, глутаровый альдегид и азид натрия в буферном растворе, и последующее нанесение на лавсановую мембрану - ядерный фильтр [3] . Сущность способа объясняется тем, что азид натрия комплексируется в активном центре алкогольоксидазы.
Недостатком способа является сравнительно низкое качество целевого продукта: иммобилизованная алкогольоксидаза при использовании в анализаторах определения этилового спирта отличается сравнительно низкой активностью и стабильностью (см. табл. 1).
Цель изобретения - повышение активности и стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы.
Способ заключается в том, что при иммобилизации алкогольоксидазы путем включения фермента в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин, глутаровый альдегид и азид натрия в коцентрации 0,25-500 мМ, в буферном растворе, pH 8,0-9,0, и последующего нанесения его на лавсановую мембрану - ядерный фильтр, в гелевую структуру дополнительно вводят комплекс меди и гистадина Cu (His) в концентрации (0,5-1,5) мг/мл.
Сущность способа может быть объяснена тем, что в активном центре алкогольоксидазы значительная часть флавинадениндинуклеотидов (Е-ФАД) является в семихиноновом состоянии (E-ФАД. ), т. е. приблизительно шесть из восьми. При хранении фермента флавинадениндинуклеотидсемихинон претерпевает редокс превращение с образованием супероксидрадикала (O2 -. ):
Е-ФАД-. +O2 --- E-ФАД+O2 -.
Е-ФАД-. +O2 --- E-ФАД+O2 -.
Образовавшийся радикал O2 -. является очень реактивным агентом, который разрушает четвертичную структуру фермента и приводит к его инактивации. Дополнительно используемый в процессе иммобилизации комплекс Cu(His) моделирует активный центр супероксиддисмутазы, элиминирующий O2 -. , что и обеспечивает повышение активности иммобилизованной алкогольоксидазы.
Комплекс меди и гистидина получают по методике, описанной в литературе.
Для иммобилизации используют алкогольоксидазу из Candida boidinii или Pichia pastoris.
П р и м е р 1. 0,1 М раствор CuSO4 смешивают с 10% избытком 0,1 М раствора гистидина. Спектрофотометрически наблюдают появление полосы поглощения при 610 нм. Методом спектрофотометрического титрования установлено, что образуется комплекс гистидина и меди в соотношении 2: 1.
П р и м е р 2. 0,1 мл алкогольоксидазы (500 U/мл), 8 мл бычьего сывороточного альбумина растворяют в 0,1 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 8,0, cодержащего 0,1 М KCl, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ азида натрия и 1 мг/мл Cu (His). В раствор добавляют 0,02 мл 5% глутарового альдегида, смесь тщательно перемешивают и выливают на лавсановую мембрану (ядерный фильтр) проницаемостью 10,7 % и диаметром пор 0,16 мкм, площадью 9 см2. Для получения ферментной мембраны, применяемой в анализаторах для определения этилового спирта, на поверхность приготовленной двухслойной мембраны надевают ацетатцеллюлозную мембрану толщиной 10 мкм. Полученную трехслойную мембрану с каплей буфера помещают в холодильник на сутки, затем надевают на электрод и тщательно отмыв струей буфера определяют ток ферментного электрода при pH 8,0 при 0,6 В отн. Ag/AgCl электрода сравнения.
Аналогично проводят иммобилизацию алкогольоксидазы с использованием комплекса Cu(His) в концентрации 0,5 и 1,5 мг/мл или в отсутствии комплекса по известному способу. Готовят аналогичные примеру 2 ферментные электроды.
В табл. 1 приведены сравнительные параметры полученных электродов. Измерения проведены в 0,01 М фосфатном буфере (0,1 М KCl, 1 мМ ЭДТА), pH 8,0.
Из табл. 1 видно, что при тех же концентрациях этилового спирта плотность тока или чувствительность электродов (2-4), содержащих иммобилизованные мембраны согласно предлагаемому способу, гораздо выше, чем содержащих мембрану (1), приготовленную согласно прототипу. Повышение активности иммобилизованной алкогольоксидазы обеспечивается при концентрациях Cu(His) 0,5-1,5 мг/мл. Однако наилучшие результаты реализации способа получены при концентрации комплекса 1 мг/мл, так как плотность тока электрода, изготовленного на основе этой иммобилизованной алкогольоксидазы, при всех концентрациях алкоголя (в интервале 5-80 мМ) увеличивается в 3,6-4,6 раза по сравнению с прототипом (ср. например, плотность тока при концентрации алкоголя 70 мМ равную 40,04 и 8,63 соответственно).
П р и м е р 3. Для определения стабильности иммобилизованной алкогольосидазы изготавливают электроды с ферментными мембранами, изготовленными по предложенному способу с использованием комплекса Cu(His) в концентрации 1 мг/мл и по прототипу, и определяют зависимость тока электродов от продолжительности хранения. Полученные результаты приведены в табл. 2. (концентрация этилового спирта в ячейки 0,5 мМ, другие условия как в примере 2). Ферментная мембрана хранится в холодильнике.
Из табл. 2 видно, что в течение 4 мес эксплуатации чувствительность электрода, приготовленного на основе иммобилизованной глюкозооксидазы по данному способу, уменьшается на 30% , тогда как мембрана, приготовленная по прототипу, за этом время полностью теряет активность, а в течение одного месяца на 50% . (56) 1. Ю. Ю. Кулис. Аналитические системы на основании иммобилизованных ферментов. Вильнюс, "Мокслас", 1981, с. 8-23.
2. Авторское свидетельство СССР N 1326978, кл. G 01 N 27/46, 1989.
3. Авторское свидетельство СССР N 1615179, кл. C 12 N 11/08, 1990.
Claims (1)
- СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ, предусматривающий включение дрожжевой алкогольоксидазы в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин, глутаровый альдегид и азид натрия в буферном растворе, перемешивание и последующее нанесение на ядерный фильтр, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности целевого продукта, в гелевую структуру дополнительно вводят комплекс меди и гистидина Cu (His) в концентрации 0,5 - 1,5 мг/мл.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU915008288A RU2010858C1 (ru) | 1991-07-03 | 1991-07-03 | Способ иммобилизации алкогольоксидазы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU915008288A RU2010858C1 (ru) | 1991-07-03 | 1991-07-03 | Способ иммобилизации алкогольоксидазы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010858C1 true RU2010858C1 (ru) | 1994-04-15 |
Family
ID=21588364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU915008288A RU2010858C1 (ru) | 1991-07-03 | 1991-07-03 | Способ иммобилизации алкогольоксидазы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2010858C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2199347C2 (ru) * | 1996-08-02 | 2003-02-27 | Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. | Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером |
| CN117884176A (zh) * | 2023-12-12 | 2024-04-16 | 广东省科学院江门产业技术研究院有限公司 | 一种多糖凝胶包覆的铁纳米酶制备方法及其醇溶蛋白改性应用 |
-
1991
- 1991-07-03 RU SU915008288A patent/RU2010858C1/ru active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2199347C2 (ru) * | 1996-08-02 | 2003-02-27 | Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. | Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером |
| CN117884176A (zh) * | 2023-12-12 | 2024-04-16 | 广东省科学院江门产业技术研究院有限公司 | 一种多糖凝胶包覆的铁纳米酶制备方法及其醇溶蛋白改性应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4919767A (en) | Sensor and method for analyte determination | |
| EP0216577B1 (en) | Sensor | |
| Bennet-Clark et al. | Water relations of plant cells. III. The respiration of plasmolysed tissues | |
| JP2685145B2 (ja) | 酵素電極 | |
| Campbell et al. | Enzymatic recycling of coenzymes by a multi-enzyme system immobilized within semipermeable collodion microcapsules | |
| JPH0761280B2 (ja) | グルコ−ス及び１，５−アンヒドログルシト−ルの同時測定法 | |
| CA1205402A (en) | Method for production of an immobilized enzyme by means of a crosslinking agent | |
| DE2305320A1 (de) | Durch einschluss in ein wasserloesliches, hydrophiles polymer stabilisierte enzymkoerper | |
| EP0105736B1 (en) | Immobilization of proteins on polymeric supports | |
| RU2010858C1 (ru) | Способ иммобилизации алкогольоксидазы | |
| JPS61145447A (ja) | 固定化酵素膜 | |
| Boguslaski et al. | A kinetic study of microencapsulated bovine carbonic anhydrase | |
| DE2553649A1 (de) | Verfahren zur durchfuehrung von enzymatischen reaktionen | |
| SU1615179A1 (ru) | Способ иммобилизации алкогольоксидазы | |
| Yoshida et al. | Immobilization of glucoamylase on polymer surface by radiation‐induced polymerization of glass‐forming monomers at low temperatures | |
| Tang et al. | Optimisation of enzyme electrodes | |
| SU1057535A1 (ru) | Способ получени иммобилизованной дрожжевой алкогольдегидрогеназы | |
| SU1130598A1 (ru) | Способ получени иммобилизованных оксидоредуктаз | |
| DE2634562A1 (de) | Enzym-membran | |
| Ohki et al. | The reduction of methemoglobin in Neo Red Cell | |
| Ohki et al. | Enzyme Electrode for Hydrogen Peroxide Using a New Enzyme-Immobilization" Polymer-Enzyme Aggregate". | |
| SU665635A1 (ru) | Способ иммобилизации нуклеиновых кислот | |
| SU1341189A1 (ru) | Способ получени иммобилизованной люциферазы светл ков | |
| CA1283615C (en) | Removal of bilirubin by the pseudoperoxidase activity of immobilized hemoglobin | |
| JPS62150166A (ja) | 液体試料成分測定用試験片 |