RU2337922C9 - ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ЭПИТОПА БЕЛКА p17 ВИРУСА ВИЧ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН, А ТАКЖЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИ-p17-АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСПОЗНАЮЩИЕ УКАЗАННЫЙ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ ЭПИТОП - Google Patents
ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ЭПИТОПА БЕЛКА p17 ВИРУСА ВИЧ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН, А ТАКЖЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИ-p17-АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСПОЗНАЮЩИЕ УКАЗАННЫЙ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ ЭПИТОП Download PDFInfo
- Publication number
- RU2337922C9 RU2337922C9 RU2004106618/13A RU2004106618A RU2337922C9 RU 2337922 C9 RU2337922 C9 RU 2337922C9 RU 2004106618/13 A RU2004106618/13 A RU 2004106618/13A RU 2004106618 A RU2004106618 A RU 2004106618A RU 2337922 C9 RU2337922 C9 RU 2337922C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hiv
- amino acid
- protein
- arg
- antibodies
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 105
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 81
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 102100029905 DNA polymerase epsilon subunit 3 Human genes 0.000 claims abstract description 114
- 101710104359 F protein Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims abstract description 61
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 101710104895 DNA replication protein 17 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102100037593 Retinal rod rhodopsin-sensitive cGMP 3',5'-cyclic phosphodiesterase subunit delta Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 11
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 claims 4
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 claims 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 3
- 101710142158 Protein P17 Proteins 0.000 abstract 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 11
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 11
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 11
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 11
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 10
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 9
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical group C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JECYNCQXXKQDJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methylhexan-2-yloxymethyl)oxirane Chemical compound CCCCC(C)(C)OCC1CO1 JECYNCQXXKQDJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZKGFGLOQNSMBS-UHFFFAOYSA-N 4,5,6-trichlorotriazine Chemical compound ClC1=NN=NC(Cl)=C1Cl LZKGFGLOQNSMBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 229930182847 D-glutamic acid Natural products 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical class NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 108010031071 cholera toxoid Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl formate Chemical compound CCOC=O WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 101150080184 p17 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
- A61K47/6897—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies
- A61K47/6898—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies using avidin- or biotin-conjugated antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Описывается полипептид белка р17 вируса ВИЧ с аминокислотной последовательностью, состоящей из пептида, соответствующего нейтрализующему эпитопу белка р17 ВИЧ, и пептида, соответствующего положениям 23-30 белка р17 ВИЧ. Пептид связан с пептидом нейтрализующего эпитопа в карбоксиконцевом положении эпитопа и придает ему растворимость. Раскрыты вакцинные композиции на основе полипептида, варианты применения полипептида, такие как для приготовления лекарственного средства против ВИЧ, а также в качестве специфического реагента в тесте на обнаружение нейтрализующих анти-р17-антител. Описаны моноклональные и поликлональные анти-р17-антитела, способные специфическим образом распознавать нейтрализующий эпитоп полипептида и нейтрализовать его биологическую активность. Раскрыто использование указанных антител к полипептиду для обнаружения р17 в биологическом материале и для приготовления лекарственного средства, ингибирующего активность белка р17 у инфицированных ВИЧ. Использование изобретения позволяет индуцировать нейтрализующие анти-р17-антитела и ингибировать активность р17, что может найти применение в медицине для приготовления вакцины или прививочного материала против ВИЧ. 9 н. и 8 з.п. ф-лы.
Description
Настоящее изобретение относится к изолированным полипептидам на основе последовательности аминоконцевой области белка р17 ВИЧ, используемым для терапии и диагностики синдрома приобретенного иммунодефицита человека (AIDS, СПИД), а также к нейтрализующим анти-р17-антителам, которые специфически распознают такую аминоконцевую последовательность.
СПИД включает в себя группу клинических синдромов, вызванных ретровирусом, называемым вирусом иммунодефицита человека (HIV, ВИЧ). ВИЧ инфицирует преимущественным образом клетки, экспрессирующие на своей поверхности антиген CD4, и, следовательно, Т-лимфоциты-хелперы и макрофаги, а также дендритные клетки лимфатических узлов.
Заражение ВИЧ может блокироваться in vitro с помощью антител, полученных из сыворотки инфицированных пациентов.
За последние годы были разработаны различные антитела, нейтрализующие ВИЧ, большинство которых взаимодействует с белковыми продуктами гена env.
Такие белковые продукты находят применение в качестве иммуногенов в различных формах, например, в виде гликопротеиновых экстрактов, рекомбинантных белков и синтетических пептидов.
Продукты гена env традиционно рассматриваются как наиболее иммуногенные белки ВИЧ и наиболее пригодны для стимуляции защитной иммунной реакции против ВИЧ.
Однако внимание исследователей привлекают также белки, закодированные другими генами ВИЧ, например, gag. Как известно, ген gag кодирует полипротеин-предшественник с молекулярной массой около 550000 (р55), который разрезается протеазой pol на полипептиды р24, р17 и р15, составляющие структурные белки ядра вириона.
В некоторых исследованиях было показано, что продукты гена gag могут служить мишенью нейтрализующей иммунной реакции.
Было обнаружено, что белок р17 ВИЧ может служить мишенью для антител, нейтрализующих репликацию ВИЧ и что высокие уровни содержания анти-р17-антител коррелируют с замедлением развития СПИД.
В патенте США 5185147 раскрыты некоторые изолированные полипептидные последовательности на основе аминоконцевой области р17, способные индуцировать анти-р17-антитела, которые взаимодействуют с вирусной частицей ВИЧ, изменяя инфицирующую способность in vitro. Однако в соответствии с данными электронной микроскопии (например, Andreassen H., H.Bohr, J.Bohr, S.Brunak, T.Bugge, R.M.J.Cotterill, C.Jacobsen, P.Kush, B.Lautrup, S.B.Petersen, T.Saemark и K.Ulrich, 1990, J.Acquir. Immune Def. Syndr. 3:615-622) белок р17 находится в вирусной частице и поэтому недоступен для взаимодействия с анти-р17-антителами. В связи с этим изменение инфицирующей способности вирусной частицы ВИЧ in vitro, которое наблюдалось в цитированной работе, не может быть приписано эффективному ингибированию биологической активности белка р17.
Проблема, к которой относится настоящее изобретение, состоит в обнаружении полипептидов на основе последовательности белка р17, которые бы обладали способностью эффективно индуцировать антитела, нейтрализующие биологическую активность белка р17 ВИЧ.
Для решения указанной проблемы авторы настоящего изобретения, прежде всего, исследовали механизм биологического действия белка р17.
Как более подробно изложено в разделе, касающемся примеров, авторы установили, что, с одной стороны, биологическая активность р17 определяется его способностью повышать продукцию таких провоспалительных цитокинов, обладающих про-ВИЧ-эффектом, таких как IFN-γ и TNF-α, а с другой стороны, его способностью повышать продукцию указанных провоспалительных цитокинов, в случае ингибирования таким анти-воспалительным цитокином, как, например, IL-4.
Кроме этого авторы изобретения обнаружили, что биологическая активность белка р17 проявляется в результате взаимодействия между белком в виде самостоятельного объекта, отделенного от вирусной частицы, и специфическими рецепторами, экспрессированными на поверхности клетки-мишени ВИЧ. Существование таких рецепторов белка р17 на лимфоцитах, являющихся мишенью для ВИЧ, до настоящего времени не предполагалось.
Основой настоящего изобретения является обнаружение взаимодействия р17/рецептор.
В результате исследования взаимодействия в системе р17/рецептор авторы изобретения фактически идентифицировали область белка р17, представляющую собой участок, связывающийся с рецептором клетки и способный выявлять антитела, ингибирующие биологическую активность белка р17, и исследовали их связывание с самим рецептором. В настоящем описании такие антитела обозначены как «нейтрализующие анти-р17-антитела», а в соответствующих случаях такая область связывания обозначается как «нейтрализующий эпитоп».
Таким образом, авторы изобретения подтвердили тот факт, что изолированные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность на основе последовательности нейтрализующего эпитопа р17, т.е. последовательность на N-концевом участке, расположенном между аминокислотными положениями 9 и 22 белка р17, способны решить проблему, адресованную настоящим изобретением, поскольку благодаря своей вторичной структуре такие полипептиды способны индуцировать антитела, нейтрализующие биологическую активность белка р17. В этой связи, рассматриваемые полипептиды особенно подходят для использования в вакцине, препятствующей репликации ВИЧ.
Аминокислотные остатки последовательности р17, используемой в изобретении, нумеруют способом, предложенным в работе Ratner et al. (1985), Nature 313:277.
Кроме этого было показано, что полипептиды настоящего изобретения специфически распознаются нейтрализующими моноклональными анти-р17-антителами, тогда как они не распознаются моноклональными анти-р17-антителами, не обладающими нейтрализующей способностью. В связи с этим, рассматриваемые полипептиды особенно подходят для использования в диагностических методах обнаружения наличия нейтрализующих анти-р17-антител у объектов, инфицированных ВИЧ, а также в способах очистки таких антител.
В связи со сказанным выше, первая цель настоящего изобретения относится к изолированному полипептиду, способному специфически реагировать с нейтрализующим анти-р17-антителом-ВИЧ, аминокислотная последовательность которого соответствует последовательности нейтрализующего эпитопа белка р17 ВИЧ, другими словами представляет собой последовательность, расположенную между 9 и 22 позициями в последовательности белка р17 ВИЧ.
Как более подробно описывается в следующих примерах, авторы изобретения вначале сконструировали указанный выше синтетический полипептид на основе последовательности нейтрализующего эпитопа белка р17, содержащегося в плазмиде ВН10 (лабораторный образец). Такой синтетический полипептид имеет последовательность NH2-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 2). Авторы изобретения экспериментально подтвердили, что такой полипептид специфически распознается нейтрализующими моноклональными антителами, полученными против белка р17 плазмиды BH10.
Таким образом, этот полипептид можно использовать в качестве иммуногена, вызывающего продукцию антител, нейтрализующих биологическую активность р17 BH10.
В дальнейшем было подтверждено, что варианты белка р17, характерные для других штаммов ВИЧ, имеют изменения в области нейтрализующего эпитопа, которые, однако, незначительно влияют на их распознавание антителами, нейтрализующими биологическую активность р17. В качестве примера, иллюстрирующего цитированные варианты, можно привести последовательность р17 вирусных штаммов, распространенных в Африке (clade C).
Изолированные полипептиды с аминокислотными последовательностями на основе последовательности, расположенной между положениями 9 и 22 в белке р17 вирусных штаммов, распространенных в специальных географических районах, позволяют получать антитела, обладающие большим сродством по сравнению с соответствующим белком р17, что обусловливает возможность их применения в качестве вакцин в указанных географических районах.
На основании информации о последовательностях, содержащейся в банках генетических данных (например, GenBank) и относящейся к последовательности р17 штаммов из различных географических районов, авторы согласно изобретению получили серии синтетических полипептидов, соответствующих положениям 9-22 р17 различных штаммов ВИЧ, которые обладают иммунологическим свойством, заключающимся в специфической реакции с нейтрализующими антителами, направленными против р17 соответствующего штамма ВИЧ.
Рассматриваемые полипептиды отвечают следующей общей формуле: NH2-X1-Gly-X2-X3-Leu-Asp-X4-Trp-Glu-X5-Ile-X6-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 1), в которой Х1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Ser и Arg; X2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Gly, Glu и Ser; X3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Glu, Lys, Asp и Arg; X4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp и Gln; X5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Lys, Arg, и Ser; а Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Arg и Gln.
Все аминокислоты, идентифицированные в настоящем описании, находятся в L-конфигурации. Сокращения, используемые для названий аминокислотных остатков, соответствуют стандартной номенклатуре.
Среди описанной выше группы полипептидов полипептид с аминокислотной последовательностью NH2-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 2) относится к предпочтительному воплощению изобретения. Рассматриваемый полипептид соответствует последовательности между положениями 9 и 22 р17 лабораторного штамма BH10 вируса ВИЧ-1, являющегося представителем штаммов, существующих в Европе и Америке (clade B).
Для повышения растворимости полипептиды согласно изобретению могут связываться с подходящей второй аминокислотной последовательностью, например, с последовательностью -Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-COOH (SEQ ID NO: 3), соответствующей положениям 23-30 последовательности белка р17 штамма НВ10 ВИЧ-1.
В соответствии с таким воплощением настоящего изобретения вторую аминокислотную последовательность соединяют непосредственно с карбокситерминальным остатком полипептида.
Полипептиды согласно изобретению обладают способностью индуцировать нейтрализующую иммунную реакцию при применении на пациенте, инфицированном соответствующим штаммом ВИЧ, и в связи с этим подходят для использования в вакцине.
В контексте настоящего описания термин вакцина охватывает композицию, содержащую полипептид согласно изобретению в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель, причем применение эффективного количества такой композиции способно стимулировать иммунитет субъекта, например млекопитающего, включая человека.
В связи со сказанным выше, вторая цель настоящего изобретения относится к составу вакцины, включающему в себя полипептид согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Такая композиция также подходит для использования в качестве инокулята, предназначенного для применения на млекопитающих, отличных от человека, с целью генерации антител, вступающих в иммунную реакцию с ВИЧ, в особенности нейтрализующих анти-р17-антител ВИЧ.
В соответствии с предпочтительным воплощением, когда полипептиды используют в составе вакцины или инокулята, полипептиды можно конъюгировать с походящей молекулой-носителем, другими словами, с молекулой, способной сшиваться с полипептидом и придавать ему иммуногенные свойства. Упомянутый выше полипептид, конъюгированный с носителем, охватывается областью согласно изобретению.
Примерами носителей, подходящих для таких целей, могут служить такие белки, как KLH (гемоцианин лимфы улитки), эдестин, тироглобулин, такие альбумины, как бычий сывороточный альбумин (BSA) или альбумин человеческой сыворотки (HSA), такие эритроциты, как эритроциты барана (SRBC), столбнячный анатоксин, холерный анатоксин, такие полиаминокислоты, как, например, поли(D-лизин:D-глутаминовая кислота), и т.п.
С целью облегчения связывания полипептида с молекулой-носителем к N-концу или С-концу полипептида могут быть присоединены аминокислотные остатки. Для этой цели в качестве дополнительного остатка на С-конце полипептида лучше всего использовать цистеин (Cys), поскольку, как известно, цистеин способен образовывать дисульфидные связи.
Следовательно, в том случае, когда полипептид согласно изобретению подлежит конъюгации с носителем, предпочтительно, чтобы он содержал дополнительный остаток цистеина (Cys), связанный с карбоксиконцевым остатком полипептида. В этом контексте выражение «карбоксиконцевой остаток полипептида» относится к карбоксиконцевому остатку последовательности нейтрализующего эпитопа белка р17 (Arg 22 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2) или к карбоксиконцевому остатку второй аминокислотной последовательности, функция которой состоит в увеличении растворимости полипептида (Lys 30 в SEQ ID NO: 3).
В соответствии с другим воплощением изобретения рассматриваемый полипептид может содержать дополнительный остаток норлейцина (Nleu) в С-концевом положении, которое предшествует положению упомянутого выше дополнительного цистеинового остатка, с целью лучшего отслеживания пептида в ходе процесса конъюгации с молекулой-носителем.
Таким образом, в соответствии с одним из воплощений изобретения полипептид конъюгирует с носителем, предпочтительно с помощью дополнительного остатка цистеина (Cys) или дополнительного дипептида Nleu-Cys в С-концевом положении.
В качестве альтернативы применению носителя полипептиды согласно изобретению могут использоваться в виде разветвленных пептидов.
В этой связи упомянутый выше полипептид в виде разветвленных пептидов также входит в область настоящего изобретения.
Выражение «разветвленный пептид» относится к комплексу с большой молекулярной массой, состоящему из множества идентичных копий полипептида согласно изобретению, связанных с центральным ядром, которое способно одновременно связывать множество идентичных копий указанного полипептида.
Разветвленный пептид может быть получен путем связывания нескольких копий полипептида с центральным ядром полилизина «МАР technology», в результате чего достигается большая молекулярная масса и обеспечивается иммуногенность даже в отсутствие молекулы-носителя (Nordelly B., et al., 1992, J. Immunol. 148:914-920). Кроме того, ядро полилизина может подвергаться модификации, например, в соответствии с Okeda K., et al., 1993, Journal of Molecular Recognition 6: 101-109 или замещаться такими другими веществами, как, например, глюкоза, которая обладает одинаковой с полилизином способностью к связыванию нескольких молекул полипептида с образованием высокомолекулярных комплексов.
Выбор носителя или типа ядра основан на известных критериях и практически не зависит от природы используемого эпитопа, вследствие чего он не является специальным объектом настоящего изобретения и его подробное описание не приводится.
Состав вакцины или инокулята согласно изобретению, кроме того, может содержать дополнительные ингредиенты, включающие в себя, например, антигенный адъювант, представляющий собой вещество, способное повышать эффективность или иммуногенность антигена.
Поскольку некоторые адъюванты, подходящие для животных, не применимы для людей, для вакцины и инокулята могут использоваться одинаковые или различные адъюванты.
Примерами адъювантов, используемых в вакцине, могут служить Alum (гидроксид алюминия), неполный адъювант Фрейнда и соединение MF59, недавно описанное Graham B.S., et al. (Ann. Int. Med. 1996, 125: 270-279).
Вакцина или инокулят согласно изобретению содержит эффективное количество полипептида согласно изобретению. Эффективное количество полипептида в стандартной дозе зависит от ряда критериев, которые, как хорошо известно, среди прочего, включают в себя природу объекта инокуляции, массу тела объекта, подлежащего инокуляции, и предписанного режима применения. Вакцины и прививочные материалы обычно содержат полипептид в количестве, которое может изменяться в интервале 1-100 микрограммов/кг в случае использования на млекопитающих среднего размера (козы, собаки и обезьяны) и на людях, и в интервале от 10 мг до 500 микрограммов в расчете на дозу в случае применения на мелких животных (мыши, крысы, кролики, хомячки).
Рассматриваемые количества основаны на массе полипептида как такового, без учета массы носителя, если он присутствует.
Как отмечалось выше, полипептиды согласно изобретению могут использоваться в качестве специальных реагентов для анализов на определение наличия в образце биологического материала, нейтрализующих анти-р17-антител, т.е. антител, направленных против белка р17 и способных нейтрализовать биологическую активность указанного белка.
Такой анализ может использоваться, например, для мониторинга противовирусных и иммуномодулирующих терапий, а также для мониторинга развития заражения ВИЧ.
Такой анализ также может использоваться в промышленных применениях, например, для контроля количества иммуноглобулиновых препаратов против р17, получаемых хроматографическими методами и другими препаративными технологиями.
Анализ на обнаружение нейтрализующих антител против р17 может представлять собой иммунологический анализ, такой, например, как иммуноферментный анализ в гетерогенной фазе (ELISA, твердофазный иммуноферментный анализ) или в гомогенной фазе (EMIT, иммуноанализ с ферментативным усилением), радиоиммунологический анализ, иммунологический анализ на основе флуоресценции, вестерн-блоттинг или любая другая методика, в которой антитело или антиген маркируют детектируемой молекулой или любыми другими индикаторными средствами.
Изолированный полипептид на основе нейтрализующего эпитопа р17 согласно изобретению или смесь таких полипептидов могут использоваться в качестве антигена. Полипептид может необязательно коньюгироваться с молекулой-носителем с целью облегчения связывания с носителем или для увеличения молекулярной массы с целью лучшего распознавания в анализе вестерн-блоттинг.
Так, например, в иммуноферментном тесте ELISA полипептид согласно изобретению, используемый в качестве антигена, может наноситься на твердую подложку, например, на титрационный микропланшет, полоску или лунку с использованием способов, известных в данной области техники.
После нанесения антигена на твердый носитель его инкубируют в присутствии образца интересующего биологического материала, т.е. материала, в котором желают подтвердить наличие нейтрализующих анти-р17-антител.
Такой биологический материал может представлять собой, например, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, мочу, слюну или клеточный сок или тканевую культуральную жидкость и т.п.
Связанное антитело может обнаруживаться в результате добавления антисыворотки или моноклонального антитела, конъюгированного с ферментом. Для этой цели может использоваться любая известная ферментная метка (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и т.п.). Чувствительность теста может быть улучшена в результате использования биотин-авидиновой или стрептавидиновой системы для детекции аналита.
Окончательное обнаружение может проводиться путем добавления раствора субстрата, который может изменяться в зависимости от природы используемого фермента. Примерами подходящих субстратов могут служить О-фенилендиамин, тетраметилбензидин, паранитрофенилфосфат. Полученные результаты могут регистрироваться визуально или с применением спектрофотометра.
Может проводиться как качественный, так и количественный тест на нейтрализующие анти-р17-антитела. Количественный тест может проводиться известными методами, например титрованием в конечной точке или построением эталонной кривой.
Полипептиды согласно изобретению также могут использоваться в качестве специальных реагентов для очистки нейтрализующих анти-р17-антител из биологической пробы. Такая биологическая проба может представлять собой образец биологического материала, взятый у субъекта, например образец крови, плазмы, сыворотки, слюны, мочи или образец асцитной жидкости, ткани или клеточной культуральной жидкости, либо препарата иммуноглобулина.
Указанный субъект может представлять собой пациента человеческого рода, инфицированного вирусом ВИЧ, или млекопитающее, отличное от человека, которому сделана прививка белка, способного вызывать продуцирование нейтрализующих анти-р17-антител. Таким белком может служить, например, белок р17 вируса ВИЧ в практически очищенной или рекомбинантной форме, или полученный из него полипептид, содержащий по меньшей мере нейтрализующий эпитоп р17, идентифицированный в настоящем изобретении, причем такой полипептид необязательно конъюгирован с носителем или находится в виде разветвленного пептида, или в любой другой иммуногенной форме.
В данном контексте выражение «белок р17 в практически очищенной форме» относится к белку р17, практически изолированному от остатка вирусной частицы.
Нейтрализующие антитела могут быть очищены с помощью любого известного метода аффинной очистки с использованием полипептида согласно изобретению или смеси таких полипептидов в качестве очищающего реагента.
Для этого полипептид, используемый в качестве очищающего реагента, связывают с матриксом, подходящим для использования в аффинных методах очистки, например с агарозой, силикагелем, полиакриламидом, магнитными гранулами и т.п.
Связывание полипептида с матриксом может обеспечиваться путем сшивания функциональных групп, присутствующих в матриксе и в пептиде в результате введения спейсерной группы. Обычно спейсерные группы представляют собой С6-С8-алифатические цепочки с функциональными группами, способными образовывать мостик между матриксом и пептидом. Для этой цели могут использоваться как гидрофобные функциональные группы (например, спейсерные группы, включая бензольное кольцо), так и гидрофильные функциональные группы (например, спирты). Альтернативой спейсерным группам могут служить молекулы-носители или биотин.
Во избежание денатурации пептида и для облегчения его связывания с матриксом полезно проводить предварительную активацию матрикса, в результате которой последующее связывание лиганда может осуществляться в мягких условиях.
Активация представляет собой химическую реакцию между матриксом и активирующими веществами, приводящую к образованию на поверхности самого матрикса реакционоспособных групп, которые быстро соединяются с лигандными группами. Известны такие реакционноспособные группы, как имидокарбонат, оксиран, трихлортриазин, О-имидазолилкарбонил и т.п. Спейсер с концевой аминогруппой может активироваться по реакции с N-гидроксисукцинимидным сложным эфиром или с бромуксусной кислотой с образованием высокореакционноспособного алкилирующего агента.
С другой стороны, полипептид может связываться с матриксом посредством ковалентных связей, например, с использованием триазиновой смолы.
Наконец, полипептид может связываться с матриксом в результате образования двухсторонних ковалентных связей.
Аффинная связь между полипептидом, присоединенным к матриксу, и анти-р17-антителами может разрушаться либо непосредственно, в результате создания условий, которые препятствуют биоспецифическим взаимодействиям, либо в результате конкурентного аффинного элюирования.
Анти-р17-антитела, специфически связывающиеся с полипептидом согласно изобретению, способны нейтрализовать биологическую активность белка р17 вируса ВИЧ и препятствовать взаимодействию между белком и его клеточным рецептором (см. пример 7).
Такие антитела могут быть получены по описанной выше методике очистки или в виде моноклональных антител с помощью метода слияния клеток, описанного в примере 6.
Авторы изобретения также установили, что моноклональные анти-р17-антитела, не обладающие способностью нейтрализовать биологическую активность белка р17 вируса ВИЧ, также неспособны связывать нейтрализующий эпитоп белка р17 в анализе ELISA, проводимом в твердой фазе (см. пример 8).
В связи с этим, другая цель настоящего изобретения относится к моноклональному или поликлональному антителу против белка р17 вируса ВИЧ, которое способно нейтрализовать биологическую активность белка р17 ВИЧ и специфически распознавать нейтрализующий эпитоп белка р17 ВИЧ, причем нейтрализующий эпитоп представляет собой аминокислотную последовательность, расположенную между 9 и 22 позициями последовательности белка р17 ВИЧ.
В соответствии с предпочтительным воплощением аминокислотная последовательность нейтрализующего эпитопа, распознаваемого антителом, согласно изобретению представляет собой последовательность: X1-Gly-X2-X3-Leu-Asp-X4-Trp-Glu-X5-Ile-X6-Leu-Arg- (SEQ ID NO: 1), где Х1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Ser и Arg; X2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Gly, Glu и Ser; X3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Glu, Lys, Asp и Arg; X4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp и Gln; X5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Lys, Arg и Ser; X6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Arg и Gln. Более предпочтительная аминокислотная последовательность имеет вид: -Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg (SEQ ID NO: 2).
Антитела согласно изобретению могут использоваться в клинических, терапевтических или профилактических целях, в качестве специфических антагонистов белка р17 для селективной иммуносупрессии физиологического ответа, индуцированного таким вирусным белком, и, в частности, тех реакций, которые вовлечены в активацию провоспалительного иммунного процесса и которые зависят от взаимодействия р17 с его клеточным рецептором.
В этой связи другой целью настоящего изобретения является применение описанного выше антитела для приготовления медикамента, предназначенного для ингибирования иммуностимулирующих эффектов белка р17 ВИЧ, проявляющихся в ходе ВИЧ-инфицирования.
С этой целью антитела согласно изобретению могут использоваться в нативной форме, в денатурированной форме или в виде антигенсвязывающих иммуноглобулиновых фрагментов (т.е. фрагментов F(Ab')2, Fab, Fab' или Fv). Такие фрагменты иммуноглобулина могут быть получены химическими, ферментативными методами или с помощью технологии рекомбинантной ДНК, например, с использованием миниантител.
Фрагменты антител или антитела применяют, предпочтительно, парентеральным методом, более предпочтительно, внутривенно; кроме этого весьма предпочтительно проводить медленное применение, например, с помощью стандартного набора для внутривенного введения или из подкожного депо.
При парентеральном применении антитела формируют в виде стандартной дозы в форме для инъекций, например, в виде раствора, эмульсии или суспензии, в состав которых также входит фармацевтически приемлемый носитель. Указанный носитель может быть водным или неводным и, кроме этого, может содержать вещества, способные повышать изотоничность и химическую устойчивость лекарственного средства. Такое антитело предпочтительно готовить в очищенной форме, практически не содержащей агрегатов и других белков, при различных концентрациях, предпочтительно в интервале 0,5-20 мг/мл.
Дозу, подлежащую применению, определяют путем измерения влияния анти-р17-антитела на уменьшение параметров, являющихся признаками заболевания, подлежащего лечению. С учетом естественного клиренса антител дозу можно периодически повторять в соответствии с клиническим статусом пациента и степенью репликации ВИЧ. В профилактических целях можно использовать короткие двухмесячные, шестимесячные или годовые курсы применения анти-р17-антител.
Кроме этого антитела согласно изобретению могут использоваться в качестве специальных реагентов в анализе на обнаружение белка р17, например, в такой пробе биологического материала, как образец тканевой культуры или клеточной культуральной жидкости, или образец биологического материала, взятого у пациента.
Анализ на обнаружение антигена может осуществляться таким традиционным методом, как конкурентный иммунологический анализ или анализ с захватом антигена (RIA, ELISA, вестерн-блоттинг, TR-FIA и т.п.). Для проведения конкурентного иммунологического анализа может использоваться натуральный или рекомбинантный белок р17 либо один или более полипептидов на основе нейтрализующего эпитопа белка р17 согласно изобретению. Эти вещества могут быть конъюгированы с такими маркерами, как, например, ферменты для метода ELISA, радиоактивные материалы для методов RIA или флуоресцентные молекулы для методов TR-FIA или других иммунофлуоресцентных методов. Обнаружение антигена может осуществляться методами иммунофлуоресценции, проточной цитометрии или другими известными способами.
Представленные ниже примеры носят исключительно иллюстративный характер и никоим образом не ограничивают область согласно изобретению.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Продукция рекомбинантного р17
Кодирующую последовательность белка р17 ВН-10 изолята ВИЧ-1 (аминокислоты 1-32, Ratner L., W.Haseltine, R.Patacra, K.J.Livak, B.Starcich, S.F.Josephs, E.R.Doran, J.A.Rafalski, E.A.Whitehoren, K.Baumeister, L.Ivanoff, S.R.Petteway, M.L.Pearson, J.A.Lautenberger, T.S.Papas, J.Ghrayeb, N.T.Chang, R.C.Gallo и F.Wong-Staal, 1985, Nature 313: 277-284) амплифицировали с помощью PCR и клонировали в сайте BamH1 плазмиды pGEX-2T (Pharmacia, Uppsala, Sweden), что обеспечивало ее слияние с NH2-концом фермента глютатион-S-трансферазы (GST).
Используемые праймеры и олигонуклеотидные последовательности выбирались на основе данных для HIVBH10 из банка данных GenBank, которые соответствовали полному геному изолята ВН-10 вируса ВИЧ-1. Правильность последовательности клонированного гена р17 подтверждали с использованием секвенирующих праймеров pGEX (Pharmacia), автоматического ДНК-секвенатора (ABI PRISM 310; Perkin Elmer, Foster City, CA) и оборудования ABI PRISM с набором Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit с AmpliTaq-ДНК-полимеразой FS (Perkin Elmer).
Слитые белки GST экспрессировали в Escherichia coli и очищали с использованием гранулированного глутатиона-4 В-сефарозы (Pharmacia). Вирусные белки разрезали с помощью GST в связанном состоянии с агарозо-глутатионовыми гранулами в соответствии с методикой, описанной Gearing D.P., N.A.Nicola, D.Metcalf, S.Foote, T.A.Willson, N.M.Gough и R.L.Williams, 1989, BioTechnology 7: 1157-1161.
Белок р17 дополнительно очищали методом обращенно-фазовой FPLC, достигая чистоты более 98%.
Отсутствие загрязнения эндотоксинами в препарате рекомбинантного р17 вируса ВИЧ-1 (<0,1 единиц эндотоксина/мл) подтверждали с помощью теста на основе Limulus amebocytes (Whitaker BioProducts, Inc, Walkersville, Maryland, USA). Очищенный р17 вируса ВИЧ-1 также подвергали биотинилированию с использованием AH-NHS-биотина (SPA, Milan, Italy) в соответствии с инструкциями производителя.
Пример 2
Культивация периферических мононуклеарных кровяных клеток крови (PBMC)
PBMC выделяли в градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Pharmacia) из гепаринизированной крови, взятой у здоровых субъектов. Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты с U-образным дном (Nunc, Roskild, Denmark) c плотностью 106 клеток/мл, и культивировали в течение указанного числа дней при 37°С в среде RPMI-1640 (Sigma, St.Louis, Mo) дополненной 10% человеческой АВ сывороткой, инактивированной нагреванием (Sigma), пенициллином в количестве 100 ед./мл и стрептомициновой полной средой 100 мкг/мл.
Пример 3
Влияние р17 на секрецию TNF-α и INF-γ под действием PBMC, стимулированных IL-2
Для решения вопроса о влиянии р17 на продукцию некоторых провоспалительных цитокинов, т.е. TNF-α и INF-γ, которые, как хорошо известно, способны создавать окружающую среду, более подходящую для репликации вируса ВИЧ-1, проводили серию экспериментов по измерению секреции таких цитокинов клетками PBMC в культуральной среде, стимулированной IL-2 в отсутствие и в присутствии р17. Тестировались различные дозы IL-2 в интервале 2,5-100 ед./мл.
Во всех проанализированных объектах доза 20 ед./мл обеспечивала последовательную индукцию секреции как в случае TNF-α, так и в случае INF-γ в супернатанте культуры РВМС. Добавление различных доз р17 увеличивало продукцию рассматриваемых цитокинов клетками РВМС, обработанными IL-2. Максимальное увеличение отмечалось при концентрации р17 порядка 50 нг/мл, хотя р17 обладает биологической активностью и при более низких концентрациях вплоть до 5 нг/мл. При концентрации р17 50 нг/мл такое увеличение более выражено для TNF-α (от 36 до 100% и более), чем для INF-γ (от 29 до 50%).
При использовании культур нестимулированных РВМС не наблюдалось повышения продукции цитокинов под действием белка р17.
Пример 4
Реверсия ингибирования, индуцированного IL-4, на продукцию TNF-α и INF-γ белком р17
Добавление IL-4 в культуры РВМС, стимулированные IL-2, приводило к снижению продукции как INF-γ, так и TNF-α. Понижение секреции INF-γ составило 62-83%, в то время как уменьшение секреции TNF-α составляло 68-84%.
Для решения вопроса о способности р17 противодействовать ингибирующему действию IL-4 вирусный белок добавляли к РВМС в начале культивации одновременно с IL-2 и IL-4.
Через 72 часа культивирования супернатанты собирали и анализировали на секрецию TNF-α и INF-γ.
Во всех проведенных экспериментах были получены результаты, показывающие, что р17 способен восстанавливать способность РВМС к продукции TNF-α и INF-γ на 88-100% и 77-89% соответственно.
Пример 5
Тест на связывание р17 со специфическим клеточным рецептором
Для того чтобы решить вопрос о взаимосвязи активности р17 и взаимодействия с рецептором, экспрессированным на клетке-мишени, вирусный белок конъюгировали с биотином и вводили в реакцию с клетками РВМС, выделенными у здоровых субъектов, или подвергнутыми 48 часовой стимуляции в присутствии фитогемоагглютинина (РНА).
Затем р17 идентифицировали на поверхности клетки методом проточной цитометрии с использованием стрептавидина, маркированного фикоэритрином.
Использовали следующую методику проведения эксперимента. Клетки РВМС подвергали стимуляции в течение двух дней в присутствии ФГА в концентрации 5 мкг/мл или оставляли без стимуляции, после чего проводили инкубацию в течение 30 минут на льду в присутствии различных количеств биотинилированного р17 в интервале от 50 до 1,6 мкг/мл. РВМС дважды промывали PBS и инкубировали в течение 30 минут на льду в присутствии подходящего количества стрептавидина, конъюгированного с фикоэритрином (Becton Dickinson, San Jose, California), разбавленным в PBS, содержащем 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS). В некоторых экспериментах клетки окрашивали анти-CD-4-, анти-CD-8-, анти-CD-16- или анти-CD-19-моноклональными антителами, конъюгированными с изоцианатом флуоресцеина (FITC) (Becton Dickinson). Для оценки фоновой флуоресценции также использовали конъюгаты антитела, предназначенные для контроля изотипа IgG (Becton Dickinson). Затем клетки дважды промывали PBS, содержащим 2% FCS и 0,2% NaN3, и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson). Анализ осуществляли с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson).
Результаты, полученные на свежих РВМС, взятых у пациента, показали, что р17 не связывает Т-лимфоциты CD-4+и CD-8+, а также NK-клетки (CD-16+), но в то же время было установлено, что такой белок присутствует на поверхности большинства В-лимфоцитов (CD-19+). С другой стороны, при стимуляции Т-лимфоциты CD-4+и CD-8+, а также NK-лимфоциты приобретают способность к связыванию р17.
Полученные данные показывают, что на циркулирующих лимфоцитах имеется рецептор для р17 вируса ВИЧ и что он конститутивно экспрессируется на В-лимфоцитах, в то время как он индуцибельно экспрессируется на поверхности T-лимфоцитов.
Пример 6
Продукция нейтрализующих моноклональных анти-р17-антител
Самкам мышей разновидности Balb/с прививали 100 мкг р17 из Примера 1, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда, и с 15-дневными промежутками делали инъекции 100 мкг белка в неполном адъюванте. Через три дня из бустера №4 удаляли селезенки с целью слияния клеток. Методика слияния, предусматривающая использование клеток мышиной миеломы NS-O в присутствии 50% полиэтиленгликоля, описана Horan Hand, P., A.Thor, D.Wunderlich, R.Muraro, A.Caruso and J.Schlom, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5227-5231.
Специфичность антител определяли методами ELISA и вестерн-блоттинга. 96-луночные титрационные микропланшеты из полистирола покрывали р17 (0,25 мкг/лунку) в карбонатном буфере. После промывки PBS, содержащего 0,05% Tween-20 (об./об.), в лунки, покрытые р17, добавляли супернатант тканевой культуры гибридомы. После одночасовой инкубации при 37°С и промывки связывание р17-моноклональных антител детектировали с использованием анти-мышиных козьих антител IgG, коньюгированных с пероксидазой хрена (Deco, Glostra, Denmark), с последующим добавлением о-фенилендиамина в качестве субстрата для колориметрической реакции.
Реакционную способность моноклональных антител с нативным р17 оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием коммерческого набора для вестерн-блоттинга ВИЧ-1 (Sanofi Diagnostic Pasteur, Marnes La Coquette, France).
Пример 7
Тест на нейтрализацию биологической активности р17 вируса ВИЧ-1
Проверяли способность моноклональных анти-р17-антител, полученных в Примере 6, оказывать влияние на биологическую активность р17 и взаимодействие белка с его клеточным рецептором, экспрессированным на Т- и В-лимфоцитах.
Клетки РВМС подвергали тройному культивированию в 96-луночных планшетах с U-образными днищами в полной среде с IL-2 (в концентрации 20 ед./мл) в присутствии или в отсутствие различных концентраций очищенного рекомбинантного р17 (концентрации в интервале 2,5-100 нг/мл). Ингибирование секреции TNF-α и INF-γ достигалось добавлением IL-4 (20 нг/мл) к клеткам, стимулированным IL-2. В начале культивирования к клеткам добавляли анти-р17-антитела в концентрации 0,5-10 мкг/мл. Через три дня активации клеток культуральные супернатанты собирали и тестировали на присутствие THF-α и INF-γ.
Анти-р17-антитела в указанных выше концентрациях также использовали для блокировки связывания р17 с клеточным рецептором, экспрессированным Т- и В-лимфоцитами. Способность антител блокировать связывание в системе р17/рецептор оценивали с помощью проточной цитометрии.
Среди различных антител, полученных в примере 6, лишь одно, названное MBS-3, оказалось способным блокировать влияние р17 на секрецию провоспалительных цитокинов. Фактически в клетках РВМС, стимулированных IL-2 и р17, снижалась продукция INF-γ и THF-α до значений, сравнимых со значениями, полученными в культурах, стимулированных только IL-2, в том случае, когда моноклональное антитело MBS-3 добавляют в культуру в начале стимуляции с митогеном (данные не представлены).
Добавление MBS-3 в культуры, стимулированные IL-2 плюс IL-4 и р17, полностью блокирует способность вирусного белка к реверсии ингибиторной активности IL-4.
Другие моноклональные анти-р17-антитела и среди них особенно одно, обозначенное МК-1, не обладают какой-либо способностью к нейтрализации. Кроме того, добавление MBS-3 в начале стимуляции совместно с митогеном не препятствует, в отсутствии р17, синтезу провоспалительных цитокинов и ингибирующему действию IL-4. Наконец, MBS-3 (но не МК-1) полностью блокирует связывание р17 с его рецептором дозозависимым образом.
Пример 8
Картирование эпитопа
Нейтрализующее моноклональное анти-р17-антитело MBS-3 охарактеризовывали по связыванию со специфическими эпитопами р17 с помощью метода картирования эпитопов.
На основе известной последовательности р17 штамма НВ10 вируса ВИЧ-1 синтезировали 62 пептида длиной в 10 аминокислот. Такие пептиды отражают р17 полной длины и перекрывают друг друга со сдвигом на две аминокислоты вдоль молекулы р17.
В качестве положительного контроля синтеза пептидов и реактивности антител также синтезировали полипептид EAENLKKYFN (однобуквенная кодировка) INF-γ, который распознается моноклональным антителом IGMB-15 (Caruso A., L.Tiberio, C. De Rango, C.Bonfanti, G.Flamminio, G.Gribaudo, E.Monti, E.Viani, N.Manca, G.Garotta, S.Landolfo, A.Balsari и A.Turano, 1993, J.Immonol. 150: 1029-1035).
Пептиды синтезировали с использованием набора SPOT Synthesis (Genosys Biotechnologies, Pampisfors, Great Britain) на клеточной мембране площадью 8×12 см, дериватизированной димером β-аланина с экспонированными наружу аминогруппами (NH2). Реакционную способность моноклональных антител относительно пептидов оценивали в соответствии с инструкциями производителей.
Затем идентифицировали область связывания MBS-3 в последовательности между положениями 9 и 22 белка р17 (SEQ ID NO: 2). Аналогичный пептид также распознается двумя другими нейтрализующими анти-р17-антителами в твердофазном тесте ELISA, в то время как другие анти-р17-антитела, не обладающие нейтрализующей способностью, не распознают такой пептид.
Кроме этого в конкурентном тесте ELISA вышеупомянутый пептид оказался эффективным веществом в связывании антитела MBS-3 с р17, абсорбированным в твердой фазе.
Пример 9
Аффинная хроматография анти-р17-антител
2 мг пептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 и дополнительным остатком лизина (Lys) на С-конце связывали с 2 мл сшивающего геля Sulfolink (Pierce, Rockford, IL), следуя стандартному протоколу, рекомендованному Pierce. Аффинную колонку присоединяли к прибору FPLC (Pharmacia) и уравновешивали фосфатным буферным раствором (PBS). Гибридомные супернатанты, содержащие моноклональные анти-р17-антитела MBS-3, пропускали через колонку с объемной скоростью 0,1 мл/мин, и связанные антитела элюировали с такой же скоростью 0,1М глицина, рН 3,0. Было установлено, что элюированные антитела специфически распознают белок р17 в вестерн-блоттинг-анализе (данные не представлены).
Claims (19)
1. Полипептид, предназначенный для использования в качестве вакцины или прививочного материала, способный вызывать продукцию анти-р17-антитела, способного ингибировать провоспалительные биологические функции белка р17 ВИЧ, имеющий первую аминокислотную последовательность, соответствующую нейтрализующему эпитопу белка р17 вируса ВИЧ, представляющую собой последовательность NH2-X1-Gly-X2-X3-Leu-Asp-X4-Trp-Glu-X5-Ile-X6-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 1), соответствующую положениям 9-22 белка р17 ВИЧ, где X1 является аминокислотным остатком, выбранным из Ser и Arg; X2 является аминокислотным остатком, выбранным из Gly, Glu и Ser; X3 является аминокислотным остатком, выбранным из Glu, Lys, Asp и Arg; X4 является аминокислотным остатком, выбранным из Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp и Gln; X5 является аминокислотным остатком, выбранным из Lys, Arg и Ser; a X6 является аминокислотным остатком, выбранным из Arg и Gln, и вторую аминокислотную последовательность, которая придает растворимость полипептиду и представляет собой пептид, соответствующий положениям 23-30 белка р17 ВИЧ, и которая непосредственно связана с аминокислотным остатком в карбоксиконцевом положении указанной аминокислотной последовательности нейтрализующего эпитопа белка р17 ВИЧ.
2. Полипептид по п.1, в котором первая аминокислотная последовательность представляет собой NH2-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-COOH (SEQ ID NO: 2).
3. Полипептид по п.1, в котором вторая аминокислотная последовательность, непосредственно связанная с аминокислотным остатком в карбоксиконцевом положении указанной аминокислотной последовательности нейтрализующего эпитопа белка р17 ВИЧ, представляет собой последовательность -Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-COOH (SEQ ID NO: 3).
4. Полипептид, способный вызывать продукцию анти-р17-антитела, способного ингибировать провоспалительные биологические функции белка р17 ВИЧ, охарактеризованный в любом из пп.1-3, отличающийся тем, что он коньюгирован с носителем.
5. Полипептид по п.4, отличающийся тем, что его коньюгируют с носителем посредством дополнительного остатка цистеина (Cys) или дополнительного дипептида -Nleu-Cys в карбоксиконцевом положении.
6. Полипептид, способный вызывать продукцию анти-р17-антитела, способного ингибировать провоспалительные биологические функции белка р17 ВИЧ, охарактеризованный в любом из пп.1-5, отличающийся тем, что он имеет форму разветвленного пептида.
7. Композиция фармацевтической вакцины или прививочного материала для выработки иммунного ответа, способного нейтрализовать биологическую активность белка р17 ВИЧ, содержащая 100 мкг/кг полипептида по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.
8. Применение полипептида по любому из пп.1-5 для приготовления лекарственного средства, способного вызывать иммунный ответ, нейтрализующий биологическую активность белка р17 вируса ВИЧ у субъекта, которому вводят указанное лекарственное средство.
9. Применение полипептида по любому из пп.1-5 в качестве специфического реагента в тесте на обнаружение присутствия нейтрализующих анти-р17-антител вируса ВИЧ в образце биологического материала.
10. Применение полипептида по любому из пп.1-5 в качестве специфического реагента для очистки нейтрализующих анти-р17-антител ВИЧ из образца биологического материала.
11. Моноклональное или поликлональное антитело, направленное против белка р17 ВИЧ, распознающее эпитоп, имеющий последовательность, определяемую в любом из пп.1 и 2, и способное нейтрализовать биологическую активность белка р17 вируса ВИЧ и специфически распознавать нейтрализующий эпитоп белка р17 ВИЧ, причем указанный нейтрализующий эпитоп представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 9-22 белка р17 ВИЧ.
12. Антитело по п.11, в котором указанная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность -X1-Gly-X2-X3-Leu-Asp-X4-Trp-Glu-X5-Ile-X6-Leu-Arg- (SEQ ID NO: 1), в которой X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Ser и Arg; X2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Gly, Glu и Ser; X3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Glu, Lys, Asp и Arg; X4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Arg, Ala, Lys, Thr, Ser, Glu, Asp и Gln; X5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Lys, Arg, и Ser; a X6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Arg и Gln.
13. Антитело по п.12, где указанная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность -Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg- (SEQ ID NO: 2).
14. Антитело по любому из пп.11-13, представляющее собой иммуноглобулиновый фрагмент F(ab')2, Fab, Fab' или Fv.
15. Фармацевтическая композиция для ингибирования провоспалительных биологических функций белка р17 ВИЧ, содержащая 0,5-20 мг/мл антитела по любому из пп.11-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
16. Применение антитела по любому из пп.11-14, полученного с использованием антигена, охарактеризованного в п.1, для приготовления терапевтического или профилактического лекарственного средства, способного ингибировать иммуностимулирующую активность белка р17 вируса ВИЧ, продуцируемого в ходе ВИЧ-инфицирования.
17. Применение антитела по любому из пп.11-14, полученного с использованием антигена, охарактеризованного в п.1, в качестве специального реагента в тесте на обнаружение присутствия белка р17 вируса ВИЧ в образце биологического материала.
Приоритет по пунктам:
Приоритет по пунктам:
07.08.2001 - по п.2;
02.11.2001 - по пп.1, 3-17.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITTO2001A000795 | 2001-08-07 | ||
| IT2001TO000795A ITTO20010795A1 (it) | 2001-08-07 | 2001-08-07 | Polipeptide isolato basato sulla sequenza della proteina p17 utile come vaccino anti-hiv. |
| ITTO2001A001042 | 2001-11-02 | ||
| ITTO20011042 ITTO20011042A1 (it) | 2001-11-02 | 2001-11-02 | Polipeptidi isolati basati sulla sequenza della proteina p17 di hiv utili come vaccino anti-hiv. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004106618A RU2004106618A (ru) | 2005-07-10 |
| RU2337922C2 RU2337922C2 (ru) | 2008-11-10 |
| RU2337922C9 true RU2337922C9 (ru) | 2009-02-10 |
Family
ID=26332884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004106618/13A RU2337922C9 (ru) | 2001-08-07 | 2002-08-05 | ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ЭПИТОПА БЕЛКА p17 ВИРУСА ВИЧ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН, А ТАКЖЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИ-p17-АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСПОЗНАЮЩИЕ УКАЗАННЫЙ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ ЭПИТОП |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7541036B2 (ru) |
| EP (1) | EP1417222B1 (ru) |
| AT (1) | ATE478089T1 (ru) |
| DE (1) | DE60237373D1 (ru) |
| DK (1) | DK1417222T3 (ru) |
| PT (1) | PT1417222E (ru) |
| RU (1) | RU2337922C9 (ru) |
| WO (1) | WO2003016337A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2727673C1 (ru) * | 2019-08-09 | 2020-07-22 | Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства | Антитела против белка р17 ВИЧ-1 субтипа А |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITTO20020286A1 (it) * | 2002-03-29 | 2003-09-29 | Medestea Int Spa | Uso della proteina p17 isolata per la preparazione di un medicamento atto ad inibire gli effetti immunostimolanti che la proteina prodotta d |
| MXPA05011997A (es) * | 2005-11-08 | 2007-05-07 | Univ Mexico Nacional Autonoma | Vacuna intranasal contra la enfermedad ocasionada por escherichia coli enterotoxigenica. |
| US8759300B2 (en) | 2007-06-14 | 2014-06-24 | The Research Foundation For The State University Of New York | Polypeptides and methods of use |
| ITTO20080027A1 (it) * | 2008-01-15 | 2009-07-16 | Medestea Res & Production S P A | Forma troncata della proteina p17 di hiv. |
| RU2412946C1 (ru) * | 2009-11-03 | 2011-02-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ р17 ВИЧ |
| IT1401359B1 (it) * | 2010-03-31 | 2013-07-18 | Medestea Res & Production S P A | Anticorpo monoclonale diretto contro la proteina p17 di hiv, atto a neutralizzare il legame fra la proteina p17 e il recettore della proteina p17 (p17r) |
| RU2475264C2 (ru) * | 2010-12-29 | 2013-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства | Вакцина против вич/спид |
| US10729741B2 (en) | 2017-03-27 | 2020-08-04 | Neomatrix Therapeutics Inc. | Methods of treating burns with i.v. cP12 in a window from 2 to 6 hours after injury |
| EP3791179A4 (en) | 2018-05-09 | 2022-01-26 | Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University | METHODS FOR ELECTRONIC DETECTION AND QUANTIFICATION OF ANTIBODIES |
| SG11202011394WA (en) | 2018-05-17 | 2020-12-30 | Stuart Lindsay | Device, system and method for direct electrical measurement of enzyme activity |
| CN113874728B (zh) | 2019-01-30 | 2024-09-17 | 代表亚利桑那大学的亚利桑那校董事会 | 生物电子电路、系统及其制备和使用方法 |
| JP2023516167A (ja) | 2020-02-28 | 2023-04-18 | アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・オン・ビハーフ・オブ・アリゾナ・ステイト・ユニバーシティー | 生体高分子の配列を決定する方法 |
| US12298300B2 (en) | 2020-04-17 | 2025-05-13 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Single-molecule electronic sequence detector and methods of use |
| US12276653B2 (en) | 2020-05-29 | 2025-04-15 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Bioelectronic devices with programmable adaptors |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5185147A (en) * | 1988-08-19 | 1993-02-09 | Cellular Products, Inc. | Short polypeptide sequences useful in the production and detection of antibodies against human immunodeficiency virus |
| RU2111010C1 (ru) * | 1987-06-10 | 1998-05-20 | Дзе Имьюн Респонс Корпорейшн, Инк. | Иммуноген для предотвращения и лечения ретровирусных заболеваний, преимущественно спида |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ235538A (en) | 1989-10-12 | 1992-06-25 | Viral Technologies Inc | Peptides immunoreactive with antibodies to hiv p17; carrier-bound peptides, vaccines, immunoassay and a method for forming antibody enriched sera |
| US6093400A (en) * | 1996-08-09 | 2000-07-25 | Cel Sci Corporation | Modified HGP-30 peptides, conjugates, compositions and methods of use |
-
2002
- 2002-08-05 EP EP02751526A patent/EP1417222B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-05 AT AT02751526T patent/ATE478089T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-08-05 PT PT02751526T patent/PT1417222E/pt unknown
- 2002-08-05 DK DK02751526.1T patent/DK1417222T3/da active
- 2002-08-05 WO PCT/IB2002/003093 patent/WO2003016337A1/en not_active Application Discontinuation
- 2002-08-05 RU RU2004106618/13A patent/RU2337922C9/ru active
- 2002-08-05 US US10/485,980 patent/US7541036B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-05 DE DE60237373T patent/DE60237373D1/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2111010C1 (ru) * | 1987-06-10 | 1998-05-20 | Дзе Имьюн Респонс Корпорейшн, Инк. | Иммуноген для предотвращения и лечения ретровирусных заболеваний, преимущественно спида |
| US5185147A (en) * | 1988-08-19 | 1993-02-09 | Cellular Products, Inc. | Short polypeptide sequences useful in the production and detection of antibodies against human immunodeficiency virus |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PAPSIDERO et al., "Human immunodeficiency virus type 1-neutralizing monoclonal antibodies wich react with р17 core protein: characterization and epitope mapping", Journal of Virology, 1989, v.63, no.1, с.267-272. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2727673C1 (ru) * | 2019-08-09 | 2020-07-22 | Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства | Антитела против белка р17 ВИЧ-1 субтипа А |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT1417222E (pt) | 2010-10-12 |
| US7541036B2 (en) | 2009-06-02 |
| EP1417222B1 (en) | 2010-08-18 |
| EP1417222A1 (en) | 2004-05-12 |
| ATE478089T1 (de) | 2010-09-15 |
| DE60237373D1 (de) | 2010-09-30 |
| RU2337922C2 (ru) | 2008-11-10 |
| US20040249124A1 (en) | 2004-12-09 |
| WO2003016337A1 (en) | 2003-02-27 |
| RU2004106618A (ru) | 2005-07-10 |
| DK1417222T3 (da) | 2010-12-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8110203B2 (en) | Adjuvant comprising non-toxic cross-linked muramyl dipeptide (MDP) microparticles derived from Propionibacterium acnes | |
| JP3802049B2 (ja) | Ｈｉｖに対する中和性抗体および細胞障害性ｔリンパ球を誘発する複合合成ペプチド構築物 | |
| US20030003440A1 (en) | Novel CCR5 epitope and antibodies against it | |
| RU2337922C9 (ru) | ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ЭПИТОПА БЕЛКА p17 ВИРУСА ВИЧ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН, А ТАКЖЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИ-p17-АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСПОЗНАЮЩИЕ УКАЗАННЫЙ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ ЭПИТОП | |
| JP2003529319A (ja) | ＨＩＶ−１ｇｐ４１を標的化する広範に中和する抗体を誘発する方法 | |
| JPH08511007A (ja) | タンデム合成ｈｉｖ−１ペプチド | |
| JPH01501547A (ja) | Ｈｉｖ感染の病因に関するペプチド | |
| GB2196634A (en) | Monoclonal antibodies to HIV and related peptides | |
| US5017688A (en) | Peptides involved in the pathogenesis of HIV infection | |
| US5346989A (en) | Peptides for use in induction of T cell activation against HIV-1 | |
| AU733234B2 (en) | Conjugated peptides, immunological reagent containing same and use thereof for treatment of immunological disorders | |
| AU2006200454B2 (en) | Compositions and methods for treating viral infections | |
| US4943627A (en) | Peptides involved in the pathogenesis of HIV infection | |
| ES2350901T3 (es) | Polipéptidos aislados basados en el epítopo neutralizante de la proteína p17 del vih útiles como vacunas, y anticuerpos anti-p17 neutralizantes que reconocen específicamente dicho epítopo neutralizante. | |
| ITTO20011042A1 (it) | Polipeptidi isolati basati sulla sequenza della proteina p17 di hiv utili come vaccino anti-hiv. | |
| NO176022B (no) | Analogifremgangsmåte til fremstilling av små peptider som hindrer binding til T4-reseptorer og virker som immunorganer | |
| MXPA99003380A (en) | Compositions and methods for treating viral infections | |
| AU2004208648A1 (en) | Compositions and methods for treating infections | |
| AU2008203501A1 (en) | Compositions and methods for treating viral infections | |
| AU2006200455A1 (en) | Compositions and methods for treating viral infections | |
| WO1991013911A1 (en) | Peptide inhibitor of human immunodeficiency virus infection blocks virus interactions with a novel cellular receptor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Reissue of patent specification |