[go: up one dir, main page]

RU2846467C2 - Versions of carbonic anhydrase for improving co2 trapping - Google Patents

Versions of carbonic anhydrase for improving co2 trapping

Info

Publication number
RU2846467C2
RU2846467C2 RU2021128081A RU2021128081A RU2846467C2 RU 2846467 C2 RU2846467 C2 RU 2846467C2 RU 2021128081 A RU2021128081 A RU 2021128081A RU 2021128081 A RU2021128081 A RU 2021128081A RU 2846467 C2 RU2846467 C2 RU 2846467C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
carbonic anhydrase
anhydrase polypeptide
recombinant carbonic
recombinant
solubility
Prior art date
Application number
RU2021128081A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2021128081A (en
Inventor
Ричард ДЭЙГЛ
Микаэль БЕДАРД
Эрик МАДОРЕ
Сильвие ФРАДЕТТЕ
Норманд ВОЕР
Original Assignee
САЙПЕМ С.п.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by САЙПЕМ С.п.А. filed Critical САЙПЕМ С.п.А.
Publication of RU2021128081A publication Critical patent/RU2021128081A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2846467C2 publication Critical patent/RU2846467C2/en

Links

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and concerns versions of recombinant carbonic anhydrase for enzyme-enhanced CO2 trapping. Invention also relates to polynucleotides, vectors, host cells, methods and processes relating thereto.
EFFECT: invention provides efficient trapping of CO2 using carbonic anhydrase.
33 cl, 7 dwg, 5 tbl, 3 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

Настоящее описание относится к способам улучшенного с помощью фермента улавливания СО2 из СО2-содержащих сточных вод или газа. Более конкретно, в настоящем документе описаны варианты рекомбинантной карбоангидразы, имеющие улучшенную растворимость и/или термостабильность в условиях, соответствующих способам улавливания СО2 на основе карбоангидразы.The present disclosure relates to methods for improved enzyme-assisted capture of CO2 from CO2 -containing wastewater or gas. More specifically, the present document discloses variants of recombinant carbonic anhydrase having improved solubility and/or thermal stability under conditions consistent with carbonic anhydrase-based CO2 capture methods.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИLEVEL OF TECHNOLOGY

Все более угрожающие предупреждения мирового научного сообщества об опасностях изменения климата в сочетании с повышением осведомленности общественности побудили активизировать усилия по сокращению антропогенных выбросов парниковых газов (ПГ), в первую очередь диоксида углерода. Электростанции, работающие на ископаемом топливе, представляют собой один из крупнейших источников выбросов CO2 во всем мире, и поэтому внедрение эффективной системы сокращения выбросов парниковых газов потребует снижения выбросов CO2, производимых в этом секторе. Способы улучшенного с помощью карбоангидразы улавливания CO2 представляют собой одно из наиболее многообещающих решений по улавливанию, утилизации и хранению углерода, однако существует ряд проблем, связанных с его широким коммерческим внедрением. Одной из основных задач является повышение экономической целесообразности. Основные эксплуатационные расходы, связанные со способами улучшенного с помощью карбоангидразы улавливания CO2, связаны с восполнением обедненного или неактивного фермента карбоангидразы. Таким образом, существует потребность в улучшенных карбоангидразах, которые могут решить по меньшей мере некоторые из этих проблем.Increasingly dire warnings from the global scientific community about the dangers of climate change, coupled with increasing public awareness, have prompted increased efforts to reduce anthropogenic emissions of greenhouse gases (GHG), primarily carbon dioxide. Fossil fuel power plants represent one of the largest sources of CO 2 emissions worldwide, and implementing an effective GHG reduction system will require reducing CO 2 emissions from this sector. Carbonic anhydrase-enhanced CO 2 capture (CAEC) processes represent one of the most promising solutions for carbon capture, utilization, and storage (CCS), but there are a number of challenges to its widespread commercial implementation. One of the main challenges is improving economic feasibility. The main operating cost associated with CAEC processes is related to replenishing depleted or inactive carbonic anhydrase enzyme. Thus, there is a need for improved carbonic anhydrases that can address at least some of these problems.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE ESSENCE OF THE INVENTION

В настоящем документе описаны варианты рекомбинантной карбоангидразы, обладающие улучшенной растворимостью и/или термостабильностью для улучшенного с помощью фермента улавливания CO2. Хотя применение ферментов карбоангидразы и их вариантов, обладающих повышенной термостабильностью, может значительно снизить эксплуатационные расходы, некоторые ферменты и варианты, демонстрирующие улучшенную термостабильность, связаны с нежелательным сопутствующим снижением растворимости фермента, что может препятствовать его применению в реальных операциях по улавливанию CO2. Например, Пример 1 показывает, что термостабильная карбоангидраза Thermovibrio ammonificans дикого типа (ТАСА) может быть склонна к агрегации/осаждению при воздействии повышенных температур (например, 80°С) в щелочных карбонатных растворах.Described herein are recombinant carbonic anhydrase variants having improved solubility and/or thermal stability for enzyme-enhanced CO2 capture. Although the use of carbonic anhydrase enzymes and variants thereof having improved thermal stability can significantly reduce operating costs, some enzymes and variants exhibiting improved thermal stability are associated with an undesirable concomitant decrease in enzyme solubility, which may hinder their use in actual CO2 capture operations. For example, Example 1 shows that the thermally stable wild-type Thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase (TACA) may be prone to aggregation/precipitation when exposed to elevated temperatures (e.g., 80°C) in alkaline carbonate solutions.

Интересно, что замена одной аминокислоты, R156E, увеличивала растворимость фермента приблизительно в два раза при 80°С в щелочном карбонатном растворе (см. Таблицу 1). Эта замена одной аминокислоты привела к снижению расчетной изоэлектрической точки (pI) фермента с 8,8 до 8,3. Таким образом, комбинация случайного мутагенеза и рациональных подходов к конструированию с последующим эмпирическим тестированием была использована для разработки и экспрессии вариантов ТАСА, сохраняющих активность карбоангидразы, но имеющих постепенно снижающиеся изоэлектрические точки, например в диапазоне от 8,3 до 5,9. Варианты ТАСА, имеющие более низкие значения pI, обычно демонстрируют более высокую растворимость в щелочных карбонатных растворах (Таблица 1).Interestingly, a single amino acid substitution, R156E, increased the solubility of the enzyme approximately twofold at 80°C in alkaline carbonate solution (see Table 1). This single amino acid substitution resulted in a decrease in the predicted isoelectric point (pI) of the enzyme from 8.8 to 8.3. Thus, a combination of random mutagenesis and rational design approaches followed by empirical testing was used to develop and express TACA variants that retain carbonic anhydrase activity but have progressively lower isoelectric points, for example in the range from 8.3 to 5.9. TACA variants having lower pI values generally exhibit higher solubility in alkaline carbonate solutions (Table 1).

С целью обнаружения новых мутаций, оказывающих положительное влияние на термостабильность и/или растворимость, был проведен крупномасштабный скрининг случайного мутагенеза, начиная с различных матриц, кодирующих функциональные варианты ТАСА, сконструированные так, чтобы иметь постепенно более низкие изоэлектрические точки (Примеры 2 и 3). Чтобы упростить сравнение различных индивидуальных вариантов ТАСА, а также их влияние на соответствующие матрицы, результаты обширных испытаний растворимости и термостабильности были преобразованы в «показатели растворимости» и «показатели стабильности». Поскольку было установлено, что и растворимость, и термостабильность часто взаимосвязаны с точки зрения их преимущества в процессах улавливания CO2, для каждого варианта также рассчитывали «общий показатель», объединяющий показатели растворимости и стабильности, что позволяло ранжировать различные варианты с точки зрения их потенциальной привлекательности для внедрения в способы улавливания CO2.In order to discover new mutations with beneficial effects on thermal stability and/or solubility, a large-scale random mutagenesis screen was performed starting from different templates encoding functional variants of TACA designed to have progressively lower isoelectric points (Examples 2 and 3). To facilitate comparison of the different individual TACA variants as well as their effects on the respective templates, the results of the extensive solubility and thermal stability tests were converted into “solubility indices” and “stability indices”. Since it was found that both solubility and thermal stability are often interrelated in terms of their advantage in CO2 capture processes, an “overall index” combining solubility and stability indices was also calculated for each variant, allowing the different variants to be ranked in terms of their potential attractiveness for implementation in CO2 capture processes.

Было обнаружено, что некоторые полезные замены аминокислот улучшают как термостабильность, так и растворимость, в то время как другие полезные замены улучшают либо термостабильность, либо растворимость. Интересно, что было обнаружено, что улучшение растворимости фермента часто снижает эффективную концентрацию этого фермента, необходимую для достижения заданной эффективности улавливания CO2, по сравнению с ферментом, имеющим такую же термостабильность, хотя и с более низкой растворимостью. Кроме того, в целом было обнаружено, что индивидуальные замены аминокислот, которые оказывали положительный эффект с точки зрения растворимости и/или термостабильности на их исходных матрицах, также оказывали положительные эффекты при введении в другие матрицы. Более того, было обнаружено, что объединение нескольких индивидуальных вариантов, оказывающих благоприятный эффект на растворимость и/или термостабильность на одной и той же матрице, приводит к получению рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, которые обычно превосходят ферменты, имеющие только соответствующие единичные варианты.Some beneficial amino acid substitutions were found to improve both thermal stability and solubility, while other beneficial substitutions improved either thermal stability or solubility. Interestingly, it was found that improving the solubility of an enzyme often reduced the effective concentration of that enzyme required to achieve a given CO2 capture efficiency, compared to an enzyme having the same thermal stability, albeit with lower solubility. Furthermore, it was generally found that individual amino acid substitutions that had a beneficial effect on solubility and/or thermal stability on their original matrices also had beneficial effects when introduced into other matrices. Furthermore, it was found that combining several individual variants that had a beneficial effect on solubility and/or thermal stability on the same matrix resulted in recombinant carbonic anhydrase polypeptides that were generally superior to enzymes having only the corresponding single variants.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, обладающие карбоангидразной активностью, включающие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60% идентичности с SEQ ID NO: 5, и отличающийся на одну или более аминокислот от SEQ ID NO: 1 в положениях остатков, выбранных из 3, 6, 11, 15, 17, 20, 24, 25, 38, 39, 48, 64, 79, 88, 119, 128, 130, 137, 145, 148, 149, 154, 160, 166, 168, 195, 199, 203, 210 и 223, при этом указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость и/или повышенную термостабильность по сравнению с соответствующим полипептидом карбоангидразы, в котором отсутствуют указанные отличия на одну или более аминокислот.In some aspects, described herein are recombinant carbonic anhydrase polypeptides having carbonic anhydrase activity, comprising an amino acid sequence having at least 60% identity to SEQ ID NO: 5 and differing by one or more amino acids from SEQ ID NO: 1 at residue positions selected from 3, 6, 11, 15, 17, 20, 24, 25, 38, 39, 48, 64, 79, 88, 119, 128, 130, 137, 145, 148, 149, 154, 160, 166, 168, 195, 199, 203, 210, and 223, wherein said recombinant carbonic anhydrase polypeptide has an increased solubility and/or increased thermal stability compared to the corresponding carbonic anhydrase polypeptide that lacks the said differences by one or more amino acids.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, обладающие карбоангидразной активностью, включающие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60% идентичности с SEQ ID NO: 5, причем указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы включает остаток (остатки): 3Е; 6R; 9А или 9N; 11L, 11P, или 11Y; 15L; 17Y; 18I, 18L, 18R, или 18S; 20K или 20L; 24I, 24М, или 24V; 25F; 27R; 38D, 38R, или 38T; 39H, 39I, 39L, 39R, или 39W; 48L, 48Q, или 48Т; 51D, 51E, 5IF, 51M, или 5IP; 64T; 73E или 73L; 77F; 79E, 79L или 79W; 88Е, 881, 88L, 88R, 88Т, или 88V; 105F; 116Е или 116R; 119D или 119М; 128Е, 128K, 128R, или 128Т; 130А, 130D, 130Е, 130F, 130Н, 130K, 130Q, 130R, 130S, 130Т, 130V, 130W, или 130Y; 137D или 137Е; 138Е или 138L; 145D или 145Е; 148F, 148V, или 148W; 1491; 154D, 154K, 154Р, или 154V; 156V; 158Y; 160D или 160Q; 166Е или 166V; 167L; 168Е, 168F, 168R, или 168W; 170F; 192D; 195D или 195Е; 199А, 199D, или 199K; 203R или 203V; 206R; 210Н; 216Т; 219I; 2231, 223L, или 223V; 226R; или любую их комбинацию.In some aspects, described herein are recombinant carbonic anhydrase polypeptides having carbonic anhydrase activity, comprising an amino acid sequence having at least 60% identity to SEQ ID NO: 5, wherein said recombinant carbonic anhydrase polypeptide comprises residue(s): 3E; 6R; 9A or 9N; 11L, 11P, or 11Y; 15L; 17Y; 18I, 18L, 18R, or 18S; 20K or 20L; 24I, 24M, or 24V; 25F; 27R; 38D, 38R, or 38T; 39H, 39I, 39L, 39R, or 39W; 48L, 48Q, or 48T; 51D, 51E, 5IF, 51M, or 5IP; 64T; 73E or 73L; 77F; 79E, 79L or 79W; 88E, 881, 88L, 88R, 88T, or 88V; 105F; 116E or 116R; 119D or 119M; 128E, 128K, 128R, or 128T; 130A, 130D, 130E, 130F, 130H, 130K, 130Q, 130R, 130S, 130T, 130V, 130W, or 130Y; 137D or 137E; 138E or 138L; 145D or 145E; 148F, 148V, or 148W; 1491; 154D, 154K, 154P, or 154V; 156V; 158Y; 160D or 160Q; 166E or 166V; 167L; 168E, 168F, 168R, or 168W; 170F; 192D; 195D or 195E; 199A, 199D, or 199K; 203R or 203V; 206R; 210H; 216T; 219I; 2231, 223L, or 223V; 226R; or any combination of them.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, обладающие карбоангидразной активностью, включающие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60% идентичности с SEQ ID NO: 5, причем указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы сконструирован таким образом, чтобы иметь изоэлектрическую точку (pI) ниже таковой для SEQ ID NO: 2, 3 или 4, и иметь растворимость выше таковой для SEQ ID NO: 2, 3 или 4 через 24 часа при 80°С в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор с концентрацией от 1,38 до 1,85 М K2СО3 с альфа от 0,60 до 0,89.In some aspects, described herein are recombinant carbonic anhydrase polypeptides having carbonic anhydrase activity, comprising an amino acid sequence having at least 60% identity to SEQ ID NO: 5, wherein said recombinant carbonic anhydrase polypeptide is engineered to have an isoelectric point (pI) lower than that of SEQ ID NO: 2, 3, or 4, and to have a solubility higher than that of SEQ ID NO: 2, 3, or 4 after 24 hours at 80°C in an alkaline carbonate solution, such as a solution having a concentration of 1.38 to 1.85 M K2CO3 with an alpha of 0.60 to 0.89.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны изолированные полинуклеотиды, кодирующие вышеупомянутые рекомбинантные полипептиды карбоангидразы.In some aspects, the present document describes isolated polynucleotides encoding the aforementioned recombinant carbonic anhydrase polypeptides.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны векторы экспрессии или клонирования, включающие вышеупомянутые изолированные полинуклеотиды.In some aspects, the present document describes expression or cloning vectors comprising the aforementioned isolated polynucleotides.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны клетки-хозяева, включающие вышеупомянутый изолированный полинуклеотид или вышеупомянутые векторы экспрессии.In some aspects, the present document describes host cells comprising the aforementioned isolated polynucleotide or the aforementioned expression vectors.

В некоторых аспектах в настоящем документе описан способ получения рекомбинантного полипептида карбоангидразы, включающий культивирование вышеупомянутой клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию вышеупомянутых рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, и выделение рекомбинантного полипептида карбоангидразы.In some aspects, the present document describes a method for producing a recombinant carbonic anhydrase polypeptide, comprising culturing the above-mentioned host cell under conditions that allow expression of the above-mentioned recombinant carbonic anhydrase polypeptides, and isolating the recombinant carbonic anhydrase polypeptide.

В некоторых аспектах в настоящем документе описано применение вышеупомянутых рекомбинантных полипептидов карбоангидразы в промышленном способе улавливания CO2 из CO2-содержащих сточных вод или газа.In some aspects, the present document describes the use of the above-mentioned recombinant carbonic anhydrase polypeptides in an industrial method for capturing CO2 from CO2 -containing wastewater or gas.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны способы абсорбции CO2 из CO2-содержащих сточных вод или газа, причем способ включает: приведение CO2-содержащих сточных вод или газа в контакт с водным абсорбирующим раствором для растворения CO2 в водном абсорбирующем растворе; и обеспечение рекомбинантного полипептида карбоангидразы, определенного в настоящем документе, для осуществления катализа реакции гидратации растворенного CO2 в ионы бикарбоната и водорода или обратной реакции.In some aspects, described herein are methods for absorbing CO2 from CO2 -containing wastewater or gas, the method comprising: contacting the CO2 -containing wastewater or gas with an aqueous absorbent solution to dissolve the CO2 in the aqueous absorbent solution; and providing a recombinant carbonic anhydrase polypeptide as defined herein to catalyze a reaction for hydrating dissolved CO2 to bicarbonate and hydrogen ions or the reverse reaction.

В некоторых аспектах в настоящем документе описан исходный или питательный раствор, включающий рекомбинантный полипептид карбоангидразы, как определено в настоящем документе, в концентрации по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 г/л.In some aspects, the present document provides a feed or nutrient solution comprising a recombinant carbonic anhydrase polypeptide as defined herein at a concentration of at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 g/L.

Общие определенияGeneral definitions

Заголовки и другие идентификаторы, например (a), (b), (i), (ii) и т.д., представлены просто для удобства чтения описания и формулы изобретения. Использование заголовков или других идентификаторов в описании или формуле изобретения не обязательно требует, чтобы стадии или элементы выполнялись в алфавитном или числовом порядке или в том порядке, в котором они представлены.Headings and other identifiers, such as (a), (b), (i), (ii), etc., are provided merely for the convenience of reading the description and claims. The use of headings or other identifiers in the description or claims does not necessarily require that the steps or elements be performed in alphabetical or numerical order or in the order in which they are presented.

Использование единственного числа вместе с термином «включающий» в формуле изобретения и/или описании может означать «один», но это также согласуется со значением «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более одного».The use of the singular together with the term "including" in the claims and/or description may mean "one", but it is also consistent with the meaning of "one or more", "at least one" and "one or more than one".

Термин «примерно» используется для обозначения того, что значение включает стандартное отклонение ошибки для устройства или способа, используемых для определения значения. Как правило, термин «примерно» означает возможное отклонение до 10%. Следовательно, в термин «примерно» включается вариация на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10% от значения. Если не указано иное, использование термина «примерно» перед диапазоном применяется к обоим концам диапазона.The term "about" is used to indicate that the value includes the standard deviation of error for the device or method used to determine the value. Generally, the term "about" means that there may be a variation of up to 10%. Therefore, the term "about" includes variations of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10% of the value. Unless otherwise specified, the use of the term "about" before a range applies to both ends of the range.

Используемые в этом описании и пункте(-ах) формулы слова «включающий» (и иные формы от «включающий» такие, как «включать» и «включает»), «имеющий» (и иные формы от «имеющий» такие, как «иметь» и «имеет», «заключающий в себе» (и иные формы от «заключающий в себе» такие, как «заключает в себе» и «заключать в себе») или «содержащий» (и любые формы от «содержащий» такие, как «содержит» и «содержать») являются взаимозаменяемыми или допускающими из изменения и не исключают дополнительных неперечисленных элементов и этапов способа.As used in this description and claim(s), the words "including" (and other forms of "including" such as "include" and "includes"), "having" (and other forms of "having" such as "have" and "has", "comprising" (and other forms of "comprising" such as "comprises" and "include") or "containing" (and any forms of "comprising" such as "contains" and "contain") are interchangeable or subject to change and do not exclude additional, unlisted elements and method steps.

Другие задачи, преимущества и функции настоящего описания станут более очевидными после прочтения следующего неограничивающего описания конкретных вариантов его осуществления, приведенного только в качестве примера со ссылкой на сопроводительные чертежи.Other objects, advantages and functions of the present description will become more apparent upon reading the following non-limiting description of specific embodiments thereof, given by way of example only with reference to the accompanying drawings.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS

На прилагаемых чертежах:In the attached drawings:

На Фиг. 1 показано выравнивание аминокислотной последовательности между SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.Fig. 1 shows the amino acid sequence alignment between SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.

На Фиг. 2 показаны показатели стабильности некоторых вариантов SEQ ID NO: 3 (Фиг. 2А) и некоторых вариантов SEQ ID NO: 4 (Фиг. 2В).Fig. 2 shows the stability indices of some variants of SEQ ID NO: 3 (Fig. 2A) and some variants of SEQ ID NO: 4 (Fig. 2B).

На Фиг. 3 показана оптическая плотность при 595 нм различных растворов K2СО3, содержащих различные ферменты карбоангидразы (СА) (Фиг. 3А - Фиг. 3L), в концентрации 2 г/л после 24-часовой инкубации при 30°С (Фиг. 3А, 3С, 3Е, 3G, 3I и 3K) и 70°С (Фиг. 3В, 3D, 3F, 3Н, 3J и 3L). Концентрация K2СО3 варьируется от 1,38 М до 1,85 М. Содержание CO2 в растворах варьировалось от 0,60 до 0,89 моль С/ моль K+. Из-за пределов растворимости KHСО3, растворы с содержанием CO2 0,89 моль С/моль K+ ограничиваются растворами с концентрацией K2СО3 в диапазоне от 1,38 М до 1,45 М. Аналогичным образом растворы с содержанием CO2 0,84 моль С/моль K+ ограничиваются растворами с концентрацией K2СО3 от 1,38 М до 1,65 М включительно. Оптическая плотность при 595 нм связана с количеством нерастворимого/агрегированного фермента в растворе.Figure 3 shows the optical density at 595 nm of various K2CO3 solutions containing different carbonic anhydrase (CA) enzymes (Fig. 3A to Fig. 3L) at a concentration of 2 g/L after 24-hour incubation at 30°C (Fig. 3A, 3C, 3E, 3G, 3I, and 3K) and 70°C (Fig. 3B, 3D, 3F, 3H, 3J, and 3L). The concentration of K2CO3 ranged from 1.38 M to 1.85 M. The CO2 content of the solutions ranged from 0.60 to 0.89 mol C/mol K + . Due to the solubility limits of KHCO3 , solutions with CO2 concentrations of 0.89 mol C/mol K + are limited to solutions with K2CO3 concentrations in the range of 1.38 M to 1.45 M. Similarly, solutions with CO2 concentrations of 0.84 mol C/mol K + are limited to solutions with K2CO3 concentrations between 1.38 M and 1.65 M inclusive. The absorbance at 595 nm is related to the amount of insoluble/aggregated enzyme in solution.

На Фиг. 4 показано увеличение времени полужизни (%) различных ферментов СА по сравнению с временем полужизни SEQ ID NO: 4 в 1,45 М K2СО3 альфа 0,70 моль С/моль K+ при 70, 85 и 95°С.Figure 4 shows the increase in half-life (%) of various CA enzymes compared to the half-life of SEQ ID NO: 4 in 1.45 M K2CO3alpha 0.70 mol C/mol K + at 70, 85 and 95°C.

На Фиг. 5 показана оптическая плотность при 595 нм различных растворов K2СО3, содержащих ферменты СА, полученные из SEQ ID NO: 4, в концентрации 2 г/л после 24-часовой инкубации при 30°С (Фиг. 5А, 5С, 5Е, 5G, и 5I) и 70°С (Фиг. 5В, 5D, 5F, 5Н и 5J). Концентрация K2СО3 в растворах варьируется от 1,38 М до 1,85 М. Содержание CO2 составляет от 0,60 до 0,89 моль С/моль K+. Из-за пределов растворимости KHСО3, растворы с содержанием CO2 0,89 моль С/моль K+ ограничиваются растворами с концентрацией K2СО3 в диапазоне от 1,38 М до 1,45 М. Аналогичным образом растворы с содержанием CO2 0,84 моль С/моль K+ ограничиваются растворами с концентрацией K2СО3 от 1,38 М до 1,65 М включительно. Оптическая плотность при 595 нм связана с количеством нерастворимого/ агрегированного фермента в растворе.Figure 5 shows the optical density at 595 nm of various K2CO3 solutions containing the CA enzymes obtained from SEQ ID NO: 4 at a concentration of 2 g/L after 24-hour incubation at 30°C (Figures 5A, 5C, 5E, 5G, and 5I) and 70°C (Figures 5B, 5D, 5F, 5H, and 5J). The concentration of K2CO3 in the solutions ranges from 1.38 M to 1.85 M. The CO2 content ranges from 0.60 to 0.89 mol C/mol K + . Because of the solubility limits of KHCO3 , solutions with CO2 concentrations of 0.89 mol C/mol K + are limited to solutions with K2CO3 concentrations in the range of 1.38 M to 1.45 M. Similarly, solutions with CO2 concentrations of 0.84 mol C/mol K + are limited to solutions with K2CO3 concentrations between 1.38 M and 1.65 M inclusive. The absorbance at 595 nm is related to the amount of insoluble/aggregated enzyme in solution.

На Фиг. 6 показан пример множественного выравнивания последовательностей карбоангидраз SEQ ID NO: 1 и 12-20, происходящих от разных организмов.Fig. 6 shows an example of a multiple alignment of carbonic anhydrase sequences SEQ ID NO: 1 and 12-20 from different organisms.

На Фиг. 7 показан анализ филогенетического дерева, соответствующий множественному выравниванию последовательностей, показанному на Фиг. 6.Figure 7 shows a phylogenetic tree analysis corresponding to the multiple sequence alignment shown in Figure 6.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, созданный 24 марта 2019 г. и имеющий размер примерно 44 КБ. Машиночитаемая форма включена в настоящую заявку в качестве ссылки.This application contains a sequence listing in machine-readable form created on March 24, 2019 and having a size of approximately 44 KB. The machine-readable form is incorporated into this application by reference.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯIMPLEMENTATION OF THE INVENTION

Настоящее описание относится к вариантам рекомбинантной карбоангидразы, обладающим улучшенной растворимостью и/или термостабильностью для усиленного с помощью фермента улавливания CO2, а также к полинуклеотидам, векторам, клеткам-хозяевам, способам и процессам, относящимся к ним.The present disclosure relates to recombinant carbonic anhydrase variants having improved solubility and/or thermal stability for enzyme-enhanced CO2 scavenging, as well as polynucleotides, vectors, host cells, methods and processes related thereto.

Промышленные операции по улавливанию CO2 на основе карбоангидразы обычно включают подвергание фермента воздействию повторяющихся колебаний температуры, которые могут быть в диапазоне от 10°С до 98°С, в зависимости от конкретных условий процесса. В заявке на патент РСТ WO/2016/029316 описаны способы улучшенного с помощью фермента улавливания CO2 с применением карбоангидразы Thermovibrio ammonificans (ТАСА) или ее функциональных производных для катализа реакции гидратации CO2 до бикарбоната и ионов водорода и/или катализа реакции десорбции с получением газа CO2.В заявке на патент РСТ WO/2017/035667 описаны варианты ТАСА, разработанные для повышения эффективности операций по улавливанию CO2, в частности, варианты ТАСА, обладающие улучшенной термостабильностью в контексте щелочного карбонатного абсорбирующего раствора по сравнению с ферментом дикого типа.Industrial carbonic anhydrase-based CO2 capture operations typically involve subjecting the enzyme to repeated temperature fluctuations that can range from 10°C to 98°C, depending on the specific process conditions. PCT patent application WO/2016/029316 describes methods for enzyme-enhanced CO2 capture using Thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase (TACA) or functional derivatives thereof to catalyze the hydration reaction of CO2 to bicarbonate and hydrogen ions and/or catalyze the desorption reaction to produce CO2 gas. PCT patent application WO/2017/035667 describes TACA variants designed to improve the efficiency of CO2 capture operations, in particular TACA variants having improved thermal stability in the context of an alkaline carbonate absorbent solution compared to the wild-type enzyme.

Хотя применение ферментов карбоангидразы и вариантов, обладающих повышенной термостабильностью, может значительно снизить эксплуатационные расходы, например, посредством увеличения периода полужизни фермента, некоторые ферменты и варианты, показывающие улучшенную термостабильность, связаны с нежелательным сопутствующим снижением растворимости фермента, что может препятствовать его применению в реальных операциях по улавливанию CO2. Например, Пример 1 показывает, что термостабильная карбоангидраза Thermovibrio ammonificans дикого типа (ТАСА) может быть склонна к агрегации/осаждению при воздействии повышенных температур (например, 80°С) в щелочных карбонатных растворах.Although the use of carbonic anhydrase enzymes and variants with increased thermal stability can significantly reduce operating costs, for example by increasing the half-life of the enzyme, some enzymes and variants exhibiting improved thermal stability are associated with an undesirable concomitant decrease in enzyme solubility, which may hinder their use in actual CO2 capture operations. For example, Example 1 shows that the thermally stable wild-type Thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase (TACA) may be prone to aggregation/precipitation when exposed to elevated temperatures (e.g., 80°C) in alkaline carbonate solutions.

В идеале фермент, используемый в операции по улавливанию CO2 в промышленных масштабах, должен оставаться в растворе в активной форме (например, без образования агрегатов и/или без осаждения) на протяжении всего процесса улавливания CO2, так как даже постепенное осаждение/агрегация фермента в любой момент во время термического цикла абсорбции/десорбции CO2 со временем снизит эффективную концентрацию фермента в растворе, что потребует более частого добавления свежего фермента. И наоборот, фермент, имеющий улучшенную растворимость и/или повышенную устойчивость к агрегации в условиях способа улавливания CO2, может иметь дополнительные технические и практические преимущества, такие как: потенциальное проявление более высокой стабильности на границе раздела фаз газ-жидкость (за счет снижения сродства к границе раздела фаз, которая является гидрофобной); облегчение солюбилизации высушенного или лиофилизированного фермента; минимизация потерь фермента вследствие агрегации (ферментативно неактивные растворимые агрегаты) и/или осаждения (нерастворимые агрегаты); предложение возможности приготовления высококонцентрированных «питательных» растворов для применения в способах улавливания CO2; обеспечение возможности отгрузки более концентрированного исходного раствора от поставщиков ферментов, тем самым снижая стоимость доставки.Ideally, the enzyme used in a commercial-scale CO2 capture operation should remain in solution in an active form (e.g., without forming aggregates and/or without precipitation) throughout the CO2 capture process, since even gradual precipitation/aggregation of the enzyme at any point during the CO2 absorption/desorption thermal cycle will eventually reduce the effective concentration of enzyme in solution, requiring more frequent addition of fresh enzyme. Conversely, an enzyme having improved solubility and/or increased resistance to aggregation under the conditions of the CO2 capture process may have additional technical and practical advantages, such as: potentially exhibiting higher stability at the gas-liquid interface (due to reduced affinity for the interface, which is hydrophobic); easier solubilization of dried or lyophilized enzyme; minimizing enzyme losses due to aggregation (enzymatically inactive soluble aggregates) and/or precipitation (insoluble aggregates); offering the ability to prepare highly concentrated “feed” solutions for use in CO2 capture applications; enabling the shipment of more concentrated feed solution from enzyme suppliers, thereby reducing shipping costs.

Интересно, что замена одной аминокислоты, R156E, увеличивала растворимость ТАСА приблизительно в два раза при 80°С в щелочном карбонатном растворе (см. Таблицу 1). Эта замена одной аминокислоты привела к небольшому снижению расчетной изоэлектрической точки (pI) фермента с 8,8 до 8,3. Таким образом, комбинация случайного мутагенеза и рациональных подходов к конструированию с последующим эмпирическим тестированием была использована для создания и экспрессии вариантов ТАСА, сохраняющих активность карбоангидразы, но имеющих постепенно более низкие изоэлектрические точки в диапазоне от 8,3 до 5,9. Испытанные варианты ТАСА, имеющие более низкие значения pI, обычно демонстрируют улучшенную растворимость в щелочных карбонатных растворах (Таблица 1).Interestingly, a single amino acid substitution, R156E, increased the solubility of TACA approximately twofold at 80°C in alkaline carbonate solution (see Table 1). This single amino acid substitution resulted in a slight decrease in the predicted isoelectric point (pI) of the enzyme from 8.8 to 8.3. Thus, a combination of random mutagenesis and rational design approaches followed by empirical testing was used to generate and express TACA variants that retain carbonic anhydrase activity but have progressively lower isoelectric points ranging from 8.3 to 5.9. The TACA variants tested with lower pI values generally exhibited improved solubility in alkaline carbonate solutions (Table 1).

С целью обнаружения новых мутаций, оказывающих положительное влияние на термостабильность без отрицательного воздействия на растворимость, три варианта ТАСА, обладающие ферментативной активностью, но разными изоэлектрическими точками, были использованы в качестве исходных матриц для скрининга случайного мутагенеза, как описано в Примерах 2 и 3. Использованные матрицы для скрининга случайного мутагенеза представлены с помощью SEQ ID NO: 5, которая представляет собой объединение SEQ ID NO: 2, 3 и 4 (см. Таблицу 1). Чтобы упростить сравнение различных идентифицированных индивидуальных вариантов ТАСА, а также их влияние на соответствующие исходные матрицы, данные испытаний растворимости и термостабильности были преобразованы в «показатели растворимости» и «показатели стабильности». Поскольку было обнаружено, что и растворимость, и термостабильность часто взаимосвязаны с точки зрения их преимущества в процессах улавливания CO2, для каждого варианта также рассчитывали «общие показатели», объединяющие показатели растворимости и стабильности, что позволяло ранжировать различные варианты с точки зрения их потенциальной пригодности для внедрения в способы улавливания CO2.In order to discover new mutations that have a positive effect on thermal stability without a negative effect on solubility, three TACA variants with enzymatic activity but different isoelectric points were used as starting matrices for random mutagenesis screening as described in Examples 2 and 3. The random mutagenesis screening matrices used are represented by SEQ ID NO: 5, which is the concatenation of SEQ ID NOs: 2, 3 and 4 (see Table 1). To facilitate comparison of the different identified individual TACA variants as well as their effect on the respective starting matrices, the solubility and thermal stability test data were converted into “solubility indices” and “stability indices”. Since both solubility and thermal stability were found to be often correlated in terms of their benefit in CO2 capture processes, “overall scores” combining solubility and stability scores were also calculated for each variant, allowing the different variants to be ranked in terms of their potential suitability for implementation in CO2 capture processes.

Соответственно, в настоящем документе описаны замены аминокислот, которые, как показано, оказывают положительное влияние, по отдельности и/или вместе, на растворимость и/или термостабильность ферментов карбоангидразы, полученных из ТАСА дикого типа (представленных в настоящем документе посредством SEQ ID NO: 1). Для большей ясности выражение «ТАСА дикого типа», используемое в настоящем документе, предназначено для обозначения аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, которая в общем случаесоответствует аминокислотной последовательности встречающейся в природе ТАСА (например, номер доступа WP_013538320.1), за исключением того, что N-концевая часть фермента оптимизирована, как описано в WO/2017/035667, для увеличения продукции фермента в бактериальной системе экспрессии. Было обнаружено, что некоторые полезные замены аминокислот, описанные в настоящем документе, улучшают как термостабильность, так и растворимость, в то время как другие полезные замены аминокислот улучшают либо термостабильность, либо растворимость. Интересно, что было обнаружено, что улучшение растворимости фермента часто снижает эффективную концентрацию этого фермента, необходимую для достижения заданной эффективности улавливания CO2, по сравнению с ферментом, имеющим такую же термостабильность, хотя и с более низкой растворимостью. В настоящем документе выражение «эффективная концентрация фермента» относится к концентрации фермента, которая вызывает определенную величину ответа в данной системе, где концентрация фермента включает все формы фермента, такие как растворимый фермент, нерастворимый фермент и растворимые агрегаты фермента. Кроме того, в целом было обнаружено, что индивидуальные замены аминокислот, которые оказывали положительный эффект с точки зрения растворимости и/или термостабильности на их исходных матрицах, также оказывали положительные эффекты при введении в другие матрицы. Более того, было обнаружено, что объединение нескольких индивидуальных вариантов, оказывающих благоприятный эффект на растворимость и/или стабильность на одной и той же матрице, приводит к получению рекомбинантных ферментов карбоангидразы, которые обычно превосходят ферменты, имеющие только соответствующие единичные варианты.Accordingly, described herein are amino acid substitutions that have been shown to have a beneficial effect, individually and/or together, on the solubility and/or thermal stability of carbonic anhydrase enzymes derived from wild-type TACA (represented herein by SEQ ID NO: 1). For clarity, the term "wild-type TACA" as used herein is intended to refer to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which generally corresponds to the amino acid sequence of naturally occurring TACA (e.g., accession number WP_013538320.1), except that the N-terminal portion of the enzyme has been optimized, as described in WO/2017/035667, to increase enzyme production in a bacterial expression system. Some beneficial amino acid substitutions described herein have been found to improve both thermal stability and solubility, while other beneficial amino acid substitutions have been found to improve either thermal stability or solubility. Interestingly, it was found that improving the solubility of an enzyme often reduces the effective concentration of that enzyme required to achieve a given CO2 capture efficiency, compared to an enzyme having the same thermal stability, albeit with a lower solubility. As used herein, the expression "effective enzyme concentration" refers to the enzyme concentration that produces a given response magnitude in a given system, where the enzyme concentration includes all forms of the enzyme, such as soluble enzyme, insoluble enzyme, and soluble enzyme aggregates. Furthermore, it was generally found that individual amino acid substitutions that had a beneficial effect in terms of solubility and/or thermal stability on their original matrices also had beneficial effects when introduced into other matrices. Furthermore, it was found that combining several individual variants that had a beneficial effect on solubility and/or stability on the same matrix resulted in recombinant carbonic anhydrase enzymes that were generally superior to enzymes having only the corresponding single variants.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, обладающие карбоангидразной активностью, содержащие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60% идентичности с любой из SEQ ID NO: 1-5, и одно или более аминокислотное отличие по сравнению с SEQ ID NO: 1 в положениях остатков, выбранных из 3, 6, 11, 15, 17, 20, 24, 25, 38, 39, 48, 64, 79, 88, 119, 128, 130, 137, 145, 148, 149, 154, 160, 166, 168, 195, 199, 203, 210 и 223. В настоящем документе показано, что замены аминокислот в этих положениях оказывают положительный эффект на растворимость и/или термостабильность фермента (например, в щелочном карбонатном растворе, как описано в настоящем документе) по сравнению с соответствующими полипептидами карбоангидразы, в которых отсутствуют замены аминокислот.In some aspects, described herein are recombinant carbonic anhydrase polypeptides having carbonic anhydrase activity comprising an amino acid sequence having at least 60% identity to any one of SEQ ID NOs: 1-5 and one or more amino acid differences compared to SEQ ID NO: 1 at residue positions selected from 3, 6, 11, 15, 17, 20, 24, 25, 38, 39, 48, 64, 79, 88, 119, 128, 130, 137, 145, 148, 149, 154, 160, 166, 168, 195, 199, 203, 210 and 223. Demonstrated herein are amino acid substitutions at these positions that have a positive effect on solubility. and/or the thermal stability of the enzyme (e.g., in an alkaline carbonate solution as described herein) compared to corresponding carbonic anhydrase polypeptides that lack amino acid substitutions.

В настоящем документе выражение «щелочной карбонатный раствор» обычно относится к раствору, содержащему карбонатное соединение или карбонатные ионы, имеющему щелочной рН (например, рН более 7 при комнатной температуре), который подходит для оценки улучшенной термостабильности и/или растворимость ферментов ТАСА и вариантов, описанных в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах осуществления щелочной карбонатный раствор может иметь концентрацию карбоната от 0,1 до 3 М, от 0,5 до 2 М, от 1 до 2 М или от 1,25 до 1,75 М. В конкретных вариантах осуществления щелочной карбонатный раствор может представлять собой раствор в диапазоне от 1,38 до 1,85 М карбоната (например, K2СО3) с альфа в диапазоне от 0,60 до 0,89, как описано в тесте растворимости путем титрования, показанном в Примере 3.As used herein, the term "alkaline carbonate solution" generally refers to a solution containing a carbonate compound or carbonate ions that has an alkaline pH (e.g., a pH greater than 7 at room temperature) that is suitable for evaluating the improved thermal stability and/or solubility of the TACA enzymes and variants described herein. For example, in some embodiments, the alkaline carbonate solution may have a carbonate concentration of 0.1 to 3 M, 0.5 to 2 M, 1 to 2 M, or 1.25 to 1.75 M. In particular embodiments, the alkaline carbonate solution may be a solution in the range of 1.38 to 1.85 M carbonate (e.g., K2CO3 ) with an alpha in the range of 0.60 to 0.89, as described in the solubility titration test shown in Example 3 .

В настоящем документе термин «альфа» в контексте щелочных карбонатных растворов относится к загрузке CO2 и соответствует отношению концентрации углерода к калию в растворе (т.е. загрузка CO2 или альфа = [углерод] / [калий]). Например, чистый раствор 1,45 М K2СО3 имеет альфа [1,45]/[2×1,45]=0,5, а чистый раствор 2,9 М KНСО3 имеет альфа [2,9]/[2,9]=1. Смесь 0,87 М K2СО3+1,16 М KНСО3 имеет альфа [0,87+1,16]/[(0,87×2)+1,16]=2,03/2,9=0,7.In this document, the term “alpha” in the context of alkaline carbonate solutions refers to the CO2 loading and corresponds to the ratio of the concentration of carbon to potassium in solution (i.e. CO2 loading or alpha = [carbon] / [potassium]). For example, a pure solution of 1.45 M K2CO3 has an alpha of [1.45]/[2×1.45]=0.5, and a pure solution of 2.9 M KHCO3 has an alpha of [2.9]/[2.9]=1. A mixture of 0.87 M K2CO3 +1.16 M KHCO3 has an alpha of [0.87+1.16]/[(0.87×2)+1.16]=2.03/2.9=0.7.

В настоящем документе выражение «рекомбинантный полипептид(ы) карбоангидразы» относится к не встречающимся в природе ферментам, способным катализировать гидратацию диоксида углерода, сконструированного или полученного с использованием рекомбинантной технологии. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут включать любой тип модификации (например, химические или посттрансляционные модификации, такие как ацетилирование, фосфорилирование, гликозилирование, сульфатирование, сумоилирование, пренилирование, убиквитинирование и т.д.). Для большей ясности предусмотрены модификации полипептидов при условии, что модификация не нарушает карбоангидразную активность полипептидов карбоангидразы, описанных в настоящем документе. Способы измерения активности карбоангидразы описаны, например, в WO/2016/029316 и/или WO/2017/035667.As used herein, the term "recombinant carbonic anhydrase polypeptide(s)" refers to non-naturally occurring enzymes capable of catalyzing the hydration of carbon dioxide that are engineered or produced using recombinant technology. In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may include any type of modification (e.g., chemical or post-translational modifications such as acetylation, phosphorylation, glycosylation, sulfation, sumoylation, prenylation, ubiquitination, etc.). For greater clarity, modifications of the polypeptides are contemplated, provided that the modification does not impair the carbonic anhydrase activity of the carbonic anhydrase polypeptides described herein. Methods for measuring carbonic anhydrase activity are described, for example, in WO/2016/029316 and/or WO/2017/035667.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать остаток (остатки): 3Е; 6R; 9А или 9N; 11L, 11P, или 11Y; 15L; 17Y; 18I, 18L, 18R, или 18S; 20K или 20L; 241, 24М, или 24V; 25F; 27R; 38D, 38R, или 38Т; 39Н, 391, 39L, 39R, или 39W; 48L, 48Q, или 48Т; 51D, 51Е, 51F, 51М, или 51Р; 64Т; 73Е или 73L; 77F; 79Е, 79L или 79W; 88Е, 88I, 88L, 88R, 88Т, или 88V; 105F; 116Е или 116R; 119D или 119М; 128Е, 128K, 128R, или 128Т; 130А, 130D, 130Е, 130F, 130Н, 130K, 130Q, 130R, 130S, 130Т, 130V, 130W, или 130Y; 137D или 137Е; 138Е или 138L; 145D или 145Е; 148F, 148V, или 148W; 149I; 154D, 154K, 154Р, или 154V; 156V; 158Y; 160D или 160Q; 166Е или 166V; 167L; 168Е, 168F, 168R, или 168W; 170F; 192D; 195D или 195Е; 199А, 199D, или 199K; 203R или 203V; 206R; 210Н; 216Т; 219I; 223I, 223L, или 223V; 226R; или любую их комбинацию. Эти замены аминокислот представляют собой замены, которые, как показано в настоящем документе экспериментально, связаны с показателем растворимости, показателем стабильности или общим показателем более 1,0, что указывает на то, что их присутствие оказало положительный эффект на растворимость и/или термостабильность фермента в щелочном карбонатном растворе, или были обнаружены на матрицах карбоангидраз с SEQ ID NO: 3 и 4, имеющих повышенную растворимость по сравнению с ТАСА дикого типа при 80°С в щелочном карбонатном растворе.In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may comprise residue(s): 3E; 6R; 9A or 9N; 11L, 11P, or 11Y; 15L; 17Y; 18I, 18L, 18R, or 18S; 20K or 20L; 241, 24M, or 24V; 25F; 27R; 38D, 38R, or 38T; 39H, 391, 39L, 39R, or 39W; 48L, 48Q, or 48T; 51D, 51E, 51F, 51M, or 51P; 64T; 73E or 73L; 77F; 79E, 79L or 79W; 88E, 88I, 88L, 88R, 88T, or 88V; 105F; 116E or 116R; 119D or 119M; 128E, 128K, 128R, or 128T; 130A, 130D, 130E, 130F, 130H, 130K, 130Q, 130R, 130S, 130T, 130V, 130W, or 130Y; 137D or 137E; 138E or 138L; 145D or 145E; 148F, 148V, or 148W; 149I; 154D, 154K, 154P, or 154V; 156V; 158Y; 160D or 160Q; 166E or 166V; 167L; 168E, 168F, 168R, or 168W; 170F; 192D; 195D or 195E; 199A, 199D, or 199K; 203R or 203V; 206R; 210H; 216T; 219I; 223I, 223L, or 223V; 226R; or any combination thereof. These amino acid substitutions are substitutions that have been shown experimentally herein to be associated with a solubility index, stability index, or total index greater than 1.0, indicating that their presence had a positive effect on the solubility and/or thermal stability of the enzyme in alkaline carbonate solution, or were found on carbonic anhydrase matrices of SEQ ID NOs: 3 and 4 that had increased solubility compared to wild-type TACA at 80°C in alkaline carbonate solution.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать остатков, определенных выше. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны все комбинации благоприятных замен аминокислот.In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may comprise at least two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen or twenty residues as defined above. In some embodiments, all combinations of favorable amino acid substitutions are described herein.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать остаток (остатки): 3Е; 11P; 18S; 24I; 38D; 39I, 39L, 39Н, 39R, 39L, или 39I; 88I; 130S или 130D; 154D или 154Р; 223L или 223I; 130S и 154D; 130А и 154D; 130D и 154D; 130А, 154Р, и 195Е; 15L, 38D, и 128K; 195Е и 2231; 25F, 38D, и 128K; 38D и 128K; 38D, 128K и 137Е; 38D, 128K, 137Е, и 154D; 38D, 128K, 137Е, и 154Р; 38D, 128K, и 145Е; 38D, 128K, и 148W; 38D, 128K, и 160Q; 38D, 128K, и 167L; 38D, 128K, и 168D; 38D, 128K, и 195Е; 38D, 128K, и 199А; 38D, 128K, и 216V; 38D, 128K, и 219L; 38D, 128K, и 226K; 38D, E88I, и 128K; 38D, Е88K, и 128K; S39I, 128K, 154D, и 2231; S39I, 130А, 154Р, 195Е, и 223I; 39I, 130А, 154Р, 195Е, и 223L; 39I, 130А, 154D, и 223L; S39I, 130А, 154D, и 223I; 39I и 195Е; 39I и 223I; 39L и 223L; 39L и 223I; 39I и 223L. Эти замены аминокислот представляют собой замены, которые, как показано в настоящем документе экспериментально, связаны с общими показателями более 2,0, что указывает на то, что их присутствие оказало положительный эффект на растворимость и/или термостабильность фермента в щелочном карбонатном растворе.In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may comprise residue(s): 3E; 11P; 18S; 24I; 38D; 39I, 39L, 39H, 39R, 39L, or 39I; 88I; 130S or 130D; 154D or 154P; 223L or 223I; 130S and 154D; 130A and 154D; 130D and 154D; 130A, 154P, and 195E; 15L, 38D, and 128K; 195E and 2231; 25F, 38D, and 128K; 38D and 128K; 38D, 128K and 137E; 38D, 128K, 137E, and 154D; 38D, 128K, 137E, and 154P; 38D, 128K, and 145E; 38D, 128K, and 148W; 38D, 128K, and 160Q; 38D, 128K, and 167L; 38D, 128K, and 168D; 38D, 128K, and 195E; 38D, 128K, and 199A; 38D, 128K, and 216V; 38D, 128K, and 219L; 38D, 128K, and 226K; 38D, E88I, and 128K; 38D, E88K, and 128K; S39I, 128K, 154D, and 2231; S39I, 130A, 154P, 195E, and 223I; 39I, 130A, 154P, 195E, and 223L; 39I, 130A, 154D, and 223L; S39I, 130A, 154D, and 223I; 39I and 195E; 39I and 223I; 39L and 223L; 39L and 223I; 39I and 223L. These amino acid substitutions represent substitutions that have been shown experimentally herein to be associated with overall indices greater than 2.0, indicating that their presence had a positive effect on the solubility and/or thermal stability of the enzyme in alkaline carbonate solution.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, сконструированы таким образом, чтобы иметь более низкие изоэлектрические точки по сравнению с ферментами дикого типа или исходными ферментами, не имеющими такой конструкции. Используемый в настоящем документе термин «изоэлектрическая точка» или «pI» относится к рН, при котором полипептид не несет суммарного электрического заряда или является электрически нейтральным, что может быть определено экспериментально или теоретически (рассчитано). В некоторых вариантах осуществления pI полипептида, описанного в настоящем документе, может быть определена экспериментально способами, известными в данной области техники, такими как изоэлектрическое фокусирование. В других вариантах осуществления pI полипептида, описанного в настоящем документе, может представлять собой теоретическую pI, вычисленную с применением алгоритма, например, основанного на использовании уравнения Хендерсона-Хассельбаха с различными значениями рK. В некоторых вариантах осуществления pI полипептида, описанного в настоящем документе, можно вычислить с применением доступного онлайн-инструмента, такого как онлайн-инструмент Compute pI/Mw, доступный на портале ресурсов ExPASy Bioinformatics (https://web.expasy.org).In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein are engineered to have lower isoelectric points than wild-type or parent enzymes that do not have such an engineered structure. As used herein, the term "isoelectric point" or "pI" refers to the pH at which the polypeptide carries no net electrical charge or is electrically neutral, which can be determined experimentally or theoretically (calculated). In some embodiments, the pI of a polypeptide described herein can be determined experimentally by methods known in the art, such as isoelectric focusing. In other embodiments, the pI of a polypeptide described herein can be a theoretical pI calculated using an algorithm, such as the Henderson-Hasselbalch equation with different pK values. In some embodiments, the pI of a polypeptide described herein can be calculated using a readily available online tool, such as the Compute pI/Mw online tool available on the ExPASy Bioinformatics Resource Portal (https://web.expasy.org).

В Примере 1 показано, что конструирование ТАСА дикого типа для снижения его pi может помочь увеличить растворимость фермента, особенно при повышенных температурах (например, 80°С) в щелочном карбонатном растворе карбоната. Действительно, в Таблице 1 показано, что варианты карбоангидразы SEQ ID NO: 2-7, имеющие постепенно снижающиеся значения pi (т.е. от 8,3 до 6,9), связаны с постепенно повышающейся растворимостью при 80°С в щелочном карбонатном растворе (например, 1,45 М K2СО3 альфа 0,7) по сравнению с ТАСА дикого типа (SEQ ID NO: 1), имеющим pi 8,8. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть сконструированы таким образом, чтобы иметь изоэлектрическую точку (pI) ниже, чем у SEQ ID NO: 2, 3 или 4. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут иметь pI на уровне или ниже 8,3, 8,2, 8,1, 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6 или 4,5. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут иметь pi от 4 до 8, от 4,5 до 7,5, от 5 до 7, от 5,5 до 6,5 или от 5 до 6.Example 1 shows that engineering wild-type TACA to lower its pI can help increase the solubility of the enzyme, particularly at elevated temperatures (e.g., 80°C) in alkaline carbonate solution. Indeed, Table 1 shows that carbonic anhydrase variants of SEQ ID NOs: 2-7 having progressively lower pI values (i.e., 8.3 to 6.9) are associated with progressively higher solubility at 80°C in alkaline carbonate solution (e.g., 1.45 M K2CO3alpha0.7 ) compared to wild-type TACA (SEQ ID NO: 1), which has a pI of 8.8. Accordingly, in some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can be engineered to have an isoelectric point (pI) lower than SEQ ID NO: 2, 3, or 4. In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can have a pI at or lower than 8.3, 8.2, 8.1, 8.0, 7.9, 7.8, 7.7, 7.6, 7.5, 7.4, 7.3, 7.2, 7.1, 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, or 4.5. In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can have a pi of 4 to 8, 4.5 to 7.5, 5 to 7, 5.5 to 6.5, or 5 to 6.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, содержащие одну или более аминокислотных отличий по сравнению с SEQ ID NO: 1 в положениях остатков, описанных в настоящем документе, могут проявлять повышенную растворимость и/или повышенную термостабильность по сравнению с соответствующим исходным полипептидом карбоангидразы, не содержащим одно или более аминокислотных различий (именуемых в настоящем документе «контрольным полипептидом карбоангидразы»), особенно в щелочном карбонатном растворе. В некоторых вариантах осуществления тесты на растворимость и/или термостабильность могут быть выполнены, как описано в Примерах 1-3. В некоторых вариантах осуществления может быть выполнен тест на термостабильность, как описано, например, в WO/2017/035667.In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein comprising one or more amino acid differences compared to SEQ ID NO: 1 at residue positions described herein may exhibit increased solubility and/or increased thermal stability compared to a corresponding parent carbonic anhydrase polypeptide lacking the one or more amino acid differences (referred to herein as a "control carbonic anhydrase polypeptide"), particularly in an alkaline carbonate solution. In some embodiments, solubility and/or thermal stability tests can be performed as described in Examples 1-3. In some embodiments, a thermal stability test can be performed as described, for example, in WO/2017/035667.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную растворимость после 24-часовой выдержки при 22°С или 70°С в щелочном карбонатном растворе по сравнению с контрольным полипептидом карбоангидразы. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную растворимость после 24-часовой выдержки при 80°С в щелочном карбонатном растворе. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную растворимость, как определено тестом растворимости путем титрования. В некоторых вариантах осуществления тест растворимости путем титрования может быть выполнен путем измерения мутности 2 г/л рекомбинантного полипептида карбоангидразы в растворах в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K2СО3 с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89, как описано в Примере 3. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут иметь растворимость более 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12 г/л через 24 часа при 80°С в щелочном карбонатном растворе.In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may exhibit increased solubility after 24 hours of exposure to 22°C or 70°C in an alkaline carbonate solution compared to a control carbonic anhydrase polypeptide. In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may exhibit increased solubility after 24 hours of exposure to 80°C in an alkaline carbonate solution. In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may exhibit increased solubility as determined by a solubility titration test. In some embodiments, a titration solubility test can be performed by measuring the turbidity of 2 g/L of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide in solutions ranging from 1.38 to 1.85 M K2CO3 with an alpha ranging from 0.60 to 0.89, as described in Example 3. In particular embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can have a solubility of greater than 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 12 g/l after 24 hours at 80°C in an alkaline carbonate solution.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную термостабильность по сравнению с контрольным полипептидом карбоангидразы после 72-часовой выдержки при 85°С в щелочном карбонатном растворе. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную термостабильность по сравнению с контрольным полипептидом карбоангидразы после 16-часовой выдержки при 95°С в щелочном карбонатном растворе.In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may exhibit increased thermal stability compared to a control carbonic anhydrase polypeptide after 72 hours of exposure to 85°C in an alkaline carbonate solution. In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may exhibit increased thermal stability compared to a control carbonic anhydrase polypeptide after 16 hours of exposure to 95°C in an alkaline carbonate solution.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96,%, 97%, 98% или 99% идентичности с любой из SEQ ID NO, описанных в настоящем документе, относящихся к карбоангидразе Thermovibrio ammonificans (например, SEQ ID NO: 1-11).In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can comprise an amino acid sequence having at least 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity to any of the SEQ ID NOs described herein. in this document, relating to the carbonic anhydrase of Thermovibrio ammonificans (e.g., SEQ ID NO: 1-11).

Методы определения «идентичности последовательности» аминокислот известны в данной области техники. Например, широко используется программа Emboss Needle (https://www.ebi.ac.uk), использующая алгоритм Нидлмана-Вунша. Эта программа оптимально выравнивает две последовательности, заданные в качестве входных данных, в соответствии с выбранной матрицей подобия (например, BLOSOM62) и другими параметрами (например, раскрытие пробела, размер пробела). На выходе она выдает выравнивание последовательностей, количество пробелов, которые она включает, а также проценты сходства и идентичности. Процент идентичности рассчитывают путем деления общего числа остатков, у которых одна и та же аминокислота обнаруживается в обеих последовательностях, на длину последовательности эталонного фермента (например, SEQ ID NO: 4, имеющего 226 остатков). Для большей ясности при вычислении процента идентичности данной последовательности относительно эталонной последовательности, которая определяет возможность присутствия более чем одной аминокислоты в данном положении остатка (например, SEQ ID NO: 5), данная последовательность считается совпадающей с эталонной последовательностью в этом положении остатка, если данная последовательность включает любую из возможных аминокислот, определенных для этого положения эталонной последовательностью.Methods for determining the "sequence identity" of amino acids are known in the art. For example, the Emboss Needle program (https://www.ebi.ac.uk) is widely used, using the Needleman-Wunsch algorithm. This program optimally aligns two sequences given as input according to a selected similarity matrix (e.g., BLOSOM62) and other parameters (e.g., gap opening, gap size). It outputs a sequence alignment, the number of gaps it includes, and percentages of similarity and identity. Percent identity is calculated by dividing the total number of residues where the same amino acid is found in both sequences by the length of the reference enzyme sequence (e.g., SEQ ID NO: 4, which has 226 residues). For greater clarity, when calculating the percent identity of a given sequence relative to a reference sequence that specifies the possibility of more than one amino acid being present at a given residue position (e.g., SEQ ID NO: 5), a given sequence is considered to match the reference sequence at that residue position if the given sequence includes any of the possible amino acids specified for that position by the reference sequence.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с карбоангидразой дикого типа из Persephonella marina (Номер доступа: WP_015898908.1; SEQ ID NO: 12), Persephonella sp.KM09-Lau-8 (WP_029522463.1; SEQ ID NO: 13), Persephonella sp.IF05-L8 (WP_029521561.1; SEQ ID NO: 14), некультивированных бактерий (AVN84966.1; SEQ ID NO: 15), Persephonella hydrogeniphila (WP_096999253.1; SEQ ID NO: 16), Aquiflcae bacterium (RMD45622.1; SEQ ID NO: 17), Caminibacter mediatlanticus (WP_007474387.1; SEQ ID NO: 18), Hydrogenimonas sp.(BBG65557.1; SEQ ID NO: 19) или Hydrogenimonas sp.(RUM45284.1; SEQ ID NO: 20). Вышеупомянутые карбоангидразы представляют собой одни из самых близких ортологов ТАСА с точки зрения консервации аминокислотной последовательности, а также происходят от термофильных организмов. В некоторых вариантах осуществления замены аминокислот, продемонстрированные в настоящем документе для обеспечения положительного эффекта с точки зрения растворимости и/или термостабильности различных матриц ТАСА, могут быть сконструированы в соответствующие положения остатков на фоне любой из SEQ ID NO: 12-20. Соответствующие положения остатков могут быть идентифицированы специалистами в данной области техники путем выполнения множественного выравнивания последовательностей с последовательностями ТАСА, описанными в настоящем документе, как показано на Фиг. 6.In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can comprise an amino acid sequence having at least 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity to a wild-type carbonic anhydrase from Persephonella marina (Accession number: WP_015898908.1; SEQ ID NO: 12), Persephonella sp.KM09-Lau-8 (WP_029522463.1; SEQ ID NO: 13), Persephonella sp.IF05-L8 (WP_029521561.1; SEQ ID NO: 14), uncultured bacteria (AVN84966.1; SEQ ID NO: 15), Persephonella hydrogeniphila (WP_096999253.1; SEQ ID NO: 16), Aquiflcae bacterium (RMD45622.1; SEQ ID NO: 17), Caminibacter mediatlanticus (WP_007474387.1; SEQ ID NO: 18), Hydrogenimonas sp.(BBG65557.1; SEQ ID NO: 19) or Hydrogenimonas sp.(RUM45284.1; SEQ ID NO: 20). The aforementioned carbonic anhydrases are among the closest orthologs of TACA in terms of amino acid sequence conservation and are also derived from thermophilic organisms. In some embodiments, the amino acid substitutions demonstrated herein to provide a beneficial effect on the solubility and/or thermal stability of various TACA templates can be engineered at the corresponding residue positions in the background of any of SEQ ID NOs: 12-20. The corresponding residue positions can be identified by those skilled in the art by performing a multiple sequence alignment with the TACA sequences described herein, as shown in Fig. 6.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны изолированные полинуклеотиды, кодирующие рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изолированный полинуклеотид может быть функционально связан с гетерологичным промотором.In some aspects, the present document describes isolated polynucleotides encoding recombinant carbonic anhydrase polypeptides as defined herein. In some embodiments, the isolated polynucleotide may be operably linked to a heterologous promoter.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны векторы экспрессии или клонирования, содержащие изолированные полинуклеотиды, как определено в настоящем документе.In some aspects, the present document describes expression or cloning vectors comprising isolated polynucleotides as defined herein.

В некоторых аспектах, в настоящем документе описаны клетки-хозяева, содержащие изолированные полинуклеотиды, как определено в настоящем документе, или векторы экспрессии или клонирования, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева могут представлять собой бактериальные клетки, дрожжевые клетки или клетки грибов.In some aspects, described herein are host cells comprising isolated polynucleotides as defined herein, or expression or cloning vectors as defined herein. In some embodiments, the host cells can be bacterial cells, yeast cells, or fungal cells.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны способы получения рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, причем способ включает культивирование клеток-хозяев, как определено в настоящем документе, в условиях, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного полипептида карбоангидразы, как определено в настоящем документе, и выделение рекомбинантного полипептида карбоангидразы.In some aspects, described herein are methods for producing recombinant carbonic anhydrase polypeptides, wherein the method comprises culturing host cells as defined herein under conditions that allow expression of a recombinant carbonic anhydrase polypeptide as defined herein, and isolating the recombinant carbonic anhydrase polypeptide.

В некоторых аспектах рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, предназначены для применения в промышленном способе улавливания CO2 из CO2-содержащих сточных вод или газа.In some aspects, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein are intended for use in an industrial process for capturing CO2 from CO2 -containing wastewater or gas.

В некоторых аспектах в настоящем документе описан способ абсорбции CO2 из CO2-содержащих сточных вод или газа, причем указанный способ включает: приведение CO2-содержащих сточных вод или газа в контакт с водным абсорбирующим раствором для растворения CO2 в водном абсорбирующем растворе; и обеспечение рекомбинантного полипептида карбоангидразы, как описано в настоящем документе, для осуществления катализа реакции гидратации растворенного CO2 в ионы бикарбоната и водорода или обратной реакции.In some aspects, described herein is a method for absorbing CO2 from a CO2 -containing wastewater or gas, said method comprising: contacting the CO2- containing wastewater or gas with an aqueous absorbent solution to dissolve the CO2 in the aqueous absorbent solution; and providing a recombinant carbonic anhydrase polypeptide as described herein to catalyze a reaction of hydration of dissolved CO2 to bicarbonate and hydrogen ions or the reverse reaction.

В некоторых вариантах осуществления способ включает подвергание описанных в настоящем документе вариантов рекомбинантного полипептида карбоангидразы воздействию условий способа (например, водный абсорбционный раствор, температура и/или условия рН), которые усиливают их улучшенную растворимость и/или термостабильность, что приводит к снижению скорости или количества потребления/истощения рекомбинантного полипептида карбоангидразы по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2, или другим контрольным полипептидом карбоангидразы. Поскольку восполнение рекомбинантного полипептида карбоангидразы относится к эксплуатационным расходам способа улавливания CO2, уменьшение скорости или количества, с которыми фермент потребляется/истощается в способе, значительно снизит эксплуатационные расходы.In some embodiments, the method comprises subjecting the recombinant carbonic anhydrase polypeptide variants described herein to process conditions (e.g., aqueous absorption solution, temperature, and/or pH conditions) that enhance their improved solubility and/or thermal stability, resulting in a reduction in the rate or amount of consumption/depletion of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide compared to a corresponding method performed with the carbonic anhydrase polypeptide of SEQ ID NO: 1 or 2, or another control carbonic anhydrase polypeptide. Since replenishment of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide is related to the operating costs of the CO2 capture method, reducing the rate or amount at which the enzyme is consumed/depleted in the method will significantly reduce the operating costs.

В некоторых вариантах осуществления снижение скорости или количества потребления рекомбинантного полипептида карбоангидразы может быть результатом снижения эффективной концентрации рекомбинантного полипептида карбоангидразы, необходимой для достижения целевого уровня улавливания CO2, по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2 или другим контрольным рекомбинантным полипептидом карбоангидразы. Более конкретно, в Примере 4 описано, что улучшение растворимости рекомбинантной карбоангидразы, как описано в настоящем документе, приводит к снижению эффективной концентрации фермента, необходимой для достижения заданной эффективности улавливания CO2, по сравнению с контрольной или сопоставимой рекомбинантной карбоангидразой, имеющей такую же или подобную термостабильность, хотя и с более низкой растворимостью. Не будучи связанными теорией, предполагается, что повышение растворимости может уменьшить образование нерастворимых и/или растворимых агрегатов ферментов, которые ослаблены или неактивны с точки зрения активности карбоангидразы. Несмотря на это, преимущество введения вариантов, которые улучшают растворимость, может снизить количество фермента, необходимое с течением времени для поддержания заданной эффективности улавливания CO2. Кроме того, возможность использовать более низкую концентрацию рекомбинантной карбоангидразы в процессе улавливания CO2 без ущерба для характеристик или эффективности улавливания CO2 является желательной для потенциального снижения эксплуатационных расходов.In some embodiments, the reduction in the rate or amount of consumption of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide may be the result of a reduction in the effective concentration of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide required to achieve a target level of CO2 capture, compared to a corresponding method performed with the carbonic anhydrase polypeptide of SEQ ID NO: 1 or 2 or another control recombinant carbonic anhydrase polypeptide. More specifically, Example 4 describes that improving the solubility of the recombinant carbonic anhydrase as described herein results in a reduction in the effective concentration of the enzyme required to achieve a given CO2 capture efficiency, compared to a control or comparable recombinant carbonic anhydrase having the same or similar thermal stability, albeit with lower solubility. Without being bound by theory, it is believed that increasing solubility may reduce the formation of insoluble and/or soluble enzyme aggregates that are weakened or inactive in terms of carbonic anhydrase activity. Regardless, the benefit of introducing variants that improve solubility may reduce the amount of enzyme required over time to maintain a given CO2 capture efficiency. Additionally, the ability to use a lower concentration of recombinant carbonic anhydrase in the CO2 capture process without sacrificing CO2 capture performance or efficiency is desirable for potential reductions in operating costs.

В некоторых вариантах осуществления снижение скорости или количества потребления рекомбинантного полипептида карбоангидразы может быть результатом снижения скорости или количества активного рекомбинантного полипептида карбоангидразы (т.е. рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, обладающих карбоангидразной активностью), которое теряется или истощается вследствие агрегации и/или термической нестабильности по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2, или другим контрольным полипептидом карбоангидразы. В настоящем документе показано, что некоторые термостабильные рекомбинантные полипептиды карбоангидразы могут быть склонны к агрегации и/или осаждению, особенно при более высоких температурах в щелочном карбонатном растворе (например, при 80°С или выше в 1,45 М K2СО3 альфа 0,7). Сконструированные рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, имеющие улучшенные профили растворимости и/или более низкие изоэлектрические точки, могут иметь большую устойчивость к осаждению и/или агрегации в условиях, регулярно встречающихся в способах улавливания CO2, и, таким образом, могут снизить эксплуатационные расходы, связанные с восполнением ферментов и/или дополнительными вмешательствами, связанными с этим.In some embodiments, the decrease in the rate or amount of consumption of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide may be the result of a decrease in the rate or amount of active recombinant carbonic anhydrase polypeptide (i.e., recombinant carbonic anhydrase polypeptides having carbonic anhydrase activity) that is lost or depleted due to aggregation and/or thermal instability compared to a corresponding method performed with the carbonic anhydrase polypeptide of SEQ ID NO: 1 or 2 , or another control carbonic anhydrase polypeptide. It is shown herein that some thermostable recombinant carbonic anhydrase polypeptides may be prone to aggregation and/or precipitation, particularly at higher temperatures in an alkaline carbonate solution (e.g., at 80°C or higher in 1.45 M K2CO3alpha0.7). The engineered recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein, having improved solubility profiles and/or lower isoelectric points, may have greater resistance to precipitation and/or aggregation under conditions routinely encountered in CO2 capture processes and, thus, may reduce operating costs associated with enzyme replenishment and/or additional interventions associated therewith.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, применяют в комбинации с абсорбирующим раствором, включающим по меньшей мере одно абсорбирующее соединение, которое способствует абсорбции CO2. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе абсорбирующие растворы могут включать по меньшей мере одно абсорбирующее соединение, такое как: (а) первичный амин, вторичный амин, третичный амин, первичный алканоламин, вторичный алканоламин, третичный алканоламин, первичная аминокислота, вторичная аминокислота, третичная аминокислота, диалкиловый эфир полиалкиленшиколей, диалкиловый эфир или диметиловый эфир полиэтиленгликоля, аминокислота или ее производное, моноэтаноламин (МЕА), 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP), 2-(2-аминоэтиламино)этанол (АЕЕ), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (Tris или AHPD), N-метилдиэтаноламин (MDEA), диметилмоноэтаноламин (DMMEA), диэтилмоноэтаноламин (DEMEA), триизопропаноламин (TIPA), триэтаноламин (TEA), диэтаноламин (DEA), диизопропиламин (DIPA), метилмоноэтаноламин (ММЕА), трет-бутиламиноэтоксиэтанол (ТВЕЕ), N-2-гидроксиэтилпиперазин (HEP), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (AHPD), стерически затрудненный диамин (HDA), бис-(трет-бутиламиноэтокси)-этан (ВТЕЕ), этоксиэтоксиэтанол-третбутиламин (ЕЕЕТВ), бис-(трет-бутиламиноэтил)эфир, 1,2-бис(трет-бутиламиноэтокси)этан и/или бис-(2-изопропиламинопропил)эфир или их комбинация; (b) первичный амин, вторичный амин, третичный амин, первичный алканоламин, вторичный алканоламин, третичный алканоламин, первичная аминокислота, вторичная аминокислота, третичная аминокислота; или их комбинация; (с) диалкиловый эфир полиалкиленгликолей, диалкиловый эфир или диметиловый эфир полиэтиленгликоля, аминокислота или ее производное, или их комбинация; (d) пиперазин или его производное, предпочтительно замещенное по меньшей мере одной из алканольных групп; (е) моноэтаноламин (МЕА), 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP), 2-(2-аминоэтиламино) этанол (АЕЕ), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (Tris или AHPD), N-метилдиэтаноламин (MDEA), диметилмоноэтаноламин (DMMEA), диэтилмоноэтаноламин (DEMEA), триизопропаноламин (TIPA), триэтаноламин (TEA), диэтаноламин (DEA), диизопропиламин (DIPA), метилмоноэтаноламин (ММЕА), трет-бутиламиноэтоксиэтанол (ТВЕЕ), N-2-гидроксиэтилпиперазин (HEP), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (AHPD), стерически затрудненный диамин (HDA), бис-(трет-бутиламиноэтокси)-этан (ВТЕЕ), этоксиэтоксиэтанол-трет-бутиламин (ЕЕЕТВ), бис-(трет-бутиламиноэтил)эфир, 1,2-бис-(трет-бутиламиноэтокси)этан и/или бис-(2-изопропиламинопропил) эфир; (f) аминокислота или ее производное, которая предпочтительно представляет собой глицин, пролин, аргинин, гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, метионин, серии, треонин, глутамин, цистеин, аспарагин, валин, лейцин, изолейцин, аланин, тирозин, триптофан, фенилаланин, таурин, Мщклогексил 1,3-пропандиамин, N-вторичный бутилглицин, N-метил N-вторичный бутилглицин, диэтилглицин, диметилглицин, саркозин, метилтаурин, метил-α-аминопропионовую кислоту, N-β(этокси)таурин, N-(β-аминоэтил)таурин, N-метилаланин, 6-аминогексановую кислоту, калиевую или натриевую соль аминокислоты или любую их комбинацию; (g) карбонатное соединение; (h) карбонат натрия, карбонат калия или MDEA; (i) карбонат натрия; или (j) карбонат калия.In some embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein are used in combination with an absorbent solution comprising at least one absorbent compound that facilitates CO2 absorption. In some embodiments, the absorbent solutions described herein may include at least one absorbent compound such as: (a) a primary amine, a secondary amine, a tertiary amine, a primary alkanolamine, a secondary alkanolamine, a tertiary alkanolamine, a primary amino acid, a secondary amino acid, a tertiary amino acid, a dialkyl ether of polyalkyleneglycols, a dialkyl ether or dimethyl ether of polyethyleneglycol, an amino acid or derivative thereof, monoethanolamine (MEA), 2-amino-2-methyl-1-propanol (AMP), 2-(2-aminoethylamino)ethanol (AEE), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (Tris or AHPD), N-methyldiethanolamine (MDEA), dimethylmonoethanolamine (DMMEA), diethylmonoethanolamine (DEMEA), triisopropanolamine (TIPA), triethanolamine (TEA), diethanolamine (DEA), diisopropylamine (DIPA), methylmonoethanolamine (MMEA), tert-butylaminoethoxyethanol (TBEE), N-2-hydroxyethylpiperazine (HEP), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (AHPD), hindered diamine (HDA), bis(tert-butylaminoethoxy)ethane (BTEE), ethoxyethoxyethanol-tertbutylamine (EEETB), bis(tert-butylaminoethyl)ether, 1,2-bis(tert-butylaminoethoxy)ethane and/or bis(2-isopropylaminopropyl)ether or a combination thereof; (b) a primary amine, a secondary amine, a tertiary amine, a primary alkanolamine, a secondary alkanolamine, a tertiary alkanolamine, a primary amino acid, a secondary amino acid, a tertiary amino acid; or a combination thereof; (c) a dialkyl ether of polyalkylene glycols, a dialkyl ether or dimethyl ether of polyethylene glycol, an amino acid or a derivative thereof, or a combination thereof; (d) a piperazine or a derivative thereof, preferably substituted with at least one alkanol group; (e) monoethanolamine (MEA), 2-amino-2-methyl-1-propanol (AMP), 2-(2-aminoethylamino)ethanol (AEE), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (Tris or AHPD), N-methyldiethanolamine (MDEA), dimethylmonoethanolamine (DMMEA), diethylmonoethanolamine (DEMEA), triisopropanolamine (TIPA), triethanolamine (TEA), diethanolamine (DEA), diisopropylamine (DIPA), methylmonoethanolamine (MMEA), tert-butylaminoethoxyethanol (TBEE), N-2-hydroxyethylpiperazine (HEP), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (AHPD), hindered diamine (HDA), bis-(tert-butylaminoethoxy)-ethane (BTEE), ethoxyethoxyethanol-tert-butylamine (EEETB), bis-(tert-butylaminoethyl)ether, 1,2-bis(tert-butylaminoethoxy)ethane and/or bis-(2-isopropylaminopropyl)ether; (f) an amino acid or a derivative thereof, which is preferably glycine, proline, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, methionine, serine, threonine, glutamine, cysteine, asparagine, valine, leucine, isoleucine, alanine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine, taurine, Methylhexyl 1,3-propanediamine, N-secondary butylglycine, N-methyl N-secondary butylglycine, diethylglycine, dimethylglycine, sarcosine, methyltaurine, methyl-α-aminopropionic acid, N-β(ethoxy)taurine, N-(β-aminoethyl)taurine, N-methylalanine, 6-aminohexanoic acid, a potassium or sodium salt of an amino acid, or any combination thereof; (g) a carbonate compound; (h) sodium carbonate, potassium carbonate, or MDEA; (i) sodium carbonate; or (j) potassium carbonate.

В некоторых вариантах осуществления концентрация абсорбирующего соединения в растворе может составлять от примерно 0,1 до 10 М, в зависимости от различных факторов. Когда абсорбирующее соединение представляет собой соединение на основе амина, концентрация раствора на основе амина может составлять от примерно 0,1 до 8 М, а когда абсорбирующее соединение представляет собой соединение на основе аминокислоты, концентрация раствора на основе аминокислоты может составлять от примерно 0,1 до 6 М. Когда абсорбирующее соединение представляет собой соединение на основе карбоната, рН абсорбирующего раствора может составлять примерно от 8 до 12, в зависимости, например, от абсорбирующего соединения и загрузки раствора СO2.In some embodiments, the concentration of the absorbent compound in the solution can be from about 0.1 to 10 M, depending on various factors. When the absorbent compound is an amine-based compound, the concentration of the amine-based solution can be from about 0.1 to 8 M, and when the absorbent compound is an amino acid-based compound, the concentration of the amino acid-based solution can be from about 0.1 to 6 M. When the absorbent compound is a carbonate-based compound, the pH of the absorbent solution can be from about 8 to 12, depending, for example, on the absorbent compound and the CO 2 loading of the solution.

В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе абсорбирующие растворы могут содержать абсорбирующее соединение, которое представляет собой карбонатное соединение в концентрации от примерно 0,1 до 3 М, от 0,5 до 2,5 М, от 0,5 до 2 М, от 1 до 2 М или от 1,25 до 1,75 М. В некоторых вариантах осуществления карбонатное соединение может представлять собой карбонат натрия или карбонат калия.In some embodiments, the absorbent solutions described herein may comprise an absorbent compound that is a carbonate compound at a concentration of from about 0.1 to 3 M, from 0.5 to 2.5 M, from 0.5 to 2 M, from 1 to 2 M, or from 1.25 to 1.75 M. In some embodiments, the carbonate compound may be sodium carbonate or potassium carbonate.

В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе способы улавливания CO2 могут включать подвергание описанных в настоящем документе рекомбинантных полипептидов карбоангидразы воздействию температуры 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99°С, и/или рН 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9 или 11 в какой-то момент во время указанного процесса (например, как часть колебаний температуры и/или рН в повторяющемся тепловом цикле процесса). В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе способы улавливания CO2 могут включать подвергание описанных в настоящем документе рекомбинантных полипептидов карбоангидразы воздействию рН от 8 до 11, от 8,5 до 11, от 9 до 10,5 или от 9 до 10 в какой-то момент во время указанного процесса (например, как часть колебаний температуры и/или рН в повторяющемся тепловом цикле процесса). С помощью таких повышенных температур и рН, особенно в контексте карбонатных растворов, можно усиливать или использовать улучшенные профили растворимости и/или термостабильности рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, описанных в настоящем документе, для повышения эффективности улавливания CO2 и/или снижения эксплуатационных расходов.In some embodiments, the methods of CO2 capture described herein may comprise exposing the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein to a temperature of 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99°C, and/or pH 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, or 11 at some point during said process (e.g., as part of temperature and/or pH swings in a repeating thermal cycle of the process). In some embodiments, the methods of CO2 capture described herein may comprise exposing the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein to a pH of 8 to 11, 8.5 to 11, 9 to 10.5, or 9 to 10 at some point during said process (e.g., as part of temperature and/or pH swings in a repeating thermal cycle of the process). Using such elevated temperatures and pH, particularly in the context of carbonate solutions, it is possible to enhance or exploit the improved solubility and/or thermal stability profiles of the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein to improve CO2 capture efficiency and/or reduce operating costs.

В некоторых вариантах осуществления CO2-содержащие сточные воды или газ могут содержать от примерно 0,04% об. до 80% об., от 3% об. до 50% об., от 5% об. до 40% об., от 5% об. до 35% об. или от 5% об. до 30% об. CO2. В некоторых вариантах осуществления CO2-содержащие сточные воды или газ могут содержать N2, О2, благородные газы, VOCs, Н2О, СО, SOx, соединения NOx, NH3, меркаптаны, H2S, H2, тяжелые металлы, пыль, золу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления CO2-содержащие сточные воды или газ могут быть получены в результате сжигания природного газа, сжигания угля, сжигания биогаза, повышения качества биогаза или очистки природного газа от серы.In some embodiments, the CO2 -containing wastewater or gas may contain from about 0.04 vol.% to 80 vol.%, from 3 vol.% to 50 vol.%, from 5 vol.% to 40 vol.%, from 5 vol.% to 35 vol.%, or from 5 vol.% to 30 vol.% CO2 . In some embodiments, the CO2 -containing wastewater or gas may contain N2 , O2 , noble gases, VOCs, H2O , CO, SOx, NOx compounds, NH3 , mercaptans, H2S , H2 , heavy metals, dust, ash, or any combination thereof. In some embodiments, the CO2 -containing wastewater or gas may be produced by natural gas combustion, coal combustion, biogas combustion, biogas upgrading, or natural gas desulfurization.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в способах улавливания CO2 можно использовать полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, в абсорбирующем растворе в концентрации от примерно 0,01 до 50 г/л, от 0,05 до 10 г/л или от 0,1 до 4 г/л. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в способах улавливания CO2 можно применять полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, в абсорбирующем растворе в концентрации примерно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9 или 4 г/л.In some embodiments described herein, the CO2 capture methods may use the carbonic anhydrase polypeptides described herein in an absorbent solution at a concentration of from about 0.01 to 50 g/L, from 0.05 to 10 g/L, or from 0.1 to 4 g/L. In some embodiments described herein, the methods of capturing CO2 can employ the carbonic anhydrase polypeptides described herein in an absorbent solution at a concentration of about 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 or 4 g/l.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть получены в исходных или питательных растворах (например, для использования в способах улавливания CO2), включающих рекомбинантный полипептид карбоангидразы, как описано в настоящем документе, в концентрации по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 г/л. В некоторых вариантах осуществления исходный или питательный растворы теряют менее 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5% (масс/об.) его начальной концентрации после инкубации в течение 24 часов при 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 или 90°С, например, из-за сниженной агрегации/осаждения фермента по сравнению с контрольным полипептидом карбоангидразы. Такую агрегацию/осаждение можно определить, например, как описано в Примере 1 и Таблице 1.In some embodiments, the carbonic anhydrase polypeptides described herein can be produced in feed or feed solutions (e.g., for use in CO2 capture methods) comprising a recombinant carbonic anhydrase polypeptide as described herein at a concentration of at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 g/L. In some embodiments, the initial or nutrient solution loses less than 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, or 5% (w/v) of its initial concentration after incubation for 24 hours at 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 or 90°C, for example, due to reduced aggregation/precipitation of the enzyme compared to a control carbonic anhydrase polypeptide. Such aggregation/precipitation can be determined, for example, as described in Example 1 and Table 1.

В некоторых вариантах осуществления способы улавливания CO2, описанные в настоящем документе, могут включать один или более дополнительных признаков (например, относящихся к общей системе улавливания CO2, блоку абсорбции, блоку десорбции, блоку разделения, устройству измерения и/или параметрам/условиям процесса), как описано в WO/2016/029316 и/или WO/2017/035667.In some embodiments, the CO2 capture methods described herein may include one or more additional features (e.g., related to the overall CO2 capture system, the absorption unit, the desorption unit, the separation unit, the measurement device, and/or the process parameters/conditions) as described in WO/2016/029316 and/or WO/2017/035667.

В различных вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в способах улавливания CO2 в качестве ферментов, которые свободны или растворены в растворителе, иммобилизованы или захвачены или иным образом прикреплены к частицам, которые находятся в абсорбирующем растворе, или к уплотнителю или другим структурам, которые закреплены в реакционной камере. В случае, когда рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть иммобилизованы по отношению к материалу носителя, это может быть осуществлено способом иммобилизации, выбранным из адсорбции, ковалентного связывания, захвата, сополимеризации, сшивания и инкапсулирования или их комбинации.In various embodiments, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can be used in CO2 capture methods as enzymes that are free or dissolved in a solvent, immobilized or captured, or otherwise attached to particles that are in an absorbent solution, or to a sealant or other structures that are secured in a reaction chamber. In the case where the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can be immobilized with respect to a support material, this can be accomplished by an immobilization method selected from adsorption, covalent binding, entrapment, copolymerization, cross-linking, and encapsulation, or a combination thereof.

В одной ситуации описанные в настоящем документе рекомбинантные полипептиды карбоангидразы могут быть иммобилизованы на носителе, который находится в форме частиц, шариков или. Такие носители могут быть твердыми или пористыми, с покрытием(ями) на их поверхности или без него. Рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть ковалентно присоединены к носителю и/или покрытию носителя или захвачены внутри подложки или носителя. В некоторых вариантах осуществления покрытие может быть пористым материалом, который захватывает описанные в настоящем документе рекомбинантные полипептиды карбоангидразы в порах и/или иммобилизует ферменты путем ковалентного связывания с поверхностями носителя. В некоторых вариантах осуществления материал подложки может включать нейлон, целлюлозу, диоксид кремния, силикагель, хитозан, полиакриламид, полиуретан, альгинат, полистирол, полиметилметакрилат, магнитный материал, сефарозу, диоксид титана, диоксид циркония и/или оксид алюминия, их соответствующие производные и/или другие материалы. В некоторых вариантах осуществления материал носителя может иметь плотность от примерно 0,6 г/мл до примерно 5 г/мл, такую как плотность выше 1 г/мл, плотность выше 2 г/мл, плотность выше 3 г/мл или плотность примерно 4 г/мл.In one situation, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can be immobilized on a carrier that is in the form of particles, beads, or. Such carriers can be solid or porous, with or without coating(s) on their surface. The recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein can be covalently attached to the carrier and/or a coating of the carrier or entrapped within the support or carrier. In some embodiments, the coating can be a porous material that entraps the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein in pores and/or immobilizes the enzymes by covalently binding to surfaces of the carrier. In some embodiments, the support material may include nylon, cellulose, silicon dioxide, silica gel, chitosan, polyacrylamide, polyurethane, alginate, polystyrene, polymethyl methacrylate, magnetic material, sepharose, titanium dioxide, zirconium dioxide and/or aluminum oxide, their corresponding derivatives and/or other materials. In some embodiments, the carrier material may have a density of about 0.6 g/mL to about 5 g/mL, such as a density greater than 1 g/mL, a density greater than 2 g/mL, a density greater than 3 g/mL, or a density of about 4 g/mL.

В некоторых ситуациях описанные в настоящем документе рекомбинантные полипептиды карбоангидразы могут быть представлены в виде агрегатов сшитых ферментов (CLEA) и/или в виде кристаллов сшитых ферментов (CLEC). В случае применения ферментных частиц, включая CLEA или CLEC, частицы могут иметь размер в диаметре примерно 17 мкм или меньше, необязательно примерно 10 мкм, примерно 5 мкм, примерно 4 мкм, примерно 3 мкм, примерно 2 мкм, примерно 1 мкм, примерно 0,9 мкм, примерно 0,8 мкм, примерно 0,7 мкм, примерно 0,6 мкм, примерно 0,5 мкм, примерно 0,4 мкм, примерно 0,3 мкм, примерно 0,2 мкм, примерно 0,1 мкм, примерно 0,05 мкм или примерно 0,025 мкм. Частицы также могут иметь распределение разных размеров.In some situations, the recombinant carbonic anhydrase polypeptides described herein may be provided as cross-linked enzyme aggregates (CLEA) and/or as cross-linked enzyme crystals (CLEC). When enzyme particles are used, including CLEA or CLEC, the particles may have a diameter size of about 17 μm or less, optionally about 10 μm, about 5 μm, about 4 μm, about 3 μm, about 2 μm, about 1 μm, about 0.9 μm, about 0.8 μm, about 0.7 μm, about 0.6 μm, about 0.5 μm, about 0.4 μm, about 0.3 μm, about 0.2 μm, about 0.1 μm, about 0.05 μm, or about 0.025 μm. The particles may also have a different size distribution.

Объем формулы изобретения не должен ограничиваться аспектами, ситуациями, реализациями, примерами или вариантами осуществления, изложенными в примерах и описании, но должен иметь самое широкое толкование, совместимое с описанием в целом.The scope of the claims should not be limited to the aspects, situations, implementations, examples or embodiments set forth in the examples and description, but should have the broadest interpretation consistent with the description as a whole.

Все патенты, опубликованные заявки на патенты и ссылки, которые упомянуты в настоящем документе, включены в настоящую заявку посредством ссылки. В случае несоответствий преимущественную силу имеет настоящее раскрытие.All patents, published patent applications, and references mentioned herein are incorporated by reference into this application. In case of inconsistency, the present disclosure controls.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Материалы и способы описаны в WO/2017/035667, если не указано иное.Materials and methods are described in WO/2017/035667 unless otherwise stated.

Пример 1:Example 1:

Карбоангидраза из Thermovibrio ammonificans демонстрирует заметное снижение растворимости в щелочном карбонатном буфере при повышенных температурахCarbonic anhydrase from Thermovibrio ammonificans exhibits a marked decrease in solubility in alkaline carbonate buffer at elevated temperatures

Растворимость ТАСА дикого типа оценивали путем измерения остаточной концентрации исходных растворов 6, 9 или 12 г/л wtTACA (SEQ ID NO: 1) в 1,45 M растворе K2СО3 альфа 0,7 после 24-часовой инкубации при 80°С, где альфа представляет собой молярное отношение углерода к калию. Измерения концентрации белка (г/л) проводили по способу Брэдфорда. Перед измерением образцы центрифугировали для удаления нерастворимых веществ. Интересно, что растворимость wtTACA упала всего до 1,0 г/л после 24-часовой инкубации при 80°С (см. Таблицу 1). Не будучи связанным теорией, резкое падение растворимости при 80°С могло быть вызвано повышенным воздействием на гидрофобные аминокислотные остатки wtTACA, вызванным более высокой температурой, что привело к агрегации белка.The solubility of wild-type TACA was assessed by measuring the residual concentration of stock solutions of 6, 9, or 12 g/L wtTACA (SEQ ID NO: 1) in 1.45 M K2CO3alpha0.7 after 24 h incubation at 80 °C, where alpha is the molar ratio of carbon to potassium. Protein concentration measurements (g/L) were performed according to the Bradford method. Samples were centrifuged to remove insoluble matter prior to measurement. Interestingly, the solubility of wtTACA dropped to only 1.0 g/L after 24 h incubation at 80 °C (see Table 1). Without being bound by theory, the sharp drop in solubility at 80 °C could be due to increased exposure of hydrophobic amino acid residues of wtTACA caused by the higher temperature, resulting in protein aggregation.

Теоретически белок имеет самую низкую растворимость в своей изоэлектрической точке (pI), которая представляет собой рН, при котором белок имеет нулевой чистый заряд. При определении путем использования онлайн-инструмента Compute pI/Mw на портале ресурсов ExPASy Bioinformatics (https://web.expasy.org), теоретическая pI wtTACA составляет 8,81 (см. Таблицу 1), что может быть не идеальным с точки зрения растворимости для щелочные условий, используемых в способах улавливания CO2.Случайный мутагенез и рациональные подходы к конструированию в комбинации с эмпирическим тестированием был использован для разработки и экспрессии вариантов ТАСА, сохраняющих активность карбоангидразы, но имеющих постепенно понижающиеся изоэлектрические точки.Theoretically, a protein has its lowest solubility at its isoelectric point (pI), which is the pH at which the protein has zero net charge. When determined using the Compute pI/Mw online tool on the ExPASy Bioinformatics Resource Portal (https://web.expasy.org), the theoretical pI of wtTACA is 8.81 (see Table 1), which may not be ideal in terms of solubility for the alkaline conditions used in CO2 capture assays. Random mutagenesis and rational design approaches in combination with empirical testing were used to develop and express TACA variants that retain carbonic anhydrase activity but have progressively lower isoelectric points.

Растворимость при 80°С нескольких вариантов ТАСА, имеющих постепенно пониажающиеся изоэлектрические точки, показана в Таблице 1.The solubility at 80°C of several TACA variants having gradually decreasing isoelectric points is shown in Table 1.

Таблица 1: Растворимость wtTACA и вариантов через 24 часа при 80°С в 1,45 М K2СО3 альфа 0,7Table 1: Solubility of wtTACA and variants after 24 hours at 80 °C in 1.45 M K2CO3alpha0.7

С целью обнаружения новых мутаций, которые увеличивают термостабильность без отрицательного воздействия на растворимость, были отобраны три варианта ТАСА (каждый из которых имеет различную pi, но все проявляют карбоангидразную активность) и использованы в качестве матриц для случайного мутагенеза, как описано в Примерах 2 и 3. Три матрицы, использованные для случайного мутагенеза, представляли собой SEQ ID NO: 2, 3 и 4 - см. Таблицу 1. SEQ ID NO: 5 представляет собой смесь трех матриц, а на Фиг. 1 показано множественное выравнивание последовательностей SEQ ID NO: 1-4.In order to discover new mutations that increase thermal stability without adversely affecting solubility, three TACA variants (each with a different pi but all exhibiting carbonic anhydrase activity) were selected and used as templates for random mutagenesis as described in Examples 2 and 3. The three templates used for random mutagenesis were SEQ ID NOs: 2, 3 and 4 - see Table 1. SEQ ID NO: 5 is a mixture of the three templates, and Fig. 1 shows a multiple sequence alignment of SEQ ID NOs: 1-4.

Пример 2:Example 2:

Скрининг мутагенеза на основе SEQ ID NO: 2Mutagenesis screening based on SEQ ID NO: 2

Крупномасштабный случайный мутагенез, нацеленный на остатки, которые, согласно прогнозам, подвергаются действию растворителя, в соответствии с атомистической структурой белка PDB ID NO 4С3Т, проводили, начиная с варианта ТАСА SEQ ID NO: 2, имеющего теоретическую изоэлектрическую точку 8,3. Мутировавшие ферменты были экспрессированы в Е. coli, очищены и охарактеризованы, как описано в WO/2017/035667, в отношении активности карбоангидразы и термостабильности. Статистика уэтой стадии мутагенеза представлена в Таблице 2.Large-scale random mutagenesis targeting residues predicted to be solvent-exposed according to the atomistic structure of protein PDB ID NO 4C3T was performed starting from the TACA variant of SEQ ID NO: 2 having a theoretical isoelectric point of 8.3. Mutated enzymes were expressed in E. coli, purified and characterized as described in WO/2017/035667 for carbonic anhydrase activity and thermal stability. The statistics for this mutagenesis step are presented in Table 2.

Растворимость вариантов ТАСА оценивали путем измерения остаточной концентрации фермента 5 г/л в 1,45 М растворе K2СО3 альфа 0,7 после 24-часовой инкубации при комнатной температуре (RT) или при 70°С, где альфа - молярное отношение углерода к калию. Результаты представлены в Таблице 3.The solubility of the TACA variants was assessed by measuring the residual enzyme concentration of 5 g/L in 1.45 M K2CO3alpha0.7 after 24 h incubation at room temperature (RT) or 70°C, where alpha is the molar ratio of carbon to potassium. The results are presented in Table 3.

Кроме того, чтобы упростить сравнение различных вариантов ТАСА с точки зрения их растворимости, каждому варианту был присвоен единый «показатель растворимости», который учитывает растворимость этого варианта при всех испытанных температурах (комнатная температура и 70°С) по сравнению с исходной матрицей, используемой в качестве исходной точки для мутагенеза этого варианта. В частности, показатель растворимости 1,0 присваивали, когда вариант демонстрировал значения растворимости, сравнимые с растворимостью фермента с его родительской матрицей. Показатель растворимости ниже 1,0 присваивали, когда вариант проявлял менее благоприятный профиль растворимости по сравнению с ферментом с его родительской матрицей, в то время как показатель растворимости более 1,0 присваивали, когда вариант проявлял более благоприятный профиль растворимости по сравнению с ферментом с его родительской матрицей. Максимальный показатель растворимости был установлен на уровне 1,5, при этом варианты, которым присвоен этот максимальный показатель, не показали осаждения/агрегации во время тестирования растворимости.Additionally, to facilitate comparison of different TACA variants in terms of their solubility, each variant was assigned a single “solubility score” that takes into account the solubility of that variant at all temperatures tested (room temperature and 70°C) compared to the parent template used as the starting point for the mutagenesis of that variant. Specifically, a solubility score of 1.0 was assigned when a variant exhibited solubility values comparable to the solubility of the enzyme with its parent template. A solubility score below 1.0 was assigned when a variant exhibited a less favorable solubility profile compared to the enzyme with its parent template, while a solubility score greater than 1.0 was assigned when a variant exhibited a more favorable solubility profile compared to the enzyme with its parent template. The maximum solubility score was set at 1.5, with variants assigned this maximum score showing no precipitation/aggregation during solubility testing.

Анализы стабильности выполняли путем измерения остаточной активности для каждого варианта после 3 дней воздействия в 1,45 М K2СО3 альфа 0,7 при 85°С и последующего сравнения с активностью соответствующего фермента с родительской матрицей. Результаты показаны в Таблице 3, где столбец, обозначенный «Показатель стабильности», указывает соотношение этих остаточных активностей к активности соответствующего фермента с родительской матрицей (SEQ ID NO: 2).Stability analyses were performed by measuring the residual activity for each variant after 3 days of exposure to 1.45 M K2CO3alpha0.7 at 85°C and then comparing it to the activity of the corresponding enzyme with the parent template. The results are shown in Table 3, where the column labeled “Stability Score” indicates the ratio of these residual activities to the activity of the corresponding enzyme with the parent template (SEQ ID NO: 2).

Поскольку и растворимость, и термостабильность являются важными факторами, влияющими на эффективную активность конкретного варианта для эффективного улавливания CO2 в течение нескольких термических циклов, для каждого варианта был присвоен общий показатель, который был получен путем умножения показателей растворимости и стабильности. Этот общий показатель позволил провести более значимое ранжирование различных вариантов операций по улавливанию CO2 по сравнению с ранжированием отдельных вариантов только с точки зрения растворимости или стабильности. Например, вариант, связанный с повышенной стабильностью, но вызывающий осаждение фермента при более высоких температурах, может быть менее привлекательным, чем вариант, который увеличивает растворимость, но существенно не влияет на стабильность. В Таблице 3 мутант «E156R», имеющий общий показатель 0,8, относится к wtTACA, поскольку аминокислотная замена просто возвращает матрицу фермента обратно к SEQ ID NO: 1.Since both solubility and thermal stability are important factors influencing the effective activity of a particular variant for efficient CO2 capture over multiple thermal cycles, each variant was assigned an overall score, which was obtained by multiplying the solubility and stability scores. This overall score allowed for a more meaningful ranking of the different variants for CO2 capture operations compared to ranking individual variants based on solubility or stability alone. For example, a variant associated with increased stability but causing enzyme precipitation at higher temperatures may be less attractive than a variant that increases solubility but does not significantly affect stability. In Table 3, the mutant “E156R”, which has an overall score of 0.8, is classified as wtTACA, since the amino acid substitution simply reverts the enzyme template back to SEQ ID NO: 1.

«Низкая продуктивность»: вариант фермента не экспрессировался в количествах, достаточных для характеризации; «н/о»: не определено."Low productivity": the enzyme variant was not expressed in quantities sufficient for characterization; "n/a": not determined.

Пример 3:Example 3:

Скрининг мутагенеза на основе SEQ ID NO: 3 и 4Mutagenesis Screening Based on SEQ ID NO: 3 and 4

ТАСА-вариант SEQ ID NO: 3, имеющий теоретическую изоэлектрическую точку 7,16, был сконструирован путем введения следующих 15 мутаций относительно wtTACA: K27R, N38D, K88R, K116R, N119D, K128R, R156E, E160D, D168E, E192D, E199D, K203R, K206R, V216T и L219I (см. Фиг. 1 и Таблицу 1). Параллельно с этим был сконструирован вариант ТАСА SEQ ID NO: 4, имеющий теоретическую изоэлектрическую точку 6,06, путем введения следующих 16 мутаций относительно wtTACA: Y77F, V79E, К88Е, Y105F, К116Е, К128Е, E137D, E145D, R156E, D168E, Y170F, E195D, E199D, V216T, L219I и K226R (см. Фиг. 1 и Таблицу 1).The TACA variant of SEQ ID NO: 3, which has a theoretical isoelectric point of 7.16, was constructed by introducing the following 15 mutations relative to wtTACA: K27R, N38D, K88R, K116R, N119D, K128R, R156E, E160D, D168E, E192D, E199D, K203R, K206R, V216T, and L219I (see Fig. 1 and Table 1). In parallel, a TACA variant of SEQ ID NO: 4 having a theoretical isoelectric point of 6.06 was constructed by introducing the following 16 mutations relative to wtTACA: Y77F, V79E, K88E, Y105F, K116E, K128E, E137D, E145D, R156E, D168E, Y170F, E195D, E199D, V216T, L219I, and K226R (see Fig. 1 and Table 1).

Мутировавшие ферменты были экспрессированы в Е. coli, очищены и охарактеризованы в отношении карбоангидразной активности, растворимости и термостабильности, как описано выше в Примерах 1 и 2. Примеры результатов тестирования стабильности для вариантов, полученных из SEQ ID NO: 3 и 4, показаны на Фиг. 2А и 2В соответственно.The mutated enzymes were expressed in E. coli, purified and characterized for carbonic anhydrase activity, solubility and thermal stability as described above in Examples 1 and 2. Examples of stability testing results for the variants derived from SEQ ID NOs: 3 and 4 are shown in Fig. 2A and 2B, respectively.

Кроме того, учитывая относительно более высокую исходную растворимость ферментов обеих матриц, используемых в качестве исходных точек в Примере 3, по сравнению с матрицей, использованной в Примере 2, для выявления замен аминокислот, связанных с дальнейшим повышением растворимости, использовали более строгие испытания растворимости путем титрования. Тестирование растворимости путем титрования проводили путем измерения мутности нескольких растворов, содержащих 2 г/л фермента. Растворы находились в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K2СО3 с изменением альфа от 0,60 до 0,89. Низкая мутность (близкая к нулю) указывает на растворимый фермент, а высокая мутность указывает на агрегацию ферментов. Примеры результатов тестирования растворимости титрованием показаны на Фиг. 3.Furthermore, given the relatively higher initial solubility of the enzymes of both matrices used as starting points in Example 3 compared to the matrix used in Example 2, more stringent solubility titration tests were used to identify amino acid substitutions associated with further increases in solubility. The solubility titration tests were performed by measuring the turbidity of several solutions containing 2 g/L of enzyme. The solutions ranged from 1.38 to 1.85 M K2CO3 with an alpha change from 0.60 to 0.89. Low turbidity (close to zero) indicates soluble enzyme, while high turbidity indicates enzyme aggregation. Examples of solubility titration test results are shown in Fig. 3.

Результаты охарактеризованных вариантов ТАСА, полученных из матриц SEQ ID NO: 3 и 4, показаны в Таблицах 4 и 5. Следует отметить, что «Показатели растворимости» в Таблицах 4 и 5 отличаются от показателей в Примере 2 тем, что показатели были модифицированы для включения данных обоих тестов на растворимость (тех, которые описаны в Примере 2, и дополнительного тестирования растворимости путем титрования, описанного выше). Что касается Таблицы 3, показатель растворимости 1,0 присваивали, когда вариант демонстрировал значения растворимости, сравнимые с растворимостью фермента с его родительской матрицей. Показатель растворимости ниже 1,0 присваивали, когда вариант проявлял менее благоприятный профиль растворимости по сравнению с ферментом с его родительской матрицей, в то время как показатель растворимости более 1,0 присваивали, когда вариант проявлял более благоприятный профиль растворимости по сравнению с ферментом с его родительской матрицей. Максимальный показатель растворимости был установлен на уровне 1,5, при этом варианты, которым присвоен этот максимальный показатель, не показали заметного осаждения/агрегации во время всех тестов растворимости.The results of the characterized TACA variants obtained from the matrices of SEQ ID NOs: 3 and 4 are shown in Tables 4 and 5. It should be noted that the “Solubility Scores” in Tables 4 and 5 differ from those in Example 2 in that the scores were modified to include data from both solubility tests (those described in Example 2 and the additional titration solubility testing described above). Referring to Table 3, a solubility score of 1.0 was assigned when a variant exhibited solubility values comparable to the solubility of the enzyme with its parent template. A solubility score below 1.0 was assigned when a variant exhibited a less favorable solubility profile compared to the enzyme with its parent template, while a solubility score greater than 1.0 was assigned when a variant exhibited a more favorable solubility profile compared to the enzyme with its parent template. The maximum solubility index was set at 1.5, with variants assigned this maximum index showing no significant precipitation/aggregation during all solubility tests.

Более того, характеризация вариантов ТАСА в Таблицах 4 и 5 позволила идентифицировать отдельные замены аминокислот, оказывающие положительное влияние на стабильность и/или растворимость фермента. Чтобы считаться имеющей положительный эффект («АК с положительным эффектом на растворимость» или «АК с положительным эффектом на стабильность»), показатель варианта, несущего мутацию, должен быть как минимум на 10% выше, чем у варианта без этой мутации. Например, мутант «SEQ ID NO: 4+N38D+E128K+D137E» имеет показатель стабильности 3,26, тогда как мутант «SEQ ID NO: 4+N38D+E128K+D137E+T154D» имеет показатель стабильности 4,89. Разница между этими двумя мутантами составляет T154D, что увеличивает показатель на 50%. Таким образом, T154D является мутацией, положительно влияющей на стабильность.Furthermore, characterization of the TACA variants in Tables 4 and 5 allowed us to identify individual amino acid substitutions that have a positive effect on the stability and/or solubility of the enzyme. To be considered as having a positive effect (“positive solubility effect AAs” or “positive stability effect AAs”), the score of the variant carrying the mutation must be at least 10% higher than that of the variant without the mutation. For example, the mutant “SEQ ID NO: 4+N38D+E128K+D137E” has a stability score of 3.26, while the mutant “SEQ ID NO: 4+N38D+E128K+D137E+T154D” has a stability score of 4.89. The difference between these two mutants is T154D, which increases the score by 50%. Thus, T154D is a mutation that has a positive effect on stability.

Наконец, каждому варианту присваивали общий показатель путем умножения показателей растворимости и стабильности. Общий показатель выше 1,0 указывает на положительное влияние мутаций аминокислот на растворимость и/или стабильность ферментов.Finally, each variant was assigned a total score by multiplying the solubility and stability scores. A total score greater than 1.0 indicates a positive effect of amino acid mutations on enzyme solubility and/or stability.

Пример 4:Example 4:

Комбинации нескольких полезных мутаций приводят к вариантам, которые превосходят wtTACA с точки зрения стабильности и растворимостиCombinations of several beneficial mutations result in variants that are superior to wtTACA in terms of stability and solubility

В целом было обнаружено, что отдельные мутации, имеющие положительный эффект с точки зрения растворимости и/или термостабильности в одной матрице, также имели такой же положительный эффект, когда те же мутации были введены в другую матрицу. Кроме того, было обнаружено, что комбинирование нескольких мутаций, оказывающих положительное влияние на растворимость и/или стабильность, позволило получить рекомбинантные ферменты, имеющие более высокую термостабильность и/или улучшенную растворимость, чем wtTACA, в щелочных карбонатных растворах для улавливания CO2 - см. Фиг. 4 и 5 и SEQ ID NO: 6 и 7 в Таблице 1.Overall, it was found that individual mutations that had a positive effect in terms of solubility and/or thermal stability in one matrix also had the same positive effect when the same mutations were introduced into another matrix. Furthermore, it was found that combining multiple mutations that had a positive effect on solubility and/or stability resulted in recombinant enzymes that had higher thermal stability and/or improved solubility than wtTACA in alkaline carbonate solutions for CO2 capture - see Figs. 4 and 5 and SEQ ID NOs: 6 and 7 in Table 1.

Было обнаружено, что некоторые полезные варианты улучшают как термостабильность, так и растворимость, в то время как другие полезные варианты улучшают либо термостабильность, либо растворимость. Варианты, связанные с улучшенной термостабильностью, обеспечивают явное преимущество для способов улавливания CO2, например, за счет уменьшения количества фермента, необходимого с течением времени для поддержания заданной эффективности улавливания CO2. Интересно, что варианты, связанные с улучшенной растворимостью, обеспечивают аналогичное преимущество способов улавливания CO2. Более конкретно, улучшение растворимости фермента может снижать эффективную концентрацию этого фермента, необходимую для достижения заданной эффективности улавливания CO2, по сравнению с ферментом, имеющим такую же термостабильность, хотя и с более низкой растворимостью. Не будучи связанным теорией, предполагается, что повышение растворимости может уменьшить образование растворимых агрегатов ферментов, которые ослаблены или неактивны с точки зрения активности карбоангидразы. Несмотря на это, преимущество введения вариантов, которые улучшают растворимость, может снизить количество фермента, необходимое с течением времени для поддержания заданной эффективности улавливания CO2.Some useful variants were found to improve both thermal stability and solubility, while other useful variants improved either thermal stability or solubility. Variants associated with improved thermal stability provide a clear advantage for CO2 capture processes, for example by reducing the amount of enzyme required over time to maintain a given CO2 capture efficiency. Interestingly, variants associated with improved solubility provide a similar advantage for CO2 capture processes. More specifically, improving the solubility of an enzyme may reduce the effective concentration of that enzyme required to achieve a given CO2 capture efficiency, compared to an enzyme having the same thermal stability, albeit with lower solubility. Without being bound by theory, it is speculated that increasing solubility may reduce the formation of soluble enzyme aggregates that are weakened or inactive in terms of carbonic anhydrase activity. Despite this, the benefit of introducing variants that improve solubility may reduce the amount of enzyme required over time to maintain a given CO2 capture efficiency.

Claims (47)

1. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы, обладающий карбоангидразной активностью, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности с SEQ ID NO: 4, и где указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы содержит по меньшей мере один остаток(и), выбранный из группы: 3E; 6R; 9A или 9N; 11L, 11P или 11Y; 15L; 17Y;18I, 18L, 18R или 18S; 20K или 20L; 24I, 24M или 24V; 25F; 27R; 38D, 38R или 38T; 39H, 39I, 39L, 39R или 39W; 48L, 48Q или 48T; 51D, 51E, 51F, 51M или 51P; 64T; 73E или 73L; 79L или 79W; 88I, 88L, 88R, 88T или 88V; 116R; 119D или 119M; 128K, 128R или 128T; 130A, 130D, 130E, 130F, 130H, 130K, 130Q, 130R, 130S, 130T, 130V, 130W или 130Y; 137E; 138E или 138L; 145E; 148F, 148V или 148W; 149I; 154D, 154K, 154P или 154V; 156V; 158Y; 160D или 160Q; 166E или 166V; 167L; 168F, 168R или 168W; 192D; 195E; 199A, 199K; 203R или 203V; 206R; 210H; 223I, 223L, или 223V, или любую их комбинацию, причем рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость и/или термостабильность по сравнению с соответствующим исходным полипептидом карбоангидразы, не содержащим одно или более аминокислотных различий.1. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide having carbonic anhydrase activity, comprising an amino acid sequence having at least 70% identity to SEQ ID NO: 4, and wherein said recombinant carbonic anhydrase polypeptide comprises at least one residue(s) selected from the group: 3E; 6R; 9A or 9N; 11L, 11P or 11Y; 15L; 17Y; 18I, 18L, 18R or 18S; 20K or 20L; 24I, 24M or 24V; 25F; 27R; 38D, 38R or 38T; 39H, 39I, 39L, 39R or 39W; 48L, 48Q or 48T; 51D, 51E, 51F, 51M or 51P; 64T; 73E or 73L; 79L or 79W; 88I, 88L, 88R, 88T or 88V; 116R; 119D or 119M; 128K, 128R or 128T; 130A, 130D, 130E, 130F, 130H, 130K, 130Q, 130R, 130S, 130T, 130V, 130W or 130Y; 137E; 138E or 138L; 145E; 148F, 148V or 148W; 149I; 154D, 154K, 154P, or 154V; 156V; 158Y; 160D or 160Q; 166E or 166V; 167L; 168F, 168R, or 168W; 192D; 195E; 199A, 199K; 203R or 203V; 206R; 210H; 223I, 223L, or 223V, or any combination thereof, wherein the recombinant carbonic anhydrase polypeptide has increased solubility and/or thermal stability compared to the corresponding parent carbonic anhydrase polypeptide lacking one or more amino acid differences. 2. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по п.1, имеющий изоэлектрическую точку (pI) ниже, чем у SEQ ID NO: 2 или 3.2. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to claim 1, having an isoelectric point (pI) lower than that of SEQ ID NO: 2 or 3. 3. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по п.1, имеющий pI ниже 8,3, 8,2, 8,1, 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6 или 4,5.3. The recombinant carbonic anhydrase polypeptide of claim 1, having a pI below 8.3, 8.2, 8.1, 8.0, 7.9, 7.8, 7.7, 7.6, 7.5, 7.4, 7.3, 7.2, 7.1, 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6 or 4.5. 4. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по п.1, имеющий pI от 4 до 8, от 4,5 до 7,5, от 5 до 7, от 5,5 до 6,5 или от 5 до 6.4. The recombinant carbonic anhydrase polypeptide of claim 1, having a pI of 4 to 8, 4.5 to 7.5, 5 to 7, 5.5 to 6.5, or 5 to 6. 5. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-4, включающий по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать остатков по п.1.5. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 4, comprising at least two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen or twenty residues according to claim 1. 6. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-4, содержащий 3E; 11P; 18S; 24I; 38D; 39H, 39R, 39L, или 39I; 88I; 130S или 130D; 154D или 154P; 223L или 223I; 130S и 154D; 130A и 154D; 130D и 154D; 130A, 154P и 195E; 15L, 38D и 128K; 195E и 223I; 25F, 38D и 128K; 38D и 128K; 38D, 128K и 137E; 38D, 128K, 137E, и 154D; 38D, 128K, 137E, и 154P; 38D, 128K и 145E; 38D, 128K и 148W; 38D, 128K и 160Q; 38D, 128K и 167L; 38D, 128K и 195E; 38D, 128K, и 199A; 38D, 88I и 128K; 39I, 128K, 154D и 223I; 39I, 130A, 154P, 195E и 223I; 39I, 130A, 154P, 195E, и 223L; 39I, 130A, 154D и 223L; 39I, 130A, 154D и 223I; 39I и 195E; 39I и 223I; 39L и 223L; 39L и 223I; или 39I и 223L.6. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 4, comprising 3E; 11P; 18S; 24I; 38D; 39H, 39R, 39L, or 39I; 88I; 130S or 130D; 154D or 154P; 223L or 223I; 130S and 154D; 130A and 154D; 130D and 154D; 130A, 154P and 195E; 15L, 38D and 128K; 195E and 223I; 25F, 38D and 128K; 38D and 128K; 38D, 128K and 137E; 38D, 128K, 137E, and 154D; 38D, 128K, 137E, and 154P; 38D, 128K and 145E; 38D, 128K and 148W; 38D, 128K and 160Q; 38D, 128K and 167L; 38D, 128K and 195E; 38D, 128K, and 199A; 38D, 88I and 128K; 39I, 128K, 154D and 223I; 39I, 130A, 154P, 195E and 223I; 39I, 130A, 154P, 195E, and 223L; 39I, 130A, 154D and 223L; 39I, 130A, 154D and 223I; 39I and 195E; 39I and 223I; 39L and 223L; 39L and 223I; or 39I and 223L. 7. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость и/или повышенную термостабильность по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K2CO3 с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.7. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said recombinant carbonic anhydrase polypeptide has increased solubility and/or increased thermal stability compared to said corresponding carbonic anhydrase polypeptide in an alkaline carbonate solution, such as a solution in the range of 1.38 to 1.85 M K2CO3 with alpha varying from 0.60 to 0.89. 8. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы через 24 часа воздействия при 22°С или 70°C в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K2CO3 с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.8. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said recombinant carbonic anhydrase polypeptide has an increased solubility compared to said corresponding carbonic anhydrase polypeptide after 24 hours of exposure at 22°C or 70°C in an alkaline carbonate solution, such as a solution in the range of 1.38 to 1.85 M K2CO3 with alpha varying from 0.60 to 0.89. 9. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы через 24 часа воздействия при 80°C в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K2CO3 с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.9. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said recombinant carbonic anhydrase polypeptide has an increased solubility compared to said corresponding carbonic anhydrase polypeptide after 24 hours of exposure at 80°C in an alkaline carbonate solution, such as a solution in the range of 1.38 to 1.85 M K2CO3 with an alpha ranging from 0.60 to 0.89. 10. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы, как определено испытанием растворимости путем титрования, включающим измерение мутности 2 г/л указанного рекомбинантного пептида карбоангидразы в растворах от 1,38 до 1,85 М K2CO3 с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.10. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 9, characterized in that said recombinant carbonic anhydrase polypeptide has an increased solubility compared to said corresponding carbonic anhydrase polypeptide, as determined by a solubility titration test involving measuring the turbidity of 2 g/L of said recombinant carbonic anhydrase peptide in solutions of 1.38 to 1.85 M K2CO3 with alpha varying from 0.60 to 0.89. 11. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-10, имеющий растворимость более 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9 или 12 г/л через 24 часа при 80°C в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор с концентрацией от 1,38 до 1,85 М K2CO3 с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.11. The recombinant carbonic anhydrase polypeptide of any one of claims 1 to 10, having a solubility of more than 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9 or 12 g /L after 24 hours at 80°C in an alkaline carbonate solution such as a solution of 1.38 to 1.85 M K2CO3 with an alpha ranging from 0.60 to 0.89. 12. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную термостабильность по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы после 72-часового воздействия при 85°C в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор от 1,38 до 1,85 М K2CO3 с изменением альфа от 0,60 до 0,89, или после 16-часового воздействия при 95° в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор с концентрацией от 1,38 до 1,85 М K2CO3 с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.12. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 11, characterized in that said recombinant carbonic anhydrase polypeptide has an increased thermal stability compared to said corresponding carbonic anhydrase polypeptide after 72 hours exposure at 85°C in an alkaline carbonate solution, such as a solution of 1.38 to 1.85 M K2CO3 , with an alpha change of 0.60 to 0.89, or after 16 hours exposure at 95° in an alkaline carbonate solution, such as a solution with a concentration of 1.38 to 1.85 M K2CO3 , with an alpha changing from 0.60 to 0.89. 13. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-12, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере-71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности SEQ ID NO: 4.13. A recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 12, comprising an amino acid sequence having at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity to SEQ ID NO: 4. 14. Изолированный полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-13.14. An isolated polynucleotide encoding a recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 13. 15. Генетическая конструкция, кодирующая рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-13, состоящая из изолированного полинуклеотида по п.14, функционально связанного с гетерологичным промотором.15. A genetic construct encoding a recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 13, consisting of an isolated polynucleotide according to claim 14, operably linked to a heterologous promoter. 16. Вектор экспрессии, включающий изолированный полинуклеотид по п.14.16. An expression vector comprising an isolated polynucleotide according to claim 14. 17. Вектор клонирования, включающий изолированный полинуклеотид по п.14.17. A cloning vector comprising an isolated polynucleotide according to claim 14. 18. Клетка-хозяин для получения рекомбинантного полипептида карбоангидразы по любому из пп.1-13, содержащая изолированный полинуклеотид по п.15, или вектор экспрессии по п.16.18. A host cell for producing a recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1-13, containing an isolated polynucleotide according to claim 15, or an expression vector according to claim 16. 19. Клетка-хозяин по п.18, которая представляет собой бактериальную клетку, дрожжевую клетку или клетку гриба.19. The host cell according to claim 18, which is a bacterial cell, a yeast cell or a fungal cell. 20. Способ получения рекомбинантного полипептида карбоангидразы, включающий культивирование клетки-хозяина по п.18 или 19, в условиях, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного полипептида карбоангидразы по любому из пп.1-13, и выделение рекомбинантного полипептида карбоангидраз .20. A method for producing a recombinant carbonic anhydrase polypeptide, comprising culturing a host cell according to claim 18 or 19, under conditions that ensure expression of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1-13, and isolating the recombinant carbonic anhydrase polypeptide. 21. Применение рекомбинантного полипептида карбоангидразы по любому из пп. 1-13 в промышленном способе улавливания СО2 из СО2-содержащих сточных вод или газа.21. Use of a recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1-13 in an industrial method for capturing CO2 from CO2 -containing wastewater or gas. 22. Способ абсорбции СО2 из СО2-содержащих сточных вод или газа, включающий: приведение СО2-содержащих сточных вод или газа в контакт с водным абсорбирующим раствором для растворения СО2 в водном абсорбирующем растворе; и обеспечение рекомбинантного полипептида карбоангидразы по любому из пп.1-13 для осуществления катализа реакции гидратации растворенного CO2 в ионы бикарбоната и водорода или обратной реакции.22. A method for absorbing CO2 from CO2 -containing wastewater or gas, comprising: contacting the CO2 -containing wastewater or gas with an aqueous absorbent solution to dissolve the CO2 in the aqueous absorbent solution; and providing a recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 13 to catalyze the reaction of hydration of dissolved CO2 into bicarbonate and hydrogen ions or the reverse reaction. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанный способ включает воздействие на рекомбинантный полипептид карбоангидразы водным абсорбционным раствором, температурой и/или условиями pH, которые усиливают их улучшенную растворимость и/или термостабильность, что приводит к снижению скорости потребления или истощения рекомбинантного полипептида карбоангидразы по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2.23. The method according to claim 22, characterized in that said method comprises exposing the recombinant carbonic anhydrase polypeptide to an aqueous absorption solution, temperature and/or pH conditions that enhance their improved solubility and/or thermal stability, which results in a decrease in the rate of consumption or depletion of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide compared to a corresponding method carried out with the carbonic anhydrase polypeptide of SEQ ID NO: 1 or 2. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что снижение скорости потребления рекомбинантного полипептида карбоангидразы является результатом: (i) снижения эффективной концентрации рекомбинантного полипептида карбоангидразы, необходимой для достижения целевого уровня улавливания CO2, по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2; (ii) снижения скорости потери активного рекомбинантного полипептида карбоангидразы вследствие агрегации и/или термической нестабильности по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2; или обоих (i) и (ii).24. The method of claim 23, wherein the reduction in the rate of consumption of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide is a result of: (i) a reduction in the effective concentration of the recombinant carbonic anhydrase polypeptide required to achieve the target level of CO2 capture, compared to a corresponding method carried out with the carbonic anhydrase polypeptide of SEQ ID NO: 1 or 2; (ii) a reduction in the rate of loss of active recombinant carbonic anhydrase polypeptide due to aggregation and/or thermal instability, compared to a corresponding method carried out with the carbonic anhydrase polypeptide of SEQ ID NO: 1 or 2; or both (i) and (ii). 25. Способ по любому из пп.22-24, согласно которому абсорбирующий раствор включает по меньшей мере одно абсорбирующее соединение, включающее:25. The method according to any one of claims 22 to 24, wherein the absorbent solution comprises at least one absorbent compound comprising: (а) первичный амин, вторичный амин, третичный амин, первичный алканоламин, вторичный алканоламин, третичный алканоламин, первичную аминокислоту, вторичную аминокислоту, третичную аминокислоту, диалкиловый эфир полиалкиленгликолей, диалкиловый эфир или диметиловый эфир полиэтиленгликоля, аминокислоту или ее производное, моноэтаноламин (MEА), 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP), 2-(2-аминоэтиламино)этанол (AEE), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (Tris или AHPD), N-метилдиэтаноламин (MDEA), диметилмоноэтаноламин (DMMEA), диэтилмоноэтаноламин (DEMEA ), триизопропаноламин (TIPА), триэтаноламин (TEА), диэтаноламин (DEA), диизопропиламин (DIPA), метилмоноэтаноламин (MMEA), трет-бутиламиноэтоксиэтанол (TBEE), N-2-гидроксиэтилпиперазин (HEP), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (AHPD), стерически затрудненный диамин (HDA), бис-(трет-бутиламиноэтокси)-этан (BTEE), этоксиэтоксиэтанол-третбутиламин (EEETB), бис-(трет-бутиламиноэтил)эфир, 1,2-бис(трет-бутиламиноэтокси)этан и/или бис-(2-изопропиламинопропил)эфир или их комбинацию;(a) primary amine, secondary amine, tertiary amine, primary alkanolamine, secondary alkanolamine, tertiary alkanolamine, primary amino acid, secondary amino acid, tertiary amino acid, dialkyl ether of polyalkylene glycols, dialkyl ether or dimethyl ether of polyethylene glycol, amino acid or derivative thereof, monoethanolamine (MEA), 2-amino-2-methyl-1-propanol (AMP), 2-(2-aminoethylamino)ethanol (AEE), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (Tris or AHPD), N-methyldiethanolamine (MDEA), dimethylmonoethanolamine (DMMEA), diethylmonoethanolamine (DEMEA), triisopropanolamine (TIPA), triethanolamine (TEA), diethanolamine (DEA), diisopropylamine (DIPA), methylmonoethanolamine (MMEA), tert-butylaminoethoxyethanol (TBEE), N-2-hydroxyethylpiperazine (HEP), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (AHPD), hindered diamine (HDA), bis-(tert-butylaminoethoxy)-ethane (BTEE), ethoxyethoxyethanol-tert-butylamine (EEETB), bis-(tert-butylaminoethyl)ether, 1,2-bis(tert-butylaminoethoxy)ethane and/or bis-(2-isopropylaminopropyl)ether, or a combination thereof; (b) первичный амин, вторичный амин, третичный амин, первичный алканоламин, вторичный алканоламин, третичный алканоламин, первичную аминокислоту, вторичную аминокислоту, третичную аминокислоту; или их комбинацию;(b) a primary amine, a secondary amine, a tertiary amine, a primary alkanolamine, a secondary alkanolamine, a tertiary alkanolamine, a primary amino acid, a secondary amino acid, a tertiary amino acid; or a combination thereof; (c) диалкиловый эфир полиалкиленгликолей, диалкиловый эфир или диметиловый эфир полиэтиленгликоля, аминокислоту или ее производное, или их комбинацию;(c) a dialkyl ether of polyalkylene glycols, a dialkyl ether or dimethyl ether of polyethylene glycol, an amino acid or a derivative thereof, or a combination thereof; (d) пиперазин или его производное, предпочтительно замещенное по меньшей мере одной из алканольных групп;(d) piperazine or a derivative thereof, preferably substituted with at least one alkanol group; (e) моноэтаноламин (MEA), 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP), 2-(2-аминоэтиламино)этанол (AEE), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (Tris или AHPD), N-метилдиэтаноламин (MDEA), диметилмоноэтаноламин (DMMEA), диэтилмоноэтаноламин (DEMEA ), триизопропаноламин (TIPA), триэтаноламин (TEA), диэтаноламин (DEA), диизопропиламин (DIPA), метилмоноэтаноламин (MMEA), трет-бутиламиноэтоксиэтанол (TBEE), N-2-гидроксиэтилпиперазин (HEP), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (AHPD), стерически затрудненный диамин (HDА), бис-(трет-бутиламиноэтокси)-этан (BTEE), этоксиэтоксиэтанол-трет-бутиламин (EEETB), бис-(трет-бутиламиноэтил)эфир, 1,2-бис-(трет-бутиламиноэтокси)этан и/или бис-(2-изопропиламинопропил)эфир;(e) monoethanolamine (MEA), 2-amino-2-methyl-1-propanol (AMP), 2-(2-aminoethylamino)ethanol (AEE), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (Tris or AHPD), N-methyldiethanolamine (MDEA), dimethylmonoethanolamine (DMMEA), diethylmonoethanolamine (DEMEA), triisopropanolamine (TIPA), triethanolamine (TEA), diethanolamine (DEA), diisopropylamine (DIPA), methylmonoethanolamine (MMEA), tert-butylaminoethoxyethanol (TBEE), N-2-hydroxyethylpiperazine (HEP), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (AHPD), hindered diamine (HDA), bis-(tert-butylaminoethoxy)-ethane (BTEE), ethoxyethoxyethanol-tert-butylamine (EEETB), bis-(tert-butylaminoethyl)ether, 1,2-bis-(tert-butylaminoethoxy)ethane and/or bis-(2-isopropylaminopropyl)ether; (f) аминокислоту или ее производное, которая предпочтительно представляет собой глицин, пролин, аргинин, гистидин, лизин, аспарагинову кислоту, глутаминовую кислоту, метионин, серин, треонин, глутамин, цистеин, аспарагин, валин, лейцин, изолейцин, аланин, тирозин, триптофан, фенилаланин, таурин, N-циклогексил 1,3-пропандиамин, -вторичный бутилглицин, -метил -вторичный бутилглицин, диэтилглицин, диметилглицин, саркозин, метилтаурин, метил-а-аминопропионовую кислоту, N-β(этокси)таурин, N-(β-аминоэтил)таурин, N-метилаланин, 6-аминогексановую кислоту, калиевую или натриевую соль аминокислоты или любую их комбинацию;(f) an amino acid or a derivative thereof, which is preferably glycine, proline, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, methionine, serine, threonine, glutamine, cysteine, asparagine, valine, leucine, isoleucine, alanine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine, taurine, N-cyclohexyl 1,3-propanediamine, α-secondary butylglycine, α-methyl secondary butylglycine, diethylglycine, dimethylglycine, sarcosine, methyltaurine, methyl-a-aminopropionic acid, N-β(ethoxy)taurine, N-(β-aminoethyl)taurine, N-methylalanine, 6-aminohexanoic acid, a potassium or sodium salt of an amino acid, or any combination thereof; (g) карбонатное соединение;(g) carbonate compound; (h) карбонат натрия, карбонат калия или MDEA;(h) sodium carbonate, potassium carbonate or MDEA; (i) карбонат натрия; или(i) sodium carbonate; or (j) карбонат калия.(j) potassium carbonate. 26. Способ по любому из пп.22-24, отличающийся тем, что абсорбирующий раствор включает абсорбирующее соединение, которое представляет собой карбонатное соединение в концентрации от примерно 0,1 до 3 М, от 0,5 до 2 М, от 1 до 2 М или от 1,25 до 1,75 М.26. The method according to any one of claims 22 to 24, characterized in that the absorbent solution comprises an absorbent compound, which is a carbonate compound in a concentration of from about 0.1 to 3 M, from 0.5 to 2 M, from 1 to 2 M, or from 1.25 to 1.75 M. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что карбонатное соединение представляет собой карбонат натрия или карбонат калия.27. The method according to claim 26, characterized in that the carbonate compound is sodium carbonate or potassium carbonate. 28. Способ по любому из пп.22-27, включающий воздействие на указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы температурой 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99°C в какой-то момент во время указанного способа.28. The method according to any one of claims 22 to 27, comprising exposing said recombinant carbonic anhydrase polypeptide to a temperature of 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99°C at some point during said method. 29. Способ по любому из пп.22-28, отличающийся тем, что указанные СО2-содержащие сточные вод или газ:29. The method according to any of paragraphs 22-28, characterized in that the said CO2 -containing wastewater or gas: (a) содержат от примерно 0,04% об. до примерно 80% об. СО2; (a) contain from about 0.04% by volume to about 80% by volume CO2 ; (b) содержат N2, O2, благородные газы, VOCs, H2O, CO, SOx, соединения NOx, NH3, меркаптаны, H2S, H2, тяжелые металлы, пыль, золу или любую их комбинацию; (b) contain N2 , O2 , noble gases, VOCs, H2O , CO, SOx, NOx compounds, NH3 , mercaptans, H2S , H2 , heavy metals, dust, ash or any combination thereof; (c) получены в результате сжигания природного газа, сжигания угля, сжигания биогаза, повышения качества биогаза или очистки природного газа; или(c) obtained from the combustion of natural gas, the combustion of coal, the combustion of biogas, the upgrading of biogas or the purification of natural gas; or (d) любая комбинация пунктов (a) - (c).(d) any combination of (a) to (c). 30. Способ по любому из пп.22-29, включающий воздействие на указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы pH от 8 до 11, от 8,5 до 11, от 9 до 10,5 или от 9 до 10 в какой-то момент во время указанного способа.30. The method of any one of claims 22 to 29, comprising exposing said recombinant carbonic anhydrase polypeptide to a pH of 8 to 11, 8.5 to 11, 9 to 10.5, or 9 to 10 at some point during said method. 31. Способ по любому из пп.22-30, отличающийся тем, что концентрация полипептида карбоангидразы в абсорбирующем растворе составляет примерно от 0,01 до 50 г/л, от 0,05 до 10 г/л или от 0,1 до 4 г/л.31. The method according to any one of claims 22 to 30, characterized in that the concentration of the carbonic anhydrase polypeptide in the absorbent solution is approximately from 0.01 to 50 g/l, from 0.05 to 10 g/l, or from 0.1 to 4 g/l. 32. Исходный раствор для абсорбции СО2 из СО2-содержащих сточных вод или газа, включающий рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-13 в концентрации по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 г/л.32. A feed solution for absorbing CO2 from CO2 -containing wastewater or gas, comprising a recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 13 at a concentration of at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 g/l. 33. Питательный раствор для абсорбции СО2 из СО2-содержащих сточных вод или газа, включающий рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-13 в концентрации по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 г/л.33. A nutrient solution for absorbing CO2 from CO2 -containing wastewater or gas, comprising a recombinant carbonic anhydrase polypeptide according to any one of claims 1 to 13 at a concentration of at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 g/l.
RU2021128081A 2019-03-26 2020-03-17 Versions of carbonic anhydrase for improving co2 trapping RU2846467C2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/823,744 2019-03-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2021128081A RU2021128081A (en) 2023-03-24
RU2846467C2 true RU2846467C2 (en) 2025-09-05

Family

ID=

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012025577A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 Novozymes A/S Heat-stable persephonella carbonic anhydrases and their use
US8329459B2 (en) * 2001-07-13 2012-12-11 Co2 Solutions Inc. Carbonic anhydrase system and process for CO2 containing gas effluent treatment
RU2472572C2 (en) * 2007-04-17 2013-01-20 ГЛОБАЛ РИСЕРЧ ТЕКНОЛОДЖИЗ, ЭлЭлСи Trapping carbon dioxide (co2) from air
CN104328104A (en) * 2014-10-10 2015-02-04 上海立足生物科技有限公司 Thermal-stability carbonic anhydrase, and preparation method and application thereof
WO2017035667A1 (en) * 2015-09-03 2017-03-09 Co2 Solutions Inc. Variants of thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase and co2 capture methods using thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase variants

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8329459B2 (en) * 2001-07-13 2012-12-11 Co2 Solutions Inc. Carbonic anhydrase system and process for CO2 containing gas effluent treatment
RU2472572C2 (en) * 2007-04-17 2013-01-20 ГЛОБАЛ РИСЕРЧ ТЕКНОЛОДЖИЗ, ЭлЭлСи Trapping carbon dioxide (co2) from air
WO2012025577A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 Novozymes A/S Heat-stable persephonella carbonic anhydrases and their use
CN104328104A (en) * 2014-10-10 2015-02-04 上海立足生物科技有限公司 Thermal-stability carbonic anhydrase, and preparation method and application thereof
WO2017035667A1 (en) * 2015-09-03 2017-03-09 Co2 Solutions Inc. Variants of thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase and co2 capture methods using thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase variants

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2890582C (en) Co2 capture methods using thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase
US20130203155A1 (en) Enzyme enhanced co2 capture and desorption processes
CN102574053A (en) Formulation and process for co2 capture using carbonates and biocatalysts
US20220186202A1 (en) Carbonic anhydrase variants for improved co2 capture
CA2803959C (en) Chemically modified carbonic anhydrases useful in carbon capture systems
US20140106440A1 (en) Enhanced enzymatic co2 capture techniques according to solution pka, temperature and/or enzyme character
Leimbrink et al. Different strategies for accelerated CO2 absorption in packed columns by application of the biocatalyst carbonic anhydrase
Dilmore et al. Carbonic anhydrase-facilitated CO2 absorption with polyacrylamide buffering bead capture
US10415028B2 (en) Variants of thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase and CO2 capture methods using thermovibrio ammonificans carbonic anhydrase variants
RU2846467C2 (en) Versions of carbonic anhydrase for improving co2 trapping
US8512989B2 (en) Highly stable beta-class carbonic anhydrases useful in carbon capture systems
RU2021128081A (en) CARBOANHYDRASE OPTIONS FOR IMPROVED CO2 CAPTURE
Alvizo et al. Highly stable beta-class carbonic anhydrases useful in carbon capture systems
Gray et al. Performance of Solid Amine Sorbents