SE458968B - Biospecifikt analysfoerfarande foer flera analyter i vilket ingaar partikelraekning och maerkning med fluorescerande maerksubstanser - Google Patents

Description

458 968 l0 15 20 25 30 35 2 som representerar olika analyter, medan markörerna med lång avklingningstid används för att bestämma koncentrationen av den enskilda analyten på mikrosfären med hjälp av en biospecifik reaktion.

Identiskt stora mikrosfärer kan framställas av lämpligt polymermaterial med viss hydrofil beskaffenhet och lämpar sig därför bra för vattensuspensioner. Mikrosfärernas yt- egenskaper tillåter också bindning av makromolekyler genom fysisk adsorption såväl som genom kovalent bindning genom aktivering av OH-grupper på ytan (L. Johansen & al, Journal of Immunological Methods, 59 (1983) pp 255-264). Enligt föreliggande uppfinning inkuberas först provet, som inkluderar alla olika analyter, med en blandning av mikrosfärer och med en blandning av märkta reaktanter i minsta möjliga volym (exempelvis 10-100/ul) för ernående av en fullständig reaktion på kort tid. På grund av det mycket lilla genom- isnittsavstândet mellan analytmolekylerna och de märkta reak- tanterna i mikrosfärssuspensionen uppnås snabbt balans i den biospecifika reaktionen under inkuberingen och som resul- tat bildas konjugat bestående av den märkta reaktanten, analyten och den immobiliserade reaktanten på mikrosfärytan, vanligen kallade "sandwich“ i litteraturen. Efter inkube- ringen spädes suspensionen pâ lämpligt sätt för fluoro- metrisk analys av de individuella mikrosfärerna. Ett till- räckligt antal mikrosfärer analyseras och.Eluorescenssig- nalerna från varje mikrosfär registreras i en dator.

Enligt föreliggande uppfinning erhålles hög detektions- känslighet för de fluorescenta markörerna i kombination med de biospecifika reaktanterna på mikropartikelytan till följd av användningen av fluorescensmarkörer med lâng avkling- ningstid, t ex lantanidkelat av europium, terbium etc som beskrives mer i detalj exempelvis i europeiska patent- ansökan nr 86850l72.7 (publiceringsnrfl ÄB Ûfh. Detektions- känsligheten förbättras genom minskning av bakgrundsfluo- rescensen genom tidsupplösning mellan excitering och emission, 10 15 20 25 30 35 3 458 968 något som vanligtvis kallas tidsupplöst fluorescensdetek- tering i litteraturen. En omfattande genomgång av den senaste utvecklingen och evolutionen av tidsupplöst fluoro- metri med fluorescensmarkörer med lång avklingningstid har gjorts av Soini och Lövgren och inlämnats 1986 för publicering av CRC Press, Inc., FL, USA. En anordning för tiåsupplöst fluorescensdetektering innefattar normalt en pulsstyrd ljuskälla och en grindstyrd detektor som aktiveras med en viss fördröjning efter exciteringspulsen. Sålunda registrerar inte detektorn vare sig fluorescensen med kort avklingningstid eller spridningen eftersom dess livstid är mycket kortare än tidsfördröjningen.

Detektorn detekterar endast den långsamt avklingande emissionen som är specifik för fluorescensmarkören med läng avklingningstid i provet.

Enligt uppfinningen kombineras egenskaperna enligt ovan i syfte att identifiera varje enskild mikropartikel som representerar olika analytkategorier för utförande av en multianalytanalys i samma prov. Identifieringen baserar sig på detektering av fluorescens med kort avklingningstid som diskuterats ovan. I ett lämpligt mätsystem kan fluorescens med kort respfilång avklingningstid detekteras separat. I synnerhet när avklingningstiderna skiljer sig med flera stor- leksordningar från varandra (organisktfluorescensmaterial inom nanosekundomrâdet och lantanidkelat inom mikrosekund- till millisekundområdetë ger en kraftig och variabel fluorescenskomponent med kort avklingningstid ett försumbart bidrag till detekteringen av fluorescenskomponenten med lång avklingningstid. Detta är den avgörande punkten i före- liggande uppfinning, nämligen att det snabbt avklingande fluorescensmaterialet kan användas för identifiering av mikropartikelkategorierna utan någon signifikant interferens med bestämningen av analytkoncentrationen.

Mikrosfärer som kombinerar ett polymermaterial med en lämplig fluorescensförening med kort avklingningstid kan 458 968 10 15 20 25 30 35 4 framställas. Organiska fluorescensföreningar med mycket kort avklingningstid, exempelvis POPOP, bisMSB, etc, kan tillsättas vilken monomer som helst (jämför t ex “Theory and practice of Scintillation Counting”. Ed. J.B. Birks, Pergamon Press, 1967, pp. 321-353), varvid kraftigt fluorescerande material bildas vid polymeriseringen. Mate- rialet formas till mikrosfärer 1 samma tillverkningssteg.

För identifiering av mikrosfärerna tillsättes de organiska fluorescensföreningarna med kort avklingningstid till olika satser av monomeren i väsentligt olika koncentrationer som skiljer sig exempelvis med en faktor två från varandra.

Identifieringssignal detekteras samtidigt med exciteringen som varar nâgra mikrosekunder som mest och är väsentligt kortare än avklingningstiden för den fluorescerande markören med lång avklingningstid. Bidraget från markören med lång fluorescensavklingningsüfi till identifieringssignalnivân är mycket litet eftersom fotonemissionen per sekund från kompo- nenten med lâng avklingningstid är mycket låg och eftersom identifieringsföreningen kan användas i mycket högre koncentra- tioner än markören med lång avklingningstid.

Det är känt att flödescytometrar (J. Steinkamp, Rev.Sci.

Instrum. 55 §l984) pp 1375-1400) kan användas för immun- analyser under utnyttjande av mikrosfärer som fast bärare (P.J. Lisi & al., Clinica Chimica Acta, 120 (1982) pp l7l- 179). Vid detta förfarande fick antigen- eller antikroppa- belagda mikroflfärer (l- , 50)mn diameter) reagera med provet och med fluorescensmärkta antigener eller antikroppar i enlighet med ett allmänt använt immunanalysförfarande såsom kompetitiv bindning, dubbel antikropps-“sandwich“, etc. Suspensionen infördes otvättad i en flödescytometer och mikrosfärerna strömmade i en tunn stråle förbi en laserstrâle.

Förutsatt att cytometern samtidigt mätte fluorescerande ljus och spritt ljus från mikrosfärerna, var det möjligt att endast mäta den mikrosfärsassocierade fluorescensen. Följ- aktligen var den speciella fördelen med denna metodik att ingen makroskopisk separation av bundna-och fria märkta l 10 15 20 25 30 35 458 968 5 föreningar behövdes. Makroskopisk separation undveks genom flödescytometerns förmåga att på mikroskopisk nivå diskriminera mellan partikelassocierad (bunden) fluorescens och lösningsassocierad (fri) fluorescens. Diskrimineringen var effektivast för mikrosfärer med en diameter av mellan 1 och 5 , varvid sfärer i ett kraftigt fluorescerande bak- grundsmedium och sfärer i ett buffertmedium uppvisade unge- fär sama fluorescensintensitet per partikel.

Möjligheten att använda flödescytometrar för multianalyt- immunanalys har diskuterats av TJM. McHugh & al., J. Immunol.

Methods 95 (1986) pp. 57-61, där mikrosfärer av olika stor- lekar användes som fast bärare och där identifieringen av mikrosfärer associerade med olika analyter baserades på analys av mikrosfärernas storlek. Detta har visat sig vara möjligt eftersom flödescytometern noggrant kan detektera partiklar på basis av deras storlek och det skulle vara möjligt att identifiera en känd míkrosfärspopulation och att bestämma fluorescensen utan störning från mikrosfärer av annan storlek.

I en flödescytometer är begreppet tidsupplösning mellan fluorescens med kort resp_lång avklingningstid emellertid inte grundat endast på användningen av en grindstyrd detektor som beskrivits ovan. Tidsupplösningen mellan excitering och emission kan uppnås genom att provet flyttas med hög hastig- het i förhållande till brännpunkterna för excitering och detektering. Enligt detta koncept, som disku fr _ß mer i detalj i den svenska patentansökan 8604434-4 befinner sig brännpunkterna för excitering och emission på ett litet av- stånd från varandra så att signalerna från spridningen och fluorescensen med kort avklingningstid inte detekteras medan signalerna från varje fluorescensmarkör med lång avklingningstid kan detekteras på grund av dess "efterlysning" när provet rör sig med hög hastighet i förhållande till brännpunkterna.

En anordning med de ovan diskuterade egenskaperna kan konstru- eras exempelvis pâ i Fig. l visat sätt. I detta exempel 458 968 5 $POPOP ligger normalt i samma område mellan 300 nm och 10 15 20 25 30 35 6 har man antagit att ett europiumkelat används som markör med lång avklingningstid och POPOP används som ett fluore- scensämne med kort avklingningstid, d v s som identifierings- substans. Exciteringsvåglängderna för europiumkelat och 360 nm. En kvävelaser eller en xenonblixtlampa med en våg- längd av 337 nm är optimal för excitering. Emissionsvâg- längderna är 613 nm för europium och c:a 400 nm för POPOP. ” Exciterings- och emissionsspektra visas 1 Fig. 2.

En suspension av mikropartiklar 1 och en mantèlvätska 2 matas genom ett mantelflödesmunstycke 3 till bildande av ett smaltlaminärtflöde 4 som först belyses med en ljus- strâle 5 från en kontinuerlig ljuskälla 6, t ex en HeNe- laser med en våglängd av 633 nm, som är fokuserad på en punkt 8 i laminärflödet 4. En fotondetektor 7, som är känslig för 633 nm är fokuserad pâ punkten 8 och används för att detektera fotonspridningen från slumpvis inkommande mikropartiklar 1. Varje mikropartikel 1 alstrar en signal i detektorn 7 och denna signal eller puls används för att utlösa en blixtlampa eller en pulsstyrd laser 9 som är fokuserad på en punkt 10 i laminärflödet 4. Den pulsstyrda ljuskällan 9 för excitering av de båda fluorescenta sub- stanserna, d v s såväl identifieringsföreningen som lantanid- kelatet hos mikropartiklarna vid en våglängd av 337 nm.

Signalen från detektorn 7 aktiverar också en dator lll En gríndstyrd fotondetektor 12 som är känslig för en våg- längd av 400 nm är fokuserad 3% çunkten 10 och mäter ampli- tuden hos signalen med kort avklingningstid från den organiska fluorescenta föreningen hos varje mikropartikel l. Denna amplitudmätning används sedan för identifiering av partikeln av datorn ll. En detektor 13 mäter fluorescensen med lång avklingningstid vid en våglängd av 614 nm. Detektorn 13 är fokuserad på en punkt 14 på ett litet avstånd dx nedströms från punkten 10. Det lilla avståndet dx lamínärflödeu;4 hastighet och td är en tidsfördröjning. En grind 15 aktiveras under en räknetidsperiod t fördröjning td. Tidsfördröjningen t = v- td, där v är efter tids- d och räkneperioden t 10 15 20 25 30 35 458 968 7 c styrs av datorn ll och optimeras för högsta signalbrus- förhållande samt är beroende av avklingningstiden för fluorescensmarkören med lång avklingningstid. Systemets räknehastighet beror på den maximala pulsfrekvensen hos den pulsstyrda ljuskällan 9 samt på räkneperioden tg för signalen från markören med lång avklingningstid. Signaler från mikropartiklar som sammanfaller inom ett tidsintervall som är kortare än minimiljuspulsperioden kan förkastas elektroniskt. Datorn ll integrerar fotonsignaler från mikropartiklarna separat för varje parameter. Genom använd- ning av lämpliga standardprov för varje analyt kan systemet kalibreras för koncentrationsenheter.

Valet av markör med lång avklingningstid påverkar system- parametrarna hos anordningen. Man bör särskilt uppmärksamma läckaget av ströljus från ljuskällan 6 till detektorn 13.

Bra fokuseringsoptik, optisk separation av punkterna 8 och 14 liksom grindstyrning av detektorerna reducerar av denna effekt förorsakat brus.

Flödescytometrar är relativt dyra och deras optiska och hydrodynamiska system är mekaniskt komplicerade och känsliga.

Analysen av mikropartiklar.kan emellertid också utföras i stationärt tillstånd och dylika system kan göras billigare och robustare. De stationära systemen baseras på använd- ningen av mikroskopiska observationer av mikropartiklar i en liten hålighet till vilken den utspädda mikropartikel- suspensionen pumpas från en ffiktionskammare. Mikropartikel- suspensionen avsökes först men mycket hög hastighet, var- efter identifieringen av såväl mikrosfärerna som deras läge samt bestämningen av deras analytkategorier äger rum på basis av detekteringen av fluorescensen med kort avklingnings- tid. Detekteringen av analytkoncentrationen hos mikropar- tiklarna äger rum under mätning av signalstyrkan hos fluore- scensen med lång avklingningstid. Ett tillräckligt antal slumpvis lokaliserade mikropartiklar identifieras och analyseras för att erhålla tillräcklig mycket information för önskad statistisk noggrannhet. w 458 968 10 15 20 25 30 35 8 Exciteringsljuskällan kan antingen vara en pulsstyrd ljus- källa eller en konstant ljuskälla. Om man använder en puls- styrd ljuskälla utsättas varje avsökt punkt av provet för en eller flera ljuspulser och detektorn och den därmed för- bundna elektroniken för fotonräkning grindstyrs för separat detektering av fluorescens med såväl kort som lång avkling- ningstid.

Om den konstanta ljuskällan används i en konfokal svepmikro- fluorometer kan tidsupplösning mellan fluorescens med kort avklingningstid och fluorescens med lång avklingningstid erhållas på följande sätt: Brännpunkterna för excitering respektive'emission hâlles på kort avstånd från varandra på sådant sätt att signalerna från fluorescensen med kort avklingningstid och signalerna från fluorescensmarkören med lång avklingningstid kan detekteras vid olika tidpunkter när exciteringssträlen rör sig med hög hastighet i för- hållande till provet. Denna teknik diskuteras mer i detalj i svensk patentansökan nr 86Q4434~4.

Vid mikrofluorometrisk analys (såväl som flödescytometrisk) kan man särskilja mellan mikrosfärsassocierad fluorescens och lösningsassocierad fluorescens, eftersom de respektive koncentrationerna i den mikroskopiska brännpunkten i den utspädda suspensionen skiljer sig flera storleksordningar från varandra. Denna detekteringsteknik ger en acceptabel separation av fria och bundna fraktioner men kan, om så är nödväfdiçt, göras mer effektiv med användning av normala separationsmetoder (tvättning, filtrering, centrifugering etc.).

Detektering av olika fluorescenssignaler kan göras med ett lämpligt datcrstyrt, automatiskt videomikroskop (Video Microscopy, ed. Shinya Inouê, Plenum Press, 1986) eller med ett svepmikroskop. Svepmikroskopet kan också utrustas med konfokala optiska system för excitering och emission- för att förbättra känsligheten och noggrannheten (G. J. Brakenhof & al., J. Microscopy, 117 (1979) pp 219-232). 10 458 968 9 Alternativt kan aperturen väljas optimalt i beroende av diametern av mikropartiklarnapch 'avsökningen av fluorescensemissïonšsignalerna kan göras under användande av en lämplig Bilddetektor som kan arbeta i en enkel- fotonmod. DylIka_detektprer kan vara uppbyggda av exempel- vis nïkrokanalplattßïldsfiörstärkare bch'laddningskopplade bildalstringsanordningar. Laddningskopplade anordningar kan grindstyras för åstadkommande av tidsupplöst drift för att särskilja mellan fluorescens med kort avklingnings- tid och fluørescens med lång avklingningstid (se Video Microscopy, ed Shinya Inoue'). Analys av bilden från laddningskopplade anordningar kan utföras med hjälp av en dator.

Claims (1)

1. 458 968 'i '° PATENTKRAV šï Biospecifikt multianalytanalysföriarande enligt vilket? k man bereder olika kategorier avmikrosfärer representerande olika analyter som skall analyseras, där de olika mikro- sfärskategorierna innefattar olika mängder av en fluoresce- rande substans, man till mikrosfärerna tillhörande de olika kategorierna binder olika biospecifika reaktanter, vilka är specifika för de olika analyterna, som skall analyseras, I man blandar mikrosfärerna tillnörande de olika kategorierna i en suspension, - man till suspensionen tillsätter dels ett prov innehållande analyter, som skall analyseras, och dels en blandning av med en fluorescerande förening märkta, biospecifika reak- tanter vilka ävenledes är specifika för de olika analyterna, som skall analyseras, i och för att initiera biospecifika reaktioner mellan analyterna, de märkta reaktanterna och de mikrosfärbundna reaktanterna, man minskar koncentrationen av märkta reaktanter som inte är bundna till mikrosfärerna, man exciterar såväl den fluorescerande substansen som den fluorescerande föreningen för erhållande av fluorescens- emissioner, man omvandlar fluorescensemissionerna till elektriska signaler, man identifierar varje mikrosfärs kategoritillhörighet och därigenom analyterna pâ basis av den elektriska signal som härrör frân den fluorescerande substansen och man mäter koncentrationen av varje analyt pâ.varje mikrosfär pâ basis av den elektriska signal som härrör från den fluorescerande föreningen, ä n n e t e c k n a t a v att man som fluorescerande substans väljer en substans med kort fluorescensavklingnings- tid, och att man som fluorescerande förening väljer en förening med lång fluorescensavklingningstid, varvid fluore- scensemissionerna från den fluorescerande substansen l respektive den fluorescerande föreningen detekteras vid olika tidpunkter.