SE466208B - Enkelstraengad aminoderivat av oligonukleotider och foerfarande foer framstaellning daerav - Google Patents

Description

466 208 2 Avsevärda ansträngningar har hittills gjorts för att utveckla effektiva kemiska metoder för syntes av sådana oligonukleo- tider. En kort sammanfattning av dessa metoder sâsom de har ut- vecklats hittills finns i Crockett, G. C., Aldrichimica Acta l6(3), 47-55 (1983). Den bästa metodologi som för närvarande finns tillgänglig använder fosforamiditderivat av nukleosiderna i kombination med ett syntetiskt fastfasförfarande, Matteucci et al, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (l98l); och Beaucage et al, M. H. Tet. Lett., 22(20), 1858-1862 (1981). Oligonukleotiderna med längder upp till 30 baser kan tillverkas rutinmässigt på detta sätt och molekyler med så mycket som 50 baser har till- verkats. Maskiner som använder denna teknologi finns nu kom- mersiellt tillgängliga.

Det finns andra rapporter i litteraturen om derivatisering av DNA. Ett modifierat nukleosidtrifosfat har utvecklats vari en biotingrupp konjugerfiïstill en alifatisk aminogrupp vid uracilens 5-position, Langer et al, Proc. Nat. Acad. Sci., ïSA¿¥78¿;&633-6631 (E9&l).fDeütæfinukledtïddéniwátrtnkdfiäfiflefiæwßw effektivt i dubbelsträngad DNA. Inne i DNA kan det bindas genom antibiotin-antikropp som därefter kan användas för detektion genom fluorscens eller enzymatiska metoder. Det DNA som har haft biotinkonjugerade nukleosider inkorporerade en- ligt metoden av Langer et al, fragmenteras till mindra enkel- eller dubbelsträngade bitar vilka är heterogena med avseende på nukleosidsubenhetsekvensen och har variabel molekylvikt.

Draper och Gold, Biochemistry, 19, 1774-1781 (1980) rapporte- rade introduktionen av alifatiska aminogrupper genom en bi- sulfitkatalyserad transamineringsreaktion och deras efterföl- jande reaktion med ett fluorescensmärke. I Draper och Gold fästes aminogruppen direkt till en pyrimidinbas. Den så be- lägna aminogruppen inhiberar vätebindning och av detta skäl är dessa material inte användbara vid hybridisering och lik- nande. Chu et al, Nucleic Acid Res. l1(l8), 6513-6529 (1983) har rapporterat en metod att fästa en amin till den terminala 5'-fosfaten av oligonukleotider eller nukleinsyror. 3 466 208 Det finns många skäl att önska en metod för att kovalent fästa andra kemiska arter till syntetiska oligonukleotider. Fluor- escerande färgämnen fästa till oligonukleotiderna tillåter en att eliminera radioisotoper från forsknings-, diagnos- och kliniska förfaranden vari de användes och förbättra lagrings- tiden och tillgängligheten. Såsom beskrivits i vår ansökan av- seende en DNA-sekvenatormaskin (DNA sequencing machine) tillåter syntesen av fluorescens- märkta oligonukleotider automatisering av DNA-sekvenerings- förfaranaet. Utvecklingen av ändamålsenliga tekniker ocn instrumentering för detektion och användning av fluorescens- märkta oligonukleotider möjliggör automatisering av andra hit- tills mödosamma laboratorie- och kliniska tekniker. Fästandet av DNA-spjälkningskemikalier såsom de som beskrivs av Schultz et al, J. Am. Chem. Soc., 104, 6861 (l982); och Hertzberg et al, J. Am. Chem. Soc., 104, 313 (1982) möjliggör konstruk- tionen av syntetiska restriktionsenzymer, vars specificitet styres av oligonukleotidsekvensen.

Föreliggande uppfinning ger en allmän metod för införandet av en fri alifatiska aminogrupp (fria alifatiska aminogrupper) i syntetiska oligonukleotider. Denna aminogrupp reagerar lätt och specifikt med en mångfald amino-reaktiva funktioner och möjliggör därigenom kovalent bindning av en mångfald kemiska arter.

I korthet innefattar föreliggande uppfinning nya alifatiska aminoderivatiserade (aliphatic aminoderivitized) enkelsträngade oligonukleotider konjugerade till endetekterbar grupp som är en kromofor, ett fluorescerande medel, protien, enzym eller ett annat "märke" ("tag").

Föreliggande uppfinning innefattar ytterligare de nya oligo- nukleotiderna med åtminstone en aminoderivatiserad nukleosid infogad via fosforamiditprekursorer.

Enligt en annan aspekt innefattar föreliggande uppfinning syn- 466 208 4 tesen av oligonukleotider på en fastfasbärare, vari oligo- nukleotiden får reagera med en skyddad aminoderivatiserad nukleosidfosforamidit.

Föreliggande uppfinning utgör enligt en specifik aspekt, den syntetiserade molekylen 5'-trifluoracetamido 5'-deoxi-3'-N,N- diisopropyl fosforamidotymidin (figur 2) och dess addition till 5' terminus som den sista additionen i fastfasoligo- nukleotidsyntesen. Under spjälkning och deprotektion av oligo- nukleotiden hydrolyseras trifluoracetylgruppen och lämnar en fri alifatiska aminogrupp på 5' terminus av oligonukleotiden.

Denna aminoderivatiserade oligonukleotid kan därefter reageras med vilken som helst av en mångfald amino-reaktiva molekyler för att ge motsvarande oligonukleotid-derivat. Detta är ett specialfall av den mer allmänna tillämpningen med användning av en modifierad nukleosid som har en skyddad alifatiska amino- grupp på basgruppen i stället för på 5'-kolet. En sådan mole- kyl möjliggör att flera fria aminogrupper kan placeras i oligo- nukleotideniochwvid.vilken:somthehstfönskadwgusitianaifigïigøfirL» nukleotidsekvensen.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla nya reagens och tekniker tillämpliga på DNA-sekvenering.

Ett annat ändamål med uppfinningen är att ge förbättringar inom DNA-hybridisering för detektion av genetiska sjukdomar och för andra ändamål.

Dessa och andra ändamål och fördelar med föreliggande upp- finning framgår för en fackman på området av de mera specifika uppgifter som följer.

Den strategi som användes för att införa alifatiska amino- grupper i en oligonukleotid är att syntetisera 3'-fosforamidit- derivatet av en nukleosidanalog innehållande en skyddad alifa- tisk aminogrupp. Denna fosforamidit kan därefter omsättas med oligonukleotiden som syntetiseras på en fast bärare på ett 5 466 208 sätt som är analogt till reaktionen av icke derivatiserade nukleosidfosforamiditer. Spjälkning från den fasta fasen och deprotektion av basgrupperna och den alifatiska aminogruppen ger den amino-derivatiserade oligonukleotiden.

Exempel I Syntes av VI. I figur 3 visas syntesen av föreningen VI från den kommersiellt tillgängliga föreningen I (tymidin). Synte- sen av föreningarna II-IV beskrivs i Horowit et al, J. Org.

Chem., 27, 3045-3048 (l962); och Gibbs och Orgel, J. Carbo- hydrates-Nucleosides and Nucleotides, 3(5 och 6), 315-334 (1976). Syntesen av föreningar V och VI är enligt följande.

Exempel II 5'-trifluoracetamido-5'-deoxitymidin(V): 1,25 g (5 mmol) 5'- amino-5'-deoxitymidin upplöstes i 25 ml torr dimetylformamid.

Till detta sattes 1,3 ml (10.mmoll^S-etyI-trifluortioacetatfi (Aldrich). Reaktionsblandningen omrördes försiktigt vid rus- temperatur. TLC av reaktionsblandningen på kiselgel F-254- plattor körda i MeOH:aceton 1:1 visar en enkel fläck av produkt spårad genom kortvâgs-UV. Produkten har hög mobilitet i detta lösningsmedelssystem i motsats till utgångsföreningen VI som är praktiskt taget orörlig.

Reaktionsblandningen rotationsindunstades till torrhet under reducerat tryck, överfördes till en Erlenmeyer-kolv i 30 ml isopropanol och omkristalliserades ur kokande isopropanol: Me0H. Utbyte = 1,315 g (3,9 mmol, 80% utbyte), smältpunkt 2610-2620 (sönderdelning), analys, beräknat C 42,7%; H 4,18%; N l2,5%, funnet C 42,7%; H 4,16%; N l2,4%. Strukturen V bekräf- tades ytterligare genom 'H NMR. 466 208 6 Exempel III p .

Detta exempel åskådliggör framställningen av en skyddad amino- derivatiserad nukleosidfosforamidit. 5'-trifluoracetamido-5'-deoxi-3'-N,N-diisoprpylfosforamido- tymidin (VI): Allt glasmaterial, sprutor och kapillärrör som användes vid denna reaktion upphettades över natten i en tork- ugn. Dimetylformamid (DMF) lagrades över 4 Å molekylsiktar (Linde). Diisopropyletylamin (DIPEA) destillerades från kalium- hydroxid, därefter från kalciumhydrid och lagrades över 4 Å molekylsiktar.

Till en torr 3-halsad 50 ml rundbottnad kolv med omröringsan- ordning sattes 63 mg (0,l9 mmol) V. De tre halsarna förseddes med gummiserumproppar och nålar instuckos i propparna. Kolven vakuumpumpades i flera timmar i en exsickator över torr CaCl2.

Kolven hölls under en sakta ström av torr kvävgas och 2 ml torr.DME tillsattes genom;imiekfiiønssprwtantg60%ul DIEEAh» (0,34 mmol) tillsattes i ett torrt 100 ul kapillärrör; 40 ul klor-N,N-diisopropylaminometoxifosfin (American Bionuclear, Emeryville, CA) tillsattes (i ett torrt 100 ul kapillärrör).

Reaktionsblandningen omrördes sakta tills allt utgångsmaterial upplösts och fick därefter sedimentera vid rumstemperatur (alltid under N2). TLC efter l timme på kiselgel F-254-plattor i HCCL3:EtOH:Et3N 88:l0:2 visade en enkel produktfläck med mycket högre mobilitet än utgångsmaterialet V. Försök att rena denna produkt på ett sätt liknande det som beskrivits för nukleosidfosforamiditerna (4) misslyckades beroende på produkt- nedbrytning. Därför användes den orena reaktionsblandningen direkt för kopplingen till den syntetiska oligonukleotiden på fastfasbäraren. Strukturen av VI bestämmes av reaktiviteten av denna produkt med tillsats av oligonukleotiden och från den väntade produkten av reaktionen på basis av litteraturresultat. 'x 7 466 208 Exempel IV Detta exempel åskådliggör framställningen av en oligonukleo- tid kopplad vid 5' terminus via en fosfodiester-bindning till 3'-hydroxylen av 5'-amino-5'-deoxitymidin.

Addition av VI till 5'terminus av en oligonukleotid: En bas- skyddad syntetisk oligonukleotid med sekvensen 5'OH-AGC ACT TTT AGA GT 3' kopplad till den fasta fasen vid 3"terminus framställdes genom metoder som i detalj beskrivs i protokollet benämnd "A Procedure for the Manual Synthesis of Deoxyoligo- nucleotides using dimethoxytrityl nucleoside phosphoramidites on a Solid Support", utgiven av Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californien. Skillnaderna i reaktion av oligo- nukleotiden med vi är a) 1 stället för stegen 4.22 och 4.23 kombineras l ml nyframställd reaktionsblandning innehållande VI med l ml 0,5M tetrazol i acetonitril och sättes till reak- tionskärlet; b) efter steg 4.33 sker två 30 sekunders tvätt- ningar med.acetonitril;¿och;c),tillslutningsreaktionenlâsute-~“ slutes (för att följas av analys av icke reagerade hydroxyl-“ grupper i en efterföljande addition).

Kopplingsreaktflxens effektivitet monitoreras lätt genom efter- följande koppling med en "normal" fosforamídit och spjälkning av dimetoxitritylgruppen för att ge färganalys. Om 5'-hydro- xylgrupperna i oligonukleotiden i den första kopplingen rea- gerar med VI finns de inte längre tillgängliga för reaktion vid den efterföljande kopplingen och lite färg frigöres vid DCA-behandlingen efter den andra kopplingen. I detta exempel är OD450=l,l2 (efter utspädning) för DMT-gruppen frigjord 45O=O,026 (efter utspädning) för DMT frigjord från en G-rest tillsatt från oligonukleotiden innan reaktionen med VI. OD efter reaktionen med VI. Därför blockerades 98% av 5' OH- grupperna genom reaktion med VI. Oligonukleotiden deprotekte- rades och spjälkades från den fasta fasen genom behandling med tiofenol och koncentrerad NH OH på vanligt sätt och NH OH av- 4 4 lägsnades under reducerat tryck. Oligonukleotiden upplöstes i 466 2Û8 l ml destillerad H20. 0D260 var 128 av denna lösning vilket indikerade koncentrationen av DNA att vara 4,5 mg/ml. 50 ul av denna lösning späddes till 1 ml med H20 och blandades i 15 minuter med några hundra mg AG50W-X4 (natriumform) jonbytar- harts för att överföra DNA från ammoniumsaltet till natrium- saltet (ammoniumjonen interfererar med den efterföljande nin- hydrinanalysen). Hartset avlägsnades genom centrifugering och den överstående vätskan torkades i en Savant rotationskon- centrator. Kvantitativ ninhydrinanalys (Sarin, V. K., et al, Anal. Biochem. 117, 147 - 157 (1981)) gav ungefär 1 mol amino- grupp per mol oligonukleotid (molkoncentrationen av oligo- nukleotiden bestämdes ur en beräknad extinktionskoefficient E260 = 1,55 x 105, beräknat på nukleotidkompositionen). Nin- hydrinanalys av samma molmängd av en kontroll-oligonukleotid till vilken inget VI hade konjugerats gav ingen amino- positiv reaktion.

Exempel V Konjugation med färgämne: Till 100 ul av ovannämnda Iöšníng av " amino-oligonukleotider sattes 200 ul H20, 50 ul 1 M karbonat/ bikarbonatbuffert pH 9,0 och 25 ul nyframställd 10 mg/ml fluorescein isotiocyanat (FITC) (Molecular Probes, Inc., Junction City, Oregon) i dimetylsulfoxid. Blandningen lämnades vid rumstemperatur i flera timmar och renades genom kromatogra- fi på en kolonn (1 cm x 9 cm) av Sephadex G-25 medium i H20.

Den gula produkten eluerades i den undantagna volymen och be- friades från oreagerat färgämne. En kontrollreaktion med oligo- nukleotider vartill inget VI omsatts gav mycket lite eller ingen färg i den från kolonnen undantagna volymen vilket indi- kerade att färgen verkligen reagerat med den tillsatta amino- gruppen. Färg-oligonukleotidkonjugatet hade eU:0D260 = 2,3, OD495 = 0,54. Beräknat på E495 7 x 104 för FITC, gav dešta en 7,7 uM lösning av färgämne. Baserat på E260 = 1,55 x 10 är DNA 12,8 UM. Därför märktes 4'60% av DNA-molekylerna med färg- ämne. Detta är en grov bedömning som inte tillåter förändrin- gar i den bundna fluoresceinadsorbtionen i förhållande till 9 466 208 obunden eller för kontaminerande kortare och icke reaktiva oligonukleotider. Ett prov av detta färgade DNA elektroforera- des på en 20% polyakrylamidgel och blev klart synlig som ett enkelt färgat (och fluorescerande) band med en mobilitet ända- målsenlig för en oligonukleotid av denna längd.

Den färgkonjugerade oligonukleotiden renades bekvämt genom högutlösningsvätskekromatografi (HPLC) på en omvänd fas C18- kolonn (Waters) med användning av acetonitril:O,l M trietyl- ammoniumacetat pH 7,0 gradient för eluering.

Det finns en mångfald tillämpningsområden för de nya amino- derivatiserade oligonukleotiderna som beskrivits ovan. Den alifatiska aminogruppen reageras lätt och specifikt med en mångfald funktionella grupper. Detta innebär att praktiskt ta- get vilken som helst önskad molekyl kan fästas till en på ovan beskrivet sätt preparerad oligonukleotid. Detta inkluderar en- zymer, andra proteiner, fluorescensmärkningar, bioluminescens- märkningar, kromoforer och så vidaret Oligonukleotiderdhanflif vid omfattning använts inom många områden, ofta i samband med radiomärkning. Det kommer att bli möjligt att ersätta de radio- aktiva märkningarna med icke-radioaktiva probemolekyler. Detta innebär att förfaranden vari oligonukleotider användes blir billigare och lättare att använda och förenliga med klinisk hantering (setting). Även om radiomärkning är mindre före- dragen kan de nya amino-derivatiserade oligonukleotiderna även 125 radiomärkas såsom exempelvis med I . Följande tre särskilda exempel på användningar av de nya amino-derivatiserade oligo- nukleotiderna utgör endast exempel: 1. Automatiserad DNA-sekvenering. 2. Detektion av genetiska sjukdomar genom DNA-hybridisering. 3. Allmän användning av fluorescens för detektion av hybridi- sation. 466 208 10 Detektion av genetiska abnormaliteter: Oligonukleotider kan användas för att bestämma individerna genotyp. Detta görs på DNA-prov erhållna från fetus genom aminiocentesis. Denna in- formation är ovärderlig för genetisk bedömning av par med risk för en mångfald genetiska sjukdomar. Vuxnas genotyp kan även bestämmas och tillåter effektiv diagnos och behandling på ett tidigt stadium. Ett slående exempel på denna teknologi är detektion av sickelcellanemi, Connor et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 80, 278 (1983). Nitton-bas-par-långa syntetiska oligo- nukleotider syntetiserades, en komplementär till den normala lummn B-globingenen (BA) och en komplementär till sickelcell- B-globingenen (BS). Dessa molekyler märktes radioaktivt och användes som prov vid DNA-hybridisation. Under lämpliga hybri- disationsbetingelser kan dessa prov användas för att skilja BA-genen från BS-allelen. Detta möjliggör diagnos av sickel- cellsjukdomen. Mera allmänt, såsom påpekas i Connor et al,' “this allele-specific hybridization behavior of oligonucleo- tides~pravides@a:general;method for the_diagnpsis of any genetic disease which'invoIves"a~porntßmuiatiønæflnmthëïüfiäïg¿ sequence of a single-copy gene". Föreliggande uppfinning är f direkt applicerbar på denna teknik. Oligonukleotidproben pre- pareras med en aminogrupp och märkes med ett fluorescensmärke.

Fluorescensprobemolekylen är obegränsat stabil i motsats till den korta livstiden för radioaktiva probe och erfordrar inte några speciella försiktighetsåtgärder vid användning eller hantering. Detta gör att ett sådant tillvägagångssätt i hög grad föredrages för användning vid klinisk användning, som är det huvudsakliga område vari teknologin kommer att användas.

Oligonukleotidprober användes i stor utsträckning vid forsknings- arbete liksom vid kliniskt arbete. De användes i allmänhet för att spåra en bit DNA och en önskad sekvens i ett “bibliotek“, en DNA-fragmentkollektion klonad i en plasmid eller fagvektor, -som innehåller sekvenser som omfattar hela genomet (eller ut- tryckt RNA) av en organism. De användes aven för att hybridi- sera till DNA i en given sekvens i en "blot“ av en restrik- tionssmälta (restriction digest) av en speciell bit av DNA. I ll 466 208 alla dessa exempel liksom i andra märkes oligonukleotiden med 32p, vanligtvis vid 5' terminus och molekylen detekteras genom autoradiografi. Föreliggande uppfinning beskriver märkningen av oligonukleotider med fluorescensfärgämnen. Därför kan fluorescens användas för detektion av molekylerna i vilken som helst av de tekniker vari radioaktivitet konventionellt har använts. Detta ger en mångfald fördelar i förhållande till radioaktivitet såsom probestabilitet, kostnader och lätt vid användning och avfallshantering.

Claims (16)

1. 466 208 /i PATENTKRAV l. Enkelsträngad oligonukleotid, k ä n n e t e c k n a d av att den innehåller en alifatisk aminogrupp fäst till deoxiri- bosringen av den 5'-terminala nukleosiden och har en detekter- bar grupp fäst till den alifatiska aminogruppen.
2. 2. Oligonukleotid n a d av att den medel.
3. 3. Oligonukleotid n a d av att den
4. 4. Oligonukleotid n a d av att den
5. 5. Oligonukleotid n a d av att den
6. 5. Oligonukleotid n a d av att den
7. 7. Oligonukleotid n a d av att den enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k - detekterbara gruppen är ett fluorescerande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k detekterbara gruppen är en kromofor. enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k detekterbara gruppen är ett protein. enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k detekterbara gruppen är ett enzym. enii-gltfl-l/fl-pateawfkraveff L detekterbara gruppen är radioaktivt I125. enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k - alifatiska aminogruppen fästes till 5'-kol- atom 2 av den 5'-terminala nukleosiden.
8. 8. Oligonukleotid enligt patentkravet 7, k ä n n e t e c k - n a d av att oligonukleotiden innehåller en 5'-terminal 5'- amino-5'-deoxitymidinnukleosid.
9. 9. 5'-deoxi-5'-(skyddad amino)-nukleosidfosforamidit.
10. 10. Förening enligt patentkravet 9, k ä n n e t e c k n a d av att den skyddade aminogruppen är en trifluoracetamidogrupp.
11. A? 466 208 ll. 5'-trifluoracetamido-5'-deoxi-3'-N,N-diisopropylfosfor- amidotymidin.
12. 12. Förfarande för framställning av ett 5'-deoxi-5'-trifluor- acetamido-tymidinfosforamidit, k ä n n e t e c k n a t av att 5'-deoxi-5'-trifluoracetattymidin omsättes med en fosfin.
13. 13. Sätt för framställning av en oligonukleotid enligt patent- kravet 8, k ä n n e t e c k n a t av att man omsätter 5'- amino-5'-deoxitymidin till 5'-trifluoracetamido-5'-deoxitymi- din, omsätter denna produkt med klor-N,N-diisopropylaminome- toxifosfin till motsvarande fosforamidit, och omsätter denna med en basskyddad oligonukleotid fäst till en fastfasbärare.
14. 14. Sätt för framställning av en oligonukleotid innehållande en alifatisk aminogrupp vid 5'-terminus, k ä n n e t e c k -_ n a t av att man inför den alifatiska aminogruppen i oligo- nukleotiden med användning av ett aminonukleosidfosforamidit i det sista kopplingssteget av oligonukleotidsyntesen på en fastfasbärare.
15. I5;VSätt*för«framstäIIningøav~enmoligonukleotídfenligm*paraÜ* kravet 13, k ä n n e t e c k n a t av att aminonukleosidfos- foramiditet är en skyddad 5'-amino-5'-deoxi-3'-fosforamiditty- midin.
16. 16. Sätt för framställning av en oligonukleotid enligt patent- kravet 13, vari aminonukleosidfosforamiditet är 5'-trifluor- acetamido-5'-deoxi-3'-fosforamido-tymidin.