SK282188B6

SK282188B6 - Purifikovaná zlúčenina

Info

Publication number: SK282188B6
Application number: SK1253-2000A
Authority: SK
Inventors: Michael John Reed; Barry Victor Lloyd Potter
Original assignee: Sterix Limited
Priority date: 1991-08-29
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 2001-12-03
Also published as: ATE237333T1; SG103374A1; AU717116B2; JP2002255993A; NO940635D0; RU2182152C2; HK1019753A1; DE69233149T2; CY2253B1; FI20002260L; JP2000355542A; NO20002595D0; FI940903A7; FI20002260A7; KR100322650B1; DK0982032T3; SG103820A1; HK1025051A1; ATE246706T1; EP0921130A3

Abstract

Purifikovaná zlúčenina obsahujúca kruhový systém, ku ktorému je pripojená sulfamátová skupina vzorca (I), kde každý z R1 a R2 je nezávisle zvolený zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, alkyl, alkenyl, cykloalkyl a aryl; kde najmenej jeden z R1 a R2 znamená atóm vodíka; a kde kruhový systém obsahuje najmenej tri kruhy, z ktorých najmenej dva sú spojené; kde je zlúčenina inhibítorom enzýmu s aktivitou steroidnej sulfatázy (E.C.3.1.6.2); kde ak by bola sulfamátová skupina nahradená v zlúčenine sulfátovou skupinou na vytvorenie sulfátovej zlúčeniny a inkubovaná enzýmom steroidnou sulfatázou (E.C.3.1.6.2.) pri pH 7,4 a teplote 37 °C, získala by sa hodnota Km menšia ako 50 umol.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových zlúčenín, ktoré môžu byť použité ako inhibítory steroidnej sulfatázy a farmaceutických prípravkov, ktoré ich obsahujú.

Doterajší stav techniky

Prekurzory steroidných hormónov, ktoré majú sulfátovú skupinu v pozícii 3 steroidného jadra, sú v ďalšom texte zjednodušene označované ako steroidné sulfáty. Tieto látky sú dôležitými medziproduktmí metabolizmu steroidov v ľudskom organizme. Estrón sulfát a dehydroepiandrosterón (DHA) sulfát sú známe ako dôležité medziprodukty tvorby telových estrogénov estrónu a estradiolu. Estrón sulfát je jedným z hlavných prekurzorov estrogénu v obehu zvlášť žien po menopauze a aktivita enzýmu estrónsulfatázy v tumoroch prsníkov je 100 až 1000 násobne vyššia než aktivita iných enzýmov, ktoré sa zúčastňujú tvorby estrogénu (James so spoluautormi, Steroids 50, 269 - 279, 1987).

Estrogény ako estrón a estradiol a najmä ich nadprodukcia sa značne uplatňujú za malígnych podmienok, napríklad pri rakovine prsníkov (pozri Breast Cancer, Treatment and Prognosis, R. A. Stoll, ed., str. 156 - 172, Blackwell Scientific Publications 1986). Kontrola produkcie estrogénov jc preto špecifickým cieľom mnohých protirakovinových terapií, využívajúcich buď chemoterapeutiká alebo operatívne postupy, t. j. odstránenie vajíčkovodov alebo nadobličiek. Endokrinná terapia sa dosiaľ zameriavala na využitie látok, ktoré inhibujú aktivitu enzýmu aromatázy. Ako ukazuje obrázok č. 1, znázorňujúci metabolické premeny estrogénov, aktivita tohto enzýmu sa uplatňuje pri premene androgénov androstendiónu na estrón a testosterónu na estradiol.

Nedávno publikovaná medzinárodná patentová prihláška WO91/13083 sa zaoberá využitím odlišného miesta (či skôr dvoch miest) metabolickej dráhy estrogénu, t. j. premeny DHA sulfátu na DHA a estrón sulfátu na estrón za účasti enzýmu steroidnej sulfatázy. 3-Monoalkyltiofosfonáty esterov steroidov, presnejšie estrón-3-metyltiofosfonát, sú súčasne používané ako inhibítor steroidnej sulfatázy.

Tento vynález sa zaoberá novými zlúčeninami, ktoré sú schopné inhibovať aktivitu enzýmu steroidnej sulfatázy v podmienkach in vitro a in vivo.

Ďalším cieľom je stanovenie nových zlúčenín, inhibujúcich steroidnú sulfatázu za podmienok tak in vitro, ako aj in vivo, so zvýšenou aktivitou.

Ďalej sa vynález zaoberá stanovením farmaceutických prostriedkov, účinných pri liečbe od estrogénu závislých tumorov a pri liečbe rakoviny prsníka.

Podstata vynálezu

Vynález spočíva v objavení nových látok, ktoré prejavujú (v niektorých prípadoch extrémne silnú) inhibičnú aktivitu proti enzýmu steroidnej sulfatázy. Týmito látkami sú sulfamátové estery polycyklických alkoholov, ktoré majú povahu polycyklických alkoholov a ktorých sulfátová skupina slúži ako substrát na enzýmy s aktivitou steroidnej sulfatázy (EC 3.1.6.2). Ďalej sú to potom N-alkyl a N-aryl deriváty uvedených sufamátových esterov a ich farmaceutický využiteľné soli.

Podstatou vynálezu je purifikovaná zlúčenina obsahujúca kruhový systém a sulfamátovú skupinu vzorca o

kde každý z R¹ a R² je nezávisle zvolený zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, alkyl, alkenyl, cykloalkyl a aryl, kde najmenej jeden z R¹ a R² znamená atóm vodíka a kde kruhový systém obsahuje najmenej tri kruhy, z ktorých najmenej dva sú spojené, kde je zlúčenina inhibítorom enzýmu s aktivitou steroidnej sulfatázy (E.C.3.1.6.2), kde ak by bola sulfamátovú skupina nahradená v zlúčenine sulfátovou skupinou na vytvorenie sulfátovej zlúčeniny a inkubovaná enzýmom steroidnou sulfatázou (E.C.3.1.6.2.) pri pH 7,4 a teplote 37 °C, získala by sa hodnota K_m menšia ako 50 pmol.

Ďalej sa vynález týka purifikovanej zlúčeniny, kde zlúčeninou je zlúčenina vzorca (I)

o

poíycyOický systém kde R¹ a R² znamenajú každý zo zvyškov R¹ a R² je zvolený zo skupiny zahrnujúcej atóm vodíka, alkyl, cykloalkyl, alkenyl a aryl alebo spoločne predstavujú alkylén, obsahujúci buď jeden, alebo viac heteroatómov či skupín v alkylénovom reťazci a skupina označená ako -O-polycyklický systém predstavuje zvyšok polycyklického alkoholu, ktorého sulfátová skupina je substrátom enzýmov s aktivitou steroidnej sulfatázy (EC 3.1.6.2).

V texte zmieňovanými polycyklickými alkoholmi, ktorých sulfátová skupina je substrátom enzýmov s aktivitou steroidnej sulfatázy, sú myslené polycyklické alkoholy so sulfátovou skupinou odvodenou od vzorca o

II ' polycyklický systém ,

II o

HO--- S --pre ktorú je hodnota K_ra získaná pri inkubácii týchto látok s enzýmom steroidnou sulfatázou (EC 3.1.6.2) pri pH 7,2 a teplote 37 °C menšia než 50 μηιοί.

Tento vynález predkladá ako nové látky sulfamátové estery polycyklických alkoholov, ktoré majú povahu polycyklických alkoholov a ktorých sulfátová skupina slúži ako substrát pre enzýmy s aktivitou steroidnej sulfatázy tak, ako bolo definované a taktiež ich N-alkyl, N-cykloalkyl, N-alkenyl a N-aryl deriváty. Ich vzorec zodpovedá skôr uvedenému vzorcu č. (I).

Polycyklická časť zlúčeniny by mala obsahovať maximálne asi 40 uhlíkových atómov a to vrátane všetkých substituentov, najlepšie však do tridsiatich uhlíkových atómov. Prednosť je dávaná polycyklickým látkam obsahujúcim steroidný skelet cyklopentánfenantrénu. Je výhodné, pokiaľ je sulfamylová alebo substituovaná sulfamylovú skupina na tento skelet viazaná v polohe 3, ako ukazuje vzorec č. (II).

kde

R¹ a R² zodpovedajú definovaným skupinám a cyklický systém ABCD predstavuje substituované alebo nesubstituované, saturované alebo nesaturované steroidné jadro, najlepšie estrón alebo dehydroepiandrosterón.

Ďalšími vhodnými cyklickými steroidmi sú: substituované estróny: 2-OH-estrón, 2-metoxyestrón, 4-OH-estrón, 6a-OH-estrón, 7a-OH-estrón, 16a-OH-estrón a 16p-OH-estrón, estradioly a substituované estradioly: 2-OH-l7p-estradiol, 2-metoxy-17p-estradiol, 4-ΟΗ-17β-estradiol, 6a-OH-173-estradiol, 7a-OH-173-estradiol, 16a-OH-17a-estradiol, 16P-OH-17a-estradiol, 16β-ΟΗ-17β-εδtradiol, 17a-estradiol, 17p-estradiol a 17a-etinyl-17p-estradiol, estradioly a substituované estrioly: estriol, 2-OH-estriol, 2-metoxyestriol, 4-OH-estriol, 6a-OH-estriol, 7a-OH-estriol, substituované dehydroepiandrosteróny: 6a-OH-dehydroepiandrosterón, 7a-OH-dehydroepiandrosterón, 16a-OH-dehydroepiandrosterón a 160-OH-dehydroepiandrosterón.

Steroidný cyklický systém ABCD môže všeobecne obsahovať množstvo neinterferujúcich substituentov. Do úvahy prichádza jeden alebo viac hydroxylových zvyškov, z alkylových substituentov výhodne skupiny s 1 až 6 uhlíkovými atómami, t. j. metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, sekundárny butyl, terciámy butyl, n-pentyl a ďalšie pentylové izoméry, n-hexyl a ďalšie hexylové izoméry, z alkoxylových substituentov výhodne skupiny obsahujúce 1 až 6 uhlíkových atómov t. j. skupina metoxylovú, etoxylová, propoxylová atď., ďalej alkinyl (ako napríklad etinyl) alebo halogénový atóm, napríklad pri fluorovaných substituentoch.

Ako cyklický systém nesteroidnej povahy môže byť použitý dietylstilboestrol, stilboestrol alebo iný cyklický systém so sulfátovými skupinami, ktorého K_m vzhľadom na steroidnú sulfatázu (EC 3.1.6.2) neprevyšuje 50 pmol.

V prípade N-substitúcie obsahujú látky, navrhované týmto vynálezom, jeden alebo dva N-alkylové, N-alkenylové, N-cykloalkylové alebo N-arylové substituenty. Tieto substituenty by mali obsahovať, či už každý z nich, alebo sumárne, maximálne desať uhlíkových atómov. Pokiaľ je ako R¹ alebo R² naviazaná alkylová skupina, mali by R¹ a R² byť nezávislé zvolené z nižších alkylových skupín, metylovej, etylovej, propylovej atď., obsahujúcich najviac 5 uhlíkových atómov. Je výhodné, pokiaľ sú obidvoma substituentmi R] a R₂ metylová skupina. Pokiaľ je jedným zo substituentov aryl, ide prednostne o fenyl a tolyl (-PhCH₃; orto, metá či para). Pokiaľ R¹ a R²predstavujú cykloalkylová skupiny, ide predovšetkým o cyklopropyl, cyklopentyl a podobne. K spojeniu R¹ a R²dochádza v prípade alkylénovej skupiny s reťazcom 4 až 6 uhlíkových atómov, ktorý môže obsahovať jeden alebo viac heteroatómov, prípadne skupín. Ide o morfolínové, pyrolidínové alebo piperidinové, to je päť, šesť alebo sedemčlenné heterocykly so skupinami -O- alebo -NH-.

Medzi alkylové, cykloalkylové, alkenylové a arylové skupiny sú zahrnuté aj skupiny, ktoré sú samé substituované takým zvyškom alebo zvyškami, ktoré neovplyvňujú inhibičnú alktivitu danej látky proti sulfatáze. Príkladom sú substituenty ako hydroxylovú, halogénová, alkoxylovú, alkylová, arylová skupina alebo aminoskupina.

Výhodné sú zlúčeniny podľa vzorcov (ΙΠ) a (IV):

kde

R¹ a R² predstavuje vodíkový atóm alebo alkyl C|-C5, t. j. estrón-3-sulfamát a dehydroepiandrosterón-3-sulfamát a ich N-(CrC5) alkylové deriváty, najmä dimetylderiváty, kde R' = R²=CH3.

Uvádzané estery kyseliny sulfámovej sú pripravované reakciou polycyklického alkoholu, to je estrónu alebo dehydroepiandrosterónu, so sulfamoyl chloridom R’R^SOjCl podľa nasledujúcej schémy:

Reakčná schéma I

r'r^!nso,ci

----► / NaH

Reakcia prebieha za nasledujúcich podmienok: hydrid sodný a sulfamoyl chlorid sa za teploty 0 °C pridajú k stále miešanému roztoku estrónu v bezvodom dimetylformamide. Potom sa môže teplota zvýšiť na laboratórnu teplotu, zatiaľ čo miešanie pokračuje počas ďalších 24 hodín. Reakčná zmes sa potom pridá do studeného saturovaného roztoku hydrouhličitanu sodného a vzniknutá vodná fáza je extrahovaná dichlórmetánom. Spojené organické extrakty sa sušia pomocou bezvodého síranu horečnatého. Po prefiltrovaní sa solvent vákuovo odpar! a ďalším odparením za prítomnosti toluénu vzniká hrubý extrakt, ktorý sa ďalej chromatograficky čistí.

Pokiaľ je potrebné, funkčné skupiny polycyklického alkoholu (sterolu) môžu byť chránené známym spôsobom a ochranné skupiny (skupina) odstránené na konci reakcie.

Pre farmaceutické podanie môžu byť inhibitory steroidnej sulfatázy podľa tohto vynálezu upravené ktorýmkoľvek vhodným spôsobom s použitím obvyklých farmaceutických metód úpravy a farmaceutických nosičov, pomocných látok, rozpúšťadiel a podobne, obvykle na parenterálne podanie. Približné hodnoty efektívnej dávky sa pohybujú v rozmedzí od 100 do 800 mg na deň v závislosti individuálnej účinnosti danej látky, podanej pacientovi priemernej hmotnosti (70 kg). Obvyklejšie dávkovanie látok, ktorým je dávaná prednosť a sú účinnejšie, sa pohybuje v rozmedzí medzi 200 až 800 mg/deň, výhodnejšie medzi 200 až 500 mg/deň a najlepšie medzi 200 až 250 mg/deň. Látky môžu byť podávané buď raz denne, alebo v dávke rozdelenej do niekoľkých intervalov počas dňa alebo opakovane počas niekoľkých dni. Na perorálne podanie môžu byť upravené do formy tabliet, kapsúl, roztoku alebo suspenzie s obsahom 100 až 500 mg príslušnej zlúčeniny v jednej dávke. Tieto látky môžu byť pripadne výhodne upravené na perorálne podanie za využitia vhodného nosiča tak, aby ich jednorazová denná dávka bola v rozmedzí 200 až 800 mg, výhodnejšie 200 až 500 mg a najlepšie 200 až 250 mg. Je zrejmé, že účinnosť dennej dávky závisí od vlastnej aktivity aktívnej zložky a od telesnej hmotnosti pacienta, čo posúdi podľa svojich znalostí ošetrujúci lekár.

Vo zvláštnych prípadoch je možné uvažovať o použití inhibítorov steroidnej sulfatázy v kombinovanej terapii buď spoločne s iným inhibítorom sulfatázy alebo v kombinácii s inhibitorom aromatázy, napríklad 4-hydroxyandrostenodiónom (4-OHA).

Prehľad obrázkov na výkresoch

Inhibičná aktivita uvádzaných látok proti steroidnej sulfatáze je znázornená na obrázkoch na priložených výkresoch:

Obrázok č. 1 ukazuje metabolické dráhy enzýmov a steroidných medziproduktov, zúčastňujúcich sa na tvorbe estradiolu in vivo.

Obrázok č. 2 dokladá inhibičný účinok estrón-3-sulfamátu (v závislosti od jeho dávky) na aktivitu steroidnej sulfatázy v ľudských bunkách MCF-7 in vitro. Na osi x sú vynesené použité moláme koncentrácie inhibítora, estrón-3-sulfamátu. Na osi y je vynesená aktivita enzýmu steroidnej sulfatázy, vyjadrená množstvom vzniknutého produktu počas inkubácie na 10⁶ buniek.

Obrázok č. 3 dokladá inhibičný účinok estrón-3-Ν,Ν-dimetylsulfamátu (v závislosti od jeho dávky) na aktivitu steroidnej sulfatázy v ľudských bunkách MCF-7 in vitro. Na osi x sú vynesené použité moláme koncentrácie inhibítora. Na osi y je vynesená aktivita enzýmu steroidnej sulfatázy, vyjadrená množstvom vzniknutého produktu počas inkubácie (20 hod.) na 10⁶ buniek.

Obrázok č. 4 uvádza krivky závislosti aktivity steroidnej sulfatázy od logaritmu koncentrácie inhibítora, estrón-3-sulfamátu a estrón-3-N,N-dimetylsulfamátu, v ľudských bunkách MCF-7 in vitro. Na osi x sú uvedené hodnoty záporného dekadického logaritmu koncentrácie inhibítora, na osi y je vynesené percento inhibície enzýmovej aktivity.

Obrázok č. 5 znázorňuje dávkovo závislý inhibičný účinok estrón-3-sulfamátu proti aktivite steroidnej sulfatázy v ľudských mikrozómoch placenty za podmienok in vitro a hodnotu IC₅₀ pre vyššie uvedenú látku (t. j. koncentráciu, ktorá vyvolá 50 % inhibiciu reakcie). Na osi x sú vynesené mikromolárne koncentrácie inhibítora, estrón-3-sulfamátu, na osi y percento inhibície enzýmovej aktivity.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava estrón-3-sulfamátu

Hydrid sodný (60 % disperzie, 2 diely) a sulfamoyl chlorid (2 diely) sa pri teplote 0 °C pridajú k stále miešanému roztoku estrónu (1 diel) v bezvodom dimetylformamide. Potom môže byť reakcia zohriata na laboratórnu teplotu, zatiaľ čo miešanie pokračuje počas ďalších 24 hodín.

Reakčná zmes sa potom pridá do studeného saturovaného roztoku hydrouhličitanu sodného a vzniknutá vodná fáza je extrahovaná dichlórmetánom. Spojené organické extrakty sú sušené pomocou bezvodého síranu horečnatého. Po prefiltrovaní sa solvent vákuovo odparí a ďalším odparením za prítomnosti toluénu vzniká extrakt, ktorý sa ďalej chromatograficky čistí.

Analýzou boli získané nasledujúce dáta:

δ'Η (270 MHz; CD₃OD): 0,91 (s, 3H, C_ls-Me), 1,40 až 2,55 (séria m, 13H), 2,90-2,92 (m, 2H) 7,04 (br d, 2H, J=10,44 Hz), 7,33 (br d, IH, J=8,42 Hz).

6¹³C (67,8 MHz; CD₃OD): 14,53 (q, C_lrMe), 22,80 (t), 27,24 (t), 27,73 (t), 30,68 (t), 33,05 (t), 37,01 (t), 39,76 (d), 45,73 (s, C₁₈), 51,86 (d), 120,76 (d), 123,54 (d), 127,89 (d), 139,83 (s), 150,27 (s), 223,87 (s, C=0).

m/z(%): 349 (9) (m⁺), 270 (100), 213 (26), 185 (43), 172 (31), 159 (21), 146 (36), 91 (33), 69 (37), 57 (73), 43 (56), 29 (24).

Mikroanalýza:	C	H	N
predpoklad	61,87%	6,63 %	4,01 %
zistené	61,90%	6,58 %	3,95 %

Príklad 2

Príprava estrón-3-N-metylsulfamátu

Postup prípravy bol rovnaký ako v príklade 1 len s tým rozdielom, že namiesto sulfamoyl chloridu bolo použité rovnaké množstvo N-metylsulfamoyl chloridu.

Analýzou boli získané nasledujúce údaje: δ*Η (270 MHz; CDC1₃): 0,91 (s, 3H, C,₈-Me), 1,28 až 1,68 (m, 6H), 1,93-2,60 (sériám, 7H), 2,90 - 2,95 (m, 2H), 2,94 (d, 3H, J=5,13 Hz, MeN-), 4,68 až 4,71 (br m, obmeniteľný, IH, -NH). 7,02 - 7,07 (m, 2H), 7,26-7,32 (m, IH).

m/z(%): 364[M+H]⁺

Príklad 3

Príprava estrón-3-N,N-dimetylsulfamátu

Postup prípravy bol rovnaký ako v príklade 1 len s tým rozdielom, že sulfamoyl chlorid bol nahradený rovnakým množstvom Ν,Ν-dimetylsulfamoyl chloridu. Analýzou boli získané nasledujúce údaje: δ’Η (270 MHz; CDC1₃): 0,92 (s, 3H, C_ls-Me), 1,39 až 1,75 (m, 5H), 1,95-2,60 (séria m, 6H), 2,82 (s, 3H MeN-), 2,96-3,0 (m, 4H), 2,98 (s, 3H, MeN-), 7,04 (br d, 2H, J=7,69 Hz), 7,29 (br d, J=7,8 8 Hz).

m/z(%): 377 [M]⁺

Mikroanalýza:	C	H	N
predpoklad	63,63 %	7,21 %	3,71 %
zistené	63,50 %	7,23 %	3,60 %

Príklad 4

Inhibícia aktivity enzýmu steroidnej sulfatázy v bunkách MCF-7 pomocou estrón-3-sulfamátu

Steroidná sulfatáza je definovaná ako sterylsulfatáza, EC 3.1.6.2.

Aktivita steroidnej sulfatázy sa meria v podmienkach in vitro v intaktných ľudských bunkách MCF-7 rakoviny prsníka. Táto línia buniek, závislých od prítomnosti hormónu, je široko používaná na štúdium kontroly bunkového rastu. Má taktiež signifikantnú aktivitu steroidnej sulfatázy (Maclndoem so spolupracovníkmi, Endocrinology 123, 1281 4

SK 282188 Β6

- 1287, 1988; Purohit a Reed, Int. J. Cancer 50, 901 až 905, 1992) a je k dispozícii vo verejnej zbierke bunkových kultúr v USA (Američan Type Culture Collection, ATCC), rovnako ako vo Veľkej Británii (The Imperiál Cancer Research Fund). Bunky sú udržované v minimálnom esenciálnom médiu (MEM, Flow Laboratories, Irvine, Scotland), obsahujúcom 20 mM HEPES, 5 % fetálne hovädzie sérum, 2 mM glutamínu, neesenciálne mastné kyseliny a 0,075 % hmotn. hydrouhličitanu sodného. Až do tridsiatej replikácie sú používané fľaštičky na tkanivové kultúry s veľkosťou 25 cm², obsahujúce približne 1 x 10⁵ bunick/fľaätičku v uvedenom médiu. Bunky sú pestované do 80 % konfluencie s výmenou média každý tretí deň.

Intaktné monomolekuláme vrstvy buniek MCF-7 z troch zmienených kultivačných fľaštičiek sa premyjú Earlovým pufŕačným roztokom (EBSS, výrobok ICN Flow, High Wycombe, Veľká Británia). Potom sú spolu s 5 pmol (7 x 10³ dpm) [6,7-³H]estrón-3-sulfátu so špecifickou aktivitou 60 Ci/mmol (New England Nuclear, Boston, Mass., USA) inkubované počas 3 až 4 hodín pri teplote 37 °C v 2,5 ml média MEM bez prídavku séra v prítomnosti estrón-3-sulfamátu v nasledujúcich koncentráciách: 0, 0,1 fM, 0,01 pM, 0,1 pM, 1 pM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 0,01 μΜ, 0,1 μΜ, 1 μΜ. Po skončení inkubácie je každá fľaštička ochladená a médium (1 ml) je napipetované do jednotlivých skúmaviek, obsahujúcich [¹⁴C]estrôn v množstve 7 x 10³ dpm so špecifickou aktivitou 97 Ci/mmol (produkt Amersham Intemational Radiochemical Centre, Amersham, Veľká Británia). Táto reakčná zmes sa počas 30 sekúnd dôkladne pretrepe s 5 ml toluénu. Je preukázané, že týmto postupom je odstránené z vodnej fázy viac než 90 % [¹⁴C]estrónu a menej než 0,1 % [³H]estrón-3-sulfátu. 2 ml organickej fázy sú odobrané a odparené na stanovenie obsahu izotopov ³H a ^l4C v zvyšnej časti pomocou scintilačnej spektrometrie. Množstvo hydrolyzovaného estrón-3-sulfátu je zistené výpočtom na základe zmeranej rádioaktivity ³H (korigované vzhľadom na množstvo média, použitú organickú fázu a výťažku pridaného [¹⁴C]estrónu) a špecifickej aktivity substrátu. Každá séria pokusov zahŕňa takisto inkubáciu mikrozómov pripravených z ľudskej placenty s pozitívnou aktivitou sulfatázy - pozitívna kontrola a inkubáciou kultivačných fľaštičiek neobsahujúcich bunky - pre odhad neenzymatickej hydrolýzy substrátu. Počet bunkových jadier v jednej fľaštičke sa stanoví na prístroji Coulter Counter po interakcii mononukleámej vrstvy buniek so saponínom. Jedna fľaštička z každej série slúži na stanovenie stavu bunkovej membrány a životnosti buniek pomocou trypanovej modrej (H. J. Phillips, Tissue culture and Application, D. F. Kruse a M. K. Patterson, editori, str. 406 - 408, Academic Press, New York, 1973).

Údaje o účinku estrón-3-sulfamátu sú uvedené v tabuľke I a na obr. č. 2 a 4. Výsledky, týkajúce sa aktivity steroidnej sulfatázy sú vyjadrené ako priemer ± 1 S. D. celkového produktu (t. j. estrón + estradiol), vzniknutého počas inkubácie (20 hodín) a vztiahnuté na 10⁶ buniek a pri hodnotách štatisticky významných, stupňom inhibície, vzniknutej počas inkubácie bez prítomnosti estrón-3-sulfamátu. Štatistická významnosť výsledkov bola hodnotená nepárovým Študentovým t-testom.

Tabuľka I

Aktivita steroidnej sulfatázy v bunkách MCF-7 za prítomnosti estrón-3-sulfamátu

koncentrácia estrón-3-sulfamátu	aktivita steroid. sulfatázy π (finol/20h/10⁶buniek)	% inhibície (% redukcie proti kontrole)
0 (kontrola)	319,7 ±18,5
1,0 fM	353,3 ± 39,0
0,01 pM	362,3 ±21,2
0,1 pM	330,7 ±17,8
1,0 pM	321,8 ± 6,2
0,01 nM	265,1 ± 11,0 *	17,2
0,1 nM	124,8 ±12,4***	60,9
1,0 nM	16,49 ± 4,7 ***	95,0
0,01 μΜ	3,92 ±0,4***	98,8
0,1 μΜ	2,53 ±1,1 ***	99,2
1,0 μΜ	1,68 ±0,7 ***	99,5

π je udané ± 1 S.D. n = 3 * p á 0,05 ***p^0,001

Príklad 5

Inhibícia aktivity steroidnej sulfatázy v bunkách MCF-7 účinkom estrón-3-N,N-dimetylsulfamátu

Výsledky, týkajúce sa estrón-N,N-dimetyl sulfamátu boli získané rovnakým postupom, aký bol opísaný v príklade 4. Len namiesto látky estrón-3-sulfamátu bol použitý estrón-3-N,N-dimetylsulfamát v koncentráciách 0, 0,001 μΜ, 0,01 μΜ, 0,1 μΜ a 1 μΜ.

Údaje o účinku estrón-3-N,N-dimetylsulfamátu sú uvedené v tabuľke II na obr. č. 3 rovnakým spôsobom, akým bola spracovaná tabuľka I a obr. č. 2. Na obr. č. 4 sú navyše porovnané krivky logaritmickej dávkovej závislosti estrón-3-sulfamátu a estrón-3-N,N-dimetylsulfamátu.

Tabuľka II

Aktivita steroidnej sulfatázy v bunkách MCF-7 za prítomnosti estrón-3-N,N-dimetylsulfamátu

koncentrácia estrón-3-Ν,Ν-dimetylsulfamátu	aktivita steroid. sulfatázy π (fmol/20h/10⁶buniek)	% inhibície (% redukcie proti kontrole)
0 (kontrola)	82,63 ± 3,6	-
0,001 μΜ	68,33 ± 3,2 **	17,3
0,01 μΜ	46,0 ±4,9***	44,3
0,1 μΜ	17,43 ±4,3 ***	78,9
1,0 μΜ	11,89 ±3,7 ♦*♦	85,6

π je udané ± 1 S.D. n = 3 **p<0,01 ***p<0,001

Príklad 6

Inhibícia aktivity steroidnej sulfatázy v bunkách MCF-7 po preinkubácii s estrón-3-sulfamátom alebo estrón-3-N,N-dimetylsulfamátom.

Obdobný postup ako v príklade 4 bol použitý pri preinkubácii buniek MCF-7 s estrón-sulfamátom a s estrón-3-N,N-dimetylsulfamátom.

Intaktné monomolekuláme vrstvy (buniek) boli najskôr inkubované počas 2 hodín pri 37 “C s 0,1 μΜ estrón-3-sulfamátom, estrón-3-N,N-dimctylsulfamátom alebo len s médiom (kontrola). Bunky potom boli z média odsaté a trikrát premyté 5 ml média. Potom boli resuspendované a inkubované 3 až 4 hodiny v médiu, ktoré obsahovalo 5 pmol (7 x 10³ dpm) [6,7‘³H]-estrón-3-sulfátu. Ďalší postup bol zhodný s postupom opísaným v príkladoch 3 a 4.

SK 282188 Β6

Údaje o účinkoch estrón-3-sulfamátu a estrón-3-Ν,Ν-dimetylsulfamátu sú uvedené v tabuľke III rovnakým spôsobom, akým bola spracovaná tabuľka I.

Tabuľka III

Aktivita steroidnej sulfatázy v bunkách MCF-7, preinkubovaných s estrón-3-sulfamátmi

Preinkubácia	aktivita steroid. sulfatázy π (fmol/20h/10⁶buniek)	% inhibície (% redukcie proti kontrole)
kontrola	65,4 ±6,4	-
estrón-3-sulfamát	1,7 ±0,2***	97,4
estrón-3-N,N-dimetylsulfamát	53,1 ±3,4*	18,8

π je udané ± 1 S.D. n = 3 *p<0,05 ***p<0,001

Príklad 7

Inhibícia aktivity steroidnej sulfatázy v mikrozómoch placenty účinkom estrón-3-sulfamátu

Ľudské placenty z normálne donosených tehotenstiev (z pôrodného oddelenia St. Mary's Hospital, Londýn) boli dôkladne rozstrihané nožnicami, premyté studeným fosfátovým pufrom (pH 7,4, 50 mM) a potom resuspendované v studenom fosfátovom pufri v pomere 5 ml/g tkaniva. Homogenizácia na Ultra Turrax homogenizéri bola vykonaná trikrát počas 10 sekúnd oddelených dvojminútovým ochladením v ľade. Jadrá a bunkové trosky boli odstránené centrifúgáciou pri 4 °C a 2000 g počas 30 minút; supematant rozdelený na 2 ml dávky bol potom uchovávaný pri -20 °C. Koncentrácia bielkovín v ňom bola stanovená metódou podľa Bradforda (Anál. Biochem. 72, 248-254, 1976).

Pri inkubáciách (v objeme 1 ml) bola používaná koncentrácia bielkovín 100 pg/ml, ako substrát 20 μΜ [6,7³H]-estrón-3-sulfát so špecifickou aktivitou 60 Ci/mmol (z New England Nuclear, Boston, Mass., USA) a čas inkubácie 20 minút pri 37 °C. Estrón-3-sulfamát bol pridávaný v ôsmich koncentráciách: 0 (t. j. kontrola), 0,05 μΜ, 0,1 μΜ, 0,2 μΜ, 0,4 μΜ, 0,6 μΜ, 0,8 μΜ a 1,0 μΜ. Po skončení inkubácie bola každá vzorka ochladená a 1 ml média bol napipctovaný do jednotlivých skúmaviek, obsahujúcich [¹⁴C]estrón (7 x 10³ dpm) so špecifickou aktivitou 97 Ci/mmol (z Amersham Intemational Radiochemical Centre, Amersham, Veľká Británia). Reakčná zmes bola počas 30 sekúnd poriadne pretrepaná s 5 ml toluénu. Pokusy ukázali, že z vodnej fázy bolo týmto postupom odstránených 90 % [^l4C]estrónu a < 0,1 % [³H]estrón-3-sulfátu. 2 ml organickej fázy boli odobrané a odparené na stanovenie obsahu ³H a ¹⁴C vo zvyšnej časti pomocou scintilačnej spektrometrie. Množstvo hydrolyzovaného estrón-3-sulfátu bolo zistené výpočtom na základe zmeranej rádioaktivity ³H (korigované vzhľadom na množstvo média, použitú organickú fázu a výťažok pridaného [¹⁴C]estrónu) a špecifickej aktivity substrátu.

Údaje o účinkoch estrón-3-sulfamátu sú uvedené v tabuľke IV a na obr. č. 5. Údaje o aktivite steroidnej sulfatázy sú v tabuľke IV vyjadrené množstvom celkového produktu (estrón a estradiol), vzniknutým počas inkubačnej doby (čas) a percentom inhibície proti kontrole, inkubovanej v neprítomnosti estrón-3-sulfemátu. Na obr. č. 5 je aktivita steroidnej sulfatázy vyjadrená percentom jej inhibície v závislosti od koncentrácie estrón-3-sulfamátu a ďalej je tu uvedená hodnota IC₅o tejto látky, rovnajúca sa 0,07 μΜ (t. j. koncentrácia, ktorá vyvolá 50 % inhibíciu reakcie).

Tabuľka IV

Aktivita steroidnej sulfatázy v mikrozómoch placenty za prítomnosti estrón-3-sulfamátu

koncentrácia estrón-3-sulfamátu	aktivita steroid. sulfatázy π (pmol/hod/0,1 mg bielk.)	% inhibície (% redukcie proti kontrole)
0 (kontrola)	768,6	-
0,05 μΜ	430,4	44,0
0,1 μΜ	305,9	60,2
0,2 μΜ	140,0	81,8
0,4 μΜ	83,3	89,2
0,6 μΜ	61,8	92,0
0,8 μΜ	49,2	93,6
1,0 μΜ	51,6	93,3

uje priemerom dvoch meraní

Príklad 8

Inhibícia aktivity steroidnej sulfatázy v jadrových mikrozómoch potkanov, ktorým bol podkožné podávaný estrón-3-sulfamát

Štyrom skupinám po troch samiciach potkanov kmeňa Wistar s hmotnosťou 80 až 110 g bolo počas siedmich dní raz denne podkožné podávaných 100 μΐ jednej z nasledujúcich látok (ako vehikulum bol použitý propylénglykol): propylén glykol (kontrola vehikula), estrón-3-sulfamát 10 mg/kg/deň, estrón-3-sulfát (10 mg/kg/deň, substrátová kontrola), estrón-3-sulfát a estrón-3-sulfamát (á 10 mg/kg/deň).

Ôsmy deň boli všetky zvieratá zabité a bola im odobraná pečeň. Príprava pečeňových mikrozómov bola rovnaká ako postup, opísaný v príklade č. 6 (okrem toho, že išlo o potkaniu pečeň), v duplicitnom stanovení aktivity steroidnej sulfatázy však bol použitý [6,7'³]estrón-3-sulfát a [7'³H]dehydroepiandrosteron-3-sulfát ako separačné substráty.

Údaje o aktivite steroidnej sulfatázy sú uvedené v tabuľke V a sú vyjadrené ako celkový produkt vzniknutý počas inkubačnej doby vo forme priemeru ±1 S. D. Výsledky inkubácií v skupinách, ktorým bol podávaný estrón-3-sulfamát, sú vyjadrené tiež percentom inhibície aktivity steroidnej sulfatázy vzhľadom na príslušné kontroly.

Tabuľka V

Aktivita steroidnej sulfatázy v potkaních pečeňových mikrozómoch po subkutánnom podaní estrón-3-sulfamátu

skupina	substrát	aktivita steroid. sulfatázy π nmol/30 min/200 Rg	% inhibície proti kontrole
kontrola	E_rS	20,95 ±0,2	-
(vehikulum) E,-SO₃NH₂	E_rS	0,34 ±0,1 ***	98,4
kontrola (E_rS)	Ej-S	20,6 ± 0,4	-
E_l-S+E₁-SO_lNH₂	E_rS	0,21 ± 0,03 ***	99,0
kontrola	DHA-S	1,73 ±0,4	-
(vehikulum) Ej-SOjNHj	DHA-S	0,1 ±0,01 ***	94,2
kontrola (E_rS)	DHA-S	1,71 ±0,1	-
ErS+ErSQNHz	DHA-S	0,09 ±0,01 ***	94,7

π je udané ± 1 S. D. n = 3 *** p < 0,001 n

E_rS = estrón-3-sulfamát

DHA-S = dehydroepiandrosteron-3-sulfamát

E_rSO₃NH₂ = estrón-3-N,N-dimetylsulfamát

Claims

1. Purifikovaná zlúčenina obsahujúca kruhový systém, ku ktorému je pripojená sulfamátová skupina vzorca kde každý z R¹ a R² je nezávisle zvolený zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, alkyl, alkenyl, cykloalkyl a aryl; kde najmenej jeden z R¹ a R² znamená atóm vodíka a kde kruhový systém obsahuje najmenej tri kruhy, z ktorých najmenej dva sú spojené;

kde je zlúčenina inhibítorom enzýmu s aktivitou steroidnej sulfatázy (E.C.3.1.6.2);

kde ak by bola sulfamátová skupina nahradená v zlúčenine sulfátovou skupinou na vytvorenie sulfátovej zlúčeniny a inkubovaná enzýmom steroidnou sulfatázou (E.C.3.1.6.2.) pri pH 7,4 a teplote 37 °C, získala by sa hodnota K_m menšia ako 50 pmol.

2. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 1, obsahujúca ako kruhový systém steroidálnu kruhovú štruktúru, ku ktorej je pripojená sulfamátová skupina vzorca o

o kde každý z R¹ a R² je nezávisle zvolený zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, alkyl, alkenyl, cykloalkyl a aryl; kde najmenej jeden z R¹ a R² znamená atóm vodíka a kde je zlúčenina inhibítorom enzýmu s aktivitou steroidnej sulfatázy (E.C.3.1.6.2);

kde ak by bola sulfamátová skupina nahradená v zlúčenine sulfátovou skupinou na vytvorenie sulfátovej zlúčeniny a inkubovaná s enzýmom steroidnou sulfatázou (E.C.3.1.6.2.) pri pH 7,4 a teplote 37 °C, získala by sa hodnota Km menšia ako 50 pmol.

3. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 2, kde steroidálnou kruhovou štruktúrou je zvyšok 3-sterolu.

4. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 3, kde sterol je zvolený zo skupiny, zahŕňajúcej estrón, dehydroepiandrosteróny, substituované estróny a substituované dehydroepiandrosteróny.

5. Purifikovaná zlúčenina podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 4, kde R¹ a R² znamenajú nezávisle atóm vodíka alebo Cj-Cio alkyl; ale kde je najmenej jeden z R¹ a R² atóm vodíka.

6. Purifikovaná zlúčenina podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 5, kde R* a R² znamenajú nezávisle atóm vodíka alebo C_rC₃ alkyl; ale kde je najmenej jeden z R¹ a R² atóm vodíka.

kde R¹ a R² sú definované v nároku 1.

11. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 10, kde skupina označovaná ako polycyklický systém je sterolový zvyšok.

12. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 2, kde zlúčeninou je zlúčenina vzorca o

o polycyklický systérr, kde polycyklický systém je sterolový zvyšok, a kde R¹ a R²znamenajú ako je definované v nároku 2.

13. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 11 alebo 12, kde sterolom je 3-sterol.

14. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 2, kde zlúčeninou je zlúčenina vzorca polycyklický systém , kde skupina označovaná ako polycyklický systém je zvyšok 3-sterolu, a kde R¹ a R² znamenajú atóm vodíka.

15. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 2, ktorou je Estrón-3 -sulfamát.

16. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 2, ktorou je Estrón-3 -N-monomety lsulfamát.

17. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 2, ktorou je Estrón-3-N,N-dimetylsulfamát.

5 výkresov

7. Purifikovaná zlúčenina podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 6, kde R¹ a R² znamenajú nezávisle atóm vodíka alebo metyl, ale kde je najmenej jeden z R¹ a R² atóm vodíka.

8. Purifikovaná zlúčenina podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 7, kde R¹ je atóm vodíka a R² je atóm vodíka.

9. Purifikovaná zlúčenina podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 8, kde zlúčeninou je ktorákoľvek zlúčenina zo skupiny estrón-3-sulfamát, estrón-3-N,N-dimetylsulfamát, estrón-3-

-N-monometylsulfamát.

10. Purifikovaná zlúčenina podľa nároku 1, kde zlúčeninou je zlúčenina vzorca