TW201410709A - 肽庫及其利用 - Google Patents
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Abstract
本發明提供肽庫。一種肽，選自於下列(1)或(2)：一種肽，選自於下列(i)或(ii)：(i)一肽，含有序列表之序列編號1表示之胺基酸序列，而且在該胺基酸序列之胺基末端側及羧基末端側的旁邊各含有由序列表之序列編號14表示之鹼基序列之鹼基編號8至42及鹼基編號43至93所編碼的胺基酸序列；及(ii)一肽，具有於前述(i)之肽擁有之胺基酸序列中，序列表之序列編號1表示之胺基酸序列之胺基末端數起1號至12號之Xaa以外之1個以上5個以下之胺基酸經保守性胺基酸取代、缺失、加成或插入而成之胺基酸序列。
Description
本發明係關於肽，該肽之衍生物，該肽或該衍生物包含之肽所對應的核苷酸，包含核苷酸之載體，導入有該載體及/或核苷酸之細胞，包含培養該細胞之步驟而成之肽或其衍生物之製造方法，包含該肽及/或其衍生物而成之肽庫，結合於標的分子之肽及/或其衍生物之鑑定方法，結合於標的分子之肽或其衍生物之製造方法，判定待檢測肽或其衍生物是否結合於標的分子之方法，包含該核苷酸而成之核苷酸庫，包含該肽或其衍生物、該核苷酸、該載體或該細胞之組成物，包含該肽或其衍生物、該核苷酸、該載體或該細胞之試藥等。
SPINK2(Serine Protease Inhibitor Kazal-type 2)係包含具有3個雙硫鍵之Kazal型區域(Kazal type domain)而構成的7kDa的蛋白質。在人活體內係於睪丸或精嚢表現，作用為胰蛋白酶/頂體酶抑制劑(trypsin/acrosin inhibitor)(非專利文獻1)。
1991年，由於Winter等人報告使用噬菌體呈現(phage display)來篩選抗體，噬菌體呈現作為完全人型抗體之創造法對於抗體醫藥開發造成了重大影響(非專
利文獻2)。近年來由於蛋白質工程的進步，使用噬菌體呈現或核糖體呈現(ribosome display)等呈現技術，已逐步積極開發非抗體支架(non-antibody scaffold)。非抗體支架也稱為工程結合(親和性)蛋白質(engineering binding(affinity)protein)等，係賦予了抗體可變區(CDR)類的結合區而得的人工蛋白質。於對於成為標的之蛋白質X有結合性且可進行蛋白質間交互作用之觀點，此外於生產性或免疫原性、組織浸潤性等觀點有其長處。期待能如Kunitz domain library(Dyax)(專利文獻1)或anticalin(Pieris)等所代表的，於科學上或產業上有所發展，但其種類尚少，希望能創造針對疾病關連分子之新穎的非抗體支架(非專利文獻3)。
專利文獻1 美國專利申請公開 US2008/0020394 A1(或日本申請公表 特表 2007-524348)
非專利文獻1 Chen T, Lee TR, Liang WG, Chang WS, Lyu PC. (2009) Identification of trypsin-inhibitory site and structure determination of human SPINK2 serine proteinase inhibitor. Proteins. 77(1): 209-19.
非專利文獻2 James D. Marks, Hennie R. Hoogenboom, Timothy P. Bonnert, John McCafferty, Andrew D.
Griffiths, Greg Winter (1991) By-passing immunization: Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol. 222(3): 581-97.
非專利文獻3 Skerra A. (2007) Alternative non-antibody scaffolds for molecular recognition. Curr Opin Biotechnol. 18: 295-304.
本案發明人等針對SPINK2及其變異體努力探討，結果藉由製作包含對於SPINK2之內在性標的以外之分子顯示高結合活性之肽的庫，並且從該庫將對於內在性標的以外之標的分子顯示高結合活性之肽單離等而完成了本發明。
本發明，例如係關於下列事項但不限於此等：[1]一種肽，係選自於下列(i)或(ii)：(i)一肽，包含如以下的胺基酸序列：序列表之序列編號14中包含第43位鹼基之胸腺嘧啶至第93位之胸腺嘧啶而構成之鹼基序列置換為編碼序列表之序列編號1表示之胺基酸序列的鹼基序列而成的鹼基序列所編碼之胺基酸序列；及(ii)如(i)之肽，具有如以下的胺基酸序列：序列表之序列編號1表示之胺基酸序列之胺基酸編號2至8及10至14以外之1個以上5個以下之胺基酸經過胺基酸取代、缺失、加成及/或插入而成之胺基酸序列。
[2]如[1]之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起1位至5位、7位、9位及10位之Xaa各為排除半胱胺酸及脯胺酸之任意之胺基酸。
[3]如[1]或[2]之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起6位及8位之Xaa各為排除半胱胺酸之任意之胺基酸。
[4]如[1]至[3]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起11位之Xaa係選自於由酪胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸、白胺酸及蘇胺酸構成之群組中之胺基酸。
[5]如[1]至[4]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起12位之Xaa係選自於由天冬醯胺酸、天冬胺酸、白胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸及麩胺酸構成之群組中之胺基酸。
[6]如[1]至[5]中任一項之肽，其中保守性胺基酸取代係於選自於疏水性胺基酸群組、中性親水性胺基酸群組、酸性胺基酸群組、鹼性胺基酸群組、影響主鏈方位之胺基酸之群組、及芳香族胺基酸群組中之任一群內進行。
[7]如[1]至[6]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起1位之Xaa係選自於由精胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、色胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸。
[8]如[1]至[7]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起2位之Xaa係選自於由蘇胺酸、精胺酸、色胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸。
[9]如[1]至[8]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起3位之Xaa係選自於由精胺酸、組胺酸、色胺酸、絲胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸。
[10]如[1]至[9]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起4位之Xaa係選自於由色胺酸、精胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸。
[11]如[1]至[10]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起5位之Xaa係選自於由甘胺酸、精胺酸、白胺酸、組胺酸、色胺酸、甲硫胺酸及酪胺酸構成之群組中之胺基酸。
[12]如[1]至[11]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起6位之Xaa係選自於由天冬醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、離胺酸、色胺酸、精胺酸及天冬胺酸構成之群組中之胺基酸。
[13]如[1]至[12]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起7位之Xaa係選自於由精胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、白胺酸、丙胺酸及甘胺酸構成之群組中之胺基酸。
[14]如[1]至[13]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起8位之Xaa係選自於由蘇胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸。
[15]如[1]至[14]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起9位之Xaa係選自於由色
胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸。
[16]如[1]至[15]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起10位之Xaa係選自於由麩醯胺酸、纈胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、白胺酸及天冬醯胺酸構成之群組中之胺基酸。
[17]如[1]至[16]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起11位之Xaa係選自於由酪胺酸、苯丙胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸。
[18]如[1]至[17]中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起12位之Xaa為離胺酸。
[19]如[1]至[18]中任一項之肽，包含序列表之序列編號2至9(第12圖之肽編號1、2、6、7、12至14及17)中任一者表示之胺基酸序列。
[20]一種肽之衍生物，係對於如[1]至[19]中任一項之肽施以化學性修飾及/或生物學性修飾而成。
[21]一種核苷酸，係下列(i)至(iii)中任一者：(i)包含由編碼如[1]至[19]中任一項之肽具有之胺基酸序列之鹼基序列構成之核苷酸而成的核苷酸；(ii)包含編碼如[1]至[19]中任一項之肽具有之胺基酸序列之鹼基序列而成之核苷酸；及、(iii)由編碼如[1]至[19]中任一項之肽具有之胺基酸序列的鹼基序列構成的核苷酸。
[22]一種載體，係包含如[21]之核苷酸而成。
[23]一種細胞，係導入有如[21]之核苷酸或如[22]之載體。
[24]一種肽之製造方法，係製造如[1]至[19]中任一項之肽，包含下列步驟(i)及(ii)而成：(i)培養如[23]之細胞；及(ii)從步驟(i)獲得之培養物回收該肽。
[25]一種肽庫，係包含如[1]至[19]中任一項之肽及/或如[20]之肽之衍生物而成。
[26]如[25]之肽庫，其中肽及/或肽之衍生物係依照如[24]之包含步驟(i)及(ii)而成之方法製備者。
[27]如[25]或[26]之肽庫，其中於庫中，係表現型(phenotype)之該肽或肽衍生物及係對應於該表現型之基因型(genotype)的核苷酸直接或間接地連結。
[28]如[27]之肽庫，其中核苷酸係如[21]之核苷酸。
[29]如[25]至[28]中任一項之肽庫，其係噬菌體呈現庫、核糖體呈現庫或核酸呈現庫。
[30]一種肽或肽衍生物之鑑定方法，係與標的分子結合之如[1]至[19]中任一項之肽或如[20]之肽衍生物之鑑定方法，包含下列(i)及(ii)之步驟而成：(i)使如[25]至[29]中任一項之肽庫所含之肽或肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)回收結合於該標的分子之肽或肽衍生物。
[31]一種肽或肽衍生物之製造方法，係與標的分子結合之如[1]至[19]中任一項之肽或如[20]之肽衍生物之製造方法，包含下列(i)至(iii)之步驟而成：
(i)使如[25]至[29]中任一項之肽庫所含之肽或肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)回收結合於該標的分子之肽或肽衍生物；及、(iii)利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備於該(ii)回收之該肽或肽衍生物所含之結合於該標的分子之肽。
[32]一種肽或肽衍生物之判定方法，係如[1]至[19]中任一項之肽或如[20]之肽衍生物是否會與標的分子結合之判定方法，包含下列(i)及(ii)之步驟而成：(i)使如[1]至[19]中任一項之待檢測肽或如[20]之待檢測肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)當待檢測肽或待檢測肽衍生物結合於該標的分子的情形，確定該肽或待檢測肽衍生物係陽性。
[33]一種肽或肽衍生物之製造方法，係結合於標的分子之如[1]至[19]中任一項之肽或如[20]之肽之衍生物之製造方法，包含下列(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如[1]至[19]中任一項之待檢測肽或如[20]之待檢測肽衍生物與該標的分子接觸；(ii)當待檢測肽或待檢測肽衍生物結合於該標的分子的情形，確定該肽或待檢測肽衍生物係陽性；及(iii)於步驟(ii)中判定待檢測肽或肽衍生物係陽性的情形，利用基因重組或體外轉譯製備該肽或肽衍生物所含之結合於標的分子之肽。
[34]一種核苷酸庫，係包含如[21]之核苷酸而成。
[35]如[34]之核苷酸庫，其中核苷酸係噬粒(phagemid)、黏質體(cosmid)或質體或或其片段。
[36]如[34]或[35]之核苷酸庫，其中核苷酸存在於原核或真核細胞內、或病毒DNA或RNA上、或病毒粒子中。
[37]一種組成物，其包含：如[1]至[19]中任一項之肽、如[20]之肽之衍生物、如[21]之核苷酸、如[22]之載體或如[23]之細胞。
[38]一種試藥，其包含：如[1]至[19]中任一項之肽、如[20]之肽之衍生物、如[21]之核苷酸、如[22]之載體或如[23]之細胞。
[39]如[1]至[19]中任一項之肽、或如[20]之肽之衍生物，其係結合於預先確定的標的分子。
[40]如[39]之肽或肽之衍生物，其中標的分子並非SPINK2之內在性標的。
[41]如[39]或[40]之肽或肽之衍生物，其中標的分子係來自於人。
[42]如[39]至[41]中任一項之肽或肽之衍生物，其中內在性標的為胰蛋白酶及/或頂體酶。
[43]如[39]至[42]中任一項之肽或肽之衍生物，其中內在性標的為胰蛋白酶。
[44]一種組成物或試藥，包含如[39]至[43]中任一項之肽或肽之衍生物。
[45]一種肽或肽衍生物之鑑定方法，係結合於胰蛋白酶及/或頂體酶以外之絲胺酸蛋白酶且抑制該
絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性之如[1]至[19]中任一項之肽或如[20]之肽衍生物之鑑定方法，包含下列(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如[25]至[29]中任一項之肽庫所含之肽或肽衍生物與該絲胺酸蛋白酶接觸；(ii)回收結合於該絲胺酸蛋白酶之肽或肽衍生物；及(iii)當該肽或肽衍生物抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性的情形，判定該肽或肽衍生物為陽性。
[46]一種肽或肽衍生物之製造方法，係結合於胰蛋白酶及/或頂體酶以外之絲胺酸蛋白酶且抑制其蛋白質分解活性之如[1]至[19]中任一項之肽或如[20]之肽衍生物之製造方法，包含下列(i)至(iv)之步驟而成：(i)使如[25]至[29]中任一項之肽庫所含之肽或肽衍生物與該絲胺酸蛋白酶接觸；(ii)回收結合於該絲胺酸蛋白酶之肽或肽衍生物；及(iii)當於步驟(ii)回收之肽或肽衍生物抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性的情形，判定該肽或肽衍生物為陽性；及(iv)利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備於步驟(iii)判定為陽性之肽或肽衍生物所含之抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性之肽。
[47]一種肽或肽衍生物之判定方法，係如[1]至[19]中任一項之肽或如[20]之肽之衍生物是否會抑制胰蛋白酶及/或頂體酶以外之絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性之判定方法，包含下列(i)及(ii)之步驟而成：
(i)使如[1]至[19]中任一項之待檢測肽或如[20]之待檢測肽衍生物與該絲胺酸蛋白酶接觸；及(ii)當該肽或肽衍生物抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性的情形，判定該肽或肽衍生物為陽性。
[48]一種肽或肽衍生物之製造方法，係抑制胰蛋白酶及/或頂體酶以外之絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性之如[1]至[19]中任一項之肽或如[20]之肽之衍生物之製造方法，包含下列(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如[1]至[19]中任一項之待檢測肽或如[20]之待檢測肽衍生物與該絲胺酸蛋白酶接觸；(ii)當該肽或肽衍生物抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性的情形，判定該肽或肽衍生物為陽性；及(iii)利用基因重組或體外轉譯製備於步驟(ii)判定為陽性之肽或肽衍生物所含之抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性之肽。
[49]一種肽，選自下列(i)或(ii)：(i)一肽，包含序列表之序列編號1表示之胺基酸序列且係下列(1)至(4)之肽：(1)序列表之序列編號1之胺基末端數起1位至5位、7位、9位及10位之Xaa各為排除半胱胺酸及脯胺酸之任意胺基酸、(2)序列表之序列編號1之胺基末端數起6位及8位之Xaa各為排除半胱胺酸之任意胺基酸、
(3)序列表之序列編號1之胺基末端數起11位之Xaa係選自於由酪胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸、白胺酸及蘇胺酸構成之群組中之胺基酸、(4)序列表之序列編號1之胺基末端數起12位之Xaa係選自於由天冬醯胺酸、天冬胺酸、白胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸及麩胺酸構成之群組中之胺基酸；及、(ii)一肽，包含序列表之序列編號1表示之胺基酸序列中從胺基末端數起1位至12位之Xaa以外之1個以上5個以下之胺基酸經過保守性胺基酸取代、缺失、加成及/或插入而成之胺基酸序列。
[50]如[49]之肽，其中保守性胺基酸取代係於選自於疏水性胺基酸群組、中性親水性胺基酸群組、酸性胺基酸群組、鹼性胺基酸群組、影響主鏈方位之胺基酸之群組、及芳香族胺基酸群組中之任一群組內進行。
[51]如[49]或[50]之肽，且係下列(1)至(12)之肽：(1)序列表之序列編號1之胺基末端數起1位之Xaa係選自於由精胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、色胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸、(2)序列表之序列編號1之胺基末端數起2位之Xaa係選自於由蘇胺酸、精胺酸、色胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸、(3)序列表之序列編號1之胺基末端數起3位之Xaa係選自於由精胺酸、組胺酸、色胺酸、絲胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸、
(4)序列表之序列編號1之胺基末端數起4位之Xaa係選自於由色胺酸、精胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸、(5)序列表之序列編號1之胺基末端數起5位之Xaa係選自於由甘胺酸、精胺酸、白胺酸、組胺酸、色胺酸、甲硫胺酸及酪胺酸構成之群組中之胺基酸、(6)序列表之序列編號1之胺基末端數起6位之Xaa係選自於由天冬醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、離胺酸、色胺酸、精胺酸及天冬胺酸構成之群組中之胺基酸、(7)序列表之序列編號1之胺基末端數起7位之Xaa係選自於由精胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、白胺酸、丙胺酸及甘胺酸構成之群組中之胺基酸、(8)序列表之序列編號1之胺基末端數起8位之Xaa係選自於由蘇胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸、(9)序列表之序列編號1之胺基末端數起9位之Xaa係選自於由色胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸、(10)序列表之序列編號1之胺基末端數起10位之Xaa係選自於由麩醯胺酸、纈胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、白胺酸及天冬醯胺酸構成之群組中之胺基酸、(11)序列表之序列編號1之胺基末端數起11位之Xaa係選自於由酪胺酸、苯丙胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸、
(12)序列表之序列編號1之胺基末端數起12位之Xaa為離胺酸。
[52]一種肽之衍生物，係對於如[49]至[51]中任一項之肽施以化學性修飾及/或生物學性修飾而成。
[53]如[49]至[51]中任一項之肽或如[52]之肽之衍生物，係結合於預先確定之標的分子。
[54]如[53]之肽或肽之衍生物，其中標的分子並非SPINK2之內在性標的。
依本發明能提供對於挑選結合於理想之標的分子的肽為有用的肽庫。
第1圖係以ELISA法確認將從針對標的分子之α-胰凝乳蛋白酶(α-chymotrypsin)之淘選獲得之SPINK2變異體(多選殖體)展現於噬菌體並與該標的分子結合之圖。陰性對象之分子係使用BSA。
第2圖係以ELISA法確認將從針對標的分子之血漿激肽釋放酶(plasma kallikrein)之淘選獲得之SPINK2變異體(多選殖體)展現於噬菌體並與該標的分子結合之圖。陰性對象之分子係使用BSA。
第3圖係以ELISA法確認將從針對標的分子之hEGFR/Fc之淘選獲得之SPINK2變異體(多選殖體)展現於噬菌體並與該標的分子結合之圖。陰性對象之分子係使用BSA。
第4圖係以ELISA法確認將從針對標的分子之hHER2/Fc之淘選獲得之SPINK2變異體(多選殖體)展現於噬菌體並與該標的分子結合之圖。陰性對象之分子係使用BSA。
第5圖係分析於大腸菌表現精製而得之α-胰凝乳蛋白酶結合肽(單一選殖體)之分子狀態為還原狀態下之SDS-PAGE之圖。
第6圖係分析於大腸菌表現精製而得之α-胰凝乳蛋白酶結合肽(單一選殖體)之分子狀態為非還原狀態下之SDS-PAGE之圖。
第7圖係以ELISA法定量地測定於大腸菌表現精製之8種α-胰凝乳蛋白酶結合肽之結合親和性。
第8圖係以ELISA法定量地測定於大腸菌表現精製之α-胰凝乳蛋白酶結合肽編號2及6(選殖體2及6)之結合親和性之圖。
第9圖係以ELISA法確認於大腸菌表現精製之α-胰凝乳蛋白酶結合肽編號2(選殖體2)之標的專一性之圖。
第10圖係以ELISA法確認於大腸菌表現精製之α-胰凝乳蛋白酶結合肽編號6(選殖體6)之標的專一性之圖。
第11圖係定量地測定於大腸菌表現精製之α-胰凝乳蛋白酶結合肽編號2及6(選殖體2及6)之胰凝乳蛋白酶抑制活性之圖。
第12圖係8種SPINK2變異體(α-胰凝乳蛋白酶結合肽編號1、2、6、7、12至14及17)之隨機區之胺基酸序列(序列編號2至9)。
第13圖係伴隨多樣性之肽之隨機區之胺基酸序列(序列編號1)。胺基酸編號2至8及10至14代表任意之胺基酸。
第14圖係片段1之鹼基序列(序列編號10)
第15-1圖係pCANTAB 5E之鹼基序列(下接第15-2圖)
第15-2圖係pCANTAB 5E之鹼基序列(底線部與序列編號11相同且為「片段2」之鹼基序列：下接第15-3圖)
第15-3圖係pCANTAB 5E之鹼基序列(下接第15-4圖)
第15-4圖係pCANTAB 5E之鹼基序列
第16圖係片段3之鹼基序列(序列編號12)
第17圖係片段5之鹼基序列(序列編號13)
第18圖係編碼SPINK2之胺基酸序列的鹼基序列(序列編號14)
第19圖係由第18圖記載之鹼基序列所編碼之胺基酸序列(序列編號15)
第20-1圖係包含片段1~片段5之PCR用模板DNA之鹼基序列(序列編號16：下接第20-2圖)
第20-2圖係包含片段1~片段5之PCR用模板DNA之鹼基序列(序列編號16：接續)
本發明提供肽、肽衍生物、肽庫、核苷酸、載體、細胞、肽及/或其衍生物之製造方法、具有理想性質之肽及/或其衍生物之鑑定方法、具有理想性質之肽及/或其衍生物之製造方法、判定待檢測肽或其衍生物是否結合於標的分子之方法、核苷酸庫、組成物、試藥等。以下敘述本發明之各種型態，但本發明之型態不限定於該等。
本發明提供肽。
本發明之「肽」之含意，也包含「多肽」、「蛋白質」。又本發明中，該「肽」之含意也包含「肽之衍生物所包含之肽」。
本發明之一型態中，肽具有序列表之序列編號1表示之胺基酸序列。該肽所具有且以序列編號1表示之胺基酸序列中，自胺基末端數起1位至12位之Xaa各為任意之胺基酸，但較佳為排除半胱胺酸之任意之胺基酸。
本發明之更理想的型態中，本發明之肽擁有之胺基酸序列所含之序列表之序列編號1表示之胺基酸序列中，胺基末端數起1至5位、7位、9位及10位之Xaa(各相當於序列編號1之2至6位、8位、11位及12位之胺基酸)係排除半胱胺酸及脯胺酸之任意之胺基酸；胺基末端數起6位及8位之Xaa(各相當於序列編號1之7位及10位之胺基酸)係排除半胱胺酸之任意之胺基
酸；胺基末端數起11位之Xaa(相當於序列編號1之13位之胺基酸)係選自於由酪胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸、白胺酸及蘇胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起12位之Xaa(相當於序列編號1之14位之胺基酸)，係選自於由天冬醯胺酸、天冬胺酸、白胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸及麩胺酸構成之群組中之胺基酸；又，自胺基末端數起1位至12位之Xaa，也可為選自於本段落記載之各群組中的胺基酸經保守性胺基酸取代而得者(在本發明之其他部分將詳述)。
本發明之更理想型態中，本發明之肽擁有之胺基酸序列所含之序列表之序列編號1表示之胺基酸序列中，胺基末端數起1位之Xaa(相當於序列編號1之2位之胺基酸)，係選自於由精胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、色胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起2位之Xaa(相當於序列編號1之3位之胺基酸)，係選自於由蘇胺酸、精胺酸、色胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起3位之Xaa(相當於序列編號1之4位之胺基酸)，係選自於由精胺酸、組胺酸、色胺酸、絲胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起4位之Xaa(相當於序列編號1之5位之胺基酸)，係選自於由色胺酸、精胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起5位之Xaa(相當於序列編號1之6位之胺基酸)，係選自於由甘胺酸、精胺酸、白胺酸、組胺酸、色胺酸、甲硫胺酸及酪胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起6位之Xaa(相當於序列編號1之7位之胺
基酸)，係選自於由天冬醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、離胺酸、色胺酸、精胺酸及天冬胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起7位之Xaa(相當於序列編號1之8位之胺基酸)，係選自於由精胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、白胺酸、丙胺酸及甘胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起8位之Xaa(相當於序列編號1之10位之胺基酸)，係選自於由蘇胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起9位之Xaa(相當於序列編號1之11位之胺基酸)，係選自於由色胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起10位之Xaa(相當於序列編號1之12位之胺基酸)，係選自於由麩醯胺酸、纈胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、白胺酸及天冬醯胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起11位之Xaa(相當於序列編號1之13位之胺基酸)，係選自於由酪胺酸、苯丙胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸；胺基末端數起12位之Xaa(相當於序列編號1之14位之胺基酸)係離胺酸；又，胺基末端數起1位至12位之Xaa也可為選自於本段落記載之各群組中的胺基酸經保守性胺基酸取代而得者(在本發明之其他部分將詳述)。
再者，本發明之某理想的型態中，本發明之肽除了序列表之序列編號1表示之胺基酸序列以外，也可於該胺基酸序列之胺基末端側直接或夾著1或2個以上之任意胺基酸而包含序列表之序列編號14之第1位鹼基即鳥嘌呤或第4位鹼基即胞嘧啶至第42位鹼基即胸腺
嘧啶構成之鹼基序列所編碼的胺基酸序列，於羧基末端側直接或夾著1或2個以上之任意胺基酸而包含序列表之序列編號14之第94位鹼基即鳥嘌呤至189位鹼基即胞嘧啶構成之鹼基序列所編碼的胺基酸序列。該肽擁有之胺基酸序列中，由序列表之序列編號14之第1位鹼基即鳥嘌呤至第3位鹼基即胸腺嘧啶編碼之天冬胺酸，也可不含於其對應位置。又，該肽擁有之胺基酸序列也可更含有其他任意之胺基酸序列。此類肽，例如：後述實施例1製備之隨機變異SPINK2庫所含之肽、從該庫於實施例3挑選並將隨機區之胺基酸序列定序的肽等，但不限定於此等。
又，本發明之某型態中，肽擁有之胺基酸序列所含之序列表之序列編號1表示之胺基酸序列之胺基末端數起1位至12位之Xaa以外之胺基酸，也可經取代、缺失、加成及/或插入。於此胺基酸序列中，序列表之序列編號1表示之胺基酸序列或該序列所對應之胺基酸序列之胺基末端數起1位至12位之Xaa以外之取代、缺失、加成及/或插入的胺基酸之數目，為1個以上10個以下即可，下限為1個。上限為10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個，最小為1個。此胺基酸之取代宜為保守性胺基酸取代。
此胺基酸序列中，序列編號1表示之胺基酸序列或該序列所對應之胺基酸序列之胺基末端數起1位至12位之Xaa，各為任意之胺基酸，宜為排除半胱胺酸之任意胺基酸，更理想為從前述各群選擇之胺基酸、或該胺基酸經保守性胺基酸取代而得者。
「保守性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」，係意指取代為在機能方面為等價或類似之胺基酸。肽的保守性胺基酸取代，會對於該肽之胺基酸序列帶來靜態的變化。例如具有同樣極性的一個或二個以上之胺基酸在機能方面等價地作用，並對於該肽之胺基酸序列帶來靜態的改變。一般而言，在某群組內之取代可認為關於構造及機能為有保守性。然而，如該技術領域中具有通常知識者所明白，特定之胺基酸殘基發揮的作用可從含有該胺基酸之分子之三維構造中推敲確定。例如半胱胺酸殘基，比起還原型(硫醇)形式的極性低，可採氧化型(二硫化物)形式。精胺酸側鏈之長脂肪族的部分，會在構造面及機能面構成重要特徵。又，包含芳香環之側鏈(色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸)可貢獻於離子-芳香族交互作用或陽離子-pi交互作用。於該情形，具有該等側鏈之胺基酸即使取代為屬於酸性或非極性群組之胺基酸，也能在構造面及機能面有保守性。脯胺酸、甘胺酸、半胱胺酸(二硫化物形式)等殘基可對於主鏈之立體構造提供直接的效果，故常常無法在構造上無變形地取代。
保守性胺基酸取代如以下所示，包含基於側鏈類似性之專一性的取代(Lehninger，生化學、修訂第2版、1975年發行、73至75頁：L.Lehninger,Biochemistry,2nd edition,pp73-75,Worth Publisher,New York(1975))及典型的取代。
(1)非極性胺基酸群組：丙胺酸(以下記載為「Ala」或簡化記載為「A」)、纈胺酸(以下記載為「Val」或簡化記載為「V」)、白胺酸(以下記載為「Leu」或簡化記載為「L」)、異白胺酸(以下記載為「Ile」或簡化記載為「I」)、脯胺酸(以下記載為「Pro」或簡化記載為「P」)、苯丙胺酸(「Phe」或簡化記載為「F」)、色胺酸(以下記載為「Trp」或簡化記載為「W」)、甲硫胺酸(以下記載為「Met」或簡化記載為「M」)
(2)非帶電極性胺基酸群組：甘胺酸(以下記載為「Gly」或簡化記載為「G」)、絲胺酸(以下記載為「Ser」或簡化記載為「S」)、蘇胺酸(以下記載為「Thr」或簡化記載為「T」)、半胱胺酸(以下記載為「Cys」或簡化記載為「C」)、酪胺酸(以下記載為「Tyr」或簡化記載為「Y」)、天冬醯胺酸(以下記載為「Asn」或簡化記載為「N」)、麩醯胺酸(以下記載為「Gln」或簡化記載為「Q」)
(3)酸性胺基酸群組：天冬胺酸(以下記載為「Asp」或簡化記載為「D」)、麩胺酸(以下記載為「Glu」或簡化記載為「E」)
(4)鹼性胺基酸群組：離胺酸(以下記載為「Lys」或簡化記載為「K」)、精胺酸(以下記載為「Arg」或簡化記載為「R」)、組胺酸(以下記載為「His」或簡化記載為「H」)
又，天然界存在的胺基酸，依據其共通的側鏈的性質可區分為如下的群組。
(1)疏水性胺基酸群組：正白胺酸(Norleucine)、Met、Ala、Val，Leu，Ile
(2)中性親水性胺基酸群組：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性胺基酸群組：Asp、Glu
(4)鹼性胺基酸群組：His、Lys、Arg
(5)影響/主鏈之方位的胺基酸的群組：Gly、Pro
(6)芳香族胺基酸群組：Trp、Tyr、Phe
以下舉保守性取代之例，但本發明之保守性胺基酸取代不限於此等。
Ala可取代為例如：Val，Leu、Ile、Met、正白胺酸、Pro、Phe、Trp。
Arg可取代為例如：Lys、His。
Asn可取代為例如：Cys、Ser、Thr、Gln、Tyr、Gly。
Asp可取代為例如：Glu。
Cys可取代為例如：Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln。
Gln可取代為例如：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn。
Glu可取代為例如：Asp。
Gly可取代為例如：Ser、Cys、Thr、Tyr、Asn、Gln、Pro、Asp、Glu。
His可取代為例如：Lys、Arg。
Ile可取代為例如：Leu、Val、Met、Pro、Ala、Phe、Trp、正白胺酸。
Leu可取代為例如：正白胺酸、Ile、Val、Pro、Met、Ala、Phe、Trp、Met
Lys可取代為例如：Arg、His。
Met可取代為例如：Ala、Val、Leu、Phe、Ile、Pro、Trp、正白胺酸。
正白胺酸可取代為例如：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp。
Phe可取代為例如：Trp、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr、Pro、Met。
Pro可取代為例如：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Gly。
Ser可取代為例如：Thr、Cys、Asn、Gln、Gly、Tyr。
Thr可取代為例如：Val、Ser、Gly、Cys、Tyr、Asn、Gln。
Trp可取代為例如：Tyr、Phe、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met。
Tyr可取代為例如：Gly、Cys、Asn、Gln、Trp、Phe、Thr、Ser。
Val可取代為例如：Ile、Leu、Met、Trp、Phe、Ala、正白胺酸、Pro。
具有包含該胺基酸而構成之胺基酸序列之本發明之肽具有之胺基酸序列所含之胺基酸序列(針對序列表之序列編號1表示之胺基酸序列：隨機區)之例，可列舉如以下者，但本發明之肽具有之胺基酸序列不限定於該等。
CRTRW GNRCT WQYKP VC(序列表之序列編號2：第12圖之α-胰凝乳蛋白酶結合肽1號)
CMRHR RHFCT MVYKP VC(序列表之序列編號3：第12圖之α-胰凝乳蛋白酶結合肽2號)
CRRWL LPWCT YKYKP VC(序列表之序列編號4：第12圖之α-胰凝乳蛋白酶結合肽6號)
CLWRR HKLCP FKFKP VC(序列表之序列編號5：第12圖之α-胰凝乳蛋白酶結合肽7號)
CWRSW RWACP YMYKP VC(序列表之序列編號6：第12圖之α-胰凝乳蛋白酶結合肽12號)
CWFFR WRWCN WALKP VC(序列表之序列編號7：第12圖之α-胰凝乳蛋白酶結合肽13號)
CSTWR MWGCP WLYKP VC(序列表之序列編號8：第12圖之α-胰凝乳蛋白酶結合肽14號)
CWRRW YDRCS FNLKP VC(序列表之序列編號9：第12圖之α-胰凝乳蛋白酶結合肽17號)
本發明中，胺基酸為L-胺基酸、D-胺基酸、或其混合物(DL-胺基酸)，但若無明確特別記載時，意指L-胺基酸。
又，本發明中，胺基酸也可為上述以外之胺基酸(以下簡便上總稱為「異常胺基酸」。)。異常胺基酸，例如在天然肽或蛋白質中發現的硒代半胱胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、焦離胺酸、焦麩胺酸、胱胺酸、羥基脯胺酸、羥基離胺酸、甲狀腺素、O-磷酸絲胺酸、鎖鏈素(dsmosine)、β-丙胺酸、肌胺酸、鳥胺酸、肌酸、γ胺基丁酸、冠癭鹼(opine)、茶胺酸(theanine)、口蘑氨酸(tricholomic acid)、紅藻胺酸(kinic acid)、軟骨藻酸
(domoic acid)、肢端酸(acromelic acid)等，非天然胺基酸可舉例如：Ac-胺基酸、Boc-胺基酸、Fmoc-胺基酸、Trt-胺基酸、Z-胺基酸等N末端保護胺基酸、胺基酸第三丁酯、苄酯、環己酯、茀酯等C末端保護胺基酸、二胺、ω胺基酸、β胺基酸、γ胺基酸、胺基酸之Tic衍生物、包含胺基膦酸之其他胺基酸等，但不限於該等。
本發明之肽可以化學合成、基因重組、體外轉譯等就製造肽或蛋白質之方法而言為該技術領域中具有通常知識者所周知之方法製備。又，由本發明之庫等鑑定或挑選之肽也可依照此等方法製備。
化學合成法，例如第三丁氧基羰基(t-Butoxycarbonyl：Boc)法、9-茀基甲氧基羰基(9-Fluorenylmethoxycarbonyl：Fmoc)法等，但不限於該等。Fmoc法具有脫保護條件溫和，且從樹脂切出肽係簡便等優點(Fmoc solid phase peptide synthesis：a practical approach,ed.by W.C.Chan,P.D.White Eds.,Oxford University Press,New York,2000.)。
本發明中，「肽之衍生物」及「肽衍生物」係指對於本發明之肽施以化學性修飾或生物學性修飾而成者。化學性修飾，係指於本發明之肽中或肽上，利用化學反應，亦即原子-原子間之鍵結之生成或切斷，使變化為與原本肽為不同的物質。生物學的修飾，係指於本發明之肽中或肽上，利用生物學的反應，亦即使用來自於生物的蛋白質(酵素、細胞激素(cytokine)等)、核酸(核糖酶(ribozyme)等)、細胞、組織、器官或非人類個體，
或該等直接的或間接的作用，而產生與原本肽為不同之物質。
該「衍生物」只要是與原本肽不同之物質即可，不特別限定，例如包含天然產生之糖鏈或人工創造之糖鏈者，含有聚乙二醇(PEG)等聚合物者，含有合成化合物或天然化合物者，經標記者，含有對於固相化為必要之部分者，於胺基末端側連結有訊息肽者，包含精製或單離時利用之標籤(tag)者，從適於呈現、淘選、表現等的載體而來的胺基酸或胺基酸序列，為了避免移碼(frameshift)或用於導入限制酶部位而改變編碼該肽之鹼基序列因而產生之胺基酸或胺基酸序列，及表現型肽及該表現型所對應之基因型直接或間接連結者，以及此等當中二種以上組合而成者等。
本發明之肽衍生物，可以本發明之肽當作原料，利用化學反應、生化學反應、轉譯後修飾等就將肽或蛋白質進行化學性或生物學性修飾之方法而言為該技術領域中具有通常知識者為周知的方法製備。又，從本發明之庫等鑑定或挑選之肽之衍生物，也可利用此等方法製備。又，即使利用使用具有理想之轉譯後修飾能力之細胞的基因重組，也能製備有實施該轉譯後修飾之本發明之肽衍生物。再者，藉由於體外轉譯系統添加修飾胺基酸，可製備包含該修飾胺基酸之本發明之肽衍生物。
PEG化之方法，可舉例如使肽或蛋白質與N-Hydroxysuccimide Ester(NHS)-PEG反應之方法等，但不限於此方法。
本發明之肽及其衍生物其較佳型態係結合於標的分子(詳細記載於本發明之他處)。與預先確定之標的分子結合之本發明之肽，作為該標的分子可成為標記之各種疾病之檢查用試藥等為有用。如前述，本發明中包含具有肽擁有之胺基酸序列所含之序列表之序列編號1表示之胺基酸序列之胺基末端數起1位至12位之Xaa以外1至數個(數個為1至10個的任意的整數個)之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入而成的胺基酸序列的肽，但該肽於其理想的型態與標的分子結合且此標的分子係預先確定較佳。
本發明之肽及其衍生物可採之形態，例如單離的形態(冷凍乾燥配製品、溶液等)、結合於其他分子之形態(經固相化之形態、融合蛋白質、與異分子之組合體、結合於標的分子之形態等)、也包含其他肽等之物理性集合(包含本發明之肽庫)、在細胞表面上(大腸桿菌或酵母之細胞表面上等)表現或展現(與呈現同義)之形態(包含本發明之細胞)、在病毒粒子上表現或展現(與呈現同義)之形態等，但不限於此等，可任意選擇適於使用、保存等目的之形態。
本發明提供核苷酸。
本發明中，「核苷酸」為單核苷酸、寡核苷酸或聚核苷酸，也稱為「核酸」、「核酸分子」或「基因」。本發明之核苷酸，可舉例如DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA、探針、寡核苷酸、聚核苷酸、引子、載體等，但
不限於此等。又，本發明之核苷酸也可為單股核苷酸、雙股核苷酸及三股以上之核苷酸之組合體中任一者，也包含有：包含DNA及RNA而構成的雜合式單股核苷酸、包含該核苷酸與其互補鏈而構成之雙股、包含單股DNA及單股RNA而構成之雜合式雙股、雙股RNA、分子內可具有雙股構造部分之單股核苷酸等。再者，本發明之核苷酸也可含有天然產生的鹼基或單核苷酸以外之(人工所創造出之)鹼基或單核苷酸一或二種以上。
本發明之較佳核苷酸，例如：包含由編碼本發明之肽具有之胺基酸序列的鹼基序列而構成的核苷酸而成的核苷酸、包含編碼本發明之肽具有之胺基酸序列的鹼基序列而成的核苷酸等。該較佳核苷酸，也可包含編碼本發明之肽具有之胺基酸序列的鹼基序列以外之鹼基序列及/或非核苷酸部分，也可施以化學性或生物學性修飾(記載於本發明之其他部分)。此等都包含在「核苷酸」。
又，本發明之核苷酸，也包含由編碼為本發明之肽具有之胺基酸序列的鹼基序列而構成的核苷酸。
本發明中，當本發明之肽具有之胺基酸序列係由某核苷酸之鹼基序列的一部分或全部所編碼時，該核苷酸稱為「(該)肽所對應之核苷酸」，該肽稱為「(該)核苷酸所對應之肽」。
本發明之肽所對應之核苷酸，可舉例如：包含由編碼本發明之肽具有之胺基酸序列之鹼基序列構成之核苷酸而成的核苷酸、包含編碼本發明之肽具有之胺
基酸序列之鹼基序列而成之核苷酸、由編碼本發明之肽具有之胺基酸序列的鹼基序列構成的核苷酸等，但不限於該等。
本發明之核苷酸所對應之肽，可舉例如：包含由本發明之核苷酸之鹼基序列之一部分或全部所編碼之胺基酸序列構成之肽而成之肽、包含由本發明之核苷酸之鹼基序列之一部分或全部所編碼之胺基酸序列而成之肽、由本發明之核苷酸之鹼基序列之一部分或全部所編碼之胺基酸序列構成之肽、此等肽之中任一者的衍生物等，但不限於該等。
本發明中，「表現型所對應之基因型」的表達方式也使用於與「肽所對應之核苷酸」為相同含意。同樣地，「基因型所對應之表現型」的表達方式也使用於與「核苷酸所對應之肽」為相同含意。
本發明之核苷酸之化學性或生物學性的修飾物含於本發明之肽時，該修飾物也包含在前述本發明之「肽之衍生物」的含意。
本發明之更佳核苷酸，例如前述較佳核苷酸當中包含由編碼結合於標的分子之本發明之肽具有之胺基酸序列之鹼基序列構成之核苷酸而成的核苷酸、包含編碼結合於標的分子之本發明之肽具有之胺基酸序列之鹼基序列而成之核苷酸、由編碼結合於標的分子之本發明之肽具有之胺基酸序列之鹼基序列構成的核苷酸等。
本發明中，設計編碼胺基酸序列之鹼基序列時，各胺基酸所對應之密碼子可使用一種或二種以上。
因此，編碼某肽或蛋白質具有之單一胺基酸序列之鹼基序列也可有多種變化。選擇該密碼子時，可以因應將該肽所對應之基因型，亦即含有該鹼基序列之核苷酸所導入的細胞(宿主細胞)的密碼子選用(codon usage)選擇適當密碼子，或適當調整複數密碼子之使用頻度或比例。例如將大腸桿菌當作細胞(宿主細胞)使用時，可使用在大腸桿菌中之使用頻度高的密碼子設計鹼基序列。
本發明之核苷酸，可以利用化學合成、基因重組等就製造核苷酸之方法而言為該技術領域中具有通常知識者為周知的方法製備。又，從本發明之庫等依照本發明之鑑定方法回收(包含挑選、濃縮、單離)之肽所對應之核苷酸，也可利用此等方法製備。
本發明之核苷酸可採之形態，例如單離的形態(冷凍乾燥配製品、溶液等)、結合於其他分子之形態(經固相化之形態等)、包含該核苷酸之重組載體(本發明之載體)、導入有該核苷酸或該載體之細胞(本發明之細胞)、包含於病毒或病毒粒子之形態(包含含有當作本發明之載體之形態)、也包含其他核苷酸等之物理的集合(包含本發明之核苷酸庫)等，但不限於此等，可任意選擇適於使用、保存等目的之形態。
本發明提供重組載體(以下也簡化記載為「載體」)。
本發明之載體，包含本發明之核苷酸，且只要是用於將本發明之核苷酸導入細胞、微生物或個體之手段即
可，不特別限定，較佳為噬粒(phagemid)、黏質體(cosmid)、質體(plasmid)等核酸載體。
本發明之載體，也可為感染原核細胞或真核細胞之病毒或病毒性載體。
本發明中，「噬粒」係指除了質體複製起點以外，還包含從單股噬菌體誘導之第二複製起點的細菌質體。具有該噬粒之細胞，可於遭到M13或與其類似之輔助性噬菌體的重複感染中，經由單股複製模式而複製噬粒。亦即，將單股噬粒DNA包裝在由噬菌體外殼蛋白質被覆之感染性粒子之中。如此，噬粒DNA能在感染細菌中以選殖體雙股DNA質體的形式形成，噬粒能從經重複感染之細胞之培養上清液以噬菌體狀之粒子的形式形成。藉由為了使噬菌體狀之該粒子的該DNA感染具有F性纖毛之細菌而注入該細菌中，能使粒子本身再度形成為質體。
若將含有本發明之肽所對應之核苷酸及噬菌體外殼蛋白質(coat protein)基因而構成之融合基因插入於該噬粒而感染細菌並且培養該細胞，能使該肽在該細菌上或噬菌體狀粒子上表現或展現(與呈現同義)，或以成為與該外殼蛋白質之融合蛋白質的形式產生於噬菌體粒子中或該細菌之培養上清液中。
例如若將含有本發明之肽所對應之核苷酸及噬菌體外殼蛋白質基因gpIII而構成之融合基因插入噬粒並且與M13或與其類似之輔助性噬菌體一起重複感染大腸桿菌，則能以包含該肽及該外殼蛋白質而構成之融合蛋白質的形式產生於該大腸桿菌之培養上清液中。此融合蛋白質作為該肽之衍生物，包含在本發明中。
即使將噬粒改為使用環狀或非環狀之各種載體，較佳為使用病毒載體，也能依照該技術領域中具有通常知識者所周知的方法，將由該載體包含之本發明之核苷酸之鹼基序列所編碼的肽在導入有該載體之細胞或病毒狀粒子上表現或展現(與呈現同義)、或產生於該細胞之培養上清液中。
本發明之載體(重組載體)也可利用基因重組等該技術領域中具有通常知識者周知之方法製備。
本發明之載體可採取的形態，例如經單離之形態(凍結乾燥配製品、溶液等)、結合於其他分子之形態(經固相化之形態等)、導入於細胞之形態(包含本發明之重組細胞)、也包含其他載體等之物理性集合(包含本發明之核苷酸庫之特定型態)等，但不限於該等，可任意選擇適於使用、保存等目的之形態。
本發明在其一型態中，提供重組細胞(以下也省略記載為「細胞」)。
本發明之細胞，係包含本發明之肽所對應之核苷酸且表現該肽之細胞。該細胞之宿主細胞，可為真核細胞(包含株化細胞、初代培養細胞、繼代培養細胞)及原核細胞任一者，不特別限定。
原核細胞可舉例如：例如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等細菌細胞，但不限於該等。
真核細胞可舉例如動物細胞、昆蟲細胞、酵母、真菌等，動物細胞例如猴的細胞COS細胞(Gluzman、Cell、23卷、1981年發行、175至182頁：Gluzman,Y.,Cell(1981),vol.23,pp175-182：美國生物資源保存中心(American Type Culture Collection)編號ATCCCRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(美國生物資源保存中心編號ATCC CRL-1658)、中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell：CHO細胞：美國生物資源保存中心編號ATCC CCL-61)、CHO細胞之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub與Chasin，Proceedings of National Academic of Science USA，77卷、1980年發行、4126至4220頁：Urlaub,G.and Chasin,L.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980),vol.77,pp4126-4220)等，但不限於該等。
本發明之細胞，可藉由將本發明之核苷酸或載體導入宿主細胞而製備，但較佳為可藉由將本發明之載體利用轉染(transfection)、轉形(transformation)、轉導(transduction)等而導入宿主細胞以製備。
本發明之細胞之製備能適用之載體，例如包含從來自能適合於該原核細胞之種類的複製子(replicon)亦即複製起點、與調節序列、轉錄開始點、(轉譯之)開始密碼子與終止密碼子等選擇之鹼基序列一個以上之質體、黏質體、噬粒等，但不限於此等。又，該核苷酸或載體也可包含能對於導入有該載體或核苷酸之細胞賦予表現形質(表現型)之選擇性的鹼基序列。藉由將該載體或核苷酸導入宿主細胞並且培養獲得之細胞，能使本發明之肽表現。
適於本發明之肽之轉譯後修飾的宿主細胞也可當作本發明之細胞使用。可適用該宿主細胞之本發明之細胞，例如可在製備本發明之肽衍生物之方法(之某型態)中使用。
本發明之細胞能採取之形態，例如經單離之形態(冷凍配製品、凍結乾燥配製品、溶液等)、結合於其他分子之形態(經固相化之形態等)、導入有本發明之核苷酸或載體之細胞(包含於本發明之細胞)、在表面有本發明之肽表現或展現(與呈現同義)之細胞(包含於本發明之細胞)、也包含其他細胞等之物理性集合(包含本發明之核苷酸庫及肽庫之特定型態)等，但不限於此等，可任意選擇適於使用、保存等目的之形態。
本發明又於其他型態提供本發明之肽之製造方法。
本發明之肽，如前述可利用化學合成、基因重組、體外轉譯等就製造肽或蛋白質之方法而言為該技術領域中具有通常知識者周知之方法製備。又，從本發明之庫等利用本發明之鑑定方法回收(包含挑選、濃縮、單離)之肽也可利用此等方法製備。
本發明之肽之製造方法在某型態中，係包含以下步驟(1-1)及(1-2)而成：(1-1)培養包含本發明之肽所對應之核苷酸且表現該肽等之細胞(本發明之細胞)；及(1-2)從該培養物回收該肽。
又，本發明之肽之製造方法，在另一型態中，係包含以下步驟(2-1)及(2-2)而成：(2-1)確定結合於標的分子之本發明之肽之胺基酸序列；及(2-2)利用化學合成或基因重組製備由該胺基酸序列構成之肽。
再者，本發明之肽之製造方法在又另一型態中，係包含以下步驟(3-1)及(3-2)而成：(3-1)製備本發明之肽所對應之mRNA；及(3-2)以前述(3-1)所獲得之mRNA當作模板，利用體外轉譯製備該肽。
又，該等製造方法可以將本發明之鑑定方法適當組合作為事前之步驟。亦即可首先實施本發明之鑑定方法包含之步驟，再實施本發明之製造方法包含之步驟。本發明之肽之製造方法，也包含此類更包含本發明之鑑定方法(之各步驟)而構成的方法。
此類本發明之肽之製造方法，例如係包含以下步驟(4-1)至(4-3)而成：(4-1)使本發明之肽庫包含之肽與標的分子接觸；(4-2)回收該結合於標的分子之肽；及(4-3)利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備經回收之肽。
同樣地，該等製造方法也可將本發明之判定方法適當組合作為事前的步驟。亦即可以首先實施本發明之判定方法包含之步驟，再實施本發明之製造方法包含之步驟。本發明之肽等之製造方法，也包含此類更包含本發明之判定方法(之各步驟)構成的方法。
此類本發明之肽等之製造方法，例如係包含以下步驟(5-1)至(5-3)而成：(5-1)使本發明之待檢測肽與
標的分子接觸；(5-2)當待檢測肽為結合於該標的分子時，確定該肽為陽性；及(5-3)當前述(5-2)中，確定待檢測肽為陽性時，利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備該肽。
再者，本發明之肽之製造方法，於另一型態包含以下步驟而成：鑑定與SPINK2之內在性標的分子即胰蛋白酶及/或頂體酶以外，較佳為胰蛋白酶以外之標的分子結合且將該標的分子擁有之生物活性一部分或全部予以活化或促進、或妨礙、不活化或抑制之肽。此製造方法例如：包含以下(6-1)至(6-3)或(7-1)至(7-3)之步驟：(6-1)使本發明之肽庫所含之肽與該標的分子接觸；(6-2)回收與該標的分子結合之肽；及(6-3)當該肽係將該標的分子擁有之生物活性予以活化或促進、或刺激(agonize)該標的分子時，判定該肽為陽性。
(7-1)使本發明之肽庫所含之肽與該標的分子接觸；(7-2)回收結合於該標的分子之肽的步驟；及(7-3)當該肽將該標的分子擁有之生物活性予以妨礙、不活化或抑制或對於該標的分子為拮抗(antagonize)時，判定該肽為陽性。
又，本發明之製造方法，於另一型態，係將(6-1)至(6-3)或(7-1)至(7-3)替換為例如包含以下(8-1)及(8-2)或(9-1)或(9-2)而成：
(8-1)使待檢測肽，與胰蛋白酶及/或頂體酶以外，較佳為胰蛋白酶以外之標的分子接觸；及(8-2)當該肽係將該標的分子擁有之生物活性予以活化或促進、或刺激(agonize)該標的分子時，判定該肽為陽性。
(9-1)使待檢測肽，與胰蛋白酶及/或頂體酶以外，較佳為胰蛋白酶以外之標的分子接觸；及(9-2)當該肽將該標的分子擁有之生物活性予以妨礙、不活化或抑制或對於該標的分子為拮抗(antagonize)時，判定該肽為陽性。
藉由將(6-1)至(6-3)、或(8-1)及(8-2)等步驟與依據(4-3)或(5-3)等之步驟組合，可製造將標的分子擁有之生物活性予以活化或促進之肽、或刺激標的分子之肽(agonistic peptide)。同樣地，藉由將(7-1)至(7-3)、或(9-1)及(9-2)等步驟，與依據(4-3)或(5-3)等之步驟組合，可製造將標的分子擁有之生物活性予以妨礙、不活化或抑制之肽、或對於標的分子拮抗之肽(antagonistic peptide)。
又，本發明提供肽之衍生物(肽衍生物)之製造方法。本發明之肽衍生物，例如可藉由將該衍生物包含之肽利用上述方法(肽之製造方法)製備後，供實施化學反應、生化學反應、轉譯後修飾等而製備，但不限定於此等。
也可將上述(2-2)、(3-2)、(4-3)或(5-3)製備之肽，改為製備具有該肽(X)擁有之胺基酸序列中有1或2個以上之胺基酸或部分胺基酸序列缺失而成之胺基酸序
列的肽(X’)。肽(X’)之製造方法也包含於本發明。依該方法製備之肽(X’)宜與標的分子結合。也可將該理想的肽(X’)之胺基酸序列中，原本之肽擁有之胺基酸序列含有但是對於與標的分子之結合並非必要的1或2個以上之胺基酸或部分胺基酸序列缺失。
本發明之肽衍生物之製造方法，可舉例：除了例如(1-1)及(1-2)、(2-1)及(2-2)、(3-1)及(3-2)、(4-1)至(4-3)、(5-1)至(5-3)、(6-1)至(6-3)、(7-1)至(7-3)、(8-1)及(8-2)、或(9-1)及(9-2)等各步驟以外，更包含以本發明之肽當作原料製備本發明之肽衍生物之步驟(以下稱為「衍生物製備步驟」)而成之方法，包含上述(2-2)、(3-2)、(4-3)及(5-3)中將肽替換為製備肽之衍生物之步驟而成之方法、預先使肽庫含有肽衍生物之方法、將待檢測肽替換為使用待檢測肽衍生物之方法等，但不限於此等。
本發明之肽衍生物之製造方法，也可製備將上述(2-2)、(3-2)、(4-3)或(5-3)製備之肽衍生物，改為具有該肽衍生物(Y)擁有之胺基酸序列中有1或2個以上之胺基酸或部分胺基酸序列缺失而成胺基酸序列的肽衍生物(Y’)。肽衍生物(Y’)之製造方法也包括在本發明。依該方法製備之肽衍生物(Y’)宜與標的分子結合。也可將該理想的肽衍生物(Y’)之胺基酸序列中，原本之肽衍生物擁有之胺基酸序列含有但是對於與標的分子之結合並非必要的1或2個以上之胺基酸或部分胺基酸序列缺失。又，藉由將具有理想之轉譯後修飾能力之細胞使用於本發明之肽之製造方法，可製備本發明之肽衍生物為已施
以理想之轉譯後修飾之肽。於此情形，例如：藉由將具有理想之轉譯後修飾能力的細胞，當作上述步驟之(1-1)及(1-2)之細胞使用，或當作(2-2)、(4-3)及(5-3)中適用於基因重組之細胞(或宿主細胞)使用，可製備已施以理想之轉譯後修飾的肽衍生物，但是本發明之製備(就肽衍生物之製造方法之型態而言)肽之轉譯後修飾體之方法，不限於此等。
本發明提供庫。
本發明中，「庫」係指類似但不相同的分子的物理性集合(collection)。該集合例如可於一個容器中共存，但也可於不同的容器或固相支持體上之不同部位以群組形式或個別分子的形式以物理上為分離地存在。多數庫也可包含在相同集合。
本發明之庫只要是非相同的本發明之肽及/或核苷酸的物理性集合即可，並無任何限定，例如噬菌體呈現庫、核糖體呈現庫、核酸呈現庫等。
「噬菌體呈現」，係指於纖維狀噬菌體(filamentous phage)等外殼蛋白質(coat protein)連結外來的肽或蛋白質，並以融合蛋白質的形式使在噬菌體狀粒子上表現或展現(與呈現同義)之技術(方法及其使用的手段)。又，利用該技術回收(包含挑選、濃縮、單離)該肽或蛋白質所對應之核苷酸也包含在「噬菌體呈現」的含意。噬菌體呈現庫係在該技術中使用之本發明之庫之一型態。
「核糖體．呈現」，係指在體外轉譯中，以包含轉譯反應中形成之mRNA-核糖體-肽或蛋白質三者而成為複合體之形態，使肽或蛋白質表現或展現(與呈現同義)之技術(方法及其使用之手段)。在此，肽或蛋白質為該mRNA之轉譯產物。又，利用該技術回收(包含挑選、濃縮、單離)該肽或蛋白質所對應之核苷酸也包含在「核糖體．呈現」的含意。核糖體呈現庫係在該技術中使用之本發明之庫之另一型態。
「核酸呈現」，係指以包含核苷酸(與核酸為同義)、該核苷酸所對應之肽或蛋白質而成之複合體之形態，使肽或蛋白質表現或展現(與呈現同義)之技術(方法及其使用之手段)(Keefe與Szostak、Nature、410卷、715至718頁、2001年發行：Keefe,A.D and Szostak,J.W.,Nature,vol.410(2001),pp715-718)。又，利用該技術回收(包含挑選、濃縮、單離)該肽或蛋白質所對應之核苷酸也包含在「核酸呈現」的含意。核酸呈現庫係在該技術中使用之本發明之庫之又另一型態。
核酸呈現可舉例如mRNA呈現，但不限於此。(Yamaguchi,J.et al.,Nucleic Acids Research,vol.37,No.16 e108,pp1-13(2009))
mRNA呈現，係以mRNA與其轉譯產物即肽或蛋白質經由中介部分夾持而連結而成的複合體的形態使肽或蛋白質展現(與呈現同義)之技術(Keefe與Szostak，Nature，410卷、715至718頁、2001年發行：Keefe,A.D and Szostak,J.W.,Nature,vol.410(2001),pp715-718)。
本發明中，包含不相同的本發明之肽及/或核苷酸之物理性集合之細胞之物理性集合、微生物(包含病毒、噬菌體、噬菌體狀分子、此等之任一之粒子等)之物理性集合、及天然產生或人工創造之載體(包含噬粒、黏質體、質體等)之物理性集合、及此等片段之物理性集合、及科學性及/或生物學性的修飾物之物理性集合，也包含在「庫」之含意。
如前述，本發明中在設置編碼胺基酸序列之鹼基序列時，可以使用各胺基酸所對應之1種或2種以上之密碼子。因此，編碼某肽或蛋白質具有之單一胺基酸序列之鹼基序列可以有複數的變化(variation)。選擇該密碼子時，可以因應將該肽所對應之基因型，亦即包含該鹼基序列之核苷酸所導入之細胞(宿主細胞)之密碼子選用(codon usage)而選擇適當密碼子、或適當調整複數密碼子之使用頻度或比例。如此，本發明之核苷酸庫中，編碼單一之胺基酸序列之鹼基序列之核苷酸可以有複數的變化。亦即，本發明之核苷酸庫，也可包含含有編碼某肽具有之胺基酸序列之鹼基序列之核苷酸之物理性集合。對應於該特定肽之核苷酸之物理性集合，其本身也可形成一個核苷酸庫。
本發明之庫包含複數類似但不相同的分子。庫包含之類似分子之種類(之數目)稱為「庫之多樣性」。例如由100種類似分子構成之庫之多樣性為102。本發明中，庫之多樣性不特別限定，但其數值愈高愈好。
包含本發明之鑑定方法及該鑑定方法之步驟的肽之製造方法中，使用之肽庫之多樣性，為1×105以上、2×105以上、5×105以上、1×106以上、2×106以上、5×106以上、1×107以上、2×107以上、5×107以上、1×108以上、2×108以上、5×108以上、1×109以上、2×109以上、5×109以上、1×1010以上、2×1010以上、5×1010以上、1×1011以上、2×1011以上、5×1011以上、1×1012以上、2×1012以上、5×1012以上、1×1013以上、2×1013以上、5×1013以上、1×1014以上、2×1014以上、5×1014以上、1×1015以上、2×1015以上、5×1015以上、1×1016以上、2×1016以上、5×1016以上、或、1×1017以上。該庫之多樣性不限於實測值，也可為理論值。
本發明提供結合於標的分子之肽及/或肽衍生物之鑑定方法。
本發明之鑑定方法例如包含前述步驟(4-1)及(4-2)、(6-1)及(6-2)、(7-1)及(7-2)等，但不限於此等。
本發明中，「標的分子」係指本發明之肽所結合之內在於人類或非人類動物個體之物質或能攝入活體內之外因性之物質。本發明之標的分子宜為SPINK2之內在性標的即胰蛋白酶及/或頂體酶以外之分子，更宜為胰蛋白酶以外之分子，又更佳為來自於人之胰蛋白酶以外之來自於人的分子。又更佳為直接或間接涉及人個
體會罹患之疾病之發病或惡化，或與該疾病顯示相關性或逆相關性之內在或外因性酵素、受體、該受體之配體、細胞激素等液性因子、其他活體高分子、訊息傳遞物質、細胞、病原體、毒素、或此等任一者以上或更多而來的物質，例如其片段、分解物、代謝產物、加工物等(以下稱為「疾病關連標的分子」)。又，本發明之標的分子也可為礦物、聚合物、塑膠、合成低分子化合物等非天然物質。
本發明之某型態的理想的標的分子係胰蛋白酶及/或頂體酶以外之蛋白酶，較佳為胰蛋白酶以外之蛋白酶，更佳為絲胺酸蛋白酶。又更理想為內切(endo)型之絲胺酸蛋白酶，內切型絲胺酸蛋白酶可列舉胰凝乳蛋白酶。當從組織、體液、細胞等將特定之蛋白質成分精製、單離時，若於含有此成分之部分中添加此等的蛋白酶抑制劑，能減少此成分分解，此等蛋白酶抑制劑對於製造重組型及非重組型之各種蛋白質為有用。
又，此等蛋白酶宜為疾病關連標的分子。
本發明之標的分子係使用在從本發明之肽庫挑選該結合於標的分子之肽、刺激該標的分子之肽或對於該標的分子拮抗之肽時，判定待檢測肽對於標的分子之結合性或刺激活性或拮抗活性等。該標的分子可為全長分子或其片段、或有任意之胺基酸、肽、蛋白質、糖鏈、聚合物、擔體等加成而得之衍生物。又，該標的分子也可經固相化。
本發明之標的分子可以從罹病的組織、細胞單離、精製後使用，或可以結合或包含全部或一部分之組織、細胞等的形態使用。又，本發明之標的分子，可利用化學合成、基因重組、體外轉譯等就肽或蛋白質之製造方法而言為該技術領域中具有通常知識者周知之方法製備。也可從如此獲得之標的分子視需要製備如前述衍生物。
本發明中，肽或蛋白質可藉由體外轉譯，即將包含肽或蛋白質所對應之DNA、cDNA等核苷酸或該核苷酸之載體於含有對於轉錄及轉譯為必要之酵素、基質、能量物質等之溶液中保溫而於體外合成理想的肽或蛋白質的方法；基因重組，亦即將該核苷酸或載體導入於原核或真核細胞(宿主細胞)並培養獲得之重組細胞後從該培養物回收理想的肽或蛋白質之方法；化學合成等製備。
標的分子為存在於細胞膜之蛋白質或其區域(domain)時，也可藉由將連結該蛋白質或區域之細胞外區域與免疫球蛋白(Ig)之不變區而成之融合蛋白質於適當的宿主-載體系統中表現而以分泌蛋白質之形式製備該分子。
標的分子所對應之核苷酸例如可利用表現選殖法取得，但不限於此。表現選殖法，係構建包含編碼肽或蛋白質之胺基酸序列之鹼基序列之cDNA之表現庫，以該cDNA庫當作模板，並使用專一性放大該cDNA
之全長或一部分的引子，進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」：Saiki等人、Science、239卷、487至489頁、1988年發行：Saiki,R.K.,et al.,Science(1988),vol.239,pp487-489)，藉此選殖肽或蛋白質所對應之cDNA之方法。
體外轉譯可適用之套組或試藥，例如Roche Diagnostics公司製之快速轉譯系統(RTS)等。
基因重組之宿主細胞，可適當選擇能適用於當作製備本發明之細胞用的宿主細胞的原核或真核細胞。
基因重組中，所獲得之重組細胞(有核苷酸或載體導入之細胞)可依照該技術領域中具有通常知識者周知之方法培養，能在該培養物中或該細胞內使理想的肽或蛋白質產生。
該培養可使用之培養基可因應宿主細胞從慣用者當中適當選擇。宿主細胞為大腸桿菌時，例如可於LB培養基視需要添加安比西林(ampicillin)等抗生物質或IPTG以供培養。
利用該培養，並將重組細胞內外產生之理想的肽或蛋白質藉由利用其物理性、化學性及/或生物學的性質等之周知之區分手法適當組合可精製及單離。
該區分手法，例如鹽析、利用蛋白質沉澱劑處理、透析、超過濾、分子篩(凝膠過濾)層析、吸附層析、離子交換層析、親和性層析、分配層析、疏水層析等，但不限於此等。
又，藉由對肽或蛋白質預先將對於精製有用之部分予以連結或加成，能以良好效率精製理想的肽或蛋白質。例如藉由預先連結由6個殘基構成的組胺酸標籤，能利用鎳親和性層析以良好效率精製理想的肽或蛋白質。又，藉由預先連結IgG之Fc區，能利用Protein A．親和性層析以良好效率精製理想的肽或蛋白質。
本發明之鑑定方法，包含使肽及/或其衍生物與標的分子接觸之步驟。在此，該肽及/或其衍生物也可包含在肽庫中。亦即本發明之鑑定方法也可包含使肽庫包含之肽及/或其衍生物與標的分子接觸之步驟。
本發明中，「使接觸」，係指使兩個或更多物質接近到該物質當中二個以上之間能交互作用之距離。該交互作用可舉例如共價鍵、配位鍵、金屬-金屬間鍵結、離子鍵、金屬鍵、氫鍵、凡得瓦鍵等(以下稱為「化學鍵」。)，基於利用庫倫力之結合、離子間交互作用、氫鍵、偶極間交互作用、凡得瓦力等靜電交互作用之交互作用(以下稱為「分子間力」。)，其他交互作用，電荷轉移交互作用，跨環交互作用，疏水交互作用，肽與活體分子之組合等，但不限於此等。本發明中，「兩個或更多之物質」只要含有標的分子及待驗物質即可，不特別限定。待驗物質只要是結合於標的分子之物質即可，不特別限定，例如本發明之肽、該肽之衍生物、此等中任一者經固相化之擔體、有此等之任一者表現或展現(與呈現同義)之細胞、病毒粒子或病毒狀粒子(包含噬
菌體、噬粒)等。該待驗物質也可藉由噬菌體呈現、核糖體呈現、核酸呈現等，於真核或原核細胞表面上、病毒粒子或病毒狀粒子上、或以連結於核糖體或核酸的形態表現或展現(與呈現同義)。
本發明之鑑定方法包含挑選具有理想的性質之肽及/或肽衍生物，較佳為結合於標的分子之肽及/或肽衍生物之步驟。
本發明中，「結合」係指在某條件下，兩個或更多物質以此等之間能發生交互作用(記載在本發明之其他部分)的程度彼此接近或成為組合之狀態。
本發明中，即使在某條件之下，使標的分子與待驗物質接觸，其次使與該標的分子非專一性吸附之待驗物質及未與該標的分子結合或吸附之待驗物質從含有待驗物質之部分除去後，只要在該部分中仍存在待驗物質，便可解讀為該待驗物質與該標的分子「結合」。
兩個或更多物質之間僅能產生非專一性吸附時，可解讀為此等物質之間未發生「結合」。又，即使使兩個或更多物質接觸，此等之間仍未彼此接近到能產生交互作用(記載於本發明之其他部分)之程度或未成為組合之狀態時，可解讀為此等物質之間未產生「結合」。
測定抗體與抗原之「結合」之方法，廣泛使用利用流式細胞計數方法等測定之螢光抗體法(直接法、間接法)、放射免疫分析、酵素免疫分析(均勻法、不均勻法)、ELISA、ELISPOT等。該等方法中，只要將
待驗抗體及抗原替換為本發明之肽或其衍生物及標的分子，便可與抗體與抗原之「結合」測定同樣地，測定是否有肽或其衍生物與標的分子之「結合」。
又，「結合」之有無，可利用測定結合活性或親和性之指標而確定。結合親和性之指標例如解離常數、結合常數等。
針對以下表示之處於化學平衡狀態之分子A及結合於A之物質B之化學的解離，ABA+B
解離常數(dissociation constant：Kd)可由下式計算：Kd=[A][B]/[AB]
在此，[A]、[B]及[AB]分別意指A、B及AB(組合體)之濃度。Kd意指經解離之A及B與未解離之AB之比，Kd之倒數為結合常數(Ka)。
本發明中，使用的「解離常數(dissociation constant)」主要意指用於結合於某標的分子之之肽及/或肽衍生物之平衡(equilibrium)解離常數。
本發明中，解離常數，可藉由測定經解離之物質(肽、肽衍生物、標的分子等)及未解離之物質(肽及/或肽衍生物-標的分子組合體等)之濃度而計算。解離常數之測定-計算方法，只要是該技術領域中具有通常知識者所周知的方法即可，不特別限定，例如使用表面電漿子共振之方法、等溫滴定熱量測定法等。
使用表面電漿子共振之方法中，標的分子及與其結合之肽及/或其衍生物之交互作用可利用以下測
定-計算：於複數之肽濃度，利用表面電漿子共振檢測一系列的結合．解離反應；解析獲得之一系列結合．解離反應；從得到的各種速度常數計算解離常數。
表面電漿子共振之測定-計算系統，例如Biacore系統(GE Healthcare公司)等，但不限於此。使用Biacore系統時之程序如下：以胺基偶合將標的分子固定化在Biacore系統之感應晶片上；於複數之肽濃度，使該標的分子接觸肽；利用表面電漿子共振檢測兩者的交互作用；將一系列結合．解離反應以時間為橫軸、結合量(RU)為縱軸繪製感應圖；從以複數之肽濃度繪製的感應圖，使用BIAevaluation軟體(GE Healthcare公司製)擬合(fitting)於1：1朗繆(Langmuir)模型，計算各種速度參數；從各種速度參數計算解離常數。
等溫滴定熱量測定法中，標的分子及與其結合之肽及/或其衍生物之交互作用可以如下測定-計算：於含有標的分子之溶液中滴加肽溶液(反之亦可)；測定交互作用產生的熱量，繪製結合等溫線；從結合等溫線可獲得解離常數(KD)、反應之結合比(N)、焓(enthalpy)變化(△H)、熵(entropy)變化(△S)。
直接測定伴隨分子間交互作用之微小熱變化(發熱變化或吸熱變化)的系統，例如MicroCal．系統(GE Healthcare公司)等，但不限於此。使用MicroCal．系統時之程序如下：於保持在固定溫度的樣本槽滴定配體溶液並攪拌；由於分子間交互作用，會產生與結合量為正比例之發熱或吸熱，而樣本槽中之溶液溫度發生變化；
槽回饋網絡(cell feedback network)(CFB)感知與參考槽之間的溫度差(△T)；將參考槽或樣本槽加熱使△T為0；測定為了保持△T=0所要花費的回饋電力，藉此獲得交互作用所生的發熱量或吸熱量；以發熱量為縱軸、標的分子與肽之莫耳比為橫軸，從結合等溫線計算解離常數。
本發明之鑑定方法及/或判定方法(後述)中，可將例如對於標的分子顯示100μM以下、50μM以下、20μM以下、10μM以下、5μM以下、2μM以下、1μM以下、500nM(0.5μM)以下、200nM以下、100nm以下、50nM以下、20nM以下、10nM以下、5nM以下、2nM以下、1nM以下、500pM(0.5nM)以下、200pM以下、100pM以下、50pM以下、20pM以下、10pM以下、5pM以下、2pM以下、或1pnM以下之解離常數之待驗物質確定為結合於標的分子，亦即陽性，但解離常數之基準值、及確定是否有「結合」之基準不限於該等。
本發明之鑑定方法中，「挑選」之步驟，亦為回收結合於標的分子之待驗物質之步驟，於該產物中只要是含有結合於標的分子之待驗物質或經濃縮即可，該產物可為僅由該結合於標的分子之物質構成者、及混有未與該標的分子結合之物質者任一者。又，該產物中含有或濃縮之結合於標的分子之待驗物質，可為單一物質也可為2種以上之混合物。
本發明之鑑定方法中，挑選步驟亦即回收步驟，係指回收含有結合於標的分子之物質之部分或濃縮之部分之步驟。該步驟只要是在本發明之技術領域中為
該技術領域中具有通常知識者周知之區分-精製方法即可，不特別限定，也可含有以下步驟：使結合於標的分子之物質、與未與標的分子結合之物質及與標的分子非專一性吸附之物質，從標的分子(含有其之部分)分離之步驟、將結合於標的分子之物質予以溶出(從標的分子分離)之步驟等。該步驟中，也可不就是否有結合設定解離常數等判定基準。
本發明中，本發明之鑑定方法包含之「挑選」有時稱為「淘選(panning)」。本發明中，「淘選」係指使本發明之肽及/或肽衍生物與標的分子接觸，並回收(包含挑選、濃縮、單離)該結合於標的分子之肽及/或肽衍生物。
淘選可以應用該技術領域中具有通常知識者所周知的方法，例如固相淘選法、液相淘選法，但不限於該等。固相淘選法，例如藉由將標的分子予以固相化，其次使液相包含之肽與該標的分子接觸，然後除去未與標的分子結合之肽及非專一性結合之肽後，選擇性地使該結合於標的分子之肽從固相(所結合之該標的分子)分離，可以挑選具有理想的結合活性的肽，但固相淘選法之操作不限於此。液相淘選法，例如可於溶液中使肽與該標的分子接觸，其次除去未與標的分子結合之肽及非專一性結合之肽後，選擇性地使該結合於標的分子之肽從該標的分離，藉此挑選具有理想的結合活性的肽，但是液相淘選法之操作不限於此。
本發明之鑑定方法中，藉由使用表現型(phenotype：與表現形質為同義)對應之基因型(genotype：與基因形質同義)連結的庫，能以良好效率挑選結合於標的分子之肽(也包括「肽衍生物包含之肽」)所對應之核苷酸，而可以良好效率製備該肽。表現型及其對應之基因型(以下簡稱為「表現型與基因型」)之連結，可為直接性及間接性任一者。
表現型與基因型「直接連結」，係指表現型與基因型之行為一致。即使表現型與基因型之間插入有其他部分等有一定的距離，只要兩者的行為一致，仍包括在「直接連結」的含意。亦即兩者不需物理性相鄰。
本發明中，表現型與基因型之「行為一致」，係指本發明之肽、核苷酸、載體、細胞、製造方法、鑑定方法、判定方法、肽庫、核苷酸庫、組成物、試藥等型態中，兩者之行為一致。此等型態中，即使由於隨時間、暫時性地在直到某時點為止、或某時點之後、內部原因、外部原因、此等之組合或其他原因，使得「行為一致」有全體的或部分喪失，仍然包括在「行為一致」的含意。
表現型與基因型直接連結者，例如核糖體呈現庫、核酸呈現庫、以本發明之肽所對應之核苷酸直接或間接連結為特徵之肽及/或其衍生物、含有該肽及/或其衍生物而成之肽庫等。
表現型與基因型「間接連結」，係指兩者之行為不一定要一致，或兩者不一定「直接連結」，但是
能從特定的表現型接續(access)該表現型對應之基因型。表現型與基因型間接連結者，例如噬菌體呈現庫、表現選殖使用之cDNA庫等，但不限於該等。
噬菌體呈現庫包含之各選殖體中，當作表現型之肽或其衍生物、與其所對應之當作基因型之核苷酸之行為雖不一致，但是可藉由經過使該庫包含之肽及/或其衍生物與標的分子接觸，除去未與標的分子結合、或與標的分子非專一性吸附之噬菌體狀粒子後，選擇性地使結合於標的分子之噬菌體狀粒子溶出等步驟，挑選結合於標的分子之肽及/或其衍生物(於噬菌體狀粒子上表現或展現)，且同時，可將對應的基因型，亦即該肽或其衍生物(包含之肽)對應之核苷酸予以精製、單離並定序其鹼基序列。從此種表現型接續(access)其所對應之基因型的好處在於，不限於噬菌體呈現等表現型與基因型係「間接連結」的情形，於「直接連結」的情形也可適用。
本發明之鑑定方法包含之步驟可以重複2次以上。尤其，藉由將於挑選步驟回收之肽及/或肽衍生物重新構建肽庫並進行接觸及挑選的步驟，能將結合於標的分子之肽及/或其衍生物更高度濃縮。藉由再重複此等操作，能使結合於標的分子之肽及/或其衍生物又更高度濃縮，最終可提高將該等單離的效率。再者，藉由使結合於標的分子之肽及/或其衍生物更高度濃縮，能將親和性更高的結合體單離。
又，結合於標的分子之肽及/或其衍生物之高度濃縮，也可藉由於本發明之鑑定方法包含之步驟中將
與標的結合之肽及/或其衍生物為非專一性結合者更強力分離而達成。此種分離方法，可舉例如增加去除非專一性結合之肽等之步驟的次數、或將使用於去除非專一性結合之肽使用之試藥(界面活性劑等)改為更強力者等。
本發明之肽或其衍生物也可採取單元體、均或雜二元體、三元體、四元體、五元體、六元體、七元體、八元體、或由九個以上之單元體構成之多元體中任一形態。
結合於標的分子一分子或標的部位一處之本發明之肽或其衍生物之分子數，可為1、2、3、4、5、6、7、8、或9以上任一者，該肽或其衍生物可以單元體、均或雜二元體、三元體、四元體、五元體、六元體、七元體、八元體、或由九個以上之單元體構成之多元體中任一形態結合於標的分子。
本發明之肽或其衍生物每一分子結合之標的分子之分子數或標的部位數可為1、2、3、4、5、6、7、8、或9以上任一者。
又，本發明提供鑑定將標的分子擁有之生物活性之一部分或全部予以活化或促進、或妨礙、不活化或抑制之肽或肽衍生物之方法，並提供鑑別刺激標的分子或拮抗標的分子的肽或肽衍生物的方法。亦即，本發明提供鑑定標的分子之活化劑、促進劑或刺激劑(agonist)、或妨礙劑、不活化劑、抑制劑或拮抗劑(antagonist)之方法。此等鑑定方法中例如可包含：前述
步驟(6-1)至(6-3)、(7-1)至(7-3)等，但不限於包含此等步驟。
本發明提供組成物。
本發明之組成物，係包含本發明之肽、肽之衍生物、核苷酸、載體或細胞而成。
包含本發明之肽或其衍生物(包括本發明之細胞表面上所展現者)而成的組成物，可利用於檢測該肽或其衍生物所結合之標的分子。
包含本發明之核苷酸、載體或細胞而成的組成物，可以使用於製備該核苷酸、具有該載體或該細胞包含之本發明之核苷酸具有之鹼基序列所編碼之胺基酸序列的肽。又，該組成物也可使用於檢測包含該核苷酸之核苷酸、載體、細胞等。
該組成物中，視需要可利用緩衝劑、鹽類、金屬、防腐劑、界面活性劑、冷凍或冷凍乾燥等製備方法使含有用於減輕或防止本發明之肽、肽之衍生物、核苷酸、載體或細胞受到損害的物質等。
本發明提供試藥。
本發明之試藥係包含本發明之肽、肽之衍生物、核苷酸、載體或細胞而成。
包含本發明之肽或其衍生物而成之試藥，可用於檢測該肽或其衍生物所結合之標的分子。
例如：彈性蛋白酶(elastase)或胰蛋白酶等胰酵素已知係由胰臟腺泡細胞合成，並以胰液的形式向胰管系分泌。若由於各種發炎刺激等而造成胰組織受損，該等酵素會有多量進入血中，故可藉由測定血中上昇的胰酵素量，來判斷胰臟是否受損。
包含本發明之核苷酸、載體或細胞而成的試藥，可用於檢測含有該核苷酸之核苷酸、載體、細胞等。
本發明之試藥也可為組成物。
包含該試藥之套組也包含在本發明之試藥。
又，本發明之肽、肽衍生物、展現此等的細胞等，可當作識別標的分子等物質之元件而利用於針對該物質之生物感測計。
本發明也提供判定待驗物質是否結合於標的分子之方法。本發明之判定方法，例如也可包含前述步驟(5-1)及(5-2)等，但不限於此等。
本發明之判定方法，可使用與本發明之鑑定方法包含之步驟為相同或經適當改變之步驟。惟，供該判定方法之待驗物質也可不包含在庫等集合。例如供判定方法之待檢測肽或待檢測肽衍生物，不限於肽庫包含之肽或肽衍生物，也可為從其他肽分離之單一肽或肽衍生物、包含此等之混合物等。亦即，本發明之鑑定方法，主要適於當作從待驗物質之物理性集合挑選具有理想的性質者的方法，相對於此，本發明之判定方法，亦適於當作用於檢查特定之待驗物質是否具有理想的性質的檢定方法。
本發明之判定方法中，例如確定待驗物質是否結合於標的分子之步驟中，可將是否滿足關於解離常數等親和性之指標的條件當作判定基準。又，在與本發明之鑑定方法同樣之挑選步驟中，若能當作結合於標的分子之物質回收待驗物質時，則可判定該待驗物質為陽性。
又，本發明也可提供判定是否待檢測物質將標的分子擁有之生物活性之一部分或全部予以活化或促進、或妨礙、不活化或抑制之方法，並提供判定是否待檢測物質會刺激(agonize)標的分子或與標的分子拮抗(antagonize)之方法。此類本發明之判定方法，例如也可含有前述步驟(8-1)及(8-2)、(9-1)及(9-2)等，但不限於此等。
以下依實施例對於本發明具體說明。惟該等實施例不限定本發明之技術性範圍。本發明之實施例使用之質體、限制酶、DNA修飾酵素等係市售品，可依常法使用。又，DNA之選殖，聚核苷酸序列之定序，宿主細胞之轉形，轉形細胞之培養，從獲得之培養物收集、精製酵素等之操作，亦為該技術區域中具有通常知識者充分知曉者、或可從文獻等輕易得知者。
隨機變異SPINK2庫之製作
為了於噬菌體展現隨機變異SPINK2庫，構建噬粒載體。首先，將含有tTH terminator之區域作為「片段
1(序列編號10)」，含有lac operator之pCANTAB 5E(GE healthcare)之2099至2232之區域(序列編號11之核苷酸編號3至136)作為「片段2」。將包含SD序列及編碼phoA信號肽及野生型SPINK2、亦即SPINK2(WT)之胺基酸序列的鹼基序列的序列(序列編號12)作為「片段3」、基於pCANTAB 5E之含有噬菌體外殼蛋白質(gene III)之序列(序列編號16之核苷酸編號600至1848)作為「片段4」，再者，將含有Ipp terminator之區域作為「片段5(序列編號13)」。將具有含「片段1」~「片段5」之鹼基序列(序列編號16)的DNA當作模板，實施使用下列引子1及2、及KOD-plus-(TOYOBO：由DNA聚合酶、緩衝液、基質等構成)的重疊延長PCR(overlap extension PCR)法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 160秒)×30個循環)。
引子1：5’-AAAAGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCC-3’
引子2：5’-AAAAAGAATTCATTAAACGGCAGACAAAAAAAATGTCGC-3’
將已放大的片段進行瓊脂糖凝膠電泳後，切出理想的DNA片段，以Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)製備DNA。將製備的DNA片段及pCANTAB 5E以限制酶SapIII(NEB)及EcoRI(NEB)於37℃處理1小時以上，進行瓊脂糖凝膠電泳後，切出理想的DNA片段，以Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System精製。將已精製之片段使用T4 DNA接合酶(NEB)於16℃反應一晚，以實施接合反應。接合溶液係添加到
大腸菌JM109(TOYOBO)，於冰上靜置30分鐘後，於42℃進行45秒熱處理，之後再於冰上靜置5分鐘，接種到含0.1mg/ml安比西林之2-YT培養盤後，於37℃進行一晚靜置培養，以實施大腸菌之轉形。翌日，將已轉形的大腸菌接種於含0.1mg/ml安比西林之Terrific Broth培養基(Invitrogen)，於37℃培養一晚後，使用QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(Qiagen)回收質體DNA(以下稱為「miniprep處理」)，並實施序列解析，以確認目的載體已構建完成。再者，將構建之載體使用限制酶EcoRI於37℃進行1小時以上處理，於Klenow處理後使用T4 DNA接合酶(NEB)，於16℃進行1小時接合反應，對於大腸菌JM109進行轉形。培養已被轉形的大腸菌後，進行miniprep處理，並實施獲得之DNA之序列解析，將構建之載體命名為「噬粒載體pPR3_SPINK2(WT)」。
然後於噬粒載體pPR3_SPINK2(WT)插入TEV蛋白酶切斷序列及stuffer。為了製作TEV蛋白酶切斷序列，實施使用下列引子3及4、及KOD-plus-之重疊延長PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 10秒)×30個循環)。
引子3：5’-GCGGCCGCATAGGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGAG-3’
引子4：5’-GCTAAACAACTTTCAACGGTgctaccGCTCTGAAAATACAGG-3’
將已放大的片段進行瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，以Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System製備DNA，作為「片段6」。將(1-1)構建之pPR3_SPINK2(WT)作為模板，實施使用下列引子5及6、及KOD-plus-之PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30個循環)，以將噬菌體外殼蛋白質(gene III)放大。
引子5：5’-ACCGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCC-3’
引子6：5’-CATTAAAGCCAGAATGGAAAGCGCAGTC-3’
再者，將已放大之DNA片段作為模板，實施使用下列引子α及β及KOD-plus-之PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 45秒)×30個循環)。
引子α：5’-AACACGCGTCTGCGGCCGCATAGGGTAGC-3’
引子β：5’-AACGGATCCTCATTAAAGCCAGAATGGAAAG-3’
將已放大之片段進行瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System製備DNA。將製備之DNA片段及pPR3以限制酶MluI(NEB)及BamHI(NEB)於37℃處理1小時以上，瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System精製。將已精製之片段使用T4 DNA接合酶於16℃反應一晚，以實施接合反應，進行大腸菌JM109轉形。培養已被轉形的大腸菌後，進行
miniprep處理，實施獲得之DNA之序列解析。構建之載體命名為「噬粒載體pPR3_TEV」。又，操作依(1-1)記載之方法進行。
將構建之噬粒載體pPR3_TEV及pcDNA3.1(+)(Invitrogen)以限制酶EcoRI(NEB)及MluI(NEB)於37℃處理1小時以上，瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System精製。將精製之片段使用T4 DNA接合酶於16℃反應一晚，以實施接合反應，將大腸菌JM109轉形。培養已被轉形的大腸菌後進行miniprep處理，實施獲得之DNA之序列解析，命名為「噬粒載體pPR3_stuffer_TEV」。又，操作依(1-1)記載之方法進行。
為了將未導入變異之SPINK2區域放大，將編碼人SPINK2之胺基酸序列之鹼基序列(序列編號14)當作模板，實施使用下列引子7及8、及KOD-plus-之PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 10秒)×30個循環)。
引子7：5’-GGTAGCGATATGAGCACCTATGC-3’
引子8：5’-GCACGGACCATTGCGAATA-3’
將已放大之片段進行瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System製備DNA。將製備之DNA片段作為Insert A。
然後合成含有隨機區(序列表之序列編號1表示之胺基酸序列所對應的區域)之SPINK2寡核苷酸。
UUU、VVV、WWW及XXX，代表從A、T、G、C之中選出之任意鹼基。
UUU包含編碼排除Cys、Pro之18種胺基酸(Ala、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Trp、Arg、Lys、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Ser、Met、Gly、Thr)之密碼子。
VVV包含編碼排除Cys之19種胺基酸(Ala、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Trp、Arg、Lys、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Ser、Met、Gly、Thr、Pro)之密碼子。
WWW包含編碼Tyr、Ser、Phe、Leu、Thr之密碼子。
XXX包含編碼Asn、Asp、Leu、Lys、Gln、Ala、Glu之密碼子。
將Insert A及SPINK2寡核苷酸作為模板，實施使用下列引子9及10、及PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶(Agilent)之PCR法((95℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 30秒)×10個循環)。
引子9：5’-GTTTGGTCTGTTTAGCAAATATCGTACCCCGAATTGT-3’
引子10：5’-GCACGGACCATTGCGAATA-3’
將已放大之片段進行瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System製備DNA。將製備之DNA片段作為Insert B。再
者，將Insert B當作模板，實施使用下列引子11及12、及PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶之PCR法((95℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 30秒)×10個循環)。
引子11：5’-AAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAGCAAATAATCGT-3’
引子12：5’-AAAGGCGCGCCGCACGGACCATTGCGAATAATTTTAAT-3’
將已放大之片段進行瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System製備DNA。將製備之DNA片段作為Insert C。將Insert C以限制酶EcoRI(NEB)及AscI(NEB)，噬粒載體pPR3_stuffer_TEV以EcoRI(TAKARA)及MluI(TAKARA)，各於37℃處理5小時以上，並將Insert C使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System精製，將噬粒載體(phagemid vector)進行瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)精製。將精製之片段使用T4 DNA接合酶(NEB)於16℃反應一晚，以實施接合反應。翌日，於65℃進行10分鐘熱處理，以Amicon-Ultra(30k：Millipore)實施DNA之脫鹽。
然後，製備用於轉形之勝任細胞(competent cell)。將前一天於37℃使用2-YT培養基(Invitrogen)培養一晚的XL1-Blue(Stratagene)接種於2-YT培養基，於
37℃培養數小時。冰冷後以離心分離(3,000g、10分鐘、4℃)回收沉澱物，以滅菌水使其懸浮後離心。再者，以10%甘油將沉澱物懸浮後離心分離，再度以10%甘油懸浮後離心分離。最後將沉澱物以10%甘油懸浮，製成勝任細胞。
使用(1-3)製備之DNA與勝任細胞，以電穿孔(1.97kV、186μF)實施轉形。之後使用SOC培養基於37℃進行1小時振盪培養，塗盤在含0.1mg/ml安比西林(和光純藥工業)及2%葡萄糖(nacalai tesque)的2-YT培養盤，於30℃靜置培養。翌日，使用含1%葡萄糖及15%甘油(和光純藥工業)之2-YT溶液回收菌落，並於-80℃保存。又，收集電穿孔後的部分培養液，以系列稀釋後塗盤並靜置培養。翌日，測定菌落數以估計庫大小，確認構建之庫之大小為約1.2×1010。
將(1-4)構建之大腸菌菌落群接種於含0.1mg/ml安比西林及1%葡萄糖之2-YT培養基，製備成OD600nm=0.3之大腸菌懸浮液。於37℃振盪培養直到OD600nm=0.5，加入足夠量之helperphage VCSM13(Stratagene)，於37℃靜置30分鐘，再於37℃實施30分鐘振盪培養。之後於冰上靜置30分鐘，離心分離(3,000g、20分鐘、4℃)，以回收沉澱物，以含0.1mg/ml安比西林、30μg/ml卡那黴素(kanamycin)(nacalai tesque)、0.25mM IPTG(和光純藥工業)之2-YT培養基懸浮，於22℃實施一晚振盪培養。
翌日，以離心分離(9,000g、20分鐘、4℃)回收培養上清液，添加1/4量的20% Polyethylene Glycol 6000(nacalai tesque)及2.5M NaCl(和光純藥工業)溶液，於4℃靜置30分鐘，使噬菌體粒子沉澱(以下稱為「PEG沉澱」)。將PEG沉澱及離心分離(9,000g、30分鐘、4℃)重複2次，將沉澱之噬菌體懸浮於PBS，以製備隨機變異SPINK2噬菌體庫。
使製作之噬菌體溶液對大腸菌XL1-Blue感染，接種於含0.1mg/ml安比西林及1%葡萄糖之2-YT培養盤，測定形成之菌落數。噬菌體庫之力價為1.8×1013phage/ml。
與標的分子結合之SPINK2變異體之挑選
使用EZ-Link NHS-Chromogenic Biotin Reagent(Thermo)，依循附帶的說明書，將(2-4)記載之標的蛋白質進行生物素(biotin)化。
生物素化標的蛋白質與SPINK2變異體展現噬菌體混合後，進行1~12小時反應。反應後，加入Dynabeads M-280 Streptavidin(Invitrogen)(以下簡單稱為「珠粒」)，以使生物素化標的蛋白質接合於珠粒，以含0.05%Tween之PBS(以下稱為「PBS-T」)洗滌指定次數之後，以AcTEVTM Protease(Invitrogen)使其反應30分鐘，以回收結合於珠粒表面之生物素化標的蛋白質的SPINK2變異體展現噬菌體。使回收之噬菌體對大腸菌
XL1-Blue感染，接種於含0.1mg/ml安比西林及1%葡萄糖之2-YT培養盤，於30℃培養一晚。又，液相淘選的第一回合，係使用隨機變異SPINK2噬菌體庫，第二回合以後，係使用從前一回合獲得之大腸菌菌落群製備的噬菌體。
於Nunc Maxisorp平底96孔盤(Nunc)添加一定量的標的蛋白質，於4℃靜置一晚，實施對盤之固定化。又，於Pierce NHS-Activated Agarose Dry Resin(Thermo)添加一定量之標的蛋白質，依附帶的說明書實施對於瓊脂糖之固定化。
將已固定化了標的蛋白質的盤或瓊脂糖與SPINK2變異體展現噬菌體混合，並反應1~12小時。反應後加入珠粒，以使生物素化標的蛋白質結合於珠粒，以PBS-T洗滌指定次數後，以AcTEVTM Protease(Invitrogen)使其反應30分鐘，藉此回收與珠粒表面之生物素化標的蛋白質結合之SPINK2變異體展現噬菌體。使回收之噬菌體對於大腸菌XL1-Blue感染，接種於含0.1mg/ml安比西林及1%葡萄糖之2-YT培養盤，於30℃培養一晚。又，固相淘選之第一回合使用隨機變異SPINK2噬菌體庫，第二回合以後使用從前回合獲得之大腸菌菌落群製備之噬菌體。
將淘選後得到的大腸菌菌落群接種於含0.1mg/ml安比西林及1%葡萄糖之2-YT培養基，製備
OD600nm=0.3之大腸菌懸浮液。於37℃進行振盪培養，培養直到OD600nm=0.5，加入足量的helperphage VCSM13(Stratagene)，於37℃靜置30分鐘，再於37℃進行30分鐘振盪培養。之後於冰上靜置30分鐘，以離心分離(3,000g、20分鐘、4℃)回收沉澱物，使其懸浮於含0.1mg/ml安比西林、30μg/ml卡那黴素(nacalai tesque)、0.25mM IPTG(和光純藥工業)之2-YT培養基，於22℃實施一晚振盪培養。翌日以離心分離回收培養上清液，重複2次PEG沉澱及離心分離，以製備次回合使用之噬菌體溶液。
將下列4種中任一者作為標的蛋白質，實施液相或固相淘選3~5回合。
．胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)(Worthington)
．重組人類血漿激肽釋放酶(Recombinant Human Plasma Kallikrein)(R & D systems)
．重組人類EGFR/Fc(R & D systems：以下稱為「EGFR/Fc」)
．重組人類ErbB2/Fc(R & D systems：以下稱為「HER2/Fc」)
依(2-3)記載之方法，從淘選後之大腸菌群製備SPINK2變異體展現噬菌體。
於Nunc Maxisorp平底96孔盤(Nunc)添加(2-4)記載之標的蛋白質、及作為負對照的無IgG、無蛋白酶之牛血清白蛋白(Jackson ImmunoResearch Laboratories：以下稱為「BSA」)，於4℃靜置一晚，以實施96孔盤之塗覆。然後將從淘選後之大腸菌群製備的SPINK2變異體展現噬菌體作為樣本添加，於室溫靜置1小時。之後去除樣本，以PBS-T洗滌後，添加HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate(GE Healthcare)，於室溫靜置1小時。之後去除HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate，以PBS-T洗滌後，使用POD基質A.B.T.S.套組(nacalai)使其發色，測定於測定波長405nm之吸光度。樣本及HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate之稀釋使用PBS-T。
結果如第1圖~第4圖所示。以ELISA法確認了藉由對於各標的蛋白質之淘選，從隨機變異SPINK2庫濃縮出顯示標的專一性結合性之SPINK2變異體(多選殖體)。
α-胰凝乳蛋白酶結合肽(單一選殖體)之評價
將pIRES Puro3(Clontech)作為模板，實施使用下列引子13及14、及KOD-plus-(TOYOBO)之PCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30個循環)。
5’-AAAGGATCCGCGAATTCATGACCGAGTACAAGCCCAC-3’
5’-AAACTCGAGTTATGCGGCCGCTCAGGCACCGGGCTTGCGG-3’
將已放大之片段進行瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)製備DNA。將製備之DNA片段及pET 32a(+)(Novagen)各使用限制酶BamHI(TAKARA)及XhoI(TAKARA)於37℃處理1小時以上，瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)精製。將精製之片段使用T4DNA接合酶於16℃反應一晚，以實施接合反應，將大腸菌JM109轉形。培養已被轉形的大腸菌後，實施miniprep及序列解析，以建構「pET 32a(變化形)」。又，操作依(1-1)記載之方法進行。
使用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen)，依循附帶的說明書，從淘選後之大腸菌群回收噬粒載體(phagemid vector)。將回收之載體及pET 32a(變化形)使用限制酶EcoRI(TAKARA)及NotI(TAKARA)於37℃處理1小時以上，瓊脂糖電泳後，切出理想的DNA片段，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)精製。將已精製之片段使用T4 DNA接合酶(NEB)於16℃反應一晚以進行接合反應，並實施大腸菌JM109之轉形。又，操作依(1-1)記載之方法進行。以利用Miniprep回收之質體將大腸菌Origami B(DE3)(Novagen)轉形，並接種於含0.1mg/ml安比西林之2-YT培養盤。
然後將菌落接種於含0.1mg/ml安比西林之2-YT培養基，於37℃培養一晚後，將其一部分再度接種於含0.1mg/ml安比西林之2-YT培養基，培養至成為OD600nm=1左右。之後加入IPTG(最終濃度1mM)，於16℃培養一晚，以實施表現誘導。翌日，以離心分離(3,000g、20分鐘、4℃)收集菌體後，添加BugBuster Master Mix(Novagen)，於室溫攪拌20分鐘。對於以離心分離(10,000g、20分鐘、4℃)回收之上清液加入TALON金屬親和性樹脂(Metal Affinity Resin)(TAKARA)，於4℃攪拌1小時以上，使His tag融合之目的蛋白質吸附於該樹脂。以磷酸鈉緩衝液(50mM Sodium Phosphate、300mM NaCl、pH7.4)洗滌樹脂數次後，添加溶出液(50mM Sodium Phosphate、300mM NaCl、150mM imidazol、pH7.4)以回收His tag融合蛋白質。再者，使用Thrombin cleavage capture kit(Novagen)切斷Thioredoxin tag，並添加到TALON以去除Thioredoin tag。最後使用Amicon-Ultra(3k)實施目的蛋白質之濃縮及PBS之取代。製備之目的蛋白質(SPINK2變異體)以還原及非還原狀態進行SDS-PAGE，以嘗試分子狀態之解析。
結果如第5及6圖。所有的選殖體，於還原及非還原狀態呈現單一染色帶(band)，故可確認表現精製之目的蛋白質之分子狀態係以單體為主成分。
為了確認(3-2)製備之SPINK2變異體(α-胰凝乳蛋白酶結合體)之標的結合專一性，以ELISA法實施評價。於Nunc Maxisorp平底96孔盤添加標的蛋白質胰凝乳蛋白酶於4℃靜置一晚，以進行96孔盤之塗覆。然後添加(3-2)製備之SPINK2變異體作為樣本，於室溫靜置1小時。之後去除樣本，以PBS-T洗滌後，添加S-Tag Antibody Affinity Purified HRP conjugated(BETHYL)，於室溫靜置1小時。之後去除檢測抗體溶液，以PBS-T洗滌後，使用POD基質A.B.T.S.套組使其發色，測定於測定波長405nm之吸光度。樣本及S-Tag Antibody Affinity Purified HRP conjugated之稀釋使用PBS-T。
結果如第7及8圖。以大腸菌製備之SPINK2變異體均對標的有結合性。又，ELISA呈現S型曲線，故可從ELISA檢測之信號強度之最低值及最大反應計算呈現最大反應之50%之濃度，亦即EC50，確認肽編號2(選殖體2)之結合活性值EC50為18.3nM、肽編號6(選殖體6)之EC50為17.8nM。
於Nunc Maxisorp平底96孔盤添加標的蛋白質胰凝乳蛋白酶及負對照胰蛋白酶(PIERCE)，於4℃靜置一晚，以進行96孔盤之塗覆。然後添加(3-2)製備之SPINK2變異體作為樣本，於室溫靜置1小時。之後將樣本去除，以PBS-T洗滌後，添加S-Tag Antibody Affinity Purified HRP conjugated，於室溫靜置1小時。之後去除
檢測抗體溶液，以PBS-T洗滌後，使用POD基質A.B.T.S.套組使其發色，測定於測定波長405nm之吸光度。樣本及S-Tag Antibody Affinity Purified HRP conjugated之稀釋係使用PBS-T。
結果如第9圖及10。肽編號2及6(選殖體2及6)對於胰蛋白酶完全未顯示反應性，但對於標的蛋白質胰凝乳蛋白酶顯示強反應，可發現具有標的專一性的結合。
關於標的蛋白質胰凝乳蛋白酶，使用(3-2)製備之SPINK2變異體及Pierce Quantitative Protease Assay Kit定量抑制活性。操作依附帶的說明書實施。
結果如第11圖。肽編號2及6(選殖體2及6)均顯示抑制活性，各自的IC50分別為815nM、374nM。
實施於(3-3)對於胰凝乳蛋白酶顯示結合性之SPINK2變異體(α-胰凝乳蛋白酶結合肽)之序列解析。將以各SPINK2變異體轉形而得之大腸菌Origami B(DE3)使用含0.1mg/ml安比西林之2-YT培養基於37℃培養一晚，翌日使用QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit從培養物回收質體DNA。將該質體DNA作為模板，並使用有以下鹼基序列之引子15實施鹼基序列解析。
引子15：5’-GTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATC-3’
隨機化區域(隨機區)之解析結果如第12圖。所有的SPINK2變異體之隨機化區域具有不同的鹼基序列。
本發明之肽庫可使用於搜尋與各種標的分子結合之肽，於檢驗試劑、診斷試劑等研究有用。又，與預先確定之標的分子結合之肽作為檢驗試劑、診斷試劑等有用。
序列表之序列編號1-伴隨多樣性之肽之隨機區(第13圖)
序列表之序列編號2-胰凝乳蛋白酶結合肽之隨機區(第12圖：肽編號1)
序列表之序列編號3-胰凝乳蛋白酶結合肽之隨機區(第12圖：肽編號2)
序列表之序列編號4-胰凝乳蛋白酶結合肽之隨機區(第12圖：肽編號6)
序列表之序列編號5-胰凝乳蛋白酶結合肽之隨機區(第12圖：肽編號7)
序列表之序列編號6-胰凝乳蛋白酶結合肽之隨機區(第12圖：肽編號12)
序列表之序列編號7-胰凝乳蛋白酶結合肽之隨機區(第12圖：肽編號13)
序列表之序列編號8-胰凝乳蛋白酶結合肽之隨機區(第12圖：肽編號14)
序列表之序列編號9-胰凝乳蛋白酶結合肽之隨機區(第12圖：肽編號17)
序列表之序列編號10-片段1(第14圖)
序列表之序列編號11-片段2(第15圖中之底線部)
序列表之序列編號12-片段3(第16圖)
序列表之序列編號13-片段5(第17圖)
序列表之序列編號14-編碼SPINK2之胺基酸序列之鹼基序列(第18圖)
序列表之序列編號15-編碼序列表之序列編號14表示之鹼基序列之胺基酸序列
序列表之序列編號16-含片段1~片段5之PCR用模板DNA之鹼基序列
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 肽庫及其利用
<130> FP1328
<150> 2012-176208
<151> 2012-08-08
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 有多樣性的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(8)
<223> 任意胺基酸
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)..(14)
<223> 任意胺基酸
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合於alpha-胰凝乳蛋白酶之肽編號1
<400> 2
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合於alpha-胰凝乳蛋白酶之肽編號2
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合於alpha-胰凝乳蛋白酶之肽編號6
<400> 4
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合於alpha-胰凝乳蛋白酶之肽編號7
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合於alpha-胰凝乳蛋白酶之肽編號12
<400> 6
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合於alpha-胰凝乳蛋白酶之肽編號13
<400> 7
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合於alpha-胰凝乳蛋白酶之肽編號14
<400> 8
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 結合於alpha-胰凝乳蛋白酶之肽編號17
<400> 9
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段1
<400> 10
<210> 11
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段2
<400> 11
<210> 12
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段3
<400> 12
<210> 13
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段5
<400> 13
<210> 14
<211> 192
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(192)
<400> 14
<210> 15
<211> 63
<212> PRT
<213> 人
<400> 15
<210> 16
<211> 1916
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 包含片段1至5之PCR用的模板DNA
<400> 16
Claims (54)
- 一種肽，係選自於下列(i)或(ii)：(i)一肽，包含如以下的胺基酸序列：序列表之序列編號14中包含第43位鹼基之胸腺嘧啶至第93位之胸腺嘧啶而構成之鹼基序列置換為編碼序列表之序列編號1表示之胺基酸序列的鹼基序列而成的鹼基序列所編碼之胺基酸序列；及(ii)如(i)之肽，具有如以下的胺基酸序列：序列表之序列編號1表示之胺基酸序列之胺基酸編號2至8及10至14以外之1個以上5個以下之胺基酸經過胺基酸取代、缺失、加成及/或插入而成之胺基酸序列。
- 如請求項1之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起1位至5位、7位、9位及10位之Xaa各為排除半胱胺酸及脯胺酸之任意之胺基酸。
- 如請求項1或2之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起6位及8位之Xaa各為排除半胱胺酸之任意之胺基酸。
- 如請求項1至3中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起11位之Xaa係選自於由酪胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸、白胺酸及蘇胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至4中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起12位之Xaa係選自於由天冬醯胺酸、天冬胺酸、白胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸及麩胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至5中任一項之肽，其中保守性胺基酸取代係於選自於疏水性胺基酸群組、中性親水性胺基酸群組、酸性胺基酸群組、鹼性胺基酸群組、影響主鏈方位之胺基酸之群組、及芳香族胺基酸群組中之任一群內進行。
- 如請求項1至6中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起1位之Xaa係選自於由精胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、色胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至7中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起2位之Xaa係選自於由蘇胺酸、精胺酸、色胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至8中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起3位之Xaa係選自於由精胺酸、組胺酸、色胺酸、絲胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至9中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起4位之Xaa係選自於由色胺酸、精胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至10中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起5位之Xaa係選自於由甘胺酸、精胺酸、白胺酸、組胺酸、色胺酸、甲硫胺酸及酪胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至11中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起6位之Xaa係選自於由天冬醯 胺酸、組胺酸、脯胺酸、離胺酸、色胺酸、精胺酸及天冬胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至12中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起7位之Xaa係選自於由精胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、白胺酸、丙胺酸及甘胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至13中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起8位之Xaa係選自於由蘇胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至14中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起9位之Xaa係選自於由色胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至15中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起10位之Xaa係選自於由麩醯胺酸、纈胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、白胺酸及天冬醯胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至16中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起11位之Xaa係選自於由酪胺酸、苯丙胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸。
- 如請求項1至17中任一項之肽，其中序列表之序列編號1之胺基末端數起12位之Xaa為離胺酸。
- 如請求項1至18中任一項之肽，包含序列表之序列編號2至9(第12圖之肽編號1、2、6、7、12至14及17)中任一者表示之胺基酸序列。
- 一種肽之衍生物，係對於如請求項1至19中任一項之肽施以化學性修飾及/或生物學性修飾而成。
- 一種核苷酸，係下列(i)至(iii)中任一者：(i)包含由編碼如請求項1至19中任一項之肽具有之胺基酸序列之鹼基序列構成之核苷酸而成的核苷酸；(ii)包含編碼如請求項1至19中任一項之肽具有之胺基酸序列之鹼基序列而成之核苷酸；及、(iii)由編碼如請求項1至19中任一項之肽具有之胺基酸序列的鹼基序列構成的核苷酸。
- 一種載體，係包含如請求項21之核苷酸而成。
- 一種細胞，係導入有如請求項21之核苷酸或如請求項22之載體。
- 一種肽之製造方法，係製造如請求項1至19中任一項之肽，包含下列步驟(i)及(ii)而成：(i)培養如請求項23之細胞；及(ii)從步驟(i)獲得之培養物回收該肽。
- 一種肽庫，係包含如請求項1至19中任一項之肽及/或如請求項20之肽之衍生物而成。
- 如請求項25之肽庫，其中肽及/或肽之衍生物係依照如請求項24之包含步驟(i)及(ii)而成之方法製備者。
- 如請求項25或26之肽庫，其中於庫中，係表現型(phenotype)之該肽或肽衍生物及係對應於該表現型之基因型(genotype)的核苷酸為直接或間接地連結。
- 如請求項27之肽庫，其中核苷酸係如請求項21之核苷酸。
- 如請求項25至28中任一項之肽庫，其係噬菌體呈現庫、核糖體呈現庫或核酸呈現庫。
- 一種肽或肽衍生物之鑑定方法，係與標的分子結合之如請求項1至19中任一項之肽或如請求項20之肽衍生物之鑑定方法，包含下列(i)及(ii)之步驟而成：(i)使如請求項25至29中任一項之肽庫所含之肽或肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)回收結合於該標的分子之肽或肽衍生物。
- 一種肽或肽衍生物之製造方法，係與標的分子結合之如請求項1至19中任一項之肽或如請求項20之肽衍生物之製造方法，包含下列(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如請求項25至29中任一項之肽庫所含之肽或肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)回收結合於該標的分子之肽或肽衍生物；及、(iii)利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備於該(ii)回收之該肽或肽衍生物所含之結合於該標的分子之肽。
- 一種肽或肽衍生物之判定方法，係如請求項1至19中任一項之肽或如請求項20之肽衍生物是否會與標的分子結合之判定方法，包含下列(i)及(ii)之步驟而成：(i)使如請求項1至19中任一項之待檢測肽或如請求項20之待檢測肽衍生物與該標的分子接觸；及 (ii)當待檢測肽或待檢測肽衍生物結合於該標的分子的情形，確定該肽或待檢測肽衍生物係陽性。
- 一種肽或肽衍生物之製造方法，係結合於標的分子之如請求項1至19中任一項之肽或如請求項20之肽之衍生物之製造方法，包含下列(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如請求項1至19中任一項之待檢測肽或如請求項20之待檢測肽衍生物與該標的分子接觸；(ii)當待檢測肽或待檢測肽衍生物結合於該標的分子的情形，確定該肽或待檢測肽衍生物係陽性；及(iii)於步驟(ii)中判定待檢測肽或肽衍生物係陽性的情形，利用基因重組或體外轉譯製備該肽或肽衍生物所含之結合於標的分子之肽。
- 一種核苷酸庫，係包含如請求項21之核苷酸而成。
- 如請求項34之核苷酸庫，其中核苷酸係噬粒(phagemid)、黏質體(cosmid)或質體或其片段。
- 如請求項34或35之核苷酸庫，其中核苷酸存在於原核或真核細胞內、或病毒DNA或RNA上、或病毒粒子中。
- 一種組成物，其包含：如請求項1至19中任一項之肽、如請求項20之肽之衍生物、如請求項21之核苷酸、如請求項22之載體或如請求項23之細胞。
- 一種試藥，其包含：如請求項1至19中任一項之肽、如請求項20之肽之衍生物、如請求項21之核苷酸、如請求項22之載體或如請求項23之細胞。
- 如請求項1至19中任一項之肽、或如請求項20之肽之衍生物，其係結合於預先確定的標的分子。
- 如請求項39之肽或肽之衍生物，其中標的分子並非SPINK2之內在性標的。
- 如請求項39或40之肽或肽之衍生物，其中標的分子係來自於人。
- 如請求項39至41中任一項之肽或肽之衍生物，其中內在性標的為胰蛋白酶及/或頂體酶(acrosin)。
- 如請求項39至42中任一項之肽或肽之衍生物，其中內在性標的為胰蛋白酶。
- 一種組成物或試藥，包含如請求項39至43中任一項之肽或肽之衍生物。
- 一種肽或肽衍生物之鑑定方法，係結合於胰蛋白酶及/或頂體酶以外之絲胺酸蛋白酶且抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性之如請求項1至19中任一項之肽或如請求項20之肽衍生物之鑑定方法，包含下列(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如請求項25至29中任一項之肽庫所含之肽或肽衍生物與該絲胺酸蛋白酶接觸；(ii)回收結合於該絲胺酸蛋白酶之肽或肽衍生物；及(iii)當該肽或肽衍生物抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性的情形，判定該肽或肽衍生物為陽性。
- 一種肽或肽衍生物之製造方法，係結合於胰蛋白酶及/或頂體酶以外之絲胺酸蛋白酶且抑制其蛋白質分解活性之如請求項1至19中任一項之肽或如請求項20之肽衍生物之製造方法，包含下列(i)至(iv)之步驟而成：(i)使如請求項25至29中任一項之肽庫所含之抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性的肽或肽衍生物與該絲胺酸蛋白酶接觸；(ii)回收結合於該絲胺酸蛋白酶之肽或肽衍生物；及(iii)當於步驟(ii)回收之肽或肽衍生物抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性的情形，判定該肽或肽衍生物為陽性；及(iv)利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備於步驟(iii)判定為陽性之肽或肽衍生物所含之肽。
- 一種肽或肽衍生物之判定方法，係如請求項1至19中任一項之肽或如請求項20之肽之衍生物是否會抑制胰蛋白酶及/或頂體酶以外之絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性之判定方法，包含下列(i)及(ii)之步驟而成：(i)使如請求項1至19中任一項之待檢測肽或如請求項20之待檢測肽衍生物與該絲胺酸蛋白酶接觸；及(ii)當該肽或肽衍生物抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性的情形，判定該肽或肽衍生物為陽性。
- 一種肽或肽衍生物之製造方法，係抑制胰蛋白酶及/或頂體酶以外之絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性之如請求項1至19中任一項之肽或如請求項20之肽之衍生物之製造方法，包含下列(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如請求項1至19中任一項之待檢測肽或如請求項20之待檢測肽衍生物與該絲胺酸蛋白酶接觸；(ii)當該肽或肽衍生物抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性的情形，判定該肽或肽衍生物為陽性；及(iii)利用基因重組或體外轉譯製備於步驟(ii)判定為陽性之肽或肽衍生物所含之抑制該絲胺酸蛋白酶擁有之蛋白質分解活性之肽。
- 一種肽，選自下列(i)或(ii)：(i)一肽，包含序列表之序列編號1表示之胺基酸序列且係下列(1)至(4)之肽：(1)序列表之序列編號1之胺基末端數起1位至5位、7位、9位及10位之Xaa各為排除半胱胺酸及脯胺酸之任意胺基酸、(2)序列表之序列編號1之胺基末端數起6位及8位之Xaa各為排除半胱胺酸之任意胺基酸、(3)序列表之序列編號1之胺基末端數起11位之Xaa係選自於由酪胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸、白胺酸及蘇胺酸構成之群組中之胺基酸、(4)序列表之序列編號1之胺基末端數起12位之Xaa係選自於由天冬醯胺酸、天冬胺酸、白胺酸、離胺 酸、麩醯胺酸、丙胺酸及麩胺酸構成之群組中之胺基酸；及、(ii)一肽，包含序列表之序列編號1表示之胺基酸序列中從胺基末端數起1位至12位之Xaa以外之1個以上5個以下之胺基酸經過保守性胺基酸取代、缺失、加成及/或插入而成之胺基酸序列。
- 如請求項49之肽，其中保守性胺基酸取代係於選自於疏水性胺基酸群組、中性親水性胺基酸群組、酸性胺基酸群組、鹼性胺基酸群組、影響主鏈方位之胺基酸之群組、及芳香族胺基酸群組中之任一群組內進行。
- 如請求項49或50之肽，且係下列(1)至(12)之肽：(1)序列表之序列編號1之胺基末端數起1位之Xaa係選自於由精胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、色胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸、(2)序列表之序列編號1之胺基末端數起2位之Xaa係選自於由蘇胺酸、精胺酸、色胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸、(3)序列表之序列編號1之胺基末端數起3位之Xaa係選自於由精胺酸、組胺酸、色胺酸、絲胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸、(4)序列表之序列編號1之胺基末端數起4位之Xaa係選自於由色胺酸、精胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸、 (5)序列表之序列編號1之胺基末端數起5位之Xaa係選自於由甘胺酸、精胺酸、白胺酸、組胺酸、色胺酸、甲硫胺酸及酪胺酸構成之群組中之胺基酸、(6)序列表之序列編號1之胺基末端數起6位之Xaa係選自於由天冬醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、離胺酸、色胺酸、精胺酸及天冬胺酸構成之群組中之胺基酸、(7)序列表之序列編號1之胺基末端數起7位之Xaa係選自於由精胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、白胺酸、丙胺酸及甘胺酸構成之群組中之胺基酸、(8)序列表之序列編號1之胺基末端數起8位之Xaa係選自於由蘇胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸及絲胺酸構成之群組中之胺基酸、(9)序列表之序列編號1之胺基末端數起9位之Xaa係選自於由色胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸及苯丙胺酸構成之群組中之胺基酸、(10)序列表之序列編號1之胺基末端數起10位之Xaa係選自於由麩醯胺酸、纈胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、白胺酸及天冬醯胺酸構成之群組中之胺基酸、(11)序列表之序列編號1之胺基末端數起11位之Xaa係選自於由酪胺酸、苯丙胺酸及白胺酸構成之群組中之胺基酸、(12)序列表之序列編號1之胺基末端數起12位之Xaa為離胺酸。
- 一種肽之衍生物，係對於如請求項49至51中任一項之肽施以化學性修飾及/或生物學性修飾而成。
- 如請求項49至51中任一項之肽或如請求項52之肽之衍生物，係結合於預先確定之標的分子。
- 如請求項53之肽或肽之衍生物，其中標的分子並非SPINK2之內在性標的。
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