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TW202029967A - 用於治療用途之經工程改造之靈長目動物胱胺酸/半胱胺酸降解酵素 - Google Patents

用於治療用途之經工程改造之靈長目動物胱胺酸/半胱胺酸降解酵素 Download PDF

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TW202029967A
TW202029967A TW108138620A TW108138620A TW202029967A TW 202029967 A TW202029967 A TW 202029967A TW 108138620 A TW108138620 A TW 108138620A TW 108138620 A TW108138620 A TW 108138620A TW 202029967 A TW202029967 A TW 202029967A
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TW
Taiwan
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modified
enzyme
cgl
cysteine
cgl enzyme
Prior art date
Application number
TW108138620A
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English (en)
Inventor
伊凡特 史登
呂韋成
克里斯托 卡拉彌托
Original Assignee
美國德州系統大學評議委員會
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Publication date
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Abstract

所說明的是有關於具有L-(半)胱胺酸降解酵素活性的蛋白質之工程改造之方法及組成物。例如，所揭示者係經修飾之胱硫醚-γ-解離酶，其包含一或多個胺基酸取代且能夠降解L-(半)胱胺酸。又，提供用於使用所揭示之經修飾之酵素或編碼該酵素之核酸來治療胱胺酸尿症之組成物及方法。

Description

用於治療用途之經工程改造之靈長目動物胱胺酸/半胱胺酸降解酵素
所揭示的是係經重組工程改造之靈長目動物酵素變異體，其具有高胱胺酸/半胱胺酸降解活性，適合用於人類治療。亦提供的是用於以消耗L-胱胺酸及L-半胱胺酸兩者的酵素來治療胱胺酸尿症之組成物及方法。
胱胺酸尿症是一種遺傳性障礙，由編碼腎臟近端小管的胱胺酸和二元胺基酸運輸蛋白的SLC3A1 和SLC7A9 基因突變引起，導致胱胺酸(胺基酸半胱胺酸的二硫化物形式)異常排泄和在尿道中的胱胺酸晶體/結石形成。患有遺傳性障礙胱胺酸尿症的患者可用的治療劑極少，其中缺陷的腎臟運輸蛋白在腎濾過期間無法再回收(re-uptake)胱胺酸。胱胺酸是胺基酸L-半胱胺酸的二硫化物形式，高度不溶，且在胱胺酸尿症患者中，尿道中的濃度很高，從而導致胱胺酸晶體和結石的形成。現有的降低循環胱胺酸水平的療法部分地防止了尿道結石形成，但是具有極嚴重的不良反應，限制了它們的使用。需要減少和預防腎臟和膀胱中胱胺酸結石形成的療法。
本發明涉及靈長目動物胱硫醚-γ-解離酶("CGL")酵素之工程改造，而使L-胱胺酸和L-半胱胺酸(在本文中稱為"L-(半)胱胺酸")可自血清有效率地降解，並以適合用於人類治療的調製劑來提供經修飾之CGL酵素。為了開發相較於天然酵素展現低KM 和高催化活性kcat 的酵素，藉由修飾經選擇的胺基酸來工程改造天然酵素，該修飾導致具有顯著改善酵素學性質的酵素。由此，如本文中所述，經修飾之CGL酵素藉由提供包含具有改善的L-(半)胱胺酸降解催化活性的人或靈長目動物多肽序列的新穎酵素，而克服本技術領域的重大缺失。由於該酵素包含人類序列，因此不太可能誘發不良免疫反應。由此，這些經修飾之酵素可適合用於人類治療並且具有低致免疫性。
所揭示之利用經工程改造之人胱硫醚-γ-解離酶(CGL)酵素之方法，該酵素有效率地轉化胱胺酸至半胱胺酸-過硫化物，其隨後衰解(decay)至游離半胱胺酸和H2 S，藉由防止胱胺酸在腎臟和泌尿道素累積和結石形成，而使其係用於治療胱胺酸尿症患者之適合療法。此外，經工程改造之人CGL酵素可轉化半胱胺酸至丙酮酸、氨、和硫化氫，實際上減少可氧化以形成胱胺酸的半胱胺酸之量。由於胱胺酸是非必需胺基酸，其正常上由大多數細胞所製造，因此在動物模式中，未發現長期胱胺酸的消耗誘發毒性。胱胺酸降解治療劑無毒消融循環中胱胺酸總量的能力表明，與現有治療方案相比，它是用於預防胱胺酸結石形成的優異治療方案。
在本文中所提供者係衍生自靈長目動物CGL酵素的具有L-(半)胱胺酸降解活性的經修飾之CGL酵素。經修飾之CGL酵素可衍生自人CGL酵素(SEQ ID NO: 1)、蘇門達臘猩猩(Pongo abelii) CGL酵素 (Genbank ID: NP_001124635.1；SEQ ID NO: 2)、食蟹獼猴(Macaca fascicularis) CGL酵素(Genbank ID: AAW71993.1；SEQ ID NO: 3)、黑猩猩 (Pan troglodytes) CGL酵素(Genbank ID: XP_513486.2；SEQ ID NO: 4)、或侏儒黑猩猩(Pan paniscus) CGL酵素(Genbank ID: XP_003830652.1；SEQ ID NO: 5)。天然 CGL酵素可藉由一或多種其他修飾來修飾，諸如化學修飾、取代、插入、缺失及/或截短。
經修飾之CGL酵素可藉由在SEQ ID NO: 1-5的胺基酸位置 51、55、59、91、163、189、193、200、234、311、336、339、及/或353之一個、二個、三個、四個或更多個取代來修飾而衍生自天然靈長目動物之CGL酵素。在這些實例中，各序列的第一個甲硫胺酸對應胺基酸位置1，並且各胺基酸從其開始依序編號。胺基酸位置51的取代可係色胺酸(W)、位置55可係麩胺酸(E)、位置59可係蘇胺酸(T)或異白胺酸(I)、位置91可係甲硫胺酸(M)或絲胺酸(S)、位置163可係精胺酸(R)、位置189可係絲胺酸(S)、位置193可係甘胺酸(G)或丙胺酸(A)、位置200可係脯胺酸(P)或組胺酸(H)、位置234可係離胺酸(K)、位置311可係甘胺酸(G)、位置336可係天冬胺酸(D)、位置339可係纈胺酸(V)、及/或位置353可係絲胺酸(S)。
經修飾之CGL酵素可具有根據SEQ ID NO: 6-95的胺基酸序列。經修飾之CGL酵素在生理條件下可係能夠降解L-(半)胱胺酸。經修飾之CGL酵素對L-(半)胱胺酸可具有至少係或約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104 、105 、106 s−1 M−1 或其中可推及之任何範圍的催化效率 (k cat /K M )。例示性的CGL酵素對L-胱胺酸可具有＞ 104 s-1 M-1 的催化效率，對於L-半胱胺酸可具有＞ 103 s-1 M-1 的催化效率。
取代可係人CGL的P193A、T311G、E339V和I353S的組合(例如，具有 SEQ ID NO: 6的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。例如，SEQ ID NO: 1中的I353對於SEQ ID NO: 2的之等效替換會修飾纈胺酸而非如 SEQ ID NO: 1中之異白胺酸。取代可係人CGL的A200P、T311G、E339V和I353S的組合(例如，具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的P193A、A200P、T311G、E339V和I353S的組合(例如，具有SEQ ID NO: 8 的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的 H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、和 E339V 的組合(例如，具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。例如，SEQ ID NO: 1中的E59對於SEQ ID NO: 2的之等效替換會修飾纈胺酸而非如 SEQ ID NO: 1 中之麩醯胺酸。取代可係人CGL的H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、和E339V的組合(例如，具有 SEQ ID NO: 10的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的T189S、P193G、T311G、E339V和I353S的組合(例如，具有 SEQ ID NO: 11 的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的 T163R、T311G、E339V 和 I353S 的組合(例如，具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。例如，SEQ ID NO: 1中的T163對於SEQ ID NO: 3的之等效替換會修飾纈胺酸而非如SEQ ID NO: 1中之蘇胺酸。取代可係人CGL的A51W、H55E、E59T、T336D和E339V的組合(例如，具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的 H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、和I353S的組合(例如，具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的A200H、T311G、E339V和I353S的組合(例如，具有 SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人 CGL的T311G、E339V和I353S的組合(例如，具有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的E59I、E339V和 I353S的組合(例如，具有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的L91M和E339V的組合(例如，具有 SEQ ID NO: 18的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的E339V和I353S的組合(例如，具有SEQ ID NO: 19的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。取代可係人CGL的E339V (例如，具有SEQ ID NO: 20的胺基酸序列或其片段或同源物之經修飾之多肽)。
經修飾之多肽可係蘇門達臘猩猩CGL-P193A-T311G-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 24)、蘇門達臘猩猩CGL-A200P-T311G-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 25)、蘇門達臘猩猩CGL-P193A-A200P-T311G-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 26)、蘇門達臘猩猩CGL-H55E-V59T-L91M-N234K-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 27)、蘇門達臘猩猩CGL-H55E-V59T-L91S-N234K-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 28)、蘇門達臘猩猩CGL-T189S-P193G-T311G-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 29)、蘇門達臘猩猩CGL-T163R-T311G-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 30)、蘇門達臘猩猩CGL-A51W-H55E-V59T-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 31)、蘇門達臘猩猩 CGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 32)、蘇門達臘猩猩CGL-A200H-T311G-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 33)、蘇門達臘猩猩CGL-T311G-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 34)、蘇門達臘猩猩CGL-V59I-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 35)、蘇門達臘猩猩CGL-L91M-E339V突變體(SEQ ID NO: 36)、蘇門達臘猩猩CGL-E339V-V353S突變體(SEQ ID NO: 37)、或蘇門達臘猩猩CGL-E339V突變體(SEQ ID NO: 38)。
經修飾之多肽可係食蟹獼猴CGL-P193A-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 42)、食蟹獼猴CGL-A200P-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 43)、食蟹獼猴CGL-P193A-A200P-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 44)、食蟹獼猴CGL-H55E-E59T-L91M-N234K-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 45)、食蟹獼猴CGL-H55E-E59T-L91S-N234K-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 46)、食蟹獼猴CGL-T189S-P193G-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 47)、食蟹獼猴CGL-V163R-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 48)、食蟹獼猴CGL-A51W-H55E-E59T-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 49)、食蟹獼猴CGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 50)、食蟹獼猴CGL-A200H-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 51)、食蟹獼猴CGL-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 52)、食蟹獼猴CGL-E59I-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 53)、食蟹獼猴CGL-L91M-E339V突變體(SEQ ID NO: 54)、食蟹獼猴CGL-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 55)、或食蟹獼猴CGL-E339V突變體(SEQ ID NO: 56)。
經修飾之多肽可係黑猩猩CGL-P193A-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 60)、黑猩猩CGL-A200P-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 61)、黑猩猩CGL-P193A-A200P-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 62)、黑猩猩CGL-H55E-E59T-L91M-N234K-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 63)、黑猩猩CGL-H55E-E59T-L91S-N234K-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 64)、黑猩猩CGL-T189S-P193G-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 65)、黑猩猩CGL-T163R-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 66)、黑猩猩CGL-A51W-H55E-E59T-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 67)、黑猩猩 CGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 68)、黑猩猩CGL-A200H-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 69)、黑猩猩CGL-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 70)、黑猩猩 CGL-E59I-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 71)、黑猩猩CGL-L91M-E339V突變體(SEQ ID NO: 72)、黑猩猩CGL-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 73)、或黑猩猩 CGL-E339V突變體(SEQ ID NO: 74)。
經修飾之多肽可係侏儒黑猩猩CGL-P193A-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 78)、侏儒黑猩猩CGL-A200P-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 79)、侏儒黑猩猩CGL-P193A-A200P-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 80)、侏儒黑猩猩CGL-H55E-E59T-L91M-N234K-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 81)、侏儒黑猩猩CGL-H55E-E59T-L91S-N234K-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 82)、侏儒黑猩猩 CGL-T189S-P193G-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 83)、侏儒黑猩猩CGL-T163R-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 84)、侏儒黑猩猩CGL-A51W-H55E-E59T-T336D-E339V突變體(SEQ ID NO: 85)、侏儒黑猩猩CGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 86)、侏儒黑猩猩CGL-A200H-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 87)、侏儒黑猩猩CGL-T311G-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 88)、侏儒黑猩猩CGL-E59I-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 89)、侏儒黑猩猩CGL-L91M-E339V突變體(SEQ ID NO: 90)、侏儒黑猩猩CGL-E339V-I353S突變體(SEQ ID NO: 91)、或侏儒黑猩猩CGL-E339V突變體(SEQ ID NO: 92)。
如在本文中所討論之經修飾之CGL酵素的特徵在於，相較於未經修飾之CGL酵素(例如，天然CGL酵素)具有某些相同度百分比。例如，未經修飾之CGL酵素可係天然靈長目動物胱硫醚酶(即，胱硫醚-γ-解離酶 (cystathionine-γ-lyase))。經修飾之CGL酵素的未經修飾部分(即，排除在 SEQ ID NO: 1-5的胺基酸位置51、55、59、91、163、189、193、200、234、311、336、339及/或353的任何取代的經修飾之CGL酵素序列，參見圖 1)與天然CGL酵素之間的相同度百分比可係至少90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%(或其中可推及之任何範圍)。亦涵蓋的是，上述討論的相同度百分比可關於相較於對應的天然酵素之未經修飾區域的酵素特定經修飾之區域。例如，經修飾之CGL酵素可含有經修飾或突變體之受質辨識位點，其可基於該經修飾或突變體之受質辨識位點之胺基酸序列對來自相同物種或跨物種未經修飾之或天然CGL酵素之胺基酸序列相同度來表徵。例如，特徵在於與未經修飾之人CGL酵素具有至少 90%同一性的經修飾之人CGL酵素，意指經修飾之人CGL酵素中至少 90%的胺基酸與未經修飾之人CGL酵素中的胺基酸相同。
經修飾之CGL酵素可經連接至異源性胜肽序列或多醣。例如，經修飾之CGL酵素可經連接至異源性胜肽序列而為融合蛋白。經修飾之CGL酵素可經連接至胺基酸序列，諸如IgG Fc、白蛋白、白蛋白結合胜肽或XTEN多肽，以增加體內半生期。經修飾之CGL酵素可經連接至聚唾液酸聚合物。
為了增加血清持久性，經修飾之CGL酵素可經連接至與一或多種聚醚分子。聚醚可係聚乙二醇(PEG)。經修飾之CGL酵素可經由特定胺基酸殘基而連接至PEG，諸如離胺酸或半胱胺酸。為了治療性投予，經修飾之CGL酵素本身可經分散於醫藥上可接受之載體。
所涵蓋的係一種核酸，其編碼經修飾之CGL酵素。該核酸可係經密碼子優化，以在諸如大腸桿菌之細菌中表現。針對在大腸桿菌中表現SEQ ID NO: 6-20所提供之經修飾之CGL酵素而最佳化的密碼子之核酸係分別提供於SEQ ID NO: 96-110中。或者，該核酸可係經密碼子優化，以在真菌(例如酵母菌)、昆蟲、或哺乳動物中表現。進一步所涵蓋的是含有此類核酸的載體，諸如表現載體。編碼經修飾之CGL酵素之核酸可經可操作地連接至啟動子，其包括但不限於異源性啟動子。經修飾之CGL酵素可藉由載體(例如基因療法載體)遞送至標靶細胞。此等載體可業經重組DNA技術修飾，以使編碼經修飾之CGL之核酸在標靶細胞中表現。這些載體可衍生自非病毒(例如質體)或病毒(例如腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒、慢病毒、疱疹病毒、或痘瘡病毒)來源的載體。非病毒載體可與劑複合以促進DNA跨細胞膜進入。此類非病毒載體複合物的實例包括具有促進DNA的濃緻(condensation)之聚陽離子劑的調製劑，以及基於脂質的遞輸系統。基於脂質的遞送系統包括基於脂質體的核酸遞輸。
所提供者係包含此類載體的宿主細胞。宿主細胞可係細菌(例如大腸桿菌)、真菌細胞(例如酵母菌)、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞。
載體可經引入至宿主細胞中以表現經修飾之CGL酵素。經修飾之CGL酵素可以任何適合的方式表現。經修飾之CGL酵素可在宿主細胞中表現，使得蛋白質係經醣苷化。或者，經修飾之CGL酵素可在宿主細胞中表現，使得蛋白質係未經醣苷化。
所提供者係含有經修飾之CGL酵素及醫藥上可接受之載體的治療性調製劑。治療性調製劑可係以脂質組成物(例如脂質體)藉由注射、藉由連續輸注、經由導管來靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下投予。
所提供者係用於治療具有胱胺酸尿症或處於發展胱胺酸尿症風險的個體之方法，該方法包含將治療有效量的調製劑投予至該個體，該調製劑包含相對於天然靈長目動物CGL胺基酸序列(參見SEQ ID NO: 1-5)具有至少一個取代之經單離、經修飾之靈長目動物CGL酵素或包含編碼該經單離、經修飾之靈長目動物CGL酵素之核酸序列之核酸。經單離、經修飾之靈長目動物CGL酵素可具有根據SEQ ID NO: 6-95中任一項之序列。該方法可減少該個體的血漿、血清、及/或尿液中之半胱胺酸及/或胱胺酸之水平。
個體可係任何動物，諸如小鼠。例如，個體可係哺乳動物、齧齒動物、靈長目動物、或人類患者。個體或患者可係維持L-(半)胱胺酸限制性膳食、甲硫胺酸限制性膳食或正常膳食併以用所述之組成物來治療。
個體先前可業經胱胺酸尿症治療，且CGL酵素係經投予以治療或減輕胱胺酸尿症的復發或緩和一或多種與胱胺酸尿症相關的狀況和/或症狀。該等方法亦可包含將至少第二療法投予該個體，諸如第二胱胺酸尿症療法，諸如膳食調整、營養療法、及震波療法。該等方法可減少個體尿道、腎臟、及/或膀胱中的胱胺酸結石的體積或胱胺酸結石的數量。該等方法可預防個體尿道、腎臟、及/或膀胱中的胱胺酸結石的形成。該等方法可減少個體尿液中胱胺酸晶體的數量。該等方法可預防個體尿液中胱胺酸晶體的形成。
由此，所提供者係用於預防具有胱胺酸尿症的個體形成胱胺酸結石之方法，該方法包含將治療有效量的調製劑投予至該個體，該調製劑包含相對於天然靈長目動物CGL胺基酸序列(參見SEQ ID NO: 1-5)具有至少一個取代之經單離、經修飾之靈長目動物CGL酵素或包含編碼該經單離、經修飾之靈長目動物CGL酵素之核酸序列之核酸。經單離、經修飾之靈長目動物CGL酵素可具有根據SEQ ID NO: 6-95中任一項之序列。該等方法可預防患者腎臟及/或膀胱中的胱胺酸結石的形成。
所提供者係包含經修飾之CGL酵素或編碼經修飾之CGL酵素之核酸之組成物，以用於治療個體之胱胺酸尿症。所提供者係經單離或經修飾之CGL酵素、編碼經修飾之CGL酵素之核酸、或包含該經修飾之CGL酵素的組成物之用途，其用於製造針對胱胺酸尿症患者治療應用之藥物。經修飾之CGL酵素可係在本文中所揭示之任何經修飾之CGL酵素。
在本文中亦提供的是： 1.   一種經單離、經修飾之靈長目動物胱硫醚-γ-解離酶(cystathionine-γ-lyase) (CGL)酵素，其包含至少下列相對於天然人CGL胺基酸序列 (SEQ ID NO: 1)之取代，其中該經修飾之酵素具有胱胺酸酶和半胱胺酸酶兩者活性，該等取代係選自由下列所組成之群組： (a)  在位置193之丙胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (b)  在位置200之脯胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (c)  在位置193之丙胺酸、在位置200之脯胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (d)  在位置55之麩胺酸、在位置59之蘇胺酸、在位置91之甲硫胺酸、在位置234之離胺酸、在位置336之天冬胺酸、及在位置339之纈胺酸； (e)  在位置55之麩胺酸、在位置59之蘇胺酸、在位置91之絲胺酸、在位置234之離胺酸、在位置336之天冬胺酸、及在位置339之纈胺酸； (f)  在位置189之絲胺酸、在位置193之甘胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (g)  在位置163之精胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (h)  在位置51之色胺酸、在位置55之麩胺酸、在位置59之蘇胺酸、在位置336之天冬胺酸、及在位置339之纈胺酸； (i)  在位置55之麩胺酸、在位置193之丙胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置336之天冬胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (j)  在位置200之組胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (k)  在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (l)  在位置59之異白胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (m) 在位置91之甲硫胺酸及在位置339之纈胺酸；以及 (n)  在位置339之纈胺酸及在位置353之絲胺酸。 2.   如態樣1之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之CGL酵素係經修飾之蘇門達臘猩猩CGL酵素。 3.   如態樣2之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之蘇門達臘猩猩CGL酵素包含選自由下列所組成之群組之取代： (a)  P193A、T311G、E339V、及V353S； (b)  A200P、T311G、E339V、及V353S； (c)  P193A、A200P、T311G、E339V、及V353S； (d)  H55E、V59T、L91M、N234K、T336D、及E339V； (e)  H55E、V59T、L91S、N234K、T336D、及E339V； (f)  T189S、P193G、T311G、E339V、及V353S； (g)  T163R、T311G、E339V、及V353S； (h)  A51W、H55E、V59T、T336D、及E339V； (i)  H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、及V353S； (j)  A200H、T311G、E339V、及V353S； (k)  T311G、E339V、及V353S； (l)  V59I、E339V、及V353S； (m) L91M及E339V；以及 (n)  E339V及V353S。 4.   如態樣1之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之CGL酵素係經修飾之人CGL酵素、經修飾之黑猩猩CGL酵素、或經修飾之侏儒黑猩猩CGL酵素。 5.   如態樣4之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之人CGL酵素、經修飾之黑猩猩CGL酵素、或經修飾之侏儒黑猩猩CGL酵素包含選自由下列所組成之群組之取代： (a)  P193A、T311G、E339V、及I353S； (b)  A200P、T311G、E339V、及I353S； (c)  P193A、A200P、T311G、E339V、及I353S； (d)  H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、及E339V； (e)  H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、及E339V； (f)  T189S、P193G、T311G、E339V、及I353S； (g)  T163R、T311G、E339V、及I353S； (h)  A51W、H55E、E59T、T336D、及E339V； (i)  H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、及I353S； (j)  A200H、T311G、E339V、及I353S； (k)  T311G、E339V、及I353S； (l)  E59I、E339V、及I353S； (m) L91M及E339V；以及 (n)  E339V及I353S。 6.   如態樣1之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之CGL酵素係經修飾之食蟹獼猴CGL酵素。 7.   如態樣6之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之食蟹獼猴CGL酵素包含選自由下列所組成之群組之取代： (a)  P193A、T311G、E339V、及I353S； (b)  A200P、T311G、E339V、及I353S； (c)  P193A、A200P、T311G、E339V、及I353S； (d)  H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、及E339V； (e)  H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、及E339V； (f)  T189S、P193G、T311G、E339V、及I353S； (g)  V163R、T311G、E339V、及I353S； (h)  A51W、H55E、E59T、T336D、及E339V； (i)  H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、及I353S； (j)  A200H、T311G、E339V、及I353S； (k)  T311G、E339V、及I353S； (l)  E59I、E339V、及I353S； (m) L91M及E339V；以及 (n)  E339V及I353S。 8.   如態樣1至7中任一項之經單離、經修飾之CGL酵素，其進一步包含異源性胜肽片段或多醣。 9.   如態樣8之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該異源性胜肽片段係XTEN胜肽、IgG Fc、白蛋白、或白蛋白結合胜肽。 10. 如態樣8之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該多醣包含聚唾液酸聚合物。 11. 如態樣1至10中任一項之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該酵素係經偶合至聚乙二醇(PEG)。 12. 如態樣11之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該酵素係經由一或多個離胺酸殘基而偶合至PEG。 13. 一種核酸，其包含編碼如態樣1至7中任一項之酵素之核苷酸序列。 14. 如態樣13之核酸，其中該核酸係經密碼子優化，以在細菌、真菌、昆蟲或哺乳動物中表現。 15. 如態樣14之核酸，其中該細菌係大腸桿菌。 16. 如態樣15之核酸，其中該核酸包含根據SEQ ID NO: 81-95中任一項之序列。 17. 一種表現載體，其包含如態樣13至16中任一項之核酸。 18. 一種宿主細胞，其包含如態樣13至16中任一項之核酸。 19. 如態樣18之宿主細胞，其中該宿主細胞係細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞。 20. 一種治療性調製劑，其包含於醫藥上可接受之載體中之如態樣1至12中任一項之酵素、或如態樣13至16中任一項之核酸。 21. 一種治療具有胱胺酸尿症或處於發展胱胺酸尿症風險的個體之方法，其包含將治療有效量之如態樣20之調製劑投予至該個體。 22. 如態樣21之方法，其中該個體係維持L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸限制性膳食。 23. 如態樣21之方法，其中該個體係維持甲硫胺酸限制性膳食。 24. 如態樣21之方法，其中該個體係維持正常膳食。 25. 如態樣21之方法，其中該個體係人類患者。 26. 如態樣21之方法，其中該調製劑係藉由注射、藉由輸注、藉由連續輸注、或經由導管來靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、血管內、皮下投予。 27. 如態樣21之方法，其中該個體先前業經針對胱胺酸尿症治療且該酵素係經投予以預防胱胺酸尿症的復發。 28. 如態樣21之方法，其進一步包含將至少第二胱胺酸尿症療法投予該個體。 29. 如態樣28之方法，其中該第二胱胺酸尿症療法係手術療法或震波療法。 30. 如態樣28之方法，其中該第二胱胺酸尿症療法包含選自由下列所組成之群組之劑或藥：碳酸氫鹽、參羥基亞甲基胺基甲烷(tris-hydroxymethylene-aminomethane)(三羥甲基胺基甲烷-E (tromethamine-E))、乙醯半胱胺酸、D-青黴胺、α-巰基丙醯基甘胺酸、及硫甲丙脯酸。 31. 如態樣21之方法，其中該方法減少該個體的血漿及/或血清中之半胱胺酸及/或胱胺酸之水平。 32. 如態樣21之方法，其中該方法減少該個體的尿液中之半胱胺酸及/或胱胺酸之水平。 33. 如態樣21之方法，其中該方法預防該個體的尿道中之胱胺酸結石的形成。 34. 如態樣21之方法，其中該方法預防該個體的腎臟中之胱胺酸結石的形成。 35. 如態樣1之方法，其中該方法預防該個體的腎臟中之胱胺酸結石的形成。 36. 一種如態樣1至12中任一項之經單離或經修飾之CGL酵素或包含該經修飾之CGL酵素的組成物之用途，其用於製造針對胱胺酸尿症患者治療應用之藥物。
如本文中所使用，用語"編碼(encode或encoding)"涉及核酸係予使用以使熟習本技術領域者容易瞭解本發明；然而，這些用語可與"包含(comprise或comprising)"互換使用。
如本文中所使用，就指定的組分而言，"基本上不含(essentially free)"用在本文中係意指所指定的組分均未刻意地經調製成組成物及/或僅以汙染物或痕量存在。因此，組成物的來自任何非所欲之指定組分之總量係遠低於0.05%，較佳的是低於0.01%。最佳的是其中指定組分之量無法以標準分析方法檢測到之組成物。
如本說明書中所使用，"一(a或an)"可意指一或多個。如本文中所使用，在申請專利範圍中，當與單詞"包含"結合使用時，單詞"一(a或an)"可意指一個或多於一個。
除非明確指出僅指涉替代者或替代者係互斥，否則用語    "或"在申請專利範圍中的使用係用於意指"及/或"，即使本揭露支持僅指涉替代者和"及/或"之定義。如本文中所使用，"另一"可意指至少第二者或更多者。
如在此所使用，用語"約"係所屬技術領域中具有通常知識者所理解的，並且在使用它的情境中在一定程度上變化。通常，約涵蓋參考值的正/負10%的數值範圍。
[相關申請案之參照]
本申請案主張2018年10月26日申請的美國臨時申請案第62/751,197號之優先權利益，其全部內容係以引用方式全部併入本案中。 [有關聯邦贊助研究之聲明]
本發明係政府經費補助，為美國國家衛生研究院贊助，編號第R01 CA189623號。政府具有本發明之部分權利。 [序列表之參照]
本申請案含有序列表，其已用ASCII格式經由EFS-Web呈送，且在此以引用方式全部併入本案中。該ASCII複本係於2019年10月22 日建立，檔案名係UTFBP1212WO_ST25.txt，且大小係365千位元組。 [共同研究協議團體]
在本文中所揭示及請求之發明係於Aeglea BioTherapeutics, Inc.與德州大學系統評議委員會(The Board of Regents of The University of Texas System)之間的共同研究協議(Joint Research Agreement)的範圍內所開發。
半胱胺酸被認為是非必需胺基酸，因為它可經由轉硫(transsulfuration)途徑由必需胺基酸L-甲硫胺酸衍生的升半胱胺酸(homocysteine) 合成，其包含胱硫醚-β-合成酶 (CBS) 和胱硫醚-γ-解離酶(CGL)。由此，預期L-(半)胱胺酸的消耗對具有完整轉硫途徑的正常組織是相對無毒的。所提供者係經工程改造之治療性酵素，其可在較高的k cat /K M 下降解L-(半)胱胺酸，從而有可能允許使用較低的劑量。亦提供使用該等酵素以治療胱胺酸尿症之方法。I. 定義
如本文中所使用，用語"酵素 (enzyme)"和"蛋白質"和"多肽"係指包含經由肽鍵所連接的胺基酸之化合物，且可以互換使用。
如本文中所使用，用語"融合蛋白"係指含有以非天然方式可操作地連接的蛋白質或蛋白質片段的嵌合蛋白。
如本文中所使用，用語"半生期(half-life)"(½-生命)係指例如在哺乳動物中注射後在體外(即，如在細胞培養基中所測量者)或體內(即，如在血清中所測量者)多肽濃度下降一半所需的時間。測量"半生期"的方法包括以ELISA形式使用對CGL或PEG特異的抗體，從而測量隨時間而變動下的蛋白質物理量。與測量半生期相關的其他方法包括藉由任何檢定來判定隨時間而變動的酵素藥物的催化活性，該檢定檢測由於L-(半)胱胺酸的轉化而產生的任何受質的產生，諸如檢測用試劑3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)衍生化後的反應產物丙酮酸。
用語"以可操作的組合(in operable combination)"、"以可操作的順序(in operable order)"和"可操作地連接(operably linked)"係指的連接是其中所描述的組分處於允許它們以其所欲方式起作用的關係，例如核酸序列的連接以核酸分子能夠引導給定基因的轉錄及/或所欲蛋白質分子的合成的方式，或胺基酸序列連接以融合蛋白被製造的方式。
用語"連接子(linker)"係指化合物或部分，其充當分子橋接以可操作地連接二個不同分子，其中該連接子的一部分可操作地連接至第一分子，並且其中該連接子的另一部分可操作地連接至第二分子。
用語"PEG化"係指與聚乙二醇(PEG)的共軛，聚乙二醇由於其高度的生物相容性和易於修飾而被廣泛用作藥物載體。PEG可以經由化學方法透過PEG鏈末端的羥基來偶合(例如，共價連接)到活性劑上；然而，PEG本身限制在每分子至多二種活性劑。在不同方法中，已開發PEG和胺基酸的共聚物作為新穎生物材料，其會保留PEG的生物相容性，但每分子具有許多接附點(由此提供更大的載藥量)之優點，並且可經合成設計以適合各種應用。
用語"基因"係指DNA序列，其包含產生多肽或其前驅物所必需的控制和編碼序列。多肽可以由全長編碼序列或編碼序列的任何部分來編碼，以便保留所需的酵素活性。
用語"天然(native)"係指基因的典型或野生型形式，或當從天然來源單離時，該基因或基因產物的特徵。相反地，用語"經修飾(modified)"、"變異體(variant)"、"突變蛋白(mutein)"、或"突變體(mutant)"係指一種基因或基因產物，其當相較於天然基因或基因產物時在序列及功能性質(即，改變的特徵)展現修飾，其中經修飾之基因或基因產物係經遺傳工程改造且非天然存在或發生。
用語"載體(vector)"係用於係指載體核酸分子，其中可插入核酸序列以引入到可在其中複製的細胞中。核酸序列可係"外源的"，這意指它對引入載體的細胞是外來的，或者該序列與細胞中的序列同源，但是在宿主細胞核酸內的某個位置通常找不到該序列。載體包括質體、黏接質體、病毒(噬菌體、動物病毒、和植物病毒)和人工染色體(例如，YAC)。透過標準重組技術，熟習本技術領域者可很熟練地構築載體(參見例如Maniatis等人，1988及Ausubel等人，1994，兩者以引用方式併入本文中)。
用語"表現載體"係指包含編碼能夠被轉錄的RNA的核酸的任何類型的遺傳構築體。在某些情況下，RNA分子接著經轉譯成蛋白質、多肽、或胜肽。在其他情況下，這些序列在例如反義分子或核糖核酸酵素的生產中係不被轉譯。表現載體可含有各種"控制序列"，其係指在特定宿主細胞中可操作連接的編碼序列的轉錄和可能轉譯所必需的核酸序列。除了控制轉錄和轉譯的控制序列外，載體和表現載體可含有具有其他功能的核酸序列。
如本文中所使用，用語"治療有效量"係指在達到治療效果(即消耗患者循環中的L-(半)胱胺酸至約0至15 µmol/L之水平)的方法中所利用的治療組成物(即，經修飾之CGL酵素或編碼此酵素的核酸)的量。在本申請案全文中使用的用語"治療益處"或"治療有效"係指就此病症的醫學治療而言促進或增強個體的福祉的任何事物。這包括但不限於減少疾病徵象或症狀的頻率或嚴重度。例如，胱胺酸尿症的治療可涉及尿液中胱胺酸濃度的減少、胱胺酸結石尺寸的減少、胱胺酸結石的消除、或胱胺酸結石形成的預防。投予治療性組成物的劑量範圍是足夠大的劑量範圍，以產生所欲效果，其中胱胺酸尿症的症收減少。例如，治療有效量的治療組成物的量可使當以生理上可耐受的組成物投予係足以達到每mL約0.001至約100單位(U)、較佳的是高於每mL約0.1 U、且更佳的是每mL高於1 U的經修飾之CGL酵素的血管內(血漿)濃度。典型的劑量可基於體重來投予，並且在約1至100 U/千克(kg)/天的範圍內，較佳的是約2至25 U/kg/天，並且更佳的是約2至8 U/kg/天。例示性的量可係5 U/kg/天或35 U/kg/週。正常人血清L-(半)胱胺酸水平約為200 µM。在胱胺酸尿症患者中，由於缺乏腎的胱胺酸再回收，血清L-(半)胱胺酸水平減少至大約一半，並且投予劑量以獲得約0至10 µM的血清L-(半)胱胺酸水平。劑量不應太大而引起不良副作用，諸如高黏度症候群(hyperviscosity syndrome)、肺水腫、充血性心衰竭、及類似者。通常，劑量將隨著患者的年齡、病況、性別、和疾病程度而變化，並且可由熟習本技術領域者判定。在發生任何併發症的情況下，劑量可由個別醫師調整。劑量應導致個體血清中L-(半)胱胺酸的含量在約12至24小時減少至少 50%、至少60%和至少70%。劑量可導致個體血清中L-(半)胱胺酸的含量在6小時減少至少50%至70%。
如本文中所使用，用語"K M "係指酵素的米氏常數，並且被定義為特定受質的濃度，在該濃度下，給定的酵素在酵素催化的反應中產生其最大速度的一半。如本文中所使用，用語"k cat "係指每單位時間各酵素位點轉化為產物的受質分子數目的轉化數，並且其中酵素以最大效率起作用。如本文中所使用，用語"k cat /K M "是特異性常數(specificity constant)，其係酵素轉化受質成為產物的效率的量度。
用語"胱硫醚-γ-解離酶(cystathionine-γ-lyase)"(CGL或胱硫醚酶)係指催化胱硫醚為半胱胺酸的γ-消除之任何酵素。如本文中所使用，該用語亦涵蓋靈長目動物形式的胱硫醚-γ-解離酶(cystathionine-γ-lyase或cystathionine-gamma-lyase)，包括人形式的胱硫醚-γ-解離酶。
"治療(treatment及treating)"係指投予或施加治療劑至個體或對個體執行程序或模態(modality)以獲得疾病或健康相關病症的治療益處。例如，治療包括投予治療有效量的經修飾之CGL酵素以降低血清L-(半)胱胺酸水平。
"個體(subject)"和"患者"係指人或非人，諸如靈長目動物、哺乳動物、和脊椎動物。Ⅱ . 胱硫醚 -γ- 解離酶
解離酶是催化各種化學鍵斷裂的酵素，通常形成新的雙鍵或新的環結構。例如，催化此反應的酵素將是解離酶：ATP→cAMP+PPi 。某些解離酶只需要一種受質；例如，胱硫醚-γ-解離酶轉化L-胱硫醚為L-半胱胺酸、α-酮丁酸酯、和氨。其他解離酶(稱為合成酶)需要二個受質；例如，胱硫醚β-合成酶使絲胺酸和升半胱胺酸縮合形成胱硫醚。
許多吡哆醛-5'-磷酸(PLP)依賴性酵素係涉及半胱胺酸、升半胱胺酸、和甲硫胺酸的代謝，且這些酵素形成演化相關家族，稱為半胱胺酸/甲硫胺酸(Cys/Met)代謝PLP-依賴性酵素。這些酵素是約400個胺基酸的蛋白質，並且PLP基團與位在多肽中央位置的離胺酸殘基形成內部醛亞胺。此家族的成員包括胱硫醚-γ-解離酶(CGL)、胱硫醚-γ-合成酶(CGS)、胱硫醚-β-解離酶(CBL)、甲硫胺酸-γ-解離酶(MGL)、和O-乙醯基升絲胺酸(OAH)/O-乙醯基絲胺酸(OAS)硫化氫解酶(OSHS)。所有PLP-依賴性酵素的共同處是形成米氏複合物(Michaelis complex)，接以對受質轉醛亞胺化(transaldimination)，形成外部醛亞胺。該反應的進一步過程係取決於特定酵素的受質特異性。
例如，本案發明人將特異性突變引入到PLP-依賴性解離酶家族成員胱硫醚-γ-解離酶中，以改變其受質特異性。以此種方式，產生具有增強的降解L-胱胺酸和L-半胱胺酸的能力之變異體。亦可涵蓋修飾其他PLP-依賴性酵素以產生新穎的L-(半)胱胺酸降解活性。
CGL是四聚體，其催化哺乳動物轉硫途徑的最後一步(Rao等人，1990)。CGL催化L-胱硫醚轉化至L-半胱胺酸、α-酮丁酸酯、和氨。吡哆醛磷酸是此酵素的輔基。使用蛋白質工程改造將對L-半胱胺酸和L-胱胺酸的降解僅具有弱活性的CGL轉化為可高速率降解L-半胱胺酸和L-胱胺酸的酵素(美國專利第9,481,877號，其係以引用方式全部併入本文)。Ⅲ . ( 半 ) 胱胺酸酶工程改造
由於使用非人蛋白質治療劑在臨床上看到的致免疫性的非所欲效果，因此理想的是工程改造治療相關的L-胱胺酸和L-半胱胺酸降解活性至人酵素中(即，工程改造L-(半)胱胺酸酶酵素，其針對L-半胱胺酸和L-半胱胺酸兩者均展現高k cat 和低K M 值且對這二種受質亦展現較佳特異性)。人具有一種稱為胱硫醚-γ-解離酶(hCGL)的酵素，其功能是催化哺乳動物轉硫途徑的最後一步(Raoet al. , 1990)，即L-胱硫醚轉化至L-半胱胺酸、α-酮丁酸酯、和氨。人CGL亦可弱降解L-半胱胺酸及其二硫化物形式的L-胱胺酸，使其成為工程改造的理想候選者。使用結構和親緣引導式誘變 (phylogenetically-guided mutagenesis)，以及隨機誘變方法，hCGL 變異體係經工程改造，以有效率地水解L-半胱胺酸和L-胱胺酸兩者。
所描述的是經修飾之CGL酵素，其展現至少一種與未經修飾之CGL酵素相當的功能性活性。經修飾之CGL酵素包括例如相較於未經修飾之CGL酵素具有其他優點的蛋白質，諸如(半)胱胺酸酶酵素活性。未經修飾之蛋白質或多肽可係天然的胱硫醚-γ-解離酶，諸如人胱硫醚-γ-解離酶。
活性的判定可使用熟悉本技術領域者熟悉的檢定來達成，特別是關於蛋白質活性，並且可包括為比較目的，例如使用經修飾或未經修飾之酵素的天然及/或重組形式。例如，野生型人CGL緩慢降解L-半胱胺酸至丙酮酸、氨和H2 S，並轉化L-胱胺酸至丙酮酸、氨、和硫半胱胺酸(k cat /K M 分別為 ~ 0.2 s-1 mM-1 及~ 0.8 s-1 mM-1 )。硫半胱胺酸係進一步經非酵素降解至L-半胱胺酸和H2 S。因此，L-(半)胱胺酸的降解活性可藉由任何檢定以偵測源自L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸降解的任何受質產生來判定，諸如檢測用試劑3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)衍生化後的反應產物丙酮酸(Takakuraet al. , 2004)。
經修飾之CGL酵素可基於其在L-(半)胱胺酸降解活性中的增加來鑑定。例如，未經修飾之多肽的受質辨識位點可予鑑定。該識別可基於結構分析或同源性分析。可產生涉及此類受質辨識位點修飾的突變體族群。具有增加的L-(半)胱胺酸降解活性的突變體可自突變體族群選擇。所欲之突變體的選擇可包括用於檢測副產物或來自L-(半)胱胺酸降解的產物之方法。
經修飾之CGL酵素可具有胺基酸的缺失及/或取代；由此，具有缺失的酵素、具有取代的酵素、以及具有缺失和取代的酵素係經修飾之CGL酵素。這些經修飾之CGL酵素可進一步包括插入或添加的胺基酸，諸如例如具有融合蛋白或具有連接子的蛋白質。"經修飾之缺失CGL酵素(modified deleted CGL enzyme)"缺乏天然酵素的一或多個殘基，但可具有天然酵素的特異性及/或活性。經修飾之缺失CGL酵素亦可具有降低的致免疫性或抗原性。經修飾之缺失CGL酵素的實例是具有胺基酸殘基自至少一抗原性區域(即經判定係在特定生物(諸如可投予該經修飾之CGL酵素的生物類型)具抗原性的酵素區域)刪除者。
取代或替代的CGL酵素變異體在蛋白質內可含有一或多個位點的一個胺基酸與另一者的交換，並且可經設計以調節多肽的一或多個特性，特別是其效應子功能及/或生體可用率。取代可係或並非為保留性的，即，一個胺基酸係以類似大小和電荷相似者替代。保留取代係本技術領域中熟知，且包括例如下列之改變：丙胺酸至絲胺酸；精胺酸至離胺酸；天冬醯胺酸至麩醯胺酸或組胺酸；天冬胺酸至麩胺酸；半胱胺酸至絲胺酸；麩醯胺酸至天冬醯胺酸；麩胺酸至天冬胺酸；甘胺酸至脯胺酸；組胺酸至天冬醯胺酸或麩醯胺酸；異白胺酸至白胺酸或纈胺酸；白胺酸至纈胺酸或異白胺酸；離胺酸至精胺酸；甲硫胺酸至白胺酸或異白胺酸；苯丙胺酸至酪胺酸、白胺酸、或甲硫胺酸；絲胺酸至蘇胺酸；蘇胺酸至絲胺酸；色胺酸至酪胺酸；酪胺酸至色胺酸或苯丙胺酸；及纈胺酸至異白胺酸或白胺酸。
用語"生物學功能等效物(biologically functional equivalent)"在本領域中是熟悉了解的，並且在本文中進一步詳細定義。因此，所包括的是CGL酵素序列與SEQ ID NO: 1具有約90%或更多的序列相同度，或甚至介於約91%與約99%之間(包括92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、和99%)的胺基酸係相同或保留性取代在本文中所揭示之經修飾之CGL酵素的胺基酸，惟該酵素的生物學活性係維持從而可測量的生物學活性參數(例如L-半胱胺酸及/或L-半胱胺酸轉化至丙酮酸)係在本文中所揭示之經修飾之CGL酵素的約20%、約15%、約10%、或約5%之內。經修飾之CGL酵素可在生物學功能上等同於其未經修飾之對應物。
胺基酸和核酸序列可包括另外的殘基，諸如另外的N-或C-端胺基酸或5'或3'序列，並且仍然基本上如本文中所揭示的序列之一者，只要序列符合上述標準，包括在涉及蛋白質表現的情況下維持生物蛋白質活性。末端序列的添加特別適用於核酸序列，其可例如包括位於編碼區的5'或3'部分側翼的各種非編碼序列，或者可包括各種內部序列，即內含子，其已知存在於基因內。Ⅳ . 用於療法的酵素性 L-( 半 ) 胱胺酸降解
胱胺酸尿症是一種遺傳性障礙，由編碼腎臟近端小管的胱胺酸和二元胺基酸運輸蛋白的SLC3A1 和SLC7A9 基因突變引起，導致胱胺酸(胺基酸半胱胺酸的二硫化物形式)異常排泄和由於胱胺酸的低溶解度而在尿道中形成胱胺酸晶體/結石。
有幾種胱胺酸尿症的小鼠模式可用，包括Slc7a9 剔除小鼠、Slc3a1 剔除小鼠、D140G Slc3a1突變小鼠和E383K Slc3a1突變小鼠(Feliubadalo等人，2003；Ercolani等人，2010；Peters等人，2003；Livrozet等人，2014，其各以引用方式全部併入本文中)。來自 129S2/SvPasCrl的Slc3a1 基因體DNA的序列分析顯示在129S2/SvPasCrl小鼠的第7外顯子中的純合突變。A1232G點突變係在高度保留序列中的誤義突變(c.1232G＞A)。由於A1232G誤義突變，位置383上的麩醯胺酸係經取代為離胺酸(E383K)。該取代位於 rBAT 的胞外部分，且是造成 129S2/SvPasCrl 小鼠 rBAT 表現喪失和胱胺酸尿症的原因(Livrozet等人，2014)。位置 383 的麩醯胺酸在各種物種中係高度保留。
胱胺酸尿症患者具有低生活品質，胱胺酸結石形成終身風險、腎功能受損、並且經常需要反復手術干預。患有遺傳性障礙胱胺酸尿症的患者可用的治療劑極少，其中缺陷的腎臟運輸蛋白在腎濾過期間無法再回收(re-uptake)胱胺酸。胱胺酸是胺基酸L-半胱胺酸的二硫化物形式，高度不溶，且在胱胺酸尿症患者中，尿道中的濃度很高，從而導致胱胺酸晶體和結石的形成。現有的降低循環胱胺酸水平的療法部分地防止了尿道結石形成，但是具有極嚴重的不良反應，限制了它們的使用。
目前尚無針對胱胺酸尿症的治癒療法，且治療係針對增加胱胺酸溶解度和降低尿液胱胺酸濃度。多尿是常見的治療；然而，它需要每日攝取＞ 4升的水，而尿液的體積＞ 3升，這很難達成和維持。其他藥物治療、諸如小硫醇分子，藉由與胱胺酸反應形成混合的二硫化物而發揮作用，這些二硫化物比胱胺酸易溶，但具有明顯的毒性，諸如白血球減少症、皮疹、發燒、蛋白尿和腎症候群，這限制了它們的使用。
本發明提供使用經工程改造之治療性酵素之方法，該治療性酵素降解L-(半)胱胺酸以治療疾病，諸如胱胺酸尿症。此方法從循環中移除胱胺酸，其業經顯示臨床上減少胱胺酸尿症患者的腎臟和尿液胱胺酸結石形成的發生率。此處所描述之方法可將循環胱胺酸減少到檢測水平下，而無與目前胱胺酸尿症藥物相關的副作用。
半胱胺酸被認為是非必需胺基酸，因為它可經由轉硫 (transsulfuration)途徑由必需胺基酸L-甲硫胺酸衍生的升半胱胺酸 (homocysteine)合成，其包含胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ-解離酶 (CGL)。由此，預期半胱胺酸的消耗對具有完整轉硫途徑的正常組織是相對無毒的。
該多肽可以消耗L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸的新穎酵素而用於治療諸如胱胺酸尿症的疾病。所揭示者係使用具有L-(半)胱胺酸降解活性的經修飾之CGL的治療方法。所提供者係具有L-(半)胱胺酸降解活性的酵素以增加治療療效。
所提供者係具有L-(半)胱胺酸降解活性的經修飾之CGL酵素以用於治療胱胺酸尿症。經修飾之多肽可具有人的多肽序列，且由此當投予人患者時可預防不良的致免疫性反應，允許重複用劑，並增加治療療效。
作為一實例，在鼠類模式中，PEG-hCGL-TV可在96 h顯著降低血清胱胺酸水平(＞ 95%)，且在48 h顯著降低半胱胺酸水平 (80%)。為判定此，對6至7週齡的雄性FVB/N小鼠(JAX 001800)腹膜內(ip)注射50 mg/kg的PEG-hCGL-TV，並在第0、1、2、4和6天犧牲(每組n = 5)以供血液和血清收集。將血清樣本與10個皮莫耳之經氘化之胱胺酸和半胱胺酸的內標準混合物混合，並使用NANOSEP® OMEGA™離心裝置(3 kDa截留值)超濾(Pall Life Biosciences) (Tiziani等人，2008；Tiziani 等人，2013)。根據製造商說明書，使用反相 BEH C18、1.7 μm, 2.1 × 150 mm管柱(THERMO SCIENTIFIC™ ACCELA® 1250 UPLC, Waters Corporation, USA)層析經過濾之極性級分，並引入偶合電噴灑游離的 EXACTIVE™ Plus ORBITRAP™質譜儀(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)。以儀器隨附的XCALIBUR™軟體以質心MS模式從50到700 m/z的質量範圍採集數據。
此外，PEG-hCGL-TV顯示大約23 h之吸收T1/2 及40 ± 7 h 之排除T1/2 。為了判定此，使用了斑點墨點光密度測定技術，其中用抗 hCGL抗體(兔子抗CTH，Sigma # C8248)探測適當的血清樣本，然後添加抗兔子IgG螢光異硫氰酸鹽(FITC) (Santa Cruz Biotechnology # sc-2012)，並藉由 TYPHOON™掃描儀(GE Healthcare)在488 nm激發顯影。使用ImageJ軟體(Schneider等人，2012)，將經掃描之斑點墨點上樣本的光密度測定與相同墨點內已知量的PEG-hCGL-TV的滴定比較，以構建標準曲線並計算相對血清PEG- hCGL-TV水平。數據配適至血管外投予模式(Foye等人，2007)。
可在體內哺乳動物的循環、在體外(組織培養或其他生物培養基中消耗L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸的情況下係所欲者時)、及擬體內程序(當生物體液、細胞、或組織係在身體外部操作且之後回到患者哺乳動物身體)進行消耗。來自循環、培養基、生物體液、或細胞的L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸的消耗係進行以減少待治療物質可及的L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸的量，且因此包含在L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸降解條件下將待消耗之材料與L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸降解量的經工程改造之酵素接觸，以降解經接觸之材料的環境L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸。
L-胱胺酸和/或L-半胱胺酸降解效率可取決應用而變化很大，並且通常取決於存在於材料中L-胱胺酸和/或L-半胱胺酸的量、所欲之的消耗速率、和物質對(半)胱胺酸酶暴露的耐受性。材料中的L-胱胺酸和/或L-半胱胺酸水平、且因此自材料消耗L-胱胺酸和/或L-半胱胺酸的速率，可藉由本技術領域中熟知的各種化學和生化方法輕易地監測。例示性的L-胱胺酸和/或L-半胱胺酸降解量在本文中進一步描述，且範圍可係每毫升(mL)待處理物質為 0.001至100單位(U)的經工程改造之(半)胱胺酸酶，較佳的是約0.01至10 U、且更佳的是約0.1至5 U的經工程改造之(半)胱胺酸酶。
L-胱胺酸和/或L-半胱胺酸降解條件是與CGL酵素的生物學活性相容的緩衝液和溫度條件，並且包括與該酵素相容的中等溫度、鹽類、和 pH 條件，例如生理條件。例示性條件包括約4至40℃，等同於約0.05至0.2 M的NaCl之離子強度，和約5至9的pH，同時包括生理條件。
藉由靜脈內或腹膜內注射向患者投予治療有效量的包含經修飾之CGL酵素的生理上可耐受的組成物，從而消耗患者中存在的循環L-胱胺酸和/或L-半胱胺酸來實現體內接觸。
經修飾之CGL酵素可藉由注射或藉由隨時間的逐步輸注而腸胃外投予。經修飾之CGL酵素可靜脈內、腹膜內、肌內、皮下投予，或可藉由連接至導管的泵來投予，該導管可含有潛在的L-(半)胱胺酸生物感測器。對於胱胺酸尿症，理想的是皮下投予CGL酵素。
含有經修飾之CGL酵素的治療組成物習知上係靜脈內投予，例如藉由注射單位劑量。當用於指涉治療組成物時，用語"單位劑量"係指適合作為個體單位劑量的物理上離散的單位，各單位包含預定量的活性物質(該活性物質經計算以產生所欲的治療效果)以及所需的稀釋劑，即載體或載劑。
組成物係以與劑型相容的方式、以治療有效量來投予。投予量取決於待治療的個體、個體系統利用活性成分的能力、以及所欲之治療效果程度。投予所需活性成分的精確量取決於從業者的判斷，並且是各個體所特有的。然而，本文揭示針對全身施用的適合劑量範圍，並且取決於投予途徑。亦涵蓋用於初次投予和加強注射的適合給藥方案，且特徵在於初次投予、隨後藉由之後注射或其他投予以一或多個小時的間隔重複劑量。本文描述了例示性的多次投予，並且特佳的是經修飾之CGL酵素維持連續高血清和組織水平量，且相對低L-(半)胱胺酸的血清和組織水平。或者，涵蓋足以將血液中的濃度維持在體內療法規定的範圍內的連續靜脈內輸注。Ⅴ . 共軛體
所提供的組成物和方法涉及經修飾之CGL酵素的進一步修飾改善，例如藉由與異源性胜肽片段或諸如聚乙二醇形成共軛體。經修飾之CGL酵素可與PEG連接以增加該酵素的流體動力學半徑，並因此增加血清持久性或半生期。所揭示的多肽可與任何靶向劑偶合，諸如具有特異性和穩定地結合至細胞上的外部受體或結合位點的能力之配體(美國專利公開號2009/0304666)。PEG的大小可係約3,000至20,000道耳頓，例示性大小係5,000道耳頓。A. 融合蛋白
提供融合蛋白，其中經修飾之CGL酵素可在N-或C-端連接至異源性結構域。例如，融合亦可利用來自其他物種的前導序列以允許蛋白質在異源宿主中的重組表現。另一可用的融合包括添加蛋白質親和力標籤，諸如血清白蛋白親和力標籤或六個組胺酸殘基，或免疫活性結構域，諸如抗體表位，較佳的是可切割，以促進融合蛋白的純化。非限制性親和力標籤包括聚組胺酸、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)和麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)。
經修飾之CGL酵素可係經連接至胜肽，其增加體內半生期，諸如XTEN多肽(Schellenberger等人，2009)、IgG Fc結構域、白蛋白或白蛋白結合胜肽。
產生融合蛋白的方法是熟習本技術領域者所熟知的。此等蛋白質可例如藉由完整融合蛋白的從頭合成、或藉由接附編碼異源性結構域的DNA序列、然後表現完整融合蛋白來產生。
回復親本蛋白質功能活性的融合蛋白的融合蛋白之製造可藉由編碼胜肽連接子的橋接DNA片段連接基因來促進，該連接子係拼接於串聯連接的多肽之間。連接子係會足夠長以允許所獲得的融合蛋白之適當折疊。B. 連接子
經修飾之CGL酵素可使用雙功能交聯試劑化學共軛或在蛋白質水平上以胜肽連接子融合。雙功能交聯試劑業經已廣泛用於各種目的，包括親和力基質的製備、各種結構的修飾和穩定化、配體和受體結合位點的鑑定、以及結構研究。適合的胜肽連接子亦可用於連接經修飾之CGL酵素，諸如Gly-Ser連接子。
帶有二個相同官能基團的同雙功能試劑可誘發相同和不同的大分子或大分子次單元之間的交聯，並將多肽配體連接至它們的特異性結合位點。異雙功能試劑含有兩個不同的官能基團。藉由利用二個不同官能基團的差異反應性，交聯選擇性和順序地兩者均可予控制。雙功能交聯試劑可根據它們的官能基團例如胺基-、巰基-、胍基-、吲哚-、羧基-特異性基團的特異性來劃分。其中，針對游離胺基的試劑由於其商業上的可獲得性、易於合成、以及可在其應用的溫和反應條件下而變得流行。
一些異雙官能性(heterobifunctional)交聯試劑含有一級胺反應性基團和硫醇反應性基團。在另一實例中，所說明的是異雙官能性交聯試劑及使用該交聯試劑之方法(美國專利第5,889,155號，其特別以引用方式全部併入本文)。交聯試劑將親核醯肼殘基與親電順丁烯二醯亞胺殘基結合，在一個實例中，允許醛與游離硫醇偶合。可對交聯試劑修飾以使各種官能團交聯。
另外，熟習本技術領域者已知的任何其他連接/偶合劑及/或機制可用於組合經修飾之CGL酵素，例如抗體-抗原交互作用、抗生物素蛋白-生物素鍵聯、醯胺鍵聯、酯鍵聯、硫酯鍵聯、醚鍵聯、硫醚鍵聯、磷酸酯鍵聯、磷醯胺鍵聯、酸酐鍵聯、二硫鍵聯、離子和疏水性交互作用、雙特異性抗體和抗體片段、或其組合。
較佳的是利用在血液中具有合理安定性的交聯劑。已知多種類型的含有雙硫鍵的連接子，其可成功地利用以共軛靶向劑和治療/預防劑。含有空間受阻的雙硫鍵的連接子可證明在體內具有更高的安定性。由此，這些連接子是一組連接劑。
除了受阻的交聯劑外，亦可利用非受阻的連接子。其他可用的交聯試劑，包括SATA、SPDP和2-亞胺基硫雜環戊烷，不被視為含有或生成受保護的二硫化物(Wawrzynczak及Thorpe，1987)。此等交聯劑的使用在本領域中是熟知的。也可使用彈性連接子(flexible linker)。
一旦經化學共軛，通常將胜肽純化以將共軛體與未共軛之劑和其他汙染物分離。許多純化技術可用於提供足夠純度的共軛體，以使其可用於臨床上。
基於尺寸分離的純化方法，諸如凝膠過濾、凝膠滲透、或高效液相層析術，通常將是最常用的方法。亦可使用其他層析技術，諸如 Blue-Sepharose 分離。可用從包涵體純化融合蛋白的習知方法，諸如使用弱清潔劑，諸如 N-月桂醯基肌胺酸鈉 (SLS)。C. 聚乙二醇化 (PEG 化 )
所揭示者係有關經修飾之CGL酵素之PEG化之方法及組成物。例如，經修飾之CGL酵素可根據在本文中所揭示之方法來PEG化。
PEG化是聚(乙二醇)聚合物鏈與另一分子(通常是藥物或治療性蛋白質)共價接附的過程。PEG化係常規地藉由培育PEG的反應性衍生物與標靶大分子來達成。PEG與藥物或治療性蛋白質的共價接附可將該劑"遮蔽"免受宿主的免疫系統(降低致免疫性和抗原性)或增加該劑的流體動力學大小(在溶液中之大小)，其藉由減少腎廓清而延長其循環時間。PEG化亦可對疏水性藥物和蛋白質提供水溶性。
PEG化的第一步是在一端或兩個末端對PEG聚合物進行適合的官能化。在每個末端被相同反應性部分所活化的PEG被稱為"同雙官能性(homobifunctional)"，而如果存在的官能性基團不同，則PEG衍生物被稱為"異雙官能性(heterobifunctional)"或"異官能性(heterofunctional)"。製備PEG聚合物的化學活性或活化衍生物以將PEG接附至所欲分子。
PEG衍生物的適合官能性基團的選擇係基於將與PEG偶合的分子上可用的反應性基團的類型。對於蛋白質，典型的反應性胺基酸包括離胺酸、半胱胺酸、組胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、和酪胺酸。也可以使用N端胺基和C端羧酸。
用於形成第一代PEG衍生物的技術通常是使PEG聚合物與可與羥基反應的基團反應，通常是酸酐、醯氯、氯甲酸酯、和碳酸酯。
隨著PEG化的應用變得越來越先進和複雜，對用於共軛的異雙官能性PEG的需求也在增加。這些異雙官能性PEG在連接二個需要親水、撓性、和生物可相容性間隔子的實體時非常有用。異雙官能性團PEG的較佳端基可係順丁烯二醯亞胺、乙烯基碸、二硫化吡啶基、胺、羧酸、和NHS酯。
最常見的修飾劑或連接子係基於甲氧基PEG(mPEG)分子。它們的活性取決於在醇端添加蛋白質修飾基團。在某些情況下，聚乙二醇(PEG二醇)係用以作為前驅物分子。隨後將二醇在兩端修飾，以製備異二聚體或同二聚體PEG連接分子。
蛋白質通常在親核位點(諸如未經質子化的硫醇(半胱胺醯基殘基)或胺基)上被PEG化。半胱胺醯基特異性修飾試劑的實例包括PEG順丁烯二醯亞胺、PEG碘乙酸酯、PEG硫醇、和PEG乙烯基碸。在溫和的條件下以及中性至些微鹼性的pH下，所有這四種都是強半胱胺醯基特異性，但各有一些缺點。與順丁烯二醯亞胺形成的硫醚在鹼性條件下可能有些不穩定，因此該連接子的配方選擇可能會受到一些限制。與碘基PEG形成的硫代胺基甲酸酯(carbamothioate)鍵聯更穩定，但游離碘會在某些條件下修飾酪胺酸殘基。PEG硫醇與蛋白質硫醇形成雙硫鍵，但這種鍵聯在鹼性條件下亦會不穩定。與順丁烯二醯亞胺和碘基PEG相比，PEG-乙烯基碸的反應性相對慢，但是，形成的硫醚鍵聯相當安定。其較慢的反應速率亦可使PEG-乙烯基碸反應更易於控制。
在天然半胱胺醯基殘基的位置特異性PEG化很少進行，因為這些殘基通常為雙硫鍵形式或生物活性所必需。另一方面，定點突變可用於併入半胱胺醯基PEG化位點以形成硫醇特異性連接子。必須設計半胱胺酸突變，使其可被PEG化試劑所接近，並且在PEG化後仍具有生物學活性。
胺特異性修飾劑包括PEG NHS酯、PEG三氟乙磺酸酯(PEG tresylate)、PEG醛、PEG異硫氰酸酯、和其他幾種。它們都在溫和的條件下反應，並且對胺基非常有特異性。PEG NHS酯可能是反應性更強的試劑之一；然而，其高反應性會使PEG化反應難以在大規模下控制。PEG醛與胺基形成亞胺，接著與氰基硼氫化鈉還原為二級胺。與硼氫化鈉不同，氰基硼氫化鈉不會還原雙硫鍵。但是，該化學品有劇毒，必須謹慎處理，尤其是在較低的pH會變得易揮發。
由於大多數蛋白質上存在多個離胺酸殘基，因此位置特異性PEG化會是挑戰。幸運的是，由於這些試劑會與未經質子化的胺基反應，因此可藉由在較低的pH下進行反應，引導PEG化至較低pK的胺基。通常，α-胺基的pK比離胺酸殘基的ε-胺基低1至2個pH單位。藉由在pH 7或更低PEG化分子，經常可獲得對N端的高選擇性。但是，這僅在蛋白質的N端部分不為生物活性所需要時才可行。儘管如此，PEG化帶來的藥物動力學益處常遠超過體外生物活性的重大損失，無論PEG化的化學，導致產物具有更高的體內生物活性。
開發PEG化程序時需要考慮幾個參數。幸運的是，通常不超過四個或五個參數。優化PEG化條件的"實驗設計"方法會非常有用。對於巰基特異性PEG化反應，要考慮的參數包括：蛋白質濃度、PEG對蛋白質的比例(以莫耳為基準)、溫度、pH、反應時間，且在某些情況下排除氧氣。(氧氣可導致蛋白質形成分子間二硫化物，這將降低PEG化產物的產量。)對於胺特異性修飾，應考慮相同的因素(氧氣除外)，除了pH甚至更為關鍵，特別是當靶向N端胺基時。
對於胺和硫醇特異性修飾，反應條件都會影響蛋白質的安定性。這可能會限制溫度、蛋白質濃度、和pH。另外，在開始PEG化反應之前，應當知道PEG連接子的反應性。例如，如果PEG化試劑僅具有70%的活性，則PEG的用量應確保在蛋白質對PEG反應的化學計量中僅算入活性PEG分子。Ⅵ . 蛋白質及胜肽
所提供者係包含至少一種蛋白質或胜肽、諸如經修飾之CGL酵素之組成物。這些胜肽可包含在融合蛋白中或與如上所述的劑共軛。
如本文中所使用，蛋白質或胜肽通常係指但不限於大於約200個胺基酸的蛋白質，直至從基因轉譯的全長序列；大於約100個胺基酸的多肽；及/或約3至約100個胺基酸的胜肽。為了方便，用語"蛋白質"、 "多肽"、和"胜肽"在本文可互換使用。
因此，用語"蛋白質或胜肽"涵蓋包含天然存在的蛋白質中發現的20種常見胺基酸中的至少一者、或至少一種經修飾或非天然胺基酸的胺基酸序列。
蛋白質或胜肽可藉由熟習本技術領域者已知的任何技術來製備，包括透過標準分子生物學技術表現蛋白質、多肽、或胜肽、從天然來源單離蛋白質或胜肽、或蛋白質或胜肽的化學合成。可使用在本文中所揭示或如熟習本技術領域者已知的技術來擴增及/或表現已知基因的編碼區。或者，蛋白質、多肽、和胜肽的各種商業製劑是熟習本技術領域者已知的。Ⅶ . 核酸及載體
所揭示者係編碼經修飾之CGL酵素或包含經修飾之CGL酵素的融合蛋白的核酸序列。取決於所使用的表現系統，可基於習知方法選擇核酸序列。例如，如果經修飾之CGL酵素衍生自人胱硫醚酶並且含有在大腸桿菌中很少使用的多個密碼子，則這可能會干擾表現。因此，使用可免費獲得的軟體(參見Hoover & Lubkowski, 2002)，可針對大腸桿菌表現密碼子優化各個基因或其變異體，以設計不含稀有密碼子的編碼序列。各種載體也可用於表現所關注之蛋白質，諸如經修飾之CGL酵素。例示性載體包括但不限於質體載體、病毒載體、轉位子、或基於脂質體的載體。Ⅷ . 宿主細胞
宿主細胞可以是可被轉型以允許表現和分泌經修飾之CGL酵素及其共軛體的任何者。宿主細胞可以是細菌、哺乳動物細胞、酵母菌、或絲狀真菌。各種細菌包括大腸桿菌和芽孢桿菌。屬於酵母菌屬、克魯維乳酸酵母菌屬(Kiuyveromyces )、漢遜氏酵母菌屬(Hansenula )、或畢赤酵母菌屬(Pichia )的酵母菌可以用作合適的宿主細胞。各種絲狀真菌都可以用以作為表現宿主，包括下列屬：麴菌屬、木黴屬、紅黴菌屬(Neurospora )、青黴菌屬、頭芽胞菌屬、棉黴屬(Achlya )、鵝柄孢殼菌屬(Podospora )、内座殼屬(Endothia )、毛黴菌屬(Mucor )、旋孢腔菌屬(Cochliobolus )、和稻熱病菌屬(Pyricularia )。
可用的宿主生物的例子包括細菌，例如大腸桿菌MC1061、枯草芽孢桿菌BRB1的衍生物(Sibakov等人，1984)、金黃色葡萄球菌SAI123(Lordanescu，1975)或藍黑鏈黴菌(Hopwood等人，1985)；酵母菌，例如釀酒酵母菌AH22(Mellor等人，1983)或粟酒裂殖酵母菌；及絲狀真菌，例如小巢狀麴菌、泡盛麴菌(Ward，1989)、或里氏木黴菌(Penttila等人，1987；Harkki等人，1989)。
哺乳動物宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1；美國菌種保存中心(ATCC) No. CCL61)、大鼠腦垂體細胞 (GH1; ATCC No. CCL82)、HeLa S3 細胞(ATCC No. CCL2.2)、大鼠肝癌細胞(H-4-II-E; ATCC No. CRL-1548)、SV40轉型的猴腎臟細胞(COS-1; ATCC No. CRL-1650)、和鼠胚胎細胞(NIH-3T3; ATCC No. CRL-1658)。前述內容旨在說明而非限制本技術領域中已知的許多可能的宿主生物。原則上，所有能夠分泌的宿主，無論原核還是真核均可使用。
表現經修飾之CGL酵素及/或它們的融合蛋白的哺乳動物宿主細胞在通常利用於培養親代細胞系的條件下培養。通常，將細胞在含有生理鹽類和營養物的標準培養基中培養，諸如標準RPMI、MEM、IMEM、或DMEM，其通常補充有5%至10%的血清，諸如胎牛血清或如針對所需細胞所述者。培養條件也是標準的，例如，將培養物在37℃下在靜止或滾動培養中培育直至達到所需的蛋白質水平。Ⅸ . 蛋白質純化
蛋白質純化技術是熟習本技術領域者所熟知的。這些技術在一個層面上涉及將細胞、組織、或器官的均質化和粗級分化(crude fractionation)以形成多肽和非多肽級分。除非另有說明，否則可以使用層析和電泳技術進一步純化所關注之蛋白質或多肽，以實現部分或完全純化(或純化至均質)。特別適合於製備純胜肽的分析方法是離子交換層析術、凝膠排阻層析術、聚丙烯醯胺凝膠電泳、親和層析術、免疫親和層析術、和等電聚焦。純化胜肽的一種特別有效率的方法是快速液相層析術(FPLC)甚至高效液相層析術(HPLC)。
經純化的蛋白質或胜肽意欲係指可與其他組分單離的組成物，其中該蛋白質或胜肽相對於其天然可獲得的狀態經純化至任何程度。因此，經單離或經純化的蛋白質或胜肽亦係指非天然可能存在的環境的蛋白質或胜肽。通常，"經純化的"是指已經過級分化以去除各種其他組分的蛋白質或胜肽組成物，並且該組成物基本上保留了其表現的生物學活性。在使用用語"實質上經純化的"的情況下，該名稱將係指其中蛋白質或胜肽形成組成物的主要組分的組成物，諸如在組成物中構成約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或更多的蛋白質。
適用於蛋白質純化的各種技術是熟習本技術領域者所熟知的。這些包括例如用硫酸銨、PEG、抗體及類似者沉澱，或藉由熱變性接著離心；層析步驟，諸如離子交換、凝膠過濾、反相、羥磷灰石、和親和層析術；等電聚焦凝膠電泳；以及這些和其他技術的組合。如通常本技術領域中已知，咸信可以改變進行各種純化步驟的順序，或者可以省略某些步驟，並且仍然產生製備實質上經純化之蛋白質或胜肽的適合方法。
定量蛋白質或胜肽的純化程度的各種方法是熟習本技術領域者已知的。這些包括例如判定活性級分的比活性，或藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS/PAGE)分析來評估級分內多肽的量。評估級分純度的一種較佳方法是計算組分的比活性，將其與初始萃取物的比活性進行比較，且由此計算其中的純度，以"倍數純化數"評估。當然，用於表示活性量的實際單位取決於經選擇用於純化的特定檢定技術，以及經表現的蛋白質或胜肽是否表現出可檢測的活性。
沒有一般要求始終以其最純化的狀態提供蛋白質或胜肽。實際上，可涵蓋的是，較不為實質上經純化的產物可能具有效用。可以藉由組合使用較少的純化步驟或藉由利用相同一般純化方案的不同形式來完成部分純化。例如，應理解，與利用低壓層析系統的相同技術相比，利用高效液相層析(HPLC)裝置進行的陽離子交換管柱層析通常將導致更大的 "倍數"純化。表現出較低的相對純化程度的方法在蛋白質產物的總回收率或維持經表現的蛋白質的活性方面可具有優勢。
蛋白質或胜肽可經單離或經純化，例如，經修飾之CGL酵素、含有經修飾之CGL酵素的融合蛋白或PEG化後的經修飾之CGL酵素。例如，在這種經修飾之CGL酵素中可包含His標籤或親和性表位以促進純化。親和層析法是一種層析程序，它依賴於待單離的物質與其可特異性結合的分子之間的特異親和力。這是受體-配體類型的交互作用。管柱材料係藉由共價偶合結合組伴(binding partner)之一者與不溶性基質來合成。接著，管柱材料能夠從溶液中特異性吸附物質。藉由將條件改變為不會發生結合的條件(例如，改變pH、離子強度、溫度等)來進行沖提。基質應該是不會吸收分子至任何大量程度並且具有廣泛的化學、物理、和熱安定性的物質。配體應以不影響其結合特性的方式偶合。配體還應提供相對緊密的結合。可沖提物質而不會破壞樣本或配體。
尺寸排阻層析法(SEC)是一種層析方法，其中溶液中的分子根據其大小、或更技術用語、根據其流體力學體積進行分離。它通常應用於大分子或巨分子複合物，諸如蛋白質和工業聚合物。通常，當使用水溶液將樣品運輸通過層析管柱時，該技術稱為凝膠過濾層析法，相對於名稱為凝膠滲透層析法，其係當有機溶劑用作流動相時使用。
SEC的基本原理是，不同大小的顆粒將以不同的速率沖提(過濾)通過固定相。這導致了基於尺寸的顆粒溶液的分離。惟所有粒子同時或接近同時加載，則相同大小的粒子應一起沖提。各尺寸排阻層析管柱都有一系列可分離的分子量。排阻極限定義該範圍上限的分子量，是分子太大而無法捕獲在固定相中的極限。滲透極限定義分離範圍下限的分子量，並且足夠小的分子可以完全滲透到固定相的孔中，並且低於此分子量的所有分子都非常小，以至於它們沖提為單一條帶。
高效液相層析法(或高壓液相層析法，HPLC)是一種管柱層析法的形式，常用於生物化學和分析化學中以分離、鑑定、和定量化合物。HPLC利用容納層析填充材料(固定相)的管柱，將流動相移動通過管柱的泵、以及顯示分子滯留時間的偵測器。滯留時間取決於固定相、被分析之分子、和所用溶劑之間的交互作用而異。Ⅹ . 治療組成物
人胱硫醚-γ-解離酶基因包含多個密碼子，其在大腸桿菌中很少使用，並且會干擾表現。因此，為了優化在大腸桿菌中的蛋白質表現，可以將各個基因與使用DNA-Works軟體設計的密碼子優化的寡核苷酸組裝在一起(Hoover等人，2002)。每個構築體可包含N端Nco I限制位、框內N端His6 標籤、和C端Eco RI位點以簡化選殖。選殖到pET28a載體(Novagen)中後，含有適當經修飾之CGL表現載體的大腸桿菌(BL21)可在含有50 μg/mL的康黴素的Terrific Broth (TB)培養基在搖瓶中以250 rpm下在37°C生長，直到達到OD600 約為0.5-0.6。此時，可將培養物換至25°C的震盪器中，用0.5 mM的IPTG誘導，並允許表現蛋白質再12 h。接著可藉由離心收集細胞沉澱，並重懸浮於 IMAC 緩衝液(10 mM NaPO4 /10 mM咪唑/300 mM NaCl，pH 8)中。在藉由法式壓碎機細胞壓碎或藉由高壓均質器溶裂後，可將溶裂物在20,000 x g下於4℃離心20分鐘，並將所得的上清液加到鎳 IMAC管柱上(珠粒大小45-165 μm，Qiagen)，用含0.1%的TRITON® 114的IMAC 緩衝液充分洗滌(90-100個管柱體積)，用10-20個管柱體積的IMAC 緩衝液洗滌，接著用 IMAC沖提緩衝液(50 mM NaPO4 /250 mM咪唑/300 mM NaCl，pH 8)沖提。使用 10,000 MWCO(截留分子量)的過濾裝置(Amicon)，將純化的蛋白質進行緩衝液交換至pH 8.3的100 mM的NaPO4 緩衝液。接著可以將含有酵素的級分與10 mM的吡哆醛-5'-磷酸(PLP)在25°C下培育一小時。接著以80:1的莫耳比將甲氧基 PEG 琥珀醯亞胺基羧甲基酯5000 MW (JenKem Technology)加入到經修飾之CGL酵素中，並在恆定攪拌下在 25℃下反應1 h。使用100,000 MWCO過濾裝置(Amicon)對所得混合物進行廣泛的緩衝液交換(含10%甘油的PBS)，並用0.2微米針筒式過濾器(VWR)滅菌。接著可以將酵素等分試樣在液氮中速凍，並在-80℃下保存。藉由SDS-PAGE和考馬斯染色評估，以這種方式純化的經修飾之CGL酵素變異體應＞ 95%均質。產率可基於最終的緩衝液濃度為6 M胍鹽酸鹽、20 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)中的計算所得之消光係數λ280 = 29,870 M-1 cm-1 來計算(Gill和von Hippel，1989)。可使用鱟變形細胞溶裂物 (LAL) 套組分析 PEG 化經修飾之CGL酵素的脂多醣(LPS)含量。
對於治療製劑的特定性質沒有限制。例如，此組成物可以與生理上可耐受的液體、凝膠、或固體載體、稀釋劑、和賦形劑一起以調製劑形式提供。可將這些治療製劑以類似於其他治療劑的方式投予哺乳動物以供獸醫用途，諸如與家畜動物，以及在人類中用於臨床。通常，治療療效所需的劑量將根據使用類型和投予模式以及個體的具體要求而變化。
此類組成物通常被製備為液體溶液或懸浮液，以用作注射劑。適合的稀釋劑和賦形劑為例如水、生理食鹽水、右旋糖、甘油、或類似者，及其組合。另外，如果需要，組成物可含有少量的輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、安定劑或pH緩衝劑。
在考慮臨床應用下，可能有必要以適合於所欲應用的形式製備包含蛋白質、抗體和藥物的治療組成物。通常，治療組成物可包含有效量的一或多種溶解或分散在醫藥上可接受的載體中的經修飾之CGL酵素或另外之劑。短語"治療上或治療上可接受的"是指當適當地投予動物諸如人時不會產生不良、過敏、或其他不幸的反應之分子實體和組成物。含有藉由在本文中所揭示的方法所單離的至少一種經修飾之CGL酵素或其他活性成分的治療組成物的製備是熟習本技術領域者已知的，例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990，其以引用方式併入本文中。又，對於動物(例如人)投予，應理解，製劑應符合FDA生物標準局要求的無菌性、熱原性、一般安全性、和純度標準。
如本文中所使用，"醫藥上可接受之載體"包括任何和所有溶劑、分散介質、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽類、防腐劑、藥物安定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、相似物質及其組合，如熟習本技術領域者已知的(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990，其以引用方式併入本文中)。除非任何習知載體與活性成分不相容，否則其於治療組成物之使用係涵蓋者。
組成物可用脂質組成物(例如脂質體)經由導管皮下、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、藉由注射、藉由輸注、藉由連續輸注、或藉由其他方法或上述的任何組合來投予，如熟習本技術領域者已知的(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990，其以引用方式併入本文中)。
經修飾之多肽可以游離鹼、中性、或鹽類形式調製成組成物。治療上可接受的鹽類包括酸加成鹽，例如，與蛋白質組成物的游離胺基所形成者，或與無機酸諸如例如鹽酸或磷酸所形成者，或諸如乙酸、草酸、酒石酸、或苦杏仁酸的有機酸所形成者。與游離羧基所形成的鹽類也可以衍生自無機鹼，諸如例如鈉、鉀、銨、鈣、或氫氧化鐵；或諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸、或普羅卡因的有機鹼。調製後，將以與劑型相容的方式和治療有效量投予溶液。該調製劑可以各種劑型投予，諸如經調合用於腸胃外投予，諸如可注射溶液，或用於遞輸至肺部的氣溶膠，或被配製用於消化投予，諸如藥物釋放膠囊及類似者。
所揭示的適合於投予的組成物可於具有或不具有惰性稀釋劑的醫藥上可接受之載體中提供。除非任何習知介質、劑、稀釋劑、或載體係有害於接受者或其中所含組成物的治療效果，否則以其在可投予的組成物用於實施該方法是合適的。載體或稀釋劑的實例包括脂肪、油、水、生理食鹽水溶液、脂質、脂質體、及類似者等，或其組合。該組成物亦可包含各種抗氧化劑，以阻止一或多種組分的氧化。另外，可藉由防腐劑來預防微生物的作用，諸如各種抗細菌劑和抗真菌劑，其包括但不限於對羥苯甲酸酯類(例如對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、乙汞硫柳酸鈉或其組合。
所揭示的組成物可用任何便利和實用的方式與載體組合，即藉由溶液、懸浮、乳化、摻和、包囊、吸收、及類似者。
投予動物患者的組成物的實際劑量可藉由物理和生理因素來判定，諸如體重、病況的嚴重度、所治療疾病的類型、先前或同時的治療干預、患者的特發病、及投予途徑。取決於劑量和投予途徑，較佳劑量及/或治療有效量的投予次數可根據個體的反應而變化。無論如何，負責投予的從業者將判定組成物中活性成分的濃度和個體的合適劑量。
治療組成物可包含例如至少約0.1%的活性化合物。活性化合物可包含單元重量的約2%至約75%，或例如介於約25%至約60%，以及可在其中衍生的任何範圍。自然地，在各治療上可用的組成物中的活性化合物的量可用以任何給定化合物單位劑量獲得適合劑量的方式製備。諸如溶解度、生體可用率、生物學半生期、投予途徑、產品儲放壽命、以及其他藥理學考量之因素，係製備此治療性調製劑的熟習本技術領域者所考量的，且由此，各種劑量及治療給藥方案可係理想的。
劑量亦可包含每次投予約500微克/kg體重、約1毫克/kg體重、約5毫克/kg體重、約10毫克/kg體重、約50毫克/kg體重、約100毫克/kg體重、約750毫克/kg體重或更高，以及可在其中衍生的任何範圍。如果每週投予，則劑量可以為5 mg/kg體重，或者例如對於70 kg個體為350 mg蛋白質。Ⅺ. 組合治療
在本文中所提供的組成物和方法可涉及投及經修飾之CGL酵素組合第二或另外的療法。這樣的療法可應用於治療與(半)胱胺酸依賴有關的任何疾病。例如，該疾病可係半胱胺酸尿症。
組合療法可增強治療或保護效果，及/或提高另一療法的治療效果。治療和預防方法和組成物可以有效地達到所需效果的組合量來提供，諸如消除尿道中的胱胺酸結石或預防尿道、腎臟及/或膀胱中胱胺酸結石的形成。此過程可涉及投予經修飾之CGL酵素和第二療法兩者。可以使組織、器官、或細胞暴露於一或多種組成物或藥理調製劑，其包含一或多種劑(即經修飾之CGL酵素或第二劑)，或使組織、器官、及/或細胞與二或更多種不同的組成物或調製劑接觸，其中一個組成物提供1)經修飾之CGL酵素，2)第二劑，或3)經修飾之CGL酵素和第二試劑。組合療法可與震波療法或手術療法結合使用。
當應用於細胞時，用語"接觸的"和"暴露的"在本文中用於描述將治療性構築體遞輸至標靶器官或置於與標靶細胞直接鄰近處的過程。為了達成結石溶解，例如將二種劑以有效溶解結石或防止其形成或再形成的組合量遞輸至細胞。
經修飾之CGL酵素可在相對於第二半胱胺酸尿症治療之前、期間、之後、或以各種組合投予。投予間隔可從同時至數分鐘至數天至數週。當將經修飾之CGL酵素與第二半胱胺酸尿症治療分開提供給患者時，通常會確保在每次遞輸時間之間的長時間未超過，使得這兩種治療在患者上仍將能夠發揮有利組合效果。在這種情況下，可在彼此約12至24小時或72小時內或彼此在約6-12小時內為患者提供經修飾之CGL酵素和第二胱胺酸尿療法。在某些情況下，理想的是在各投予間，可能需要將幾天(2、3、4、5、6或7)的治療時間延長到幾週(1、2、3、4、5、6、7或8)的治療時間。
所涵蓋的是經修飾之CGL可在第1天至第90天的任何一天(此範圍包括間隔天數)或其任何組合來給予，並且可在第1天至第90天的任何天給予另一治療(此範圍包括間隔天數)或其任何組合。在單一天(24小時期間)內，可給患者一或多次投予治療。經過一個療程後，可能會有一段時間不投予任何治療。該時間段可持續1-7天、及/或1-5週、及/或1-12個月或更長(此範圍包括間隔天數)，取決於患者的病況，諸如患者的預後、體力、健康等。治療循環可根據需要重複。
可利用各種組合。針對下列之實例，經修飾之CGL酵素係"A"且第二胱胺酸尿症療法係"B"； A/B/A   B/A/B   B/B/A   A/A/B   A/B/B   B/A/A   A/B/B/B   B/A/B/B B/B/B/A   B/B/A/B   A/A/B/B   A/B/A/B   A/B/B/A   B/B/A/A B/A/B/A   B/A/A/B   A/A/A/B   B/A/A/A   A/B/A/A   A/A/B/A
考慮到治療的毒性(如果有的話)，投予任何化合物或療法給患者將遵循投予此類化合物的一般規程。因此，可有監測可歸因於該療法的毒性的步驟。A. 手術
去除胱胺酸結石的最常見方法之一是經皮腎造瘻取石術(percutaneous nephrolithotomy)，其中在背部進行鎖孔切開術，並使用腎鏡將結石切裂並去除。儘管此手術比開放手術的侵入性小，但通常需要一般或脊髓麻醉，並需住院2至3天，恢復時間為數週。B. 震波療法
胱胺酸尿症患者一生中經常有結石形成的反復發作和外科手術。震波碎石術，利用高能震波碎石，可用於治療小於1.5 cm的胱胺酸結石。胱胺酸結石是所有泌尿結石中最堅固的，碎石術通常無法有效地將其分解。但是，較小的胱胺酸結石可能會用碎石術碎裂，因為可以使用較高能量的更頻繁的震波。C. 藥物療法
胱胺酸結石相關醫學病況的藥物治療涉及使用含巰基的藥物，諸如D-青黴胺、α-巰基丙醯基甘胺酸或硫普羅寧(Tiopronin) (Thiola®)、及硫甲丙脯酸(captopril)，以破壞胱胺酸雙硫鍵並形成更易溶的混合二硫化物或半胱胺酸本身。但是，這些藥物經常給患者帶來各種不適的副作用，諸如胃腸道不耐受、皮疹和關節痛(Sakhaee及Sutton，1996)。D. 其他方法
去除胱胺酸結石的其他治療過程通常涉及管理尿中胱胺酸水平以減少結石形成的風險。這些管理方法包括大量增加水的攝入量(從而增加尿液量和可溶解的胱胺酸的量)、鈉和甲硫胺酸(胱胺酸的代謝前驅物)的飲食限制、以及口服投予檸檬酸鉀以增加尿液的pH，從而增加胱胺酸的溶解度。
治療胱胺酸結石的另一方法是非手術和微創途徑，涉及經由腎造口術導管將化學溶液遞輸至腎臟以化學溶解結石，也稱為化學溶解。在該技術中已使用了多種化學分解劑，包括碳酸氫鈉和pH 10的有機緩衝液參羥基亞甲基胺基甲烷(tromethamine-E)，它們均提供強鹼性環境以溶解胱胺酸結石。乙醯基半胱胺酸亦係經常用於化學溶解中，並以類似於D-青黴胺和Thiola®的方式藉由破壞胱胺酸二硫化物並形成更可溶的二硫化物來溶解結石。但是，這種溶解方法在胱胺酸結石的治療中作用有限，因為這些化學溶解劑的作用緩慢，且可通常花數週到數月才能溶解結石(Ng和Streem，2001)。Ⅻ. 套組
所提供者係套組，例如治療套組。例如，套組可包含一或多種如本文中所述的治療組成物和任選的使用說明。套組亦可包含一或多種用於完成此類組成物投予的裝置。例如，所請標的套組可包含治療組成物和導管，用於完成將組成物直接靜脈內注射到標靶組織中。套組可包含預填充的經修飾之CGL酵素的安瓿，任選經調配製成治療組成物、或凍乾，以與遞輸裝置一起使用。
套組可包含帶有標籤的容器。合適的容器包括例如瓶、小瓶和試管。容器可以由多種材料形成，例如玻璃或塑膠。容器可以容納包括經修飾之CGL酵素的組成物，其對如上所述的治療或非治療應用有效。容器上的標籤可以指示該組成物用於特定療法或非治療性應用，亦可指示體內或體外使用的方向，例如上述說明。套組通常包含上述容器和一或多個其他容器，其包含從商業和用戶角度理想的材料，包括緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器、和帶有使用說明的包裝插頁。XIII. 實例
包括下列實例以說明本發明的較佳實施態樣。熟習本技術領域者應理解，下列實例中所揭示之技術代表本案發明人所發現的在本發明的實施中發揮良好作用的技術，且由此可認為構成其實施的較佳模式。然而，根據本揭露，熟習本技術領域者應理解，可在所公開的特定實施態樣中進行許多改變，並且在不脫離本發明的精神和範圍下仍獲得相似或類似的結果。實例 1 – 96 孔板篩選 ( 半 ) 胱胺酸酶活性
半胱胺酸酶酵素將L-半胱胺酸降解為丙酮酸、氨和 H2 S，並將L-胱胺酸轉化為丙酮酸、氨和硫半胱胺酸(k cat /K M 分別為 ~ 0.2 mM-1 s-1 及0.5 mM-1 s-1 )(硫半胱胺酸進一步經非酵素性降解為L-半胱胺酸和 H2 S)。使用3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)進行比色法檢定偵測丙酮酸(Takakura et al., 2004)被縮放至96孔板形式，以篩選小型庫和對具有最大胱胺酸及/或半胱胺酸解離酶活性的選殖體進行分級。該平板篩選提供了一種從突變庫挑選活性最高的選殖體的簡便方法。
將含有經突變的hCGL或hCGL對照的單個菌落挑入96孔培養板，其含100 µL TB培養基/孔，含50 µg/mL康黴素。然後將這些培養物在37℃的平板振盪器上生長12小時。冷卻至25℃後，再加入100 µL培養基/孔，含有50 µg/mL康黴素和加入1 mM IPTG。在 25℃ 搖動進行16小時表現，然後將100 µL培養物/孔轉移至96孔檢定板。然後將檢定板離心以沉澱細胞，除去培養基，並藉由加入100 µL/孔的B-PER蛋白萃取試劑(Pierce)溶裂細胞。藉由離心清除溶裂物後，將90 µL的上清液轉移至His-Sorb板(Qiagen)的每個孔中，並在10℃下緩慢攪動培育三小時。然後棄去所得的上清液，並藉由向每個孔中加入200 µL PBS洗滌平板總共三次，在4℃下緩慢攪動平板15分鐘，並吸出洗滌緩衝液。然後，向His-Sorb平板的每個孔中加入100 µL含有0.5 mM 胱胺酸的反應緩衝液，並在37℃下培育二小時。隨後將50 µL反應液轉移到單獨的96孔板中，並藉由添加150 µL MBTH工作溶液/孔來進行衍生化。然後將平板在50○ C 下加熱40分鐘，冷卻後在微量滴定板讀取器中在λ = 320 nm下讀取。選擇展現出比親代對照更大活性的選殖體用於進一步定性。實例 2 – 經工程改造之人半胱胺酸突變庫之構築
結構和親緣關係分析表明，殘基 A51、E59、L91、T163、V166、T189、P193、A200、N234、T311、E339、I353、K361及N362可在半胱胺酸酶介導的胱胺酸降解中起作用。藉由重疊延伸PCR在這些位置上構築各種簡併密碼子飽和突變庫。用NcoI和EcoRI消化得到的PCR產物，並用T4 DNA連接酶連接到pET28a載體中。將連接物直接轉型到大腸桿菌(BL21-DE3)中，並平板培養在Lb-康黴素平板上，用於實例1中所述的後續篩選實驗。對所有庫的篩選均超出其理論大小的二倍。分離出與親本對照反應相比顯示出增強活性的選殖體，並判定序列以鑑定突變。實例 3 – 半胱胺酸酶變異體的表現及純化
將在 96 孔板篩選中顯示增強活性的半胱胺酸酶變異體在含有50 μg/mL的康黴素的Terrific Broth (TB)培養基在搖瓶中以250 rpm下培養，直至到達OD600為0.5-0.6。此時，將培養物換至25○ C的震盪器中，且用0.5 mM的IPTG誘導，並允許表現蛋白質再12 h。接著藉由離心收集細胞沉澱，並重懸浮於IMAC緩衝液(10 mM NaPO4 /10 mM咪唑/300 mM NaCl，pH 8)中。在法式壓碎機細胞壓碎溶裂後，將溶裂液在4℃下以20,000 x g離心20分鐘，並將所得的上清液加到鎳IMAC管柱上，用10-20倍管柱體積的IMAC緩衝液洗滌，然後用IMAC沖提緩衝液沖提(50 mM NaPO4 /250 mM咪唑/300 mM NaCl，pH 8)。然後將含酵素的級分與5 mM吡哆醛磷酸(PLP)在 25°C培育一小時。使用10,000 MWCO離心過濾器裝置(Amicon)，將蛋白質緩衝液交換數次到100 mM PBS、10%甘油、pH 7.3溶液中。立即分析半胱胺酸酶變異酵素的等分試樣的生物物理性質，或在液氮中速凍並儲存在-80℃。藉由SDS-PAGE和考馬斯染色評估，以這種方式純化的hCGL-變異體酵素係＞ 95%均質。實例 4 – 共軛乳酸去氫酶檢定以供判定動力學
為了判定半胱胺酸酶變異體的穩態動力學參數，開發一種偶合、連續分光光度檢定。該檢定法依賴於由半胱胺酸酶與胱胺酸催化反應產生的丙酮酸、藉由輔助酵素即乳酸去氫酶(LDH)來利用。LDH在丙酮酸化學計量存在的情況下氧化NADH，生成乳酸和NAD+ 。NADH的氧化與丙酮酸成正比，而這繼而與半胱胺酸酶酵素的活性成正比。使用寬範圍的胱胺酸濃度在340 nm下分光光度法監測NADH的消失與時間的關係，並使用記錄曲線的線性部分計算10%受質耗盡之前的反應速率(初始速度的條件)。將受質濃度依賴性的觀察速率標準化至用於反應的酵素濃度，隨後將其繪製為受質濃度的函數。所得數據配適於Michaelis-Menten方程式，用於計算穩態參數。使用NADH的莫耳吸收消光係數(6.22 mM-1 cm-1 )計算NADH吸光度到絕對濃度的轉化。使用該檢定測試變異體以確定穩態動力學參數，並將所得的k cat /K M 值直接與參考半胱胺酸酶變異體(hCGL-H55E-E59T-T336D-E339V；參見美國專利申請號15/977,246，其係以引用方式全部併入本文)並行比較。多個變異體顯示出用於降解胱胺酸的k cat /K M 增加(表1，k cat /K M 的倍數改善)。表 1 . 相對於參考半胱胺酸酶(hCGL-H55E-E59T-T336D-E339V)的胱胺酸降解之k cat /K M 倍數改善。
序列識別號： 突變 倍數改善 k cat /K M
6 P193A、T311G、E339V、I353S 2.7
7 A200P、T311G、E339V、I353S 2.5
8 P193A、A200P、T311G、E339V、I353S 2
9 H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、E339V 1.3
10 H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、E339V 1.4
11 T189S、P193G、T311G、E339V、I353S 1.3
12 T163R、T311G、E339V、I353S 1.4
13 A51W、H55E、E59T、T336D、E339V 1.8
14 H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、I353S 1.5
15 A200H、T311G、E339V、I353S 1.6
16 T311G、E339V、I353S 2.6
17 E59I、E339V、I353S 1.5
18 L91M、E339V 1.3
19 E339V、I353S 2.9
20 E339V 2.8
nd = 未判定
*  *  *
就本揭露而言，在本文中所揭示和所請之所有方法可在不進行過度實驗下進行和執行。儘管已經根據較佳實施態樣說明本發明的組成物和方法，但是對於熟習本技術領域者而言顯而易見的是，在不背離本發明的概念、精神和範圍的情況下，可對在本文中所說明之方法及方法的步驟或步驟順序變化。更特定言之，顯而易見的是，化學和生理相關的某些劑可取代在本文中所述的劑，同時將達成相同或相似的結果。對於熟習本技術領域者顯而易見的所有這些類似的取代和修飾都被認為落入所附申請專利範圍所界定的本發明精神、範圍和概念之內。參考文獻 下列參考文獻在一定程度上提供在在本文中所提及的例示性的程序或其他細節的補充，其以引用方式特別併入本文中。 美國專利第5,889,155號 美國專利公開第2009/0304666號 Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1994。 Bekkevold等人，Dehydration parameters and standards for laboratory mice.J. Am. Assoc.Lab.Anim.Sci. , 52(3):233-239, 2013。 Doxsee等人，Sulfasalazine‐induced cystine starvation: Potential use for prostate cancer therapy。The Prostate , 67(2): 162-171, 2007。 Ercolani等人，Bladder outlet obstruction in male cystinuria mice.Int. Urol.Nephrol. 42: 57-63, 2010。 Feliubadalo等人，Slc7a9-deficient mice develop cystinuria non-I and cystine urolithiasis.Hum.Mol.Genet. , 12: 2097-2108, 2003。 Foye等人，Foye's Principles of Medicinal Chemistry, Lippincott Williams & Wilkins, 2007。 Gill and von Hippel, Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.Anal.Biochem. , 182(2): 319-326, 1989。 Glode等人，Cysteine auxotrophy of human leukemic lymphoblasts is associated with decreased amounts of intracellular cystathionase protein.Biochemistry , 20(5): 1306-1311, 1981。 Guan等人，The x c− cystine/glutamate antiporter as a potential therapeutic target for small-cell lung cancer: use of sulfasalazine.Cancer Chemotherapy and Pharmacology , 64(3): 463-472, 2009。 Harkki等人，BioTechnology , 7: 596-603, 1989。 Hopwood等人，In:Genetic Manipulation of Streptomyces , A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, Conn., 1985。 Hoover等人，The structure of human macrophage inflammatory protein-3alpha/CCL20.Linking antimicrobial and CC chemokine receptor-6-binding activities with human beta-defensins.J. Biol.Chem. , 277(40): 37647-37654, 2002。 Kim等人，Expression of cystathionine β-synthase is downregulated in hepatocellular carcinoma and associated with poor prognosis.Oncology Reports , 21(6): 1449-1454, 2009。 Hui及Hashimoto,Infection Immun., 66(11): 5329-5336, 1998。 Link等人，Cystathionase: a potential cytoplasmic marker of hematopoietic differentiation.Blut , 47(1): 31-39, 1983。 Livrozet等人，An animal model of Type A Cystinuria due to spontaneous mutation in 129S2/SvPasCrl Mice.PLoS One 9:e102700, 2014。 Lordanescu,J. Bacteriol , 12: 597-601, 1975。 Maniatis等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988。 Mellor等人，Gene , 24: 1-14, 1983。 Morris等人，Guidelines for the diagnosis and management of cystathionine beta-synthase deficiency.J. Inherit.Metab.Dis. , 40(1):49-74, 2017。 Penttila等人，Gene , 61: 155-164, 1987。 Peters等人，A mouse model for cystinuria type I.Hum Mol Genet 12: 2109-2120, 2003。 Rao等人，Role of the Transsulfuration Pathway and of {gamma}-Cystathionase Activity in the Formation of Cysteine and Sulfate from Methionine in Rat Hepatocytes.Journal of Nutrition , 120(8):837, 1990。 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1289-1329, 1990。 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed.Pharmaceutical Press, 2013。 Schneider等人，671 NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.Nature Methods , 9:2012。 Sibakov等人，Eur.J. Biochem. , 145: 567-572, 1984。 Stone等人，Strategies for optimizing the serum persistence of engineered human arginase I for cancer therapy.Journal of Controlled Release , 158:171-179, 2012。 Takakura等人，Assay method for antitumor L-methionine -lyase: comprehensive kinetic analysis of the complex reaction with L-methionine.Analytical Biochemistry , 327(2): 233-240, 2004。 Tiziani等人，Optimized metabolite extraction from blood serum for 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy.Analytical Biochemistry , 377: 16-23, 2008。 Tiziani等人，Metabolomics of the tumor microenvironment in pediatric acute lymphoblastic leukemia.PLoS One , 8:e82859, 2013。 Ward, Proc, Embo-Alko Workshop on Molecular Biology of Filamentous Fungi, Helsinki, 119-128, 1989。 Wawrzynczak及Thorpe, In:Immunoconjugates, Antibody Conjugates In Radioimaging And Therapy Of Cancer , Vogel (Ed.), NY, Oxford University Press, 28, 1987。 Zhang等人，Stromal control of cystine metabolism promotes cancer cell survival in chronic lymphocytic leukaemia.Nature Cell Biology , 14(3): 276-286, 2012。 Zhao等人，Frequent Epigenetic Silencing of the Folate-Metabolising Gene Cystathionine-Beta-Synthase in Gastrointestinal Cancer.PLoS One , 7(11): e49683, 2012。
下列圖式形成本說明書的一部分，並且經包括在內以進一步例示所描述之方法、化合物、及組成物。
圖 1 –SEQ ID NO: 1-5的序列比對。星號表示各種經修飾之CGL酵素的經工程改造之位置。
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Figure 12_A0101_SEQ_0228
Figure 12_A0101_SEQ_0229
Figure 12_A0101_SEQ_0230
Figure 12_A0101_SEQ_0231
Figure 12_A0101_SEQ_0232
Figure 12_A0101_SEQ_0233

Claims (36)

  1. 經修飾之靈長目動物胱硫醚-γ-解離酶(cystathionine-γ-lyase) (CGL)酵素，其包含至少下列相對於天然人CGL胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)之取代，其中該經修飾之酵素具有胱胺酸酶和半胱胺酸酶兩者活性，該等取代係選自由下列所組成之群組： (a)   在位置193之丙胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (b)   在位置200之脯胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (c)   在位置193之丙胺酸、在位置 200 之脯胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (d)   在位置55之麩胺酸、在位置59之蘇胺酸、在位置91之甲硫胺酸、在位置234之離胺酸、在位置336之天冬胺酸、及在位置339之纈胺酸； (e)   在位置55之麩胺酸、在位置59之蘇胺酸、在位置91之絲胺酸、在位置234之離胺酸、在位置336之天冬胺酸、及在位置339之纈胺酸； (f)   在位置189之絲胺酸、在位置193之甘胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (g)   在位置163之精胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (h)   在位置51之色胺酸、在位置55之麩胺酸、在位置59之蘇胺酸、在位置336之天冬胺酸、及在位置339之纈胺酸； (i)    在位置55之麩胺酸、在位置193之丙胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置336之天冬胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (j)   在位置200之組胺酸、在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (k)   在位置311之甘胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (l)    在位置59之異白胺酸、在位置339之纈胺酸、及在位置353之絲胺酸； (m)  在位置91之甲硫胺酸及在位置339之纈胺酸；以及 (n)   在位置339之纈胺酸及在位置353之絲胺酸。
  2. 如請求項1之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之CGL酵素係經修飾之蘇門達臘紅毛猩猩(Pongo abelii) CGL酵素。
  3. 如請求項2之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之蘇門達臘紅毛猩猩CGL酵素包含選自由下列所組成之群組之取代： (a)   P193A、T311G、E339V、及V353S； (b)   A200P、T311G、E339V、及V353S； (c)   P193A、A200P、T311G、E339V、及V353S； (d)   H55E、V59T、L91M、N234K、T336D、及E339V； (e)   H55E、V59T、L91S、N234K、T336D、及E339V； (f)   T189S、P193G、T311G、E339V、及V353S； (g)   T163R、T311G、E339V、及V353S； (h)   A51W、H55E、V59T、T336D、及E339V； (i)    H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、及V353S； (j)   A200H、T311G、E339V、及V353S； (k)   T311G、E339V、及V353S； (l)    V59I、E339V、及V353S； (m)  L91M及E339V；以及 (n)   E339V及V353S。
  4. 如請求項1之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之CGL酵素係經修飾之人CGL酵素、經修飾之黑猩猩(Pan troglodytes) CGL酵素、或經修飾之侏儒黑猩猩(Pan paniscus)CGL酵素。
  5. 如請求項4之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之人CGL酵素、經修飾之黑猩猩CGL酵素、或經修飾之侏儒黑猩猩CGL酵素包含選自由下列所組成之群組之取代： (a)   P193A、T311G、E339V、及I353S； (b)   A200P、T311G、E339V、及I353S； (c)   P193A、A200P、T311G、E339V、及I353S； (d)   H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、及E339V； (e)   H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、及E339V； (f)   T189S、P193G、T311G、E339V、及I353S； (g)   T163R、T311G、E339V、及I353S； (h)   A51W、H55E、E59T、T336D、及E339V； (i)    H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、及I353S； (j)   A200H、T311G、E339V、及I353S； (k)   T311G、E339V、及I353S； (l)    E59I、E339V、及I353S； (m)  L91M及E339V；以及 (n)   E339V及I353S。
  6. 如請求項1之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之CGL酵素係經修飾之食蟹獼猴CGL酵素。
  7. 如請求項6之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該經修飾之食蟹獼猴CGL酵素包含選自由下列所組成之群組之取代： (a)   P193A、T311G、E339V、及I353S； (b)   A200P、T311G、E339V、及I353S； (c)   P193A、A200P、T311G、E339V、及I353S； (d)   H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、及E339V； (e)   H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、及E339V； (f)   T189S、P193G、T311G、E339V、及I353S； (g)   V163R、T311G、E339V、及I353S； (h)   A51W、H55E、E59T、T336D、及E339V； (i)    H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、及I353S； (j)   A200H、T311G、E339V、及I353S； (k)   T311G、E339V、及I353S； (l)    E59I、E339V、及I353S； (m)  L91M及E339V；以及 (n)   E339V及I353S。
  8. 如請求項1至7中任一項之經單離、經修飾之CGL酵素，其進一步包含異源性胜肽片段或多醣。
  9. 如請求項8之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該異源性胜肽片段係XTEN胜肽、IgG Fc、白蛋白、或白蛋白結合胜肽。
  10. 如請求項8之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該多醣包含聚唾液酸聚合物。
  11. 如請求項1至 10 中任一項之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該酵素係經偶合至聚乙二醇 (PEG)。
  12. 如請求項11之經單離、經修飾之CGL酵素，其中該酵素係經由一或多個離胺酸殘基而偶合至 PEG。
  13. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至7中任一項之酵素之核苷酸序列。
  14. 如請求項13之核酸，其中該核酸係經密碼子優化，以在細菌、真菌、昆蟲或哺乳動物中表現。
  15. 如請求項14之核酸，其中該細菌係大腸桿菌。
  16. 如請求項15之核酸，其中該核酸包含根據SEQ ID NO: 81-95中任一項之序列。
  17. 一種表現載體，其包含如請求項13至16中任一項之核酸。
  18. 一種宿主細胞，其包含如請求項13至16中任一項之核酸。
  19. 如請求項18之宿主細胞，其中該宿主細胞係細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞。
  20. 一種治療性調製劑，其包含於醫藥上可接受之載體中之如請求項1至12中任一項之酵素、或如請求項13至16中任一項之核酸。
  21. 一種治療具有胱胺酸尿症或處於發展胱胺酸尿症風險的個體之方法，其包含將治療有效量之如請求項20之調製劑投予至該個體。
  22. 如請求項21之方法，其中該個體係維持L-胱胺酸及/或L-半胱胺酸限制性膳食。
  23. 如請求項21之方法，其中該個體係維持甲硫胺酸限制性膳食。
  24. 如請求項21之方法，其中該個體係維持正常膳食。
  25. 如請求項21之方法，其中該個體係人類患者。
  26. 如請求項21之方法，其中該調製劑係藉由注射、藉由輸注、藉由連續輸注、或經由導管來靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、血管內、皮下投予。
  27. 如請求項21之方法，其中該個體先前業經針對胱胺酸尿症治療且該酵素係經投予以預防胱胺酸尿症的復發。
  28. 如請求項21之方法，其進一步包含將至少第二胱胺酸尿症療法投予該個體。
  29. 如請求項28之方法，其中該第二胱胺酸尿症療法係手術療法或震波療法。
  30. 如請求項28之方法，其中該第二胱胺酸尿症療法包含選自由下列所組成之群組之劑或藥：碳酸氫鹽、參羥基亞甲基胺基甲烷(tris-hydroxymethylene-aminomethane) (三羥甲基胺基甲烷-E (tromethamine-E))、乙醯半胱胺酸、D-青黴胺、α-巰基丙醯基甘胺酸、及硫甲丙脯酸。
  31. 如請求項21之方法，其中該方法減少該個體的血漿及/或血清中之半胱胺酸及/或胱胺酸之水平。
  32. 如請求項21之方法，其中該方法減少該個體的尿液中之半胱胺酸及/或胱胺酸之水平。
  33. 如請求項21之方法，其中該方法預防該個體的尿道中之胱胺酸結石的形成。
  34. 如請求項21之方法，其中該方法預防該個體的腎臟中之胱胺酸結石的形成。
  35. 如請求項1之方法，其中該方法預防該個體的腎臟中之胱胺酸結石的形成。
  36. 一種如請求項1至12中任一項之經單離或經修飾之CGL酵素或包含該經修飾之CGL酵素的組成物之用途，其用於製造針對胱胺酸尿症患者治療應用之藥物。
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