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WO1992000383A1 - Anticorps specifiques de la liaison isopeptidique induite par les transglutaminases - Google Patents

Anticorps specifiques de la liaison isopeptidique induite par les transglutaminases Download PDF

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Publication number
WO1992000383A1
WO1992000383A1 PCT/FR1991/000491 FR9100491W WO9200383A1 WO 1992000383 A1 WO1992000383 A1 WO 1992000383A1 FR 9100491 W FR9100491 W FR 9100491W WO 9200383 A1 WO9200383 A1 WO 9200383A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibodies
isopeptide
lysine
protein
immunogen
Prior art date
Application number
PCT/FR1991/000491
Other languages
English (en)
Inventor
Gérard Quash
Jean-Claude Saccavini
Saïd EL ALAOUI
Joëlle BOHY
Elisabeth Aumaitre
Original Assignee
Cis Bio International
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cis Bio International filed Critical Cis Bio International
Publication of WO1992000383A1 publication Critical patent/WO1992000383A1/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to antibodies specific for the isopeptide bond induced by transglutaminases, to antigens constituted by an isopeptide in which a protein is conjugated via the glutamic acid residue which it contains, to the primary amino function d 'a lysine contained in another protein.
  • the present invention extends to the methods for obtaining said antibodies and antigens and to their diagnostic and therapeutic applications.
  • transverse bonds between protein chains generally takes place via the ⁇ -NH 2 groups of lysine residues of peptides, to give rise to the formation of isopeptide bonds N ⁇ - ( ⁇ glutamyl) lysine in the presence of transglutaminases: a covalent bond is thus formed between the ⁇ -carboxamide groups of the glutamine residues contained in a protein and the ⁇ -amino groups of lysine residues contained in the same protein chains or in different chains.
  • crosslinking has been identified in the case of cellular proteins (collagen, keratin) as well as in extracellular proteins (insoluble fibrin of the plasma, uteroglobulin of the seminal fluid, proteins of the lens and capillary films) and it has been observed. both between homologous proteins and between heterologous proteins.
  • fibrin which constitutes a marker for disseminated intravascular coagulation (DIC) and for myocardial infarction, is the dimeric form "D-Dimer” (Francis et Al., “Circulation", 75, (1987), p. 1170-1177).
  • TG activity in the primary tumor decreases when metastases are detected in the lung (Barnes et al., 1985).
  • TG activity could therefore be an enzymatic marker of metastasizing power.
  • the TG content varies in parallel to the TG activity according to the following order: fibroblast at rest> proliferative> transformed.
  • TG as a diagnostic marker, by labeling tumor biopsies using antibodies directed against the isopeptides produced by the TG reaction, could make it possible to differentiate between benign tumors and malignant tumor and possibly to classify the intermediate states, which always pose problems to pathologists.
  • Plasma TG (coagulation factor XIII) could also play an indirect role in tumor development:
  • the DFMO added to the drinking water of mice bearing Lewis tumors inhibits the growth of the primary tumor by 40-50% and the formation of pulmonary metastases by 80% (Sunkara et al., 1982).
  • the DFMO is an inhibi competitive source of TG (Delcros et al., 1984). This should be taken into account when interpreting the results of the in vivo experiments. Indeed, plasma TG (factor XIII) could be a prime target for DFMO, which would explain the increase in clotting time observed in rats treated with DFMO (Luk et al., 1983).
  • DD3B6 commercially available from American Diagnostica, Greenwich, C.T.
  • DD-1C3 / 108 reacts with the D-dimer of fibrin and also with the degradation products of fibrin of high molecular weight containing ⁇ - ⁇ chains (Elms et al., 1983),
  • DD3B6 reacts with an epitope present on the D fragment, whether it is in monomeric form or in D-dimer dimeric form (Devine and Greenberg, A.J.C.P. 1988, 89. p. 663-666).
  • fibrin which constitutes a marker for disseminated intravascular coagulation (DIC) and for myocardial infarction, is the dimeric form, D-Dimer.
  • DD3 B6 which is the mAb most used at present in diagnostic kits for the determination of the level of D-Dimer, by agglutination and by ELISA, does not have the absolute specificity required for measure D-dimer in the presence of D-monomer, due to its reaction with non-crosslinked fibrin (Devine and Greenberg, AJCP, 1988, 89, p. 663-666).
  • HSA 99m Tc-HSA, serum albumin, MAA labeled with 99m Tc; fibrinogen labeled with 123 I, 131 I-streptokinase, TPA labeled with 111 In, 99 ⁇ n Tc-plasmin, 131 I-strombospondin, among others
  • HSA 99m Tc-HSA, serum albumin, MAA labeled with 99m Tc
  • fibrinogen labeled with 123 I 131 I-streptokinase
  • TPA labeled with 111 In
  • 99 ⁇ n Tc-plasmin 99 ⁇ n Tc-plasmin
  • 131 I-strombospondin among others
  • Monoclonal Antibodies have been produced against platelets, but they cannot be used in other cases than for the detection of recent, developing thrombi. In addition, administration of heparin in such cases renders this type of antibody unusable.
  • Anti-fibrin antibodies are also known which, however, recognize only free fibrin and not cross-linked fibrin.
  • the present invention therefore has as its object the provision of antibodies specific for the isopeptide bond induced by transglutaminases, capable of allowing the detection in vivo and / or in vitro of the isopeptide produced in the presence of transglutaminase, which it is the cellular or extracellular isopeptide.
  • the present invention also aims to provide a protein immunogen containing said isopeptide bond and capable of allowing, by immunization of suitable mammals, the obtaining of the above-mentioned antibodies directed against the isopeptide produced in the presence of transglutaminase, and also suitable for allowing the determination of immunocomplexes containing antibodies directed against said isopeptide.
  • the present invention relates to antibodies which specifically recognize the isopeptide N ⁇ - ( ⁇ -glutamyl) -lysine formed under the action of transglutaminase, between the ⁇ -carboxamide group of a glutamine residue present in a protein. and the ⁇ -NH 2 group of lysine or between the ⁇ -NH 2 group of a free or present lysine residue in a protein and the ⁇ -carboxyl group of free or present glutamic acid in a protein, or fragments of said antibodies.
  • said specific antibodies are polyclonal antibodies obtained by immunization of a suitable mammal using a suitable immunogen, contained in the serum collected from the latter and, optionally, isolated from said serum by appropriate purification techniques.
  • said specific antibodies are monoclonal antibodies obtained by immunization of a suitable mammal using a suitable immunogen, followed by the fusion of the spleen cells collected from said immunized mammal, with the cells of a judiciously chosen myeloma, of a mammal of the same species, selection of hybridomas secreting the desired antibodies, cloning, culture and collection of specific monoclonal antibodies.
  • an immunogen capable of being used for the immunization of suitable mammals with a view to the production of specific antibodies directed against the isopeptide N 6 - ( ⁇ -glutamyl) -lysine and, moreover, suitable for being used for the determination of antibodies directed against said isopeptide, contained in immunocomplexes, which immunogen is characterized in that it consists of a protein containing glutamic acid, conjugated via the ⁇ -carboxyl group of said acid to the ⁇ -NH 2 group of a lysine residue contained in an appropriate protein.
  • the aforementioned specific monoclonal antibodies are in free form.
  • said specific monoclonal antibodies are immobilized on suitable insoluble supports.
  • the above-mentioned immunogen is immobilized on a suitable insoluble support.
  • said monoclonal antibodies are labeled with the aid of all appropriate markers.
  • said monoclonal antibodies are labeled using appropriate radio-elements, in particular when they are intended to be used in imaging, in which case they are advantageously marked by any usual radio-elements, in particular by 123 I, 131 I, 111 In, 99M Tc.
  • said monoclonal antibodies are labeled with the aid of all suitable markers such as radio-elements, enzymatic markers, fluorescent markers, luminescent markers, in particular, among others.
  • the present invention further relates to an agent for in vitro diagnosis of lesions or tumors of human breast or colorectal tissues, by immunohistochemical techniques on biopsies of said tissues, characterized in that it consists of said specific polyclonal or monoclonal antibody , preferably in free form, suitably labeled.
  • the present invention further relates to an agent for in vitro diagnosis of cardiovascular diseases and viral diseases accompanied by sequelae such as hemorrhagic fever, characterized in that it consists of said specific monoclonal antibody, preferably immobilized on an insoluble support, suitably marked.
  • the present invention also relates to an agent for in vivo diagnosis of malignant tumors and cardiovascular diseases, characterized in that it consists of said specific monoclonal antibody, or one of its fragments, in free form, suitably labeled.
  • the present invention has, moreover, for subject a therapeutic composition characterized in that it comprises said specific monoclonal antibody, or one of its fragments, coupled to at least one suitable proteolytic enzyme or to a suitable drug.
  • said antibody or one of its fragments can advantageously serve as a vector for a proteolytic enzyme chosen from the group which comprises in particular, but not limited to, urokinase, streptokinasé, TPA.
  • a proteolytic enzyme chosen from the group which comprises in particular, but not limited to, urokinase, streptokinasé, TPA.
  • Another subject of the present invention is an agent for detecting antibodies directed against an isopeptide formed under the action of transglutaminase, present in a tissue or a body fluid, in particular in the form of immunocomplexes, characterized in that it consists of an isopeptide formed of a protein containing a glutamine residue, conjugated via the ⁇ -carboxamide group of the latter to the ⁇ -NH 2 group of a lysine residue contained in an appropriate protein, which isopeptide is, if as desired, suitably marked.
  • said antibody can be presented either in the form of whole immunoglobulins, or in the form of Fab, Fab 2 fragments, etc., chimerized or not.
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanine
  • 10 mM phosphate buffer pH6 To 1.36 mg of Keyhole Limpet Hemocyanine (KLH) in solution in 1 ml of 10 mM phosphate buffer pH6 were added 8.7 mg (20 ⁇ moles) of N- ⁇ -CBZ-lysine-pnitrophenyl ester which will be designated below under the name of "(Z-lys)" in the presence of 3.8 mg (20 ⁇ moles) of 1-ethyl-3 (3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC). The mixture was left at room temperature with gentle agitation for 6 h.
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanine
  • EDC 1-ethyl-3 (3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide
  • mice Female Balb / C mice aged 6 to 8 weeks were each injected intraperitoneally (IP) on the first day (D0) with 100 ⁇ g of KLH-Z-lys emulsified with an equal volume (100 ⁇ l) of the complete adjuvant from Freund. On D12 and D24, the animals received boosters from KLH-Z-Lys with incomplete Freund's adjuvant, at doses of 100 and 50 ⁇ g respectively.
  • IP intraperitoneally
  • mice having the highest antibody levels were sacrificed, the spleens removed and the spleen cells were fused with the cells of the mouse myeloma Sp2 / 0Agl4 according to the conventional Kohler method & Milstein (1975).
  • the clones secreting Ab were selected by Dot-blot and subcloned by the limit dilution method.
  • 20 of the 102 hybridomas were selected according to the criterion of the intensity of the positive reaction of their medium with BSA-Z-lys in Dot-blot. They were cloned by the limit dilution method in 96-well plates. From this cloning, 85 clones were selected: 5 of them (71A3f1, 81Alb10, 81Dlc2.81Dlell and 82D6g7) whose media showed strong immunoreactivity with BSA-Z-lys were retained.
  • the Ig subclass produced by each clone was determined by Dot-blot using rabbit sera specific for each subclass.
  • the kit from ZYMED (Laboratories, INC - USA) was used according to the instructions provided by the manufacturer. EXAMPLE II
  • An adjacent section is treated with hematoxylin-saffron-eosin to serve as a histopathological reference.
  • the mAb according to the invention reacts only with cell chromatin.
  • the still organized glandular acini react with mAb while the nearby tumor cells are not reactive. Even within a group of acini the tumor cells appear negative.
  • the inventors estimated on each section the percentage of the cell population reacting with mAb either 0%, less than 10%, between 10 and 50% or more than 50%.
  • Glu-Lys isopeptides therefore constitutes a reliable marker which clearly differentiates malignant tissue from benign tissue on Ristological sections.
  • HEp2 or MRC5 cells are trypsinized and then seeded in a Petri dish containing culture medium and a glass slide. The slide covered with cells is taken at different culture times. The cells are fixed in acetone.
  • the inventors tested the reactivity of the cells to the antiPA antiserum.
  • the mAb according to the invention reacts only with the nucleus for both Hep2 and MRC5 as do the cells of the biopsies.
  • the inventors grew the cells in microtitration plates and after treatment with the specific antibodies the chromogen which remains soluble gives a colored reaction readable at 490 nm on a plate reader. Immunostaining varies during cell growth.
  • CELIA Covalent Enzyme Linked Immuno Assay
  • nitrocellulose squares were washed first with buffer B, then treated with antibodies (sheep) labeled with 125 I, directed against mouse IgG (AMERSHAM) diluted with 1/50 in a suspension of Rmpedlait diluted to 5% in PBS.
  • the radioactivity retained on each square was then determined in a ⁇ counter.
  • the tubes of series (B) were not washed to determine the influence of washing.
  • 1 tube of each series received 200 ⁇ l of the culture medium of mAb 71A3f1 and the other 200 ⁇ l of an irrelevant mAb. After incubation for 2 h at laboratory temperature, all the tubes were washed by centrifugation with Buffer B. This step was followed by the addition of a 1/50 diluted solution (5% regulated in PBS) of antibodies (sheep) labeled with 125 I directed against mouse IgG. After incubation for 2 h, at laboratory temperature, the steps for washing and measuring the radioactivity were identical to those described above.
  • IgGs 71 A3 fl were prepared from ascites fluid.
  • the spheres thus recovered were subjected to electrophoresis in 7.5% polyacrylamide gel under non-denaturing conditions.
  • Each dipeptide at concentrations varying from 0.03 ⁇ mol to 1 ⁇ mol was added to 0.1 ml of 1/50 diluted medium in buffer (B).
  • the 1/50 diluted medium supplemented with 100 ⁇ l of PBS served as a control.
  • nitrocellulose squares were washed first with buffer A and then treated with 125 I labeled antibodies (sheep) directed against mouse IgG (Amersham Code 1M 131) diluted 1/50 in PBS - Regulated 5%.
  • the anti-isopeptide 71 A3 fl IgG was first purified from an ascites liquid and then coupled by covalent bond (hydrazone) to paramagnetic spheres.
  • the -IgG spheres were contacted either with the purified D-Dimer, or with a serum containing the D-Dimer. After incubation at 4 ° C for 1 h, the spheres were washed with 4 successive cycles of magnetization and then subjected directly to electrophoretic separation on 7.5% polyacrylamide gel in non-denaturing conditions.
  • the anti-isopeptide mAb covalently immobilized (hydrazone bonds on the carbohydrate residues) on functionalized polystyrene plates is capable of measuring in vitro the amount of D-dimer naturally present either in human plasma or in this same plasma added from D-Dimère.
  • FIG. 4 shows the reactivity of the anti-isopeptide mAb with D-Dimer (50 ng / well) in the presence or in the absence of human plasma and in particular the influence of amount of mAb coupled per well.
  • the injection volume is 600 ⁇ l / 500 mg antibody.
  • the radioactive concentration per animal 300 ⁇ ci.
  • the antibody is reconcentrated by ultrafiltration (Amicon cell) to the concentration of
  • the labeling yield is greater than 90%.
  • the cotton is removed and the wound cleaned with physiological saline and then closed.
  • the injection of the labeled antibody solution is carried out 30 minutes after the end of the operation by the intravenous route.
  • the mAb according to the invention reacts exclusively on fibrin in the form of a polymer and not in the form of a monomer.

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Abstract

Anticorps reconnaissant de façon spécifique l'isopeptide Nε-(η-glutamyl)-lysine formé sous l'action de la transglutaminase entre le groupe η-carboxamide d'un résidu glutamine présent dans une protéine et le groupe ε-NH¿2? de la lysine ou entre le groupe ε-NH2 d'un résidu lysine libre ou présent dans une protéine et le groupe η-carboxyle de l'acide glutamique libre ou présent dans une protéine, ou des fragments desdits anticorps. Immunogène constitué par l'isopeptide N?ε¿-(η-glutamyl)-lysine. Applications au diagnostic et en thérapeutique.

Description

ANTICORPS SPECIFIQUES DE LA LIAISON ISOPEPTIDIQUE INDUITE PAR LES TRANSGLUTAMINASES
CONTENANT
La présente Invention est relative à des anticorps spécifiques de la liaison isopeptidique induite par les transglutaminases, à des antigènes constitués par un isopeptide dans lequel une protéine est conjuguée par l'intermédiaire du résidu acide glutamique qu'elle contient, à la fonction aminé primaire d'une lysine contenue dans une autre protéine. La présente Invention s'étend aux procédés d'obtention desdits anticorps et antigènes et à leurs applications diagnostiques et thérapeutiques.
La formation de liaisons transversales entre des chaînes de protéines a généralement lieu par l'intermédiaire des groupes ε-NH2 de résidus lysine de peptides, pour donner lieu à la formation de liaisons isopeptidiques Nε- (γglutamyl) lysine en présence de transglutaminases : il se forme ainsi une liaison covalente entre les groupes γ-carboxamide des résidus glutamine contenus dans une protéine et les groupes ε-amino de résidus lysine contenus dans les mêmes chaînes de protéines ou dans des chaînes différentes. Une telle réticulation a été identifiée aussi bien dans le cas de protéines cellulaires (collagène, kératine), que dans des protéines extra-cellulaires (fibrine insoluble du plasma, utéroglobuline du fluide séminal, protéines du cristallin et pellicules capillaires) et elle a été observée aussi bien entre des protéines homologues qu'entre des protéines hétérologues.
Il a été rapporté récemment que la teneur en isopeptides cellulaires varie en fonction directe d e la croissance des cellules et il a été observé que la fonction maximale d'isopeptides coïncide avec une activité transglutaminase dans les cellules concernées.
En ce qui concerne les protéines extracellulaires telles que la fibrine, comme on le sait, la forme de la fibrine qui constitue un marqueur pour la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) et pour les infarctus du myocarde, est la forme dimérique "D-Dimer" (Francis et Al., "Circulation", 75, (1987), p. 1170- 1177). Or il est connu que cette dimérisation est réalisée entre deux chaînes monomères du fragment D, par la formation d'une liaison isopeptidique entre le ε-NH2 de la lysine d'un monomère D et le γ-carboxamide d'une glutamine d'un autre monomère D, par action du facteur XlIIa, qui est la transglutaminase plasmatique, conformément à la formule ci-après :
Figure imgf000004_0001
Ce qui vient d'être dit montre que si une corrélation entre l'activité transglutaminase et la formation de liaisons isopeptidiques est vérifiée, la possibilité de révéler les liaisons isopeptidiques et l'activité transglutaminase pourrait permettre, entre autres, de diagnostiquer de façon très précoce des lésions ou des tumeurs bénignes ou malignes du sein ou du tractus gastro-intestinal, de diagnostiquer des maladies cardiovasculaires, de diagnostiquer des maladies virales accompagnées de séquelles telles que fièvre hémorragique, voire des applications thérapeutiques.
L'emploi d'inhibiteurs spécifiques compétitifs (Polylysine, Spermine, Putrescine, CBZ-gln-gly) de TG injectés chez la souris en même temps que des cellules tumorales inhibent la croissance tumorale (Yancey et Laki, 1972). Le même effet est obtenu par l'immunisation de la souris contre la TG cellulaire (Yancey et Laki, 1972).
La TG cellulaire semble jouer un rôle dans la métastase puisqu'il a été montré une relation inverse entre l'activité TG et le pouvoir métastasiant de clones cellulaires provenant de rhabdomyosarcome de rat (DELCROS et col., 1986). Chez le rat, l'activité TG dans la tumeur primaire (sarcome de foie) diminue lorsque des métastases sont détectées dans le poumon (Barnes et col., 1985).
L'activité TG pourrait donc être un marqueur enzymatique du pouvoir métastasiant.
D'autres auteurs ont pu mesurer en même temps que l'activité, la quantité d'enzyme cellulaire par test ELISA avec des anticorps anti-TG (Fesus et Arato, 1986).
Ainsi, dans des fibroblastes humains WI38 en culture
(isolés d'un tissu pulmonaire embryonnaire), le contenu en TG varie parallèlement à l'activité TG selon l'ordre suivant : fibroblaste au repos > proliférâtif > transformé.
Au niveau cellulaire, les Inventeurs ont pris pour hypothèse que l'utilisation de la TG comme marqueur diagnostique, par marquage de biopsies tumorales à l'aide d'anticorps dirigés contre les isopeptides produits par la réaction TG, pourrait permettre de différencier entre tumeur bénigne et tumeur maligne et éventuellement de classifier les états intermédiaires, qui posent toujours des problèmes aux anatomopathologistes.
La TG plasmatique (facteur XIII de coagulation) pourrait également jouer un rôle indirect dans le développement tumoral :
de nombreuses tumeurs solides sont entourées d'un manchon de fibrine (Chew et Wallace, 1976). Ces molécules de fibrine réticulées par action du facteur XIII pourraient masquer les antigènes tumoraux et donc la reconnaissance des cellules tumorales par les cellules immunocompétentes.
le DFMO ajouté dans l'eau de boisson de souris porteuses de tumeur de Lewis inhibe la croissance de la tumeur primaire à 40-50 % et la formation de métastases pulmonaires à 80 % (Sunkara et col., 1982). Or en plus de son effet direct sur l'ODC, le DFMO est un inhibi teur compétitif de TG (Delcros et al., 1984). Ceci est à prendre en considération en interprétant les résultats des expériences in vivo . En effet, la TG plasmatique (facteur XIII) pourrait être une cible privilégiée du DFMO, ce qui expliquerait l'augmentation du temps de coagulation observé chez les rats traités par DFMO (Luk et col., 1983).
Par ailleurs, des méthodes capables de distinguer in vivo et/ou in vitro le fibrinogene de la fibrine ont été proposées : plusieurs équipes ont fait appel à des moyens immunologiques en développant les anticorps monoclonaux (AcM) spécifiques de la fibrine, qui ne réagissent pas avec le fibrinogene.
Pour ce faire, ils ont utilisé le fait que le clivage du fibrinogene par la thrombine fait apparaître sur la molécule de fibrine ainsi formée, des séquences peptidiques N-terminales nouvelles qui sont différentes de celles présentes sur la molécule de fibrinogene intacte.
L'immunisation des animaux avec cette fibrine génère des anticorps dirigés contre tous les épitopes sur la fibrine. Certains de ces anticorps donnent des réactions croisées avec le fibrinogene natif, d'autres ne réagissent qu'avec la fibrine et plus particulièrement avec la nouvelle séquence N-terminale.
La synthèse chimique de ce peptide spécifique de la région N-terminale a permis de sélectionner un AcM 59D8 spécifique (Hui et al. Science, 1983, 222. 1129) et de l'utiliser après marquage à H^-ln pour visualiser par immuno-scintigraphie les caillots formés expérimentalement chez le chien et le lapin (Knight et al. J. NuclearMed., 1988, 21, 494).
Plusieurs autres AcM, capables de réagir spécifiquement avec la fibrine ont été décrits.
Deux des AcM les plus utilisés sont :
. DD-1C3/108 (Elms et al., Thromb Haemostas, 1983, 50, 591-594),
. DD3B6 disponible commercialement chez American Diagnostica, Greenwich, C.T.
Cependant, ces AcM présentent des inconvénients :
. DD-1C3/108 réagit avec le D-Dimère de la fibrine et également avec les produits de dégradation de la fibrine de haut poids moléculaire contenant des chaînes γ-γ (Elms et al., 1983),
. DD3B6 réagit avec un épitope présent sur le fragment D qu'il soit sous forme monomérique ou sous forme dimérique D-Dimère (Devine et Greenberg, A.J.C.P. 1988, 89. p. 663-666).
Or la forme de la fibrine qui constitue un marqueur pour la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) et pour les infarctus du myocarde, est la forme dimérique, D-Dimère.
Il est donc clair que DD3 B6 qui est l'AcM le plus utilisé à l'heure actuelle dans les coffrets de diagnostic pour les déterminations du taux de D-Dimère, par agglutination et par ELISA, n'a pas la spécificité absolue requise pour mesurer le D-Dimère en présence de D-monomère, du fait de sa réaction avec la fibrine non-réticulée (Devine et Greenberg, A.J.C.P., 1988, 89. p. 663-666).
L'imagerie des thrombi a fait l'objet de recherches en médecine nucléaire depuis de nombreuses années. Toutefois, aucune des techniques proposées
(HSA, 99mTc-HSA, sérum-albumine, MAA marqué au 99mTc ; fibrinogene marqué à 123I, 131I-streptokinase, TPA marqué à l'111In, 99ιnTc-plasmine, 131I-strombospondine, entre autres) n'a eu des applications étendues du fait de son manque de sensibilité et/ou de spécificité. De même en ce qui concerne les plaquettes autologues marquées à l'111In, elles requièrent beaucoup de temps et d'adresse technique pour la séparation et le marquage de plaquettes fonctionnellement actives.
Des Anticorps monoclonaux ont été produits contre les plaquettes, mais ils ne peuvent pas être utilisés dans d'autres cas que pour la détection de thrombi récents, en cours de développement. De plus, l'administration d'héparine, en pareils cas, rend inutilisable ce genre d'anticorps.
On connait également des anticorps antifibrine qui, toutefois, ne reconnaissent que la fibrine libre et non la fibrine réticulée.
La présente Invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des anticorps spécifiques de la liaison isopeptidique induite par des transglutaminases, propres à permettre la détection in vivo et/ou in vitro de l'isopeptide produit en présence de transglutaminase, qu'il s'agisse de l'isopeptide cellulaire ou extra-cellulaire.
La présente Invention s'est également donné pour but de pourvoir à un immunogène protéique contenant ladite liaison isopeptidique et propre à permettre, par immunisation de mammifères appropriés, l'obtention des anticorps susdits dirigés contre l'isopeptide produit en présence de transglutaminase, et également propre à permettre le dosage d' immuncomplexes contenant des anticorps dirigés contre ledit isopeptide.
La présente invention a pour objet des anticorps qui reconnaissent de façon spécifique l'isopeptide Nε-(γ-glutamyl)-lysine formé sous l'action de la transglutaminase, entre le groupe γ-carboxamide d'un résidu glutamine présent dans une protéine et le groupe ε-NH2 de la lysine ou entre le groupe ε-NH2 d'un résidu lysine libre ou présent dans une protéine et le groupe γ-carboxyle de l'acide glutamique libre ou présent dans une protéine, ou des fragments desdits anticorps.
Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdits anticorps spécifiques sont des anticorps polyclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, contenus dans le sérum prélevé chez ce dernier et, éventuellement, isolés dudit sérum par des techniques de purification appropriées.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits anticorps spécifiques sont des anticorps monoclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, suivie de la fusion des cellules spléniques prélevées chez ledit mammifère immunisé, avec les cellules d'un myélome judicieusement choisi, d'un mammifère de même espèce, sélection des hybridomes sécrétant les anticorps recherchés, clonage, culture et collecte des anticorps monoclonaux spécifiques.
Conformément à la présente invention, celle-ci a également pour objet un immunogène propre à être mis en oeuvre pour l'immunisation de mammifères appropriés en vue de la production d'anticorps spécifiques dirigés contre l'isopeptide N6-(γ-glutamyl)-lysine et, de plus, propre à être mis en oeuvre pour le dosage d'anticorps dirigés contre ledit isopeptide, contenus dans des immuncomplexes, lequel immunogène est caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine contenant de l'acide glutamique, conjuguée par l'intermédiaire du groupe γ-carboxyle dudit acide au groupe ε-NH2 d'un résidu lysine contenu dans une protéine appropriée.
Selon une disposition avantageuse de l'invention, les anticorps monoclonaux spécifiques susdits sont sous forme libre.
Selon une autre disposition avantageuse de l'invention, lesdits anticorps monoclonaux spécifiques sont immobilisés sur des supports insolubles appropriés.
Selon encore une autre disposition avantageuse de l'invention, l'immunogène susdit est immobilisé sur un support insoluble approprié.
Conformément à une modalité avantageuse de l'invention, lesdits anticorps monoclonaux sont marqués à l'aide de tous marqueurs appropriés.
De façon plus spécifique, lesdits anticorps monoclonaux sont marqués à l'aide de radio-éléments appropriés, notamment lorsqu'ils sont destinés à être mis en oeuvre en imagerie, auquel cas ils sont avantageusement marqués par tous radio-éléments usuels, notamment par 123I, 131I, 111In, 99MTc. Lorsqu'ils sont destinés à être mis en oeuvre dans des tests de diagnostic in vitro, lesdits anticorps monoclonaux sont marqués à l'aide de tous marqueurs convenables tels que radio-éléments, marqueurs enzymatiques, marqueurs fluorescents, luminescents, notamment, entre autres.
La présente invention a en outre pour objet un agent de diagnostic in vitro de lésions ou de tumeurs de tissus mammaires ou colorectaux humains, par techniques immunohistochimiques sur des biopsies desdits tissus, caractérisé en ce qu'il est constitué par ledit anticorps spécifique polyclonal ou monoclonal, de préférence sous forme libre, convenablement marqué.
La présente invention a, de plus, pour objet un agent de diagnostic in vitro, de maladies cardiovasculaires et de maladies virales accompagnées de séquelles telles que fièvre hémorragique, caractérisé en ce qu'il est constitué par ledit anticorps spécifique monoclonal, de préférence immobilisé sur un support insoluble, convenablement marqué.
La présente invention a également pour objet un agent de diagnostic in vivo de tumeurs malignes et de maladies cardiovasculaires, caractérisé en ce qu'il est constitué par ledit anticorps monoclonal spécifique, ou l'un des ses fragments, sous forme libre, convenablement marqué.
La présente invention a, par ailleurs, pour objet une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend ledit anticorps monoclonal spécifique, ou l'un de ses fragments, couplé à au moins une enzyme protéolytique appropriée ou à un médicament convenable.
Conformément à l'invention, ledit anticorps ou l'un de ses fragments, peut avantageusement servir de vecteur à une enzyme protéolytique choisie dans le groupe qui comprend notamment, mais non limitativement, l'urokinase, la streptokinasé, le TPA.
La présente invention a encore pour objet un agent de détection d'anticorps dirigés contre un isopeptide formé sous l'action de la transglutaminase, présents dans un tissu ou un fluide corporel, notamment sous la forme d'immuncomplexes, caractérisé en ce qu'il est constitué par un isopeptide formé d'une protéine contenant un résidu glutamine, conjuguée par l ' intermédiaire du groupe γ-carboxamide de ce dernier au groupe ε-NH2 d'un résidu lysine contenu dans une protéine appropriée, lequel isopeptide est, si on le désire, convenablement marqué.
Conformément à l'invention, ledit anticorps peut se présenter soit sous forme d' Immunoglobulines entières, soit sous forme de fragments Fab, Fab 2, etc.. chimérisés ou non.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention d'anticorps et d'immunogènes conformes à la présente invention et à la vérification de leur activité.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLES EXEMPLE I - PREPARATION D 'AcM
1) Préparation de l' immunogène
A 1.36 mg de Keyhole Limpet Hemocyanine (KLH) en solution dans 1ml de tampon phosphate 10 mM pH6 ont été ajoutés 8,7 mg (20μmoles) de N-α-CBZ-lysine-pnitrophenyl ester qui sera désigné ci-après sous le nom de" (Z-lys)" en présence de 3,8 mg (20μmoles) de 1 -éthyl-3 (3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC). Le mélange a été laissé à la température de la pièce avec agitation douce pendant 6 h.
A la fin de cette période, les produits solubles ont été éliminés par dialyse prolongée (4 × 30mn) contre le tampon phosphate 10mM pH6. L ' adsorption (UV) du CBZ a permis de déterminer que 3 , 7 μmoles Z-lys étaient couplées par mg KLH.
2) Préparation de l'antigène pour déterminer le taux d'anticorps dans les sérums de souris, les milieux de culture et les liquides d'ascites de souris.
Afin de diminuer les réactions croisées avec la KLH qui a servi comme immunogène, le (Z-lys) a été couplé à la sérum albumine bovine (BSA) dans les conditions identiques à celles décrites ci-dessus.
3) Immunisation des souris
Les souris femelles Balb/C âgées de 6 à 8 semaines ont chacune été injectées par voie intraperitonéale (IP) au premier jour (J0) avec 100 μg de KLH-Z-lys emulsifiés avec un volume égal (100μl) de l'adjuvant complet de Freund. A J12 et à J24, les animaux on reçu des rappels de KLH-Z-Lys avec adjuvant incomplet de Freund, à des doses de 100 et 50μg respectivement.
4) Détermination du taux d'anticorps des souris immunisées.
Les serums prélevés tous les 10 jours par ponction rétro-orbital ont été éprouvés pour leur taux en anticorps anti Nε(γglu)lys par leur réaction avec la BSA-Z-lys adsorbée sur nitrocellulose (Dot-blot).
5) Fusion de cellules et sélection des clones Les souris présentant les taux d'anticorps les plus élevés ont été sacrifiées, les rates prélevées et les cellules spléniques ont été fusionnées avec les cellules du myélome de souris Sp2/0Agl4 selon le procédé classique de Kohler & Milstein (1975).
Les clones sécrétant des Ac ont été sélectionnés par Dot-blot et sub-clonés par la méthode de dillution limite.
Sur 720 puits ensemencés, 102 ont donné une réaction positive avec la BSA-Z-lys, un rendement de 14,2 %.
20 des 102 hybridomes ont été sélectionnés selon le critère de l'intensité de la réaction positive de leur milieu avec la BSA-Z-lys en Dot-blot. Elles ont été clonées par la méthode de dilution limite dans les plaques à 96 puits. A partir de ce clonage, 85 clones ont été sélectionnés : 5 d'entre eux (71A3f1, 81Alb10, 81Dlc2,81Dlell et 82D6g7) dont les milieux montraient une forte immunoréactivité avec la BSA-Z-lys ont été retenus.
Ils ont été cultivés par la suite dans les fioles de 75 cm2 pour la préparation des AcM en quantité plus grande.
6) Détermination de la sous-classe d'Immunoglobuline (Ig) .
La sous-classe d'Ig produite par chaque clone a été déterminée par Dot-blot à l'aide de sérums de lapin spécifiques de chaque sous-classe. Le coffret provenant de ZYMED (Laboratories, INC - U.S.A) a été utilisé selon les instructions fournies par le fabricant. EXEMPLE II
REACTIVITE A L'AcM DE L'EXEMPLE I DE TISSUS FIXES PUIS
INCLUS EN PARAFFINE :
COMPARAISON BENIN / MALIN / ETATS INTERMEDIAIRES.
Les tissus sont fixés dans la solution de
Bouin (acide picrique, formol, acide acétique) puis inclus en paraffine. Pour chaque biopsie étudiée, 3 coupes de 5μm sont déparaffinées puis traitées avec l'AcM concentré : 1/8 ou 1/2 et 1 témoin sans AcM. La réaction positive à l'anticorps anti Glu-Lys est révélée sur les coupes par la présence d'un chromogène rouge. Les noyaux sont contre-colorés en bleu.
Une coupe adjacente est traitée à 1 'hématoxyline-safran-éosine pour servir de référence histopathologique.
Ont été examinés :
- 34 carcinomes infiltrants galactophoriques (4 différenciés, 14 moyennement différenciés et 16 indifférenciés) dont 16 étaient associés sur la même coupe avec des zones bénignes,
- 11 carcinomes in situ dont 9 associés à du tissu bénin sur la même coupe.
Outre ces zones bénignes mitoyennes des carcinomes, 38 mastopathies fibrokystiques ou fibrohyperplasiques typiques dont 11 étaient associées à des métaplasies idrosadénoides, 10 à des hyperplasies atypiques, 11 à du sclerosing adenosis, ont été observées.
L'AcM conforme à l'invention ne réagit qu'avec la chromatine cellulaire. Les acini glandulaires encore organisés réagissent avec l'AcM alors que les cellules tumorales toutes proches ne sont pas réactives. A l'intérieur même d'un groupe d' acini les cellules tumorales apparaissent négatives.
Afin de comparer la réactivité des différentes cellules sur les coupes, les Inventeurs ont estimé sur chaque coupe le pourcentage de la population cellulaire réagissant avec l'AcM soit 0%, inférieur à 10%, compris entre 10 et 50% ou supérieur à 50%.
Comme le montre le tableau I ci-après, tandis que 88 % (soit 30 sur 34) des malins invasifs ne réagissent pas avec l'AcM conforme à l'invention, c'est le cas seulement pour 20 % (soit 13 sur 63) des mastopathies bénignes ; 7 carcinomes in situ sur 10 (cribriforme) se comportent comme la majorité des carcinomes infiltrants ; 7 hyperplasies atypiques sur 10 et 8 cas de sclerosing adenosis sur 11 se comportent comme la grande majorité des coupes bénignes.
Pour savoir si les différences de réactivité observées étaient significatives, les Inventeurs ont réalisé un test de Chi2 en regroupant les classes pour ne garder que 2 groupes : le négatif (inférieur à 10 %) et le positif (supérieur à 10 %) . Le calcul de Chi2 (avec la correction de Yates) montre que la réactivité des cellules de chaque type histologique à l'AcM apparait significative (p 0.001) entre :
- bénin et carcinome invasif,
- hyperplasie atypique et carcinome invasif,
- sclerosing adenosis et carcinome invasif,
- bénin et carcinome in situ.
Figure imgf000016_0001
La présence d' isopeptides Glu-Lys constitue donc un marqueur fiable qui différencie nettement le tissu malin du tissu bénin sur coupes Ristologiques.
EXEMPLE III DOSAGE DES PRODUITS DE REACTION TG EN FONCTION
DE LA CROISSANCE CELLULAIRE :
Des cellules HEp2 ou MRC5 sont trypsinées puis ensemencées dans une boîte de Pétri contenant du milieu de culture et une lame de verre. La lame couverte de celIules est prélevée à différents temps de culture. Les cellules sont fixées en acétone. Pour tester l'ensemble des produits de réaction TG, en plus du test de réactivité à l'AcM anti Glu - Lys, les Inventeurs ont testé la réactivité des cellules à l' antisérum antiPA. L'AcM conforme à l'invention réagit uniquement avec le noyau aussi bien pour Hep2 que pour MRC5 comme le font les cellules des biopsies.
Afin de quantifier la réaction, les Inventeurs ont fait pousser les cellules dans des plaques de microtitration et après traitement avec les anticorps spécifiques le chromogène qui reste soluble donne une réaction colorée lisible à 490 nm sur un lecteur de plaque. L'immunomarquage varie pendant la croissance cellulaire.
Ces variations sont corrélées avec celles de l'activité TG, sur les homogénats cellulaires. Cette activité a été dosée en présence d'un excès de substrats exogènes : dimethylcaséine DMC (1er substrat) et 14C Put (2ème substrat). Dans ce cas, le seul facteur limitant de la réaction est la TG. Le témoin en absence de DMC renseigne sur la disponibilité du premier substrat endogène. EXEMPLE IV
DOSAGE. AU NTVEAU PLASMATIOUE. D'ANTICORPS ANTITSOPEPTTDE SOUS FORME D'IMMUNCOMPLEXES .
Le dosage d'immuncomplexes par un "Covalent Enzyme Linked Immuno Assay" (CELIA) a été mis au point. Il permet, contrairement à toutes les autres techniques publiées à ce jour (liaison du Clq ou de la conglutinine, précipitation avec le polyethylène-glycol ..) de mesurer le taux de l'anticorps faisant partie de l'immuncomplexe et qui est spécifique d'un antigène particulier.
Lorsqu'un sérum humain est dissocié à pH 2,25 puis réassocié in situ sur plaque-Spm à pH 8,1 son contenu en IgG antiSpm est augmenté de 9 fois par rapport au sérum non dissocié. L'augmentation est de 2 fois pour les IgM anti-Spm.
Cette observation n'est pas restreinte à un seul sérum : pour 9 autres sérums de malades bronchopulmonaires, leur contenu en IgG antiSpm est accru de 2,7 à 13,5 fois après dissociation et réassociation par rapport à celui des sérums non dissociés.
Une différence significative est toutefois notée : pour 5 sur 6 des sérums de malades cancéreux l'augmentation est moins que 8,5 fois tandis que pour les 3 sérums de malades témoins elle est supérieure à 10,6 fois.
EXEMPLE V
DETERMINATION DE LA SPECIFICITE DES AcM
VIS-A-VIS DE LA FIBRINE ET DU D-DIMERE a - envers le fibrinogene, la fibrine et la BSA-Z lys.
Cette expérience a été effectuée par Dot-blot sur carrés de nitrocellulose sur chacun desquels ont été absorbés 2μg de fibrinogene, de fibrine (en suspension fine obtenue par sonication), et de BSA-Z-lys. Les carrés ont été ensuite incubés avec un tampon (A) contenant 10 % Régilait dans PBS pendant 30 mn à la température am biante. A la fin de cette période, les carrés ont été rincés avec PBS, puis mis à incuber avec le milieu de culture de l'AcM 71 A3fl dilué 1/100 dans un tampon (B) : 0,1 % Tween 20 dans PBS .
L'ensemble des carrés a été incubé pendant 2h à 37º C.
A la fin de la période d'incubation, les carrés de nitrocellulose ont été lavés tout d'abord avec le tampon B, ensuite traités avec les anticorps (mouton) marqués à 125I, dirigés contre les IgG de souris (AMERSHAM) dilués au 1/50 dans une suspension de Régilait dilué à 5 % dans le PBS.
Après un temps de contact de 1 h à 37ºC, les carrés ont été lavés plusieurs fois avec le tampon B jusqu'à ce que le liquide de lavage ne contienne plus de trace de I'125I.
La radioactivité retenue sur chaque carré a ensuite été déterminée dans un compteur γ.
b - envers la fibrine humaine formée in situ A 4 tubes contenant chacun 0,5 ml de plasma humain prélevé sur citrate, a été ajouté CaCl2 à une concentration finale de 40 mM.
A 2 tubes contenant chacun 0,5 ml de plasma prélevé sur citrate a été ajouté du NaCl 0,14 M à la place de CaCl2.
Tous les tubes ont été incubés une nuit à 37ºC. Après cette période, ils ont été centrifugés à 700 g pendant 10 mn.
2 tubes de la série (A) et 2 tubes de la série (C) ont été lavés 3 fois avec le tampon B pour éliminer les traces de protéines plasmatiques.
Les tubes de la série (B) n'ont pas été lavés pour déterminer l'influence du lavage.
A la fin de cette étape, 1 tube de chaque série a reçu 200 μl du milieu de culture de l'AcM 71A3f1 et l'autre 200 μl d'un AcM irrelevant. Après incubation pendant 2 h à la température du laboratoire, tous les tubes ont été lavés par centrifugation avec le Tampon B. Cette étape était suivie de l'addition d'une solution diluée 1/50 ( 5 % Régilait dans PBS) d'anticorps (mouton) marqués à 125I dirigés contre les IgG de souris. Après incubation pendant 2 h, à la température du laboratoire, les étapes de lavage et de mesure de la radioactivité étaient identiques à celles décrites ci-dessus.
c - envers le D-Dimère
1) Immobilisation de l'AcM par couplage direct Les sphères paramagnétiques porteuses de groupements NH2 ont été utilisées. Les groupements NH2 ont été convertis en acide-hydrazide : CO-NH-NH2 (AH) selon les techniques décrites dans l'Art antérieur .
Des IgG spécifiques (71 A3 fl) ont été préparés à partir de liquide d'ascite.
50 μg de ces IgG purifiées ont été oxydés à l'aide de périodate de sodium et couplés à la fonction AH des sphères selon la méthode décrite.
2) Immobilisation de l'AcM par immuno-capture Dans ce cas, les IgG (chèvre) anti-Fc souris ont été tout d'abord couplées par l'intermédiaire de liaison hydrazone qui a été formée entre ces IgG oxydées et les groupements AH sur les sphères (Quash et al.,1989).
3,5 mg de ces sphères anti-IgG de souris ont été ensuite mises à réagir directement avec 50 μg d'IgG purifié (71 A3 fl) pendant 1 nuit à 4ºC. Le lendemain, les sphères ont été lavées par plusieurs cycles d'aimantation, tout d'abord à l'aide du tampon B et ensuite par un tampon (C) contenant :
- 0,05 M Tris ajusté à pH 8.1 avec l'acide
citrique,
- 0,1 % Tween 20 (V/V),
- 0,14 M NaCl. 1 mg de ces sphères-AcM ainsi lavées a été resuspendu dans 1 ml de tampon 1 et ajouté à 16 μl de plasma humain étalon contenant le D-Dimère (fourni par STAGO).
Après 1 nuit à 4ºC, les sphères ont été lavées
3 fois avec le tampon (C) contenant 1 M NaCl par aimentation pour éliminer toute protéine réagissant non spécifiquement avec les sphères-AcM.
Les sphères ainsi récupérées ont été soumises à l'electrophorese en gel de polyacrylamide à 7,5 % dans des conditions non dénaturantes.
d - envers les dipeptides
La spécificité fine d'un de ces AcM 71 A3 fl a été recherchée à l'aide du peptide homologue Nε (γ-glu)lys et des peptides hétérologues Nα - (α-glu)lys et Nε (α-glu)lys.
Chaque dipeptide à des concentrations variant de 0,03 μmol à 1 μmol, a été ajouté, à 0,1ml de milieu dilué 1/50 dans tampon (B) . Le milieu dilué 1/50 additionné de 100 μl de PBS servait de contrôle.
Après incubation pendant 1 h à 37ºC, les milieux ainsi traités ont été mis en contact avec les carrés de nitrocellulose sur lesquels avaient été préalablement déposés 2μg de BSA-Z-lys et incubés en présence de tampon (A).
L'ensemble des carrés et des milieux a été incubé pendant 2 h à 37 'C.
A la fin de la période d'incubation, les carrés de nitrocellulose ont été lavés tout d'abord avec du tampon A et ensuite traités avec les anticorps (mouton) marqués à 125I dirigés contre les IgG de souris (Amersham Code 1M 131) dilué au 1/50 dans PBS - Régilait 5 %.
La suite de l'expérimentation est identique à celle décrite en (a). EXEMPLE VI
DETERMINATION DE LA SPECIFICITE DE L'AcM CONFORME A
L'INVENTION,
La sélection des AcM a été effectuée à l'aide de l'isopeptide Nε(γ-glu) lys. Néanmoins, il a été vérifié si ces anticorps avaient une spécificité stricte pour le dipeptide homologue ou s'ils donnaient des réactions croisées avec d'autres dipeptides hétérologues contenant glu et lys tels que Nα (α-glu) lys qui existe naturellement dans des protéines ou même avec Nε(α-glu) lys dont l'existence naturelle dans des protéines n'a pas encore été trouvée à ce jour.
Détermination de la spécificité fine de l'AcM 71 A3 f1
Pour ce faire, ces deux dipeptides ainsi que l'homologue Nε(γ-glu)lys ont été additionnés (à des concentrations variables) à l'AcM avant son contact avec la BSA-Z-lys. L'expérimentation a été menée comme décrit à l' EXEMPLE V (d).
Les résultats obtenus sont représentés sur la
Fig. 1 annexée.
Il est clair que le taux d'inhibition maximale avec les dipeptides Nα (α-glu) lys et Nε (α-glu) lys ne dépasse pas 15 %.
En revanche, avec le Nε (γ-glu)lys, cette inhibition atteint 60 %. Dans d'autres expériences d'inhibition utilisant cette fois-ci un dosage immunoenzymatique, l'inhibition par le dipeptide homologue a atteint 72,4 % tandis que celles obtenues avec les dipeptides hétérologues n'ont jamais dépassé 10 %.
Détermination de la réactivité de 71 A3 f1 avec le fibrinogene et la fibrine.
Cette expérience a effectuée par Dot-bloot conformément aux modalités décrites à l' EXEMPLE V (a).
Les résultats représentés à la Fig. 2 annexée montrent que cet AcM réagit effectivement avec la fibrine et avec la BSA-Z-lys utilisée comme contrôle mais ne réagit pas avec le fibrinogene.
Toutefois, comme cette réaction avec la fibrine ne permettait pas de dire si cet AcM réagirait avec la fibrine native car la sonication subie par la fibrine pour faire une suspension homogène, lors des dot-blots, aurait pu révéler sur la molécule les liaisons Nε(γ-glu)lys, qui pourraient être à l'état cryptique dans la fibrine native, la réactivité de l'AcM conforme à l'invention sur la fibrine néo-formée, à été testée.
Détermination de la réactivité de 71 A3 fl avec la fibrine néoformée.
L'expérimentation a été menée comme décrit à l'EXEMPLE V (b) pour déterminer l'influence éventuelle d'autres protéines plasmatiques sur la réaction de l'AcM avec la fibrine.
Les résultats qui figurent dans le Tableau II ci-après montrent que cet AcM est capable de réagir avec la fibrine néo-formée. Même en présence d'autres protéines plasmatiques (série non-lavée), l'interaction reste spécifique.
Figure imgf000024_0001
Détermination de la réactivité de l'AcM conforme à l'invention avec le D-DIMER.
La procédure expérimentale mise en oeuvre est celle décrite à l' EXEMPLE V (c).
Tmmunocapture
Pour faciliter la séparation des produits de cette réaction l'IgG anti isopeptides 71 A3 fl a été tout d'abord purifiée à partir d'un liquide d'ascites et ensuite couplée par liaison covalente (hydrazone) à des sphères paramagnétiques.
Les sphères -IgG ont été mises en contact soit avec le D-Dimer purifié, soit avec un sérum contenant le D-Dimer. Après incubation à 4*C, pendant 1 h, les sphères ont été lavées par 4 cycles successifs d'aimantation et ensuite soumises directement à une séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide 7,5 % dans les conditions non-dénaturantes .
Les résultats obtenus sont présentés sur les Fig. 3A et 3B annexées.
II est clair que :
1) les IgG anti isopeptide ont pu interagir avec le D-Dimer en solution,
2) de toutes les protéines présentes dans un sérum, seul le D-Dimer a été reconnu par les anticorps anti isopeptide.
Ces résultats montrent sans équivoque non seulement la spécificité de l'AcM pour une seule protéine plasmatique, le D-Dimer, mais également la possibilité de l'isoler en quantité suffisante afin de servir comme immunogène.
Les résultats sont similaires, que l'AcM soit couplé directement par liaison hydrazone sur les sphères ou lié indirectement par l'intermédiaire d'IgG de mouton anti IgG souris fixée elle-même par liaison hydrazone sur les sphères. EXEMPLE VII
DOSAGE IN VITRO DU TAUX DE D-DIMERE PRESENT DANS LES
MILIEUX BIOLOGIQUES
L'AcM anti-isopeptide immobilisé par covalence (liaisons hydrazone sur les résidus glucidiques) sur des plaques de polystyrène fonctionnalisé, est capable de mesurer in vitro la quantité de D-Dimère présente naturellement soit dans le plasma humain, soit dans ce même plasma additionné de D-Dimère.
Le protocole mis en oeuvre est le suivant :
1) Couplage par liaison hydrazone des anti-corps anti-isopeptide en quantités différentes (0,5 μg -
3 μg) sur les plaques de polystyrène fonctionnalisé.
2) Incubation pendant 1 heure à 37ºC des échantillons suivants :
- 100 μl de plasma humain dilué au 1/100 dans du
PBS - 0,1% Tween 20 (Tampon A),
- 100 μl de D-Dimère purifié à 500 ng/ml,
- 50 μl de plasma humain dilué au 1/100 dans le Tampon A et 50 μl de D-Dimère à 1 μg/ml.
3) Lavage de la plaque en Tampon A.
4) Incubation de la plaque pendant 30 min à 37ºC avec de l'anticorps antifibrinogene marqué à la Peroxydase et dilué au 1/1000 dans le Tampon A.
5) Lavage de la plaque en Tampon A.
6) Révélation de l'activité peroxydase à l'aide du mélange réactionnel contenant :
- O-phényl-diamine lmg/ml dans 0,1 M Tris-citrate pH 4,5,
- H2O2 dilué au 1/100.
Incubation de la plaque pendant 30 min avec 100 μl de substrat.
7) Résultats.
Les résultats sont présentés à la figure 4 annexée qui montre la réactivité de l'AcM anti-isopeptide avec le D-Dimère (50 ng/puits) en présence ou en l'absence de plasma humain et notamment l'influence de la quantité d'AcM couplé par puits.
DETECTION DE CAILLOT CHEZ LE LAPIN
Etude d'un anticorps anti-liaison isopeptique marqué à l'Indium 111, chez le lapin Fauve de Bourgogne, sur lequel une thrombose rouge "in situ" a été réalisée.
Visualisation par l'utilisation de la Gamma Caméra, après 1 heure, 4 h, 24h et 48 h.
Le volume d'injection est de 600 μl./ 500 mg anticorps. La concentration radioactive par animal 300μci.
Marquage anticorps 71 A3 fl.
couplage au DTPA (acide éthylènediaminetetra-acétique). A 6,5 mg d'anticorps 71 A3 fl dans 2,2 ml de NaHCO3 0,1 M on ajouter 0,157 mg d'anhydride de DTPA dans du DMSO anhydre ( rapport molaire DTPA/Anticorps = 10). Après incubation de 20 minutes à température ambiante le DTPA non lié à l'anticorps est éliminé par gel filtration sur HR 200
(30 × 1,5) élue par NaCl 0,15 M.
Ensuite l'anticorps est reconcentré par ultrafiltration ( cellule Amicon) à la concentration de
1,7 mg/ml dans NaCl 0,15 M.
- Marquage à l'indium 111
A 170 pcg d'anticorps ( 100 μl) couplés au DTPA on rajoute 100 μl de tampon acétate 0,2 M pM 5,0 puis 300 μl d'endium 111 Cl3 ( à 100μl/ml)
Après incubation de 60 minutes le rendement de marquage est supérieur à 90 %.
Réalisation d'une thrombose rouge "in situ" chez le lapin
- Chirurgie sur l'animal
Une incision parallèle à la trachée-artère est pratiquée. La veine jugulaire est dégagée, un abaisselangue (type médical) est glissé sous la veine, un coton fortement imbibé de formaline (aldéhyde formique pur en solution à 30 %) est appliqué sur celle-ci durant 20 mi nutes.
Passée cette période, le coton est retiré et la plaie nettoyée à l'aide de sérum physiologique puis refermée.
L'injection de la solution d'anticorps marqué est effectuée 30 minutes après la fin de l'opération par la voie intra-veineuse.
EXPLOITATION :
La visualisation du thrombus est tentée 1 heure et 4 heures après la fin de l'injection ;
On note une fixation hépatique et une activité circulante importantes.
Après 24 heures, on peut observer une petite fixation au niveau de la plaie sur un des 2 lapins.
A 48 heures, la fixation est apparente sur les
2 lapins, avec toujours une fixation hépatique et une activité circulante importantes.
Pour vérification, le thrombus et 1ml de sang sont prélevés et comptés sur la chaine de mesure universelle ECT 33
ANTI-CORPS ANTI- -LIAISON ISOPEPTIDIQUE In 111
ACTIVITE LAPIN LAPIN
Nº1 Nº2
THROMBUS/g 4053 2733
SANG/ml 2053 2185
THROMBUS/SANG 1,97 1,25
Il est clairement démontré par les exemples que l'AcM conforme à l'invention réagit exclusivement sur la fibrine sous forme de polymère et non pas sous forme de monomère.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps caractérisés en ce qu'ils reconnaissent de façon spécifique l'isopeptideNε-(γ-glutamyl)-lysine formé sous l'action de la transglutaminase entre le groupe γ-carboxamide d'un résidu glutamine présent dans une protéine et le groupe ε-NH2 de la lysine ou entre le groupe ε-NH2 d'un résidu lysine soit libre soit présent dans une protéine et le groupe γ-carboxyle de l'acide glutamique, soit libre, soit présent dans une protéine, ou des fragments desdits anticorps.
2. Anticorps selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont des anticorps polyclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, contenus dans le sérum prélevé chez ce dernier et, éventuellement, isolés dudit sérum par des techniques de purification appropriées.
3. Anticorps selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont des anticorps monoclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, suivie de la fusion des cellules spléniques prélevées chez ledit mammifère immunisé, avec les cellules d'un myélome judicieusement choisi d'un mammifère de même espèce, sélection des hybridomes sécrétant les anticorps recherchés, clonage, culture et collecte des anticorps monoclonaux spécifiques.
4. Immunogène propre à être mis en oeuvre pour l'immunisation de mammifères appropriés en vue de la production d'anticorps spécifiques dirigés contre l'isopeptide Nε-(γ-glutamyl)-lysine et, de plus, propre à être mis en oeuvre pour le dosage d'anticorps dirigés contre ledit isopeptide, contenus dans des immuncomplexes, lequel immunogène est caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine contenant de l'acide glutamique, conjuguée par l'intermédiaire du groupe γ-carboxyle dudit acide au groupe ε-NH2 d'un résidu lysine contenu dans une protéine appropriée.
5. Immunogène propre à être mis en oeuvre pour l'immunisation de mammifères appropriés en vue de la production d'anticorps spécifiques dirigés contre l'isopeptide Nε- (γ-glutamyl)-lysine et, de plus, propre à être mis en oeuvre pour le dosage d'anticorps dirigés contre ledit isopeptide, contenus dans des immuncomplexes, lequel immunogène est caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine contenant de la lysine conjuguée par l'intermédiaire du groupe ε-NH2 de ladite lysine, ou groupe γ-carboxyle d'un résidu acide glutamique soit libre, soit contenu dans une protéine appropriée.
6. Anticorps selon la Revendication 3, caractérisés en ce qu'ils sont sous forme libre.
7. Anticorps selon la Revendication 3, caractérisés en ce qu'ils sont immobilisés sur des supports insolubles appropriés.
8. Immunogène selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il est immobilisé sur un support insoluble approprié.
9. Anticorps et Immunogènes selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, caractérisés en ce qu'ils sont marqués à l'aide de tous marqueurs appropriés .
10. Anticorps selon la Revendication 9, caractérisés en ce qu'ils sont marqués à l'aide de radio-éléments appropriés, notamment lorsqu'ils sont destinés à être mis en oeuvre dans des tests de diagnostic in vivo , auquel cas ils sont avantageusement marqués par tous radio-éléments usuels.
11. Agent de diagnostic in vitro de lésions ou de tumeurs de tissus mammaires ou colorectaux humains, par techniques immunohistochimiques sur des biopsies desdits tissus, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps spécifique polyclonal ou monoclonal, de préférence sous forme libre, convenablement marqué selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, 6, 7, 9 et 10.
12. Agent de diagnostic in vitro, de maladies cardiovasculaires et de maladies virales accompagnées de séquelles telles que fièvre hémorragique, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps spécifique monoclonal, de préférence immobilisé sur un support insoluble, convenablement marqué, selon l'une quelconque des Revendications 3, 6, 7, 9 et 10.
13. Agent de diagnostic in vivo de tumeurs malignes et de maladies cardiovasculaires, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps monoclonal spécifique, ou l'un des ses fragments, convenablement marqué, selon l'une quelconque des Revendications 3, 6, 7, 9 et 10.
14. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal spécifique selon l'une quelconque des Revendications 3, 6, 7, 9 et 10 ou l'un de ses fragments, couplé à au moins une enzyme protéolytique appropriée ou à un médicament convenable.
15. Agent de détection d'anticorps dirigés contre un isopeptide formé sous l'action de la transglutaminase, présents dans un tissu ou un fluide corporel, notamment sous la forme d' immuncomplexes, caractérisé en ce qu'il est constitué par un isopeptide formé d'une protéine contenant un résidu glutamine, conjuguée par l'intermédiaire du groupe γ-carboxamide de ce dernier au groupe ε-NH2 d'un résidu lysine soit libre, soit contenu dans une protéine appropriée, lequel isopeptide, conforme à la Revendication 4 ou à la Revendication 5, est, si on le désire, convenablement marqué.
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