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WO1992000315A1 - Procede de fonctionnalisation d'un oligonucleotide - Google Patents

Procede de fonctionnalisation d'un oligonucleotide Download PDF

Info

Publication number
WO1992000315A1
WO1992000315A1 PCT/FR1991/000503 FR9100503W WO9200315A1 WO 1992000315 A1 WO1992000315 A1 WO 1992000315A1 FR 9100503 W FR9100503 W FR 9100503W WO 9200315 A1 WO9200315 A1 WO 9200315A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotide
formula
amino
dideoxynucleotide
rnh
Prior art date
Application number
PCT/FR1991/000503
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Louis Imbach
Bernard Rayner
Jean-Jacques Vasseur
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Publication of WO1992000315A1 publication Critical patent/WO1992000315A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to the process for functionalizing an oligonucleotide at its 5 ′ OH end with an amino effector.
  • the present invention also relates to a synthon useful in the process consisting of a phosphoramidite derivative of didesoxynucleoside.
  • the synthesis of oligonucleotides linked covalently to various effector agents is of considerable interest due to the massive use in biochemistry and molecular biology of these molecules and their use as potential therapeutic agents.
  • Richterich, Nucleic Acids Res. , 17, 2181-2185, 1989 can be easily detected respectively by very sensitive fluorometric or enzymatic and colorimetric methods. These compounds can be used as cold molecular probes and advantageously replace radioactive probes.
  • oligonucleotides linked to reactive groups which can be chemically activated (CB Chen and DS Sigman, Proc. Natl. A cad. Sci. USA, 83, 7147-7151; T. Le Doan et al., Nucleic Acids Res., JL5, 8643-8659, 1987; 3. C. Institut et al., Biochemistry, 27, 2272-2276, 1988;
  • oligonucleotide is understood to mean both oligodeoxynucleotides, that is to say in DNA series, and oligoribonucleotides, that is to say in RNA series.
  • oligonucleotide is also understood to mean oligonucleotides with an anomeric beta configuration or with an unnatural anomeric configuration alpha.
  • nucleotides constituting the oligonucleotide ' can be true nucleotides, that is to say with a phosphate 5' to the corresponding nucleoside or derivatives, among others, of the phosphorothiorate, methylphosphonate type, as will be seen more far.
  • effector means a radical corresponding to an intercalating agent also called an intercalating agent, or a chemical or photbactivable radical such as a radical carrying a function reacting directly or indirectly with the nucleotide chains or a radical whose presence allows easy and sensitive detection.
  • the article by Stein et al Gene 72 (1988) 333-341 relates to a conventional method of functionalization of an oligonucleotide, in this case it is acridine (ACr).
  • the oligonucleotide chain can then only contain pyrimidine nucleosides taking into account the fact that dC and dT are much less sensitive to acid hydrolysis than dA or dG. In other words, it is therefore not possible, by this method, to functionalize, by amino effectors, the oligodeoxyribonucleotides consisting solely of pyrimidine nucleo ⁇ sides.
  • the present invention provides a general method for forming an abasic site at the 5'OH end of an oligonucleotide (both in DNA series and in RNA series) synthesized on a solid support and this time comprising, if appropriate, all the usual bases (A, C, G, T or U) of DNA and RNA as well as the modified bases.
  • This original method thus makes it possible to functionalize oligonucleotides of any sequence by amino effectors.
  • the functionalization method according to the invention has the essential characteristic of using didesoxyribonucleosides and allows, via automated synthesis on a solid support, to functionalize oligonucleotides of any sequence at their 5'OH end.
  • the subject of the present invention is a process for functionalizing an oligonucleotide at its 5'OH end with an amino effector agent of formula RNH- characterized in that it comprises the following steps: a) said oligonucleotide is synthesized b) a dideoxynucleotide is assembled on the 5'OH end of said oligonucleotide via the 5 'end of the latter, c) a covalent coupling of said oligonucleotide with said amino reagent RNH is carried out by a reductive amination reaction between said amino reagent and an aldehyde function at the 5′OH end of the oligonucleotide originating from the opening by acid hydrolysis of the glycosidic
  • the present invention therefore provides a new approach for forming an abasic dideoxyribose site at the 5'OH end of an oligomer which may contain any bases, regardless of the oligonucleotide series considered (natural or modified). These abasic oligonucleotides are not isolated because they easily and quantitatively lead to their derivatized form after reductive amination with amino effectors.
  • the synthesis of the oligonucleotide is an assembly synthesis with phosphoramidite on solid support in the last step of which a 5-point phosphoramidite derivative is used 'of the dideoxy-nucleoside corresponding to the dideoxynucleotide which is assembled by an additional synthesis cycle at the 5' end of said oligonucleotide. It appears that the phosphoramidite derivatives of didesoxy ⁇ nucleosides according to the invention are much more sensitive to acid hydrolysis than the corresponding didesoxyribonucleosides or ribonucleosides.
  • dideoxynucleoside derivatives of nebularin hydrolyze more readily.
  • the same applies to other derivatives of didesoxy ⁇ nucleosides in particular, corresponding hydrogen phosphonate derivatives of formula:
  • a solid phase process according to the phosphora ⁇ midite method comprises the following essential steps: - A 5 'protected nucleoside derivative is immobilized, via one of its hydroxyl functions in 2 * or 3' on a support solid,
  • the oligobonucleotide chain protected by condensation of monomers consisting of nucleosides protected in 5 ′ and 2 ′ and substituted by phosphoramidite groups in 3 ′ is assembled on this support in a manual or automatic synthesizing reactor.
  • the oligonucleotides are obtained after detaching from the support of the oligomer obtained and elimination of the protective groups.
  • the oligonucleotide is assembled by condensation, in the presence of an activating agent, of said monomers between their 3 ′ function and the 5 ′ hydroxyl function of the nucleoside compound immobilized for the first monomer or of a compound protected polynucleotide intermediate attached to said immobilized nucleoside compound for the following monomers.
  • the activating agent for the condensation of said monomers can be chosen from tetrazole and its derivatives, such as paranitro-phenyi tetrazole.
  • step c) the compound consisting of said oligonucleotide is detached from the solid support at the 5 ′ end of which said dideoxynucleotide is assembled and eliminates protecting groups.
  • the reductive amination reaction in step c) can be carried out, for example, by treatment with sodium cyanoborohyride in an acid medium.
  • R. and R- represent an optionally substituted C 1 -C 4 alkyl, such as CH ,, CH- (CH,) 2 or R. + R_ together form a morpholino group
  • R represents a C alkyl. to C7 optionally substituted in particular nt CH 3 orCH 2 -CH 2 CN
  • - B represents a nucleic acid base in particular, adenine, guanine or nebularine.
  • nucleic acid base B it is indeed preferable to choose, adenine, guanine or nebularin, taking into account their ease of acid hydrolysis, compared to the other nucleic acid bases.
  • a phosphoramidite derivative of formula I in which B represents nebularin is a phosphoramidite derivative of formula I in which B represents nebularin.
  • the originality and the interest of the approach according to the invention resides in the use during the last stage of the oligonucleotide synthesis on solid support of the same phosphoramidite derivative of dideoxynucleoside whatever the effector agent than the we want to introduce.
  • the phosphoramidite derivative of dideoxynucleoside after opening of the deoxy-sugar cycle, provides the "linker" between the oligonucleotide proper and the effector.
  • RNH is the monovalent residue of the amino effector RNH_
  • radicals B may be identical or different from each other and each represent a base of an optionally modified nucleic acid attached to the glycosidic cycle according to an alpha or beta anomeric configuration
  • radicals X may be identical to or different from each other and represent an oxoanion O, a thioanion S " , an alkyl group, an aicoxy group, aryioxy, an aminoalkyl group, aminoalkoxy, thioaikyle,
  • n is between 1 and 50. 10
  • effector radicals of formula RNH- according to the invention correspond to effector agents which are compounds known in the techniques relating to nucleic acids. These are, for example, compounds capable of "intercalating" in the structure of DNAs or RNAs.
  • intercalating agents are, in general, constituted by polycyclic compounds having a planar configuration such as acridine, furocoumarin, daunomycin, 1,10-phenanthroiine, phenanthridinium, prophyrins, derivatives of the dipyrido (1,2-a: 3 ', 2'-d) imidazole, ellipticine or ellipticinium or their derivatives containing a function
  • effector agents can also be reactive chemical radicals such as chemical cleavage radicals, that is to say that these radicals can directly or indirectly react to split a chain of nucleotides.
  • these reactive chemical radicals will be activatable, for example chemically or photochemically.
  • the activatable cleavage reactive groups are, for example, derivatives of compounds such as: ethylene diamine-tetracetic acid, 1 1
  • diethylene-triamine-pentaacetic acid diethylene-triamine-pentaacetic acid, porphyrins, 1,10-phenanthroline, psoraiene and other aromatic groups absorbing near UV and visible radiation.
  • the RNH residue of the effector agent can represent:
  • R. representing an amino (NH_) or azido (N,) group
  • B preferably represents adenine, guanine or nebularine.
  • EXAMPLE 1 Use of dideoxy ⁇ nucleoside phosphoramidite in order to create an abasic site (residue 2 ', 3' didesoxyribose 5 'from an oligonu ⁇
  • the corresponding oligomer is obtained after deprotection according to the usual methods then optionally purified by HPLC. Treatment in an acid medium (30 mM HCL, 37 °, 12 to 15 min) leads to the selective hydrolysis of the dideoxynébularine residue and thus to the formation of a dideoxyribose end 5 ′ of the oligomer, ie 3.
  • the reductive amination reaction in step c) of the process according to the invention is carried out by a sodium cyanoborohydride treatment in an acid medium.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate, filtered and evaporated to dryness under reduced pressure.
  • the residue obtained is chromatographed on a column of silica gel and the elution takes place with mixtures of cyclohexane, dichioromethane and triethylamine (90/9/1 to 30/69/1, v / v / v).
  • the fractions containing the desired pure product are combined, evaporated to dryness and the residue redissolved in dioxane is subjected to lyophilization.
  • a colorless powder is obtained (345.3 mg, 44% yield).
  • N, N-diisopropylaminomethoxyphosphine (0.35 ml, 1.8 mm geese). The mixture is stirred for 30 minutes at room temperature, under an argon atmosphere, then poured into a separatory funnel containing ethyl acetate (40 ml). The resulting solution is washed with brine
  • EXAMPLE 4 Synthesis of oligonucleotides comprising the dideoxynébularine at their 5 ′ end on solid support by the so-called phosphorami ⁇ method.
  • Dideoxynébularine is incorporated in the final stage of synthesis of oligonucleotides prepared on the scale of one ⁇ mol in a conventional manner according to the methods described in the literature (for example method with cyanoethylphosphoroamidite for oiigodeoxyribonucleotides of beta configuration, method with methyiphosphoroamidite for alpha-configuration oligodeoxyribonucleotides: F. Morvan, B. Rayner,
  • the coupling cycle of the methyiphosphoroamidite synthon of ddN is that used in the methyiphosphoroamidite method (reference above). At the end of this cycle, the detritylation step is omitted.
  • capping is carried out by NH ⁇ OH 32% for 16 hours at 55 °.
  • NH ⁇ OH 32% for 16 hours at 55 °.
  • oiodeodesribribucleotides only treatments with NH. OH are used.
  • the amount of functionalized oligonucleotide obtained is 29 absorbance units at 260 nm.
  • the spectrophotometric purity of this compound is 99% at this same wavelength.
  • EXAMPLE 6 Functionalization with amino-9 ellipticine at the 5'OH end of a ⁇ oligonucleotide directed against the splicing site of the tat gene of the HIV 1 virus.
  • O 0 C H- (CH 2 ) 2 -CHOH-CH 2 0-P-0 ⁇ d 5 '(ACA CCC AAT TCT) 3 ' 21
  • HPLC conditions used injection 10 ⁇ i Beckman XLODS C column. Plate3 ⁇ linear gradient from a 0.1 M ammonium acetate buffer solution at pH 5.9 to a 20% acetonitrile solution in the same buffer in 20 min at a flow rate of 1 ml per min.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de fonctionnalisation d'un oligonucléotide en son extrémité 5'OH par un agent effecteur aminé de formule RNH2 caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: (a) on synthétise ledit oligonucléotide, (b) on assemble sur l'extrémité 5'OH dudit oligonucléotide, un didésoxynucléotide via l'extrémité 5' de ce dernier, (c) on effectue un couplage covalent dudit oligonucléotide avec ledit réactif aminé RNH2 par une réaction d'amination réductrice entre ledit réactif aminé et une fonction aldéhyde à l'extrémité 5'OH de l'oligonucléotide provenant de l'ouverture par hydrolyse acide du cycle glycosidique du didésoxynucléotide à l'extrémité 5'OH dudit oligonucléotide.

Description

PROCEDE DE FONCTIONNALISATION D ' UN OLIGONUCLEOTIDE
La présente invention concerne le procédé de fonctionnali- saπon d'un oligonucleotide en son extrémité 5 'OH par un agent effecteur aminé. La présente invention concerne également un synthon utile dans le procédé consistant en un dérivé phosphoramidite de didesoxynucléoside. La synthèse d'oligonucléotides liés de façon covalente à divers agents effecteurs présente un intérêt considérable de par l'usage massif en biochimie et en biologie moléculaire de ces molécules et leur utilisation en tant qu'agents thérapeutiques potentiels.
En particulier, il a été montré que la fixation d'un agent intercalant sur un oligonucleotide accroît la stabilité des duplexes formés avec la séquence complémentaire de ces oligomères (U. Asseiine et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81_, 3297-3301, 1984) et améliore la pénétration de ces derniers à travers les membranes cellulaires (P. Verspieren et col., Gène, 6j., 307-315, 1987). D'autre part, des oligonuciéotides liés à des groupements fluorescents ou à la biotine (S. Agra al, C. Christodoulou et M. J. Gait, Nucieic Acids Res. , 14, 6227-6245, 1986 ; P. Richterich, Nucleic Acids Res., 17, 2181-2185, 1989) peuvent être aisément détectés respectivement par des méthodes fluorometriques ou enzymatiques et colorimétriques très sensibles. Ces composés peuvent être utilisés comme sondes moléculaires froides et remplacer avantageusement les sondes radioactives.
Enfin, des oligonuciéotides liés à des groupements réactifs pouvant être activés chimiquement (C. B. Chen et D. S. Sigman, Proc. Natl. A cad. Sci. USA, 83, 7147-7151 ; T. Le Doan et col., Nucleic Acids Res., JL5, 8643-8659, 1987 ; 3. C. François et col., Biochemistry, 27, 2272-2276, 1988 ;
S. A. Strobel, H. E Moser et P. B. Dervan, 3. Am. Chem. Soc, 110, 7927-7929, 1988 ; S.B. Lin et col., Biochemistry, 28» 1054- 1061, 1989) ou photochimiquement (T. Le Doan et col., Nucleic Acids Res., _ 5 7749-7760, 1987) sont susceptibles de se fixer sur des acides nucléiques au niveau de séquences complémentaires et d'induire localement des dommages irréversibles. Cette famille de composés peut être utilisée pour inhiber sélectivement les fonctions biologiques d'un gène déterminé. La séquence de l'oligomère a pour fonction d'assurer la spécificité de reconnaissance au niveau de la séquence complémentaire portée par le gène ; l'effecteur chimique assurant alors des dommages sur cette cible. Dans la présente demande de brevet, on entend par "oligonucleotide" aussi bien des oligodésoxynucléotides c'est-à-dire en série ADN que des oligoribonuciéotides c'est-à-dire en série ARN. D'autre part, on entend également par "oligonucleotide" des oligonuciéotides à confi- guration anomérique bêta ou à configuration anomérique non naturelle alpha.
Enfin, les nucléotides constituant l'oligonuciéotide ' peuvent être des nucléotides vrais c'est-à-dire avec un phosphate en 5' du nucléoside correspondant ou des dérivés, entre autres, du type phospho- rothiorate, méthylphosphonate, comme il sera vu plus loin.
La demanderesse a déjà décrit dans d'autres demandes de brevet des procédés de fonctionnalisation d'un oligonucleotide en son extrémité 5'OH par un agent effecteur aminé. Ainsi pour la meilleure intelligence de la présente invention, on se reportera utilement aux demandes de brevet FR 83 01 223 (2 540 122) et FR 84 1 17 955 ( 2 568
254) dans lesquelles ont été décrits des composés chimiques constitués par un oligonucleotide comportant un enchaînement de nucléotides naturels, à anomerie béta éventuellement modifiés, sur lequel se trouve fixé par une liaison covalente au moins un groupe intercalant. Dans FR 87 03 366 (2 586 707) on a décrit la synthèse de composés oligonucleotidiques liés à un groupe chimique activable, leur application à titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences.
Dans la demande de brevet International PCT 0 83/01 451 a été décrite une méthode dans lequel l'oligonuciéotide est stabilisé sous forme de phosphotriester.
Dans le brevet Américain US 4 469 863 sont décrits des oligonuciéotides qui sont stabilisés par remplacement des liaisons phospho- diesters naturelles par des liaisons phophonates.
Dans la demande internationale PCT WO 88/04 301 , on a décrit la préparation d'oligonucleotides à anomerie alpha ainsi que leur couplage a un agent intercalant ou a un groupement activable chimi¬ quement ou photochimiquement.
Dans la présente demande, on entend par "agent effecteur", un radical correspondant à un agent d'intercalation encore appelé agent intercalant, ou un radical chimique ou photbactivable tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaines de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible.
Dans la demande de brevet FR 87 04 339, on a décrit des synthèses par la méthode au phosphoramidite sur support solide pour préparer des composés oligodésoxyribonucléotides alpha et dans la demande de brevet FR 88 12 264, on a décrit des synthèses par la méthode au phosphoramidite sur support solide, de composés oligoribonuciéotides alpha. Jusqu'à présent, dans les procédés de fonctionnalisation d'un oligonucleotide par un agent effecteur, on utilise lors de la dernière étape de l'éiongation de l'oligonuciéotide, un dérivé par exemple phosphoramidite dans le cas d'une synthèse sur support solide au phosphoramidite dudit agent effecteur fonctionnalisé par un lin er. Ainsi, l'article de Stein et al Gène 72 ( 1988) 333-341 se rapporte à une méthode de fonctionnalisation classique d'un oligonucleotide, il s'agit dans ce cas de l'acridine (ACr). On peut décomposer cette méthode comme suit : a) Fonctionnalisation de l'acridine par le linker (m = 3 ou 5) b) Formation du phosphoroamidite correspondant.
Figure imgf000005_0001
c) Synthèse sur support solide en utilisant J^ lors de la dernière étape de l'éiongation sur machine. d) Décrochage du support solide, et déprotection de l'oligomère avec C,H_5H. On observe, dans ces conditions, une réaction parasite sur l'acridine de l'oligomère final lors de la déprotection (Cl est remplacé par CgH-5). L'approche décrite dans cet article nécessite, à chaque fois que l'on veut introduire un effecteur différent, de synthétiser le phosphoroamidite correspondant :
Figure imgf000006_0001
Pour pallier à cet inconvénient, on a cherché à coupler de façon covalente un oligodesoxyribonucleotide avec un réactif aminé (R-NH2) à son extrémité 3'OH par une réaction d'amination réductrice entre le dérivé aminé et la fonction aidéhydique d'un site abasique (AP) généré dans l'oligonuciéotide U.-^J. Vasseur, C. Gauthier, B. Rayner, 3. Paoletti et 3. -L. Imbach, Biochem. Biophys. Res. Commun., 152, 56-61, 1988 ; 3. -R. Bertrand, 3. -3. Vasseur, A. Gouyette, B. Rayner, 3.-L. Imbach, C. Paoletti et C. Malvy, 3. Biol. Chem., 264, 14172-17178, 1989) selon le schéma suivant :
O
Il y
5' oiigodésoxyribonuciéotide- -P— dA"5 l _ o
création d'un site AP (en milieu de chaîne)
HC1 ou comme ici à l'extrémité 3' de l'oligomère
Figure imgf000006_0002
5'
Figure imgf000006_0003
OH
R-NH2, NaBH3CN
Figure imgf000006_0004
O I I oligodesoxyribonucleotide — P — O— CH^CHOH^CH- -NH— R
Cette approche très générale, en elle-même puisque de nombreux effecteurs R-NH2 peuvent être considérés, est toutefois limitée par la création du site AP (2' -désoxyribose).
En effet, celui-ci est obtenu par hydrolyse acide de la liaison glycosidique d'une désoxyadénosine (dA).
La chaîne oiigonucléotidique ne peut alors contenir que des nucléosides pyrimidiniques compte tenu du fait que dC et dT sont beaucoup moins sensibles à l'hydrolyse acide que dA ou dG. En d'autre termes, il n'est donc possible par cette méthode de fonctionnaliser par des effecteurs aminés des oiigodésoxyribonuciéotides constitués uniquement de nucléo¬ sides pyrimidiniques.
La présente invention propose un procédé générai de formation d'un site abasique à l'extrémité 5'OH d'un oligonucleotide (tant en série ADN qu'en série ARN) synthétisé sur support solide et comprenant cette fois-ci le cas échéant toutes les bases usuelles (A, C, G, T ou U) de l'ADN et de l'ARN ainsi que les bases modifiées. Ce procédé original permet ainsi de fonctionnaliser des oligonuciéotides de séquences quelconques par des effecteurs aminés.
La méthode de fonctionnalisation selon l'invention, a pour caractéristique essentielle l'utilisation de didesoxyribonucleosides et permet via la synthèse automatisée sur support solide de fonctionnaliser des oligonuciéotides de séquences quelconques à leur extrémité 5'OH.
Le procédé selon l'invention est applicable aux séries ADN ou ARN quelles que soient les modifications structurelles apportées aux oligomères (séries naturelles de configuration béta, séries non naturelles de configuration alpha, phosphorothioates, méthyphosphonates, etc.). Plus précisément la présente invention a pour objet un procédé de fonctionnalisation d'un oligonucleotide en son extrémité 5'OH par un agent effecteur aminé de formule RNH- caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) on synthétise ledit oligonucleotide b) on assemble sur l'extrémité 5'OH dudit oligonucleotide, un didésoxynucléotide via l'extrémité 5' de ce dernier, c) on effectue un couplage covalent dudit oligonucleotide avec ledit réactif aminé RNH^ par une réaction d'amination réductrice entre ledit réactif aminé et une fonction aldéhyde à l'extrémité 5'OH de l'oligonuciéotide provenant de l'ouverture par hydrolyse acide du cycle glycosidique du didésoxynucléotide à l'extrémité 5'OH dudit oligonu¬ cleotide.
La présente invention fournit donc une nouvelle approche de formation d'un site abasique didésoxyribose à l'extrémité 5'OH d'un oligomère pouvant contenir des bases quelconques et ceci quelle que soit la série oligonucléotidique considérée (naturelle ou modifiée). Ces oligonu¬ ciéotides abasiques ne sont pas isolés car ils conduisent aisément et de façon quantitative à leur forme dérivatisée après amination réductrice avec des effecteurs aminés.
Dans un mode de réalisation du procédé selon l'invention aux étapes a) et b), la synthèse de l'oligonuciéotide est une synthèse d'assemblage au phosphoramidite sur support solide dans la dernière étape de laquelle, on utilise un dérivé phosphoramidite en 5' du didésoxy- nucleoside correspondant au didésoxynucléotide que l'on assemble par un cycle de synthèse supplémentaire à l'extrémité 5' dudit oligonucleotide. Il apparaît que les dérivés phosphoramidites de didesoxy¬ nucleosides selon l'invention sont beaucoup plus sensibles à l'hydrolyse acide que les didesoxyribonucleosides ou les ribonucléosides correspondant. Parmi ceux-ci, comme ce sera vu plus loin, les dérivés didesoxynucleosides de la nébularine s'hydrolysent plus aisément. Toutefois, il en va de même d'autres dérivés de didesoxy¬ nucleosides, notamment, des dérivés hydrogéno-phosphonates correspon¬ dants de formule :
Figure imgf000009_0001
ce qui ouvre la possibilité d'avoir recours à d'autres types de synthèses que la synthèse au phosphoramidite et en particulier aux synthèses à l'aide de dérivés hydrogéne-phosphonates (Nucleic Acids Researchs Vol. 14 N° 13 1988).
Un procédé en phase solide selon la méthode au phosphora¬ midite, comporte les étapes essentielles suivantes : - On immobilise un dérivé nucleoside protégé en 5', par l'intermédiaire d'une de ses fonctions hydroxyle en 2* ou 3' sur un support solide,
- On assemble sur ce support dans un réacteur synthétiseur manuel ou automatique la chaîne d'oligobonucléotide protégée par condensation de monomères constitués de nucléosides protégés en 5' et 2' et substitués par des groupes phosphoramidites en 3',
- Les oligonuciéotides sont obtenus après décrochage du support de l'oligomère obtenu et élimination des groupes protecteurs.
De façon appropriée, l'assemblage de l'oligonuciéotide se fait par condensation, en présence dun agent activateur, desdits monomères entre leur fonction en 3' et la fonction hydroxyle-5' du composé nucleoside immobilisé pour le premier monomère ou d'un composé intermédiaire polynucléotide protégé fixé sur ledit composé nucleoside immobilisé pour les monomères suivants. Notamment, l'agent activateur pour la condensation desdits monomères peut être choisi parmi le tétrazole et ses dérivés, tels que le paranitro-phényi tétrazole. Dans le procédé selon l'invention, de préférence après les étapes a) et b) et avant l'étape c) on décroche du support solide le composé constitué par ledit oligonucleotide à l'extrémité 5' duquel est assemblé le dit didésoxynucléotide et on élimine les groupes protecteurs. La réaction d'amination réductrice à l'étape c) peut se faire par exemple par un traitement au cyanoborohyrure de sodium en milieu acide.
Dans un mode de réalisation du procédé selon une synthèse de phosphoramidite, utilisera le dérivé phosphoramidite de didésoxynucleoside de formule :
Figure imgf000010_0001
formule dans laquelle :
- R . et R- représentent un alkyl en C , à C, éventuellement substitué, tel que CH,, CH-(CH,)2 ou R . + R_ forment ensemble un groupe morpholino
Figure imgf000010_0002
- R, représente un alkyl en C . à C7 éventuellement substitué notamme nt CH3 ouCH2-CH2CN
- B représente une base d'acide nucléique notamment, l'adénine, la guanine ou la nebularine.
S'agissant de la base d'acide nucléique B, on choisit en effet de préférence, l'adénine, la guanine ou la nebularine compte tenu de leur facilité d'hydrolyse acide, par rapport aux autres bases d'acides nucléiques.
De préférence encore, on utilisera un dérivé phosphoramidite de formule I dans laquelle B représente la nebularine. L'originalité et l'intérêt de l'approche selon l'invention réside en l'utilisation lors de la dernière étape de la synthèse oligonucléotidique sur support solide d'un même dérivé phosphoramidite de didésoxynucleoside quel que soit l'agent effecteur que l'on souhaite introduire. Le dérivé phosphoramidite de didésoxynucleoside, après ouverture du cycle désoxy- sucre, apporte le "linker" entre l'oligonuciéotide proprement dit et l'agent effecteur. En outre, la déprotection ne s'effectue plus selon l'invention sur l'oligomère fonctionnalisé avec des risques de réaction parasite, mais l'oligomère est déprotégé avant l'introduction de l'effecteur. La consom¬ mation en agent effecteur, substance en général assez chère, est donc moindre dans un procédé selon l'invention car introduit à la dernière étape de la synthèse. Dans les réalisations antérieures telles que l'article de Stein et al, la préparation du phosphoramidite nécessitait l'introduction préalable du linker avec nécessité d'utiliser lors de la synthèse en phase solide un excès (20 fois la stoechiometrie du dérivé phosphoramidite 1). Dans un mode de réalisation particulier, il est possible selon le procédé selon l'invention de préparer des composés de formule :
(")
RNH-(CH2)3-CH0H-CH2-0- O H
formule dans laquelle :
Figure imgf000011_0001
- RNH est le reste monovalent de l'agent effecteur aminé RNH_,
H ou OH
- les radicaux B peuvent être identiques ou différents entre eux et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée attachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha ou bêta,
- les radicaux X peuvent être identiques ou différents entre eux et représentent un oxoanion O , un thioanion S", un groupe alkyle, un groupe aicoxy, aryioxy, un groupe aminoalkyle, aminoalcoxy, thioaikyle,
n est compris entre 1 et 50. 10
On citera plus particulièrement les composés de formule II dans laquelle X = O", S", ou CH
Lorsque X = S", l'étape usuelle d'oxydation après la détπty- lation, l'addition et le capping peut être remplacée par un cycle de suifurisation (GENE 72 343-347) (W.3. Stec, G. Zon, W. Egan et B. Stec, 3. Amer. Chem. Soc, 106, 6077-6079, 1984 ; R.P. Iyer, W. Egan, 3.B. Regan et S.L. Beaucage, 3. Amer. Chem. Soc. 1 12, 1253-1254, 1990). Lorsque X = CH-, un synthon 5'-(dimethoxytrityi) nucleoside 3'-(N,N-diisopropylméthyl- phosphonamidite) peut être utilisé en lieu et place d'un synthon phosphoramidite, lors de l'étape d'addition (M.A. Dorman, S.A. Noble, L.3. Me Bride et M.H. Caruthers, Tetrahedron, 40, 95-102, 1984 ; A. 3âger et 3. Engels, Tetrahedron Letters, 2_5, 1437-1440, 1984).
Comme on l'a déjà mentionné, les radicaux effecteurs de formule RNH- selon l'invention correspondent à des agents effecteurs qui sont des composés connus dans les techniques touchant aux acides nucléiques. Il s'agit par exemple des composés capables de "s'intercaler" dans la structure des ADN ou des ARN.
Ces agents d'intercalation sont, en général, constitués par des composés polycycliques ayant une configuration plane tels que l'acridine, la furocoumarine, la daunomycine, la 1,10-phénanthroiine, la phénanthridi- nium, les prophyrines, les dérivés de la dipyrido (1,2-a : 3', 2'-d) imidazole, l'ellipticine ou l'ellipticinium ou leurs dérivés comportant une fonction
NH2.
Ces agents effecteurs peuvent aussi être des radicaux chimiques réactifs tels que des radicaux chimiques de scission c'est-à-dire que ces radicaux peuvent directement ou indirectement réagir pour scinder une chaîne de nucléotides. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs seront activables, par exemple par voie chimique ou photochimique. Les groupes réactifs de scission activables sont, par exemple, des dérivés de composés tels que : l'acide éthylène-diamine-tétracétique, 1 1
l'acide diéthylène-triamine-pentaacétique, les porphyrines, la 1,10-phénanthroline, le psoraiène et autres groupes aromatiques absorbant les radiations du proche U.V. et du visible.
Ces groupements chimiquement activables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur, induisent des coupures dans des séquences d'acides nucléiques situées dans leur voisinage.
Plus précisément selon la présente invention le reste RNH de l'agent effecteur peut représenter :
- les radicaux dérivés de l'acide éthylène-diamine-tétraacétique de formule :
Figure imgf000013_0001
- les radicaux dérivés de l'acide d'iéthylène-triamine-pentaacétique,
- les radicaux dérivés de la méthylpyrroporphyrine de formule :
Figure imgf000013_0002
les radicaux dérivés une de formule
Figure imgf000013_0003
12
- les radicaux dérivés de l'acridine
H-N
Figure imgf000014_0001
- les radicaux dérivés de la proflavine
Figure imgf000014_0002
H
R . représentant un groupement amino (NH_) ou azido (N,)
- la 9 amino ellipticine =
Figure imgf000014_0003
Enfin la présente invention a pour objet un synthon utile dans un procédé selon l'invention caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale :
Figure imgf000014_0004
formule dans laquelle R , , R2, R.. et B ont les significations données dans la revendication 4. 13
Comme déjà mentionné, de préférence dans le synthon selon l'invention, B représente de préférence l'adénine, la guanine ou la nebularine.
D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre :
EXEMPLE 1 : Utilisation de phosphoramidite de didésoxy¬ nucleoside en vue de créer un site abasique (résidu 2', 3' didesoxyribose en 5' d'un oligonu¬
10 cleotide destiné à être fonctionnalisé).
On a préparé le phosphoramidite de formule
Figure imgf000015_0001
20
Après assemblage complet de l'oligonuciéotide désiré sur le synthétiseur un cycle supplémentaire est effectué qui permet d'incorporer 5 le phosphoroamidite J..
Figure imgf000015_0002
14
L'oligomère correspondant est obtenu après déprotection selon les méthodes usuelles puis éventuellement purifié par CLHP. Un traitement en milieu acide (30 mM HCL, 37°, 12 à 15 min) conduit à l'hydrolyse sélective du résidu didésoxynébularine et ains à la formation d'une extrémité didésoxyribose en 5' de l'oligomère soit 3.
Figure imgf000016_0001
RNH2 BH3CNNa
Figure imgf000016_0002
Celui-ci est mis en réaction avec i'amine désirée en présence de cyanoborohydrure de sodium en milieu tamponné. Les conditions expérimentales de cette étape dépendent de la nature de l'aminé utilisée (solubilité, réactivité, ...) et l'oligomère fonctionnalisé 4^ est isolé par CLHP.
Selon une variante de réalisation, la réaction d'amination réductrice à l'étape c) du procédé selon l'invention, se fait par un traitement cyanoborohydrure de sodium en milieu acide.
Il apparaît que le dérivé phosphoramidite de didésoxynucleo¬ side de nebularine s'hydrolysent plus aisément que tous les autres nucléosides pirymidiques ou puriniques en particulier que les nucléosides de l'adénine. 15
Les exemples ci-après décrivent la synthèse et la caractéπsa- tion des phosphoroamidites 5' de ddA et de ddN de type :
Figure imgf000017_0001
A = adénine B = nebularine
Il est possible cependant d'utiliser d'autres dérivés phospho¬ roamidites protégés par divers autres groupements substituant le phosphore
CNCH2CH2 à la place de CH3,
p à la place de N; etc
\_/
Est ensuite décrite l'utilisation de ces phosphoroamidites pour dérivatiser différents types d'oiigodésoxynucléotides (béta ou alpha). L'amination réductrice par des effecteurs aminés du produit obtenu après dépurination sélective de la ddN 5'terminaie, est décrite dans la mesure où cette succession d'étapes s'effectue sans isolement de oligomères intermédiaires.
EXEMPLE 2 .Synthèse du phosphoroamidite de la ddA :
5' -diisopropylaminométhoxyphosphinyl-2', 3' -didésoxyadénosine.
Figure imgf000017_0002
16
A une solution de 2', 3' -didésoxyadénosine (470,5 mg, 2 mmoies) dans du dichiorométhane anhydre (6ml) on ajoute de la N'.N.N'-diisopropyléthylamine (1,39 ml, 8 m oies) et de la chloro N.N- diisopropyiaminométhosyphosphine (0,98 ml, 5 mmoies). Le mélange est agité pendant 30 minutes à température ambiante, sous atmosphère d'argon, puis est versé dans une ampoule à décanter contenant de l'acétate d'éthyie (&0 ml). La solution résultante est lavée avec de la saumure (4 x 50 ml). La phase organique est séché sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée à sec sous pression réduite. Le résidu obtenu est chromatographie sur colonne de gel de silice et l'élution a lieu avec des mélanges de cyclohexane, de dichiorométhane et de triéthylamine (90/9/1 à 30/69/1, v/v/v). Les fractions contenant le produit désiré pur sont rassemblées, évaporées à sec et le résidu redissous dans du dioxanne est soumis à lyophilisation. On obtient une poudre incolore (345,3 mg, 44 % Rdt).
- RMN 31P (CD3CN) 149,89 ppm.
- RMN lH (CD3CI 3) d S,33, 8,32 et 8,26 (3s, 2H, H∑ et Hg) ; 6,32 (m, 1H, Hj,) ; 4.34 (m, 1H, H^.,) ; 3,83 (m, 2H, Hy et H5„) ; 3,58 (m, 2H, CH (iPr)2) ; 3,44 et 3, 43 (2d, 3H, CH30) ; 2,50 (m, 2H, H2, et H2„) ; 2,1 (m, 2H, H3, et H3„) ; 1,16 (m, 12H, CH3(iPr)2).
note : s = singulet, d = doublet, m = multiplet. ô = déplacement chimique exprimé en ppm par rapport au signal du
TMS.
- Spectre de masse :
FAB <^0 ; matrice poiyéthylèneglycol : (M-H)~ = 395 ; B" = 134
CH30-P-(0")N(iPr)2 = 178.
FAβ 0 ; matrice poiyéthylèneglycol : (M+H)+ = 397 ; (M+H - HN(iPr)2)+ = 296 ; (M+H) - BH)+ = 262 ;
( _. -+"
\V-+H - CH3θ-P(OH)N(iPr)2) = 218 ; CH30-P-N(iPr)2 et B-C =0 = 162 ;
(B+H2)+ = 136. 1 7
EXEMPLE 3 :Synthèse du phosphoroamidite de la ddN : 5 -diisopropylaminométhoxyphosphin yl-21, 3 -didésoxynébularine
Figure imgf000019_0001
A une suspension de 2', 3' -didésoxynébularine (21 1,6 mg, 0,961 mmoies) dans du dichiorométhane anhydre (5 ml) on ajoute de la N,
N, N,-diisopropyIéthyiamine (0,67 ml, 3,844 mmoies) et de la chloro
N,N-diisopropylaminométhoxyphosphine (0,35 ml, 1,8 mmoies). Le mélange est agité pendant 30 minutes à température ambiante, sous atmosphère d'argon, puis est versé dans une ampoule à décanter contenant de l'acétate d'éthyle (40 ml). La solution résultante est lavée avec de la saumure
( 4 x 25 ml). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée à sec sous pression réduite. Le résidu obtenu est chromatographie sur colonne de gel de silice et dichiorométhane et de thriétyiamine (90/9/ 1 à 50/49/ 1 , v/v/v). Les fractions contenant le produit désiré pur sont rassemblées, évaporées à sec et le résidu redissous dans du benzène est soumis à lyophilisation. On obtient une poudre incolore ( 165,3 mg, 45 %
Rdt).
- RMN 3 1 P (CD3CN 150,09 ppm.
- RMN ! H (CD3C 1 3) <3 9,03 (s, 1 H, H2 ou H6 ou Hg; 8,88 (s, 1 H,
H2 ou Hé ou Hg) ; 8,59 et 8,55 (2s, 1H? H2 ou H6 ou Hg) ; 6,40 (m, 1 H, H ) ; 4,32 (m, 1 H, H^,) ; 3,93-3,67 (m, 2H, H5, et H5„) ; 3,61 -3,51 (m, 2H, CH(iPr)2) ; 3,36 et 3,35 (2d, 3H, CH30, 3Hp = 12,9 et 13,5 Hz) ; 2L,54 (m, 2H, H2' et H2") ; 2,18 (m, 2H, H3' et H3") ; 1 , 13 (m, 12H, CH3)(iPr)). - Spectre de masse :
FAB <^0 ; matrice poiyéthylèneglycol : (M-H)~ = 380 ; B" = 1 19 ; CH30-P-(0")N(iPr)2 = 178. FAB ^> O ,• matrice polyétylènegiycoi : (M+H) +. = 382 ;
(M+H - HN(iPr)2 = 281 ; (M+H - BH)+ = 262 ;
(M+H - CH30-P(OH)N(iPr)2)+ = 203 ; CH30-P-N(iPr)2 et B-C≈O = 162 ; B-C =0 = 147 ; (B+H2)+ = 121.
EXEMPLE 4 .Synthèse d'oligonucleotides comportant la didésoxynébularine à leur extrémité 5' sur support solide par la méthode au phosphorami¬ dite.
La didésoxynébularine est incorporée au dernier stade de synthèse des oligonuciéotides préparés à l'échelle d'une μmole de façon classique selon les méthodes décrites dans la littérature (par exemple méthode au cyanoéthylphosphoroamidite pour les oiigodésoxyribonucléo- tides de configuration béta, méthode au methyiphosphoroamidite pour les oligodésoxyribonucléotides de configuration alpha : F. Morvan, B. Rayner,
3.P. Leonetti et 3.L. Imbach, Nucleic Acids Res., 16, 833-847, 1988).
Le cycle de couplage du synthon methyiphosphoroamidite de la ddN est celui utilisé en méthode au methyiphosphoroamidite (référence ci-dessus). A la fin de ce cycle, l'étape de détritylation est omise. Déprotection des oligonuciéotides :
Cette déprotection est tout à fait classique et dépend de la nature des groupements protecteurs des phosphates utilisés.
Ainsi, pour les oligonuclétotides de configuration « _. la déprotection des phosphates est réalisée par une solution de thiophénol/-
3N/dioxanne (l/l/2v/v/v) pendant 30 minutes à température ambiante, le décrochage de l'oligonuciéotide sur le support est réalisé par un traitement avec NH^OH 32 % pendant 3 fois 30 minutes à température ambiante et la déprotection des fonctions protégées par des groupements acyles (résultant 19
du capping) est effectuée par NH^OH 32 % pendant 16 heures à 55°. Pour les oiigodésoxyribonucléotides de configuration , seul les traitements avec NH. OH sont utilisés.
EXEMPLE 5 : Fonctionnalisation par l'amino-9 ellipticine à l'extrémité 5'OH d'un oligonucleotide dirigé contre l'extrémité "cap" du gène de la -globine de lapin.
<_d .5° '' ( TGT GAA CGA AAΛ CT )3
Figure imgf000021_0001
HC1 30mM, 37#C, 14 min
c_d5'(TGT GAA CGA AAA CT)
Figure imgf000021_0002
NaBH3CN, pH 5 amino- ellipticine
00_d5'(TGT GAA CGA AA
Figure imgf000021_0003
L'oligonuciéotide (brut réactionnel obtenu après déprotection, 72 unités d'absorbance à 260 nm) comprenant à son extrémité 5' la didésoxynébularine est mis en solution d'acide chlorhydrique l OOmM (300 μi). Le mélange est laissé à 37°C pendant 14 minutes. L'évolution de la réaction est suivie par CLHP dans les conditions décrites en annexe. On observe la disparition de l'oligonuciéotide de départ (RT = 17,20 min, max 20
= 259,2 nm) et la formation ή max = 263,4 nm) et de l'oligonuciéotide comportant à son ex • trémité 5' la chaîne OCH-(CH_ _)- _)-CHOH-CH_ _)0-P(0")02-)
(Rτ = 15,03 min, n max = 259,2 nm).
Au bout de ces 14 min de traitement acide, on ajoute successivement une solution de cyanoborohydrure de sodium (6,2 -mg, 100 μmoies) dans un tampon acétate de sodium 1M à pH 5 (400 μl), de l'eau (500 μi) puis une solution d'amino-9 ellipticine 10 nM dans l'acide chlorhydrique 20 mM. Le mélange reactionnel est laissé à température ambiante pendant 30 minutes. A ce stade, l'analyse CLHP du milieu reactionnel indique la disparition de l'oligonuciéotide intermédiaire (Rτ =
15,03 min) et la formation de l'oligonuciéotide lié à l'aminoellipticine (Rτ = 17,80 min, πmax = 259,2 nm et 307,2 nm). Ce dernier composé est alors purifié par CLHP.
La quantité obtenue d'oligonucléotide fonctionnalisé est de 29 unités d'absorbance à 260 nm. La pureté spectrophotometrique de ce composé est de 99 % à cette même longueur d'ondei.
Conditions CLHP utilisées injection : 10 μl colonne Beckman XLODS Cj g 3μ gradient linéaire d'une solution à 5 % d'acétonitrile dans un tampon acétate d'ammonium 0,1 M à pH 5,9 vers une solution à 15 % d'acétonitrile dans le même tampon en 30 min à un débit de I ml par min.
EXEMPLE 6 : Fonctionnalisation par l'amino-9 ellipticine à l'extrémité 5'OH d'un oligonucleotide β dirigé contre le site d'épissage du gène tat du virus HIV 1.
N O —O-P-0 d5 ' (ACA CCC AAT TCT )3
HC1 30mM, 37βC, 12 min
O 0=CH-(CH2)2-CHOH-CH20-P-0 βd5'(ACA CCC AAT TCT)3' 21
NaBH3CN, pH 5 amino-9 ellipticine
Figure imgf000023_0001
L'oligonuciéotide (brut reactionnel obtenu après déprotection,
80,5 unités d'absorbance à 260 nm) comprenant à son extrémité 5' la didésoxynébularine est mis en solution dans l'eau (700 μl). On ajoute alors une solution d'acide chlorhydrique 100 mM (300 μl). Le mélange est laissé à 37°C pendant 12 minutes. L'évolution de la réaction est suivie par CLHP dans les conditions décrites en annexe. On observe la disparition de l'oligonuciéotide de départ (R- 16,76 min, π max = 262,4 nm) et la formation concommitante de la base nebularine (Rτ = 8,91 min, n max = 263,4 nm) et de l'oligonuciéotide comportant à son extrémité 5' la chaîne CH-(CH2)2-CHOH-CH20-P(0")02-(Rτ = 16,16 min, ^ max = 262,4 nm). Au bout de ces 12 min de traitement acide, on ajoute successivement une solution de cyanoborohydrure de sodium (6,2 mg, 100 μmol) dans un tampon acétate de sodium IM à pH 5 (400 μl), de l'eau 500 μl) puis une solution d'amino-9 ellipticine 10 nM dans l'acide chlorhydrique 20 mM. Le mélange reactionnel est laissé à température ambiante pendant 30 minutes. A ce stade, une analyse CLHP du mélange reactionnel indique la disparition de l'oligonuciéotide intermédiaire (R = 16,16 min) et la formation de l'oligonuciéotide lié à i'aminoeliipticine (Rj = 17,86 min, n max = 262,4 nm et 307,2 nm). Ce dernier composé est alors purifié par CLHP. La quantité obtenue d'oligonucléotide fonctionnalisé est de 33 unités d'absorbance à 260 nm. La pureté spectrophotometrique de ce composé est de 94 % à cette même longueur d'onde.
Conditions CLHP utilisées injection : 10 μi colonne Beckman XLODS C . „ 3μ gradient linéaire d'une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1 M à pH 5,9 vers une solution à 20 % d'acétonitrile dans le même tampon en 20 min à un débit de 1 ml par min.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de fonctionnalisation d'un oligonucleotide en son extrémité 5'OH par un agent effecteur aminé de formule RNH-, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) on synthétise ledit oligonucleotide b) on assemble sur l'extrémité 5'OH dudit oligonucleotide, un didésoxynucléotide via l'extrémité 5' de ce dernier, c) on effectue un couplage covalent dudit oligonucleotide avec ledit réactif aminé RNH- par une réaction d'amination réductrice entre ledit réactif aminé et une fonction aldéhyde à l'extrémité 5'OH de l'oligonuciéotide provenant de l'ouverture par hydrolyse acide du cycle glycosidique du didésoxynucléotide à l'extrémité 5'OH dudit oligonu¬ cleotide.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'aux étapes a) et b), la synthèse de l'oligonuciéotide est une synthèse d'assemblage au phosphoramidite sur support solide dans la dernière étape de laquelle, on utilise un dérivé phosphoramidite en 5' du didésoxynucléo- side correspondant au didésoxynucléotide que l'on assemble par un cycle de synthèse supplémentaire à l'extrémité 5' dudit oligonucleotide.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que après les étapes a) et b) et avant l'étape c) on décroche du support solide le composé constitué par ledit oligonucleotide à l'extrémité 5' duquel est assemblé le dit didésoxynucléotide et on élimine les groupes protecteurs.
24
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit dérivé phosphoramidite de didésoxynucléotide a pour formule :
Figure imgf000026_0001
(I) formule dans laquelle
- R , et R2 représentent un alkyl en C , à C, éventuellement substitué, tel que CH3, CH-(CH 2 ou R . + R2 forment ensemble un groupe morphoiino
Figure imgf000026_0002
- R3 représente un alkyl en C . à C7 éventuellement substitué, notamment CH3, ou CH2-CH2CN
- B représente une base d'acide nucléique notamment, l'adénine, la guanine ou la nebularine.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'oligonuciéotide fonctionnalisé a pour formule :
Figure imgf000026_0003
formule dans laquelle
- RNH est le reste monovalent de l'agent effecteur aminé RNH-.
- 3 = H ou OH 25
- les radicaux B peuvent être identiques ou différents entre eux et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée attachée au cycle glycosidique selon une configuration anoméri¬ que alpha ou bêta,
- les radicaux X peuvent être identiques ou différents entre eux et représentent un oxoanion O , un thioanion S", un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, aminoalcoxy, thioaikyle,
- n est compris entre 1 et 50
6. Procédé selon revendication 6 , procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que X = O", S", ou CHr
7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le reste RNH de l'agent effecteur représente :
- les radicaux dérivés de l'acide éthylène-diamine-tétraacétique de formule :
Figure imgf000027_0001
les radicaux dérivés de l'acide d'iéthylène-triamine-pentaacétique, les radicaux dérivés de la méthylpyrroporphyrine de formule :
Figure imgf000027_0002
26
les radicaux dérivés de la phénanthroliune de formule
Figure imgf000028_0001
- les radicaux dérives de l'acridine i
H-N
Figure imgf000028_0002
- les radicaux dérivés des la proflavine
Figure imgf000028_0003
R représentant un groupement amino (NH-) ou azido (N 3)
Figure imgf000028_0004
8. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la réaction d'amination réductrice à l'étape c) se fait par un traitement au cyanoborohydrure de sodium en milieu acide. 27
9. Synthon utile dans un procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale :
Figure imgf000029_0001
formule dans laquelle R . , R2, R , et B ont les significations données dans la revendication 4.
10. Synthon selon la revendication 9 caractérisé en ce que B représente l'adénine, la guanine ou la nebularine.
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