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WO1992000795A1 - Vorrichtung für die präparative elektrophorese - Google Patents

Vorrichtung für die präparative elektrophorese Download PDF

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Publication number
WO1992000795A1
WO1992000795A1 PCT/EP1991/001219 EP9101219W WO9200795A1 WO 1992000795 A1 WO1992000795 A1 WO 1992000795A1 EP 9101219 W EP9101219 W EP 9101219W WO 9200795 A1 WO9200795 A1 WO 9200795A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compartments
capillaries
electrophoresis
cooling
chamber
Prior art date
Application number
PCT/EP1991/001219
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bertold Radola
Original Assignee
Serva Feinbiochemica Gmbh & Co.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Serva Feinbiochemica Gmbh & Co. filed Critical Serva Feinbiochemica Gmbh & Co.
Priority to CA002086535A priority Critical patent/CA2086535A1/en
Priority to JP91510938A priority patent/JPH05508577A/ja
Publication of WO1992000795A1 publication Critical patent/WO1992000795A1/de

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44708—Cooling
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
    • B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis

Definitions

  • the invention relates to a device for preparative electrophoresis and in particular to a dimension-independent cooling system for this device.
  • Electrophoresis is currently the most powerful analytical method for protein separation. Numerous techniques of preparative electrophoresis are also known, but these are mainly used for separations on a scale of milligram amounts of proteins. A major problem with scale up (“scale up M ) is the dissipation of the Joule's heat generated during the passage of current. A particularly successful technique is the preparative isoelectric focusing in layers of granulated gels, with the aid of which gram amounts of proteins are separated with high resolution could (Radola, BJ, Methods Enzymol. 1984, 104, 256-275).
  • the layer thickness is limited to approximately 1 cm, and the separation distance cannot be extended either, so that the separation volume can only be increased by varying the width of the layer.
  • Such an extension of the scale has narrow practical limits.
  • other preparative systems with cylindrical geometry known from the literature can neither be transferred to a larger scale with radial or axial cooling (Rilbe, H. and Petterson, S., in: Arbuthnott, JP and Beeley, JA Isoelectric Focusing, Butterworth, London 1975, pp. 44-57). It is the object of the present invention to provide a device for preparative electrophoresis which enables the separation of larger amounts of substance.
  • a device for preparative electrophoresis is proposed, which is characterized by a modular structure of the electrolyte chamber from a large number of individual compartments, the compartments being linked by separating elements with membrane-like properties, and each compartment containing a cooling element consisting of capillaries arranged in parallel.
  • An essential component of every compartment - which contains the electrolyte - is a cooling element made up of capillaries, in which thin capillaries are arranged parallel to each other, so that the distance to each other and to the boundary surfaces of the compartment is never more than a few millimeters.
  • the boundary surface of the compartment is formed by the adjacent element (also referred to as a separating element) with the membrane-like properties.
  • the distance between the capillaries is generally between 3 and 10 mm, preferably between 5 and 7 mm.
  • the distance to the next adjacent surface - the separating element between two compartments - should not be more than 5, preferably not more than between 1 and 3 mm, the distance being measured from the surface of the capillary.
  • the diameter of the capillaries should be as small as possible, but due to the
  • the outer diameter of the capillaries is between 1 and 3 mm.
  • capillaries are not electrically conductive
  • Suitable materials from which capillaries can consist are, for example, metals, provided that they are coated on the outside with electrical non-conductors, e.g. with plastics (polyethylene, Teflon etc.), plastics and glass.
  • the cooling of the capillaries is a function of the length
  • Cooling units The cooling principle according to the invention can be used up to a total volume of at least 100 liters and more and is primarily determined by the length of the separation section and the separation time to be used with it. Separation times of over
  • the capillary cooling system according to the invention is also referred to as a dimension-independent cooling system, since it is automatically adapted to the volume of the chamber due to the modular construction of the electrolyte chamber.
  • a compartment forms a structural unit with the cooling element made up of capillaries, the compartment having the following structural features: Opposite side parts together with a base part form a flat frame which is generally open at the top.
  • the height of the side parts and the length of the bottom part can be chosen in a wide range, whereby the height and width of the internal dimensions of the electrophoresis chamber are defined. For example, the height is 30 cm and the width is 40 cm, with the outside dimensions being larger depending on the materials used.
  • Preferred materials are chemically resistant plastics that can be processed mechanically, such as plexiglass and polyethylene.
  • the edges of the opposite side parts together with the edges of the bottom part each form a surface, which is followed by a separating element.
  • the distance between these two surfaces ie the thickness of the side parts and that of the bottom part, is predetermined by the cooling capacity of the capillary cooling system. As a rule, the distance is 2 to 10 mm, preferably 2 to 5 mm.
  • the number of compartments defines the separation performance of the electrophoresis chamber. For a given equal volume of the chamber, a smaller thickness of the compartment means a larger number of compartments and thus at the same time an improved separation performance of the system. A compartment of small thickness should therefore be aimed at, but the capillary cooling system places structural limits on this.
  • the bottom part has an increasing thickness, so that a gradient is created in the interior of the compartment, so that the Electrolyte solution - if necessary together with the separated protein - can be completely emptied via an outlet opening at the lowest point.
  • each side part contains one or more recesses (openings). Due to the modular structure of a multitude of compartments, these cutouts form cooling water channels through which the cooling liquid flows in on one side - through the capillaries - and out of the opposite cooling water channel. It goes without saying that the electrophoresis chamber according to the invention - composed of individual compartments - contains connections so that the cooling water channels can be supplied with cooling liquid.
  • the capillaries of each compartment can be supplied with cooling liquid alone or combined in blocks, separately.
  • the temperature of the cooling liquid can - for example using cryostats - be adapted to the separation problem that arises, for example in a temperature range between 1 to 30 ° C or in low-temperature electrophoresis between -10 to -30 ° C.
  • the preferred temperature range is around 20 ° C.
  • the capillaries are connected to the side parts in such a way that there is contact with the cooling water channel, but no cooling liquid can penetrate into the interior of the electrophoresis chamber.
  • the interfaces between two neighboring compartments are sealed against each other by a separating element. Accordingly, the edges of the side parts and the edges of the bottom part of each compartment are designed in such a way that they fulfill a sealing function and no electrolyte liquid can escape.
  • they can contain sealing profiles made of rubber or another suitable material - such as Teflon or silicone.
  • the separating elements serve to prevent liquid exchange between adjacent compartments, while the proteins to be separated can diffuse, i.e. the separating elements fulfill the function of a membrane.
  • the separating elements fulfill the function of a membrane.
  • Suitable materials are, for example, porous polymer films, ceramic membranes, or technical fabrics that are coated with a very thin gel. Such fabrics are described for example in German Offenlegungsschrift 37 36 087, to which reference is hereby made.
  • REPLACEMENT LEAF Pressure applied pressure fix the gels between the compartments.
  • the area of the gels is dimensioned so that the cooling water channels are not covered.
  • thin frames with a firmly connected fabric, on which the gel can be polymerized are used as separating elements. This embodiment enables a quick construction of the
  • Electrophoresis chamber or an easier exchange of the separating elements. It goes without saying that in this case the frames must have recesses for the cooling water cannula of the same size as the associated compartments.
  • the gels contain additives as can usually be used in electrophoresis. This makes it possible to adapt the electrophoresis chamber according to the invention to the various separation problems posed. For example, when using
  • Polyacrylamide gels additional functional groups are introduced into the gel, as is also known in the art of isoelectric focusing in immobilized pH gradients.
  • the dimensionless capillary cooling system according to the invention can be in various embodiments.
  • the preferred embodiment, in which the capillaries are firmly connected to the side parts of the compartments and are supplied with cooling liquid through cooling water channels, has already been described above.
  • the capillaries of each compartment are connected to form an “endless” capillary and connected to a coolant system.
  • the capillary cooling system is not firmly connected to the compartment.
  • the capillaries are arranged in a flat frame, which also contains the device for supplying and disposing of coolant.
  • the frame is dimensioned so that it can be inserted into the grooves provided in the compartment. It is necessary that the frame with the capillaries is arranged parallel to the interfaces of the compartments.
  • the electrodes (cathode or anode) of the electrophoresis chamber are arranged in the first and last compartments.
  • a "coarse-mesh" mesh (1-3 mm mesh size) made of an inert material (eg plastic) is meandering through a conductive material, preferably a platinum wire. Nets that are braided exclusively from a platinum or platinum-iridium wire are also suitable. Graphite electrodes or titanium platinum electrodes are also suitable.
  • the area of the electrode roughly corresponds to the inner area of the compartments.
  • the two compartments that contain the two electrodes have a significantly larger volume than the other compartments. This avoids excessive foaming.
  • the segmented structure of the electrophoresis chamber according to the invention enables the electrolyte solution of the compartments with the electrodes to have a different composition than the other compartments. For example, a polyol reduce foaming in the region of the electrode "a higher content.
  • the electrophoresis chamber according to the invention is composed of a large number of parts, with compartments and separating elements alternating.
  • the two outer compartments contain the two electrodes.
  • This layered electrophoresis chamber is held together by a tensioning device in order to seal the individual components (compartments and separating elements) in such a way that no electrolyte solution escapes to the outside and no liquid exchange can take place between adjacent compartments.
  • the chamber with a 40-80% solution of a polyol, e.g. Fill glycerin, sucrose, sorbitol or a mixture of these polyols.
  • a polyol e.g. Fill glycerin, sucrose, sorbitol or a mixture of these polyols.
  • the individual compartments are separated from each other using tissue-based polyacrylamide gels.
  • Electrode decantation would cause separated substances to collect in the lower part of the compartments, which would impair the separation and is undesirable.
  • a uniform distribution of the separated substances and electrolytes over the entire cross-section of the compartments is desirable.
  • the pump is excluded via the discharge channel of the individual compartments and the pumped liquid is returned to the upper part of the respective compartments via a hose.
  • Compartmenting with tissue-based polyacrylamide gels offers a number of advantages.
  • Polyacrylamide gels are a matrix that is well known from analytical tests and does not interfere with isoelectric focusing and other electrophoretic separations.
  • the layer thickness of the fabric-supported polyacrylamide gels can be chosen between 0.05-2 mm. In this way it is possible to variably adjust the ratio of the liquid phase to the gel phase in the separation chamber, which can have a decisive influence on the dissolution.
  • the tissue-supported gels are mechanically stable and enable good compartmentation.
  • the tissue-based gels can be washed, dried and rehydrated.
  • the composition of the tissue-supported gels can be chosen as desired within certain degrees of crosslinking.
  • polyacrylamide gels also enables additional functional groups to be introduced into the gel, as is known from the technique of isoelectric focusing in immobilized pH gradients (Görg, A., Fawcett, JS and Chrambach, A, Adv. Electrophoresis 1988, 2 , 1-43).
  • the compartments can contain sensors for measuring important parameters, e.g. pH value, temperature, UV, IR, activity measurement of radioactive labeled samples, conductivity etc.
  • the electrophoresis chamber according to the invention can be fully automated for discontinuous operation if an automatic sample application and sampling is additionally installed.
  • the electrophoresis chamber according to the invention is usually operated in a horizontal position. However, if the frames of the compartments are closed on all sides - with the exception of an opening for filling and emptying the compartment - the electrophoresis chamber can also be operated vertically.
  • One or more compartments of the compartments filled with electrolyte solution are emptied and filled with a mixture of the sample to be separated and the electrolyte solution.
  • the course of the separation can either be followed by taking direct samples from the individual compartments or, if the compartments contain suitable sensors, by means of the measurement data obtained.
  • the separated samples are isolated by simply emptying the relevant compartments.
  • the fractionation of carrier apholytes is an important sub-step in the production of carrier ampholytes for isoelectric focusing.
  • a high-resolution separation chamber it should be possible to produce narrow pH ranges of carrier ampholytes with better defined properties than was possible with the previously usual methods.
  • Such narrow pH ranges of carrier ampholytes are important for separations in which high resolution is required, such as is the case when examining genetic markers.
  • the electrophoresis chamber according to the invention is characterized by a modular structure.
  • the compartments (2) are arranged one after the other, the separating elements which are located between two Ko artimenten not shown in this drawing.
  • the compartments containing the electrodes (3) there are two stable end blocks (4) which have devices (5) for receiving two guide rails (6).
  • the plates, the guide rails and the end part (8) allow the individual compartments to be fixed, so that a liquid-tight electrophoresis chamber is formed.
  • the guide rails can, if they are designed as a round rod or as a tube, contain a thread.
  • the end piece (8) is put on and screwed with the nuts, whereby the required pressure is exerted on the electrophoresis chamber via the end piece which can move on the guide rails.
  • the end blocks (4) also serve to seal the recesses (7) for the two cooling water channels so that the cooling liquid does not leak.
  • the end blocks also contain devices (9) for connecting the capillary cooling system (11) to a cryostat or another coolant supply (not shown in the drawing). Seals (12) between the compartments (2) prevent liquid from escaping.
  • the recesses (7) form two opposite coolant channels.
  • the electrical leads to the electrodes are also not shown in the drawing.
  • the cohesion of the compartments can of course be achieved by means of appropriate technically equivalent devices.
  • compartments are only shown in elevation in order to show the structure of the electrophoresis chambers according to the invention more clearly.
  • the chamber consists of at least 5 compartments, as a smaller number is possible, but only makes sense in exceptional cases from the point of view of the separation performance. Shortened separation sections with 5 or fewer compartments are useful if they are used in so-called cascades.
  • the sample is first separated in a first electrophoresis chamber, the content of a compartment subsequently being fractionated further in a further electrophoresis chamber. This process can be repeated several times.
  • the combination of several electrophoresis chambers with a small number of compartments in a cascade enables, for example, the rapid separation of a protein mixture.
  • Figure 2 shows a section through a compartment (2) with a permanently installed capillary cooling system.
  • Two side parts (14) and a bottom part (15) are connected to form a frame (16).
  • the bottom part has a different thickness, at the lowest point there is a closable drainage channel (17), via which a multi-channel pump can also be connected in order to circulate the contents of the individual compartments to avoid electrode decantation. Openings (7) are provided in the side parts.
  • the cooling water channels are thus formed by combining several frame parts.
  • the capillaries (18) are firmly connected to the side parts (14).
  • Figure 3 shows a section through a compartment (2) with subdivided openings (7a) and (7b) to form separate coolant channels. For more effective cooling, they can be charged with cooling liquid in opposite directions, for example.
  • Figure 4 shows a separating element (19) with a permanently installed tissue-supported gel (20).
  • the side parts (21) contain cutouts (22) for the formation of cooling water channels.
  • the side parts (21), the bottom part (25) and an upper part (23) form a fixed frame (24) to support the tissue on which the gel is polymerized.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Elektrophoresekammer mit modularem Aufbau und einem dimensionsunabhängigen Kapillarkühlsystem.

Description

Vorrichtung für die pr parative Elektrophorese
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung für die praparative Elektrophorese und insbesondere ein dimensions-unabhängiges Kühlsystem für diese Vorrichtung.
Die Elektrophorese ist die zur Zeit leistungsfähigste analytische Methode für die Trennung von Proteinen. Man kennt auch zahlreiche Techniken der präparativen Elektrophorese, die jedoch überwiegend für Trennungen in einem Maßstab von Milligramm-Mengen von Proteinen eingesetzt werden. Ein Hauptproblem bei der Maßstabserweiterung ("scale upM) ist die Ableitung der beim Stromdurchgang entstehenden Joule'sehen Wärme. Eine besonders erfolgreiche Technik ist die praparative isoelektrische Fokussierung in Schichten granulierter Gele, mit deren Hilfe Gramm-Mengen von Proteinen mit hoher Auflösung getrennt werden konnten (Radola, B.J., Methods Enzymol. 1984, 104, 256-275).
In diesem Trennsystem ist die Schichtdicke auf ca. 1 cm begrenzt, auch kann die Trennstrecke nicht verlängert werden, so daß das Trennvolumen lediglich durch Variation der Breite der Schicht vergrößert werden kann. Einer solchen Maßstabserweiterung sind aber enge praktische Grenzen gesetzt. Auch andere aus der Literatur bekannte praparative Systeme mit zylindrischer Geometrie lassen sich weder bei radialer noch axialer Kühlung in einen größeren Maßstab übertragen (Rilbe, H. und Petterson, S., in: Arbuthnott, J.P. und Beeley, J.A. Isoelectric Focusing, Butterworth, London 1975, pp. 44 - 57). Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung für die pr parative Elektrophorese zur Verfügung zu stellen, die die Trennung von größeren Substanzmengen ermöglicht.
ERSATZBLAT Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zur präparativen Elektrophorese vorgeschlagen, die durch einen modularen Aufbau der Elektrolytkammer aus einer Vielzahl von einzelnen Kompartimenten gekennzeichnet ist, wobei die Kompartimente durch Trennelemente mit membranartigen Eigenschaften verknüpft sind, und wobei jedes Kompartiment ein aus parallel angeordneten Kapillaren bestehendes Kühlelement enthält.
Ein wesentlicher Bestandteil jedes Kompartiments - das den Elektrolyten enthält - ist ein aus Kapillaren aufgebautes Kühlelement, bei dem dünne Kapillaren parallel zueinander angeordnet sind, so daß der Abstand zueinander wie auch zu den Begrenzungsflächen des Kompartiments an keiner Stelle mehr als wenige Millimeter beträgt. Die Begrenzungsfläche des Kompartiments wird durch das angrenzende Element (auch als Trennelement bezeichnet) mit den membranartigen Eigenschaften gebildet. Im allgemeinen beträgt der Abstand der Kapillaren zueinander zwischen 3 und 10 mm, bevorzugt zwischen 5 und 7 mm. Der Abstand zur nächsten angrenzenden Fläche - dem Trennelement zwischen zwei Kompartimenten - sollte nicht mehr als 5, bevorzugt nicht mehr als zwischen 1 und 3 mm betragen, wobei der Abstand von der Oberfläche der Kapillare aus gemessen wird. Der Durchmesser der Kapillaren sollte möglichst gering sein, wobei jedoch infolge der
Materialeigenschaften und eines - zur Aufrechterhaltung eines effektiven Kühlflüssigkeitstransportes notwendigen - inneren Durchmessers technische Grenzen gesetzt sind. Im allgemeinen beträgt der äußere Durchmesser der Kapillaren zwischen 1 und 3 mm.
Eine wichtige Anforderung an die Eigenschaften der Kapillaren ist, daß sie elektrisch nicht leitend sind
ERSATZB und sich gegenüber den eingesetzten Chemikalien (Elektrolyt, Protein etc.) neutral und beständig verhalten.
Geeignete Materialien, aus denen Kapillaren bestehen können, sind beispielsweise Metalle, soweit sie außen mit elektrischen Nichtleitern beschichtet sind, so z.B. mit Kunstsoffen (Polyethylen, Teflon etc.), Kunststoffe und Glas.
Die Kühlung der Kapillaren ist eine Funktion der Länge,
Wandstärke, Wärmeleitfähigkeit des Materials, der
Durchflußgeschwindigkeit und Leistung der
Kühlaggregate. Das erfindungsgemäße Kühlprinzip kann bis zu einem Gesamtvolumen von mindestens 100 Litern und mehr eingesetzt werden und wird in erster Linie durch die Länge der Trennstrecke und die damit aufzuwendende Trennzeit bestimmt. Trennzeiten von über
24 Stunden erscheinen nur bei besonderen
Problemstellungen gerechtfertigt. Die Kühlleistung wurde in Kompartimenten mit unterschiedlicher Anordnung der Kapillaren (Abstand, Länge, Durchmesser, Material,
Durchflußgeschwindigkeit der Kühlflüssigkeit,
Schichthöhe) überprüft. Temperaturmessungen bei unterschiedlicher Belastung des Systems haben gezeigt, daß die Temperatur im ganzen System, auch an kritischen
Stellen z.B. in der Nähe von Elektroden, bis zu einer
3 Belastung von 0,3-0,4 Watt/cm konstant ist. Diese
Wattbelastung übertrifft um ein Vielfaches die bei der
Elektrophorese zu erwartende Wärmeentwicklung.
Das erfindungsgemäße Kapillarkühlsystem wird auch als dimensions-unabhängiges Kühlsystem bezeichnet, da es infolge des modularen Aufbaus der Elektrolytkammer automatisch dem Volumen der Kammer angepaßt ist.
ERSATZBLATT In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform bildet ein Kompartiment mit dem aus Kapillaren aufgebautem Kühlelement eine konstruktive Einheit, wobei das Kompartiment folgende konstruktiven Merkmale aufweist: Gegenüberliegende Seitenteile bilden zusammen mit einem Bodenteil einen flachen Rahmen, der im allgemeinen nach oben offen ist. Die Höhe der Seitenteile und die Länge des Bodenteils können in weiten Bereichen beliebig gewählt werden, wobei hiermit die Höhe und Breite der Innenmaße der Elektrophoresekammer definiert ist. Beispielsweise beträgt die Höhe 30 cm und Breite 40 cm, wobei die Außenmaße je nach eingesetzten Werkstoffen größer sind. Bevorzugte Werkstoffe sind chemisch resistente Kunststoffe,- die sich mechanisch gut verarbeiten lassen, wie z.B. Plexiglas und Polyethylen. Die Kanten der gegenüberliegenden Seitenteile bilden zusammen mit den Kanten des Bodenteils jeweils eine Fläche, an die sich ein Trennelement anschließt. Der Abstand dieser beiden Flächen voneinander, d.h. die Dicke der Seitenteile und die des Bodenteils, ist durch die Kühlleistung des Kapillar-Kühlsystems vorgegeben. In der Regel beträgt der Abstand 2 bis 10 mm, bevorzugt 2 bis 5 mm. Die Anzahl der Kompartimente definiert die Trennleistung der Elektrophoresekammer. Bei vorgegebenem gleichen Volumen der Kammer bedeutet eine geringere Dicke des Kompartiments eine größere Anzahl von Kompartimenten und damit gleichzeitig eine verbesserte Trennleistung des Systems. Anzustreben ist somit ein Kompartiment geringer Dicke, jedoch sind diesem durch das Kapillarkühlsystem konstruktive Grenzen gesetzt.
In einer besonderen Ausführungsform weist das Bodenteil eine zunehmende Stärke auf, so daß im Innern des Kompartiments ein Gefälle entsteht, so daß die Elektrolytlösung - gegebenenfalls zusammen mit dem getrennten Protein - vollständig über eine am tiefsten Punkt angebrachte Auslaßöffnung entleert werden kann.
Für den Fall, daß das Kompartiment und das aus Kapillaren gebildete Kühlelement eine konstruktive Einheit bilden (Abb.2), enthält jedes Seitenteil eine oder mehrere Aussparung(en) (Öffnungen). Durch den modularen Aufbau aus einer Vielzahl von Kompartimenten werden durch diese Aussparungen Kühlwasserkanäle gebildet, durch die die Kühlflüssigkeit auf einer Seite einströmt - durch die Kapillaren hindurch - und aus dem gegenüberliegenden Kühlwasserkanal herausströmt. Es ist selbstverständlich, daß die erfindungsgemäße - aus einzelnen Kompartimenten zusammengesetzte - Elektrophoresekammer Anschlüsse enthält, damit die Kühlwasserkanäle mit Kühlflüssigkeit versorgt werden können.
Wenn es erwünscht oder erforderlich ist, die Kühlleistung zu erhöhen, können die Kapillaren jedes Kompartiments allein oder in Blöcken zusammengefaßt, separat mit Kühlflüssigkeit versorgt werden. Die Temperatur der Kühlflüssigkeit kann - beispielsweise unter Verwendung von Kryostaten - dem sich ergebenden Trennproblem angepaßt werden, beispielsweise in einen Temperaturbereich zwischen 1 bis 30°C oder bei Tieftemperaturelektrophorese zwischen -10 bis -30°C. Bei Trennungen in Gegenwart hoher Polyolkonzentraten liegt der bevorzugte Temperaturbereich um 20°C.
Die Kapillaren sind so mit den Seitenteilen verbunden, daß ein Kontakt zu dem Kühlwasserkanal besteht, jedoch keine Kühlflüssigkeit in das innere der Elektro¬ phoresekammer dringen kann.
ERSATZ Die Grenzflächen zweier benachbarter Kompartimente werden gegeneinander durch ein Trennelement abgedichtet. Dementsprechend sind die Kanten der Seitenteile und die Kanten des Bodenteils jedes Kompartiments so gestaltet, daß sie eine abdichtende Funktion erfüllen und keine Elektrolyt-Flüssigkeit austreten kann. Sie können beispielsweise Dichtungsprofile aus Gummi oder einem anderen geeigneten Material - z.B. Teflon oder Silicon - enthalten.
Die Trennelemente dienen dazu, einen Flüssigkeitsaustausch zwischen benachbarten Kompartimenten zu unterbinden, während die zu trennenden Proteine diffundieren können, d.h. die Trennelemente erfüllen die Funktion einer Membran. Stoffe, die diese Membranfunktion aufweisen und zudem ausreichend mechanisch stabil sind, können verwendet werden. Geeignete Materialien sind beispielsweise poröse Polymerfilme, keramische Membranen, oder technische Gewebe, die mit einem sehr dünnen Gel überzogen sind. Solche Gewebe sind beispielsweise in der deutschen Offenlegungsschrift 37 36 087 beschrieben, auf die hiermit inhaltlich Bezug genommen wird.
Besonders bevorzugt sind ultradünne gewebegestützte Polyacrylamidgele oder Agarosegele mit einer Stärke von ca. 50 μm bis 2 mm, bevorzugt 50 bis 100 μm. Solche dünnen gewebegestützten Gele können direkt zwischen zwei Kompartimente gelegt werden, ohne daß weitere konstruktive Maßnahmen zur Aufnahme eines Trennelements notwendig sind. Infolge des durch eine äußere
RSATZBLATT Spannvorrichtung ausgeübten Druckes sind die Gele zwischen den Kompartimenten fixiert. Die Fläche der Gele ist so dimensioniert, daß die Kühlwasserkanäle nicht verdeckt werden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist es vorgesehen, als Trennelemente dünne Rahmen mit einem fest verbundenen Gewebe zu verwenden, auf dem das Gel aufpolymerisiert werden kann. Diese Ausführungsform ermöglicht einen schnellen Aufbau der
Elektrophoresekammer, bzw. einen einfacheren Austausch der Trennelemente. Es ist selbstverständlich, daß die Rahmen in diesem Fall gleichgroße Aussparungen für die Kühlwasserkanüle aufweisen müssen, wie die dazugehörigen Kompartimente.
Es ist möglich, daß die Gele Zusatzstoffe, wie sie bei der Elektrophorese üblicherweise eingesetzt werden können, enthalten. Hierdurch ist es möglich, die erfindungsgemäße Elektrophoresekammer den gestellten, vielfältigen Trennproblemen anzupassen. So können beispielsweise bei der Verwendung von
Polyacrylamidgelen zusätzliche funktioneile Gruppen in das Gel eingeführt werden, wie dies auch in der Technik der isoelektrischen Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten bekannt ist.
Das erfindungsgemäße dimensionslose Kapillarkühlsystem kann in verschiedenen Ausführungsformen vorliegen. Die bevorzugte Ausführungsform, bei der die Kapillaren fest mit den Seitenteilen der Kompartimente verbunden sind und durch Kühlwasserkanäle mit Kühlflüssigkeit versorgt werden, wurde bereits oben beschrieben.
ERSAT In einer anderen Ausführungsform sind die Kapillaren jedes Kompartiments zu einer "endlos" Kapillaren verbunden und an ein Kühlflüssigkeitssystem angeschlossen.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Kapillarkühlsystem nicht fest mit dem Kompartiment verbunden. Die Kapillaren sind in einem flachen Rahmen, der auch die Vorrichtung zur Kühlflüssigkeitsversorgung und Kühlflüssigkeitsentsorgung enthält, angeordnet. Der Rahmen ist so dimensioniert, daß er in vorgesehene Nuten des Kompartiments eingeschoben werden kann. Es ist notwendig, daß der Rahmen mit den Kapillaren parallel zu den Grenzflächen der Kompartimente angeordnet ist.
Im ersten und letzten Kompartiment sind die Elektroden (Kathode bzw. Anode) der Elektrophoresekammer angeordnet. Obwohl die Ausführung der Elektroden im Rahmen üblicher Ausführungsformen variiert werden kann, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, eine netzartig aufgebaute Elektrode einzusetzen. Ein "grobmaschiges" Netz (1-3 mm Maschenweite) aus einem inerten Material (z.B. Kunststoff), wird meanderförmig von einem leitenden Material, bevorzugt einem Platindraht, durchzogen. Geeignet sind ebenfalls Netze, die ausschließlich aus einem Platin- oder Platin- Iridium-Draht geflochten sind. Geeignet sind auch Graphit-Elektroden oder Titan-Platin-Elektroden. Die Fläche der Elektrode entspricht in etwa der Innenfläche der Kompartimente. Aufgrund der hohen Feldstärke zwischen 50 ml bis 200 Volt/cm, und der damit verbundenen Gasentwicklung im Elektrodenraum ist es vorteilhaft, wenn die beiden Kompartimente, die die beiden Elektroden enthalten, ein wesentlich größeres Volumen aufweisen als die anderen Kompartimente. Hierdurch wird zu starkes Schäumen vermieden. Der segmentierte Aufbau der erfindungsgemäßen Elektrophoresekammer ermöglicht es, daß die Elektrolytlösung der Kompartimente mit den Elektroden eine andere Zusammensetzung aufweisen als die anderen Kompartimente. So kann beispielsweise ein höherer Gehalt eines Polyols das Schäumen im Bereich der Elektroden "herabsetzen.
Die erfindungsgemäße Elektrophoresekammer wird aus einer Vielzahl von Teilen zusammengesetzt, wobei Kompartimente und Trennelemente abwechseln. Die beiden äußeren Kompartimente enthalten die beiden Elektroden. Diese schichtartig aufgebaute Elektrophoresekammer wird durch eine Spannvorrichtung zusammengehalten, um die einzelnen Bauteile (Kompartimente und Trennelemente) so abzudichten, daß keine Elektrolytlösung nach außen dringt und auch kein Flüssigkeitsaustausch zwischen benachbarten Kompartimenten erfolgen kann.
Bei der erfindungsgemäßen Elektrophoresekammer hat sich als vorteilhaft erwiesen zur antikonvektiven Stabilisierung der aufgetrennten Substanzen die Kammer mit einer 40-80% Lösung eines Polyols, z.B. Glycerin, Saccharose, Sorbit oder einem Gemisch dieser Polyole zu füllen. Die einzelnen Kompartimente werden voneinander mit gewebegestützten Polyacrylamidgelen getrennt. Bei dieser antikonvektiven Stabilisierung ist es möglich, während der Trennung aus allen Segmenten Proben zu entnehmen und nach der Trennung die Proteine ohne störende Vermischung leicht zu eluieren. Bereits bei der Einführung der isoelektrischen Fokussierung in von Polyol-Dichtegradienten stabilisierten pH Gradienten wurde gezeigt, daß hohe Polyolkonzentrationen mit der Durchführung der Elektrophorese kompatibel sind.
ER Inbesondere bei hoher Substanzbeladung der Kammer kann es erforderlich sein, den Inhalt der einzelnen Kompartimente mit Hilfe einer Mehrkanalpumpe ständig umzuwälzen, um auf diese Weise einer Elektrodekantation vorzubeugen. Durch Elektrodekantation würden sich aufgetrennte Substanzen im unteren Teil der Kompartimente ansammeln, was die Trennung beeinträchtigen würde und unerwünscht ist. Für eine optimale Trennung ist eine über den gesamten Querschnitt der Kompartimente gleichmäßige Verteilung der aufgetrennten Substanzen und Elektrol te wünschenswert. Die Pumpe wird über den Abflußkanal der einzelnen Kompartimente ausgeschlossen und die umgepumpte Flüssigkeit über einen Schlauch in den oberen Teil der jeweiligen Kompartimente zurückgeführt.
Die Kompartimentierung mit gewebegestützten Polyacrylamidgelen bietet eine Reihe von Vorteilen. Polyacrylamidgele sind eine aus analytischen Versuchen bestens bekannte Matrix, die die isoelektrische Fokussierung und andere elektrophoretische Trennungen nicht stört. Die Schichtdiche der gewebegestützten Polyacrylamidgele kann zwischen 0.05-2 mm beliebig gewählt werden. Auf diese Weise ist es möglich, das Verhältnis der flüssigen Phase zur Gelphase in der Trennkammer variabel einzustellen, was einen entscheidenden Einfluß auf die Auflösung haben kann. Die gewebegestützten Gele sind mechanisch stabil und ermöglichen eine gute Kompartimentierung. Die gewebegestützten Gele können gewaschen, getrocknet und rehydratiert werden. Die Zusammensetzung der gewebegestützten Gele kann innerhalb bestimmter Vernetzungsgrade beliebig gewählt werden. Die Verwendung von Polyacrylamidgelen ermöglicht es auch, zusätzliche funktionelle Gruppen in das Gel einzuführen, wie dies von der Technik der isoelektrischen Fokussierung in immobilisierten pH Gradienten bekannt ist (Görg, A., Fawcett, J.S und Chrambach, A, Adv. Electrophoresis 1988, 2, 1-43).
Die Kompartimente können Sensoren zum Messen wichtiger Parameter enthalten, wie z.B. pH-Wert, Temperatur, UV, IR, Aktivitätsmessung radioaktiv markierter Proben, Leitf higkeit u.a. Die erfindungsgemäße Elektrophoresekammer kann für den diskontinuierlichen Betrieb vollautomatisiert werden, wenn zusätzlich eine automatische Probenauftragung und Probenentnahme installiert wird.
Üblicherweise wird die erfindungsgemäße Elektrophoresekammer in horizontaler Lage betrieben. Sind die Rahmen der Kompartimente jedoch allseitig geschlossen - mit Ausnahme einer Öffnung zum Füllen und Entleeren des Kompartiments - kann die Elektrophoresekammer auch vertikal betrieben werden.
Um beispielsweise ein Protein zu trennen, wird wie folgt vorgegangen:
Von den mit Elektrolytlösung gefüllten Kompartimenten wird ein oder mehrere Kompartiment(e) geleert und mit einer Mischung der zu trennenden Probe und Elektrolytlösung gefüllt. Der Verlauf der Trennung kann entweder durch direkte Probenentnahme aus den einzelnen Kompartimenten verfolgt werden, oder aber sofern die Kompartimente geeignete Sensoren enthalten durch die erhaltenen Meßdaten. Die Isolierung der getrennten Proben erfolgt durch einfaches Entleeren der betreffenden Kompartimente.
ERSATZBLATT 12
Bei der isoelektrischen Fokussierung können alle Kompartimente entleert werden, um dann mit Probenlösung aufgefüllt zu werden. Im elektrischen Feld erfolgt dann die Auftrennung der Probe gemäß den isoelektrischen Punkten der einzelnen Komponenten.
Die Fraktionierung von Trägera pholyten ist ein wichtiger Teilschritt bei der Herstellung von Trägerampholyten für die isoelektrische Fokussierung. Mit einer hochauflösenden Trennkammer sollte es möglich sein, enge pH-Bereiche von Trägerampholyten, mit besser definierten Eigenschaften als dies mit den bisher üblichen Verfahren möglich war, herzustellen. Solche enge pH-Bereiche von Trägerampholyten sind wichtig bei Auftrennungen, in denen ein hohe Auflösung gefragt ist, wie es z.B. bei der Untersuchung genetischer Marker der Fall ist.
In mehreren Versuchen wurden Syntheseansätze der Trägerampholyte fraktioniert und die isolierten Fraktionen in analytischen Fokussierungsversuchen geprüft. Dank der ausgezeichneten Kühlleistung der neuen Trennkammer konnte der konzentrierte Syntheseansatz (35%) direkt, d.h. ohne Verdünnung, fraktioniert werden, was die bisher übliche, teure Aufkonzentrierung der verdünnt fraktionierten Trägerampholyte einsparen konnte. Nach einer Trennzeit von 44 h zeige der pH Gradient einen annähernd linearen Verlauf, mit einem für diesen pH Bereich charakteristischen Minimum der Leitfähigkeit beim neutralen pH. Bei der analytischen Refokussierung decken sich die im Gel gemessenen pH Gradienten mit den im präparativen Versuch isolierten pH Bereich, mit zum Teil ausgezeichneter Linearität über einen engen pH Bereich (z.B. der Bereich pH 3-4). Die Fraktionierung von Trägerampholyten zeigt, daß es in der neuen Trennkammer möglich ist, Trennungen auch bei hoher Leitfähigkeit der Probe oder der Pufferelektrolyte durchzuführen. Solche Trennungen könnten auch bei anderen niedermolekularen Substanzen von Interesse sein.
Für die Auftrennung verschiedener Proteine müssen jeweils der pH'Gradient und das Vh Produkt optimiert werden. Dies setzt eine Stabilität der pH Gradienten im elektrischen Feld voraus. In einem Versuch in pH 4-9 Servalyt Trägerampholyten war der pH Gradient für Vh Produkte von 6000 - 13000 Vh konstant. Bei präparativer Refokussierung enger pH Bereiche deckt sich der pH Bereich mit dem ursprünglich isolierten Bereich. Dieser Versuch zeigt, daß eine Kaskadenfokussierung in zwei und mehr Schritten möglich ist, was die Auflösung bei schwer trennbaren Komponenten entscheidend verbessern könnte.
Wie in der Abbildung 1 dargestellt, ist die erfindungsgemäße Elektrophoresekammer durch einen modularen Aufbau gekennzeichnet. Auf einer Bodenplatte (1) sind die Kompartimente (2) nacheinander angeordnet, wobei in dieser Zeichnung die Trennelemente, die sich zwischen zwei Ko artimenten befinden, nicht dargestellt sind. Im Anschluß an die Kompartimente, die die Elektroden (3) enthalten, befinden sich zwei stabile Endblöcke (4), die Vorrichtungen (5) zur Aufnahme zweier Führungsschienen (6) aufweisen. Die Platten, die Führungsschienen und das Endteil (8) ermöglichen eine Fixierung der einzelnen Kompartimente, so daß eine flüssigkeitsdichte Elektrophoresekammer gebildet wird. Die Führungsschienen können, sofern sie als runden Stab oder als Rohr ausgebildet sind, ein Gewinde enthalten.
ERSATZB Das Endstück (8) wird aufgesteckt und mit den Muttern verschraubt, wodurch der erforderliche Druck über das auf den Führungsschienen bewegliche Endstück auf die Elektrophoresekammer ausgeübt wird. Die Endblöcke (4) dienen gleichzeitig dazu, die Aussparungen (7) für die beiden Kühlwasserkanäle abzudichten, damit die Kühlflüssigkeit nicht ausläuft. Ebenfalls enthalten die Endblöcke Vorrichtungen (9), um das Kapillarkühlsystem (11) an einen Kryostaten oder eine andere Kühlflüssigkeitsversorgung anzuschließen (in der Zeichnung nicht dargestellt). Dichtungen (12) zwischen den Kompartimenten (2) verhindern, daß Flüssigkeit austritt. Die Aussparungen (7) bilden zwei gegenüberliegende Kühlflüssigkeitskanäle. Die elektrischen Zuleitungen zu den Elektroden sind in der Zeichnung ebenfalls nicht abgebildet. Der Zusammenhalt der Kompartimente kann selbstverständlich durch entsprechende technisch äquivalente Vorrichtungen hergestellt werden.
Die Kompartimente sind - bis auf eine Ausnahme - nur im Aufriß abgebildet, um den Aufbau der erfindungsgemäßen Elektrophoresekammern deutlicher darzustellen.
Im Allgemeinen besteht die Kammer aus mindestens 5 Kompartimenten, da eine geringere Anzahl zwar möglich, aber aus Sicht der Trennleistung nur in Ausnahmef llen sinnvoll ist. Verkürzte Trennstrecken mit 5 oder weniger Kompartimenten sind dann sinnvoll, wenn sie in sogenannten Kaskaden eingesetzt werden. In einer ersten Elektrophoresekammer erfolgt eine erste Auftrennung der Probe, wobei anschließend der Inhalt eines Kompartiments in einer weiteren Elektrophoresekammer weiter fraktioniert wird. Dieser Vorgang kann mehrmals wiederholt werden. Die Kombination mehrer Elektrophoresekammern mit einer geringen Anzahl von Kompartimenten zu einer Kaskade ermöglicht beispielsweise die schnelle Auftrennung eines Proteingemisches.
In Abbildung 2 ist ein Schnitt durch ein Kompartiment (2) mit fest eingebautem Kapillarkühlsystem dargestellt. Zwei Seitenteile (14) und ein Bodenteil (15) sind zu einem Rahmen (16) verbunden. Das Bodenteil weist eine unterschiedliche Dicke auf, am tiefsten Punkt befindet sich ein verschließbarer Abflußkanal (17), über den auch eine Mehrkanalpumpe angeschlossen werden kann, um den Inhalt der einzelnen Kompartimente zur Vermeidung einer Elektrodekantation umzuwälzen. In den Seitenteilen sind Öffnungen (7) vorhanden. Durch die Kombination mehrerer Rahmenteile werden somit die Kühlwasserkanäle gebildet. Die Kapillaren (18) sind fest mit den Seitenteilen (14) verbunden.
Abbildung 3 zeigt einen Schnitt durch ein Kompartiment (2) mit unterteilten Öffnungen (7a) und (7b) zur Ausbildung getrennter Kühlflüssigkeitskanäle. Zur effektiveren Kühlung können diese beispielsweise gegenläufig mit Kühlflüssigkeit beschickt werden. Abbildung 4 zeigt ein Trennelement (19) mit einem fest eingebauten gewebegestützten Gel (20). Die Seitenteile (21) enthalten Aussparungen (22) zur Bildung von Kühlwasserkanälen. Die Seitenteile (21), das Bodenteil (25) und ein oberes Teil (23) bilden einen festen Rahmen (24), um das Gewebe, auf dem das Gel aufpolymerisiert ist, zu stützen.

Claims

Patentansprüche
1) Vorrichtung für die praparative Elektrophorese, gekennzeichnet durch einen modularen Aufbau der Elektrolytkammer aus einer Vielzahl von Kompartimenten, wobei die einzelnen Kompartimente durch Elemente (Trennelemente) mit membranartigen Eigenschaften voneinander getrennt sind und jedes Kompartiment ein aus parallel angeordneten Kapillaren bestehendes Kühlelement enthält.
2) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trennelement aus einem Polymerfilm mit membranartigen Eigenschaften besteht.
3) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trennelement aus einem gewebegestützten Polyacrylamid- oder Agarosegel besteht.
4) Dimensions-unabhängiges Kühlsystem für die pr parative Elektrophorese, dadurch gekennzeichnet, daß es parallel angeordnete Kühlkapillaren geringen Außendurchmessers in geringem Abstand zueinander angeordnet enthält.
5) Dimensions-unabhängiges Kühlsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillaren aus Stahl bestehen und mit einem elektrisch nichtleitenden Material überzogen sind.
6) Dimensionsunabhängiges Kühlsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillaren aus Kunststoff bestehen. 7) Elektrophoresekammer, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus
a) mindestens 5 - mit parallel angeordneten Kühlkapillaren geringen Abstandes versehenen - Kompartimenten,
b) zwei Kompartimenten, zur Aufnahme der Elektroden,
c) einer Vorrichtung für die Versorgung der Kapillaren mit Kühlflüssigkeit, und"
d) einer Vorrichtung zum Zusammenhalt der Kompartimente
besteht.
8) Elektrophoresekammer gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie Vorrichtungen" zum Durchmischen des Elektrolyten in den einzelnen Kompartimenten zur Vermeidung der Elektrodekantation enthält.
9) Elektrophoresekammer nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mehrkanalpumpe zur Durchmischung des Elektrolyten in den einzelnen Kompartimenten zur Vermeidung der
Elektrodekantation in den einzelnen Kompartimenten enthält.
ERSATZ
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