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WO1992006764A1 - Procede et dispositif de separation de cellules a partir d'un milieu de culture fluide - Google Patents

Procede et dispositif de separation de cellules a partir d'un milieu de culture fluide Download PDF

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Publication number
WO1992006764A1
WO1992006764A1 PCT/BE1991/000072 BE9100072W WO9206764A1 WO 1992006764 A1 WO1992006764 A1 WO 1992006764A1 BE 9100072 W BE9100072 W BE 9100072W WO 9206764 A1 WO9206764 A1 WO 9206764A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
filter
cells
fluid medium
agitation
culture
Prior art date
Application number
PCT/BE1991/000072
Other languages
English (en)
Inventor
Alain Miller
Dominique Dubois
Original Assignee
Alain Miller
Dominique Dubois
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alain Miller, Dominique Dubois filed Critical Alain Miller
Publication of WO1992006764A1 publication Critical patent/WO1992006764A1/fr

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D33/00—Filters with filtering elements which move during the filtering operation
    • B01D33/06—Filters with filtering elements which move during the filtering operation with rotary cylindrical filtering surfaces, e.g. hollow drums
    • B01D33/073—Filters with filtering elements which move during the filtering operation with rotary cylindrical filtering surfaces, e.g. hollow drums arranged for inward flow filtration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D33/00—Filters with filtering elements which move during the filtering operation
    • B01D33/58—Handling the filter cake in the filter for purposes other than for regenerating the filter cake remaining on the filtering element
    • B01D33/68—Retarding cake deposition on the filter during the filtration period, e.g. using stirrers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2201/00—Details relating to filtering apparatus
    • B01D2201/28—Position of the filtering element
    • B01D2201/287—Filtering elements with a vertical or inclined rotation or symmetry axis

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating cells from a fluid culture medium, comprising an immersion in the fluid medium of a filter having a tubular envelope capable of filtering at least a fraction of said cells, a entrainment of this filter in a direction of rotation about its longitudinal axis, separation by filtration of a filtrate inside the filter casing and a retentate outside of it, a withdrawal of the filtrate out of the filter, and agitation of the fluid medium, simultaneously with filtration.
  • a device for separating cells from a fluid culture medium comprising a tank in which the fluid medium is contained, a means for filtering the fluid medium in the form of a filter immersed in the latter and having a filtering tubular casing, capable of filtering at least a fraction of said cells, means for rotating this filter around its longitudinal axis, means for withdrawing from the filter a filtrate which has reached the inside of the tubular filtering casing, and a means for agitating the fluid medium, capable of operating simultaneously by means of filtration.
  • the invention relates in particular to the agitation of fluids used in fermentative processes in a bioreactor, and the retention of a biomass inside the bioreactor. It allows in particular to concentrate the biomass inside the bioreactor while maintaining a continuous and efficient mixing of the fluid.
  • cells By cells is meant the cells themselves (microorganisms, animal or plant cells, isolated or associated), or a matrix serving to support the cells (in particular macroscopic supports, full or hollow microsupports, carrageenan beads or d alginate, encapsulation matrices, particles serving as a substrate nutrient with which cells are associated).
  • separation of cells is meant, starting from a fluid containing cells within the meaning of the invention suspended or suspended by stirring, obtaining two fluids which can be collected separately, one containing cells and the other does not or one which differs from the other by the size and / or the concentration of cells which it contains in suspension.
  • the invention relates more particularly to the stages of culture and concentration of animal cells in a bio-reactor, for the production of different types of biological materials.
  • materials obtained from cell culture mention may be made of the cells themselves, the cellular components, the viruses or viral proteins, the viral or bacterial vaccines, the monoclonal antibodies, the proteins resulting from the manipulation of the cell genome.
  • the invention will be described below with reference to the culture of animal cells.
  • a bioreactor is an enclosure in which the cells are subjected to an environment which can be controlled, and which corresponds to the physiological requirements of the cells: the parameters controlled are for example the temperature, the supply of nutritive agents, the withdrawal of products from the metabolism, oxygenation of the culture medium, acid-base balance, oxidation-reduction balance, turbulence and shear forces, cell concentration, pressure.
  • the stirring is carried out by a stirring mobile immersed in the fluid, and the mobile is set in motion by a motor, or contains a magnetic bar set in motion by a magnetic stirrer ( small volume tanks)
  • a stirring mobile immersed in the fluid
  • the mobile is set in motion by a motor, or contains a magnetic bar set in motion by a magnetic stirrer ( small volume tanks)
  • A. PROKOP et cons. Bioreactor for ammalian Cell Culture, in FIECHTER A., Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, 39, p. 29-71, Springer-Verlag, Berlin, 1989.
  • the expected performances of the stirring system are in particular the maintenance in suspension of the biomass, the homogenization of the concentrations in the fluid, the contact between phases
  • the substantial concentration of cells inside the bioreactor itself constitutes for these reasons an appreciable reduction in the investment and operating costs of the first steps downstream of the bioreactor, an improvement in the safety of particle separation, an improvement in the quality of the cells harvested, and a reduction in the total duration of the process.
  • the present invention aims to develop a method and a device for cell separation, which do not have the drawbacks of the methods and devices according to the prior art. She must . in particular to allow the separation of cells by remedying the agitation difficulties encountered with current means.
  • this process must be able to be applied to the various modes of culture. existing, traditionally classified according to the evolution of contributions and withdrawals of medium to the bioreactor. In order to show the extent of the applications of the method and the device according to the invention, these various cultivation methods can be described below. 1. - In batch culture, the nutritive agents are provided by the culture medium present during inoculation, the culture then evolving without substantial addition or withdrawal of culture medium, until the end of the culture. of the lot. The volume of the culture is constant. 2.
  • a separation method as described at the outset comprising agitation of the fluid medium from a zone thereof which is situated at the periphery of the filtering tubular envelope.
  • provision is made to immerse the filter to the bottom of the agitated fluid medium so as to obtain filtration over the entire height of the fluid medium.
  • said zone, from which the agitation of the fluid medium takes place is situated along the entire height of the submerged filtering tubular envelope.
  • the agitation produces a tangential circulation of the fluid medium over the height of the submerged filtering tubular casing.
  • the stirring can produce a simultaneous transfer of at least one gas, present above the fluid medium, inside the latter and a distribution of this or these gases in the fluid medium.
  • a separation device as described at the start, this device comprising a means for agitating the fluid medium, arranged around the tubular filtering envelope of the filter.
  • the stirring means is a helical ribbon arranged around the tubular filter envelope, optionally over the entire height thereof.
  • the helical tape is fixed in places on the tubular filter envelope, with an internal edge of the tape located a short distance from said envelope, in particular of the order of 0.5 to 5 mm.
  • the helical ribbon can in particular be arranged so as to be able to partially emerge above the fluid medium.
  • the stirring means is formed of blades driven in rotation around the above-mentioned filtering tubular casing.
  • the filter is immersed up to a small distance from the bottom of the tank, in particular of the order of 1 cm.
  • Figure 1 shows, schematically, a sectional view of a device according to the invention.
  • FIG. 2 shows a sectional view of a mechanism for driving the rotary filter and the stirring means, in an alternative embodiment of a device according to the invention.
  • Figure 3 shows, schematically, a sectional view of yet another embodiment of dispo ⁇ device according to the invention.
  • the figure shows a detailed view of a filter support in a device according to the invention.
  • FIG. 5 represents a view in section along the line V-V of FIG. 1.
  • the device illustrated comprises a tank 1 in which is contained a fluid culture medium 2.
  • This tank 1 is closed at its upper end by a closing plate 3.
  • This supports a motor 4 which, in service, rotates an output shaft 5 in the direction of rotation indicated by the arrow FI.
  • a rotary filter 6 is mounted on this shaft. It comprises an upper support flange 7 and a lower support flange 8 which are mounted on the shaft 5 so as to be driven in rotation by the latter.
  • a filter envelope 9 in the form of a cylindrical mesh.
  • the filter may consist of a stainless steel mesh of known nominal and absolute fineness.
  • the mesh can be made of porous ceramic or a synthetic polymer of good biological compatibility and resistant to sterilization, in particular nylon, ethylene-tetrafluoroethylene (ETFE).
  • EFE ethylene-tetrafluoroethylene
  • the trellis is closed on itself to adopt the shape of a cylinder with a vertical axis, and it is therefore integral with the rotation shaft 5 of the motor 4 placed at the top of the tank.
  • the particle separation performance of the lattice is expressed by the size of the cells retained in a functional test (nominal separation diameter), rather than by the diameter of the spaces formed between the lattices of the lattice. Indeed, the spaces provided by the trellis do not necessarily have a circular shape.
  • the choice of the fineness of the mesh of the rotary filter is a compromise between the diameter of the cells to be retained and the operating conditions under which the separation will take place.
  • the diameter of the cells retained by the rotating rotary filter depends on the nominal diameter of separation of the lattice, its tangential speed, the possible flow of fluid through the lattice, the configuration of the stirring system (shape of the lattice , geometrical relationships between the stirring means and the lattice), the appearance of soiling (tendency of biological media to form deposits on surfaces and to plug orifices of small diameter), and of the interactions existing between suspended cells and the lattice or the substances deposited therein (in particular hydrophobic, electrostatic interactions, electrocine ⁇ ticks).
  • the rotary filter may possibly be equipped with a trellis having a nominal separation diameter greater than the size of the cells to be separated, since the effective cut-off diameter of the rotating trellis is greater than the cut-off diameter determined by a functional test on static trellis.
  • the stirring means is arranged around the filter envelope, that is to say at the same height as the filter envelope, which makes it possible to improve the agitation and filtration functions. , as described below.
  • the size of the two elements can be such that they extend over the major part of the height of the phase containing the cells, and they can exert a stirring and filtration function over most of this phase.
  • the stirring means consists of a helical ribbon 10, disposed around the filter envelope 9 in the form of a cylindrical trellis.
  • the helical ribbon is fixed in any suitable manner at one of its ends 12 to the upper support flange 7 of the filter and at the other end 13 to the lower support flange 8 of the filter.
  • this agitator By its rotation by means of a motor arranged above, or possibly also below the tank, this agitator ensures particularly efficient pumping of the fluid, with generation of a minimum turbulence field in the fluid.
  • the various functions of agitation described above (maintenance in suspension, homogenization, contact between phases, aeration) are best encountered by a type of agitator which achieves maximum pumping for minimum turbulence.
  • the liquid streams 11 (Fig. 1) describe a generally vertical trajectory over the entire height of the tank; more particularly, the liquid is pumped downwards by the stirring means 10 and it rises along the walls of the tank, to be pumped back into the stirring means.
  • Such circulation in the vertical axis of the tank defines an axial type agitator.
  • the helical ribbon and the Archimedes' screw exert greater pumping than a marine propeller or a turbine with inclined blades. In the case of operation in turbulent regime, this type of mobile also provides greater homogeneity of the turbulence field, than a radial type agitator.
  • the helical ribbon 10 arranged vertically so as to surround the cylindrical trellis
  • the material chosen for the production of the stirring means must meet the requirements of the process, and will in particular have good mechanical strength, good biological compatibility, resistance to sterilization conditions (thermal sterilization in autoclave or in situ). Mention may in particular be made of synthetic polymers, stainless steel, composite materials formed of epoxy resins reinforced with carbon, aramid or glass fibers.
  • the upper part 12 of the helical ribbon 10 be emerged from the fluid medium 2, so that pumping downwards increases the coefficient of transfer of gases. towards the liquid phase. This is particularly the case in the culture of animal cells in a bioreactor, where oxygen is supplied to the cells from the surface of the liquid, or from fine submerged tubes permeable to gases. In these two aeration modes, it is preferable that the stirring system ensures a high pumping rate, without however creating a turbulent regime.
  • the supply of oxygen to the cells is a critical factor, given the very low solubility of oxygen in aqueous media, the sensitivity of the cells to variations in dissolved oxygen, and the sensitivity of the cells to the shearing effects created. by gas bubbles. of used fluid, and the concentration of cells in situ, can be exerted in partially filled tanks, or in tanks for which the height of the level of the liquid can vary during culture.
  • a very specific embodiment example of a device according to the invention, of the type illustrated in FIG. 1, will now be described.
  • the filter casing 9 consists of a mesh of braided stainless steel wires, of the T illed Dutch eave type (Haver & Boec er, R.F. Germany).
  • the mesh chosen has a nominal fineness of 10 micrometers, and an absolute fineness of 15 to 18 micrometers.
  • the fineness of the filter to be chosen may be very different, for example between 0.5 micrometers and 1 centimeter, but in general it is between 5 micrometers and 200 micrometers.
  • the average diameter of these is typically 13 micrometers. It is possible to choose a trellis having a nominal separation diameter greater than the size of the cells to be separated, because the effective cut-off diameter of the rotary filter is greater than the cut-off diameter determined on the trellis under static conditions.
  • the trellis is closed on itself to adopt the shape of a cylinder with vertical axis (variable diameter from 3 centi ⁇ meters to several meters, depending on the dimensions of the tank, typically from 4 to 8 cm for a tank of 15 liters with a height of 44 cm and an internal diameter of 22 cm), and it is fixed to a stainless steel support by laser welding.
  • FIG. 4 A type of support is shown more particularly in FIG. 4, in which the trellis has not been drawn, for reasons of clarity of the drawing.
  • the trellis is carefully welded to its lower base on the flange 8 so as not to leave space between the support and the trellis.
  • the flange 8 has a central rod 27 which, by a threaded axial bore, secures the threaded end of the rotation shaft 5, and which extends this shaft so as to
  • the illustrated device further comprises a fixed suction tube 25 which opens into the interior of the filter 6, at a level close to the bottom of the tank, and which is therefore capable of withdrawing the filtrate which has reached the interior of the filter.
  • the device also comprises a fixed suction tube 26 which opens at the bottom of the tank 1 and outside the filter 6, and which is capable of withdrawing from the retentate.
  • a tube for introducing fresh fluid medium 28 can also be provided to supply the retentate retained in the tank 1 outside the filter 6.
  • the output shaft 5 carries a coupling mechanism 14 of the type having planets 17 and 18, which pivot around the longitudinal axis of the shaft 5, and satellites 15 and 16 which pivot around the axis of shaft ends 20, supported in any way for example by the closure plate of the tank.
  • the sun gear 17 is rotated in the direction FI by the output shaft 5 and, via the satellites 15 and 16, it rotates in the opposite direction F2 the sun gear 18 and the shaft 19.
  • the shaft 19 is, in the example illustrated, coaxial with shaft 5 and they each rotate in opposite directions.
  • the filter 6 is supported by the sun gear 18 and rotates in the direction F2.
  • the stirring means for example a helical ribbon
  • the shaft 5 can be fixed to the shaft 5 by a support flange not shown, of the type of the flange 8 in Figure 1. It then rotates in the direction FI.
  • the device according to the invention comprises a radial type agitator, constituted for example by one or more discs 21 carrying at their periphery straight blades 22. These discs are mounted so as to be driven in rotation by the output shaft 5 of the motor 4.
  • the disc 21 is supported on the lower support flange 8 by support rods 23 arranged vertically around the filter 6. It is obvious that other methods of fixing the discs can be envisaged, for example through the filter envelope 9.
  • Such a device is used in particular when it is desired to obtain greater turbulence in the fluid.
  • the streams of liquid current 24 leave the agitator radially towards the wall of the tank 1, and they are divided into two parts: the upper one goes up along the wall, then is pumped into the agitator, the other, lower, descends along the wall towards the bottom of the tank, then is pumped into the agitator.
  • the disc 21 located at the bottom it is useful for the disc 21 located at the bottom to be close to the bottom of the tank.
  • the devices which have just been described can be used in particular, although not exclusively, in a culture of animal cells in an appropriate culture medium.
  • the device according to the invention allows efficient agitation of the culture medium in the various culture modes described previously.
  • the method makes it possible to concentrate the cells at the end of a batch culture, while maintaining them in the adequate and controlled physiological environment present in the bioreactor.
  • the liquid volumes to be treated in order to harvest the cells are greatly reduced. This concentration process is made possible by the use of a separation device, the filter element of which can fall to the bottom of the tank.
  • the device according to the invention allows continuous culture at high cell concentration.
  • the various functions of agitation, withdrawal of used fluid, and the concentration of cells in situ, can be exerted in partially filled tanks, or in tanks for which the height of the level of the liquid can vary during culture.
  • the filter envelope 9 consists of a mesh of braided stainless steel wires, of the Twilled Dutch eave type (Haver & Boecker, R.F. Germany).
  • the mesh chosen has a nominal fineness of 10 micrometers, and an absolute fineness of 15 to 18 micrometers.
  • the fineness of the filter to be chosen may be very different, for example between 0.5 micrometers and 1 centimeter, but in general it is between 5 micrometers and 200 micrometers.
  • the average diameter of these is typically 13 micrometers. It is possible to choose a trellis having a nominal separation diameter greater than the size of the cells to be separated, because the effective cut-off diameter of the rotary filter is greater than the cut-off diameter determined on the trellis under static conditions.
  • the trellis is closed on itself to adopt the shape of a cylinder with vertical axis (variable diameter from 3 centi ⁇ meters to several meters, depending on the dimensions of the tank, typically from 4 to 8 cm for a tank of 15 liters with a height of 44 cm and an internal diameter of 22 cm), and it is fixed to a stainless steel support by laser welding.
  • FIG. 4 A type of support is shown more particularly in FIG. 4, in which the trellis has not been drawn, for reasons of clarity of the drawing.
  • the trellis is carefully welded to its lower base on the flange 8 so as not to leave space between the support and the trellis.
  • the flange 8 has a central rod 27 which, by a threaded axial bore, secures the threaded end of the rotation shaft 5, and which extends this shaft so as to position the stirring means 10 at the bottom of the tank.
  • On the flange 8 is welded a support tube 31 of stainless steel of the same diameter, very much openwork.
  • the trellis follows the cylindrical shape of the perforated tube 31, and the upper edge of the trellis is welded to the upper end of the tube. Alternatively, the upper edge of the trilis can be welded to an upper flange, as illustrated in FIG. 1.
  • the rotary filter thus described is closed at its base, it has a trellis over its entire height, and it is open at its top.
  • the flange 8 which forms the base of the filter can also be perforated and support a horizontal trellis.
  • the filter comprises a plane trellis at its base and a cylindrical trellis over its entire height.
  • One or more fixed tubes 25 are arranged vertically in the interior space of the filter, and their end is close to the bottom of the latter. These tubes make it possible to withdraw the fluid having passed through the filtering element, or to introduce various fluids, or else to apply specific conditions for treating the filtrate. H are attached to the closure plate 3 ( Figure 1). Alternatively, tubes can be held integral with a horizontal stainless steel intermediate plate 32, which bears on parts not shown of the bioreactor, and the tubes are connected to the closure plate 3.
  • the horizontal section of the trellis described here is a simple circle, but it can be modified in particular in a scalloped circle, in order to locally increase the turbulence.
  • the filter element typically has the following dimensions: height of the filter cylinder: 250 mm diameter of the filter cylinder: 60 mm height of the submerged part of the filter cylinder: 220 mm submerged surface of the mesh: 415 cm 2 elevation of the filter compared to the bottom of the tank:
  • the stirring means consists of a helical ribbon 10 disposed around the cylindrical trellis, and traversing its entire height.
  • the helical ribbon is composed of modified epoxy resin (Fibredux 914, Ciba-Geigy, Switzerland) pre-impregnated with unidirectional carbon fibers (High tensile Carbon T300).
  • modified epoxy resin Fibredux 914, Ciba-Geigy, Switzerland
  • the upper and / or lower edge of the helical ribbon is made integral with the rotary filter by one or two removable metal parts 29 and / or 30, fixed to the upper and / or lower part of the rotary filter.
  • the agitation and filtration unit prevents or delays the possible appearance of soiling in highly charged fluids, taking advantage of the following factors:
  • the arrangement of the stirring means around the trellis increases the local turbulence at the location of the trellis.
  • the turbulence prevailing at the level of the usual rotary filters is low, because the stirring means is arranged below the rotary filter, and the circulation in the tank is essentially of the laminar type.
  • the distance of 0.5 to 5 mm, existing, according to the invention between the rotary filter and the helical ribbon and designated in Figure 5 by the reference d, allows a tangential flow of liquid over the height of the rotary filter. This arrangement increases the turbulence at the level of the filter, and prevents the appearance of zones of low circulation between the filter and the helical strip.
  • a helical ribbon as a means of agi ⁇ tation provides maximum pumping: the agitation carried out can be quantified by the oxygen volume transfer coefficient (parameter kL.a).
  • the oxygen volume transfer coefficient Parameter kL.a
  • the value of kL.a obtained with the device according to the invention described, rotated at 100 revolutions per min., Is 4.0 / hour, against a value of + _ 0.5 / hour obtained with a conventional marine propeller provided for this type of tank.
  • the pumping efficiency can be further increased by adding a segment of immersed concentric fixed tube, wider than the stirring means and of lower height.
  • This guide tube known per se and not shown, allows the entry of the fluid by its upper edge and the exit of the fluid from the pumping zone, by its lower edge.
  • Such a guide tube allows the use of the device according to the invention for agitating the medium in the batch and continuous culture.
  • Such a guide tube can typically have a diameter of 18 cm and a height of 12 cm, for a tank whose height of the liquid level is 23 cm.
  • the device according to the invention which has just been described has been used for the concentration of cells cultured in batches, at the end of culture.
  • the concentration of cells in the filtrate is three orders of magnitude less than the concentration in the retentate.
  • the effluent containing the concentrated cells (retentate) comprises one liter of cells at 29.7 million cells per milliliter.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Procédé de séparation de cellules à partir d'un milieu fluide, comprenant une immersion dans le milieu fluide d'un filtre présentant une enveloppe tubulaire capable de filtrer au moins une fraction desdites cellules, un entraînement de ce filtre dans un sens de rotation autour de son axe longitudinal, une séparation par filtration d'un filtrat à l'intérieur de l'enveloppe du filtre et d'un rétentat à l'extérieur de celle-ci, un soutirage du filtre hors du filtre, et, simultanément à la filtration, une agitation du milieu fluide depuis une zone de celui-ci qui est située à la périphérie de l'enveloppe tubulaire filtrante, et dispositif pour la mise en ÷uvre de ce procédé.

Description

"Procédé et dispositif de séparation de cellules à partir d'un milieu de culture fluide"
La présente invention est relative à un procédé de séparation de cellules à partir d'un milieu de culture fluide, compre- nant une immersion dans le milieu fluide d'un filtre présentant une enveloppe tubulaire capable de filtrer au moins une fraction desdites cellules, un entraînement de ce filtre dans un sens de rotation autour de son axe longitudinal, une séparation par filtration d'un filtrat à l'intérieur de l'enveloppe du filtre et d'un rétentat à l'extérieur de celle-ci, un soutirage du filtrat hors du filtre, et une agitation du milieu fluide, simultanément à la filtration. Elle concerne également un dispositif de séparation de cellules à partir d'un milieu de culture fluide, comprenant une cuve dans laquelle est contenue le milieu fluide, un moyen de filtration du milieu fluide sous la forme d'un filtre immergé dans ce dernier et présentant une enveloppe tubulaire filtrante, capable de filtrer au moins une fraction desdites cellules, des moyens pour entraîner en rotation ce filtre autour de son axe longitudinal, des moyens pour soutirer hors du filtre un filtrat parvenu à l'intérieur de l'enveloppe tubulaire filtrante, et un moyen d'agitation du milieu fluide, capable de fonctionner simultanément au moyen de filtration.
L'invention concerne en particulier l'agitation des fluides utilisés dans les procédés fermentatifs en bioréacteur, et la rétention d'une biomasse à l'intérieur du bioréacteur. Elle permet notamment de concentrer la biomasse à l'intérieur du bioréacteur tout en maintenant un mélange continu et efficace du fluide.
Par cellules, on entend les cellules elles-mê -nes (micro-organismes, cellules animales ou végétales, isolées ou associées), ou une matrice servant de support aux cellules (notamment supports macroscopiques, microsupports pleins ou creux, billes de carraghénane ou d'alginate, matrices d'encapsulation, particules servant de substrat nutritif auxquelles les cellules sont associées).
Par séparation de cellules, on entend, au départ d'un fluide contenant des cellules au sens de l'invention en suspension ou mises en suspension par une agitation, l'obtention de deux fluides qui puissent être récoltés séparément, l'un contenant des cellules et l'autre pas ou encore l'un différant de l'autre par la taille et/ou la concentration des cellules qu'il contient en suspension.
L'invention concerne plus particulièrement les étapes de culture et de concentration de cellules animales en bio- réacteur, pour la production de différents types de matériaux biolo¬ giques. Comme exemples de tels matériaux issus de la culture de cellules, on peut citer les cellules elles-mêmes, les composants cellu¬ laires, les virus ou protéines virales, les vaccins viraux ou bactériens, les anticorps monoclonaux, les protéines résultant de la manipulation du génome des cellules. Vu la demande importante et croissante pour de tels produits en médecine humaine ou vétérinaire et en biologie moléculaire, l'invention sera décrite ci-après en référence à la culture de cellules animales.
Un bioréacteur est une enceinte dans laquelle les cellules sont soumises à un environnement qui puisse être contrôlé, et qui correspond aux exigences physiologiques des cellules : les paramètres contrôlés sont par exemple la température, l'apport d'agents nutritifs, le retrait de produits du métabolisme, l'oxygénation du milieu de culture, l'équilibre acido-basique, l'équilibre d'oxydo- réduction, la turbulence et les forces de cisaillement, la concentration cellulaire, la pression.
Chacun de ces paramètres dépend du système d'agi¬ tation du milieu, ainsi que du système d'introduction de milieu de culture dans la cuve, ou de retrait de milieu usagé hors de la cuve. II en résuite que l'agitation du fluide et le renouvellement du fluide sont deux opérations majeures pour le succès de la culture des cellules. Vu la grande sensibilité des cellules aux variations de leur environnement, il est souhaitable, dans un processus de pro¬ duction de matériaux biologiques, que les cellules soient maintenues un maximum de temps à l'intérieur du bioréacteur. On connaît des dispositifs de culture de cellules animales en cuve agitée dans lesquels des cellules isolées ou des supports d'ancrage pour les cellules sont mis en suspension. Selon les méthodes classiques en usage dans ces dispositifs, l'agitation est réalisée par un mobile d'agitation immergé dans le fluide, et le mobile est mis en mouvement par un moteur, ou contient un barreau magnétique mis en mouvement par un agitateur magnétique (cuves de petit volume) (A. PROKOP et cons., Bioreactor for ammalian Cell Culture, dans FIECHTER A., Advances in Biochemical Engi- neering/Biotechnology, 39, p. 29-71, Springer-Verlag, Berlin, 1989).
L'ensemble des pièces en contact avec la culture est stérilisé avant inoculation, et doit demeurer stérile pendant la culture.
Les perfomances attendues du système d'agitation sont notamment le maintien en suspension de la biomasse, l'homo- généisation des concentrations dans le fluide, le contact entre phases
(gaz-liquide-biomasse), l'aération du milieu de culture.
De tels dispositifs ne permettent toutefois pas une séparation entre la biomasse et le liquide usé, dans la cuve elle- même. Ces étapes de séparation sont toutefois indispensables, aussi bien dans les procédés qui visent à la production des cellules que dans les procédés qui visent à la production, par les cellules, de substances solubies. Dans un procédé de culture d'un lot de cellules dans un bioréacteur, après la phase de culture cellulaire, les volumes liquides à traiter sont très importants par rapport au poids récolté de biomasse concentrée. Typiquement, il faut centrifuger 10 litres d'un milieu de culture contenant 1,6 millions de cellules animales par millilitre de milieu, pour récolter seulement 50 grammes de cellules (poids du culot mouillé). Ces étapes de centrifugation (ou microfiltration) rendues nécessaires pour la séparation des particules, demandent des investissements, de la main-d'oeuvre et le respect de consignes de sécurité.
Dans les cas où la production de biomasse constitue le but visé par le procédé, ces étapes, pratiquées en dehors du bio¬ réacteur, altèrent la qualité des cellules récoltées, et sont susceptibles d'augmenter la variation de qualité d'un lot à l'autre. Or, le maintien de la qualité des cellules récoltées est au contraire particulièrement important dans la production en masse de cellules animales destinées à l'étude structurelle ou à l'étude de l'activité fonctionnelle de constituants cellulaires. Dans les cas de culture cellulaire pour la culture d'organismes pathogènes (par exemple production de vaccins viraux), les risques infectieux encourus par le personnel sont liés au nombre d'étapes nécessaires en aval des bioréacteurs. Par ailleurs, la concen¬ tration des cellules à l'intérieur du bioréacteur est appréciée dans la production de virus, à l'étape d'inoculation des cellules par le virus, car l'inoculum virai n'est pas dilué dans un grand volume de milieu liquide.
Dans les deux cas, le maintien de la stérilité de la ligne de production est rendu difficile par le volume des effluents de bioréacteur à traiter.
La concentration substantielle des cellules à l'inté¬ rieur même du bioréacteur constitue pour ces raisons une diminution appréciable des coûts d'investissements et opératoires des premières étapes en aval du bioréacteur, une amélioration de la sécurité dé la séparation des particules, une amélioration de la qualité des cellules récoltées, et une réduction de la durée totale du processus.
On a alors mis au point, pour la culture en continu de cellules, des cuves contenant un filtre en rotation autour d'un axe. Ce filtre sert usuellement à isoler au sein du bioréacteur un compartiment essentiellement dépourvu de cellules et dans lequel un ou plusieurs tubes fixes sont introduits, pour pomper le milieu liquide hors du bioréacteur (v. entre autres S. REUVENY et cons.,
Comparison of cell propagation methods , 3ournal of Immunological
Methods, 86, 1986, p. 61-69; P.5. THAYER, Spin Filter Device for Suspension Cultures, dans KRUSE P.F. et cons., Tissue Culture Methods and Applications, Académie Press, 1973, p. 345-351). Dans ces dispo¬ sitifs toutefois l'agitation du milieu de culture résulte uniquement de la turbulence provoquée par la rotation du filtre, ce qui est insuf¬ fisant ou inapproprié dans beaucoup de circonstances. On a aussi réalisé des dispositifs dans lesquels la croissance et l'agitation du milieu de culture ont lieu dans une cuve principale et la filtration du milieu de culture dans une cuve auxiliaire (v. W.R. TOLBERT et cons., Perfusion culture Systems for production of mammalian cell biomolecules, dans J. FEDER et cons., Large-scale mammalian celle culture, Académie Press, 1985, p. 97-119). Un tel agencement s'avère particulièrement coûteux, et présente les inconvénients précités qui sont inhérents à tous les dispositifs où la séparation doit avoir lieu en aval de la cuve de culture. On a aussi développé un procédé et un dispositif tels que décrits au début (v. entre autres brevet US-A- .166.768; P. HIMMELFARB et cons., Spin Filter Culture..., Science, vol. 1 , p. 555-557; G.C. AVGERINOS et cons., Spin Filter Perfusion..., Bio/ Technology, vol. 8, 1990, p. 54-58). Ces dispositifs sont utilisés dans la culture continue en perfusion, pour maintenir les cellules dans le bioréacteur et augmenter la concentration cellulaire en cours de culture continue. Ils ne sont cependant pas utilisés pour concentrer les cellules dans le bioréacteur à la fin d'une culture par lot. En réalité les filtres rotatifs sont placés au-dessus du mobile d'agitation, constitue d'un barreau magnétique dans les petites cuves ou d'un mobile de pompage dans les grandes cuves. Or, il n'est pas possible d'abaisser le niveau liquide dans le bioréacteur en dessous du niveau inférieur du filtre rotatif, et celui-ci est relativement élevé dans la cuve étant donné la présence de l'agitateur sous-jacent. La présence du filtre, reportant le mobile d'agitation vers le bas, nuit à l'efficacité de pompage de celui-ci. L'agitation du milieu de culture dans toute la cuve depuis une zone localisée au fond de celle-ci se heurte à la sensibilité des cellules aux forces de cisaillement.
La présente invention a pour but de mettre au point un procédé et un dispositif de séparation de cellules, qui ne présentent pas les inconvénients des procédés et dispositifs selon l'état de la technique. Elle doit . tout particulièrement permettre de procéder à la séparation de cellules en remédiant aux difficultés d'agitation rencontrées avec les moyens actuels. Avantageusement, ce procédé doit pouvoir s'appliquer aux divers modes de culture existants, traditionnellement classés selon l'évolution des apports et retraits de milieu au bioréacteur. Dans le but de montrer l'étendue des applications du procédé et du dispositif selon l'invention on peut décrire ci-après ces divers modes de culture. 1. - Dans la culture par lot, les agents nutritifs sont apportés par le milieu de culture présent lors de l'inoculation, la culture évoluant ensuite sans apport ni retrait substantiel de milieu de culture, et ce jusqu'à la fin de la culture du lot. Le volume de la culture est constant. 2. - Dans la culture par lot alimenté, il y a un apport continu ou discontinu de milieu de culture au bioréacteur, sans retrait substantiel de liquide du bioréacteur. Le volume de la culture est croissant. 3. - Dans la culture continue, il y a un apport de milieu de culture conjointement à un retrait de liquide de la culture. Le volume de la culture est généralement maintenu constant. Lorsqu'on réalise, en particulier, un retrait de milieu de culture du bioréacteur en y associant un procédé de séparation des cellules, lequel retient les cellules dans le bioréacteur ou renvoie les cellules au bioréacteur, la culture continue est dite en perfusion. Il en résulte un accroissement de la concentration cellulaire dans le bioréacteur.
Pour résoudre ces problèmes, on prévoit un procédé de séparation tel que décrit au début, ce procédé comprenant une agitation du milieu fluide depuis une zone de celui-ci qui est située à la périphérie de l'enveloppe tubulaire filtrante. Avantageusement, on prévoit une immersion du filtre jusqu'au bas du milieu fluide agité de manière à obtenir une filtration sur toute la hauteur du milieu fluide. Suivant un mode particulier du procédé suivant l'invention, ladite zone, depuis laquelle s'effectue l'agitation du milieu fluide, est située le long de la totalité de la hauteur de l'enveloppe tubulaire filtrante immergée. Suivant un mode préféré de réalisation de l'inven¬ tion, l'agitation produit une circulation tangentielle du milieu fluide sur la hauteur de l'enveloppe tubulaire filtrante immergée. Suivant l'invention l'agitation peut produire un transfert simultané d'au moins un gaz, présent au-dessus du milieu fluide, à l'intérieur de ce dernier et une distribution de ce ou ces gaz dans le milieu fluide. On prévoit également, suivant l'invention, un dispo¬ sitif de séparation tel que décrit au début, ce dispositif comprenant un moyen d'agitation du milieu fluide, agencé autour de l'enveloppe tubulaire filtrante du filtre. Suivant une forme de réalisation avanta- geuse de l'invention, le moyen d'agitation est un ruban hélicoïdal disposé autour de l'enveloppe tubulaire filtrante, éventuellement sur toute la hauteur de celle-ci. Suivant une forme de réalisation préférée de l'invention, le ruban hélicoïdal est fixé par endroits sur l'enveloppe tubulaire filtrante, avec un bord interne du ruban situé à une faible distance de ladite enveloppe, notamment de l'ordre de 0,5 à 5 mm. Suivant l'invention, le ruban hélicoïdal peut en particu¬ lier être disposé de manière à pouvoir émerger partiellement au-dessus du milieu fluide. Suivant une autre forme de réalisation de l'invention, le moyen d'agitation est for -né de pales entraînées en rotation autour de l'enveloppe tubulaire filtrante susdite. Très avantageusement, le filtre est immergé jusqu'à une faible distance du fond de la cuve, notamment de l'ordre de 1 cm.
D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et avec référence aux dessins annexés.
La figure 1 représente, d'une manière schématique, une vue en coupe d'un dispositif suivant l'invention.
La figure 2 représente une vue en coupe d'un méca¬ nisme d'entraînement du filtre rotatif et du moyen d'agitation, dans une variante de réalisation d'un dispositif suivant l'invention.
La figure 3 représente, d'une manière schématique, une vue en coupe d'encore une autre forme de réalisation de dispo¬ sitif suivant l'invention.
La figure représente une vue de détail d'un support de filtre dans un dispositif suivant l'invention.
La figure 5 représente une vue en section suivant la ligne V-V de la figure 1.
Dans les différentes figures, les éléments identiques portent les mêmes références. Ainsi qu'il ressort de la figure 1, le dispositif illustré comprend une cuve 1 dans laquelle est contenue un milieu de culture fluide 2. Cette cuve 1 est fermée à son extrémité supérieure par une plaque de fermeture 3. Celle-ci supporte un moteur 4 qui, en service, entraîne en rotation un arbre de sortie 5 dans le sens de rotation désigné par la flèche FI. Sur cet arbre est montée un filtre rotatif 6. Celui-ci comprend une - bride de support supérieure 7 et une bride de support inférieure 8 qui sont montées sur l'arbre 5 de manière à être entraînées en rotation par ce dernier. Entre les deux brides 7 et 8 est tendue une enveloppe filtrante 9 sous la forme d'un treillis cylindrique. Le filtre peut être constitué d'un treillis d'acier inoxydable de finesse nominale et absolue connues. Alternati¬ vement, le treillis peut être constitué de céramique poreuse ou d'un polymère synthétique de bonne compatibilité biologique et résistant à la stérilisation, notamment du Nylon, de l'éthylène-tétrafluoroéthylène (ETFE).
Le treillis est refermé sur lui-même pour adopter la forme d'un cylindre à axe vertical, et il est donc solidaire de l'arbre de rotation 5 du moteur 4 disposé en haut de la cuve.
Les performances de séparation particulaire du treillis sont exprimées par la taille des cellules retenues dans un test fonctionnel (diamètre nominal de séparation), plutôt que par le diamètre des espaces ménagés entre les mailles du treillis. En effet, les espaces ménagés par le treillis n'ont pas nécessairement une forme circulaire. Le choix de la finesse de la maille du filtre rotatif est un compromis entre le diamètre des cellules à retenir et les conditions opératoires dans lesquelles la séparation aura lieu.
En effet, le diamètre des cellules retenues par le filtre rotatif en rotation dépend du diamètre nominal de séparation du treillis, de sa vitesse tangentielle, du débit éventuel de fluide au travers du treillis, de la configuration du système d'agitation (forme du treillis, relations géométriques entre le moyen d'agitation et le treillis), de l'apparition d'un salissement (tendance des milieux biologiques à former des dépôts sur les surfaces et à obturer les orifices de faible diamètre), et des interactions existant entre les cellules en suspension et le treillis ou les substances y déposées (notamment interactions hydrophobes, électrostatiques, électrociné¬ tiques).
En conséquence, le filtre rotatif pourra éventuel- lement être équipé d'un treillis présentant un diamètre nominal de séparation supérieur à la taille des cellules à séparer, car le diamètre de coupure effectif du treillis en rotation est supérieur au diamètre de coupure déterminé par un test fonctionnel sur treillis statique.
Suivant l'invention, le moyen d'agitation est disposé autour de l'enveloppe filtrante, c'est-à-dire à la même hauteur que l'enveloppe filtrante, ce qui permet d'améliorer les fonctions d'agitation et de filtration, comme décrit ci-après. La taille des deux éléments peut être telle qu'ils s'étendent sur la majeure partie de la hauteur de la phase contenant les cellules, et ils peuvent exercer une fonction d'agitation et de filtration sur la plus grande partie de cette phase.
Dans l'exemple de réalisation illustré sur la figure
1, le moyen d'agitation est constitué d'un ruban hélicoïdal 10, disposé autour de l'enveloppe filtrante 9 en forme de treillis cylindrique.
Dans cet exemple, le ruban hélicoïdal est fixé d'une manière appropriée quelconque à l'une de ses extrémités 12 à la bride de support supérieure 7 du filtre et à l'autre extrémité 13 à la bride de support inférieure 8 du filtre.
Par sa mise en rotation au moyen d'un moteur disposé au-dessus, ou éventuellement aussi en dessous de la cuve, cet agitateur assure un pompage du fluide particulièrement efficace, avec génération d'un champ de turbulence minimal dans le fluide. Lorsqu'il s'agit d'agiter des cellules sensibles aux forces de cisail¬ lement, les différentes fonctions d'agitation décrites plus haut (maintien en suspension, homogénéisation, contact entre phases, aération) sont le mieux rencontrées par un type d'agitateur qui réalise un pompage maximal pour une turbulence minimale. Dans les cuves agitées de la sorte, les filets de courant liquide 11 (Fig. 1) décrivent une trajectoire globalement verticale sur toute la hauteur de la cuve; plus particulièrement, le liquide est pompé vers le bas par le moyen d'agitation 10 et il remonte le long des parois de la cuve, pour être pompé de nouveau dans le moyen d'agitation. Une telle circulation dans l'axe vertical de la cuve définit un agitateur de type axial.
Parmi les agitateurs- de type axial, le ruban héii- coïdal et la vis d'Archimède exercent un pompage plus important qu'une hélice marine ou une turbine à pales inclinées. Dans le cas d'un fonctionnement en régime turbulent, ce type de mobile procure également une plus grande homogénéité du champ de turbulence, qu'un agitateur de type radial. Typiquement, le ruban hélicoïdal 10, disposé verticalement de manière à entourer le treillis cylindrique
9, est immergé jusqu'au fond de la cuve, et il assure le pompage du fluide vers le bas.
Le matériau choisi pour la réalisation du moyen d'agitation devra répondre aux exigences du processus, et présentera en particulier une bonne résistance mécanique, une bonne compatibilité biologique, une résistance aux conditions de stérilisation (stérilisation thermique en autoclave ou in situ). On peut citer notamment les polymères de synthèse, l'acier inoxydable, les matériaux composites formés de résines époxy renforcées de fibres de carbone, d'aramide ou de verre.
Lorsque le transfert de gaz de la surface vers le liquide est un paramètre important, il est préférable que la partie supérieure 12 du ruban hélicoïdal 10 soit émergée du milieu fluide 2, de façon que le pompage vers le bas augmente le coefficient de transfert des gaz vers la phase liquide. C'est en particulier le cas dans la culture de cellules animales en bioréacteur, où l'oxygène est apporté aux cellules au départ de la surface du liquide, ou au départ de fins tubes immergés perméables aux gaz. Dans ces deux modes d'aération, il est préférable que le système d'agitation assure un débit de pompage important, sans toutefois créer un régime tur¬ bulent. L'apport d'oxygène aux cellules est un facteur critique, vu la très faible solubilité de l'oxygène dans les milieux aqueux, la sensibilité des cellules aux variations d'oxygène dissous, et la sensi¬ bilité des cellules aux effets de cisaillement créés par les bulles de gaz. de fluide usagé, et la concentration des cellules in situ, peuvent être exercées dans des cuves partiellement remplies, ou dans des cuves pour lesquelles la hauteur du niveau du liquide peut varier en cours de culture. Un exemple de réalisation tout particulier de dis¬ positif suivant l'invention, du type illustré sur la figure 1, va à présent être décrit.
L'enveloppe filtrante 9 est constituée d'un treillis de fils d'acier inoxydable tressés, de type T illed Dutch eave (Haver & Boec er, R.F. Allemagne). Le treillis choisi a une finesse nominale de 10 micromètres, et une finesse absolue de 15 à 18 micro¬ mètres. Selon le type de cellules à séparer, la finesse du filtre à choisir pourra être très différente, par exemple comprise entre 0,5 micromètres et 1 centimètre, mais en général elle est comprise entre 5 micromètres et 200 micromètres.
Dans le cas des cellules animales en suspension, le diamètre moyen de celles-ci est typiquement de 13 micromètres. On peut choisir un treillis présentant un diamètre nominal de sépara¬ tion supérieur à la taille des cellules à séparer, car le diamètre de coupure effectif du filtre rotatif est supérieur au diamètre de coupure déterminé sur le treillis dans des conditions statiques.
Le treillis est refermé sur lui-même pour adopter la forme d'un cylindre à axe vertical (diamètre variable de 3 centi¬ mètres à plusieurs mètres, selon les dimensions de la cuve, typiquement de 4 à 8 cm pour une cuve de 15 litres avec une hauteur de 44 cm et un diamètre intérieur de 22 cm), et il est fixé à un support d'acier inoxydable par soudure au laser.
Un type de support est représenté plus particu¬ lièrement sur la figure 4, dans laquelle le treillis n'a pas été dessiné, pour des raisons de clarté du dessin.
Le treillis est soigneusement soudé à sa base infé¬ rieure sur la bride 8 de manière à ne pas ménager d'espace entre support et treillis. La bride 8 possède une tige centrale 27 qui, par un alésage axial taraudé, assure la fixation à l'extrémité filetée de l'arbre de rotation 5, et qui prolonge cet arbre de manière à Le dispositif illustré comprend en outre un tube fixe d'aspiration 25 qui débouche à l'intérieur du filtre 6, à un niveau proche du fond de la cuve, et qui est donc capable de soutirer du filtrat parvenu à l'intérieur du filtre. Le dispositif comprend également un tube fixe d'aspiration 26 qui débouche au fond de la cuve 1 et à l'extérieur du filtre 6, et qui est capable de soutirer du rétentat. Un tube d'introduction de milieu fluide frais 28 peut aussi être prévu pour alimenter le rétentat retenu dans la cuve 1 à l'extérieur du filtre 6. Suivant l'exemple de réalisation illustré sur la figure 2, le filtre 6 représenté partiellement et de manière schéma¬ tique et le moyen d'agitation non représenté ne sont pas solidaires l'un de l'autre. L'arbre de sortie 5 porte un mécanisme d'accouplement 14 du type présentant des planétaires 17 et 18, qui pivotent autour de l'axe longitudinal de l'arbre 5, et des satellites 15 et 16 qui pivotent autour de l'axe de bouts d'arbre 20, supportés d'une manière quelconque par exemple par la plaque de fermeture de la cuve. Le planétaire 17 est entraîné en rotation dans le sens FI par l'arbre de sortie 5 et, par l'intermédiaire des satellites 15 et 16, il entraîne en rotation dans le sens opposé F2 le planétaire 18 et l'arbre 19. L'arbre 19 est, dans l'exemple illustré, coaxial à l'arbre 5 et ils tournent chacun en sens opposés. Le filtre 6 est supporté par le planétaire 18 et tourne dans le sens F2. Par contre, le moyen d'agitation, par exemple un ruban hélicoïdal, peut être fixé à l'arbre 5 par une bride de support non représentée, du type de la bride 8 sur la figure 1. Il tourne alors dans le sens FI.
Il est évident qu'on peut aussi prévoir un mécanisme d'accouplement réducteur ou multiplicateur permettant d'entraîner le filtre et le moyen d'agitation à des vitesses différentes. On peut d'ailleurs aussi dans toutes les formes de réalisation suivant l'invention prévoir de modifier la vitesse de rotation du filtre en fonction de conditions préétablies.
Suivant l'exemple de réalisation illustré sur la figure 3, le dispositif suivant l'invention comprend un agitateur de type radial, constitué par exemple d'un ou de plusieurs disques 21 portant à leur périphérie des pales droites 22. Ces disques sont montés de manière à être entraînés en rotation par l'arbre de sortie 5 du moteur 4. Dans l'exemple de réalisation illustré, le disque 21 est supporté sur la bride de support inférieure 8 par des tiges de soutien 23 agencées verticalement autour du filtre 6. Il est évident que d'autres modes de fixation des disques peuvent être envisagés, par exemple à travers l'enveloppe filtrante 9.
On utilise en particulier un tel dispositif, lorsqu'on souhaite obtenir une plus grande turbulence dans le fluide. Dans ce type de dispositif, les filets de courant liquide 24 quittent l'agita¬ teur de manière radiale vers la paroi de la cuve 1, et ils se divisent en deux parties : l'une, supérieure remonte le long de la paroi, puis est pompée dans l'agitateur, l'autre, inférieure, descend le long de la paroi vers le fond de la cuve, puis est pompée dans l'agitateur. Lorsque l'on souhaite faire fonctionner le dispositif dans des cuves à niveau liquide de hauteur variable, il est utile que le disque 21 situé le plus bas soit proche du fond de cuve.
Les dispositifs qui viennent d'être décrits peuvent être mis en oeuvre en particulier, bien que non exclusivement, dans une culture de cellules animales dans un milieu de culture approprié.
Tout en maintenant la turbulence à une valeur minimale, le dispositif suivant l'invention permet une agitation efficace du milieu de culture dans les divers modes de culture décrits précé¬ demment. Le procédé permet de concentrer les cellules en fin d'une culture de lot, tout en les maintenant dans l'environnement physiologique adéquat et contrôlé présent dans le bioréacteur. Les volumes liquides à traiter pour récolter les cellules sont fortement réduits. Ce procédé de concentration est rendu possible par l'utilisa- tion d'un dispositif de séparation dont l'élément filtrant peut des¬ cendre jusqu'en bas de cuve.
Par un retrait continu ou intermittent de milieu usagé essentiellement dépourvu de cellules, le dispositif suivant l'invention permet une culture continue à haute concentration cellulaire. Les diverses fonctions que sont l'agitation, le retrait de fluide usagé, et la concentration des cellules in situ, peuvent être exercées dans des cuves partiellement remplies, ou dans des cuves pour lesquelles la hauteur du niveau du liquide peut varier en cours de culture. Un exemple de réalisation tout particulier de dis¬ positif suivant l'invention, du type illustré sur la figure 1, va à présent être décrit.
L'enveloppe filtrante 9 est constituée d'un treillis de fils d'acier inoxydable tressés, de type Twilled Dutch eave (Haver & Boecker, R.F. Allemagne). Le treillis choisi a une finesse nominale de 10 micromètres, et une finesse absolue de 15 à 18 micro¬ mètres. Selon le type de cellules à séparer, la finesse du filtre à choisir pourra être très différente, par exemple comprise entre 0,5 micromètres et 1 centimètre, mais en général elle est comprise entre 5 micromètres et 200 micromètres.
Dans le cas des cellules animales en suspension, le diamètre moyen de celles-ci est typiquement de 13 micromètres. On peut choisir un treillis présentant un diamètre nominal de sépara¬ tion ' supérieur à la taille des cellules à séparer, car le diamètre de coupure effectif du filtre rotatif est supérieur au diamètre de coupure déterminé sur le treillis dans des conditions statiques.
Le treillis est refermé sur lui-même pour adopter la forme d'un cylindre à axe vertical (diamètre variable de 3 centi¬ mètres à plusieurs mètres, selon les dimensions de la cuve, typiquement de 4 à 8 cm pour une cuve de 15 litres avec une hauteur de 44 cm et un diamètre intérieur de 22 cm), et il est fixé à un support d'acier inoxydable par soudure au laser.
Un type de support est représenté plus particu¬ lièrement sur la figure 4, dans laquelle le treillis n'a pas été dessiné, pour des raisons de clarté du dessin.
Le treillis est soigneusement soudé à sa base infé¬ rieure sur la bride 8 de manière à ne pas ménager d'espace entre support et treillis. La bride 8 possède une tige centrale 27 qui, par un alésage axial taraudé, assure la fixation à l'extrémité filetée de l'arbre de rotation 5, et qui prolonge cet arbre de manière à positionner le moyen d'agitation 10 en bas de cuve. Sur la bride 8 est soudé un tube de support 31 en acier inoxydable de même diamètre, très largement ajouré. Le treillis épouse la forme cylindrique du tube ajouré 31, et le bord supérieur -du treillis est soudé à l'extrémité supérieure du tube. Alternativement, le bord supérieur du treilis peut être soudé à une bride supérieure, comme illustré sur la figure 1.
Le filtre rotatif ainsi décrit est fermé à sa base, il comporte un treillis sur toute sa hauteur, et il est ouvert à son sommet. La bride 8 qui forme la base du filtre peut être également ajourée et supporter un treillis horizontal. Dans ce cas, le filtre comporte un treillis plan à sa base et un treillis cylindrique sur toute sa hauteur.
Un ou plusieurs tubes fixes 25 (par exemple de 6 millimètres de diamètre extérieur) sont disposés verticalement dans l'espace intérieur du filtre, et leur extrémité est proche du bas de celui-ci. Ces tubes permettent de soutirer le fluide ayant franchi l'élément filtrant, ou d'introduire divers fluides, ou encore d'appliquer des conditions particulières de traitement du filtrat. H sont fixés à la plaque de fermeture 3 (figure 1). Alternativement des tubes peuvent être maintenus solidaires d'une plaque intermédiaire horizontale en acier inoxydable 32, qui prend appui sur des parties non représentées du bioréacteur, et les tubes sont connectés à la plaque de fermeture 3. La section horizontale du treillis décrit ici est un cercle simple, mais elle peut être modifiée notamment en cercle festonné, dans le but d'augmenter localement la turbulence.
Dans une cuve de 15 litres de volume total (hauteur 44 cm, diamètre intérieur 22 cm), utilisée à 9 litres, l'élément filtrant présente typiquement les dimensions suivantes : hauteur du cylindre filtrant : 250 mm diamètre du cylindre filtrant : 60 mm hauteur de la partie immergée du cylindre filtrant : 220 mm surface immergée du treillis : 415 cm2 élévation du filtre par rapport au fond de la cuve :
I cm. Cette distance (désignée par la référence D sur la figure 1) permet par exemple le passage d'un tube de vidange. de la cuve. Le moyen d'agitation est constitué d'un ruban hélicoïdal 10 disposé autour du treillis cylindrique, et parcourant toute sa hauteur. Le ruban hélicoïdal est composé de résine époxy modifiée (Fibredux 914, Ciba-Geigy, Suisse) préimprégnée de fibres unidirectionnelles de carbone (High tensile Carbon T300). Pour sa réalisation, on peut envisager par exemple que des rubans de Fibredux
914 soient coupés et disposés sur un moule de Duralumin taillé au tour, et chauffés sous pression de manière à former un matériau composite renforcé présentant les caractéristiques suivantes :
- haute résistance mécanique (résistance au cisaillement in ter laminaire ILSS = 80-90 MN/mz à 37°C; résistance à la rupture par flexion, longitudinale (0°) UFS = 1700 MN/m2; module de flexion FM = 125 GN/m2; résistance à la rupture par flexion, transversale (90°) TFS = 95 MN/m2; module de flexion transversal TFM = 7,5 GN/m2)
- résistance à la stérilisation thermique (121 °C, 1,5 bar, vapeur d'eau, 30 minutes)
- compatibilité biologique avec les cellules animales et présentant les dimensions suivantes : hauteur du ruban hélicoïdal : 250 mm pas du ruban hélicoïdal : 140 mm largeur du ruban hélicoïdal : 42 mm diamètre interne : 61 mm, diamètre externe : 145 mm épaisseur du ruban hélicoïdal : +_ 0,9 mm
Le bord supérieur et/ou inférieur du ruban hélicoïdal est rendu solidaire du filtre rotatif par une ou deux pièces métalliques amovibles 29 et/ou 30, fixées à la partie supérieure et/ou inférieure du filtre rotatif.
II est utile de maintenir cette unité d'agitation et de filtration en constante rotation, de manière à diminuer l'appa¬ rition d'éventuels dépôts et le salissement du treillis. Ceci est parti- culièrement le cas dans les fluides biologiques qui sont fortement chargés en substances dissoutes (protéines, lipides, molécules d'ADN) et en particules susceptibles de colmater le treillis.
L'unité d'agitation et de filtration empêche ou retarde l'apparition éventuelle d'un salissement dans les fluides très chargés, en tirant parti des facteurs suivants :
1. La disposition du moyen d'agitation autour du treillis augmente la turbulence locale à l'endroit du treillis. Au contraire, la turbulence régnant au niveau des filtres rotatifs usuels est faible, car le moyen d'agitation est disposé au-dessous du filtre rotatif, et la circulation dans la cuve est essentiellement de type laminaire.
2. La distance de 0,5 à 5 mm, existant, suivant l'invention entre le filtre rotatif et le ruban hélicoïdal et désignée sur la figure 5 par la référence d, autorise une circulation tangentielle de liquide sur la hauteur du filtre rotatif. Cette disposition augmente la turbulence au niveau du filtre, et évite l'apparition de zones de faible circulation entre le filtre et le ruban hélicoïdal.
3. La configuration du treillis s'étendant du fond de la cuve jusqu'à la surface du liquide, donne une grande surface de filtration. Les filtres rotatifs usuels ont au contraire une hauteur réduite par rapport aux dimensions de la cuve.
Le choix d'un ruban hélicoïdal comme moyen d'agi¬ tation procure un pompage maximal : l'agitation réalisée peut être quantifiée par le coefficient de transfert volumique d'oxygène (paramètre kL.a). Dans une cuve de 15 litres remplie de 8 litres de liquide et aérée par la surface, la valeur de kL.a obtenue avec le dispositif suivant l'invention décrit, mis en rotation à 100 tours par min., est de 4,0/heure, contre une valeur de +_ 0,5/heure obtenue avec une hélice marine classique prévue pour ce type de cuve.
L'efficacité de pompage peut encore être accrue par l'ajout d'un segment de tube fixe concentrique immergé, plus large que le moyen d'agitation et de moindre hauteur. Ce tube de guidage,connu en soi et non représenté, autorise l'entrée du fluide par son bord supérieur et la sortie du fluide de la zone de pompage, par son bord inférieur. Un tel tube de guidage autorise l'utilisation du dispositif suivant l'invention pour l'agitation du milieu dans la culture en lots et dans les cultures continues. Un tel tube de guidage peut typiquement avoir un diamètre de 18 cm et une hauteur de 12 cm, pour une cuve dont la hauteur du niveau liquide est de 23 cm. A titre d'exemple, on a mis en oeuvre le dispositif suivant l'invention qui vient d'être décrit pour la concentration de cellules cultivées en lot, en fin de culture. Il permet en une heure de ramener de 10 litres à 1 litre le volume d'une culture à 3 millions de cellules animales par millilitre, en soutirant le milieu filtré à un débit de 150 millilitres par minute (filtrat). Utilisant une unité d'agitation et de filtration en rotation à 150 tours par minute, un diamètre nominal de coupure de 10 micromètres et des cellules ayant un mode de distribution des tailles de 13 micromètres, la concen¬ tration des cellules dans le filtrat est de trois ordres de grandeur inférieure à la concentration dans le rétentat. Dans l'exemple cité, l'effluent contenant les cellules concentrées (rétentat) comporte un litre de cellules à 29,7 millions de cellules par millilitre.
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes et modes de réalisation décrits ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.
On peut par exemple prévoir la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention dans un milieu de culture de cellules accrochées sur un support mis en suspension, par exemple des micro- billes, et une filtration des cellules détachées de leur support.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de séparation de cellules à partir d'un milieu de culture fluide, comprenant une immersion dans le milieu fluide d'un filtre présentant une enveloppe tubulaire capable de filtrer au moins une fraction desdites cellules, un entraînement de ce filtre dans un sens de rotation autour de son axe longitudinal, une séparation par filtration d'un filtrat à l'intérieur de l'enveloppe du filtre et d'un rétentat à l'extérieur de celle-ci, un soutirage du filtrat hors du filtre, et une agitation du milieu fluide, simultanément à la filtration, caractérisé en ce qu'il comprend une agitation du milieu fluide depuis une zone de celui-ci qui est située à la péri¬ phérie de l'enveloppe tubulaire filtrante.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une immersion du filtre jusqu'au bas du milieu fluide agité de manière à obtenir une filtration sur toute la hauteur du milieu fluide.
3. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica¬ tions 1 et 2, caractérisé en ce que ladite zone, depuis laquelle s'ef¬ fectue l'agitation du milieu fluide, est située le long de la totalité de la hauteur de l'enveloppe tubulaire filtrante immergée. .4. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 3, caractérisé en ce que l'agitation produit une circulation tangentielle du milieu fluide sur la hauteur de l'enveloppe tubulaire filtrante immergée.
5. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'agitation produit un transfert simultané d'au moins un gaz, présent au-dessus du milieu fluide, à l'intérieur de ce dernier et une distribution de ce ou ces gaz dans le milieu fluide.
6. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 5, caractérisé en ce que, pour produire l'agitation, il comprend un entraînement en rotation d'un moyen d'agitation agencé autour du filtre, dans un sens de rotation différent de celui du filtre.
7. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 5, caractérisé en ce que, pour produire l'agitation, il comprend un entraînement en rotation d'un moyen d'agitation agencé autour du filtre, dans le même sens de rotation que celui du filtre.
8. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une modification du niveau du milieu fluide pendant le procédé. 9. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend un apport de milieu fluide frais au milieu fluide en cours d'agitation et/ou de séparation.
10. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend un entraînement du filtre en rotation à une vitesse variable.
11. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tion 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une culture d'un lot de cellules et, en fin ou en cours de culture du lot, la filtration du milieu agité, avec concentration des cellules dans le milieu de culture lui-même.
12. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tion 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une culture continue à une haute concentration cellulaire dans le rétentat.
13. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend une culture de cellules accrochées sur un support mis en suspension, et une filtration des cellules détachées de leur support.
14. Dispositif de séparation de cellules à partir d'un milieu de culture fluide (2), comprenant une cuve (1) dans laquelle est contenue le milieu fluide, un moyen de filtration (6) du milieu fluide sous la forme d'un filtre immergé dans ce dernier et présentant une enveloppe tubulaire filtrante (9), capable de filtrer au moins une fraction desdites cellules, des moyens pour entraîner (4, 5, 15-18) ce filtre dans un sens de rotation (FI, F2) autour de son axe longitudinal, et des moyens pour soutirer (25) hors du filtre un filtrat parvenu à l'intérieur de l'enveloppe tubulaire filtrante (9), et un moyen d'agitation (10, 21, 22) du milieu fluide, capable de fonctionner simultanément au moyen de filtration, caractérisé en ce que le moyen d'agitation (10, 21, 22) du milieu fluide (2) est agencé autour de l'enveloppe tubulaire filtrante (9).
15. Dispositif suivant la revendication 14, caracté¬ risé en ce que le moyen d'agitation est un ruban hélicoïdal (10) disposé autour de l'enveloppe tubulaire filtrante (9), éventuellement sur toute la hauteur de celle-ci.
16. Dispositif suivant la revendication 15, caracté¬ risé en ce que le ruban hélicoïdal (10) est fixé par endroits sur l'en¬ veloppe tubulaire filtrante (9), avec un bord interne du ruban situé à une faible distance (d) de ladite enveloppe, notamment de l'ordre de 0,5 à 5 mm.
17. Dispositif suivant l'une des revendications 15 et 16, caractérisé en ce que le ruban hélicoïdal (10) est disposé de manière à pouvoir émerger partiellement au-dessus du milieu fluide (2). IS. Dispositif suivant la revendication 14, caracté¬ risé en ce que le moyen d'agitation est formé de pales (21) entraînées en rotation autour de l'enveloppe tubulaire filtrante (9) susdite.
19. Dispositif suivant l'une quelconque des revendi¬ cations 14 à 18, caractérisé en ce que le filtre est immergé jusqu'à une faible distance (D) du fond de la cuve (1), notamment de l'ordre de 1 cm.
20. Dispositif suivant l'une quelconque des revendi¬ cations 14 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour entraîner en rotation (4, 5, 15-20) le moyen d'agitation dans un sens (FI) différent du sens de rotation (F 2) du filtre. 21. Dispositif suivant l'une quelconque des revendi¬ cations 14 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour entraîner en rotation (4, 5) le moyen d'agitation dans le même sens que le sens de rotation (FI) du filtre.
22. Dispositif suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 14 à 21, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour entraîner en rotation (4, 5) le moyen d'agitation à une vitesse variable.
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