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WO1992007960A1 - Method of detecting non-a non-b hepatitis specific gene and reagent composition used therefor - Google Patents

Method of detecting non-a non-b hepatitis specific gene and reagent composition used therefor Download PDF

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Publication number
WO1992007960A1
WO1992007960A1 PCT/JP1991/001452 JP9101452W WO9207960A1 WO 1992007960 A1 WO1992007960 A1 WO 1992007960A1 JP 9101452 W JP9101452 W JP 9101452W WO 9207960 A1 WO9207960 A1 WO 9207960A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hepatitis
blood
probe
seq
nucleic acid
Prior art date
Application number
PCT/JP1991/001452
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Terukatsu Arima
Osami Yamamoto
Masayuki Tsuchiya
Masanobu Oshima
Mitsuro Yagasaki
Yukio Matsuoka
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
Publication of WO1992007960A1 publication Critical patent/WO1992007960A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a blood-transmitting non-A non-B hepatitis-specific gene and a reagent for detection. Specifically, a method for detecting a blood-transmitting non-A non-B hepatitis-specific gene, which comprises using all or a part of a DNA sequence encoding a blood-transmitting non-A non-B hepatitis-specific antigen protein And the reagent for detection.
  • hepatitis which is not a type A nor a type B, so-called non-A non-B type, has not yet been identified because the etiological amount of virus is extremely small in vivo. Blood-transmitted non-A, non-B hepatitis accounts for over 90% of post-ring blood hepatitis, and this hepatitis develops in 10 to 20% of people who have received blood ring [Experimental Medicine Vol. 7, 19 6-201 (19989)].
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-2576 discloses that, after the blood of a non-A non-B hepatitis patient is transferred to a chimpanzee and infected, RNA is extracted from the hepatocytes, and the non-A non-B It is stated that hepatitis-specific antigen protein gene was cloned.
  • the probability of diagnosis of non-A non-B hepatitis virus-infected blood of the diagnostic reagent is low, and the cloned gene has a blood-transmitting non-A non-B Considering that the number of bases is not sufficient compared to the expected number of bases of the hepatitis virus gene, and that there may be two or more types of blood-transmitting non-A non-B hepatitis viruses, etc. It's not enough.
  • RNA obtained through chimpanzees is used, and human blood-transmitting non-A, non-B hepatitis Is not directly extracted from humans, so it is not clear whether the cloned DNA faithfully reflects the gene of human non-A, non-B hepatitis virus, and highly accurate diagnosis Given the need for drug and vaccine development, a new approach is essential.
  • RNA directly from the blood of patients with non-A, non-B hepatitis and reported the results using the method described later (Experimental Medicine Vol. 7, 1). 9 6— 2 0 1 (1 9 8 9)) o
  • RNA directly from hepatocytes or blood of non-A non-B hepatitis patients and, based on this RNA, obtained a blood-transmitting non-A non-B hepatitis-specific antigen protein.
  • the non-A, non-B hepatitis-specific antigen protein thus obtained is used for diagnosis of non-A, non-B hepatitis by measuring antibodies against these antigen proteins using blood samples or tissue samples. It is a useful reagent.
  • hepatitis B the appearance time or amount of the antibody against the virus antigen protein varies depending on the course of the patient, and also varies depending on the type of the antigen protein. In general, no antibody appeared at the beginning of infection, and antibodies to HBc (hepatitis B virus core protein) and HBe (hepatitis B virus protein) appeared after about three months. It is said that a few months later, HBs (hepatitis B virus surface antigen) antibodies will appear (Hiroshi Suzuki, hepatitis, Nanundo, 1989).
  • the present inventor uses a probe and / or primer based on the nucleotide sequence of a DNA clone successfully cloned by the inventor as a means for directly determining the presence of a non-A non-B hepatitis-specific pathway gene. As a result, the present inventors have found that it is possible to detect a non-A non-B hepatitis-specific gene, and based on this, completed the present invention.
  • the present invention relates to a method for detecting a non-A non-B hepatitis-specific gene by a specific gene amplification method using a primer and a hybridization (duplex formation) method using a probe.
  • a non-A non-B hepatitis-specific gene characterized by using the nucleotide sequence of cDNA or a part thereof inserted into any of the phage clones shown in Table 1 as a probe and a primer or a primer. And a reagent therefor.
  • FIGS. 1 and 2 show the phage vectors AH C225, 56, 220, 222, 224, 232, 223, and 222.
  • the method for detecting a non-A non-B hepatitis-specific gene using a probe and / or a primer in the present invention is based on the principle of molecular hybridization (duplex formation) of nucleic acids (Maniatis T. et al., Molecular Cloning Laboratory). nanual, Cold Spring Harbor Press).
  • the exogenous probe when exogenous nucleotide proteins (probes) are introduced into a denatured nucleic acid sample, the exogenous probe binds to a sequence portion complementary to these denatured nucleic acids to generate double fragments. .
  • This reaction is basically the same whether the nucleic acid is RNA or DNA.
  • the degree of stability of the resulting duplex depends on the degree of entrapment of the nucleic acid sequence in the duplex. Therefore, in order to detect non-A, non-B hepatitis-specific genes efficiently, it is necessary to use probes and primers or primers that can form bispecific proteins in the nucleic acid sample to be assayed. It becomes important.
  • probe or primer to be used is specific to the nucleotide sequence of the nucleic acid sample to be assayed and has a sufficiently long chain length, specific and stable formation of a double strand can be achieved in distinction from other similar nucleic acid sequences.
  • Substance labeled on the probe can be appropriately measured to determine the presence of a specific nucleic acid sequence in a given nucleic acid sample.
  • Non-A non-B hepatitis viruses or specific nucleic acids are said to be present in very small amounts in blood and tissues.
  • the target nucleic acid can be identified more sharply by amplifying the target nucleic acid using a primer having a specific sequence and then forming a duplex with the probe.
  • the target nucleic acid can be identified by sufficiently amplifying the target nucleic acid using the primer as described above and then staining the nucleic acid using ethidium ore.
  • the present inventors have prepared a DNA clone coding for a non-A non-B hepatitis-specific antigen protein based on a hepatocyte and a blood sample of a non-A non-B hepatitis-derived liver cancer patient. ⁇ has been successfully isolated. As shown in Table 1, these DNA clones are inserted into phage and deposited as recombinant phage HC at the Patent Microorganisms Depositary of the National Institute of Microbial Technology, and a part of them is collected in Budapest. International deposit under the Treaty. Table 1 Fage Domestic Deposit Number
  • the DNA sequence contained in these clones can be part of the non-A, non-B hepatitis virus itself or a closely related nucleic acid.
  • the DNA sequence or any portion of any of the clones listed in Table 1 or the RNA corresponding to this DNA may be a non-A non-B based on DNA-DNA, DNA-RNA or RNA-RNA hybridisation. It will be an extremely specific probe for the detection of hepatitis-specific genes.
  • a part of the DNA sequence contained in any of the clones in Table 1 and a complementary strand thereof serve as a primer in the gene amplification method.
  • their base sequences are not necessarily identical, and there are considerable mutations. Therefore, a pro- cedure for detecting non-A non-B hepatitis-specific genes.
  • a probe or primer capable of hybridizing with as wide a range of mutants as possible as a primer for amplifying a gene specific to a probe or hepatitis.
  • a base sequence portion having less mutation may be used among the above sequences of each clone.
  • a base sequence portion for example, in the region where two or more corresponding base sequences are shown in FIGS. 1 and 2, arbitrarily select two base sequences.
  • the homology of the base sequences between them is examined, and a region where the homology is equal to or more than a predetermined value may be selected irrespective of the choice of the above two base sequences.
  • the degree of such homology is greater than 80%, preferably greater than 90%, and more preferably greater than 95%.
  • the length of the homology region satisfying the above conditions is generally 25 mer or more, preferably 3 O mer or more.
  • HC 2 248, ⁇ HC 2 220 and HC 2 216 are ⁇ , and in No. 3, only HC 221 1 is ⁇ and in others, G is G ing.
  • Each clone is one base difference from each other. As a result, the mismatch rate is only about 3.4%, so that even if there is no perfectly matched consensus sequence, it can function sufficiently as a probe.
  • the sequence from 67 to 103 if the sequence of / IHC2206 is selected as a probe, there will be a single base difference between each clone. You can make an effective probe with it.
  • hybridization can be carried out by inserting a base such as 5-fluorouracil (5-FU) or inosine (I) at the corresponding position.
  • a base such as 5-fluorouracil (5-FU) or inosine (I)
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • I inosine
  • a part of the base sequence of each clone is, of course, the optimal probe for detecting those clones, but if the probe is long enough, there may be a difference of one or two bases.
  • the target base sequence can be detected.
  • the nucleotide sequence of the probe selected in this way is specific to non-A non-B hepatitis, and the same can be considered for primer selection.
  • the degree of mutation of the base in the base sequence used for the probe or primer should be within 10 to 15% of the base sequence of the probe or primer (that is, 85 to 95% or more).
  • non-radioactive labels are also well-known in addition to 32 P radioactive labels (Toyozo Takahashi, DNA probe technology and application 1, CMC, 1988)
  • the probe is devised for non-radiolabeling so as not to compromise the efficiency of the hybridization.
  • a probe with high detection efficiency can be prepared by inserting a special linker that can bind a chemiluminescent substance or fluorescent dye between bases in the base sequence of the DNA probe ( Arnold et al., Clinical Chemistry Fifteen
  • the region containing the target base sequence can be detected by gene amplification as described above.
  • the region to be gene-amplified is usually a region having a length of 100 bases or more, and the gene is enzymatically amplified using a primer.
  • a probe or a primer As an indicator for constructing a probe or a primer, the above-mentioned indices have been shown, but the present invention does not always follow this concept, and a probe or primer that does not conform to this concept is used. However, it can be used to detect non-A non-B hepatitis-specific genes.
  • preferred examples of the probe are shown in Table 2.
  • Preferred examples of the primer include the respective base sequences shown in Table 3 and the base sequences of their complementary chains.
  • the position indicated by X is the insertion position of the linker for binding the substance when detecting with a coloring substance, fluorescent substance, or chemiluminescent substance. This is an example. Other positions may be inserted.
  • the linker has an NH 2 group or a C-OH group, and a non-radioactive substance-labeled probe can be prepared by binding a coloring substance, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or the like to these groups.
  • a non-radioactive substance-labeled probe can be prepared by binding a coloring substance, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or the like to these groups.
  • commercially available linkers can be used for the linker.
  • RNA from serum and liver tissue was performed using guanidinium thiocyanate (GTC) according to the method of P. Chomczynski et al.
  • Example 2 Among recombinant phages containing cDNA encoding a non-A non-B hepatitis-specific antigen protein, HC2232, ⁇ HC232, ⁇ HC22, and HC22 High homology is recognized in cDNA base sequences of 58, HC2248, 1 HC222, AHC222, AHC221, and IHC221.
  • oligonucleotides having the following nucleotide sequences were synthesized as primers and probes from regions having particularly high homology in the nucleotide sequence of each cDNA. The synthesis was carried out using an automatic DNA synthesizer (Abrido Biosystems; 380 A type). Primer (PR)
  • PR 1 5'-CTGCACAGGTACGCTCCGGC- 3 '(SEQ ID NO: 51)
  • PR 2 5'-CTCCTGCGGGATGAGGTCAC- 3 '(SEQ ID NO: 52)
  • scDNA single-stranded complementary DNA
  • the primers PR1 and PR4 were added to the obtained sc DNA at 10 O pmol, respectively, and the gene was amplified by PCR using Taq DNA polymerase using the DNA Amplification System (Zenzo). . After heating for 92 to 3 minutes, the reaction was repeated for 30 to 40 cycles of heating at 92'C for 2 minutes, 40'C for 2 minutes, and 72 to 2 minutes.
  • hybridization buffer 60 mM Tris-HCI (pH 8.0), 160 mM NaCl, 6 mM). . 7 mM M g C 1 2 ), 5 ' end 32 P-labeled probe was added, 6 Te 0, and heated for 15 minutes. This mixture was equilibrated with 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 300 mM NaCl, and 1 mM EDTA. Column chromatography using Sephadex G-75 (Pharmacia).
  • the primers “PR2j” and “P3” were added to the PCR reaction solution, and a gene amplification of 30 to 40 cycles was performed in the same manner.
  • the resulting reaction solution was subjected to electrophoresis using an 8% polyacrylamide gel, and after electrophoresis, stained with ethidium bromide.
  • bp band was detected, but not detected in the serum-derived RNA of a similarly treated healthy individual, indicating that non-A non-B type specifically amplified in non-A non-B hepatitis patients. The presence of a hepatitis-specific gene was confirmed.
  • Example 3 Recombinant phage HC2256, AHC22
  • PR 6 5 '-AGTCCCAAACATCCCTGAGCCA-3' (SEQ ID NO: 57)
  • PR 7 5'-TGCCCTCCACCGAGGACCTGG-3 '(SEQ ID NO: 58)
  • PR 8 5'-CGCTTTCAGGCACATAATGCGT- 3 '(SEQ ID NO: 59)
  • SEQ ID NO: 60 nucleotide sequence of 277-307 of cDNA inserted into ⁇ HC2256, 0.5 g of random primer and RNA prepared in Example 1 were mixed, and the same procedure as in Example 2 was carried out.
  • primers “PR 7” and “PR 8” were added to the above PCR reaction solution, and gene amplification of 30 to 40 cycles was performed in the same manner.
  • the resulting reaction solution is treated with 8% polyacrylamide gel. After electrophoresis, staining with ethidium mouth was performed.
  • the gene was specifically amplified by the primers “PR7j and ⁇ PR8” to about 150 bp. This band confirmed the presence of the specifically amplified non-A non-B hepatitis-specific gene.
  • no band of 15 O bp was observed when RNA from healthy human serum treated in the same manner was used.
  • Example 3 One-tenth of the total amount of the reaction solution subjected to gene amplification in Example 3 was heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, and then rapidly cooled, and the probe CP 5 (X in the probe base sequence shown in Table 2) was added thereto. Indicates the position of linker (Amino Modifier II ZC10ntech), and the linker is labeled with an acrylic ester. A hybrid solution (0, 1 MN) is used. a Diluted with C 110 mM Tris-HCl (pH 6.0), 1 mM EDTA) was added, and the mixture was incubated at 60 ° C for 30 minutes.
  • RNA extracted from non-A and non-B hepatitis patients and liver tissue was added 0.1 M sodium borate (pll 7.6), and the mixture was incubated at 60 ° C for 10 minutes to remove the probe's acrylic ester which did not hybridize with the target substance. After hydrolysis, Eta 2 0 and N a 0 Eta solution was added, more luminometer, chemiluminescence amount was measured (see, supra a Rnold et al). As a result, detection was performed using RNA extracted from non-A and non-B hepatitis patients and liver tissue.
  • New paper 24 The luminescence was measured and the non-A non-B hepatitis-specific gene could be detected sharply.However, non-A non-B hepatitis-specific gene No chemiluminescence indicating the presence of was found.
  • oligonucleotides prepared based on the nucleotide sequence of cDNA encoding a non-A non-B hepatitis-specific protein can be extracted from non-A non-B hepatitis patients by using them as primers and probes.
  • Non-A, non-B hepatitis-specific pathogens contained in the isolated RNA can be detected.
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Description

明 細 書 ' 非 A非 B型肝炎特異的遣伝子の検出方法及び 検出用試薬組成物 技術分野
本発明は血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出方 法並びに検出用試薬に関する。 詳し く は血液伝播性非 A非 B 型肝炎特異的抗原蛋白質をコー ドする D N A配列の全部又は 一部を用いることを特徴とする血液伝播性非 A非 B型肝炎特 異的遺伝子の検出方法並びに検出用試薬に閔する。
背景技術
ゥィルス性肝炎のうち A型及び B型についてはすでにその ゥィルスが発見され免疫学的な方法による診断も可能となつ ており、 これらのウ ィ ルスに対するワクチンも開発されてい る。 しかしながら A型でもなく B型でもないいわゆる非 A非 B型といわ'れる肝炎に関しては病因ゥィルス量が生体内で極 めて微量であるため実体が明らかにされていないのが現状で ある。 血液伝播性非 A非 B型肝炎は輪血後肝炎の 9 0 %以上 を占め、 輪血をうけた人の 1 0〜 2 0 %にこの肝炎が発症す る 〔実験医学 7巻、 1 9 6 - 2 0 1 ( 1 9 8 9 ) 〕 。
血液伝播性非 A非 B型肝炎に関連した抗原蛋白質の検索は い く つかの研究者により患者の血液を材料として展開されて いる。 例えば C h o o ら （ S c i e n c e、 2 4 4巻、 3 5 9 - 3 6 2 ( 1 9 8 9 ) ) 及びヨーロ ッパ出願公開 0 3 1 8 2 1 6 A 1 によ り血液伝播性非 A非 B型肝炎患者の 血液をチンパンジーに移入して感染させた後その血清から R N Aを抽出し、 この R N Aから調製される c D N Aライブラ リーより非 A非 B型肝炎ゥィルス遺伝子の一部を単離した旨 の報告がなされている。 このウイルス遺伝子断片を基にして 作られた免疫学的手法による診断試薬を用いて我国の血液サ ンプル試験の結果非 A非 B型肝炎ゥィルスに感染した血液を 6 0〜 7 0 %の確率で診断できるとの報告もされている （厚 生省肝炎研究連絡協議会報告 1 9 8 9 , 3 . 1 3 ) 。
一方、 特開昭 64— 2576には、 非 A非 B型肝炎患者血液をチ ンパンジーに移入して感染させた後、 その肝細胞から R N A を抽出し、 この R N Aを用いて非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋 白質遺伝子をクローン化した旨述べられている。
前者においては診断試薬の非 A非 B型肝炎ウイルス感染血 液に対する診断確率が低いこと、 又該報告者がその論文中で も述べている如く クローン化された遺伝子が血液伝播性非 A 非 B型肝炎ウイルス遺伝子の想定塩基数に比べ充分な数でな いこと、 血液伝播性非 A非 B型肝炎ウイルスは 2種以上存在 する可能性のあることなどを考え合せると得られた知見はき わめて不十分なものである。
後者においてはクローン化された遺伝子がヒ ト非 A非 B型 肝炎特異的である直接的証拠が示されていない。
上記いずれの場合にもチ ンパンジーを介して得られた R N Aが使用されており、 ヒ ト血液伝播性非 A非 B型肝炎ヒ ト患 者から直接的に R N Aを抽出したものではないため、 ク ロー ン化された D N Aがヒ ト非 A非 B型肝炎ウィルスの遺伝子を 忠実に反映しているか否か明らかでなく、 確度の高い診断試 薬さらにはワクチン開発が要望されていることを考えると新 たなアプローチが必須である。
そのひとつとして本発明者の 1人はすでに非 A非 B型肝炎 患者血液より直接 R N Aを抽出し、 本発明人が後述する方法 を用いてその成果を報告している 〔実験医学 7巻、 1 9 6— 2 0 1 ( 1 9 8 9 ) ) o
本発明者は鋭意研究を行った結果、 非 A非 B型肝炎患者の 肝細胞、 または血液から直接 R N Aを抽出し、 この R N Aに 基づいて血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋白質をコー ドする D N Aのク ローユングに成功し、 それらの D N Aを大 腸菌にて発現することに成功した。 この様にして得られた非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋白質は、 血液試料あるいは組織試 料を用いて、 これらの抗原蛋白質に対する抗体を測定するこ とによる非 A非 B型肝炎の診断に有用な試薬となる。
一方、 B型肝炎においてはウィ ルス抗原蛋白質に対する抗 体の出現時期、 あるいはその量は患者の経過により異なり、 また抗原蛋白質の種類においても異なる。 一般的に、 感染初 期には抗体の出現はな く、 約 3 力月以降に H B c ( B型肝炎 ウィルスコア蛋白） 、 H B e ( B型肝炎ゥィルスェンベロ一 ブ蛋白） に対する抗体が出現し、 さ らに数力月後、 H B s ( B型肝炎ウィ ルス表面抗原） 抗体が出現すると言われてい る （鈴木宏編、 肝炎、 南雲堂、 1 9 8 9 ) 。 非 A非 B型肝炎においても、 ある特定の抗体の出現とその 抗原逭伝子の存在が必ずしも一致しないと言う報告がある (A. J. Weiner b Lancet 335巻 1頁（1990) ； J . Λ . Garson ζ> Lance t 335巻 1419頁（1990)) 。
以上のことを考慮すると、 非 A非 B型肝炎ゥィルスの存在 を直接確かめることによる、 非 A非 B型肝炎の確定診断法の 開発が望まれる。 発明の開示
本発明者は非 A非 B型肝炎特異的道伝子の存在を直接判定 する手段として、 本発明者がクローユングに成功した D N A ク ローンの塩基配列に基づく プローブ及び/又はブライマ一 を利用することにより、 非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出 が可能との知見を得、 それに基づき本発明を完成した。
即ち本発明はプライ マーを用いた特異的な遣伝子増幅法と プローブを用いたハイブリダィゼーショ ン （二本鎖形成） 法 による非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出法において、 第 1 表に示すファージク ローンのいずれかに挿入されている c D N Aの塩基配列又はその一部をプローブ及びノ又はブラィ マ 一として用いるこ とを特徴とする非 A非 B型肝炎特異的遺伝 子の検出方法及びそのための試薬に関する。 図面の簡 ij な説明 第 1図及び第 2図はファ ージベクター A H C 2 2 5 6、 同 2 2 0 7、 同 2 2 4 4、 同 2 2 3 2、 同 2 2 3 0、 同 2 2
斩たな 用 4 / 1 、 同 2 2 5 8、 同 2 2 4 8、 同 新たな用紙 5
2 2 2 0、 同 2 2 4 6 , 同 2 2 1 1および同 2 2 1 6 の挿入 部の塩基配列の相同性を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明におけるプローブ及び/又はプライマ一を用いた非 A非 B型肝炎特異的遣伝子の検出法は、 核酸の分子ハイプリ ダイゼーショ ン（二本鎖形成）の原理（Maniatis T.等 Molecular Cloning Laboratory nanual , Cold Spring Harbor Press)に 基づいている。
この方法によれば、 変性させた核酸試料に外来性ヌク レオ チ ド鎮 （プローブ） を導入した際、 これらの変性した核酸と 相補的な配列部分に外来性プローブが結合し二本鎮を生じる。 この反応はその核酸が R N Aでも D N Aでも原理的には同じ である。 しかし、 生じた二本鎖の安定性の程度は、 この二本 鎖内の核酸配列の柑捕性の程度により異なる。 従って効率よ く非 A非 B型肝炎特異的遣伝子の検出を行なうには、 検定さ れる核酸試料に対して極めて特異的にニ本鎮形成するプロ一 ブ及びノ又はプライマーを用いることが重要となる。
ニ本鎮形成の条件はこの分野において用いられている参考 書等 （J,Sambrook等 Molecular Cloning 9.47, 11.45, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) に詳細に述べられ ているが、 いずれにしても用いるプローブ又はプライマーが 検定される核酸試料の塩基配列に特異的であり、 鎖長が十分 長ければ、 他の類緣核酸配列とは区別して特異的かつ安定な ニ本鎮形成が達成され、 例えばプローブに標識された物質 (色素、 化学発光物質あるいは放射性物質） を適宜測定して 与えられた核酸試料中に特異的な核酸配列の存在を確定する ことができる。
非 A非 B型肝炎ゥィルスあるいは特異的核酸は、 血液や組 織中に極微量にしか存在しないと言われている。 このような 微量の核酸を同定する場合、 それらの核酸を直接上記の如く のプローブにて検出することは困難が伴う。 従ってこのよう な場合、 特異的な配列からなるブライマ一を用いて標的とす る核酸を増幅したのち、 プローブと二本鎖形成することによ り、 より鋭敏に目的核酸を同定することができる。 また、 前 記の如きプライマーを用いて標的とする核酸を十分に増幅し たのち、 ェチジゥムブ口マイ ド等を用いて核酸を染色するこ とにより目的の核酸を同定することもできる。 このような核 酸の遺伝子増幅法は既にい くつかの方法が知られており （実 験医学 Vo l . 8 No . 9 (1990)羊土社 P C Rとその応用） 、 それ らの遣伝子増幅方法を適用できる。
本発明者は、 先にも述べた如く、 非 A非 B型肝炎由来肝癌 患者の肝細胞及び血液試料を基にして非 A非 B型肝炎特異的 抗原蛋白をコー ドする D N Aク ローン 6 1偭を単離すること に成功している。 これらの D N Aク ローンは第 1表に示すと おりであり、 それぞれファージに挿入して組換えファージス H Cとして微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに 寄託してあり、 更にその一部はブダぺス ト条約に基づき国際 寄託してある。 第 1 表 フ ァ ージ 国内寄託番号
ク ロ 一 ン Να (微ェ研菌寄） (微ェ研条 λ Ε C A Q 2 1 β
U o q ス H C A Q 6 1 u R o q Q o
Λ H C 1 2 1 n β o A 1 2 9 5 1
A H C o 0 2 1 n \j P o Λ 9 λ E C 9 4 1 P o Q Q ス H C ? 6 1 n R u f At
λ U C 0 9 0 6 1 u Q o A
¾ u p 2 9 5 2
A H C 9 9 0 7 1 n P o A R u 2 9 5 3 ス H C 9 9 1 1 0 u R (J 7 R u 2 9 5 6 ス H C 2 9 1 6 1 n R u 7 7 2 9 5 7 λ H C 9 0 1 7 1 n u 0 o ϋ 9
A H C . 9 9 2 0 1 n U 0 O o Q 2 9 5 4
A R C 2 2 2 5 1 0 8 5 4
A H C 2 4 0 4 C 1 0 8 9 9
λ n c 2 4 0 5 B 1 0 9 0 ひ
A H C 2 4 1 0 A 1 0 9 0 5
λ E C 2 4 1 0 C 1 0 9 1 8 2 9 6 7
Λ H C 2 4 1 0 D 1 0 9 3 4
A H C 2 4 1 3 1 0 9 1 9
A E C 2 4 1 4 A 1 0 9 0 6
λ E C 2 4 2 4 A 1 0 9 1 1 l ¾ (続き） フ ァ ージ 国内寄託番号 S 審 Ιί悉号 ク ロー ン Ncx (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄） H C 2 5 0 1 1 0 9 2 0
A H C 2 5 0 2 1 0 8 4 7
λ U C 2 5 0 5 1 0 9 2 1
H C 2 5 0 7 1 0 9 3 5
A H C 2 5 0 8 1 0 8 5 9
λ E C 2 5 0 9 1 0 9 3 6
A H C 2 5 1 2 1 0 8 8 2
λ n c 2 5 1 4 1 0 8 6 0
ス H C 2 5 1 6 1 0 8 6 1
A H C 2 5 3 3 1 0 9 0 7 2 9 6 3 λ U C 2 5 3 4 1 0 9 3 7
λ n c 2 5 3 5 1 0 8 8 3
ス H C 2 6 0 2 1 0 9 0 8
H C 2 6 0 3 B 1 0 9 2 2
ス H C 2 6 0 7 1 0 9 0 9 2 9 6 4
Λ H C 2 2 3 0 1 0 9 1 6 2 9 6 6
A H C 2 2 3 2 1 0 9 3 0 2 9 6 8 ス H C 2 2 3 9 1 0 9 3 1
λ E C 2 2 4 0 1 0 8 5 5
λ E C 2 2 4 1 1 0 8 5 6
λ E C 2 2 4 2 1 0 8 5 7 (続き） フ ァ一ジ 国内寄託番号 国際寄託番号 ク CIーン No. (微ェ研菌寄） (微ェ研条寄）
A H C 2 2 4 3 1 0 8 7 8
A H C 2 2 4 4 1 0 8 7 9 2 9 5 8
Λ H C 2 2 4 6 1 0 8 5 8 2 9 5 5 H C 9 2 4 8 1 0 8 8 n 2 9 5 9
A H C 2 2 4 9 1 o 9 1 7
A H C 2 9 5 0 1 o 9 o 4
ス H C 2 2 5 2 1 o 8 8
λ E C 2 2 5 5 1 o R u R u q
λ E C 2 2 5 6 1 R Q 0 2 9 6 0
A H C 2 2 5 8 1 o 8 9 1 2 9 6 1 λ C 2 2 5 9 1 0 8 9 2
A H C 2 2 6 3 1 0 8 9 3
Λ H C 2 2 6 4 1 0 9 3 2
A H C 2 2 6 5 1 0 9 3 3
λ H C 2 2 6 8 1 0 8 9 4
A H C 2 2 7 0 1 0 8 9 5 2 9 6 2 λ E C 2 2 7 1 1 0 8 9 6
λ E C 2 6 0 8 1 0 9 2 3
Λ H C 2 6 1 0 1 0 9 1 0 2 9 6 5 これらの各クローンに舍まれる c D N Aのコードする蛋白 質の血清学的反応は、 きわめて非 Α非 Β型肝炎特異的であつ 10 たことから、 これらのク ローンに舍まれる D N A配列は非 A 非 B型肝炎ウイルス自身の一部か、 密接に関連した核酸であ るといえる。 従って、 第 1表に示すクローンのいずれかに舍 まれる D N A配列またはその一部あるいはこの D N Aに対応 する R N Aは、 D N A— D N A, D N A— R N Aまたは R N A— R N Aハイ ブリダィゼーシヨ ンに基づく非 A非 B型肝炎 特異的遺伝子の検出法において、 きわめて特異性の高いプロ ーブになり う る。 また第 1表のクローンのいずれかに舍まれ る D N A配列の一部およびそれらの相補鎖は、 遺伝子増幅法 におけるプライ マーとなる。
これらのファージク ローンの内、 国際寄託されている 1 8 株については、 その c D N A揷入部の塩基配列が配列番号 ： 1 〜配列番号 ： 1 8に示されている。 これらの配列の相互の 相同性を比較し相同性の高い c D N Aの塩基配列を並置した ものを第 1図及び第 2図に示す。 この様な塩基配列の比較か ら、 これらのクローンは、 限られた一定の領域をコー ドして いることが明らかである。 例えば、 クローン / I H C 2 2 δ 6 , A H C 2 2 0 7およびス H C 2 2 4 4 は一部分で重 なっており、 また / I H C 2 2 3 2 , λ E C 2 2 3 0 , λ H C 2 2 0 6 , ス H C 2 2 5 8 , R C 2 2 4 8 , λ H C 2 2 2 0 , H C 2 2 1 6 , I H C 2 2 4 6及び ス H C 2 2 1 1 はほとんど重なっている。 しかしながら、 このク ローンの塩基配列が対応している部分は、 それらの塩 基配列が必ずしも同一ではなく、 かなりの変異が存在する。 従って、 非 A非 B型肝炎特異的遺伝子を検出するためのプロ ーブ又は肝炎特異的遺伝子増幅用のプライマーとしては、 で きるだけ広範な変異体とハイプリダイズし得るプローブ又は プライマーを使用するのが好ましい。 このためには、 各クロ ーンの上記配列の内、 変異の少ない塩基配列部分を用いれば よい。
この様な塩基配列部分を選択するには、 例えば第 1図及び 第 2図中の対応する 2種類以上の塩基配列が示されている領 域において、 任意に 2種類の塩基配列を選択してそれらの間 の塩基配列の相同性を調べ、 1上 1記 2種類の塩基配列をどのよ うに選択しても相同性が所定の値以上である様な領域を選択 すればよい。 この様な相同性の程度は 8 0 %以上であり、 好 ましく は 9 0 %以上であり、 そしてさらに好ましく は 9 5 % 以上である。 上記の様な条件を満たす相同性領域の長さは一 般に 2 5 mer 以上であり、 好ましく は 3 O mer 以上である。
この様な観点から、 プローブ用の塩基配列を選択すれば、 例えば、 第 1図においては、 / 1 H C 2 2 5 6 と / 1 H C 2
2 0 7の共通部分として、 塩基番号 3 0 0番から 3 4 3番、
3 4 8番から 4 1 2番、 4 1 4番から 4 4 2番、 4 5 3番か ら 4 8 5番、 及び 4 9 8番から 5 2 6番、 また、 ス H C 2 2 5 6 , ス H C 2 2 0 7及びス H C 2 2 4 4 の共通部分 として、 6 7 8番から 7 0 3番、 7 1 4番から 7 3 9番、 7 8 3番から 8 4 7番、 さらには 8 5 4番から 8 8 4番の塩基 配列が挙げられる。 さ らに、 2 7 7番から 3 0 7番の配列に おいては、 2 9 9番の塩基が H C 2 2 5 6では Τ、 λ Η C 2 2 0 7では Aとなっている。 また 7 5 0番から 7 8 1 12 番の配列においては、 7 5 8番の塩基が H C 2 2 5 6で は C、 I H C 2 2 0 7および / I H C 2 2 4 4ではどちら も Tとなっている。 この場合、 前者の場合は 2 9 9番の塩基 が A、 また後者の場合は 7 5 8番の塩基が Tとなるようなプ ローブを作製して用いても、 3 0 nier のプローブならばミ ス マッチの率が約 3. 3 %となり、 ス H C 2 2 5 6 は十分に 検出可能である。 同様に、 第 2図に示した 9 ク ローンの領域 において、 同じ様な考え方を適用すると、 これらの 9 クロ一 ンの塩基配列上に 3 0 mer 以上の長さですベて共通の一致し た配列は存在しない。 しかしながら、 1番から 3 0番の 3 0 mer の配列、 2 2番から 5 0番の 2 9 mer の配列、 6 7番か ら 1 1 3番の 4 7 mer の配列、 1 5 5番から 1 9 1番の 3 7 mer の配列、 2 2 6番から 2 6 6番の 4 1 mer の配列、 2 9 6番から 3 3 2番の 3 7 mer の配列、 3 4 0番から 3 7 1番 の 3 2 mer の配列、 3 6 1番から 4 4 3番の 8 3 mer の配列 などは比較的変異が少ない。 比較的変異の少ない配列として はこれらの他、 取り方によって例えば 2 3 5番から 2 6 9番 の配列も比較的変異の少ない配列として取ることができるの で、 上記に示した配列は一例であることが容易に理解される。 これらの配列の中で、 例えば、 2 2番から 5 0番の配列を見 ると、 2 7番の位置ではス H C 2 2 4 6のみが Aとなって おり他のク ローンでは G、 3 1番ではス H C 2 2 4 8 , λ H C 2 2 2 0およびス H C 2 2 1 6が Τとなっており他 はじ、 3 3番では H C 2 2 1 1 のみが Αで他は Gとなつ ている。 各ク ローンの間ではお互いに 1塩基の違いになって 13 いることから、 ミスマッチの率は約 3. 4 %におさまるので、 たとえ完全に一致した共通配列がなくてもプローブとして十 分機能する。 また 6 7番から 1 0 3番の配列において、 プロ ーブとして / I H C 2 2 0 6の配列を選ぶと各クローン間で はそれぞれ 1塩基の違いとなるので、 3 0 mer 以上の長さを 持つ有効なプローブを作ることができる。
各クローン間で同じ位置にいくつかの変異が起こつている よゔな場合には、 該当する位置に 5 —フルォロウラ シル （ 5 - F U ) あるいはイノ シン （ I ) 塩基を入れることにより、 ハイブリダィゼ一シヨ ンに影響を与えずに、 プローブの機能 を維持することができる（Y.Takahashiら、 Proc. Natl . Acad. Sci. USA 82 巻 1931— 1935頁（1985) ； T.Kodamaら、 Nature 343巻 531頁（1990)) 。 この様な手法を応用すると、 プロ一 ブとなり うる場所の範囲はさらに広げることができる。 例え ば、 第 1図及び第 2図中の対応する 2種類以上の塩基配列が 並記されている領域において、 これらの塩基配列相互間で塩 基が異なる場合、 その異なる塩基のいずれか一方を 5 —フル ォロウラシル又はィノ シンにより置換するとして、 任意に選 択された 2種類の塩基配列間の相同性がいずれの 2種類の塩 基配列を選択しても 8 0 %以上であるような 2 5 mer 以上の 領域を選択し、 この領域に属する前記 5 —フルォロウラシル 又はイノ シンで置換された塩基配列を有する D N Aを用いる ことができる。 この場合、 4個以下の塩基の置換によって上 記の条件を満たす領域を用いることが好ましい。 この様な例 として、 3 0 1番から 3 3 0番の配列を例にとると、 3 0 6 14 番、 3 0 9番、 3 1 8番、 及び 3 2 4番に 5 — F Uあるいは I を入れ、 3 0 mer のプローブを作ることができる。
さらに各ク ローンの塩基配列の一部分は当然のことながら、 それらのクローンを検出するための最適なプローブであるが、 プローブの長さが充分であれば、 1塩基や 2塩基の違いのあ る標的塩基配列を検出することができる。 もちろん、 このよ うにして選んだプローブの塩基配列は非 A非 B型肝炎に特異 的であることが前提であり、 プライ マーの選択についても同 様に考えられる。 プローブあるいはプライマーに利用する塩 基配列中の塩基の変異の程度は、 特異的な診断に利用するこ とからプローブあるいはブライマーの塩基配列の 1 0〜 1 5 %以内 （すなわち相同性が 8 5〜 9 5 %以上） にしておく こ とが望ましい。
実際に、 これらのプローブを用いて非 A非 B型肝炎を診断 するには、 試料中の核酸とハイプリ ッ ト形成をしたプローブ を検出する ことが必要であり、 そのためにプローブにはし力、 るべき標識が施されていなければならない。 標識にはさきに 述べたように、 32Pによる放射標識のほか、 非放射標識もよ く知られており （高橋豊三著、 D N Aプローブ一技術と応用一、 シーエム シー、 1 9 8 8 ) 、 ハイブリダィゼーショ ンの効率 を損なわないようにして、 非放射標識化のための工夫がプロ ーブに施されている。 例えば、 D NAプローブの塩基配列の 塩基と塩基の間に、 化学発光物質あるいは蛍光色素などが結 合できるような特殊なリ ンカーを挿入し、 検出効率の高いブ ローブを作製することもできる（Arnoldら、 Clinical Chemistry 15
35巻 1588 (1989) ) 。
標的とする R Aあるいは D N Aがきわめて微量にしか存 在しないような試料では、 それらの R N Aあるいは D N Aを 直接、 プローブで検出することは困難な場合がある。 このよ うな場合、 さきに述べたように標的塩基配列を舍む領域を遺 伝子増幅して検出することができる。 遺伝子増幅される領域 は通常 1 0 0塩基以上の長さを持つ領域で、 プライマーを用 いて酵素化学的に遺伝子増幅される。
プローブあるいはブライマーを構築する場合の一つの目安 として、 上記の如き指標を示したが本発明にあっては、 必ず しもこの考え方に従う ものではなく、 この考え方に合致しな いプローブあるいはプライマーであっても、 非 A非 B型肝炎 特異的遺伝子の検出に使用しうる。 第 1図及び第 2図に示し た各クローンの中から、 好ましいプローブの例を第 2表に示 した。 また、 好ましいブライマーの例としては第 3表に示し た各塩基配列及びその相捕鎖の塩基配列を挙げることができ る。
なお、 第 2表に示された各プローブの塩基配列中、 Xで示 された位置は発色物質、 蛍光物質、 又は化学発光物質による 検出を行う際にその物質を結合するためのリ ンカー挿入位置 の例である。 これ以外の位置に揷入してもよい。
リ ンカ一は N H 2 基又は Cひ 0 H基等を舍み、 これらの基 に発色物質、 蛍光物質、 化学発光物質などを結合させること により非放射性物質標識プローブを作製できる。 リ ンカ一は 一般に市販されているものが使用でき、 例えば 「アミノ モデ
靳たな用羝 16 ィ フ ァ イ ア一 II」 （ C I o n t e c h社） 「ア ミ ノ リ ンク II」 (アブライ ド ' バイオシステムズ社） が挙げられる。 32 Pに よる放射標識プローブの場合は Xで示したリ ンカーはな くて もよい。
第 2 表 名 称 第 1及び 2図中の位置 長さ 配列番号
C P 1 A #2256 84 - 116 33 19
C P 2 A#2256 141 - 172 32 20
C P 3 A#2256 189 -221 33 21
C P 4 A#2256 258 - 289 32 22
C P 5 A#2207 277 - 307 31 23
C P 6 A#2256 315-347 29 24
C P 7 A#2256 768-798 31 25
C P 8 A#2256 806-838 33 26
C P 9 B #2246 1 -32 32 27
C P 10 B #2206 239-269 31 28
C P U B #2230 340- 369 30 29
C P 12 B #2248 377 -407 31 30
17
3 表
Figure imgf000020_0001
名称の末尾に Rの付く ものは下流から上流の、 Rのないもの は上流から下流のプライマーである。 18 非 A非 B型肝炎特異的な核酸の同定を行うため、 血液試料 や組織試料中から核酸を抽出する方法は、 例えば前出 'Molecular Cloning ； Cold Spring Harbor し sborstory Press (1989) ' ¾ どにも記載され広く知られており、 本発明の実施に何ら困難 を伴う ものではない。
以下に実施例によつて本発明を説明するが、 これによつて 本発明が限定されるものではない。
実施例 1 血清及び肝組織よりの R N Aの抽出
血清及び肝組織よりの R N Aの抽出は、 チォシア ン酸グァ 二ジ ン（G T C)を用いて P.Chomczynski等の方法（Ana litica卜
Biochemistry 162巻 156頁 1987年） に従って行った。
血清 1 m 1に 1 6 0 μ 1 の 5 0 %ポリ エチレングリ コール 4
0 0 0 と 5 Μ N a C 1 4 0 / 1 を加えて混合し、 4て 1 時間静置後、 遠心により沈殿を得た。 この沈殿もし く は肝組 織 1 0 0 mgを溶液 D ( 4 M G T C、 2 5 mMクェン酸ナ ト リ ゥム pH 7. 0、 0. 5 %ザルコ シル、 l O O mM 2 —メ ゾレ力 ブトエタノール、 ） 3 0 0 // 1 に溶解させ、 2 M酢酸ナ ト リ ゥム （PH 4 ) 4 5 1、 水飽和フ エノ ール 3 0 0 1 、 及び ク ロ 口ホルム . イ ソア ミ ルアルコーノレ （ 4 9 ： 1 ) 6 0 1 を加えて R N Aを抽出した。 遠心後、 水層に 2 0 gノ^ 1 の G l y c o g e n 1 ^ 1 と 2. 5倍量のエタノールを加 えて、 一 2 0てに静置した後、 遠心により沈殿を得た。 こ の 沈殿を 8 0 %エタノールで洗浄することにより R N Aを得た。 また、 血清 1 0 0 1 に G T C溶液 1 mlを混合するこ とによ つても R N Aを得た。 19 実施例 2
Figure imgf000022_0001
非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋白質をコー ドする c D N Aを 含む組換えファージのう ち、 ス H C 2 2 3 2 , λ H C 2 2 3 0 , λ H C 2 2 0 6 , ス H C 2 2 5 8 , ス H C 2 2 4 8 , 1 H C 2 2 2 0 , A H C 2 2 4 6 , A H C 2 2 1 1及び I H C 2 2 1 6 は、 c D N Aの塩基配列に高い 相同性が認められる。 これら c D N Aに対応する遺伝子を検 出するため、 各 c D N Aの塩基配列で特に相同性の高い領域 より、 下記の塩基配列のオリ ゴヌク レオチ ドをプライマー及 びプローブとして合成した。 合成は D N A自動合成機 （アブ ライ ドバイオシステムズ社 ； 3 8 0 A型） を用いて行った。 プライマー （ P R )
PR 1 ： 5 ' -CTGCACAGGTACGCTCCGGC- 3 ' (配列番号 ： 51)
( I HC 2232 に挿入された cDNAの 31— 50の塩基配列）
PR 2 ： 5 ' -CTCCTGCGGGATGAGGTCAC- 3 ' (配列番号 ： 52)
( I HC 2232 に挿入された cDNAの 61— 80の塩基配列）
PR 3 ： 5 ' -GGCGCAGACAACTGACTAGC- 3 ' (配列番号 ： 53)
( λ HC 2232 に挿入された cDNAの 250— 269 の塩基配列） PR 4 ： 5 ' -CCGCCCATCTCCTGCCGCCA- 3 ' (配列番号 ： 54)
( λ HC 2232 に揷入された cDNAの 340— 359 の塩基配列） 20 プローブ （ P B )
PB 1 ： 5 ' -CACAGCTCCCATGTGAGCCCGAACCGGATG- 3 '
(配列番号 ： 55)
( λ HC 2258 に挿入された cDNAの 116— 145 の塩基配列） 実施例 1 にて調製された R NAとランダムブライマー 0.
5 μ gを混合し、 常法 ( J- Sambrook等、 Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) )に従いヽ 6 5 て、 5分間ァニーリ ングを行ったのち逆転写酵素 （宝酒造）
1 0 0ユニッ トを用いて 3 7 'C、 1時間反応させ、 一本鎖相 補 D N A ( s c D N A ) を合成した。 得られた s c D N Aに ブライマー 「 P R l 」 及び 「 P R 4 」 をそれぞれ 1 0 O pmol 加え、 DNA Amplification System (全酒造） により T a q D N Aボリ メ ラーゼを用いて P C R法による遺伝子増幅を行な つた。 反応は 9 2て 3分間の加熱後、 9 2 'C 2分間、 4 0 'C 2分間、 7 2て 2分間の反応を 3 0 — 4 0サイ クル繰り返し 行なった。
上記 P C R反応液 1 0 1 を 1 0 0 て、 5分間加熱後急冷 し、 ハイ ブリダィゼーシヨ ン緩衝液 （ 6 0 mM T r i s — H C I (pH 8. 0 ) 、 1 6 0 mM N a C l、 6. 7 mM M g C 1 2 ) 、 5 ' 端32 Pラベル化プローブを加え、 6 0て、 1 5 分間加熱した。 この混合液を 1 0 mM T r i s — H C 1 (pH 7. 5 ) 、 3 0 0 mM N a C l、 1 mM E D T Aにて平衡化 S e p h a d e x G - 7 5 (フア ルマシア） を用いたカラ ムクロマ トグラフィーに供し、 P C R法に遺伝子増幅の期待 される非 A非 B型肝炎特異的遺伝子に対応する約 3 3 0塩基 21 の D N A分画を分取し、 その放射活性を測定した。 その結果. 同様に処理した健常人の血清由来 R N Aにおいては検出され なかった放射活性が非 A非 B型肝炎患者の血清並びに肝組織 より抽出した R N Aを用いた場合には、 特異的に検出され、 特異的に増幅された非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の存在が確 認された。
また、 上記 P C R反応液にブライマ一 「 P R 2 j 及び 「 P 3 」 を加え、 同様にして 3 0 — 4 0サイ クルの遺伝子増幅 を行なつた。 得られた反応液を 8 %ボリアク リルァ ミ ドゲル を用いて電気泳動し、 泳動後、 ヱチジゥムプロマイ ドで染色 した。 その結果、 非 A非 B型肝炎患者の血清並びに肝組織よ り抽出した R N Aを用いた場合に、 特異的にプライマー 「 P R 2」 及び 「 P R 3」 によつて遺伝子増幅される約 2 0 0 bp のバン ドが見られたが、 同様に処理した健常人の血清由来 R N Aにおいては検岀されなかったことにより、 非 A非 B型肝 炎患者に特異的に増幅された非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の 存在が確認された。 実施例 3 組換えファージ ス H C 2 2 5 6 , A H C 2 2
4： 4 、 A R C ~~ 2 0 7に揷 された c D N
A，に対 Eする非 A非 B型肝炎特魏 遺伝 の增幅 非 A非 B型肝炎特異的抗原蛋白質をコードする c D N Aを 含む組換えファージのうち、 H C 2 2 5 6 , H C 2 2 4 4、 及び H C 2 2 0 7の c D N Aに対する遺伝子を 検出するため、 実施例 2 と同様にプライマー及びプローブと して、 下記の塩基配列のオリ ゴヌク レオチ ドを合成した。 22 プライマー （ P R )
PR 5 ： 5 ' -ACATCCTGGCGGGTTATGGAGC- 3 ' (配列番号 ： 56)
( λ HC 2256 に挿入された cDNAの 70— 91の塩基配列）
PR 6 ： 5 ' - AGTCCCAAACATCCCTGAGCCA- 3 ' (配列番号 ： 57)
( λ HC 2256 に挿入された cDNAの 447— 468 の塩基配列）
PR 7 ： 5 ' -TGCCCTCCACCGAGGACCTGG - 3 ' (配列番号 ： 58)
( λ HC 2256 に挿入された cDNAの 139— 160 の塩基配列）
PR 8 ： 5 ' -CGCTTTCAGGCACATAATGCGT- 3 ' (配列番号 ： 59)
( λ HC 2256 に挿入された cDNAの 315— 336 の塩基配列） ブローブ （ P B )
PB 2 ： 5 ' -TGATAGCGTTCGCTTCGCGGGGTAACCACGT 一 3 '
(配列番号 ： 60) ( λ HC 2256 に挿入された cDNAの 277— 307 の塩基配列） 実施例 1 にて調製された R N Aとラ ンダムプライマー 0. 5 gを混合し、 実施例 2 と同様にして s c D N Aを合成し た。 得られた s c D N Aにプライマー 「 P R 5 」 及び 「 P R 6 」 を加え、 実施例 2 と同様にして遺伝子増幅を行なつた後、 プローブ 「 P B 2 」 とハイブリダィズさせ、 増幅された非 A 非 B型肝炎特異的遺伝子の検出を試みた。 その結果、 非 A非 B型肝炎患者より抽出された R N Aを用いた場合に特異的に 放射活性が検出され、 特異的に増幅された非 A非 B型肝炎特 異的遺伝子の存在が確認された。
また、 上記 P C R反応液にプライマー 「 P R 7 」 及び 「 P R 8 」 を加え、 同様にして 3 0 — 4 0サイ クルの遣伝子増幅 を行なった。 得られた反応液を 8 %ポリアク リルァ ミ ドゲル 23 を用いて電気泳動し、 泳動後、 ェチジゥムブ口マイ ドで染色 した。 その結果、 非 A非 B型肝炎患者の血清並びに肝組織よ り抽出した R N Aを用いた場合に、 特異的にプライ マー 「 P R 7 j 及び Γ P R 8 」 によって遺伝子増幅される約 1 5 0 bp のバン ドが見られたことにより、 特異的に増幅された非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の存在が確認された。 尚、 同様に処理 された健常人血清由来の R N Aを用いた場合には 1 5 O bpの バン ドは認められなかった。 ^じ化^ ¾光物笪の ϋΛさ^^こフ ローデに rる— ww~ 一 ―
実施例 3で遺伝子増幅を行った反応液総量の 1 0分の 1 を 9 5 'C、 5分間熱処理した後急冷し、 これに第 2表で示した プローブ C P 5 (プローブの塩基配列中 Xはリ ンカ一 （ア ミ ノ モディ ファ イ ア一 II ZC 1 0 n t e c h社） の位置を示し、 このリ ンカーにァク リ ジニゥムエステルが標識されている。 ） をハイ ブリダィ ズ溶液 （ 0 , 1 M N a C 1 1 0 mM T r i s - H C 1 (pH 6. 0 ) 、 1 mM E D T A ) で希釈したも のを加え、 6 0てで 3 0分間イ ンキュベー ト した。 これに 0. 1 Mホゥ酸ナ ト リ ウム (pll 7. 6 ) 2 0 0 1 を加え、 6 0 ΐで 1 0分間イ ンキュベー ト し、 目的物とハイブリダィ ズしないプローブのァク リ ジニゥムエステルを加水分解した のち、 Η 2 0 及び N a 0 Η溶液を加え、 ルミノ メーターに より、 化学発光量を測定した （参照、 前出の A r n o l d ら の文献） 。 この結果非 A非 B型肝炎患者血惰及び肝組織より 抽出した R N Aを用いて検出を行ったところ、 特異的に化学
新たな用紙 24 発光が測定され非 A非 B型肝炎特異的遺伝子を鋭敏に検出す ることができたが、 同様に処理された健常人血清由来 R N A においては、 非 A非 B型肝炎特異的遣伝子の存在を示す化学 発光は認められなかった。
以上の如く、 非 A非 B型肝炎特異的蛋白質をコー ドする c D N Aの塩基配列に基づいて調製したオリ ゴヌク レオチ ドを プライ マー及びプローブとして用いることにより、 非 A非 B 型肝炎患者より抽出した R N A中に舍まれる非 A非 B型肝炎 特異的な道伝子を検出することができる。
25 規則第 1 3規則の 2の寄託された微生物への言及
寄託機関 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 受託番号及び寄託した日付 ：
1 . 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 4 2号 平成元年 7月 1 3 曰
2 . 微ェ研菌寄第 ] . 0 8 4 3号 平成元年 Ί月 1 3 曰
3 . 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 4 4号 平成元年 Ί月 1 3 H
4 . 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 4 7号 平成兀年 7月 1 3 曰
5 . 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 5 2号 平成元年 7月 1 8 曰
6 . 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 5 4号 平成元年 Ί月 1 8 曰
7 . 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 5 5号 平成元年 7月 1 8 曰
8 . 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 5 6号 平成兀年 7月 1 8 H
9 . 微ェ研菌寄第 1 0 8 5 7号 平成兀年 7月 1 8 曰
10. 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 5 9号 平成元年 1月 1 8 曰
11. 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 6 0号 平成元年 Ί月 1 8 曰
12. 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 6 1号 平成元年 7月 1 8 H
13 , 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 7 8号 平成元年 7月 2 1 曰
14. 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 8 1号 平成元年 7月 2 1 曰
15. 微ェ研菌寄第 ] . 0 8 8 2号 平成元年 7月 2 1 曰
16. 微ェ研菌寄第 ] . 0 8 8 3号 平成元年 7月 2 1 曰
17. 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 8 9号 平成元年 7月 2 6 日
18. 微ェ研菌寄第 ] . 0 8 9 2号 平成元年 7月 2 6 曰
19. 微ェ研菌寄第 1 . 0 8 9 3号 平成元年 7月 2 6 日
20. 微ェ研菌寄第 ] . 0 8 9 4号 平成元年 7月 2 6 H
21. 微ェ研菌寄第】 . 0 8 9 6号 平成元年 7月 2 6 曰 26
22. 微ェ研菌寄第 0 8 9 7号 平成元年 7月 2 6 日
23. 微ェ研菌寄第 0 8 9 8号 平成元年 7月 2 6 日
24. 微ェ研菌寄第 0 8 9 9号 平成元年 7月 2 6 日
25. 微ェ研菌寄第 0 9 0 0号 平成元年 7月 2 6 日
26. 微ェ研菌寄第 0 9 0 4号 平成元年 7月 2 8 曰
27. 微ェ研菌寄第 0 9 0 5号 平成元年 7月 2 8 日
28. 微ェ研菌寄第 0 9 0 6号 平成元年 7月 2 8 日
29. 微ェ研菌寄第 0 9 0 8号 平成元年 7月 2 8 日
30. 微ェ研菌寄第 0 9 1 1号 平成元年 7月 2 8 曰
31. 微ェ研菌寄第 0 9 1 7号 平成元年 8月 2 曰
32. 微ェ研菌寄第 0 9 1 9号 平成元年 8月 2 曰
33. 微ェ研菌寄第 0 9 2 0号 平成元年 8月 2 日
34. 微ェ研菌寄第 0 9 2 1号 平成元年 8月 2 日
35. 微ェ研菌寄第 0 9 2 2号 平成元年 8月 2 日
36. 微ェ研菌寄第 0 9 2 3号 平成元年 8月 2 曰
37. 微ェ研菌寄第 0 9 3 1号 平成元年 8月 9 日
38. 微ェ研菌寄第 0 9 3 2号 平成元年 8月 9 日
39. 微ェ研菌寄第 0 9 3 3号 平成元年 8月 9 日
40. 微ェ研菌寄第 0 9 3 4号 平成元年 8月 9 日
41. 微ェ研菌寄第 0 9 3 5号 平成元年 8月 9 日
42. 微ェ研菌寄第 0 9 3 6号 平成元年 8月 9 曰
43. 微ェ研菌寄第 0 9 3 7号 平成元年 8月 9 日
44. 微ェ研条寄第 2 9 5 1号 平成元年 7月 1 3 曰
45. 微ェ研条寄第 2 9 5 2号 平成元年 7月 1 3 日
46. 微ェ研条寄第 2 9 5 3号 平成元年 7月 1 3 曰 27
47. 徽ェ研条寄第 2 9 5 4号 平成元年 7月 1 8 曰
48. 微ェ研条寄第 2 9 5 5号 平成元年 7月 1 8 曰
49. 微ェ研条寄第 2 9 5 6号 平成元年 7月 2 1 曰
50. 微ェ研条寄第 2 9 5 7号 平成元年 7月 2 1 日
51 . 微ェ研条寄第 2 9 5 8号 平成元年 7月 2 1 曰
52. 微ェ研条寄第 2 9 5 9号 平成元年 Ί月 2 1 曰
53. 微ェ研条寄第 2 9 6 0号 平成元年 7月 2 6 曰
54. 微ェ研条寄第 2 9 6 1号 平成元年 Ί月 2 6 B
55. 微ェ研条寄第 2 9 6 2号 平成元年 Ί月 2 6 曰
56. 微ェ研条寄第 2 9 6 3号 平成元年 Ί月 2 8 曰
57. 微ェ研条寄第 2 9 6 4号 平成元年 Ί月 2 8 曰
58. 微ェ研条寄第 2 9 6 5号 平成元年 7月 2 8 曰
59. 微ェ研条寄第 2 9 6 6号 平成元年 8月 2 曰
60. 微ェ研条寄第 2 9 6 7号 平成元年 8月 2 曰
61. 微ェ研条寄第 2 9 6 8号 平成元年 8月 9 曰
28
【配列表】
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 6 6 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージク ローン λ E C 2 2 1 1
配列
GAATTCTTCA CGGAATTGGA TGGGGTGCGG CTACACAGGT ACGCTCCGGC 50 GTGCAAGCCT CTCCTACGGG ATGAGGTCAC ATTCCAGGTC GGGCTCAACC 100 AATTCCCGGT TGGGTCACAG CTCCCATGTG AACCCGAACC GGATGTAATG 150 GTGGTCACCT CTATGCTCAC CGACCCCTCC CATATTACAG CAGAGACGGC 200 TAAGCGTAGG CTGGCCAGAG GGTCTCCCCC TTCTTTGGCC AGCTCTTCAG 250 CTAGTCAGTT GTCTGCGCCC TCCTTGAAGG CGACATGCAC CACCCGTCAT 300 GACTCCCCGG ACGCTGACCT CATAGAGGCC AACCTCCTGT GGCGGCAGGA 350 GATGGGCGGG AACATCACCC GTGTGGAGTC AGAGAATAAG GTAGTGATTT 400 TGGACTCTTT TGAACCGCTT CGGGTGGAGG AGGATGAGAG GGAAGTATCC 450 GTAGCGGCGG ATTTCAGTGA CTTGAATGCA GAATGAATCC CGTGGCTCAC 500 TTCCTAGACT ATTTGCCAAA GAAGATGTTG CCCTGGCCAT GATCAAGATG 550 ACACAAACGG TGGCCTTTTG CAGGGAGAAC CGCCGTGGAG GCCTGTGTCT 600 GTGGCACTGG TAGCTTCTCT CTGCAGGCAA AGACCCCATG GCTTAGTTCT 650 TCATCAGAGT GAGAATTC 668 29 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 4 7 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本鎮
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージク ローン A H C 2 2 4 6
配列
GAATTCTTCA CGGAGTTGGA TGGGGTACGG CTGCACAGGT ACGCTCCGGC 50 GTGCAAGCCA CTGCTACGGG ATGAGGTCAC ATTCCAGGTC GGGCTCAACC 100 AATTTCCAGT TGGATGACAG CTCCCATGTG AGCCCGAGCC GGATGTAGCG 150 GTGGTCACTT CCATGCTCAC CGACCCCTCC CACATTACAG CAGAGA CGGC 200 TAAGCGTAGG CTGGCCAGGG GGTCCCCCCC CTCCTTGGCC AGCTCTTCAG 250 CTAGTCAGTT GTCTGCGCCC TCCTTGAAGG CGACATGCAC TACCCA CGAT 300 GACTGCCCGG ACGCTGACCT CATCGAGGCC AACCTCCTGT GGCGGCAGGA 350 GATGGGAGGA AACATCACCC GCGTGGAGTC AG協 AT A AG GTAGTAATTC 400 TAGACTCTTT TGACCCGGTC CGAGCGGAGG AGGATGAGAG GGAAGTGTCC 450 GTTGCGGCGG AGATCCTGCG GAAGA CCAG 479 配列番号 ： 3
配列の長さ ； 4 9 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖 30 トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージク ローン A E C 5 1 2
配列
TCACTCAATC CTCGACGGTG CTGCCGGTGC GGCAATCCGG AACGATACCG 50 ACGCCGGATC GCCCTGCTGC CCCCACGCAT TTACCGCCCG GACTGTCAGC 100 CTGTAGTTCC CCAGCGCCAG TTGCGTGAAG CGGTATGTGG TTTCCGTCGT 150 CCGGGCCGTG CTGACCAGCC GCTCACTGCC GTCGTCCGTG TTACGGTCAG 200 ACGGAGCAGG AAACTCACGC CTTCACACTT CGGTGTGTCC CATCGCGCCA 250 GCACCTGATA TTCCCCGCTG TCTGCAGTGA CTTCTGCGGT CAGGTGCTGC 300 ACCGCTCGTG ACACCATTCA CCGTGCCACT CTGTTCGCCG TCAAAGTGCG 350 CCCCGTTATC CACGATGGCC TCTTTTTCCG GCACATGCTG CACGGCGGTG 400 ATGGCATACG TGCCGTCGTC GTTCTCACGG ATACTCACGC AGCGGAACAG 450 TCCTGGCGCA GCGTCGGCAG CTTCAGCTCC CATACGCTGT ATTCAGCT 498 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 6 8 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本鎮
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A 31 起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージクローン ス H C 2 2 0 6
配列
GAATTCTTCA CAGAGTTGGA CGGGGTGCGG CTGCACAGGT ACGCTCCGGC 50 GTGCAGACCT CTGCTGCGGG ATGAGGTCAC ATTCCAGGTC GGGCTCAA CC 100 AATACCCGGT TGGGTCACCG CTCCCATGTG AGCCCGAACC GGATGTAAC 150 GTGGTCACTT CCATGCTCAC CGACCCCTCC GACATTACAG CGGAAACTGC 200 CAGGCGTA GG TTGGCCAGGG GGAGTCCCCC TTCCTTGGCC AGCTCTTCAG 250 CTAGTCAGTT GTCTGCACCT TCCTTGAAGG CGACATGTAC TACCCATCAT 300 GACTCTCCAG ACGCTGATCT CATCGAGGCC AACCTTCTAT GGCGGGAGGA 350 GATGGGCGGG AACATCACCC GTGTGGAGTC A6A6AATAAG GTAGTAATCC 400 TAGACTCTTT TGACCCGCTT CGAGC6GAGG AGGATGAGAG GGAAGTATCC 450 GTTGCGGCGG AGATCCTGCG GAGAACCAGG AGATTCCCCC CGGCGATACC 500 TGTATGGGCG CGCCCGGACT ACAACCCGCC ACTGATAGAA TCTTGGAAGG 550 ACCCAGACTA CGTCGCACCG GTGGTACACG GGTGTCCATT GGCACCTGCC 600 AAGACCCCTC AAGTGGATAT TCAGACCTCT TTGAGGCTTT CGTTGGAAAC 650 GGGATTTCTT CATACTATGC TAGACAGAAG AATTC 685 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 6 0 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トボ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A 32
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： フ ァ ージク ローン ス H C 2 2 0 7
配列
TGATAGCGTT CGCTTCGCGG GGAAACCACG TCTCCCCCAC GCACTATGTG 50 CCTGAAAGCG ACGCTGCAGC GCGTGTCACC CAGATCCTCT CCAGCCTTAC 100 CATCACTCAG CTGTTGAAGA GGCTCCACCA GTGGATCAAT GAGGACTGCT 150 CCACGCCATG CTCCGGTTCG TGGCTTAGGG ATGTTTGGGA CTGGATATGC 200 ACGGTGTTGA CTGACTTCAA AACCTGGCTC CAGTCCAAGC TCCTGCCGCG 250 ATTGCCGGGA GTCCCTTTCC TTTCATGCCA ACGAGGGTAC AAGGGAGTCT 300 GGCGGGGAGA TGGTGTCATG CAAACCACCT GCCCATGTGG AGCACAGATC 350 AGTGGGCATG TCAAAAATGG CTCCATGAGG ATCGTTGGGC CTAGAACCTG 400 TAGCAACACG TGGCACGGAA CGTTCCCTAT CAACGCGTAC ACCACAGGCC 450 CCTGCACACC CTCCCCGGCG CCCAACTACT CTAGGGCGTT GTGGCGGGTG 500 GCTGCTGAGG AGTACGTGGA GGTCACGCGG GTGGGGGATT TCCACTACGT 550 GACGGGCATG ACCACTGACA ACGTAAGATG CCCATGCCAG GTTCCGGCCC 600 CCGAATTC 608 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 4 7 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本鎮
トポロ ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A 33 起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージクローン え H C 2 2 1 6
配列
GAATTCTTCA CAGAGTTGGA TGGGGTGCGG TTGCACAGGT AGGCTCCGGC 50 TGCAAAGCCT CTCCTACGGG ATGAGGTCAC ATTTCAGGTC GGGCTCAACC 100 AATTCCCGGT TGGGTCACAG CTCCCATGTG AGCCCGAACC GGA TGTAACA 150 GTGATCA CCT CCATGCTCAC CGACCCCTCC CA CATTA CA G CAGAGGCGGC 200 TGGGCGTAG G CTGGCCAGAG GGTCTCCCCC TTCCTTGGCC AGGTCTTCGG 250 CTAGTCAGTT GTCTGCGCCC TTCCCTGTTG AAGGCCGACA TGCACTACCC 300 GTCATGACTC CCCAGACGCT GACCTCATCG AGGCCAATCT CCTGTGGCGG 350 CAGGAGATGG GAGGGAACAT CACCCGCGTG GAGTCAGAGA ACAAGGTACT 400 AATCCTAGAC TCTTTTGACC CGCTCCGAGC GGAGGAGGAT GAGAGGGAGA 450 TATCTGTTGC GGCCCAGCTG AGC 473 配列番号： 7
配列の長さ ： 5 2 6
配列の型 ：核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージクローン ス H C 2 2 2 0 34 配列
GAATTCTTCA CAGAGCTGGA TGGGGTGCGG TTGCACAGGT ACGCTCCGGC 50 GTGCAAGCCT CTCCTACGGG ATGAGGTCAC ATTTCAGGTC GGGCTCAACC 100 AATTCCCGGT TGGGTCACAG CTCCCGTGTG AGCCCGAACC GGATGTAACG 150 GTGATCACTT CCATGCTCAC CGACCCCTCC CACATTACAG CAGAGACGGC 200 TGGGCGTAGG CTGGCCAGAG GGTCTCCCCC TTCCTTGGCC AGCTCTTCGG 250 CTAGTCAGTT GTCTGCGCCC TCCTTGAAGG CAACATGCAC TACCCGTCAT 300 GACTCCCCAG ACGCTGACCT CATCGAGGCC AATCTCCTGT GGCGGCAGGA 350 GATGGGAGGG AACATCACCC GCGTGGAGTC AGAGAACAAG GTAGTAATCC 400 TAGACTCTTT TGACCCGCTC CGAGCGGAGG AGGATGAGAG GGAGATATCT 450 GTTGCGGCGG AGATCCTACG GAAATCTAGG AAATTCCCCC CAGCATTACC 500 CATATGGGCG CGCCCGGACT ACAACC 526 配列番号 ： 8
配列の長さ ： 5 9 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本鎮
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージクローン I H C 2 2 3 0
配列
GAATTCTTCA CAGAGTTGGA TGGGGTGCGG CTGCACAGGT ACGCTCCGGC 50 GTGCAAACCT CTCCTGCGGG ATGAGGTCAC GTTCCAGGTC GGGCTCAACC 100 35
AATACCCGGT TGGATCACAG CTCCCATGCG AGCCCGAACC GGATGTGGCG 150
GTGCTCACTT CCATGCTCAC CGACCCCACC GACATTAGAG CAGAAGCGG C 200
TAGGCGCAGG CTGGCCAGAG GGTCTCCTCC TTCCTTGGCC AGCTCTTCAG 250
CTAGTCAGTT GTCTGCGCCC TCCTTGAAGG CGACATGGAC TACCCATCA T 300
GACTGCCCAG ACGCTGACCT CATCGAGGCC AACCTCCTGT GGCGGCAGGA 350
GATGGGCGGA AACATCACCC GCGTGGAGTC AGAGAATAAG GTAGTAATTC 400
TAGACTCTTT TGAACCGCTT CGAGCGGAAG AGGATGAGAG GGAAGTATCC 450
GTTGCGGCAG AGATCCTGCG GAAAACCAGG AGATTCCCCG CAGCGATGCC 500
CATATGGGCA CGTCCGGACT ACAACCCACC ATTACTACAG TCCTGGAAGG 550
ACCCGGACTA CGTCCCTCCG GTGGTGCACG GGTGCCCATT GGCACCTGC 599 配列番号： 9
配列の長さ ： 1 1 8 4
配列の型： 核酸
鎮の数 ：二本
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージクローン I H C 2 2 3 2
配列
GAATTCTTCA CAGAGTTGGA TGGGGTGCGG CTGCACAGGT ACGCTCCGGC 50 GTGCAAACCT CTCCTGCGGG ATGAGGTCAC GTTCCAGGTC GGGCTCAACC 100 AATACCCGGT TGG ATCACAG CTCCCATGCG AGCCCGA ACC GGATGTGGCG 150 GTGCTCACTT CCATGCTCAC CGACCCCACC CACATTACAG CA GAAGCGGC 200 36
TAGGCGCAGG CTGGCCAGAG GGTCTCCTCC TTCCTTGGCC AGCTCTTCAG 250 CTAGTCAGTT GTCTGCGCCC TCCTTGAAGG CGACATGCAC TACCCATCAT 300 GACTCCCCAG ACGCTGACCT CATCGAGGCC AACCTCCTGT GGCGGCAGGA 350 GATGGGCGGA AACflTCACCC GCGTGGAGTC AGAGAATAAG GTAGTAATTC 400 TAGACTCTTT TGAACCGCTT CGAGCGGAAG AGGATGAGAG GGAAGTATCC 450 GTTGCGGCAG AGATCCTGCG GAAAACCAGG AGATTCCCCG CAGCGATGCC 500 CATATGGGCA CGTCCGGACT ACAACCCACC ATTACTACAG TCCTGGAAGG 550 ACCCGGACTA CGTCCCTCCG GTGGTGCACG GGTGCCCATT GCCACCTGCC 600 AAGGCCCCTC CAGTACCACC TCCAAGGAG/1 AAGAGGACGG TTGTCCTGAC 650 AGAATCCACC GTGTCTTCCG CCTTGGCGGA GCTTGCTACA AAGACCTTCG 700 GCGGGTCCGG ATCATCGGCC GCCGACAGCG GCACAGCAAG CGGCCCTCCT 750 GGCCAGGCCT CCGACGATGG AGATACAGGA TCCGACGTTG AGTCGTACTC 800 CTCCATGCCC CCCCTTGAGG GAGAGCCGGG GGACCCCGAC CTCAGCGACG 850 GGTCTTGGTC TACTGTGAGT GAGGAGGCTG GTGAGGATGT CGTCTGCTGC 900 TCGATGTCCT ACACATGGAC AGGCGCCTTA ATCACACCAT GCACCGCGGA 950 GGAGAGCAAG CTGCCCATCA ACCCGTTGAG CAACTCTTTG CTGCGGGCAT 1000 CTGCTCGGGC GTATCATCAA CTGATGAGCA AGAAGGATAT AATTCCTACG 1050 CCCTCTCAGC CGATGAACAG TTGGAATAGG TTGTTAGCGG TAACTAAGAT 1100 TAGTATGGTfl ATTAGGAAflA TGAGTAGATA TTTGAAGAAC TGATTAATGT 1150 TTGGGTCTGA GTTTATATAT CACAGTGAGA ATTC 1184 配列番号 ： 1 0
配列の長さ ： 2 5 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本鎮 37 トボロジ一 ：直鎖状
配列の種類： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージクローン ス H C 2 2 4
配列
GGGCATGTCA AAAATGGCTC CATGAGGATC GTTGGGCCTA GAACCTGTAG 50 CAACACGTGG CACGGAACGT TCCCTATCAA CGCGTACACC ACAGGCCCCT 100 GCACACCCTC CCCGGCGCCC AACTACTCTA GGGCGTTGTG GCGGGTGGCT 150 GCTGAGGAGT ACGTGGAGGT CACGCGGGTG GGGGATTTCC ACTACGTGAC 200 GGGCATGAGC ACTGACAACG TAAGATGCCC ATGCCAGGTT CCGGCCCCCG 250 AATTC 255 配列番号 ： 1 1
配列の長さ ： 5 5 3
配列の型 ： 核酸
鎮の数 ： ニ本鎮
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージクローン H C 2 2 4 8
配列
GAATTCTTCA CAGAGTTGGA TGGGGTGCGG TTGCACAGGT ACGCTCCGGC 50 GTGCAAACCT CTCCTACGGG ATGAGGTCAC ATTTCAGGTC GGGCTCAACC 100 38
AATTCCCGGT TGGGTCACAG CTCCCATGTG AGCCCGAACC GGATGTAACA 150
GTGATCACCT CCATGCTCAC CGACCCCTCC CACATTACAG CAGAGACGGC 200
TGGGCGTAGG CTGGCCAGAG GGTCTCCCCC TTCCTTGGCC AGCTCTTCGG 250
CTAGTCAGTT GTCTGCGCCT TCCTTGAAGG CGACATGCAC TACCCGTCAT 300
GACTCCCCAG ACGCTGACCT CATCGAGGCC AATCTCCTGT GGCGGCAGGA 350
GATGGGAGGG AACATCACCC GCGTGGAGTC AGAGAACAAG GTAGTAATCC 400
TAGACTCTTT TGACCCGCTC CGAGCGGAGG AGGATGAGAG GGAGATATCT 450
GTTGCGGCGG AGATCCTACG GAAATCTAGG AAATTCCCCC CAGCATTACC 500
CATATGGGCG CGCCCGGACT ACAACCCACC ACTGCTAGAG TCTTGGCCAG 550
CTG 553 配列番号 ： 1 2
配列の長さ ： 8 8 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージク ローン I H C 2 2 5 6
配列
CGGCTTTCGT GGGCGCCGGC ATAGCCGGCG CGGCTGTTGG CAGCATAGGC 50 CTTGGGAAGG TGCTTGTGGA CATCCTGGCG GGTTATGGAG CAGGGCTGGC 100 AGGCGCACTC GTGGTCTTTA AGGTTATGAG TGGCGACATG CCCTCCACCG 150 AGGACCTGGT CAACTTACTC CCTGCCATCC TTTCCCCTGG CGCCCTGGTC 200 39
GTCGGGGTCG TGTGCGCACA GATACTGCGT CGACATGTCG GCCCAGGGGA 250 GGGAGCTGTG CAGTGGATGA ACCGGCTGAT AGCGTTCGCT TCGCGGGGTA 300 ACCACGTCTC CCCCACGCAT TATGTGCCTG AAAGCGACGC TGCGAGTCGT 350 GTCACCCAGA TCCTCTCCAG CCTTACCATC ACTCAGGTGT TGAAGAGGCT 400 CCACCAGTGG ATTAATGAGG ACTGCTCCAC GCCATGCTCC GGCACGTGGC 450 TCAGGGATGT TTGGGACTGG ATATGCACGG TGTTGGCTGA CTTCAAGACG 500 TGGCTCCAGT CCAAGCTCCT GCCGCGGTTA CCGGGGGTCC CTTTCCTGTC 550 ATGTCAGCGT GGGTACAAGG GAGTTTGGCG GGGAGATGGC ATCATGCACA 600 GCACCTGCCC ATGCGGAGCC CAAATCACCG GACATGTCAA AAACGGGTCC 650 ATGAGGATCG CCGGGCCTAA AACCTGCAGC AACACGTGGC ACGGAACGTT 700 CCCCATTAAC GCATACACCA CAGGCCCCTG CACACCCTCT CCGGCGCCAA 750 ACTACTCCAG GGCGTTGTGG CGGGTGGCTG CGGAGGAGTA CGTGGAGGTC 800 ACGCGGGTGG GGGATTTCCA CTACGTGACG GGCATGACCA CTGACAATGT 850 AAAATGCCCA TGCCAGGTTC CGGCCCCCGA ATTC 884 配列番号 ： 1 3
配列の長さ ： 5 2 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本鎮
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージクローン ス H C 2 2 5 & 40 配列
GAATTCTTCA CAGAGTTGGA CGGGGTGCGG CTGCACAGGT ACGCTCCGGC 50
GTGCAGACCT CTCCTGCGGG ATGAGGTCAC ATTCCAGGTC GGGCTCAACC 100
AATACCCGGT TGGGTCACAG CTCCCATGTG AGCCCGAACC GGATGTAACA 150
GTGGTCACTT CCATGCTCAC CGACCCCTCC CACATTACAG CGGAAACTGC 200
CAGGCGTAGG TTGGCCAGGG GGAGTCCCCC TTCCTTGGCC AGCTCTTCAG 250
CTAGTCAGTT GTCTGCACCT TCCTTGAAGG CGACATGTAC TACCCATCAT 300
GACTCTCCAG ACGCTGATCT CATCGAGGCC AACCTTCTAT GGCGGCAGGA 350
GATGGGCGGG AACATCACCC GTGTGGAGTC AGAGAATAAG GTAGTAATCC 400
TAGACTCTTT TGACCCGCTT CGAGCGGAGG AGGATGAGAG GGAAGTATCC 450
GTTGCGGCGG AGATCCTGCG GAGAACCAGG AGATTCCCCC CGGCGATACC 500
TGTATGGGCG CGCCCGGACC AGCT 524 配列番号 ： 1 4
配列の長さ ： 1 7 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： フ ァ ージク ローン ス H C 2 2 7 0
配列
GAATTCAGCA AAGTTTCCAG ATACAAGATT AATGGACACA AATCAGTAGC 50 TCTTCCATAC ATCAACAGCT ACCAAGCAGA GAATCACATC AAGAACTCAA 100 41
CCCCTTTTAC AATAGCTGCG ACAAACAACA ACAACAAAAA AACAAAACTT 150 AGGAATATAC CTAGCAAAGA ATTC 174 配列番号 ： 1 5
配列の長さ ： 1 3 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポ口ジ一： 直鎖状
配列の種類： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： ファージクローン ス H C 2 1 0 C 配列
GAATTCCCTA GCCTGGGCAA CAGAGTGAGA GTCCGTCTCA AAAA AAA A AA 50 AACAACAACA AAAAAAACAA ACCCACAAAA CTGCAGCCAC CTATGTCCCT 100 ACCTCCCCAG CCTCCAGGGC CCCTTCCGGA ATTCC 135 配列番号 ： 1 6
配列の長さ ： 3 0 6
配列の型： 核酸
鎖の数 ： ニ本鎮
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト 42
直接の起原 ： フ ァ ージク ローン ス H C 2 5 3 3
配列
GAATTCGCGG GAACCCGGGA GGCGGACGTT GCAGTGAGCC GAGATCGCGC 50
CACTGCACTC CAGCCTGGGC GACAGAGCAA GACTCTGTCT CAAAAAAAAA 100
AAAACAAAAA CAAAAAGAAG GACTGGGAGG GTCGGCAGTA ATCGAGGACC 150
ACCTGGCAGT GACAGAGGGT GACCCAGGGC TGGGAGGATA CCCCAGGGGA 200
GACCCCAGGC TCTGAAAAGT GCCTTGCCAT TCAATCTACT TCAGTAATAG 250
CATGTGTCAT GGGATAGATA ATAAAATCCG GAGGGGAAAA AATGCTCGCG 300
GAATTC 306 配列番号 ： 1 Ί
配列の長さ ： 1 7 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポ口ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： フ ァ ージク ローン ス H C 2 6 0 7
配列
GAATTCAGCA CAGTTTCCAG ATACAAGATT AATGGACACA AATCAGTAGC 50 TCTTCCATAC ATCAACAGCT ACCAAGCAGA GAATCACATC AAGAACTCAA 100 CCCCTTTTAC AATAGCTGCG ACAAACAACA ACAACAAAAA AACAAAACTT 150 AGGAATATAC CTAGCAAAGA ATTC 174 43
配列番号 ： 1 8
配列の長さ ： 9 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トボ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
起原
生物名 ： ヒ ト
直接の起原 ： フ ァ 一ジク ローン ス H C 2 6 1 0
配列
GAATTCCCTA AAAAAGAAAA AAAAAAAAAA AGACTTCAGC CAACftGATCA 50 GAACGCAGAA AATGCATTTG CCTCAGTAGT GAGTCGGCAG AATTC 95 配列番号 ： 1 9
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TATGGAGCAG GGGXTGGCAG GCGCACTCGT GGTG 33 配列番号 ： 2 0
配列の長さ ： 3 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
新たな用 St 44 トボロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CCCTCCACCG AGGACCXTGG TCAACTTACT CCC 32 配列番号 ： 2 1
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GGCGCCCTGG TCGXTCGGGG TCGTGTGCGC ACAG 33 配列番号 ： 2 2
配列の長さ ： 3 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GTGCAGTGGA TGAACCXGGC TGA TAGCG TT CGC 32
配列番号 ： 2 3
配列の長さ ： 3 1
新たな用紙 45
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TGATAGCGTT CGCTTCGCXG GGGTAACCAC GT 31
配列番号 ： 2 4
配列の長さ ： 2 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACGCATTATG TGCXCTGAAA GCGACGCTGC 29
配列番号 ： 2 5
配列の長さ ： 3 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TGGCGGGTGG CTGCGGAGGX AGTACGTGGA GG 31
靳たな用羝 46
配列番号 ： 2 6
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GGTGGGGG AT TTCCXACTAC GTGACGGGCA TGAC 33 配列番号 ： 2 7
配列の長さ ： 3 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GA ATTCTTCA CGGAGTTGGX ATGGGGTACG GCT 32 配列番号 ： 2 8
配列の長さ ： 3 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎮
トボロジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
新たな用羝 47
配列
CCAGCTCTTC AG CTAGTCA GTTGTCTGCA CC 31
配列番号 ： 2 9
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボ口ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TGGCGGCAGG AGATGGXGCG GAAACATCAC C 30
配列番号 ： 3 0
配列の長さ ： 3 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボ口ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
AGTCAGAGAA CAAGGXTAGT AATCCTAGAC TC 31
配列番号 ： 3 1
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
靳たな用紙 48 トポ口ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACATCCTGGC GGGTTATGGA GC 22
配列番号 ： 3 2
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TGCCCTCCAC CGAGGACCTG GT 22
配列番号 ： 3 3
配列の長さ ： 1 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A 配列
TGATAGCGTT CGCTTCGCG 19 49
配列番号 ： 3 4
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CGCTTTCAGG CACATAATGC GT 22
配列番号 ： 3 5
配列の長さ ： 2 1
配列の型： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GCACTATGTG CCTGAAAGCG A 21
配列番号 ： 3 6
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボ口ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A 50
配列
TGGCTCAGGG ATGTTTGGGA CT 22
配列番号 ： 3 7
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボ口ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
AGTCCCAAAC ATCCCTGAGC CA 22
配列番号 ： 3 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TGGAGCCAGG TTTTGAAGTC 20 配列番号 ： 3 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖 51 トボ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TTGTACCCTC GTTGGCATGA 20 配列番号 ： 0
配列の長さ ： 1 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状 - 配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GGCCTGTGGT GTATGCGTT 19 配列番号 ： 4 1
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
AACGCATA CA CCACAGGCCC CT 22 配列番号 ： 4 2
配列の長さ ： 2 3 52
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GTGGCTGCGG AGGAGTACGT GGA 23
配列番号 ： 4 3
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TCCACGTACT CCTCCGCAGC CA 22 配列番号 ： 4 4
配列の長さ ： 2 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎮
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GAACGTGACC TCATCCCGCA G 21 53 配列番号 ： 4 5
配列の長さ ： 2 3
配列の型： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GTGAGCACCG CCACGTCCGG TTC 23 配列番号 ： 4 6
配列の長さ ： 2 3
配列の型： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GTGGCGGTGC TCACTTCCAT GCT 23 配列番号 ： 4 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A 54
配列
A TGCTCACCG ACCCCA CCCA 20
配列番号 ： 4 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CA TGA CTCCC CAGACGCTGA 20
配列番号 ： 4 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TACTTCCCTC TCATCCTCTT 20
配列番号 ： 5 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖 55 トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GTTTTCCGCA GGATCTCTGC 20 配列番号 ： 5 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎮
トポ口ジー ： 直鎮状
配列の種類： 合成 D N A
配列
CTGCACAGGT ACGCTCCGGC 20 配列番号 ： 5 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CTCCTGCGGG ATGAGGTCAC 20 配列番号 ： 5 3
配列の長さ ： 2 0 56
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鏆状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
GGCGCAGACA ACTGACTAGC 20
配列番号 ： 5 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CCG CCCATCT CCTGCCGCCA 20
配列番号 ： 5 5
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CACAGCTCCC ATGTGAGCCC GAACCGGATG 30 57 配列番号 ： 5 6
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎮の数 ： 一本鎮
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
ACATCCTG G C GGGTTATGGA GC 22 配列番号 ： 5 7
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
AGTCGCAAA C ATCCCTGAGC CA 22 配列番号 ： 5 8
配列の長さ ： 2 1
配列の型 ： 核酸
鎮の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A 58
配列
TGCCCTCCAC CGAGGACCTG G 21
配列番号 ： 5 9
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
CGCTTTCAGG CACATAATGC GT 22
配列番号 ： 6 0
配列の長さ ： 3 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列
TGATAGCGTT CGCTTCGCGG GGTAACCACG T 31

Claims

59 請 求 の 範 囲
1 . 第 1表に示すファージク ローンのいずれかに挿入され ている c D N A又はその一部をプローブとして用いることを 特徴とする D N A— D N A , D N A— R N A又は R N A— R N Aハイブリダィゼ一ショ ンに基づく血液伝播性非 A非 B型 肝炎特異的遣伝子の検出方法。
2 . プローブが配列番号 ： 1 〜 1 8に示すいずれかの塩基 配列を有する D N A又はその一部であることを特徴とする請 求項 1記載の血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出 方法。
3 . プローブが配列番号 ： 1〜 1 8に示す塩基配列のう ち, 互いに相同性の高い部分であることを特徴とする請求項 1記 載の血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出方法。
4 . 第 1図及び第 2図中の対応する 2種類以上の塩基配列 が示されている領域において、 任意に選択された 2種類の塩 基配列間の相同性がいずれの 2種類の塩基配列を選択しても 8 0 %以上である 2 5 mer 以上の領域に属するいずれかの塩 基配列を有するプローブを用いる、 請求項 1 に記載の血液伝 播性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出方法。
5 . 第 1図及び第 2図中の対応する 2種類以上の塩基配列 が示されている領域において、 これらの塩基配列相互間で塩 基を異にする部位の該塩基を 5 —フルォロウラシル又はイ ノ シンにより置き換えた場合に、 任意に選択された 2種類の塩 基配列の相同性がいずれの 2種類の塩基配列を選択しても 60
8 0 %以上である 2 5 me r 以上の領域に属する、 該 5 — フル ォロウラ シル又はィ ノ シ ンにより置き換えられた塩基配列を 有するプローブを使用するこ とを特徴とする D N A— D N A D N A— R N A又は R N A— R N Aハイ ブリ ダィゼーシ ヨ ン に基づく血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出方法 <
6 . 第 1 表に示すファージク 口 ンのいずれかに揷入されて いる c D N Aの塩基配列の一部をプライ マーとして用いるこ とを特徴とする核酸配列増幅方法に基づく血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出方法。
7 . プライ マーが配列番号 ： 1 〜 1 8 に示すいずれかの塩 基配列又はその一部であることを特徴とする請求項 6記載の 血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出方法。
8 . プライ マーが配列番号 ： 1 〜 1 8 に示す塩基配列のう ち、 互いに相同性の高い部分であることを特徴とする請求項 6記載の血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出方法。
9 . 第 1 図及び第 2図中の対応する 2種類以上の塩基配列 が示されている颌域において、 任意に選択された 2種類の塩 基配列間の相同性がいずれの 2種類の塩基配列を選択しても 8 0 %以上である 1 5 tne r 以上の颌域に属するいずれかの塩 基配列を有するプライ マーを用いる、 請求項 6 に記載の血液 伝 ¾性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出方法。
1 0 . 第 1 図及び第 2図中の対応する 2種類以上の塩基配 列が示されている領域において、 これらの塩基配列相互問で 塩基を異にする部位の該塩基を 5 —フルォロウ ラ シル又はィ ノ シ ンにより置き換えた場合に、 任意に選択された 2種類の
新たな Λ 61 塩基配列の相同性がいずれの 2種類の塩基配列を選択しても 8 0 %以上である 1 5 mer 以上の領域に属する、 該 5—フル ォロ ウ ラ シル又はィ ノ シ ンによ り置き換えられた塩基配列を 有するプライ マーを使用することを特徴とする核酸配列増幅 方法に基づく血液伝播性非 A非 B型肝炎特異的遺伝子の検出 方法。
1 1 . 請求項 1 〜 5 のいずれか 1項に記載のプローブ及び ノ又は請求項 6 〜 1 0 のいずれか 1項に記載のブライ マ一を 含んで成ることを特徴とする血液伝播性非 A非 B型肝炎特異 的遺伝子検出用試薬。
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