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WO1993002183A1 - Serum-free tissue culture medium containing tissue inhibitor of metalloproteinase and method for cell growth - Google Patents

Serum-free tissue culture medium containing tissue inhibitor of metalloproteinase and method for cell growth Download PDF

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Publication number
WO1993002183A1
WO1993002183A1 PCT/JP1992/000897 JP9200897W WO9302183A1 WO 1993002183 A1 WO1993002183 A1 WO 1993002183A1 JP 9200897 W JP9200897 W JP 9200897W WO 9302183 A1 WO9302183 A1 WO 9302183A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
timp
culture
fcs
serum
Prior art date
Application number
PCT/JP1992/000897
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Taro Hayakawa
Kyoko Yamashita
Kazushi Iwata
Original Assignee
Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha filed Critical Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha
Publication of WO1993002183A1 publication Critical patent/WO1993002183A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8146—Metalloprotease (E.C. 3.4.24) inhibitors, e.g. tissue inhibitor of metallo proteinase, TIMP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a serum-free medium for culturing adherent cells and suspension cells containing tissue 'inhibitor' ob 'metalloproteinase (TIMP).
  • TIMP tissue 'inhibitor' ob 'metalloproteinase
  • the present invention relates to a method for growing adherent cells and floating cells in a short period of time using the method.
  • the present invention relates to a TIMP-free blood culture medium for tissue culture which is an alternative to a tissue culture medium containing 10-15% fetal calf serum (FCS),
  • FCS fetal calf serum
  • the present invention also relates to a method for culturing adherent cells and non-adherent cells which have been separated and established from mammals using this serum-free medium, or for culturing floating cells such as human or mouse-type fused cells and the like. It is.
  • Tissue 'inhibitor' of metabolic proteinase which is a sugar protein with approximately 30,000 molecules i: J : T.
  • stromal collagenase gelatinase / type IV collagenase (72 kDa and 92 kDa)
  • stromuraysin stromuraysin.
  • bacterial collagenase and thermolysin are not inhibited at all (Cawston, In Proteinase Inhi itors (eds. Barrett AJ and Sa I vesen 6.) Elsevier, Ams-terdani, pp.
  • a TIMPs are synthesized by a variety of cells, namely, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, osteoblasts, chondrocytes, platelets, macrophages, some tumor cells, and all mammalian cells. It is found in body fluids (Welgus and Stricklin, J. Bio I. Chen., 258, 12259-12264, 1983; Kodama et al., Matrix 9, 1-6, 1989). This suggests that TIMP is a fundamental and tight protein in mammals.
  • the present inventors have previously succeeded in producing a mouse monoclonal antibody against ⁇ the dental pulp ⁇ , and antibodies from several clones thereof specifically bind to TIMP in human dental pulp tissue culture solution. I found something to respond. (Kodama et al., Col. Lagen Re. Res. 7, 341-350, 1987). We also succeeded in measuring TIMP in bodily fluids and human tissue fluids and blood with high sensitivity using the Sandwich enzyme immunoassay (II) by combining these antibodies. (Kodaraa et al., Matrix 9, 1-6, 1989). It is well known that the addition of fetal calf serum (FCS) to tissue culture media promotes all cell growth, but what components in FCS can act as growth factors? Has not yet been revealed.
  • FCS fetal calf serum
  • the present inventors measured the concentration of TIMP in FCS by the Sandwich EIA method using the above monoclonal antibody and obtained a value of about 250 ng Z ⁇ . Similarly, an affinity column was prepared using the above monoclonal antibody, and the FCS When TIMP was completely removed, and human gingival fibroblasts were cultured in a culture solution prepared from FCS containing no TIMP, hardly any proliferation was observed until the third day of culture, and the above culture was continued. When anti-TIMP monoclonal antibody was added to the solution, no growth was observed.
  • the present inventors confirmed the effect of TIMP as a growth factor on cell proliferation, and used TIMP as an alternative to FCS by adding it to a serum-free medium. As a result, the present inventors have succeeded in providing an extremely excellent serum-free medium for culturing adherent spores and floating cells.
  • the present invention provides a serum-free medium for tissue culture, characterized in that it contains a tissue 'inhibitor'ob'metaprotein protein. Inhibitor / obtain ⁇ Tissue inhibitor or ob- tained metabolic proteinases using animal mouth cells or fused cells derived from animals, using meta-oral proteinase as a bacterial growth factor. Grown in serum-free medium for tissue culture It provides a method.
  • TIMP to be added to the tissue culture medium of the present invention purified products from mammalian tissues, blood, body fluids, macrophages and normal cells and tumor cells isolated from mammals are used. However, those produced by the recombinant DNA method described in JP-A-61-282095 or JP-A-61-501640 can also be used. .
  • a novel medium that can be used in place of the tissue culture medium containing 10-15% FCS that is, a medium in which a certain amount of TIMPZEPA is added to a serum-free medium for tissue culture is provided.
  • an extremely useful culture method for growing adherent cells, non-adherent cells and toxins, mouse-type fused suspension cells, etc., which has been isolated and established from mammals using a serum-free medium containing rice TIMP has been developed. Provided.
  • the present invention it is possible to reduce the high culture cost in the use of a culture medium supplemented with normal fetal serum at present, and to facilitate the purification of the dilute protein produced in the culture medium.
  • the industrial contribution of the present invention is extremely large, for example, and the present invention also reduces the criticism of fetal serum production due to the recent increase in animal welfare. It has the advantage of being able to.
  • a mouse monoclonal antibody against TIMP was prepared.
  • fusion cells of clone Nos. 7-6C1, 7-21B12 and 7-23G9 were administered to Balb / c mice to obtain ascites.
  • the obtained monoclonal antibody in each ascites was purified according to the method of Kodaraa et al. Described in Collagen ReI. Res., 7, 341-350, 1987.
  • FCS In order to remove TIMP in FCS, FCS was replaced with anti-TIMP monoclonal antibody (Clone N0.7-21B12) according to the method of Kodama et al. Described in J. Iramuno I, Methods, 127, 103-108.
  • the TIMP in the FCS was adsorbed to the column by passing it through a high-performance column. Subsequently, the column-through fraction was sterilized using a Falcon 7104 bottle top filter (0. m, manufactured by Becton Dickinson).
  • TIMP is derived from the conditioner culture of human gingival fibroblasts (Gin-1 cells), and is composed of introgel AcA-44, Con A sepharose, anti-TIMP monoclonal antibody and one sepharose. purified using a full I Second-hand I - ⁇ column, finally, 35 e C, 30 min, 4 M guanidine - after treatment with hydrochloric acid, subjected to Bio-Ge P60 column, bound to TIMP Potential cell growth factors were dissociated. ⁇ Removed by fractionation.
  • the effect of the TIMP-free 10% FCS medium on the growth of Gin-1 spores was examined by changing the TIMP concentration stepwise.As shown in Figure 3 below, the culture on the 7th day was examined. During the period, a change in DNA content was observed in a TIMP concentration-dependent manner. At a TIMP concentration of 100 ng / l, a nearly 100% growth was observed as compared with the control 10% FCS group. The DNA content on day 0 was 0.891 ⁇ 0.018 g Z dish.
  • the Gin-1 cells used in Example 1 are adherent cells.
  • non-adherent cells such as human lymphoblasts (non-secretory mutant, WIL2-NS),
  • Example 1 Using human chronic erythroid leukemia cells (K-562), human acute myeloid leukemia cells (HI-60) and parkitymoma cells (Raji, Ramos and Dau-di), respectively.
  • K-562 human chronic erythroid leukemia cells
  • HI-60 human acute myeloid leukemia cells
  • Parkitymoma cells Rajifs and Dau-di
  • Non-adherent cells (Raj i and Daud i) and adherent cells [SV40-transformed human lung fibroblasts (Wi-38 VA13) and human skin broad epithelial cells (NTCC 2544)]
  • the effect of adding TIMP on growth in ASF-104 was examined. Raj i cells and Daud i cells were used on day 3 of the culture, and Wi-38 VA13 cells and NTCC 254 cells were on day 7 of the culture.
  • Figure 5 shows the results.
  • RNA extraction buffer (0.14M aCH, 15mH MgCjg 2, 10mM Tr i s-HCJI, pH8.6, 0.5% Non i det P-40, 1 IBM DTT) to suspend the cells in 5 minutes under ice-cooling After 5 cells were lysed, the supernatant was collected by centrifugation at 4. To this, an equal volume of a 2 ⁇ concentration of a protease buffer (0.4 M Tris-HCi !, ⁇ 8.0, 50 ⁇ EDTA, 0.6 ⁇ aCi, 4% SDS) is added, and proteinase ⁇ is finally added. concentration was added to the power sale by a 50 g / i »2, 37 e C in left allowed to proceed 0 exploded protein Me 30 minutes to obtain a cytoplasmic IBRNA fraction.
  • a protease buffer 0.4 M Tris-HCi !, ⁇ 8.0, 50 ⁇ EDTA, 0.6 ⁇ aCi, 4% SDS
  • Oligo (JT) —cellulose equilibrated with RNA adsorption buffer (20 mM Tris-HCJ !, pH 7.6, 0.5 H Had, 1 niH EDTA, 0.1% Na- laury I sarcosinate) The mixture was immediately heated to room temperature and rapidly cooled to room temperature. After addition, the mixture was gently stirred at room temperature to absorb poly A + mRNA. Transfer the mixture to a glass column that has been coated with silicon to remove the supernatant, wash the oligo (dT) -cellulose thoroughly with RA adsorption buffer, and elute mRNA without poly A added. , Removed.
  • RNA adsorption buffer 20 mM Tris-HCJ !, pH 7.6, 0.5 H Had, 1 niH EDTA, 0.1% Na- laury I sarcosinate
  • Poly A + RNA elution buffer (10mM Tr is -HCJ?, PH7.8 , 1 ⁇ EDTA, 0.05% SDS)
  • Deo eluted re rubber (dT) Po Li A + mRNA adsorbed to an cellulose, the fraction Minutes were collected.
  • To the recovered poly A + mRNA fraction was added 1 to 10 volumes of Na-acetate buffer, PH5.2, and a 2.5-fold volume of ethanol was used to obtain a precipitate of poly A + mRNA, which was washed with 70% ethanol. After drying, it was dissolved in distilled water.
  • the poly (A + IDRNA) obtained in the above (2) was used as the reverse transcription transcript using oligo dT (12-18) as a primer to synthesize a 1st strand cDNA.
  • Reverse transcriptase reaction solution under ice cooling 50 mM Tris-HCJI, pH7.3, 75 mM KCJ !, 0iuM DTT, 3 ntM MgC, 0.5 mM each (IGTP, dATP, dTTP, dCTP, 10 zg / mi To dT (12-18)), add poly A + IB RNA to 20 g Zn2, add reverse transcriptase derived from Money murine leuke ia virus, and incubate at 37 E for 1 hour. As a result, a hybridized heavy chain of the first strand cDNA and mRNA was obtained.
  • a PCR primer was used to identify the oligo nucleotides complementary to the 5 'and 3' ends of the TIMP gene. It was designed as follows.
  • the DNA was synthesized using a DNA synthesizer (Cyclone) manufactured by Milli-Smith Bao Search in accordance with the same instruc- tion;
  • the obtained oligodeoxyxynucleotide was precipitated with ethanol, washed with 70% ethanol, dried, and dissolved in distilled water.
  • the hybridized heavy chain of 1st strand cDNA and raRNA prepared by the method described above was used as the amplification type II, and two types of TIHP-F1 and TIHP-R1 prepared by the method described above were used.
  • the reaction system of PCR was constructed using ribodexoxysilicon nucleotides as replication primers.
  • PCR reaction solution (67BM Tris-HCJ!, PH8.8 , 16.6IBH (NH 4) 2 S 04, 1.5 ⁇ HgC 2, 10 ⁇ Merukapu preparative ethanol, 6 ⁇ 7 MEDTA, 170 g / ai BSA, each 0,2 (mH dGTP, dATP, dTTP, dCTP) each with 300 ng of the primers TIMP-fl and TIMP-R1, the 1st strand cDNA and the hybrididoni heavy chain of mRNA, and add Taq polymerase Then, an amplification cycle of 93 minutes for 2 minutes, 48 minutes for 1.5 minutes, and 65 minutes for 1.5 minutes was repeated 30 ⁇ . The resulting PC product was analyzed by agarose gel electrophoresis. It was a DNA fragment with a length of 630 base pairs.
  • PIC-20H (Marsh et al., Gene32, 481-485) was obtained by recutting pUFYK-1 with the restriction enzymes BamH I and Ecol I and cutting the DNA fragment with the restriction enzymes BamH I and Ecorl. , 1984) to obtain plasmid.
  • E. coli strain ATCC 33767
  • an E. coli strain having PFEX4 was selected.
  • the transformed E. coli strain is inoculated into a field B containing 50 // g / mg of ampicillin. Reinoculate LB medium containing ampjurin at 50 jug / ⁇ and shake culture in a constant temperature bath at 30 ° C for 2.5 hours. Continued. The resulting cell culture was transferred to a thermostat at 42 and shaking continued for another 1.5 hours. After cooling the culture on ice, collect the cells by centrifugation, suspend them directly in the SDS-PAGE sample buffer, heat-treat them, and subject them to SDS-PAGE. All proteins were analyzed.
  • the protein accumulated in the cells following the induction of the expression of the lacZ gene of PFEX4 was analyzed by the ⁇ stan blotting method using a mouse anti-TIMP monoclonal antibody. Indicated. From the Conoco, PFEX4 it was confirmed and 0 Ru This contains a TIMP Yadenko.
  • PFYK-2 was digested with restriction enzymes Sail and Xhol, and after agarose gel electrophoresis, about 630 base pair DMA fragment was cut out from the gel and purified.
  • the purified DNA fragment of about 630 base bases was digested with the restriction enzyme Sail, and then dephosphorylated with alkaline phosphatase PHE M-neee et al. Nature 294, 228-232. 1981) to obtain plasmid PMAMPT1.
  • CH0 (Chinese Hamster ovary) cells were used as host cells for G gene transfer.
  • the introduction method was a general calcium phosphate coprecipitation method.
  • the CH0 cells by cormorants 25cm 2 culture off Las co-introduced reaches on the day to 80- 90% co-Nfuruen door of DNA introduction were cultured in lO ⁇ FCS containing HaroF12 medium.
  • Approximately 5 purified PMAMPT1 DNA solution is added to 250 2 of 2X HBS (Hank's ba lanced salts;? .?
  • TE buffer was added to 2 M CACI 2 and "(1 mM EDTA-containing 10 mM Tris- HCi, pH 8.0), total volume is 500 ju, leave at room temperature for 30 minutes, remove the medium from the cultured CH0 cells with DNA-calcium phosphate precipitate, and add a 25 cm 2 fresh medium to the culture medium. ! Ri 3.5mJ addition, DNA --phosphate Karushiu arm precipitate gently Pibette I ring were 4 hours fin key Yupe preparative 37 e C.
  • the 0NA-introduced cells were seeded on a 10% fCS-containing ASF-104 serum-free medium in which Cytodex2 Microcarrier (Pharmacia) was suspended.
  • FCS was gradually reduced to 0% in 4 to 5 days, after which FCS free AS04 Dexin in serum-free medium
  • the cells were cultured for about 10 days while inducing with mesasone.
  • the culture supernatant during this period was collected and used for rTIMP purification.
  • ⁇ in the culture supernatant at this time was about 2 ragZisiJ.
  • This culture supernatant was adsorbed to a mouse anti-human TIHP monoclonal antibody-conjugated surface 4 B affinity column. After washing, the eluted fraction was subjected to gel filtration with an introgelAcA54 column, and the rTIMP fraction was collected and concentrated.
  • the purified rTIMP was a single band of about 30 kDa at 303-1 ⁇ 6 £ (12.5% average gel under reducing conditions). Similarly, in Western blotting (staining with mouse anti-human TIMP monoclonal antibody labeled with peroxidase), a single band of about 30 kDa was obtained.
  • the IC 50 was about 1 ⁇ 10 19 M.
  • bnTIHP was purified from a condi- tion culture of the dental pulp tissue according to the method described by Co-Ilagen el. Res., 7, 341-350, 1987, et al.
  • Example 13 The effect of rTIMP concentration on the proliferation of human Gin-1 adherent cells was examined in the same manner as described in Example 1 (b). As shown in Fig. 6, at 100 rng of rTIHP, almost 100% growth was observed as compared to the control group supplemented with 10% FCS. Example 13
  • mice rectal cancer colon 26 cells mouse rectal cancer colon 26 cells
  • rTIMP or bnTIMP both at 1 G0 ng /
  • TIMP in FCS clearly has a proliferative effect on a range of cells.
  • Many polypeptide hormones and growth factors have been discovered so far, and have been shown to promote the growth of cultured cells (Hayashi and Sato, Nature, 259, 132-134, 1976).
  • a special ixocyst strain that can be cultured as a chick in a culture medium that does not contain it at all has been established (Gkabe et al., Cancer Res. ⁇ 46, 43-1046, 1936).
  • the growth of most vertebrates requires blood. This fact suggests that the blood contains one or more unknown growth factors.
  • the proliferative activity of TIMP revealed by the present invention indicates that TIMP is one of these unknown growth factors.
  • L Asno. Laginic acid 20.0% — sodium glutamate 20.0
  • Glutatin (reduced form) 1.0 Biotin 0.2 D — Calcium pantothenate 4.0 Colin bitartrate 20.0 Folic acid 4.0 i — Inositol 20.0 Acid nicotinic acid 4.0 Biridoxal hydrochloride 4.0 Riboflavin 0.4 Tiamine hydrochloride 4.0 Vita Min BL 2 0.1 Calcium phosphoric acid 0.01 Hypoxanthine sodium sodium 2.0 Natrium chloride 8,000.0 Calidium chloride 400.0 Calcium chloride 100.0 Magnesium sulfate 98.0 Zinc sulfate (heptahydrate) 0.01 Copper sulfate (pentahydrate (Salt) 0.001 ferric nitrate (9-hydrate) 0.1 sodium selenite 0.004 sodium dihydrogen phosphate 125.0 sodium bicarbonate 1, 800.0 Table 1 (continued)
  • HEPES 1,200.0 m sodium pyruvate 220.0 succinic acid 106.0 sodium succinate (hexahydrate) 27.0-sodium sodium glycerate 1,500.0 sodium sodium ascorbate 5.0 phenolic (For medium) 5.0 Deoxyadenosine 1.0 Deoxyxitytidine 0.03
  • L-Histidine hydrochloride (monohydrate) 42.0 iso-leucine 105.0 iso-leucine 105.0 L- lysine hydrochloride 146.0
  • FIG. 1 is a graph showing the time-dependent changes in the growth of human Gin-1 cells under various culture conditions.
  • FIG. 2 shows the effect of anti-TIMP monoclonal antibody on the proliferation of human Gin-1 cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the dependence of human Gin-1 cell proliferation on TIMP concentration.
  • FIG. 4 shows the effect of TIHP on the growth of various non-adherent cells.
  • FIG. 5 shows the effect of adding TIMP to various cells in a serum-free culture medium for tissue culture (ASD-104).
  • FIG. 6 shows the results of adding human Gin-1 in a serum-free culture medium.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of human rT IMP on cell growth.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of ⁇ on the growth of human K-562 cells in a serum-free culture medium of AS f-104.
  • Figure 8 shows the effect of adding human rTIMP and bnTIMP on the growth of mouse colon 26 cells in RPM11640 culture medium and the effect of human on growth of mouse 3T3 cells in D-MEM serum-free culture medium.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of adding ton and bnTIMP.
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of adding bnTIMP and human rTIMP on the growth of mouse hybridoma in RPM11640 culture solution.

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Description

明 細 書
テ ィ シュ · イ ンヒ ビター · ォブ ' メ タ 口
プロティ ナーゼ含有組織培養用無血清培
地と細胞増殖方法
[技術分野 ]
本発明は、 テ ィ シュ ' イ ンヒ ビター ' ォブ ' メ タ ロプ ロティ ナーゼ （ TIMP) を含有せ しめた接着性細胞および 浮遊細胞培養用の無血清培地に関する ものであ り 、 また、 この培地を用いて接着性細胞および浮遊細胞を短期間に 増殖させる方法に関する ものである 。
さ ら に詳 し く は、 本発明は、 10— 15%ゥ シ胎児血清 ( FCS ) を含有せ しめた組織培養用培地の代替 と なる TIMP含有組織培養用無血淸培地に関する ものであ り 、 ま た、 この無血清培地を用いて哺乳類から分離、 樹立した 接着性細胞、 非接着性細胞の培養あるいはヒ 卜型ある い はマウス型の融合細胞等の浮遊細胞その他を培養する方 法に関する ものである 。
[背景技術 ]
約 3万の分子 iを持つシァロ糖タ ンパク であ るテ ィ シュ ' イ ンヒ ビタ ー ' ォ ブ ' メ タ 口プロティ ナーゼ ： tissue in i itor of meta I I oprote i nases ( J¾ T . T I MP と い う ） は主たるマ ト リ ッ クス金属プロテアーゼである 間質コ ラ ゲナーゼ、 ゼラチナーゼ / I V型コ ラ ゲナーゼ ( 72 kDaおよび 92 kDa) およびス ト ロムライ シンの特異 的なイ ンヒ ビ夕一である 。 しかし、 同 じ金属酵素でも細 菌コラゲナーゼやサーモライ シンは全く 阻害しないこ と が知られている ( Cawston, In Proteinase Inhi itors ( eds. Barrett A. J. and Sa I vesen 6. ) Elsevier, Ams- terdani, pp.589- 610, 1986) a TIMPは種々の細胞、 すな わち、 線維芽細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 骨芽細胞、 軟 骨細胞、 血小板、 マク ロフ ァージ、 いくつかの腫瘍細胞 によって合成され、 また、 哺乳類の全ての体液中に見い 出されている （ Welgus and Strickl in, J . B i o I . Chen. , 258, 12259- 12264, 1983 ； Kodamaら ， Matrix9 ， 1 - 6 ， 1989 ) 。 このこ とは TIMPが、 哺乳類において基本的 かつ营逼的なタ ンパク質である こ と を示唆している 。
Dochertyら （ Nature 318, 66- 69, 1985 ) は、 cDNA分 折の結果から TIMPの全ァミ ノ酸配列を明らかに した。 そ の配列は、 HTLV-II を感染させた Mo T リ ンパ芽球が産 生する erythro i d potentiating act i v i ty (EPA) (Gasson ら ， Nature、 315, 768— 771, 1985 ) のアミ ノ酸配列と 全く 同 じ配列である こ とが判明している 。 さ らに EPA は in vitroでヒ ト赤芽球性白血病細胞株 （ K 562 )の増殖も 促進する こ と が明らかにされている （ Aval osら ， Blood, 71， 1720- 1725 , 1988 ) 。 最近、 Hayakawaら （ FEBS Lett. , 268, 125 - 128, 1990 ) は、 ヒ ト骨髄間質紲胞祙の 1 つ 102が産生する ΤΙΜΡが burst— for ing units 一 erythro i d (BFU-E ) と CG I ony— f orra i ng units - eryth- roid ( CFU-E)のコロニー形成を促進する こ と を明らかに した。 他方、 正常マウス線維芽細胞の " cel l division cycle " (細胞分裂周期） 遺伝子の 1 つ、 16C8の発現産 物である 22 kDaのタ ンパク質が、 マウス TIMPと全く 同 じ であ り （ Gewertら、 EMBO J. , 6 , 651 - 657, 1987 ) ヒ ト TIMP/EPAに相当する こ と が明らかにされている （EcJwa- rds ら ， Nucleic Ac id Res. , 1 , 8863 - 8878, 1986 ) β これらの事実は、 ΤΙΜΡが赤血球系始祖 （幹） 細胞だけで なく 、 他の細胞に対して も細胞成長因子と しての话性を もつ可能性を示唆している
本発明者らは、 先に、 ゥシ齒髄 ΤΙΜΡに対するマウスモ ノ ク ローナル抗体の作製に成功し、 その中の数ク ローン からの抗体がヒ ト歯髄組織培養液中の T IMPと 特異的に反 応する こ と を見い出 した。 （ Kodamaら ， Col lagen Reに Res.7 , 341 - 350, 1987 ) 。 またそれらの抗体を組み 合わせる こ と によ るサン ドィ ツチ酵素免疫測定法 （ ΕΙΑ) によ り ゥシおよびヒ 卜組織体液および血液中の TI MPを高 感度で測定する こ と に成功 した （ Kodaraaら ， Matrix9 , 1 - 6 , 1989 ) 。 従来、 組織培養用培地にゥシ胎児血清 ( FCS ) を添加する と あらゆる細胞増殖が促進される こ と はよ く 知られて いるが、 FCS 中のいかなる成分が成長 因子と して働く のかについては未だ明らかにされていな い .
本発明者らは、 上記のモノ ク ローナル抗体を用いたサ ン ドィ ツチ EIA 法によ り FCS 中の TIMPの濃度を測定した と ころ約 250n g Z ^の値を得た。 同様に上記のモノ ク ロ ーナル抗体を用いてァフ ィ 二テ ィ カラムを作製 し、 FCS 中の TIMPを完全に除去し、 その TIMPの非含有の FCS よ り 調製した培養液でヒ 卜歯肉線維芽細胞を培養したと ころ、 培養 3 日 目 ま では殆 ど増殖せず、 更に上記培養液に抗 TIMPモノ クローナル抗体を添加した場合、 全く増殖しな いこ と が認められた。 一方、 TIMP非含有 FCS よ り調製し た培養液に精製 TIMPを添加 して 、 培養を行 う と 、 その TJMPの濃度に比例して増殖し、 TIHP 100 ng Z 濃度で 通常の 10% S 添加培養液の場合と 同程度まで増殖した。
また、 組織培養用無血清培地に TIHP 00 ng Z を添 加し、 接着性細胞および非接着性細胞を培養したと ころ、 通常の 10% FCS 添加培養液の場合と 同程度の紲胞増殖促 進効果が認められた。
これらの知見に基づき 、 本発明者らは、 細胞増殖に対 する TIMPの成長因子と しての効果を確認し、 TIMPを FCS の代替物と して 、 無血清培地中に添加して用いる こ と に よって、 接着性紲胞および浮遊細胞を培養するためめ極 めて優れた無血清培地を提供する こ と に成功した。
[発明の開示 ]
本発明はテ ィ シュ ' イ ンヒ ビター ' ォブ ' メ タ口プロ ティ ナーゼを含有せしめたこ と を特徴とする組織培養用 無血清培地を提供する ものであ り 、 さ らに、 テ イ シユ イ ンヒ ビター · ォブ ■ メ タ口プロティ ナーゼを紲脗増殖 成長因子と して用いて 、 動物組織細胞あるいは動物由来 の融合細胞をテ ィ シュ · イ ンヒ ビター ' ォブ ' メ タ ロプ ロティ ナーゼ含有組織培養用無血清培地中で増殖させる 方法を提供する ものである 。 本発明の組織培養用培地に 添加する TIMPと しては、 哺乳類の組織、 血液、 体液、 マ ク ロフ ァージおよび哺乳類よ り分離された正常細胞、 腫 瘍細胞からの精製品を使用する こ と ができ るが、 特開昭 61— 282095ある いは特開昭 61— 501640に記載されて いる リ コ ンビナン ト DN A 法な どによ って作製された もの も使 用する こ と ができ る 。
本発明によ り 、 10— 15% FCS 含有組織培養用培地に替 えて用いる こ と のでき る新規な培地、 すなわち、 組織培 養用無血清培地に TIMPZEPA を一定量添加 した培地が提 供され、 また、 こめ TIMP含有無血清培地を用いて哺乳類 よ り分離、 樹立 した接着性細胞、 非接着性細胞および t 卜 、 マウス型融合浮遊細胞などを増殖させる と い う 極め て有用な培養法が提供される 。
本発明によ り 、 現在、 通常のゥシ胎児血清添加培養液 の使用における高培養コス ト を低減する こ と ができ 、 か つ培養液中の希薄な産生たん白質の精製を容易にする こ と ができ るなど、 本発明によ る産業的貢献は極めて大き いものであ り 、 また、 本発明は、 最近の動物愛護運動の 高ま り によ る ゥシ胎児血清生産への非難も軽減でき る と い う 利点を有する 。
以下、 実施例によ り 、 本発明を具体的に説明する 。 た だ し、 本発明はこれに限定される ものではない。
なお、 下記の実施例中で用いられて いる " Π MPは、 下記 の如く して調製された ものである 。 (a) 抗 TIHPモノ ク ローナル抗体の調製
特開昭 63— 219392号公報記載の方法に従っ て ゥシ歯 髄 TIMPに対するマウスモノ ク ローナル抗体を調製した。 得 ら れた 17種の ク ローンの内、 ク ローン Nos. 7-6C1、 7-21B12 および 7-23G9の融合細胞を Balb/cマウスに投与 し腹水を得た 。 得 られた各腹水中のモ ノ ク ローナル抗 体を Col lagen Re I . Res. , 7 , 341- 35 0, 1987 に記載の Kodaraaらの方法に従って精製した。
(b) TIMP非含有 FCS の調製
FCS 中の TIMPを除去するために、 J. Iramuno I , Methods, 127, 103— 108,に記載の Kodamaらの方法に従って FCS を 抗 TIMPモノ ク ローナル抗体 （ ク ローン N0.7-21B12) —セ フ ァ ロース . ァフ ィ 二テ ィ ー · カラムを通過させ、 FCS 中の TIMPをカ ラムに吸着 させた。 ついで、 カ ラム素通 り画分を Falcon 7104 bottle top f i lter ( 0. m , Becton Dickinson製） を用いて除菌した。
(c) TIHPの精製
TIMPはヒ 卜齒肉線維芽細胞 （ Gin-1 細胞 ） のコ ンディ シ ヨ ン培養液よ り 、 introgel AcA-44, Con Aセフ ァ ロー ス ， 抗 TIMPモノ ク ローナル抗体一セフ ァ ロース ■ ァフ ィ 二テ ィ ー ■ カ ラム を用いて精製 し、 最後に、 35eC、 30 分間、 4 Mグァニジン—塩酸中で処理した後、 Bio-Ge! P60 カラムにかけて 、 TIMPに結合している可能性のある 細胞成長因子を解離 ■ 分画によ って除去した。
(cl) FCS 中の TIMP濃度の測定 B i oce I I , Bockneck, 隠， Boeh l i ngerあるいは G i bco か ら入手 した 検体の fCS について 、 Matr i x 9 ， 1 一 6 , に記載の方法に従って TIMP含有量を測定 した と ころ、 124 - 357n g /mi ( 253 ± 16 n g / mjj . 平均土 SD) なる 値を得た。
実施例 1
(a) G i n-1 細胞を用いた増殖の経時的変化の検討
種々の培養条件下で G i n-1 細胞増殖の経時的変化を調 ベた。
すなわち、 Anaに B iochera.， 39， 197— 201，に記載の H卜 negardner の方法に従って G i n-1 細胞の増殖程度を細胞 中の DNA 量によ り調べた 6 その結果を後掲図 1 に示す。 同 図か ら 明 ら かなよ う に G i n-1 細胞は通常の 10% FCS ( —〇一 ） 中ではコンフルェン 卜になる までの 7 日間、 ほぼ直線的な増殖を示したが、 TIMP非含有 FCS ( —拿一 ） 中では、 3 日 目 まではほと んど増殖しなかった。 その後、 増殖の回復がみられ、 7 日 目では 10% FCS 群の約 60%に 達した。 しか し、 この増殖の回復は培養液中へモノ ク ロ ーナル抗体 （ ク ローン to.7-6C1， 54n g / , - A - ) を 加える こ と によ り完全に抑制された。 なお、 DMA 量測定 結果は、 3 d i shの平均士 SDで表 した。
この G i n-1 細胞増殖に及ぼす抗 TIMPモノ ク ローナル抗 体の影響を調べるために、 G i n-1 細胞培養液中へ抗 TIMP モノ ク ローナル抗体の 1 つ （ ク ローン No. 7-6C1 ) を加え 培養 7 日 目に DMA 量を測定した と こ ろ （ 一 一 ） 、 後掲 図 2 に示したよ う に、 添加量依存的に顕著な増殖抑制が みられた。 この増殖抑制は TIHP分子上の別のェピ トープ を認識する も う 1 つの抗体、 ク ローン No.7-23G9 ( —〇一 ） によ っ て も認め られた。 と こ ろが、 対照と して用いた マウス免疫グロ ブ リ ン （ 一▲ 一 ） ではこのよ う な阻害 は全く認められなかった。 なお、 0 日 目の DNA 含量は、 0.891 ± 0.018 u g /cHshであった。
(b) Gin-1 細胞増殖に対する TIMP濃度の影響
Gin-1 紲胞の増殖に対して TIMP非含有 10% FCS 培地に ついて TIMP濃度を段階的に変えてその影響を調べた と こ ろ、 後掲図 3 に示したよ う に 7 日 目の培養期間中、 TIMP 濃度依存的に DNA 含量の変化が認められ、 TIMP濃度 100 n g Ζ ι»2では対照の 10% FCS 群に比べ、 ほぼ 100 %の增 殖が認められた。 なお、 0 日 目の DNA 含量は、 0.891 ± 0.018 g Z d ishであった。
実施例 2〜 7
種々の非接着性細胞の増殖に対する TIMPの効果
実施例 1 で用いた Gin-1 細胞は接着性細胞であるが、 本実施例 2 〜 7 においては、 非接着性細胞であるヒ 卜 リ ンパ芽球 （非分泌変異株、 WIL2-NS)、 ヒ 卜慢性赤血球性 白血病細胞 （ K-562 )、 t ト急性骨髄性白血病細胞（HI -60) およびパーキ ッ ト リ ンパ腫細胞 （ Raj i， Ramosおよび Dau- d i ) をそれぞれ、 用い、 実施例 1 と 同様に実施して 、 非 接着性細胞の増殖に対する TIMPの影響を調べた。 その結 果を後掲図 4 に示す （ 1 , 培養 0 日 目 ； 2， 10% FCS ； 3 , TIMP非含有 10% FCS ； 4 , T I Μ Ρ非含有 10 % FCS 十 100ng / mi UHP ) いずれの細胞も TIMP非含有の FCS 中、 2 日 間の培養ではほ と ん ど増殖は認め られなかつたが (3) 、 これに 100n g ^の TIMPを添加する と （4) 、 対照 の 10% fCS (2) にほぼ匹敵する増殖が認められた （ 1 ， 培養 0 日 ； 2 , 3 , 4 , 培養 2 日 ） 。 このよ う に細胞増 殖の TIMP依存性については、 接着性細胞および非接着性 細胞によ る差異は見られなかった。
実施例 8〜 11
無血清培地への TIM Pの添加効果
非接着性細胞 （ Raj iおよび Daud i ) および接着性細胞 [ SV40形質転換ヒ ト肺線維芽細胞 （ Wi-38 VA13 ) および ヒ ト皮廣上皮細胞 （ NTCC 2544 ) ] のそれぞれについて 、 無血清培地 ASF-104 (表 1 ) 中での増殖に対する TIMPの 添加効果を調べた。 Raj i細胞と Daud i 細胞は培養 3 日 目 、 Wi-38 VA13細胞と NTCC 254 細胞は培養 7 日 目の試料を 用い結果を 3 d is hの平均士 SDで表した。 その結果を図 5 に示す。 この図から明らかなよ う に （ 1 , 培養 0 日 目 ； 2 , 10% FCS ； 3 ， AS卜 104 ； 4 , AS F- 104 + 30 n g / «2 TIMP； 5 , ASF-10 十 100n gノ T I MP ) 、 何れの細胞 において も TIMP濃度 100n g で （ 5 および表 1 ) 有意 の細胞増殖促進効果が認められ、 10% fCS 中（2) と 同程 度細胞増殖がみられた。 また、 表 2 および表 3 に示 した 別の市販の組織培養用無血清培地、 イ スコ フ培地および D-MfM /卜 12混合培地それぞれに 100rig Zm2 TIHPを添加 したものについて も全く 同様な増殖効果がみられた。 以下の実施例で用いられている rTI MP および bnTIMPは 下記の如く して調製した。
(a) ヒ ト リ コンビナン ト TIMP ( rTIMP ) の調製
(1) 細胞質 raRNAの抽出
ト Gin-1 細胞を 10% FCS を含む D-MEH 培地で飽和 前段階まで培養した後、 培地を FCS 非含有 培地に 変更して觎餓状態と し、 24時間培養を続行し、 TIMPをコ ー ドする BRNAの生合成、 蓄積を誘導した。 得られた培養0 細胞は、 培養用シャーレ上で水冷した PBS で洗浄した後、 氷冷下でスク レイ パーでかき取 り小量の PBS で再懸濁、 4 °Cで遠心して集めた。 RNA 抽出用緩衝液 （ 0.14M aCH , 15mH MgCjg2 , 10mM Tr i s-HCJI , pH8.6 , 0.5% Non i det P-40, 1 IBM DTT ) で細胞を懸濁し、 氷冷下に 5分間置き5 細胞を溶解した後、 4 で遠心して上清を回収した。 こ れに、 2 倍濃度のタ ンパク 質分解酵素用緩衝液 （ 0.4M T r i s-HCi! , ρΗ8.0, 50πιΗ EDTA, 0.6Μ aCi , 4 % SDS ) を等量加え、 プロティ ナーゼ Κ を最終濃度が 50 g /i»2 と なる よ う に添加 し、 37eCで 30分間放置しタ ンパク質め0 分解を進行させ、 細胞質 IBRNA画分を得た。
(2) ポリ A+ niRNAの選択
RNA 吸着緩衝液 （ 20mM Tr i s-HCJ! , pH7.6, 0.5H Had , 1 niH EDTA, 0.1% Na- laury I sarcos i nate ) で平 衡化したオリ ゴ （ （JT ) —セルロースを、 65で間で加温し た後室温まで急冷 した前記（υ の細胞質™RNA画分に直接 添加して 、 室温で穏やかに撹拌 しポリ A+ mRNAを吸収さ せた。 これを シリ コ ンコー ト済みのガラス製カラムに移 して上清を除去し、 R A 吸着緩衝液でオ リ ゴ （ dT) —セ ルロースを十分洗浄 し、 ポリ Aが付加されていない mRNA を溶出、 除去した。 ポリ A+ RNA 溶出緩衝液（10mM Tr is -HCJ? , pH7.8, 1 ίθΜ EDTA, 0.05% SDS ) でオ リ ゴ （ dT) 一セルロースに吸着したポ リ A+ mRNAを溶出 し、 この画 分を回収 した。 回収ポリ A+ mRNA画分に 1 ノ 10体積の Na - acetate 緩衝液， PH5.2 を添加、 2.5 倍体積のェタ ノ —ルでポリ A+ mRNAの沈殿を得、 70%エタ ノールで洗浄 し、 乾燥した後、 蒸留水に溶解 した。
(3) cDNAの合成
前記（2) で得られたポリ A+ IDRNAはォ リ ゴ dT ( 12- 18個） をプライ マーと した逆転写の銕型と して用い、 1 st strand cDNAの合成を行った。 氷冷下の逆転写酵素反 応液 （ 50mM Tr is - HCJI ， pH7.3, 75mH KCJ! , 0iuM DTT， 3 ntM MgC , 各 0.5mM (IGTP, dATP, dTTP, dCTP, 10 z g / mi ォ リ ゴ dT ( 12— 18個） ） にポリ A + IB R N Aを 20 g Zn2と な る よ う 加 え た後 、 Mo loney murine leuke ia virus 由来逆転写酵素を添加し、 37ECで 1 時間反応させ、 1 st strand cDNAと mRNAのハィ ブリ ッ ドニ重鎖を得た。
(4) PCR プライ マーの設計
TIMPの cDNA配列 （ Dochertyら、 Nature 318、 66— 69、 1985 ) から TIMP遣伝子の 5'末端側および 3'末端側に相補 的なオ リ ゴデ才キシ リ ボヌ ク レオチ ドを PCR プライ マー と して設計した。
プライ マー " TIMP-F1 " の塩基配列 5'-ATG GCC CCC TTT GAG CCC CTG-3'
プライマー " TIMP-fn " の塩基配列 5'-CAG GAT TCA GGC TAT CTG-3'
(5) プライ マーの合成
ミ リ ジヱンバ オサーチ社 DNA シンセサイザー （サ イ ク ロン ） を用い、 同イ ンス ト ラク シ ョ ンに従って 、 ；3 一ア ミ ダイ ド法で合成した。 得られたオ リ ゴデ才キシリ ボヌ ク レオチ ドはエタノール沈殿し、 70%エタノールで 洗浄し、 乾燥した後、 蒸留水に溶解した，
(6) PCR による TIMPcDNAの特異的増幅
先に述べた方法で調製した 1 st strand cDNAと raRNA のハイ ブリ ッ ドニ重鎖を増幅の篛型と し、 先に述べた方 法で調製した TIHP-F1 、 TIHP-R1 の 2種のオ リ ゴデォキ シリ ボヌ ク レオチ ドを複製のプライ マーと して PCR の反 応系を構成した。 PCR 反応液 （ 67BM Tris-HCJ! ， pH8.8, 16.6IBH (NH4) 2S 04 , 1.5ηιΗ HgC 2 , 10ίΐΜ ーメルカプ ト エタ ノール、 6 · 7 MEDTA , 170 g / ai BSA, 各 0,2 mH dGTP ， dATP, dTTP, dCTP) にそれぞれ 300n gのプラ イ マ一 TIMP-fl と TIMP-R1 と の 1 st strand cDNA と mRNAのノヽィ ブリ ッ ドニ重鎖を力 πえ、 Taq polymeraseを 添加し、 93で 2分閭、 48で 1.5分間、 65で 1.5分間の増 幅サイ クルを 30Θ繰 り 返 した 。 こめ様に して得られた PC 産物は、 ァガロースゲル電気泳動による分析で、 約 630 ベースペアの長さ を も った DNA 断片であった。
(7) 増幅された DNA 断片のサブク ローニング
プライ マー TIMP-F1 と TIMP-R1 で規定された PCR 産 物である約 630 ベースペアの DNA 断片を、 ァガロースゲ 5 ル電気泳動後、 ゲルから切 りだし精製 した。 精製 した約 630 ベースペアの DNA 断片は、 制限酵素 Sma l で切断し たプラス ミ ド PUC 13と 直接連結し、 プラス ミ ド pUFYK-l を得た。 さ らに pUFYK-1 を制限酵素 BamH I と Ecor I で再 切断 して得られた DNA 断片を制限酵素 BamH I と Ecorl で セ刀断 し た PIC-20H (Marshら、 Ge ne32、 481— 485、 1984 ) と結合させ、 プラス ミ ド を得た。
(8) 大腸菌における TIMP遣伝子発現ベク ターの作製 PFYK-2を制限酵素 BamH I と Xho l で切断し、 ァガロ ースゲル電気泳動後、 ゲルから約 630 ベースペアの DNA5 断片を切 りだし、 精製 した。 精製された約 630 ベースぺ ァの DNA 断片は、 制限酵素 BamH I と Sal I で切断 したプ ラス ミ ド pEX ( Stan ley ら、 EMBO J. 3 、 1429- 1434. 1984 ) と連結 し、 プラス ミ ド PFEX4 を得た。
(9) 大腸菌における TIMP遺伝子の導入と発現
0 PFEX4 は一般的な方法で大腸菌株 (ATCC 33767 ) に形質転換し、 PFEX4 を持つ大腸菌株を選択 した。 形質 転換した大腸菌株を 、 50// g / mgのアンプシ リ ンを含む B き地に接種 し 3(TCの恒温槽で一晩、 振盪培養を行い、 5 % ( v/v ) と なる よ う に 50ju g /^のアンプシ リ ン含b 有 LB培地に再接種 し 30°Cの恒温槽で 2.5時間、 振盪培養 を続行した。 得られた細胞培養液を 42での恒温槽に移し、 更に 1.5時間振盪を続行した。 培養液を氷冷後、 遠心で 菌体を集め、 直接 SDS-PAGEのサンプル緩衝液に懸濁、 熱 処理を して SDS-PAGEに供し、 PFEX4 で形質転換された大 5 腸菌株に由来する全タ ンパク質を分析 した 。 PFEX4 の lacZ遣伝子の発現の誘導に伴つて菌体内に蓄積していた タ ンパク質をマウス抗 TIMPモノク ローナル抗体によ る ゥ エスタ ンブロ ッテ イ ング法で分析したと ころ、 反応性を 示した。 このこ と から、 PFEX4 が TIMP遣伝子を含んでい0 る こ と を確認した。
(10) CH0 における TIMP遣伝子発現ベク ターの作成
PFYK-2を制限酵素 Sai l と Xho l で切断し、 ァガロ ースゲル電気泳動後、 ゲルから約 630 ベースペアの DMA 断片を切 りだし、 精製した。 精製された約 630 ベースべ5 ァの DNA 断片は、 制限酵素 Sai l で切断し、 次にアル力 リ フ ォ スフ ァ タ一ゼで脱リ ン酸化 したプラス ミ ド PHE M- neo eeら、 Nature 294、 22 8- 232. 1981 ) と連結し、 プラス ミ ド PMAMPT1 を得た。
(11) 培養細胞への遣伝子導入
G 遣伝子導入の宿主細胞と して CH0 (チャイ ニーズハ ムスター卵巣） 細胞を用いた。 導入の方法は一般的なリ ン酸カルシウム共沈法で行った。 DNA 導入の導入当日に 80— 90%コ ンフルェン ト に達する よ う 25cm2 培養フ ラス コで CH0 細胞を lO^ FCS 含有 HaroF12培地で培養した。 約5 の精製 PMAMPT1 DNA 溶液を 250 ϋ の 2 X HBS ( Hank's ba lanced salts ； .4niM NaHP04 , 10mM KCJ? , 12raM g lucose. 275mM NaCj?含有 40mM HESPES , pH6.95 ) と 』 の 2 M CaCi2 に加え TE緩衝液 （ 1 mM EDTA 含有 10mM Tris-HCi , pH 8.0) で全量を 500 ju と し、 室温 で 30分間放置し DNA — リ ン酸カルシウム沈殿をつ く った 培養 した CH0 細胞から培地を除き 、 新しい培地を 25cm2 培養フ ラスコあた り 3.5mJ! 加え、 DNA — リ ン酸カルシゥ ム沈殿を穏やかにピベッテ ィ ング し、 37eCで 4 時間ィ ン キ ュペー ト した。 DNA — リ ン酸カ ル シ ウム沈殿 を培地 と と もに除去 し、 25cra2 の培養フ ラスコあた り 2.5mJl の FCS フ リ ー HamF12培地で細胞を洗い、 10%DMS0溶液を 25 cm2 の培養フ ラスコあた り 1 m2加え、 2 — 4分間室温で 放置 した後、 DMS0を除去 した。 次に 10%FCS および 0.1 mM ク 口 口 キ ン含有 HamF12培地を 25cm2 培養フ ラス コあ た り 1.7ηι』 加え、 37でで 2.5 時間イ ンキ ュベー ト し、 力 Π えたク ロ口キ ンを除去し、 FCS フ リ ー HamF12培地で細胞 を洗い、 10% FCS 含有 Ham M2培地を加え 2 日 間培養 し た。 更に g ジエネティ シン （ G418) および 10 % FCS 含有 HamM2選択培地で培養を行い DNA 導入綳胞を 選択 した。
(12) 培養細胞における遣伝子の発現および精製
0NA 導入細胞を 、 Cytodex2マイ ク ロキ ャ リ アー （ フ アルマシア製 ） を懸濁した 10% fCS 含有 ASF-104 無血清 培地に播種 した。 4 〜 5 日間で FCS を徐々 に 0 %まで低 下させ、 以後 FCS フ リ ー AS 04 無血清培地中デキサ メサゾンで誘導しながら、 約 10日間培養した。 その間の 培養上清を回収し、 rTIMP の精製に供した。 この時の培 養上清中の ΓΤΙΜΡ は、 約 2 ragZisiJであった。
この培養上清をマウス抗ヒ ト TIHPモノクローナル抗体 結合セフ ァース 4 Bァフ ィ 二テ ィ ーカラムに吸着させ、 洗浄後溶出した画分を introgelAcA54 カラムでゲル濾過 し、 rTIMP 画分を集め濃縮した。
(13) 培養細胞で発現した rTIMP の性質
精製した rTIMP は303-1^6£ ( 12.5%均ーゲル、 還元 条件） で約 30 kDaの単一バン ドであった。 また、 同樣に ウェスタンブロ ッテイ ング （ペルォキシダーゼ標識マウ ス抗ヒ ト TIMPモノ ク ローナル抗体で染色） において も、 約 30 kDaの単一バン ドであった。
rTIMP の CCD -41 SK細胞由来コラゲナーゼに対する阻害 活性を測定した と ころ、 IC50は約 1 X 10一9 Mであった。
(b) ゥシ歯髄 TIMP ( bnTIMP) の調製
bnTIHPは、 ゥ シ齒髄組織のコ ンデシ ヨ ン培養液よ り Co I lagen el. Res. , 7 , 341 - 350, 1987に記載の «0- daniaらの方法に従って精製した。
実施例 12
Gin-1 細胞増殖に対する rTIMP の効果
前記実施例 1 (b) 記載と 同様にヒ ト Gin-1 接着性細胞 の増殖に対する rTIMP 濃度の効果を調べた。 図 6 に示し たよ う に rTIHP 濃度 100n gノ^で対照の 10% FCS 添加群 に比べ、 ほぼ 100%の増殖が認められた。 実施例 13
K-562 細胞増殖に対する ΓΤΙΜΡ の効果
前記実施例 2〜 7 に記載された方法と 同様に して 、 ヒ ト Κ-562 非接着性細胞の増殖に対する rTIMP 濃度の効果 を調べた。 図 7に示 したよ う に rTI MP 濃度 100n g ^で 対照の 10% FCS 添加群に比べ、 ほぼ 100%の増殖が認め られた。
実施例 14、 15
マウ ス由来コ ロン 26細胞および同 3T3 細胞の増殖に対す る rTIMP および bnTIMPの効果
マウスコ ロン 26細胞 （ マウス直腸癌コ ロン 26細胞 ） の 増殖に対 して rTIMP ある いは bnTIMPを （ いずれも 1G0ng / ) 添加 しその効果を調べた と ころ 、 図 8に示 したよ う に 7 日間の培養期間中、 RPM 11640培養液添加ではほと んど増殖 しなかったが、 bnTIMP添加で対照の 10%添加群 に比べ、 約 70%ま でその増殖が回復 した。 同様な結果は、 マウ ス 3T3 細胞 （ 3T3 スイ スアルビノ細胞一マ ウ ス胎児 線維芽細胞） でも認められた。
実施例 16
マ ウ ス由来ハイ プ リ ドーマ増殖に対する ΓΤ IMP および bnTIMPの効果
マウス抗ヒ ト ラ ミ ニンモ ノ ク ローナル抗体産生ハイ ブ リ ドーマ （ ク ローン ito 22— 3810： 微工^菌寄第 12200 号 ， FERM . 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号 . 通商産業省工業技術院微生物工業技術^究所 ） 増殖に対 する rTIMP および tjnn MP ( いずれも 100n g / mi ) 添加効 果を調べた と ころ、 図 9 に示 したよ う に rTIMP では劫果 を認められなかったが、 bnTIMPでは対照め 10% FCS 添方 Π 群に比べ、 約 70%までその増殖が回復した。
以上の実験結果から明らかなよ う に、 FCS 中の TIMPは 明らかに店い範囲の細胞に対し増殖効果を示す。 これま で多 く のポリペプチ ドホルモンや成長因子が発見され、 培養細胞の増殖を促進する こ とが示され （ Hayashi and Sato, Nature, 259, 132 - 134, 1976 )、 また、 タンパク 性因子を全く 含まない培養液中でも雛代培養可能な特殊 な翊胞株も確立されている （ Gkabe ら ， Cancer Res. τ 46 , 43— 1046, 1936 ) 。 一般的にはほとんどの脊椎動物の 増殖には血液が要求される 。 この事実は血液中に 1 つま たは複数の未知の増殖因子が含まれている こ と を示唆し て いる 。 本発明によ り 明らかにされた TI MPの増殖促進 ¾ 性は、 TIMPがこれら未知の増殖因子の う ちの 1 つである こ と を示している 。 したがって 、 本発明は、 天然の TIMP または リ コ ンビナン ト TIMPを合成人工培養液中に加える こ と によ り 、 これまで、 合成人工培養液中では増殖を行 わせる こ とが困難であった り 、 制限されて いた細胞の増 殖を FCS 含有培養液中と 同 じレベルにおいて行う こ と を 可能に したものであ り 、 細胞培養を用いる諸研究や、 さ らに、 工業レベルへの応用等 .. これら分野での進歩に大 き な貢献をする も である 。 表 1
) ASM04培地
[成分組成 ] 1 リ ッ トル中
し 一ァラニン 20.0 me L—アルギニン塩酸塩 200.0
L—ァスパラギン （ 一水塩 ） 56.0
L— ァ ス ノ、。ラギン酸 20.0 し — グルタ ミ ン酸ナ ト リ ウム 20.0
L— システィ ン塩酸塩 （ 一水塩 ） 70.0 グ リ シン 30.0
L— ヒ スチジン塩酸塩 （一水塩） 42.0 し ー ィ ソ ロイ シン 105.0
L— ロイ シン 105.0
L一 リ ジン塩酸塩 146.0 L—メ チ才ニン 30.0
L一 フ エ 二ルァラニン 67.0
L一 プロ リ ン 20.0 し 一セ リ ン 80.0 し — ス レ才ニン 95.0 L— ト リ プ ト フ ァ ン 25.0 し 一チロシン 64.0
L一 ノく リ ン 94.0
L一オル二チン塩酸塩 100.0 グ リ シル L— グルタ ミ ン 500.0 ァラニル L— グルタ ミ ン 500.0 表 1 (つづき ）
[成分組成 ] リ ッ トル中
グルタチン （還元型） 1.0 ビォチン 0.2 D —パン トテン酸カルシウム 4.0 重酒石酸コ リ ン 20.0 葉酸 4.0 i —イ ノ シ トール 20.0 ニコチン酸ァシ ド 4.0 ビリ ドキサール塩酸塩 4.0 リ ボフラビン 0.4 チアミ ン塩酸塩 4.0 ビタ ミ ン B L 2 0.1 フ オルニッ ク酸カルシウム 0.01 ヒポキサンチンニナ ト リ ウム 2.0 塩化ナ ト リ ウム 8， 000.0 塩化カ リ ウム 400.0 塩化カルシウム 100.0 硫酸マグネシウム 98.0 硫酸亜鉛 （七水塩） 0.01 硫酸銅 （五水塩） 0.001 硝酸第二鉄 （九水塩） 0.1 亜セレン酸ナ ト リ ウム 0.004 リ ン酸二水素ナ ト リ ウム 125.0 炭酸水素ナ ト リ ウム 1， 800.0 表 1 (つづき ）
[成分組成 ] リ ッ 卜ル中
HEPES 1， 200.0 m ピルビン酸ナ ト リ ウム 220.0 コハク酸 106.0 コハク酸ナ ト リ ウム （六水塩） 27.0 ーグリ セ口 リ ン酸ニナ ト リ ウム 1, 500.0 ァスコルビン酸ナ ト リ ウム 5.0 フエノール レ ッ ド （培地用 ） 5.0 デォキシアデノ シン 1.0 デ才キシシチジン 0.03
6, 8 —ジヒ ドロキシプリ ン 0.3 チ ミ ジン 0.2 ゥ リ ジン 5.0 プ ト レスシン二塩酸塩 0.3 フ ォ ス フ ォエタ ノールァ ミ ン 28.0 コ レステロール 0.1 グルコース 2, 000.0 マンノース 500.0 ガラク トース 200.0 α— シク ロデキス ト リ ン 2, 200.0 ひ ーシク ロデキス ト リ ン一 リ ノール酸 10.0 ヒ 卜 卜 ランスフ ェ リ ン 5.0 結晶イ ンシュ リ ン 5.0 カナマイ シン 60.0 表 1 (つづき ）
[成分組成 ] 1 ッ トル中
TIHP °- 1 ^
表 2
) イ スコ フ培地
[成分組成 ] 1 リ ッ トル中
Lーァラニン 25.0 a? L一アルギニン塩酸塩 84.0
Lーァスパラギン塩酸塩 28.4 L—ァスパラギン酸 30.0 し一グルタ ミ ン酸 75.0 し一グルタ ミ ン 584.0 L一 シスチンニナ ト リ ウム 82.8 グリ シン 30.0
L一 ヒスチジン塩酸塩 （一水塩） 42.0 し 一イ ソ ロイ シン 105.0 し 一ロイ シン 105.0 L— リ ジン塩酸塩 146.0
L一 メチォニン 30.0
L— フエ二ルァラニン 66.0
L一プロ リ ン 40.0 し 一セ リ ン 42.0 し 一ス レ才ニン 95.0
L一 卜 リ プ 卜 フ ァ ン 16.0
L—チロシンニナ ト リ ウム 104.2
L一ノく リ ン 94.0 ビォチン 0.013 D—ノヽ °ン トテン酸カルシウム 4.0 表 2 (つづき ）
[成分組成 ] 1 リ ツ 卜ル中
塩化コ リ ン 4.0 a? 棄酸 4.0
5 i 一イ ノ シ 卜ーノレ 7.2 ニコチン酸ア ミ ド 4.0 ピリ ドキサール塩酸塩 4.0 リ ボフラビン 0.4 チアミ ン塩酸塩 4.0 0 ビタ ミ ン B t 2 0.013 塩化カ リ ウム 330.0 硝酸カ リ ウム 0.076 硫酸マグネシウム （七水塩） 200.0 塩化ナ ト リ ウム 4, 505.0 ^5 リ ン酸二水素ナ ト リ ウム （二水塩 ） 141.3
HEPES 5, 962.0 塩化カルシウム （二水塩） 218.6 フエ ノーノレ レ ッ ドナ ト リ ウム 15.0 ピルビン酸ナ ト リ ウム 110.0 ?0 亜セレン酸ナ ト リ ウム 0.017
炭酸水素ナ ト リ ウム 2, 520.0 I) 一グルコース 4， 500.0 ゥシ血清アルブミ ン 400.0 ヒ 卜 卜 ラ ンス フ ェ リ ン 1.0
15 大豆レクチン 100.0 表 2 ( つづき ）
[成分組成 ] 1 リ ッ トル中
丁 IMP 0.1
2 表 3
) D-HEM/f-12混合培地
[成分組成〗 1 リ ッ トル中
し一ァラニン 4.5 ag L一アルギニン塩酸塩 147.4 し一ァスパラギン （一水塩） 7.5 し 一ァスパラギン酸 6.7 し 一システィ ン塩酸塩 （一水塩） 17.6 し 一シスチン 24.0 し 一グルタ ミ ン 365.
し 一グルタ ミ ン酸 7.4 グリ シン 18.8 し 一ヒスチジン塩酸塩 （一水塩） 31.5 し一 ィ ソ ロイ シン 54.4 し 一 πイ シン 59.0 し 一 リ ジン塩酸塩 91.4 し一 メチォニン 17.2
L— フ エ二ルァラニン 35.5
L一プロ リ ン 17.3 し 一セ リ ン 26.3 しース レオニン 53.6
L一 ト リ プ 卜 フ ァ ン 9.0 しーチロシン 38.7
L―ノくリ ン 52.7 プ 卜 レスシン塩酸塩 0.081 表 3 (つづき ）
[成分組成 ] 1 リ ッ トル中
ピオチン 0.004
D —ノ、 °ン トテン酸カルシウム 2.1 塩化コ リ ン 9.0 葉酸 2.7 i —イ ノ シ トール 12.5 ニコチン酸ア ミ ド 2.0 ピ リ ドキサール塩酸塩 2.0 ピ リ ドキ シン塩酸塩 0.031 リ ボフ ラ ビン 0.219 チア ミ ン塩酸塩 2.2 ビタ ミ ン B 12 0.680
D —グルコース 3, 151.0 ヒ。ルビン酸ナ ト リ ウム 110.0 リ ボ酸 0.103 リ ノ レン酸メチル 0.044 硫酸銅 0.001 硫酸鉄 （七水塩 ） 0.417 硫酸マグネシウム 85.0 硫酸亜鉛 （七水塩） 0.432 硫酸第二鉄 （九水塩 ） 0.050 塩化カルシウム （二水塩 ） 154.5 塩化カ リ ウム 311.9 塩化ナ ト リ ウム 7, 000.0 表 3 (つづき ）
[成分組成 ] リ ッ 卜ノレ中
リ ン酸二水素ナ ト リ ウム （二水塩） D2.0 as リ ン酸一水素ナ ト リ ウム 71.0 炭酸水素ナ 卜 リ ウム 1， 200.0 ヒポキサンチン 2.0 チ ミ ジン 0.364 フエノール レ ッ ドナ ト リ ウム 8.1 TIHP 0.1
[図面の簡単な説明 ]
図 1 は、 種々の培養条件下でのヒ 卜 Gin-1 細胞増殖の 経時的変化を示す図であ り 、
図 2 は、 ヒ ト Gin-1 細胞の増殖に及ぼす抗 TIMPモノク ロ ーナル抗体の影響を示す図であ り 、
図 3 は、 ヒ ト Gin-1 細胞増殖に対する TIMP濃度依存性 を示す図であ り 、
図 4 は、 種々の非接着性細胞の増殖に対する TIHPのも た らす効果を示す図であ り 、
図 5は、 組織培養用無血清培養液 （ ASD-104 ) 中での 種々の細胞に対する TIMPの添加効果を示す図であ り 、 図 6 は、 無血清培養液中でのヒ ト Gin-1 細胞の 増殖に対する ヒ ト rT IMP のもたらす添加効果を示す図で あ り 、
図 7 は、 AS f -104 無血清培養液中でのヒ ト K-562 細胞 の増殖に対する ΓΤΙΗΡ 添加効果を示す図であ り 、 図 8は、 RPM 11640培養液中でのマウスコ ロン 26細胞の 増殖に対する ヒ ト rTIMP および bnTIMPのもた らす添加効 果、 および D-MEM 無血清培養液中でのマウス 3T3 細胞の 増殖に対する ヒ ト ΓΠΜΡ および bnTIMPのもた らす添加効 果を示す図であ り 、
図 9は、 RPM 11640培養液中でのマウスハイ プ リ ドーマ の増殖に対する bnTIMPおよびヒ ト rTIMP のもた らす添加 効果を示す図である 。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . テ ィ シュ ' イ ンヒビター ' ォブ ' メ タ口プロティ ナ ーゼを含有せしめたこ と を特徴とする組織培養用無血 清培地。
2 . テ ィ シュ ' イ ンヒビター ' ォブ ' メ タ 口プロティ ナ ーゼを細胞増殖成長因子と して用いて 、 動物組織細胞 ある いは動物由来の融合細胞をテ ィ シュ · ィ ンヒビタ 一 ■ ォブ · メ タ 口プロティ ナーゼ含有組織培養用無血 清培地中で増殖させる方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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EP0834556A1 (en) * 1996-09-25 1998-04-08 Academisch Ziekenhuis Leiden Methods for culturing cells
GB9714936D0 (en) * 1997-07-17 1997-09-17 Smith & Nephew Cell culture products
CA2318376A1 (en) * 1998-01-12 1999-07-15 Betagene, Inc. Compositions and methods for regulated secretion from neuroendocrine cell lines
AU2013331126A1 (en) 2012-10-18 2015-06-04 Lifeline Scientific, Inc. Preservation of biomaterial properties and methods of storing

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61282095A (ja) * 1985-01-07 1986-12-12 セルテツク　リミテツド 蛋白質の製造方法
JPH02171182A (ja) * 1988-12-22 1990-07-02 Agency Of Ind Science & Technol 付着依存性細胞用増殖助剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61282095A (ja) * 1985-01-07 1986-12-12 セルテツク　リミテツド 蛋白質の製造方法
JPH02171182A (ja) * 1988-12-22 1990-07-02 Agency Of Ind Science & Technol 付着依存性細胞用増殖助剤

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Biochemistry, Vol. 110, No. 2, 1991, pages 189-195. *
Journal of Biological Chemistry, Vol. 259, No. 16, 1984, pages 9992-9996. *
Proc. Natl. Acad. Sci. US, Vol. 77, No. 1, 1980, pages 593-596. *
See also references of EP0550760A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1046778C (zh) * 1993-10-22 1999-11-24 普罗克特和甘保尔公司 含有可生物降解的化学柔软成分和粘结剂材料的多层搽面纸产品

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